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KR101552735B1 - 씨디22에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도 - Google Patents

씨디22에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR101552735B1
KR101552735B1 KR1020097013205A KR20097013205A KR101552735B1 KR 101552735 B1 KR101552735 B1 KR 101552735B1 KR 1020097013205 A KR1020097013205 A KR 1020097013205A KR 20097013205 A KR20097013205 A KR 20097013205A KR 101552735 B1 KR101552735 B1 KR 101552735B1
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헤이디 엔. 레블랑크
리챠드 쎄올리스
아스나 마수드
마크 야마나까
키라 디. 젠스
사라 아르. 드위긴스
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메다렉스, 엘.엘.시.
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Abstract

본 발명은 고친화도로 CD22에 특이적으로 결합하는 분리된 단일클론 항체, 특히 인간 단일클론 항체를 제공한다. 또한, 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 본 발명의 항체를 발현하기 위한 방법을 제공한다. 또한 본 발명의 항체를 포함하는, 항체-파트너 분자 접합체, 이중특이적 분자 및 약제학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 CD22를 검출하는 방법, 뿐만 아니라 본 발명의 항-CD22 항체를 이용하여 다양한 암 및 염증성 및 자가면역성 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
항-CD22 항체, 항체-파트너 접합체, 종양 세포, 세포독소

Description

씨디22에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도{HUMAN ANTIBODIES THAT BIND CD22 AND USES THEREOF}
본 발명은 고친화도로 CD22에 특이적으로 결합하는 분리된 단일클론 항체, 특히 인간 단일클론 항체를 제공한다. 또한, 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 본 발명의 항체를 발현하기 위한 방법을 제공한다. 또한 본 발명의 항체를 포함하는, 항체-파트너 분자 접합체, 이중특이적 분자 및 약제학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 CD22를 검출하는 방법, 뿐만 아니라 본 발명의 항-CD22 항체를 이용하여 다양한 암 및 염증성 및 자가면역성 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
CD22는 시알로어드헤신(sialoadhesin) 종의 세포-표면 타입 I 당단백질이다. 또한 CD22는 다른 이름들 중에 BL-CAM, B3, Leu-14 및 Lyb-8로서 기술 분야에 공지되어 있다. CD22는 처음에 항체 항-S-HCL-1(Schwarting, R. 등 (1985) Blood 65:974-983), HD39 (Dorken, B. 등 (1986) J. Immunol . 136:4470-4479) 및 RFB4 (Campana, D. 등 (1985) J. Immunol . 134:1524-1530)에 의하여 특징지워졌다. CD22 는 알파2,6-연결 시알산을 지닌 리간드에 결합하는 렉틴-유사성(lectin-like) 접착 분자로서 그리고 B 세포 항원 수용체(B cell antigen receptor, BCR) 시그널링의 조절제로서 확립되어 왔다. 구조적으로, 존재하는 CD22의 몇 개의 접합 변이체가 있으나, 인간 내에서의 우세한 형태는 일곱 개의 면역글로불린-유사성 도메인을 함유하는 세포외 영역을 가진다.
CD22는 B 림프구에 의하여 특이적으로 발현된는 것으로 보여지며, B 림프구 활성화의 음성형 조절제로서 기능적으로 중요하다(Nitschke, L. (2005) Curr . Opin. Immunol . 17:290-297 및 Tedder, T.F. 등 (2005) Adv . Immunol . 88:1-50에 의하여 검토됨). 알파2,6-연결 시알산 리간드와 반응하지 않는 변이체 CD22 분자를 발현하는 유전자-표적화 마우스를 이용했던 연구에서, 소정의 기능들(성숙한 B 세포 상의 세포 표면 CD22, IgM 및 MHC 클래스 II의 발현, 주변 영역 B 세포군의 유지, 최적 B 세포 항원 수용체-유도성 증폭 및 B 세포 전환 속도와 같은)이 CD22 리간드 결합에 의하여 조절되었으나, 반면에 다른 기능들(CD22 인산화, BCR 결찰 후 칼슘 동원의 CD22 음성형 조절, CD22으로의 SHP-1의 모집 및 B 세포 이동)은 리간드 결합을 요구하지 않음이 결정되었다.(Poe, J.C. 등 (2004) Nat . Immunol . 5:1078-1087).
CD22는 B 세포의 과도자극을 막는 신호 문턱값(threshold)을 설정함으로써 BCR 시그널링을 하위조정하는 억제성 공동-수용체라고 여겨진다. 억제성 공동-수용체의 활성화는 세포질 ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motifs) 상에서의 인산화에 의하여, 그 다음 티로신 포스파타아제 SHP-1 또는 지질 포스파타 아제 SHIP 의 모집에 의하여 일어난다(Nitschke, L. (2005) Curr . Opin . Immunol . 17:290-297에 의하여 검토됨). 추가적으로, CD22는 BCR 결찰 후 기본 시그널링 문턱값을 조절하고 Src-종 키나아제 활성을 강화시키는 CD19/CD21-Src-종 단백질 티로신 키나아제(protein tyrosine kinase, PTK)를 제어하는 조절 루프에서 중심 역할을 하는 것으로 발견되었다(Tedder, T.F. 등 (2005) Adv . Immunol . 88:1-50에서 검토됨).
B 세포 악성종양의 약 60-80%는 CD22를 발현하며, 그렇게 함으로써 그것을 수동적 면역치료의 강력한 표적으로 만든다(예, Cesano, A. 및 Gayko, U. (2003) Semin. Oncol . 30:253-257 참조). 또한, CD22의 표적화를 통한 B 세포 활성의 선택 조정은 자가면역 질환을 치료하기 위한 수단으로서 제안되었다(예, Steinfeld, S.D. 및 Youinou, P. (2006) Expert . Opin . Biol . Ther . 6:943-949 참조). 인간화 항-CD22 단일클론 항체인 에프라투주맵(epratuzumab)이 기술되었다(Coleman, M. 등 (2003) Clin . Cancer Res . 9:3991S-3994S). 그러나, 추가의 항-CD22 시약이 여전히 요구된다.
<발명의 개요>
본 발명은 인간 CD22에 결합하고 많은 원하는 성질들을 나타내는, 분리된 단일클론 항체, 특히 인간 단일클론 항체를 제공한다. 이러한 성질들은 CD22에 대한 고친화도 결합, CD22+ 세포로 내재화하는 능력, 항체 의존성 세포독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)을 조절하는 능력, B 세포 수용체(B cell receptor, BCR) 자극에 의하여 유도된 라모스 세포의 세포 사멸을 증진시키는 능력, 및/또는 세포독소에 접합될 때 생체내에서 CD22-발현 세포의 성장을 억제하는 것을 포함한다. 본 발명의 항체는, 예를 들어, CD22+ B 세포 악성 종양을 치료 및/또는 다양한 염증성 또는 자가면역성 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
한 관점에서, 본 발명은 분리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부에 관한 것인데, 상기 항체는 인간 CD22에 결합하고 다음의 성질 중 적어도 하나를 나타낸다:
(a) CD22+ 세포로 내재화하고;
(b) CD22+ 세포에 대항하여 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 나타내며;
(c) B 세포 수용체(BCR) 자극에 의하여 유도되는 라모스 세포의 세포 사멸을 증진시키고; 및
(d) 세포독소에 접합될 때 생체내에서 CD22-발현 세포의 성장을 억제한다.
다른 구체예에서, 항체는 성질 (a), (b), (c) 및 (d) 중 적어도 둘을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 항체는 성질 (a), (b), (c) 및 (d) 중 셋을 나타낸다. 다른 구체예에서, 항체는 성질 (a), (b), (c) 및 (d) 중 넷 모두를 나타낸다. 어떤 구체예에서, 항체는 라모스 세포에 대하여 직접 항-증식 효과를 가지지 않는다. 어떤 구체예에서 항체는 라모스 세포에서 칼슘 플럭스를 유도하지 않는다. 어떤 구체예에서, 항체는 라모스 세포 상에서 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 매개하지 않는다. 바람직하게, 항체는 고친화도, 예를 들어, 1 x 10-7 M 이하의 KD 또는 1 x 10-8 M 이하의 KD 또는 1 x 10-9 M 이하의 KD 또는 1 x 10-10 M 이하의 KD 또는 7 x 10-11 M 이하의 KD로 인간 CD22에 결합한다.
다른 관점에서, 본 발명은 분리된 인간 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 포함하는데, 상기 항체는 CD22에 결합하는 것에 대하여 참조 항체와 교차-경쟁하는데, 상기 참조 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(b) 서열번호 32 또는 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(c) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 37 또는 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(d) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 39 또는 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(e) 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 84 또는 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(f) 서열번호 82 또는 83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
여기에서, 상기 항체는 인간 CD22에 특이적으로 결합한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부에 관한 것으로, 인간 VH 7-4.1 유전자, 인간 VH 4-34 유전자, 인간 VH 5-51 유전자, 또는 인간 VH 1-69 유전자의 생성물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기에서 상기 항체는 인간 CD22에 특이적으로 결합한다. 또 다른 관점에서, 본 발명은 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부에 관한 것으로, 인간 Vλ 2b2 유전자, 인간 VK L6 유전자, 인간 VK A27 유전자, 인간 VK A10 유전자, 또는 인간 L18 유전자의 생성물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기에서 상기 항체는 인간 CD22에 특이적으로 결합한다. 또 다른 관점에서, 본 발명은 분리된 항체, 또는 이의 항원-결합부에 관한 것으로, 다음을 포함한다:
(a) 인간 VH 7-4.1 유전자의 생성물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 중쇄 가변 영역 및 인간 Vλ 2b2 유전자의 생성물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 경쇄 가변 영역; 또는
(b) 인간 VH 4-34 유전자의 생성물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 중쇄 가변 영역 및 인간 VK L6 유전자의 생성물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 경쇄 가변 영역; 또는
(c) 인간 VH 5-51 유전자의 생성물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 중쇄 가변 영역 및 인간 VK A27 또는 A10 유전자의 생성물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 경쇄 가변 영역;
(d) 인간 VH 1-69 유전자의 생성물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 중쇄 가변 영역 및 인간 VK L6 유전자의 생성물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 경쇄 가변 영역; 또는
(e) 인간 VH 1-69 유전자의 생성물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 중쇄 가변 영역 및 인간 VK L18 또는 A27 유전자의 생성물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 경쇄 가변 영역;
여기에서, 상기 항체는 인간 CD22에 특이적으로 결합한다.
다른 관점에서, 본 발명은 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합부에 관한 것으로, 다음을 포함한다:
CDR1, CDR2 및 CDR3 서열들을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
CDR1, CDR2 및 CDR3 서열들을 포함하는 경쇄 가변 영역,
여기에서,
(a) 상기 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열번호 9-12 및 69-71의 아미노산 서열들, 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
(b) 상기 경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열번호 25-30, 78-80의 아미노산 서열들 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며; 및
(c) 상기 항체는 인간 CD22에 결합한다.
바람직한 구체예에서, 또한 상기 항체는 하나 이상의 다음의 특징들을 가진다: 상기 항체는 CD22+ 세포로 내재화하며, ADCC 활성을 매개하며, 및/또는 BCR 자극에 의하여 유도된 라모스 세포의 세포 사멸을 증진시키며, 및/또는 세포독소에 접합될 때 생체내에서 CD22-발현 세포의 성장을 억제한다.
바람직하게, 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열번호 5-8, 60, 66-68의 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 및 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열번호 19-24, 75-77의 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게, 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열번호 1-4, 63-65의 아미노산 서열들 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열번호 13-18, 72-74의 아미노산 서열들 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 1을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 5를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 9를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 13을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 25를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 2를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 6 또는 60을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 14를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 26을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 15 또는 16을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 21 또는 22를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 27 또는 28을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 4를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 8을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 12를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 17 또는 18을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 23 또는 24를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 29 또는 30을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 63을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 66을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 69를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 72 또는 73을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 75 또는 76을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 78 또는 79를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 64 또는 65를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 67 또는 68을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 70 또는 71을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 74를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 77을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 80을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
본 발명의 다른 바람직한 항체, 또는 이의 항원 결합부는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 31-34, 61 및 81-83으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 35-40 및 84-86으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
여기에서 상기 항체는 인간 CD22에 특이적으로 결합한다.
바람직한 조합은 다음을 포함한다: (a) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다: (a) 서열번호 32 또는 61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다: (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 37 또는 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다: (a) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 39 또는 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다: (a) 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 84 또는 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다: (a) 서열번호 82 또는 83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
본 발명의 다른 관점에서, CD22에 결합하는 것에 대하여 상기 언급한 항체들의 임의의 것과 경쟁하는 항체, 또는 이의 항원-결합부가 제공된다.
본 발명의 항체는, 예를 들어, 전장 항체, 예를 들어, IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다. 대안적으로, 상기 항체는 Fab, Fab’ 또는 Fab’2 단편과 같은, 항체 단편 또는, 단일 사슬 항체일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 면역접합체를 제공하며, 이는 세포독소 또는 방사성 동위원소와 같은, 치료 제제에 연결된다. 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 화합물 “사이토톡신 A”에 연결되는(예, thiol 연결을 통하여), 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 항체, 또는 이의 항원 결합부와는 다른 결합 친화도를 갖는 제2 기능적 부분(moiety)에 연결되는, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 이중특이적 분자를 제공한다.
본 발명의 항체, 이의 항원-결합부, 또는 면역접합체 또는 이중특이적 분자 및 약제학적 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합부를 암호화하는 핵산 분자 또한 본 발명에 포함되며, 뿐만 아니라 그러한 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 그러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포도 본 발명에 포함된다. 또한 그러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 이용하여 항-CD22 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 이것은 (i) 상기 숙주 세포에서 상기 항체를 발현시키고 (ii) 상기 숙주 세포로부터 상기 항체를 분리하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 관점은 CD22-발현 종양 세포의 성장을 억제하는 방법과 관련이 있다. 상기 방법은 CD22-발현 종양 세포의 성장을 억제하기 위하여 CD22-발현 종양 세포를, 본 발명의, 항체, 또는 이의 항원-결합부와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 종양 세포는, 예를 들어, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin’s lymphoma)과 같은, B 세포 림프종일 수 있다. 어떤 구체예에서, 상기 항체, 또는 이의 항원-결합부는, 세포독소와 같은, 치료 제제에 접합된다.
본 발명의 다른 관점은 대상체 내의 염증성 또는 자가면역성 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 대상체 내의 염증성 또는 자가면역성 장애를 치료하기 위하여 대상체내에 본 발명의, 항체, 또는 이의 항원-결합부를 투여하는 것을 포함한다. 자가면역성 장애는, 예를 들어, 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus) 및 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis)일 수 있다.
또한 본 발명은 고친화도로 CD22에 특이적으로 결합하는 분리된 항-CD22 항체-파트너 분자 접합체를 제공하는데, 특히 상기 접합체는 인간 단일클론 항체를 포함한다. 그러한 항체-파트너 분자 접합체 중 어떤 것은 CD22-발현 세포로 내재화될 수 있으며 항체 의존성 세포독성을 매개할 수 있다. 본 발명은 또한, 본 명세서에 공지된 항-CD22 항체-파트너 분자 접합체를 이용하여, 암, 예를 들어, 비-호지킨 림프종과 같은, B 세포 림프종을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 관점에서, 본 발명은 대상체 내에 염증성 또는 자가면역성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상체 내의 염증성 또는 자가면역성 장애를 치료하기 위하여 대상체내에 본 발명의, 항체, 또는 이의 항원-결합부를 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 자가면역성 장애의 비-제한적 예는 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus) 및 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis)을 포함한다. 자가면역성 장애의 다른 예는 염증성 장 질환(궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 크론병(Crohn’s disease)을 포함), I형 당뇨병, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 쇼그렌 증후군(Sjogren’s syndrome), 자가면역성 갑상선염(autoimmune thyroiditis)(그레이브병(Grave’s disease) 및 하시모토 갑상선염을 포함), 건선(psoriasis) 및 사구체신염(glomerulonephritis)을 포함한다.
또한, 본 발명의 파트너 분자에 접합되고, 항체, 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 명세서에 공지된 항체 파트너 분자 접합체에서 항체에 유리하게 접합될 수 있는 파트너 분자들은 약물, 독소, 마커 분자(예, 방사성동위원소), 단백질 및 치료 제제로서의 분자들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한 항체-파트너 분자 접합체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 본 명세서에 개시된다.
한 관점에서, 그러한 항체-파트너 분자 접합체는 화학적 링커를 통하여 접합된다. 어떤 구체예에서, 링커는 펩티딜 링커이고, 본 명세서에 (L4)p-F- (L1)m로 표시된다. 다른 링커는 하이드라진 및 디설파이드 링커들을 포함하고, 본 명세서에서, 각각, (L4)p-H- (L1)m 및 (L4)p-J- (L1)m로 표시된다. 파트너에 부착된 링커에 부가하여, 본 발명은 또한 필수적인 임의의 분자 종에 부착하기에 적절한 분리가능한(cleavable) 링커 가지(arm)를 제공한다.
다른 관점에서, 본 발명은 CD22-발현 종양 세포의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 CD22-종양 세포의 성장을 억제하기 위하여 CD22-발현 종양 세포를 본 발명의 항체-파트너 분자 접합체와 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 파트너 분자는 세포독소와 같은, 치료 제제이다. 특히 바람직한 CD22-발현 종양 세포는 비-호지킨 림프종과 같은, B 세포 림프종이다. CD22-발현 종양 세포의 다른 유형은 브루키트 림프종(Burkitt’s lymphomas) 및 B 세포 만성 림프성 백혈병을 포함한다. 또한 다른 구체예에서, CD22-발현 종양 세포는 브루키트 림프종(Burkitt’s lymphomas) 및 B 세포 만성 림프성 백혈병으로 구성되는 군으로부터 선택된 암이다.
다른 관점에서, 본 발명은 대상체 내에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 대상체 내에서 암을 치료하기 위하여 본 발명의 항체-파트너 분자 접합체를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 파트너 분자는 세포독소와 같은, 치료 제제이다. 치료를 위한 특히 바람직한 암은 비-호지킨 림프종과 같은, B 세포 림프종이다. 암의 다른 유형은 브루키트 림프종(Burkitt’s lymphomas) 및 B 세포 만성 림프성 백혈병을 포함한다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 제한적으로 해석되어서는 안 될 하기의 상세한 설명 및 실시예로부터 명확해질 것이다. 본 명세서 전체에 인용된 모든 참조 문헌, 진뱅크(Genbank) 등록 번호, 특허 및 공개 특허 출원서의 내용은 참조를 위하여 본 명세서에 명백히 포함된다.
<상세한 설명>
본 발명은 분리된 단일클론 항체, 특히 높은 친화도로 인간 CD22에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체에 관한 것이다. 소정의 구체예에서, 본 발명의 항체는 특정 중쇄 및 경쇄 생식계열 서열로부터 유래되며 및/또는 특정 아미노산 서열을 포함하는 CDR 영역과 같은 특별한 구조적 특징을 포함한다. 본 발명은 분리된 항체, 면역-파트너 분자 접합체, 이중특이적 분자, 어피바디(affibodies), 도메인 항체, 나노바디(nanobodies) 및 유니바디(unibodies), 상기 분자들을 제조하는 방법, 및 상기 분자들 및 약제학적 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 CD22의 발현과 관련된 질병 또는 장애에서 B 세포 활성을 조정하는 것과 같은 상기 분자들을 이용하는 방법, 또는 CD22+ 종양 및 염증성 또는 자가면역성 장애와 같은 B 세포 조절을 포함하는 방법 뿐만 아니라 CD22를 탐지하는 것에 관한 것이다. 또한 본 발명은 CD22+ 종양 세포의 성장을 억제하기 위하여, 예를 들어, B 세포 림프종을 치료하기 위하여, 본 발명의 항-CD22 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 추가적으로, 본 발명은 염증성 또는 자가면역성 장애를 치료하기 위하여 본 발명의 항-CD22 항체를 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명이 좀더 쉽게 이해되도록 하기 위하여, 우선 소정의 용어를 정의한다. 추가의 정의들은 상세한 설명 전체를 통하여 설명된다.
용어 “CD22”, “BL-CAM”, “B3”, “Leu-14”및 “Leu-14”은 상호교환적으로 사용되고, CD22의 변이체, 이소형, 및 종 동족체를 포함한다. 따라서, 본 발명의 인간 항체는, 소정의 경우에, 인간 이외의 종으로부터의 CD22와 교차-반응할 수 있다. 어떤 구체예에서, 상기 항체는 인간 CD22에 완전히 특이적일 수 있으며 비-인간 교차-반응성의 종 또는 다른 유형을 나타낼 수 있다. 예시적 인간 CD22의 완전한 아미노산 서열은 진뱅크(Genbank) 기탁 번호 NP_001762(서열번호 59)를 가진다.
인간 CD22 서열은, 예를 들어, 비-보존적 영역에서 보존적 돌연변이체 또는 돌연변이체를 가짐으로써 서열번호 59의 인간 CD22와는 다를 수 있으며, CD22는 서열번호 59의 인간 CD22와 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 가진다. 예를 들어, 인간 CD22의 생물학적 기능은 본 발명의 항체에 의하여 특이적으로 결합되는 CD22의 세포외 도메인에서 에피토프를 가지는 것이거나 인간 CD22의 생물학적 기능은 BCR 시그널링을 조절하는 것이다.
특정 인간 CD22 서열은 일반적으로 서열번호 59의 인간 CD22와 아미노산 서열에 있어서 적어도 90%가 동일할 것이고 다른 종(예, 쥐과 동물)의 CD22 아미노산 서열과 비교할 때 인간이라는 것으로서의 아미노산 서열을 정의하는 아미노산 잔기들을 함유한다. 소정의 경우에, 인간 CD22는 아미노산 서열에 있어서 서열번호 59의 CD22와 적어도 95%, 또는 심지어는 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일할 수 있다. 소정의 구체예에서, 인간 CD22 서열은 서열번호 59의 CD22와는 단지 10 개의 아미노산 차이를 보일 수 있다. 소정의 구체예에서, 인간 CD22는 서열번호 59의 CD22와는 단지 5, 또는 심지어 4, 3, 2, 또는 1 개의 아미노산 차이를 보일 수 있다. 퍼센트 동일성은 본 명세서에서 설명한 바와 같이 결정될 수 있다.
용어 “면역 반응”은 예를 들어, 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구, 및 상기 세포들 또는 간(항체, 사이토카인(cytokines) 및 보체를 포함)에 의하여 생산되는 가용성 거대분자의 거동을 말하는데, 침입 병원체, 병원체에 감염된 세포 또는 조직, 암세포, 또는 자가면역 또는 병리적 염증의 경우에서 있어서 정상 인간 세포 또는 조직에 선택적으로 손상을 주거나 그것을 파괴하거나 또는 그것을 인간 신체로부터 제거하는 결과를 가져온다.
“신호 전달 경로”는 세포의 또 다른 부분으로의 신호 전달에 있어서 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자들 사이의 생화학적 관계를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같은, 어구 “세포 표면 수용체”, 예를 들어, 신호를 받고 그 신호를 세포의 원형질 막을 가로질러 전달할 수 있는 분자 및 분자의 복합체를 포함한다. 본 발명의 “세포 표면 수용체”의 예는 CD22 단백질이다.
본 명세서에서 지칭되는 용어 “항체”는, 온전한 항체 및 이의 항원 결합 단편(즉, “항원-결합부”) 또는 단일 사슬을 포함한다. “항체”는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 두개의 중쇄(H) 및 적어도 두개의 경쇄(L), 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH로 약자화) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 세가지 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL로 약자화) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역들은, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리워지는, 초가변 영역들로 더 나뉠 수 있는데, 이들은 골격 영역(framework region, FR)으로 불리우는 더 보존적인 영역과 섞여있다. 각 VH 및 VL은 세 개 CDR과 네 개 FR로 구성되고, 이들은 아미노 말단에서부터 카르복시 말단방향으로 하기 순서로 정렬되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 상기 항체들의 불변 영역은, 면역계(예, 작동자(effector) 세포) 및 전통적인 보체계(classical complement system)의 제 1 요소(Clq)를 포함한, 숙주 조직 또는 인자에 면역글로불린을 결합시키는 것을 매개할 수 있다.
용어 항체의 “항원-결합부”(간단히 “항원부”)는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 항원(예컨대, CD22)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편들을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의하여 수행될 수 있음을 보여 주었다. 용어 항체의 “항원-결합부” 내에 포함되는 결합 단편들의 예는, (i) Fab 단편, 즉 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 즉, 힌지 영역에서 디설파이드 다리(disulfide bridge)에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) Fab’, 즉, 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab(Fundamental Immunology (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993) 참조); (iv) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (v) 항체의 단일 가지(arm)의 VL와VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편; (vi) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward 등 (1989) Nature 341:544-546); (vii) 분리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (viii) 나노바디, 즉 단일 가변 도메인 및 두 개의 불변 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 더욱이, Fv 단편의 두 개 도메인, VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 암호화 되어 있지만, 그것들은 재조합 방법들을 사용하여, 합성 링커에 의해 결합되어 단일 단백질 사슬로서 만들어 질 수 있고, 여기에서 VL 및 VH 영역들은 짝을 이뤄 단일가 분자(단일 사슬 Fv (scFv)로서 공지됨; 예, Bird 등 (1988) Science 242:423-426; 및 Huston 등 (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883 참조)를 형성하게 된다. 그러한 단일 사슬 항체들은 또한 용어 항체의 “항원-결합부” 범위내에 내포되는 것으로 의도된다. 이러한 항체 단편들은 당해 분야의 숙련자들에게 공지된 기술을 사용하여 얻어질 수 있고, 상기 단편들을 본래의 항체들과 동일한 방식으로 검출하여 이용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 약자 “VK”는 카파 경쇄의 가변 도메인을 지칭하고, 반면에 본 명세서에서 사용되는, 약자 “Vλ”는 람다 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는, 약자 “VL”는 면역글로불린 경쇄의 가변 도메인을 지칭하고 VK 및 Vλ 경쇄 둘 다 포함한다.
"분리된 항체"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 상이한 항원 특이성들을 갖는 다른 항체들이 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다(예, CD22와 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 CD22 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 항체들이 실질적으로 없다). 그러나, CD22에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종으로부터 유래한 CD22 분자와 같은, 다른 항원에 교차 반응성(cross-reactivity)을 가진다. 더욱이, 분리된 항체는 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 “단일클론 항체”또는 “단일클론 항체 조성물”은, 단일 분자 조성물의 항체 분자들의 제조물을 지칭한다. 단일클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대하여 단일 결합 특이성 및 친화도를 보인다.
용어 “인간 항체”는, 명세서에서 사용되는 바와 같이, 골격 영역 및 CDR 영역 둘 다가 인간 생식계열 면역글로불린 서열들로부터 유래하는 가변 영역을 갖는 항체들을 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 상기 항체가 불변 영역을 포함한다면, 그 불변 영역 또한 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래한다. 본 발명의 인간 항체들은 인간 생식계열 면역글로불린 서열들에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기들(예, 시험관 내 랜덤 또는 자리-특이적(site-specific) 돌연변이생성(mutagenesis)에 의해 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 유도된 돌연변이들)을 포함할 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 사용되는, 용어 “인간 항체”는, 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열들이 인간 골격 서열들에 이식된 항체들을 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
용어 “인간 단일클론 항체”는, 골격 영역 및 CDR 영역 둘 다가 인간 생식계열 면역글로불린 서열들로부터 유래된, 가변 영역을 가지는 단일 결합 특이성을 보이는 항체들을 지칭한다. 한 구체예에서, 상기 인간 단일클론 항체들은, 무한증식 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스유전자 및 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 가지는, 트랜스유전자성(transgenic) 비인간 동물, 예를 들어, 트랜스유전자성 쥐로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 “재조합 인간 항체”는, 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 만들어지거나 또는 분리된 모든 인간 항체들, 예를 들어, (a) 인간 면역글로불린 유전자들에 대하여 트랜스유전자성(transgenic) 이거나 트랜스염색체성(transchromosomal)인 동물(예, 마우스)로부터 또는 이로부터 제조된 하이브리도마(하기에 설명됨)로부터 분리된 항체들, (b) 형질전환되어 인간 항체를 발현하는 숙주세포로부터, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 분리된 항체들, (c) 재조합, 조합성 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체들, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열들을 다른 DNA 서열들로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 만들어지거나 또는 분리된 항체들을 포함한다. 그러한 재조합 인간 항체들은, 골격 영역 및 CDR 영역이 인간 생식계열 면역글로불린 서열들로부터 유래되는 가변 영역을 가진다. 그러나 소정 구체예에서, 그러한 재조합 인간 항체들은 시험관 내 돌연변이생성(mutagenesis)(또는 인간 Ig 서열들에 대해 트랜스유전자성인 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이생성)으로 처리될 수 있고, 따라서 재조합 항체들의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열들은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열들로부터 유래되고 이에 관련된 것인 반면에, 생체 내에서 인간 항체 생식계열 원천에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열들이다.
본 명세서에서 사용되는, “이소타입”은 중쇄 불변 영역 유전자들에 의해 암호화되는 항체 등급(예, IgM 또는 IgGl)을 지칭한다.
본 명세서에서, 어구 “항원을 인식하는 항체”및 “항원에 특이적인 항체”는 용어 “항원에 특이적으로 결합하는 항체”와 함께 상호교환적으로 이용된다.
용어 “인간 항체 유도체”인간 항체의 임의의 변이된 형태, 예를 들어, 항체 및 다른 제제나 또는 항체의 접합체를 지칭한다.
용어 “인간화 항체”는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열들이 인간 골격 서열들에 접합된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 추가의 골격 영역 변이가 인간 골격 서열 내에서 이루어 질 수 있다.
용어 “키메릭 항체”는 가변 영역 서열들이 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열들이 다른 종으로부터 유래된 항체들, 예를 들어, 가변 영역 서열들이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열들이 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 “항체 의태체”는 항원을 결합하는 항체의 능력을 의태할 수 있는 분자들을 지칭하는 것으로 의도되나, 천연 항체 구조에 한정되지 않는다. 그러한 항체 의태체의 예들은 어피바디(Affibodies), 디에이알핀(DARPins), 안티칼린(Anticalins), 아비머(Avimers), 및 베르사바디(Versabodies)를 포함하나 이에 제한되지 않는데, 이들 모두는, 일반적인 항체 결합을 의태하나, 구별된 메커니즘으로부터 생성되고 그것을 통해 기능하는 결합 구조를 사용한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 “파트너 분자”는 항체-파트너 분자 접합체에서 항체에 접합하는 개체를 지칭하다. 파트너 분자의 예들은 약물, 독소, 마커 분자(펩티드 및 형광색소 마커와 같은 소분자 마커, 뿐만 아니라 방사성동위원소와 같은 단일 원자 마커를 포함하나 이에 한정되지 않음), 단백질 및 치료 제제를 포함한다.
본 명세서에 사용되는, “인간 CD22에 특이적으로 결합하는” 항체는 인간 CD22(및 아마도 하나 이상의 비-인간 종으로부터의 CD22)에 결합하나 비-CD22 단백질에 실질적으로 결합하지 않는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 소정 구체예에서, 본 발명의 항체는 서열번호 59의 인간 CD22 또는 이의 변형체(variant)에 특이적으로 결합한다. 바람직하게, 상기 항체는 1 x 10-7 M 이하, 더 바람직하게 1 x 10-8 M 이하, 더 바람직하게 5 x 10-9 M 이하, 더 바람직하게 1 x 10-9 M 이하, 더욱 더 바람직하게 5 x 10-10 M 이하, 및 더 더욱 바람직하게 7 x 10-11 이하의 KD로 인간 CD22에 결합한다.
