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KR20100013352A - 뼈 형태발생 단백질(ｂｍｐ), ｂｍｐ 수용체 및 ｂｍｐ 결합 단백질 및 녹내장 진단 및 치료에서 그의 용도 - Google Patents

뼈 형태발생 단백질(ｂｍｐ), ｂｍｐ 수용체 및 ｂｍｐ 결합 단백질 및 녹내장 진단 및 치료에서 그의 용도 Download PDF

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KR20100013352A
KR20100013352A KR1020107001960A KR20107001960A KR20100013352A KR 20100013352 A KR20100013352 A KR 20100013352A KR 1020107001960 A KR1020107001960 A KR 1020107001960A KR 20107001960 A KR20107001960 A KR 20107001960A KR 20100013352 A KR20100013352 A KR 20100013352A
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ser
arg
glu
gly
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KR1020107001960A
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English (en)
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애보트 에프. 클라크
로버트 제이. 와딩거
Original Assignee
알콘, 인코퍼레이티드
유니버시티 오브 노스 텍사스 헬스 사이언스 센터
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Filing date
Publication date
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Abstract

본 발명은 녹내장 진단 및 치료 방법 및 그를 위한 키트를 제공한다.

Description

뼈 형태발생 단백질(ＢＭＰ), ＢＭＰ 수용체 및 ＢＭＰ 결합 단백질 및 녹내장 진단 및 치료에서 그의 용도{BONE MORPHOGENIC PROTEINS (BMP), BMP RECEPTORS AND BMP BINDING PROTEINS AND THEIR USE IN THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF GLAUCOMA}
본 발명은 녹내장 및 관련 질환을 진단 및 치료하기 위한 방법 및 시약을 개시한다.
"녹내장"은 미국 및 다른 선진국에서 비가역적 실명의 주된 원인이 되는 쇠약성 눈 질환 그룹이다. 녹내장중 가장 보편화된 형태인 원발성 개방각 녹내장(Primary Open Angle Glaucoma("POAG"))는 눈방수가 홍채와 각막사이의 공간(예: "각(angle)")을 폐쇄시키지 않고 눈을 통과(leave)하는 정상적인 능력을 폐쇄시키면서 잔기둥그물의 퇴화시키는 것을 특징으로 한다(Vaughan, D. et al.,(1992) ). 이 질환에서 상기 폐쇄의 특징은 안압을 증가시켜("IOP") 점차적으로 시력 손실을 가져오거나 적당하게 재때 치료받지 못하는 경우에는 실명을 일으킨다. 이 질환은 40세 이상의 모든 성인중 0.4% 내지 3.3%에 영향을 주는 것으로 예측된다(Leske, M. C. et al.(1986); Bengtsson, B.(1989); Strong, N. P.(1992) ). 또한, 이 질환은 75세 이상의 연령대에 널리 퍼져있다(Strong, N. P.,(1992)).
IOP 증가가 녹내장을 용이하게 측정할 수 있는 특징이기 때문에 상기 질환의 진단은 주로 안압을 측정하므로써 조사하게 된다(안압측정법)(Strong, N. P.(1992) ; Greve, M. et al.(1993) ). 불행하게도, 녹내장성 및 정상압의 범위가 중복되어 있기 때문에 그러한 방법은 다중 리딩이 수득되지 않는다면 제한된 가치를 갖는다(Hitchings, R. A. ,(1993); Tuck, M. W. et al.(1993); Vaughan, D. et al.,(1992); Vernon, S. A. ,(1993) ). 이러한 이유에서, 예를 들면, 시각신경유두를 직접 조사하고 환자의 시야 상실 범위를 결정하는 것과 같은 추가의 방법을 자주 수행하여 진단 정확도를 개선시킨다(Greve, M. et al.,(1993)).
녹내장은 눈중 3개의 상이한 조직에 작용한다. POAG와 관련된 IOP의 증가는 각막 및 홍채사이의 각에 위치하는 조직인 잔기둥그물(TM)의 형태학적 및 생화학적 변화에 기인한다. 대부분의 영양성 눈방수는 TM을 통해 앞쪽 세그먼트에 존재한다. TM 세포의 진행성 손실 및 녹내장 눈의 TM에서 세포외 조직파편의 형성으로 방수 흐름에 대한 내성은 증가하여(Lutjen-Drecoll and Rohen 1996; Rohen 1983; Rohen et al. 1993; Grierson and Calthorpe 1988), IOP은 증가하게 된다. IOP 증가, 및 허혈과 같은 다른 인자는 시신경유두(ONH)의 퇴행성 변화를 유발하여 ONH의 진행성 함몰(cupping)(Varma and Minckler 1996; Hernandez and Gong 1996; Hernandez et al. 1990; Hernandez and Pena 1997; Morrison et al. 1990) 및 망막 신경절 세포(Quigley et al. 2000; Quigley 1999; Quigley et al. 1995; Kerrigan et al. 1997) 및 축삭 손실을 일으킨다. TM, ONH, 및 망막 신경절 세포에 대하여 녹내장 손상을 초래하는 상세한 분자 기작은 공지된 바 없다.
현재 녹내장 치료법은 녹내장의 발생 및 진행의 주요 위험 요소가 되는 IOP를 저하시키는 것이다. 이 치료법은 IOP를 저하시키지만, 직접적으로 발병 기작을 처리하지는 못하여 질환은 계속 진행된다. 녹내장 환자중 적어도 50%는 진단을 받지 않았고, 이 환자가 녹내장으로 진단을 받을 때까지는 그들의 망막 신경절 세포는 이미 대략 40%가 손실된 상태이다. 따라서, 녹내장을 초기에 검출하고 진단하는 방법이 요구되고 있다.
녹내장이 중요하고 선행의 진단 방법이 적어도 부분적으로는 부적절하다는 것과 관련하여, 초기에 녹내장을 진단하는 개선되고 보다 정확한 방법이 바람직할 수 있다. 또한, 녹내장의 발병 기작을 처리하는 신규한 치료제가 바람직할 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 녹내장을 초기에 진단하는 방법 및 그를 위한 키트, 녹내장을 치료하는 방법, 및 녹내장 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법 및 그를 위한 키트를 제공하므로써 선행 기술의 단점들을 극복하였다.
특정 일면에서, 본 발명은 뼈 형태발생 단백질 패밀리 구성원 유전자중 발현이 변경된 것을 검출하여 세포 또는 채액으로부터 수득한 샘플에서 녹내장을 진단하는 방법을 제공한다. 이 방법은 통상
a) 녹내장에 걸린 것으로 의심되는 환자로부터 조직 또는 체액 샘플을 수득하고;
b) 상기 샘플로부터 DNA를 추출하고;
c) 각각 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5, 서열번호: 7, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호 : 47, 또는 서열번호: 53으로부터 18 내지 1547개의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 서열을 포함하는 복수의 PCR 프라이머를 수득하고;
d) 상기 프라이머를 사용하여 추출된 DNA 부위를 증폭시켜 PCR 산물을 수득하고;
e) PCR 산물을 분할하고;
f) 증폭된 추출 DNA의 서열과 프라이머의 서열 사이의 차이를 확인하는(여기에서, 증폭된 서열과 표준 유전자 서열 사이가 녹내장의 특징이 된다) 단계를 포함한다.
일반적으로 본 발명의 방법은 각 개체로부터 샘플을 수득하고 그 샘플로부터 DNA를 추출하는 것을 포함할 수 있다. BMP 유전자 패밀리의 특정 구성원에 대한 선별된 PCR 프라이머를 상요하여 추출된 유전자중 관련된 부위를 증폭시켜 PCR 산물을 수득한다. PCR 산물을 평가하고자 하는 특정 BMP 패밀리 유전자(추출된 DNA)의 정상 형태와 돌연변이형 상치의 DNA 서열의 차이를 효율적으로 확인하는 기술에 의해 결정한다. 서열상의 확인된 차이가 녹내장의 지표이다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 조직 또는 체액 샘플은 혈액 또는 구강 세포이다.
전형적으로, 프라이머 서열의 길이는 약 10, 15 또는 18개의 뉴클레오티디드 내지 약 20개, 또는 약 30개의 뉴클레오티디드일 것이다. 특정 일례의 경우에는 장쇄의 서열, 예로서, 40, 50, 80, 90, 95, 100, 심지어는 전장의 서열이 더욱더 바람직하다. 본 분야의 기술자에게는 길이가 적어도 약 18 내지 20개의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티디드가 분자 프로브로 유용하도록 충분히 특이적으로 하이브리젠이션하기에 충분한 것으로 허용된다[Lathe(1985), 이 목적을 위해 참고문헌으로서 특별히 인용된다). 바람직하게, 뉴크레오티드 서열은 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5, 서열번호: 7, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 47, 또는 서열번호: 53의 20 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드로 구성될 것이다. 또한, 프라이머 서열은 이미 공지되어 있는 BMP 수용체 유전자 및 BMP-결합 단백질의 서열로부터의 적어도 10, 15 또는 18개의 연속된 뉴클레오티디드의 서열로 구성될 수 있다.
서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5, 서열번호: 7, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 47, 또는 서열번호: 53중 어느 하나에 상보적인, 10, 18, 20, 30, 50, 60, 65개 이상 및 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 스트레치(stretch)을 갖는 핵산 분자이 하이브리제이션 프로브로서 유용성을 갖는다. 뉴클레오티드의 길이가 약 18개의 뉴클레오티드인 프라이머 또는 프로브가 표적 서열에 대하여 고도로 특이성인 하이브리제이션을 제공한다는 것에 대하여 본 분야의 기술자는 인지하고 있다. 단편의 전체 크기, 및 상보적 스트레치의 크기는 궁극적으로 특정 핵산 세그먼트를 사용하는 용도에 따른다. 더욱 작은 단편이 검출하고자 하는 상보적 서열에 따라 상보적 부위의 길이가 예를 들면 약 10, 18, 20 또는 30 및 약 50, 60, 70, 80, 80 또는 100개의 뉴클레오티디드, 또는 전장으로 다양할 수 있는 하이브리제이션 일례에서 통상 사용된다는 것을 볼 수 있을 것이다.
