CN112194708A - 一种普卡那肽的制备方法 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明提供了一种普卡那肽的制备方法，涉及多肽合成技术领域。本发明通过FMPB对AM树脂或MBHA树脂进行改性，以H‑Leu‑OtBu作为首氨基酸偶联到改性树脂上，对难连位点氨基酸进行了修饰后再按照普卡那肽主链肽的序列逐步偶联到改性树脂中，大大降低了普卡那线性肽的合成难度，解决了目前合成中杂质多、纯度低、收率低和氨基酸消旋等问题；对序列中4位和12位的Cys进行第一氧化成键后进行柱色谱粗纯化，提高了所得普卡那肽的纯度；纯化液稀释后再进行7位和15位的Cys的第二氧化成键，能够降低预氧化普卡那肽线肽的浓度，从而降低第二氧化成键过程中分子间成二硫键，提高普卡那肽的收率，并且操作简便、适宜工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，具体涉及一种普卡那肽的制备方法。
背景技术
Plecanatide(普卡那肽)由美国Synergy制药公司研发，是尿鸟苷蛋白(uroguanylin)的类似物，含有16个氨基酸的环状多肽，其序列为：Asn1-Asp2-Glu3-Cys4-Glu5-Leu6-Cys7-Val8-Asn9-Val10-Ala11-Cys12-Thr13-Gly14-Cys15-Leu16(两对二硫键：Cys4&Cys12和Cys7&Cys15)，具有促尿钠排泄的鸟苷酸环化酶受体激动药的作用，能调节胃肠道中的酸碱离子，诱导液体转运进入胃肠道，增加胃肠道的蠕动和加速排便。
中国专利CN107383170A公开一种普卡那肽的制备方法：(1)在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Leu-OH偶联得到Fmoc-Leu-树脂；(2)通过固相合成法，按照普卡那肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸；(3)裂解，液相环化；(4)纯化，冻冻干后得到普卡那肽。然而，由于普卡那肽的序列在偶联过程中容易形成树脂缩聚，未对主链上的氨基酸进行修饰，影响普卡那肽的偶联效率，导致线性肽合成难度高、纯度低、收率低。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种普卡那肽的制备方法，本发明提供的制备方法，普卡那肽合成难度小、收率高且纯度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种普卡那肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将起始树脂、FMPB和缩合试剂混合，进行改性，得到改性树脂；所述起始树脂包括MBHA树脂或AM树脂；
(2)在保护气氛下，将所述改性树脂、H-Leu-OtBu和呋喃类溶剂混合，进行氨醛缩合反应，将所得席夫碱与还原剂混合，进行还原反应，得到H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂；
(3)按照普卡那肽主链肽的序列，在所述H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂上依次连接Fmoc-Cys(Acm)-OH、R1-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、R2-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH，得到全保护普卡那肽树脂；所述R1和R2独立地包括Fmoc和/或Fmoc-Hmb，所述R1和R2不同时为Fmoc；所述连接包括依次进行的偶联反应和脱Fomc保护基反应；
(4)将所述全保护普卡那肽树脂在裂解液中进行裂解，得到普卡那肽线肽；
(5)将普卡那肽线肽溶解于试剂中，将得到的普卡那肽线肽溶液的pH值调节至7～10后与第一氧化剂混合，对所述普卡那肽线肽序列中4位和12位的Cys中的二硫键进行第一氧化成键，得到预氧化普卡那肽线肽；
所述第一氧化剂包括空气、过氧化氢或二甲基亚砜；
(6)将所述预氧化普卡那肽线肽进行柱色谱粗纯化，将得到的纯化液进行稀释后和第二氧化剂混合，对所述预氧化普卡那肽线肽序列中的7位和15位的Cys中的二硫键进行第二氧化成键，将得到的第二氧化产物进行反相制备色谱纯化，得到普卡那肽；
所述柱色谱粗纯化采用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括醋酸水溶液、三氟醋酸水溶液、磷酸三乙胺水溶液或乙酸铵水溶液，所述流动相B包括乙腈、甲醇或乙醇；
所述第二氧化剂包括碘、二价汞盐、银盐或三价钛盐。
优选的，步骤(1)中，所述起始树脂的取代度为0.3～1.6mmol/g；
所述缩合试剂包括HOBT-DIC、HBTU-NMM、HATU-NMM或PyBOP-HOBT-NMM；
所述起始树脂、FMPB和缩合试剂的摩尔比为1：(1.5～4)：(1.5～4)。
优选的，步骤(2)中，所述改性树脂和H-Leu-OtBu的摩尔比为1：(1～6)；
所述氨醛缩合反应在酸性或碱性条件下进行，所述酸性条件的pH值为2～6，所述碱性条件的pH值为7.5～11。
优选的，步骤(2)中，所述还原剂包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠和醋酸硼氢化钠中的一种或几种；
所述改性树脂和还原剂的摩尔比为1：(2～6)。
优选的，步骤(3)中，所述偶联反应采用的缩合试剂包括HOBT-DIC、HBTU-NMM、HATU-NMM或PyBOP-HOBT-NMM；
所述脱Fomc保护基反应采用的脱保护试剂为哌啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯或三乙胺。
优选的，步骤(4)中，所述裂解液的组成包括TFA、EDT、TIS和H2O，所述TFA、EDT、TIS和H2O的体积比为(85～100)：(0～5)：(0～5)：(0～5)；
所述全保护普卡那肽树脂的质量和裂解液的体积之比为1g：(3～15)mL。
优选的，所述裂解的温度为15～35℃，时间为2～6h。
优选的，步骤(5)中，所述试剂包括水、乙腈水溶液或缓冲盐水溶液；
所述普卡那肽线肽溶液的浓度为0.2～10mg/mL；
优选的，步骤(6)中，所述第二氧化剂和普卡那肽线肽的摩尔比为(0.6～3):1。
优选的，步骤(6)中，所述稀释的倍数为2～20倍。
优选的，步骤(6)中，所述反相制备色谱纯化包括依次进行的第一纯化和第二纯化；