본 명세서에서 사용되는, 단백질 또는 세포에 “실질적으로 결합하지 않는”이라는 용어는, 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나 또는 높은 친화도로 결합하지 않는 것, 즉, 단백질 또는 세포에 1 x 10-6 M 이상, 더 바람직하게는 1 x 10-5 M 이상, 더욱 바람직하게는 1 x 10-4 M 이상, 더욱더 바람직하게는 1 x 10-3 M 이상, 더욱더 바람직하게는 1 x 10-2 M 이상의 KD 로 결합하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 “Kassoc” 또는 “Ka”는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도(association rate)를 지칭하는 것이고, 본 명세서에서 사용되는, 용어 “Kdis” 또는 “Kd”는, 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 “KD”는 Kd 대 Ka 의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 얻어지고, 몰 농도(M)로 표시되는 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 항체들에 대한 KD 값은 당해 분야에 설정된 방법들을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD 를 결정하는 바람직한 방법은 표면 플라즈몬(plasmon) 공명, 바람직하게, 비아코어(Biacore®)시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, IgG 항체에 대한 “고친화도”라는 용어는 표적 항원에 대하여 1 x 10-7 M 이하, 더 바람직하게는 5 x 10-8 M 이하, 더욱 더 바람직하게는 1x10-8 M 이하, 더욱 더 바람직하게는 5 x 10-9 M 이하, 그리고 더욱 더 바람직하게는 1 x 10-9 M 이하의 KD를 가지는 항체를 지칭한다. 그러나, “고친화도”결합은 다른 항체 이소타입(isotypes)에 대하여 다양해질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소타입에 대한 “고친화도”결합은 10-6 M 이하, 더 바람직하게는 10-7 M 이하, 더욱 더 바람직하게는 10-8 M 이하의 KD 를 가지는 항체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 “대상체”는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 “비인간 동물”은 모든 척추동물, 예를 들어, 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등과 같은, 포유 동물 및 비포유동물을 포함한다.
기호 “-”는, 결합으로서 사용되거나 결합에 수직으로 표시되거나, 표시된 부분이 분자, 고체 지지체 등의 잔여 부분에 부착되는 지점을 나타낸다.
용어 “알킬”은, 단독으로 또는 다른 치환기의 부분으로서, 다른 언급이 없으면, 직쇄 또는 분지쇄, 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼, 또는 이의 조합을 의미하고, 이들은 충분히 포화되거나, 단일불포화되거나 또는 다중불포화되며, 지정된 탄소 수(즉, C1-C10은 하나부터 열 개의 탄소를 의미함)를 갖는, 이가 및 다가 라디칼을 포함할 수 있다. 포화 탄화수소 라디칼의 예들은, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 사이클로헥실, (사이클로헥실)메틸, 사이클로프로필메틸, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등의 상동체(homologs) 및 이성질체(isomers)와 같은 기들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 불포화 알킬기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 가지는 것이다. 불포화 알킬기의 예들은, 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고도 상동체 및 이소형태를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한 용어 “알킬”은, 다르게 기술되지 않으면,“헤테로알킬”과 같은, 하기에 더 자세히 정의되는 알킬의 유도체들을 포함하는 것을 의미한다. 탄화수소기에 한정되는, 알킬기는“호모알킬(homoalkyl)”로 불리운다.
용어 “알킬렌”은, 단독으로 또는 다른 치환기의 부분으로서, -CH2CH2CH2CH2-에 의하여 예시되나 이에 한정되지 않는, 알칸으로부터 유래되는 이가 라디칼을 의미하고, “헤테로알킬렌”으로서 하기에 설명된 기들을 포함한다. 일반적으로, 알킬(또는 알킬렌)기는 1개부터 24개의 탄소 원자를 가질 것이며, 10개 이하의 탄소 원자를 갖는 기들이 본 발명에서 바람직하다. “저급알킬”또는 “저급알킬렌”은, 일반적으로 8개 이하의 탄소 원자를 갖는, 더 짧은 사슬 알킬 또는 알킬렌 기이다.
용어 “헤테로알킬”은, 단독으로 또는 다른 용어와 조합하여, 다른 언급이 없으면, 안정한 직쇄 또는 분지쇄, 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼, 또는 이들의 조합을 의미하는데, 정해진 수의 탄소 원자와 O, N, Si, 및 S으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자로 이루어지며, 여기에서 질소, 탄소 및 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고 질소 헤테로원자는 선택적으로 사급화될(quaternized) 수 있다. 헤테로원자(들) O, N, S, 및 Si은 헤테로알킬기의 임의의 내부 위치에 또는 알킬기가 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치에 위치할 수 있다. 예들은, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, -CH2-NH-OCH3및 -CH2-O-Si(CH3)3와 같이, 두 개의 헤테로원자까지가 연속적일 수 있다. 유사하게, 용어 “헤테로알킬렌”은, 단독으로 또는 다른 치환기의 일부로서, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-에 의하여 예시되나 이에 한정되지 않는, 헤테로알킬로부터 유래되는 이가 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬렌기에 있어서, 헤테로원자는 또한 사슬 말단의 어느 한쪽 또는 둘 다를 차지할 수 있다(예, 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노, 등등). 용어 “헤테로알킬” 및 “헤테로알킬렌”은 폴리(에틸렌 글리콜) 및 그의 유도체(예를 들어, Shearwater Polymers Catalog, 2001 참조)를 포함한다. 더 나아가, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 연결기에 있어서, 연결기의 식이 쓰여진 방향에 의하여 연결기의 어떠한 방향도 암시되지 않는다. 예를 들어, 식 -C(O)2R’- 은 -C(O)2R’- 및 -R’C(O)2- 둘 다를 나타낸다.
용어 “저급”은 용어 “알킬” 또는 “헤테로알킬”과 조합하여 1 개부터 6개의 탄소 원자를 갖는 부분을 지칭한다.
용어들 “알콕시”, “알킬아미노”, “알킬설포닐”, 및 “알킬티오”(또는 티오알콕시)는 그들의 일반적인 의미로 사용되며, 각각, 산소 원자, 아미노기, SO2기, 또는 황 원자를 통하여 분자의 나머지 부분에 부착된 알킬기를 지칭한다. 용어 “아릴설포닐”은 SO2기를 통하여 분자의 나머지 부분에 부착된 아릴기를 지칭하며, 용어 “설피드릴”은 SH기를 지칭한다.
일반적으로, “아실 치환기”는 또한 상기에서 서술된 기로부터 선택된다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 “아실 치환기”는 본 발명의 화합물의 다중고리 핵에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 카르보닐 탄소에 부착되어 그 원자가(valence)를 맞추는 기들을 지칭한다.
용어 “사이클로알킬” 및 “헤테로사이클로알킬”은, 단독으로 또는 다른 용어와 조합하여, 다른 언급이 없으면, 각각, 치환 또는 비치환 “알킬” 및 치환 또는 비치환 “헤테로알킬”의 고리 형을 나타낸다. 추가적으로, 헤테로사이클로알킬에 있어서, 헤테로원자는 헤테로사이클이 분자의 나머지 부분에 부착된 위치를 점유할 수 있다. 사이클로알킬의 예는, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐, 사이클로헵틸, 등등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 헤테로사이클로알킬의 예에는 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐, 등등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 고리 구조의 헤테로원자 및 탄소 원자는 임의로 산화될 수 있다.
용어 “할로” 또는 “할로겐”은, 단독으로 또는 다른 치환기의 부분으로서, 다른 언급이 없으면, 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드 원자를 의미한다. 추가적으로, “할로알킬”과 같은 용어는 모노할로알킬 및 폴리할로알킬을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들면, 용어 “할로(C1-C4)알킬”은 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필, 등등을 포함하나 이에 한정되지 않는 것을 의미한다.
용어 “아릴”은, 다른 언급이 없으면, 함께 융합되거나 공유 결합되어 단일 또는 다중 고리(바람직하게는 1개부터 3개의 고리)가 될 수 있는 치환 또는 비치환 다중포화, 방향족, 탄화수소 치환기를 의미한다. 용어 “헤테로아릴”은, N, O, 및 S로부터 선택된 1개부터 4개의 헤테로원자를 포함하는 아릴기(또는 고리)를 지칭하는데, 여기에서, 질소, 탄소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있으며, 질소 원자(들)는 임의로 사급화될 수 있다. 헤테로아릴기는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴기들의 비-제한적인 예는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤지미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹사리닐, 5-퀴녹사리닐, 3-퀴놀릴, 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 상기에서 기술된 아릴 및 헤테로아릴 고리계의 각각의 치환기는 하기에서 기술된 허용가능한 치환기들의 군으로부터 선택된다. “아릴” 및 “헤테로아릴”은 또한 하나 이상의 비-방향족 고리계가 융합되거나, 그렇지 않으면, 아릴 또는 헤테로아릴 시스템에 결합된 고리계를 포함한다.
요약하면, 용어 “아릴”은 다른 용어들(예, 아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬)과 조합하여 사용될 때, 상기에서 정의된 아릴 및 헤테로아릴 고리 둘 다를 포함한다. 따라서, 용어 “아릴알킬”은, 탄소 원자(예, 메틸렌기)가 예를 들면, 산소 원자에 의해 대체된(예, 펜옥시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필, 등등) 알킬기들을 포함하는, 알킬기(예, 벤질, 펜에틸, 피리딜메틸, 등등)에 아릴기가 부착된 라디칼들을 포함하는 것을 의미한다.
상기 용어들(예, “알킬”, “헤테로알킬”, “아릴” 및 “헤테로아릴”) 각각은 지시된 라디칼의 치환 및 비치환 형태를 포함한다. 라디칼의 각 유형의 바람직한 치환기는 하기에 제공된다.
알킬, 및 헤테로알킬 라디칼의 치환기(알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 헤테로사이클로알케닐로 흔히 지칭되는 그러한 기들을 포함함)는 일반적으로 “알킬 치환기” 및 “헤테로알킬 치환기”로 각각 지칭되고, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(0)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2로부터 선택되는 여러 가지 기들 중 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 그 수는 0 부터 (2m'+l)의 범위를 가지는데, m'은 그러한 라디칼 내에서 탄소 원자의 총 수이다. R', R", R"' 및 R"" 각각은 바람직하게는 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 예를 들면, 1-3 할로겐으로 치환된 아릴, 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기, 또는 아릴알킬기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R기를 포함할 때, 예를 들면, 각각의 R기들은 하나 이상의 이들 기가 존재하는 각각의 R', R", R"' 및 R"" 기들로 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착되면, 이들은 질소 원자와 결합되어 5-, 6-, 또는 7-멤버 고리를 형성할 수 있다. 예를 들면, -NR'R"은 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나 이에 한정되지 않는 것으로 의미된다. 치환기에 대해 상술한 것으로부터, 당업자는 용어 “알킬”이 할로알킬(예, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실(예, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, 등등)과 같은, 수소기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기를 포함한다는 것을 이해할 것이다.
알킬 라디칼에 대해 기술된 치환기와 유사하게, 아릴 치환기 및 헤테로아릴 치환기는 일반적으로 “아릴 치환기” 및 “헤테로아릴 치환기”로 각각 지칭되며, 예를 들면, 0부터 방향족 고리계 상의 개방 원자가(open valence)의 총 수까지의 범위에서, 할로겐, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R")=NR", - S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 및 플루오로(C1-C4)알킬로부터 다양화되고 선택되는데; 여기에서, R', R", R"' 및 R""은 바람직하게는 수소, (C1-C8)알킬 및 헤테로알킬, 비치환 아릴 및 헤테로아릴, (비치환 아릴)-(C1-C4)알킬, 및 (비치환 아릴)옥시-(C1-C4)알킬로부터 독립적으로 선택된다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R기를 포함할 때, 예를 들면, 각각의 R기들은 하나 이상의 이들 기가 존재하는 각각의 R', R", R"' 및 R"" 기들로서 독립적으로 선택된다.
아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 아릴 치환기들 중 둘은 식-T-C(O)-(CRR')q-U-의 치환기로 임의로 대체될 수 있는데, 여기에서, T 및 U는 독립적으로 -NR-, -O-, -CRR'- 또는 단일 결합이고, q는 0부터 3까지의 정수이다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환기들 중 둘은 식 -A-(CH2)r-B-의 치환기로 임의로 대체될 수 있는데, 여기에서, A 및 B는 독립적으로 -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- 또는 단일결합이고, r은 1부터 4까지의 정수이다. 그렇게 형성된 새로운 고리의 단일 결합들 중 하나는 이중결합으로 임의로 대체될 수 있다. 대안적으로 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환기들 중 둘은 식 -(CRR')s-X-(CR"R"')d-의 치환기로 임의로 대체될 수 있는데, 여기에서, s 및 d는 독립적으로 0부터 3까지의 정수이고, X는 -O-, -NR'-, -S-, - S(O)-, -S(O)2-, 또는 -S(O)2NR'-이다. 치환기 R, R', R" 및 R"'는 바람직하게는 수소 또는 치환 또는 비치환 (C1-C6) 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 “디포스페이트”는 두 개의 포스페이트기를 포함하는 인산의 에스테르를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 용어 “트리포스페이트”는 세 개의 포스페이트기를 포함하는 인산의 에스테르를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 디포스페이트 또는 트리포스페이트를 갖는 특정 약물은 다음을 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00001
본 명세서에서 사용되는, 용어 “헤테로원자”는 산소(O), 질소(N), 황(S) 및 실리콘(Si)을 포함한다.
기호 “R”은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로시클릴 기들로부터 선택되는 치환기를 나타내는 일반적인 약어이다.
본 발명의 다양한 관점은 다음의 소단락에서 좀더 자세히 기술된다.
항- CD22 항체
본 발명의 항체는 항체의 특정 기능적 특징 또는 성질에 의하여 특징지어진다. 예를 들면, 상기 항체는 인간 CD22에 특이적으로 결합한다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 고친화도, 예를 들면 1 x 10-7 M 이하의 KD로 CD22에 결합한다.
본 발명의 항-CD22 항체는 바람직하게 다음의 특징들 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) CD22+ 세포로 내재화함;
(b) CD22+ 세포에 대항하여 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 나타냄;
(c) B 세포 수용체(BCR)에 의하여 유도되는 라모스 세포의 세포 사멸을 증진시킴; 및
(d) 세포독소에 접합될 때 생체 내에서 CD22-발현 세포의 성장을 억제함.
바람직한 구체예에서, 상기 항체는 성질 (a), (b), (c) 및 (d) 중 적어도 둘을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 상기 항체는 성질 (a), (b), (c) 및 (d) 중 셋을 나타낸다. 다른 구체예에서, 상기 항체는 성질 (a), (b), (c) 및 (d) 중 넷 모두를 나타낸다.
본 발명의 항-CD22 항체가 소정의 기능적 성질들을 나타내는 반면에, 소정의 구체예에서, 상기 항체의 다른 특징은 그것들이 다른 특정 기능적 성질들을 나타낸지 않는다는 것이다. 예를 들면, 소정 구체예에서, 상기 항체는 라모스 세포에 대하여 직접 항-증식성 효과를 가지지 않는다. 다른 구체예에서, 상기 항체는 라모스 세포에서 칼슘 플럭스를 유도하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 상기 항체는 라모스 세포 상에서 보체 의존성 세포독성(CDC)을 매개하지 않는다.
인간화 항-CD22 항체, 에프라투주맵(epratuzumab)은 비-호지킨 림프종 세포주에 대하여 직접 항-증식성 효과 및 CDC 활성을 결여하나, 상기 항체는 다른 수단에 의하여 상기 세포주에 대하여 세포독소적 효과를 전달한다(Carnahan, J. 등 (2006) Mol . Immunol . 44:1331-1341 참조).
바람직하게, 본 발명의 항체는 1 x 10-7 M 이하의 KD로 인간 CD22에 결합하거나, 1 x 10-8 M 이하의 KD로 인간 CD22에 결합하거나, 5 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 CD22에 결합하거나, 3 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 CD22에 결합하거나, 1 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 CD22에 결합하거나, 5 x 10-10 M 이하의 KD로 인간 CD22에 결합하거나, 1 x 10-10 M의 KD로 인간 CD22에 결합하거나, 7 x 10-11 M 이하의 KD로 인간 CD22에 결합한다.
인간 CD22에 대한 항체의 결합 친화도를 평가하기 위한 표준 분석법은, 예를 들어, 재조합 CD22를 사용한 ELISA 및 비아코어(BIAcore) 분석법(실시예 3 참조)을 포함하여, 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 실시예들은 또한 항체 내재화(실시예 4), ADCC 활성(실시예 5), BCR 자극에 의하여 유도된 세포 사멸의 증진(실시예 7), 항체의 직접 항-증식성 효과(실시예 8), 칼슘 플럭스의 유도(실시예 6), 및 CDC 활성(실시예 9), 및 생체 내에서 고형 종양 세포 증식에 대한 항-약물 면역접합체의 항-증식성 효과(실시예 10)를 평가하기 위한 적절한 분석법의 상세한 설명을 제공한다.
단일클론 항체 12 C5 , 19A3, CD22 .1, CD22 .2, 16F7, 23 C6 , 4 G6 및 21F6
본 발명의 바람직한 항체는 인간 단일클론 항체 12C5, 19A3, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6, 그리고 재조합 인간 단일클론 항체 CD22.1, CD22.2이고, 이들 모두는 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 분리되고 구조적으로 특징지어진다.
12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6의 VH 아미노산 서열은 각각 서열번호 31, 32, 61, 33, 34, 81, 82 및 83에 보이는데, 여기에서, 19A3 및 CD22.1의 중쇄는 서열번호 32와 동일하고 이에 대응되며, 21F6의 VH 중쇄는 서열번호 82 또는 83에 대응된다.
12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6의 VL 아미노산 서열은 각각 서열번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 84, 85 및 86에 보이는데, 여기에서, 19A3, CD22.1 및 CD22.2의 카파 경쇄는 서열번호 36과 동일하고 이에 대응되며, 16F7의 카파 경쇄는 서열번호 37 또는 38에 대응되고, 23C6의 카파 경쇄는 서열번호 39 또는 40에 대응되며, 4G6의 카파 경쇄는 서열번호 84 또는 85에 대응된다.
이러한 항체 각각이 CD22에 결합할 수 있다면, VH 및 VL 서열은 “혼합되고 짝지워져서”본 발명의 다른 항-CD22 결합 분자를 만들 수 있다. 그러한 “혼합되고 짝지워진” 항체의 CD22 결합을 상기 및 실시예에서 기술된 결합 분석법(예, ELISA 또는 유세포 분석법)을 이용하여 검사할 수 있다. 바람직하게, VH 및VL 사슬이 혼합되고 짝지워질 때, 특정 VH/VL 접합으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체된다. 마찬가지로, 바람직하게 특정 VH/VL 접합으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 V L서열로 대체된다.
따라서, 일 관점에서, 본 발명은 다음을 포함하는 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고:
(a) 서열번호 31-34, 61 및 81-83으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 35-40 및 84-86으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
여기에서 상기 항체는 CD22, 바람직하게는 인간 CD22에 특이적으로 결합한다.
바람직한 중쇄 및 경쇄 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(b) 서열번호 32 또는 61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(c) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 37 또는 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(d) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 39 또는 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(e) 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 84 또는 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(f) 서열번호 82 또는 83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 관점에서, 본 발명은 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6, 21F6, 또는 이의 조합의 중쇄 및 경쇄 CDR1들, CDR2들 및 CDR3들을 포함하는 항체를 제공한다.
12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6의 VH CDR1들의 아미노산 서열들이 각각 서열번호 1-4 및 63-65에 보인다(여기에서, 19A3, CD22.1 및 CD22.2의 VH 서열들의 CDR1들은 동일하며 서열번호 2에 보이고, 21F6의 VH1 및 VH2 서열들의 CDR1들은 각각 동일하며 각각 서열번호 64 및 65에 보임).
12C5, 19A3, CD22.1, 16F7, 23C6, CD22.2, 4G6 및 21F6의 VH CDR2들의 아미노산 서열들이 각각 서열번호 5-8, 60, 및 66-68에 보인다(여기에서, 19A3 및 CD22.1의 VH 서열들의 CDR2들은 동일하며 서열번호 6에 보이고, CD22.2의 VH 서열의 CDR2는 서열번호 60에 보이고, 21F6의 VH1 및 VH2 서열들의 CDR2들은 서열번호 67 및 68에 보임).
12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6의 VH CDR3들의 아미노산 서열들이 각각 서열번호 9-12 및 69-71에 보인다(여기에서, 19A3, CD22.1 및 CD22.2의 VH 서열들의 CDR3들은 동일하며 서열번호 10에 보이고, 21F6의 VH1 및 VH2 서열들의 CDR3들은 서열번호 70 및 71에 보임).
12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6의 VL CDR1들의 아미노산 서열들이 각각 서열번호 13-18 및 72-74에 보인다(여기에서, 19A3, CD22.1 및 CD22.2의 VK 서열들의 CDR1들은 동일하며 서열번호 14에 보이고, 16F7의 VK.1 및 VK.2 서열들의 CDR1들은 서열번호 15 및 16에 보이고, 23C6의 VK.1 및 VK.2 서열들의 CDR1들은 서열번호 17 및 18에 보이며, 4G6의 VK.1 및 VK.2 서열들의 CDR1들은 서열번호 72 및 73에 보임).
12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6의 VL CDR2들의 아미노산 서열들이 각각 서열번호 19-24 및 75-77에 보인다(여기에서, 19A3, CD22.1 및 CD22.2의 VK 서열들의 CDR2들은 동일하며 서열번호 20에 보이고, 16F7의 VK.1 및 VK.2 서열들의 CDR2들은 서열번호 21 및 22에 보이고, 23C6의 VK.1 및 VK.2 서열들의 CDR2들은 서열번호 23 및 24에 보이며, 4G6의 VK.1 및 VK.2 서열들의 CDR2들은 서열번호 75 및 76에 보임).
12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6의 VL CDR3들의 아미노산 서열들이 각각 서열번호 25-30 및 78-80에 보인다(여기에서, 19A3, CD22.1 및 CD22.2의 VK 서열들의 CDR3들은 동일하며 서열번호 26에 보이고, 16F7의 VK.1 및 VK.2 서열들의 CDR3들은 서열번호 27 및 28에 보이고, 23C6의 VK.1 및 VK.2 서열들의 CDR3들은 서열번호 29 및 30에 보이며, 4G6의 VK.1 및 VK.2 서열들의 CDR3들은 서열번호 78 및 79에 보임).
카밧 시스템(Kabat system)을 이용하여 CDR 영역이 묘사되어 있다(Kabat, E. A., 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).
이러한 항체 각각이 CD22에 결합할 수 있고 항원-결합 특이성이 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역들에 의하여 일차적으로 제공된다면, VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열들과 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열들은 “혼합되고 짝지어져서”(즉, 비록 각 항체가 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열들과 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하더라도, 상이한 항체들로부터의 CDR들이 혼합되고 짝지어질 수 있음), 본 발명의 다른 항-CD22 결합 분자를 만들 수 있다. 그러한 “혼합되고 짝지어진” 항체의 CD22 결합은 상기 및 실시예에서 기술된 결합 분석법(예, ELISAs, 비아코어(Biacore®분석)을 이용하여 검사할 수 있다. 바람직하게, VH CDR 서열이 혼합되고 짝지어질 때, 특정 VH 서열의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합되고 짝지어질 때, 특정 VL 서열의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열들은 바람직하게는 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 하나 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 단일클론 항체 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6의 CDR1에 대하여 본 명세서에 공지된 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 신규한 VH 및 VL 서열을 만들 수 있다는 것은 통상적으로 숙련된 기술자에게는 확실히 명백하다.
따라서, 다른 관점에 있어서, 본 발명은 다음을 포함하는 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다:
(a) 서열번호 1-4 및 63-65로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 5-8, 60 및 66-68로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 9-12 및 69-71로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 13-18 및 72-74로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 19-24 및 75-77로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 25-30 및 78-80으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
여기에서 상기 항체는 CD22, 바람직하게는 인간 CD22에 특이적으로 결합한다.
바람직한 실시예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 1을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 5를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 9를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 13을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 25를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 2를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 6 또는 60을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 14를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 26를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 15 또는 16을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 21 또는 22를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 27 또는 28을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 4를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 8을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 12를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 17 또는 18을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 23 또는 24를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 29 또는 30을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 63을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 66을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 69를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 72 또는 73을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 75 또는 76을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 78 또는 79를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 64 또는 65를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 67 또는 68을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 70 또는 71을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 74를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 77을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 80을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
CDR3 도메인은, CDR1 및/또는 CDR2 도메인(들)과 독립적으로, 단독으로 동족체 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 결정지을 수 있다는 것과 공통의 CDR3 서열에 근거하여 동일한 결합 특이성을 가지는 다중 항체들이 예상대로 발생될 수 있다는 것이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Klimka 등, British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000) (쥐 항-CD30 항체 Ki-4의 중쇄 가변 영역 도메인 CDR3만을 사용한 인간화된 항-CD30 항체의 생산을 설명함); Beiboer 등, J. Mol . Biol . 296:833-849 (2000) (부모 쥐 MOC-31 항-EGP-2 항체의 중쇄 CDR3 서열만을 사용한 재조합 상피 당단백질-2(EGP-2) 항체를 설명함); Rader 등, Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998) (쥐 항-인테그린 αvβ3 항체 LM609의 중쇄 및 경쇄 가변 CDR3 도메인을 사용한 인간화된 항-인테그린 αvβ3 항체들의 패널을 설명하고 있고 여기에서 각 항체 구성원은 CDR3 도메인 외부에 있고 부모 쥐 항체와 동일하거나 더 높은 친화도를 가지고 부모 쥐 항체와 동일한 에피토프를 결합할 수 있는 고유의 서열을 포함함); Barbas 등, J. Am . Chem . Soc . 116:2161-2162 (1994) (CDR3 도메인은 항원 결합에 가장 중대한 공헌을 한다는 것을 설명함); Barbas 등, Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A. 92:2529-2533 (1995) (인간 태반 DNA에 대한 세 개 Fab (SI-1, SI-40, 및 SI-32)의 중쇄 CDR3 서열들을 항-파상풍 유독소(toxoid) Fab의 중쇄에 접합하고 이로써 기존의 중쇄 CDR3를 대체하는 것을 설명하고, CDR3 도메인 단독으로 결합 특이성을 부여한다는 것을 증명함); Ditzel 등, J. Immunol . 157:739-749 (1996) (부모 다중특이성 Fab LNA3의 중쇄 CDR3 만을 단일특이적인 IgG 파상풍 유독소-결합 Fab p313 항체의 중쇄에 전달하는 것으로도 부모 Fab의 결합 특이성을 유지하는 데 충분하다는 결과를 나타낸 이식 연구를 설명함); Berezov 등, BIAjournal 8:Scientific Review 8 (2001) (항-HER2 단일클론 항체의 CDR3에 근거한 펩티드 유사체를 설명함); Igarashi 등, J. Biochem ( Tokyo ) 117:452-7 (1995) (항-포스파티딜세린 항체의 CDR3 도메인에 해당하는 12 아미노산 합성 폴리펩티드를 설명함); Bourgeois 등, J. Virol 72:807-10 (1998) (항-호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항체의 중쇄 CDR3 도메인으로부터 유래된 단일 펩티드가 시험관내에서 바이러스를 중화할 수 있다는 것을 보여줌); Levi 등, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 90:4374-8 (1993) (쥐 항-HIV 항체의 중쇄 CDR3 도메인에 근거한 펩티드를 설명함); Polymenis와 Stoller, J. Immunol . 152:5218-5329 (1994) (Z-DNA-결합 항체의 중쇄 CDR3 영역을 접합함으로써 scFv의 결합을 가능하게 함을 설명함), 및 Xu와 Davis, Immunity 13:37-45 (2000) (중쇄 CDR3에서의 다양성이 동일한 IgM 분자가 다양한 합텐(hapten)과 단백질 항원을 구별하도록 하는데 충분하다라는 것을 설명함)을 참조. 또한, 단일 CDR 도메인에 의하여 정의된 특허된 항체를 설명하는, 미국 특허 번호 제6,951,646호; 제6,914,128호; 제6,090,382호; 제6,818,216호; 제6,156,313호; 제6,827,925호; 제5,833,943호; 제5,762,905호 및 제5,760,185호를 참조. 이러한 참고 문헌 각각은 전체적으로 본 명세서 상에 참조로서 통합되어 있다.
따라서, 본 발명은 인간 또는 비-인간 동물로부터 유래되는 항체로부터 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단일클론 항체를 제공하는데, 여기에서 단일클론 항체는 CD22에 특이적으로 결합할 수 있다. 어떤 관점 내에서, 본 발명은 마우스 또는 래트 항체와 같은, 비-인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단일클론 항체를 제공하는데, 여기에서 단일클론 항체는 CD22에 특이적으로 결합할 수 있다. 어떤 실시예 내에서, 비-인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 그러한 독창적인 항체는 (a) 결합을 위한 경쟁을 할 수 있고; (b) 기능적 특징을 보유하며; (c) 동일한 에피토프에 결합하고; 및/또는 (d) 해당 부모 비-인간 항체와 유사한 결합 친화도를 가진다.
다른 관점 내에서, 본 발명은 인간 항체, 예를 들어, 비-인간 동물로부터 얻은 인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단일클론 항체를 제공하는데, 상기 인간 항체는 CD22에 특이적으로 결합할 수 있다. 다른 관점 내에서, 본 발명은, 예를 들어, 비-인간 동물로부터 얻은 인간 항체와 같은, 제 1 인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단일클론 항체를 제공하는데, 상기 제 1 인간 항체는 CD22에 특이적으로 결합할 수 있고 제 1 인간 항체로부터의 상기 CDR3 도메인은 CD22에 대한 결합 특이성이 부족한 인간 항체에서 CDR3 도메인을 대체하여 CD22에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 인간 항체를 생성한다. 어떤 실시예 내에서, 제 1 인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 그러한 독창적인 항체는 (a) 결합을 위한 경쟁을 할 수 있고; (b) 기능적 특징을 보유하고; (c) 동일한 에피토프에 결합하고; 및/또는 (d) 해당 모체 제 1 인간 항체와 동일한 결합 친화도를 가진다.
특정 생식계열 서열을 갖는 항체
소정 실시예에서, 본 발명의 항체는 특정 생식계열 중쇄 면역글로불린 유전자로부터의 중쇄 가변 영역 및/또는 특정 생식계열 경쇄 면역글로불린 유전자로부터의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
예를 들어, 바람직한 구체예에서, 본 발명은, 인간 VH 7-4.1 유전자, 인간 VH 4-34 유전자, 인간 VH 5-51 유전자, 또는 인간 VH 1-69 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하는데, 상기 항체는 CD22에 특이적으로 결합한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은, 인간 Vλ 2b2 유전자, 인간 VK L6 유전자, 인간 VK A27 유전자, 인간 VK A10 유전자, 또는 인간 VK L18 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하는데, 상기 항체는 CD22에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하는데, 상기 항체는 인간 VH 7-4.1 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역 및 인간 Vλ 2b2 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체는 CD22, 바람직하게는 인간 CD22에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하는데, 상기 항체는 인간 VH 4-34 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역 및 인간 VK L6 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체는 CD22, 바람직하게는 인간 CD22에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하는데, 상기 항체는 인간 VH 5-51 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역 및 인간 VK A27 또는 A10 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체는 CD22, 바람직하게는 인간 CD22에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하는데, 상기 항체는 인간 VH 1-69 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역 및 인간 VK L6 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체는 CD22, 바람직하게는 인간 CD22에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하는데, 상기 항체는 인간 VH 1-69 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역 및 인간 VK A27 또는 L18 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체는 CD22, 바람직하게는 인간 CD22에 특이적으로 결합한다.
또한 그러한 항체는, CD22+ 세포로의 내재화, CD22+ 세포에 대항하는 ADCC 활성 및/또는 BCR 자극 세포독소에 의하여 유도된 라모스 세포의 세포사멸의 증진과 같은, 상기에서 자세히 상술된 기능적 특징들 중 하나 이상을 가질 수 있다.