구체적으로 바람직한 일면으로, 프라이머는 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5, 서열번호: 7, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호 : 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 47, 또는 서열번호: 53으로부터 연속된 서열로 구성될 것이다. 다른 바람직한 일면으로, 프라이머는 BMP 수용체 유전자(Dijke et al. 1993; Astrom et al. 1999; Nohno et al. 1995, 모두 참고문헌으로 인용됨)) 또는 BMP-관련 유전자, 예로서, 코딘(NCBI NM-029130), 그렘린(Murphy et al. 1999; McMahon et al. 2000), 폴리스타틴(NCBI NM003892) 또는 밤비(NCBI Nu005791)로부터의 연속된 서열로 구성될 것이다. 가장 바람직하게, 프라이머는 서열번호: 3으로부터의 연속된 서열로 구성될 것이다. 특정 일면으로, 프라이머중 적어도 일부는 추가로 검출가능한 표지를 포함할 수 있다.
다른 일면으로, 본 발명은 BMP2 작용제, BMP4 작용제, BMP5 작용제, BMP7 작용제, Smad 1/5 작용제, 코딘 길항제, 그렘린 길항제 및 폴리스타틴 길항제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 조성물을 그를 필요로 하는 환자에 투여하여 녹내장을 치료하는 방법을 제공한다.
추가의 일면으로, 본 발명은 녹내장 치료예를 확인하는 방법을 제공한다. 예를 들면,
a) BMP-2A, BMP4, BMP-5, 또는 BMP7을 발현시키는 재조합 세포 집단을 포함하는 제 1 조성물을 수득한고;
b) 후보 물질을 수득하고;
c) 조성물과 후보 물질을 인큐베이션 시키고;
BMP-유도 Smad 신호전달 경로 및/또는 BMP-조절 유전자 발현을 개시시키는 조성물의 능력에 대하여 시험하고;
BMP의 이들 하류 작용을 저해하거나 자극하는 후보 물질을 확인하여 치료제를 확인할 수 있다.
본 발명의 또다른 일면은 단백질, 펩티드 또는 그의 항체와 결합하는 연결된 검출가능한 표지와 같은 적절한 시약 및 본 발명의 서열을 포함하는 진단용 키트이다. 다르게는, 검출 가능한 표지는 본 발명의 서열과 특이적으로 하이브리젠이션하는 제 2 서열와 결합할 수 있다.
관련된 일면은 본 명세서에 기술된 핵산 서열 또는 펩티드 또는 단백질 서열의 약제학적으로 허용가능한 제제를 포함하는 치료용 키트를 포함한다. 이 키트는 녹내장 진단을 위한 임상 샘플에서 BMP 유전자 및 단백질의 변경된 발현을 검출하는데 유용하다.
BMP/Smad 신호전달 경로는 수개의 기작에 의해 음성적으로 조절된다. 특정 BMP-결합 단백질(예: 그렘린, 밤비, 또는 폴리스타틴)은 BMPs에 결합하여 BMP 수용체와의 상호작용을 저해한다. 또한, 저해성 Smad 단백질(예를 들면, Smad 6 및 Smad 7)이 존재하고, 이는 BMP 수용체에 결합하고 불활성화시킨다(Kowabata et al. 1998; Itoh et al. 2000; Miyazono 2000). 본 발명자들은 인간 TM 세포, ONH 성상 세포 및 사상판 세포가 BMP 수용체 컴플렉스에 대한 메세지 및 단백질을 발현시킨다는 것을 발견하게 되었다. 따라서, 이들 세포는 내인성 BMP 리간드에 반응할 수 있다.
도면은 본 명세서의 일부를 형성하며 본 발명의 특정 일례를 설명하기 위하여 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 제히한 특정 일례의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 도면을 참고로 하여 더욱 잘 이해될 수 있다.
도 1. BMP2A의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열
도 2. BMP4의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열
도 3. BMP5의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열
도 4. BMP7의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열
도 5. 뼈 형태발생 단백질 신호전달 경로. 뼈 형태발생 단백질(BMP) 이합체는 세린/트레오닌 키나제이며, BMP 수용체 1 및 2로 구성된 막 컴플렉스에 결합한다. 조절 Smads(Smadl/Smad5)는 인산화되고 공-Smad(Smad 4)와 결합한다. 이렇게 생성된 Smad 컴플렉스는 핵내로 들어가 전사인자(TF)와 결합하고 유전자 발현을 조절한다. BMP-결합 단백질은 BMP에 결합하고 BMP 수용체와 BMP가 상호작용하지 못하도록 하므로써 BMP 길항제로서 작용한다.
도 6. 인간 TM 세포 및 조직에서의 BMP 발현. 인간 TM 세포(레인 1-5) 및 조직(레인 6-7)에서의 BMP 발현에 대한 RT-PCR 분석으로부터 형성된 cDNA 샘플로부터의 BMP PCR 산물의 에티디움 브로마이드-염색된 아가로스 겔. L = 염기쌍 마커. C = PCR 음성 대조군 레인. β-액틴을 양성 RT-PCR 내부 대조군으로서 사용하였다.
도 7. 인간 TM 세포 및 조직에서의 BMP 수용체 발현. 인간 TM 세포(레인 1-5) 및 조직(레인 6-7)에서의 BMP 수용체 발현에 대한 RT-PCR 분석으로부터 형성된 cDNA 샘플로부터의 PCR 산물의 에티디움 브로마이드-염색된 아가로스 겔. L = 염기쌍 마커. C = PCR 음성 대조군 레인. β-액틴을 양성 RT-PCR 내부 대조군으로서 사용하였다.
도 8. 인간 ONH 성상 세포, ONH 조직, 및 인간 뇌 성상 세포에서의 BMP 발현. 인간 ONH 성상 세포(레인 1-5), ONH 조직(레인 6), 및 인간 뇌 성상 세포(레인 7)에서의 BMP 발현에 대한 RT-PCR 분석으로부터 형성된 cDNA 샘플로부터의 PCR 산물의 에티디움 브로마이드-염색된 아가로스 겔. L = 염기쌍 마커. C = PCR 음성 대조군 레인. β-액틴을 양성 RT-PCR 내부 대조군으로서 사용하였다.
도 9. 인간 사상판 세포주에서의 BMP 발현. 인간 사상판(레인 1-9)의 RT-PCR 분석으로부터 형성된 cDNA 샘플로부터의 PCR 산물의 에티디움 브로마이드-염색된 아가로스 겔. L = 염기쌍 마커. C = PCR 음성 대조군 레인. β-액틴을 양성 RT-PCR 내부 대조군으로서 사용하였다.
도 10. 인간 ONH 성상 세포, ONH 조직, 및 인간 뇌 성상 세포에서의 BMP 수용체 발현. 인간 ONH 성상 세포(레인 1-5), ONH 조직(레인 6), 및 인간 뇌 성상 세포(레인 7)에서의 BMP 수용체 발현에 대한 RT-PCR 분석으로부터 형성된 cDNA 샘플로부터의 PCR 산물의 에티디움 브로마이드-염색된 아가로스 겔. L = 염기쌍 마커. C = PCR 음성 대조군 레인. β-액틴을 양성 RT-PCR 내부 대조군으로서 사용하였다.
도 11. 인간 사상판 세포주에서의 BMP 수용체 발현. 인간 사상판(레인 1-9)의 RT-PCR 분석으로부터 형성된 cDNA 샘플로부터의 PCR 산물의 에티디움 브로마이드-염색된 아가로스 겔. L = 염기쌍 마커. C = PCR 음성 대조군 레인. β-액틴을 양성 RT-PCR 내부 대조군으로서 사용하였다.
도 12. 배양된 인간 TM 세포, 시신경 유도 성상세포(ONA), 및 사상판 세포에서 BMP 및 BMP 수용체 발현의 웨스턴 블랏. 인간 잔기둥그물 세포(레인 1-2), ONH 성상 세포(레인 3-4), 및 사상판 세포(레인 5- 6)에서의 BMP 단백질 및 BMP 수용체의 화학발광 검출. 단백질 크기는 kDa로 표시.
도 13. 인간 TM 세포에서의 BMP 결합 단백질 mRNA 발현. 인간 TM 세포(레인 1-5)의 RT-PCR 분석으로부터 형성된 cDNA 샘플로부터의 PCR 산물의 에티디움 브로마이드-염색된 아가로스 겔. L = 염기쌍 마커. C = PCR 음성 대조군 레인. β-액틴을 양성 RT-PCR 내부 대조군으로서 사용하였다.
도 14. 인간 사상판 세포 및 ONH 성상 세포에서의 BMP 결합 단백질 mRNA 발현. 사상판(LC) 세포(레인 1-7) 및 ONH 성상 세포(ONA)(레인 8-11)의 RT-PCR 분석으로부터 형성된 cDNA 샘플로부터의 PCR 산물의 에티디움 브로마이드-염색된 아가로스 겔. L = 염기쌍 마커. C = PCR 음성 대조군 레인. β-액틴을 양성 RT-PCR 내부 대조군으로서 사용하였다.
도 15. 녹내장 TM 세포에서 BMP 길항제 그렘린(CKTSF1B1)의 발현 증가를 나타낸다. 유전자 발현은 Affymetrix 유전자 어레이(Affymetrix 유전자 칩 U133A)을 사용하여 평가하였다.
정상적인 수성 체액의 흐름에 있어 잔기둥그물이 중요한 역할을 한다고 제안되었고, 녹내장 눈에서 중요한 유출 저항 부위인 것으로 가정되고 있다. 인간 잔기둥그물(HTM) 세포는 눈방수가 눈으로부터 유출되도록 하는 방수유출로를 가득 채우는(line) 분화된 세포이다. 이 세포의 합성 작용의 변형이 POAG, 스테로이드성 녹내장, 및 다른 유형의 녹내장의 발병에 관여할 수 있다.
