[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

EA039276B1 - Пирролобензодиазепиновые конъюгаты - Google Patents

Пирролобензодиазепиновые конъюгаты Download PDF

Info

Publication number
EA039276B1
EA039276B1 EA202090148A EA202090148A EA039276B1 EA 039276 B1 EA039276 B1 EA 039276B1 EA 202090148 A EA202090148 A EA 202090148A EA 202090148 A EA202090148 A EA 202090148A EA 039276 B1 EA039276 B1 EA 039276B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
group
ser ser
antibody
conjugate according
alkyl
Prior art date
Application number
EA202090148A
Other languages
English (en)
Other versions
EA202090148A1 (ru
Inventor
Наццарено Димази
Филип Уилсон Ховард
Люк Мастерсон
Арно Шарль Тибергьен
Балакумар Виджаякришнан
Джейсон Уайт
Original Assignee
Медимьюн Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Медимьюн Лимитед filed Critical Медимьюн Лимитед
Publication of EA202090148A1 publication Critical patent/EA202090148A1/ru
Publication of EA039276B1 publication Critical patent/EA039276B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D519/00—Heterocyclic compounds containing more than one system of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system not provided for in groups C07D453/00 or C07D455/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Abstract

В изобретении предложен конъюгат формулы Iгде Ab представляет собой модифицированное антитело, содержащее по меньшей мере один свободный сайт конъюгации в каждой тяжелой цепи, где модифицированное антитело модифицировано таким образом, что оно содержит по меньшей мере один аминокислотный остаток, содержащий реакционноспособную группу, подходящую для конъюгации с линкером, в каждой тяжелой цепи. Также изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей указанный конъюгат формулы I, и к его применению для лечения рака у субъекта.