VH 7-4.1 및 Vλ 2b2의 VH 및 VL을 갖는 항체의 예는, 각각 12C5 항체이다. VH 4-34 및 VK L6의 VH 및 VL을 갖는 항체의 예는, 각각 19A3 항체이다. VH 4-34 및 VK L6의 VH 및 VL을 갖는 항체의 다른 예는, 각각 CD22.1 항체이다. VH 4-34 및 VK L6의 VH 및 VL을 갖는 항체의 다른 예는, 각각 CD22.1 항체이고, 여기에서 상기 VH 사슬은 N57Q 돌연변이체를 포함한다. VH 4-34 및 VK L6 생식계열의 VH 및 VL을 갖는 항체의 다른 예는, 각각 21F6 항체이다. VH 5-51 및 VK A27 또는 A10의 VH 및 VL을 갖는 항체의 예는, 각각 16F7 항체이다. VH 1-69 및 VK L6의 VH 및 VL을 갖는 항체의 예는, 각각 23C6 항체이다. VH 1-69 및 VK A27 또는 L18의 VH 및 VL을 갖는 항체의 예는, 각각 4G6 항체이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 인간 항체는, 항체의 가변 영역들이 인간 생식계열 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 얻어진다면, 특정 생식계열 서열의 “생성물”인 또는“이로부터 유래된” 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 그러한 시스템들은 인간 면역글로불린 유전자를 가지는 유전자 이식 마우스를 관심의 항원으로 면역화하거나 또는 파지 상에 전시된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 관심의 항원으로 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 “생성물”인 또는“이로부터 유래된” 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식계열 면역글로불린의 아미노산 서열들과 비교하고 서열에 있어서 인간 항체의 서열과 가장 가까운(즉, 최대 % 상동성) 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 선택함으로써 그러한 것으로 확인될 수 있다. 특정 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 “생성물”인 또는“이로부터 유래된” 인간 항체는, 예를 들어, 자연발생적 체세포 변이 또는 부위-지정 돌연변이(site-directed mutation)의 인위적 도입으로 인해 생식계열 서열과 비교하여 상이한 아미노산을 포함할 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 일반적으로는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 아미노산 서열에 있어서 적어도 90% 동일하고 다른 종의 생식계열 면역글로불린 아미노산 서열들(예, 쥐의 생식계열 서열들)과 비교할 때, 인간 항체를 인간이라는 것으로 확인하는 아미노산 잔기들을 포함한다. 특정 경우, 인간 항체는, 아미노산 서열에 있어서, 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과, 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 일반적으로, 특정 인간 생식계열 서열로부터 유래된 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 단지 10개 아미노산 차이만을 보인다. 특정의 경우, 상기 인간 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 단지 5 개, 또는 심지어 4, 3, 2, 또는 1 개 아미노산 차이만을 보인다.
동종성 항체
또 다른 실시예에서, 본 발명의 항체는 본 명세서에서 설명된 바람직한 항체들의 아미노산 서열들에 상동성인 아미노산 서열들을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체들은 본 발명의 항-CD22 항체들의 소망의 기능적 성질을 보유한다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하며, 여기에서:
(a) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 31-34, 61 및 81-83으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 상동성인 아미노산 서열을 포함하고;
(b) 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 35-40 및 84-86으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 상동성인 아미노산 서열을 포함하며;
(c) 상기 항체는 인간 CD22에 특이적으로 결합한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 상기 항체는 다음의 기능적 특징들 중 하나 이상을 가질 수 있다: (a) 1x10-7 M 이하의 KD로 인간 CD22에 결합하고; (b) CD22+ 세포로 내재화하며; (c) CD22+ 세포 상에서 ADCC 활성을 나타내고; (d) 예를 들어, BCR 자극에 의하여 유도되는 라모스 세포의 세포사멸을 증진시키며; 및/또는 (e) 세포독소에 접합할 때, 생체 내에서 CD22-발현 세포의 성장을 억제한다.
다양한 실시예들에서, 상기 항체는, 예를 들어, 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메릭 항체일수 있다.
다른 실시예에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열들은 상기 설명된 서열들에 대하여 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성일 수 있다. 상기 설명된 서열들의 VH 및 VL 영역에 대하여 높은 (즉, 80% 이상) 상동성을 가지는 VH 및 VL 영역을 갖는 항체는 서열번호 41-44, 62, 또는 87-89, 또는 서열번호 45-50 또는 90-92를 암호화하는 핵산 분자의 돌연변이생성(예, 자리-지정 또는 PCR-매개 돌연변이생성)에 의하여 얻은 후, 본 명세서에서 설명된 기능적 분석법을 사용하여 보유된 기능(즉, 상기에서 설명된 기능)에 대하여 상기 암호화된 변형된 항체를 테스트할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 두 개의 아미노산 서열 간의 상동성 백분율은 두 서열 간의 동일성 백분율에 대응된다. 두 서열 간의 동일성 백분율은, 두 서열의 최적 정렬에 대하여 도입될 필요가 있는, 간격들의 수 및 각 간격의 길이를 고려하여, 상기 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 상동성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100). 두 서열 간 서열의 비교 및 백분율 동일성의 결정은, 하기 비-제한적 실시예에서 설명된 바와 같이, 수학적 알고리즘을 사용하여 이룰 수 있다.
두 개 아미노산 서열간의 동일성 백분율은 E. Meyers 및 W. Miller의 알고리즘 (Comput . Appl . Biosci., 4:11-17 (1988))을 사용하여 결정될 수 있고, 이 알고리즘은 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합되어 있으며, PAM120 가중치 잔기 표, 12의 간격 길이 페널티 및 4의 간격 페널티를 사용한다. 또한, 두 개 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 Needleman 및 Wunsch (J. Mol . Biol . 48:444-453 (1970)) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있고, 이 알고리즘은 GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 이용가능) 내의 GAP 프로그램에 통합되어 있으며, 블로섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스와, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 간격 가중치와 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열들을 “조회(query) 서열”로 사용하여 공공 데이터베이스에 대하여 검색을 수행함으로써, 예를 들어, 연관 서열들을 확인할 수 있다. 그러한 검색은 Altschul, 등 (1990) J. Mol . Biol. 215:403-10의 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이= 3을 사용하여 BLAST 단백질 검색을 수행하여 본 발명의 항체 분자와 상동인 아미노산 서열들을 얻을 수 있다. 비교 목적상 이격된 정렬들을 얻기 위해, Gapped BLAST를 Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402에서 설명된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램(예, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트(default) 변수들이 유용하다. www.ncbi.nlm.nih.gov 참조.
보존적 변형체(conservative modifications)를 갖는 항체
소정의 실시예에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는데, 이러한 CDR 서열들의 하나 이상은 본 명세서에서 설명된 바람직한 항체들(예컨대, 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6) 또는 이의 보존적 변형물에 기초한 특정 아미노산 서열을 포함하며, 그리고 상기 항체는 본 발명의 항-CD22 항체들의 소망의 기능적 성질을 보유한다. 항원 결합을 제거하지 않는 소정의 보존적 서열 변형물이 만들어질 수 있다는 것은 당해 분야에서 이해되고 있다. 예를 들어, Brummell 등. (1993) Biochem 32:1180-8(살모넬라에 특이적인 항체의 CDR3 중쇄 도메인에서 돌연변이 분석법을 설명함); de Wildt 등 (1997) Prot . Eng. 10:835-41(항-UA1 항체에서 돌연변이 연구를 설명함); Komissarov 등 (1997) J. Biol . Chem. 272:26864-26870(HCDR3의 중앙부에서의 돌연변이가 친화도를 없애거나 감소시켰음을 보여줌); Hall 등 (1992) J. Immunol. 149:1605-12(CDR3 영역에서의 단일 아미노산 변화가 결합 활성도를 없앴음을 설명함); Kelley와 O’Connell (1993) Biochem. 32:6862-35(항원 결합에서 Tyr 잔기의 기여를 설명함); Adib-Conquy 등 (1998) Int . Immunol. 10:341-6 (결합에서 소수성의 영향을 설명함) 및 Beers 등 (2000) Clin . Can . Res. 6:2835-43 (HCDR3 아미노산 돌연변이를 설명함)을 참조.
따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공하며:
(a) 상기 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열번호 9-12, 69-71의 아미노산 서열들, 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
(b) 상기 경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열번호 25-30, 79-80의 아미노산 서열들 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며; 및
(c) 상기 항체는 인간 CD22에 특이적으로 결합한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 상기 항체는 다음의 기능적 성질들 중 하나 이상을 가질 수 있다: (a) 1x10-7 M 이하의 KD로 인간 CD22에 결합하고; (b) CD22+ 세포로 내재화하며; (c) CD22+ 세포 상에서 ADCC 활성을 나타내고; (d) BCR 자극에 의하여 유도되는 라모스 세포의 세포사멸을 증진시키며; 및/또는 (e) 세포독소에 접합할 때, 생체 내에서 CD22-발현 세포의 성장을 억제한다.
바람직한 구체예에서, 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열번호 5-8, 60, 66-68의 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 및 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열번호 19-24, 75-77의 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 실시예에서, 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열번호 1-4, 63-65의 아미노산 서열들 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 및 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열번호 13-18, 72-74의 아미노산 서열들 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구체예에서, 상기 항체는, 예를 들어, 인간 항체들, 인간화 항체들 또는 키메릭 항체들일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 “보존적 서열 변형체”는 그 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성을 유의하게 변화 또는 변경하지 않는 아미노산 변형체를 지칭하는 것으로 의도된다. 그러한 보존적 변형체는 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 자리-지정 돌연변이생성 및 PCR-매개 돌연변이생성과 같이, 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여, 본 발명의 항체에 변형을 유도할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기의 일 군은 당해 분야에 정의되어 있다. 이러한 군들은 염기성 측쇄(예, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예, 아스파르트 산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지 측쇄(예, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 가진 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역내에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 군으로부터 나온 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 이러한 변형된 항체는 본 명세서에서 설명된 기능 분석법을 사용하여 보유된 기능 (즉, 상기에서 설명된 기능들)에 대하여 테스트할 수 있다.
항- CD22 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 항-CD22 단일클론 항체(즉, CD22에 결합하는 것에 대하여 본 발명의 임의의 단일클론 항체와 교차-경쟁하는 능력을 가진 항체)에 의하여 인식된 인간 CD22 상에서 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 교차-경쟁 연구를 위한 참조 항체는 단일클론 항체 12C5(서열번호 31 및 35에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐), 또는 단일클론 항체 19A3 또는 단일클론 항체 CD22.1 또는 단일클론 항체 CD22.2(서열번호 32/61 및 36에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐), 또는 단일클론 항체 16F7(서열번호 33 및 37/38에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐) 또는 단일클론 항체 23C6(서열번호 34 및 39/40에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐), 또는 단일클론 항체 4G6(서열번호 81 및 84/85에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐) 또는 단일클론 항체 21F6(서열번호 82/83 및 86에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐)일 수 있다.
그러한 교차-경쟁하는 항체들은 표준 CD22 결합 분석법에서 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6 와 교차-경쟁하는 그들의 능력에 기초하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 표준 ELISA 분석법이 이용될 수 있는데, 여기에서, 재조합 CD22는 플레이트 상에 고정되고, 항체들 중 하나가 형광적으로 표지되며, 표지 항체의 결합을 경쟁하는 비-표지 항체의 능력이 평가된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 실시예 3에 설명된 바와 같이(12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6의 에피토프 그루핑(grouping)에 관하여), 비아코어 분석법을 항체의 교차-경쟁 능력을 평가하기 위해 사용할 수 있다. 인간 CD22에 대한, 예를 들어 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6의 결합을 억제하는 테스트 항체의 능력은, 상기 테스트 항체가 인간 CD22에 결합하는 것에 대하여 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6와 경쟁할 수 있고 그럼으로써 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6에 의하여 인식된 인간 CD22 상의 동일한 에피토프에 결합한다는 것을 증명한다. 실시예 3에 자세히 기술된 바와 같이, 항체 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6 각각은 CD22 상의 별개의 에피토프에 결합하고 따라서 별개의 에피토프 그룹들에 속한다. 바람직한 구체예에서, 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 단일클론 항체이다. 그러한 인간 단일클론 항체를 실시예들에서 기술된 바와 같이 제조 및 분리할 수 있다.
조작되고 변형된 항체
본 발명의 항체는 본 명세서에서 공지된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열들을 가지는 항체를 출발 물질로 사용하여, 이러한 출발 항체로부터 변형된 특성을 가질 수 있는, 변형된 항체를 조작함으로써 제조될 수 있다. 하나 또는 양 쪽 가변 영역(즉, VH 및/또는 VL) 내의, 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역 내 및/또는 하나 이상의 골격 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 항체를 조작할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 불변 영역(들) 내의 잔기들을 변형함으로써, 항체를 조작하여, 예를 들어, 항체의 작동자(effector) 기능(들)을 바꿀 수 있다.
소정의 구체예에서, CDR 접합은 항체의 가변 영역을 조작하는 데 사용될 수 있다. 항체들은 주로, 여섯 개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR)에 위치하는 아미노산 잔기를 통해서 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내에 있는 아미노산 서열들은 CDR바깥의 서열들보다 개별적 항체들 간에 있어서 더욱 다양하다. CDR 서열들이 대부분 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 가지는 상이한 항체로부터 유래된 골격 서열들에 접합된, 특이적 자연발생 항체들로부터 나온 CDR 서열들을 포함하는 발현 벡터들을 제작함으로써 특이적 자연 발생 항체들의 특성을 닮은 재조합 항체들을 발현하는 것이 가능하다(예, Riechmann, L. 등 (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. 등 (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. 등 (1989) Proc . Natl . Acad . See . U.S.A. 86:10029-10033; Winter의 미국 특허 제 5,225,539 호, 및 Queen 등의 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).
따라서, 본 발명의 다른 구체예는 서열번호 1-4 및 63-65, 서열번호 5-8, 60 및 66-68, 및 서열번호 9-12및 69-71로 구성되는 군으로부터 각각 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열들을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 13-18 및 72-74, 서열번호 19-24 및 75-77, 및 서열번호 25-30 및 78-80으로 구성되는 군으로부터 각각 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열들을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합부에 관한 것이다. 따라서, 그러한 항체들은 단일클론 항체 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6의 VH 및 VL CDR 서열들을 포함하나, 이러한 항체들로부터의 상이한 골격 서열들을 포함할 수 있다.
그러한 골격 서열들은, 생식계열 항체 유전자 서열들을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참조문헌으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열들은 Kabat, E. A., 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., 등 (1992) “The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of V-H Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol . Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. 등 (1994) “A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur . J. Immunol. 24:827-836에서는 물론 “VBase” 인간 생식계열 서열 데이터베이스(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 인터넷 상으로 이용가능)에서 발견될 수 있고, 이들 각각의 내용은 참조문헌으로 본 명세서에 명백하게 병합된다. 다른 예로서, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자들에 대한 생식계열 DNA 서열들은 진뱅크(Genbank) 데이터베이스에서 발견될 수 있다. 예를 들어, HCo7 HuMAb 마우스에서 발견되는 하기 중쇄 생식계열 서열들은 첨부한 진뱅크(Genbank) 기탁 번호: 1-69(NG_0010109, NT_024637 및 BC070333), 3-33(NG_0010109 및 NT_024637) 및 3-7(NG_0010109 및 NT_024637)에서 입수할 수 있다. 다른 예로서, HCo12 HuMAb 마우스에서 발견되는 하기 중쇄 생식계열 서열들은 첨부한 진뱅크(Genbank) 기탁 번호: 1-69(NG_0010109, NT_024637 및 BC070333), 5-51(NG_0010109 및 NT_024637), 4-34(NG_0010109 및 NT_024637), 3-30.3(CAJ556644) 및 3-23(AJ406678)에서 입수할 수 있다.
항체 단백질 서열들은 축척된 단백질 서열 데이터베이스와 비교하는 데 있어서 당해 분야의 숙련자들에게는 잘 알려진, 서열 유사성 검색 방법들 중 하나인, Gapped BLAST으로 불리는 방법을 사용할 수 있다(Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402). BLAST는 발견적(heuristic) 알고리즘으로, 여기에서 항체 서열 및 데이터베이스 서열 간의 통계적으로 유의한 정렬은 정렬된 단어들의 고-득점 분절 쌍 (high-scoring segment pairs, HSP)을 포함할 수 있을 것이다. 연장 또는 가지치기(trimming)에 의해서 그 득점을 향상시키지 못하는 분절 쌍(segment pair)을 히트(hit)라고 칭한다. 간략하게, VBASE 유래의 뉴클레오티드 서열들( http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php )은 번역되어 있고, FR1 내지 FR3 골격 영역간 및 이를 포함하는 영역은 유지되어 있다. 상기 데이터베이스 서열들은 평균 98 잔기의 길이를 가진다. 단백질의 전체 길이에 걸쳐서 정확히 들어맞는 이중 서열들은 제외된다. 저 복잡도 필터(complexity filter)를 정지시킨 것을 제외하고는 기설정된(default), 표준 변수들을 가지고 blastp 프로그램 및 BLOSUM62의 치환 매트릭스를 사용하여 단백질들에 대하여 BLAST 검색을 실시하여 5 등까지의 히트를 걸러내어, 서열 짝(match)들을 생성하였다. 그 뉴클레오티드 서열들을 6 개 모든 프레임에서 번역하고 상기 데이터베이스 서열의 매칭 분절에서 정지 코돈이 없는 프레임이 잠재적인 히트로 고려된다. 이를, 다음, BLAST 프로그램 tblastx를 사용하여 확정하였고, 이것은 상기 항체 서열을 6 개 모든 프레임에서 번역하며 이러한 번역물을 6 개 모든 프레임에서 동적으로 번역된 VBASE 뉴클레오티드 서열들과 비교한다.
동일한 것들은 서열의 전체 길이에 걸쳐서 항체 서열과 단백질 데이터베이스 간의 아미노산이 정확하게 들어맞는 것들이다. 양성적인 것들(동일한 것들+치환 짝)은 일치하지는 않으나 BLOSUM62 치환 매트릭스에 의해 가이드되는 아미노산 치환물이다. 만약 항체 서열이 동일한 동일성을 가진 두 데이터베이스 서열과 매치되다면, 가장 양성적인 것들을 가지는 히트는 매칭 서열 히트(matching sequence hit)인 것으로 결정될 수 있다.
본 발명의 항체에 사용하기에 바람직한 골격 서열들은 본 발명의 선택된 항체들에 의해 사용된 골격 서열들과 구조적으로 유사한데, 예를 들어, 본 발명의 바람직한 단일클론 항체들에 의해 사용되는 VH 7-4.1(서열번호 51), VH 4-34(서열번호 52), VH 5-51(서열번호 53), 또는 VH 1-69(서열번호 54) 골격 서열들 및/또는 Vλ 2b2(서열번호 55), VK L6(서열번호 56), VK A27(서열번호 57), VK A10(서열번호 58), 또는 VK L18 (서열번호 93) 골격 서열들에 유사하다. VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 VK CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은, 골격 서열이 유래하는 생식계열 면역글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 가지는 골격 영역 상에 접합될 수 있거나, 또는 상기 CDR 서열들은 생식계열 서열들에 비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 골격 영역 상에 접합될 수 있다. 예를 들어, 소정의 경우, 골격 영역 내의 잔기를 변이시켜 항체의 항원 결합능을 유지 또는 강화시키는 것이 유익한 것으로 알려져 있다(예를 들어, Queen 등의 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).
다른 유형의 가변 영역 변이는 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 변이시켜 관심의 항체의 하나 이상의 결합 성질(예, 친화도)을 향상시키는 것이다. 부위-지정 돌연변이생성 또는 PCR-매개 돌연변이생성을 수행하여 변이(들)를 도입하고 항체 결합, 또는 다른 관심의 기능적 성질에 대한 효과는 명세서에서 설명되고 실시예에서 제공된 바와 같이, 시험관내 또는 생체내 분석법으로 평가할 수 있다. 바람직하게는, 보존적 변이(상기에서 기술된 바와 같이)가 도입된다. 이러한 변이는 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실일 수 있지만, 바람직하게는 치환이다. 더욱이, 일반적으로, 하나의 CDR 영역 내에서 단지 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 잔기만이 변형된다.
따라서, 다른 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 항-CD22 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다: (a) 서열번호1-4 또는 63-65로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 1-4 또는 63-65에 비하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 아미노산 치환들, 결실들 또는 첨가들을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역; (b) 서열번호5-8, 60, 또는 66-68로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 5-8, 60, 또는 66-68에 비하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 아미노산 치환들, 결실들 또는 첨가들을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; (c) 서열번호 9-12 또는 69-71로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 9-12 또는 69-71에 비하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 아미노산 치환들, 결실들 또는 첨가들을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역; (d) 서열번호13-18 또는 72-74로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 13-18 또는 72-74에 비하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 아미노산 치환들, 결실들 또는 첨가들을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1 영역; (e) 서열번호19-24 또는 75-77로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 19-24 또는 75-77에 비하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 아미노산 치환들, 결실들 또는 첨가들을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 영역; (f) 서열번호25-30 또는 78-80으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 25-30 또는 78-80에 비하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 아미노산 치환들, 결실들 또는 첨가들을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 영역.
본 발명의 조작된 항체들은, 예를 들어, 항체의 성질을 향상시키기 위하여, VH 및/또는 VL 내의 골격 잔기에 변이가 만들어진 것을 포함한다. 일반적으로 그러한 골격 변이들은 항체의 면역원성을 감소시키도록 만들어진다. 예를 들어, 하나의 접근 방법은 하나 이상의 골격 잔기를 상응하는 생식계열 서열로 시키는 것이다. 더욱 상세하게는, 체세포 돌연변이된 항체는 항체가 유래되는 생식계열 서열과는 상이한 골격 잔기를 포함할 수 있다. 그러한 잔기는 항체 골격 서열들을 항체가 유래되는 생식계열 서열들을 비교함으로써 확인할 수 있다.
예를 들어, 12C5 Vλ영역에서, 골격 영역 아미노산 위치들 40 및 68(카밧 계수 시스템을 사용함)은 생식계열과는 다르다. 이러한 위치들의 하나 또는 둘 다는 다음 치환기의 하나 또는 둘 다를 만듦으로써 생식계열 서열로 복귀돌연변이될 수 있다: L40Q 및 R68K.
또한, 19A3 및 CD22.1 VH영역들에서, 골격 영역 아미노산 위치 27(카밧 계수 시스템을 사용함)은 생식계열과는 다르다. 이 위치는 다음 치환기를 만듦으로써 생식계열 서열로 복귀돌연변이될 수 있다: R27G.
또한, CD22.2 VH영역에서, 골격 영역 아미노산 위치들 27 및 57(카밧 계수 시스템을 사용함)은 생식계열과는 다르다. 이 위치는 다음 치환기를 만듦으로써 생식계열 서열로 복귀돌연변이될 수 있다: R27G 및 Q57N.
또한, 16F7 VH영역에서, 골격 영역 아미노산 위치 28(카밧 계수 시스템을 사용함)은 생식계열과는 다르다. 이 위치는 다음 치환기를 만듦으로써 생식계열 서열로 복귀돌연변이될 수 있다: N28S.
또한, 16F7 VK.2 영역에서, 골격 영역 아미노산 위치 85(카밧 계수 시스템을 사용함)은 생식계열과는 다르다. 이 위치는 다음 치환기를 만듦으로써 생식계열 서열로 복귀돌연변이될 수 있다: A85T.
또한, 23C6 VH 영역에서, 골격 영역 아미노산 위치들 14, 79 및 88(카밧 계수 시스템을 사용함)은 생식계열과는 다르다. 이러한 위치들의 하나, 둘 또는 셋 모두는 다음 치환기들의 하나, 둘 또는 셋 모두를 만듦으로써 생식계열 서열로 복귀돌연변이될 수 있다: T14P, V79A 및 A88S.
또한, 4G6 VH 영역에서, 골격 영역 아미노산 위치들 P, D, F, D, T, Y 및 F(카밧 계수 시스템을 사용함)은 생식계열과는 다르다. 이 위치는 다음 치환기들의 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 일곱 모두를 만듦으로써 생식계열 서열로 복귀돌연변이될 수 있다: P?A; D?G; N?S; F?Y; D?E; T?S; Y?R; F?S. NEED INPUT RE: KABAT NUMBERING.
또한, 4G6 VK1 영역에서, 골격 영역 아미노산 위치들 T 및 D(카밧 계수 시스템을 사용함)는 생식계열과는 다르다. 이러한 위치들은 다음 치환기들의 하나 또는 둘을 만듦으로써 생식계열 서열로 복귀돌연변이될 수 있다: T?K 및 D?E.
또한, 21F6 VH1 영역에서, 골격 영역 아미노산 위치들 S 및 I(카밧 계수 시스템을 사용함)는 생식계열과는 다르다. 이러한 위치들은 다음 치환기들을 만듦으로써 생식계열 서열로 복귀돌연변이될 수 있다: S?P 및 I?V.
또한, 21F6 VH2영역에서, 골격 영역 아미노산 위치들 S 및 M(카밧 계수 시스템을 사용함)은 생식계열과는 다르다. 이러한 위치들은 다음 치환기들을 만듦으로써 생식계열 서열로 복귀돌연변이될 수 있다: S?P 및 M?V.
다른 유형의 골격 변형은 골격 영역 내에 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내에 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거하고 그것에 의하여 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 포함한다. 이러한 접근방식은 또한 “탈면역화”로 지칭되며 Carr 등의 미국 특허 공개 번호 제2003/0153043 호에 보다 상세히 설명되어 있다.
골격 또는 CDR 영역 내에서 만들어진 변형에 더하여 또는 대안적으로, 본 발명의 항체들을 조작하여 Fc 영역 내에서 변형을 만들어, 예를 들어, 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포 독성과 같은 항체의 하나 이상의 기능적 성질을 일반적으로 변경할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체를 화학적으로 변형시키고(예, 하나 이상의 화학적 분체를 항체에 붙일수 있다) 또는 글리코실화를 변경하는 것으로 변형시켜 항체의 하나 이상의 기능적 성질을 변경할 수 있다. 이러한 구체예들 각각이 하기에 더 상세히 설명되어 있다. Fc 영역에서의 잔기의 번호매김은 카밧의 EU 인덱스의 것과 같다.
한 구체예에서, CH1의 힌지 영역을 변형시켜 힌지 영역에서 시스테인 잔기의 수를 변경, 예를 들어 증가시키거나 감소시킨다. 이러한 접근 방법은 Bodmer 등의 미국 특허 제 5,677,425 호에 더 설명되어 있다. CH1의 힌지 영역에서의 시스테인 잔기의 수를 변경하여, 예를 들어, 경쇄 및 중쇄들의 결집을 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시킨다.
다른 구체예에서, 항체의 Fc 힌지 영역을 돌연변이시켜 항체의 생물학적 반감기를 감소시킨다. 더욱 상세하게는, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 부위에 도입되어 상기 항체가, 천연 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비하여, 손상된 포도상구균 단백질 A(SpA) 결합을 가진다. 이러한 방법은 Ward 등의 미국 특허 제 6,165,745 호에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
다른 구체예에서, 상기 항체를 변형시켜 생물학적 반감기를 증가시킨다. 다양한 접근 방식이 가능하다. 예를 들어, Ward의 미국 특허 제6,277,375호에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 하기 돌연변이를 도입할 수 있다: T252L, T254S, 및 T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 연장시키기 위해, Presta 등의 미국 특허 제5,869,046호 및 제6,121,022호에서 설명된 바와 같이, 항체를 CH1 또는 CL 영역에서 변경시켜 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 두 개 루프로부터 얻은 살비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 치환하여 항체의 작동자(effector) 기능(들)을 변경하도록 Fc 영역을 변경할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산들을 상이한 아미노산 잔기로 치환하여 항체가 작동자 리간드에 대한 변경된 친화도를 가지지만, 부모 항체의 항원-결합 능력을 보유하게 한다. 친화도가 변경되는 상기 작동자 리간드는, 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근 방법은 Winter 등의 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호에 더 상세히 기술되어 있다.
다른 구체예에서, 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산들을 아미노산 잔기로 치환하여 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 파괴된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 가지게 한다. 이러한 접근 방법은 Idusogie 등의 미국 특허 제6,194,551호에 더 상세히 설명되어 있다.
다른 구체예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경하여 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경한다. 이러한 접근 방법은 Bodmer 등의 PCT 공개공보 제 WO 94/29351호에 더 기술되어 있다.
또 다른 구체예에서, 다음의 위치에서 하나 이상의 아미노산들을 변형함으로써 Fc 영역을 변형시켜 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 조정하는 항체의 능력을 증가시키고 및/또는 Fcγ수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시킨다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 이러한 접근 방법은 Presta의 PCT 공개 번호 제WO 00/42072호에 더 상세히 기술되어 있다. 더욱이, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 자리가 지도화되어 있고 향상된 결합을 가지는 변이체들(variants)이 기술되어 있다 (Shields, R.L. 등 (2001) J. Biol . Chem. 276:6591-6604 참조). 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서의 특이적 변이는 FcγRIII에 대한 결합을 향상시키는 것으로 나타났다. 덧붙여, 다음의 조합 돌연변이체는 FcγRIII 결합을 향상시키는 것으로 나타났다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A.
또 다른 구체예에서, 항체의 글리코실화를 변경시킨다. 예를 들어, 비글리코실화된 항체를 만들 수 있다(즉, 항체는 글리코실화를 결여함). 글리코실화를 변경하여, 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 그러한 탄수화물 변경은, 예를 들어, 항체 서열 내에서 하나 이상의 글리코실화의 자리를 변경함으로써 성취될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 골격 글리코실화 자리를 제거하도록 야기하는 하나 이상의 아미노산 치환을 만들어서 그 자리에서 글리코실화를 없애버릴 수 있다. 그러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 그러한 접근 방법은 Co 등의 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호에 더욱 상세하게 기술되어 있다. 글리코실화를 변경하는 추가적 접근법은 Hanai 등의 미국 특허번호 제 7,214,775호, Presta의 미국 특허번호 제 6,737,056호, Presta 의 미국 특허공개 번호 20070020260호, Dickey 등의 PCT 공개번호 제 WO/2007/084926호, Zhu 등의 PCT 공개번호 제 WO/2006/089294호, 및 Ravetch 등의 PCT 공개번호 제 WO/2007/055916호에 더 자세히 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본 명세서에 병합된다.