수년간 집중적으로 연구하였지만, 눈에 대하여 녹내장 손상을 초래하는 중요한 분자 기작은 알려지지 않았다. 최근 연구를 통해 성장 인자는 녹내장과 관련된 눈 조직에서 정상적인 항상성을 유지시키는데 중요하고, 성장 인자/성장 인자 수용체의 변형이 녹내장 발병에 중요한 역할을 하다고 제시되었다. 성장 인자은 세포 성장 및 분화를 조절하는 거대 폴리펩티드 패밀리이다. 이들 분자, 및 뉴트로핀/신경성 인자 및 그의 수용체(Liu et al. 2001; Wordinger et al. 2000)는 유전자 발현, 세포외 기질 조성 및 분해, 세포골격 조직화, 및 세포 기능 조절에 대하여 세포 특이성 다양하게 영향을 미친다(Tripathi et al. 1993a; Tripathi et al. 1993b; Tripathi et al. 1994a; Tripathi et al. 1994b; Wordinger et al. 1998; Wordinger et al. 1999). 2개의 시신경 유두 세포형태인 ONH 성상 세포 및 사상판 세포는 성장 인자, 뉴트로핀 및 그의 수용체를 발현시킨다(Lambert et al. 2001; Pena et al. 1999). 또한, 눈방수는 다양한 성장 인자, 예를 들면 FGF2, EGF, TGF , HGF(Tripathi et al. 1996; Tripathi et al. 1991; Tripathi et al. 1992; Hu and Ritch 2001) 및 뉴트로핀(Chundru et al. 2000)을 포함한다. POAG 환자의 경우 눈방수 TGF -2 및 HGF의 수준이 증가되었다고 보고되었다(Tripathi et al. 1994c; Inatani et al. 2001; Picht et al. 2001). 성장 인자는 정상적인 TM 및 ONH의 발생 및/또는 작용을 변형시킴으로써 녹내장에 관여할 수 있다.
본 발명은 뼈 형태발생 단백질(BMP)이 뼈 및 연골 형성을 유도할 뿐만 아니라, 여러 형태의 세포에 대하여 광범위한 효과를 갖는 다기능성 사이토카인이고(Hogan 1996; Reddi 1997) 인간 잔기둥그물(HTM) 및 시신경유두(ONH) 세포 모두에 의해 발현된다는(Wordinger et al. 2002) 인식으로부터 부분적으로 유래한다. BMP는 TGFβ 슈퍼패밀리의 구성원이고; 인간에는 대략 15-20개의 BMPs 유전자, 3개의 BMP 수용체, 및 BMP 길항제로서 작용하는 다수의 BMP 결합 단백질이 존재한다(Yamashita et al. 1996). BMPs는 BMPR-I 및 BMPR-II로 구성된 BMP 수용체 컴플렉스를 통해 신호를 전달한다. 슈퍼패밀리 구성원 TGFβ 및 TGFβR(Agarwal et al. 1997; Lambert et al. 1997) 및 GDNF 및 GDNFR(Wordinger et al. 1999; Liu et al. 1999) 은 HTM 및 ONH 세포 모두에 의해 발현된다고 보고되었다.
BMPs 및 BMP 수용체는 눈 조직에서 발현되지만(Obata et al. 1999; You et al. 1999), 상기 보고는 눈 발달에 대하여 중점을 두고 있다. 마우스에서 BMPs를 코딩하는 유전자를 표적하여 파괴하는 것이 망막 및 수정체에서 심각한 발달 결합을 유발시키기 때문에 BMPs의 작용은 눈 발달에 있어 중요하다(Jena et al. 1997 ; Luo et al. 1995; Dudley et al. 1995). BMP-2, BMP-4 및 BMP-7은 수정체 및 망막 발달에 관여한다(Jena et al. 1997; Furuta and Hogan 1998; Reddi 2000; Trousse et al. 2001). BMP-6 및 BMP-7은 또한 저혈당 또는 허혈성 손상(Nonner et al. 2001; Liu et al. 2001)으로부터 신경세포를 보호하는데 중요한 작용을 하며, BMP2는 신경절세포 뉴트로핀 발현을 증진시키는 것으로 나타났다(Zhang et al. 1998). Bmp4에 대하여 단수불충분한(haploinsufficient) 이형접합 넉-아웃 마우스는 앞쪽 세그먼트 발생장애, IOP 증가, 및 시신경 이상을 포함하는 눈 표현형을 갖는다(Chang et al. 2001). 인간의 출생후의 눈에 있어 BMPs의 기능과 관련하여 공개된 정보는 매우 제한되어 있다.
Mohan과 그의 동료들은(1998) BMP-2 및 BMP-4 및 BMP 수용체가 성인의 각막 세포에서 발현된다고 보고하고, BMP 기능은 각막세포 증식 및 괴사를 포함할 수 있다고 제안하였다. You와 그의 동료들은(1999) 이 연구를 입증하고 생체밖 및 배양된 간질세포에서 BMP-3, BMP-5, 및 BMP-7 발현을 보고하였다. BMP 전사 수준은 간질세포에서 더욱 높았지만 수용체에 대한 수준은 배양된 각막 상피 세포에서 더욱 높았다고 보고하였다.
RT-PCR을 사용하여, 본 발명자들은 HTM, 사상판(LC) 및 ONH 성상 세포 세포주 및 조직에서 BMPs, BMP 수용체 BMPR-IA, BMPR-IB 및 BMPR-II에 대한 mRNAs, 및 BMP 결합 단백질 그렘린, 코딘, 폴리스타틴, 및 밤비를 발견하였다(Wordinger et al. 2002). 또한 본 발명자들은 HTM 및 ONH 세포가 단백질 BMP-2, BMP-4, BMP-5 및 BMP-7을 발현시킨다는 것을 발견하게 되었다.
녹내장은 신호전달 패밀리(signaling 패밀리) 구성원의 유전자들의 유전자 변형을 특징화여 진단될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바, 어구 "뼈 형태발생 단백질 패밀리 구성원 유전자" 및 "BMP 신호전달 패밀리"는 BMPs, BMP 수용체 및 결합 단백질을 포함한다. 용어 "유전자 변형"은 본 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 특정 유전자의 유전자 변형과 관련된 다숭의 질환 예가 있다(예: 참조 Cummings 1997; Strachan, et al. 1996; Jorde, et al. 1999). 특정 유전자의 유전자 변형(예: BMP)은 본 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있는 다양한 기술, 예를 들면, 단일 가닥 입체 다형(single strand conformation polymorphism, SSCP), 변성 농도 구배 겔 전기영동 (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE), 대립유전자 특이성 올리고뉴클레오티드 (allele specific oligonucleotide, ASO), 제한 단편 길이 다형(restriction fragment length polymorphism, RFLP), 헤테로이중(heteroduplex) 분석, CCM, PTT, 및 RNase 절단(참조 Birren, et al. 1998)을 사용하여 측정할 수 있다.
녹내장은 눈에서 하나 이상의 BMP 패밀리 유전자의 발현이 변형되므로써 유발될 수 있고, 이는 IOP를 증가시키고/거나 녹내장 시각신경병증을 일으킨다. "변형된 BMP 유전자 발현"은 정상적인 것과는 상이한 유전자 사물의 발현을 의미한다. 이 용어는 또한 유전자 또는 단백질의 서열의 변형을 언급할 수 있다. 정상 BMP 유전자는 잘 특징화되어 있고(상기 참조) BMP 발현은 TM 및 ONH를 포함하는 다양한 조직에 보고되어 있다. BMP 패밀리 유전자중 코딩 부위의 유전자 변형은 이들 단백질의 기능을 변형시킬 수 있다. 코딩 부위외의 유전자 변형 또한 녹내장을 유발할 수 있다.
특정 유전자중 "코딩 부위외의 유전자 변형"은 유전자 발현의 조절에 있어 중요하다고 본 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 대부분 유전자의 코딩 부위의 상류 부위(5')는 상기 유전자의 발현을 "프로모터"하고 조절하는 프로모터 유전자로서 공지되어 있다. 프로모터 부위는 유전자 발현을 활성화시키거나 억제시키는 DNA 결합 단백질 및 다양한 전사 인자에 의해 인지되는 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 유전자의 하류 부위(3')은 유전자 산물의 폴리-아데닐화를 결정하여, RNA 프로세싱을 조절하고 유전자 산물을 해독할 수 있다.
녹내장의 지표가 되는 유전자 서열상의 BMP 유전자의 변형된 발현 및 돌연변이는 본 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있는 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들면, 바람직하게는 의도하는 프로토콜에서 제조 및 사용의 용이성에 의해 제한되는 바, 전장을 포함하여 모든 길이의 핵산 단편을 사용할 수 있음을 고려한다. 본 명세서에 기술된 핵산 서열은 핵산은 하이브리제이션 일례에서 프로브 또는 프로브로서의 유용성을 가질 수 있다. 예를 들면, BMP-2A(서열번호: 1), BMP-4(서열번호: 3), BMP-5(서열번호: 5), BMP-7(서열번호: 7), BMP-RIA(서열번호: 37), BMP-RIB(서열번호: 39), BMP-RII(서열번호: 41), 코딘(서열번호: 43), 그렘린(서열번호: 45), 폴리스타틴(서열번호: 47), 또는 밤비(서열번호: 53)의 14개의 뉴클레오티드의 연속된 서열과 동일한 서열을 갖거나, 그와 상보적인 적어도 14개의 뉴클레오티드의 연속된 서열로 구성된 서열 부위를 포함하는 핵산 세그먼트가 특정 유용성을 갖는다는 것을 고려한다. 예를 들면, 약 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000개의 뉴클레오티디드(중간 길이의 것 모두 포함), 및 약 1547개의 뉴클레오티디드(BMP-2A), 1946개의 뉴클레오티디드(BMP-4), 2153개의 뉴클레오티디드(BMP-5) 및 1878개의 뉴클레오티디드(BMP-7), 2932개의 뉴클레오티디드(BMP-RIA), 2032개의 뉴클레오티디드(BMP-RIB), 3611개의 뉴클레오티디드(BMP-RII), 3561개의 뉴클레오티디드(코딘), 4049개의 뉴클레오티디드(그렘린), 1386개의 뉴클레오티디드(폴리스타틴), 및 1523개의 뉴클레오티디드(밤비)의 전장의 서열과 일치하거나 이와 상보적인 장쇄의 연속된 서열 또한 특정 일면에서 유용할 것이다.
