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ES2278079T3 - Proteinas morfogenicas oseas (bmp), receptores de bmp y proteinas de union a bmp y su utilizacion en el diagnostico y en el tratamiento del glaucoma. - Google Patents

Proteinas morfogenicas oseas (bmp), receptores de bmp y proteinas de union a bmp y su utilizacion en el diagnostico y en el tratamiento del glaucoma. Download PDF

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ES2278079T3 ES02802562T ES02802562T ES2278079T3 ES 2278079 T3 ES2278079 T3 ES 2278079T3 ES 02802562 T ES02802562 T ES 02802562T ES 02802562 T ES02802562 T ES 02802562T ES 2278079 T3 ES2278079 T3 ES 2278079T3
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glaucoma
cells
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Abbot F. Clark
Robert J. Wordinger
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Alcon Inc
University of North Texas
University of North Texas Health Science Center
Original Assignee
Alcon Inc
University of North Texas
University of North Texas Health Science Center
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Abstract

Procedimiento para el diagnóstico del glaucoma en una muestra obtenida de una célula o de un líquido corporal mediante la detección de la expresión alterada de un gen miembro de la familia morfogénica ósea, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes: a) extraer ADN de una muestra de tejido o de líquido obtenida de un paciente del que se sospecha que presenta un glaucoma; b) obtener una pluralidad de cebadores de PCR, en el que dichos cebadores comprenden cada uno una secuencia constituida por de 18 a 1.547 nucleótidos contiguos de SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39, SEC ID nº 41, SEC ID nº 43, SEC ID nº 45, SEC ID nº 47 o SEC ID nº 53; c) amplificar regiones del ADN extraído utilizando dichos cebadores para obtener un producto de PCR; d) resolver el producto de PCR; y e) identificar las diferencias entre la secuencia del ADN extraído amplificado y la secuencia del cebador; en el que una diferencia entre la secuencia amplificada y el cebador es diagnóstica de glaucoma.

Description

Proteínas morfogénicas óseas (BMP), receptores de BMP y proteínas de unión a BMP y su utilización en el diagnóstico y en el tratamiento del glaucoma.
1. Campo de la invención
La presente invención da a conocer procedimientos y reactivos para el diagnóstico y el tratamiento del glaucoma y los trastornos relacionados.
2. Descripción de la técnica relacionada
Los "glaucomas" son un grupo de enfermedades debilitantes de los ojos que son la causa principal de ceguera irreversible en los Estados Unidos y en otros países desarrollados. El glaucoma primario de ángulo abierto ("PoAG"), la forma más común de glaucoma, se caracteriza por la degeneración de la malla trabecular, conduciendo a la obstrucción de la capacidad normal del humor acuoso de salir del ojo sin cierre del espacio (es decir, el "ángulo") entre el iris y la córnea (Vaughan, D. et al., (1992)). Una característica de dicha obstrucción en la enfermedad es la presión intraocular ("IOP") incrementada, que resulta en la pérdida gradual de la visión y en ceguera si no se trata adecuadamente y a tiempo. Se estima que la enfermedad afecta a entre 0,4% y 3,3% de la población adulta de más de 40 años (Leske, M.C. et al., (1986); Bengtsson, B., (1989); Strong, N.P., (1992)). Además, la prevalencia de la enfermedad se incrementa con la edad hasta superar el 6% de las personas de 75 o más años (Strong, N.P., (1992)).
Debido a que la IOP incrementada es una característica fácilmente medible del glaucoma, se realiza un cribado diagnóstico de la enfermedad mayoritariamente mediante la medición de la presión intraocular (tonometría) (Strong, N.P., (1992); Greve, M. et al., (1993)). Por desgracia, debido a que los intervalos de presión glaucomatosa y normal se solapan, estos procedimientos resultan de valor limitado a menos que se obtengan múltiples lecturas (Hitchings, R.A., (1993); Tuck, M.W. et al., 1993; Vaughan, D. et al., (1992); Vernon, S.A., (1993)). Por ello, con frecuencia se llevan a cabo procedimientos adicionales, tales como el examen directo del disco óptico y la determinación del grado de pérdida del campo visual del paciente, con el fin de mejorar la exactitud del diagnóstico (Greve, M. et al., (1993)).
El glaucoma afecta a tres tejidos diferentes del ojo. La IOP incrementada asociada con el PoAG se debe a cambios morfológicos y bioquímicos en la malla trabecular (TM), un tejido situado en el ángulo entre la córnea y el iris. La mayor parte del humor acuoso nutritivo sale por el segmento anterior del ojo a través de la TM. La pérdida progresiva de células de la TM y la acumulación de residuos extracelulares en la TM del ojo glaucomatoso conduce a un incremento de la resistencia a la salida de flujo acuoso (Lutjen-Drecoll y Rohen, 1996; Rohen, 1983; Rohen et al., 1993; Grierson y Calthorpe, 1988), elevando de esta manera la IOP. La IOP incrementada, así como otros factores, tales como la isquemia, causan cambios degenerativos en la cabeza del nervio óptico (ONA), conduciendo a una "excavación" progresiva de la ONA (Varma y Minckler, 1996; Hernández y Gong, 1996; Hernández et al. 1990; Hernández y Pena, 1997; Morrison et al., 1990) y la pérdida de células ganglionares y axones retinianos (Quigley et al., 2000; Quigley, 1999; Quigley et al., 1995; Kerrigan et al., 1997). Los mecanismos moleculares detallados responsables de los daños glaucomatosos en la TM, ONA y células ganglionares retinianas son desconocidos.
La terapia actual del glaucoma se centra en reducir la IOP, un factor de riesgo importante del desarrollo y progresión de glaucoma. Estas terapias reducen la IOP, pero no tratan directamente los mecanismos patogénicos, por lo que la enfermedad continúa progresando. Como mínimo la mitad de los pacientes con glaucoma no han sido diagnosticados, y cuando el glaucoma ha sido diagnosticado en estos pacientes, ya han perdido aproximadamente el 40% de sus células ganglionares retinianas. Por lo tanto, son necesarios procedimientos para la detección y diagnóstico precoces del glaucoma.
En vista de la importancia del glaucoma, y a lo inadecuado por lo menos en parte de los procedimientos de diagnóstico anteriores, resultaría deseable disponer de un procedimiento mejorado, más exacto para diagnosticar el glaucoma en sus primeros estadios. Además, resultaría deseable disponer de nuevos agentes terapéuticos que tratasen los mecanismos patogénicos glaucomatosos.
Sumario de la invención
La presente invención supera éstas y otras desventajas de la técnica anterior proporcionando procedimientos para el diagnóstico precoz del glaucoma.
En determinadas formas de realización específicas, la invención proporciona un procedimiento para diagnosticar el glaucoma en una muestra obtenida de una célula o líquido corporal mediante la detección de la expresión alterada de un gen miembro de una familia de proteínas morfogénicas óseas, Este procedimiento se proporciona en la reivindicación 1. Se proporcionan formas de realización ventajosas en la reivindicación dependiente 5.
En general, los procedimientos de la invención pueden incluir obtener una muestra de un individuo y extraer el ADN de dicha muestra. A continuación, se utilizan unos cebadores de PCR seleccionados para miembros específicos de la familia del gen de BMP con el fin de amplificar regiones relevantes del gen extraído, obteniendo un producto de PCR. El producto de PCR se resuelve mediante una técnica que identifica efectivamente las diferencias en la secuencia de ADN entre la forma normal y la mutada del gen específico de la familia de BMP que se está evaluando (el ADN extraído). Las diferencias identificadas entre las secuencias son indicativas de glaucoma.
La muestra de tejido o de líquido para la utilización en los procedimientos de la invención puede ser de células de sangre o de la boca.
Típicamente, las secuencias de cebador presentarán una longitud de entre aproximadamente 10, 15 ó 18 nucleótidos y aproximadamente 20, o aproximadamente 30 nucleótidos. Las secuencias más largas, por ejemplo de 40, 50, 80, 90, 95, 100, incluso hasta la longitud completa, resultan todavía más preferidos para determinadas formas de realización. Las longitudes de oligonucleótidos de por lo menos aproximadamente 18 a 20 nucleótidos se encuentran bien aceptadas por los expertos en la materia como suficientes para una hibridación suficientemente específica para que resulte útil como sonda molecular, tal como describe Lathe (1985), cuya referencia se incorpora específicamente a la presente memoria como referencia con este fin. Preferentemente, la secuencia de nucleótidos consta de 20 a 100 nucleótidos contiguos de SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39, SEC ID nº 41 SEC ID nº 43, SEC ID nº 45, SEC ID nº 47 o SEC ID nº 53. Se contempla asimismo que las secuencias de cebador consten de secuencias de por lo menos 10, 15 ó 18 nucleótidos contiguos a las secuencias de genes de receptor de BMP y de proteínas asociadas a BMP, las secuencias de las cuales son conocidas.