한 예시적인 구체예에서, N57Q 돌연번이를 도입함으로써 19A3 항체의 VH 사슬의 CDR2 영역에 글리코실화 자리를 제거하여(실시예 1 참조), 서열번호 61에 보인 VH 아미노산 서열을 갖는 재조합 항체 CD22.2를 생기게 한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 가지는 항체, 예를 들어, 감소된 양의 퓨코실 잔기를 가지는 저퓨코실화 항체, 또는 증가된 두 갈래 GlcNac 구조를 가지는 항체를 만들 수 있다. 그러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체들의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 나타났다. 그러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 변경된 글리코실화 기제(machinery)를 가진 숙주 세포에서 상기 항체를 발현시킴으로써 이루어 질 수 있다. 변경된 글리코실화 기제를 가진 세포들은 당해 분야에 공지되어 있으며 본 발명의 재조합 항체들을 발현하여 변경된 글리코실화를 가지는 항체를 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705, 및 Ms709는 퓨코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8(알파 (1,6) 퓨코실트랜스퍼라제)이 결여되어 있어서, Ms704, Ms705, 및 Ms709 세포주에서 발현되는 항체들은 그들 탄수화물 상에서 퓨코스가 결여되어 있다. Ms704, Ms705, 및 Ms709 FUT8-/- 세포주들은 두 개의 대체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자를 표적 파괴함으로써 만들 수 있다(Yamane 등의 미국 특허공개 번호 제20040110704호 및 Yamane-Ohnuki 등 (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22 참조). 다른 예로서, Hanai 등의 EP 제1,176,195호에는 퓨코실 트랜스퍼라제를 암호화하는 FUT8 유전자가 기능적으로 파괴되어 있는 세포주가 기술되어 있고, 그러한 세포주에서 발현되는 항체들은 알파 1,6 결합-관련 효소를 감소시키거나 제거함으로써 저퓨코실화를 나타내게 된다. Hanai 등은 또한 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 퓨코스를 첨가하는데 낮은 효소 활성을 가지는 또는 그러한 효소 활성을 가지지 않는 세포주, 예를 들어, 래트 골수종 세포주 YB2/0(ATCC CRL 1662)를 기술하고 있다. Presta의 PCT 공개번호 제WO 03/035835호는 변형 CHO 세포주인 Lec13 세포에 대해서 기술하고 있는 데, 이 세포들은 Asn(297)-연결 탄수화물에 퓨코스를 첨부하는 능력이 감소되어 있어서, 그러한 숙주 세포에서 발현된 항체들에 저퓨코실화를 야기하게 된다(또한 Shields, R.L. 등 (2002) J. Biol . Chem. 277:26733-26740 참조). 변형된 글리코실화 프로파일을 갖는 항체는 또한, 미국 특허출원 번호 제 PCT/US06/05853호에 설명된 바와 같이, 닭의 알에서 생산할 수 있다. 대안적으로, 변형된 글리코실화 프로파일을 갖는 항체는, 렘나(Lemna)와 같은, 식물 세포에서 생산될 수 있다. 식물 시스템에서 항체의 생산을 위한 방법은 2006년 8월 11일에 출원된, Alston & Bird LLP attorney docket No. 040989/314911에 해당하는 미국 특허 출원에 공지되어 있다. Umana 등의 PCT 공개번호 제WO 99/54342호는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기술하고 있고, 이러한 조작된 세포주에서 발현된 항체들은 증가된 양갈래 GlcNac 구조를 보이고, 결과적으로 상기 항체들의 증가된 ADCC 활성을 나타낸다(Umana 등 (1999) Nat . Biotech. 17:176-180을 참조). 대안적으로, 퓨코시다제 효소를 사용하여 상기 항체의 퓨코스 잔기를 절단할 수 있다. 예를 들어, 퓨코시다제 알파-L-퓨코시다제는 항체들에서 퓨코실 잔기를 제거한다(Tarentino, A.L. 등 (1975) Biochem. 14:5516-23).
추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체를 만들 수 있는데, 변경은 항체의 시알릴화(sialyation)의 수준과 관련이 있다. 그러한 변경은 Dickey 등의 PCT 공개번호 제 WO/2007/084926호 및 Ravetch 등의 PCT 공개번호 제 WO/2007/055916호에 기술되어 있는데, 이 둘은 그 전체가 참고로서 본 명세서에 병합되어 있다. 예를 들어, 아스로박터 우레아파센스 시알리다제(Arthrobacter ureafacens sialidase)와 같은, 시알리다제와의 효소 반응을 이용할 수 있다. 그러한 반응의 조건은 미국 특허번호 제 5,831,077호에 일반적으로 기술되어 있으며, 이것은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 병합되어 있다. 적절한 효소의 다른 비-제한적 예들은, Schloemer 등, J. Virology, 15(4), 882-893 (1975) 및 Leibiger 등, Biochem J., 338, 529-538 (1999)에 각각 기술된 바와 같은, 뉴라미니다제(neuraminidase) 및 N-글리코시다제 F이다. 탈시알릴화된 항체를 친화성 크로마토그래피를 이용하여 더 정제할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 시알트랜스퍼라제(sialytransferase) 효소를 이용함으로써 시알릴화의 수준을 증가시키는 방법을 이용할 수 있다. 그러한 반응의 조건들이 Basset 등, Scandinavian Journal of Immunology, 51(3), 307-311 (2000)에 일반적으로 기술되어 있다.
본 발명에 의하여 고려될 수 있는 본원 항체들의 다른 변형은 페그화(pegylation)이다. 항체를 페그화시켜, 예를 들어, 항체의 생물학적(예, 혈청) 반감기를 늘릴 수 있다. 항체를 페그화시키기 위해, 항체 또는 이의 단편을, 예를 들어, PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과, 하나 이상의 PEG 군이 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에서 반응시킨다. 바람직하게, 페그화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 실시된다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 “폴리에틸렌 글리콜”은 다른 단백질들, 예를 들어, 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 유도하는 데 사용된 PEG의 임의의 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 소정의 구체예에서, 페그화될 항체는 비글리코실화된 항체이다. 단백질을 페그화시키는 방법은 당해 분야에 알려져 있고, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, Nishimura 등의 EP 제0 154 316호 및 Ishikawa 등의 EP 제0 401 384호 참조.
항체 단편 및 항체 의태체
본 발명은 전통적인 항체에 한정되지 않고, 항체 단편 및 항체 의태체를 사용하여 실행될 수 있다. 하기에 기술된 바와 같이, 다양한 항체 단편 및 항체 의태 기술이 개발되고 있으며 당해 업계에 널리 공지되어 있다. 도메인 항체, 나노바디 및 유니바디와 같이, 이러한 많은 기술들은, 통상적인 항체 구조의 단편 또는 다른 변형체를 이용하는 반면에, 통상적인 항체 결합을 의태하지만, 독특한 메커니즘들로부터 발생되고 이를 통해 기능하는 결합 구조를 사용하는, 어피바디, 디에이알핀, 안티칼린, 아비머, 및 베르사바디와 같은, 대안적 기술도 있다.
도메인 항체(dAbs)는 항체의 최소 기능적 결합 유닛으로서, 인간 항체의 중쇄 (VH) 또는 경쇄 (VL)의 가변 영역에 상응한다. 도메인 항체는 약 13 kDa의 분자량을 가진다. 도만티스(Domantis)는 완전 인간 VH 및 VL dAb들의 일련의 크고 높은 기능적 라이브러리(각 라이브러리당 백억개 이상의 상이한 서열)를 개발하였고, 이러한 라이브러리를 사용하여 치료적 표적에 특이적인 dAb를 선택한다.　많은 통상적인 항체들과는 달리, 도메인 항체들은 박테리아, 효모, 및 포유동물 세포 시스템에서 잘 발현된다. 도메인 항체들 및 이의 제조방법에 대한 상세 설명은 미국 특허 번호 제6,291,158호; 제6,582,915호; 제6,593,081호; 제6,172,197호; 제6,696,245호; 미국 출원 일련 번호 제2004/0110941호; 유럽 특허출원 번호 제1433846호 및 유럽 특허 번호 제0368684호 및 제0616640호; 제WO05/035572호, 제WO04/101790호, 제WO04/081026호, 제WO04/058821호, 제WO04/003019호 및 제WO03/002609호에서 찾을 수 있고, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참조 문헌으로 통합되어 있다.
나노바디는 자연적으로-일어나는 중쇄 항체의 유일한 구조적 및 기능적 성질을 포함하는 항체-유도 치료 단백질이다. 이들 중쇄 항체는 단일 가변 도메인(VHH) 및 두 개의 불변 도메인(CH2 및 CH3)을 포함한다. 중요한 것은, 클론화되고 분리된 VHH 도메인은 원래 중쇄 항체의 전체 항원-결합 능을 보유하고 있는 완벽하게 안정된 폴리펩티드이다. 나노바디들은 인간 항체들의 VH 도메인과 높은 상동성을 가지며 활성의 임의의 손실 없이 더 인간화될 수 있다. 중요한 것은 나노바디가 낮은 면역원성 잠재능을 가지며, 이는 나노바디가 주된 화합물로 사용된 영장류 실험에서 확인되었다.
나노바디는 통상적인 항체들의 장점과 작은 분자 약물의 중요한 성질을 조합한다. 통상적인 항체들과 같이, 나노바디들은 높은 표적 특이성, 이들 표적에 대한 높은 특이성 및 낮은 내재적 독성을 보인다. 그러나, 작은 분자 약물과 같이, 이들은 효소를 억제하며 수용체 틈에 용이하게 접근할 수 있다. 또한, 나노바디들은 매우 안정하고, 주사 외 다른 방식으로 투여될 수 있고 (예, 제WO 04/041867호 참조, 본 명세서에 참조 문헌으로 병합됨), 제조하기 쉽다. 나노바디의 다른 장점은 그들의 작은 크기의 결과로서, 공통적이지 않거나 숨겨진 에피토프를 인식하고, 그들의 독특한 삼차원적, 약물 포맷 유연성으로 인하여 높은 친화도 및 선택성으로 단백질 표적의 빈 공간 또는 활성 부위에 결합하며, 약물 전달의 수명, 용이성과 속도를 맞추는 것을 포함한다.
나노바디는 단일 유전자에 의해 암호화되며 거의 모든 원핵 및 진핵 숙주, 예를 들어, E. coli(예, 미국 특허 번호 제6,765,087호 참조, 이는 전체적으로 본 명세서에 참조 문헌으로 병합됨), 곰팡이(molds)(예, 아스파질러스 또는 트리코데마) 및 효소 (예, 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 한세눌라 또는 피키아)(예, 미국 특허 번호 제6,838,254호 참조, 이는 전체적으로 본 명세서에서 참조문헌으로 병합됨)에서 효과적으로 생산된다. 제조 공정은 증감될 수 있고 수 킬로그램 양의 나노바디들을 생산해왔다. 나노바디들이 통상적인 항체에 비하여, 뛰어난 안정성을 나타내므로, 이들은 긴 보관 수명, 즉시 사용되는 용액으로서 제형화될 수 있다.
나노클론 방법(예, 제WO 06/079372호 참조, 이는 전체적으로 본 명세서에 참조문헌으로 병합됨)은 B-세포의 자동화된 고출력 선택에 기초하여, 원하는 표적에 대하여 나노바디를 생성하는 독점적 방법으로서, 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.
유니바디는 또 다른 항체 단편 기술이지만, 이러한 것은 IgG4 항체들의 힌지 영역을 제거하는 것에 기초한다. 힌지 영역을 삭제하면 통상적인 IgG4 항체들의 크기에 실질적으로 절반인 분자가 생성되고, IgG4 항체들의 이가 결합 영역보다는 일가 결합 영역을 가진다. IgG4 항체들이 비활성적이고 따라서 면역계와 상호작용하지 않는데, 이는 면역 반응을 원치 않는 질병 치료에 장점일 수 있고, 이러한 장점은 유니바디에 있는 것이 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 유니바디들은 그들이 결합된 세포를 억제하거나 휴지(silence)시키지만 죽이지는 않게 기능할 수 있다. 부가적으로, 암 세포에 결합하는 유니바디는 증식하도록 그것들을 자극하지 않는다. 더구나, 유니바디는 통상적IgG4 항체의 크기의 반 정도이기 때문에, 더 큰 고형암에 걸쳐 잠재적으로 유리한 효능으로 더 좋은 분포를 나타낼 수 있다. 유니바디는 온전한 IgG4 항체들과 유사한 속도로 신체에서 제거되며 온전한 항체들과 유사한 항원 친화도로 결합할 수 있다. 유니바디의 상세 설명은 특허출원 제WO2007/059782호를 참조할 수 있고, 이것은 전체적으로 본 명세서에 참조문헌으로 병합된다.
어피바디 분자는, 포도상구균의 단백질 A의 IgG-결합 도메인들 중 하나로부터 유래되는, 58-아미노산 잔기 단백질 도메인에 기초한 새로운 형태의 친화성 단백질을 나타낸다. 이러한 세 개 나선 묶음 도메인은 조합성 파지미드 라이브러리의 제작용 골격으로 사용될 수 있고, 그로부터 파지 디스플레이 기술을 사용하여 원하는 분자를 표적하는 어피바디 변이체를 선택할 수 있다(Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain, Nat Biotechnol 1997;15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur J Biochem 2002;269:2647-55). 어피바디 분자의 간단하고 견고한 구조는 이들의 저분자량(6 kDa)과 조합되어 이들을 다양한 적용에, 예를 들어, 검출 시약에 적절하게 하고(Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, 등, Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli, J Immunol Methods 2002;261:199-211), 수용체 상호작용을 억제한다(Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering, Protein Eng 2003;16:691-7). 어피바디 및 이의 제조 방법의 상세 설명은 미국 특허 번호 제5,831,012호를 참조할 수 있고, 이것은 전체적으로 본 명세서에 참조 문헌으로 병합되어 있다.
표지된 어피바디는 또한 이소형태의 풍부함을 결정하기 위한 이미징 어플리케이션에 유용하다.
디에이알핀(DARPin, Designed Ankyrin Repeat Proteins)은 항체 의태 DRP(Designed Repeat Protein) 기술의 한 예인데, 이는 비-항체 폴리펩티드의 결합 능력을 이용하기 위해 개발되었다. 안키린 또는 류신이 많은 반복 단백질과 같은 반복 단백질은 편재하는 결합 분자이고, 이는 항체와는 달리, 세포 내 및 세포외적으로 발생한다. 이들의 독특한 모듈식 건축구조는 반복되는 구조적 단위체(반복체)를 특징으로 하고, 이것들은 함께 쌓여져서 가변성 및 모듈식의 표적-결합 표면을 나타내는 연장된 반복 도메인을 형성한다. 이러한 모듈성에 근거하여, 고도로 다양화된 결합 특이성을 가지는 폴리펩티드들의 조합적 라이브러리들을 생성할 수 있다. 이러한 전략은 가변적인 표면 잔기 및 이들이 무작위적으로 반복 도메인으로 결집되는 것을 나타내는 자가-양립성 반복체들의 일치된 구성을 포함한다.
디에이알핀은 고효율로 박테리아성 발현 시스템에서 생산될 수 있으며, 공지된 가장 안정한 단백질에 속한다. 인간 수용체, 사이토카인, 키나아제, 인간 프로테아제, 바이러스 및 막 단백질을 포함한 광범위한 표적 단백질에 대한 매우 특이적이고 고친화도인 디에이알핀들을 선택하였다. 단단위(single-digit) 나노몰 내지 피코몰 범위의 친화도를 가지는 디에이알핀들을 얻을 수 있다.
디에이알핀은 ELISA, 샌드위치 ELISA, 유세포 분석(FACS), 면역조직화학(IHC), 칩 응용, 친화도 정제 또는 웨스턴 블랏팅을 포함하여, 광범위한 범위의 어플리케이션에 사용되어 왔다. 디에이알핀은 또한, 예를 들어, 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP)에 융합된 세포내 마커 단백질로서 세포내 분획에서 매우 활성적이라는 것이 증명되었다. 디에이알핀은 또한 pM 범위 내에 있는 IC50으로 바이러스 입장을 억제하는 데 사용되었다. 디에이알핀은 단백질-단백질 상호작용을 차단하는 데 이상적일 뿐 아니라, 효소를 억제하는 데에도 이상적이다. 프로테아제, 키나아제 및 운반자가 가장 일반적으로 알로스테릭 억제 방식으로 성공적으로 억제되었다. 종양 상에 매우 빠르고 특이적으로 농축되는 것과 매우 양호한 종양 대 혈액 비율로 인하여, 디에이알핀은 생체내 진단 또는 치료적 접근에 매우 적절하다.
디에이알핀 및 다른 DRP 기술에 관한 추가의 정보는 미국 특허 출원 공개 번호 제2004/0132028호 및 국제 특허 출원 공개 공보 제 WO 02/20565호에서 발견될 수 있고, 둘 다 본 명세서에 전체적으로 참조 문헌으로서 병합된다.
안티칼린은 추가적인 항체 의태 기술이나, 이 경우, 결합 특이성은 리포칼린, 즉 인간 조직 및 체액에서 자연적으로 그리고 풍부하게 발현되는 저분자량 단백질의 군으로부터 유래된다. 리포칼린은 생체 내에서 생리적 수송 및 화학적으로 민감하거나 불용성인 화합물의 저장과 관련된 일단의 기능들을 수행하기 위해 발달하였다. 리포칼린은 단백질의 하나의 말단에서 네 개 루프를 지지하는 고도로 보존된 β-배럴을 포함하는 견고하고 고유한 구조를 가진다. 이러한 루프들은 결합 포켓의 입구를 형성하고, 분자의 이러한 부분에서의 형태적 차이는 개별 리포칼린 간의 결합 특이성에서의 다변화를 설명한다.
보존된 β-시트 골격에 의해 지지되는 초가변성 루프의 전체 구조가 면역글로불린의 흔적이지만, 리포칼린은 크기에서 항체들과 상당히 상이하며, 단일 면역글로불린 도메인보다 약간 더 큰 160-180 아미노산들의 단일 폴리펩티드 사슬로 구성된다.
리포칼린을 클론화하고 이들의 루프를 조작하여 안티칼린을 생성한다. 구조적으로 다양한 안티칼린들의 라이브러리를 생성하였고 안티칼린 디스플레이는 결합 기능의 선택 및 스크리닝을 가능하게 하며, 용해성 단백질을 발현하고 생성하여 원핵 또는 진핵 시스템에서 더 분석할 수 있다. 연구에 따르면, 실질적으로 임의의 인간 표적 단백질에 특이적인 안티칼린을 개발할 수 있고 분리할 수 있으며, 나노몰 또는 그 이상의 범위의 결합 친화도를 얻을 수 있다는 것이 성공적으로 밝혀졌다.
또한 안티칼린은 소위 듀오칼린으로 불리는, 이중 표적화 단백질로서 형성될 수 있다. 듀오칼린은, 그의 두개 결합 도메인의 구조적 방향과는 관계없이 표적 특이성 및 친화도를 유지하면서, 표준 제조방법으로 용이하게 제조되는 하나의 단량체성 단백질에서 두 개의 개별적인 치료적 표적을 결합한다.
단일 분자를 통하여 다중 표적들을 조정하는 것은 단일 원인 인자 이상을 포함하는 것으로 알려진 질병에 특히 유리하다. 더욱이, 듀오칼린과 같은 이중 또는 다중 결합 형식은 질병에서 세포 표면 분자를 표적화하는데 있어서, 신호 전달 경로 상에 작용 효과(agonistic effect)를 매개하는데 있어서, 또는 세포 표면 수용체들을 결합하고 클러스터링하는 것을 통해 향상된 내부화 효과를 유도하는 데 있어서 상당한 잠재능력을 가진다. 더구나, 듀오칼린의 높은 고유 안정성은 단량체성 안티칼린과 비견되며, 듀오칼린에게 유연한 배합 및 전달 능력을 제공한다.
안티칼린에 대한 추가 정보는 미국 특허 번호 제7,250,297호 및 국제 특허 출원 공개번호 제 WO 99/16873호에서 발견되며, 이 둘은 본 명세서에서 참조 문헌으로서 병합된다.
본 발명의 맥락에 유용한 또 다른 항체 의태 기술은 아비머이다. 아비머는 시험관내 엑손 셔플링(exon shuffling) 및 파지 디스플레이에 의해 인간 세포외 수용체 도메인의 거대 군으로부터 개발되고, 결합 및 억제 성질을 갖는 다중도메인 단백질을 생성한다. 다중 독립적 결합 도메인들을 연결하는 것은, 결합활성(avidity)을 생성하고 그 결과로 통상적인 단일-에피토프 결합 단백질에 비하여 친화도 및 특이성을 향상시킨다는 것을 보여 주었다. 잠재적 장점은 대장균(Escherichia coli) 내에서 다중표적-특이적 분자를 간단하고 효율적으로 생산하고, 열안정성 및 프로테아제에 대한 내성을 향상시킨다는 것을 포함한다. 나노몰 이하의 친화도를 가지는 아비머를 다양한 표적에 대하여 얻었다.
아비머에 대한 추가 정보는 미국 특허출원 공개번호 제2006/0286603호, 제2006/0234299호, 제2006/0223114호, 제2006/0177831호, 제2006/0008844호, 제2005/0221384호, 제2005/0164301호, 제2005/0089932호, 제2005/0053973호, 제2005/0048512호, 제2004/0175756호에서 발견되며, 이 모두는 전체적으로 본 명세서에 참조 문헌으로서 병합된다.
베르사바디(Versabodies)는 본 발명에 사용될 수 있는 다른 항체 의태 기술이다. 베르사바디는 >15% 시스테인 함량을 갖는 3-5 kDa의 작은 단백질이고, 높은 이황화물 밀도 골격을 형성하여, 통상적인 단백질이 가지는 소수성 코어를 대체한다. 소수성 코어를 포함하는, 많은 수의 소수성 아미노산을 작은 수의 이황화물로 대체하면, 더 작고, 더 강한 친수성(덜 결집되고 비-특이적 결합)이고, 프로테아제와 열에 더 저항성이 있으며, 더 낮은 밀도의 T-세포 에피토프를 가지는 단백질을 생성하게 되는데 이는, MHC 발현에 대부분 기여하는 잔기가 소수성이기 때문이다. 이러한 네가지 성질 모두는 면역원성에 영향을 끼치는 것으로 알려져 있고, 이들은 함께 면역원성을 크게 저하시킬 것으로 예상된다.
베르사바디 대한 영감은 거머리, 뱀, 거미, 전갈, 달팽이, 및 말미잘에 의해 생산되는 천연적 주입성 생약학물로부터 나온 것인데, 이것은 예상외로 낮은 면역원성을 보이는 것으로 알려진다. 모양에 의해서 그리고 크기를 스크리닝함으로써, 선택된 천연 단백질 군으로 출발하여, 소수성, 단백질 가수분해성 항원 가공 및 에피토프 밀도를 천연적 주입성 단백질에 대하여 평균보다 훨씬 낮은 수준으로 최소화한다.
베르사바디의 구조가 주어지면, 이러한 항체 의태체는 다-가(multi-valency), 다중 특이성, 다양한 반감기 메카니즘, 조직 표적화 모듈 및 항체 Fc 영역의 부재를 포함하는 다양한 형식을 제공한다. 더구나, 베르사바디는 E. coli에서 고효율로 제조되며, 그들의 친수성 및 작은 크기 때문에, 베르사바디는 고도로 용해성이고 고농도로 제형될 수 있다. 베르사바디는 뛰어나게 열에 안정성이고(그것들을 끓일 수도 있음) 보관 수명이 길다.
베르사바디에 대한 추가 정보는 미국 특허출원 공개번호 제2007/0191272호에서 발견되며, 그 전체가 본 명세서에서 참조 문헌으로서 병합된다.
상기에서 제공된 항체 단편 및 항체 의태 기술의 상세한 설명은 본 명세서의 맥락에서 사용될 수 있는 모든 기술의 포함 목록인 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 비제한적 방식으로, 다양한 추가 기술이 본 발명의 맥락에서 사용할 수 있는 데, Qui 등, Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007)(이는 그 전체로서 본 명세서에 참조 문헌으로서 병합됨)에 개략적으로 기술된 상보적 결정 영역의 융합과 같은 대안적 폴리펩티드-기반 기술을 포함하며, 뿐만 아니라, 미국 특허번호 제5,789,157호, 제5,864,026호, 제5,712,375호, 제5,763,566호, 제6,013,443호, 제6,376,474호, 제6,613,526호, 제6,114,120호, 제6,261,774호, 및 제6,387,620호(이들 모두는 그 전체로서 본 명세서에 참조 문헌으로서 병합됨)에 서술된 RNA 앱타머 기술(RNA aptamer technologies)과 같은 핵산-기반 기술도 포함한다.
항체 물리적 성질
본 발명의 항체들은 항-CD22 항체의 다양한 물리적 성질에 의해 더 특성화될 수 있다. 다양한 분석 방법들을 사용하여 이러한 물리적 성질에 근거하여 항체들의 상이한 부류를 검출 및/또는 분화시킬 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 항체들은 경쇄 또는 중쇄 가변 영역에서 하나 이상의 글리코실화 자리를 가질 수 있다. 가변 영역에서 하나 이상의 글리코실화 자리가 존재하는 것은 변경된 항원 결합으로 인하여 항체의 면역원성을 높이거나 또는 항체의 pK를 변경하는 결과를 가져올 수 있다(Marshall 등 (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA 및 Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick 등 (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh 등 (1985) Nature 316:452-7; Mimura 등 (2000) Mol Immunol 37:697-706). 글리코실화는 N-X-S/T 서열을 포함하는 모티프(motifs)에서 발생한다고 알려져 있다. 가변 영역 글리코실화는 글로코블랏(Glycoblot) 분석법을 사용하여 테스트할 수 있는데, 이는 항체를 절단하여 Fab를 생산한 후, 과요오드산 산화 및 쉬프(Schiff) 염기 형성을 측정하는 분석법을 사용하여 글리코실화를 테스트한다. 대안적으로, 가변 영역 글리코실화는 다이오넥스 광 크로마토그래피(Dionex-LC)를 사용하여 테스트할 수 있는데, 이는 Fab로부터 당류를 단당류로 절단하고 개별적인 당 함유량을 분석한다. 어떤 경우에, 가변 영역 글리코실화를 포함하지 않는 항-CD22 항체를 가지는 것이 바람직하다. 이것은 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여, 가변 영역에서 글리코실화 모티프를 포함하지 않는 항체들을 선택함으로써 또는 글리코실화 모티프 내에 잔기를 돌연변이시킴으로써 성취될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체들은 아스파라긴 이성화 자리를 포함하지 않는다. 탈아미드화 또는 이소아스파르트 산 효과는 각각 N-G 또는 D-G 서열들에서 일어날 수 있다. 탈아미드화 또는 이소아스파르트 산 효과는 이소아스파르트 산의 생성을 야기하는데, 이것은 주 사슬보다는 측쇄 카르복시 말단의 얽힘 구조(kinked structure)를 생성함으로써 항체의 안정성을 저하시킨다. 이소아스파르트 산의 생성은 역-상 HPLC를 사용하여 이소아스파르트 산에 대하여 테스트하는 등량분석법(iso-quant assay)을 사용하여 측정될 수 있다.
각 항체는 고유의 등전위점(pI)을 가지나, 일반적으로 항체들은 6 내지 9.5 사이의 pH 범위 안에 거한다. IgG1 항체에 대한 pI는 대표적으로 7-9.5의 pH 범위에 있고, IgG4 항체에 대한 pI는 대체로 6-8의 pH 범위에 거한다. 항체들은 이러한 범위 밖에 있는 pI를 가질 수 있다. 비록 상기 효과들이 일반적으로 알려져 있지 않더라도, 정상적인 범위 밖의 pI를 가진 항체들이 생체내 조건하에서 풀림(unfolding) 및 불안정성을 가질 수 있다고 생각된다. 상기 등전점을 모세관 등전위 초점 분석법(capillary isoelectric focusing assay)을 사용하여 테스트할 수 있는데, 이것은 pH 구배를 만들고 레이저 포커싱을 사용하여 정확성을 높일 수 있다(Janini 등 (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma 등 (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt 등 (1998) J Chromatogr A 800:355-67). 어떤 경우에, 정상 범위에 들어가는 pI 값을 포함하는 항-CD22 항체를 가지는 것이 바람직하다. 이것은 정상 범위 내의 pI를 갖는 항체를 선택함으로써, 또는 해당 분야에서 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 하전된 표면 잔기를 돌연변이시킴으로써 이룰 수 있다.
각 항체는 열 안정성을 나타내는 용융점을 가질 수 있다(Krishnamurthy R 및 Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). 더 높은 열적 안정성은 생체내에서 더 큰 전체 항체 안정성을 나타낸다. 항체의 용융점은 차등 스캐닝 열량계와 같은 기술을 사용하여 측정될 수 있다(Chen 등 (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando 등 (1999) Immunol Lett 68:47-52). TM1은 항체의 초기 풀림의 온도를 나타낸다. TM2는 항체의 완전한 풀림의 온도를 나타낸다. 일반적으로, 본 발명의 항체의 TM1은 60℃ 이상, 바람직하게는 65℃ 이상, 더욱 바람직하게는 70℃ 이상이다. 대안적으로, 항체의 열적 안정성은 원편광 이색성 분석(circular dichroism)을 사용하여 측정될 수 있다(Murray 등 (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).
바람직한 구체예에서, 빠르게 분해하지 않는 항체들을 선택한다. 항-CD22 항체의 단편화는, 당해 분야에 공지된, 모세관 전기영동(CE) 및 MALDI-MS를 이용하여 측정될 수 있다(Alexander AJ 및 Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).
다른 바람직한 구체예에서, 최소 결집 효과를 갖는 항체들을 선택한다. 결집은 원치 않는 면역 반응 및/또는 변경되거나 바람직하지 않은 약물동력학(pharmacokinetic) 성질을 개시하게 할 수 있다. 일반적으로, 25% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 더욱 바람직하게는 15% 이하, 더 더욱 바람직하게는 10% 이하, 그리고 더욱 더 바람직하게는 5% 이하로 결집하는 항체가 허용된다. 결집은, 크기 배제 컬럼(size-exclusion column, SEC) 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC) 및 광 분산을 포함한, 당해 분야에 공지된 몇가지 기술을 사용하여 단량체, 이량체, 삼량체 또는 다량체를 확인하여 측정될 수 있다.
항체를 조작하는 방법
상기에 서술된 바와 같이, 본 명세서에서 공지된 VH 및 VL 서열들을 갖는 항-CD22 항체를 사용하여 VH 및/또는 VL 서열들 또는 이에 부착된 불변 영역(들)을 변형함으로써 새로운 항-CD22 항체들을 만들 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 관점에서, 본 발명의 항-CD22 항체, 예컨대 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6의 구조적 특징을 이용하여, 인간 CD22에 결합하는 것과 같은, 본 발명의 항체의 적어도 하나의 기능적 성질을 보유하는, 구조적으로 관련된 항-CD22 항체를 만들 수 있다. 예를 들어, 상기에 검토된 바와 같이, 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6, 또는 이의 돌연변이들의 하나 이상의 CDR 영역을 공지된 골격 영역 및/또는 다른 CDR들과 재조합적으로 조합하여, 추가의 재조합적으로 조작된 본 발명의 항-CD22 항체를 만들 수 있다. 변형의 다른 유형은 앞 부분에서 설명되었던 것들을 포함한다. 이러한 조작 방법에 사용되는 개시 물질은 본 명세서에서 제공된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열들 또는 이의 하나 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 만들기 위해, 본 명세서에서 제공된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열들 또는 이의 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조하는(즉, 단백질로서 발현시킴) 것은 필요치 않다. 그보다는, 그 서열(들)에 포함된 정보를 개시 물질로 사용하여 원래 서열(들)로부터 유래된 “2세대” 서열(들)을 생성시킨 후, 상기 “2세대” 서열(들)을 제조하고 단백질로서 발현시킨다.
따라서, 다른 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-CD22 항체를 제조하는 방법을 제공한다:
(a) (i) 서열번호 1-4 및 63-65로 구성되는 군으로부터 선택된 CDR1 서열; 서열번호 5-8, 60, 및 66-68 로 구성되는 군으로부터 선택된 CDR2 서열; 및/또는 서열번호 9-12 및 69-71로 구성되는 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및/또는 (ii) 서열번호 13-18 및 72-74로 구성되는 군으로부터 선택된 CDR1 서열; 서열번호 19-24 및 75-77로 구성되는 군으로부터 선택된 CDR2 서열; 및/또는 서열번호 25-30 및 78-80으로 구성되는 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 제공하고;
(b) 상기 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 상기 경쇄 가변 영역 항체 서열 내에서의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경하여 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 생성하고; 및
(c) 상기 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현하는 것.
예를 들어, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 상기 변경된 항체 서열을 제조하고 발현시킬 수 있다.
바람직하게, 변경된 항체 서열(들)에 의하여 암호화된 항체는 본 명세서에서 기술된 항-CD22 항체의 기능적 성질들의 하나, 몇 개 또는 모두를 보유하는 항체이며, 상기 기능적 성질들은 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
(a) CD22+ 세포로 내재화하고;
(b) CD22+ 세포 상에서 ADCC 활성을 나타내며;
(c) BCR 자극에 의하여 유도되는 라모스 세포의 세포 사멸을 증진시키고;
(d) 라모스 세포 상에서 직접 항-증식성 효과를 가지지 않으며;
(e) 라모스 세포 내에서 칼슘 플럭스를 유도하지 않고; 및/또는
(f) 세포독소에 접합될 때 생체내에서 CD22-발현 세포의 성장을 억제한다.