이 문맥에서 "중간 길이"는 인용 범위 사이의 어느 길이, 예를 들면, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 등.; 21, 22, 23, 등; 30, 31, 32, 등.; 50, 51, 52, 53, 등; 100, 101, 102, 103, 등; 150, 151, 152, 153, 등; 200-500; 500-1,000; 1,000-2,000 범위의 모든 정수, 및 2,001, 2002, 2050, 2051개 등의 서열을 의미할 수 있음을 용이하게 이해할 것이다.
상기 핵산 프로브 및 프라이머가 BMP 코딩 서열과 특이적으로 하이브리제이션할 수 있는 능력 및 프라이머가 BMP 서열을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 능력을 통해 제공된 샘플에서 상보적인 서열의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 돌연변이종 프라이머, 다른 유전자 작제물을 제조하기 위하여 사용하는 프라이머에 대한 서열 정보의 사용을 포함하는 다른 용도도 포함한다.
BMP-2A(서열번호: 1), BMP-4(서열번호: 3), BMP-5(서열번호: 5), BMP-7(서열번호: 7), BMP-RIA(서열번호: 37), BMP-RIB(서열번호: 39), BMP-RII(서열번호: 41), 코딘(서열번호: 43), 그렘린(서열번호: 45), 폴리스타틴(서열번호: 47), 또는 밤비(서열번호: 53)와 동일하거나 그와 상보적인 10, 20, 30, 50개, 또는 100-200개의 뉴클레오티디드의 연속된 뉴클레오티드 스트레치로 구성된 서열 부위를 갖는 핵산 분자는 서던 및 노던 블랏팅외에도 SNP 평가 및 고체상 하이브리제이션 어세이에서 사용하기 위한 하이브리제인션 프로브로서도 특히 고려되고 있다. 이는 조직 및 세포 모두에서 BMP 구조 또는 조절 유전자 분석을 가능케 한다. 단편의 전체 크기, 및 상보적인 스트레치(들)의 크기는 궁극적으로 특정 핵산 세그먼트를 사용하는 용도에 의존하다. 단쇄의 단편은 통상 연속된 상보적인 부위의 길이가 예를 들면, 약 10 내지 100개의 뉴클레오티드로 다양할 수 있는 하이브리제인션 이례에서 사용될 것이지만, 약 1547개의 뉴클레오티디드(BMP-2A), 1946개의 뉴클레오티디드(BMP-4), 2153개의 뉴클레오티디드(BMP-5) 및 1878개의 뉴클레오티디드(BMP-7), 2932개의 뉴클레오티디드(BMP-RIA), 2032개의 뉴클레오티디드(BMP-RIB), 3611개의 뉴클레오티디드(BMP-RII), 3561개의 뉴클레오티디드(코딘), 4049개의 뉴클레오티디드(그렘린), 1386개의 뉴클레오티디드(폴리스타틴), 및 1523개의 뉴클레오티디드(밤비)의 상보적인 장쇄의 연속된 스트레치는 검출하고자 하는 길이의 상보적인 서열에 따라 사용될 수 있다.
길이 약 10-14개의 뉴클레오티디드의 하이브리제이션 프로브를 사용하여 안정적이고 특이성인 이중나선 분자를 형성할 수 있다. 하이브리드의 안정성 및 특이성을 증가시켜 수득된 특정 하이브리드 분자의 질 및 정도를 개선시키기 위하여 길이가 10개 염기 이상인 스트레치에 대하여 상보적인 연속된 서열을 갖는 분자가 통상 바람직하지만 15 내지 20개의 연속된 뉴클레오티드, 또는 원하는 경우 그보다 장쇄의 유전자-상보적인 스트레치를 갖는 핵산 분자를 고안하는 것이 바람직하다.
하이브리제이션 프로브는 본 명세서에 기술된 어느 서열중 어느 일부로부터 선택될 수 있다. 모든 요구되는 것은 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5, 서열번호: 7, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 47 또는 서열번호: 53에 기재된 서열을 리뷰하고 프로브 또는 프라이머로서 사용하고자 하는, 전장 서열을 포함하는 길이가 약 10개의 뉴클레오티드인 서열중 어느 연속 부위를 선택하는 것이다. 프로브 및 프라이머 서열을 선택하는 것은 다양한 요소에 의해 제한될 수 있고, 단지 예로서, 추가의 DNA를 증폭시키기 위하여 전체 서열의 말단쪽, 또는 기능성 영역-코딩 서열의 말단으로부터 프라이머를 사용할 수 있다.
BMP-2A(서열번호: 1), BMP4(서열번호: 3), BMP- 5(서열번호: 5), BMP7(서열번호: 7), BMP-RIA(서열번호: 37), BMP-RIB(서열번호: 39), BMP-RII(서열번호: 41), 코딘(서열번호: 43), 그렘린(서열번호: 45), 폴리스타틴(서열번호: 47), 또는 밤비(서열번호: 53)내 연속된 서열을 포함하는 핵산 세그먼트를 선별하고, 제조하는 방법은 핵산 단편을 제조하는 것과 같이 기술될 수 있다. 물론, 기계적 절단 또는 제한 효소 분해와 같은 다른 기술에 의해 단편을 수득할 수 있다. 작은 핵산 세그먼트 또는 단편은 통상 자동 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 실시하기 때문에 예를 들면, 화학적 수단에 의해 단편을 직접 합성하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 단편은 U. S. Pat. No. 4,683, 202 및 U. S. Pat. No. 4,682, 195(각각 참조문헌으로 인용됨)의 PCRTM 기술과 같은 핵산 재생 기술을 사용, 선별된 서열을 재조합 생산용 재조합 벡터내로 도입, 분자 생물학 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있는 다른 재조합 DNA 기술에 의해 수득할 수 있다.
따라서, 본 발명의 뉴크레오티드 서열은 BMP 유전자s 또는 또는 cDNAs의 상보적인 스트레치와 특이적으로 이중나선 분자를 형성하는 능력에 대하여 사용될 수 있다. 포함된 목적에 따라, 다양한 정도의 하이브리제이션 특이성을 사용하여 다양한 정도의 표적 서열에 대한 프로브의 특이성을 성립시키는 것이 바람직할 것이다.고도의 특이성을 요하는 경우, 전형적으로는 하이브리드를 형성하는 상대적으로 엄격한 조건을 사용하는 것이 바람직하고, 예를 들면, 상재적으로 낮은 염도 및/또는 높은 온도 조건, 예를 들면, 0.02M-0.15M의 NaCl, 50℃ 내지 70℃가 선택될 것이다. 이러한 선택 조건은 있다면 주형 또는 표적 스트랜드와 프로브 사이의 불일치는 거의 허용하지 않으며 이는 BMP 유전자 조사에 특히 적절할 것이다.
물론, 기본이 되는 주형에 하이브리제이션된 돌연변이 프라이머 스트랜드를 사용하여 돌연변이체를 제조하거나 확인하고자 하는 경우, 또는 관련 종, 기능성 동등물 등으로부터 BMP 코딩 서열을 분리하고자 하는 경우와 같은 일부 사용에 있어서는 헤테로이중나성을 형성하기 위하여 다소 덜 엄격한 하이브리제니션 조건이 요구될 것이다. 이러한 조건하에서는 예를 들면, 0.15M-1.OM의 염, 20℃ 내지 55℃ 범위의 온도와 같은 조건을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 교차-하이브리제이션 종은 하이브리제이션을 조정하는 것과 관련하여 양성 하이브리제이션 시그날로서 용이하게 확인될 수 있다. 이러한 경우, 조건은 NaCl 농도를 감소시키거나 포름아미드양을 증가시켜 더욱 엄격하게 하여 승온하에서도 동일한 방식으로 하이브리드 이중나선을 탈안정화시킨다는 것을 이해하게 될 것이다. 따라서, 하이브리제이션 고전은 용이하게 조작될 수 있고, 통상 원하는 결과에 따라 선택될 것이다.
특정 일례로, 적절한 수단, 예로서, 하이브리제이션 츠정용 표지와 결합시켜 본 발명의 핵산 서열을 사용하는 것이 유익할 것이다. 광범위하게 적절한 지표 수단은 본 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 형광, 방사능 효소 또는 다른 리간드, 예로서 아비딘/바이오틴을 포함하며, 이는 검출가능한 시그날을 제공할 수 있다. 바람직한 일면으로, 다른 환경적으로 바람직하지 못한 시약이나 방사능을 대신하여 형광 표지 또는 효소 태그, 예로서 우레아제, 알칼리성 포스포타아제 또는 퍼옥시다제을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 효소 태그의 경우, 비색 지표 기질은 인간의 눈으로 볼 수 있거나, 분광광도법으로 볼 수 있는 수단을 제공하고, 상보적인 핵산을 포함하는 샘플와 특이적 하이브리제이션을 확인하기 위하여 사용될 수 있다고 공지되어 있다.
통상, 본 명세서에 기술된 하이브리제이션 프로브는 용액 하이브리제이션 및 고체상을 사용하는 일면 모두에서 시약으로서 유용할 것이다. 고체상을 포함하는 일면에서, 시험 DNA(또는 RNA)는 흡착되거나 다르게는 선택된 기질 또는 표면에 부착된다. 부착된 이 싱글-스트랜드 핵산을 바람직한 조건하에서 선별된 프로브와 특이적으로 하이브리제니션시킨다. 이 선택되는 조건은 요구되는 특정 요건에 기초한 특정 환경에 따른다(예로서, G+C 함량, 표적 핵산 유형, 핵산 공급원, 하이브리제이션 프로브 크기, 등). 비특이적으로 결합한 프로브 분자를 제거하기 위하여 하이브리제이션된 표면을 세척한 후, 특이적인 하이브리제이션을 검출하거나 표지에 의해 측량한다.