所述第一纯化的条件包括：色谱柱填料为C18烷基键合硅胶；柱温为35℃；流动相A为0.5～2v/v％磷酸三乙胺水溶液、2～32g/L醋酸铵水溶液或10～50mol/L磷酸二氢盐水溶液；流动相B为乙腈；洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为0～6min，流动相A的体积分数为80％，流动相B的体积分数为20％；6～66min，流动相A的体积分数为60％，流动相B的体积分数为40％；检测波长为214nm；
所述第二纯化的条件包括：色谱柱填料为C18烷基键合硅胶；柱温为35℃；流动相A为0.05～5v/v％醋酸水溶液；流动相B为乙腈；洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为0～6min，流动相A的体积分数为75％，流动相B的体积分数为25％；6～66min，流动相A的体积分数为55％，流动相B的体积分数为45％；检测波长为214nm。
本发明提供了一种普卡那肽的制备方法，包括以下步骤：(1)将起始树脂、FMPB和缩合试剂混合，进行改性，得到改性树脂；所述起始树脂包括MBHA树脂或AM树脂；(2)在保护气氛下，将所述改性树脂、H-Leu-OtBu和呋喃类溶剂混合，进行氨醛缩合反应，将所得席夫碱与还原剂混合，进行还原反应，得到H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂；(3)按照普卡那肽主链肽的序列，在所述H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂上依次连接Fmoc-Cys(Acm)-OH、R1-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、R2-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH，得到全保护普卡那肽树脂；所述R1和R2独立地包括Fmoc和/或Fmoc-Hmb，所述R1和R2不同时为Fmoc；所述连接包括依次进行的偶联反应和脱Fomc保护基反应；(4)将所述全保护普卡那肽树脂在裂解液中进行裂解，得到普卡那肽线肽；(5)将普卡那肽线肽溶解于试剂中，将得到的普卡那肽线肽溶液的pH值调节至7～10后与第一氧化剂混合，对所述普卡那肽线肽序列中4位和12位的Cys中的二硫键进行第一氧化成键，得到预氧化普卡那肽线肽；所述第一氧化剂包括空气、过氧化氢或二甲基亚砜；(6)将所述预氧化普卡那肽线肽进行柱色谱粗纯化，将得到的纯化液进行稀释后和第二氧化剂混合，对所述预氧化普卡那肽线肽序列中的7位和15位的Cys中的二硫键进行第二氧化成键，将得到的第二氧化产物进行反相制备色谱纯化，得到普卡那肽；所述柱色谱粗纯化采用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括醋酸水溶液、三氟醋酸水溶液、磷酸三乙胺水溶液或乙酸铵水溶液，所述流动相B包括乙腈、甲醇或乙醇；所述第二氧化剂包括碘、二价汞盐、银盐或三价钛盐。本发明提供的制备方法，通过FMPB对AM树脂或MBHA树脂进行改性，并对难连位点氨基酸的主链进行了修饰，通过空间位阻打破空间结构中的beta折叠，大大降低了普卡那线性肽合成难度，解决了目前合成中出现的杂质多、纯度低、收率低以及氨基酸消旋问题。
对序列中4位和12位的Cys中的二硫键进行第一氧化成键后再进行柱色谱粗纯化，提高了最终所得普卡那肽的纯度；纯化液经稀释后再进行后续的第二氧化成键，能够降低预氧化普卡那肽线肽的浓度，从而降低了第二氧化成键过程中分子间成二硫键，提高了普卡那肽的收率，并且操作简便、适宜工业生产。
具体实施方式
本发明提供了一种普卡那肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将起始树脂、FMPB和缩合试剂混合，进行改性，得到改性树脂；所述起始树脂包括MBHA树脂或AM树脂；
(2)在保护气氛下，将所述改性树脂、H-Leu-OtBu和呋喃类溶剂混合，进行氨醛缩合反应，将所得席夫碱与还原剂混合，进行还原反应，得到H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂；
(3)按照普卡那肽主链肽的序列，在所述H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂上依次连接Fmoc-Cys(Acm)-OH、R1-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、R2-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH，得到全保护普卡那肽树脂；所述R1和R2独立地包括Fmoc和/或Fmoc-Hmb，所述R1和R2不同时为Fmoc；所述连接包括依次进行的偶联反应和脱Fomc保护基反应；
(4)将所述全保护普卡那肽树脂在裂解液中进行裂解，得到普卡那肽线肽；
(5)将普卡那肽线肽溶解于试剂中，将得到的普卡那肽线肽溶液的pH值调节至7～10后与第一氧化剂混合，对所述普卡那肽线肽序列中4位和12位的Cys中的二硫键进行第一氧化成键，得到预氧化普卡那肽线肽；
所述第一氧化剂包括空气、过氧化氢或二甲基亚砜；
(6)将所述预氧化普卡那肽线肽进行柱色谱粗纯化，将得到的纯化液进行稀释后和第二氧化剂混合，对所述预氧化普卡那肽线肽序列中的7位和15位的Cys中的二硫键进行第二氧化成键，将得到的第二氧化产物进行反相制备色谱纯化，得到普卡那肽；
所述柱色谱粗纯化采用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括醋酸水溶液、三氟醋酸水溶液、磷酸三乙胺水溶液或乙酸铵水溶液，所述流动相B包括乙腈、甲醇或乙醇；
所述第二氧化剂包括碘、二价汞盐、银盐或三价钛盐。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
在本发明中，缩写代表的物质如表1所示：
表1缩写对应的物质名称
本发明将起始树脂、FMPB和缩合试剂混合，进行改性，得到改性树脂；所述起始树脂包括MBHA树脂或AM树脂。
在本发明中，所述MBHA树脂的结构式如式I所示：
其中，
为树脂载体；
所述AM树脂的结构式如式II所示：
其中，
为树脂载体。
在本发明中，所述FMPB的结构式如式III所示
