CN113512091A

CN113512091A - 一种普卡那肽的合成方法

Info

Publication number: CN113512091A
Application number: CN202110497892.0A
Authority: CN
Inventors: 杨秋初; 陈逸民; 吴艳; 朱友耀; 熊玲媛; 王宇
Original assignee: Zhangzhou Weiming Boxin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhangzhou Weiming Boxin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-05-08
Filing date: 2021-05-08
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2041-05-08
Also published as: CN113512091B

Abstract

本发明公开了一种普卡那肽的合成方法。该方法包括在活化剂的存在下，由树脂固相载体和Fmoc‑Leu‑OH偶联得到Fmoc‑Leu‑树脂，通过固相合成法，按照普卡那肽主链肽顺序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，偶联完之后裂解，使得普卡那肽从树脂上脱除并脱除掉全部侧链保护基团，裂解之后冻干得到普卡那肽线性粗肽；将所得的普卡那肽线性粗肽溶于溶剂中得到溶解液，溶解液中溶质/溶剂的质量体积比为0.1‑1.0mg/mL，然后进行环化，分离纯化得到环化好的普卡那肽，冻干得到精肽。该方法简单，产率高，错配率低。

Description

一种普卡那肽的合成方法

技术领域

本发明涉及化学合成领域，尤其涉及一种普卡那肽的合成方法。

背景技术

目前普卡合成方法常规有二：一是先采用液相合成法合成六肽片段，利用酶促法将六肽片段偶联至固相树脂上，利用固相树脂的假稀释效应在固相树脂上通过对Cys不同位置的保护基，直完成两个二硫环的选择性合成，之后将其从树脂上切割下来进行纯化。但是用酶促反应将片段偶联至固相树脂，产率低，不适用于工业生产；选择性去除Cys上特殊保护基团较为困难，条件苛刻；且在固相树脂上进行第一对二硫键环化方法复杂，得率低。二是在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Leu-OH偶联得到Fmoc-Leu-树脂，通过固相合成法，按照普卡那肽主链肽顺序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，按照普卡那肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联，合成完毕之后进行裂解，在水溶液或者DMSO溶液中进行液相环化，最后纯化，冻干后得到普卡那肽；但是在高氧化能力下，二硫键错配程度高，导致最终纯化困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单，产率高，错配率低的普卡那肽的合成方法。

为实现上述目的，本发明提供一种普卡那肽的合成方法，其特征在于，合成步骤包括：

获取线性肽：在活化剂的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Leu-OH偶联得到Fmoc-Leu-树脂，通过固相合成法，按照普卡那肽主链肽顺序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，偶联完之后裂解，使得普卡那肽从树脂上脱除并脱除掉全部侧链保护基团，裂解之后冻干得到普卡那肽线性粗肽；

环化步骤：将所得的普卡那肽线性粗肽溶于溶剂中得到溶解液，溶解液中溶质/溶剂的质量体积比为0.1-1.0mg/mL，然后进行环化，所述环化所用的环化液为0.1-1M NaCl、0.1-1M Tris-HCl、5-10mM GSH和0.5-1mM GSSG和0.1-0.5mM盐酸胍，pH值为7.5；

纯化：分离纯化得到环化好的普卡那肽，冻干得到精肽。

进一步，所述溶剂为水或者有机溶剂。

进一步，所述有机溶剂为乙腈。

进一步，所述环化步骤中的环化为将溶解液缓慢滴入到环化液中密封，黑暗下0-6℃放置12-24h。

进一步，所述环化步骤中的环化为黑暗下0-6℃放置20-24h。

进一步，所述环化步骤中的环化通过加入50％TFA终止反应。

进一步，所述普卡那肽线性粗肽与环化液的用量比为5mg：50mL。

所述环化液为0.1-1M NaCl、0.1-1M Tris-HCl、5-10mM GSH和0.5-1mM GSSG和0.1-0.5mM盐酸胍，pH值为7.5。0.1-1M NaCl是用于保证环化液的离子平衡，Tris-HCl是缓冲体系，与NaCl一起保证溶液内离子平衡和酸碱度不变，5-10mM GSH和0.5-1mM GSSG是用于氧化形成2硫键的关键，盐酸胍的作用是破坏形成好的二硫键，整个环化过程在PH7.5的缓冲体系下，GSH与GSSH的氧化还原对不断形成，盐酸胍不断破环，最终形成最稳定的二硫键构象，GSH浓度是GSSH的5倍过量，可使形成2硫键的速度大于盐酸胍破环速度，可使得最终反应完之后都是已环化的产品。