Resultan útiles como sondas de hibridación las moléculas de ácidos nucleicos con tramos de 10, 18, 20, 30, 50, 60, 65 o incluso hasta 100 nucleótidos aproximadamente, complementarios a cualquiera de entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39, SEC ID nº 41, SEC ID nº 43, SEC ID nº 45, SEC ID nº 47 o SEC ID nº 53. Los expertos en la materia reconocen que los cebadores o sondas con una longitud de nucleótidos de aproximadamente 18 nucleótidos proporcionan una hibridación altamente específica con una secuencia diana. El tamaño total del fragmento, así como el tamaño de los tramos complementarios, en última instancia dependerá del uso aplicado que se pretenda para el segmento particular de ácidos nucleicos. Los fragmentos más pequeños generalmente resultarán útiles en formas de realización de hibridación, en las que la longitud de la región complementaria puede ser variada, tal como entre aproximadamente 10, 18, 20 ó 30 y aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 nucleótidos, o incluso de longitud completa según las secuencias complementarias que se desee detectar.
En las formas de realización específicamente preferidas, los cebadores constan de secuencias contiguas de SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39, SEC ID nº 41, SEC ID nº 43, SEC ID nº 45, SEC ID nº 47 o SEC ID nº 53. En otras formas de realización preferidas, los cebadores consisten de secuencias contiguas a genes de receptor de BMP (dadas a conocer en Dijke et al., 1993; Astrom et al., 1999; Nohno et al., 1995, que se incorporan a la presente memoria en su totalidad como referencia) o de genes asociados a BMP, tales como la cordina (NCBI NM_029130), la gremlina (Murphy et al., 1999; McMahon et al., 2000), la folistatina (NCBI NM_003892) o bambi (NCBI NM_005791). Más preferentemente, los cebadores consisten de una secuencia contigua a SEC ID nº 3. En determinados aspectos, por lo menos algunos de los cebadores pueden incluir además un marcaje detectable.
En otras formas de realización, la invención proporciona un procedimiento para tratar el glaucoma mediante la administración a un paciente que lo necesita, de una composición que comprende una secuencia que consta por lo menos un compuesto seleccionado de entre el grupo constituidos por un agonista BMP2, un agonista BMP4, un agonista BMP5, un agonista de BMP7, un agonista de Smad 1/5, un antagonista de la cordina, un antagonista de la gremlina y un antagonista de la folistatina.
En aspectos adicionales, la presente invención proporciona un procedimiento para identificar un agente terapéutico para el tratamiento del glaucoma. Pueden identificarse agentes terapéuticos, por ejemplo mediante:
a)
la obtención de una primera composición que comprende una población de células recombinantes que expresan BMP-2A, BMP4, BMP5 o BMP7;
b)
la obtención de una sustancia candidata;
c)
la incubación de dicha composición y dicha sustancia candidata;
el ensayo de dicha composición para su capacidad de activar rutas de señalización de Smad inducidas por BMP y/o la expresión génica regulada por BMP; y la identificación de una sustancia candidata que inhiba o estimule estos efectos corriente abajo de la BMP.
Otro aspecto de la invención son kits diagnósticos que contienen secuencias de la presente invención y reactivos adecuados, tales como un marcaje detectable unido a una proteína, péptido o al anticuerpo mismo. Alternativamente, el marcaje detectable puede unirse a una segunda secuencia que se hibride selectivamente a una secuencia de la invención.
Entre las formas de realización relacionadas se incluyen kits terapéuticos que incluyen formulaciones farmacéuticamente aceptables de las secuencias de ácidos nucleicos o de secuencias de péptido o de proteína dadas a conocer en la presente memoria. Estos kits resultan útiles en la detección de la expresión alterada de genes y proteínas BMP en muestras clínicas para el diagnóstico del glaucoma.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos forman parte de la presente especificación y se incluían para demostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente invención. La invención podrá entenderse mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las formas de realización específicas presentadas en la presente memoria.
Fig. 1. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de BMP2A.
Fig. 2. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de BMP4.
Fig. 3. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de BMP5.
Fig. 4. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de BMP7.
Fig. 5. Ruta de señalización de proteína morfogénica ósea. Los dímeros de proteína morfogénica ósea (BMP) se une a un complejo de membrana compuesto de receptores 1 y 2 de BMP, que son serina/treonina quinasas. Los Smads (Smad1/Smad5) reguladores resultan fosforilados y se asocian con un co-Smad (Smad 4). Este complejo Smad resultante entra en el núcleo, en el que se asocia con factores de transcripción (TF) y regula la expresión génica. Las proteínas asociadas a la BMP actúan como antagonistas de la BMP añadiéndose a BMP y evitando la interacción de BMP con receptores de BMP.
Fig. 6. Expresión de BMP en células y tejidos de la TM humana. Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio de productos PCR de BMP procedentes de muestras de ADNc generados a partir de análisis de PCR-RT de la expresión de BMP en células (carriles 1 a 5) y tejidos de la TM (carriles 6 y 7) humanas. L = marcadores de pares de bases. C = carril de control negativo de PCR. Se utilizó la \beta-actina como control interno positivo de la PCR-RT.
Fig. 7. Expresión de receptores de BMP en células y tejidos de la TM humana. Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio de productos PCR procedentes de muestras de ADNc generados en análisis de PCR-RT de receptores de BMP en células (carriles 1 a 5) y tejidos de la TM (carriles 6 y 7) humana. L = marcadores de pares de bases. C = carril de control negativo de PCR. Se utilizó la \beta-actina como control interno positivo de la PCR-RT.
Fig. 8. Expresión de BMP en astrocitos de la ONA humano, tejidos de la ONA y en astrocitos cerebrales humanos. Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio de productos PCR procedentes de muestras de ADNc generados en análisis PCR-RT de la expresión de BMP en astrocitos de la ONA humana (carriles 1 a 5), tejido de la ONA (carril 6) y astrocitos cerebrales humanos (carril 7). L = marcadores de pares de bases. C = carril de control negativo de PCR. Se utilizó la \beta-actina como control interno positivo de PCR-RT.
Fig. 9. Expresión de BMP en líneas celulares de lámina cribosa humana. Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio de productos PCR procedentes de muestras de ADNc generados en análisis PCR-RT de células de lámina cribosa humana (carriles 1 a 9). L = marcadores de pares de bases. C = carril de control negativo de PCR. Se utilizó la \beta-actina como control interno positivo de PCR-RT.
Fig. 10. Expresión de receptores de BMP en astrocitos de ONA humana, tejidos de la ONA y astrocitos cerebrales humanos. Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio de productos PCR procedentes de muestras de ADNc generados en análisis PCR-RT de la expresión de receptores de BMP en astrocitos de cabeza de nervio óptico (ONA) humana (carriles 1 a 5), tejido de la ONA (carril 6) y astrocitos cerebrales humanos (carril 7). L = marcadores de pares de bases. C = carril de control negativo de PCR. Se utilizó la \beta-actina como control positivo de PCR-RT.
Fig. 11. Expresión de receptores de BMP en líneas celulares de lámina cribosa humana. Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio de productos PCR procedentes de muestras de ADNc generados mediante análisis de PCR-RT de células de lámina cribosa humana (carriles 1 a 9). L = marcadores de pares de bases. C = carril de control negativo de PCR. Se utilizó la \beta-actina como control positivo de PCR-RT.
Fig. 12. Inmunotransferencia western de BMP y de la expresión de receptores de BMP en cultivo de células de TM humana, astrocitos de cabeza de nervio óptico (ONA) y en células de lámina cribosa. Detección quimioluminiscente de proteínas BMP y receptores de BMP en células de malla trabecular humana (carriles 1 y 2), astrocitos de la ONA (carriles 3 y 4) y células de lámina cribosa (carriles 5 y 6). El tamaño de las proteínas se indica en kDa.