본 발명은 또한 BMP-2A(서열번호: 1), BMP4(서열번호: 3), BMP-5(서열번호: 5), BMP7(서열번호: 7), BMP-RIA(서열번호: 37), BMP-RIB(서열번호: 39), BMP-RII(서열번호: 41), 코딘(서열번호: 43), 그렘린(서열번호: 45), 폴리스타틴(서열번호: 47), 또는 밤비(서열번호: 53)의 특정 핵산 및 아미노산 서열로 제한하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 재조합 벡터 및 분리된 DNA 세그먼트는 다양하게 BMP 코딩 부위 그 자체, 상기 유전자의 상류 또는 하류 부위, 기본 코딩 부위중 선택된 변형 또는 변이를 포함하는 코딩 부위를 포함할 수 있거나, BMP 코딩 부위도 포함하는 거대 폴리펩티드를 코딩할 수 있거나 변이체 아미노산 서열을 갖는 생물학적으로 기능상 동등한 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
본 발명의 DNA 세그먼트는 생물학적으로 기능상 동등한 BMP 단백질 및 폴리펩티드를 포함한다. 그러한 서열은 핵산 서열내에서 자연발생되고 그렇게 코딩된 단백질에 대하여 알려져 않은 코돈 중복성 및 기능상 일치성의 결과로서 발생할 수 있다. 다르게는, 기능적으로 동등한 단백질 또는 폴리펩티드는 교환하고자 하는 아미노산의 성질을 고려하여 단백질 구조상의 변형를 조작하는 재조합 DNA 기술을 사용하므로써 형성될 수 있다. 인공적으로 작제된 변형은 특정부위 돌연변이 유발 기술을 도입하여, 예를 들면, 단백질의 항원성에 대한 개선점을 도입하거나 분자 수준으로 결합 활성을 조사하기 위하여 BMP 돌연변이체를 시험할 수 있다.
녹내장 치료제는 하나 이상의 눈 BMP 경로에 작용하는 펩티드 또는 단백질, 펩티드 모방체(mimetic), 올리고뉴클레오티드 또는 유도된 올리고뉴클레오티드, 또는 작은 약물양(drug-like) 분자일 수 있다. 바람직한 치료제는 (1) BMP2, BMP4, BMP5, 또는 BMP7 작용제;(2) 코딘, 그렘린, 폴리스타틴, 또는 밤비 길항제; 및/또는(3) Smadl, Smad5 및/또는 Smad4 작용제이다.
약제는 본 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있는 기술에 따라 눈에 직접적으로 투여될 수 있거나(예: 국소용 점안제 또는 연고; 막힌관내 저속 방출 장치 또는 공막 인접하게 또는 눈안에 삽입된 저속 방출 장치; 눈주변, 결막, 서브-테논스(sub-Tenons), 앞방내주사 또는 유리체내 주사) 또는 비경구(예: 경구; 정맥내, 피하 또는 근육내 주사; 진피 투여; 등 ) 투여될 수 있다. 하기는 본 발명에 의해 예시되는 가능한 제제의 예이다.
(a) 국소 안과용 제제 wt. %
눈 BMP-4 발현을 증가시키는 약제 0.01-2
HPMC 0. 5
염화나트륨 0.8
BAC 0. 01%
EDTA 0.01 NaOH/HCl pH 7.4까지
정제수 100 mL까지
(b) 국소 안과용 제제 wt. %
그렘린 길항제 0.01-2
HPMC 0. 5
염화나트륨 0.8
BAC 0.01
EDTA 0.01 NaOH/HCl pH 7.4까지
정제수 100 mL까지
(c) 국소 안과용 제제 wt. %
Smad 1/5 작용제 0.01-2
HPMC 0. 5
염화나트륨 0.8
BAC 0. 01%
EDTA 0.01 NaOH/HCl pH 7.4까지
정제수 100 mL까지
본 발명의 화합물은 눈속 삽입 장치로서 제형화될 수 있음을 고려한다.
A. 치료제 분석
본 발명은 또한 BMP 신호전달 경로(참조 도 5)에 관여하는 신규한 항-녹내장 치료제를 발견하는데 유용하다. 특이적인 BMP 리간드는 I형 BMP 및 II형 세린/트레오닌 키나제 수용체(BMP-RI 및 BMP-RII)에 결합하고 Smad 단백질을 통해 시그날을 유도한다. BMP 시그날은 단백질-단백질 및 단백질-DNA 상호작용(Attisano and Tuen Lee- Hoeflich 2001)을 통해 Smads에 의해 전달된다. 조절 Smad 1 및 Smad 5는 리간드 결합 BMP 수용체에 의해 활성화된다(인산화에 의해)(von Bubnoff and Cho 2001). 이어서 이 조절 Smads는 Smad 4와 상호작용하여 헤테로다이머 컴플렉스 를 형성하게 되고 이는 핵으로 이동한다. 이 컴플렉스는 핵의 공-인자의 존재에 따라 이 전사 컴플렉스를 인식하는 특이적인 유전자의 전자슷 활성화시키거나 억제시킬 수 있다.
BMP/Smad 신호전달 경로는 수개의 기작에 의해 음성적으로 조절된다. 특정 BMP-결합 단백질(예: 그렘린, 밤비, 또는 폴리스타틴)은 BMPs에 결합하여 BMP 수용체와의 상호작용을 저해한다. 또한, 저해성 Smad 단백질(예를 들면, Smad 6 및 Smad 7)이 존재하고, 이는 BMP 수용체에 결합하고 불활성화시킨다(Kowabata et al. 1998; Itoh et al. 2000; Miyazono 2000). 본 발명자들은 인간 TM 세포, ONH 성상 세포 및 사상판 세포가 BMP 수용체 컴플렉스에 대한 메세지 및 단백질을 발현시킨다는 것을 발견하게 되었다. 따라서, 이들 세포는 내인성 BMP 리간드에 반응할 수 있다.
다양한 방법을 사용하여 신규한 항-녹내장 치료제를 발견하게 되었고, 이들 기술은 본 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 펩티드 또는 BMPs의 작용제 또는 저해제로서 작용하는 펩티드 모방제를 BMP/BMP 수용체 구조물을 분자적으로 모델링하여 발견하게 되었다(Nickel et al. 2001). BMP 시그날 트랜스덕션은 특이적인 Smad 단백질s 세트를 포함한다(Kawabata et al. 1998; Itoh et al. 2000; Attiseno et al. 2000). 특이적인 BMP 작용제s 및 Smad 작용제s는 세포 기초 에세이를 사용하여 발견할 수 있다. 시험 세포는 적절한 BMP 수용체(들)을 발현시켜야 하고 적절한 BMP 신호전달 경로를 가져야 한다. BMP 신호전달의 중요한 효과중 하나가 유전자 발현의 변형이기 때문에, BMP 작용제s 및 Smad 작용제s는 BMP-유도 유전자를 선별하므로써 발견할 수 있다. BMP 조절 유전자의 유도는 또한 측량 RT-PCR(Wang et al. 2001), DNA 마이크로어레이, 또는 수용체 유전자 작제물을 사용하여 mRNA 수준을 측량하므로써 분석할 수 있다. 자연발생된 BMP 신호전달의 저해제인, BMP 결합 단백질(also known as BMP-결합 단백질로서 공지됨), 예로서 코딘, 그렘린, 및 폴리스타틴이 존재한다. 단백질 저해제의 길항제는 리간드 결합 분석을 사용하여 발견할 수 있다. 예를 들면, 시험 약물을 재조합 정제된 그렘린에 가하고 그렘린에 결합한 이 약물은 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 다양한 기술을 사용하여 확인한다. 이 약물이 그렘린 길항제인지 여부를 결정하기 위하여 상기 기술한 방법과 유사한 세포 기초 에세이를 사용한다.
어느 공지된 시험관내 및 생체내 선별 방법을 BMP 패밀리 유전자에 대한 신규한 녹내장 치료법을 확인하기 위한 본 발명과 함께 사용할 수 있음을 고려한다. 이 모델은 본 분야의 기술자에게 공지되어 있고 이는 루틴한 것이다. BMP, BMPR, 및/또는 BMP 결합 단백질 유전자 산물의 구조/기능상의 정보에 기초하여 작은 펩티드 또는 펩티드 모방제를 디자인할 수 있다. 리간드 결합 에세이를 사용하여 BMPs, BMPRs, 또는 BMP 결합 단백질에 결합하는 작은 분자를 검출할 수 있다. 세포 기초 에세이를 통해 BMP 신호전달 경로에 대한 다양한 약물의 효능을 볼 수 있다. 리포터 유전자와 커플링된 BMP 패밀리 유전자 프로모터를 포함하는 넉-인 세포주를 생산하여 BMP 패밀리 구성원 유전자 발현을 변형시키는 약물을 찾을 수 있다. 이 에세이를 사용하여 작용제 및 길항제 분자를 확인할 수 있다. 생체외 에세이, 예로서 인간 눈으로부터의 배양된 앞쪽 세그먼트의 관류(Clark et al. 1995a; Pang et al. 2000)를 사용하여, IOP 및 TM 조직내 BMP 신호전달에 대한 약물의 효능을 조사할 수 있다. 녹내장에 걸린 설치류 모델을 제조하여 잘 공지되어 있는 기술을 사용하여 안정적인 BMP 패밀리 구성원 형질전환된, 넉아웃 또는 넉-인 마우스 또는 래트 세포주를 형성할 수 있다. 이 설치류 모델을 사용하여 녹내장-양(like) 표현형(들)을 변형시키는 약물을 선별할 수 있다(예를 들면, IOP에 대한 효능을 평가하는 안압, 녹내장 신경안관에 대한 효능을 평가하는 조직).