相较于其他普卡那肽合成方法来看，本发明的方法利用GSSH/GSH氧化试剂进行普卡那肽的环化，同时利用盐酸胍对错配二硫键的破坏，两者互相拮抗，最终得到正确的环化产品，是一种新的普卡那肽环化方法。同时本方法的操作步骤简单，反应条件温和易得，无需进行两步环化就可以直接得到最终产品，纯度高，产率高，大大节省成本，提高效率利于工业生产。

附图说明

图1是普卡那肽线性肽的图谱。

图2是普卡那肽线性肽主峰细分的图谱。

图3是实施例1反应3h后的产品谱图。

图4是实施例1反应12h后的产品谱图。

图5是实施例1反应24h后的产品谱图。

图6是实施例1反应24h后的细分产品谱图。

图7是实施例1反应24h后的产品谱图。

图8是实施例2的碘氧化粗肽质谱图。

图9是实施例2的碘氧化粗肽质谱图。

图10是实施例2的普卡那肽线性肽主峰细分的图谱。

图11是实施例2的普卡那肽线性肽其中一个主峰的质谱分析图。

图12是实施例2的普卡那肽线性肽其中一个主峰的质谱分析图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下附图1-6,8和10中，A为图谱，B为A的时间以及对应的保留时间和峰面积的表格图。

实施例1：

步骤一：利用wang树脂或2-CTC树脂作为固相载体，在活化剂的存在下(DIEA)，和Fmoc-Leu-OH偶联得到Fmoc-Leu-树脂；

步骤二：按照从C端到N端依次合成普卡那肽，具体步骤如下：

1.用20％的哌啶脱除Fmoc-Leu-树脂上的Fmoc保护基，得到H-Leu-树脂；

2.在活化系统(例如DIC/HOBT、EDC/HOBT、DIC/HOSu、EDC/HOSu，活化剂还可以是PyBop+DIEA,DIEA+TBTU,HATU+HOBT+N-甲基吗啉)的存在下，H-Leu-树脂和N端带Fmoc保护且侧链带保护基团的半胱氨酸比如moc-Cys(Trt)-OH(保护基团可以是R基或Trt基等基团)偶联得Fmoc-Cys(Trt)-Leu-树脂。

3.重复步骤1、2，按照普卡那肽主链按照从序列上的N端偶联至C端，依次进行其余氨基酸的偶联；得到粗肽树脂；(比如第一氨基酸为Leu，第二个氨基酸为Cys，那么先偶联完第一个氨基酸Leu，然后利用哌啶溶液脱除Leu上的Fmoc保护基团，再偶联第二个Cys，之后脱除Cys的Fmoc保护基团，再偶联后续氨基酸)。

步骤三：将得到粗肽树脂在不同比例的TFA条件下裂解，裂解条件为(三氟醋酸∶1，2-乙二硫醇∶三异丙基硅烷：茴香硫醚∶苯甲醚∶水的体积比为＝80∶5∶1∶5∶5∶4)，使得普卡那肽从树脂上脱除并脱除掉全部侧链保护基团；得到普卡那肽线性肽；其图谱见图1。可以看出，采用多肽固相合成方法按照普卡那肽序列合成得到了普卡那肽线性肽，HPLC检测结果为最大主峰为线性肽峰。再对普卡那肽线性肽主峰细分，见图2，可以看出普卡那肽线性肽主峰内并未包含多余杂质，普卡那肽线性肽合成成功。