Fig. 13. Expresión de ARNm de proteínas asociadas a BMP en células de TM humana. Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio de productos PCR procedentes de muestras de ADNc generadas en análisis de PCR-RT de células de TM humana (carriles 1 a 5). L = marcadores de pares de bases. C = carril de control negativo de PCR. Se utilizó \beta-actina como control positivo interno de PCR-TM.
Fig. 14. Expresión de ARNm de proteínas asociadas a BMP en células de lámina cribosa humana y en astrocitos de la ONA. Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio de productos PCR procedentes de muestras de ADNc generadas en análisis PCR-RT de células de lámina cribosa (LC) (carriles 1 a 7) y en astrocitos (ONA) de la ONA (carriles 8 a 11). L = marcadores de pares de bases. C = carril de control negativo de PCR. Se utilizó \beta-actina como control positivo de PCR-RT.
Fig. 15. Ilustra la expresión incrementada del antagonista de BMP gremlina (CKTSF1B1) en células glaucomatosas de la TM. Se evaluó la expresión génica utilizando series génicas Affymetrix (chip génico Affymetrix U133A).
Descripción detallada de las formas de realización preferidas
Se ha propuesto que la malla trabecular desempeña un importante papel en el flujo normal del humor acuoso, y se ha planteado que constituye el sitio principal de resistencia al flujo hacia afuera en los ojos glaucomatosos. Las células de la malla trabecular humana (HTM) son células especializadas que revisten los canales de flujo externo por los que el humor acuoso sale del ojo. La alteración de la función sintética de las células puede encontrarse implicada en la patogénesis del POAG, glaucoma por esteroides y otros tipos de glaucoma.
A pesar de años de investigación intensiva, los mecanismos moleculares exactos responsables del daño glaucomatosa en el ojo no se conocen. La investigación recientemente ha sugerido que los factores de crecimiento podrían resultar importantes en el mantenimiento de la homeostasis normal en los tejidos oculares asociados al glaucoma, y que las alteraciones en el factor de crecimiento/receptores del factor de crecimiento podrían desempeñar un papel en la patogénesis del glaucoma. Los factores de crecimiento son una familia muy grande de polipéptidos que controlan el crecimiento y diferenciación celulares. Estas moléculas presentan una diversidad de efectos específicos de células sobre la expresión génica, composición y deposición de la matriz extracelular, la organización citoesquelética y la regulación de funciones celulares. La TM expresa una amplia diversidad de factores de crecimiento, receptores de factor de crecimiento (Tripathi et al., 1993a; Tripathi et al., 1993b; Tripathi et al., 1994a; Tripathi et al. 1994b; Wordinger et al., 1998; Wordinger et al., 1999), así como neurotrofina/factores neurotróficos y sus receptores (Liu et al., 2001; Wordinger et al., 2000). Los astrocitos de la ONA y las células de la lámina cribosa, dos tipos celulares de la cabeza del nervio óptico, expresan factores de crecimiento, neurotrofinas y sus receptores (Lambert et al., 2001; Pena et al., 1999). El humor acuoso también contiene una diversidad de factores de crecimiento, incluyendo FGF2, EGF, TGF\beta, HGF (Tripathi et al., 1996; Tripathi et al., 1991; Tripathi et al., 1992; Hu y Ritch, 2001), así como neurotrofinas (Chundru et al., 2000). Se ha informado de niveles incrementados de TGF\beta-2 y HGF de humor acuoso en pacientes de POAG (Tripathi et al., 1994c; Inatani et al., 2001; Picht et al., 2001). Pueden encontrarse implicados factores de crecimiento en el glaucoma mediante la alteración del desarrollo y/o funcionamiento normales de la TM y
de la ONA.
La presente invención surge en parte del reconocimiento de que las proteínas morfogénicas óseas (BMP) no sólo inducen la formación de hueso y de cartílago, sino que son citoquinas multifuncionales que presentan un amplio abanico de efectos sobre numerosos tipos celulares (Hogan 1996; Reddi, 1997) y se expresan en células tanto de la malla trabecular humana (HTM) como de la cabeza del nervio óptico (ONA) (Wordinger et al., 2002). Las BMP son miembros de la superfamilia TGF\beta y existen aproximadamente 15 a 20 genes de BMP en el hombre, 3 receptores de BMP y varias proteínas asociadas a BMP que funcionan como antagonistas de las BMP (Yamashita et al., 1996). Las BMP señalizan por medio de un complejo receptor que consiste en BMPR-I y BMPR-II. Se ha informado de que los miembros de la superfamilia TGF\beta y TGF\betaR (Agarwal et al., 1997; Lambert et al., 1997) y GDNF y GDNFR (Wordinger et al., 1999; Liu et al., 1999) se expresan en células tanto de la HTM como de la ONH.
Las BMP y receptores de BMP se expresan en tejidos oculares (Obata et al., 1999; You et al., 1999), aunque los trabajos anteriores se han centrado en el desarrollo ocular. La función de las BMP resulta importante en el desarrollo ocular debido a que la alteración dirigida de los genes que codifican las BMP en ratones conduce a defectos severos del desarrollo en la retina y el cristalino (Jena et al., 1997; Luo et al., 1995; Dudley et al., 1995). La BMP-2, BMP-4 y BMP-7 se encuentran implicadas en el desarrollo de la retina y del cristalino (Jena et al., 1997; Furuta y Hogan, 1998; Reddi, 2000; Trousse et al., 2001). BMP-6 y BMP-7 aparentemente también desempeñan un papel en la protección de las neuronas frente a daños hipoglucémicos o isquémicos (Nonner et al., 2001; Liu et al., 2001) y BMP2 se ha demostrado que potencia la expresión de neurotrofinas de células ganglionares (Zhang et al., 1998). Los ratones heterocigóticos knock-out haploinsuficientes para Bmp4 presentan fenotipos oculares entre los que se incluyen la disgénesis del segmento anterior, IOP elevada, y anormalidades del nervio óptico (Chang et al., 2001). Se dispone de información muy limitada sobre el papel de las BMP en el ojo postnatal huno.
Mohan y colaboradores (1998) informaron de que BMP-2 y BMP-4 y los receptores de las BMP se expresaban en células de la córnea adulta y sugirieron de que la función de las BMP podría incluir la proliferación y apoptosis de los queratocitos. You y colaboradores (1999) corroboraron este estudio e informaron asimismo de la expresión de BMP-3, BMP-5 y BMP-7 en células de epitelio corneal y estromales ex vivo y en cultivo. Informaron de que el nivel de transcripción de las BMP era más elevado en el estroma, mientras que el nivel para los receptores era más elevado en el cultivo de células epiteliales corneales.
Mediante la utilización de PCR-RT, los presentes inventores descubrieron ARNm para BMP, receptores de BMP llamados BMPR-IA, BMPR-IB y BMPR-II, así como las proteínas de unión a BMP gremlina, cordina, folistatina y bambi, en la HTM, lámina cribosa (LC) y líneas celulares de astrocitos y tejidos del ONH (Wordinger et al., 2002). Los presentes inventores descubrieron además que las células de HTM y ONH expresan proteínas BMP-2, BMP-4, BMP-5 y BMP-7.
El glaucoma se diagnostica mediante la caracterización de cambios genéticos en los genes de miembros de la familia de señalización de BMP. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "gen miembro de la familia de las proteínas morfogénicas óseas" y "familia de señalización de BMP" se refiere a todas las BMP, receptores de BMP y proteínas asociadas. La expresión "cambios genéticos" es bien conocida por los expertos en la materia. Existen numerosos ejemplos de enfermedades asociadas a cambios genéticos en genes específicos (por ejemplo ver Cummings, 1997; Strachan et al., 1996; Jorde et al., 1999). Los cambios genéticos en un gen específico (por ejemplo BMP) pueden determinarse utilizando una diversidad de técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, tales como SSCP, DGGE, ASO, RFLP, análisis de heterodúplex, CCM, PTT y corte por ARNasa (ver Birren et al., 1998).
El glaucoma puede estar causado por la expresión alterada de uno o más genes de la familia de las BMP en el ojo, que conduce a IOP elevada y/o a neuropatía óptica glaucomatosa. La expresión "expresión alterada del gen de BMP" se refiere a una expresión de este producto génico diferente de la normal. El término también puede referirse a alteraciones de la secuencia del gen o proteína. El gen normal de la BMP ha sido bien caracterizado (ver lo expuesto anteriormente), y la expresión de la BMP ha sido informada en una diversidad de tejidos, incluyendo la TM y el NOH. Los cambios genéticos en la región codificante de los genes de la familia de BMP puede alterar la función de estas proteínas. Los cambios genéticos fuera de la región codificante también pueden conducir al glaucoma.