B. 키트
본 발명은 녹내장을 초기에 검출하기 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다. 키트는 BMP 폴리펩티드 또는 단백질를 코딩하는 핵산 세그먼트를 포함할 수 있다. 이 키트는 추가로 샘플 및 본 발명의 핵산 또는 펩티드사이의 상호작용을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 제공되는 시약은 방사능-, 형광- 또는 효소적으로 표지될 수 있다. 키트는 본 발명의 헥산 또는 펩티드 또는 단백질과 결합 또는 상호작용할 수 있는 공지된 방사능표지 시약을 포함할 수 있다.
키트의 시약은 액상 용액, 고체 기판에 부착되거나 건성 분말로서 제공될 수 있다. 바람직하게, 시약이 액상 용액으로 제공되는 경우, 액상 용액은 수용액이다. 바람직하게 제공되는 시약이 고체 기판에 부착되는 경우, 고체 기판은 크로마토그래피 매질, 다수의 웰을 갖는 테스트 플레이트, 또는 현미경 슬라이드일 수 있다. 제공되는 시약이 건성 분말인 경우, 분말은 적절한 용매를 가하여 재구성되어 제공될 수 있다.
추가의 일면으로, 본 발명은 녹내장 진단 방법 및 녹내장 진단용의 관련 키트에 관한 것이다. 본 발명의 BMP 관련 펩티드 및 핵산을 사용하여 환자 샘플로부터의 BMP 핵산내 다형태 또는 돌연변이를 검출할 수 있다. 통상, 이 방법은 다형태 또는 돌연변이를 포함할 것으로 의심이 되는 샘플을 수득하고, 컴플렉스를 형성하기에 유효한 조건하에서 본 발명의 펩티드 또는 핵산와 샘플을 접촉시키고 컴플렉스의 존재를 검출하는 것을 포함할 것이다.
통상, 컴플렉스 형성의 검출은 본 분야에 잘 공지되어 있고 이는 다수의 접근법을 적용시켜 달성될 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 ELISA, RIA, 간접 형광 기술등의 사용을 고려할 수 있다. 통상, 컴플렉스 형성은 표지, 예를 들면, 방사능표지 또는 효소 태그(예로서 알칼리성 포스포타제, 홍당무과산화효소 등)을 사용하여 검출할 수 있다. 물론, 2차 결합 리간드를 사용하므로써 추가의 잇점을 발견할 수 있을 것이다.
하기 실시예는 본 발명의 일면을 수행할 때 발명자에 의해 사용될 기술의 대표적인 예이다. 이 기술은 본 발명의 실시를 위한 바람직한 일례인 반면, 본 발명의 개시와 관련하여 본 발명의 기술자는 본 발명의 정신이 의도를 벗어나지 않는 한 다수로 변형될 수 있음을 이해할 것이다.
실시예 1
세포 배양액 : 인간 TM 세포 및 ONH 세포를 [(Steely et al. 1992; Steely et al. 2000; Wilson et al. 1993; Clark et al. 1994; Clark et al. 1995b; Clark et al. 1995c; Clark et al. 1996; Clark et al. 2001a ; Clark et al. 2001b; Dickerson et al. 1998; Wordinger et al. 1998; Wordinger et al. 1999; Wordinger et al. 2000; Wordinger et al. 2002; Lambert et al. 2001; Agarwal et al. 1999; Liu et al. 2001)]에 기술된 바와 같이 기증받은 눈으로부터 제조하였다. 연령 범위가 6일 내지 90세인 기증가의 TM 추출물로부터 TM 세포를 배양하였다. 앞서 보고된 것과 같은 것을 특징으로 하는(Lambert et al. 2001; Clark et al. 1995a) 인간 시신경 유도 성상세포 및 사상판(LC) 세포를 주의하여 분할된(dissect) 시신경 유두 (기증자 연령: 2세 내지 90세)로부터 제조하였다. 세포를 하기 배지에서 융합시까지 배양하였다: TM 세포용의 항생제(Gibco BRL-Life Technologies, Grand Island, NY) 및 10% 우태아 혈청(HyClone, Logan, UT)를 포함하는 Ham's F10 배지(JRH Biosciences, Lenexa, KS); LC 세포용의 10% FBS를 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's 배지(DMEM, HyClone); ONH 성상 세포용의 5% FBS를 포함하는 성상 세포 성장 배지(AGM, Clonetics, San Diego, CA).
RT-PCR : 인간 TM 및 ONH 조직 또한 기증자의 눈으로부터 분할하였다(Wordinger et al. 1998; Wang et al. 2001). 전체 RNA를 TRIzol 추출법을 사용하여 TM 및 ONH 세포 및 조직으로부터 추출하고(Gibco BRL-Life Technologies), 표준 방법에 따라 역전사 의해 cDNA를 제조하였다(Wordinger et al. 1998; Wordinger et al. 1999; Wordinger et al. 2000; Wordinger et al. 2002). PCR 프라이머를 Oligos 4. 0 소프트웨어 프로그램을 사용하여 디자인하였다(참조 표 1의 프라이머쌍). 모든 프라이머쌍은 잠재적으로 오염된 게놈 DNA 서열의 증폭이 기대치보다 실질적으로 더 큰 mRNA PCR 산물을 제조할 수 있도록 디자인하여 RNA 프로세싱동안 절단되는 인트론 서열이 게놈 DNA에 포함되도록 하였다. 55℃의 어닐링 온도에서 β-액틴 PCR 프라이머, AGGCCAACCGCGAGAAGATGACC(상류) 및 GAAGTCCAGGGCGACGTAGCAC(하류)를 사용하여 350 bp의 PCR 산물을 수득하였다.
PCR 반응은 (Wordinger et al. 1998; Wordinger et al. 1999; Wordinger et al. 2000; Lambert et al. 2001; Wordinger et al. 2002)에 기술된 바와 같이 Taq Start Antibody Hot Start를 사용하여 하기 사이클 조건에 따하 수행하였다: 2 분 94℃, 2 분 92℃, 및 40 싸이클의 최적 어닐링 온도에서 30초, 72℃에서 90초간 신장 및 92℃에서 45초간 변성. 증폭된 PCR 산물을 1.5% 아가로스 겔에서 수평 전기영동에 의해 조사하였다. RT-PCR 산물의 특이성을 확인하기 위하여, 서던블랏 분석을 프로브 designed using Oligo 4.0를 사용하여 증폭된 PCR 산물내 부위와 하이브리제이션하도록 디자인된하는 프로브를 사용하여 수행하였다. PCR 산물을 서열화하여 PCR 반응물의 특이성을 확인하였다. 표 2에 인간 TM 및 ONH에서 발현된 BMP 패밀리 구성원을 열거한다.
Figure pat00001

Figure pat00002

웨스턴 블랏팅: 용해 완충액을 사용하여 배양된 세포로부터 단백질을 추출하고, 단백질을 니트로셀룰로오스 막에 전기영동 이동시키기 앞서 폴리아클리아미드 겔 전기영동을 변성시켜 분리하였다(Lambert et al. 2001). 막은 5% 우유(BMPs) 또는 3% 젤라틴(BMPRs)으로 차단하고 하기의 1차 항체와 함께 인큐베이션시켰다: BMP2, BMP4, BMP5, BMP7(모두 Santa Cruz, Santa Cruz, CA로부터), 또는 BMP-RIA, BMP-RIB, BMP-RII(Jackson Immuno Research, West Grove, PA). 막을 세척하고 2차 항체(염소 항-마우스 IgG-홍당무과산화효소 BMPs, Santa Cruz; 당나귀 항-염소-홍당무과산화효소 BMP 수용체, Jackson Immuno Research)와 함께 인큐베이션시키고, WesternBreeze 화학발광 면역검출 시스템을 사용하여 현상하였다(Invitrogen, Carlsbad, CA).
인간 TM 세포 및 조직에서 BMPs, BMPRs mRNA의 발현 : 인간 TM 세포 및 조직에서 기대되는(expected) BMP-2, BMP-4, BMP-5 및 BMP-7 프라이머 쌍의 증폭 산물은 도 6에서 보여준다. 특이적 프로브를 사용한 서던 블롯은 이들이 기대되는 PCR 산물이었음을 증명해준다. 모든 인간 TM 세포주 및 조직은 BMP-2, BMP-4, 및 BMP-7에 대한 메세지를 발현한다. 그러나, BMP-5에 대한 메세지는 인간 TM 조직 샘플 내에서 검출될 수 없이 낮았다(도 6, 레인 6 및 7). cDNA없는 대조군 반응은 시약 및 프라이머가 DNA 또는 RNA 오염이 없음을 나타내는 증폭 산물 내에서 일어나지 않았다(도 6, 레인 C).
도 7은 인간 TM 세포 및 조직에서 BMP-RIA, BMP-RIB, 및 BMP-RII 프라이머 쌍에 대한 기대되는 크기의 증폭산물을 보여준다. 모든 인간 TM 세포 및 조직은 BMP 수용기 복합체에 대한 메세지를 발현한다. 특이적 프로브를 사용한 서던 블롯은 이들이 기대되는 PCR 산물이었음을 증명해준다. 다른 증폭 산물(350 bp)은 BMP-RII PCR 반응에서 검출되었다. 다른 증폭 산물은 모든 인간 TM 세포 및 조직 내에 존재한다. 다른 밴드는 수용체의 다른 스플라이싱 형태인지를 결정하기 위하녀 확인한다. cDNA없는 대조군 반응은 시약 및 프라이머가 DNA 또는 RNA 오염이 없음을 나타내는 증폭 산물 내에서 일어나지 않았다(도 7, 레인 C) .