在本发明中，所述起始树脂的取代度优选为0.3～1.6mmol/g，更优选为0.5～1.5mmol/g，最优选为0.8～1mmol/g。在本发明中，所述起始树脂在使用前优选还包括进行预处理，所述预处理优选包括：将起始树脂和溶胀剂混合进行溶胀；再除去所述溶胀剂、有机溶剂洗涤和除去所述有机溶剂。在本发明中，所述溶胀剂优选为碱性试剂溶液，所述碱性试剂优选包括优选N,N′-二异丙基乙胺、N-甲基吗啉和三乙胺中的一种或几种；所述碱性试剂溶液的体积百分浓度优选为2～5％，更优选为3～4％；所述碱性试剂溶液中的溶剂优选包括二氯甲烷、四氢呋喃或吡咯烷酮。在本发明中，所述溶胀的温度优选为室温；时间优选为30～120min，更优选为50～100min。在本发明中，所述溶胀的目的是将初始树脂中多余的酸中和掉，通过溶胀可以使得树脂膨胀开，反应位点舒展，有利于FMPB对初始树脂进行改性以及偶联氨基酸。在本发明中，所述除去所述溶胀剂的方式优选为抽滤。在本发明中，所述有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺；所述有机溶剂洗涤的次数优选为2～3次；所述有机溶剂洗涤的目的是除去杂质以及未反应的原料。在本发明中，所述除去所述有机溶剂的方式优选为抽滤。
在本发明中，所述缩合试剂优选包括HOBT-DIC、HBTU-NMM、HATU-NMM或PyBOP-HOBT-NMM；所述HOBT-DIC中HOBT和DIC的摩尔比优选为(1.5～6)：(1.5～6)，更优选为(2～5)：(2～5)，最优选为(3～4)：(3～4)；所述HBTU-NMM中HBTU和NMM的摩尔比优选为(1.425～5.7)：(3～12)，更优选为(2～5)：(5～10)，最优选为(3～4)：(6～8)；所述HATU-NMM中HATU和NMM的摩尔比优选为(1.425～5.7)：(3～12)，更优选为(2～5)：(5～10)，最优选为(3～4)：(6～8)；所述PyBOP-HOBT-NMM中PyBOP、HOBT和NMM的摩尔比优选为(1.425～5.7)：(1.5～6)：(3～12)，更优选为(2～5)：(2～5)：(5～10)，最优选为(3～4)(3～4)：(6～8)。
在本发明中，所述起始树脂和缩合试剂的摩尔比优选为1：(1.5～6)，更优选为1：(2～3)。
在本发明中，所述起始树脂和FMPB的摩尔比优选为1：(1.5～4)，更优选为1：(2～3.5)，最优选为1：(2.5～3)。在本发明中，所述FMPB优选以FMPB溶液形式使用，所述FMPB溶液中的溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺，本发明对于所述FMPB溶液的浓度没有特殊限定，溶剂能够将FMPB溶解即可。
在本发明中，所述改性的温度优选为15～40℃，更优选为25～35℃；本发明对于所述改性的时间没有特殊限定，通过茚三酮检测液检测成阴性即可。在本发明中，所述改性反应过程中，在缩合试剂作用下，FMPB与初始树脂上氨基发生酰胺键缩合，连接到AM或MBHA树脂上。
本发明对于所述茚三酮检测液检测的操作没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的茚三酮检测液检测操作即可。
所述改性后，本发明优选还包括将所述改性的体系进行有机溶剂洗涤后除去有机溶剂，得到改性树脂。在本发明中，所述有机溶剂洗涤包括依次进行的DMF洗涤和THF洗涤；所述DMF洗涤的次数优选为3～5次；所述THF洗涤的次数优选为2～3次；所述DMF洗涤和THF洗涤的目的是除去未反应的FMPB，以避免FMPB影响后续的反应。在本发明中，所述除去所述有机溶剂的方式优选为抽滤。
得到改性树脂后，本发明在保护气氛下，将所述改性树脂、H-Leu-OtBu和呋喃类溶剂混合，进行氨醛缩合反应，将所得席夫碱与还原剂混合，进行还原反应，得到H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂；所述H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂的结构式如式IV所示：
本发明对于所述保护气氛没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的保护气氛即可，具体如氮气或氩气。
在本发明中，所述改性树脂和H-Leu-OtBu的摩尔比优选为1：(1～6)，更优选为1：(1～3)，最优选为1：(1.5～2)。在本发明中，所述H-Leu-OtBu优选以H-Leu-OtBu·HCl形式使用。
在本发明中，所述呋喃类溶剂优选包括四氢呋喃。在本发明中，所述改性树脂和呋喃类溶剂的体积之比优选为1：(3～6)，更优选为1：(4～5)mL。
在本发明中，所述氨醛缩合反应优选在酸性或碱性条件下进行。在本发明中，所述酸性条件的pH值优选为2～6，更优选为3～5；本发明对于提供所述酸性条件的试剂没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的酸即可，具体如醋酸。在本发明中，所述碱性条件的pH值优选为7.5～11，更优选为8～10；本发明对于提供所述碱性条件的试剂没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的碱即可，具体如氢氧化钠或氢氧化钾。
在本发明中，所述氨醛缩合反应的温度优选为室温；时间优选为10～30min，更优选为20min；所述氨醛缩合反应过程中，改性树脂中的醛与H-Leu-OtBu中的氨基之间氨醛缩合生成席夫碱。
在本发明中，所述还原剂优选包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠和醋酸硼氢化钠中的一种或几种，更优选包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠或醋酸硼氢化钠。在本发明中，所述还原剂优选以还原剂溶液形式使用，所述还原剂溶液中的溶剂优选包括甲醇或乙醇；所述还原剂溶液的浓度优选为10～20mol/L，更优选为13～15mol/L。在本发明中，所述改性树脂和还原剂的摩尔比优选为1：(2～6)，更优选为1：(3～5)，最优选为1:4。在本发明中，所述还原反应的温度优选为室温；时间优选为2～24h，更优选为5～20h，最优选为10～15h。
所述还原反应后，本发明优选还包括将所述还原反应的体系有机溶剂洗涤后干燥，得到H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂。在本发明中，所述有机溶剂洗涤包括依次进行的酰胺类溶剂洗涤和醇类溶剂洗涤；所述酰胺类溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺；所述酰胺类溶剂洗涤的次数优选为3～4次；所述醇类溶剂优选包括甲醇或乙醇；所述醇胺类溶剂洗涤的次数优选为3～4次。在本发明中，所述干燥的方式优选为真空抽干。