Es bien conocido por los expertos en la materia que los "cambios en el exterior" de la región codificante de un gen específico resultan importantes en la regulación de la expresión génica. Por ejemplo, la región más arriba (5’) de la región codificante de la mayoría de genes es conocida como la región promotora que "promueve" y regula la expresión de ese gen. La región promotora contiene numerosas secuencias de nucleótidos reconocidas por diversos factores de transcripción y proteínas de unión a ADN que son responsables de la activación o represión de la expresión génica. Las regiones más abajo (3’) del gen puede determinar la poliadenilación del producto génico, regulando de esta manera el procesamiento y traducción del ARN en el producto génico.
La expresión alterada de los genes o mutaciones de las BMP en la secuencia de los genes que es indicativa de glaucoma puede detectarse utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, se contempla que pueda utilizarse un fragmento de ácidos nucleicos de prácticamente cualquier longitud, estando preferentemente limitada la longitud total por la facilidad de preparación y utilización en el protocolo pretendido. Las secuencias de ácidos nucleicos dadas a conocer en la presente memoria también pueden presentar utilidad como sondas o cebadores en formas de realización de hibridación de ácidos nucleicos. Como tales, se contempla que presenten utilidad particular los segmentos de ácidos nucleicos que comprenden una región de secuencia que consta de por lo menos una secuencia contigua de 14 nucleótidos de longitud que presenta la misma secuencia, o es complementaria, a una secuencia contigua de 14 nucleótidos de longitud de BMP-2A (SEC ID nº 1), BMP-4 (SEC ID nº 3), BMP-5 (SEC ID nº 5), BMP-7 (SEC ID nº 7), BMP-RIA (SEC ID nº 37), BMP-RIB (SEC ID nº 39), BMP-RII (SEC ID nº 41), cordina (SEC ID nº 43), gremlina (SEC ID nº 45), folistatina (SEC ID nº 47) o bambi (SEC ID nº 53). Las secuencias complementarias o idénticas contiguas de mayor longitud, por ejemplo las de aproximadamente 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1.000 nucleótidos (incluyendo todas las longitudes intermedias) e incluso hasta las secuencias de longitud completa de aproximadamente 1.547 nucleótidos (para BMP-2A), 1.946 nucleótidos (para BMP-4), 2.153 nucleótidos (para BMP-5) y 1.878 nucleótidos (para BMP-7), 2.932 nucleótidos (para BMP-RIA), 2.032 nucleótidos (para BMP-RIB), 3.611 nucleótidos (para BMP-RII), 3.561 nucleótidos (para cordina), 4.049 nucleótidos (para gremlina), 1.386 nucleótidos (para folistatina) y 1.523 nucleótidos (para bambi), también resultarán de utilidad en determinadas formas de realización.
Se pondrá fácilmente de manifiesto que las "longitudes intermedias", en este contexto, se refieren a cualquier longitud entre los intervalos indicados, tales como 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; incluyendo todos los números enteros comprendidos en los intervalos entre 200 y 500; entre 500 y 1.000, entre 1.000 y 2.000, hasta, e incluyendo, secuencias de 2.001, 2.002, 2.050, 2.051 y similares.
La capacidad de estas sondas de ácidos nucleicos y cebadores de hibridarse específicamente a secuencias codificantes y cebadores de BMP para amplificar específicamente secuencias de BMP permite que resulten de utilidad en la detección de la presencia de secuencias complementarias en una muestra dada. Sin embargo, se contemplan otros usos, incluyendo la utilización de la información de secuencia para la preparación de cebadores de especies mutantes, o de cebadores para la utilización en la preparación de otras construcciones genéticas.
Las moléculas de ácidos nucleicos con regiones de secuencia que consisten en tramos contiguos de nucleótidos de 10, 20, 30, 50 o incluso de 100 a 200 nucleótidos aproximadamente, idénticos o complementarios a BMP-2A (SEC ID nº 1), BMP4 (SEC ID nº 3), BMP-5 (SEC ID nº 5), BMP7 (SEC ID nº 7), BMP-RIA (SEC ID nº 37), BMP-RIB (SEC ID nº 39), BMP-RII (SEC ID nº 41), cordina (SEC ID nº 43), gremlina (SEC ID nº 45), folistatina (SEC ID nº 47) o bambi (SEC ID nº 53) se contemplan particularmente como sondas de hibridación para la utilización, por ejemplo, en ensayos de evaluación de SNP y de hibridación en fase sólida, además de transferencia southern y northern. Esto permitiría analizar genes estructurales o reguladores de BMP, tanto en tejidos como en células. El tamaño total del fragmento, así como el tamaño del tramo o tramos complementarios, dependerá finalmente del uso aplicado pretendido del segmento particular de ácidos nucleicos. Los fragmentos de tamaño más reducido generalmente resultarán útiles en formas de realización de hibridación, en las que la longitud de la región complementaria contigua puede variarse, tal como entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 nucleótidos, aunque pueden utilizarse tramos complementarios contiguos mayores, de hasta aproximadamente 1.547 nucleótidos (para BMP-2A), de 1.946 nucleótidos (para BMP-4), 2.153 nucleótidos (para BMP-5) y 1.878 nucleótidos (para BMP-7), 2.932 nucleótidos (para BMP-RIA), 2.032 nucleótidos (para BMP-RIB), 3.611 nucleótidos (para BMP-RII), 3.561 nucleótidos (para la cordina), 4.049 nucleótidos (para la gremlina), 1.386 nucleótidos (para la folistatina) y 1.523 nucleótidos (para bambi), según la longitud de las secuencias complementarias que se desee detectar.
La utilización de una sonda de hibridación de aproximadamente 10 a 14 nucleótidos de longitud permite la formación de una molécula dúplex que es tanto estable como selectiva. Las moléculas con secuencias complementarias contiguas a lo largo de tramos de más de 10 bases de longitud resultan generalmente preferidas, aunque, con el fin de incrementar la estabilidad y la selectividad del híbrido, y de esta manera mejorar la calidad y grado de las moléculas híbridas específicas obtenidas, generalmente resulta preferido diseñar moléculas de ácidos nucleicos con tramos complementarios al gen de 15 a 20 nucleótidos contiguos, o incluso de mayor longitud donde se desee.
Pueden seleccionarse sondas de hibridación de cualquier parte de cualquiera de las secuencias dadas a conocer en la presente memoria. Sólo se requiere revisar la secuencia proporcionada en la SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39, SEC ID nº 41, SEC ID nº 43, SEC ID nº 45, SEC ID nº 47 o SEC ID nº 53 y seleccionar cualquier parte continua de la secuencia, de entre aproximadamente 10 nucleótidos de longitud y la secuencia de longitud completa, que se desee utilizar como sonda o cebador. La elección de secuencias de sonda y cebador puede encontrarse gobernada por diversos factores, tales como, únicamente a título de ejemplo, que puede desearse utilizar cebadores que partan de los extremos de la secuencia total, o de los extremos de las secuencias codificantes del dominio funcional, con el fin de amplificar más ADN.
El procedimiento de selección y de preparación de un segmento de ácidos nucleicos que incluye una secuencia contigua de entre el interior de BMP-2A (SEC ID nº 1), BMP4 (SEC ID nº 3), BMP-5 (SEC ID nº 5), BMP7 (SEC ID nº 7), BMP-RIA (SEC ID nº 37), BMP-RIB (SEC ID nº 39), BMP-RII (SEC ID nº 41), cordina (SEC ID nº 43), gremlina (SEC ID nº 45), folistatina (SEC ID nº 47) o bambi (SEC ID nº 53) puede alternativamente describirse como la preparación de un fragmento de ácidos nucleicos. Evidentemente también pueden obtenerse fragmentos mediante otras técnicas, tales como, por ejemplo, mediante rotura mecánica o mediante digestión con enzimas de restricción. Pueden prepararse fácilmente segmentos o fragmentos pequeños de ácidos nucleicos mediante, por ejemplo, la síntesis directa del fragmento por medios químicos, como es práctica común utilizando un sintetizador automático de oligonucleótidos. Además, pueden obtenerse fragmentos mediante la aplicación de tecnología de reproducción de ácidos nucleicos, tal como la tecnología PCR^{TM} de las patentes US nº 4.683.202 y nº 4.682.195 (cada una incorporadas a la presente memoria como referencia), mediante la introducción de secuencias seleccionadas en vectores recombinantes para la producción recombinante, y mediante otras técnicas de ADN recombinante generalmente conocidas por los expertos en biología molecular.