Description

Уровень техники
Некоторые пирролобензодиазепины (PBD) обладают способностью распознавать и связываться с определенными последовательностями ДНК; предпочтительной последовательностью является PuGPu. Первый PBD противоопухолевый антибиотик, антрамицин, открыт в 1965 г. (Leimgraber, et al., J. Am. Chem. Soc, 87, 5793-5795 (1965); Leimgraber, et al., J. Am. Chem. Soc, 87, 5791-5793 (1965)). С тех пор описано множество природных PBD и разработано более 10 синтетических способов получения различных аналогов (Thurston, et al., Chem. Rev. 1994, 433-465 (1994)). Члены семейства включают аббеймицин (Hochlowski, et al., J. Antibiotics, 40, 145-148 (1987)), чикамицин (Konishi, et al., J. Antibiotics, 37, 200-206 (1984)), DC-81 (японский патент 58-180 487; Thurston, et al., Chem. Brit, 26, 767-772 (1990); Bose, et al., Tetrahedron, 48, 751-758 (1992)), мазетрамипин (Kuminoto, et al., J. Antibiotics, 33, 665-667 (1980)), неотрамицины А и В (Takeuchi, et al, J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976)), поротрамицин (Tsunakawa, et al., J. Antibiotics, 41, 1366-1373 (1988)), протракарцин (Shimizu, et al., J. Antibiotics, 29, 2492-2503 (1982); Langley and Thurston, J. Org. Chem., 52, 91-97 (1987)), сибаномицин (DC-102)(Hara, et al., J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988); Itoh, et al., J. Antibiotics, 41, 1281-1284 (1988)), сибиромицин (Leber, et al., J. Am. Chem. Soc, 110, 2992-2993 (1988)) и томамицин (Arima, et al., J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972)). PBD имеют общую структуру
Они отличаются по количеству, типу и положению заместителей в ароматических кольцах А и пиррольных кольцах С, а также по степени насыщенности кольца С. В кольце В находится имин (N=C), карбиноламин (NH-CH(OH)) или метиловый эфир карбиноламина (NH-CH(OMe)) в положениях N10-C11, которые представляют собой электрофильный центр, отвечающий за алкилирование ДНК. Все известные природные продукты имеют ^-конфигурацию в хиральном положении d1a, что обеспечивает их правостороннее скручивание, если смотреть с кольца С на кольцо А. Это придает им соответствующую трехмерную форму для изоспиральности с малой бороздкой В-формы ДНК, что приводит к точному совпадению у сайта связывания (Kohn, In Antibiotics Ш. Springer-Verlag, Нью-Йорк, cc. 3-11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230-237 (1986)). Их способность образовывать аддукт в малой бороздке обеспечивает возможность влиять на процессинг ДНК, вследствие чего их используют в качестве противоопухолевых агентов.
Ранее было описано, что биологическая активность указанных молекул может быть усилена посредством соединения двух звеньев PBD друг с другом через их С8/С'-гидроксильные функциональные группы посредством гибкого алкиленового линкера (Bose, D.S., et al., J. Am. Chem. Soc., 114, 4939-4941 (1992); Thurston, D.E., et al., J. Org. Chem., 61, 8141-8147 (1996)). Димеры PBD предположительно образуют последовательность-селективные повреждения ДНК, такие как палиндромная 5'-Pu-GATC-Py-3' межнитевая поперечная сшивка (Smellie, M., et al., Biochemistry, 42, 8232-8239 (2003); Martin, C, et al., Biochemistry, 44, 4135-4147), которые предположительно несут главную ответственность за их биологическую активность.
Одним из примеров димера PBD является SG2000 (SJG-136)
(Gregson, S., et al., J. Med. Chem., 44, 737-748 (2001); Alley, M.C., et al., Cancer Research, 64, 67006706 (2004); Hartley, J.A., et al., Cancer Research, 64, 6693-6699 (2004)), который исследовали в клиниче ских испытаниях в качестве отдельного агента, например, NCT02034227, изучая его применение при лечении острого миелоидного лейкоза и хронического лимфоцитарного лейкоза (см. https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02034227).
Димерные PBD соединения, содержащие С2 арильные заместители, такие как SG2202 (ZC-207), описаны в WO 2005/085251
- 1 039276
Было показано, что данные соединения являются весьма подходящими цитотоксическими агентами (Howard, P.W., et al., Bioorg. Med. Chem. (2009), doi: 10.1016/j.bmcl.2009.09.012).
В WO 2007/085930 описано получение димерных соединений PBD, содержащих линкерные группы для связи с клеточно-связывающим агентом (СВА), таким как антитело. Указанный линкер находится в мостиковой связи мономерных звеньев PBD данного димера.
Димерные соединения PBD, содержащие линкерные группы для связывания с клеточно связывающим агентом, таким как антитело, описаны в WO 2011/130598. Линкер в таких соединениях присоединен к одному из доступных положений N10 и обычно расщепляется под действием фермента на данную линкерную группу. Если несвязанное положение N10 защищено кэп-группой, то иллюстратив ные кэп-группы имеют такой же триггер расщепления, как линкер, связанный с антителом.
В WO 2014/057074 описаны два специфических димерных конъюгата PBD, связанных через положение N10 в одном мономере, причем другой мономер PBD находится в иминной форме. Один из описанных конъюгатов лекарственное соединение-линкер представляет собой SG3249, тезирин
который, будучи конъюгирован с анти-DLL3 ровалпитузумабом, известен как ровалпитузумабтезирин (Rova-T), проходящий в настоящее время оценку при лечении мелкоклеточного рака легких (Tiberghien, А.С., et al., ACSMed. Chem. Lett, 2016, 7 (11), 983-987; DOI: 10.1021/acsmedchemlett.6b00062). Дополнительные конъюгаты указанного лекарственного соединения-линкера со сконструированной версией трастузумаба и гуманизированным антителом против человеческого CD19 также начали проходить испытания в начале 2017 г. в компании ADC Therapeutics SA (рефераты № 51 и № 52 в публикации Proceedings of the American Association for Cancer Research, т. 58, апрель, 2017).
В WO 2015/052322 описан специфический димерный конъюгат PBD, связанный через положение N10 в одном мономере, причем другой мономер PBD находится в иминной форме. Описан также специфический димерный конъюгат PBD, связанный через положение N10 в одном мономере, причем другой мономер PBD содержит кэп-группу с таким же триггером расщепления, как линкер, связанный с антите лом
- 2 039276
Сущность изобретения
В данном изобретении предложены PBD и родственные димерные конъюгаты PBD, в которых PBD конъюгированы с антителами, которые модифицированы так, что содержат по меньшей мере один свободный сайт конъюгации в каждой тяжелой цепи, и при этом конъюгация осуществлена через каждую группу N10 PBD через линкер.
Авторами настоящего изобретения обнаружено, что такие конъюгаты являются неожиданно эффективными, несмотря на предположение того, что невозможно связать один PBD или родственный димер с одним антителом через два линкера.
В первом аспекте данного изобретения предложен конъюгат формулы I
где Ab представляет собой модифицированное антитело, содержащее по меньшей мере один свободный сайт конъюгации в каждой тяжелой цепи, где модифицированное антитело модифицировано таким образом, что оно содержит по меньшей мере один аминокислотный остаток, содержащий реакционноспособную группу, подходящую для конъюгации с линкером, в каждой тяжелой цепи; D означает группу D1
пунктирная линия означает необязательное наличие двойной связи между С2 и С3; при наличии двойной связи между С2 и С3 R2 выбран из группы, состоящей из (ia) C1-5 насыщенного алифатического
R алкила; (ib) циклопропила; (1С) R ’ где каждый из R11, R12 и R13 независимо выбран из Н, C1-3 насыщенного алкила, С2.3 алкенила, С2-3 алкинила и циклопропила, и общее количество атомов углерода в группе R2 составляет не более 5;
(id) R ’ где R14 представляет собой Н;
- 3 039276 при наличии одинарной связи между С2 и С3
R2 выбран из Н, ОН, F, diF и где R16a и R16b независимо выбраны из Н, F, C1-4 насыщенного алкила, С2-3 алкенила;
D' представляет собой группу D'1
R22
СЗ'
D4 где пунктирная линия означает необязательное наличие двойной связи между С2' и С3'; при наличии двойной связи между С2' и С3' R22 выбран из группы, состоящей из: (iia) C1-5 насыщенного алифатиО32 ческого алкила; (iib) циклопропила; « r31 где каждый из R31, R32 и R33 независимо выбран из Н, С1-3 насыщенного алкила, С2-3 алкенила, С2-3 алкинила и циклопропила, и общее количество атомов углерода в группе R22 составляет не более 5;
(iid) R ’ где R24 представляет собой Н;
при наличии одинарной связи между С2' и С3',
R22 выбран из Н, ОН, F, diF и где R26a и R26b независимо выбраны из Н, F, C1-4 насыщенного алкила, С2-3 алкенила;
R6 и R9 представляют собой Н;
R7 представляет собой C1-4 алкоксигруппу;
R представляет собой С3-12 алкиленовую группу, цепь которой может прерываться бензолом или пиридином;
Y и Y' представляют собой О;
R11a представляет собой ОН;
R6, R7, R9 и R11a выбраны из таких же групп, как R6, R7, R9 и R11a соответственно; и
Rll1 и Rll2 представляют собой линкеры, связанные с антителом в разных сайтах, которые независимо представляют собой формулу IIIa' где Q представляет собой
где QX является таким, что Q представляет собой аминокислотный остаток, дипептидный остаток или трипептидный остаток;
X представляет собой
где а = 0-5, b = 0-16, с = 0 или 1, d = 0-5; Gll- выбран из
- 4 039276
(GLL1-1) О CBAg О (G^s-1) CBA A /N\ NC^
(GLL1-2) о cba; у (G^s-2) N ZBA 4
A
(G1'1'2) о cba; Z^tZ у 4 C—C о О (GLL9’1) 4N CBA
(G^-1) (G^9’2)
CBA
(Glls-2) CBApS^ G1'10 CBA n—\ H
(GLl-4) CBA«___ 1 \ h 7/ N о У Glu cba A λ A \ / H<T \ О
(GLL5) О // °ч 0й2 hn\A\ /1 X
(G^6) о СВА<___// G1'13 H N^n
CBA
(GLL7) СВА^
где Ar представляет собой C5-6 ариленовую группу и X представляет собой C1-4 алкил, где СВА представляет собой клеточносвязывающий агент, который является модифицированным антителом, содержащим по меньшей мере один свободный сайт конъюгации в каждой тяжелой цепи, где модифицированное антитело модифицировано таким образом, что оно содержит по меньшей мере один аминокислотный остаток, содержащий реакционноспособную группу, подходящую для конъюгации с линкером, в каждой тяжелой цепи.
Следует понимать, что такие ADC, которые имеют эффективное отношение лекарственного средства к антителу (DAR), равное 1, могут обеспечивать существенное преимущество, включая сниженную нецелевую токсичность и расширенное терапевтическое окно благодаря уменьшению необходимой минимальной эффективной дозы, по сравнению с ADC, состоящими из гетерогенных смесей с более высоким значением DAR.
Второй аспект данного изобретения включает соединение формулы II
- 5 039276
и его соли и сольваты, где D, R2, R6, R7, R9, R11a, Y, R, Y', D', R6, R7, R9, R11a и R12 (включая наличие или отсутствие двойных связей между С2 и С3 и между С2' и С3' соответственно) являются такими, как определено в первом аспекте данного изобретения;
Rl1 и Rl2 представляют собой линкеры для связывания с клеточносвязывающим агентом, которые независимо представляют собой формулу IIIa
где Q и X являются такими, как определено в любом из пп.1, 9 или 12, и GL выбран из
(GL1-1) О A (GL6) О С) P \ γ-Ν X Дхо
(GL1-2) A (GL7) Br—
(GL2) AV о (G1*)
(GL3-1) A (NO2) где группа NO2 является необязательной (GL9) N3
(GL3-2) s—s^1 A (NO2) где группа NO2 является необязательной (GL1°) О H
(GL3-3) S— ο2νΛ=/ где группа ΝΟ2 является необязательной (GLn)
- 6 039276
где Ar представляет собой C5-6 ариленовую группу и X представляет собой C1-4 алкил.
В третьем аспекте данного изобретения предложено применение конъюгата по первому аспекту данного изобретения и фармацевтическая композиция, его содержащая, для лечения рака у субъекта.
Специалисты в данной области техники могут без труда определить, подходит или не подходит потенциальный конъюгат для лечения пролиферативного состояния для любого конкретного типа клеток. Например, анализы, которые можно удобно использовать для оценки активности, обеспечиваемой кон кретным соединением, описаны ниже в примерах.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показано влияние однократной дозы конъюгата по данному изобретению по сравнению с отсутствием лечения в модели ксенотрансплантата NCI-N87.
На фиг. 2 показано влияние меньшей однократной дозы того же конъюгата по данному изобретению по сравнению с отсутствием лечения в модели ксенотрансплантата NCI-N87.
На фиг. 3 показано схематическое изображение (А) модифицированных антител, пригодных для применения по данному изобретению, (В) конъюгата антитела и лекарственного соединения, содержащего PBD по данному изобретению.
На фиг. 4 показано схематическое изображение конъюгации модифицированного антитела с соединением 10.
На фиг. 5 показаны последовательности тяжелой и легкой цепи соединения герцептин-Flexmab.
На фиг. 6 показана активность конъюгата по данному изобретению по сравнению с конъюгатом, не относящимся к данному изобретению.
Определения.
Заместители.
Выражение необязательно замещенная в данном контексте относится к исходной группе, которая может быть незамещенной или которая может быть замещенной.
Если не указано иное, термин замещенная в данном контексте относится к исходной группе, которая имеет один или более заместителей. Термин заместитель в данном контексте использован в обычном смысле и относится к химическому фрагменту, который ковалентно присоединен или, если это возможно, конденсирован с исходной группой. Хорошо известны многочисленные заместители, и так же хорошо известны способы их получения и внедрения в различные исходные группы.
Примеры заместителей более подробно описаны ниже.
C1.12алкил. Термин С1.12алкил в данном контексте относится к одновалентному фрагменту, полученному посредством отщепления атома водорода от атома углерода в углеводородном соединении, содержащем от 1 до 12 атомов углерода, которое может быть алифатическим или алициклическим, и которое может быть насыщенным или ненасыщенным (например, частично ненасыщенным, полностью ненасыщенным). Термин C1.4алкил в данном контексте относится к одновалентному фрагменту, полученному посредством отщепления атома водорода от атома углерода в углеводородном соединении, содержащем от 1 до 4 атомов углерода, которое может быть алифатическим или алициклическим, и которое может быть насыщенным или ненасыщенным (например, частично ненасыщенным, полностью ненасыщенным). Таким образом, термин алкил включает подклассы алкенила, алкинила, циклоалкила и т.д., рассмотренные ниже.
Примеры насыщенных алкильных групп включают, но не ограничиваются этим, метил-(С1), этил(С2), пропил-(С3), бутил-(С4), пентил-(С5), гексил-(С6) и гептил-(С7).
Примеры насыщенных линейных алкильных групп включают, но не ограничиваются этим, метил(С1), этил-(С2), н-пропил-(С3), н-бутил-(С4), н-пентил-(амил) (C5), н-гексил-(С6) и н-гептил-(С7).
Примеры насыщенных разветвленных алкильных групп включают изопропил-(С3), изобутил-(С4), втор-бутил-(С4), трет-бутил-(С4), изопентил-(С5) и неопентил-(С5).
С2-12 алкенил. Термин С2-12 алкенил в данном контексте относится к алкильной группе, содержащей одну или более двойных углерод-углеродных связей.
- 7 039276
Примеры ненасыщенных алкенильных групп включают, но не ограничиваются этим, этенил(винил, -СН=СН2), 1-пропенил-(-СН=СН-СН3), 2-пропенил-(аллил, -СН-СН=СН2), изопропенил-(1метилвинил, -С(СН3)=СН2), бутенил-(С4), пентенил-(С5) и гексенил-(С6).
С2.12 алкинил. Термин С2-12 алкинил в данном контексте относится к алкильной группе, содержащей одну или более тройных углерод-углеродных связей.
Примеры ненасыщенных алкинильных групп включают, но не ограничиваются этим, этинил-(-С^СН) и 2-пропинил-(пропаргил, -СН2-С^СН).
С3_12 циклоалкил. Термин С3_12 циклоалкил в данном контексте относится к алкильной группе, которая также является циклической группой; т.е. к одновалентному фрагменту, полученному посредством отщепления атома водорода от алициклического кольцевого атома циклического углеводородного (карбоциклического) соединения, и указанный фрагмент содержит от 3 до 7 атомов углерода, включая от 3 до 7 кольцевых атомов.
Примеры циклоалкильных групп включают, но не ограничиваются этим, группы, полученные из насыщенных моноциклических углеводородных соединений: циклопропана (С3), циклобутана (С4), циклопентана (C5), циклогексана (С6), циклогептана (С7), метилциклопропана (С4), диметилциклопропана (C5), метилциклобутана (C5), диметилциклобутана (С6), метилциклопентана (С6), диметилциклопентана (С7) и метилциклогексана (С7);
ненасыщенных моноциклических углеводородных соединений: циклопропена(С3), циклобутена (С4), циклопентена (C5), циклогексена (С6), метилциклопропена (С4), диметилциклопропена (C5), метилциклобутена (C5), диметилциклобутена (С6), метилциклопентена (С6), диметилциклопентена (С7) и метилциклогексена (С7); и насыщенных полициклических углеводородных соединений: норкарана (С7), норпинана (С7), норборнана (С7).
С3_20 гетероциклил. Термин С3_20 гетероциклил в данном контексте относится к одновалентному фрагменту, полученному посредством отщепления атома водорода от кольцевого атома гетероциклического соединения, и указанный фрагмент содержит от 3 до 20 кольцевых атомов, из которых от 1 до 10 являются кольцевыми гетероатомами. Предпочтительно каждое кольцо содержит от 3 до 7 кольцевых атомов, из которых от 1 до 4 являются кольцевыми гетероатомами.
В данном контексте приставки (например, С3-20, С3-7, C5-6 и т.д.) означают количество кольцевых атомов или диапазон количества кольцевых атомов, будь-то атомы углерода или гетероатомы. Например, термин C5-6 гетероциклил в данном контексте относится к гетероциклильной группе, содержащей 5 или 6 кольцевых атомов.
Примеры моноциклических гетероциклильных групп включают, но не ограничиваются этим, группы, полученные из
N1: азиридина (С3), азетидина (С4), пирролидина (тетрагидропиррола) (C5), пирролина (например, 3пирролина, 2,5-дигидропиррола) (C5), 2Н-пиррола или 3Н-пиррола (изопиррола, изоазола) (C5), пиперидина (С6), дигидропиридина (С6), тетрагидропиридина (С6), азепина (С7);
О1: оксирана (С3), оксетана (C4), оксолана (тетрагидрофурана) (C5), оксола (дигидрофурана) (C5), оксана (тетрагидропирана) (С6), дигидропирана (С6), пирана (С6), оксепина (С7);
Sv тиирана (С3), тиетана (С4), тиолана (тетрагидротиофена) (C5), тиана (тетрагидротиопирана) (С6), тиепана (С7);
О2: диоксолана (C5), диоксана (С6) и диоксепана (С7);
О3: триоксана (С6);
N2: имидазолидина (C5), пиразолидина (диазолидина) (C5), имидазолина (C5), пиразолина (дигидропиразола) (C5), пиперазина (С6);
N1O1: тетрагидрооксазола (C5), дигидрооксазола (C5), тетрагидроизоксазола (C5), дигидроизоксазола (C5), морфолина (С6), тетрагидрооксазина (С6), дигидрооксазина (С6), оксазина (С6);
N1S1: тиазолина (C5), тиазолидина (C5), тиомофролина (С6);
N2O1: оксадиазина (С6);
O1S1: оксатиола (C5) и оксатиана (тиоксана) (С6); и
N1O1S1: оксатиазина (С6).
Примеры замещенных моноциклических гетероциклильных групп включают группы, полученные из сахаридов в циклической форме, например из фураноз (C5), таких как арабинофураноза, ликсофураноза, рибофураноза и ксилофураноза, и пираноз (С6), таких как аллопираноза, альтропираноза, глюкопираноза, маннопираноза, гулопираноза, идопираноза, галактопираноза и талопираноза.
С5-20 арил. Термин С5-20 арил в данном контексте относится к одновалентному фрагменту, полученному посредством отщепления атома водорода от ароматического кольцевого атома ароматического соединения, и указанный фрагмент содержит от 3 до 20 кольцевых атомов. Термин C5-7 арил в данном контексте относится к одновалентному фрагменту, полученному посредством отщепления атома водорода от ароматического кольцевого атома ароматического соединения, и указанный фрагмент содержит от 5 до 7 кольцевых атомов, а термин C5-10 арил в данном контексте относится к одновалентному фрагменту, полученному посредством отщепления атома водорода от ароматического кольцевого атома аро
- 8 039276 матического соединения, и указанный фрагмент содержит от 5 до 10 кольцевых атомов. Предпочтительно каждое кольцо содержит от 5 до 7 кольцевых атомов.
В данном контексте приставки (например, С3-20, С5-7, C5-6, С5.ю и т.д.) означают количество кольцевых атомов или диапазон количества кольцевых атомов, будь-то атомы углерода или гетероатомы. Например, термин С5-6 арил в данном контексте относится к арильной группе, содержащей 5 или 6 кольцевых атомов.
Все кольцевые атомы могут представлять собой атомы углерода, как в карбоарильных группах. Примеры карбоарильных групп включают, но не ограничиваются этим, группы, полученные из бензола (т.е. фенил) (С6), нафталина (С10), азулена (С10), антрацена (С14), фенантрена (С14), нафтацена (C1s) и пирена (C16).
Примеры арильных групп, которые содержат конденсированные кольца, по меньшей мере одно из которых является ароматическим кольцом, включают, но не ограничиваются этим, группы, полученные из индана (например, 2,3-дигидро-1Н-индена) (С9), индена (С9), изоиндена (С9), тетралина (1,2,3,4тетрагидронафталина (С10), аценафтена (С12), флуорена (С13), феналена (С13), ацетфенантрена (C15) и ацеантрена (C16).
Альтернативно, кольцевые атомы могут включать один или более гетероатомов, как в гетероарильных группах. Примеры моноциклических гетероарильных групп включают, но не ограничиваются этим, группы, полученные из
Np пиррола (азола) (C5), пиридина (азина) (С6);
Оу фурана (оксола) (C5);
Sy тиофена (тиола) (C5);
N1O1: оксазола (C5), изоксазола (C5), изоксазина (С6);
N2O1: оксадиазола (фуразана) (C5);
N3O1: оксатриазола (C5);
N1S1: тиазола (C5), изотиазола (C5);
N2: имидазола (1,3-диазола) (C5), пиразола (1,2-диазола) (C5), пиридазина (1,2-диазина) (С6), пиримидина (1,3-диазина) (С6) (например, цитозина, тимина, урацила), пиразина (1,4-диазина) (С6);
N3: триазола (C5), триазина (С6); и
N4: тетразола (C5).
Примеры гетероарила, содержащего конденсированные кольца, включают, но не ограничиваются этим,
C9 (с 2 конденсированным кольцами), полученные из бензофурана (O1), изобензофурана (O1), индола (N1), изоиндола (N1), индолизина (N1), индолина (N1), изоиндолина (N1), пурина (N4) (например, аденина, гуанина), бензимидазола (N2), индазола (N2), бензоксазола (N1O1), бензизоксазола (N1O1), бензодиоксола (О2), бензофуразана (N2O1), бензотриазола (N3), бензотиофурана (S1), бензотиазола (N1S1), бензотиадиазола (N2S);
С10 (с 2 конденсированными кольцами), полученные из хромена (O1), изохромена (O1), хромана (O1), изохромана (O1), бензодиоксана (О2), хинолина (N1), изохинолина (N1), хинолизина (N1), бензоксазина (N1O1), бензодиазина (N2), пиридопиридина (N2), хиноксалина (N2), хиназолина (N2), циннолина (N2), фталазина (N2), нафтиридина (N2), птеридина (N4);
C11 (с 2 конденсированными кольцами), полученные из бензодиазепина (N2);
С13 (с 3 конденсированными кольцами), полученные из карбазола (N1), дибензофурана (O1), дибензотиофена (S1), карболина (N2), перимидина (N2), пиридоиндола (N2); и
C14 (с 3 конденсированными кольцами), полученные из акридина (N1), ксантена (O1), тиоксантена (S1), оксантрена (О2), феноксатиина (O1S1), феназина (N2), феноксазина (N1O1), фенотиазина (N1S1), тиантрена (S2), фенантридина (N1), фенантролина (N2), феназина (N2).
Вышеперечисленные группы, отдельно или как часть другого заместителя, сами могут быть необязательно замещены одной или более группами, выбранными из них самих и дополнительных заместителей, перечисленных ниже.
Галоген -F, -Cl, -Br и -I. Гидрокси -ОН.
Простой эфир: -OR, где R представляет собой заместитель простого эфира, например C1_7алкильную группу (также упоминаемый как C1.7алкоксигруппа, как описано ниже), С3_20гетероциклильную группу (также упоминаемый как С3_20гетероциклилоксигруппа), или C5.20арильную группу (также упоминаемый как C5_20 арилоксигруппа), предпочтительно C1_7алкильную группу.
Алкокси: -OR, где R представляет собой алкильную группу, например C1_7алкильную группу. Примеры C1-7 алкоксигрупп включают, но не ограничиваются этим, -ОМе (метокси), -OEt (этокси), -O(nPr) (н-пропокси), -O(iPr) (изопропокси), -O(nBu) (н-бутокси), -O(sBu) (втор-бутокси), -O(iBu) (изобутокси) и -O(tBu) (трет-бутокси).
Ацаталь: -CH(OR1)(OR2), где R1 и R2 независимо представляют собой заместители ацеталя, например C1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно C1-7 алкильную группу, или в случае циклической ацетальной группы R1 и R2 вместе с двумя атомами кислорода, к которым они присоединены, и атомами углерода, к которым они присоединены, образуют
- 9 039276 гетероциклическое кольцо, содержащее от 4 до 8 кольцевых атомов. Примеры ацетальных групп включают, но не ограничиваются этим, -СН(ОМе)2, -CH(OEt)2 и -CH(OMe)(OEt).
Полуацеталь: -CH(OH)(OR1), где R1 представляет собой заместитель полуацеталя, например С1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно С1-7 алкильную группу. Примеры полуацетальных групп включают, но не ограничиваются этим, -СН(ОН)(ОМе) и -CH(OH)(OEt).
Кеталь: -CR(OR1)(OR2), где R1 и R2 являются такими, как определено для ацеталей, и R представляет собой заместитель кеталя, отличный от водорода, например С1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно С1-7 алкильную группу. Примеры кетальных групп включают, но не ограничиваются этим, -С(Ме)(ОМе)2, -C(Me)(OEt)2, -C(Me)(OMe)(OEt), -C(Et)(OMe)2, -C(Et)(OEt)2 и -C(Et)(OMe)(OEt).
Полукеталь: -CR(OH)(OR1), где R1 является таким, как определено для полуацеталей, и R представляет собой заместитель полукеталя, отличный от водорода, например С1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно С1-7 алкильную группу. Примеры полуацетальных групп включают, но не ограничиваются этим, -С(Ме)(ОН)(ОМе), -C(Et)(OH)(OMe), -C(Me)(OH)(OEt) и -C(Et)(OH)(OEt).
Оксо (кето, -он): =O. Тион (тиокетон): =S.
Имино (имин): =NR, где R представляет собой заместитель иминогруппы, например, водород, С1-7 алклиьную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно водород или С1-7 алкильную группу. Примеры сложноэфирных групп включают, но не ограничиваются этим, =NH, =NMe, =NEt и =NPh.
Формил-(карбальдегид, карбоксальдегид): -С(=О)Н.
Ацил-(кето): -C(=O)R, где R представляет собой заместитель ацила, например С1-7 алкильную группу (также упоминаемый как С1-7 алкилацил или С1-7 алканоил), С3-20 гетероциклильную группу (также упоминаемый как С3-20 гетероциклилацил) или С5-20 арильную группу (также упоминаемый как С5-20 арилацил), предпочтительно С1-7 алкильную группу. Примеры ацильных групп включают, но не ограничиваются этим, -С(=О)СН3 (ацетил), -С(=О)СН2СН3 (пропионил), -С(=О)С(СН3)3 (трет-бутирил) и -C(=O)Ph (бензоил, фенон).
Карбокси (карбоновая кислота): -С(=О)ОН.
Тиокарбокси (тиокарбоновая кислота): -C(=S)SH.
Тиолокарбокси (тиолокарбоновая кислота): -C(=O)SH.
Тионокарбокси (тионокарбоновая кислота): -C(=S)OH.
Имидокислота: -C(=NH)OH.
Гидроксамовая кислота: -C(=NOH)OH.
Сложный эфир (карбоксилат, сложный эфир карбоновой кислоты, оксикарбонил): -C(=O)OR, где R представляет собой заместитель сложного эфира, например С1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно С1-7 алкильную группу. Примеры сложноэфирных групп включают, но не ограничиваются этим, -С(=О)ОСН3, -С(=О)ОСН2СН3, -С(=О)ОС(СН3)3 и -C(=O)OPh.
Ацилокси (обратный сложный эфир): -OC(=O)R, где R представляет собой заместитель ацилоксигруппы, например С1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно С1-7 алкильную группу. Примеры ацилоксигрупп включают, но не ограничиваются этим, -ОС(=О)СН3 (ацетокси), -ОС(=О)СН2СН3, -ОС(=О)С(СН3)3, -OC(=O)Ph и -OC(=O)CH2Ph.
Оксикарбоилокси: -OC(=O)OR, где R представляет собой заместитель сложного эфира, например С1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно С1-7 алкильную группу. Примеры сложноэфирных групп включают, но не ограничиваются этим, -ОС(=О)ОСН3, -ОС(=О)ОСН2СН3, -ОС(=О)ОС(СН3)3 и -OC(=O)OPh.
Амино: -NR1R2, где R1 и R2 независимо представляют собой заместители для амино, например водород, С1-7 алкильную группу (также упоминаемый как С1-7 алкиламино или ди-С1-7 алкиламино), С3-20 гетероциклильную группу ил С5-20 арильную группу, предпочтительно Н или С1-7 алкильную группу, или в случае циклической аминогруппы R1 и R2 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют гетероциклическое кольцо, содержащее от 4 до 8 кольцевых атомов. Аминогруппы могут быть первичными (-NH2), вторичными (-NHR1) или третичными (-NHR1R2), и в катионной форме могут быть четвертичными (-+NR1R2R3). Примеры аминогрупп включают, но не ограничиваются этим, -NH2, -NHCH3, -NHC(CH3)2, -N(CH3)2, -N(CH2CH3)2 и -NHPh. Примеры циклических аминогрупп включают, но не ограничиваются этим, азиридино, азетидино, пирролидино, пиперидино, пиперазино, морфолино и тиоморфолино.
Амидо (карбамоил, карбамид, аминокарбонил, карбоксамид): -C(=O)NR1R2, где R1 и R2 независимо представляют собой заместители для амино, как определено для аминогрупп. Примеры амидогрупп включают, но не ограничиваются этим, -C(=O)NH2, -C(=O)NHCH3, -C(=O)N(CH3)2, -C(=O)NHCH2CH3 и -C(=O)N(CH2CH3)2, а также амидогруппы, в которых R1 и R2 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют гетероциклическую структуру, как, например, в пиперидинокарбониле, морфоли
- 10 039276 нокарбониле, тиоморфолинокарбониле и пиперазинокарбониле.
Тиоамидо (тиокарбамил): -C(=S)NR1R2, где R1 и R2 независимо представляют собой заместители для амино, как определено для аминогрупп. Примеры амидогрупп включают, но не ограничиваются этим, -C(=S)NH2, -C(=S)NHCH3, -C(=S)N(CH3)2 и -C(=S)NHCH2CH3.
Ациламидо (ациламино): -NR1C(=O)R2, где R1 представляет собой заместитель амида, например водород, C1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно водород или C1-7 алкильную группу, и R2 представляет собой заместитель ацила, например C1.7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно водород или Ci.7 алкильную группу. Примеры ациламидных групп включают, но не ограничиваются этим, -NHC(=O)CH3, -NHC(=O)CH2CH3 и -NHC(=O)Ph. R1 и R2 могут вместе образовывать циклическую структуру, как, например, в сукцинимидиле, малеимидиле и фталимидиле
Аминокарбонилокси: -OC(=O)NR1R2, где R1 и R2 независимо представляют собой заместители для амино, как определено для аминогрупп. Примеры аминокарбонилоксигрупп включают, но не ограничиваются этим, -OC(=O)NH2, -OC(=O)NHMe, -OC(=O)NMe2 и -OC(=O)NEt2.
Уреидо: -N(R1)CONR2R3, где R2 и R3 независимо представляют собой заместители аминогруппы, как определено для аминогрупп, и R1 представляет собой заместитель уреидогруппы, например водород, C1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно водород или C1-7 алкильную группу. Примеры уреидогрупп включают, но не ограничиваются этим, -NHCONH2, -NHCONHMe, -NHCONHEt, -NHCONMe2, -NHCONEt2, -NMeCONH2, -NMeCONHMe, -NMeCONHEt, -NMeCONMe2 и -NMeCONEt2.
Гуанидино: -NH-C(=NH)NH2.
Тетразолил: пятичленное ароматическое кольцо, содержащее четыре атома азота и один атом углерода
Имино: =NR, где R представляет собой заместитель иминогруппы, например водород, C1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно Н или C1-7 алкильную группу. Примеры иминогрупп включают, но не ограничиваются этим, =NH, =NMe и =NEt.
Амидин (амидино): -C(=NR)NR2, где каждый R представляет собой заместитель амидина, например водород, C1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно Н или C1-7 алкильную группу. Примеры амидиновых групп включают, но не ограничиваются этим, -C(=NH)NH2, -C(=NH)NMe2 и -C(=NMe)NMe2.
Нитро: -NO2.
Нитрозо: -NO.
Азидо: -N3.
Циано (нитрил, карбонитрил): -CN.
Изоциано: -NC.
Цианато: -OCN.
Изоцианато: -NCO.
Тиоциано (тиоцианато): -SCN.
Изотиоциано (изотиоцианато): -NCS.
Сульфгидрил-(тиол, меркапто): -SH.
Простой тиоэфир (сульфид): -SR, где R представляет собой заместитель простого тиоэфира, например C1-7 алкильную группу (также упоминаемый как C1-7 алкилтиогруппа), С3-20 гетероциклильную группу или C5-20 арильную группу, предпочтительно C1-7 алкильную группу. Примеры С1-7алкилтиогрупп включают, но не ограничиваются этим, -SCH3 и -SCH2CH3.
Дисульфид: -SS-R, где R представляет собой заместитель дисульфида, например C1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или C5-20 арильную группу, предпочтительно C1-7 алкильную группу (также упоминаемый как C1-7 алкилдисульфид). Примеры C1-7 алкилдисульфидных групп включают, но не ограничиваются этим, -SSCH3 и -SSCH2CH3.
Сульфин (сульфинил, сульфоксид): -S(=O)R, где R представляет собой заместитель сульфина, например C1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или C5-20 арильную группу, предпочтительно C1-7 алкильную группу. Примеры сульфиновых групп включают, но не ограничиваются этим,
- 11 039276
-S(=O)CH3 и -S(=O)CH2CH3.
Сульфон (сульфонил): -S(=O)2R, где R представляет собой заместитель сульфона, например C1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно C1-7 алкильную группу, включая, например, фторированную или перфторированную C1-7 алкильную группу. Примеры сульфоновых групп включают, но не ограничиваются этим, -S(=O)2CH3 (метансульфонил, мезил), -S(=O)2CF3 (тритил), -S(=O)2CH2CH3 (эзил), -S(=O)2C4F9 (нонафлил), -S(=O)2CH2CF3 (трезил), -S(=O)2CH2CH2NH2 (таурил), -S(=O)2Ph (фенилсульфонил, безил), 4-метилфенилсульфонил-(тозил), 4хлорфенилсульфонил-(клозил), 4-бромфенилсульфонил-(брозил), 4-нитрофенил-(нозил), 2-нафталинсульфонат (напсил) и 5-диметиламинонафталин-1-илсульфонат (дансил).
Сульфиновая кислота (сульфино): -S(=O)OH, -SO2H.
Сульфоновая кислота (сульфо): -S(=O)2OH, -SO3H.
Сульфинат (сложный эфир сульфиновой кислоты): -S(=O)OR; где R представляет собой заместитель сульфината, например C1-7 алкильную группу, С3_20 гетероциклильную группу или С5_20 арильную группу, предпочтительно C1-7 алкильную группу. Примеры сульфинатных групп включают, но не ограничиваются этим, -S(=O)OCH3 (метоксисульфинил; метилсульфинат) и -S(=O)OCH2CH3 (этоксисульфинил; этилсульфинат).
Сульфонат (сложный эфир сульфоновой кислоты): -S(=O)2OR, где R представляет собой заместитель сульфоната, например C1-7 алкильную группу, С3_20 гетероциклильную группу или С5_20 арильную группу, предпочтительно C1-7 алкильную группу. Примеры сульфонатных групп включают, но не ограничиваются этим, -S(=O)2OCH3 (метоксисульфонил; метилсульфонат) и -S(=O)2OCH2CH3 (этоксисульфонил; этилсульфонат).
Сульфинилокси: -OS(=O)R, где R представляет собой заместитель сульфинилоксигруппы, например C1-7 алкильную группу, С3_20 гетероциклильную группу или С5_20 арильную группу, предпочтительно C1-7 алкильную группу. Примеры сульфинилоксигрупп включают, но не ограничиваются этим, -OS(=O)CH3 и -OS(=O)CH2CH3.
Сульфонилокси: -OS(=O)2R, где R представляет собой заместитель сульфонилоксигруппы, например C1-7 алкильную группу, С3_20 гетероциклильную группу или С5_20 арильную группу, предпочтительно C1-7 алкильную группу. Примеры сульфонилоксигрупп включают, но не ограничиваются этим, -OS(=O)2CH3 (мезилат) и -OS(=O)2CH2CH3 (эзилат).
Сульфат: -OS(=O)2OR; где R представляет собой заместитель сульфата, например C1-7 алкильную группу, С3_20 гетероциклильную группу или С5_20 арильную группу, предпочтительно C1-7 алкильную группу. Примеры сульфатных групп включают, но не ограничиваются этим, -OS(=O)2OCH3 и -SO(=O)2OCH2CH3.
Сульфамил-(сульфамоил; амид сульфиновой кислоты; сульфинамид): -S(=O)NR1R2, где R1 и R2 независимо представляют собой заместители для амино, как определено для аминогрупп. Примеры сульфамильных групп включают, но не ограничиваются этим, -S(=O)NH2, -S(=O)NH(CH3), -S(=O)N(CH3)2, -S(=O)NH(CH2CH3), -S(=O)N(CH2CH3)2 и -S(=O)NHPh.
Сульфонамидо (сульфинамоил; амид сульфоновой кислоты; сульфонамид): -S(=O)2NR1R2, где R1 и R2 независимо представляют собой заместители для амино, как определено для аминогрупп. Примеры сульфонамидогрупп включают, но не ограничиваются этим, -S(=O)2NH2, -S(=O)2NH(CH3), -S(=O)2N(CH3)2, -S(=O)2NH(CH2CH3), -S(=O)2N(CH2CH3)2 и -S(=O)2NHPh.
Сульфамино: -NR1S(=O)2OH, где R1 представляет собой заместитель аминогруппы, как определено для аминогрупп. Примеры сульфаминогрупп включают, но не ограничиваются этим, -NHS(=O)2OH и -N(CH3)S(=O)2OH.
Сульфонамино: -NR1S(=O)2R, где R1 представляет собой заместитель аминогруппы, как определено для аминогрупп, и R представляет собой заместитель сульфонаминогруппы, например C1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно C1-7 алкильную группу. Примеры сульфонаминогрупп включают, но не ограничиваются этим, -NHS(=O)2CH3 и -N(CH3)S(=O)2C6H5.
Сульфинамино: -NR1S(=O)R, где R1 представляет собой заместитель аминогруппы, как определено для аминогрупп, и R представляет собой заместитель сульфинаминогруппы, например C1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно C1-7 алкильную группу. Примеры сульфинаминогрупп включают, но не ограничиваются этим, -NHS(=O)CH3 и -N(CH3)S(=O)C6H5.
Фосфино (фосфин): -PR2, где R представляет собой заместитель фосфиногруппы, например -Н, C1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно -Н, C1-7 алкильную группу или С5-20 арильную группу. Примеры фосфиногрупп включают, но не ограничиваются этим, -РН2, -Р(СН3)2, -Р(СН2СН3)2, -P(t-Bu)2 и -P(Ph)2.
Фосфо: -Р(=О)2.
Фосфинил-(фосфиноксид): -P(=O)R2, где R представляет собой заместитель фосфинила, например C1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно C1-7 алкильную группу или С5-20 арильную группу. Примеры фосфинильных групп включают, но не ограни
- 12 039276 чиваются этим, -Р(=О)(СН3)2, -Р(=О)(СН2СН3)2, -P(=O)(t-Bu)2 и -P(=O)(Ph)2.
Фосфоновая кислота (фосфоно): -Р(=О)(ОН)2.
Фосфонат (фосфоновый сложный эфир): -P(=O)(OR)2, где R представляет собой заместитель фосфоната, например -Н, C1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно -Н, C1-7 алкильную группу или С5-20 арильную группу. Примеры фосфонатных групп включают, но не ограничиваются этим, -Р(=О)(ОСН3)2, -Р(=О)(ОСН2СН3)2, -P(=O)(O-t-Bu)2 и -P(=O)(OPh)2.
Фосфорная кислота (фосфоноокси): -ОР(=О)(ОН)2.
Фосфат (сложный фосфонооксиэфир): -OP(=O)(OR)2, где R представляет собой заместитель фосфата, например -Н, C1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно -Н, C1-7 алкильную группу или С5-20 арильную группу. Примеры фосфатных групп включают, но не ограничиваются этим, -ОР(=О)(ОСН3)2, -Ор(=0)(оСн2Сн3)2, -OP(=O)(O-t-Bu)2 и -OP(=O)(OPh)2.
Фосфористая кислота: -ОР(ОН)2.
Фосфит: -OP(OR)2, где R представляет собой заместитель фосфита, например -Н, C1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу, предпочтительно -Н, C1-7 алкильную группу или С5-20 арильную группу. Примеры фосфитных групп включают, но не ограничиваются этим, -ОР(ОСН3)2, -ОР(ОСН2СН3)2, -OP(O-t-Bu)2 и -OP(OPh)2.
Фосфорамидит: -OP(OR1)-NR22, где R1 и R2 представляют собой заместители фосфорамидита, например -Н, (необязательно замещенную) C1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или C5-20 арильную группу, предпочтительно -Н, C1-7 алкильную группу или C5-20 арильную группу. Примеры фосфорамидитных групп включают, но не ограничиваются этим, -OP(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2 и -OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2.
Фосфорамидат: -OP(=O)(OR1)-NR22, где R1 и R2 представляют собой заместители фосфорамидата, например -Н, (необязательно замещенную) C1-7 алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или C5-20 арильную группу, предпочтительно -Н, C1-7 алкильную группу или C5-20 арильную группу. Примеры фосфорамидатных групп включают, но не ограничиваются этим, -OP(=O)(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP(=O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2 и -OP(=O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2.
Алкилен.
С3-12 алкилен. Термин С3-12 алкилен в данном контексте относится к бидентатному фрагменту, полученному посредством отщепления двух атомов водорода от одного и того же атома углерода или от двух разных атомов углерода углеводородного соединения, содержащего от 3 до 12 атомов углерода (если не указано иное), которое может быть алифатическим или алициклическим, и которое может быть насыщенным, частично ненасыщенным или полностью ненасыщенным. Таким образом, термин алкилен включает подклассы алкенилена, алкинилена, циклоалкилена и т.д., рассмотренные ниже.
Примеры линейных насыщенных С3-12 алкиленовых групп включают, но не ограничиваются этим, -(СН2)п-, где n представляет собой целое число от 3 до 12, например -СН2СН2СН2- (пропилен), -СН2СН2СН2СН2- (бутилен), -СН2СН2СН2СН2СН2- (пентилен) и -СН2СН2СН2СН-2СН2СН2СН2- (гептилен).
Примеры разветвленных насыщенных С3-12 алкиленовых групп включают, но не ограничиваются этим, -СН(СН3)СН2-, -СН(СН3)СН2СН2-, -СН(СН3)СН2СН2СН2-, -СН2СН(СН3)СН2-,
-СН2СН(СН3)СН2СН2-, -СН(СН2СН3)-, -СН(СН2СН3)СН2- и -СН2СН(СН2СН3)СН2-.
Примеры линейных частично ненасыщенных С3-12 алкиленовых групп (С3-12 алкениленовых и алкиниленовых) групп включают, но не ограничиваются этим, -СН=СН-СН2-, -СН2-СН=СН2-, -СН=СН-СН2СН2-, -СН=СН-СН2-СН2-СН2-, -СН=СН-СН=СН-, -СН=СН-СН=СН-СН2-, -СН=СН-СН=СН-СН2-СН2-, -СН=СН-СН2-СН=СН-, -СН=СН-СН2-СН2-СН=СН- и -СН2-С С-СН2-.
Примеры разветвленных частично ненасыщенных С3-12 алкиленовых групп (С3-12 алкениленовых и алкиниленовых групп) включают, но не ограничиваются этим, -С(СН3)=СН-, -С(СН3)=СН-СН2-, -СН=СН-СН(СНз)- и -C С-01(С1 Ы-.
Примеры алициклических насыщенных С3-12 алкиленовых групп (С3.12 циклоалкиленов) включают, но не ограничиваются этим, циклопентилен (например, циклопент-1,3-илен) и циклогексилен (например, циклогекс-1,4-илен).
Примеры алициклических частично ненасыщенных С3-12 алкиленовых групп (С3-12 циклоалкиленов) включают, но не ограничиваются этим, циклопентилен (например, 4-циклопентен-1,3-илен), циклогексилен (например, 2-циклогексен-1,4-илен; 3-циклогексен-1,2-илен; 2,5-циклогексадиен-1,4-илен).
Звено лиганда.
Звенья лиганда для применения по данному изобретению представляют собой клеточносвязывающие агенты, более конкретно модифицированные антитела или их антиген-связывающие фрагменты, содержащие по меньшей мере один сайт конъюгации в каждой тяжелой цепи. Примеры конкретных модифицированных антител, пригодных для применения по данному изобретению, описаны в публикации WO 2012/064733 (поданной как PCT/US 2011/059775), которая включена в данный документ посредст
- 13 039276 вом ссылки.
Антитела.
Термин антитело в данном контексте использован в самом широком смысле и включает, в частности, моноклональные антитела, поликлональные антитела, димеры, мультимеры, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и фрагменты антител, при условии, что они демонстрируют требуемую биологическую активность (Miller et al. (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). Антитела могут быть мышиными, человеческими, гуманизированными, химерными или полученными из других видов. Антитело представляет собой белок, созданный иммунной системой, который способен распознавать и связываться со специфическим антигеном. (Janeway, С., Travers, P., Walport, М., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5-е изд., Garland Publishing, Нью-Йорк). Антиген мишени обьино имеет множество связывающих сайтов, также называемых эпитопами, которые распознаются определяющими комплементарность областями (CDR) различных антител. Каждое антитело, которое специфически связывается с другим эпитопом, имеет другую структуру. Так, один антиген может иметь более одного соответствующего антитела. Антитело включает полноразмерную молекулу иммуноглобулина или иммунологически активную часть полноразмерной молекулы иммуноглобулина, т.е. молекулу, которая содержит антиген-связывающий сайт, который иммуноспецифически связывается с антигеном рассматриваемой мишени или его частью, и такие мишени включают, но не ограничиваются ими, раковые клетки или клетки, которые вырабатывают аутоиммунные антитела, связанные с аутоиммунным заболеванием. Иммуноглобулин может быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса иммуноглобулиновых молекул. Иммуноглобулины могут быть получены из любых видов животных, включая человека, мышей или кроликов.
Фрагменты антител содержат часть полноразмерного антитела, обычно его антигенсвязывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антител включают фрагменты F(ab')2 и scFv, а также димерные эпитоп-связывающие фрагменты любых вышеперечисленных, которые иммуноспецифически связываются с антигенами раковых клеток, вирусными антигенами или микробными антигенами, одноцепочечными молекулами антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
Модифицированные антитела, пригодные для применения по данному изобретению, включают те, в которых природные межцепочечные цистеиновые остатки заменены на аминокислотные остатки, не содержащие тиольных групп. Такие антитела могут содержать по меньшей мере одну дополнительную замену в каждой тяжелой цепи аминокислотного остатка, содержащую реакционноспособную группу, пригодную для конъюгации с линкером. Дополнительно замещенная аминокислота может быть цистеином или неприродной аминокислотой. Замененное положение может быть выбрано из следующих:
Антитело Изотип IgGl IgG2 IgG3 IgG4
Положение(по Кабату, ЕС) и со ответству ющая аминокислота 239 Ser Ser Ser Ser
282 Vai Vai Vai Vai
289 Thr Thr Thr Thr
297 Asn Asn Asn Asn
312 Asp Asp Asp Asp
324 Ser Ser Ser Ser
330 Ala Ala Ala Ser
335 Thr Thr Thr Thr
337 Ser Ser Ser Ser
339 Ala Thr Thr Ala
356 Glu Glu Glu Glu
359 Thr Thr Thr Thr
361 Asn Asn Asn Asn
383 Ser Ser Ser Ser
384 Asn Asn Ser Asn
398 Leu Leu Leu Leu
400 Ser Ser Ser Ser
422 Vai Vai He Vai
440 Ser Ser Ser Ser
442 Ser Ser Ser Ser
- 14 039276
Примеры модифицированных антител, пригодных для применения по данному изобретению, включают структуры Flexmab, описанные в публикации WO 2012/064733, содержание которой включено в данный документ. Такие структуры Flexmab содержат цистеин со свободными тиольными группами в шарнирной области антитела, которые могут быть использованы в качестве сайтов конъюгации для связывания через группы N10 PBD по данному изобретению.
Другие примеры модифицированных антител, пригодных для применения по данному изобретению, включают антитела, в которых цистеиновые остатки вставлены в выборочные сайты антитела. Они описаны в публикации Dimasi, N., et al., Molecular Pharmaceutics, 2017, 14, 1501-1516 (DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.6b00995) и WO 2015/157595. В частности, пригодны антитела, которые модифицированы посредством вставки цистеина после положения S239 (т.е. между положениями 239 и 240).
Сделана ссылка на перечень на стр. 60-62 публикации WO 2012/064733, содержание которой включено в данный документ. В некоторых вариантах реализации антитело может представлять собой опухолеассоциированный антиген, например HER2 (ErbB2); EPHA2 (ЕРН рецептор А2); CD19; IL2RA (рецептор интерлейкина 2,α.
Опухолеассоциированные антигены и когнатные антитела для применения в вариантах реализации данного изобретения перечислены ниже и более подробно описаны на стр. 14-86 публикации 2017/186894, которая включена в данный документ.
(1) BMPR1B (рецептор костного морфогенетического белка типа IB), (2) Е16 (LAT1, SLC7A5), (3) STEAP1 (шестой трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы), (4) 0772Р (СА125, MUC16), (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, фактор стимуляции мегакариоцитов, мезотелин), (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, семейство носителей растворенных веществ 34 (фосфат натрия), член 2, тип II, натрийзависимый фосфатный транспортер 3b), (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Hlog семафорина 5b, домен sema, из семи тромбоспондиновых повторов (типа 1 и подобных типу 1), трансмембранный домен (ТМ) и короткий цитоплазматический домен, (семафорин) 5В), (8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, кДНК RIKEN 2700050C12, кДНК RIKEN, ген 2700050С12), (9) ETBR (рецептор эндотелина типа В), (10) MSG783 (RNF124, гипотетический белок FLJ20315), (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, ассоциированный с раком предстательной железы ген 1, ассоциированный с раком предстательной железы белок 1, шестой трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы 2, шестой трансмембранный белок предстательно железы), (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, катионный канал транзиторного рецепторного потенциала 5, подсемейство М, член 4), (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, фактор роста, полученный из тератокарциномы), (14) CD21 (CR2 (рецептор комплемента 2) или C3DR (С3d/рецептор вируса Эпштейна-Барра) или Hs.73792), (15) CD79b (CD79B, CD79e, IGb (иммуноглобулин-ассоциированный, бета), В29), (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (домен SH2, содержащий якорный белок фосфатазы 1a), SPAP1B, SPAP1C), (17) HER2 (ErbB2), (18) NCA (CEACAM6), (19) MDP (DPEP1), (20) IL20R-a (IL20Ra, ZCYTOR7), (21) Brevican (bCAN, BEHAB), (22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5), (23) ASLG659 (B7h), (24) PSCA (предшественник антигена стволовых клеток предстательной железы), (25) GEDA, (26) BAFF-R (рецептор фактора активации В-клеток, рецептор BLyS 3, BR3), (27) CD22 (изоформа В CD22 рецептора В-клеток, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814) (27а) CD22 (молекула CD22), (28) CD79a (CD79A, CD79alpha), иммуноглобулин-ассоциированный альфа, специфичный к Вклеткам белок, который ковалентно взаимодействует с Ig бета (CD79B) и образует комплекс на поверхности с молекулами IgM, передает сигнал, участвующий в дифференцировке В-клеток), pI: 4,84, СС: 25028 ТМ: 2 [Р] хромосома гена: 19q13.2), (29) CXCR5 (рецептор 1 лимфомы Беркитта, рецептор, связанный с белком G, который активируется хемокином CXCL13, участвует в миграции лимфоцитов и гуморальной защите, играет роль в инфек