得到H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂后，本发明按照普卡那肽主链肽的序列，在所述H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂上依次连接Fmoc-Cys(Acm)-OH、R1-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、R2-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH，得到全保护普卡那肽树脂；所述R1和R2独立地包括Fmoc和/或Fmoc-Hmb，所述R1和R2不同时为Fmoc；所述连接包括依次进行的偶联反应和脱Fomc保护基反应。在本发明中，所述全保护普卡那肽树脂的结构式为：
Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Acm)-Val-A sn(Trt)-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Leu-OtBu-FMPB AM树脂。
在本发明中，所述H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂在使用前优选进行溶胀。在本发明中，所述溶胀用采用的有机溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或二氯甲烷；所述H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂和溶胀用有机溶剂的体积比优选为1：(1～3)，更优选为1:2；所述溶胀的温度优选为室温；所述溶胀的时间优选为30～120min，更优选为50～100min。
在本发明中，所述Fmoc-Cys(Acm)-OH、R1-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、R2-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH与H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂的摩尔比独立地优选为(1.5～6)：1，更优选为(2～5)：1，最优选为(3～4)：1。
在本发明中，所述缩合试剂优选与前述改性树脂制备过程中采用的缩合试剂的可选种类相同，在此不再一一赘述。
在本发明中，所述缩合试剂和H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂的摩尔比优选为(1.5～6)：1，更优选为(2～3)：1。
在本发明中，所述脱Fomc保护基反应采用的脱保护试剂优选包括哌啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯或三乙胺，更优选为哌啶；所述脱保护试剂优选以脱保护试剂溶液形式使用，所述脱保护试剂溶液的体积浓度优选为20～30％，更优选为20～25％。在本发明中，所述脱保护试剂溶液中的溶剂优选为酰胺类溶剂，所述酰胺类溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺。在本发明中，所述H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂和脱保护试剂的体积比优选为1：(1～3)，更优选为1:2。
在本发明中，所述脱除保护基的温度优选为室温；时间优选为5min～1h，更优选为20～30min。在本发明中，所述脱除保护基优选通过茚三酮检测液检测判定反应终点，当检测结果为阳性时，所述脱Fomc保护基反应完毕。
在本发明中，所述偶联反应的温度优选为20～40℃，更优选为室温；时间优选为0.5～4h，更优选为1～3h。在本发明中，所述偶联反应优选通过茚三酮检测液检测判定反应终点，当检测结果为阴性时，所述第二偶联反应完毕。在本发明中，所述偶联反应过程中发生的反应如式(1)所示：
式(1)中R1不存在或为Hmb，R2不存在或为Hmb，R1和R2至少有一个为Hmb。
得到全保护普卡那肽树脂后，本发明将所述全保护普卡那肽树脂在裂解液中进行裂解，得到普卡那肽线肽。
在本发明中，所述普卡那肽线肽的结构式为：
Asn-Asp-Glu-Cys-Glu-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(Acm)-Leu-OH。
在本发明中，所述裂解液的组成优选包括TFA、EDT、TIS和H2O，所述TFA、EDT、TIS和H2O的体积比优选为(85～100)：(0～5)：(0～5)：(0～5)，更优选为(88～98)：(1～4)：(1～4)：(1～4)，更优选为(90～95)：(2～3)：(2～3)：(2～3)。在本发明中，所述全保护普卡那肽树脂的质量和裂解液的体积之比优选为1g：(3～15)mL，更优选为1g：(5～12)mL，最优选为1g：(5～10)mL。
在本发明中，所述裂解的温度优选为15～35℃，更优选为20～30℃，最优选为25℃；时间优选为2～6h，更优选为3～5h，最优选为4h。在本发明中，所述裂解过程中发生的反应如式(2)所示：
所述裂解后，本发明优选还包括将所述裂解体系进行第一固液分离，得到固体组分和液体组分；将所得固体组分进行TFA洗涤，得到洗液；将所述洗液和所述液体组分合并后加入沉降剂进行沉淀，然后第二固液分离，将所得固体组分有机溶剂洗涤后干燥，得到普卡那肽线肽。在本发明中，所述第一固液分离的方式优选为过滤或抽滤；所述第一固液分离的目的是除去改性树脂。在本发明中，所述沉降剂优选包括甲基叔丁基醚；所述沉降剂和液体组分的体积比优选为(3～10)：1，更优选为(5～8)：1。在本发明中，所述沉降的温度优选为-20～15℃，更优选为0～10℃；时间优选为0.5～4h，更优选为1～2.5h。在本发明中，所述第二固液分离的方式优选为离心分离，本发明对于离心分离的条件没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的离心分离条件即可。在本发明中，所述有机溶剂洗涤优选为甲基叔丁基醚洗涤；所述有机溶剂洗涤的次数优选为2～3次。在本发明中，所述干燥的方式优选为真空干燥；所述干燥的温度优选为15～40℃，更优选为25～35℃；时间优选为12～24h，更优选为16～20h。
得到普卡那肽线肽后，本发明将普卡那肽线肽溶解于试剂中，将得到的普卡那肽线肽溶液的pH值调节至7～10后与第一氧化剂混合，对所述普卡那肽线肽序列中4位和12位的Cys中的二硫键进行第一氧化成键，得到预氧化普卡那肽线肽；
所述第一氧化剂包括空气、过氧化氢或二甲基亚砜。