De acuerdo con lo expuesto anteriormente, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden utilizarse por su capacidad de formar selectivamente moléculas dúplex con tramos complementarios de genes o ADNc de BMP. Dependiendo de la aplicación contemplada, se deseará utilizar grados diversos de selectividad de hibridación para conseguir grados diversos de selectivamente de la sonda hacia la secuencia diana. Para las aplicaciones que requieran selectividad elevada, típicamente se deseará utilizar condiciones relativamente restrictivas para formar los híbridos, por ejemplo se seleccionarán condiciones de salinidad relativamente reducida o de temperatura elevada, tal como las proporcionadas por NaCl 0,02 a 0,15 M a temperaturas de 50ºC a 70ºC. Estas condiciones selectivas toleran poco o ningún desapareamiento entre la sonda y la cadena molde o diana, y resultaría particularmente adecuada para examinar los genes de BMP.
Evidentemente, para algunas aplicaciones, por ejemplo en las que se desee preparar o identificar mutantes que utilizan una cadena cebadora mutante hibridada con un molde subyacente o en el caso de que se desee aislar secuencias codificantes de BMP de especies relacionadas, equivalentes funcionales, o similares, resultarán típicamente necesarias condiciones de hibridación menos restrictivas con el fin de permitir la formación del heterodúplex. En estas circunstancias, puede desearse utilizar condiciones tales como concentraciones salinas de 0,15 M a 1,0 M, a temperaturas comprendidas entre 20ºC y 55ºC. De esta manera pueden identificarse con facilidad especies de hibridación cruzada como señales de hibridación positiva con respecto a las hibridaciones de control. En cualquier caso, se aprecia generalmente que pueden obtenerse condiciones más restrictivas reduciendo las concentraciones de NaCl o mediante la adición de cantidades crecientes de formamida, que sirve para desestabilizar el dúplex híbrido de la misma manera que la temperatura incrementada. De esta manera, pueden manipularse con facilidad las condiciones de hibridación, y de esta manera resultarán generalmente en un procedimiento de selección dependiendo de los resultados
deseados.
En determinadas formas de realización, resultará ventajoso utilizar secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención en combinación con un medio apropiado, tal como un marcaje, para identificar la hibridación. Se conocen en la técnica una amplia diversidad de medios indicadores apropiados, incluyendo ligandos fluorescentes, radioactivos, enzimáticos u otros, tal como avidina/biotina, capaces de proporcionar una señal detectable. En formas de realización preferidas, resultará probablemente deseable utilizar un marcaje fluorescente o una etiqueta enzimática, tal como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en lugar de reactivos radioactivos u otros reactivos ambientalmente no deseables. En el caso de las etiquetas enzimáticas, se conocen sustratos indicadores colorimétricos que pueden utilizarse para proporcionar un medio visible para el ojo humano, o espectrofotométricamente para identificar la hibridación específica con muestras que contienen ácidos nucleicos complementarios.
En general, se contempla que las sondas de hibridación indicadas en la presente memoria resultarán útiles tanto como reactivos en la hibridación en solución, así como en formas de realización que utilizan una fase sólida. En las formas de realización que implican una fase sólida, el ADN (o ARN) de ensayo se adsorbe o fija de otra manera a una matriz o superficie seleccionada. Este ácido nucleico de una cadena fijo se somete a continuación a hibridación específica con sondas seleccionadas bajo condiciones deseadas. Las condiciones deseadas dependen de las circunstancias particulares basándose en los criterios particulares requeridos (dependiendo, por ejemplo, del contenido de G+C, el tipo de ácido nucleico diana, la fuente de ácido nucleico, el tamaño de la sonda de hibridación, etc.). Tras el lavado de la superficie hibridada para eliminar las moléculas de sonda unidas no específicamente, se detecta, o incluso se cuantifica, la hibridación específica, por medio del marcaje.
Se entenderá que la presente invención no se encuentra limitada a las secuencias particulares de ácidos nucleicos y de aminoácidos de BPM-2A (SEC ID nº 1), BMP4 (SEC ID nº 3), BMP-5 (SEC ID nº 5), BMP7 (SEC ID nº 7), BMP-RIA (SEC ID nº 37), BMP-RIB (SEC ID nº 39), BMP-RII (SEC ID nº 41), cordina (SEC ID nº 43), gremlina (SEC ID nº 45), folistatina (SEC ID nº 47) o bambi (SEC ID nº 53). Por lo tanto, los vectores recombinantes y segmentos aislados de ADN pueden incluir variadamente las regiones codificantes de BMP mismas, las regiones más arriba o más abajo de los genes, las regiones codificantes que portan alteraciones o modificaciones seleccionadas en la región codificante básica, o pueden codificar polipéptidos mayores que, sin embargo, incluyen regiones codificantes de BMP o pueden codificar proteínas o polipéptidos equivalentes biológicamente funcionales que presentan secuencias variantes de aminoácidos.
Los segmentos de ADN de la presente invención comprenden proteínas y polipéptidos BMP equivalentes biológicamente funcionales. Estas secuencias pueden surgir como consecuencia de la redundancia de codones y la equivalencia funcional que es conocido que se producen naturalmente dentro de las secuencias de ácidos nucleicos y las proteínas codificadas de esta manera. Alternativamente, pueden crearse proteínas o polipéptidos funcionalmente equivalentes por medio de la aplicación de tecnología de ADN recombinante, en la que pueden introducirse cambios la estructura de la proteína, basándose en consideraciones de las propiedades de los aminoácidos que se intercambian. Pueden introducirse cambios diseñados por el hombre mediante la aplicación de técnicas de mutagénesis sitio-dirigida, por ejemplo para introducir mejoras en la antigenicidad de la proteína o para someter a ensayo mutantes de BMP con el fin de examinar la actividad de unión a nivel molecular.
El agente terapéutico para el tratamiento del glaucoma puede ser: un péptido o proteína, un mimético de péptido, un oligonucleótido u oligonucleótido derivatizado, o molécula pequeña similar a fármaco, que en su totalidad afectan a uno o más aspectos de las rutas de la BMP ocular. Los agentes terapéuticos preferidos son los que son: (1) agonistas de BMP2, BMP4, BMP5 o BMP7, (2) antagonistas de cordina, gremlina, folistatina o bambi, y/o (3) agonistas de Smad1, Smad5 y/o Smad4.
El agente puede administrarse directamente al ojo (por ejemplo: gotas o pomadas oculares tópicas; dispositivos de liberación lenta en el fondo del ojo o implantados contiguos a las escleróticas o dentro del ojo; inyecciones periocular, conjuntival, subtenones, intracameral o intravitreal) o parenteralmente (por ejemplo: oralmente; inyecciones intravenosa, subcutánea o intramuscular,: administración dérmica, etc.) utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Los siguientes son ejemplos de posibles formulaciones incorporadas por la presente invención.
(a) Formulación ocular tópica % en peso
Agente que incrementa la expresión de BMP-4 ocular 0,01 a 2
HPMC 0,5
Cloruro sódico 0,8
BAC 0,01%
EDTA 0,01
NaOH/HCl cs para pH 7,4
Agua purificada cs para 100 ml 
\vskip1.000000\baselineskip
(b) Formulación ocular tópica % en peso
Antagonista de gremlina 0,01 a 2
HPMC 0,5
Cloruro sódico 0,8
BAC 0,01
EDTA 0,01
NaOH/HCl cs para pH 7,4
Agua purificada cs para 100 ml 
\vskip1.000000\baselineskip
(c) Formulación ocular tópica % en peso
Agonista de smad 1/5 0,01 a 2
HPMC 0,5
Cloruro sódico 0,8
BAC 0,01
EDTA 0,01
NaOH/HCl cs para pH 7,2
Agua purificada cs para 100 ml
Se contempla adicionalmente que los compuestos de la invención podrían formularse en dispositivos de inserción intraocular.