- 15 039276 ции ВИЧ-2 и возможно развитии СПИДа, лимфомы, миеломы и лейкоза); 372 аа, pI: 8,54, ММ: 41959 ТМ: 7 [Р] хромосома гена: 1 lq23.3, (30) HLA-DOB (β-субъединица молекулы II класса МНС (антиген Ia), которая связывает пептиды и предоставляет их в лимфоциты CD4+ Т); 273 аа, pi: 6,56, ММ: 30820, ТМ: 1 [Р] хромосома гена: 6р21.3), (31) Р2Х5 (лиганд-управляемый ионный канал 5 пуринергического рецептора Р2Х, ионный канал, управляемый внеклеточной АТФ, может участвовать в синаптической трансмисиии и нейрогенезе, дефицит может способствовать патофизиологии идиопатической нестабильности детрузора); 422 аа), pI: 7.63, ММ: 47206 ТМ: 1 [Р] хромосома гена: 17р13.3), (32) CD72 (антиген дифференцировки В-клеток CD72, Lyb-2); 359 аа, pI: 8,66, ММ: 40225, ТМ: 1 5 [Р] хромосома гена: 9р13.3), (33) LY64 (лимфоцитарный антиген 64 (RP105), мембранный белок I типа семейства с высоким содержанием лейцина (LRR), регулирует активацию и апоптоз В-клеток, потеря функции связана с повышенной активностью заболевания у пациентов с системной красной волчанкой); 661 аа, pI: 6,20, ММ: 74147 ТМ: 1 [Р] хромосома гена: 5q12), (34) FcRH1 (рецепторподобный белок 1 Fc, предполагаемый рецептор к домену Fc иммуноглобулина, который содержит Ig-подобный домен типа С2 и домен ITAM, может играть роль в дифференцировке В-лимфоцитов); 429 аа, pi: 5,28, ММ: 46925 ТМ: 1 [Р] хромосома гена: Iq21-lq22), (35) IRTA2 (рецептор иммуноглобулинового суперсемейства, ассоциированный с транслокацией 2, предполагаемый иммунорецептор с возможным участием в развитии В-клеток и лимфомагенезе; разрегуляция гена вследствие транслокации происходит при некоторых В-клеточных злокачественных заболеваниях); 977 аа, pi: 6,88, ММ: 106468, ТМ: 1 [Р] хромосома гена: Iq21), (36) TENB2 (TMEFF2, томорегулин, TPEF, HPP1, TR, предполагаемый трансмембранный протеогликан, связанный с семейством EGF/герегулина факторов роста и фоллистатина); 374 аа), (37) PSMA - FOLH1 (фолатгидролаза (простата-специфический мембранный антиген 1), (38) SST (рецептор соматостатина; следует учитывать, что существует 5 подтипов) (38 .1) SSTR2 (рецептор соматостатина 2), (38 .2) SSTR5 (рецептор соматостатина 5), (38 .3) SSTR1, (38 .4) SSTR3, (38 .5) SSTR4,
AvB6 - обе субъединицы (39+40), (39) ITGAV (интегрин, aV) (40) ITGB6 (интегрин, β6), (41) СЕАСАМ5 (молекула клеточной адгезии 5, связанная с карциноэмбриональным антигеном), (42) МЕТ (прото-онкоген met; рецептор фактора роста гепатоцитов), (43) MUC1 (муцин 1, связанный с клеточной поверхностью), (44) СА9 (карбонангидраза IX), (45) EGFRvIII (рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), транскрипционный вариант 3), (46) CD33 (молекула CD33), (47) CD19 (молекула CD19), (48) IL2RA (рецептор интерлейкина 2,a); эталонная последовательность NCBI: NM000417.2), (49) AXL (рецепторная тирозинкиназа AXL), (50) CD30 - TNFRSF8 (8 член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли), (51) ВСМА (антиген созревания В-клеток) - TNFRSF17 (17 член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли), (52) СТ Ags - СТА (антигены рака яичек), (53) CD174 (Льюис Y) - FUT3 (фукозилтрансфераза 3 (галактозид-3(4)Щ-фукозилтрансфераза, группа крови Льюиса), (54) CLEC14A (член А семейства 14 лектиновых доменов С-типа; Genbank, номер доступа NM175060), (55) GRP78 - HSPA5 (белок 5 теплового шока 70 кДа (глюкозорегулируемый белок, 78 кДа), (56) CD70 (молекула CD70) L08096, (57) Антигены, специфические для стволовых клеток. Например, 5Т4 (см. строку (63) ниже), CD25 (см. строку (48) выше), CD32, LGR5/GPR49 Проминин/CD133, (58) ASG-5, (59) ENPP3 (эктонуклеотидная пирофосфатаза/фосфодиэстераза 3), (60) PRR4 (пролин-богатый 4 (лакримальный)), (61) GCC - GUCY2C (гуанилатциклаза 2С (рецептор термостабильного энтеротоксина), (62) Liv-1 - SLC39A6 (6 член семейства носителей растворенных веществ 39 (транспортер цинка)), (63) 5Т4, трофобластный гликопротеин, TPBG - TPBG (трофобластный гликопротеин), (64) CD56 - NCMA1 (молекула адгезии нервных клеток 1),
- 16 039276 (65) CanAg (опухолеассоциированный антиген СА242), (66) FOLR1 (фолатный рецептор 1), (67) GPNMB (гликопротеин (трансмембранный) nmb), (68) TIM-1 - HAVCR1 (клеточный рецептор 1 вируса гепатита А), (69) RG-1/мишень опухоли предстательной железы Mindin-Mindin/RG-1, (70) В7-Н4 - VTCN1 (ингибитор 1 активации Т-клеток, содержащий V-образный домен), (71) PTK7 (протеинтирозинкиназа 7 PTK7), (72) CD37 (молекула CD37), (73) CD138 - SDC1 (синдекан 1), (74) CD74 (молекула CD74, главный комплекс гистосовместимости, инвариантная цепь II класса), (75) Клаудины - CL (клаудины), (76) EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), (77) Her3 (ErbB3) - ERBB3 (гомолог 3 вирусного онкогена эритробластного лейкоза v-erb-b2 (птиц)), (78) RON - MST1R (макрофаг-стимулирующий рецептор 1 (c-met-родственная тирозинкиназа)), (79) ЕРНА2 (ЕРН рецептор А2), (80) CD20 - MS4A1 (трансмембранные 4-домены, подсемейство А, член 1), (81) Тенасцин С - TnC (тенасцин С), (82) FAP (α-белок активации фибробластов), (83) DKK-1 (Dickkopf 1 гомолог (Xenopus laevis), (84) CD52 (молекула CD52), (85) CS1 - SLAMF7 (7 член семейства SLAM), (86) Эндоглин - ENG (эндоглин), (87) Аннексин А1 - ANXA1 (аннексин А1), (88) V-CAM (CD106) - VCAM1 (молекула адгезии сосудистого эндотелия 1 типа).
Связывание линкерного звена со звеном лиганда.
Звено лиганда может быть связано с линкерным звеном через дисульфидную связь.
В одном варианте реализации связь между звеном лиганда и линкером лекарственного соединения образуется между тиольной группой цистеинового остатка в звене лиганда и малеимидной группой в звене лекарственного линкера. Другие возможные группы для связывания, а также образующиеся линкерные группы, представлены ниже.
Цистеиновые остатки звена лиганда могут быть доступны для реакции с функциональной группой линкерного звена с образованием связи. В других вариантах реализации, например, если звено лиганда представляет собой антитело, тиольные группы антитела могут участвовать в межцепочечных дисульфидных связях. Указанные межцепочечные связи можно превращать в свободные тиольные группы, например, посредством обработки антитела агентом DTT перед осуществлением реакции с функциональной группой линкерного звена.
В некоторых вариантах реализации цистеиновый остаток внедряют в тяжелую или легкую цепь антитела. Положения для вставки цистеина посредством замещения тяжелых или легких цепей антитела включают положения, описанные в опубликованной заявке США № 2007-0092940 и в публикации международного патента WO 2008/070593, которые включены в данный документ.
Способы лечения.
Соединения по данному изобретению можно использовать в способе терапии. Также предложен способ лечения, включающий введение субъекту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества конъюгата формулы I. Термин терапевтически эффективное количество означает количество, достаточное для обеспечения благоприятного эффекта для пациента. Такой благоприятный эффект может представлять собой облегчение по меньшей мере одного симптома. Фактически введенное количество, а также частота и схема введения зависят от природы и тяжести патологического состояния, подлежащего лечению. Назначение лечения, например определение дозы, входит в ответственность врачей общей практики и другого медицинского персонала.
Конъюгат можно вводить отдельно или в комбинации с другими способами лечения, одновременно или последовательно, в зависимости от патологического состояния, подлежащего лечению. Примеры способов лечения и терапий включают, но не ограничиваются ими, химиотерапию (введение активных агентов, включая, например, лекарства); хирургические операции; и лучевую терапию.
Фармацевтические композиции по данному изобретению и для применения в соответствии с данным изобретением могут содержать, помимо активного ингредиента, т.е. конъюгата формулы I, фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, носитель, буфер, стабилизатор или другие материалы, известные специалистам в данной области техники. Такие материалы должны быть нетоксичными и не должны влиять на эффективность активного ингредиента. Точная природа носителя или другого материала зависит от способа введения, который может быть пероральным, или посредством инъекции, например, кожной, подкожной или внутривенной.
Фармацевтические композиции для перорального введения могут быть в форме таблетки, капсулы,
- 17 039276 порошка или в жидкой форме. Таблетка может содержать твердый носитель или адъювант. Жидкие фармацевтические композиции обычно содержат жидкий носитель, такой как вода, нефтяной, животный или растительный жир, минеральное масло или синтетическое масло. Может быть включен физиологический солевой раствор, раствор декстрозы или другого сахарида или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль. Капсула может содержать твердый носитель, такой как желатин.
Для внутривенной, кожной или подкожной инъекции или инъекции в очаг поражения активный ингредиент должен быть в форме парентерально приемлемого водного раствора, который является апирогенным и имеет подходящий рН, изотоничность и стабильность. Специалисты в данной области техники могут получить подходящие растворы с применением, например, изотоничных сред, таких как раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, лактатный раствор Рингера для инъекций. При необходимости можно добавлять консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки.
Указанные конъюгаты можно использовать для лечения пролиферативного заболевания и аутоиммунного заболевания. Термин пролиферативное заболевание относится к нежелательной или неконтролируемой клеточной пролиферации избыточных или патологических клеток, которые являются нежелательными, такой как неопластический или гиперпластический рост in vitro или in vivo.
Примеры пролиферативных патологических состояний включают, но не ограничиваются ими, доброкачественную, предзлокачественную и злокачественную клеточную пролиферацию, включая, но не ограничиваясь этим, неоплазмы и опухоли (например, гистоцитому, глиому, астроцитому, остеому), рак (например, рак легких, мелкоклеточный рак легких, желудочно-кишечный рак, рак кишечника, рак толстой кишки, карцинома молочной железы, карцинома яичника, рак предстательной железы, рак яичек, рак печени, рак почек, рак молочного пузыря, рак поджелудочной железы, рак головного мозга, саркома, остеосаркома, саркома Капоши, меланома), лейкозы, псориаз, болезни костей, фибропролиферативные расстройства (например, соединительных тканей) и атеросклероз. Другие раковые заболевания, представляющие интерес, включают, но не ограничиваются ими, гематологические заболевания; злокачественные заболевания, такие как лекйозы и лимфомы, такие как неходжкинская лимфома и подтипы, такие как DLBCL, лимфома из клеток маргинальной зоны, из клеток мантийной зоны и фолликулярная лимфома, лимфома Ходжкина, AML и другие раковые заболевания из В- или Т-клеток.
Примеры аутоиммунного заболевания включают следующие: ревматоидный артрит, аутоиммунные демиелинизирующие заболевания (например, рассеянный склероз, аллергический энцефаломиелит), псориатический артрит, эндокринная офтальмопатия, увеоретинит, системная красная волчанка, миастения гравис, болезнь Грейса, гломерулонефрит, аутоиммунное гепатологическое расстройство, воспалительная болезнь кишечника(например, болезнь Крона), анафилаксия, аллергическая реакция, синдром Шегрена, сахарный диабет I типа, первичный билиарный цирроз, гранулематоз Вегенера, фибромиалгия, полимиозит, дерматомиозит, множественная эндокринная недостаточность, синдром Шмидта, аутоиммунный увеит, болезнь Аддисона, адреналит, тиреоидит, тиреоидит Хашимото, аутоиммунная болезнь щитовидной железы, перниционзная анемия, желудочная атрофия, хронический гепатит, волчаночный гепатит, атеросклероз, подострая кожная красная волчанка, гипопаратиреоз, синдром Дресслера, аутоиммунная тромбоцитопения, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, гемолитическая анемия, обыкновенная пузырчатка, пузырчатка, герпетиформный дерматит, очаговая алопеция, пемфигоид, склеродермия, прогрессирующий системный склероз, CREST-синдром (кальциноз, феномен Рейно, пищеводная дискинезия, склеродактилия и телеангиэктазия), аутоиммунное бесплодие мужчин и женщин, анкилозирующий спондилит, язвенный колит, смешанная болезнь соединительной ткани, нодозный полиартериит, системный некротизирующий васкулит, атопический дерматит, атопический ринит, синдром Гудпасчера, болезнь Шагаса, саркоидоз, ревматическая лихорадка, астма, привичный выкидыш, антифосфолипидный синдром, аллергический альвеолит фермеров, мультиформная эритема, посткардиотомный синдром, синдром Кушинга, аутоиммунный хронический активный гепатит, легочная аллергия птицеводов, токсический эпидермальный некролиз, синдром Альпорта, альвеолит, аллергический альвеолит, фиброзирующий альвеолит, интерстициальная болезнь легких, нодозная эритема, гангренозная пиодермия, трансфузионная реакция, артериит Такаясу, ревматическая полимиалгия, височный артериит, шистозомоз, гигантоклеточный артериит, аскаридоз, аспергиллоз, синдром Самптера, экзема, лимфоматоидный гранулематоз, болезнь Бехчета, синдром Каштана, болезнь Кавасаки, денге, энцефаломиелит, эндокардит, эдомиокардиальный фиброз, эндофтальмит, стойко возвышающаяся эритема, псориаз, эритробластоз плода, эозинофильный фасциит, синдром Шульмана, синдром Фелти, филяриоз, циклит, хронический циклит, гетерохронический циклит, циклит Фукса, нефроматия IgA, пурпура Геноха-Шонлейна, болезнь трансплантат против хозяина, отторжение трансплантата, кардиомиопатия, синдром Итона-Ламберта, рецидивирующий полихондрит, криоглобулинемия, макроглобулинемия Вальденстрема, синдром Эванса и аутоиммунная гонадная недостаточность.
В некоторых вариантах реализации аутоиммунное заболевание представляет собой расстройство Влимфоцитов (например, системная красная волчанка, синдром Гудпасчера, ревматоидный артрит и диабет I типа), Th1-лимфоцитов (например, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, псориаз, синдром Шегрена, тиреоидит Хашимото, болезнь Грейвса, первичный билиарный цирроз, гранулематоз Вегенера,
- 18 039276 туберкулез или болезнь трансплантат против хозяина) или Th2-лимфоцитов (например, атопический дерматит, системная красная волчанка, атопическая астма, риноконъюнктивит, аллергический ринит, синдром Оменна, системный склероз или хроническая болезнь трансплантат против хозяина). В целом, расстройства, затрагивающие дендритные клетки, включают расстройства Тй1-лимФоцитов или Th2лимфоцитов. В некоторых вариантах реализации аутоиммунное расстройство представляет собой иммунологическое расстройство, опосредованное Т-клетками.
В некоторых вариантах реализации количество введенного конъюгата составляет от около 0,01 до около 10 мг/кг на одну дозу. В некоторых вариантах реализации количество введенного конъюгата составляет от около 0,01 до около 5 мг/кг на одну дозу. В некоторых вариантах реализации количество введенного конъюгата составляет от около 0,05 до около 5 мг/кг на одну дозу. В некоторых вариантах реализации количество введенного конъюгата составляет от около 0,1 до около 5 мг/кг на одну дозу. В некоторых вариантах реализации количество введенного конъюгата составляет от около 0,1 до около 4 мг/кг на одну дозу. В некоторых вариантах реализации количество введенного конъюгата составляет от около 0,05 до около 3 мг/кг на одну дозу. В некоторых вариантах реализации количество введенного конъюгата составляет от около 0,1 до около 3 мг/кг на одну дозу. В некоторых вариантах реализации количество введенного конъюгата составляет от около 0,1 до около 2 мг/кг на одну дозу.
Содержание лекарственного вещества.
Содержание лекарственного вещества (р) представляет собой среднее количество PBD лекарств на один клеточно-связывающий агент, например антитело. В данном изобретении оно всегда равно 1. Однако любая композиция может содержать антитела, в которых PBD является конъюгированным, и антитела, в которых PBD является не конъюгированным. Таким образом, Для композиции содержание лекарственного вещества (или DAR) может быть меньше 1, например 0,75 и более, 0,80 и более, 0,85 и более, 0,90 и более или 0,95 или более.
Общие способы синтеза.
Синтез PBD соединений подробно описан в следующих ссылках, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки:
a) WO 00/12508 (стр. 14-30);
b) WO 2005/023814 (стр. 3-10);
c) WO 2004/043963 (стр. 28-29) и
d) WO 2005/085251 (стр. 30-39).
Способ синтеза.
Соединения по данному изобретению формулы I
можно синтезировать из соединения формулы 2 где R2, R6, R7, R9, R11a, R6, R7, R9, R11a, Y, Y' и R являются такими, как определено для соединений формулы I, Rpre-L1 является предшественником RL, и Rpre-L2 является предшественником RL2 - указанный способ особенно пригоден для соединений формулы I, где RL1 и RL2 имеют формулу IIIa. Для таких соединений Rpre-L1 и Rpre-L2 обычно представляют собой части RL1 и RL2, такие как группа формулы IIIa'
- 19 039276
В таком случае реакция включает присоединение группы GL.
Соединения формулы 2 можно получать посредством снятия защиты с соединений формулы 3
где R2, R6, R7, R9, R11a, R6, R7, R9, R11a, Y, Y' и R являются такими, как определено для соединений формулы I, Rpre-L1Prot представляет собой защищенную версию Rpre-L1, Rpre-L2Prot представляет собой защищенную версию Rpre-L2 и Prot означает соответствующую защитную группу для карбокси/гидроксигруппы.
Соединения формулы 3 можно получать посредством замыкания кольца в соединениях формулы 4
Prot---R
Формула 4 где указанное замыкание кольца осуществляют посредством окисления, например, по Сверну. Соединения формулы 4 можно синтезировать из соединений формулы 5
посредством присоединения двух защитных групп для аминогрупп. Если указанные группы являются разными, то поэтапное присоединение можно осуществлять простой защитой одной аминогруппы (например, с использованием Fmoc), с последующей установкой требуемой защитной группы на другой аминогруппе. После этого можно удалять простую защитную группу, а затем устанавливать другую требуемую защитную группу для аминогруппы.
Соединения формулы I, где RL1 и RL2 имеют формулу IIIb, можно синтезировать таким же способом, хотя можно установить всю группу Rl1 и/или Rl2, исходя из соединения формулы 5, а не использовать защищенный предшественник.
Соединения формулы 5 можно синтезировать известными способами, такими как описаны в WO 2011/130598.
Синтез лекарственных конъюгатов.
Антитела, как правило, можно конъюгировать с линкером лекарственного соединения, как описано в публикации Doronina et al., Nature Biotechnology, 2003, 21, 778-784). Вкратце, антитела (4-5 мг/мл) в PBS, содержащем 50 мМ бората натрия при рН 7,4, восстанавливают гидрохлоридом трис(карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) при 37°С. Ход реакции, в которой восстанавливают межцепочечные дисульфиды, контролируют по реакции с 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислотой) и продолжают реакцию до достижения требуемого значения отношения тиолы/mAb. Затем восстановленное антитело охлаждают до 0°С и алкилируют, используя 3 экв. линкера лекарственного соединения на одно антитело. Через 1 ч реакцию гасят добавлением 5 экв. N-ацетилцистеина. Погашенный линкер лекарственного соединения удаляют гель-фильтрацией на колонке PD-10. Затем ADC фильтруют через стерилизующий шприц-фильтр размером 0,22 мкм. Концентрацию белка можно определять спектральным анализом при
- 20 039276
280 и 329 нм, соответственно, с поправкой на вклад поглощения лекарства при 280 нм. Можно использовать эксклюзионную хроматографию для определения степени агрегации антитела, и можно использовать ОФ-ВЭЖХ для определения содержания остаточного NAC-погашенного линкера лекарственного соединения.
Дополнительные предпочтения.
Следующие предпочтения можно применять в отношении всех аспектов данного изобретения, описанных выше, или они могут относиться к одному аспекту. Предпочтения можно комбинировать друг с другом в любом сочетании.
R6, R7, R9, R11a и Y' выбраны из тех же групп, что и R6, R7, R9, R11a и Y соответственно. В некоторых вариантах реализации R6, R7, R9, R11a и Y' являются такими же, как R6, R7, R9, R11a и Y соответствен но.
В некоторых вариантах реализации R12 является таким же, как R2.
Димерная связь.
В некоторых вариантах реализации оба Y и Y' представляют собой О.
В некоторых вариантах реализации R представляет собой С3-7 алкиленовую группу без заместителей. В некоторых из таких вариантов реализации R'' представляет собой С3, C5 или C7 алкилен. В частности, R'' может представлять собой С3 или C5 алкилен.
В других вариантах реализации R представляет собой группу формулы
где r равен 1 или 2.
R6-R9.
В некоторых вариантах реализации R9 представляет собой Н.
В некоторых вариантах реализации R6 выбран из Н, ОН, OR, SH, NH2, нитро и галогена и может быть выбран из Н или галогена. В некоторых из таких вариантов реализации R6 представляет собой Н.
В некоторых вариантах реализации R7 выбран из Н, ОН, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' и галогена. В некоторых из таких вариантов реализации R7 выбран из Н, ОН и OR, где R выбран из необязательно замещенных С1-7 алкильных, С340 гетероциклильных и C5-1o арильных групп. Более предпочтительно R может представлять собой С1-4 алкильную группу, которая может быть или не быть замещенной. Пригодный заместитель представляет собой C5-6 арильную группу (например, фенил). Особенно предпочтительные заместители в 7 положениях представляют собой ОМе и OCH2Ph. Другие особенно пригодные заместители представляют собой диметиламино (т.е. -NMe2); -(OC2H4)qOMe, где q равен от 0 до 2; азотсодержащие С6 гетероциклилы, включая морфолино, пиперидинил и N-метилпиперазинил.
Указанные варианты реализации и предпочтения относятся к R9, R6 и R7 соответственно.
D и D'.
В некоторых вариантах реализации D и D' представляют собой D1 и D'1 соответственно.
В некоторых вариантах реализации D и D' представляют собой D2 и D'2 соответственно.
R2.
При наличии двойной связи между С2 и С3 R2 выбран из (a) C5.io арильной группы, необязательно замещенной одним или более заместителями, выбранными из группы, содержащей галоген, нитро, циано, простой эфир, С1-7 алкил, С3-7 гетероциклил и бис-окси-С1-3 алкилен;
(b) С1-5 насыщенного алифатического алкила;
(c) С3-6 насыщенного циклоалкила;
R12
(d) R , где каждый из R11, R12 и R13 независимо выбран из Н, С1-3 насыщенного алкила, С2-3 алкенила, С2-3 алкинила и циклопропила, и общее количество атомов углерода в группе R2 составляет не более 5;
15b
R
где один из R15a и R15b представляет собой Н, а другой выбран из: фенила, необязательно замещенного группой, выбранной из галогена, метила, метокси; пиридила; и тиофенила; и
- 21 039276 где R14 выбран из Н; C1.3 насыщенного алкила; С2-3 алкенила; С2-3 алкинила; циклопропила; фенила, необязательно замещенного группой, выбранной из галогена, метила, метокси; пиридила; и тиофенила.
Если R2 представляет собой C5-10 арильную группу, он может представлять собой С5-7 арильную группу. С5-7 арильная группа может представлять собой фенильную группу или С5-7 гетероарильную группу, например фуранил, тиофенил и пиридил. В некоторых вариантах реализации R2 предпочтительно представляет собой фенил. В других вариантах реализации R2 предпочтительно представляет собой тиофенил, например тиофен-2-ил и тиофен-3-ил.
Если R2 представляет собой C5-10 арильную группу, он может представлять собой C8-10 арил, например группу хинолинила или изохинолинила. Группа хинолинила или изохинолинила может быть связана с ядром PBD через любое доступное кольцевое положение. Например, хинолинил может представлять собой хинолин-2-ил, хинолин-3-ил, хинолин-4-ил, хинолин-5-ил, хинолин-6-ил, хинолин-7-ил и хинолин8-ил. Из них предпочтительными могут быть хинолин-3-ил и хинолин-6-ил. Изохинолин может представлять собой изохинолин-1-ил, изохинолин-3-ил, изохинолин-4-ил, изохинолин-5-ил, изохинолин-6-ил, изохинолин-7-ил и изохинолин-8-ил. Из них предпочтительными могут быть изохинолин-3-ил и изохинолин-6-ил.
Если R2 представляет собой C5-10 арильную группу, он может представлять иметь любое количество групп заместителей. Предпочтительно он содержит от 1 до 3 групп заместителей, более предпочтительно 1 и 2 группы заместителей и наиболее предпочтительными являются однократно замещенные группы. Заместители могут быть в любом положении.
Если R2 представляет собой С5-7 арильную группу, то единственный заместитель предпочтительно находится у кольцевого атома, который не является смежным со связью с остальной частью соединения, т.е. он предпочтительно находится в положении β или γ относительно связи с остальной частью соединения. Таким образом, если С5-7 арильная группа представляет собой фенил, то заместитель предпочтительно находится в мета- или пара-положениях и более предпочтительно находится в пара-положении.
Если R2 представляет собой C8-10 арильную группу, например хинолинил или изохинолинил, он может содержать любое количество заместителей в любом положении хинолинового или изохинолинового кольца. В некоторых вариантах реализации он содержит один, два или три заместителя, и они могут быть расположены либо в ближнем, либо в дальнем кольце, либо в обоих кольцах (при наличии более чем одного заместителя).
Заместители R2, если R2 представляет собой C5-10 арильную группу.
Если заместитель в R2, когда R2 представляет собой C5-10 арильную группу, представляет собой галоген, то он предпочтительно представляет собой F или Cl, более предпочтительно Cl.
Если заместитель в R2, когда R2 представляет собой C5-10 арильную группу, представляет собой простой эфир, то в некоторых вариантах реализации он может представлять собой алкоксигруппу, например C1-7 алкоксигруппу (например, метокси, этокси) или в некоторых вариантах реализации может представлять собой С5-7 арилоксигруппу (например, фенокси, пиридилокси, фуранилокси). Сама алкоксигруппа может быть дополнительно замещена, например, аминогруппой (например, диметиламино).
Если заместитель в R2, когда R2 представляет собой С5.ю арильную группу, представляет собой C1-7 алкил, то он может предпочтительно представлять собой C1-4 алкильную группу (например, метил, этил, пропил, бутил).
Если заместитель в R2, когда R2 представляет собой C5-10 арильную группу, представляет собой С3-7 гетероциклил, то в некоторых вариантах реализации он может представлять собой С6 азотсодержащую гетероциклильную группу, например, морфолино, тиоморфолино, пиперидинил, пиперазинил. Указанные группы могут быть связаны с остальной частью фрагмента PBD через атом азота. Указанные группы могут быть дополнительно замещены, например, C1-4 алкильными группами. Если С6 азотсодержащая гетероциклильная группа представляет собой пиперазинил, то указанный дополнительный заместитель может быть расположен у второго кольцевого атома азота.
Если заместитель в R2, когда R2 представляет собой С5.ю арильную группу, представляет собой бисокси-С1-3 алкилен, то он предпочтительно представляет собой бис-оксиметилен или бис-оксиэтилен.
Если заместитель в R2, когда R2 представляет собой С5.ю арильную группу, представляет собой сложный эфир, то он предпочтительно представляет собой метиловый эфир или этиловый эфир.
Особенно предпочтительные заместители, если R2 представляет собой С5.ю арильную группу, включают метокси, этокси, фтор, хлор, циано, бис-оксиметилен, метилпиперазинил, морфолино и метилтиофенил. Другие особенно предпочтительные заместители для R2 представляют собой диметиламинопропилокси и карбокси.
Особенно предпочтительные замещенные группы R2, если R2 представляет собой C5-10 арильную группу, включают, но не ограничиваются этим, 4-метоксифенил, 3-метоксифенил, 4-этоксифенил, 3этоксифенил, 4-фторфенил, 4-хлорфенил, 3,4-бис-оксиметиленфенил, 4-метилтиофенил, 4-цианофенил, 4-феноксифенил, хинолин-3-ил и хинолин-6-ил, изохинолин-3-ил и изохинолин-6-ил, 2-тиенил, 2фуранил, метоксинафтил и нафтил. Другая возможная замещенная группа R12 представляет собой 4нитрофенил. Группы R12, представляющие особый интерес, включают 4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил и 3,4-бис-оксиметиленфенил.
- 22 039276
Если R2 представляет собой C1-5 насыщенный алифатический алкил, он может представлять собой метил, этил, пропил, бутил или пентил. В некоторых вариантах реализации он может представлять собой метил, этил или пропил-(н-пентил или изопропил). В некоторых из таких вариантов реализации он может представлять собой метил. В других вариантах реализации он может представлять собой бутил или пентил, который может быть линейным или разветвленным.
Если R2 представляет собой С3-6 насыщенный циклоалкил, он может представлять собой циклопропил, циклобутил, циклопентил или циклогексил. В некоторых вариантах реализации он может представлять собой циклопропил.
Если R2 представляет собой
то каждый из R11, R12 и R13 независимо выбран из Н, С1-3 насыщенного алкила, С2-3 алкенила, С2-3 алкинила и циклопропила, причем общее количество атомов углерода в группе R2 составляет не более 5. В некоторых вариантах реализации общее количество атомов углерода в группе R2 составляет не более 4 или не более 3.
В некоторых вариантах реализации один из R11, R12 и R13 представляет собой Н, а другие две группы выбраны из Н, C1-3 насыщенного алкила, С2-3 алкенила, С2-3 алкинила и циклопропила.
В других вариантах реализации два из R11, R12 и R13 представляют собой Н, а другая группа выбрана из Н, C1-3 насыщенного алкила, С2-3 алкенила, С2-3 алкинила и циклопропила.
В некоторых вариантах реализации группы, которые не представляют собой Н, выбраны из метила и этила. В некоторых из таких вариантов реализации группы, которые не представляют собой Н, представляют собой метил.
В некоторых вариантах реализации R11 представляет собой Н. В некоторых вариантах реализации R12 представляет собой Н. В некоторых вариантах реализации R13 представляет собой Н. В некоторых вариантах реализации R11 и R12 представляют собой Н. В некоторых вариантах реализации R11 и R13 представляют собой Н. В некоторых вариантах реализации R12 и R13 представляют собой Н.
Особенно предпочтительная группа R2 представляет собой
Если R2 представляет собой R · то один из R15a и R15b представляет собой Н, а другой выбран из: фенила, необязательно замещенного группой, выбранной из галогена, метила, метокси; пиридила; и тиофенила. В некоторых вариантах реализации группа, которая не представляет собой Н, представляет собой необязательно замещенный фенил. Если необязательный заместитель фенила представляет собой галоген, то он предпочтительно представляет собой фтор. В некоторых вариантах реализации фенильная группа является незамещенной.
Если R2 представляет собой , то R14 выбран из Н; C1-3 насыщенного алкила; С2-3 алкенила;
С2-3 алкинила; циклопропила; фенила, необязательно замещенного группой, выбранной из галогена, метила, метокси; пиридила; и тиофенила. Если необязательный заместитель фенила представляет собой галоген, то он предпочтительно представляет собой фтор. В некоторых вариантах реализации фенильная группа является незамещенной.
В некоторых вариантах реализации R14 выбран из Н, метила, этила, этенила и этинила. В некоторых из таких вариантов реализации R14 выбран из Н и метила.
ДД6’
При наличии одинарной связи между С2 и С3 R2 представляет собой Н или R °b . где R16a и R16b независимо выбраны из Н, F, C1-4 насыщенного алкила, С2-3 алкенила, и указанные алкильные и алкенильные группы необязательно замещены группой, выбранной из Cm алкиламидо и сложного Cm алкилового эфира; или если один из R16a и R16b представляет собой Н, то другой выбран из нитрила и сложного C1-4 алкилового эфира.
В некоторых вариантах реализации R2 представляет собой Н.
В некоторых вариантах реализации R2 представляет собой дн16а
R16b
В некоторых вариантах реализации предпочтительно, что оба R16a и R16b представляют собой Н. В других вариантах реализации предпочтительно, что оба R16a и R16b представляют собой метил.
В дополнительных вариантах реализации предпочтительно, что один из R16a и R16b представляет собой Н, а другой выбран из C1-4 насыщенного алкила, С2-3 алкенила, и указанные алкильные и алкениль
- 23 039276 ные группы являются необязательно замещенными. В указанном дополнительном варианте реализации может быть дополнительно предпочтительно, что группа, которая не представляет собой Н, выбрана из метила и этила.
R22.
При наличии двойной связи между С2' и С3' R22 выбран из (a) С5-10 арильной группы, необязательно замещенной одним или более заместителями, выбранными из группы, содержащей галоген, нитро, циано, простой эфир, C1-7 алкил, С3-7 гетероциклил и бис-окси-С1-3 алкилен;
(b) C1-5 насыщенного алифатического алкила;
(c) С 3-6 насыщенного циклоалкила;
где каждый из R31, R32 и R33 независимо выбран из Н, C1-3 насыщенного алкила, С2-3 алкенила, С2-3 алкинила и циклопропила, и общее количество атомов углерода в группе R22 составляет не более 5;
где один из R25a и R25b представляет собой Н, а другой выбран из фенила, необязательно замещенного группой, выбранной из галогена, метила, метокси; пиридила; и тиофенила; и
где R24 выбран из Н; C1-3 насыщенного алкила; С2-3 алкенила; С2-3 алкинила; циклопропила; фенила, необязательно замещенного группой, выбранной из галогена, метила, метокси; пиридила; и тиофенила.
Если R22 представляет собой C5.10 арильную группу, он может представлять собой С5-7 арильную группу. С5-7 арильная группа может представлять собой фенильную группу или С5-7 гетероарильную группу, например фуранил, тиофенил и пиридил. В некоторых вариантах реализации R22 предпочтительно представляет собой фенил. В других вариантах реализации R22 предпочтительно представляет собой тиофенил, например тиофен-2-ил и тиофен-3-ил.
Если R22 представляет собой C5-10 арильную группу, он может представлять собой C8-10 арил, например группу хинолинила или изохинолинила. Группа хинолинила или изохинолинила может быть связана с ядром PBD через любое доступное кольцевое положение. Например, хинолинил может представлять собой хинолин-2-ил, хинолин-3-ил, хинолин-4-ил, хинолин-5-ил, хинолин-6-ил, хинолин-7-ил и хи нолин-8-ил. Из них предпочтительными могут быть хинолин-3-ил и хинолин-6-ил. Изохинолин может представлять собой изохинолин-1-ил, изохинолин-3-ил, изохинолин-4-ил, изохинолин-5-ил, изохинолин6-ил, изохинолин-7-ил и изохинолин-8-ил. Из них предпочтительными могут быть изохинолин-3-ил и изохинолин-6-ил.
Если R22 представляет собой C5-10 арильную группу, он может представлять иметь любое количество групп заместителей. Предпочтительно он содержит от 1 до 3 групп заместителей, более предпочтительно 1 и 2 группы заместителей, и наиболее предпочтительными являются однократно замещенные группы. Заместители могут быть в любом положении.
Если R22 представляет собой С5-7 арильную группу, то единственный заместитель предпочтительно находится у кольцевого атома, который не является смежным со связью с остальной частью соединения,
т.е. он предпочтительно находится в положении β или γ относительно связи с остальной частью соединения. Таким образом, если С5-7 арильная группа представляет собой фенил, то заместитель предпочтительно находится в мета- или пара-положениях и более предпочтительно находится в пара-положении.
Если R22 представляет собой C8-10 арильную группу, например хинолинил или изохинолинил, он может содержать любое количество заместителей в любом положении хинолинового или изохинолинового кольца. В некоторых вариантах реализации он содержит один, два или три заместителя, и они могут быть расположены либо в ближнем, либо в дальнем кольце, либо в обоих кольцах (при наличии более чем одного заместителя).
Заместители R22, если R22 представляет собой С5-10 арильную группу.
Если заместитель в R22, когда R22 представляет собой C5-10 арильную группу, представляет собой галоген, то он предпочтительно представляет собой F или Cl, более предпочтительно Cl.
Если заместитель в R22, когда R22 представляет собой C5-10 арильную группу, представляет собой простой эфир, то в некоторых вариантах реализации он может представлять собой алкоксигруппу, например, C1-7 алкоксигруппу (например, метокси, этокси) или в некоторых вариантах реализации может представлять собой С5-7 арилоксигруппу (например, фенокси, пиридилокси, фуранилокси). Сама алкок
- 24 039276 сигруппа может быть дополнительно замещена, например, аминогруппой (например, диметиламино).
Если заместитель в R22, когда R22 представляет собой C5-10 арильную группу, представляет собой C1-7 алкил, то он может предпочтительно представлять собой C1-4 алкильную группу (например, метил, этил, пропил, бутил).
Если заместитель в R22, когда R22 представляет собой C5-10 арильную группу, представляет собой С3-7 гетероциклил, то в некоторых вариантах реализации он может представлять собой С6 азотсодержащую гетероциклильную группу, например морфолино, тиоморфолино, пиперидинил, пиперазинил. Указанные группы могут быть связаны с остальной частью фрагмента PBD через атом азота. Указанные группы могут быть дополнительно замещены, например, C1-4 алкильными группами. Если С6 азотсодержащая гетероциклильная группа представляет собой пиперазинил, то указанный дополнительный заместитель может быть расположен у второго кольцевого атома азота.
Если заместитель в R22, когда R22 представляет собой C5-10 арильную группу, представляет собой бис-окси-С1-3 алкилен, то он предпочтительно представляет собой бис-оксиметилен или бис-оксиэтилен.
Если заместитель в R22, когда R22 представляет собой C5-10 арильную группу, представляет собой сложный эфир, то он предпочтительно представляет собой метиловый эфир или этиловый эфир.
Особенно предпочтительные заместители, если R22 представляет собой C5-10 арильную группу, включают метокси, этокси, фтор, хлор, циано, бис-оксиметилен, метилпиперазинил, морфолино и метилтиофенил. Другие особенно предпочтительные заместители для R22 представляют собой диметиламинопропилокси и карбокси.
Особенно предпочтительные замещенные группы R22, если R22 представляет собой C5-10 арильную группу, включают, но не ограничиваются этим, 4-метоксифенил, 3-метоксифенил, 4-этоксифенил, 3этоксифенил, 4-фторфенил, 4-хлорфенил, 3,4-бис-оксиметиленфенил, 4-метилтиофенил, 4-цианофенил, 4-феноксифенил, хинолин-3-ил и хинолин-6-ил, изохинолин-3-ил и изохинолин-6-ил, 2-тиенил, 2фуранил, метоксинафтил и нафтил. Другая возможная замещенная группа R22 представляет собой 4нитрофенил. Группы R22, представляющие особый интерес, включают 4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил и 3,4-бис-оксиметиленфенил.
Если R22 представляет собой C1-5 насыщенный алифатический алкил, он может представлять собой метил, этил, пропил, бутил или пентил. В некоторых вариантах реализации он может представлять собой метил, этил или пропил-(н-пентил или изопропил). В некоторых из таких вариантов реализации он может представлять собой метил. В других вариантах реализации он может представлять собой бутил или пентил, который может быть линейным или разветвленным.
Если R22 представляет собой С3-6 насыщенный циклоалкил, он может представлять собой циклопропил, циклобутил, циклопентил или циклогексил. В некоторых вариантах реализации он может представлять собой циклопропил.
Если R22 представляет собой
то каждый из R31, R32 и R33 независимо выбран из Н, C1-3 насыщенного алкила, С2-3 алкенила, С2-3 алкинила и циклопропила, причем общее количество атомов углерода в группе R22 составляет не более 5. В некоторых вариантах реализации общее количество атомов углерода в группе R22 составляет не более 4 или не более 3.
В некоторых вариантах реализации один из R31, R32 и R33 представляет собой Н, а другие две группы выбраны из Н, C1-3 насыщенного алкила, С2-3 алкенила, С2-3 алкинила и циклопропила.
В других вариантах реализации два из R31, R32 и R33 представляют собой Н, а другая группа выбрана из Н, C1-3 насыщенного алкила, С2-3 алкенила, С2-3 алкинила и циклопропила.
В некоторых вариантах реализации группы, которые не представляют собой Н, выбраны из метила и этила. В некоторых из таких вариантов реализации группы, которые не представляют собой Н, представляют собой метил.
В некоторых вариантах реализации R31 представляет собой Н. В некоторых вариантах реализации R32 представляет собой Н. В некоторых вариантах реализации R33 представляет собой Н. В некоторых вариантах реализации R31 и R32 представляют собой Н. В некоторых вариантах реализации R31 и R33 представляют собой Н. В некоторых вариантах реализации R32 и R33 представляют собой Н.
Особенно предпочтительная группа R22 представляет собой
Если R22 представляет собой
- 25 039276
то один из R25a и R25b представляет собой Н, а другой выбран из: фенила, необязательно замещенного группой, выбранной из галогена, метила, метокси; пиридила; и тиофенила. В некоторых вариантах реализации группа, которая не представляет собой Н, представляет собой необязательно замещенный фенил. Если необязательный заместитель фенила представляет собой галоген, то он предпочтительно представляет собой фтор. В некоторых вариантах реализации фенильная группа является незамещенной.
Если R22 представляет собой ^^R24 то R24 выбран из Н; C1-3 насыщенного алкила; С2-3 алкенила; С2-3 алкинила; циклопропила; фенила, необязательно замещенного группой, выбранной из галогена, метила, метокси; пиридила; и тиофенила. Если необязательный заместитель фенила представляет собой галоген, то он предпочтительно представляет собой фтор. В некоторых вариантах реализации фенильная группа является незамещенной.
В некоторых вариантах реализации R24 выбран из Н, метила, этила, этенила и этинила. В некоторых из таких вариантов реализации R24 выбран из Н и метила.
При наличии одинарной связи между С2' и С3' R22 представляет собой Н или R где R26a и R26b независимо выбраны из Н, F, C1-4 насыщенного алкила, С2-3 алкенила, и указанные алкильные и алкенильные группы необязательно замещены группой, выбранной из C1-4 алкиламидо и сложного C1-4 алкилового эфира; или если один из R26a и R26b представляет собой Н, то другой выбран из нитрила и сложного C1-4 алкилового эфира.
В некоторых вариантах реализации R22 представляет собой Н.
В некоторых вариантах реализации R22 представляет собой <^R26a
R26b
В некоторых вариантах реализации предпочтительно, что оба R26a и R26b представляют собой Н. В других вариантах реализации предпочтительно, что оба R26a и R26b представляют собой метил.
В дополнительных вариантах реализации предпочтительно, что один из R26a и R26b представляет собой Н, а другой выбран из C1-4 насыщенного алкила, С2-3 алкенила, и указанные алкильные и алкенильные группы являются необязательно замещенными. В указанном дополнительном варианте реализации может быть дополнительно предпочтительно, что группа, которая не представляет собой Н, выбрана из метила и этила.
R11.
В некоторых вариантах реализации R11a представляет собой ОН.
В некоторых вариантах реализации R11a представляет собой ORA, где RA представляет собой C1-4 алкил. В некоторых из таких вариантов реализации RA представляет собой метил.
В некоторых вариантах реализации первого аспекта данного изобретения предложены соединения формулы Ia-1, Ia-2 или Ia-3
- 26 039276
где R2a и R22a являются одинаковыми и выбраны из
R1a выбран из метила и бензила;
RLL1, Rll2 и R11a являются такими, как определено выше.
В некоторых вариантах реализации данного изобретения и R2, и R22 содержат не более 3 атомов уг- 27 039276 лерода.
В тех вариантах реализации, в которых между С2 и СЗ присутствует двойная связь, R2 может быть
выбран из (i) метил; (v)
(ii) этила; (vi) ; и
(iii) пропила; АО Ζ
(iv) циклопропила;
В тех вариантах реализации, в которых между С2 и СЗ нет двойной связи, R2 может быть выбран из
(i) Η; аю Η ; и
В тех вариантах реализации, в которых между С2' и СЗ' присутствует двойная связь, R22 может быть выбран из
1) метила;
(ii) этила;
(iii) пропила;
(iv) циклопропила;
В тех вариантах реализации, в которых между С2' и СЗ' нет двойной связи, R22 может быть выбран из (i) Н;
В некоторых из таких вариантов реализации и R2, и R22 содержат не более 2 атомов углерода.
В тех вариантах реализации, в которых между С2 и СЗ присутствует двойная связь, R2 может быть выбран из (i) метила;
(ii) этила; и
В тех вариантах реализации, в которых между С2 и СЗ нет двойной связи, R2 может быть выбран из (i) Н; (iii)
Н
-28 039276
В тех вариантах реализации, в которых между С2' и С3' присутствует двойная связь, R22 может быть
В следующих из таких вариантов реализации и R2, и R22 содержат не более 1 атома углерода.
В тех вариантах реализации, в которых между С2 и С3 присутствует двойная связь, R2 может представлять собой метил. В тех вариантах реализации, в которых между С2 и С3 нет двойной связи, R2 может быть выбран из
В тех вариантах реализации, в которых между С2' и С3' присутствует двойная связь, R22 может представлять собой метил. В тех вариантах реализации, в которых между С2' и С3' нет двойной связи, R22 может быть выбран из
Не ограничиваясь теорией, если заместитель в положении С2 димеров PBD является небольшим, то использование глюкуронидного кэп-звена в таких линкерах лекарственных соединений предположительно является особенно преимущественным, поскольку оно может увеличивать гидрофильность линкера лекарственного соединения, упрощая конъюгацию линкеров лекарственных соединений со звеном лиганда.
Указанные варианты реализации и предпочтения также относятся ко второму аспекту данного изобретения.
Линкер (RL/RLL).
В некоторых вариантах реализации RLL1 и RLL2 имеют формулу IIIa'.
В некоторых вариантах реализации RL1 и RL2 имеют формулу IIIa.
GL.
GL может быть выбран из_________________________________________________
(GL1') О С (GL6) О ° А %—N
(GL1- 2) А (GL7) вг^
- 29 039276
(GL2) О о (GL8)
(GL3') s— 0 (NO2) где группа NO? является необязательной (GL9) N3
(GL3- 2) (NO2) где группа NO2 является необязательной (G1-10) iq^ H
(GL3‘ 3) S— гЧ ο2νΛ=/ где группа ΝΟ2 является необязательной (G1) о о VyH w
(GL3' 4) ^5s O2N<=/ где группа NO2 является необязательной (G112)
(GL4) О Hal Ν—ί Η * где Hal = I, Br, Cl (Cl13) WN n\ \\
(GL5) О Hal—0 Η
где Ar представляет собой C5-6 ариленовую группу, например фенилен, и X представляет собой С1-4 алкил.
В некоторых вариантах реализации GL выбран из GL1-1 и GL1-2. В некоторых из таких вариантов реализации Gl представляет собой GL1-1.
GLL.
Gll может быть выбран из
- 30 039276
(Gll1') 0 О CBA A /N\
(Gll1- 2) οβα^Χν-ΑΓΫ (G1^-2) N CBA
(GLL2) О cba; Νχ v—L ° о (С1-1-9-1) A % CBA
(Gll37 CBA< X Η (GLl9-2) CBA
(Gll3- 2) G1'10 CBA T* N—\ H
(GLL·4) CBA;___ I \ H >7 N о V GLu CBA Л λ G Λ N \ R 7 О
(GLL5) о CBA$___Z/ G1'12 CBA ) । L > HN^+\ /—/ X
(GLL6) о G1'13 H CBA
(GLL7) CBA^
где Ar представляет собой C5-6 ариленовую группу, например фенилен, и X представляет собой C1-4 алкил.
В некоторых вариантах реализации GLL выбран из GLL1-1 и GLL1-2. В некоторых из таких вариантов реализации GLL представляет собой GLL1-1.
X.
X представляет собой
где а = от 0 до 5, b = от 0 до 16, с = 0 или 1, d = от 0 до 5.
а может быть равен 0, 1, 2, 3, 4 или 5. В некоторых вариантах реализации а равен от 0 до 3. В некоторых из таких вариантов реализации а равен 0 или 1. В дополнительных вариантах реализации а равен 0.
b может быть равен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16. В некоторых вариантах реализации b равен от 0 до 12. В некоторых из таких вариантов реализации b равен от 0 до 8 и может быть равен 0, 2, 4 или 8.
с может быть равен 0 или 1.