상기 변경된 항체들의 기능적 성질들은 실시예에서 설명된 바와 같이, 당해 분야에서 이용가능하고 및/또는 본 명세서에 서술된 표준 분석법을 이용하여 평가될 수 있다.
본 발명의 항체를 조작하는 방법에 관한 소정의 구체예에서, 항-CD22 항체 암호화 서열의 전체 또는 일부를 따라서 돌연변이를 무작위적으로 또는 선택적으로 도입할 수 있으며, 그 결과의 변형된 항-CD22 항체들을, 본 명세서에 설명된 바와 같이, 결합 활성에 대하여 및/또는 다른 기능적 성질들에 대하여 스크리닝할 수 있다. 돌연변이 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, Short의 PCT 공개번호 제WO 02/092780호는 포화 돌연변이생성법, 합성 결찰 조립법(synthetic ligation assembly) 또는 이의 조합을 사용하여 항체 돌연변이를 생성하고 검출하는 방법을 기술한다. 대안적으로, Lazar 등의 PCT 공개번호 제WO 03/074679호는 컴퓨터화된 스크리닝 방법을 사용하여 항체들의 생리화학적 성질을 최적화시키는 방법들을 기술한다.
본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자
본 발명의 다른 관점은 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 핵산은 온전한 세포, 세포 용해물, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태 내에 존재할 수 있다. 핵산은, 알카라인/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로즈 젤 전기영동 및 당해 업계에 공지된 다른 기술을 포함한 표준 기술을 사용하여, 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때, “분리”되거나 “실질적으로 순수하게 된”것이다. F. Ausubel 등, ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York을 참조. 본 발명의 핵산은, 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있고 인트론성 서열들을 포함할 수도 안할 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 핵산은 cDNA 분자이다.
본 발명의 핵산을 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 하이브리도마(예, 후술하는 바와 같은 인간 면역글로불린 유전자를 지닌 트랜스유전자성(transgenic) 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현되는 항체의 경우, 하이브리도마에 의해 만들어진 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호하하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 얻을 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 얻은(예, 파지 디스플레이 기술을 사용함) 항체의 경우, 그러한 항체를 암호화하는 핵산은 유전자 라이브러리로부터 회수할 수 있다.
본 발명의 바람직한 핵산 분자들은 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6 단일클론 항체들의 VH 및 VL 서열들을 암호화하는 것들이다. 12C5, 19A3, CD22.1, 16F7, 23C6, CD22.2, 4G6 및 21F6의 VH 서열들을 암호화하는 DNA 서열들은 각각 서열번호 41-44, 62 및 87-89에 나타나 있다(여기에서, 19A3 및 CD22.1의 중쇄는 동일하고 서열번호 42에 대응하고, CD22.2의 중쇄는 서열번호 62에 대응하며, 21F6의 중쇄들은 서열번호 82 및 83에 대응함). 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 및 21F6의 VL 서열들을 암호화하는 DNA 서열들은 각각 서열번호 45-50 및 90-92에 나타나 있다(여기에서, 19A3, CD22.1 및 CD22.2의 카파 경쇄들은 동일하고 서열번호 46에 대응하고, 16F7의 카파 경쇄는 서열번호 47 또는 48에 대응하며, 23C6의 카파 경쇄는 서열번호 49 또는 50에 대응하고, 4G6의 카파 경쇄는 서열번호 90 또는 91에 대응함) .
일단 VH 및 VL 분절을 암호화하는 DNA 단편들을 얻는다면, 이러한 DNA 단편들은 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 더 조작하여, 예를 들어, 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자로, Fab 단편 유전자로 또는 scFv 유전자로 변환시킬 수 있다. 이러한 조작에서, VL- 또는 VH-암호화 DNA 단편은 항체 불변 영역 또는 유연한 링커와 같은, 다른 단백질을 암호화하는 다른 DNA 단편과 작동적으로 연결되어 있다. 본 명세서의 맥락에서 사용되는, 용어 “작동적으로 연결된”은, 두 개 DNA 단편들이 연결되어서 그 두 개 DNA 단편들에 의해 암호화된 아미노산 서열들이 프레임 내에 남아있는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
VH-암호화 DNA를 불변 영역들(CH1, CH2, 및 CH3)을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결함으로써 VH 영역을 암호화하는 분리된 DNA를 전장 중쇄 유전자로 변환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자들의 서열은 당해 분야에 공지되어 있고(예, Kabat, E. A. 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조), 이러한 영역들을 포함하는 DNA 단편들을 표준 PCR 증폭에 의하여 얻을 수 있다. 상기 중쇄 불변 영역이 IgG1, IgQ1, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있으나, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-암호화 DNA를 중쇄 CH1 불변 영역만을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결할 수 있다.
VL-암호화 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결함으로써, VL 영역을 암호화하는 분리된 DNA를 전장 경쇄 유전자(Fab 경쇄 유전자는 물론)로 변환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열들은 당해 분야에 공지되어 있고(예, Kabat, E. A. 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조), 이러한 영역들을 포함하는 DNA 단편들은 표준 PCR 증폭에 의하여 얻을 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 만들기 위해, VH- 및 VL-암호화 DNA 단편들을 유연한 링커를 암호화하는, 예를 들어, 아미노산 서열 (Gly4 -Ser)3을 암호화하는 다른 단편에 작동적으로 연결시켜서, VH 및 VL 서열들을 상기 유연한 링커로 연결된 VL 및 VH를 가지고, 연속적인 단일 사슬 단백질로서 발현하게 할 수 있다(예, Bird 등 (1988) Science 242:423-426; Huston 등 (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883; McCafferty 등 (1990) Nature 348:552-554 참조).
본 발명의 단일클론 항체의 생산
본 발명의 단일클론 항체(mAbs)를 통상적인 단일클론 항체 방법, 예를 들어, Kohler 및 Milstein (1975) Nature 256:495 의 표준 체세포 하이브리드화 기술을 포함하는 다양한 기술로 생산할 수 있다. 비록 체세포 하이브리드화 과정이 바람직하다 하더라도, 원칙적으로, 단일클론 항체를 생산하는 다른 기술, 예를 들어, B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성 형질전환을 사용할 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 바람직한 동물 시스템은 쥐 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 매우 잘 확립된 방법이다. 면역화 프로토콜 및 융합용 면역화된 비장세포의 분리 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 융합 파트너들(예를 들어, 쥐의 골수종 세포) 및 융합 공정 또한 공지되어 있다.
본 발명의 키메릭 또는 인간화 항체들을 전술한 대로 제조된 비-인간 단일클론 항체의 서열에 근거하여 제조할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린들을 암호화하는 DNA는 관심의 비-인간 하이브리도마로부터 얻을 수 있고, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 비-쥐(예, 인간) 면역글로불린 서열을 포함하도록 조작할 수 있다. 예를 들어, 키메릭 항체를 생성하기 위해, 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 쥐의 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다(예, Cabilly 등의 미국 특허 제4,816,567호 참조). 인간화 항체를 만들기 위해, 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 쥐의 CDR 영역들을 인간 골격으로 삽입할 수 있다(예, Winter의 미국 특허 제5,225,539호 및 Queen 등의 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).
바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체들은 인간 단일클론 항체들이다. CD22에 대하여 지정된 그러한 인간 단일클론 항체들은 마우스 시스템보다는 인간 면역 시스템의 부분을 지닌 트랜스유전자성(transgenic) 또는 트랜스염색체성(transchromosomic) 마우스를 사용하여 생산할 수 있다. 이러한 트랜스유전자성 및 트랜스염색체성 마우스는 각각 본 명세서에서 HuMAb Mouse® 및 KM Mouse®로 지칭되는 마우스를 포함하고, 총칭하여 본원에서 “인간 Ig 마우스”라 지칭한다.
HuMAb 마우스®(Medarex®사)는 정렬되지 않은 인간 중쇄(μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열들을, 내인성 μ 및 κ 사슬 좌위를 비활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 암호화하는 인간 면역글로불린 유전자 미소좌위(miniloci)를 포함한다(예, Lonberg, 등 (1994) Nature 368(6474):856-859 참조). 따라서, 상기 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스유전자들은 유형 전환(switching) 및 체세포 돌연변이를 겪게 되어 고 친화도 인간 IgGκ단일클론 항체를 생성한다(Lonberg, N. 등 (1994) 위 문헌; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. 및 Huszar, D. (1995) Intern . Rev . Immunol. 13: 65-93, 및 Harding, F. 및 Lonberg, N. (1995) Ann . N.Y. Acad . Sci. 764:536-546에서 검토됨). HuMab 마우스®제조와 사용, 및 상기 마우스에 의한 게놈 변형은 Taylor, L. 등 (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. 등 (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon 등 (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:3720-3724; Choi 등 (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. 등 (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon 등 (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. 등 (1994) International Immunology 6: 579-591; 및 Fishwild, D. 등 (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851에 더 설명되어 있는데, 이 모든 것들의 내용은 전체적으로 참조 문헌으로서 본 명세서에 특히 병합된다. Lonberg 및 Kay의 미국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 및 제5,770,429호; Surani 등의 미국 특허 제5,545,807호; Lonberg 및 Kay의 PCT 공개공보 제 WO 92/03918호, 제 WO 93/12227호, 제 WO 94/25585호, 제 WO 97/13852호, 제 WO 98/24884호 및 제 WO 99/45962호; 및 Korman 등의 PCT 공개공보 제 WO 01/14424호를 더 참조.
다른 구체예에서, 본 발명의 인간 항체를, 인간 중쇄 트랜스유전자 및 인간 경쇄 트랜스염색체를 지닌 마우스와 같이, 트랜스유전자 및 트랜스염색체 상에 인간 면역글로불린 서열을 지닌 마우스를 사용하여 키울 수 있다. 이 마우스는 본 명세서에서 “KM 마우스®”로 지칭되며, Ishida 등의 PCT 공개공보 제 WO 02/43478 호에 더 상세하게 설명되어 있다.
또한, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스유전자성 동물 시스템은 당해 분야에서 이용가능하며 본 발명의 항-CD22 항체를 키우는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(Abgenix 사)로 지칭되는 대안적 트랜스유전자성 시스템을 사용할 수 있는데; 그러한 마우스는, 예를 들어, Kucherlapati 등의 미국 특허 제5,939,598호; 제6,075,181호; 제6,114,598호; 제6, 150,584호 및 제6,162,963호에 설명되어 있다.
더구나, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스염색체성 동물 시스템은 당해 분야에서 이용가능하고 본 발명의 항-CD22 항체를 키우는데 사용될 수 있다. 예를 들어, “TC 마우스”로 지칭되는, 인간 중쇄 트랜스염색체 및 인간 경쇄 트랜스염색체 둘 다를 지닌 마우스를 사용할 수 있는데; 그러한 마우스는 Tomizuka 등 (2000) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97:722-727에 설명되어 있다. 또한, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스염색체를 지닌 소는 당해 분야에서 설명되어 있고(예, Kuroiwa 등 (2002) Nature Biotechnology 20:889-894 및 PCT 출원 번호 제 WO 2002/092812호) 본 발명의 항-CD22 항체를 키우는데 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 단일클론 항체들은 또한 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하는 파지 디스플레이 방법들을 사용하여 제조할 수 있다. 인간 항체들을 분리하는 그러한 파지 디스플레이 방법들은 당해 분야에 확립되어 있다. 예를 들어: Ladner 등의 미국 특허 제5,223,409호; 제5,403,484호; 및 제5,571,698호; Dower 등의 미국 특허 제5,427,908호 및 제5,580,717호; McCafferty 등의 미국 특허 제5,969,108호 및 제6,172,197호; 및 Griffiths 등의 미국 특허 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호 참조.
본 발명의 인간 단일클론 항체들은 또한 인간 면역 세포가 재구성되어 인간 항체 반응이 면역화시 발생될 수 있는 SCID 마우스를 사용하여 제조할 수 있다. 그러한 마우스는, 예를 들어, Wilson 등의 미국 특허 제5,476,996호 및 제5,698,767호에 설명되어 있다.
다른 구체예에서, Buechler 등의 미국 특허 제 6,794,132호에 기술된 바와 같이, 인간 항-CD22 항체를 인간 Ig 마우스 및 파지 디스플레이 기법의 조합을 이용하여 제조한다. 더구나 특히, 그 방법은 우선 인간 Ig 마우스(상기한 HuMab 마우스 또는 KM 마우스와 같은)를 CD22 항원으로 면역화시킴으로써 상기 마우스에 항-CD22 항체 반응을 키우고, 이어서 핵산 암호화 인간 항체 사슬을 마우스의 림프 세포로부터 분리하고 이러한 핵산을 디스플레이 벡터(예, 파지)에 도입하여 디스플레이 패키지의 라이브러리를 제공하는 것을 포함한다. 따라서, 각 라이브러리 멤버는 인간 항체 사슬을 암호화하는 핵산을 포함하고 각 항체 사슬은 디스플레이 패키지로부터 나타내어진다. 그 다음 라이브러리를 CD22 항원으로 스크린하여 CD22에 특이적으로 결합하는 라이브러리 멤버를 분리한다. 그 후 선택된 라이브러리 멤버의 핵산 삽입물(inserts)을 표준 방법에 의하여 분리하고 배열하여 선택된 CD22 바인더의 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 결정한다. VH 영역이 CH 영역에 작동적으로 연결되고 VL 영역이 CL 영역에 작동적으로 연결될 수 있도록 가변 영역을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 지니는 발현 벡터로 클론화하는 것과 같은, 표준 재조합 DNA 기법에 의하여 가변 영역은 전장 항체 사슬로 전환될 수 있다.
인간 Ig 마우스의 면역화
인간 Ig 마우스를 사용하여 본 발명의 인간 항체를 키울 때, Lonberg, N. 등 (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. 등 (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; 그리고 및 PCT 공개 번호 제WO 98/24884호 및 제WO 01/14424호에 의하여 설명된 바와 같이, 그러한 마우스를 CD22 항원 및/또는 재조합 CD22의 정제되거나 농축된 제조물, 또는 CD22를 발현하는 세포, 또는 CD22 융합 단백질로 면역화할 수 있다. 바람직하게는, 상기 마우스는 첫 주입시 6-16 주령일 것이다. 예를 들어, CD22 항원의 정제되거나 재조합 제조물(5-50 μg)은 복강내로 인간 Ig 마우스를 면역화시키는데 사용될 수 있다. 가장 바람직하게, 본 발명의 항체를 키우는데 사용되는 면역원은 재조합 인간 CD22 세포외 도메인 및 조작되어 세포 표면 상에서 전장 인간 CD22를 발현하는 CHO 세포의 조합이다(실시예 1에서 더 설명함).
CD22에 대한 인간 단일클론 항체를 충분히 생성하는 상세 과정이 하기 실시예 1에 기술되어 있다. 다양한 항원들과의 축적된 실험에 따르면, 트랜스유전자성 마우스는, 프로인트 완전 항원보강제(complete Freund’s adjuvant) 내의 항원으로 복강내(IP)로 처음 면역화시킨 후, 프로인트 불완전 항원보강제(incomplete Freund’s adjuvant) 내의 항원으로 2 주마다 (총 6 번까지) IP 면역화시킬 때, 반응하는 것으로 나타났다. 그러나, 프로인트 이외의 다른 항원보강제도 효과적이라는 것을 또한 발견하였다. 덧붙여, 보강제 부재시 완전 세포가 높은 항원성이라는 것도 발견하였다. 안화후방 혈액(retroorbital bleed)에 의하여 얻은 혈장 샘플을 이용한 면역화 프로토콜의 과정에 걸쳐서 면역반응을 모니터할 수 있다. 혈장을 ELISA에 의하여 스크린할 수 있고(하기 기술함), 항-CD22 인간 면역글로불린의 충분한 역가를 가진 마우스를 융합에 사용할 수 있다. 비장을 희생 및 제거하기 3일 전에 마우스를 항원으로 정맥내 증폭시킬 수 있다. 각 면역화에 대하여 2-3 개 융합이 수행되는 것이 필요한 것으로 예상된다. 일반적으로, 각 항원에 대하여 6 내지 24 마리 마우스를 면역화시킨다. 통상, HCo7 및 HCo12 세포주 둘 다가 사용된다. 또한, HCo7 및 HCo12 트랜스유전자 둘 다를 두 개의 상이한 인간 중쇄 트랜스유전자 (HCo7/HCo12)를 가진 단일 마우스 내로 함께 배양할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 실시예 1에 보인 바와 같이, KM 마우스® 및/또는 KM-λHAC 세포주를 사용할 수 있다.
본 발명의 인간 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
본 발명의 인간 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터 얻은 비장세포 및/또는 림프절 세포를 분리하고 적절한 무한증식 세포주, 예를 들어, 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 결과로 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체들의 생산을 위하여 스크린할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터 얻은 비장 림프구들의 단일 세포 현탁액을 50% PEG를 사용하여, P3X63-Ag8.653을 분비하지 않는 마우스 골수종 세포(ATCC, CRL 1580)의 수의 6분의 1에 융합시킬 수 있다. 대안적으로, 사이토펄스(CytoPulse) 대형 챔버 세포 융합 전기천공기(CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie, Maryland)를 사용하여, 전기장에 기초한 전기융합 방법을 사용함으로써 면역화된 마우스의 비장 림프구의 단일세포 현탁액을 융합시킬 수 있다. 세포를 평평한 바닥 마이크로타이터 플레이트에 약 2 x 105으로 도말한 후, 20% 태아 클론 혈정, 18% "653" 조건 배양액, 5% 오리겐 (IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트, 5mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 units/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 50 mg/ml 겐타마이신 및 1X HAT (Sigma; HAT는 융합 24 시간 후에 첨가)를 함유하는 선택 배지에 2주일 배양한다. 약 2 주일 후에는, 세포를 HAT가 HT로 치환된 배지에서 배양할 수 있다. 그 다음, 개별 웰을 인간 단일클론 IgM 및 IgG 항체들에 대하여 ELISA에 의하여 스크린할 수 있다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 통상 10-14 일후에 배지를 관찰할 수 있다. 하이브리도마를 분비하는 항체를 재도말하고, 다시 스크린하고 나서, 인간 IgG에 대하여 여전히 양성이면, 단일클론 항체들을 제한 희석법으로 적어도 두 번 서브클론화할 수 있다. 그 다음 안정된 서브클론들을 시험관 내에서 배양하여 특성화용 조직 배양 배지에서 소량의 항체를 생성할 수 있다.
인간 단일클론 항체들을 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 단일클론 항체 정제용 2-리터 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 단백질 A-세파로즈(Pharmacia, Piscataway, N.J.)를 사용한 친화 크로마토그래피 전에 상청액을 여과하고 농축할 수 있다. 용출된 IgG를 젤 전기영동과 고성능 액체 크로마토그래피로 점검하여 순도를 확실하게 할 수 있다. 완충액을 PBS로 교환할 수 있고, 농도를 1.43 흡광 계수를 사용하여 OD280에 의하여 결정할 수 있다. 상기 단일클론 항체들을 분주하고 -80℃에 보관할 수 있다.
본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
또한 본 발명의 항체들을, 예를 들어, 당해 분야에 잘 알려진 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 사용하여, 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산할 수 있다(예, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
예를 들어, 상기 항체 또는 이의 항체 단편을 발현하기 위해, 일부 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA들을, 표준 분자 생물학 기술(예, PCR 증폭 또는 관심의 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 cDNA 클로닝)에 의하여, 얻을 수 있고 이러한 DNA들을 발현 벡터들에 삽입하여 그 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동적으로 연결할 수 있다. 이러한 맥락에서, 용어 “작동적으로 연결된”은 항체 유전자가 벡터 내로 결찰되어 벡터 내의 전사 및 번역 조절 서열들이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그들의 의도된 기능을 행하도록 하는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열들은 사용되는 발현 숙주 세포에 사용할 수 있도록 선택된다.
항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자를 별개의 벡터로 삽입할 수 있거나, 더욱 일반적으로는 두 유전자들을 동일한 발현 벡터로 삽입한다. 상기 항체 유전자들을 표준 방법(예, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보 제한 자리의 결찰, 또는 제한 자리가 없으면 블런트 말단 결찰(blunt end ligation))에 의하여 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 본 명세서에서 설명된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역들은, 그것들을 원하는 이소타입의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 이미 암호화하고 있는 발현 벡터 내로 삽입함으로써, 임의의 항체 이소타입의 전장 항체 유전자를 생성하는데 사용될 수 있는데, 상기 벡터 내에서 VH 분절이 CH 분절(들)과 작동적으로 연결되고 벡터내에서 VL 분절이 CL 분절과 작동적으로 연결된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 상기 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 상기 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 상기 항체 사슬 유전자를 벡터로 클론화하여 신호 펩티드가 인-프레임으로 항체 사슬 유전자의 아미노산 말단에 연결되게 할 수 있다. 상기 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터 유래된 신호 펩티드)일 수 있다.
상기 항체 사슬 유전자에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열들을 지닌다. 용어 “조절 서열”은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 조절하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 그러한 조절 서열들은, 예를 들어, Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))에 설명되어 있다. 조절 서열들의 선택을 포함하여, 발현 벡터의 구성은 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 요소에 달려있다는 것은 당해 분야의 숙련자에게 이해될 것이다. 포유 숙주 세포 발현에 대한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 계도하는 바이러스성 요소, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미언 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스 및 폴리오마 바이러스로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서(예, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(adenovirus major late promoter (AdMLP))를 포함한다. 대안적으로, 비바이러스성 조절 서열들, 예를 들어, 유비퀴틴 프로모터 또는 b-글로빈 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 조절 요소들은, SV40초기 프로모터로부터 유래된 서열들 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입 1의 긴 말단 반복체를 포함하는 SRα 프로모터 시스템과 같이, 상이한 소스로부터 얻어진 서열들로 구성될 수 있다(Takebe, Y. 등 (1988) Mol . Cell . Biol. 8:466-472).
항체 사슬 유전자 및 조절 서열들에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가 서열, 예를 들어, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예, 복제 개시점) 및 선택 마커 유전자와 같은 서열들을 지닐 수 있다. 상기 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다(예, Axel 등의 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호 참조). 예를 들어, 일반적으로, 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포 상에, G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 저항성을 부여한다. 바람직한 선택 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭으로 dhfr- 숙주 세포에서 사용) 및 네오(neo) 유전자(G418 선택용으로)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄를 발현하기 위해, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의하여 숙주 세포로 형질감염시킨다. 용어 “형질감염”의 다양한 유형은 외부 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 도입하는 데 공통적으로 사용되는 다양한 기술, 예를 들어, 전기천공, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 의도된다. 비록 본 발명의 항체들을 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현하는 것이 이론적으로 가능하다고 할지라도, 진핵 세포, 및 가장 바람직하게는 포유 동물 숙주 세포에서 항체를 발현시키는 것이 가장 바람직한데, 이는 그러한 진핵 세포, 및 특히 포유동물 세포가 원핵 세포보다, 적절히 접히고 면역적으로 활성인 항체를 더 잘 모으고 분비할 것 같기 때문이다. 항체 유전자의 원핵성 발현은 활성 항체를 높은 효율로 생산하는 것에 비효율적이라는 것이 보고되었다(Boss, M. A. 및 Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).
본 발명의 재조합 항체들을 발현하기 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포는 차이니스 햄스터 난소(CHO 세포)(R. J. Kaufman 및 P. A. Sharp (1982) J. Mol . Biol. 159:601-621 에서 설명된 바와 같이, DHFR 선택 마커와 같이 사용되는, Urlaub 및 Chasin, (1980) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216-4220 에서 설명된 dhfr- CHO 세포를 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 같이 사용하기 위해, 다른 바람직한 발현 시스템은 제WO 87/04462호(Wilson), 제WO 89/01036호(Bebbington) 및 EP 제338,841호(Bebbington)에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포로 도입될 때, 숙주 세포에서 항체가 발현하기에, 또는 더 바람직하게는 항체가 숙주세포가 성장되는 배양 배지로 분비되기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써, 상기 항체를 생산할 수 있다. 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 항체를 회수할 수 있다.
항원에 대한 항체 결합의 특성화
예를 들어, 표준 ELISA에 의하여, CD22에 결합하는 것에 대하여 본 발명의 항체들을 테스트할 수 있다. 간단히 말하면, 미세 역가 플레이트(microtiter plates)를 PBS 중의 0.25 μg/ml의 정제된 및/또는 재조합 CD22(예, 실시예 1에서 설명되는 CD22 ECD)로 도말하고 나서, PBS 중의 5% 소 혈청 알부민으로 블로킹시킨다. 항체의 희석물(예, CD22-면역화된 마우스로부터의 혈청 희석액)을 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 1-2 시간 동안 배양한다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척하고 나서, 알카라인 포스파타아제에 접합된 2차 시약(예, 인간 항체에서, 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 다중클론 시약)으로 37℃에서 1 시간동안 배양한다. 세척 후, 플레이트를 pNPP 기질(1 mg/ml)로 전개시킨 다음, 405-650의 OD로 분석한다. 바람직하게, 최고의 역가를 전개한 마우스가 융합에 사용될 것이다.
또한 상술한 바와 같은 ELISA 분석법을 사용하여 CD22 면역원과의 양성 반응성을 보여주는 하이브리도마를 스크린할 수 있다. 높은 결합력으로 CD22에 결합하는 하이브리도마를 서브클론화하고 나아가 특정화한다. 부모 세포의 반응성을 보유하는(ELISA 분석법에 의함), 각 하이브리도마로부터의 하나의 클론을 선택하여 5-10 바이얼 세포 은행(vial cell bank)을 만들어 -140 ℃에서 저장하고 항체를 정제할 수 있다.
항-CD22 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 단일클론 항체 정제용 2-리터 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 단백질 A-세파로즈(Pharmacia, Piscataway, NJ)를 사용한 친화 크로마토그래피 전에 상청액을 여과하고 농축할 수 있다. 용출된 IgG를 젤 전기영동과 고성능 액체 크로마토그래피로 점검하여 순도를 확실하게 할 수 있다. 완충액을 PBS로 교환할 수 있고, 농도를 1.43 흡광계수를 사용하는 OD280으로 결정할 수 있다. 상기 단일클론 항체들을 분주하고 -80 ℃에 보관할 수 있다.
선택된 항-CD22 단일클론 항체가 특이한 에피토프에 결합하고 있는지를 판단하기 위하여, 각 항체를 시판되는 시약(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 비오티닐화할 수 있다. 비표지된 단일클론 항체와 비오티닐화된 단일클론 항체를 이용한 경쟁 연구를 상기에서 설명된 CD22 코팅-ELISA 플레이트를 이용하여 수행할 수 있다. 비오티닐화된 mAb 결합을 스트렙-아비딘-알카라인 포스파타제 탐침자(strep-avidin-alkaline phosphatase probe)로 검출할 수 있다.
정제된 항체들의 이소타입을 결정하기 위해, 특정 이소타입의 항체들에 특이적인 시약을 사용하여 이소타입 ELISA를 수행할 수 있다. 예를 들어, 인간 단일클론 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 1 μg/ml의 항-인간 면역글로불린으로 밤새 4℃에서 코팅할 수 있다. 1% BSA로 차단한 후, 주위 온도에서 1 내지 2 시간 동안 플레이트를 1 μg/ml 이하의 테스트 단일클론 항체들 또는 정제된 이소타입 대조군과 반응시킨다. 다음, 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알카라인 포스파타제-접합 탐침자와 반응시킬 수 있다. 플레이트를 전개시키고 전술한 바와 같이 분석한다.
웨스턴 블랏팅에 의하여, CD22 항원과의 반응성에 대하여 항-CD22 인간 IgG를 더 분석할 수 있다. 간단히 말하면, CD22를 준비하고, 여기에 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 실시한다. 전기영동 후, 분리된 항원들을 니트로셀룰로오스 막에 옮기고, 10% 태아 소혈청으로 차단하며, 테스트될 단일클론 항체들로 탐침한다. 인간 IgG 결합을 항-인간 IgG 알카라인 포스파타제를 사용하여 검출하고 BCIP/NBT 기질 타블렛으로 전개시킬 수 있다(Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).
또한 본 발명의 항체의 결합 특이성을, 예를 들어 유세포 분석법에 의하여, CD22를 발현하는 세포에 대한 항체의 결합을 모니터링함으로써 결정할 수 있다. 다우디(Daudi) 세포 또는 라지(Raji) 세포와 같은, CD22를 자연적으로 발현하는 세포주를 사용할 수 있거나, CHO 세포주와 같은, 세포주를 CD22의 트랜스멤브레인 형태를 암호화하는 발현 벡터로 감염시킬 수 있다. 감염된 단백질은, 태그에 대한 항체를 이용한 탐지용으로서, 바람직하게는 N-말단에서의, myc-태그와 같은, 태그를 포함할 수 있다. CD22에 대한 본 발명의 항체의 결합을 감염된 세포를 항체로 배양하고, 결합한 항체를 탐지함으로써 결정할 수 있다. 감염된 단백질 상에서 태그에 대한 항체의 결합을 양성 대조군으로서 이용할 수 있다.
이중특이적 분자
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD22 항체 또는 이의 단편을 포함하는 이중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부는, 다른 기능성 분자, 예컨대, 다른 펩티드 또는 단백질(예, 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)로 유도되거나 연결되어 적어도 두 개의 상이한 결합 자리 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 사실상 하나 이상의 다른 기능성 분자로 유도되거나 연결되어 두 개 이상의 상이한 결합 자리 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성하는데; 그러한 다중특이적 분자들은 또한, 본 명세서에서 사용되는, 용어 “이중특이적 분자”에 의하여 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 만들기 위해, 본 발명의 항체를, 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 의태체와 같은, 하나 이상의 다른 결합 분자에 기능적으로 연결시켜(예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유적 결합 또는 기타), 이중특이적 분자를 만들어낸다.
따라서, 본 발명은 CD22에 대한 적어도 하나의 제 1 결합 특이체 및 제 2 표적 에피토프에 대한 제 2 결합 특이체를 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 제 2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어, 인간 FcγRI (CD64) 또는 인간 Fcα 수용체 (CD89)이다. 따라서, 본 발명은 FcγR 또는 FcαR 발현 작동자 세포(예, 단핵구, 대식세포 또는 다형핵 세포(PMN)), 및 CD22를 발현하는 표적 세포 둘 다에 결합할 수 있는 이중특이적 분자를 포함한다. 이러한 이중특이적 분자들은 CD22 발현 세포를 작동자 세포에 표적화시키고 Fc 수용체-매개 작동자 세포 활성, 예를 들어, CD22 발현 세포의 대식작용, 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 사이토카인 분비, 또는 슈퍼옥사이드 음이온의 발생을 개시한다.
이중특이적 분자가 다중특이성인 본 발명의 구체예에서, 상기 분자는 항-Fc 결합 특이체 및 항-CD22 결합 특이체에 더하여, 제 3 결합 특이체를 더 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 제 3 결합 특이체는 항-증진 인자(anti-enhancement factor, EF) 부분, 예를 들어, 세포독성 활성에 수반된 표면 단백질에 결합하여 표적 세포에 대하여 면역 반응을 증가시키는 분자이다. 상기 “항-증진 인자 부분”은 주어진 분자, 예를 들어 항원 또는 수용체에 결합하는 항체, 기능적 항체 단편 또는 리간드일 수 있고, 따라서 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 대한 결합 결정자의 작용을 향상시키는 결과를 낳는다. 상기 “항-증진 인자 부분”은 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원과 결합할 수 있다. 대안적으로, 상기 항-증진 인자 부분은 제1 및 제2 결합 특이체들이 결합하는 독립체와는 다른 개체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-증진 인자 부분은 세포독성 T-세포를 결합할 수 있다(예, CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 표적 세포에 대하여 면역 반응을 증진시키는 결과를 가져오는 다른 면역 세포를 통해서).