A. Ensayo de agentes terapéuticos
La presente invención resulta asimismo útil para el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos contra el glaucoma que se encuentren implicados en la ruta de señalización de la BMP (ver la fig. 5). Algunos ligandos selectivos de BMP se unen a receptores serina/treonina quinasa de la BMP de tipo I y II (BMP-RI y BMP-RII) transducen señales a través de las proteínas Smad. La señal de la BMP es propagada por Smads mediante interacciones proteína-proteína y proteína-ADN (Attisano y Tuen Lee-Hoeflich, 2001). Las proteínas reguladoras Smad1 y Smad5 se activan (mediante fosforilación) mediante receptores de BMP unidos a ligando (von Bubnoff y Cho, 2001). A continuación, estos Smads reguladores interaccionan con Smad4 para formar un complejo heteromérico que se trasloca hacia el núcleo. Este complejo puede activar o reprimir la transcripción de genes selectivos que reconocen este complejo transcripcional, dependiendo de que cofactores nucleares se encuentran presentes.
La ruta de señalización BMP/Smad se encuentra regulada negativamente por varios mecanismos. Determinadas proteínas de unión a BMP (tales como gremlina, BAMBI o folistatina) se unen a BMP e inhiben su interacción con receptores de la BMP. Además, existen proteínas Smad inhibidoras (por ejemplo Smad6 y Smad7) que se unen e inactivan los receptores de la BMP (Kowabata et al., 1998; Itoh et al., 2000; Miyazono, 2000). Los presentes inventores han descubierto que las células de la TM humana, los astrocitos de la ONH y las células de lámina cribosa expresan mensaje y proteína para el complejo receptor de la BMP. De esta manera, estas células podrían responder a ligandos endógenos de la BMP.
Pueden utilizarse diversos procedimientos para descubrir nuevos agentes terapéuticos contra el glaucoma, y estas técnicas son bien conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, pueden descubrirse agentes péptido o miméticos de péptido que actúan como agonistas o inhibidores de las BMP a través del modelado molecular de estructuras receptoras de la BMP (Nickel et al., 2001). La transducción de señales de BMP implica seleccionar grupos de proteínas Smad (Kawabata et al., 1998; Itoh et al., 2000; Attiseno et al., 2000). Pueden descubrirse agonistas seleccionados de BMP y de Smad utilizando ensayos basados en células. La célula experimental debe expresar el receptor o receptores de BMP apropiados y poseer la ruta apropiada de señalización de la BMP. Debido a que uno de los efectos principales de la señalización de la BMP es la alteración de la expresión génica, pueden descubrirse agonistas de BMP y de Smad mediante cribado para genes inducidos por BMP. La inducción de genes regulados por BMP puede asimismo someterse a ensayo mediante la cuantificación de niveles de ARNm utilizando PCR-RT cuantitativa (Wang et al., 2001), micromatrices de ADN o constructos de gen informador. Existen inhibidores naturales de la señalización de la BMP, las proteínas de unión a BMP (también conocidas como proteínas asociadas a BMP), tales como la cordina, la gremlina y la folistatina. Pueden descubrirse antagonistas de las proteínas inhibidoras utilizando ensayos de unión a ligandos. Por ejemplo, pueden añadirse agentes de ensayo a gremlina recombinante purificada, y los agentes que se unen a la gremlina se identifican utilizando una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la materia. Para determinar si estos
agentes son antagonistas de la gremlina, se utiliza un ensayo basado en células similar al indicado anteriormente.
Se contempla que se utilice cualquier modelo de cribado in vitro e in vivo conjuntamente con la presente invención para identificar nuevas terapias para el glaucoma centradas en la familia de genes de la BMP. Estos modelos son bien conocidos por los expertos en la materia y su práctica se ha convertido en rutinaria. Pueden diseñarse péptidos o miméticos de péptido de tamaño reducido basados en el conocimiento de la estructura/función de la BMP, BMPR y/o productos génicos de proteína de unión a BMP. Pueden utilizarse ensayos de unión a ligando para detectar moléculas pequeñas que se unen a BMP, BMPR o proteínas de unión a BMP. Los ensayos basados en células pueden detectar los efectos de diversos agentes sobre las rutas de señalización de la BMP. Las líneas celulares knock-in que contienen promotores de genes de la familia de la BMP acoplados a un gen informador pueden generarse para buscar agentes que alteran la expresión de genes de miembros de la familia de la BMP. Estos ensayos pueden utilizarse para identificar moléculas tanto agonistas como antagonistas. Pueden utilizarse ensayos ex vivo, tales como segmentos anteriores cultivados en perfusión procedentes de ojos humanos (Clark et al., 1995a; Pang et al., 2000), para examinar los efectos de agentes sobre la IOP y sobre la señalización de la BMP en tejido de la RT. Pueden generase modelos de roedor del glaucoma utilizando técnicas bien conocidas para crear cepas estables de ratón y de rata transgénicas, knockout o knock-in para miembros de la familia de la BMP. Estos modelos de roedor pueden utilizarse para cribar para agentes que alteran el fenotipo o fenotipos similares a glaucoma (por ejemplo la tonometría para evaluar los efectos sobre la IOP, la histología para evaluar los efectos sobre la neurología óptica glaucomatosa).
B. Kits
La presente invención proporciona procedimientos, composiciones y kits para la detección precoz del glaucoma. Los kits pueden contener un segmento de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido o proteína BMP. El kit puede contener adicionalmente reactivos para detectar una interacción entre una muestra y un ácido nucleico o péptido de la presente invención. El reactivo proporcionado puede marcarse radioactivamente, fluorescentemente o enzimáticamente. El kit puede contener un agente marcado radioactivamente conocido capaz de unirse o de interaccionar con un ácido nucleico o péptido o proteína de la presente invención.
El reactivo del kit puede proporcionarse en forma de una solución líquida, unido a un soporte sólido o en forma de polvos secos. Preferentemente, en el caso de que el reactivo se proporcione en una solución líquida, ésta es una solución acuosa. Preferentemente, en el caso de que el reactivo proporcionado se una a un soporte sólido, el soporte sólido puede ser un medio cromatográfico, presentando una placa de ensayo una pluralidad de pocillos, o un portaobjetos de microscopía. En el caso de que el reactivo se proporcione en forma de polvos secos, estos pueden reconstituirse mediante la adición de un solvente adecuado, que puede proporcionarse.
Todavía, en otras formas de realización, la presente invención se refiere a procedimientos diagnósticos y kits asociados para el diagnóstico del glaucoma. Se propone que se utilicen los péptidos y ácidos nucleicos asociados a BMP de la invención para detectar polimorfismos o mutaciones en los ácidos nucleicos de la BMP procedentes de muestras del paciente. En general, entre estos procedimientos se incluye, en primer lugar, obtener una muestra que se sospecha que contiene este polimorfismo o mutación, poner en contacto la muestra con un péptido o ácido nucleico de la presente invención, según sea el caso, bajo condiciones efectivas para permitir la formación de un complejo, y detectar a continuación la presencia del complejo.
En general, la detección de la formación de complejo se conoce bastante bien en la técnica y puede conseguirse mediante la aplicación de numerosos enfoques. Por ejemplo, la presente invención contempla la aplicación de ELISA, RIA, técnicas de fluorescencia indirecta y similares. Generalmente, la formación de complejo se detecta mediante la utilización de un marcaje, tal como un marcaje radioactivo o una etiqueta enzimática (tal como la fosfatasa alcalina, la peroxidasa de rábano picante, o similar). Evidentemente, pueden apreciarse ventajas adicionales de la utilización de un ligando secundario de unión.
Los ejemplos siguientes son representativos de las técnicas utilizadas por los inventores para llevar a cabo aspectos de la presente invención. Debe apreciarse que, aunque estas técnicas son ejemplares de formas de realización preferidas para la práctica de la invención, los expertos en la materia, a la luz de la presente exposición, apreciarán que pueden introducirse numerosas modificaciones sin apartarse del espíritu y el alcance pretendido de la invención.