在本发明中，所述试剂优选包括水、乙腈水溶液或缓冲盐水溶液；所述乙腈水溶液中乙腈的体积分数优选为0～50％，更优选为10～20％；所述缓冲盐水溶液优选包括碳酸氢铵水溶液、氨水或磷酸三乙胺水溶液；本发明对于所述缓冲盐水溶液的浓度没有特殊限定，能够将pH值调节至7～10即可；在本发明的实施例中，所述碳酸氢铵水溶液优选为饱和碳酸氢铵水溶液。
在本发明中，所述普卡那肽线肽溶液的浓度优选为0.2～10mg/mL，更优选为0.5～5mg/mL，最优选为2～5mg/mL。
在本发明中，pH值为7～10，优选为8～9。本发明对于所述pH值调节采用的试剂没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的碱性试剂即可，具体如氨水、碳酸氢钠、碳酸氢钾或碳酸氢铵；所述氨水的质量百分浓度优选为1～25％，更优选为5～10％。
在本发明中，所述第一氧化剂包括空气、过氧化氢或二甲基亚砜。在本发明中，所述空气加入方式优选为通入；所述空气的通入量优选为100～2000mL/min，更优选为500～1000mL/min。在本发明中，所述过氧化氢优选以过氧化氢水溶液形式使用，所述过氧化氢水溶液的质量百分浓度优选为0.5～30％，更优选为1～10％；所述普卡那肽线肽和过氧化氢的摩尔比优选为1：(0.8～2)，更优选为1：(1～1.5)。在本发明中，所述普卡那肽线肽溶液和二甲基亚砜的体积比优选为1：(0.05～0.3)，更优选为1：(0.1～0.2)。在本发明中，所述过氧化氢和二甲基亚砜的加入方式优选为滴加，本发明对于所述滴加的速度没有特殊限定，匀速逐滴加入即可。
在本发明中，当所述普卡那肽线肽的剩余量≤所述普卡那肽线肽总量的2.5％时，优选停止第一氧化成键。在本发明中，所述第一氧化成键的温度优选为室温；时间优选为2～72h，更优选为10～60h，更优选为30～50h。在本发明中，所述第一氧化成键过程中，由于普卡那肽线肽中7位和15位的两个Cys的侧链巯基采用Acm保护，该保护基在空气、过氧化氢以及二甲基亚砜氧化剂存在下稳定，因而7位和15位的两个Cys不会发生反应；所述第一氧化成键过程中发生的反应如式(3)所示：
得到预氧化普卡那肽线肽后，本发明将所述预氧化普卡那肽线肽进行柱色谱粗纯化，将得到的纯化液进行稀释后和第二氧化剂混合，对所述预氧化普卡那肽线肽序列中的7位和15位的Cys中的二硫键进行第二氧化成键，将得到的第二氧化产物进行反相制备色谱纯化，得到普卡那肽；
所述柱色谱粗纯化采用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括乙腈、甲醇或乙醇，所述流动相B包括醋酸水溶液、三氟醋酸水溶液、磷酸三乙胺水溶液或乙酸铵水溶液；
所述第二氧化剂包括碘、二价汞盐、银盐或三价钛盐。
在本发明中，所述柱色谱粗纯化采用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括醋酸水溶液、三氟醋酸水溶液、磷酸三乙胺水溶液或乙酸铵水溶液，所述流动相B包括乙腈、甲醇或乙醇。在本发明中，所述醋酸水溶液的质量百分浓度优选为0.1～5％，更优选为0.5～2％；所述三氟醋酸水溶液的质量百分浓度优选为0.05～0.5％，更优选为0.08～0.2％；所述磷酸三乙胺水溶液的质量百分浓度优选为0.5～5％，更优选为0.5～2％；所述乙酸铵水溶液的质量百分浓度优选为0.1～2％，更优选为0.5～1％。本发明对于所述柱色谱粗纯化的其他条件没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的柱色谱粗纯化条件能够将杂质去除即可。在本发明中，经柱色谱粗纯化，能够除去预氧化普卡那肽线肽中的残留溶剂、裂解过程中产生的碱性氨基酸盐、裂解液和被脱除的侧链保护基等杂质，再进行后续的第二氧化成键，从而提高最终普卡那肽的纯度。
在本发明中，所述稀释采用的稀释剂优选包括水或乙腈水溶液；所述乙腈水溶液中乙腈的体积百分含量优选<30％；所述稀释的倍数优选为2～20倍，更优选为5～15倍，最优选为10～15倍。在本发明中，经过稀释，纯化液中的预氧化普卡那肽线肽的浓度显著降低，从而降低后续第二氧化成键过程中预氧化普卡那肽线肽分子间形成二硫键。
所述稀释后，本发明优选还包括将所述稀释后的体系的pH值调节至3～6。在本发明中，所述pH值优选为4～5；本发明对于所述pH值调节采用的试剂没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的酸即可，具体如醋酸或磷酸。
在本发明中，所述第二氧化剂包括碘、二价汞盐、银盐或三价钛盐；所述第二氧化剂优选以第二氧化剂溶液形式使用，所述第二氧化剂溶液中的溶剂优选包括甲醇、醋酸或乙腈；所述第二氧化剂溶液的浓度优选为0.01～1mol/L，更优选为0.1～0.8mol/L，最优选为0.3～0.5mol/L。本发明对于所述二价汞盐、银盐或三价钛盐的种类没有特殊限定，能够溶解于甲醇、醋酸或乙腈中即可。在本发明中，所述第二氧化剂溶液的加入方式优选为滴加，本发明对于所述滴加的速度没有特殊限定，匀速逐滴加入即可。在本发明中，所述第二氧化剂优选分2～3次加入。在本发明中，所述第二氧化剂和普卡那肽线肽的摩尔比优选为(0.6～3):1，更优选为(1～2):1，最优选为1.5:1。
在本发明中，所述第二氧化成键的温度优选为10～40℃，更优选为室温；时间优选为5～24h，更优选为5～12h。在本发明中，所述第二氧化成键过程中发生的反应如式(4)所示：
所述第二氧化成键后，本发明优选还包括在所述第二氧化成键的体系中加入还原剂除去多余的碘。在本发明中，所述还原剂优选包括维生素C或亚硫酸氢钠。本发明对于所述还原剂的用量没有特殊限定，加入还原剂至第二氧化成键的体系的淡黄色(碘的颜色)褪去即可。
在本发明中，所述反相制备色谱纯化包括依次进行的第一纯化和第二纯化。在本发明中，所述第一纯化的条件包括：色谱柱填料优选为C18烷基键合硅胶；柱温优选为35℃；检测波长优选为214nm；流动相A优选为0.5～2v/v％磷酸三乙胺水溶液、2～32g/L醋酸铵水溶液或10～50mol/L磷酸二氢盐水溶液，所述磷酸三乙胺水溶液的浓度更优选为1～1.5v/v％，所述醋酸铵水溶液的浓度更优选为10～16g/L，所述磷酸二氢盐水溶液的浓度更优选为20～30mol/L；流动相B优选为乙腈；所述流动相A和流动相B的流速独立地优选为5～15mL/min，更优选为10mL/min；洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为0～6min，流动相A的体积分数为80％，流动相B的体积分数为20％；6～66min，流动相A的体积分数为60％，流动相B的体积分数为40％。