d может быть равен 0, 1, 2, 3, 4 или 5. В некоторых вариантах реализации d равен от 0 до 3. В неко
- 31 039276 торых из таких вариантов реализации d равен 1 или 2. В дополнительных вариантах реализации d равен 2.
В некоторых вариантах реализации группы X а равен 0, с равен 1 и d равен 2, и b может быть равен от 0 до 8. В некоторых из таких вариантов реализации b равен 0, 4 или 8.
QX.
В одном варианте реализации QX представляет собой остаток аминокислоты. Аминокислота может быть природной аминокислотой или неприродной аминокислотой.
В одном варианте реализации QX выбран из Phe, Lys, Val, Ala, Cit, Leu, Ile, Arg и Trp, где Cit представляет собой цитруллин.
В одном варианте реализации QX содержит дипептидный остаток. Аминокислоты в дипептиде могут представлять собой любую комбинацию природных аминокислот и неприродных аминокислот. В некоторых вариантах реализации дипептид содержит природные аминокислоты. Если линкер представляет собой катепсин-подвижный линкер, то дипептид представляет собой место действия катепсинопосредованного расщепления. В таком случае дипептид представляет собой сайт распознавания для катепсина.
В одном варианте реализации QX выбран из C0-Phe-Lys-NH, C0-Val-Ala-NH, ^-Val-Lys-™1, C0-Ala-Lys-NH, со-Уа1-Сй-№, co-Phe-Cit-NH, co-Leu-Cit-NH, co-Ile-Cit-NH, C0-Phe-Arg-NH, и со-Тгр-Сй-№;
где Cit представляет собой цитруллин. Предпочтительно QX выбран из C0-Phe-Lys-NH, C0-Val-Ala-NH, C0-Val-Lys-NH, C0-Ala-Lys-NH, ^-Val-Cit-™1.
Наиболее предпочтительно QX выбран из CO-Phe-Lys-NH, CO-Val-Cit-NH и CO-Val-Ala-NH. Другие перспективные дипептидные комбинации включают ^-Gly-Gly-™1, co-Pro-Pro-NH, и ^-Val-Glu-™
Можно использовать другие дипептидные комбинации, включая комбинации, описанные в публикации Dubowchik et al., Bioconjugate Chemistry, 2002, 13,855-869, включенной в данный документ посредством ссылки.
В некоторых вариантах реализации QX представляет собой трипептидный остаток. Аминокислоты в трипептиде могут представлять собой любую комбинацию природных аминокислот и неприродных аминокислот. В некоторых вариантах реализации трипептид содержит природные аминокислоты. Если линкер представляет собой катепсин-подвижный линкер, то трипептид представляет собой место действия катепсин-опосредованного расщепления. В таком случае трипептид представляет собой сайт распознавания для катепсина.
В одном варианте реализации боковая цепь аминокислоты является химически защищенной, если это необходимо. Защитная группа боковой цепи может представлять собой группу, описанную ниже. Защищенные аминокислотные последовательности могут расщепляться ферментами. Например, дипептидная последовательность, содержащая остаток Lys с Вос-защищенной боковой цепью, расщепляется катепсином.
Защитные группы для боковых цепей аминокислот хорошо известны в данной области техники и описаны в каталоге Novabiochem, а также описаны выше в данном документе.
В некоторых вариантах реализации RLL1 и RLL2 имеют формулу IIIb'. В некоторых вариантах реали
- 32 039276 зации Rl1 и Rl2 имеют формулу IIIb.
Rsl1 и Rsl2 независимо выбраны из Н и метила или вместе с атомом углерода, с которым они связаны, образуют циклопропиленовую или циклобутиленовую группу.
В некоторых вариантах реализации оба Rsl1 и Rsl2 представляют собой Н.
В некоторых вариантах реализации Rsl1 представляет собой Н, и Rsl2 представляет собой метил.
В некоторых вариантах реализации оба Rsl1 и Rsl2 представляют собой метил.
В некоторых вариантах реализации Rsl1 и Rsl2 вместе с атомом углерода, с которым они связаны, образуют циклопропиленовую группу.
В некоторых вариантах реализации Rsl1 и Rsl2 вместе с атомом углерода, с которым они связаны, образуют циклобутиленовую группу.
В некоторых вариантах реализации в группе IIIb е равен 0. В других вариантах реализации е равен 1, и нитрогруппа может быть в любом доступном положении кольца. В некоторых из таких вариантов реализации она находится в орто-положении. В других из таких вариантов реализации она находится в пара-положении.
В некоторых вариантах реализации Rl1 и Rl2 являются одинаковыми. В некоторых вариантах реализации Rll1 и Rll2 являются одинаковыми.
В одном конкретном варианте реализации первый аспект данного изобретения включает конъюгат формулы Id
где m представляет собой целое число от 2 до 8.
В одном конкретном варианте реализации второго аспекта данного изобретения линкер лекарственного соединения (DL) имеет формулу (Id')
где m представляет собой целое число от 2 до 8.
В некоторых вариантах реализации Rl1 и RL2 являются разными. В некоторых вариантах реализации Rll1 и Rll2 являются разными.
В частности, в тех вариантах реализации, в которых линкерные группы являются различными, указанные различия могут быть только в группах r, так что остальные линкерные группы являются одинаковыми (поэтому инициаторы расщепления являются одинаковыми).
В некоторых вариантах реализации данного изобретения заместитель С11 может быть в следующем стереохимическом положении относительно соседних групп:
В других вариантах реализации заместитель С11 может быть в следующем стереохимическом положении относительно соседних групп:
- 33 039276
Соединения, представляющие собой особый интерес, включают соединения, описанные в примерах.
Примеры
Флэш-хроматографию проводили с использованием силикагеля под давлением. Чистоту фракций проверяли с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), используя силикагель Merck Kieselgel 60 F254, с флуоресцентным индикатором на алюминиевых пластинах. Визуализацию ТСХ осуществляли с помощью УФ-света или паров йода, если не указано иное. Растворители для экстракции и хроматографии приобретали и использовали без дополнительной очистки у компании VWR, Великобритания. Все химические реактивы приобретали у компании Sigma-Aldrich, если не указано иное. Пэгилированные реагенты приобретали у компании Quanta biodesign, США, через компанию Stratech, Великобритания, или у компании Pierce Scientific, через компанию Thermo Fisher.
1H и 13С ЯМР-спектры записывали на спектрометре Bruker Avance® 400. Константы связывания записывали в герцах (Гц). Химические сдвиги записывали в миллионных долях (м.д.) в сторону слабого поля относительно сигнала тетраметилсилана. Спиновые мультиплетности записывали как с (синглет), шс (широкий синглет), д (дублет), т (триплет) и м (мультиплет).
Использовали следующие условия аналитической ЖХ/МС (для проверки хода реакции и определения чистоты): Электрораспылительную масс-спектрометрию в режиме положительной ионизации проводили на приборе Shimadzu Nexera®/Prominence® LCMS-2020. В качестве подвижных фаз использовали растворитель А (Н2О с 0,1% муравьиной кислоты) и растворитель В (CH3CN с 0,1% муравьиной кислоты). Градиент для обычной записи хроматограммы за 3 мин: первоначальное содержание 5% В выдерживали в течение 25 с, затем повышали от 5% В до 100% В за 1 мин 35 с. Такое содержание выдерживали в течение 50 с при 100% В, затем возвращали к 5% В за 5 с и выдерживали в течение 5 с. Общая продолжительность градиентного цикла составляла 3,0 мин. Градиент для записи хроматограммы за 15 мин: первоначальное содержание 5% В выдерживали в течение 1,25 мин, затем повышали от 5% В до 100% В за 8,75 мин. Такое содержание выдерживали в течение 2,5 мин при 100% В, затем возвращали к 5% В за 30 с и выдерживали в течение 2 мин. Общая продолжительность градиентного цикла составляла 15,0 мин. Скорость потока составляла 0,8 мл/мин, (для 3-минутного цикла) и 0,5 мл/мин, (для 15-минутного цикла). Обнаружение проводили при 254 нм. Колонки: Waters Acquity UPLC® ВЕН Shield RP18, 1,7 мкм, 2,1 χ 50 мм при 50°С, оснащенная предколонкой Waters Acquity UPLC® ВЕН Shield RP18 VanGuard, 130A, 1,7 мкм, 2,1 мм χ 5 мм (стандартный 3-минутный цикл); и Waters Acquity UPLC CSH C18, 1,7 мкм, 2,1 χ 100 мм, оснащенная предколонкой Waters Acquity UPLC® ВЕН Shield RP18 VanGuard, 130A, 1,7 мкм, 2,1 мм χ 5 мм (15-минутный цикл).
Использовали следующие условия препаративной ВЭЖХ: обращенно-фазовую сверхскоростную высокоэффективную жидкостную хроматографию (СВЭЖХ) проводили на приборе Shimazdzu Prominence®, используя колонку Phenomenex® Gemini NX, 5 мкм, С18 (при 50°С), 150 χ 21,2 мм. В качестве элюентов использовали растворитель А (Н2О с 0,05% муравьиной кислоты) и растворитель В (CH3CN с 0,05% муравьиной кислоты). Все эксперименты СВЭЖХ проводили, используя следующие условия градиента: первоначальное содержание 13% В увеличивали до 100% В за 17 мин с градиентом, пригодным для обеспечения требуемого разделения, затем выдерживали в течение 1 мин при 100% В, затем возвращали к 13% В за 0,1 мин и выдерживали в течение 1,9 мин. Общая продолжительность градиентного цикла составляла 20,0 мин. Скорость потока составляла 20,0 мл/мин., обнаружение проводили при 254 и 280 нм.
- 34 039276
Пример 1.
(S)-(2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метил-2,3-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)(4-гидрокси-5- 35 039276 метокси-2-нитрофенил)метанон (2).
Дигидрат ацетата лития (3,52 г, 34,5 ммоль, 1,0 экв.) добавляли к перемешанному раствору простого эфира TIPS (1) (19,96 г, 34,5 ммоль, 1,0 экв.) в ДМФА/Н2О (300 мл/4 мл). Полученный красный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 3,5 ч. Реакционную смесь разбавляли EtOAc (600 мл) и промывали 1М раствором лимонной кислоты (2x250 мл), Н2О (2x250 мл), насыщенным солевым раствором (300 мл) и сушили (MgSO4). Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением продукта в виде желтого твердого вещества (14,57 г, 100%). Продукт использовали без дополнительной очистки. Аналитические данные: ЖХ/МС, RT 1,74 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 423 ([М + Н]+, 100); 445 ([M + Na])+, 75).
(b) ((Пентан-1,5-диилбис(окси))бис(5-метокси-2-нитро-4,1-фенилен))бис(((S)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метил-2,3-дигидро-1H-пиррол-1-ил)метанон) (3).
Карбонат калия (5,03 г, 36,44 ммоль, 1,1 экв.) добавляли к перемешанному раствору фенола (2) (14 г, 33,13 ммоль, 1,0 экв.) и 1,5-дийодпентана (21,46 г, 9,86 мл, 66,26 ммоль, 2,0 экв.) в ДМФА (250 мл). Раствор нагревали при 70°С в течение 3,5 ч. Раствор выливали в смесь льда/воды (800 мл) и экстрагировали EtOAc (4x500 мл). Объединенные экстракты промывали Н2О (2x250 мл), насыщенным солевым раствором (400 мл), сушили (MgSO4) и выпаривали при пониженном давлении с получением коричневого маслянистого вещества. После очистки колоночной флэш-хроматографией [н-гептан/EtOAc, от 40% до 80% с приращениями по 10%] получали продукт в виде желтого пенистого вещества (12,7 г, 85%). Аналитические данные: ЖХ/МС, RT 2,16 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 913 ([М+ Н]+, 100); 935 ([М + Na])+, 100).
(c) ((Пентан-1,5-диилбис(окси))бис(2-амино-5-метокси-4,1-фенилен))бис(((S)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метил-2,3-дигидро-1H-пиррол-1 -ил)метанон) (4).
Цинковую пыль (19,9 г, 304 ммоль, 40 экв.) обрабатывали 1М HCl (100 мл) и перемешивали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем смесь обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин и собирали активированный цинк вакуумной фильтрацией, затем промывали 1М HCl (50 мл), Н2О (до рН 67), МеОН и сушили in vacuo на фильтре. Активированный цинк добавляли к энергично перемешиваемому раствору бис-нитросоединения (3) (6,94 г, 7,6 ммоль, 1,0 экв.) в EtOH/H2O/EtOAc (60 мл/4 мл/60 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь по каплям обрабатывали 5% об./об. раствором HCO2H в МеОН (76 мл). Цвет изменялся с зеленого на металлический серый, наблюдали экзотерму до 42°С. После угасания экзотермы до 30°С ЖХ/МС показала, что реакция не завершена. Добавляли еще одну порцию 5% об./об. HCO2H в МеОН (20 мл) и наблюдали еще одну экзотерму (34°С). Реакционную смесь оставляли остывать до комнатной температуры, когда анализ ЖХ/МС показал полное превращение в требуемый продукт. Смесь фильтровали через Celite® и промывали набивку EtOAc. Фильтрат промывали насыщенным водным раствором NaHCO3 (2x300 мл), водой (300 мл), насыщенным солевым раствором (300 мл), сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали in vacuo с получением бис-анилина в виде желтого пенистого вещества (6,22 г, 96%). Продукт использовали без дополнительной очистки. Аналитические данные: ЖХ/МС, RT 2,12 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 853 ([М+ Н]+, 15).
(d) бис(4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил) ((пентан-1,5-диилбис(окси))бис(6-((S)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метил-2,3-дигидро1 H-пиррол-1 -карбонил)-4-метокси-3,1 -фенилен))дикарбамат (6).
Триэтиламин (0,171 г, 235 мкл, 1,69 ммоль, 4,4 экв.) через шприц добавляли к перемешанному раствору бмс-анилина (4) (0,33 г, 0,38 ммоль, 1,0 экв.) и трифосгена (0,082 г, 0,28 ммоль, 0,72 экв.) в сухом ТГФ в атмосфере аргона. Полученную суспензию нагревали до 40°С и через 5 мин брали образец в МеОН для анализа ЖХ/МС, который показал бис-метилкарбамат (МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 969 ([М + Н]+, 80); 992 ([М+ Na])+, 100). Добавляли дилаурат дибутилолова (0,024 г, 23 мкл, 38 мкмоль, 0,1 экв.), затем твердый линкер (5) (0,319 г, 0,85 ммоль, 2,2 экв.) и триметиламин (0,085 г, 118 мкл, 0,85 ммоль, 2,2 экв.) и нагревали смесь при 40°С при перемешивании в атмосфере аргона в течение 5 ч. Реакционную смесь оставляли остывать, фильтровали и выпаривали ТГФ при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией [CHCl3/МеОН 0%, 1%, 1,5%, 2%, градиентное элюирование] с получением продукта в виде желтого пенистого вещества (0,42 г, 66%). Аналитические данные: ЖХ/МС, RT 2,16 мин.; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1660 ([М+ Н]+, 60); 1682 ([М+ Na])+, 65).
(e) бис(4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил) ((пентан-1,5-диилбис(окси))бис(6-((S)-2-(гидроксиметил)-4-метил-2,3-дигидро-1H-пиррол-1-карбонил)-4метокси-3,1-фенилен))дикарбамат (7).
n-Толуолсульфоновую кислоту (0,296 г, 1,7 ммоль, 2,2 экв.) добавляли к перемешанному раствору бис-трет-бутилдиметилсилилового эфира (6) (1,26 г, 0,76 ммоль, 1,0 экв.) в 10% об./об. Н2О в ТГФ. Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Реакционную смесь разбавляли EtOAc (100 мл) и промывали насыщенным раствором NaHCO3 (2x100 мл), Н2О (100 мл), насыщенным солевым раствором (100 мл), сушили (MgSO4) и выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией [CHCl3/МеОН, от 0 до 5% с приращениями по 1%] с получением продукта
- 36 039276 в виде белого пенистого вещества (0,896 г, 92%). Аналитические данные: ЖХ/МС, RT 1,61 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1432 ([М+ Н]+, 5); 1454 ([М+ Na])+, 5).
(f) бис(4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)-8,8'(пентан-1,5-диилбис(окси))(11S,11aS,11'S,11a'S)-бис(11-гидрокси-7-метокси-2-метил-5-оксо-11,11адигидро-1 Н-пирроло[2,1 -с] [ 1,4] бензодиазепин-10(5Н)-карбоксилат) (8).
Периодинан Десс-Мартина (0,24 г, 0,57 ммоль, 2,0 экв.) добавляли к перемешанному раствору бисспирта (7) в сухом ДХМ (20 мл). Полученную белую суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Реакционную смесь разбавляли ДХМ (100 мл) и экстрагировали насыщенным раствором NaHCO3 (2x100 мл), водой (100 мл), насыщенным солевым раствором (100 мл), сушили (MgSO4) и выпаривали при пониженном давлении. После очистки колоночной флэш-хроматографией [CHCl3/МеОН, от 0 до 3% с приращениями по 0,5%] получали продукт в виде белого пенистого вещества (0,28 г, 69%). Аналитические данные: ЖХ/МС, RT 1,58 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1428 ([М + Н]+, 20); 1450 ([М+ Na])+, 30).
(g) бис(4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)-8,8'-(пентан-1,5-диилбис(окси))(11S,11aS,11'S,11a'S)-бис(11-гидрокси-7-метокси-2-метил-5-оксо-11,11а-дигидро-1Hпирроло[2,1-c][1,4] бензодиазепин-10(5Н)-карбоксилат) (9).
Pd(PPh3)4 (8 мг, 7 мкмоль, 0,04 экв.) добавляли к перемешанному раствору бис-alloc производного (8) (0,25 г, 0,176 ммоль 1,0 экв.) и пирролидина (31 мг, 36 мкл, 0,44 ммоль, 2,5 экв.) в сухом ДХМ (10 мл). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь разделяли между насыщенным раствором NH4Cl (50 мл) и ДХМ (50 мл). ДХМ отделяли и промывали насыщенным солевым раствором (100 мл), сушили (MgSO4) и выпаривали при пониженном давлении. Твердый остаток измельчали/обрабатывали ультразвуком с Et2O (3x15 мл) и сушили под вакуумом с получением продукта в виде белого твердого вещества (0,207 г, 93%). Продукт использовали без дополнительной очистки. Аналитические данные: ЖХ/МС, RT 1,06 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 630 ([М + 2Н]+, 100).
(h) бис(4-((2S,5S)-37-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5-изопропил-2-метил-4,7,35триоксо-10,13,16,19,22,25,28,31-октаокса-3,6,34-триазагептатриаконтанамидо) бензил)-8,8'-(пентан-1,5диилбис(окси))(11S,11aS,11'S,11a'S)-бис(11-гидрокси-7-метокси-2-метил-5-оксо-11,11а-дигидро-1Hпирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-10(5Н)-карбоксилат) (10).
EDCI.HCl (56 мг, 0,29 ммоль, 3 экв.) добавляли к перемешанному раствору бис-амина (9) (0,123 г, 98 мкмоль, 1,0 экв.) и MaldPEG®OH (0,128 г, 0,22 ммоль, 2,2 экв.) в CHCl3 (15 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин, затем разбавляли CHCl3 (50 мл), промывали Н2О (100 мл), насыщенным солевым раствором (100 мл), сушили (MgSO4) и выпаривали при пониженном давлении. После очистки препаративной ВЭЖХ с последующей лиофилизацией получали продукт в виде белого пенистого вещества (0,047 г, 20%). Аналитические данные: ЖХ/МС, RT 6,61 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1205 ([М+ 2Н]+, 55).
Пример 2
- 37 039276 бис(4-((2S,5S)-25-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-nиррол-1-ил)-5-изопропил-2-метил-4,7,23-триоксо10,13,16,19-тетраокса-3,6,22-триазапентакозанамидо)бензил)-8,8'-(пентан-1,5-диилбис(окси)) (11S,11aS, 11'S,11a'S)-6uc(11-гидроkси-7-метокси-2-метил-5-оkсо-11,11а-дигидро-1H-nирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-10(5Н)-карбоксилам) (11).
DIPEA (30 мг, 42 мкл, 0,23 ммоль, 3 экв.) добавляли к перемешанному раствору бис-амина (9) (98 мг, 78 мкмоль, 1,0 экв.) и MalPEG4OSu (88 мг, 0,17 ммоль, 2,2 экв.) в CHCl3 (10 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 72 ч, затем разбавляли CHCl3 (50 мл), промывали Н2О (100 мл), насыщенным солевым раствором (100 мл), сушили (MgSO4) и выпаривали при пониженном давлении. После очистки препаративной ВЭЖХ с последующей лиофилизацией получали продукт в виде белого пенистого вещества (0,043 г, 25%). Аналитические данные: ЖХ/МС, RT 6,11 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1028 ([М+ 2Н]+, 80).
Пример 3
бис(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)nроnанамидо)бензил)-8,8'-(nентан-1,5-диилбис(окси))(11S,11aS,1ΓS,11a'S)-бис(11-гидрокси-7метокси-2-метил-5-оксо-11,11 а-дигидро-1 Шпирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-10(5Н)-карбоксилат) (12).
EDCI.HCl (50 мг, 0,26 ммоль, 3 экв.) добавляли к перемешанному раствору бис-амина (9) (0,109 г, 86,5 мкмоль, 1,0 экв.) и MCOSu (40 мг, 0,19 ммоль, 2,2 экв.) в CHCl3 (10 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин, затем разбавляли CHCl3 (50 мл), промывали Н2О (100 мл), насыщенным солевым раствором (100 мл), сушили (MgSO4) и выпаривали при пониженном давлении. После очистки препаративной ВЭЖХ с последующей лиофилизацией получали продукт в виде белого пенистого вещества (0,045 г, 32%). Аналитические данные: ЖХ/МС, RT 6,82 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1646 ([М+Н]+, 20); 1667 ([M+Na])+, 30).
- 38 039276
Пример 4
(а) бис(4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил) ((пропан-1,3-диилбис(окси))бис(6-((S)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)пирролидин-1-карбонил)-4-метокси-3,1-фенилен))дикарбамат (14).
Трифосген (472 мг, 1,59 ммоль, 0,72 экв.) одной порцией добавляли к смеси соединения 13 (1,77 г, 2,21 ммоль) и триэтиламина (1,35 мл, 9,69 ммоль, 4,38 экв.) в дихлорметане (3,6 мл). Через 10 мин одной порцией добавляли соединение 5 (1,83 г, 4,85 ммоль, 2,19 экв.) в виде тонкодисперсного порошка, затем триэтиламин (0,68 мл, 4,9 ммоль, 2,2 экв.) и дилаурат дибутилолова (132 мкл, 0,221 ммоль, 0,1 экв.). Реакционную смесь оставляли перемешиваться при 37°С в течение 4 ч, после чего перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Органическую фазу промывали водой и декантировали в фильтрующем картридже. ДХМ удаляли выпариванием, а остаток в сухом виде загружали на силикагель, затем проводили хроматографию на картридже Ultra Biotage, 50 г (градиент ДХМ/ДХМ:МеОН 90:10, от 5% до 32%, элюирование при 32%). Чистые фракции объединяли с получением продукта 14 (2,35 г, 1,46 ммоль, выход 66,2%).
Аналитические данные: ЖХ/МС, 3 мин, липофильный метод, RT 2,24 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1608,9 ([М+Н]+, 100);
(b) бис(4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил) ((пропан-1,3-диилбис(окси))бис(6-((S)-2-(гидроксиметил)пuрролидин-1-карбонил)-4-метокси-3,1фенилен))дикарбамат (15).
Гидрат паратолуолсульфоновой кислоты (277 мг, 1,46 ммоль, 1 экв.) одной порцией добавляли к смеси соединения 14 (2,34 г, 1,46 ммоль) в тетрагидрофуране (53,0 мл) и воде (5,00 мл) при 0°С (баня изо
- 39 039276 льда/воды). Реакционную смесь оставляли перемешиваться при 20°С в течение 7 ч до завершения реакции, по данным ЖХМС. Реакционную смесь разделяли между этилацетатом и водой и промывали NaHCO3, затем насыщенным солевым раствором. Органические вещества сушили над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали хроматографией (50 г Ultra, сухая загрузка на картридж Samplet, ДХМ и смесь ДХМ:МеОН 90:10, градиент от 20 до 64%, элюирование около 64%. Чистые фракции объединяли и концентрировали под вакуумом с получением продукта 15 (1,60 г, 1,16 ммоль, выход 79,7%) в виде белого твердого вещества.
Аналитические данные: ЖХ/МС, 3 мин, липофильный метод, RT 1,50 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1380,9 ([М+Н]+, 100).
(c) бис(4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)-8,8'(пропан-1,3-диилбис(окси))(11S,11aS,11'S,11 a'S)-бис( 11 -гидрокси-7-метокси-5 -оксо-2,3,11,11атетрагидро-1H-бензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-10(5Н)-карбоксилат) (16).
Добавляли 0,2М раствор Stahl Tempo (2,10 мл, 0,420 ммоль, 0,44 экв.), затем трифлат тетракисацетонитрилмеди(I) (160 мг, 0,425 ммоль, 0,44 экв.) к раствору соединения 15 (1,32 г, 0.957 ммоль) в ДМФА (4,00 мл) в колбе объемом 500 мл. Реакционную смесь быстро перемешивали и нагревали при 40°С в течение 5 ч, затем при 35°С в течение 18 ч в атмосфере воздуха из баллона, после чего наблюдали завершение реакции, по данным ЖХМС. Растворители удаляли выпариванием. Следы ДМФА удаляли вторым выпариванием с бутаноном, затем под высоким вакуумом. Сухой остаток загружали на картридж Samplet (10 г) с ацетоном, затем проводили хроматографию на колонке Ultra, 50 г, в системе Biotage Isolera. Градиент 10% МеОН в ДХМ/ДХМ, от 20 до 63% в 8 объемах колонки. Элюирование и выдерживание около 60%. Первые фракции примесей повторно очищали на той же системе, используя 25 г колонку. Все чистые фракции объединяли. Остаток растворяли в ацетоне. Добавление гептана вызывало образование белого осадка продукта. Летучие вещества выпаривали с получением продукта 16 в виде белого порошка после обработки под высоким вакуумом. (892 мг, 0,648 ммоль, выход 67,8%). Аналитические данные: ЖХ/МС, 3 мин, липофильный метод, RT 1,42 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1376,6 ([М + Н]+,100).
(d) бис(4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)-8,8'-(пропан-1,3-диилбис(окси))(11S,11aS,11'S,11a'S)-бис(11-гидрокси-7-метокси-5-оксо-2,3,11,11а-тетрагидро-1H-бензо[е] пирроло[1,2-а] [ 1,4]диазепин-10(5Н)-карбоксилат) (17).
Тетракис(трифенилфосфин)палладий(0) (10,0 мг, 0,00865 ммоль, 0,034 экв.) добавляли к смеси соединения 16 (350 мг, 0,254 ммоль) и пирролидина (65,0 мкл, 0,780 ммоль, 3,07 экв.) в дихлорметане (7,50 мл) и метаноле (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 1 ч 30 мин, и реакция была завершена, по данным ЖХМС.
Добавляли хлорид аммония в воде (30 мл, 34,3 ммоль, 6 мас.%) и энергично перемешивали смесь. Затем смесь декантировали в картридже для разделения фаз Biotage. Слой ДХМ выпаривали досуха под вакуумом. Остаток растворяли в хлороформе (20 мл) и удаляли растворитель выпариванием под вакуумом при 35°С. Указанный цикл повторяли второй раз, затем сушили под высоким вакуумом (3 мбар) с получением неочищенного продукта 17 (307 мг, 0,254 ммоль, 100%) в виде белого твердого вещества, которое напрямую использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Аналитические данные: ЖХ/МС, 3 мин, липофильный метод, 2 пика, RT 0,22 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 604,9 ([М+ 2Н]2+, 100); 1208,2 ([М+Н]+, 10).
(е) бис(4-((2S,5S)-37-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5-изопропил-2-метил-4,7,35- триоксо-10,13,16,19,22,25,28,31-октаокса-3,6,34-триазагептатриаконтанамидо)бензил)-8,8'-(пропан-1,3диилбис(окси))(11S,11aS,1ΓS,11а'S)-бис(11-гидрокси-7-метокси-5-оксо-2,3,11,11а-тетрагидро-Шбензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-10(5Н)-карбоксилат) (18).
Хлороформ (10,00 мл) и метанол (0,4 мл) добавляли к неочищенному соединению 17 (307 мг, 0,254 ммоль), затем добавляли mal-амидо-ПЭГ8-кислоту (339 мг, 0,561 ммоль, 2,2 экв.) и EDCI (107 мг, 0,558 ммоль, 2,19 экв.). Реакцию проводили при комнатной температуре в течение 45 мин, после чего наблюдали завершение реакции, по данным ЖХМС. Добавляли хлорид аммония в воде (30 мл, 6 мас.%) и энергично перемешивали смесь. Смесь декантировали в картридже для разделения фаз Biotage. Слой ДХМ выпаривали досуха под вакуумом. Летучие вещества удаляли на ротационном испарителе и очищали неочищенный остаток хроматографией (50 г Ultra, Biotage, градиент от 30/70 до 100/0 смеси 16% МеОН в ДХМ/ДХМ в 10 объемах колонки; элюирование при более 10% МеОН). Все фракции анализировали с помощью ТСХ (10% МеОН в ДХМ). Чистые фракции объединяли. Растворитель удаляли выпариванием с получением соединения 18 (200 мг). Анализ ЖХМС показал следы mal-ПЭГ8-кислоты, и материал еще раз очищали препаративной ВЭЖХ, сушили замораживанием, брали аликвоту в дихлорметане и сушили под высоким вакуумом с получением соединения 18 в виде белого твердого вещества. Чистота составляла 99,45%. (В, 110 мг, 0,0467 ммоль, выход 18,3%). Аналитические данные: ЖХ/МС, 15 мин. период, RT 5,90 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1179,5 ([М+2Н]2+, 100);
1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 9,92 (с, 2Н), 8,16 (д, J = 6,9 Гц, 2Н), 7,99 (т, J = 5,7 Гц, 2Н), 7,86 (д, J = 8,7 Гц, 2Н), 7,55 (с, 4Н), 7,18 (с, 4Н), 7,07 (с, 2Н), 7,00 (с, 4Н), 6,79 (с, 2Н), 6,50 (с, 2Н), 5,48 (с, 2Н), 5,23 4,77 (м, 4Н), 4,39 (т, J = 7,0 Гц, 2Н), 4,22 (дд, J = 8,7, 6,6 Гц, 2Н), 4,10 (с, 4Н), 3,77 (с, 6Н), 3,64 - 3,55 (м,
- 40 039276
8Н), 3,55 - 3,42 (м, 56Н), 3,37 (т, J = 5,9 Гц, 6Н), 3,28 (т, J = 8,3 Гц, 2Н), 3,15 (к, J = 5,8 Гц, 4Н), 2,49 - 2,37 (м, 4Н), 2,37 - 2,30 (м, 4Н), 2,17 (с, 2Н), 2,09 - 1,73 (м, 10Н), 1,30 (д, J = 7,0 Гц, 6Н), 0,85 (дд, J = 15,3, 6,7 Гц, 12Н).
Пример 5
TBSO^, ^-OTBS
ЛХ -¾ и 1Q и
(а) бис(4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил) ((пропан-1,3-диилбис(окси))бис(6-((S)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-метиленпирролидин1-карбонил)-4-метокси-3,1-фенилен))дикарбамат (20).
Трифосген (816 мг, 2,75 ммоль, 0,72 экв.) одной порцией добавляли к смеси соединения 19 (3,15 г, 3,82 ммоль) и триэтиламина (2,34 мл, 16,8 ммоль, 4,4 экв.) в дихлорметане (75 мл) при 0°С. Ледяную баню убирали и через 15 мин одной порцией добавляли спирт 5 (3,17 г, 8,40 ммоль, 2,2 экв.) в виде тонкодисперсного порошка, затем триэтиламин (1,17 мл, 8,39 ммоль, 2,2 экв.) и дилаурат дибутилолова (229 мкл, 0,383 ммоль, 0,1 экв.). Реакционную смесь оставляли перемешиваться при 37°С в течение 1 ч, затем перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Органическую фазу разбавляли ДХМ (100 мл) и промывали водой (200 мл), насыщенным раствором хлорида аммония (100 мл) и насыщенным солевым раствором (50 мл), затем сушили над сульфатом магния. Летучие вещества удаляли выпариванием при пониженном давлении. Неочищенный продукт в сухом виде загружали на силикагель и элюировали на 340 г колонке Ultra с градиентом этилацетат - ацетон, от 20 до 100% в 7 объемах колонки. Быстрое элюирование в 2 объемах колонки при около 30% ацетона обеспечивало получение чистых фракций, которые сушили под вакуумом с получением соединения 20 (4,00 г, 2,45 ммоль, 100 мас.%, выход 64,2%). Аналитические данные: ЖХ/МС, 3 мин, липофильный метод, RT 2,34 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1661,1 ([М+Н]+, 100).
(b) бис(4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил) ((пропан-1,3-диилбис(окси))бис(6-((S)-2-(гидроксиметил)-4-метиленпирролидин-1-карбонил)-4-метокси
- 41 039276
3,1-фенилен))дикарбамат (21).
бис-TBS эфир 20 (4,00 г, 2,45 ммоль) и гидрат паратолуолсульфоновой кислоты (300 мг, 1,58 ммоль) растворяли в смеси 2-метилтетрагидрофурана (25,0 мл, 249 ммоль, 100 мас.%), уксусной кислоты (4,00 мл, 69,8 ммоль, 100 мас.%) и воды (4,00 мл, 222 ммоль, 100 мас.%). Смесь нагревали при 40°С. Через 2 ч наблюдали завершение реакции, по данным ЖХМС. Реакционную смесь разделяли между этилацетатом (150 мл) и водой (200 мл), затем промывали насыщенным раствором NaHCO3 (150 мл) и насыщенным солевым раствором (100 мл). Органические вещества сушили над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали хроматографией (100 г Ultra, сухая загрузка на картридж Samplet 10 г, этилацетат/ацетон, градиент от 85/15 до 0/100, элюирование при около 80% ацетона. Чистые фракции объединяли и концентрировали под вакуумом с получением чистого продукта 21 (960 мг, 0,684 ммоль, выход 27,9%) в виде белого твердого вещества. Аналитические данные: ЖХ/МС, 3 мин, липофильный метод, RT 1,54 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1402,3 ([М+ Н]+, 100).
(c) бис(4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)-8,8'(пропан-1,3-диилбис(окси))(11S,11aS,11'S,11a'S)-бис(11-гидрокси-7-метокси-2-метилен-5-оксо2,3,11,11а-тетрагидро-1H-бензо[е]пирроло[ 1,2-а][1,4]диазепин-10(5Н)-карбоксилат) (22).
0,2 М Раствор Stahl Tempo (1,34 мл, 0,268 ммоль, 0,4 экв.), затем трифлат тетракисацетонитрилмеди(1) (190 мг, 0,504 ммоль, 0,75 экв.) добавляли к раствору спирта 21 (940 мг, 0,670 ммоль) в ДМФА (3,00 мл) и ДХМ (13,0 мл) в колбе объемом 500 мл. Реакционную смесь быстро перемешивали и нагревали при 37°С в течение 5 ч (почти до завершения), затем при -20°С в течение 96 ч, после чего реакционную смесь разбавляли дихлорметаном (60 мл) и водой (60 мл) и перемешивали в течение 5 мин. Реакционную смесь декантировали в устройстве для разделения фаз и сушили ДХМ фазу при пониженном давлении. Добавляли МЭК (60 мл) и удаляли остаточный ДМФА азеотропной перегонкой с МЭК при пониженном давлении (2 раза) с получением неочищенного продукта в виде твердого вещества. Его снова растворяли в смеси ДХМ/изопропанол 80/20 (от 5 до 10 мл) и загружали на картридж Biotage Samplet (10 г), сушили и загружали на 100 г колонку Ultra. Градиент от 88/12 ДХМ/20% МеОН в ДХМ до 70/30 в 10 объемах колонки. Чистые фракции объединяли с получением чистого соединения 22 (602 мг, 0,430 ммоль, выход 64,2%) в виде белого продукта. Аналитические данные: ЖХ/МС, 3 мин, липофильный метод, RT 1,51 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1401,5 ([М+ Н]+, 100).
(d) бис(4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)-8,8'-(пропан-1,3-диилбис(окси))(11S,11aS,11'S,11а'S)-бис(11-гидрокси-7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,11,11а-тетрагидро-1Hбензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-10(5Н)-карбоксилат) (23).
Тетракис(трифенилфосфин)палладий(0) (8,2 мг, 0,0071 ммоль, 100 мас.%) добавляли к смеси соединения 22 (250 мг, 0,179 ммоль) и пирролидина (37,0 мкл, 0,444 ммоль, 2,49 экв.) в ДХМ (7,50 мл) и метаноле (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 1 ч 30 мин, и реакция была завершена, по данным ЖХМС.
Добавляли хлорид аммония в воде (30 мл, 6 мас.%) и энергично перемешивали смесь. Затем смесь декантировали в картридже для разделения фаз Biotage. ДХМ слой выпаривали досуха под вакуумом. Остаток растворяли в хлороформе (20 мл) и удаляли растворитель на ротационном испарителе под вакуумом при 35°С. Указанный цикл повторяли второй раз, затем сушили под высоким вакуумом (3 мбар, на ротационном испарителе) с получением неочищенного продукта 23 (220 мг, 0,179 ммоль, 100%) в виде белого твердого вещества, которое напрямую использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Аналитические данные: ЖХ/МС, 3 мин, метод, 2 пика, RT 1,15 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 616,9 ([М+2Н]2+, 100); 1232,1 ([М+Н]+, 10).
(е) бис(4-((2S,5S)-37-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5-изопропил-2-метил-4,7,35- триоксо-10,13,16,19,22,25,28,31-октаокса-3,6,34-триазагептатриаконтанамидо)бензил)-8,8'-(пропан-1,3дuuлбuс(оксu))(11S,11aS,11'S,11α'S)-бuс(11-гuдроксu-7-метоксu-2-метuлен-5-оксо-2,3,11,11α-тетрαгuдро1H-бензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-10(5Н)-карбоксилат) (24).
Хлороформ (4,1 мл) и метанол (0,2 мл) добавляли к соединению 23, затем добавляли mal-амидоПЭГ8-кислоту (238 мг, 0,394 ммоль, 2,2 экв.) и EDCI (85,0 мг, 0,443 ммоль, 2,48 экв.). Реакцию проводили при комнатной температуре в течение 45 мин, после чего наблюдали завершение реакции, по данным ЖХМС. Реакционную смесь концентрировали (2 мл), загружали на 3 г картридж Biotage Samplet из диоксида кремния и сушили под вакуумом. Samplet загружали на 25 г колонку Ultra Biotage и элюировали (градиент от 10/90 до 58/42 смеси 20% МеОН в ДХМ/ДХМ за 12 объемов колонки; элюирование при около 55% смеси 20% МеОН). Все фракции анализировали с помощью ТСХ (10% МеОН в ДХМ). Чистые фракции объединяли. Растворитель удаляли выпариванием с получением соединения 24 (250 мг, 0,105 ммоль, выход 58,8%). Аналитические данные: ЖХ/МС, 15 мин метод, RT 6.20 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1191,5 ([М+ 2Н]2+, 100);
1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 9,92 (с, 2Н), 8,16 (д, J = 6,9 Гц, 2Н), 7,99 (т, J = 5,5 Гц, 2Н), 7,86 (д, J = 8,6 Гц, 2Н), 7,68 - 7,42 (м, 4Н), 7,39-7,11 (м, 4Н), 7,07 (с, 2Н), 7,00 (с, 4Н), 6,81 (с, 2Н), 6,60 (с, 2Н), 5,46 5,30 (м, 2Н), 5,21 - 4,79 (м, 8Н), 4,39 (т, J = 7,0 Гц, 2Н), 4,22 (дд, J = 8,7, 6,7 Гц, 2Н), 4,15 - 3,88 (м, 8Н), 3,77 (с, 6Н), 3,65 - 3,55 (м, 8Н), 3,54 - 3,40 (м, 58Н), 3,37 (т, J = 5,9 Гц, 4Н), 3,15 (к, J = 5,8 Гц, 4Н), 2,95 2,79 (м, 2Н), 2,57 - 2,52 (м, 2Н), 2,49 - 2,37 (м, 4Н), 2,37 - 2,29 (м, 4Н), 2,22 -2,10 (м, 2Н), 2,03 - 1,88 (м,
- 42 039276
2Н), 1,30 (д, J = 7,0 Гц, 6Н), 0,85 (дд, J = 15,3, 6,7 Гц, 12Н).
Пример 6.
(i) Синтез (S,Е)-(2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-этилиденпирролидин-1-ил)(5-метокси2-нитро-4-((триизопропилсилил)окси)фенил)метанона (29)
Соединение 25 описано в публикации Tiberghien et al., ACS Med. Chem. Lett., 2016, 7 (11), cc. 983987. Соединение 26 описано в публикации Smits and Zemribo, Org. Lett., 2013, 15 (17), cc. 4406-4409.
(а) Метил(S,Е)-4-этилиден-1-(5-метокси-2-нитро-4-((триизопропилсилил)окси)бензоил)пирролидин2-карбоксилам (27).
Соединение 25 (325 г, 1,2 экв.) и 26 (1,0 экв.) растворяли в ДХМ (3,25 л) и охлаждали до -40°С. По частям добавляли Т3Р (2 экв.) при -40 °С, затем DIEA (6,0 экв.). Смесь перемешивали в течение 1 ч при -40°С. По данным ЖХМС, наблюдали завершение реакции. Добавляли водный раствор уксусной кислоты (10%, 3,25 л) при 0°С. Органическую фазу отделяли и второй раз промывали водным раствором уксусной кислоты (10%, 3,25 л), затем насыщенным солевым раствором (3,25 л). Летучие вещества удаляли под вакуумом с получением неочищенного продукта 27 в виде коричневого маслянистого вещества, которое очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc, градиент от 100/1 до 10/1, сбор от 20/1. (591 г, чистота 87,6% по ЖХ, 70% по ЯМР, выход = 60%). RT: 6,374 мин.
Аналитический метод, использованный для соединения 27.
Колонка: Agilent Poroshell 120 ЕС- С18 4,6*100 мм, 2,7 мкм.
Подвижная фаза А: 0,05% ТФК в воде.
Подвижная фаза В: 0,05% ТФК в ACN.
Разбавитель: ACN.
Скорость потока: 1,0 мл/мин.
Объем ввода пробы: 1 мкл.
Температура колонки: 40°С.
Детектор: 220 нм.
Время записи хроматограммы: 8,1 мин.
Время перерыва: 2 мин.
Таблица градиента
Время (мин.) 0,0 4,0 8,0 8,1
% подвижной фазы А 80 0 0 95
% подвижной фазы В 20 100 100 5
(b) (S,Е)-(4-этилиден-2-(гидроксиметил)пирролидин-1-ил)(5-метокси-2-нитро-4-((триизопропилсилил)окси)фенил)метанон (28).
Соединение 27 (591 г, 1 экв.) растворяли в ДХМ и охлаждали до 0°С. По частям добавляли боргидрид лития (2,0 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 6 ч. По данным ЖХМС, наблюдали завершение реакции. Добавляли водный раствор уксусной кислоты (10%, 5,9 л) при 0°С. Органическую фазу отделяли и второй раз промывали водным раствором уксусной кислоты (10%, 5,9 л), затем насыщенным солевым раствором (5,9 л). Летучие вещества удаляли под вакуумом с получением остатка, который очищали флэш-хроматографией (петролейный эфир/EtOAc, градиент от 50/1 до 1/1, сбор от 5/1) с получением соединения 28 в виде грязновато-белого твердого вещества (250 г, выход 64%). RT: 7,922 мин.
(c) (S,Е)-(2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-этилиденпирролидин-1-ил)(5-метокси-2нитро-4-((триизопропилсилил)окси)фенил)метанон (29).
Соединение 28 (250 г, 1 экв.) и имидазол (2 экв.) растворяли в ДХМ (1,5 л, 6 об.) при комнатной температуре. По частям добавляли TBSCl (1,5 экв.), поддерживая температуру ниже 30°С. Реакционную смесь оставляли перемешиваться при 25°С в течение 1 ч, когда наблюдали исчезновение исходного вещества, по данным ЖХМС. Смесь фильтровали через хлопковую вату. Осадок на фильтре промывали
- 43 039276
ДХМ (500 мл). Фильтрат промывали водным раствором уксусной кислоты (10%, 2,5 л) при 10°С, затем насыщенным солевым раствором (2,5 л). Органическую фазу сушили безводным сульфатом натрия и концентрировали под вакуумом с получением продукта 29 в виде желтого маслянистого вещества, которое было достаточно чистым для использования на следующей стадии (285 г, выход 92,2%). RT: 11,002 мин. МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 663,4 ([М+ Н]+, 100).
Аналитический метод, использованный для соединения 28 и 29.
Колонка: Agilent Poroshell 120 ЕС- С18 4,6*100 мм, 2,7 мкм.
Подвижная фаза А: 0,05% ТФК в воде.
Подвижная фаза В: 0,05% ТФК в ACN.
Разбавитель: ACN.
Скорость потока: 1,0 мл/мин.
Объем ввода пробы: 2 мкл.
Температура колонки: 40°С.
Детектор: 220 нм.
Время записи хроматограммы: 12,1 мин.
Время перерыва: 2 мин.
(ii) Синтез бис(4-((2S,5S)-37-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-5-изопропил-2-метил-4,7,35триоксо-10,13,16,19,22,25,28,31 -октаокса-3,6,34-триазагептатриаконтанамидо)бензил)-8,8-(пентан-1,5диилбис(окси))(2Е,2Έ,11S,11aS,11'S,11а'S)-бис(2-этилиден-11-гидрокси-7-метокси-5-оксо-2,3,11,11aтетрагидро-1H-бензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-10(5Н)-карбоксилата) (37).
(а)(S,Е)-(2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-этилиденпирролидин-1-ил)(4-гидрокси-5метокси-2-нитрофенил)метанон (30).
- 44 039276
TIPS-защищенный фенол 29 (10,0 г, 16,9 ммоль) растворяли в смеси этилацетата (20,0 мл) и ДМФА (20,0 мл) при 40°С. Добавляли раствор ацетата лития (0,668 г, 10,1 ммоль, 0,6 экв.) в воде (3,0 мл). Реакцию проводили при 40°С в течение 4 ч, после чего наблюдали завершение реакции, по данным ЖХМС. Реакционную смесь разделяли между 2-Ме-ТГФ (200 мл) и 2% раствором лимонной кислоты в воде (200 мл). Органическую фазу промывали насыщенным солевым раствором (70 мл) и сушили над сульфатом магния. Летучие вещества удаляли под вакуумом. Твердый остаток в форме осадка получали при добавлении диэтилового эфира (50 мл) и гексана (200 мл). Продукт собирали фильтрованием, промывали небольшим количеством диэтилового эфира и сушили в течение ночи под вакуумом с получением соединения 30 в виде бледно-желтого твердого вещества. (5,8 г, 13 ммоль, выход 79%). Аналитические данные: ЖХ/МС, 3 мин, липофильный метод, RT 1,82 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 437,8 ([М+Н]+, 100).
(b) ((Пентан-1,5-диилбис(окси))бис(5-метокси-2-нитро-4,1-фенилен))бис(((S,Е)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-этилиденпирролидин-1-ил)метанон) (31).
Добавляли 1,5-дибромпентан (0,986 г, 4,29 ммоль, 0,5 экв.), затем карбонат калия (1,30 г, 9,41 ммоль, 1,1 экв.) к раствору соединения 30 (3,74 г, 8,57 ммоль) и йодида тетрабутиламмония (0,63 г, 1,7 ммоль, 0,2 экв.) в ацетоне (20,0 мл) в круглодонной колбе объемом 100 мл. Реакционную смесь быстро перемешивали и нагревали при 60°С в течение 2 ч, а затем оставляли перемешиваться при 45°С в течение ночи. Реакция была завершена, по данным ЖХМС. Смесь разделяли в этилацетате (150 мл) и воде (200 мл), затем промывали насыщенным солевым раствором (100 мл), сушили над сульфатом магния. Летучие вещества удаляли под вакуумом с получением продукта 31 (4,04 г, 4,29 ммоль, выход 100%), который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Аналитические данные: ЖХ/МС, 3 мин, липофильный метод, RT 2,39 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 942,3 ([М+ Н]+, 100).
(c) ((Пентан-1,5-диилбис(окси))бис(2-амино-5-метокси-4,1-фенилен))бис(((S,Е)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-этилиденпирролидин-1-ил)метанон) (32).
Цинк (20,6 г, 315 ммоль, 74 экв.) добавляли к смеси этанола (64,0 мл), воды (4,00 мл) и муравьиной кислоты (4,00 мл, 106 ммоль, 25 экв.) при 10°С (ледяная баня) и энергично перемешивали. К этой смеси по каплям, с помощью пипетки добавляли раствор соединения 31 (4,00 г, 4,25 ммоль) в этаноле (16,0 мл), поддерживая температуру ниже 35°С. Цинковую массу периодически перемешивали вручную. Реакцию проводили еще 30 мин при комнатной температуре, после чего было достигнуто завершение реакции. Смесь разбавляли этилацетатом (200 мл). Твердое вещество удаляли фильтрованием через целит. Агломерат промывали этилацетатом (200 мл). Фильтрат промывали водой (300 мл), насыщенным раствором бикарбоната натрия (150 мл), насыщенным солевым раствором (100 мл) и сушили над сульфатом магния. Летучие вещества удаляли выпариванием и очищали остаток автоматической флэш-хроматографией (100 г Ultra, Biotage, этилацетат/гексан, градиент от 30 до 80% за 8 объемов колонки, элюирование от 58% с 10 объемов колонки), с получением соединения 32 (1,94 г, 2,20 ммоль, выход 51,8%) в виде бледножелтого пенистого вещества. Аналитические данные: ЖХ/МС, 3 мин, липофильный метод, RT 2,29 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 882,4 ([М+ Н]+, 100).
(d) бис(4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил) ((пентан-1,5-диилбис(окси))бис(6-((S,Е)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-4-этилиденпирролидин-1-карбонил)-4-метокси-3,1-фенилен))дикарбамат (33).
Трифосген (0,461 г, 1,55 ммоль, 0,72 экв.) одной порцией добавляли к смеси соединения 32 (1,90 г, 2,16 ммоль) и триэтиламина (1,32 г, 13,0 ммоль, 6 экв.) в ДХМ (45 мл) при 0°С. Ледяную баню убирали и через 15 мин одной порцией добавляли соединение 5 (1,79 г, 4,74 ммоль, 2,2 экв.) в виде тонкодисперсного порошка, затем триэтиламин (0,661 г, 6,53 ммоль, 3 экв.) и дилаурат дибутилолова (0,129 мл, 0,215 ммоль, 0,1 экв.). Реакционную смесь оставляли перемешиваться при 37°С на 4 ч, затем перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Органическую фазу разбавляли ДХМ (100 мл) и промывали водой (200 мл), насыщенным раствором хлорида аммония (100 мл) и насыщенным солевым раствором (50 мл), затем сушили над сульфатом магния. Летучие вещества удаляли выпариванием при пониженном давлении с получением соединения 3 (3,00 г, 1,78 ммоль, выход 82%). Неочищенный продукт напрямую использовали для реакции на следующей стадии.
Аналитические данные: ЖХ/МС, 3 мин, липофильный метод, RT 2,31 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1689,6 ([М+Н]+, 100).
(е) бис(4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил) ((пентан-1,5-диилбис(окси))бис(6-((S,Е)-4-этилиден-2-(гидроксиметил)пирролидин-1-карбонил)-4метокси-3,1 -фенилен))дикар бамат (34).
бис-TBS эфир 33 (3,00 г, 1,78 ммоль) растворяли в смеси 2-метилтетрагидрофурана (9 мл), уксусной кислоты (9 мл) и воды (1.5 мл). Смесь нагревали при 40°С в течение 2 ч. Наблюдение с помощью ЖХМС показало неудовлетворительную степень завершения реакции (40%). Добавляли гидрат паратолуолсульфоновой кислоты (203 мг, 1,07 ммоль, 0,6 экв.), которая ускоряла реакцию. Завершение наблюдали через 30 мин.
Реакционную смесь разделяли между этилацетатом (150 мл) и водой (200 мл), затем промывали на
- 45 039276 сыщенным раствором NaHCO3 (150 мл) и насыщенным солевым раствором (100 мл). Органические вещества сушили над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали хроматографией (50 г Ultra, сухая загрузка на рыхлый силикагель, этилацетат/ацетон, градиент от 85/15 до 0/100, элюирование около 55% ацетона). Чистые фракции объединяли и концентрировали под вакуумом с получением чистого продукта 34 (2,20 г, 1,51 ммоль, выход 84,8%) в виде белого твердого вещества. Аналитические данные: ЖХ/МС, 3 мин, липофильный метод, RT 1,67 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1461,6 ([М+Н]+, 100).
(f) бис(4-((S)-2-((S)-2-(((аллилокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)-8,8'(пентан-1,5-диилбис(окси)) (2Е,2'Е, 11S, 11aS, 11'S, 11а'S)-бис(2-этилиден-11-гидрокси-7-метокси-5-оксо2,3,11,11а-тетрагидро-1H-бензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-10(5Н)-карбоксилат) (35).
0,2М раствор Stahl Tempo (3,50 мл, 0,700 ммоль, 0,47 экв.), затем трифлат тетракисацетонитрилмеди (I) (290 мг, 0,770 ммоль, 0,52 экв.) добавляли к раствору соединения 34 (2,17 г, 1,49 ммоль) в ДМФА (3,00 мл) в колбе объемом 500 мл. Реакционную смесь быстро перемешивали и нагревали при 40°С в течение 5 ч (завершение), затем при 30°С в течение 18 ч в атмосфере воздуха из баллона, после чего реакционную смесь разбавляли дихлорметаном (60 мл) и водой (60 мл) и перемешивали в течение 5 мин. Реакционную смесь декантировали в устройстве для разделения фаз и сушили ДХМ фазу при пониженном давлении. Добавляли МЭК (60 мл) и удаляли остаточный ДМФА азеотропной перегонкой при пониженном давлении (2 раза) с получением неочищенного продукта в виде твердого вещества. Его снова растворяли в ДХМ (5-10 мл) и загружали на 100 г колонку Ultra. Градиент от 75/25 ДХМ/10% МеОН в ДХМ до 40/60 (элюирование около 50/50). Чистые фракции объединяли с получением соединения 35 (1,35 г, 0,927 ммоль, выход 62,4%) в виде белого продукта. Аналитические данные: ЖХ/МС, 3 мин, липофильный метод, RT 1,63 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1457,3 ([М+ Н]+, 100); 15 мин период, RT 7,52 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1456,6 ([М+ Н]+, 100).
(g) бuс(4-((S)-2-((S)-2-αмuно-3-метuлбутαнαмuдо)nроnαнαмuдо)бензuл)-8,8'-(nентαн-1,5-дuuлбис(окси))(2Е,2'Е, 11S,11aS,11'S,11 a'S)-бис(2-этилиден-11 -гидрокси-7-метокси-5 -оксо-2,3,11,11атетрагидро-1H-бензо[е]πирроло[1,2-а][1,4]диазеπин-10(5Н)-карбоксилат) (36).
Тетракис(трифенилфосфин)палладий(0) (10,0 мг, 0,0086 ммоль, 0,01 экв.) добавляли к смеси соединения 35 (1,33 г, 0,914 ммоль) и пирролидина (190 мкл, 2,28 ммоль, 2,5 экв.) в ДХМ (7,50 мл) и метаноле (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 1 ч 30 мин, и реакция была завершена, по данным ЖХМС. Добавляли хлорид аммония в воде (30 мл, 6 мас.%) и энергично перемешивали смесь. Затем смесь декантировали в картридже для разделения фаз Biotage. ДХМ слой выпаривали досуха под вакуумом. Остаток растворяли в хлороформе (20 мл) и удаляли растворитель под вакуумом при 35°С. Указанный цикл повторяли второй раз, затем сушили под высоким вакуумом (3 мбар) с получением неочищенного соединения 36 (1,17 г, 0,914 ммоль, выход 100%) в виде белого твердого вещества. Аналитические данные: ЖХ/МС, 3 мин метод, RT 1,23 мин, 2 пика; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 645,0 ([М+ 2Н]2+, 100); 1288,8 ([М+ Н]+, 10).