한 구체예에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 결합 특이체로서 적어도 하나의 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하고, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb 또는 단일 사슬 Fv를 포함한다. 상기 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 이의 임의의 최소 단편일 수 있고, 예를 들어 Fv 또는 단일 사슬 구성체일 수 있으며, 이는 Ladner 등의 미국 특허 제 4,946,778 호에 기술되어 있고, 이의 내용은 참조문헌으로서 명백히 본 명세서에 병합된다.
한 구체예에서, Fcγ수용체를 위한 결합 특이체가 단일클론 항체에 의해 제공되며, 이의 결합은 인간 면역글로불린 G(IgG)에 의해 차단되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 “IgG 수용체”는 염색체 1 상에 위치한 8 개 g-사슬 유전자들 중의 임의의 것을 지칭한다. 이러한 유전자들은 총 12 개의 트랜스멤브레인 또는 용해성 수용체 이소형태을 암호화하고 이들은 세 가지 Fcγ 수용체 군으로 나뉜다: FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), 및 FcγRIII(CD16). 바람직한 한 구체예에서, Fcγ수용체는 인간 고친화성 FcγRI이다. 인간 FcγRI은 72 kDa 분자이고, 단량체성 IgG에 대하여 높은 친화도(108 - 109 M-1)를 보여준다.
소정의 바람직한 항-Fcγ단일클론 항체들의 생산 및 특성화는 Fanger 등의 PCT 공개번호 제WO 88/00052호 및 미국 특허 제4,954,617호에 기술되어 있고, 이의 교시는 본 명세서에 참조문헌으로서 완전히 병합된다. 이러한 항체들은 수용체의 Fcγ의 결합 자리와 구별되는 자리에서 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII의 에피토프에 결합하고, 따라서, 그들의 결합은 IgG의 생리적 수준에 의해서 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에 유용한 특이성 항-FcγRI 항체들은 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. mAb 32 를 생산하는 하이브리도마는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection), ATCC 기탁번호 HB9469로부터 입수가능하다. 다른 구체예에서, 상기 항-Fcγ 수용체 항체는 단일클론 항체 22(H22)의 인간화 형태이다. H22 항체의 생산과 특성화는 Graziano, R. F. 등 (1995) J. Immunol 155 (10):4996-5002 및 Tempest 등의 PCT 공개번호 제WO 94/10332호에 기술되어 있다. H22 항체 생산 세포주는 지정 HA022CL1 하에서 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었고 및 기탁번호 CRL 11177을 가진다.
다른 바람직한 구체예에서, Fc 수용체에 대한 결합특이성이 인간 IgA 수용체, 예를 들어, Fc-알파 수용체(FcαRI (CD89))에 결합하는 항체에 의해 제공되며, 이의 결합은 바람직하게는 인간 면역글로불린 A(IgA)에 의해 차단되지 않는다. 용어 “IgA 수용체”는 염색체 19 상에 위치한 하나의 α-유전자(FcαRI)의 유전자 산물을 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 유전자는 55 내지 110 kDa의 수 개의 교호적으로 스플라이스된 트랜스멤브레인 이소형태를 암호화하는 것으로 알려져 있다. FaαRI(CD89)은 단핵구/대식세포, 호산구 및 호중구 과립세포 상에 구조적으로 발현되나, 비-작동자(non-effector) 세포군 상에서는 아니다. FaαRI은 IgA1 및 IgA2둘 다에 대하여 중간 정도의 친화도(
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5×107M-1)를 가지며, 이는 G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 사이토카인류에 노출시 증가된다(Morton, H. C. 등 (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). A3, A59, A62 및 A77로서 동정된, IgA 리간드 결합 도메인 외부의 FcαRI과 결합하는, 4 개 FcαRI-특이성 단일클론 항체가 설명된다(Monteiro, R. C. 등 (1992) J. Immunol. 148:1764).
FcαRI 및 FcγRI은 본 발명의 이중특이적 분자에 사용하기에 바람직한 개시 수용체인데, 이는 그것들이 (1) 면역 작동자 세포, 예를 들어, 단핵구, PMN, 대식세포 및 수지상 세포 상에서 일차적으로 발현되고; (2) 높은 수준(예, 세포당 5,000-100,000)으로 발현되며; (3) 세포독성 활성의 매개자이고(예, ADCC, 대식작용); 및 (4) 그것들에 표적화된, 자체-항원을 포함한, 항원의 향상된 항원 제시를 매개하기 때문이다.
인간 단일클론 항체가 바람직하지만, 본 발명의 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 쥐, 키메릭 및 인간화 단일클론 항체이다.
본 발명의 이중특이적 분자는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여, 구성적 결합 특이체, 예를 들어, 항-FcR 및 항-CD22 결합 특이체들을 접합함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각 결합 특이체는 분리적으로 생성되고 이후에 서로 접합될 수 있다. 상기 결합 특이체들이 단백질 또는 펩티드인 경우, 다양한 커플링 또는 교차결합 제제가 공유결합성 접합에 사용될 수 있다. 교차결합 제제의 예는 단백질 A, 카보디이미드, N-석신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 및 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트(sulfo-SMCC)를 포함한다(예, Karpovsky 등 (1984) J. Exp . Med. 160:1686; Liu, MA 등 (1985) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 82:8648 참조). 다른 방법들은 Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan 등 (1985) Science 229:81-83, 및 Glennie 등 (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375에 설명된 것들을 포함한다. 바람직한 접합 제제는 SATA 및 sulfo-SMCC이고, 둘 다 Pierce Chemical Co.(Rockford, IL)에서 입수할 수 있다.
결합 특이체들이 항체인 경우, 이들을 두 개 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 설피드릴 결합을 통해 접합할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 접합 전에, 힌지 영역은 변형되어 홀수의 설피드릴 잔기, 바람직하게는 하나를 포함한다.
대안적으로, 양쪽 결합 특이체들은 동일 벡터에서 암호화되고, 동일한 숙주 세포에서 발현하고 결집될 수 있다. 이러한 방법은 상기 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일 사슬 항체와 결합 결정자를 포함하는 단일 사슬 분자, 또는 두 개 결합 결정자를 포함하는 단일 사슬 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 두 개 단일 사슬 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하기 위한 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,260,203호; 제5,455,030호; 제4,881,175호; 제5,132,405호; 제5,091,513호; 제5,476,786호; 제5,013,653호; 제5,258,498호; 및 제5,482,858호에 설명되어 있고, 이들 모두는 본 명세서에 참조문헌으로서 명백히 병합된다.
이중특이적 분자가 그의 특이성 표적에 결합하는 것은, 예를 들어, 효소연관 면역흡착법(ELISA), 방사능면역분석(RIA), FACS 분석, 생체분석(예, 성장 억제), 또는 웨스턴 블랏 분석으로 확인될 수 있다. 이러한 분석법의 각각은 일반적으로, 관심의 복합체에 특이적인 표지 시약(예, 항체)을 사용함으로써, 특정 관심의 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, FcR-항체 복합체는 항체-FcR 복합체를 인식하고 특이적으로 결합하는, 예컨대 효소-연계 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출될 수 있다. 대안적으로, 상기 복합체는 다양한 다른 면역분석법 중 임의의 것을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 방사능으로 표지되고 방사능면역분석(radioimmunoassay, RIA)에서 사용될 수 있다(예를 들어, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986 참조, 이는 본 명세서에 참조 문헌으로 기재됨). 방사능 동위원소는 γ계수기 또는 신틸레이션 계수기(scintillation counter)와 같은 수단을 사용하여 또는 자가방사기록법(autoradiography)으로 검출될 수 있다.
링커( linkers )
본 발명은 화학적 링커를 통해 항체가 상기 파트너에 연결되는 항체-파트너를 제공한다. 어떤 구체예에서, 링커는 펩티딜 링커이고, 본 명세서에 (L4)p-F-(L1)m로 표시된다. 다른 링커는 하이드라진 및 디설파이드 링커들이고, 각각, (L4)p-H-(L1)m 및 (L4)p-J-(L1)m로 표시된다. 파트너에 부착된 링커에 부가하여, 본 발명은 또한 필수적인 임의의 분자 종에 부착하기에 적절한 분리가능한 (cleavable) 링커 가지를 제공한다. 본 발명의 링커 가지의 양상은 치료 부분(moiety)에 대한 이들의 부착을 참고로 하여 본 명세서에 예시된다. 그러나, 링커는 진단용 제제, 분석용 제제, 생분자, 표적화 제제, 검출가능한 표지 등을 포함하나 이에 한정되지 않는, 다양한 종에 부착될 수 있다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다.
항체-파트너 접합체에서 펩티딜 및 다른 링커들의 사용은 미국 임시 특허출원 일련번호 제 60/295,196호; 제 60/295,259호; 제 60/295342호; 제 60/304,908호; 제 60/572,667호; 제 60/661,174호; 제 60/669,871호; 제 60/720,499호; 제 60/730,804호; 제 60/735,657호; 제 60/891,028호; 및 미국 특허출원 일련번호 제 10/160,972호; 제 10/161,234호; 제 11/134,685호; 제 11/134,826호; 및 제 11/398,854호 및 미국 특허번호 제6,989,452호 및 PCT 특허출원 번호 제 PCT/US2006/37793호에 기술되어 있으며, 이들 모두는 참조 문헌으로서 본 명세서에 병합된다.
추가 링커들은 미국 특허 번호 제 6,214,345 호(Bristol-Myers Squibb), 미국 특허출원 번호 제 2003/0096743호 및 미국 특허출원 번호 제 2003/0130189 호(둘다 Seattle Genetics에 속함), de Groot 등, J. Med. Chem. 42, 5277 (1999); de Groot 등, J. Org. Chem. 43, 3093 (2000); de Groot 등, J. Med. Chem. 66, 8815, (2001); 제WO 02/083180호 (Syntarga); Carl 등, J. Med. Chem. Lett. 24, 479, (1981); Dubowchik 등, Bioorg & Med. Chem. Lett. 8, 3347 (1998)에 기술되어 있다.
한 관점에서, 본 발명은 치료제 및 마커에 표적화기(targeting groups)를 부착하는데 유용한 링커에 관한 것이다. 다른 관점에서, 본 발명은 화합물에 안정성을 부여하거나, 그들의 생체내 독성을 감소시키거나, 그렇지 않으면, 그들의 약물동력학, 생물학적 이용효능 및/또는 약물역학에 유리하게 영향을 미치는 링커를 제공한다. 그러한 구체예에서, 약물이 작용의 자리에 전달되면, 상기 링커는 분리되어 활성 약물을 방출하는 것이 일반적으로 바람직하다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 링커는 흔적이 없어서, 일단 치료제 또는 마커로부터 제거되면(예를 들어 활성화 동안에), 링커의 존재 흔적은 남지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 링커들은 치료 작용 또는 마커 활성의 자리에서와 같은 표적 세포의 자리에서 또는 근처에서 분리될 수 있는 그들의 능력에 의해 특징지워진다. 그러한 분리는 자연에서 효소적일 수 있다. 이 특징은 치료제 또는 마커의 전신 활성을 감소시키고 독성 및 전신 부작용을 감소시키는 것에 도움을 준다. 효소적 분리의 바람직한 분리가능한 기는 펩티드 결합, 에스테르 결합, 및 디설파이드 결합을 포함한다. 다른 구체예에서, 링커는 pH에 민감하고, pH의 변화를 통해 분리된다.
본 발명의 한 중요한 관점은 링커가 분리되는 속도를 조절하는 능력이다. 때때로 빨리 분리하는 링커가 바람직하다. 그러나 어떤 구체예에서, 더 느리게 분리하는 링커가 바람직할 수 있다. 예를 들면, 빠른 방출 및 느린 방출 성분 둘다를 가진 지속 방출 제형(sustained release formulation) 또는 제형(formulation)에서 더 느리게 분해하는 링커를 제공하는 것이 유용할 수 있다. 제WO 02/096910호는 하이드라진 링커를 갖는 여러 개의 특정 리간드-약물 복합체를 제공한다. 그러나, 요구되는 고리화(cyclization)의 속도에 따라 링커 조성물을 조절할 수 있는 방법은 없고 상술된 특정 화합물이 많은 약물-링커 접합체에 바람직한 것보다 더 느린 속도로 약물로부터 리간드를 분리한다. 이와 대조적으로, 본 발명의 하이드라진 링커는 매우 빠른 것에서 매우 느린 것까지의 고리화 속도 범위를 제공하고, 이에 의하여 바람직한 고리화 속도에 기초한 특정 하이드라진 링커의 선택이 가능하다.
예를 들어, 매우 빠른 고리화는 분리시 단일한 5-멤버 고리를 생산하는 하이드라진 링커로 성취될 수 있다. 세포에 세포독성제를 표적 전달하는 바람직한 고리화 속도는 분리시 제미널 위치(geminal position)에 2개의 메틸기를 갖는 링커로부터 얻어진 두 개의 5-멤버 고리 또는 단일 6-멤버 고리를 생산하는 하이드라진 링커를 사용하여 성취될 수 있다. 젬-디메틸 효과(gem-dimethyl effect)는 제미널 위치에 2개의 메틸기가 없는 단일 6-멤버 고리에 비해 고리화 반응 속도를 가속하는 것으로 보여졌다. 이는 스트레인(strain)이 고리에서 느슨해짐으로 인한 것이다. 그러나, 때때로 치환기들은 그것을 빠르게 하는 대신에 반응을 느리게 할 수 있다. 흔히 지연의 이유는 입체 장애일 수 있다. 예를 들어, 젬 디메틸 치환은 제미널 탄소(geminal carbon)가 CH2일 때에 비해 훨씬 빠른 고리화 반응을 허용한다.
그러나, 어떤 구체예에서, 더 느리게 분리하는 링커가 바람직할 수 있다는 것을 주의하는 것이 중요하다. 예를 들면, 지속 방출 제형에서 또는 빠른 방출과 느린 방출 성분 둘 다를 갖는 제형에서, 더 느리게 분리하는 링커를 제공하는 것이 유용할 수 있다. 어떤 구체예에서, 느린 고리화 속도는, 분리시, 젬-디메틸 치환이 없이, 단일 6-멤버 고리 또는 단일 7-멤버 고리를 생산하는 하이드라진 링커를 사용하여 성취할 수 있다. .
또한 링커는 순환 중에 분해에 대항하는 치료제 또는 마커를 안정화시키는 작용을 한다. 그러한 안정화는 부착된 제제 또는 마커의 순환 반감기를 연장하기 때문에 이 특징은 유의한 이점을 제공한다. 또한 링커는 부착된 제제 또는 마커의 활성을 약화시켜서 접합체를 순환 중에 상대적으로 양성을 띠게하여(relatively benign), 원하는 작용 자리에서 활성화 후에, 원하는 효과, 예를 들면, 독성을 갖게 한다. 치료제 접합체에 대해서, 링커의 이 특징이 제제의 치료 지표를 개선한다.
바람직하게 안정화기는 혈액 또는 비-표적 조직에 존재할 수 있는 효소에 의한 치료 제제 또는 마커의 제거 및 대사를 제한하기 위해서 선택되며, 더 나아가 제제 또는 마커가 세포로 이동하는 것을 제한하기 위해 선택된다. 안정화기는 제제 또는 마커의 분해를 차단하는 작용을 하고, 또한 제제 또는 마커의 다른 물리학적 특성을 제공하는 작용도 할 수 있다. 안정화기는 또한 제형화된 또는 비-제형화된 형태로 저장되는 제제 또는 마커의 안정성을 개선할 수 있다.
이상적으로, 37℃에서 2시간 동안 인간 혈액내에 제제 또는 마커를 저장함으로써 테스트시 안정화기가 분해로부터 제제 또는 마커를 보호한다면, 안정화기는 치료 제제 또는 마커를 안정화시키는데 유용하며 주어진 분석 조건하에서 인간 혈액내에 존재하는 효소에 의해 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 더욱 바람직하게는 5% 미만 및 더더욱 바람직하게는 2% 미만으로 제제 또는 마커를 분리하게 된다.
또한 본 발명은 이러한 링커들을 포함하는 접합체에 관한 것이다. 더욱 특별하게, 본 발명은 질병의 치료, 특히 암 화학요법에 사용될 수 있는 전구약물에 관한 것이다. 특히, 본 명세서에 기술된 링커들의 사용은 유사한 구조의 전구약물에 비해 혈액내에서 작용의 높은 특이성, 감소된 독성 및 개선된 안정성을 나타내는 전구약물을 제공한다.
본 명세서에 기술된 본 발명의 링커는 파트너 분자 내의 다양한 위치에 존재할 수 있다.
따라서, 그러한 기를 결여하는 구성체들의 속도에 비해 증진된 속도로, 생체내, 예컨대, 혈액류에서 분리될 그의 사슬의 부분으로서 임의의 다양한 기들을 포함하는 링커를 제공한다. 또한 치료 제제 및 진단용 제제와 링커 가지의 접합체도 제공한다. 링커는 치료 제제의 전구약물 유사체를 형성하고 치료 제제 또는 진단용 제제를 표적화 제제, 검출가능한 표지, 또는 고형 지지체에 가역적으로 연결하는데 유용하다. 링커를 본 발명의 세포독소를 포함하는 복합체에 함입할 수 있다.
분리가능한 펩티드, 하이드라진, 또는 디설파이드 기에 부가하여, 하나 이상의 자기-희생 링커기 L1은 세포독소와 표적화 제제 사이에 임의로 도입된다. 또한 이러한 링커기는 스페이서기(spacer groups)로 기술될 수도 있으며, 적어도 2개의 반응성 기능기(functional groups)를 포함한다. 전형적으로, 스페이서기의 하나의 화학적 기능성기(functionality)는 치료 제제, 예를 들면, 세포독소의 화학적 기능성기에 결합되고, 반면에 상기 스페이서기의 다른 화학적 기능성기는 표적화 제제 또는 분리가능한 링커의 화학적 기능성기에 결합하는데 사용된다. 스페이서기의 화학적 기능성기의 예는 하이드록시, 메르캅토, 카르보닐, 카르복시, 아미노, 케톤, 및 메르캅토 기들을 포함한다.
L1으로 표시되는, 자기-희생 링커는 일반적으로 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 또는 치환 또는 비치환 헤테로알킬 기이다. 한 구체예에서, 알킬 또는 아릴 기는 1개 및 20개 사이의 탄소 원자를 포함한다. 또한 그것들은 폴리에틸렌글리콜 부분도 포함한다.
예시적 스페이서기는, 예를 들어, 6-아미노헥사놀, 6-메르캅토헥사놀, 10-하이드록시데칸산, 글리신 및 다른 아미노산, 1,6-헥산디올, β-알라닌, 2-아미노에탄올, 시스테아민(2-아미노에탄티올), 5-아미노펜탄산, 6-아미노헥산산, 3-말레이미도벤조산, 프탈리드, α-치환 프탈리드, 카르보닐기, 아민성 에스테르, 핵산, 펩티드 등을 포함한다.
스페이서기는 부가적인 분자 부분 및 화학적 기능성기를 세포독소-표적화 제제 복합체 내로 도입하게 할 수 있다. 일반적으로, 부가적인 부분 및 기능성기는 상기 복합체의 혈장 반감기 및 다른 성질들에 영향을 줄 것이다. 따라서, 스페이서기의 신중한 선택을 통하여, 혈장 반감기 범위를 갖는 세포독소 복합체를 생산할 수 있다.
약물 부분에 직접 인접하여 위치한 스페이서(들)는 또한 (L1)m으로 나타내며, 여기에서 m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 정수이다. 다중 L1 스페이서가 존재할 때, 동일한 또는 상이한 스페이서를 사용할 수 있다. L1 은 임의의 자기-희생기일 수 있다.
L4는 상기 부분을 포함하는 링커를 사용하여 접합체에 증가된 용해성 또는 감소된 응집성을 바람직하게 부여하거나 상기 접합체의 가수분해 속도를 변경하는 링커 성분이다. L4 링커는 자기-희생이 될 필요가 없다. 한 구체예에서, L4 부분은 직쇄, 분지쇄, 또는 고리일 수 있는, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로알킬, 또는 비치환 헤테로알킬이다. 치환기는, 예를 들면, 저급(C1-C6)알킬, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 또는 디알킬아미노일 수 있다. 어떤 구체예에서, L4 는 비-고리형 부분을 포함한다. 다른 구체예에서, L4 는 임의의 양 또는 음으로 하전된 아미노산 폴리머, 예를 들면, 폴리리신 또는 폴리아르게닌을 포함한다. L4는 폴리에틸렌 글리콜 부분과 같은 폴리머를 포함할 수 있다. 부가적으로, L4 링커는 예를 들면, 폴리머 성분 및 작은 화학적 부분 둘 다를 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, L4는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부분을 포함한다. L4의 PEG 부분은 1-50개 단위의 길이일 수 있다. 바람직하게는, PEG는 1-12개의 반복 단위, 더욱 바람직하게는 3-12개의 반복 단위, 더욱 바람직하게는 2-6개의 반복 단위, 또는 심지어 더 바람직하게는 3-5개의 반복 단위 및 가장 바람직하게는 4개의 반복 단위를 가질 것이다. L4는 단지 PEG 부분만으로 구성되거나, 부가적인 치환 또는 비치환 알킬 또는 헤테로알킬을 또한 포함할 수 있다. L4 부분의 일부로서 PEG를 조합하여 복합체의 수용성을 향상시키는 것이 유용하다. 부가적으로, PEG 부분은 항체에 약물이 접합하는 동안 일어날 수 있는 응집의 정도를 감소시킨다.
어떤 구체예에서, L4 는 (AA1)c의 N-말단에 직접 부착되는
Figure 112009038497318-pct00003
을 포함한다. R20은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택되는 멤버이다. 각 R25, R25 ’, R26, 및 R26 ’는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되고; s 및 t는 1-6으로부터 독립적으로 선택되는 정수들이다. 바람직하게, R20, R25, R25 ’, R26, 및 R26 ’는 소수성이다. 어떤 구체예에서, R 20은 H 또는 알킬(바람직하게, 비치환 저급 알킬)이다. 어떤 구체예에서, R25, R25 ’, R26, 및 R26 ’는 독립적으로 H 또는 알킬(바람직하게, 비치환 C1부터 C4까지의 알킬)이다. 어떤 구체예에서, R25, R25 ’, R26, 및 R26 ’는 모두 H이다. 어떤 구체예에서, t는 1이고 s는 1 또는 2이다.
펩티드 링커(F)
상술한 바와 같이, 본 발명의 펩티딜 링커는 다음의 일반식으로 표시될 수 있다: (L4)p-F-(L1)m, 여기에서 F는 펩티딜 부분을 포함하는 링커 부분을 나타낸다. 한 구체예에서, F 부분은 임의의 부가적인 자기-희생 링커(들), L2, 및 카르보닐기를 포함한다. 다른 구체예에서, F 부분은 아미노기 및 임의의 스페이서기(들), L3를 포함한다.
따라서, 한 구체예에서, 펩티딜 링커를 포함하는 접합체는 다음 식 (a)의 구조를 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00004
이 구체예에서, L1은 상술된 바와 같이, 자기-희생 링커이고, L4는 상술된 바와 같이, 증가된 용해성 또는 감소된 응집성을 부여하거나 가수분해율을 변경하는 부분이다. L2 는 자기-희생 링커(들)를 나타낸다. 덧붙여, m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고; o 및 p는 독립적으로 0 또는 1이다. AA1은 하나 이상의 천연 아미노산, 및/또는 비천연 α-아미노산을 나타내고; c는 1 내지 20의 정수이다. 어떤 구체예에서, c는 2 내지 5의 범위에 있거나, 2 또는 3이다.
상기 식 (a)의 본 발명의 펩티드 링커에서, AA1은 그의 아미노 말단에서 L4에 직접 연결되거나, 또는 L4가 부재하는 경우, X4기(즉, 표적화 제제, 검출가능한 표지, 보호된 반응성 기능기 또는 비보호된 반응성 기능기)에 직접 연결된다. 어떤 구체예에서, L4가 존재하면, L4는 (AA1)c의 N-말단에 직접 부착된 카르복실 아실기를 포함하지 않는다. 따라서, 이들 구체예에서, 미국 특허 번호 제 6,214,345호의 펩티드 링커에서는 필요한, 카르복실 아실 단위가 L4 와 X4 중의 하나와 AA1 사이에 직접 있을 필요는 없다.
다른 구체예에서, 펩티딜 링커를 포함하는 접합체는 다음 식(b)의 구조를 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00005
이 구체예에서, L4는 상술된 바와 같이, 바람직하게 증가된 용해성 또는 감소된 응집성을 부여하거나 가수분해율을 변경하는 부분이고; L3는 일차 또는 이차 아민 또는 카르복실 기능기를 포함하는 스페이서기이며, L3의 아민은 D의 매달린(pendant) 카르복실 기능기와 아미드 결합을 형성하거나 또는 L3 의 카르복실은 D의 매달린 아민 기능기와 아미드 결합을 형성하고; o 및 p는 독립적으로 0 또는 1이다. AA1는 하나 이상의 천연 아미노산, 및/또는 비천연 α-아미노산을 나타내고; c는 1 내지 20의 정수이다. 이 구체예에서, L1은 없다(즉 m은 일반식에서 0임).
상기 식 (b)의 본 발명의 펩티드 링커에서, AA1은 그의 아미노 말단에서 L4에 직접 연결되거나, 또는 L4가 부재하는 경우, X4기(즉, 표적화 제제, 검출가능한 표지, 보호된 반응성 기능기 또는 비보호된 반응성 기능기)에 직접 연결된다. 어떤 구체예에서, L4가 존재하면, L4는 (AA1)c의 N-말단에 직접 부착된 카르복실 아실기를 포함하지 않는다. 따라서, 이들 구체예에서, 미국 특허 번호 제 6,214,345호의 펩티딕 링커에서는 필요한, 카르복실 아실 단위가 L4 와 X4 중의 하나와 AA1 사이에 직접 있을 필요는 없다.
자기-희생 링커( self - immolative linker ) L 2
자기-희생 링커 L2는 두 개의 간격이 있는 화학적 부분을 함께 공유적으로 연결시켜 정상적으로 안정한 세 부분으로 된 분자를 형성할 수 있는 2-기능성 화학적 성분으로, 효소적 분리 수단에 의해 상기 세 부분으로 된 분자로부터 상기의 간격이 있는 화학적 부분 중의 하나를 방출하고; 상기 효소적 분리 후에, 상기의 간격이 있는 화학적 부분 중 다른 하나를 상기 분자의 나머지로부터 자발적으로 분리하여 방출한다. 본 발명에 따라, 자기-희생 스페이서를 그의 한쪽 끝에서 펩티드 부분에 공유적으로 연결시키고, 그의 다른 쪽 끝에서 유도체화가 약리적학 활성을 억제하는 약물 부분의 화학적 반응성 자리에 공유적으로 연결되어, 결과적으로 펩티드 부분과 약물 부분을 함께 구분하고 공유적으로 연결하여 세 부분으로된 분자를 형성하는데, 이것은 표적 효소가 없을 때는 안정되고 약리학적으로 비활성이지만, 스페이서 부분과 펩티드 부분을 공유적으로 연결하는 결합부에서 표적 효소에 의해 효소적으로 분리되어 세 부분으로 된 분자로부터 펩티드 성분을 방출한다. 그러한 효소적 분리는, 다시, 스페이서 부분의 자기-희생적 특성을 활성화하고 약물 부분에 스페이서 부분을 공유적으로 연결하는 결합부의 자발적 분리를 개시하는데, 그렇게 함으로써 약물을 약리학적으로 활성인 형태로 방출한다.
자기-희생 링커 L2는 임의의 자기-희생기가 될 수 있다. 바람직하게는 L2는 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 치환 헤테로사이클로알킬, 치환 및 비치환 아릴, 및 치환 및 비치환 헤테로아릴이다.
특히 바람직한 자기-희생 스페이서 L2는 식(c)에 의하여 나타낼 수 있다:
Figure 112009038497318-pct00006
아미노벤질기의 방향족 고리는 하나 이상의 “K”로 치환될 수 있다. “K”기는, 고리 구조의 일부인 4개의 비치환 탄소 중 하나에 부착된 수소를 대체한 방향족 고리 상의 치환기다. “K”기는 할로겐과 같은 단일 원자일 수 있고, 또는 알킬, 헤테로알킬, 아미노, 니트로, 하이드록시, 알콕시, 할로알킬, 및 시아노와 같은 다-원자기일 수 있다. 각 K는 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR21R22, NR21COR22, OCONR21R22, OCOR21, 및 OR21로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는데, 여기에서 R21 및 R22는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬 및 비치환 헤테로사이클로알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 예시적인 K 치환기는 F, Cl, Br, I, NO2, OH, OCH3, NHCOCH3, N(CH3)2, NHCOCF3 및 메틸을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. “K i ”에서 i는 0, 1, 2, 3, 또는 4의 정수이다. 한 바람직한 구체예에서, i는 0이다.
상기에서 보여진 구조의 에테르 산소 원자는 카르보닐기에 연결된다. NR24 기능성기로부터 방향족 고리로 난 선은, 아민 기능성기가 고리를 형성하면서 -CH2-O- 기에 의해 치환되지 않는 5개의 탄소 중 임의의 것에 결합됨을 나타낸다. 바람직하게, X의 NR24 기능성기는 -CH2-O- 기에 대한 파라 위치에서 방향족 고리에 공유적으로 결합되어 있다. R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 구성된 군으로부터 선택되는 멤버이다. 특정 구체예에서, R24는 수소이다.
한 구체예에서, 본 발명은 상기 식(a)의 펩티드 링커를 제공하는데, 여기에서, F는 다음 구조를 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00007
여기에서, R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 구성된 군으로부터 선택된다. 각 K는 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR21R22, NR21COR22, OCONR21R22, OCOR21, 및 OR21로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 멤버인데, 여기에서 R21 및 R22는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬 및 비치환 헤테로사이클로알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되며; i는 0, 1, 2, 3, 또는 4의 정수이다.
다른 구체예에서, 상기 식(a)의 펩티드 링커는 다음 구조를 포함하는 -F-(L1)m- 를 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00008
여기에서 각 R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 멤버이다.
어떤 구체예에서, 자기-희생 스페이서 L1 또는 L2는 다음을 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00009
여기에서 각 R17, R18, 및 R19는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 및 치환 또는 비치환 아릴로부터 독립적으로 선택되고, w는 0 내지 4의 정수이다. 어떤 구체예에서, R17 및 R18은 독립적으로 H 또는 알킬(바람직하게, 비치환 C1-4 알킬)이다. 바람직하게, R17 및 R18은 메틸 또는 에틸과 같은, C1-4 알킬이다. 어떤 구체예에서, w는 0이다. 특정 이론에 구속되는 것을 바라는 것은 아니지만, 이 특정한 자기-희생 스페이서는 상대적으로 빠르게 고리화한다는 것을 실험적으로 알아내었다.
어떤 구체예에서, L1 또는 L2는
Figure 112009038497318-pct00010
을 포함한다.
스페이서기(spacer group) L 3
스페이서기 L3은 일차 또는 이차 아민 또는 카르복실 기능기를 포함하는 것으로 특징지워지며, L3기의 아민이 D의 매달린 카르복실 기능기와 아미드 결합을 형성하거나 또는 L3의 카르복실기가 D의 매달린 아민 기능기와 아미드 결합을 형성한다. L3 는 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 한 바람직한 구체예에서, L3는 방향족기를 포함한다. 더욱 바람직하게, L3은 벤조산기, 아닐린기 또는 인돌기를 포함한다. -L3-NH- 스페이서로 작용할 수 있는 구조의 비-제한적인 예들은 다음의 구조를 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00011
여기에서 Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택되는 멤버이며, R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택되는 멤버이다.