在本发明中，所述第二纯化的条件包括：色谱柱填料优选为C18烷基键合硅胶；柱温优选为35℃；检测波长优选为214nm；流动相A优选为0.05～5v/v％醋酸水溶液，所述醋酸水溶液的浓度更优选为1～4％，最优选为2～3％；流动相B优选为乙腈；所述流动相A和流动相B的流速独立地优选为5～15mL/min，更优选为10mL/min；洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为0～6min，流动相A的体积分数为75％，流动相B的体积分数为25％；6～66min，流动相A的体积分数为55％，流动相B的体积分数为45％。
在本发明中，所述反相制备色谱纯化后，本发明优选还包括将所述反相制备色谱纯化得到的纯化液浓缩后干燥，得到普卡那肽。本发明对于所述浓缩的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可，具体如减压蒸馏。在本发明中，所述干燥的的温度优选为10～40℃，更优选为20～30℃；本发明对于所述干燥的时间没有特殊限定，干燥至恒重即可；所述干燥优选在挂瓶冻干机中进行。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)将10g取代度为1.0mmol/g的AM树脂、200mL 5v/v％DIEA/DCM溶胀树脂1h后，DMF洗涤2次，抽滤除去溶液，加入3.33g FMPB(15mmol)加入反应器中，加入DMF溶解，加入2.36mL DIC(15mmol)和2.03g HoBt(15mmol)混合，改性1.5h后，茚三酮检测成阴性，用DMF洗涤3次，THF洗涤2次，抽滤除去溶剂，得到改性树脂(13.56g)。
(2)在氮气保护下，将步骤(1)得到的1.36g改性树脂、4.47g H-Leu-OtBu·HCl(20mmol)、200mL THF混合，加入2.3mL(40mmol)醋酸混合均匀后，氨醛缩合反应30min，加入3mL浓度为13.3mol/L的氰基硼氢化钠/甲醇溶液混合，还原反应16h，用DMF洗涤3次，甲醇洗涤3次，真空抽干，得到H-Leu-OtBu-FMPBAM树脂(1.49g，产率96.3％)。
(3)将1.49g步骤(2)得到的H-Leu-OtBu-FMPB AM树脂(1mmol)置于25mL DCM溶胀30min，以3mmol DIC和3mmol HoBt为缩合试剂，将溶胀后的H-Leu-OtBu-FMPB AM树脂与Fmoc-Cys(Acm)-OH在室温下偶联反应，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阴性，然后在30mL20v/v％的哌啶的DMF溶液存在下脱除Fmoc保护基，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阳性，脱除Fmoc保护基反应完成，得到Cys(Acm)-Leu-OtBu-FMPBAM树脂；重复上述偶联反应和脱除Fmoc保护基反应，按照普卡那肽主链肽的序列，在Cys(Acm)-Leu-OtBu-FMPB AM树脂依次连接Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH，得到全保护普卡那肽树脂Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Leu-OtBu-FMPB AM树脂(4.18g)；其中，各氨基酸的用量均为3mmol。
(4)将4.18g步骤(3)得到的全保护普卡那肽树脂和40mL裂解液(TFA:EDT:TIS:H2O体积比＝90:5:2.5:2.5)混合，在室温下裂解3h，过滤，得到树脂和收集液体组分；将所述树脂用3mL TFA洗涤1次，得到洗液；将所述洗液和所述液体组分合并后加入到320mL甲基叔丁基醚中，在-10℃下沉降5min，离心分离，将所得固体组分用甲基叔丁基醚洗涤2次，每次洗涤甲基叔丁基醚用量为100mL，真空干燥，得到普卡那肽线肽Asn-Asp-Glu-Cys-Glu-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(Acm)-Leu-OH(1.77g，收率为97.0％，纯度为68.6％)。
(5)将200mg步骤(4)得的普卡那肽线肽置于纯水中，加入饱和碳酸氢铵溶液调节pH至7.5，磁力搅拌至普卡那肽线肽粗品完全溶解，得到浓度为1mg/mL的普卡那肽线肽溶液，分两次滴加50μL 7.5wt％双氧水溶液第一氧化成键共60min(其中，每次滴加量为25μL，每次滴加后第一氧化成键30min)，得到预氧化普卡那肽线肽液，HPLC检测，得到纯度为70.2％；
(6)将所述步骤(5)得到的预氧化普卡那肽线肽液进行柱色谱粗纯化，得到纯化液，在所述纯化液中加入20mL纯水进行稀释，滴加0.25mL浓度为0.50mol/L的碘的甲醇溶液至体系颜色为浅黄棕色时停止加入，待溶液褪去后继续滴加碘的甲醇溶液至体系30min内不变色后停止滴加，第二氧化成键12h，加入维生素C还原过量碘至淡黄色退去，得到普卡那肽粗品液，HPLC检测得到其纯度为56.8％。
(7)将步骤(6)得到的普卡那肽粗品液过0.45μm滤膜后利用反相制备色谱进行第一纯化和第二纯化，然后在30℃下挂瓶冻干机干燥48h，得到普卡那肽(31.2mg，纯化收率为15.6％；纯度为99.74％，最大单杂含量0.08％)。
其中，第一纯化的条件为：色谱柱为Luna-C18(20×250mm，10μm)；柱温为35℃；检测波长为214nm；流动相A为1v/v％TEAP水溶液(pH＝3)；流动相B为乙腈；流动相A和流动相B的流速为10mL/min；洗脱方式为梯度洗脱：0～6min，流动相A的体积分数为80％，流动相B的体积分数为20％；6～66min，流动相A的体积分数为60％，流动相B的体积分数为40％。
第二纯化的条件为：色谱柱为Luna-C18(20×250mm，10μm)；柱温为35℃；检测波长为214nm；流动相A为0.3v/v％醋酸水溶液(pH＝3)；流动相B为乙腈；流动相A和流动相B的流速为10mL/min；洗脱方式为梯度洗脱：0～6min，流动相A的体积分数为75％，流动相B的体积分数为25％；6～66min，流动相A的体积分数为55％，流动相B的体积分数为45％。
实施例2