(h) бис(4-((2S,5S)-37-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5-изопропил-2-метил-4,7,35триоксо-10,13,16,19,22,25,28,31-октаокса-3,6,34-триазагептатриаконтанамидо)бензил)-8,8'-(пентан-1,5диилбис(окси))(2Е,2'Е, 11S,11aS, 11'S, 11 а'S)-бис(2-этилиден-11 -гидрокси-7-метокси-5-оксо-2,3,11,11атетрагидро-1H-бензо[е]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-10(5Н)-карбоксилат) (37).
ДХМ (10,00 мл) и метанол (0,4 мл) добавляли к соединению 36 (393 мг, 0,305 ммоль), затем добавляли mal-амидо-ПЭГ8-кислоту (380 мг, 0,628 ммоль, 2,06 экв.) и EDCI (128 мг, 0,668 ммоль, 2,2 экв.). Реакцию проводили при комнатной температуре в течение 4 ч, после чего наблюдали завершение реакции, по данным ЖХМС. Добавляли хлорид аммония в воде (30 мл, 6 мас.%) и энергично перемешивали смесь. Смесь декантировали в картридже для разделения фаз Biotage. ДХМ слой выпаривали досуха под вакуумом и очищали неочищенный остаток хроматографией (25 г Ultra, градиент от 15/85 до 100/0 смеси 20% МеОН в ДХМ/ДХМ за 12 объемов колонки; выдерживание при элюировании при около 48%). Фракции анализировали с помощью ТСХ (10% МеОН в ДХМ). Чистые фракции объединяли. Растворитель удаляли выпариванием. Остаток дополнительно очищали обращенно-фазовой препаративной ВЭЖХ (градиент от 15 до 75% смеси вода/ацетонитрил + 0,01% муравьиной кислоты), затем сушили замораживанием и брали аликвоту из ДХМ с получением соединения 37 (516 мг, 0,212 ммоль, выход 69,4%) в виде белого пенистого вещества. Чистота составила 97,65%. Аналитические данные: ЖХ/МС, 15 мин метод, RT 6,61 мин; МС (ИР+) m/z (относительная интенсивность) 1219,7 ([М+ 2Н]2+, 100);
1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 9,92 (с, 2Н), 8,17 (д, J = 6,9 Гц, 2Н), 8,01 (т, J = 5,6 Гц, 2Н), 7,87 (д, J = 8,7 Гц, 2Н), 7,72 - 7,44 (м, 4Н), 7,39 - 7,10 (м, 4Н), 7,05 (с, 2Н), 7,00 (с, 4Н), 6,76 (с, 2Н), 6,66 - 6,46 (м, 2Н), 5,56 (д, J = 7,1 Гц, 2Н), 5,34 (дд, J = 9,7, 5,9 Гц, 2Н), 5,21 - 4,70 (м, 4Н), 4,39 (т, J = 7,0 Гц, 2Н), 4,22 (дд, J = 8,7, 6,7 Гц, 2Н), 4,15 - 4,01 (м, 2Н), 3,94 (д, J = 15,3 Гц, 4Н), 3,86 - 3,72 (м, 8Н), 3,60 (т, J = 7,3 Гц, 8Н), 3,55 - 3,42 (м, 58Н), 3,37 (т, J = 5,9 Гц, 4Н), 3,15 (к, J = 5,8 Гц, 4Н), 2,76 - 2,56 (м, 4Н), 2,46 (т, J = 6,8 Гц, 2Н), 2,40 (т, J = 6,5 Гц, 2Н), 2,36 - 2,29 (м, 4Н), 1,96 (к, J = 6,7 Гц, 2Н), 1,78 (с, 4Н), 1,66 (д, J = 6,6 Гц, 6Н), 1,57 (д, J = 8,6 Гц, 2Н), 1,30 (д, J = 7,0 Гц, 6Н), 0,85 (дд, J = 15,2, 6,7 Гц, 12Н).
- 46 039276
Получение антител герцептин-Flexmab и NIP228-Flexmab.
Общая информация.
Клеточные линии SKBR-3 (HER2+, 1,5х106 рецепторов/клетка), MDA-MB-453 (HER2+, 7,7x104 рецепторов/клетка) и MCF-7 (HER2-) приобретали у АТСС и выдерживали в колбах для тканевых культур Т175 (Corning), используя рекомендованную производителем среду (SKBR-3: McCoys 5А + 10% FBS, MDA-MB-453: DMEM + 10% FBS и MCF-7: DMEM + 10% FBS). Клетки 293F (Invitrogen), использованные для трансфекции, выдерживали в среде Freestyle 293F (Invitrogen). Клетки SKBR-3, MDA-MB-453 и MCF-7 выращивали в инкубаторе при 37°С с 5% CO2. Клетки 293F выращивали в качалочных колбах (2 л, Corning) при 37°С с 8% СО2 и при скорости вращения 120 об/мин. Все реагенты приобретали у Sigma Aldrich, VWR или JT Baker, если не указано иное, и использовали без дополнительной очистки.
Разработка и сборка антител герцептин-Flexmab и NIP228-Flexmab.
Антитело дикого типа герцептин использовали в качестве матрицы для сборки герцептин-Flexmab. Легкая цепь герцептин-Flexmab состоит из двух мутаций, F118C и C214V, а тяжелая цепь содержит три мутации, L124C, C216V и C225V (см. фиг. 3 и 5 - на фиг. 5, С представляет собой сконструированные цистеины, V представляет собой мутации с цистеина на валин, и С представляет собой цистеин, использованный для конъюгации/изменения мостиковой связи). Мутация F118C в легкой цепи образует дисульфидную связь с мутацией L124C в тяжелой цепи. Такой сконструированный дисульфид не является гидрофильным, но служит для защиты ковалентной связи между легкой и тяжелой цепями. Шарнирный цистеин С222 оставлен без модификации и служит в качестве места сайт-специфической конъюгации с лекарственным линкером на основе pBD. Последовательности легкой цепи и тяжелой цепи для герцептин-Flexmab были кодон-оптимизированы для экспрессии у млекопитающих, и их приобретали у компании GeneArt (Life Technologies). Оптимизированный конструкт герцептин-Flexmab субклонировали стандартными технологиями молекулярной биологии, используя сайты BssHII/NheI (легкая цепь) и сайты SalI/NotI (тяжелая цепь), в запатентованный вектор экспрессии млекопитающих MedImmune, который содержит сигнальный пептид легкой цепи IgG для секреции и промоторы цитомегаловируса для рекомбинантной экспрессии. Завершенную плазмиду экспрессии млекопитающих, рОЕ-герцептин-Flexmab, подтверждали секвенированием ДНК. Отрицательный контроль, антитело NIP228-флексмаб, получали так, как описано для герцептин-Flexmab, используя антитело NIP228 дикого типа (собственность Medlmmune) в качестве матрицы.
Экспрессия и очистка антител герцептин-Flexmab и NIP228-Flexmab.
Экспрессию и очистку антител герцептин-Flexmab и NIP228-Flexmab проводили в соответствии с опубликованными ранее способами (Dimasi, N., et al., Journal of Molecular Biology, 2009, 393, 672-692; DOI: 10.1016/j.jmb.2009.08.032). После транзиентной экспрессии 293F и очистки белка А антитела смешивали с буфером для конъюгации (1X PBS, 0,1 мМ ЭДТК, рН 7,2), используя диализные кассеты SlideA-Lyzer при 4°С (НОММ 10 кДа, Thermo), и концентрировали до 8,0 мг/мл (герцептин-Flexmab) и 5,52 мг/мл (NIP228-Flexmab), используя концентраторы Vivaspin (НОММ 10 кДа, GE Healthcare). Конечные концентрации определяли на спектрофотометре Nanodrop (А280, Thermo). Через 6 дней выход транзиентной экспрессии составлял 500 мг/л и 150 мг/л для герцептин-Flexmab и NIP228-Flexmab соответственно.
Пример 7. Сборка ADC герцептин-Flexmab и NIP228-Flexmab.
Герцептин-Flexmab (15 мг, 100 нмоль) в буфере для конъюгации (1X PBS, 1 мМ ЭДТК, рН 7,2, 3 мл) восстанавливали с помощью ТСЕР (3 экв., 300 нмоль, Thermo) в течение 2 ч при комнатной температуре. После восстановления к восстановленному антителу добавляли ДМСО (10% об./об., 300 мкл), затем добавляли соединение 10 (3 экв., 300 нмоль). Реакцию конъюгации проводили при комнатной температуре в течение 3 ч. Избыток соединения 10 гасили N-ацетилцистеином (5 экв. относительно соединения 10, 1,5 мкмоль, Sigma Aldrich) и диализировали ADC против трех замен буфера для конъюгации при 4°С, используя диализную кассету Slide-A-Lyzer (HOMM 10 кДа, Thermo). ADC разбавляли 1:5 деионизированной Н2О и загружали на колонку из керамического гидроксиапатита II типа (Bio-Rad) при 5 мл/мин, используя жидкостный хроматограф быстрого разрешения АКТА Pure (GE Healthcare), промывали колонку 20 объемами колонки буфера СНТ А (10 мМ NaPO3, рН 7). Элюирование ADC проводили с использованием линейного градиента буфера СНТ В (0-2М NaCl в 10 mM NaPO3, рН 7) за 20 мин. Элюированный ADC диализировали в течение ночи при 4°С в буфер для конъюгации, используя диализную кассету Slide-A-Lyzer (HOMM 10 кДа), и разбавляли 1:5 буфером HIC А (25 мМ Tris-HCl, 1,5М (NH4)2SO4, рН 8). ADC загружали на колонку для полупрепаративной хроматографии гидрофобных взаимодействий (HIC) (HiTrap Butyl-S FF, GE Healthcare) при 1 мл/мин, используя жидкостный хроматограф быстрого разрешения АКТА Pure, и промывали 20 объемами колонки буфера HIC A. ADC элюировали, используя линейный градиент буфера HIC В (25 мМ Tris-HCl, 5% изопропилового спирта) за 45 мин при 1 мл/мин. Очищенный герцептин-Flexmab-10 диализировали в буфер для конъюгации в течение ночи при 4°С, концентрировали в концентраторе Vivaspin (HOMM 10 кДа) до 2 мг/мл и стерильно отфильтровывали через шприц-фильтр 0,2 мкм (Pall Corporation). Предложенный способ схематически изображен на фиг. 4. Выделенные V означают мутации валина.
Сайт-специфическую конъюгацию соединения 10 с NIP228-Flexmab и последующую очистку осуществляли так, как описано для герцептин-Flexmab-10.
- 47 039276
Пример 8. Аналитическая характеристика ADC.
ДСН-ПААК.
ДСН-ПААГ использовали для подтверждения молекулярной массы конструктов герцептинFlexmab, герцептин-Flexmab-10, NIP228-Flexmab и NIP228-Flexmab-10. Образцы (2 мкг, в исходном или конъюгированном виде) смешивали 1:4 с буфером для образца LDS Bolt (Invitrogen), 1:10c восстанавливающим буфером Nu-ПААГ (Invitrogen) и нагревали до 70°С в течение 10 мин, затем загружали на 10% гель Bis-tris (Invitrogen). Гели подвергали электрофорезу при 150 В и окрашивали окрашивающим реагентом простым синим (Invitrogen) и удаляли краситель деионизированной Н2О. Гели визуализировали с помощью системы визуализации Gel Doc EZ (Bio-RAD).
Восстановленный ДСН-ПААГ использовали для подтверждения молекулярной массы очищенных антител герцептин-Flexmab и NIP228-Flexmab и ADC. Результаты демонстрируют разделение легких цепей (LC) и тяжелых цепей (НС) герцептин-Flexmab с молекулярной массой ~25 кДа и 50 кДа соответственно. Конъюгирование полезной нагрузки соединения 10, содержащего два малеимида, с герцептинFlexmab приводило к весьма эффективному мостиковому связыванию тяжелых цепей с наличием полосы при 100 кДа. Такие же результаты наблюдали для NIP228-Flexmab, с четкой идентификацией легкой и тяжелой цепей в восстановительных условиях. Наблюдали весьма эффективное связывание через дисульфидные мостики тяжелых цепей NIP228-Flexmab с соединением 10. Агрегацию не наблюдали ни для антител, ни для ADC.
Хроматография гидрофобного взаимодействия.
Аналитическую хроматографию гидрофобного взаимодействия использовали для оценки эффективности конъюгации соединения 10 на антителах герцептин-Flexmab и NIP228-Flexmab и для оценки отношения лекарственного соединения к антителу (DAR) для каждого ADC. ADC (500 мкг в 50 мкл) по отдельности загружали на колонку Proteomix HIC Butyl-NP5 (внутренний диаметр 4,6 мм х 3,5 см х 5 мкм, Sepax), используя буфер HIC А (25 мМ Tris-HCl, 1,5М (NH4)2SO4, рН 8), и элюировали ADC с использованием линейного градиента буфера HIC В (25 мМ Tris-HCl, 5% изопропилового спирта, рН 7, 5100%) за 13 мин при 0,8 мл/мин. Абсорбцию измеряли при 280нм и 330нм и вручную интегрировали элиюрованные пики для определения эффективности конъюгации каждого ADC. Эффективность конъюгации и DAR рассчитывали по уравнению 1 и уравнению 2 соответственно.
Уравнение 1: эффективность конъюгации
Пло Щйдъкт ъ юеировалл ый (П-^ощадънеконъюг11роеаннъ1й + Плоищдьконъюги^
X 100
Уравнение 2\ DAR = Площадъ^Л^ + 2(Площадь£)АК2) + н(Площадьр)^ (Площадь^^о + Площадь^^ + 17лоща0ьщрл + ПлощаОъг^ п)
ADC ПлощадьПАК0 ПлощадьПАК1 ПлощадьПАК2 Эфф. т т конъюг. DAR
Герцептин-Р1ехшаЬЗ10 138,4 1285,9 н/д 90,3 0,90
NIP228-Flexmab3-10 118,1 1191,4 н/д 90,1 0,90
Эксклюзионная хроматография.
Эксклюзионную хроматографию ВЭЖХ (ЭХ-ВЭЖХ) проводили на исходных антителах и ADC для анализа чистоты и агрегации с помощью ВЭЖХ серии Agilent 1200. Образцы (100 мкг в 100 мкл буферадля конъюгации) вводили в колонку TSK Gel (G3000SW, внутренний диаметр 8 мм х 30 см х 5 мкм, Tosoh Bioscience), используя 0,1М NaPO4, 0,1М NaSO4, 10% изопропанола, рН 6,8 в качестве подвижной фазы при скорости потока 1 мл/мин. Абсорбцию элюированных пиков измеряли при 280нм с последующим интегрированием вручную для определения чистоты и процентной агрегации каждого образца.
После очистки белка А каждое антитело обеспечивало получение высокого содержание мономера, превышающее 98%, и указанные характеристики сохранялись после конъюгации полезной нагрузки соединения 10 с образованием ADC с DAR = 1. Герцептин-Flexmab и герцептин-Flexmab-W элюировали при времени удерживания (TR) 8,65 мин, 8,66 мин и 9,01 мин соответственно. NIP228-Flexmab и NIP228Flexmab-10 элюировали при TR=8,52 мин и 8,54 мин соответственно.
Обращенно-фазовая ВЭЖХ восстановленных соединений.
Для подтверждения сайт-специфической конъюгации соединения 10 на тяжелой цепи антител использовали обращенно-фазовую ВЭЖХ (вОФ-ВЭЖХ) восстановленных соединений. ADC обрабатывали дитиотреитолом (DTT, 50 мМ) в течение 30 мин при комнатной температуре. После восстановления ADC вводили в колонку PLRP-S (1000 А, 2,1 мм х 50 мм, Agilent) и элюировали градиентной подвижной фазой растворителя А для ОФ-ВЭЖХ (0,1% трифторуксусной кислоты в воде) и растворителя В для ОФ
- 48 039276
ВЭЖХ (0,1% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле), от 5% растворителя В до 100% растворителя В за 25 мин. Градиентное элюирование проводили при 80°С при скорости потока 1 мл/мин. Абсорбцию измеряли при 280нм.
Хроматограммы герцептин-Flexmab и ADC герцептин-Flexmab-10 накладывали друг на друга. Легкие цепи обоих соединений элюировались вместе (герцептин-Flexmab-10 TR= 17,57 мин; герцептинFlexmab TR = 17,54 мин), однако наблюдали заметное изменение времени удерживания для тяжелой цепи герцептин-Flexmab-10 (TR= 21,31 мин) по сравнению с неконъюгированным антителом герцептинFlexmab (TR= 19,75 мин). Небольшое количество неконъюгированной тяжелой цепи также наблюдали на хроматограмме герцептин-Flexmab-10 (TR = 19,97 мин).
Хроматограммы для отрицательных контрольных образцов NIP228-Flexmab и NIP228-Flexmab-10 также накладывали друг на друга для проведения сравнительного анализа. Тяжелая цепь ADC NIP228Flexmab-10 демонстрировала изменение времени удерживания (TR = 21,57 мин) по сравнению с тяжелой цепью NIP228-Flexmab (TR = 20,09 мин). Наблюдали небольшое количество неконъюгированной тяжелой цепи для NIP228-Flexmab-10 (TR= 20,35 мин).
Масс-спектрометрия.
Использовали обращенно-фазовую жидкостную хроматомасс-спектрометрию (ЖХМС) интактных и восстановленных соединений для подтверждения молекулярных масс антител герцептин-Flexmab и NIP228-Flexmab и ADC. Приблизительно 2 мкг (4 мкл) антитела или ADC вводили в колонку ВЭЖХ серии Agilent 1200, последовательно соединенную с времяпролетной (ВП) ЖХ-МС для точного измерения масс Agilent 6520. Антитело или ADC загружали на колонку быстрого разрешения Zorbax 300 Diphenyl HD (2,1 мм χ 50 мм х 1,8 мкм) и элюировали при скорости потока 0,5 мл/мин ступенчатым градиентом 180% растворителя В (0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле) через 2 мин (растворителя А: 0,1% муравьиной кислоты в воде). Данные записывали и анализировали с помощью программного обеспечения MassHunter (Agilent).
Очищенный герцептин-Flexmab демонстрировал пик при 147985,36 Да (G0f расч.: 147980,8 Да). После конъюгирования с полезной нагрузкой, соединением 10 (ММ: 2408,67 Да), ЖХМС демонстрировала молекулярную массу герцептин-Flexmab3-10, равную 150396,71 Да (G0f расч.: 150394,03 Да). Анализ NIP228-Flexmab с помощью ЖХМС выявил пик при 146770,36 Да (G0f расч.: 146743,98 Да). После конъюгирования с полезной нагрузкой, соединением 10, наблюдали пик с ММ 149199,75 Да (G0f расч.: 149152,65 Да).
Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК).
Антитела и ADC подвергали тщательному диализу в 25 мМ гистидине с рН 6 при 4°С и получали в концентрации 0,5 мг/мл. Эксперименты ДСК проводили на приборе MicroCal VP-DSC (Malvern). Исходные данные нормировали по концентрации и скорости сканирования (1°С/мин). Анализ данных и деконволюцию проводили с помощью программного обеспечения Origin 7 (Malvern). Деконволюционный анализ проводили с помощью недвухуровневой модели, и наилучшие совпадения получали, используя 10-15 циклов итерации. Для каждого конструкта определяли температуру денатурации, Tm, соответствующую максимуму переходных пиков.
Результаты экспериментов ДСК показали температуру перехода Tm для доменов СН2 и Fab герцептина (СН2 Tm1 = 68,95°С, Fab Tm2 = 81,43°С) и NIP228 (СН2 Tm1 = 69,09°С, Fab Tm2 = 74,22°С) антител дикого типа (Wakankar, A.A., et al., Bioconjugate Chemistry, 2010, 21, 1588-1595; DOI: 10.1021/bc900434c). Антитело NIP228 демонстрировало третью температуру перехода Tm для домена СН3 при 81,92°С. Внедрение технологии Flexmab в указанные антитела обусловливало изменение указанных трех температур перехода Tm, при этом домен Fab имел более низкую температуру перехода Tm по сравнению с доменом СН2 (герцептин-Flexmab Fab Tm1 = 68,21°С, СН2 Tm1 = 81,05°С; NIP228-Flexmab Fab Tm1 = 66,58°C, CH2 Tm3 = 81,85°C). Как можно видеть для антитела NIP228 дикого типа, авторы изобретения наблюдали третью температуру перехода Tm у NIP228-Flexmab для домена СН3 (Tm2 = 76,28°С). Как и ожидалось, после конъюгации соединения 10 с антителами герцептин-Flexmab и NIP228-Flexmab, наблюдали самые минимальные изменения температур перехода Tm. (Герцептин-Flexmab-10 Fab Tm1 = 67,83°С, СН2 Tm1 = 81,11°С; NIP228-Flexmab-10 Fab Tm1 = 66,11°C, CH2 Tm3 = 82,19°C). Третья температура перехода Tm для домена СН3 NIP228-Flexmab-10 (Tm2 = 78,78°С) минимально изменилась по сравнению с NIP228Flexmab.
Пример 9. In vitro характеристика антител герцептин-Flexmab и NIP228-Flexmab и ADC.
Связывание клеток с использованием проточной цитометрии.
Связывающую аффинность и специфичность ADC герцептин-Flexmab и NIP228-Flexmab подтверждали проточной цитометрией. В день исследования клетки SKBR-3 (HER2+) и MCF-7 (HER2-) отделяли от колбы с помощью трипсина TrypLE (Life Technologies) и повторно суспендировали в соответствующей среде для выращивания. Клетки подсчитывали на цитометре ViCell (Beckman Coulter) и доводили до концентрации 1х106 клеток/мл. Клетки в двух экземплярах переносили в лунки (5х104 клеток/лунка) 96луночного планшета (Falcon) и центрифугировали при 1200 об/мин при 4°С. Гранулы клеток повторно суспендировали в 180 мкл буфера для проточной цитометрии (PBS рН 7,2, 2% FBS, на льду) и по отдель
- 49 039276 ности добавляли к клеткам антитело или ADC (20 мкл серийного разбавления: 200 мкг/мл - 0,01 мкг/мл; конечная концентрация 20 мкг/мл - 0,001 мкг/мл). Антитела и клетки инкубировали при 4°С в течение 1 ч, после чего их промывали буфером для проточной цитометрии и гранулировали центрифугированием (2х, 1200 об/мин). После последнего поворота гранулированные клетки повторно суспендировали во вторичном античеловеческом антителе, конъюгированном с AlexaFluor 647 (150 мкл, 8 мкг/мл, в PBS рН 7,2, 2% FBS), и инкубировали при 4 °С в течение 1 ч. Клетки промывали буфером для проточной цитометрии и центрифугировали (2х, 1200 об/мин), затем повторно суспендировали в 135 мкл буфера для проточной цитометрии. В каждую клеточную суспензию добавляли DAPI (15 мкл из 10Х маточного раствора, конечная концентрация 1 мкМ, Sigma Aldrich), действующий как краситель для живых/погибших клеток. Данные флуоресценции клеток записывали на проточном цитометре LSRII (Beckton Dickson) и анализировали данные с помощью программного обеспечения Flow Jo Analysis (версии 9, FlowJo, LLC). Кривые связывания строили с помощью GraphPad Prism (версии 6, GraphPad Software, Inc.).
ADC герцептин-Flexmab-10 демонстрировал высокую аффинность (ЕС50 = 0,24 мкг/мл) и селективность в отношении клеточной линии SKBR-3 при отсутствии связывания с клеточной линией MCF-7.
Испытания стабильности сыворотки.
Сыворотку мышей (Jackson Immunoresearch Labs) фильтровали через шприц-фильтр 0,2 мкм (Pall Corporation) в стерильные полипропиленовые пробирки и хранили на льду. К мышиной сыворотке добавляли ADC (200 мкг) до конечной концентрации 200 мкг/мл и инкубировали образцы при 37°С. В качестве отрицательного контроля использовали PBS. Из каждого образца брали аликвоты по 200 мкл через время Т = 0, 24, 72 и 148 ч инкубации. Образец, взятый в момент Т = 0, помещали на сухой лед в первые минуты после добавления ADC к сыворотке. Образцы хранили при -80°С до проведения аффинного захвата и анализа ЖХМС. Для аффинного захвата ADC из мышиной сыворотки использовали агарозу античеловеческого IgG (Fc-специфического) (Sigma Aldrich). Для каждого момента времени смешивали 50 мкл гранул агарозы античеловеческого Fc с 300 мкл PBS и 100 мкл образца сыворотки в течение 30 мин при комнатной температуре при непрерывном вращении. Гранулы три раза промывали 1xPBS для удаления несвязанных белков сыворотки и элюировании ADC, используя 100 мкл буфера для элюирования IgG (Thermo Scientific), и нейтрализовали, используя 20 мкл 1М Tris с рН 8. Отдельные образцы (20 мкл) анализировали с помощью ЖХМС, как описано выше, и анализировали исходные данные с помощью программного обеспечения Masshunter.
Через семь дней инкубации ЖХМС показала, что утрачено менее 1% полезной нагрузки соединения 10 из герцептин-Flexmab-10. Такая высокая стабильность in vitro позволяет предположить, что может быть снижена нецелевая токсичность in vivo.
Анализы цитотоксичности.
Клетки SKBR-3, MDA-MD-453 и MCF-7 хранили так, как описано выше. За день до обработки клетки отделяли от колбы с помощью трипсина TrypLE и повторно суспендировали в среде для выращивания. Клетки подсчитывали на цитометре ViCell и доводили до концентрации 1,0х105 клеток/мл в соответствующей среде для выращивания. Клеточные суспензии (100 мкл, 1,0х104 клеток/лунка) переносили в лунки 96-луночного планшета с белыми стенками и прозрачным дном (Corning). Клетки оставляли прикрепляться на ночь в инкубаторе при 37°С с 5% СО2. В день обработки получали серийные разбавления ADC в диапазоне 30 мкг/мл - 1,5 нг/мл и добавляли в лунки 50 мкл каждого разбавления в трех экземплярах (конечные концентрации ADC 10 мкг/мл - 0,5 нг/мл, общий объем в каждой лунке 150 мкл). В каждый планшет также включали соответствующие лунки без обработки, которые использовали в качестве контроля. На 5 день планшеты извлекали из инкубатора и оставляли уравновешиваться до комнатной температуры. Планшеты центрифугировали (1300 об/мин, 5 мин) и аспирировали надосадочный раствор. В каждую лунку добавляли среду (SKBR-3: McCoy 5A, MDA-MB-453 и MCF-7: DMEM) без фенолового красного или FBS (50 мкл), затем добавляли реагент CellTiter-Glo® (50 мкл). Планшеты встряхивали в течение 1 ч в темноте при комнатной температуре и измеряли люминесценцию на планшет-ридере Envision™ (PerkinElmer). Процент жизнеспособности рассчитывали следующим образом: (неизвестное/ср. контроль)х100. Экспериментальные данные наносили на график с помощью GraphPad Prism для построения кривых IC50.
Через 3 дня инкубации в клетках MDA-MB-453 (низкая экспрессия HER2; 7,7х104 рецепторов HER2 на лунку), герцептин-Flexmab-10 демонстрировал IC50 = 1,08 нМ с жизнеспособностью клеток ~90%. Через 5 дней герцептин-Flexmab-10 демонстрировал IC50 = 0,0375 нМ с жизнеспособностью клеток ~35%.
Через 3 дня инкубации в клетках SKBR-3 (высокая экспрессия HER2; 1,5х106 рецепторов HER2 на лунку), герцептин-Flexmab-10 демонстрировал IC50 = 0,229 нМ с жизнеспособностью клеток ~30%. Через 5 дней герцептин-Flexmab-10 демонстрировал IC50 = 0,03 5 5 нМ с жизнеспособностью клеток ~5%.
Пример 10. In vivo характеристика антител герцептин-Flexmab и NIP228-Flexmab и ADC.
Все исследования, включающие использование животных, проводили гуманным образом по протоколу, одобренному институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию MedImmune в учреждении, аккредитованном компанией AAALAC International.
- 50 039276
Ксенотрансплантаты.
Клетки NCI-N87 (5χ106) в 50% матригеле подкожно инокулировали 4-6-недельным самкам бестимусных голых мышей (Harlan). По достижении объема опухолей 200 мм3 мышей случайным образом разделяли на группы, по 5 мышей в группе. ADC вводили IV в указанных дозах, причем введение осуществляли на 5 день после инокуляции клеток. Объем опухолей измеряли два раза в неделю с помощью штангенциркуля. Объем опухолей рассчитывали по формуле 1/2 χ L χ W2 (L = длина; W = ширина). Измеряли массу тела для оценки переносимости лечения. Кривые роста опухоли и массы тела строили с помощью программного обеспечения Prism5 (GraphPad, Ла-Холья, штат Калифорния). Объем опухоли выражали как среднее значение ±СОС.
На фиг. 1 показано влияние однократной дозы 1,0 мг/кг (♦) по сравнению с отсутствием лечения (·) указанная доза вызывала регрессию опухоли после стаза опухоли в течение 55 дней.
На фиг. 2 показано влияние однократной дозы 0,3 мг/кг (*) по сравнению с отсутствием лечения (·) указанная доза вызывала регрессию опухоли после стаза опухоли в течение 55 дней.
Токсичность.
Самцам крыс Спрага-Доули (в возрасте 8-12 недель, 5 на группу) вводили однократную IV инъекцию (1 день) 0,75, 1,5, 3 или 4 мг/кг герцептин-Flexmab-10 и проводили оценку крыс в течение 21 дня. Животных сателлитной токсикокинетической (TK) группы (по 3 на группу) включали в каждую группу лечения для измерения концентрации в плазме суммарного антитела и ADC. Контрольным крысам (5 на группу) вводили однократную IV инъекцию контрольного носителя на 1 день. Всех животных, участвующих в основном исследовании, оценивали по клиническим признакам, изменениям массы тела, клинической патологии, макропатологии с массой органов и микроскопическим наблюдениям. Всех животных сателлитной TK группы оценивали по клиническим признакам, изменениям массы тела и фармакокинетическим анализам. Образцы для анализов гематологии и химического состава сыворотки собирали и анализировали на 8 и 15 день. Дополнительные образцы для анализа коагуляции собирали и анализировали только на 22 день. Образцы крови для фармакокинетического анализа собирали в пробирки с К2ЭДТА до введения доз в несколько моментов времени на 1, 8, 15 и 22 день. Макроскопическое вскрытие проводили на всех животных, участвовавших в главном исследовании, и органы стандартного списка, включая головной мозг, легкие, печень, почки, селезенку, тимус, яички, сердце и кости, заливали в парафин, получали срезы, окрашивали гематоксилином и эозином и изучали под микроскопом с привлечением патологоанатома-ветеринара.
Хорошо переносимыми были дозы герцептин-Flexmab-10 до 4 мг/кг.
Терапевтический индекс.
Терапевтический индекс можно рассчитать делением максимальной переносимой однократной дозы (MTD) ADC ненаправленного действия у крыс на минимальную эффективную однократную дозу (MED) ADC направленного действия. MED представляет собой однократную дозу, необходимую для достижения стаза опухоли в in vivo модели через 28 дней (для ксенотрансплантата NCI-N87). Таким образом, рассчитанный терапевтический индекс для герцептин-Flexmab-10 составляет по меньшей мере 13,3.
Пример 11.
Герцептин и антитела R347, сконструированные так, что они содержат цистеин, внедренный между положениями 239 и 240, получали способами, описанными в публикации Dimasi, N., et al., Molecular Pharmaceutics, 2017, 14, 1501-1516 (DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.6b00995).
HerC239i-10 ADC.
DTT (100 мол.экв./антитело, 26,7 мкмоль) добавляли к раствору антитела герцептин-C239i (40 мг, 266,7 нмоль) в PBS, 1 мМ ЭДТК, рН 7,4, и доводили конечный объем до 8 мл. Восстановление проводили при комнатной температуре в течение 4 ч при осторожном встряхивании, затем удаляли DTT центробежным фильтрованием, используя центробежный фильтр Amicon Ultracell с НОММ 30 кДа. Добавляли (L)-дегидроаскорбиновую кислоту (DHAA, 20 мол.экв./антитело, 5,3 мкмоль, 106,7 мкл при 50 мМ в ДМСО) к восстановленному антителу (5 мг/мл, 8 мл) в PBS, 1 мМ ЭДТК, рН 7,4 и проводили повторное окисление при комнатной температуре в течение ночи при осторожном встряхивании. DHAA удаляли фильтрованием через мембранный фильтр 0,22 мкм и добавляли соединение 10 в виде раствора в ДМСО (3 мол.экв./антитело, 0,8 мкмоль, в 0,9 мл ДМСО) к 8,1 мл повторно окисленного антитела (40 мг, 266,7 нмоль) в PBS, 1 мМ ЭДТК, рН 7,4, до конечной концентрации ДМСО 10% (об./об.). Раствор оставляли для протекания реакции при комнатной температуре на 4 ч при осторожном встряхивании. Конъюгацию прекращали добавлением N-ацетилцистеина (4 мкмоль, 40 мкл при 100 мМ) и очищали хроматографией гидрофобного взаимодействия, используя колонку для жидкостной хроматографии быстрого разрешения и колонку HP-Butyl (5 мл) с градиентным элюированием 1М (NH4)2SO4, 25 мМ калий-фосфатного буфера с рН 6,0, и 25 мМ калий-фосфатного буфера с рН 6,0. Фракции, содержащие более 95% DAR1, объединяли, концентрировали, меняли буфер на PBS с рН 7,4 с помощью центробежного фильтрования с использованием 15 мл центробежного фильтра Amicon Ultracell с НОММ 50 кДа, стерильно отфильтровывали и анализировали.
- 51 039276
Анализ СВЭЖХ на системе Shimadzu Prominence с использованием непористой колонки Proteomix HIC Butyl-NP5, 5 мкм, 4,6 х 35 мм (Sepax), при элюировании градиентом 1,5М сульфата аммония, 25 мМ ацетата натрия с рН 7,4 и 25 мМ ацетата натрия с рН 7,4 с 20% ацетонитрила (об./об.) на неразбавленном образце ADC HerC239i-10 при 214 нм выявил лишь однократно конъюгированное соединение 10, что согласуется с отношением лекарственного соединения к антителу (DAR) 1,00 молекулы соединения 10 на антитело.
Анализ СВЭЖХ на системе Shimadzu Prominence с использованием колонки Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4 мкм, 4,6 х 150 мм (с предколонкой 4 мкм, 3,0 х 20 мм), при элюировании со скоростью 0,3 мл/мин, стерильно отфильтрованным буфером SEC, содержащим 200 мМ фосфата калия с рН 6,95, 250 мМ хлорида калия и 10% изопропанола (об./об.) на неразбавленном образце ADC HerC239i10 при 280 нм выявил чистоту мономера 99%. ЭХ-СВЭЖХ анализ выявил концентрацию конечного ADC HerC239i-10, равную 1,71 мг/мл в 11,1 мл, и массу полученного ADC HerC239i-10 18,9 мг (выход 47%).
R347C239i-10 ADC.
DTT (100 мол.экв./антитело, 133,3 мкмоль) добавляли к раствору антитела R347-Maia (200 мг, 1,33 мкмоль) в PBS, 1 мМ ЭДТК, рН 7,4, и доводили конечный объем до 40 мл. Восстановление проводили при комнатной температуре в течение 4 ч при осторожном встряхивании, затем удаляли DTT тангенциальной поточной фильтрацией (волоконный фильтр 30 кДа). Добавляли Щ)-дегидроаскорбиновую кислоту (DHAA, 20 мол.экв./антитело, 26,7 мкмоль, 533,3 мкл при 50 мМ в ДМСО) к восстановленному антителу (4 мг/мл, 50 мл) в PBS, 1 мМ ЭДТК, рН 7,4, и проводили повторное окисление при комнатной температуре в течение ночи при осторожном встряхивании. DHAA удаляли фильтрованием через мембранный фильтр 0,22 мкм и добавляли соединение 10 в виде раствора в ДМСО (2 мол.экв./антитело, 2,67 мкмоль, в 5,6 мл ДМСО) к 50,5 мл повторно окисленного антитела (200 мг, 1,33 мкмоль) в PBS, 1 мМ ЭДТК, рН 7,4, до конечной концентрации ДМСО 10% (об./об.). Раствор оставляли для протекания реакции при комнатной температуре на 4 ч при осторожном встряхивании. Конъюгацию прекращали добавлением N-ацетилцистеина (6,7 мкмоль, 66,7 мкл при 100 мМ) и очищали хроматографией гидрофобного взаимодействия, используя колонку для жидкостной хроматографии быстрого разрешения и колонку HPButyl (5 мл) с градиентым элюированием 1М (NH4)2SO4, 25 мМ калий-фосфатного буфера с рН 6,0, и 25 мМ калий-фосфатного буфера с рН 6,0. Фракции, содержащие более 95% DAR1, объединяли, концентрировали, меняли буфер на 25 мМ гистидина, 200 мМ сахарозы с рН 6,0 с помощью центробежного фильтрования с использованием 15 мл центробежного фильтра Amicon Ultracell с НОММ 50 кДа, стерильно отфильтровывали и анализировали.
Анализ СВЭЖХ на системе Shimadzu Prominence с использованием непористой колонки Proteomix HIC Butyl-NP5, 5 мкм, 4,6 х 35 мм (Sepax), при элюировании градиентом 1,5М сульфата аммония, 25 мМ ацетата натрия с рН 7,4 и 25 мМ ацетата натрия с рН 7,4 с 20% ацетонитрила (об./об.) на неразбавленном образце ADC R347C239i-10 при 214 нм выявил лишь однократно конъюгированное соединение 10, что согласуется с отношением лекарственного соединения к антителу (DAR) 1,00 молекулы соединения 10 на антитело.
Анализ СВЭЖХ на системе Shimadzu Prominence с использованием колонки Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4 мкм, 4,6 х 150 мм (с предколонкой 4 мкм, 3,0 х 20 мм), при элюировании со скоростью 0,3 мл/мин, стерильно отфильтрованным буфером SEC, содержащим 200 мМ фосфата калия с рН 6,95, 250 мМ хлорида калия и 10% изопропанола (об./об.) на неразбавленном образце ADC R347C239i-10 при 280 нм выявил чистоту мономера 99%. ЭХ-СВЭЖХ анализ выявил концентрацию конечного ADC R347C239i-10, равную 1,72 мг/мл в 55 мл, и массу полученного ADC R347C239i-10 94,5 мг (выход 47%).
1C1C239J-10 ADC.
DTT (100 мол.экв./антитело, 3,3 мкмоль) добавляли к раствору антитела 1C1-Maia (5 мг, 33,3 нмоль) в PBS, 1 мМ ЭДТК, рН 7,4, и доводили конечный объем до 2,5 мл. Восстановление проводили при комнатной температуре в течение 5 ч при осторожном встряхивании, затем удаляли DTT центробежным фильтрованием, используя центробежный фильтр Amicon Ultracell с НОММ 30 кДа. Добавляли (L)дегидроаскорбиновую кислоту (DHAA, 20 мол.экв./антитело, 0,67 мкмоль, 13,3 мкл при 50 мМ в ДМСО) к восстановленному антителу (2 мг/мл, 2,5 мл) в PBS, 1 мМ ЭДТК, рН 7,4, и проводили повторное окисление при комнатной температуре в течение ночи при осторожном встряхивании. DHAA удаляли фильтрованием через мембранный фильтр 0,22 мкм и добавляли соединение 10 в виде раствора в ДМСО (3 мол.экв./антитело, 0,1 мкмоль, в 0,27 мл ДМСО) к 2,5 мл повторно окисленного антитела (5 мг, 33,3 нмоль) в PBS, 1 мМ ЭДТК, рН 7,4, до конечной концентрации ДМСО 10% (об./об.). Раствор оставляли для протекания реакции при комнатной температуре на 5 ч при осторожном встряхивании. Конъюгацию прекращали добавлением N-ацетилцистеина (2 мкмоль, 39,6 мкл при 100 мМ) и очищали препаративной эксклюзионной хроматографией, используя колонку для жидкостной хроматографии быстрого разрешения и колонку Superdex 200 26/600 с PBS при рН 7,4 в качестве элюирующего буфера. Фракции, содержащие более 95% мономеров, объединяли, концентрировали, меняли буфер на 25 мМ гистидина, 200 мМ сахарозы с рН 6,0 с помощью центробежного фильтрования с использованием 15 мл центробежного
- 52 039276 фильтра Amicon Ultracell с НОММ 50 кДа, стерильно отфильтровывали и анализировали.
Анализ СВЭЖХ на системе Shimadzu Prominence с использованием непористой колонки Proteomix HIC Butyl-NP5, 5 мкм, 4,6 х 35 мм (Sepax), при элюировании градиентом 1,5 М сульфата аммония, 25 мМ ацетата натрия с рН 7,4 и 25 мМ ацетата натрия с рН 7,4 с 20% ацетонитрила (об./об.) на неразбавленном образце ADC 1C1C239i-10 при 214 нм выявил неконъюгированное антитело и смесь однократно конъюгированного и двукратно конъюгированного соединения 10, что согласуется с отношением лекарственного соединения к антителу (DAR) 1,04 молекулы соединения 10 на антитело.
Анализ СВЭЖХ на системе Shimadzu Prominence с использованием колонки Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4 мкм, 4,6 х 150 мм (с предколонкой 4 мкм, 3,0 х 20 мм), при элюировании со скоростью 0,3 мл/мин, стерильно отфильтрованным буфером SEC, содержащим 200 мМ фосфата калия с рН 6,95, 250 мМ хлорида калия и 10% изопропанола (об./об.) на неразбавленном образце ADC 1C1C239i10 при 280 нм выявил чистоту мономера 100%. ЭХ-СВЭЖХ анализ выявил концентрацию конечного ADC 1C1C239i-10, равную 1,45 мг/мл в 2,3 мл, и массу полученного ADC 1C1C239i-10 3,34 мг (выход 67%).
HerC239i-11ADC.
DTT (100 мол.экв./антитело, 3,3 мкмоль) добавляли к раствору антитела герцептин-Maia (5 мг, 33,3 нмоль) в PBS, 1 мМ ЭДТК, рН 7,4, и доводили конечный объем до 2,5 мл. Восстановление проводили при комнатной температуре в течение 5 ч при осторожном встряхивании, затем удаляли DTT центробежным фильтрованием, используя центробежный фильтр Amicon Ultracell с НОММ 30 кДа. Добавляли (L)-дегидроаскорбиновую кислоту (DHAA, 20 мол.экв./антитело, 0,67 мкмоль, 13,3 мкл при 50 мМ в ДМСО) к восстановленному антителу (2 мг/мл, 2,5 мл) в PBS, 1 мМ ЭДТК, рН 7,4 и проводили повторное окисление при комнатной температуре в течение ночи при осторожном встряхивании. DHAA удаляли фильтрованием через мембранный фильтр 0,22 мкм и добавляли соединение 11 в виде раствора в ДМСО (1,5 мол.экв./антитело, 0,05 мкмоль, в 0,27 мл ДМСО) к 2,5 мл повторно окисленного антитела (5 мг, 33,3 нмоль) в PBS, 1 мМ ЭДТК, рН 7,4, до конечной концентрации ДМСО 10% (об./об.). Раствор оставляли для протекания реакции при комнатной температуре на ночь при осторожном встряхивании. Конъюгацию прекращали добавлением N-ацетилцистеина (2 мкмоль, 39,6 мкл при 100 мМ) и очищали препаративной эксклюзионной хроматографией, используя колонку для жидкостной хроматографии быстрого разрешения и колонку Superdex 200 26/600 с PBS при рН 7,4 в качестве элюирующего буфера. Фракции, содержащие более 95% мономеров, объединяли, концентрировали, меняли буфер на 25 мМ гистидина, 200 мМ сахарозы с рН 6,0 с помощью центробежного фильтрования с использованием 15 мл центробежного фильтра Amicon Ultracell с НОММ 50 кДа, стерильно отфильтровывали и анализировали.
Анализ СВЭЖХ на системе Shimadzu Prominence с использованием непористой колонки Proteomix HIC Butyl-NP5, 5 мкм, 4,6 х 35 мм (Sepax), при элюировании градиентом 1,5 М сульфата аммония, 25 мМ ацетата натрия с рН 7,4 и 25 мМ ацетата натрия с рН 7,4 с 20% ацетонитрила (об./об.) на неразбавленном образце ADC HerC239i-11 при 214 нм выявил неконъюгированное антитело и смесь однократно конъюгированного и двукратно конъюгированного соединения 11, что согласуется с отношением лекарственного соединения к антителу (DAR) 1,10 молекулы соединения 11 на антитело.
Анализ СВЭЖХ на системе Shimadzu Prominence с использованием колонки Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4 мкм, 4,6 х 150 мм (с предколонкой 4 мкм, 3,0 х 20 мм), при элюировании со скоростью 0,3 мл/мин, стерильно отфильтрованным буфером SEC, содержащим 200 мМ фосфата калия с рН 6,95, 250 мМ хлорида калия и 10% изопропанола (об./об.) на образце ADC HerC239i-l1 при 280 нм выявил чистоту мономера 99%. ЭХ-СВЭЖХ анализ выявил концентрацию конечного ADC HerC239i-11, равную 1,29 мг/мл в 4,0 мл, и массу полученного ADC HerC239i-11 3,23 (выход 65%).
1C1C239i-11ADC.
DTT (100 мол.экв./антитело, 3,3 мкмоль) добавляли к раствору антитела 1C1-Maia (5 мг, 33,3 нмоль) в PBS, 1 мМ ЭДТК, рН 7,4, и доводили конечный объем до 2,5 мл. Восстановление проводили при комнатной температуре в течение 5 ч при осторожном встряхивании, затем удаляли DTT центробежным фильтрованием, используя центробежный фильтр Amicon Ultracell с НОММ 30 кДа. Добавляли (L)дегидроаскорбиновую кислоту (DHAA, 20 мол.экв./антитело, 0,67 мкмоль, 13,3 мкл при 50 мМ в ДМСО) к восстановленному антителу (2 мг/мл, 2,5 мл) в PBS, 1 мМ ЭДТК, рН 7,4 и проводили повторное окисление при комнатной температуре в течение ночи при осторожном встряхивании. DHAA удаляли фильтрованием через мембранный фильтр 0,22 мкм и добавляли соединение 11 в виде раствора в ДМСО (1,5 мол.экв./антитело, 0,05 мкмоль, в 0,27 мл ДМСО) к 2,5 мл повторно окисленного антитела (5 мг, 33,3 нмоль) в PBS, 1 мМ ЭДТК, рН 7,4, до конечной концентрации ДМСО 10% (об./об.). Раствор оставляли для протекания реакции при комнатной температуре на ночь при осторожном встряхивании. Конъюгацию прекращали добавлением N-ацетилцистеина (2 мкмоль, 39,6 мкл при 100 мМ) и очищали препаративной эксклюзионной хроматографией, используя колонку для жидкостной хроматографии быстрого разрешения и колонку Superdex 200 26/600 с PBS при рН 7,4 в качестве элюирующего буфера. Фракции, содержащие более 95% мономеров, объединяли, концентрировали, меняли буфер на 25 мМ гистидина, 200 мМ сахарозы с рН 6,0 с помощью центробежного фильтрования с использованием 15 мл центробеж
- 53 039276 ного фильтра Amicon Ultracell с НОММ 50 кДа, стерильно отфильтровывали и анализировали.
Анализ СВЭЖХ на системе Shimadzu Prominence с использованием непористой колонки Proteomix HIC Butyl-NP5, 5 мкм, 4,6 х 35 мм (Sepax), при элюировании градиентом 1,5 М сульфата аммония, 25 мМ ацетата натрия с рН 7,4 и 25 мМ ацетата натрия с рН 7,4 с 20% ацетонитрила (об./об.) на неразбавленном образце ADC 1С1С2391-11 при 214 нм выявил неконъюгированное антитело и смесь однократно конъюгированного и двукратно конъюгированного соединения 11, что согласуется с отношением лекарственного соединения к антителу (DAR) 1,05 молекулы соединения 11 на антитело.
Анализ СВЭЖХ на системе Shimadzu Prominence с использованием колонки Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4 мкм, 4,6 х 150 мм (с предколонкой 4 мкм, 3,0 х 20 мм), при элюировании со скоростью 0,3 мл/мин, стерильно отфильтрованным буфером SEC, содержащим 200 мМ фосфата калия с рН 6,95, 250 мМ хлорида калия и 10% изопропанола (об./об.) на образце ADC 1C1C239i-11 при 280 нм выявил чистоту мономера 99%. ЭХ-СВЭЖХ анализ выявил концентрацию конечного ADC 1C1C239i-11, равную 1,50 мг/мл в 2,2 мл, и массу полученного ADC 1C1C239i-11 3,3 мг (выход 66%).
Проводили дополнительные реакции конъюгации следующих антител с соединением 10: RSVC239i; В7Н4-Е02- C239i; PSMA- C239i и CDH6-50B- C239L.
Пример 12. In vitro анализ РС3 1C1.
Среду из субконфлюэнтной (конфлюэнтность 80-90%) клеток РС3 в колбе Т75 аспирировали и промывали колбу PBS (около 20 мл) и опустошали. Добавляли трипсин-ЭДТК (5 мл), колбу возвращали в насыщенный газом инкубатор при 37°С примерно на 5 мин, затем резко постукивали для отделения осадка и открепления клеток от пластика. Клеточную суспензию переносили в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл с винтовой крышкой, разбавляли средой для выращивания до конечного объема 15 мл, затем центрифугировали (400g в течение 5 мин). Надосадочный раствор аспирировали и повторно суспендировали осадок в 10 мл культуральной среды. Может потребоваться повторный отбор пипеткой для получения монодисперсной клеточной суспензии. Концентрацию и жизнеспособность клеток измеряли по клеткам, окрашенным трипановым синим, с помощью LUNA-II. Клетки разбавляли до 1500 клеток/лунка, распределяли (50 мкл/лунка) в 96-луночные плоскодонные планшеты и инкубировали в течение ночи перед использованием.
Исходный раствор (1 мл) конъюгата антитело-лекарственное соединение (ADC) (20 мкг/мл) получали разбавлением стерилизованного через фильтр ADC в среде для клеточных культур. Серию 8х10кратных разбавлений исходного ADC проводили в 24-луночном планшете посредством серийного переноса 100 мкл в 900 мкл среды для клеточных культур. Разбавленный ADC распределяли (50 мкл/лунка) в 4 экземплярах в лунки 96-луночного планшета, содержащие 50 мкл клеточной суспензии, высеянной в предыдущий день. В контрольные лунки помещали 50 мкл среды для клеточных культур. 96-луночный планшет, содержащий клетки и ADC, инкубировали при 37°С в насыщенном CO2 инкубаторе в течение 6 дней. По окончании периода инкубации планшеты уравновешивали до комнатной температуры в течение 30 мин, затем в каждую лунку вводили CellTiter-Glo (Promega) (100 мкл на лунку). Планшеты устанавливали на орбитальный шейкер на 2 мин, после чего проводили стабилизацию при комнатной температуре в течение 10 мин. Измеряли люминесценцию лунок и рассчитывали процентное выживание клеток по средней люминесценции в 4 лунках, обработанных ADC, по сравнению со средней люминесценцией в 4 контрольных, не обработанных лунках (100%). IC50 определяли по данным зависимости ответа от дозы с помощью GraphPad Prism, используя алгоритм нелинейного сглаживания кривой: сигмоидальная зависимость ответа от дозы, X представляет собой ^(концентрации). Среда для выращивания клеток для РС3 представляла собой: F12K с глутамином, 10% (об./об.) эмбриональной бычьей сыворотки HyClone™.
ADC EC50 (мкг/мл)
lClC239i-10 ADC 0,002247
!ClC239i-ll ADC 0,003987
In vitro анализ MTS.
Активность ADC in vitro измеряли в клеточной линии NCI-N87, экспрессирующей Her2, и в Her2негативной клеточной линии MDA-MB-468.
Концентрацию и жизнеспособность клеток из субконфлюэнтной (конфлюэнтность 80-90%) клеточной культуры в колбе Т75 измеряли по клеткам, окрашенным трипановым синим, и подсчитывали с помощью автоматического счетчика клеток LUNA-II™. Клетки разбавляли до 2х105/мл, распределяли (50 мкл/лунка) в 96-луночные плоскодонные планшеты.
Исходный раствор (1 мл) конъюгата антитело-лекарственное соединение (ADC) (20 мкг/мл) получали разбавлением стерилизованного через фильтр ADC в среде для клеточных культур. Серию 8х10кратных разбавлений исходного ADC проводили в 24-луночном планшете посредством серийного переноса 100 мкл в 900 мкл среды для клеточных культур. Разбавленный ADC распределяли (50 мкл на лунку) в 4 экземплярах в лунки 96-луночного планшета, содержащие 50 мкл клеточной суспензии, высеянной ранее. В контрольные лунки помещали 50 мкл среды для клеточных культур. 96-Луночный планшет, содержащий клетки и ADC, инкубировали при 37°С в насыщенном СО2 инкубаторе в течение времени
- 54 039276 воздействия. По окончании периода инкубации измеряли жизнеспособность клеток с помощью анализа MTS. MTS (Promega) помещали (20 мкл на лунку) в каждую лунку и инкубировали в течение 4 ч при 37°С в насыщенном СО2 инкубаторе. Поглощение в лунках измеряли при 490 нм. Процентное выживание клеток рассчитывали по среднему поглощению в 4 лунках, обработанных ADC, в сравнении со средним поглощением в 4 контрольных, необработанных лунках (100%). IC50 определяли по данным зависимости ответа от дозы с помощью GraphPad Prism, используя алгоритм нелинейного сглаживания кривой:
сигмоидальная кривая зависимости ответа от дозы с переменным углом наклона.
Время инкубации ADC составляло 4 дня с MDA-MB-468 и 7 дней для NCI-N87. MDA-MB-468 и NCI-N87 выращивали в среде RPMI 1640 с Glutamax + 10% (об./об.) эмбриональной бычьей сыворотки HyClone™.
EC50 (мкг/мл) NCI-N87 MDA-MB-468
HerC23 91-10 ADC 0,0002893 14,9
HerC23 9i-ll ADC 0,0005823 11,4
Пример 13. Мыши.
Возраст самок мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (Fox Chase SCID®, C.B17/Icr-Prkdcscid, Charles River) составлял десять недель, диапазон массы тела (BW) от 16,2 до 21,9 г на 1 день исследования. Животных обеспечивали водой ad libitum (обратный осмос, 1 м.д. Cl) и модифицированным кормом NIH 31, а также облученным кормом Lab Diet®, состоящим из 18,0% неочищенного белка, 5,0% неочищенного жира и 5,0% неочищенного волокна. Мышей содержали на подстилке для лабораторных животных Enricho'cobs™ в статических микроизоляторах с 12-часовым циклом освещения при 20-22°С (68-72°F) и влажности 40-60%. Компания CR Discovery Services, в частности, действует в соответствии с рекомендациями Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных в отношении обездвиживания, содержания, хирургических операций и регуляции обеспечения корма и жидкости, а также ветеринарного ухода. Программа по содержанию и использованию животных в компании CR Discovery Services аккредитована Международной ассоциацией по аттестации и аккредитации содержания лабораторных животных (AAALAC), что гарантирует соблюдение принятых стандартов по содержанию и использованию лабораторных животных.
Ксенотрансплантаты JIMT -1.
Культура опухолевых клеток.
Клетки карциномы молочной железы человека JIMT-1 выращивали в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 100 единиц/мл пенициллина G натрия, 100 мкг/мл стрептомицина сульфата и 25 мкг/мл гентамицина. Клетки выращивали в колбах для тканевых культур в увлажненном инкубаторе при 37°С, в атмосфере 5% CO2 и 95% воздуха.
In Vivo имплантация и рост опухоли.
В день имплантации клетки JIMT-1 собирали на логарифмической фазе роста и повторно суспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) в концентрации 1x108 клеток/мл в 50% MatrigelTM (BD Biosciences). Ксенотрансплантаты получали подкожной имплантацией 1x107 клеток JIMT-1 (0,1 мл суспензии) в правый бок каждого экспериментального животного. Опухоли наблюдали по мере увеличения их объема, приближающегося к целевому диапазону от 100 до 150 мм3, и измеряли в двух направлениях с помощью штангенциркуля. Объем опухоли рассчитывали по формуле:
w2 х I
Объем опухоли (мм ) = —-— где w = ширина, и l = длина, в мм, опухоли.
Массу опухоли можно оценить, допуская, что 1 мг эквивалентен 1 мм3 объема опухоли.
Лечение.
Через четырнадцать дней после имплантации опухоли, обозначенной как 1 день исследования, животных разделяли на группы (n = 10) с отдельными объемами опухоли от 75 до 162 мм3, и средние объемы опухоли в группах составляли 115-117 мм3.
ADC HerC239i-10 и ADC HerC239i-SG3249 вводили внутривенно в однократной дозе 0,3 мг/кг на 1 день. Группу, которой вводили носитель, использовали в качестве контрольной группы роста опухоли. Опухоли измеряли два раза в неделю.
HerC239i-SG3249 представляет собой конъюгат, полученный из SG32349, как описано, например, в публикации Dimasi, N., et al., Molecular Pharmaceutics, 2017, 14, 1501-1516 (DOI:
10.1021/acs.molpharmaceut.6b00995).
Влияние на объем опухоли показано на фиг. 6, где
- 55 039276
Носитель •
HerC239i-SG3249 ♦
HerC23 9i-10 ADC ▲
ADC HerC239i-10 демонстрирует такую же активность, как ADC HerC239i-SG3249, несмотря на то, что содержит вдвое меньше димерных активных фрагментов PBD.
Все документы и другие ссылки, упомянутые выше, включены в данный документ посредством ссылки.