인간 ONH 세포 및 조직 내의 BMP 및 BMP 수용체 mRNA의 발현 : 인간 ONH 성상 세포 및 ONH 조직 내의 BMP-2, BMP-4, BMP-5 및 BMP-7 프라이머 쌍에 대한 기대되는 크기의 증폭산물은 도 8에서 보여준다. 모든 ONH 성상 세포 및 ONH 조직은 각각의 BMP에 대한 메세지를 발현한다. 인간 뇌 성상 세포는 양성 대조군 세포주로서 사용되었다. 특이적 프로브를 사용한 서던 블롯은 이들이 기대되는 PCR 산물이었음을 증명해준다. BMP-2의 발현과 함께, 모든 다른 BMP는 인간 뇌 성상 세포에 의해 발현된다(도 8, 레인 7). cDNA 없는 대조군 반응은 시약 및 프라이머가 DNA 또는 RNA 오염이 없음을 나타내는 증폭 산물(도 8, 레인 C) 내에서 일어나지 않았다.
도 9는 배양된 인간 LC 세포내의 BMP-2, BMP-4, BMP-5 및 BMP-7 프라이머 쌍에 대한 기대되는 크기의 증폭산물을 보여준다. 모든 LC 세포주는 각각의 BMP에 대한 메세지를 발현한다. 특이적 프로브를 사용한 서던 블롯은 이들이 기대되는 PCR 산물이었음을 증명해준다. cDNA 없는 대조군 반응은 시약 및 프라이머가 DNA 또는 RNA 오염이 없음을 나타내는 증폭 산물(도 9, 레인 C) 내에서 일어나지 않았다.
인간 ONH 성상 세포 및 ONH 조직에서의 BMP-RIA, BMP-RIB, 및 BMP-RII 프라이머 쌍에 대한 기대되는 크기의 증폭산물은 도 10에서 보여준다. 모든 ONH 성상 세포 세포주 및 조직은 BMP-RIA 및 BMP-RIB에 대해 메시지를 발현한다. 특이적 프로브를 사용한 서던 블롯은 이들이 기대되는 PCR 산물이었음을 증명해준다. ONH 조직을 제외하고(도 10, 레인 6), BMP-RII는 모든 ONH 성상 세포 세포주에 의해 발현된다. 모든 BMP 수용체(도 10, 레인 7)에 대한 메시지는 양성 대조군로서 제공되는 인간 뇌 성상 세포 세포주에 의해 발현된다. ONH 조직 및 ONH 세포주 내에서의 BMP-RII의 발현에 모순이 있음이 나타난다. ONH 조직 내에서의 감소된 발현은 낮은 수준의 발현을 반영할 수 있다. cDNA 없는 대조군 반응은 시약 및 프라이머가 DNA 또는 RNA 오염이 없음을 나타내는 증폭 산물(도 5, 레인 C) 내에서 일어나지 않았다.
도 11은 배양된 인간 LC 세포 내에서의 BMP-RIA, BMP- RIB, 및 BMP-RII 프라이머 쌍에 대한 기대되는 크기의 증폭산물을 보여준다. 모든 LC 세포주는 각각의 BMP 수요체에 대해 메시지를 발현한다. 특이적 프로브를 사용한 서던 블롯은 이들이 기대되는 PCR 산물이었음을 증명해준다. cDNA 없는 대조군 반응은 시약 및 프라이머가 DNA 또는 RNA 오염이 없음을 나타내는 증폭 산물(도 11, 레인 C) 내에서 일어나지 않았다.
인간 TM 및 ONH 세포 및 조직 내에서의 BMP 단백질 및 BMP 수용체 단백질의 발현: 도 12은 인간 TM 및 ONH 세포 및 조직 내에서의 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-7, BMP-RIA, BMP-RIB, 및 BMP-RII 단백질의 화학발광 이뮤노블롯 검출을 나타낸다. 모든 세포주는 발현된 각각의 BMP 단백질을 연구했다. BMP 단백질은 세포주 내에서 하기의 분자량: 54-56 kDa BMP-2,25-27 kDa BMP-4, 55-57 kDa BMP-5, 및 77 kDa BMP-7으로 검출되었다. 다중 밴드는 BMP-2 및 BMP-4에 대해 검출되었으며, 이는 다른 연구에서 보여진 이들 BMP의 글리코실레이트된 및 부분적으로 글리코실레이트된 형태를 가장 유사하게 보여준다. BMP 수용체 단백질은 세포주 내에서 분자량: 38 kDa BMP-RIA, 64 kDa BMP-RIB, 및 57 kDa BMP-RII에서 검출되었다. 다중밴드는 TM세포 내에서BMP-RIB 및 BMP-RII에 대해 검출되었으며, 이는 다른 연구에서 보여진 글리코실레이트된 및 부분적으로 글리코실레이트된 형태를 가장 유사하게 보여준다. BMP 수용체에 대한 단백질 발현 수준은 ONH 세포과 비교하여 TM 세포에서 더 낮게 나타난다. 예를 들면 BMP-RII은 TM 세포 내에서 검출되지않고,BMP-RIB는 상당히 감소되었다.
배양된 인간 TM 세포 및 인간 ONH 세포 내에서의 BMP 결합 단백질 mRNA의 발현: 인간 TM 세포주 내에서의 BMP 결합 단백질 프라이머 쌍에 대한 기대된 크기의 증폭 산물은 도 13에서 보여준다. 인간 TM 세포주는 DRM(그렘린), 코딘, 폴리스타틴, 및 NMA(밤비)에 대해 메세지를 발현한다.
특이적 프로브를 사용한 서던 블롯은 이들이 기대되는 PCR 산물이었음을 증명해준다. 세포주 간의 메세지 발현에 있어서의 명백한 차이는 없다. 모든 인간 TM 세포는 BMP 결합 단백질 노긴(noggin) 및 Cer-1에 대하여 mRNA를 발현하는데 실패하게 실험되었다. cDNA 없는 대조군 반응은 시약 및 프라이머가 DNA 또는 RNA 오염이 없음을 나타내는 증폭 산물 내에서 일어나지 않았다.
ONH 성상 세포 및 LC 세포주내 기대되는 크기의 BMP 결합 단백질의 증폭 산물을 도 14에 나타내었다. 모든 ONH 성상 세포 및 LC 세포주는 DRM(그렘린), 폴리스타틴 및 NMA(밤비)에 대한 메세지를 발현시켰다. 특정 프로브를 사용하는 서던 블랏팅에 의해 이들이 예측된 PCR 산물임을 확인하였다. 대다수의 LC 세포 및 ONH 성상 세포는 코딘에 대한 메세지를 발현시켰다. 조사된 모든 인간 ONH 성상 세포 및 LC 세포는 BMP 결합 단백질 노긴 및 Cer-1에 대한 mRNA는 발현시키지 못했다. cDNA가 없는 대조군 반응물은 증폭 산물을 일으키지 못했고 이는 시약 및 프라이거에는 DNA 및 RNA 오염이 없음을 언급한다.
도 15는 녹내장 TM 세포에서 BMP 길항제 그렘린(CKTSF1B1)의 발현이 증가되었음을 나타낸다. 유전자 발현을 Affymetrix 유전자 어레이(Affymetrix 유전자 칩 U133A)를 사용하여 평가하였다.
기술되고 청구하는 모든 조성물 및/또는 방법은 본 발명과 관련되는 부당한 시험없이도 수행되고 실시될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 바람직한 일례를 통해 기술되지만, 이는 본 발명의 개념, 정신 및 범위로부터 벗어나지 않는 한 기술된 조성물 및/또는 방법 및 방법의 단계 또는 일련의 단계에서 변형될 수 있음을 본 분야의 기술자는 잘 알고 있을 것이다. 더욱 구체적으로, 유사한 결과를 얻기 위하여 화학 및 구조적으로 관련된 특정 약물을 본 명세서에 기술된 약물을 대신하여 대체할 수 있음을 이해할 것이다. 본 분야의 기술자에게 자명한 모든 치환 및 변형은 청부된 청구범위로서 본 발명의 정신, 개념 및 범쥐내의 것임을 이해할 것이다.
참고 문헌
본 명세서에 기술된 것에 대한 예시 방법 또는 다른 상세한 설명을 제공하는 범위로 하기 참고문헌으로 본 명세서에서 구체적으로 인용된다.