(1)将6.30g实施例1步骤(2)得到H-Leu-OtBu-FMPBAM树脂(1mmol)置于25mL DCM溶胀30min，以3mmol DIC和3mmol HoBt作为缩合试剂，将溶胀后的H-Leu-OtBu-FMPB AM树脂与Fmoc-Cys(Acm)-OH在室温下偶联反应，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阴性，然后在140mL20v/v％的哌啶的DMF溶液存在下脱除Fmoc保护基，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阳性，脱除Fmoc保护基反应完成，得到Cys(Acm)-Leu-OtBu-FMPB AM树脂；重复上述偶联反应和脱除Fmoc保护基反应，按照普卡那肽主链肽的序列，在Cys(Acm)-Leu-OtBu-FMPB AM树脂依次连接Fmoc-Hmb-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH，得到全保护普卡那肽树脂Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Leu-OtBu-FMPB AM树脂(21.27g)；其中，各氨基酸的用量均为3mmol。
(2)将21.27g步骤(1)制备的全保护普卡那肽树脂和250mL裂解液(TFA:EDT:TIS:H2O体积比＝90:5:2.5:2.5)混合，在室温下裂解3h，过滤，得到树脂和收集液；将所述树脂用10mL TFA洗涤1次，得到洗液；将所述洗液和所述收集液合并后加入到1100mL甲基叔丁基醚中，在-10℃下沉降30min，离心分离，将所得固体组分用甲基叔丁基醚洗涤2次，每次洗涤甲基叔丁基醚用量为100mL，真空干燥，得到普卡那肽线肽(9.02g，收率为96.7％，纯度为81.2％)。
(3)将200mg步骤(2)得到的普卡那肽线肽置于纯水中，加入饱和碳酸氢铵溶液调节pH至7.5，磁力搅拌至普卡那肽线肽粗品完全溶解，得到浓度为1mg/mL的普卡那肽线肽溶液，以200mL/min的流速通入空气，分两次滴加50μL 7.5wt％双氧水溶液第一氧化成键共60min(其中，每次滴加量为25μL，每次滴加后第一氧化成键30min)，得到预氧化普卡那肽线肽液，HPLC检测得到纯度为83.4％。
(4)将步骤(3)得到的预氧化普卡那肽线肽液以1v/v％TEAP水溶液为流动相进行柱色谱粗纯化，得到18mL纯化液，在所述纯化液中加入102mL纯水进行稀释，得到稀释液，用醋酸调节稀释液的pH值至3，滴加0.25mL浓度为0.50mol/L的碘的甲醇溶液至体系颜色为浅黄棕色时停止加入，待溶液褪去后继续滴加碘的甲醇溶液至体系30min内不变色后停止滴加，第二氧化成键8h，加入维生素C还原过量碘至淡黄色退去，得到普卡那肽粗品液HPLC检测得到其纯度为89.4％。
(5)将步骤(4)得到的普卡那肽粗品液过0.45μm滤膜后利用反相制备色谱进行第一纯化和第二纯化，然后在挂瓶冻干机上室温冻干24h，得到普卡那肽(65.2mg，纯化收率为32.6％；纯度为99.76％，最大单杂含量为0.06％)。
其中，第一纯化的条件为：色谱柱为Luna-C18(20×250mm，10μm)；柱温为35℃；检测波长为214nm；流动相A为1v/v％TEAP水溶液(pH＝3)；流动相B为乙腈；流动相A和流动相B的流速为10mL/min；洗脱方式为梯度洗脱：0～6min，流动相A的体积分数为80％，流动相B的体积分数为20％；6～66min，流动相A的体积分数为60％，流动相B的体积分数为40％。
第二纯化的条件为：色谱柱为Luna-C18(20×250mm，10μm)；柱温为35℃；检测波长为214nm；流动相A为0.3v/v％醋酸水溶液(pH＝3)；流动相B为乙腈；流动相A和流动相B的流速为10mL/min；洗脱方式为梯度洗脱：0～6min，流动相A的体积分数为75％，流动相B的体积分数为25％；6～66min，流动相A的体积分数为55％，流动相B的体积分数为45％。
实施例3
(1)将8.02g按照实施例2步骤(1)制备的普卡那肽线肽置于纯水中，加入饱和碳酸氢铵溶液调节pH至7.5，磁力搅拌至普卡那肽线肽粗品完全溶解，得到浓度为1mg/mL的普卡那肽线肽溶液，以600mL/min的流速通入空气，分三次滴加2.1mL7.5wt％双氧水溶液第一氧化成键共90min(其中，每次滴加量为700μL，每次滴加后第一氧化成键30min)，得到预氧化普卡那肽线肽液，HPLC检测得到其纯度为81.6％。
(2)将步骤(1)得到的预氧化普卡那肽线肽液以1v/v％TEAP水溶液为流动相进行柱色谱粗纯化，得到850mL纯化液，在所述纯化液中加入3650mL纯水进行稀释，得到稀释液，稀释后溶液pH值约为3.5，滴加2.35mL浓度为0.50mol/L的碘的甲醇溶液至体系颜色为浅黄棕色时停止加入，待溶液褪去后继续滴加碘的甲醇溶液至体系30min内不变色后停止滴加，第二氧化成键12h，加入维生素C还原过量碘至淡黄色退去，HPLC检测，得到普卡那肽粗品液，HPLC检测得到其纯度为90.2％。
(3)将步骤(1)得到的普卡那肽粗品液过0.45μm滤膜后利用反相制备色谱进行第一纯化和第二纯化，挂瓶冻干机室温冻干约32h，得到普卡那肽2.55g，纯化收率为39.6％；纯度为99.80％，最大单杂含量为0.04％)。
其中，第一纯化的条件为：色谱柱为Luna-C18(20×250mm，10μm)；柱温为35℃；检测波长为214nm；流动相A为1v/v％TEAP水溶液(pH＝3)；流动相B为乙腈；流动相A和流动相B的流速为10mL/min；洗脱方式为梯度洗脱：0～6min，流动相A的体积分数为80％，流动相B的体积分数为20％；6～66min，流动相A的体积分数为60％，流动相B的体积分数为40％。
第二纯化的条件为：色谱柱为Luna-C18(20×250mm，10μm)；柱温为35℃；检测波长为214nm；流动相A为0.3v/v％醋酸水溶液(pH＝3)；流动相B为乙腈；流动相A和流动相B的流速为10mL/min；洗脱方式为梯度洗脱：0～6min，流动相A的体积分数为75％，流动相B的体积分数为25％；6～66min，流动相A的体积分数为55％，流动相B的体积分数为45％。
对比例1
将200mg实施例1步骤(4)得到的普卡那肽线肽置于纯水中，加入饱和碳酸氢铵溶液调节pH至7.5，磁力搅拌至普卡那肽线肽粗品完全溶解，得到浓度为1mg/mL的普卡那肽线肽溶液，滴加50μL 7.5wt％双氧水溶液第一氧化成键40min，得到预氧化普卡那肽线肽液，HPLC检测得到其纯度为67.2％。
将所述预氧化普卡那肽线肽液用醋酸调节稀释液的pH值至5，滴加0.3mL浓度为0.50mol/L的碘的甲醇溶液第二氧化成键3h，加入维生素C还原过量碘至淡黄色退去，得到普卡那肽粗品液，HPLC检测其纯度为55.4％。
对比例2
将200mg实施例1步骤(4)得到的普卡那肽线肽置于20v/v％乙腈水溶液中，加入饱和碳酸氢铵溶液调节pH至7.5，磁力搅拌至普卡那肽线肽粗品完全溶解，得到浓度为1mg/mL的普卡那肽线肽溶液，滴加50μL 7.5wt％双氧水溶液第一氧化成键40min，得到预氧化普卡那肽线肽液，HPLC检测得到其纯度为69.4％。