Claims (24)

1. Конъюгат формулы I
где Ab представляет собой модифицированное антитело, содержащее по меньшей мере один свободный сайт конъюгации в каждой тяжелой цепи, где модифицированное антитело модифицировано таким образом, что оно содержит по меньшей мере один аминокислотный остаток, содержащий реакционноспособную группу, подходящую для конъюгации с линкером, в каждой тяжелой цепи;
D означает группу D1
пунктирная линия означает необязательное наличие двойной связи между С2 и С3; при наличии двойной связи между С2 и С3 R2 выбран из группы, состоящей из (ia) С1-5 насыщенного алифатического алкила;
(ib) циклопропила;
R12
R13 R ’ где каждый из R11, R12 и R13 независимо выбран из Н, C1-3 насыщенного алкила,
C2-3 алкенила, С2-3 алкинила и циклопропила, и общее количество атомов углерода в группе R2 составляет не более 5;
(id)
R14 ’ где R14 представляет собой Н;
Д^16а при наличии одинарной связи между С2 и С3 R2 выбран из Н, ОН, F, diF и R ’ где R16a и R16b независимо выбраны из Н, F, C1-4 насыщенного алкила, C2-3 алкенила;
D' представляет собой группу D'1
где пунктирная линия означает необязательное наличие двойной связи между С2' и С3'; при наличии двойной связи между С2' и С3' R22 выбран из группы, состоящей из
- 56 039276 (iia) С1-5 насыщенного алифатического алкила; (iib) циклопропила;
R32
R33 (iic) R ’ где каждый из R31, R32 и R33 независимо выбран из Н, С1-3 насыщенного алкила,
C2-3 алкенила, C2-3 алкинила и циклопропила, и общее количество атомов углерода в группе R22 составляет не более 5;
(iid) . 24 _____ , _ ’ где R представляет собой Н;
при наличии одинарной связи между С2' и С3' /R263 ^26Ь
R22 выбран из Н, ОН, F, diF и , где R26a и R26b независимо выбраны из Н, F, C1-4 насыщенного алкила, C2-3 алкенила;
R6 и R9 представляют собой Н;
R7 представляет собой C1-4 алкоксигруппу;
R представляет собой С3-12 алкиленовую группу, цепь которой может прерываться бензолом или пиридином;
Y и Y' представляют собой О;
R11a представляет собой ОН;
R6, R7, R9 и R11a выбраны из таких же групп, как R6, R7, R9 и R11a соответственно;
Rll1 и RLL2 представляют собой линкеры, связанные с антителом в разных сайтах, которые независимо представляют собой формулу IIIa' где Q представляет собой
где QX является таким, что Q представляет собой аминокислотный остаток, дипептидный остаток или трипептидный остаток;
X представляет собой
где а = 0-5, b = 0-16, с = 0 или 1, d = 0-5;
Gll выбран из (GLL1-1) о сва^ о (GLL8-1) СВА (Gll1-2) о A ^Аг i сва| N у 4 о (Gll8-2) Ν СВА 0
- 57 039276
где Ar представляет собой C5-6 ариленовую группу и X представляет собой С1-4 алкил, где СВА представляет собой клеточносвязывающий агент, который является модифицированным антителом, содержащим по меньшей мере один свободный сайт конъюгации в каждой тяжелой цепи, где модифицированное антитело модифицировано таким образом, что оно содержит по меньшей мере один аминокислотный остаток, содержащий реакционноспособную группу, подходящую для конъюгации с линкером, в каждой тяжелой цепи.
2. Конъюгат по п.1, отличающийся тем, что R представляет собой С3-7 алкилен или группу формулы
где r равен 1 или 2.
3. Конъюгат по п.1 или 2, отличающийся тем, что D представляет собой D1, где существует двойная связь между С2 и С3, и R2 представляет собой
a) C1-5 насыщенную алифатическую алкильную группу, например, где R2 представляет собой метил, этил или пропил;
b) группу формулы
где
i) общее количество атомов углерода в группе R2 составляет не более 4;
ii) один из R11, R12 и R13 представляет собой Н, а другие две группы выбраны из Н, С1-3 насыщенного алкила, С2-3 алкенила, С2-3 алкинила и циклопропила; или iii) два из R11, R12 и R13 представляют собой Н, а другая группа выбрана из Н, С1-3 насыщенного ал
- 58 039276 кила, С2-3 алкенила, С2-3 алкинила и циклопропила.
4. Конъюгат по п.1 или 2, отличающийся тем, что D представляет собой D1, где существует одинарная связь между С2 и С3, и R2 представляет собой
а) Н; или
I Wb
Ь) ’ и R16a и R16b оба представляют собой Н; или /4/Rl6a
6b с) ’ и R16a и R16b оба представляют собой метил; или
I Wb
Ф ’ один из R16a и R16b представляет собой Н, а другой выбран из C1-4 насыщенного алкила, С2-3 алкенила.
5. Конъюгат по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что D' представляет собой D'1, где существует двойная связь между С2' и С3', и R22 представляет собой
a) C1.5 насыщенную алифатическую алкильную группу; или
b) циклопропил; или
с) группу формулы
где
i) общее количество атомов углерода в группе R22 составляет не более 4; или ii) один из R31, R32 и R33 представляет собой Н, а другие две группы выбраны из Н, С1-3 насыщенного алкила, С2-3 алкенила, С2-3 алкинила и циклопропила; или iii) два из R31, R32 и R33 представляют собой Н, а другая группа выбрана из Н, С1-3 насыщенного алкила, С2-3 алкенила, С2-3 алкинила и циклопропила.
6. Конъюгат по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что D' представляет собой D'1, где существует одинарная связь между С2' и С3', и R22 представляет собой
а) Н; или .26а
ла, C2-3 алкенила.
и R26a и R26b оба представляют собой Н; или и R26a и R26b оба представляют собой метил; или один из R26a и R26b представляет собой Н, а другой выбран из C1-4 насыщенного алки-
7. Конъюгат по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что
a) R6 выбран из тех же групп, что и R6, R7 выбран из тех же групп, что и R7, R9 выбран из тех же групп, что и R9, R11a выбран из тех же групп, что и R11a, и Y' выбран из тех же групп, что и Y; и/или
b) R6 представляет собой ту же группу, что и R6, R7 представляет собой ту же группу, что и R7, R9 представляет собой ту же группу, что и R9, R11a представляет собой ту же группу, что и R11a, и Y' представляет собой ту же группу, что и Y; и/или
c) R22 представляет собой ту же группу, что и R2.
8. Конъюгат по п.1, имеющий формулу Ia-1, Ia-2 или Ia-3
- 59 039276
где R2a и R22a являются одинаковыми и выбраны из (а);
(Ь);
(с);
(Ф;
R1a представляет собой метил;
Rll1, RLL2 и R11a являются такими, как определено в п.1.
9. Конъюгат по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что RLL1 имеет формулу IIIa', и QX представ ляет собой
a) аминокислотный остаток, выбранный из Phe, Lys, Val, Ala, Cit, Leu, Ile, Arg и Trp; или
b) дипептидный остаток, выбранный из CO-Phe-Lys-NH, CO-Val-Ala-NH, CO-Val-Lys-NH, CO-Ala-Lys-NH, CO-Val-Cit-NH, CO-Phe-Cit-NH, CO-Leu-Cit-NH, CO-Ile-Cit-NH, CO-Phe-Arg-NH и CO-Trp-Cit-NH; или
с) трипептидный остаток.
10. Конъюгат по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что RLL1 имеет формулу IIIa', и
a) а равен от 0 до 3; и/или
b) b равен от 0 до 12; и/или
c) d равен от 0 до 3.
11. Конъюгат по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что RLL1 имеет формулу IIIa', и а равен 0, с равен 1 и d равен 2, b равен от 0 до 8, например, где b равен 0, 4 или 8.
12. Конъюгат по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что RLL2 имеет формулу IIIa', и QX представляет собой
a) аминокислотный остаток, выбранный из Phe, Lys, Val, Ala, Cit, Leu, Ile, Arg и Trp; или
b) дипептидный остаток, выбранный из CO-Phe-Lys-NH, CO-Val-Ala-NH, CO-Val-Lys-NH, CO-Ala-Lys-NH, CO-Val-Cit-NH, CO-Phe-Cit-NH, CO-Leu-Cit-NH, CO-Ile-Cit-NH, CO-Phe-Arg-NH и CO-Trp-Cit-NH; или
- 60 039276
с) трипептидный остаток.
13. Конъюгат по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что RLL2 имеет формулу Ша', и
а) а равен от 0 до 3; и/или
b) b равен от 0 до 12; и/или
c) d равен от 0 до 3.
14. Конъюгат по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что RLL2 имеет формулу IIIa', и а равен 0, с равен 1 и d равен 2, b равен от 0 до 8.
15. Конъюгат по п.1 формулы Id
где m представляет собой целое число от 2 до 8.
16. Конъюгат по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что модифицированное антитело, содержащее по меньшей мере один свободный сайт конъюгации в каждой тяжелой цепи, представляет собой антитело IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
17. Конъюгат по п.16, отличающийся тем, что модифицированное антитело, содержащее по меньшей мере один свободный сайт конъюгации в каждой тяжелой цепи, представляет собой антитело человека или гуманизированное антитело.
18. Конъюгат по п.1, или 16, или 17, отличающийся тем, что природные межцепочечные цистеиновые остатки заменены на аминокислотные остатки, не содержащие тиольных групп.
19. Конъюгат по п.1, где модифицированное антитело содержит по меньшей мере одну дополнительную замену в каждой тяжелой цепи аминокислотного остатка, содержащую реакционноспособную группу, подходящую для конъюгации с линкером, и дополнительно замещенная аминокислота в модифицированном антителе представляет собой цистеин или неприродную аминокислоту.
20. Конъюгат по п.1 или 19, отличающийся тем, что замещенное положение выбрано из положений, перечисленных ниже
- 61 039276
Антитело Изотип IgGl IgG2 IgG3 IgG4
Положение (по Кабату, ЕС) и соответствующая аминокислота 239 Ser Ser Ser Ser
282 Vai Vai Vai Vai
289 Thr Thr Thr Thr
297 Asn Asn Asn Asn
312 Asp Asp Asp Asp
324 Ser Ser Ser Ser
330 Ala Ala Ala Ser
335 Thr Thr Thr Thr
337 Ser Ser Ser Ser
339 Ala Thr Thr Ala
356 Glu Glu Glu Glu
359 Thr Thr Thr Thr
361 Asn Asn Asn Asn
383 Ser Ser Ser Ser
384 Asn Asn Ser Asn
398 Leu Leu Leu Leu
400 Ser Ser Ser Ser
422 Vai Vai He Vai
440 Ser Ser Ser Ser
442 Ser Ser Ser Ser
SEQ Ш NO: 1 2 3 4
21. Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат по любому из пп.1-20, фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или вспомогательное вещество.
22. Применение конъюгата по любому из пп.1-20 или фармацевтической композиции по п.21 для лечения рака у субъекта.
23. Соединение формулы II
и его соли и сольваты, где D, R2, R6, R7, R9, R11a, Y, R, Y', D', R6', R7', R9', R11a' и R12 (включая наличие или отсутствие двой ных связей между С2 и С3 и между С2' и С3' соответственно) являются такими, как определено в любом из пп.1-8;
RL1 и RL2 представляют собой линкеры для связывания с клеточносвязывающим агентом, которые независимо представляют собой формулу IIIa
где Q и X являются такими, как определено в любом из пп.1, 9 или 12, и GL выбран из
- 62 039276
О (GL6) o О ,°0 %—N (GL1·2) tc (GL7) ВГ-- (GL2) о (GL8) Y (GL30 0 (NO2) где группа NO2 является необязательной (GL9) N3 (GL3·2) S— 0 (NO2) где группа NO2 является необязательной (GL1°) H (GL30 Ο2νΛ^/ где группа ΝΟ2 является необязательной (GLU) о о w (GL3-4) ο2νΛ=/ (GL12) где группа NO2 является необязательной (GL4) О Hal N—I H » где Hal = I, Br, Cl (Gl13) ,n==n __/ \ \\ I (GL5) 0 Hal— где Ar представляет собой C5-6 ариленовую группу и X представляет собой C1-4 алкил.
24. Соединение по п.23, отличающееся тем, что указанное соединение имеет формулу Id'
- 63 039276
где m представляет собой целое число от 2 до 8.
1500 η
Фиг. 1
Фиг. 2
Flexmab-PBD(10)-ADC
Фиг. 3
- 64 039276
Восстановление cTCEP
Flexmab
SH HS
Восстановленный Flexmab
Конъюгация / преобразование мостиковой связи с PBD10
Восстановленный Flexmab-10
4.
Верхний^ шарнир
Натуральный межцепочечный д исульфид ны й мости к
Е Р К S V D К Т
Средний! р шарнир1 г
Нижний шарнир
V Lp ГА
Р Е L L G ^G
Р
Р ρ V Р А Р
Верхний шарнир
Восстановленный межцепочечный дисульфидный мостик
EA202090148A 2017-08-18 2018-08-17 Пирролобензодиазепиновые конъюгаты EA039276B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762547303P 2017-08-18 2017-08-18
PCT/EP2018/072298 WO2019034764A1 (en) 2017-08-18 2018-08-17 CONJUGATES OF PYRROLOBENZODIAZEPINE