Ejemplo 1
Cultivo celular: se generaron células de la TM y de la ONA a partir de ojos de donantes tal como se encuentra descrito (Steely et al., 1992; Steely et al., 2000; Wilson et al., 1993; Clark et al., 1994; Clark et al., 1995b; Clark et al., 1995c; Clark et al., 1996; Clark et al., 2001a; Clark et al., 2001b; Dickerson et al., 1998; Wordinger et al., 1998; Wordinger et al., 1999; Wordinger et al., 2000; Wordinger et al., 2002; Lambert et al., 2001; Agarwal et al., 1999; Liu et al., 2001). Se cultivaron células de la TM a partir de explantes de TM de donantes de edades comprendidas entre 6 días y 90 años. Se generaron células de astrocitos de cabeza de nervio óptico humano y de células de lámina cribosa (LC) a partir de cabezas de nervio óptico cuidadosamente diseccionadas (donantes de edades comprendidas entre 2 días y 90 años) y caracterizadas según trabajos anteriores (Lambert et al., 2001; Clark et al., 1995a). Las células se cultivaron hasta la confluencia en los medios siguientes: medio F10 de Ham (JRH Biosciences, Lenexa, KS) que contenía suero de feto bovino al 10% (HyClone, Logan, UT) y antibióticos (Gibco BRL-Life Technologies, Grand Island, NY) para las células de la RT; medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, HyClone) que contenía FBS al 10% paras las células de LC; y medio de cultivo de astrocitos (AGM, Clonetics, San Diego, CA) que contenía FBS al 5% para los astrocitos de la ONA.
PCR-RT: también se diseccionaron tejidos de TM y de ONA procedentes de ojos de donante (Wordinger et al., 1998; Wang et al. 2001). Se extrajo ARN total de las células y tejidos de TM y de ONA utilizando extracción con TRIzol (Gibco BRL-Life Technologies) y se preparó ADNc mediante procedimientos estándar de transcripción inversa (Wordinger et al., 1998; Wordinger et al., 1999; Wordinger et al. 2000; Wordinger et al. 2002). Se diseñaron cebadores de PCR utilizando el programa informático Oligos 4.0 (ver los pares de cebadores en la Tabla 1). Todos los pares de cebadores se diseñaron de manera que la amplificación de secuencias de ADN genómico potencialmente contaminado produjera productos PCR de ARNm que fueran sustancialmente de mayor tamaño del esperado debido a que las secuencias de intrón que se extrajeron durante el procesamiento del ARN se incluirían en el ADN genómico. Los cebadores de PCR de la \beta-actina, AGGCCAACCGCGAGAAGATGACC (corriente arriba) y GAAGTCCAGGGCGACG
TAGCAC (corriente abajo), con una temperatura de hibridación de 55ºC rindieron un producto de PCR de 350 pb.
Se llevaron a cabo reacciones de PCR tal como se ha descrito (Wordinger et al., 1998; Wordinger et al., 1999; Wordinger et al., 2000; Lambert et al., 2001; Wordinger et al., 2002) utilizando anticuerpo de taq start de inicio caliente con las condiciones de ciclo siguientes: 2 minutos a 94ºC, 2 minutos a 92ºC, y 40 ciclos de 30 segundos a la temperatura de hibridación óptima, extensión durante 90 segundos a 72ºC y desnaturalización durante 45 segundos a 92ºC. Se examinaron los productos de PCR amplificados mediante electroforesis horizontal en geles de 1,5% de agarosa. Con el fin de garantizar la especificidad de los productos de PCR-RT, se llevó a cabo análisis de transferencia southern con sondas diseñadas utilizando Oligo 4.0 que se hibridaban a una región dentro del producto de PCR amplificado. Se secuenciaron los productos de PCR para verificar la especificidad de las reacciones de PCR. La Tabla 2 lista los miembros de la familia de BMP expresados en TM y ONA humanas.
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TABLA 1 Pares de cebadores de PCR, temperatura de hibridación y tamaño de amplímero de las BMP
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TABLA 2 Miembros de la familia de BMP que se expresan en la TM y en la ONA humanas
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Inmunotransferencia western: se extrajo proteína a partir de un cultivo celular utilizando tampón de lisis, y las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante previamente a la transferencia electroforética a membranas de nitrocelulosa (Lambert et al., 2001). Las membranas se bloquearon con 5% de leche (para BMP) o 3% de gelatina (para BMPR) y se incubaron con los anticuerpos primarios siguientes: BMP2, BMP4, BMP5, BMP7 (en su totalidad de Santa Cruz, Santa Cruz, CA) o BMP-RIA, BMP-RIB, BMP-RII (de Jackson Immuno Research, West Grove, PA). Las membranas se lavaron, se incubaron con anticuerpos secundarios (IgG de cabra antiratón-peroxidasa de rábano picante para las BMP, Santa Cruz; anticabra de burro-peroxidasa de rábano picante para los receptores de BMP, Jackson Immuno Research) y se revelaron utilizando el sistema de inmunodetección de quimioluminiscencia WesternBreeze (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Expresión de ARNm de BMP, de BMPR en células y tejidos de TM humana: los productos de amplificación esperados de los pares de cebadores de BMP-2, BMP-4, BMP-5 y BMP-7 en células y tejidos de TM humana se muestran en la fig. 6. Las transferencias southern con sondas específicas verificaron que eran los productos de PCR esperados. Todas las líneas celulares y tejidos de TM humana expresaron el mensaje para BMP-2, BMP-4 y BMP-7. Sin embargo, el mensaje para BMP-5 se presentó en cantidades reducidas o indetectables en las muestras de tejido de TM humana (fig. 6, carriles 6 y 7). Las reacciones de control sin ADNc no resultaron en productos de amplificación, indicando que los reactivos y cebadores se encontraban libres de contaminación por ADN o ARN (fig. 6, carril C).
La fig. 7 muestra los productos de amplificación de tamaño esperado para los pares de cebadores de BMP-RIA, BMP-RIB y BMP-RII en células y tejidos de TM humana. Todas las células y tejidos de TM humana expresaron el mensaje para los complejos de receptores de BMP. Las transferencias southern con sondas específicas verificaron que eran los productos de PCR esperados. Se detectó un producto de amplificación alternativo (de 350 pb) en la reacción de BMP de la BMP-RII. El producto de amplificación alternativo se encontraba presente en todas las células y tejidos de TM humana. Esta banda alternativa se está identificando en la actualidad para determinar si es una forma procesada alternativa del receptor. Las reacciones de control sin ADNc no resultó en productos de amplificación (fig. 7, carril C), indicando que los reactivos y cebadores se encontraban libres de contaminación con ADN o ARN.
Expresión de ARNm de BMP y de receptor de BMP en células y tejidos de ONA humana: se muestran en la fig. 8 los productos de amplificación del tamaño esperado para los pares de cebadores de BMP-2, BMP-4, BMP-5 y BMP-7 en astrocitos de ONA humana y tejidos de ONA. Todos los astrocitos de ONA y tejidos de ONA expresaron el mensaje para la BMP respectiva. Se utilizaron los astrocitos cerebrales humanos como línea celular de control positivo. Las transferencias southern con sondas específicas verificaron que eran los productos de PCR esperados. Con la excepción de BMP-2, todas las demás BMP fueron expresadas por los astrocitos cerebrales humanos (fig. 8, carril 7). Las reacciones de control sin ADNc no resultaron en productos de amplificación (fig. 8, carril C), indicando que los reactivos y cebadores se encontraban libres de contaminación con ADN o ARN.
La fig. 9 muestra los productos de amplificación de tamaños esperados para los pares de cebadores de BMP-2, BMP-4, BMP-5 y BMP-7 en cultivo de células de LC humana. Todas las líneas celulares de LC expresaron el mensaje para cada BMP. Las transferencias southern con sondas específicas verificaron que eran los productos de PCR esperados. Las reacciones de control sin ADNc no resultaron en productos de amplificación (fig. 9, carril C), indicando que los reactivos y cebadores se encontraban libres de contaminación con ADN o ARN.
Los productos de amplificación del tamaño esperado de las parejas de cebadores de BMP-RIA, BMP-RIB y BUT-RII en astrocitos de ONA humana y de tejidos de ONA se muestran en la fig. 10. Todas las líneas celulares de astrocitos de ONA expresaron el mensaje para BMP-RIA y BMP-RIB. Las sondas southern con sondas específicas verificaron que eran los productos de PCR esperados. Con la excepción del tejido de ONA (fig. 10, carril 6), se expresó BMP-RII en todas las líneas celulares de astrocitos de ONA. Aparentemente, el mensaje para todas las BMP (Fig. 10, carril 7) es una discrepancia respecto a la expresión de la BMP-RII en tejido de ONA y en líneas celulares de ONA. La expresión reducida de tejido de ONA podría reflejar un nivel reducido de expresión. Las reacciones de control sin ADNc no resultaron en productos de amplificación (fig. 5, carril C), indicando que los reactivos y cebadores se encontraban libres de contaminación con ADN o ARN.