L3을 포함하는 본 발명의 링커의 분리시, L3 부분은 약물, D에 부착된 상태로 남는다. 따라서, L3 부분은 D에 부착된 그의 존재가 D의 활성을 유의하게 변경하지 않도록 선택된다. 다른 구체예에서, 약물 D의 일 부분은 그 자체가 L3 스페이서로 기능한다. 예를 들면, 한 구체예에서, 약물, D는, 약물의 일 부분이 L3 스페이서로서 기능하는 듀오카르마이신 유도체이다. 그러한 구체예의 비-제한적인 예는 NH2-(L3)-D가 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 것들을 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00012
및
Figure 112009038497318-pct00013
여기에서 Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고, R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택되는 멤버이고; 각 구조상의 NH2기는 (AA1)c 와 반응하여 -(AA1)c-NH-를 형성한다.
펩티드 서열 AA 1
AA1기는 단일 아미노산 또는 아미드 결합에 의해 함께 연결된 다수의 아미노산을 나타낸다. 아미노산은 천연 아미노산 및/또는 비천연 α-아미노산일 수 있다.
펩티드 서열 (AA1)c는 단일 아미노산(c=1일때) 또는 아미드 결합에 의해 함께 결합된 다수의 아미노산의 기능적 아미드화 잔기이다. 본 발명의 펩티드는 생물학 시스템에서 관심의 위치에서 효소에 의한 펩티드의 효소-촉매 분리를 위해 선택된다. 예를 들면, 표적화 제제를 사용하여 세포에 표적화되나, 그 세포에 의하여 내재화되지 않은 접합체에 대하여, 예컨대, 근처의 사멸하는 세포의 세포 내용물의 방출로 인하여 세포외 기질에 존재할 수 있는 하나 이상의 프로테아제에 의하여 분리되는 펩티드를 선택하여, 펩티드를 세포외적으로 분리한다. 펩티드 내의 아미노산의 수는 1부터 20까지의 범위에 있을 수 있으나; 더욱 바람직하게는 (AA1)c를 포함하여 1-8개의 아미노산, 1-6개의 아미노산 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산일 것이다. 특정 효소 또는 효소류에 의해서 분리되기 쉬운 펩티드 서열은 당해 분야에 잘 알려져 있다.
혈청, 간, 장 등에서 효소에 의해 분리되는 많은 펩티드 서열은 당해 분야에 알려져 있다. 본 발명의 예시적인 펩티드 서열은 프로테아제에 의하여 분리되는 펩티드 서열을 포함한다. 프로테아제-민감성 서열의 사용에 대하여 나오는 논의의 초점은 설명을 명확하게 하기 위함이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
펩티드를 분리하는 효소가 프로테아제일 때, 링커는 일반적으로 프로테아제의 분리 인식 서열을 포함하는 펩티드를 포함한다. 프로테아제의 분리 인식 서열은 단백질분해 분리 동안에 프로테아제에 의하여 인식되는 특정 아미노산 서열이다. 많은 프로테아제 분리 자리는 당해 분야에 알려져 있고, 이들 및 다른 분리 자리들은 링커 부분에 포함될 수 있다. 예컨대, Matayoshi 등, Science 247: 954 (1990); Dunn 등, Meth . Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah 등, Meth . Enzymol. 244: 175 (1994); Thornberry, Meth . Enzymol. 244: 615 (1994); Weber 등, Meth . Enzymol. 244: 595 (1994); Smith 등, Meth . Enzymol. 244: 412 (1994); Bouvier 등, Meth . Enzymol. 248: 614 (1995), Hardy 등, in Amyloid Protein Precursor in Development, Aging, and Alzheimer's Disease, ed. Masters et al. pp. 190-198 (1994) 참조.
펩티드 서열 (AA1)c의 아미노산은 종양-관련 프로테아제와 같은 특정 분자에 의한 선택적인 효소적 분리에 대한 그들의 적합성을 근거로 선택된다. 사용된 아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 그것들은 L 또는 D 배열일 수 있다. 한 구체예에서, 적어도 3개의 상이한 아미노산이 사용된다. 다른 구체예에서는, 단지 2개의 아미노산이 사용된다.
바람직한 구체예에서, 펩티드 서열 (AA1)c은 리소좀 프로테아제에 의하여 분리되는 그의 능력을 근거로 선택되는데, 그의 비-제한적인 예는 카텝신 B, C, D, H, L 및 S를 포함한다. 바람직하게, 펩티드 서열 (AA1)c은 시험관내에서 카텝신 B에 의하여 분리될 수 있는데, 이것을 당해 분야에 알려진 실험실내 프로테아제 분리 분석법을 사용하여 테스트할 수 있다.
다른 구체예에서, 펩티드 서열 (AA1)c은 종양 세포의 부근에서 세포외적으로 발견되는 프로테아제와 같은, 종양-관련 프로테아제에 의하여 분리될 수 있는 그의 능력을 근거로 선택되는데, 이의 비-제한적인 예는 티메트 올리고펩티다아제(thimet oligopeptidase, TOP) 및 CD10을 포함한다. TOP 또는 CD10에 의해 분리되는 펩티드의 능력을 당해 분야에 알려진 실험실내 프로테아제 분리 분석법을 이용하여 테스트할 수 있다.
본 발명의 접합체에 사용하기에 적절한 펩티드 서열의 적절하나 비-제한적인 예는 Val-Cit, Cit-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosyl-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu(서열번호 94), β-Ala-Leu-Ala-Leu(서열번호 95) 및 Gly-Phe-Leu-Gly(서열번호 96), Val-Ala, Leu-Leu-Gly-Leu(서열번호 97), Leu-Asn-Ala, and Lys-Leu-Val를 포함한다. 바람직한 펩티드 서열은 Val-Cit 및 Val-Lys이다.
다른 구체예에서, 약물 부분에 가장 근접하게 위치한 아미노산은 다음으로부터 구성되는 군으로부터 선택된다: Ala, Asn, Asp, Cit, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 및 Val. 또한, 다른 구체예에서, 약물 부분에 가장 근접하게 위치한 아미노산은 다음으로부터 구성되는 군으로부터 선택된다: Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 및 Val.
프로테아제는 암 전이에 관련되어 왔다. 프로테아제 우로키나아제의 합성의 증가는 많은 암에서 전이하는 능력의 증가와 관련되어 있다. 우로키나아제는 세포외 공간에 편재하여 위치하는, 플라스미노겐으로부터 플라스민을 활성화하고, 그의 활성화는, 전이하는 종양 세포가 침입하는 통로가 되는 세포외 기질에서 단백질의 분해를 일으킬 수 있다. 플라스민은 또한 콜라게나제를 활성화하여, 모세관 및 림프계를 둘러싸는 기저막에서 콜라겐의 분해를 증진시키고, 그 때문에 종양 세포가 표적 조직으로 침입하게 한다(Dano 등, Adv . Cancer . Res., 44:139 (1985)). 따라서, 우로키나아제에 의해 분리되는 펩티드 서열을 링커로서 사용하는 것은 본 발명의 범위내에 있다.
본 발명은 또한 트립타제에 의한 분리에 민감한 펩티드 서열의 사용을 제공한다. 인간 마스트 세포(mast cells)는, a bI, bII, 및 bIII로 지정된, 적어도 4개의 다른 트립타제를 발현한다. 이러한 효소들은 혈액 혈장 프로테이나제 억제제에 의해서 조절되지 않으며, 단지 시험관내에서 약간의 생리학적인 기질을 분리한다. 세린 프로테아제의 트립타제 군(family)은 마스트 세포를 수반하는 다양한 알러지 및 염증성 질병에 관련되어 있는데, 이는 이러한 질병을 갖는 환자의 생물학적 유체(biological fluids)에서 발견되는 높아진 트립타제 수준으로 인한 것이다. 그러나, 질병의 병리생리학에 있어서 트립타제의 정확한 역할은 서술될 것으로 남는다. 트립타제의 생물학적 기능 및 해당 생리학적 결과의 범위는 그들의 기질 특이성에 의하여 실질적으로 한정된다.
트립타제는 종양 전이 및 침입과 관련된 프로테아제의 치모겐(zymogen) 형태인, 프로-우로키나아제 플라스미노겐 활성제(uPA)의 우수한 활성제이다. 세포의 유출 및 이동을 위한 세포외 기질의 파괴를 초래하는, 플라스미노겐 캐스케이드의 활성화는 Pro-Arg-Phe-Lys(서열번호 98)의 P4-P1 서열에서 프로-우로키나아제 플라스미노겐 활성제의 트립타제 활성화의 작용일 수 있다(Stack 등, Journal of Biological Chemistry 269 (13): 9416-9419 (1994)). 관 투과성의 조절에 관련되어 있는 뉴로펩티드인, 혈관작용성 장 펩티드는, 또한 Thr-Arg-Leu-Arg(서열번호 99) 서열에서 일차적으로, 트립타제에 의하여 분리된다(Tam 등, Am . J. Respir . Cell Mol. Biol. 3: 27-32 (1990)). G-단백질과 짝지워진 수용체 PAR-2는 Ser-Lys-Gly-Arg(서열번호 100) 서열에서 트립타제에 의하여 분리되고 활성화되어 섬유아세포 증식을 이끌 수 있으며, 반면에 트롬빈 활성화 수용체 PAR-1은 Pro-Asn-Asp-Lys(서열번호 101) 서열에서 트립타제에 의하여 비활성화된다(Molino 등, Journal of Biological Chemistry 272(7): 4043-4049 (1997)). 취합하면, 이 증거는 질병의 결과로서 조직 리모델링에서의 트립타제의 주요한 역할을 암시한다. 이는 여러 마스트 세포-매개 질병에서 관찰되는 의미있는 변화와 일치한다. 만성 천식 및 다른 장-기성 호흡기 질병들의 한 증거는 그의 생리학적 표적의 트립타제 활성화의 결과일 수 있는 하부 조직의 섬유증 및 비대화이다. 유사하게, 일련의 보고서는 다양한 암에서 마스트 세포 밀도, 트립타제 활성 및 나쁜 예후와 관련된 혈관생성(angiogenesis)을 보여준다(Coussens 등, Genes and Development 13(11): 1382-97 (1999)); Takanami 등, Cancer 88(12): 2686-92 (2000); Toth-Jakatics 등, Human Pathology 31(8): 955-960 (2000); Ribatti 등, International Journal of Cancer 85(2): 171-5 (2000)).
특정 프로테아제가 선택된 펩티드 서열을 분리하는지를 평가하는 방법은 당해 분야에 알려져 있다. 예를 들면, 7-아미노-4-메틸 코우마린(AMC) 형광성 펩티드 기질의 사용은 프로테아제 특이성을 결정하는 잘 확립된 방법이다(Zimmerman, M. 등 (1977) Analytical Biochemistry 78:47-51). 아닐리드 결합의 특이한 분리는 형광성 AMC 이탈기를 방출하여 개개의 기질의 분리 속도를 간단히 결정하게 한다. 더욱 최근에, AMC 펩티드 기질 라이브러리의 배열(Lee, D. 등 (1999) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9:1667-72) 및 위치-스캐닝 라이브러리(Rano, T.A. 등 (1997) Chemistry and Biology 4:149-55)를 사용하여 단일 실험에서 넓은 범위의 기질을 샘플링함으로써 프로테아제의 N-말단 특이성을 빠르게 개괄하였다. 따라서 당업자는 적당하지 않은 실험을 다시 분류하지 않고서도 펩티드 서열의 배열을 쉽게 평가하여 본 발명에서 그들의 유용성을 결정할 수 있다.
본 발명의 항체-파트너 접합체는 선택적으로 둘 이상의 링커를 포함할 수 있다. 이 링커들은 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 펩티딜 링커는 약물을 리간드에 연결하는 데에 사용될 수 있고 제2 펩티딜 링커는 진단용 제제를 복합제에 부착할 수 있다. 추가 링커들의 다른 이용은 분석용 제제, 생분자, 표적제제, 및 검출가능한 표지를 항체-파트너 복합체에 연결하는 것을 포함한다.
또한, 예를 들어, 본 발명의 화합물의 이량체, 삼량체, 사량체 및 고도의 동족체, 또는 이의 반응성 유사체와 같은, 종을 포함하는, 다중- 또는 다-가 종인 본 발명의 화합물은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 다중- 및 다-가 종은 본 발명의 단일 종 또는 하나 이상의 종으로부터 회합될 수 있다. 예를 들면, 이량체적의 구성체는 “동종-이량체적”또는 “이종 이량체적”일 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물 또는 이의 반응성 유사체가 올리고머 또는 폴리머 골격(예, 폴리리신, 덱스트란, 하이드록시에틸 전분 등)에 부착되는 다중- 또는 다-가 구성체는 본 발명의 범위 내에 있다. 골격은 바람직하게 다중기능적이다(즉, 본 발명의 접착 화합물에 반응 자리들의 배열을 가짐). 또한, 본 발명의 단일 종 또는 본 발명의 하나 이상의 종을 갖는 골격이 유도될 수 있다.
또한, 본 발명은, 유사하게 기능화되지 않은 유사 화합물에 비교하여 향상된 수용성을 갖는 화합물을 제공하도록 기능화된 화합물을 포함한다. 따라서, 본 명세서에 설명된 임의의 치환기는 향상된 수용성을 갖는 유사 라디칼로 치환될 수 있다. 예를 들면, 하이드록실기를 디올로 대체하는 것, 또는 아민을 4급 아민, 하이드록시 아민 또는 유사한 보다 수용성인 부분으로 대체하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 바람직한 구체예에서, 부모 합성물의 수용성을 향상시킨 부분으로 본 명세서에 설명된 화합물의 이온 채널을 향하여 활성에 본질적이지 않은 자리에서의 치환에 의하여, 추가적인 수용성이 부여된다. 유기 화합물의 수용성을 향상시키는 방법은 당해 분야에 알려져 있다. 그러한 방법은, 예컨대 4급 암모늄과 같은 영구히 하전된 부분을 가지는 유기 핵, 또는 예컨대 카르복실산, 아민과 같은 생리학적으로 관련된 pH에서 하전된 기를 기능화하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 방법은 유기 핵 하이드록실- 또는 아민-함유기, 예건태, 알코올, 폴리올, 폴리에테르, 등에 부가하는 것을 포함한다. 대표적인 예는 폴리리신, 폴리에틸렌이민, 폴리(에틸렌글리콜) 및 폴리(프로필렌글리콜)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 화합물을 위한 적절한 기능화 화학법 및 전략은 당해 분야에 알려져 있다. 예를 들어, Dunn, R.L. 등, Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991을 참조.
하이드라진 링커(H)
두 번째 구체예에서, 본 발명의 접합체는 하이드라진 자기-희생 링커를 포함하는데, 상기 접합체는 다음의 구성을 가진다:
Figure 112009038497318-pct00014
여기에서, D, L1, L4, 및 X4는 상기에서 정의된 바와 같고 본 명세서에서 더 기술되며, H는 다음의 구조를 포함하는 링커이다:
Figure 112009038497318-pct00015
여기에서, n1은 1 - 10의 정수이고; n2는 0, 1, 또는 2이고; 각 R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 멤버이고; I는 결합(즉, 골격의 탄소와 인접한 질소 사이의 결합) 또는 다음의 구조이다:
Figure 112009038497318-pct00016
여기에서 n3은 0 또는 1이며, 단 n3이 0일 때, n2 는 0이 아니고; n4는 1, 2, 또는 3이며, 여기에서 I가 결합일 때, n1은 3이고 n2는 1이며, D는 다음의 구조가 될 수 없다:
Figure 112009038497318-pct00017
여기에서 R은 Me 또는 CH2- CH2-NMe2이다.
한 구체예에서, 페닐 고리 상에서의 치환은 파라 치환이다. 바람직한 구체예에서, n1은 2, 3, 또는 4이거나 또는 n1은 3이다. 바람직한 구체예에서, n2는 1이다. 바람직한 구체예에서, I는 결합(즉, 골격의 탄소와 인접한 질소 사이의 결합)이다. 한 관점에서, 하이드라진 링커, H는 분리시, 예를 들면, n3가 0이고 n4가 2일때, 6-멤버 자기-희생 링커를 형성할 수 있다, 다른 관점에서, 하이드라진 링커, H는 분리시 2개의 5-멤버 자기-희생 링커를 형성할 수 있다. 또 다른 관점에서, 분리시, H는 5멤버 자기-희생 링커를 형성하거나, H는 7-멤버 자기-희생 링커를 형성하거나, 또는 H는 5-멤버 자기-희생 링커 및 6-멤버 자기-희생 링커를 형성한다. 분리의 속도는 분리시 형성되는 고리의 크기에 의해 영향을 받는다. 따라서, 원하는 분리 속도에 따라, 분리시 형성될 적절한 크기의 고리를 선택할 수 있다.
5-멤버 하이드라진 링커
한 구체예에서, 하이드라진 링커는 5-멤버 하이드라진 링커를 포함하는데, 여기에서 H는 다음의 구조를 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00018
한 바람직한 구체예에서, n1은 2, 3, 또는 4이다. 다른 바람직한 구체예에서, n1은 3이다. 상기 구조에서, 각 R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 멤버이다. 한 구체예에서, 각 R24는 독립적으로 H 또는 C1 - C6 알킬이다. 다른 구체예에서, 각 R24는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬, 더욱 바람직하게는 H 또는 CH3이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 R24는 메틸기이다. 다른 구체예에서, 각 R24는 H이다. 각 R24는 화합물 입체 효과를 맞추고 용해성을 변경하기 위해서 선택된다.
5-멤버 하이드라진 링커는 약물을 링커로부터 분리하는 하나 이상의 고리화 반응으로 처리될 수 있으며, 예를 들어, 다음에 의하여 기술될 수 있다:
Figure 112009038497318-pct00019
본 발명의 5 멤버 링커를 제조하기 위한 예시적인 합성 경로는 다음과 같다:
Figure 112009038497318-pct00020
Cbz-보호 DMDA b는 염화 티오닐을 갖는 용액에서 2,2-디메틸말론산 a와 반응하여 Cbz-DMDA-2,2-디메틸말론산 c를 형성한다. 화합물 c는 EDC의 존재하에서 Boc-N-메틸 하이드라진 d와 반응하여 DMDA-2,2-디메틸말로닉-Boc-N-메틸하이드라진 e를 형성한다.
6-멤버 하이드라진 링커
다른 구체예에서, 하이드라진 링커는 6-멤버 하이드라진 링커를 포함하는데, 여기에서 H는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00021
한 바람직한 구체예에서, n1은 3이다. 상기 구조에서, 각 R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 멤버이다. 한 구체예에서, 각 R24는 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이다. 다른 구체예에서, 각각의 R24는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬, 더욱 바람직하게는 H 또는 CH3이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 R24는 메틸기이다. 다른 구체예에서, 각 R24는 H이다. 각 R24는 화합물의 입체 효과를 맞추고 용해성을 변경하기 위해서 선택된다. 한 바람직한 구체예에서, H는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00022
한 구체예에서, H는 제미널 디메틸 치환을 포함한다. 상기 구조의 한 구체예에서, 각 R24는 독립적으로 H 또는 치환 또는 비치환 알킬이다.
6-멤버 하이드라진 링커는 링커로부터 약물을 분리하는 고리화 반응으로 처리될 수 있으며, 다음과 같이 설명된다:
Figure 112009038497318-pct00023
본 발명의 6 멤버 링커를 제조하기 위한 예시적인 합성 경로는 다음과 같다:
Figure 112009038497318-pct00024
디클로로메탄을 갖는 용액의 Cbz-보호 디메틸알라닌 a는 HOAt 및 CPI와 반응하여 Cbz-보호 디메틸알라닌 하이드라진 b를 형성한다. 하이드라진 b는 메탄올의 작용에 의하여 탈보호되어 화합물 c를 형성한다.
다른 하이드라진 링커
본 발명은 7개의 멤버를 갖는 링커를 포함하는 것으로 고려된다. 이 링커는 5 또는 6 멤버 링커와 같이 빠르게 고리화하지 않을 것 같지만, 이것은 어떤 항체-파트너 접합체에 바람직하다. 유사하게, 상기 하이드라진 링커는 2개의 6 멤버 고리, 또는 하나의 6 및 하나의 5 멤버 고리화 생성물을 갖는 하나의 하이드라진 링커를 포함할 수 있다. 6 및 7 멤버 링커 뿐만 아니라 5 및 7 멤버 링커도 또한 고려된다.
다른 하이드라진 구조, H는 다음의 식을 가진다.
Figure 112009038497318-pct00025
여기에서, q는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고; 및
각 R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 멤버이다. 이 하이드라진 구조는 또한 5-, 6-, 또는 7-멤버 고리를 형성할 수 있으며, 부가 성분을 더하여 다중 고리를 형성할 수 있다.
디설파이드 링커(J)
또 다른 구체예에서, 링커는 효소적으로 분리가능한 디설파이드기를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명은 식(d)를 따르는 구조를 갖는 세포독성 항체-파트너 화합물을 제공한다:
Figure 112009038497318-pct00026
여기에서 D, L1, L4, 및 X4는 상기에서 정의되어 있고 본 명세서에 더 설명되어 있으며, J는 다음의 구조를 가지는 기를 포함하는 디설파이드 링커이다:
Figure 112009038497318-pct00027
여기에서, R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 멤버이고; 각 K는 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR21R22, NR21COR22, OCONR21R22, OCOR21, 및 OR21로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 멤버이고, 여기에서, R21 및 R22는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 및 비치환 헤테로사이클로알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고; i는 0, 1, 2, 3, 또는 4의 정수이고; d는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 정수이다.
디설파이드 링커의 방향족 고리는 하나 이상의 “K”기로 치환될 수 있다. “K”기는, 고리 구조의 일부인 4개의 비치환 탄소 중 하나에 부착된 수소를 대체하는 방향족 고리 상의 치환기다. “K”기는 할로겐과 같은 단일 원자일 수 있고, 또는 알킬, 헤테로알킬, 아미노, 니트로, 하이드록시, 알콕시, 할로알킬, 및 시아노와 같은 다-원자기일 수 있다. 예시적인 K 치환기는 독립적으로 F, Cl, Br, I, NO2, OH, OCH3, NHCOCH3, N(CH3)2, NHCOCF3 및 메틸을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. “K i ”에서, i는 0, 1, 2, 3, 또는 4의 정수이다. 한 특정 구체예에서, i는 0이다.
바람직한 구체예에서, 링커는 다음 식의 효소적으로 분리가능한 디설파이드기를 포함한다.
Figure 112009038497318-pct00028
이 구체예에서, L4, X4, p, 및 R24의 아이덴티티들(identities)은 상기에 서술된 바와 같고, d는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다. 특정 구체예에서, d는 1 또는 2이다.
더욱 특정한 디설파이드 링커는 다음 식에서 보인다:
Figure 112009038497318-pct00029
이 구체예의 특정한 예는 다음과 같다:
Figure 112009038497318-pct00030
바람직하게, d는 1 또는 2이다.
다른 디설파이드 링커는 하기 식에서 보인다:
Figure 112009038497318-pct00031
이 구체예의 특정한 예는 다음과 같다:
Figure 112009038497318-pct00032
바람직하게, d는 1 또는 2이다.
다양한 구체예에서, 디설파이드기는 아민에 대하여 오르토(ortho)에 있다. 다른 특정 구체예에서, a는 0이다. 바람직한 구체예에서, R24는 H 및 CH3로부터 독립적으로 선택된다.
본 발명의 디설파이드 링커를 제조하기 위한 예시적인 합성 경로는 다음과 같다:
Figure 112009038497318-pct00033
3-메르캅토프로피온산 a의 용액을 알드리티올-2와 반응시켜 3-메틸 벤조티아졸리움 아이오다이드 b를 형성한다. 3-메틸 벤조티아졸리움 아이오다이드 c를 수산화나트륨과 반응시켜 화합물 d를 형성한다. 화합물 d의 용액을 메탄올과 함께 화합물 b와 더 반응시켜 화합물 e를 형성한다. 화합물 e를 염화아세틸 및 메탄올의 작용에 의하여 탈보호하여 화합물 f를 형성한다.
세포독소, 링커 및 항체에 치료 제제를 접합하기 위한 다른 방법에 대해 더 많은 검토는, 또한, Gangwar 등의 PCT 공개번호 제 WO 2007/059404호, 및 Saito, G. 등 (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215의 “Cytotoxic Compounds And Conjugates”; Trail, P.A. 등 (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. 및 Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. 및 Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264를 참조, 이들 각각은 그 전체가 참조문헌으로서 본 명세서에서 병합되어 있다.
파트너 분자( Partner Molecules )
한 관점에서, 본 발명은, 세포독소, 약물(예, 면역억제제) 또는 방사능독소와 같은, 파트너 분자에 접합하는 항체를 특징으로 한다. 그러한 접합체는 본 명세서에서 “면역접합체”로도 지칭된다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 “면역독소”로 지칭된다. 세포독소 또는 세포독성 제제는 세포에 해로운(예, 살해) 임의의 제제를 포함한다.
본 발명의 파트너 분자의 예는 택솔, 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 그라미시딘 D(gramicidin D), 에티듐 브로마이드(ethidium bromide), 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시 안트라신 디오네(dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 악티노마이신 D(actinomycin D), 1-디하이드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라노롤(propranolol), 및 퓨로마이신(puromycin) 및 이들의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 또한, 파트너 분자의 예는, 예를 들어, 항대사물질(예, 메토트렉세이트(methotrexate), 6-메르캅토퓨린(6-mercaptopurine), 6-티오구아닌(6-thioguanine), 사이타라빈(cytarabine), 5-플루오로우라실 데카르바진(5-fluorouracil decarbazine), 알킬화 제제(예, 메클로레타민(mechlorethamine), 티오에파 클로람부실(thioepa chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 카르무스틴(carmustine) (BSNU) 및 로무스틴(lomustine) (CCNU), 사이클로토스프아미드(cyclothosphamide), 부술판(busulfan), 디브로모만니톨(dibromomannitol), 스트렙토조토신(streptozotocin), 미토마이신C(mitomycin C), 및 cis-디클로로디아민 플라티늄 (II)(cis-dichlorodiamine platinum, (DDP), 시스플라틴(cisplatin)), 안트라사이클린(anthracyclines)(예, 다우노루비신(daunorubicin)(이전에는 다우노마이신(daunomycin)) 및 독소루비신(doxorubicin)), 항생제(예, 닥티노마이신(dactinomycin)(이전에는 악티노마이신(actinomycin)), 블레오마이신(bleomycin), 미트라마이신(mithramycin), 및 안트라마이신(anthramycin, AMC)), 및 항-유사분열 제제(예, 빈크리스틴(vincristine) 및 빈블라스틴(vinblastine))을 포함한다.
본 발명의 항체에 접합할 수 있는 파트너 분자의 다른 바람직한 예는 듀오카르마이신(duocarmycins), 칼리체아미신(calicheamicins), 메이탄신(maytansines) 및 아우리스타틴(auristatins), 및 이들의 유도체를 포함한다. 칼리체아미신 항체 접합체의 예는 상업적으로 입수가능하다(Mylotarg®; American Home Products).
파트너 분자의 바람직한 예는 CC-1065 및 상기 듀오카르마이신이다. CC-1065는 Upjohn사에 의해 스트렙토마이세스 젤렌시스(Streptomyces zelensis)로부터 처음 분리되었고(Hanka 등, J. Antibiot. 31: 1211 (1978); Martin 등, J. Antibiot. 33: 902 (1980); Martin 등, J. Antibiot. 34: 1119 (1981)), 시험관 내에서 그리고 실험용 동물에서도 우수한 항종양 및 항균 활성을 가지고 있는 것이 발견되었다(Li 등, Cancer Res. 42: 999 (1982)). CC-1065는 5'-d(A/GNTTA)-3' 및 5'-d(AAAAA)-3'의 서열 선택과 함께 마이너 그루브(minor groove) 내에서 이중-가닥 B-DNA에 결합하고(Swenson 등, Cancer Res. 42: 2821 (1982)), 분자에 존재하는 그의 CPI 좌-수 유닛(left-hand unit)에 의하여 3'-아데닌의 N3 위치를 알킬화한다(Hurley 등, Science 226: 843 (1984)). 강하고 넓은 항종양 활성에도 불구하고, CC-1065는 실험용 동물에서 죽음을 지연시키기 때문에 인간에 이용될 수 없다.
CC-1065 및 듀오카르마이신의 많은 유사체 및 유도체는 당해 분야에서 알려져 있다. 많은 화합물의 구조, 합성 및 성질에 대한 연구가 검토되었다. 예를 들어, Boger 등, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 1438 (1996); 및 Boger 등, Chem. Rev. 97: 787 (1997) 참조.
Kyowa Hakko Kogya 사에서의 하나의 기(group)는 많은 CC-1065 유도체를 제조하였다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,101, 038호; 제 5,641,780호; 제 5,187,186호; 제 5,070,092호; 제 5,703,080호; 제 5,070,092호; 제 5,641,780호; 제 5,101,038호; 및 제 5,084,468호; 공개된 PCT 출원번호 제 WO 96/10405 호 및 공개된 유럽 특허출원 번호 제 0 537 575 A1호를 참조.
또한 Upjohn 사(Pharmacia Upjohn)가 CC-1065의 유도체를 제조하는데 활발하다. 예를 들어, 미국 특허번호 제 5,739,350호, 제 4,978,757호, 제 5,332, 837호 및 제 4,912,227호를 참조.
본 발명의 특히 바람직한 관점은 다음 식(e)에 따른 구조를 갖는 세포독성 화합물을 제공한다:
Figure 112009038497318-pct00034
(e)
여기에서, 고리계 A는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 기들로부터 선택되는 멤버이다. 고리계의 예에는 페닐 및 피롤이 있다.
기호 E 및 G는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 헤테로원자, 단일결합으로부터 독립적으로 선택되거나, E 및 G는 임의로 결합되어 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 고리계를 형성한다.
기호 X는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버를 나타낸다. R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬로, 및 아실로부터 선택된 멤버이다.
기호 R3는 (=O), SR11, NHR11 및 OR11로부터 선택된 멤버를 나타내는데, 여기에서 R11은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 설포네이트, 아실, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O)(OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12 또는 SiR12R13R14이다. 기호 R12, R13, 및 R14는 독립적으로 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 및 치환 또는 비치환 아릴을 나타내며, 여기에서, R12 및 R13은 이들이 부착된 질소 또는 탄소 원자와 함께 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는 4부터 6까지의 멤버를 갖고 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성한다. 하나 이상의 R12, R13, 또는 R14는 그의 구조 안에 분리가능한 기를 포함할 수 있다.
R4, R4 ’, R5 및 R5 ’는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로부터 독립적으로 선택되는 멤버들인데, 여기에서 n은 1부터 20까지의 정수이며, 또는 R4, R4 ’, R5 및 R5 ’의 임의의 이웃한 쌍은, 그들이 부착된 탄소 원자와 함께, 결합되어 4부터 6까지의 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성한다. R15 및 R16은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 및 치환 또는 비치환 펩티딜을 나타내는데, 여기에서 R15 및 R16는 그들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는 4부터 6까지의 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성한다. 하나의 예시적인 구조는 아닐린이다.
R4, R4 ’, R5 , R5 ’, R11, R12, R13, R15 및 R16은 분리가능한 링커 또는 분리가능한 기질과 같이, 그들의 구조 안에 하나 이상의 분리가능한 기를 임의로 포함한다. 예시적인 분리가능한 기는 펩티드, 아미노산, 하이드라진, 디설파이드, 및 세팔로스포린 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
어떤 구체예에서, R4, R4 ’, R5 , R5 ’, R11, R12, R13, R15 및 R16 중 적어도 하나는, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 약물을 본 발명의 링커 또는 효소 분리가능한 기질에, 예를 들면 존재한다면 L1에, 또는 F, H, J, 또는 X2에, 또는 J에 결합하는데 사용된다.