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA202090148A1 EA202090148A1 (ru) 2020-05-08
EA039276B1 true EA039276B1 (ru) 2021-12-27

Family

ID=63294219

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA202090148A EA039276B1 (ru) 2017-08-18 2018-08-17 Пирролобензодиазепиновые конъюгаты

Country Status (27)

Country Link
US (1) US11649250B2 (ru)
EP (1) EP3668874B1 (ru)
JP (1) JP7220203B2 (ru)
KR (2) KR102312910B1 (ru)
CN (1) CN111065638B (ru)
AU (1) AU2018316532B2 (ru)
BR (1) BR112020003003A2 (ru)
CA (1) CA3070765A1 (ru)
CL (1) CL2020000395A1 (ru)
CO (1) CO2020001751A2 (ru)
CY (1) CY1125053T1 (ru)
DK (1) DK3668874T3 (ru)
EA (1) EA039276B1 (ru)
ES (1) ES2906965T3 (ru)
HR (1) HRP20220311T1 (ru)
IL (1) IL272625B2 (ru)
LT (1) LT3668874T (ru)
MX (1) MX2020001880A (ru)
MY (1) MY194477A (ru)
NZ (1) NZ761175A (ru)
PL (1) PL3668874T3 (ru)
PT (1) PT3668874T (ru)
RS (1) RS62928B1 (ru)
SG (1) SG11202000358YA (ru)
SI (1) SI3668874T1 (ru)
WO (1) WO2019034764A1 (ru)
ZA (1) ZA202000397B (ru)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023509991A (ja) 2020-01-13 2023-03-10 シンアフィックス ビー．ブイ． 抗体及び免疫細胞エンゲージャーのコンジュゲート
EP4090376A1 (en) 2020-01-13 2022-11-23 Synaffix B.V. Via cycloaddition bilaterally functionalized antibodies
CN115243727A (zh) * 2020-01-13 2022-10-25 西纳福克斯股份有限公司 经由环加成的双侧官能化抗体
CN117157107A (zh) 2021-02-08 2023-12-01 西纳福克斯股份有限公司 多功能抗体
GB202105186D0 (en) 2021-04-12 2021-05-26 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
WO2023088963A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Adc Therapeutics Sa Anti-il-13ralpha2 conjugates
US20230201366A1 (en) 2021-11-19 2023-06-29 Adc Therapeutics Sa Anti-psma conjugates
WO2024038065A1 (en) 2022-08-15 2024-02-22 Synaffix B.V. Anthracyclins and conjugates thereof
EP4389152A1 (en) 2022-12-23 2024-06-26 Synaffix B.V. Conjugates of pbd prodrugs
WO2024218164A1 (en) 2023-04-17 2024-10-24 Synaffix B.V. Stable 4-isoxazoline conjugates
EP4450093A1 (en) 2023-04-17 2024-10-23 Synaffix B.V. Cleavable immune cell engagers

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016166300A1 (en) * 2015-04-15 2016-10-20 Van Berkel Patricius Hendrikus Cornelis Site-specific antibody-drug conjugates
WO2017137553A1 (en) * 2016-02-10 2017-08-17 Medimmume Limited Pyrrolobenzodiazepine conjugates
WO2018031662A1 (en) * 2016-08-11 2018-02-15 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine prodrugs and antibody conjugates thereof