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Met Glu Arg Cys Pro Ser Leu Gly Val Thr Leu Tyr Ala Leu Val Val 1 5 10 15 Val Leu Gly Leu Arg Ala Thr Pro Ala Gly Gly Gln His Tyr Leu His 20 25 30 Ile Arg Pro Ala Pro Ser Asp Asn Leu Pro Leu Val Asp Leu Ile Glu 35 40 45 His Pro Asp Pro Ile Phe Asp Pro Lys Glu Lys Asp Leu Asn Glu Thr 50 55 60 Leu Leu Arg Ser Leu Leu Gly Gly His Tyr Asp Pro Gly Phe Met Ala 65 70 75 80 Thr Ser Pro Pro Glu Asp Arg Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Gly 85 90 95 Gly Ala Glu Asp Leu Ala Glu Leu Asp Gln Leu Leu Arg Gln Arg Pro 100 105 110 Ser Gly Ala Met Pro Ser Glu Ile Lys Gly Leu Glu Phe Ser Glu Gly 115 120 125 Leu Ala Gln Gly Lys Lys Gln Arg Leu Ser Lys Lys Leu Arg Arg Lys 130 135 140 Leu Gln Met Trp Leu Trp Ser Gln Thr Phe Cys Pro Val Leu Tyr Ala 145 150 155 160 Trp Asn Asp Leu Gly Ser Arg Phe Trp Pro Arg Tyr Val Lys Val Gly 165 170 175 Ser Cys Phe Ser Lys Arg Ser Cys Ser Val Pro Glu Gly Met Val Cys 180 185 190 Lys Pro Ser Lys Ser Val His Leu Thr Val Leu Arg Trp Arg Cys Gln 195 200 205 Arg Arg Gly Gly Gln Arg Cys Gly Trp Ile Pro Ile Gln Tyr Pro Ile 210 215 220 Ile Ser Glu Cys Lys Cys Ser Cys 225 230 <210> 51 <211> 804 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 51 atgcatctcc tcttatttca gctgctggta ctcctgcctc taggaaagac cacacggcac 60 caggatggcc gccagaatca gagttctctt tcccccgtac tcctgccaag gaatcaaaga 120 gagcttccca caggcaacca tgaggaagct gaggagaagc cagatctgtt tgtcgcagtg 180 ccacaccttg tagccaccag ccctgcaggg gaaggccaga ggcagagaga gaagatgctg 240 tccagatttg gcaggttctg gaagaagcct gagagagaaa tgcatccatc cagggactca 300 gatagtgagc ccttcccacc tgggacccag tccctcatcc agccgataga tggaatgaaa 360 atggagaaat ctcctcttcg ggaagaagcc aagaaattct ggcaccactt catgttcaga 420 aaaactccgg cttctcaggg ggtcatcttg cccatcaaaa gccatgaagt acattgggag 480 acctgcagga cagtgccctt cagccagact ataacccacg aaggctgtga aaaagtagtt 540 gttcagaaca acctttgctt tgggaaatgc gggtctgttc attttcctgg agccgcgcag 600 cactcccata cctcctgctc tcactgtttg cctgccaagt tcaccacgat gcacttgcca 660 ctgaactgca ctgaactttc ctccgtgatc aaggtggtga tgctggtgga ggagtgccag 720 tgcaaggtga agacggagca tgaagatgga cacatcctac atgctggctc ccaggattcc 780 tttatcccag gagtttcagc ttga 804 <210> 52 <211> 267 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 52 Met His Leu Leu Leu Phe Gln Leu Leu Val Leu Leu Pro Leu Gly Lys 1 5 10 15 Thr Thr Arg His Gln Asp Gly Arg Gln Asn Gln Ser Ser Leu Ser Pro 20 25 30 Val Leu Leu Pro Arg Asn Gln Arg Glu Leu Pro Thr Gly Asn His Glu 35 40 45 Glu Ala Glu Glu Lys Pro Asp Leu Phe Val Ala Val Pro His Leu Val 50 55 60 Ala Thr Ser Pro Ala Gly Glu Gly Gln Arg Gln Arg Glu Lys Met Leu 65 70 75 80 Ser Arg Phe Gly Arg Phe Trp Lys Lys Pro Glu Arg Glu Met His Pro 85 90 95 Ser Arg Asp Ser Asp Ser Glu Pro Phe Pro Pro Gly Thr Gln Ser Leu 100 105 110 Ile Gln Pro Ile Asp Gly Met Lys Met Glu Lys Ser Pro Leu Arg Glu 115 120 125 Glu Ala Lys Lys Phe Trp His His Phe Met Phe Arg Lys Thr Pro Ala 130 135 140 Ser Gln Gly Val Ile Leu Pro Ile Lys Ser His Glu Val His Trp Glu 145 150 155 160 Thr Cys Arg Thr Val Pro Phe Ser Gln Thr Ile Thr His Glu Gly Cys 165 170 175 Glu Lys Val Val Val Gln Asn Asn Leu Cys Phe Gly Lys Cys Gly Ser 180 185 190 Val His Phe Pro Gly Ala Ala Gln His Ser His Thr Ser Cys Ser His 195 200 205 Cys Leu Pro Ala Lys Phe Thr Thr Met His Leu Pro Leu Asn Cys Thr 210 215 220 Glu Leu Ser Ser Val Ile Lys Val Val Met Leu Val Glu Glu Cys Gln 225 230 235 240 Cys Lys Val Lys Thr Glu His Glu Asp Gly His Ile Leu His Ala Gly 245 250 255 Ser Gln Asp Ser Phe Ile Pro Gly Val Ser Ala 260 265 <210> 53 <211> 1523 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 53 ctggcgcggg cgggagctgc ggcggatacc cttgcgtgct gtggagaccc tactctcttc 60 gctgagaacg gccgctagcg gggactgaag gccgggagcc cactcccgac ccggggctag 120 cgtgcgtccc tagagtcgag cggggcaagg gagccagtgg ccgccgacgg gggaccggga 180 aacttttctg ggctcctggg cgcgccctgt agccgcgctc catgctccgg cagcggcccg 240 aaacccagcc ccgccgctga cggcgcccgc cgctccgggc agggcccatg ccctgcgcgc 300 tccgggggtc gtaggctgcc gccgagccgg ggctccggaa gccggcgggg gcgccgcggc 360 cgtgcggggc gtcaatggat cgccactcca gctacatctt catctggctg cagctggagc 420 tctgcgccat ggccgtgctg ctcaccaaag gtgaaattcg atgctactgt gatgctgccc 480 actgtgtagc cactggttat atgtgtaaat ctgagctcag cgcctgcttc tctagacttc 540 ttgatcctca gaactcaaat tccccactca cccatggctg cctggactct cttgcaagca 600 cgacagacat ctgccaagcc aaacaggccc gaaaccactc tggcaccacc atacccacat 660 tggaatgctg tcatgaagac atgtgcaatt acagagggct gcacgatgtt ctctctcctc 720 ccaggggtga ggcctcagga caaggaaaca ggtatcagca tgatggtagc agaaacctta 780 tcaccaaggt gcaggagctg acttcttcca aagagttgtg gttccgggca gcggtcattg 840 ccgtgcccat tgctggaggg ctgattttag tgttgcttat tatgttggcc ctgaggatgc 900 ttcgaagtga aaataagagg ctgcaggatc agcggcaaca gatgctctcc cgtttgcact 960 acagctttca cggacaccat tccaaaaagg ggcaggttgc aaagttagac ttggaatgca 1020 tggtgccggt cagtgggcac gagaactgct gtctgacctg tgataaaatg agacaagcag 1080 acctcagcaa cgataagatc ctctcgcttg ttcactgggg catgtacagt gggcacggga 1140 agctggaatt cgtatgacgg agtcttatct gaactacact tactgaacag cttgaaggcc 1200 ttttgagttc tgctggacag gagcacttta tctgaagaca aactcattta atcatctttg 1260 agagacaaaa tgacctctgc aaacagaatc ttggatattt cttctgaagg attatttgca 1320 cagacttaaa tacagttaaa tgtgttattt gcttttaaaa ttataaaaag caaagagaag 1380 actttgtaca cactgtcacc agggttattt gcatccaagg gagctggaat tgagtaccta 1440 aataaacaaa aatgtgccct atgtaagctt ctacatcttg atttattgta aagatttaaa 1500 agaaatatat atattttgtc tga 1523 <210> 54 <211> 260 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 54 Met Asp Arg His Ser Ser Tyr Ile Phe Ile Trp Leu Gln Leu Glu Leu 1 5 10 15 Cys Ala Met Ala Val Leu Leu Thr Lys Gly Glu Ile Arg Cys Tyr Cys 20 25 30 Asp Ala Ala His Cys Val Ala Thr Gly Tyr Met Cys Lys Ser Glu Leu 35 40 45 Ser Ala Cys Phe Ser Arg Leu Leu Asp Pro Gln Asn Ser Asn Ser Pro 50 55 60 Leu Thr His Gly Cys Leu Asp Ser Leu Ala Ser Thr Thr Asp Ile Cys 65 70 75 80 Gln Ala Lys Gln Ala Arg Asn His Ser Gly Thr Thr Ile Pro Thr Leu 85 90 95 Glu Cys Cys His Glu Asp Met Cys Asn Tyr Arg Gly Leu His Asp Val 100 105 110 Leu Ser Pro Pro Arg Gly Glu Ala Ser Gly Gln Gly Asn Arg Tyr Gln 115 120 125 His Asp Gly Ser Arg Asn Leu Ile Thr Lys Val Gln Glu Leu Thr Ser 130 135 140 Ser Lys Glu Leu Trp Phe Arg Ala Ala Val Ile Ala Val Pro Ile Ala 145 150 155 160 Gly Gly Leu Ile Leu Val Leu Leu Ile Met Leu Ala Leu Arg Met Leu 165 170 175 Arg Ser Glu Asn Lys Arg Leu Gln Asp Gln Arg Gln Gln Met Leu Ser 180 185 190 Arg Leu His Tyr Ser Phe His Gly His His Ser Lys Lys Gly Gln Val 195 200 205 Ala Lys Leu Asp Leu Glu Cys Met Val Pro Val Ser Gly His Glu Asn 210 215 220 Cys Cys Leu Thr Cys Asp Lys Met Arg Gln Ala Asp Leu Ser Asn Asp 225 230 235 240 Lys Ile Leu Ser Leu Val His Trp Gly Met Tyr Ser Gly His Gly Lys 245 250 255 Leu Glu Phe Val 260

Claims (5)

  1. a) 녹내장에 걸린 것으로 의심되는 환자로부터 조직 또는 체액 샘플을 수득하고;
    b) 상기 샘플로부터 DNA를 추출하고;
    c) 각각 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5, 서열번호: 7, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호 : 47, 또는 서열번호: 53으로부터 18 내지 1547개의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 서열을 포함하는 복수의 PCR 프라이머를 수득하고;
    d) 상기 프라이머를 사용하여 추출된 DNA 부위를 증폭시켜 PCR 산물을 수득하고;
    e) PCR 산물을 분리하고;
    f) 증폭된 추출 DNA의 서열과 프라이머의 서열 사이의 차이를 확인하는 단계를 포함하고, 증폭된 서열과 프라이머간의 차이가 녹내장을 진단하는 것인, 녹내장을 진단하기 위하여 세포 또는 체액으로부터 수득한 샘플중 뼈 형태발생 패밀리 구성원 유전자의 변형된 발현을 검출하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 조직 또는 체액 샘플이 혈액 또는 구강 세포인 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 프라이머가 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5, 서열번호: 7, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 47, 또는 서열번호: 53의 20 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 서열을 포함하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 프라이머가 서열번호: 3의 20 내지 50개의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 서열을 포함하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, PCR 산물을 단일 가닥 입체 다형(single strand conformation polymorphism, SSCP), 변성 농도 구배 겔 전기영동 (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE), 대립유전자 특이성 올리고뉴클레오티드 (allele specific oligonucleotide, ASO) 또는 제한 단편 길이 다형(restriction fragment length polymorphism, RFLP)에 의해 분리하는 방법.
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