将所述预氧化普卡那肽线肽液用醋酸调节稀释液的pH值至5，滴加0.3mL浓度为0.50mol/L的碘的甲醇溶液第二氧化成键3h，加入维生素C还原过量碘至淡黄色退去，得到普卡那肽粗品液，HPLC检测得到其纯度为46.6％。
由对比例1～2可知，在第一氧化成键完以后，不经过色谱纯化，直接调节pH值，然后加入碘/甲醇溶液进行第二氧化成键，得到的普卡那肽粗品液的纯度显著降低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种普卡那肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将起始树脂、FMPB和缩合试剂混合，进行改性，得到改性树脂；所述起始树脂包括MBHA树脂或AM树脂；
(2)在保护气氛下，将所述改性树脂、H-Leu-OtBu和呋喃类溶剂混合，进行氨醛缩合反应，将所得席夫碱与还原剂混合，进行还原反应，得到H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂；
(3)按照普卡那肽主链肽的序列，在所述H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂上依次连接Fmoc-Cys(Acm)-OH、R1-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、R2-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH，得到全保护普卡那肽树脂；所述R1和R2独立地包括Fmoc和/或Fmoc-Hmb，所述R1和R2不同时为Fmoc；所述连接包括依次进行的偶联反应和脱Fomc保护基反应；
(4)将所述全保护普卡那肽树脂在裂解液中进行裂解，得到普卡那肽线肽；
(5)将普卡那肽线肽溶解于试剂中，将得到的普卡那肽线肽溶液的pH值调节至7～10后与第一氧化剂混合，对所述普卡那肽线肽序列中4位和12位的Cys中的二硫键进行第一氧化成键，得到预氧化普卡那肽线肽；
所述第一氧化剂包括空气、过氧化氢或二甲基亚砜；
(6)将所述预氧化普卡那肽线肽进行柱色谱粗纯化，将得到的纯化液进行稀释后和第二氧化剂混合，对所述预氧化普卡那肽线肽序列中的7位和15位的Cys中的二硫键进行第二氧化成键，将得到的第二氧化产物进行反相制备色谱纯化，得到普卡那肽；
所述柱色谱粗纯化采用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括醋酸水溶液、三氟醋酸水溶液、磷酸三乙胺水溶液或乙酸铵水溶液，所述流动相B包括乙腈、甲醇或乙醇；
所述第二氧化剂包括碘、二价汞盐、银盐或三价钛盐。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述起始树脂的取代度为0.3～1.6mmol/g；
所述缩合试剂包括HOBT-DIC、HBTU-NMM、HATU-NMM或PyBOP-HOBT-NMM；
所述起始树脂、FMPB和缩合试剂的摩尔比为1：(1.5～4)：(1.5～4)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述改性树脂和H-Leu-OtBu的摩尔比为1：(1～6)；
所述氨醛缩合反应在酸性或碱性条件下进行，所述酸性条件的pH值为2～6，所述碱性条件的pH值为7.5～11。
4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述还原剂包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠和醋酸硼氢化钠中的一种或几种；
所述改性树脂和还原剂的摩尔比为1：(2～6)。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述偶联反应采用的缩合试剂包括HOBT-DIC、HBTU-NMM、HATU-NMM或PyBOP-HOBT-NMM；
所述脱Fomc保护基反应采用的脱保护试剂包括哌啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯或三乙胺。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述裂解液的组成包括TFA、EDT、TIS和H2O，所述TFA、EDT、TIS和H2O的体积比为(85～100)：(0～5)：(0～5)：(0～5)；
所述全保护普卡那肽树脂的质量和裂解液的体积之比为1g：(3～15)mL；
所述裂解的温度为15～35℃，时间为2～6h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述试剂包括水、乙腈水溶液或缓冲盐水溶液；
所述普卡那肽线肽溶液的浓度为0.2～10mg/mL。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述第二氧化剂和普卡那肽线肽的摩尔比为(0.6～3):1。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述稀释的倍数为2～20倍。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述反相制备色谱纯化包括依次进行的第一纯化和第二纯化；
所述第一纯化的条件包括：色谱柱填料为C18烷基键合硅胶；柱温为35℃；流动相A为0.5～2v/v％磷酸三乙胺水溶液、2～32g/L醋酸铵水溶液或10～50mol/L磷酸二氢盐水溶液；流动相B为乙腈；所述流动相A和流动相B的流速独立地为5～15mL/min；洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为0～6min，流动相A的体积分数为80％，流动相B的体积分数为20％；6～66min，流动相A的体积分数为60％，流动相B的体积分数为40％；检测波长为214nm；
所述第二纯化的条件包括：色谱柱填料为C18烷基键合硅胶；柱温为35℃；流动相A为0.05～5v/v％醋酸水溶液；流动相B为乙腈；所述流动相A和流动相B的流速独立地为5～15mL/min；洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为0～6min，流动相A的体积分数为75％，流动相B的体积分数为25％；6～66min，流动相A的体积分数为55％，流动相B的体积分数为45％；检测波长为214nm。
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