步骤四：将得到的普卡那肽线性肽溶于水或者乙腈等有机溶剂中进行环化，溶质/水的质量体积比为0.1-1.0mg/mL，以环化5mg普卡那肽为例,环化步骤如下所示:室温下，用水配制50mL环化液(0.1-1M NaCl、0.1-1M Tris-HCl、5-10mM GSH和0.5-1mM GSSG，0.1-0.5mM盐酸胍)，调pH值到7.5，称取5mg普卡那肽线性肽，用1mL超纯水溶解。将配好的环化液转移至用锡箔纸包好的50mL管中，将溶解好的样品缓慢滴入管中，盖好离心管盖子并用封口膜封好口放入4℃冰箱，24h后加入0.5mL 50％TFA终止反应。不同反应时间HPLC图谱见图3-6。其中图3为反应3h后的产品谱图；图4为反应12h后的产品谱图；图5-7均为反应24h后的产品谱图，可以看出：4小时反应未完全，但最大主峰是普卡那肽环化峰。反应12h之后已经几乎反应完全。图6为反应24h后的细分产品谱图。可以看出开发方法未发现有错配峰，取上部接出来的主峰进行HPLC分析，未发现包含有相同分子量的峰。说明本发明的方法能一步环化，且环化出的普卡那肽错配几率小。并且由于环化体系的特殊，在反应12h左右反应完全之后持续反应也不会产生其他明显杂质。

步骤五：HPLC检测并分离纯化得到环化好的普卡那肽，冻干得到精肽。

对比例1：碘氧化方法制备普卡那肽

1.利用wang树脂或2-CTC树脂作为固相载体，在活化剂DIEA的存在下，和Fmoc-Leu-OH偶联得到Fmoc-Leu-树脂。

2.按照普卡那肽序列从C端到N端依次合成普卡那肽，其中第四位和第十二位Cys用Fmoc-Cys(Acm)-OH代替，全部合成完后，裂解冻干得到线性粗肽。

3.在液相中，碱性条件下双氧水环化第一对二硫键，之后将PH调至中性，加入碘溶液环化第二对二硫键，环化完成之后将溶液冻干得到普卡那肽粗肽。

将制备得到的普卡那肽进行HPLC检测，得到的图谱见图8-9。可以看出，碘氧化方法能得到正确分子量的普卡那肽，但是分析HPLC检测发现(图8)，主峰形状不对称，推测主峰内包含有一定杂质，而对其主峰进行质谱分析发现(图9)，主峰内只包含有一定量的氧化杂质，之后将主峰收集之后进行细分(图10)，发现主峰内包含有两个相同分子量的多肽，推测其中一个为错配峰，另一个为正确配对的普卡那肽(质谱分析如图11和12)。能获得最大主峰为分子量正确的普卡那肽环化峰，但粗肽内含有少量氧化峰，并且主峰较为粗大(初步怀疑是过载，所以后续进行了细分)。图9为碘氧化粗肽质谱图，可以看出其主峰为1681.5，是环化成功的峰，包含有少量氧化峰。

再对碘氧化法主峰进行细分：对上部结果接主峰出来进行HPLC，其HPLC检测图见图10。分析发现，该主峰内含有两个不同组分，但保留时间很接近。对两个峰进行质谱分析，发现两个峰分子量一致，为1681，推测两个峰内有一个为错配峰，图11和12为两个峰的质谱分析图。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种普卡那肽的合成方法，其特征在于，合成步骤包括：

纯化：分离纯化得到环化好的普卡那肽，冻干得到精肽。

2.如权利要求1所述普卡那肽的合成方法，其特征在于，所述溶剂为水或者有机溶剂。

3.如权利要求2所述普卡那肽的合成方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙腈。

4.如权利要求1所述普卡那肽的合成方法，其特征在于，所述环化步骤中的环化为将溶解液缓慢滴入到环化液中密封，黑暗下0-6℃放置12-24h。

5.如权利要求4所述普卡那肽的合成方法，其特征在于，所述环化步骤中的环化为黑暗下0-6℃放置20-24h。

6.如权利要求1所述普卡那肽的合成方法，其特征在于，所述环化步骤中的环化通过加入50％TFA终止反应。

7.如权利要求1所述普卡那肽的合成方法，其特征在于，所述普卡那肽线性粗肽与环化液的用量比为5mg：50mL。