La fig. 11 muestra los productos de amplificación de tamaño esperado para los pares de cebadores de BMP-RIA, BMP-RIB y BMP-RII en cultivo de células de LC humana. Todas las líneas celulares de LC expresaron el mensaje para cada receptor de BMP. Las transferencias southern con sondas específicas verificaron que eran los productos de PCR esperados. Las reacciones de control sin ADNc no resultaron en productos de amplificación (fig. 11, carril C), indicando que los reactivos y cebadores se encontraban libres de contaminación con ADN o ARN.
Expresión de proteínas BMP y proteínas receptoras de BMP en células y tejidos de TM y ONA humanas: la fig. 12 representa la detección de inmunotransferencia quimioluminiscente de las proteínas BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-7, BMP-RIA, BMP-RIB y BMP-RII en células y tejidos de TM y ONA humanas. Todas las líneas celulares estudiadas expresaron las proteínas BMP respectivas. Las proteínas BMP se detectaron en las líneas celulares que presentan los pesos moleculares siguientes: 54 a 56 kDa para BPM-2, 25 a 27 kDa para BMP-4, 55 a 57 kDa para BMP-5 y 77 kDa para BMP-7. Se detectaron bandas múltiples para BMP-2 y BMP-4, que con toda probabilidad representan formas glucosiladas y parcialmente glucosiladas de estas BMP, tal como se ha observado en otros estudios. Sin embargo, los presentes inventores no llevaron a cabo estudios de glucosilación, al encontrarse fuera del alcance del presente estudio. Se detectaron las proteínas receptoras de BMP en líneas celulares con los pesos moleculares siguientes: 38 kDa para BMP-RIA, 64 kDa para BMP-RIB, y 57 kDa para BMP-RII. Se detectaron bandas múltiples para BMP-RIB y BMP-RII en las células de TM, que con toda probabilidad representan formas glucosiladas y parcialmente glucosiladas, tal como se ha observado en otros estudios. Los niveles de expresión de proteínas para los receptores de BMP eran aparentemente más reducidos en las células de TM que en las células de ONA. Por ejemplo, no se detectó BMP-RII en células de TM y la BMP-RIB se encontraba a niveles muy reducidos.
Expresión de ARNm de proteínas asociadas a BMP en cultivo de células de TM humana y en células de ONA humana: en la fig. 13 se muestran productos de amplificación de tamaño esperado para los pares de cebadores de proteínas asociadas a BMP en líneas celulares de TM humana. Las líneas celulares de TM humana expresaron el mensaje de DRM (gremlina), cordina, folistatina y NMA (BAMBI). Las transferencias southern con sondas específicas verificaron que eran los productos de PCR esperados. No se observaron diferencias aparentes en la expresión del mensaje entre líneas celulares. Todas las células de TM humana examinadas no consiguieron expresar el mensaje para las proteínas asociadas a BMP llamadas nogina y Cer-1. Las reacciones de control sin ADNc no resultaron en productos de amplificación, indicando que los reactivos y cebadores se encontraban libres de contaminación con ADN o ARN.
Los productos de amplificación de tamaño esperado para los pares de cebadores de proteínas asociadas a BMP en astrocitos de ONA y en líneas celulares de LC se muestran en la fig. 14. Todos los astrocitos de ONA y las líneas celulares de LC expresaron el mensaje para DRM (gremlina), folistatina y NMA (BAMBI). Las transferencias southern con sondas específicas verificaron que eran los productos de PCR esperados. La mayoría de las células de LC y de los astrocitos de ONA expresaron el mensaje para cordina. Todos los astrocitos de ONA humana y de las células de LC examinadas no consiguieron expresar ARNm para las proteínas asociadas a BMP llamadas nogina y Cer-1. Las reacciones de control sin ADNc no resultaron en productos de amplificación, indicando que los reactivos y los cebadores se encontraban libres de contaminación con ADN o ARN.
La fig. 15 muestra un nivel incrementado de expresión de los antagonistas de BMP llamados gremlina (CKTSF1B1) en células glaucomatosas de TM. Se evaluó la expresión génica utilizando series génicas Affymetrix (chip génico Affymetrix U 133A).
Todas las composiciones y/o procedimientos dados a conocer y reivindicados en la presente invención pueden llevarse a cabo y ejecutarse sin experimentación indebida a partir de la presente exposición. Aunque las composiciones y procedimientos de la presente invención han sido descritos en términos de las formas de realización preferidas, resultará evidente para los expertos en la materia que pueden introducirse variaciones en las composiciones y/o procedimientos y en las etapas o en la secuencia de etapas del procedimiento descrito en la presente memoria sin apartarse del concepto y alcance de la invención. Más específicamente, resultará evidente que determinados agentes que se encuentran relacionados tanto química como estructuralmente pueden sustituirse con los agentes descritos en la presente invención, consiguiendo resultados similares. Todas las sustituciones y modificaciones evidentes para los expertos en la materia se considera que se encuentran comprendidos dentro del alcance y del concepto de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Referencias
Las referencias siguientes, en el grado en que proporcionan detalles de procedimiento ejemplificativos u otros detalles suplementarios a los proporcionados en la presente memoria.
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<160> 54
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 1547
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tgccacctga gaaaggctac 
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20 
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acagacaggc tcatccgact 
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20 
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\hfill
20 
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<400> SEC ID nº 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atagtgagcc cttcccacct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> SEC ID nº 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatgaacaga cccgcatttc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatcgccact ccagctacat c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggcacggca atgacc 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2932
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 37
\vskip1.000000\baselineskip
20
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 532
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 38
\vskip1.000000\baselineskip
22
23
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2032
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 39
\vskip1.000000\baselineskip
25
26 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 502
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 40
27
28
29 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3611
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 41
\vskip1.000000\baselineskip
30
31
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1038
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 42
\vskip1.000000\baselineskip
33
34
35
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3561
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 43
\vskip1.000000\baselineskip
37
38
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 44
\vskip1.000000\baselineskip
40 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4049
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 45
\vskip1.000000\baselineskip
41
42 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 46
\vskip1.000000\baselineskip
43 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1386
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 47
\vskip1.000000\baselineskip
44
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 317
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 48
\vskip1.000000\baselineskip
46
47 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 699
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 49
\vskip1.000000\baselineskip
48 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 50
\vskip1.000000\baselineskip
50 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 804
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 51
\vskip1.000000\baselineskip
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 267
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 52
\vskip1.000000\baselineskip
52
53 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1523
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 53
\vskip1.000000\baselineskip
54
55 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 260
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID nº 54
\vskip1.000000\baselineskip
56
57

Claims (5)

1. Procedimiento para el diagnóstico del glaucoma en una muestra obtenida de una célula o de un líquido corporal mediante la detección de la expresión alterada de un gen miembro de la familia morfogénica ósea, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:
a)
extraer ADN de una muestra de tejido o de líquido obtenida de un paciente del que se sospecha que presenta un glaucoma;
b)
obtener una pluralidad de cebadores de PCR, en el que dichos cebadores comprenden cada uno una secuencia constituida por de 18 a 1.547 nucleótidos contiguos de SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39, SEC ID nº 41, SEC ID nº 43, SEC ID nº 45, SEC ID nº 47 o SEC ID nº 53;
c)
amplificar regiones del ADN extraído utilizando dichos cebadores para obtener un producto de PCR;
d)
resolver el producto de PCR; y
e)
identificar las diferencias entre la secuencia del ADN extraído amplificado y la secuencia del cebador;
en el que una diferencia entre la secuencia amplificada y el cebador es diagnóstica de glaucoma.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha muestra de tejido de o líquido es sangre o células bucales.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los cebadores comprenden secuencias constituidas por de entre 20 a 100 nucleótidos contiguos de SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39, SEC ID nº 41, SEC ID nº 43, SEC ID nº 45, SEC ID nº 47 o SEC ID nº 53.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los cebadores comprenden secuencias constituidas por de 20 a 50 nucleótidos contiguos de SEC ID nº 3.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el producto de PCR se resuelve mediante SSCP, DGGE, ASO o RFLP.
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