Family Cites Families (421)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3361742A (en) 1964-12-07 1968-01-02 Hoffmann La Roche 5-oxo-1h-pyrrolo-[2, 1-c][1, 4]-benzodiazepin-2-crylamides
US3523941A (en) 1967-03-06 1970-08-11 Hoffmann La Roche Benzodiazepine compounds and process for their preparation
US3524849A (en) 1967-10-27 1970-08-18 Hoffmann La Roche Process for the preparation of pyrrolo-benzodiazepine acrylamides and intermediates useful therein
FR2027356A1 (en) 1968-12-30 1970-09-25 Fujisawa Pharmaceutical Co Benzodiazepinone antibiotics
JPS4843755B1 (ru) 1969-06-26 1973-12-20
IL33558A (en) 1968-12-30 1973-10-25 Fujisawa Pharmaceutical Co Antibiotic pyrrolo-benzodiazepine compound,its derivatives and processes for their production
JPS585916B2 (ja) 1977-12-27 1983-02-02 株式会社ミドリ十字 新規ベンゾジアゼピン系化合物
JPS5615289A (en) 1979-07-17 1981-02-14 Green Cross Corp:The Novel benzodiazepinnbased compound 3
JPS57131791A (en) 1980-12-31 1982-08-14 Fujisawa Pharmaceut Co Ltd Benzodiazepine derivative and its preparation
CA1185602A (en) 1981-02-27 1985-04-16 Emilio Kyburz Imidazodiazepines
CA1173441A (en) 1981-02-27 1984-08-28 Hoffmann-La Roche Limited Imidazodiazepines
CA1184175A (en) 1981-02-27 1985-03-19 Walter Hunkeler Imidazodiazepines
JPS58180487A (ja) 1982-04-16 1983-10-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 抗生物質ｄｃ−８１およびその製造法
US4427588A (en) 1982-11-08 1984-01-24 Bristol-Myers Company Process for conversion of oxotomaymycin to tomaymycin
US4427587A (en) 1982-11-10 1984-01-24 Bristol-Myers Company Total synthesis of antitumor antibiotics BBM-2040A and BBM-2040B
JPS59152329A (ja) 1983-02-17 1984-08-31 Green Cross Corp:The 局所障害抑制剤
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
FR2586683B1 (fr) 1985-08-29 1988-07-01 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives de neothramycine, leur procede de preparation et leur application en tant que medicaments
US5583024A (en) 1985-12-02 1996-12-10 The Regents Of The University Of California Recombinant expression of Coleoptera luciferase
JP2660201B2 (ja) 1988-08-05 1997-10-08 塩野義製薬株式会社 新規ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン誘導体および老人性痴呆薬
CA2023779A1 (en) 1989-08-23 1991-02-24 Margaret D. Moore Compositions and methods for detection and treatment of epstein-barr virus infection and immune disorders
JPH053790A (ja) 1990-04-19 1993-01-14 Fujisawa Pharmaceut Co Ltd デヒドロペプチダーゼ−ｉ
US5256643A (en) 1990-05-29 1993-10-26 The Government Of The United States Human cripto protein
AU9016591A (en) 1990-10-25 1992-05-26 Tanox Biosystems, Inc. Glycoproteins associated with membrane-bound immunoglobulins as antibody targets on B cells
US5440021A (en) 1991-03-29 1995-08-08 Chuntharapai; Anan Antibodies to human IL-8 type B receptor
WO1992017497A1 (en) 1991-03-29 1992-10-15 Genentech, Inc. Human pf4a receptors and their use
US5543503A (en) 1991-03-29 1996-08-06 Genentech Inc. Antibodies to human IL-8 type A receptor
FR2676058B1 (fr) 1991-04-30 1994-02-25 Hoechst Lab Prodrogues glycosylees, leur procede de preparation et leur utilisation dans le traitement des cancers.
FR2676230B1 (fr) 1991-05-07 1993-08-27 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives de pyrrolo [1,4]-benzodiazepines, leur procede de preparation et medicaments les contenant.
JP3050424B2 (ja) 1991-07-12 2000-06-12 塩野義製薬株式会社 ヒトエンドセリンリセプター
US5264557A (en) 1991-08-23 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Polypeptide of a human cripto-related gene, CR-3
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US5976551A (en) 1991-11-15 1999-11-02 Institut Pasteur And Institut Nationale De La Sante Et De La Recherche Medicale Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and method of using the determinant
US6153408A (en) 1991-11-15 2000-11-28 Institut Pasteur And Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and methods of using the determinant
GB9205051D0 (en) 1992-03-09 1992-04-22 Cancer Res Campaign Tech Pyrrolobenzodiazepine derivatives,their preparation,and compositions containing them
FR2696176B1 (fr) 1992-09-28 1994-11-10 Synthelabo Dérivés de pipéridine, leur préparation et leur application en thérapeutique.
IL107366A (en) 1992-10-23 2003-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Genes coding for megakaryocyte potentiator
US5644033A (en) 1992-12-22 1997-07-01 Health Research, Inc. Monoclonal antibodies that define a unique antigen of human B cell antigen receptor complex and methods of using same for diagnosis and treatment
US5869445A (en) 1993-03-17 1999-02-09 University Of Washington Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
US5801005A (en) 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
GB9316162D0 (en) 1993-08-04 1993-09-22 Zeneca Ltd Fungicides
US5773223A (en) 1993-09-02 1998-06-30 Chiron Corporation Endothelin B1, (ETB1) receptor polypeptide and its encoding nucleic acid methods, and uses thereof
EP0647450A1 (en) 1993-09-09 1995-04-12 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Improved prodrugs for enzyme mediated activation
US5750370A (en) 1995-06-06 1998-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acid encoding human endothlein-bombesin receptor and method of producing the receptor
JPH08336393A (ja) 1995-04-13 1996-12-24 Mitsubishi Chem Corp 光学活性なγ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法
US5707829A (en) 1995-08-11 1998-01-13 Genetics Institute, Inc. DNA sequences and secreted proteins encoded thereby
US20020193567A1 (en) 1995-08-11 2002-12-19 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
JP3646191B2 (ja) 1996-03-19 2005-05-11 大塚製薬株式会社 ヒト遺伝子
US6218519B1 (en) 1996-04-12 2001-04-17 Pro-Neuron, Inc. Compounds and methods for the selective treatment of cancer and bacterial infections
SK157498A3 (en) 1996-05-17 1999-10-08 Schering Corp Isolated and recombinant nucleic acid, bas-1 protein or peptide thereof, and agent, antibody, expression vector, host cell and method of their use
EP0961619A4 (en) 1996-09-27 2001-09-26 Bristol Myers Squibb Co HYDROLYSABLE DRUGS FOR THE RELEASE OF ANTI-CANCER DRUGS IN METASTATIC CELLS
US6759509B1 (en) 1996-11-05 2004-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
US5945511A (en) 1997-02-20 1999-08-31 Zymogenetics, Inc. Class II cytokine receptor
US7033827B2 (en) 1997-02-25 2006-04-25 Corixa Corporation Prostate-specific polynucleotide compositions
US20030185830A1 (en) 1997-02-25 2003-10-02 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
US6261791B1 (en) 1997-03-10 2001-07-17 The Regents Of The University Of California Method for diagnosing cancer using specific PSCA antibodies
US6541212B2 (en) 1997-03-10 2003-04-01 The Regents Of The University Of California Methods for detecting prostate stem cell antigen protein
EP0981541B1 (en) 1997-03-10 2004-06-02 The Regents Of The University Of California Psca: prostate stem cell antigen
US6555339B1 (en) 1997-04-14 2003-04-29 Arena Pharmaceuticals, Inc. Non-endogenous, constitutively activated human protein-coupled receptors
US6319688B1 (en) 1997-04-28 2001-11-20 Smithkline Beecham Corporation Polynucleotide encoding human sodium dependent phosphate transporter (IPT-1)
WO1998051824A1 (en) 1997-05-15 1998-11-19 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting disease of the urinary tract
WO1998051805A1 (en) 1997-05-15 1998-11-19 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
US20030060612A1 (en) 1997-10-28 2003-03-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20020034749A1 (en) 1997-11-18 2002-03-21 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US6110695A (en) 1997-12-02 2000-08-29 The Regents Of The University Of California Modulating the interaction of the chemokine, B Lymphocyte Hemoattractant, and its Receptor, BLR1
CA2323071C (en) 1998-03-13 2011-06-21 The Burnham Institute Molecules that home to various selected organs or tissues
CA2685270C (en) 1998-05-13 2014-07-29 Pharmexa Inc. Expression vectors for stimulating an immune response and methods of using the same
US20020187472A1 (en) 2001-03-09 2002-12-12 Preeti Lal Steap-related protein
KR100581443B1 (ko) 1998-05-22 2006-05-23 다이이찌 세이야꾸 가부시기가이샤 약물복합체
US20030064397A1 (en) 1998-05-22 2003-04-03 Incyte Genomics, Inc. Transmembrane protein differentially expressed in prostate and lung tumors
DE69934618T2 (de) 1998-07-08 2007-05-03 E-Ink Corp., Cambridge Verbesserte farbige mikroverkapselte elektrophoretische Anzeige
GB9818731D0 (en) 1998-08-27 1998-10-21 Univ Portsmouth Compounds
GB9818732D0 (en) 1998-08-27 1998-10-21 Univ Portsmouth Collection of compounds
GB9818730D0 (en) 1998-08-27 1998-10-21 Univ Portsmouth Collections of compounds
WO2000012130A1 (en) 1998-08-27 2000-03-09 Smithkline Beecham Corporation Rp105 agonists and antagonists
ATE240334T1 (de) 1998-08-27 2003-05-15 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepine
JP4689781B2 (ja) 1998-09-03 2011-05-25 独立行政法人科学技術振興機構 アミノ酸輸送蛋白及びその遺伝子
AU5963699A (en) 1998-10-02 2000-04-26 Mcmaster University Spliced form of (erb)b-2/neu oncogene
WO2001057188A2 (en) 2000-02-03 2001-08-09 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US20030091580A1 (en) 2001-06-18 2003-05-15 Mitcham Jennifer L. Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6468546B1 (en) 1998-12-17 2002-10-22 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20020119158A1 (en) 1998-12-17 2002-08-29 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6962980B2 (en) 1999-09-24 2005-11-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6858710B2 (en) 1998-12-17 2005-02-22 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
DE69939553D1 (de) 1998-12-30 2008-10-23 Beth Israel Hospital Charakterisierung der proteinfamilie von soc/crac kalziumkanälen
US20030009013A1 (en) 1998-12-30 2003-01-09 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
CZ20012587A3 (cs) 1999-01-29 2002-05-15 Corixa Corporation Izolovaný protein, nukleová kyselina, virový vektor, farmaceutický prostředek, izolovaná populace T buněk, způsob posílení imunitní odpovědi, způsob odstranění nádorových buněk, způsob stimulace a/nebo namnoľení T buněk a způsob přípravy fúzního proteinu
GB9905124D0 (en) 1999-03-05 1999-04-28 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
AU3395900A (en) 1999-03-12 2000-10-04 Human Genome Sciences, Inc. Human lung cancer associated gene sequences and polypeptides
US7304126B2 (en) 1999-05-11 2007-12-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6268488B1 (en) 1999-05-25 2001-07-31 Barbas, Iii Carlos F. Prodrug activation using catalytic antibodies
AU4952600A (en) 1999-06-03 2000-12-28 Takeda Chemical Industries Ltd. Screening method with the use of cd100
KR20020012292A (ko) 1999-06-25 2002-02-15 제넨테크, 인크. 항-ＥｒｂＢ 항체-메이탄시노이드 결합체를 사용한 치료방법
US6302318B1 (en) 1999-06-29 2001-10-16 General Electric Company Method of providing wear-resistant coatings, and related articles
US7589172B2 (en) 1999-07-20 2009-09-15 Genentech, Inc. PRO256 polypeptides
US7297770B2 (en) 1999-08-10 2007-11-20 Genentech, Inc. PRO6496 polypeptides
US7294696B2 (en) 1999-08-17 2007-11-13 Genentech Inc. PRO7168 polypeptides
US6909006B1 (en) 1999-08-27 2005-06-21 Spirogen Limited Cyclopropylindole derivatives
AU7573000A (en) 1999-09-01 2001-03-26 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030232056A1 (en) 1999-09-10 2003-12-18 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030206918A1 (en) 1999-09-10 2003-11-06 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030129192A1 (en) 1999-09-10 2003-07-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
DE60039448D1 (de) 1999-10-29 2008-08-21 Genentech Inc Gegen das prostata-stammzellantigen (psca) gerichtete antikörper und deren verwendung
EP2363403B1 (en) 1999-11-29 2016-04-20 The Trustees of Columbia University in the City of New York Isolation of five novel genes coding for new fc receptors-type melanoma involved in the pathogenesis of lymphoma/melanoma
WO2001040269A2 (en) 1999-11-30 2001-06-07 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of breast cancer
EP1568373A3 (en) 1999-12-10 2005-12-21 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to HER2/neu using peptide and nucleic acid compositions
EP1616575B1 (en) 1999-12-23 2012-06-06 ZymoGenetics, Inc. Method for treating inflammation
US6610286B2 (en) 1999-12-23 2003-08-26 Zymogenetics, Inc. Method for treating inflammation using soluble receptors to interleukin-20
AU783473B2 (en) 1999-12-23 2005-10-27 Zymogenetics Inc. Soluble interleukin-20 receptor
NZ502058A (en) 1999-12-23 2003-11-28 Ovita Ltd Isolated mutated nucleic acid molecule for regulation of ovulation rate
US20040001827A1 (en) 2002-06-28 2004-01-01 Dennis Mark S. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
DE60041564D1 (de) 1999-12-24 2009-03-26 Genentech Inc Verfahren und Zusammensetzungen zur Verlängerung der Entsorgungshalbwertszeit von biowirksamen Verbindungen
US7294695B2 (en) 2000-01-20 2007-11-13 Genentech, Inc. PRO10268 polypeptides
CA2398102A1 (en) 2000-01-21 2001-07-26 Corixa Corporation Compounds and methods for prevention and treatment of her-2/neu associated malignancies
US20030224379A1 (en) 2000-01-21 2003-12-04 Tang Y. Tom Novel nucleic acids and polypeptides
US20030219806A1 (en) 2000-02-22 2003-11-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel 18607, 15603, 69318, 12303, 48000, 52920, 5433, 38554, 57301, 58324, 55063, 52991, 59914, 59921 and 33751 molecules and uses therefor
WO2001062794A2 (en) 2000-02-22 2001-08-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 18607, a human calcium channel
US20040052793A1 (en) 2001-02-22 2004-03-18 Carter Paul J. Caspase activivated prodrugs therapy
US20040005561A1 (en) 2000-03-01 2004-01-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
CA2402293A1 (en) 2000-03-07 2001-09-13 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
CA2403637A1 (en) 2000-03-24 2001-10-04 Fahri Saatcioglu Novel prostate-specific or testis-specific nucleic acid molecules, polypeptides, and diagnostic and therapeutic methods
US20030186889A1 (en) 2000-03-31 2003-10-02 Wolf-Georg Forssmann Diagnostic and medicament for analysing the cell surface proteome of tumour and inflammatory cells and for treating tumorous and inflammatory diseases, preferably using a specific chemokine receptor analysis and the chemokine receptor-ligand interaction
US7279294B2 (en) 2000-04-03 2007-10-09 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services, Nih Tumor markers in ovarian cancer
CA2402392A1 (en) 2000-04-07 2001-10-18 Arena Pharmaceuticals, Inc. Non-endogenous, constitutively activated known g protein-coupled receptors
US20030119115A1 (en) 2000-05-17 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2001088133A2 (en) 2000-05-18 2001-11-22 Lexicon Genetics Incorporated Human semaphorin homologs and polynucleotides encoding the same
WO2001090304A2 (en) 2000-05-19 2001-11-29 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
AU2001275437A1 (en) 2000-06-09 2001-12-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Gene targets and ligands that bind thereto for treatment and diagnosis of ovarian carcinomas
CA2409776A1 (en) 2000-06-16 2001-12-27 Incyte Genomics, Inc. G-protein coupled receptors
WO2002002587A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. B7-like polynucleotides, polypeptides, and antibodies
AU2001273151A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Incyte Genomics, Inc. Human extracellular matrix and cell adhesion polypeptides
AU2001273194A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Amgen Inc. B7-Like Molecules and Uses Thereof
WO2002006339A2 (en) 2000-07-03 2002-01-24 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
US20040044179A1 (en) 2000-07-25 2004-03-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2002010187A1 (en) 2000-07-27 2002-02-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-h3 and b7-h4, novel immunoregulatory molecules
AU2001287639A1 (en) 2000-07-28 2002-02-13 Ulrich Wissenbach Trp8, trp9 and trp10, markers for cancer
US7229623B1 (en) 2000-08-03 2007-06-12 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins
EP1366153A2 (en) 2000-08-14 2003-12-03 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of her-2/neu-associated malignancies
WO2002013847A2 (en) 2000-08-14 2002-02-21 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
JP2004520806A (ja) 2000-08-24 2004-07-15 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
GB0020953D0 (en) 2000-08-24 2000-10-11 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
WO2002022660A2 (en) 2000-09-11 2002-03-21 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US20060073551A1 (en) 2000-09-15 2006-04-06 Genentech, Inc. Pro4487 polypeptides
US6613567B1 (en) 2000-09-15 2003-09-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of Her-2 expression
WO2002022153A2 (en) 2000-09-15 2002-03-21 Zymogenetics, Inc. Use of a polypeptide comprising the extracellular domains of il-20rb for the treatment of inflammation
EP1320604A2 (en) 2000-09-18 2003-06-25 Biogen, Inc. Cripto mutant and uses thereof
UA83458C2 (ru) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Выделенный полипептид baff-r (рецептор фактора активации в-клеток семейства tnf)
ATE310724T1 (de) 2000-09-19 2005-12-15 Taiho Pharmaceutical Co Ltd Zusammensetzungen und verfahren zur verwendung achirale analoge von cc1065 und den duocarmycinen
WO2002030268A2 (en) 2000-10-13 2002-04-18 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of prostate cancer, compositions and methods of screening for modulators of prostate cancer
DK1407017T3 (en) 2000-11-07 2009-09-21 Zymogenetics Inc Human receptor for tumor nekrose faktor
US20020150573A1 (en) 2000-11-10 2002-10-17 The Rockefeller University Anti-Igalpha-Igbeta antibody for lymphoma therapy
US20040018194A1 (en) 2000-11-28 2004-01-29 Francisco Joseph A. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
WO2002061087A2 (en) 2000-12-19 2002-08-08 Lifespan Biosciences, Inc. Antigenic peptides, such as for g protein-coupled receptors (gpcrs), antibodies thereto, and systems for identifying such antigenic peptides
AU2002243495A1 (en) 2001-01-12 2002-07-24 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Bone morphogenetic protein-2 in the treatment and diagnosis of cancer
US20030119126A1 (en) 2001-01-16 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030119119A1 (en) 2001-01-16 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
MXPA03006617A (es) 2001-01-24 2004-12-02 Protein Design Labs Inc Metodos de diagnostico de cancer de pecho, composiciones y metodos de rastreo de moduladores de cancer de pecho.
AU2002251841A1 (en) 2001-01-30 2002-08-12 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of pancreatic cancer
US20040170994A1 (en) 2001-02-12 2004-09-02 Callen David Frederick DNA sequences for human tumour suppressor genes
WO2002071928A2 (en) 2001-03-14 2002-09-19 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules and proteins for the identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
AU2002311787A1 (en) 2001-03-28 2002-10-15 Zycos Inc. Translational profiling
US6362331B1 (en) 2001-03-30 2002-03-26 Council Of Scientific And Industrial Research Process for the preparation of antitumor agents
WO2003008537A2 (en) 2001-04-06 2003-01-30 Mannkind Corporation Epitope sequences
US6820011B2 (en) 2001-04-11 2004-11-16 The Regents Of The University Of Colorado Three-dimensional structure of complement receptor type 2 and uses thereof
MXPA03009510A (es) 2001-04-17 2005-04-29 Univ Arkansas Secuencias de repeticion del gen ca125 y su uso para intervenciones de diagnosticos y terapeuticas.
AU2002309583A1 (en) 2001-04-18 2002-11-05 Protein Desing Labs, Inc. Methods of diagnosis of lung cancer, compositions and methods of screening for modulators of lung cancer
CN100352501C (zh) 2001-04-26 2007-12-05 比奥根艾迪克Ma公司 Cripto阻断抗体及其用途
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
JP2005504513A (ja) 2001-05-09 2005-02-17 コリクサ コーポレイション 前立腺癌の治療及び診断のための組成物及び方法
US20030078399A1 (en) 2001-05-11 2003-04-24 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acid sequence encoding ovarian antigen, CA125, and uses thereof
RS52228B (en) 2001-05-24 2012-10-31 Zymogenetics, Inc. TACI-IMUNOGLOBULINSKI PROTEIN FUNCTIONS
WO2002098358A2 (en) 2001-06-04 2002-12-12 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis and treatment of androgen-dependent prostate cancer, prostate cancer undergoing androgen-withdrawal, and androgen-independent prostate cancer
JP2005518185A (ja) 2001-06-04 2005-06-23 キュラジェン コーポレイション 新規タンパク質およびそれをコード化する核酸
CA2449136A1 (en) 2001-06-05 2002-12-12 Exelixis Inc. Igs as modifiers of the p53 pathway and methods of use
WO2002099044A2 (en) 2001-06-05 2002-12-12 Exelixis, Inc. B3galts as modifiers of the p53 pathway and methods of use
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US7125663B2 (en) 2001-06-13 2006-10-24 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Genes, compositions, kits and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cervical cancer
EP1517998A2 (en) 2001-06-18 2005-03-30 EOS Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
US7189507B2 (en) 2001-06-18 2007-03-13 Pdl Biopharma, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
US7705120B2 (en) 2001-06-21 2010-04-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
WO2003002717A2 (en) 2001-06-28 2003-01-09 Schering Corporation Biological activity of ak155
US20030120040A1 (en) 2001-06-29 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and Transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU2002314433A1 (en) 2001-07-02 2003-01-21 Licentia Ltd. Ephrin-tie receptor materials and methods
US20040076955A1 (en) 2001-07-03 2004-04-22 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of bladder cancer, compositions and methods of screening for modulators of bladder cancer
WO2003003984A2 (en) 2001-07-05 2003-01-16 Curagen Corporation Novel proteins and nucleic acids encoding same
WO2003055439A2 (en) 2001-07-18 2003-07-10 The Regents Of The University Of California Her2/neu target antigen and use of same to stimulate an immune response
WO2003009814A2 (en) 2001-07-25 2003-02-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of prostate cancer
IL160127A0 (en) 2001-08-03 2004-06-20 Genentech Inc Tacis and br3 polypeptides and uses thereof
US20070015145A1 (en) 2001-08-14 2007-01-18 Clifford Woolf Nucleic acid and amino acid sequences involved in pain
US20030092013A1 (en) 2001-08-16 2003-05-15 Vitivity, Inc. Diagnosis and treatment of vascular disease
AU2002313559A1 (en) 2001-08-23 2003-03-10 Oxford Biomedica (Uk) Limited Genes
US6902930B2 (en) 2001-08-29 2005-06-07 Vanderbilt University Human Mob-5 (IL-24) receptors and uses thereof
US20030124579A1 (en) 2001-09-05 2003-07-03 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
WO2003022995A2 (en) 2001-09-06 2003-03-20 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled steap-1 useful in treatment and detection of cancer
CA2459219A1 (en) 2001-09-17 2003-03-27 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer compositions and methods of screening for modulators of cancer
US20050004017A1 (en) 2001-09-18 2005-01-06 Yuval Reiss Methods and compositions for treating hcap associated diseases
KR101008758B1 (ko) 2001-09-18 2011-01-14 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료를 위한 방법 및 이를 위한 조성물
CA2460621A1 (en) 2001-09-19 2003-03-27 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
WO2003026577A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Seattle Genetics, Inc. P-amidobenzylethers in drug delivery agents
AU2002327792A1 (en) 2001-09-28 2003-04-07 Bing Yang Diagnosis and treatment of diseases caused by mutations in cd72
WO2003029277A2 (en) 2001-10-03 2003-04-10 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Modulators of lymphocyte activation and migration
US20040249144A1 (en) 2001-10-03 2004-12-09 Zairen Sun Regulated breast cancer genes
US20050123925A1 (en) 2002-11-15 2005-06-09 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20050089957A1 (en) 2001-10-19 2005-04-28 Audrey Goddard Compositions and methods for the diagnosis and treatment of inflammatory bowel disorders
CA2465268A1 (en) 2001-10-24 2003-05-01 National Jewish Medical And Research Center Three-dimensional structures of tall-1 and its cognate receptors and modified proteins and methods related thereto
US20050118585A1 (en) 2001-10-31 2005-06-02 Clark Abbot F. Bone morphogenic proteins (bmp),bmp receptors and bmp binding proteins and their use in the diagnosis and treatment of glaucoma
US20030232350A1 (en) 2001-11-13 2003-12-18 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
WO2003042661A2 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
EP1482972A4 (en) 2001-11-20 2005-11-23 Seattle Genetics Inc TREATMENT OF IMMUNOLOGICAL DISORDERS USING ANTI-CD30 ANTIBODIES
WO2003045422A1 (en) 2001-11-29 2003-06-05 Genset S.A. Agonists and antagonists of prolixin for the treatment of metabolic disorders
AU2002349784A1 (en) 2001-12-03 2003-06-17 Asahi Kasei Pharma Corporation Nf-kappab activating genes
PT1461428E (pt) 2001-12-03 2012-05-29 Alexion Pharma Inc Método para produção de anticorpos híbridos
AU2002366951A1 (en) 2001-12-10 2003-07-09 Nuvelo,Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
EP1463759B8 (en) 2002-01-07 2013-07-10 Euroscreen S.A. Ligand for g-protein coupled receptor gpr43 and uses thereof
US20030134790A1 (en) 2002-01-11 2003-07-17 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Bone Morphogenetic Protein-2 And Bone Morphogenetic Protein-4 In The Treatment And Diagnosis Of Cancer
CA2473549C (en) 2002-01-16 2011-02-15 Japan Science And Technology Agency Moving-image holographic reproducing device and color moving-image holographic reproducing device
US7452675B2 (en) 2002-01-25 2008-11-18 The Queen's Medical Center Methods of screening for TRPM4b modulators
AU2003224624B2 (en) 2002-02-21 2008-08-28 Duke University Reagents and treatment methods for autoimmune diseases
EP1575480A4 (en) 2002-02-22 2008-08-06 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING DISEASES RELATED TO THE IMMUNE SYSTEM
AU2003223207A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Exelixis, Inc. SCDs AS MODIFIERS OF THE p53 PATHWAY AND METHODS OF USE
US20050220798A1 (en) 2002-06-04 2005-10-06 Reinhard Ebner Cancer-linked gene as target for chemotherapy
WO2003104399A2 (en) 2002-06-07 2003-12-18 Avalon Pharmaceuticals, Inc Cancer-linked gene as target for chemotherapy
US20050287147A1 (en) 2002-05-15 2005-12-29 Reinhard Ebner Cancer-linked gene as target for chemotherapy
US6660856B2 (en) 2002-03-08 2003-12-09 Kaohsiung Medical University Synthesis of pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepine analogues
EP2258712A3 (en) 2002-03-15 2011-05-04 Multicell Immunotherapeutics, Inc. Compositions and Methods to Initiate or Enhance Antibody and Major-histocompatibility Class I or Class II-restricted T Cell Responses by Using Immunomodulatory, Non-coding RNA Motifs
WO2004000997A2 (en) 2002-03-19 2003-12-31 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
JP2005534286A (ja) 2002-03-21 2005-11-17 サネシス ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド キナーゼインヒビターの同定
US7193069B2 (en) 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
EP1494693B1 (en) 2002-03-22 2010-12-08 Biogen Idec MA Inc. Cripto-specific antibodies
EP1490085A2 (en) 2002-03-25 2004-12-29 Uab Research Foundation Fc receptor homolog, reagents, and uses thereof
AU2003222103A1 (en) 2002-03-28 2003-10-13 Idec Pharmaceuticals Corporation Novel gene targets and ligands that bind thereto for treatment and diagnosis of colon carcinomas
US20030194704A1 (en) 2002-04-03 2003-10-16 Penn Sharron Gaynor Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for gene expression analysis two
MXPA04009728A (es) 2002-04-05 2005-06-08 Agenysys Inc Acido nucleico y proteina correspondiente titulada 98p4b6 en el tratamiento y deteccion del cancer.
AU2003223520A1 (en) 2002-04-12 2003-10-27 Mitokor Targets for therapeutic intervention identified in the mitochondrial proteome
MXPA04010092A (es) 2002-04-16 2004-12-13 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores.
US20030224467A1 (en) 2002-04-17 2003-12-04 Osborne C. Kent AIB1 as a prognostic marker and predictor of resistance to endocrine therapy
AU2003228869A1 (en) 2002-05-03 2003-11-17 Incyte Corporation Transporters and ion channels
US20030224454A1 (en) 2002-05-30 2003-12-04 Ryseck Rolf Peter Human solute carrier family 7, member 11 (hSLC7A11)
WO2003101283A2 (en) 2002-06-04 2003-12-11 Incyte Corporation Diagnostics markers for lung cancer
SG145559A1 (en) 2002-06-06 2008-09-29 Oncotherapy Science Inc Genes and polypeptides relating to human colon cancers
WO2003104270A2 (en) 2002-06-06 2003-12-18 Ingenium Pharmaceuticals Ag Dudulin 2 genes, expression products, non-human animal model: uses in human hematological disease
AU2003245441A1 (en) 2002-06-12 2003-12-31 Avalon Pharmaceuticals, Inc. Cancer-linked gene as target for chemotherapy
WO2003106659A2 (en) 2002-06-18 2003-12-24 Archemix Corp. Aptamer-toxin molecules and methods for using same
US20040249130A1 (en) 2002-06-18 2004-12-09 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
WO2004000221A2 (en) 2002-06-20 2003-12-31 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modulating lymphocyte activity
EP1534331B1 (en) 2002-06-21 2014-10-29 Johns Hopkins University School of Medicine Membrane associated tumor endothelium markers
DE10229834A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Zinser Textilmaschinen Gmbh Streckwerk für Spinnmaschinen mit nachgeordneter Verdichtungsvorrichtung
WO2004009622A2 (en) 2002-07-19 2004-01-29 Cellzome Ag Protein complexes of cellular networks underlying the development of cancer and other diseases
NZ537781A (en) 2002-07-25 2008-04-30 Genentech Inc Taci antibodies and uses thereof
EP1545613B9 (en) 2002-07-31 2012-01-25 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
AU2003294210A1 (en) 2002-07-31 2004-05-04 Seattle Genetics, Inc Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
WO2004015426A1 (en) 2002-08-06 2004-02-19 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with human cxc chemokine receptor 5(cxcr5)
JP2004121218A (ja) 2002-08-06 2004-04-22 Jenokkusu Soyaku Kenkyusho:Kk 気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法
KR20050048615A (ko) 2002-08-19 2005-05-24 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법
EP1572957A4 (en) 2002-08-27 2007-10-10 Bristol Myers Squibb Pharma Co IDENTIFICATION OF POLYNUCLEOTIDES FOR PREDICTING THE ACTIVITY OF COMPOUNDS INTERACTING WITH AND / OR MODULATING TYROSINE KINASE PROTEINS AND / OR TYROSINE KINASE PROTEIN PATHWAYS IN MAMMARY CELLS
WO2004020595A2 (en) 2002-08-29 2004-03-11 Five Prime Therapeutics, Inc. Novel human polypeptides encoded by polynucleotides
US20050271615A1 (en) 2002-08-30 2005-12-08 Doron Shabat Self-immolative dendrimers releasing many active moieties upon a single activating event
AU2002951346A0 (en) 2002-09-05 2002-09-26 Garvan Institute Of Medical Research Diagnosis of ovarian cancer
US20040180354A1 (en) 2002-09-06 2004-09-16 Simard John J.L. Epitope sequences
US20060134109A1 (en) 2002-09-09 2006-06-22 Nura Inc. G protein coupled receptors and uses thereof
JP2004113151A (ja) 2002-09-27 2004-04-15 Sankyo Co Ltd 癌遺伝子及びその用途
EP1554309A2 (en) 2002-10-03 2005-07-20 McGILL UNIVERSITY Antibodies and cyclic peptides which bind cea (carcinoembryonic antigen) and their use as cancer therapeutics
US20060183120A1 (en) 2002-10-04 2006-08-17 Teh Bin T Molecular sub-classification of kidney tumors and the discovery of new diagnostic markers
US20040138269A1 (en) 2002-10-11 2004-07-15 Sugen, Inc. Substituted pyrroles as kinase inhibitors
CA2503748A1 (en) 2002-11-08 2004-05-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of natural killer cell related diseases
CA2503621A1 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Genentech, Inc. Methods and compositions for diagnosing dysplasia
GB0226593D0 (en) 2002-11-14 2002-12-24 Consultants Ltd Compounds
WO2004043493A1 (en) 2002-11-14 2004-05-27 Syntarga B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
JP2006516189A (ja) 2002-11-15 2006-06-29 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー Ｃａ１２５遺伝子、および診断および治療のためのその使用
CN100594037C (zh) 2002-11-15 2010-03-17 Musc研究发展基金会 通过补体受体2定向的补体调节剂
WO2004046342A2 (en) 2002-11-20 2004-06-03 Biogen Idec Inc. Novel gene targets and ligands that bind thereto for treatment and diagnosis of carcinomas
EP2410332A1 (en) 2002-11-21 2012-01-25 The University Of Utah Method for identifying purinergic modulators of the olfactory system
AU2003298786A1 (en) 2002-11-26 2004-06-18 Protein Design Labs, Inc. Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators
WO2004053079A2 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Diadexus, Inc. Compositions, splice variants and methods relating to ovarian specific genes and proteins
JP2004198419A (ja) 2002-12-13 2004-07-15 Bayer Healthcare Llc Ｔｉｍｐ１を用いた検出方法
US7276372B2 (en) 2002-12-20 2007-10-02 Pdl Biopharma, Inc. Antibodies against GPR64 and uses thereof
AU2003299819A1 (en) 2002-12-23 2004-07-22 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha conjugate, neutrokine-alpha complex, and uses thereof
WO2004063709A2 (en) 2003-01-08 2004-07-29 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to epidermal growth factor receptor modulators
WO2004063355A2 (en) 2003-01-10 2004-07-29 Protein Design Labs, Inc. Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of matastatic cancer
US20050227301A1 (en) 2003-01-10 2005-10-13 Polgen Cell cycle progression proteins
US20040171823A1 (en) 2003-01-14 2004-09-02 Nadler Steven G. Polynucleotides and polypeptides associated with the NF-kappaB pathway
WO2004065576A2 (en) 2003-01-15 2004-08-05 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of urological disorder using differential expressed polypeptides
AU2004213432A1 (en) 2003-02-14 2004-09-02 Sagres Discovery, Inc. Novel therapeutic targets in cancer
US20030224411A1 (en) 2003-03-13 2003-12-04 Stanton Lawrence W. Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells
CA2520898C (en) 2003-03-31 2009-10-20 Council Of Scientific And Industrial Research Non-cross-linking pyrrolo(2,1-c)(1,4)benzodiazepines as potential antitumour agents and process thereof
GB0321295D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Spirogen Ltd Synthesis of protected pyrrolobenzodiazepines
EP1675857B1 (en) 2003-10-22 2011-07-13 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Pyrrolobenzodiazepine derivatives, compositions comprising the same and methods related thereto
GB0416511D0 (en) 2003-10-22 2004-08-25 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
ES2534185T3 (es) 2003-11-06 2015-04-20 Seattle Genetics, Inc. Compuestos de monometilvalina conjugados con anticuerpos
EP1720908A2 (en) 2004-02-17 2006-11-15 Absalus, Inc. Super-humanized antibodies against respiratory syncytial virus
EP1718667B1 (en) 2004-02-23 2013-01-09 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
GB0404577D0 (en) 2004-03-01 2004-04-07 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB0404574D0 (en) 2004-03-01 2004-04-07 Spirogen Ltd Amino acids
GB0404578D0 (en) 2004-03-01 2004-04-07 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
SI1720881T1 (sl) 2004-03-01 2013-04-30 Spirogen Sarl 11-hidroksi-5H-pirolo(2,1-c)(1,4)benzodiazepin-5onski derivati kot ključni intermediati za pipravo C2 substituiranih pirolobenzodiazepinov
DE102004010943A1 (de) 2004-03-03 2005-09-29 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von N-geschützten 4-Ketprolinderivaten
US7528126B2 (en) 2004-03-09 2009-05-05 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines
FR2869231B1 (fr) 2004-04-27 2008-03-14 Sod Conseils Rech Applic Composition therapeutique contenant au moins un derive de la pyrrolobenzodiazepine et la fludarabine
JP5248107B2 (ja) 2004-05-11 2013-07-31 ザ、ジェネラル、ホスピタル、コーポレイション 耐酸化性重合体状材料の製造方法
GB0410725D0 (en) 2004-05-13 2004-06-16 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepine therapeutic agents
ES2579805T3 (es) 2004-09-23 2016-08-16 Genentech, Inc. Anticuerpos y conjugados modificados por ingeniería genética con cisteína
CA2587589A1 (en) 2004-11-29 2006-06-22 Seattle Genetics, Inc. Engineered antibodies and immunoconjugates
EP1831418A2 (en) 2004-12-24 2007-09-12 Showa Denko Kabushiki Kaisha Production method of thermoelectric semiconductor alloy, thermoelectric conversion module and thermoelectric power generating device
WO2006082406A2 (en) 2005-02-03 2006-08-10 Antitope Limited Human antibodies and proteins
CN101203241B (zh) 2005-04-19 2012-02-22 西雅图基因公司 人源化抗-cd70结合物和其应用
US7612062B2 (en) 2005-04-21 2009-11-03 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines
GB0508084D0 (en) 2005-04-21 2005-06-01 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
WO2007039752A1 (en) 2005-10-05 2007-04-12 Spirogen Limited Alkyl 4- [4- (5-oxo-2, 3, 5, 11a-tetrahyd0-5h-pyrr0l0 [2, 1-c] [1, 4] benzodiazepine-8-yloxy) -butyrylamino]-1h-pyrrole-2-carboxylate derivatives and related compounds for the treatment of a proliferative disease
US20070154906A1 (en) 2005-10-05 2007-07-05 Spirogen Ltd. Methods to identify therapeutic candidates
CA2927656C (en) 2005-10-07 2019-09-24 Exelixis, Inc. Mek inhibitors and methods of their use
DK1813614T3 (da) 2006-01-25 2012-01-23 Sanofi Sa Cytotoksiske midler, der omfatter nye tomaymycinderivater
MY157757A (en) 2006-07-18 2016-07-15 Sanofi Aventis Antagonist antibody against epha2 for the treatment of cancer
PT2059536E (pt) 2006-08-14 2014-04-14 Xencor Inc Anticorpos otimizados que visam cd19
US20080112961A1 (en) 2006-10-09 2008-05-15 Macrogenics, Inc. Identification and Engineering of Antibodies with Variant Fc Regions and Methods of Using Same
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
WO2008050140A2 (en) 2006-10-27 2008-05-02 Spirogen Limited Compounds for treatment of parasitic infection
PT2099823E (pt) 2006-12-01 2014-12-22 Seattle Genetics Inc Agentes de ligação ao alvo variantes e suas utilizações
TW200902554A (en) 2007-05-08 2009-01-16 Genentech Inc Cysteine engineered anti-MUC16 antibodies and antibody drug conjugates
EP2019104B1 (en) 2007-07-19 2013-09-04 Sanofi Cytotoxic agents comprising new tomaymycin derivatives and their therapeutic use
RU2505544C2 (ru) 2007-10-19 2014-01-27 Дженентек, Инк. Антитела против tenb2, сконструированные с цистеином, и конъюгаты антитело - лекарственное средство
GB0722087D0 (en) 2007-11-09 2007-12-19 Spirogen Ltd Polyamides
GB0722088D0 (en) 2007-11-09 2007-12-19 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
EP2265283B1 (en) 2008-03-18 2014-09-03 Seattle Genetics, Inc. Auristatin drug linker conjugates
EP2109244A1 (de) 2008-04-09 2009-10-14 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren zur sicherheitsgerichteten Übertragung Sicherheitsschaltgerät und Kontrolleinheit
KR20220035504A (ko) 2008-04-30 2022-03-22 이뮤노젠 아이엔씨 가교제 및 그 용도
SG191679A1 (en) 2008-06-16 2013-07-31 Immunogen Inc Novel synergistic effects
GB0813432D0 (en) 2008-07-22 2008-08-27 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB0819097D0 (en) 2008-10-17 2008-11-26 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB0819095D0 (en) 2008-10-17 2008-11-26 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
EP3100745B1 (en) 2009-02-05 2018-04-18 Immunogen, Inc. Novel benzodiazepine derivatives
BRPI1005984A2 (pt) 2009-02-23 2016-10-04 Glenmark Pharmaceuticals Sa anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo que se liga ao cd19 humano, acido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo que se liga à cd12 humano, composição, imunoconjugado, uso de um anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo, artigo de manufatura e kit
JP5382792B2 (ja) 2009-08-14 2014-01-08 独立行政法人理化学研究所 光２次非線形薄膜における１次及び２次光感受率異方性同時測定方法、当該方法を実行する装置及び当該方法をコンピュータに実行させるプログラム
FR2949469A1 (fr) 2009-08-25 2011-03-04 Sanofi Aventis Derives anticancereux, leur preparation et leur application en therapeutique
US8586714B2 (en) 2009-09-01 2013-11-19 Abbvie, Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20110070227A1 (en) 2009-09-18 2011-03-24 Anna-Marie Novotney-Barry Treatment of Autoimmune and Inflammatory Diseases
CA2775350A1 (en) 2009-09-24 2011-03-31 Seattle Genetics, Inc. Dr5 ligand drug conjugates
EP2534158B1 (en) 2010-02-09 2014-01-08 Bristol-Myers Squibb Company Benzylpyrrolidinone derivatives as modulators of chemokine receptor activity
CN102933231B (zh) 2010-02-10 2015-07-29 伊缪诺金公司 Cd20抗体及其用途
US9175086B2 (en) 2010-02-10 2015-11-03 Immunogen, Inc. CD20 antibodies and uses thereof
NZ602932A (en) 2010-04-15 2014-08-29 Seattle Genetics Inc Targeted pyrrolobenzodiazapine conjugates
WO2011130615A2 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Dr. Reddy's Laboratories Ltd. Preparation of lacosamide
BR112012026410B8 (pt) 2010-04-15 2023-01-31 Spirogen Dev Sarl Composto e conjugado de pirrolobenzodiazepinas e usos dos mesmos
SI2528625T1 (sl) 2010-04-15 2013-11-29 Spirogen Sarl Pirolobenzodiazepini in njihovi konjugati
GB201006340D0 (en) 2010-04-15 2010-06-02 Spirogen Ltd Synthesis method and intermediates
PT3056203T (pt) 2010-04-21 2018-02-15 Syntarga Bv Conjugados de análogos de cc-1065 e ligantes bifuncionais
FR2963007B1 (fr) 2010-07-26 2013-04-05 Sanofi Aventis Derives anticancereux, leur preparation et leur application therapeutique
EP2638066A4 (en) 2010-11-09 2015-06-03 Medimmune Llc ANTIBODY EQUIPMENT FOR HOMOGENEOUS CONJUGATION
DK2675479T3 (en) 2011-02-15 2016-04-11 Immunogen Inc cytotoxic benzodiazepine
US9135118B2 (en) 2011-03-07 2015-09-15 Aptare, Inc. System to catalog and search point-in-time instances of a file system
EP2751120B1 (en) 2011-09-20 2018-08-22 MedImmune Limited Pyrrolobenzodiazepines as unsymmetrical dimeric pbd compounds for inclusion in targeted conjugates
CA2850096C (en) 2011-10-14 2018-07-03 Spirogen Sarl Synthesis method and intermediates useful in the preparation of pyrrolobenzodiazepines
WO2013053871A1 (en) 2011-10-14 2013-04-18 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines
HUE025661T2 (en) 2011-10-14 2016-04-28 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and their conjugates
CN108164551A (zh) 2011-10-14 2018-06-15 西雅图基因公司 吡咯并苯并二氮杂卓和靶向结合物
MX341523B (es) 2011-10-14 2016-08-24 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinas.
BR112014009055B1 (pt) 2011-10-14 2021-12-14 Seattle Genetics, Inc. Compostos pirrolobenzodiazepinas, conjugados alvos, ligante de fármaco e uso dos ditos conjugados para tratar uma doença proliferativa
JP2013194140A (ja) 2012-03-19 2013-09-30 Fuji Xerox Co Ltd トナー用ポリエステル樹脂、静電荷像現像用トナー、静電荷像現像剤、トナーカートリッジ、プロセスカートリッジ、画像形成装置及び画像形成方法
IN2014MN02092A (ru) 2012-04-30 2015-09-04 Spirogen Sarl
WO2013164592A1 (en) 2012-04-30 2013-11-07 Ucl Business Plc Pyrrolobenzodiazepines
US9062577B2 (en) 2012-05-14 2015-06-23 Southwest Research Institute Diesel engine operation for fast transient response and low emissions
WO2013177481A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 Immunogen, Inc. Benzodiazepines and conjugates thereof
MX2015000359A (es) 2012-07-09 2015-04-14 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados anti-cd79b.
WO2014011518A1 (en) 2012-07-09 2014-01-16 Genentech, Inc. Immunoconjugates comprising anti-cd22 antibodies
BR112015002193A2 (pt) 2012-08-02 2017-07-04 Genentech Inc anticorpos anti-etbr e imunoconjugados
EP2887965A1 (en) 2012-08-22 2015-07-01 ImmunoGen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
CN109134599A (zh) 2012-10-12 2019-01-04 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物
WO2014057072A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Spirogen Sàrl Synthesis and intermediates of pyrrolobenzodiazepine derivatives for conjugation
RS61294B1 (sr) 2012-10-12 2021-02-26 Medimmune Ltd Pirolobenzodiazepini i njihovi konjugati
ES2660029T3 (es) 2012-10-12 2018-03-20 Medimmune Limited Conjugados de anticuerpo-pirrolobenzodiazepinas
LT2906296T (lt) 2012-10-12 2018-06-11 Adc Therapeutics Sa Pirolobenzodiazepino-antikūno konjugatai
EP2906298B1 (en) 2012-10-12 2018-10-03 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
BR112015008177A2 (pt) 2012-10-12 2017-09-19 Adc Therapeutics Sarl conjugados de pirrolobenzodiazepina - anticorpo
WO2014057118A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sarl Pyrrolobenzodiazepine-anti-cd22 antibody conjugates
SI2906251T1 (en) * 2012-10-12 2018-01-31 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-anti-CD22 antibody conjugates
AU2013328619B2 (en) 2012-10-12 2016-11-17 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine - anti-PSMA antibody conjugates
ES2680153T3 (es) 2012-10-12 2018-09-04 Adc Therapeutics Sa Conjugados de anticuerpos anti-PSMA-pirrolobenzodiazepinas
US20140121126A1 (en) 2012-10-25 2014-05-01 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of detecting axl and gas6 in cancer patients
JP6133431B2 (ja) 2012-11-24 2017-05-24 ハンジョウ ディーエーシー バイオテック シーオー．，エルティディ．Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｄａｃ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． 親水性連結体及び薬物分子と細胞結合分子との共役反応における親水性連結体の使用
AU2013366490B9 (en) 2012-12-21 2018-02-01 Medimmune Limited Unsymmetrical pyrrolobenzodiazepines-dimers for use in the treatment of proliferative and autoimmune diseases
JP6307519B2 (ja) 2012-12-21 2018-04-04 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピンおよびその結合体
TR201908761T4 (tr) 2013-02-22 2019-07-22 Abbvie Stemcentrx Llc Antidll3-antikor-pbd konjugatları ve kullanımları.
SG11201507214SA (en) 2013-03-13 2015-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CA2905181C (en) 2013-03-13 2020-06-02 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof for providing targeted therapy
JP6340019B2 (ja) 2013-03-13 2018-06-06 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びそのコンジュゲート
US20160106861A1 (en) 2013-04-26 2016-04-21 Spirogen Sarl Axl antibody-drug conjugate and its use for the treatment of cancer
RU2016111137A (ru) 2013-08-28 2017-10-03 ЭББВИ СТЕМСЕНТРКС ЭлЭлСи Сконструированные конъюгаты против dll3 и способы применения
NL2011583C2 (en) 2013-10-10 2015-04-13 Wwinn B V Module, system and method for detecting acoustical failure of a sound source.
EP3054986B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317981D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3054984A1 (en) 2013-10-11 2016-08-17 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3055423B1 (en) 2013-10-11 2019-12-25 Cellectis Method for detecting nucleic acid sequences of interest using talen protein
DE102013220528B4 (de) 2013-10-11 2015-05-07 Continental Automotive Gmbh Einspritzventil und Verfahren zum Betreiben eines Einspritzventils
GB201318069D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Maersk Olie & Gas Seismic data processing method and apparatus
WO2015052532A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3054985B1 (en) 2013-10-11 2018-12-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CN105848685B (zh) 2013-12-16 2020-09-22 健泰科生物技术公司 拟肽化合物及其抗体药物偶联物
WO2015112822A1 (en) 2014-01-24 2015-07-30 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Antibody-drug conjugates targeting kit receptor and uses thereof
PT3129406T (pt) 2014-04-11 2019-04-24 Medimmune Llc Compostos conjugados que compreendem anticorpos com manipulação de cisteínas
GB201406767D0 (en) 2014-04-15 2014-05-28 Cancer Rec Tech Ltd Humanized anti-Tn-MUC1 antibodies anf their conjugates
JP6531166B2 (ja) 2014-09-10 2019-06-12 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びそのコンジュゲート
EA201790569A1 (ru) 2014-09-12 2017-08-31 Дженентек, Инк. Антитела и иммуноконъюгаты против cll-1
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
AU2015317653A1 (en) 2014-09-17 2017-04-06 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and antibody disulfide conjugates thereof
WO2016053107A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Synaffix B.V. Sulfamide linker, conjugates thereof, and methods of preparation
GB201506399D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506388D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Cancer Res Technology Ltd And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506407D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506409D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Williams David G And Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Humanized anti-axl antibodies and their conjugates
GB201506393D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
TW201709932A (zh) 2015-06-12 2017-03-16 西雅圖遺傳學公司 Ｃｄ１２３抗體及其共軛物
EP3383917A4 (en) * 2015-12-04 2019-08-21 Abbvie Stemcentrx LLC NOVEL ANTI-CLAUDIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
AU2018430758B2 (en) 2018-07-05 2022-01-27 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd Cross-linked pyrrolobenzodiazepine dimer (PBD) derivative and its conjugates

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016166300A1 (en) * 2015-04-15 2016-10-20 Van Berkel Patricius Hendrikus Cornelis Site-specific antibody-drug conjugates
WO2017137553A1 (en) * 2016-02-10 2017-08-17 Medimmume Limited Pyrrolobenzodiazepine conjugates
WO2018031662A1 (en) * 2016-08-11 2018-02-15 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine prodrugs and antibody conjugates thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IONTCHO R VLAHOV, LEAMON CHRISTOPHER, PAUL, QI LONGWU ;, ZOU NING ;, WANG KEVIN, YU, FELTEN ALBERT E ;, PARHAM GARTH L ;, YOU FEI : "Preparation of pyrrolobenzodiazepine peptide conjugates for treating cancer diseases", WO2017172930 A1, 5 October 2017 (2017-10-05), pages 1 - 6, XP055518028 *
MASTERSON, L.A. ; SPANSWICK, V.J. ; HARTLEY, J.A. ; BEGENT, R.H. ; HOWARD, P.W. ; THURSTON, D.E.: "Synthesis and biological evaluation of novel pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepine prodrugs for use in antibody-directed enzyme prodrug therapy", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 16, no. 2, 15 January 2006 (2006-01-15), AMSTERDAM, NL , pages 252 - 256, XP027965878, ISSN: 0960-894X *
ZHONGHUA PEI, CHUNJIAO CHEN, JINHUA CHEN, JOSEFA DELA CRUZ-CHUH, REGINALD DELAROSA, YUZHONG DENG, AIMEE FOURIE-O’DONOHUE, IS: "Exploration of Pyrrolobenzodiazepine (PBD)-Dimers Containing Disulfide-Based Prodrugs as Payloads for Antibody–Drug Conjugates", MOLECULAR PHARMACEUTICS, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 15, no. 9, 4 September 2018 (2018-09-04), US , pages 3979 - 3996, XP055516648, ISSN: 1543-8384, DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.8b00431 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA3070765A1 (en) 2019-02-21
CL2020000395A1 (es) 2020-08-28
EP3668874B1 (en) 2021-12-22
CN111065638A (zh) 2020-04-24
SG11202000358YA (en) 2020-02-27
AU2018316532A1 (en) 2020-02-13
SI3668874T1 (sl) 2022-04-29
KR102312910B1 (ko) 2021-10-15
CN111065638B (zh) 2021-04-09
BR112020003003A2 (pt) 2020-08-11
HRP20220311T1 (hr) 2022-05-13
ZA202000397B (en) 2022-06-29
US20200247823A1 (en) 2020-08-06
JP2020531471A (ja) 2020-11-05
EA202090148A1 (ru) 2020-05-08
AU2018316532B2 (en) 2022-11-24
CY1125053T1 (el) 2023-06-09
US11649250B2 (en) 2023-05-16
NZ761175A (en) 2024-07-26
MX2020001880A (es) 2021-07-06
RS62928B1 (sr) 2022-03-31
PL3668874T3 (pl) 2022-03-28
JP7220203B2 (ja) 2023-02-09
KR102270107B1 (ko) 2021-06-30
DK3668874T3 (da) 2022-02-14
CO2020001751A2 (es) 2020-04-01
IL272625B2 (en) 2023-08-01
EP3668874A1 (en) 2020-06-24
KR20210035905A (ko) 2021-04-01
PT3668874T (pt) 2022-02-24
LT3668874T (lt) 2022-03-25
WO2019034764A1 (en) 2019-02-21
IL272625B1 (en) 2023-04-01
KR20200024925A (ko) 2020-03-09
IL272625A (en) 2020-03-31
MY194477A (en) 2022-11-30
ES2906965T3 (es) 2022-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7220203B2 (ja) ピロロベンゾジアゼピン複合体
US20210283141A1 (en) Pyrrolobenzodiazepine conjugates
KR20210081350A (ko) 피롤로벤조디아제핀 컨쥬게이트
JP7259024B2 (ja) ピロロベンゾジアゼピン複合体
JP7520870B2 (ja) がんの治療における使用のための、アゼチドベンゾジアゼピン二量体及びこれを含む複合体
EP3710066B1 (en) Pyrrolobenzodiazepine conjugates
EA045942B1 (ru) Азетидобензодиазепиновые димеры и конъюгаты, содержащие их, для применения для лечения рака
WO2022218973A2 (en) Pyrrolobenzodiazepine conjugates
WO2022218970A2 (en) Pyrrolobenzodiazepine conjugates