또 다른 예시적인 구체예에서, R4, R4 ’, R5 , R5 ’, R11, R12, R13, R15 및 R16 중 적어도 하나는 화합물을 접합하기에 적절한 반응기를 가진다. 다른 예시적인 구체예에서, R4, R4 ’, R5 , R5 ’, R11, R12, R13, R15 및 R16 은 독립적으로 H, 치환 알킬 및 치환 헤테로알킬로부터 선택되며, 알킬 또는 헤테로알킬 부분의 자유말단에서 반응성 기능기를 가진다. R중 하나 이상은 다른 종, 예를 들어, 표적 제제, 검출가능한 표지, 고형 지지체, 등등에 접합될 수 있다.
R6은 존재하거나 부재하는 단일 결합이다. R6가 존재하면, R6 및 R7은 결합되어 사이클로프로필 고리를 형성한다. R7은 CH2-X1 또는 -CH2-이다. R7이 -CH2-이면, 그것은 사이클로프로판 고리의 성분이다. 기호 X1은 할로겐, 예를 들어 Cl, Br 또는 F와 같은 이탈기를 나타낸다. R6 및 R7의 조합은 화학 원자가의 규칙을 어기지 않는 방식으로 해석된다.
X1은 임의의 이탈기일 수 있다. 유용한 이탈기는 할로겐, 아지드, 설포닉 에스테르(예, 알킬설포닐, 아릴설포닐), 옥소늄 이온, 알킬 퍼클로레이트, 암모니오알칸설포네이트 에스테르, 알킬플루오로설포네이트 및 플루오르화 화합물(예, 트리플레이트, 노나플레이트, 트레실레이트) 및 기타 유사한 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이탈기로서 유용한 특정 할로겐은 F, Cl 및 Br이다. 이들 및 특정의 반응 조건에 적절한 다른 이탈기를 선택하는 것은 당해 분야의 숙련자의 능력 범위안에 있다(예를 들어, March J, Advanced Organic Chemistry, 제2판, John Wiley and Sons, 1992; Sandler SR, Karo W, Organic Functional Group Preparations, 제2판, Academic Press, Inc., 1983; 및 Wade LG, Compendium of Organic Synthetic Methods, John Wiley and Sons, 1980).
6-멤버 고리 내의 곡선은 고리가 하나 이상의 불포화도를 가질 수 있으며, 방향족일 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 아래에 설명된 것들과 같은 고리 구조 및 관련 구조는 식(f)의 범위 내에 있다:
Figure 112009038497318-pct00035
(f).
어떤 구체예에서, R4, R4 ’, R5, 및 R5 ’중 적어도 하나는 상기 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F, H, J, 또는 X2에 결합시키고, 다음을 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00036
여기에서 v는 1부터 6까지의 정수이고; 각 R27, R27', R28, 및 R28' 은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택된다. 어떤 구체예에서, R27, R27', R28, 및 R28' 는 모두 H이다. 어떤 구체예에서, v는 1부터 3까지의 정수이다(바람직하게, 1). 이 유닛은 약물로부터 아릴 치환기를 분리하는데 사용될 수 있으며, 그렇게하여 다중-약물 저항에 대한 기질인 화합물을 생성하는 것을 저지하거나 피한다.
한 구체예에서, R11은 자기-고리화하지 않으며 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F, H, J, 또는 X2에 연결하는 부분, X5를 포함한다. 부분, X5는, 바람직하게 효소를 사용하여 분리가능하며, 분리될 때, 활성 약물을 제공한다. 예로써, R11은 다음 구조(약물의 나머지 부분에 결합하는 우측를 가짐)를 가진다:
Figure 112009038497318-pct00037
예시적 구체예에서, 식(e)의 고리계 A는 치환 또는 비치환 페닐 고리이다. 고리계 A는 본 명세서에 정의 부분에서 설명된 바와 같은 하나 이상의 아릴기 치환기로 치환될 수 있다. 어떤 구체예에서, 페닐기는 CN 또는 메톡시 부분으로 치환된다.
어떤 구체예에서, R4, R4', R5, 및 R5' 중 적어도 하나는 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F, H, J, 또는 X2에 연결하며, R3는 SR11, NHR11 및 OR11로부터 선택된다. R11는 -SO(OH)2, -PO(OH)2, -AAn, -Si(CH3)2C(CH3)3, -C(O)OPhNH(AA)m,
Figure 112009038497318-pct00038
,
Figure 112009038497318-pct00039
,
Figure 112009038497318-pct00040
,
Figure 112009038497318-pct00041
,
Figure 112009038497318-pct00042
,
Figure 112009038497318-pct00043
또는 임의의 다른 당류 또는 당류의 조합,
Figure 112009038497318-pct00044
,
Figure 112009038497318-pct00045
,
Figure 112009038497318-pct00046
,
Figure 112009038497318-pct00047
,
Figure 112009038497318-pct00048
및 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로부터 선택되는데, 여기에서 n은 1 내지 10의 범위 내에 있는 정수이고, m은 1 내지 4의 범위 내에 있는 정수이며, p는 1 내지 6의 범위 내에 있는 정수이고, AA는 천연 또는 비-천연 아미노산이다. 어떤 구체예에서, AAn 또는 AAm은 펩티드 링커(F)에 대하여 상기에 설명된 동일한 아미노산 서열로부터 선택되고, R4, R4', R5, 또는 R5'의 링커 부분에 사용되는 아미노산 서열과 임의로 동일하다. 적어도 어떤 구체예에서, R3은 생체내에서 분리가능하여 활성 약물 화합물을 제공한다. 적어도 어떤 구체예에서, R3은 화합물 내의 생체내 용해성을 증가시킨다. 어떤 구체예에서, 활성 약물을 제공하기 위하여 혈액에서 활성 약물의 농도의 감소 속도가 R3의 분리 속도보다 실질적으로 빠르다. 이것은 활성 약물의 독성이 전구약물 형태의 것보다 실질적으로 높은 곳에서 특히 유용하다. 다른 구체예에서, 혈액에서, 활성 약물을 제공하기 위한 R3의 분리 속도는 활성 약물의 농도의 감소 속도보다 빠르다.
다른 예시적 구체예에서, 본 발명은 식(g)에 따른 구조를 갖는 화합물을 제공한다:
Figure 112009038497318-pct00049
(g).
이 구체예에서, 치환기 R3, R4, R4', R5, R5', R6, R7 및 X의 아이덴티티들(identities)은 실질적으로 식(a)에서 상술한 바와 같으며, 뿐만 아니라 특정 구체예에서도 같다. 기호 Z는 O, S 및 NR23으로부터 독립적으로 선택된 멤버이다. 기호 R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버를 나타낸다. 각 R23은 독립적으로 선택된다. 기호 R1은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, C(O)R8 또는 CO2R8을 나타낸다. R8은 치환 알킬, 비치환 알킬, NR9R10, NR9NHR10 및 OR9로부터 선택된 멤버이다. R9 및 R10은 H, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택된다. R2는 H, 또는 치환 또는 비치환 저급 알킬이다. R2가 치환 알킬일 때, 그것은 예컨대, 퍼플루오로알킬, 예를 들어, CF3이외의 것이 일반적으로 바람직하다. 한 구체예에서, R2는 치환 알킬인테, 여기에서 치환기는 할로겐이 아니다. 다른 구체예에서, R2는 비치환 알킬이다.
어떤 구체예에서, R1은 CO2CH3와 같은, 에스테르 부분이다. 어떤 구체예에서, R2은 저급 알킬기인데, 치환되거나 비치환될 수 있다. 현재 바람직한 저급 알킬기는 CH3이다. 어떤 바람직한 구체예에서, R1은 CO2CH3이고 R2는 CH3이다.
어떤 구체예에서, R4, R4', R5, 및 R5'는 H, 할로겐, NH2, OMe, O(CH2)2N(R29)2 및 NO2로부터 독립적으로 선택된 멤버들이다. 각 R29는 독립적으로 H 또는 저급 알킬(예, 메틸)이다.
어떤 구체예에서, 이탈기 X1이 할로겐, 일킬설포닐, 아릴설포닐, 및 아지드로 구성되는 군으로부터 선택되는 멤버이도록 약물을 선택한다. 어떤 구체예에서, X1는 F, Cl, 또는 Br이다.
어떤 구체예에서, Z는 O 또는 NH이다. 어떤 구체예에서, X는 O이다.
또 다른 예시적 구체예에서, 본 발명은 식 (h) 또는 (i)에 따른 구조를 갖는 화합물을 제공한다:
Figure 112009038497318-pct00050
(h) (i)
식(e)의 듀오카르마이신 유사체의 다른 바람직한 구조는 고리계 A가 비치환 또는 치환 페닐 고리인 구조이다. 고리계 A가 피롤일 때의 식 7의 구조에 대해 상술된 약물 분자 상의 바람직한 치환기는 또한 고리계 A가 비치환 또는 치환 페닐 고리일 때의 바람직한 치환기이다.
예를 들면, 바람직한 구체예에서, 약물 (D)는 구조(j)를 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00051
(j)
이 구조에서, R3, R6, R7, X는 식 (e)에 대하여 상술된 바와 같다. 더욱이, Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고, 여기에서, R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 요소이며;
R1은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, C(O)R8, 또는 CO2R8이고, 여기에서 R8은 NR9R10 및 OR9로부터 선택된 멤버이며, 여기에서 R9 및 R10은 H, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택되는 멤버이고;
R1'은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 C(O)R8이고, 여기에서, R8은 NR9R10 및 OR9으로부터 선택된 멤버이며, 여기에서 R9 및 R10은 H, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택되는 멤버이고;
R2는 H, 또는 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 비치환 헤테로알킬, 또는 시아노, 또는 알콕시이고; R2'는 H, 또는 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 비치환 헤테로알킬이다.
R4, R4', R5, R5', R11, R12, R13, R15 또는 R16 중 적어도 하나는 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F, H, J, 또는 X2에 연결한다.
약물 (D)의 다른 구체예는 구조 (k)를 포함하는데, 여기에서 R4 및 R4' 는 결합되어 헤테로사이클로알킬을 형성한다:
Figure 112009038497318-pct00052
(k)
이 구조에서, R3, R5, R5', R6, R7, X는 식 (e)에 대해 상술된 바와 같다. 더욱이, Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고, 여기에서, R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 요소이고;
R32는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로부터 선택되는데, 여기에서 n은 1 내지 20의 정수이다. R15 및 R16은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 및 치환 또는 비치환 펩티딜을 나타내는데, 여기에서 R15 및 R16은 그들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의로 결합되어, 임의로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는 4내지 6의 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성한다. R32는, 분리가능한 링커 또는 분리가능한 기질과 같이, 그의 구조 안에 하나 이상의 분리가능한 기를 임의로 포함한다. 예시적인 분리가능한 기는 펩티드, 아미노산, 하이드라진, 디설파이드, 및 세팔로스포린 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, R4, R4' ,R5, R5' ,R15 및 R16에 대하여 본 명세서에 서술된 치환기의 임의의 선택은 R32에도 적용가능하다.
R5, R5' , R11, R12, R13, R15, R16, 또는 R32의 적어도 하나는 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F, H, J, 또는 X2에 연결한다. 적어도 어떤 구체예에서, R32는 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F, H, J, 또는 X2에 결합한다.
이 화합물의 바람직한 구체예는 다음 구조를 가진다:
Figure 112009038497318-pct00053
R1은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, C(O)R8, 또는 CO2R8이고, 여기에서 R8은 NR9R10 및 OR9로부터 선택된 멤버이고, 여기에서 R9 및 R10은 H, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택되는 멤버이고;
R1' 은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 C(O)R8이고, 여기에서, R8은 NR9R10 및 OR9로부터 선택된 멤버이며, 여기에서 R9 및 R10은 H, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택되는 멤버이고;
R2는 H, 또는 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 비치환 헤테로알킬, 또는 시아노, 또는 알콕시이고; R2' 는 H, 또는 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 비치환 헤테로알킬이다.
다른 구체예는 다음 식을 가진다:
Figure 112009038497318-pct00054
이 구조에서, A, R6, R7, X, R4, R4', R5, 및 R5'는 식 (e)에 대해 상술된 바와 같다. 더욱이, Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고, 여기에서, R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버이고;
R33은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로부터 선택되는데, 여기에서 n은 1 내지 20의 정수이다. R15 및 R16은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 및 치환 또는 비치환 펩티딜을 나타내는데, 여기에서 R15 및 R16는 그들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의로 결합되어, 둘 이상의 헤테로원자를 임의로 포함하는, 4내지 6의 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성한다. R33은 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F, H, J, 또는 X2에 연결한다.
바람직하게, A는 치환 또는 비치환 페닐, 또는 치환 또는 비치환 피롤이다. 또한, R11에 대하여 본 명세서에 서술된 치환기의 임의의 선택은 R33에도 적용가능하다.
리간드
X4는 보호된 반응성 기능기, 비보호된 반응성 기능기, 검출가능한 표지, 및 표적화 제제로 구성된 군으로부터 선택된 리간드를 나타낸다. 바람직한 리간드는 항체 및 그의 단편과 같은, 표적화 제제다.
어떤 구체예에서, X4군은 R29, COOR29, C(O)NR29, 및 C(O)NNR29로부터 선택되는 멤버로 기술될 수 있으며, 여기에서 R29는 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로아릴로부터 선택된 멤버이다. 또 다른 예시적인 구체예에서, R29는 티올 반응성 멤버이다. 더 예시적인 구체예에서, R29는 할로아세틸 및 알킬 할라이드 유도체, 말레이미드, 아지리딘, 및 아크릴로일 유도체로부터 선택된 티올 반응성 멤버이다. 상기 티올 반응성 멤버는, 예를 들어, 항체와 같은 표적화 제제의 아미노산의 측쇄와 반응하여 표적화 제제를 링커-약물 부분에 결합시킬 수 있는 반응성 보호기로서 작용할 수 있다.
검출가능한 표지( Detectable Labels )
본 발명의 화합물 및 방법과 연관되어 사용된 특정 표지 또는 검출가능한 기는 일반적으로 그것이 본 발명의 화합물의 활성 또는 유용성에 유의하게 간섭하지 않는 한, 본 발명의 중요한 관점이 아니다. 검출가능한 기는 검출가능한 물리적 또는 화학적 성질을 갖는 임의의 물질일 수 있다. 그러한 검출가능한 표지는 면역분석 분야에서 잘 발달되어 왔으며, 일반적으로, 그러한 방법에 유용한 대부분의 임의의 표지는 본 발명에 적용될 수 있다. 따라서, 표지는 분광기의, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물이다. 본 발명에 유용한 표지는 자성 구슬(예, DYNABEADS™), 형광 색소(예, 형광물질 이소티오시아네이트, Texas red, rhodamine, 등), 방사능표지(예, 3H, 125I, 35S, 14C, 또는 32P), 효소(예, 호스라디시 퍼옥시다제(horse radish peroxidase), 알카리성 포스파타제, 및 ELISA에 일반적으로 사용되는 다른 것들), 및 콜로이드성 금 또는 착색된 유리 또는 플라스틱 구슬(예, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스, 등)과 같은 비색 표지를 포함한다.
당해 분야에서 잘 알려진 방법에 따라 표지를 본 발명의 화합물에 직접적으로 또는 간접적으로 결합시킬 수 있다. 상술한 바와 같이, 요구되는 민감도, 화합물과의 접합의 용이성, 안정성 요구, 사용가능한 설비 및 처리 규정에 따라 표지를 선택함으로써 매우 다양한 표지를 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물이 검출가능한 표지에 접합될 때, 상기 표지는 바람직하게는 방사성 동위원소, 형광성 제제, 형광성 제제 전구체, 발색단(chromophores), 효소 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 멤버이다. 항체에 여러 기들을 접합시키는 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들면, 항체에 빈번히 접합되는 검출가능한 표지는 호스라디시 퍼옥시다제, 알카리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 및 글루코스 옥시다제와 같은 효소이다.
비-방사성 표지는 흔히 간접적인 수단에 의해서 부착된다. 일반적으로, 리간드 분자(예, 비오틴)는 접합체의 성분에 공유적으로 결합된다. 다음에 상기 리간드는 고유하게 검출가능하거나, 검출가능한 효소, 형광성 화합물, 화학발광성 화합물과 같은, 신호 시스템에 공유적으로 결합되는 다른 분자(예, 스트렙타비딘)에 결합된다.
또한 본 발명의 접합체의 성분은, 예를 들면, 효소 또는 형광단과의 접합에 의하여, 신호 생성 화합물에 직접적으로 접합될 수 있다. 표지로서 관심의 효소는 우선적으로 하이드롤라제, 특히 포스파타제, 에스테라제 및 글리코시다제, 또는 옥시도타제, 특히 퍼옥시다제일 것이다. 형광성 화합물은 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 등등을 포함한다. 화학발광성 화합물은 루시페린, 및 2,3-디하이드로프탈라지딘디온, 예를 들면, 루미놀을 포함한다. 사용될 수 있는 여러 표지화 또는 신호 생성 시스템의 검토를 위하여, 미국 특허번호 제 4,391,904호를 참조.
표지를 검출하는 수단은 당업자에 잘 알려져 있다. 따라서, 예를 들면, 표지가 방사성 표지일 때, 검출 수단은 자가방사기록법(autoradiography)에서와 같은 신틸레이션 계수기 또는 사진 필름을 포함한다. 표지가 형광성 표지일 때, 적절한 파장의 빛을 갖는 형광색소를 여기시키고(exciting) 그 결과의 형광을 검출함으로써 표지를 검출할 수 있다. 필름 수단에 의하여, 전하결합소자(charge coupled devices, CCDs) 또는 광증폭기 등과 같은 전자 검출기를 사용함으로써, 상기 형광을 육안으로 검출할 수 있다. 유사하게, 효소에 적절한 기질을 제공하고 그 결과의 반응 생성물을 검출함으로써, 효소 표지를 검출할 수 있다. 마지막으로, 단순한 비색 표지는 표지와 관련된 색깔을 관찰함으로써 간단히 검출할 수 있다. 따라서, 여러 딥스틱(dipstick) 분석법에서, 접합된 금은 흔히 분홍색으로 나타나고, 반면에 다양한 접합된 구슬은 구슬의 색으로 나타낸다.
형광성 표지는 취급시 주의를 거의 요구하지 않는다는 장점을 가지며, 고-처리량 가시화 기술(컴퓨터를 포함하는 통합된 시스템에서 분석용 이미지의 디지털화를 포함하는 광학적 분석)에 사용할 수 있어서 현재 바람직하다. 바람직한 표지는 다음 중 하나 이상에 의하여 전형적으로 특징지어질 수 있다: 표지화하는데 있어서 높은 감응성, 높은 안정성, 낮은 백그라운드(background), 낮은 환경 감응성 및 높은 특이성. 많은 형광성 표지는 SIGMA chemical company (Saint Louis, MO), Molecular Probes (Eugene, OR), R&D systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), Fluka Chemica- Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland), 및 Applied Biosystems (Foster City, CA), 뿐만 아니라 당업자에게 알련진 많은 다른 상업적 소스(sources)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 더욱이, 당업자들은 특정 용도에 적절한 형광단을 선택하는 방법을 알 것이며, 상업적으로 입수할 수 없다면, 필요한 형광단을 새로 합성하거나 상업적으로 입수할 수 있는 형광성 화합물을 합성적으로 변경하여 원하는 형광성 표지에 도달할 수 있을 것이다.
작은 분자 형광단에 덧붙여, 자연적으로 발생하는 형광성 단백질 및 그러한 단백질의 조작된 유사체가 본 발명에서 유용하다. 그러한 단백질은, 예를 들면, 자포동물의 녹색 형광성 단백질(Ward 등, Photochem . Photobiol. 35:803-808 (1982); Levine 등, Comp . Biochem . Physiol., 72B:77-85 (1982)), 비브리오 피쉐리(Vibrio fischeri) 균주로부터의 황색 형광성 단백질 (Baldwin 등, Biochemistry 29:5509-15 (1990)), 와편모충 심비오디니움(dinoflagellate Symbiodinium) sp 종으로부터의 페리디닌-클로로필(Peridinin-chlorophyll)(Morris 등, Plant Molecular Biology 24:673:77 (1994)), 시네코코커스(Synechococcus), 예를 들면, 피코에리트린(phycoerythrin) 및 피코시아닌(phycocyanin)과 같은 해양 시아노박테리아로부터의 피코빌리단백질(phycobiliproteins)(Wilbanks 등, J. Biol . Chem. 268:1226-35 (1993)), 등을 포함한다.
일반적으로, 세포독소와 표적화 제제(또는 다른 시약), 및 선택적으로는 스페이서기의 사이에 결합을 형성하기 전에, 적어도 하나의 화학적 기능성기가 활성화될 것이다. 당업자는 하이드록시, 아미노, 및 카르복시기를 포함한, 다양한 화학적 기능성기가 다양한 표준 방법 및 조건을 사용하여 활성화될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들면, 세포독소 또는 표적화 제제의 하이드록실기를 포스겐 처리를 통해 활성화시켜 해당 클로로포르메이트, 또는 p-니트로페닐클로로포르메이트를 형성하고 해당 카르보네이트를 형성할 수 있다.
한 예시적인 구체예에서, 본 발명은 카르복실 기능성기를 포함하는 표적화 제제를 이용한다. 예를 들면, 카르복실기를 해당 아실 할라이드 또는 활성 에스테르로의 전환에 의하여 활성화시킬 수 있다. 이 반응을 상기 March, pp. 388-89에 기술된 바와 같이 다양한 조건하에서 실시할 수 있다. 한 예시적인 구체예에서, 아실 할라이드를 카르복실-함유기와 옥살일 클로라이드의 반응을 통하여 제조한다. 활성화된 제제를 세포독소 또는 세포독소-링커 가지 조합과 반응시켜 본 발명의 접합체를 형성한다. 카르복실-함유 표적화 제제의 사용은 단순히 예시적이고, 많은 다른 기능성 기들을 갖는 제제를 본 발명의 링커에 접합할 수 있다는 것을 당업자는 알 것이다.
반응성 기능기
기술되는 바를 명확히 하기 위하여, 계속되는 논의는 표적화 제제에 본 발명의 세포독소를 접합시키는 것에 초점을 맞춘다. 이 초점은 본 발명의 한 구체예를 예시하고, 다른 것들은 당업자에 의해서 쉽게 추론될 수 있다. 한 구체예의 논의에 초점을 맞춘 것으로 본 발명이 한정되지 않는다.
본 발명의 예시적 화합물은 치환 또는 비치환 알킬 또는 헤테로알킬 사슬에 일반적으로 위치하며, 다른 종류에 그것들의 용이한 부착을 허용하는, 반응성 기능기를 포함한다. 상기 반응성기의 편리한 위치는 사슬의 말단 위치이다.
본 발명을 실시하는 데 유용한 반응들의 반응성기 및 반응부류는 일반적으로 생접합 화학의 분야에 잘 알려진 것들이다. 반응성 기능기를 보호하거나 보호하지 않을 수 있으며, 상기 기의 보호된 성질을 유기 합성의 분야에 알려진 방법에 의해 변하게 할 수 있다. 반응성 세포독소 유사체에 유용한 반응들의 바람직한 부류는 비교적 온화한 조건하에서 진행하는 것들이다. 이것들은 친핵성 치환(nucleophilic substitutions)(예, 아실 할라이드, 활성 에스테르를 갖는 아민 및 알코올의 반응), 친전자성 치환(예, 엔아민 반응) 및 탄소-탄소 및 탄소-헤테로원자 다중 결합에 첨가(예, 마이클 반응(Michael reaction), 디엘스-알더 첨가(Diels-Alder addition))를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이들 및 다른 유용한 반응들은 예를 들면, March, Advanced Organic Chemistry, 제3판, John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; 및 Feeney 등, Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982에서 논의된다.
예시적인 반응 유형은 N-하이록시숙신이미드 에스테르, N-하이드록시벤즈트리아졸 에스테르, 산 할라이드, 아실 이미다졸, 티오에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 방향족 에스테르를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 카르복실기 및 이의 다양한 유도체들의 반응을 포함한다. 하이드록실기는 에스테르, 에테르, 알데히드, 등등으로 전환될 수 있다. 할로알킬기는, 예를 들면, 아민, 카르복실레이트 음이온, 티올 음이온, 카르바니온 또는 알콕시드 이온과의 반응에 의하여 새로운 종류로 전환될 수 있다. 디에노필(예, 말레이미드)기는 디엘스-알더 반응에 참여한다. 알데히드 또는 케톤 기는 이민, 하이드라존, 세미카르바존, 또는 옥심으로, 또는 그리그나드(Grignard) 첨가 또는 알킬리튬 첨가와 같은 메커니즘을 통하여, 전환될 수 있다. 설포닐 할라이드는 아민과 쉽게 반응하여, 예를 들면, 설포아민을 형성한다. 아민 또는 설프하이드릴 기는 예를 들면, 아실화, 알킬화 또는 산화될 수 있다. 알켄은, 사이클로첨가, 아실화, 마이클 첨가, 등등을 이용하여 새로운 종류의 배열로 전환될 수 있다. 에폭시드는 아민 및 하이드록실 화합물과 쉽게 반응한다.
당업자는 많은 이러한 연결들을 다양한 방법으로 다양한 조건을 이용하여 생성할 수 있음을 알 것이다. 에스테르의 제조에 대해서, 예를 들면, 상기 March, 상기 1157 참조; 티오에스테르에 대해서, 상기 March, 362-363, 491, 720-722, 829, 941, 및 1172 참조; 카르보네이트에 대해서, 상기 March, 346-347 참조; 카르바메이트에 대해서, 상기 March, 1156-57 참조; 아미드에 대해서, 상기 March 1152 참조; 우레아 및 티오우레아에 대해서, 상기 March 1174 참조; 아세탈 및 케탈에 대해서, 상기 Greene 등 178-210 및 상기 March 1146 참조; 아실옥시알킬 유도체에 대해서, Prodrugs: Topical and Ocular Drug Delivery, K. B. Sloan, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1992 참조; 에놀 에스테르에 대해서, 상기 March 1160 참조; N-설포닐이미데이트에 대해서, Bundgaard 등, J. Med . Chem., 31:2066 (1988) 참조; 안하이드라이드에 대해서, 상기 March 355-56, 636-37, 990-91, 및 1154 참조; N-아실아미드에 대해서, 상기 March 379 참조; N-마니쉬 염기에 대해서, 상기 March 800-02 및 828 참조; 하이드록시메틸 케톤 에스테르에 대해서, Petracek 등, Annals NY Acad . Sci., 507:353-54 (1987) 참조; 디설피드에 대해서, 상기 March 1160 참조; 그리고 및 포스포네이트 에스테르 및 포스폰아미데이트에 참조.
반응성 기능기들은 반응에 참여하지 않거나 반응을 간섭하지 않도록 비보호되거나 선택될 수 있다. 대안적으로, 보호기의 존재에 의하여 반응성 기능기가 반응에 참여하는 것을 막을 수 있다. 당업자는 특정 기능기가 반응 조건의 선택을 간섭하는 것을 막는 방법을 알 것이다. 유용한 보호기의 예에 대해서, Greene 등, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991 참조.
전형적으로, 표적화 제제는 표준 화학 기술을 사용하여 그들 각각의 화학적 기능성기들을 통해 세포독소에 공유적으로 연결된다. 임의적으로, 링커 또는 제제는 하나 이상의 스페이서기를 통하여 제제에 결합된다. 스페이서기는 조합으로 사용될 때 등가이거나 다를 수 있다.
일반적으로, 세포독소와 반응성 기능기 사이의 연결이 형성되기 전에, 그리고 임의로, 스페이서기는, 적어도 하나의 화학적 기능성기가 활성화될 것이다. 당업자는 하이드록시, 아미노 및 카르복시 기들을 포함하는, 다양한 화학적 기능성기들이 다양한 표준 방법들 및 조건들을 이용하여 활성화될 수 있다는 것을 알 것이다. 한 예시적인 구체예에서, 본 발명은 반응성 기능기로서 카르복실 기능성기를 포함한다. 카르복실기는 상기에서 기술된 바와 같이 활성화될 수 있다.
분리가능한 기질
본 발명의 분리가능한 기질은 “X2”로 나타낸다. 바람직하게, 분리가능한 기질은 효소에 의하여 분리될 수 있는 분리가능한 효소 기질이다. 바람직하게, 효소는, 직접적으로 또는 간접적으로, 치료될 종양 또는 다른 표적 세포와 우선적으로 관련이 있다. 효소는 치료될 종양 또는 다른 표적 세포에 의하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 분리가능한 기질은 종양 또는 다른 표적 세포의 주위에 또는 안에서 발견되는 효소에 의하여 우선적으로 분리될 수 있는 펩티드일 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 효소는, 종양 항원에 특이적인 항체와 같은, 종양 세포에 특이적으로 결합하는 표적화 제제에 부착될 수 있다.
상기에 기술된 약물에 결합하기 적당한 효소 분리성 기질의 예로서, PCT 특허출원 공개번호 제 WO 00/33888호, 제 WO 01/95943호, 제 WO 01/95945호, 제 WO 02/00263호, 및 제 WO 02/100353호는 약물에 분리가능한 펩티드의 부착을 공지하며, 이들 모두는 참조 문헌으로서 본 명세서에 병합된다. 펩티드는, 종양과 관련있는, 트로우아제(trouase)(티메트 올리고펩티다아제(thimet oligopeptidase)와 같은), CD10(네프릴리신), 기질 메탈로프로테아제(MMP2 또는 MMP9와 같은), 유형 II 트랜스멤브레인 세린 프로테아제(헵신, 테스티신, TMPRSS4, 또는 매트립타제/MT-SP1과 같은), 또는 카텝신과 같은, 효소에 의하여 분리될 수 있다. 이 구체예에서, 전구약물은 상술한 바와 같은 약물, 펩티드, 안정화기, 및 선택적으로 약물과 펩티드 사이의 연결기를 포함한다. 안정화기는 펩티드의 말단에 부착되어 전구약물이 종양 또는 다른 표적 세포에 도달하기 전에 분해되는 것을 막는다. 적절한 안정화기의 예들은, 숙신산, 디글리콜산, 말레산, 폴리에틸렌 글리콜, 피로글루탐산, 아세트산, 나프틸카르복실산, 테레프탈산, 및 글루탐산 유도체들과 같은, 비-아미노산; 뿐만 아니라, 비-유전자로 암호화된 아미노산, 또는 아스파르트산의 β-카르복시기 또는 글루탐산의 γ-카르복실기에서 펩티드의 N-말단에 부착되는 아스파르트산 또는 글루탐산을 포함한다.
펩티드는 전형적으로 3-12(또는 그 이상) 아미노산을 포함한다. 특정 아미노산의 선택은, 적어도 부분적으로, 펩티드를 분리하는데 사용될 효소, 뿐만 아니라, 생체내 팹티드의 안정성에 의존할 것이다. 적절한 분리가능한 펩티드의 일 예는 β-AlaLeuAlaLeu이다. 이것은 안정화기와 조합하여 숙시닐-β-AlaLeuAlaLeu를 형성한다. 적절한 분리가능한 펩티드의 다른 예가 상기에 언급된 참조문헌에 제공되어 있다.
예증적 예로써, 네프릴리신(neprilysin), 중성 엔도펩티다아제(neutral endopeptidase, NEP), 및 공통 급성 림프구성 백혈병 항원(common acute lymphoblastic leukemia antigen, CALLA)으로도 알려진, CD10은 유형 II 세포-표면 아연-의존성 메탈로프로테아제이다. CD10과 함께 사용되는데 적절한 분리가능한 기질은 LeuAlaLeu 및 IleAlaLeu을 포함한다. 기질이 커짐에 따라 촉매 효율성이 종종 감소된다 할지라도, CD10에 대한 다른 알려진 기질은 50개까지의 아미노산 길이를 갖는 펩티드를 포함한다.
다른 예증적 예는 기질 메탈로프로테아제(metalloproteases, MMP)에 기초한다. 아마도 종양과 관계된 가장 특성화된 단백질 분해적 효소에서, 종양 미세환경 내에서 MMP의 활성화의 명확한 상관관계가 있다. 특히, 용해성 기질 효소 MMP2(젤라티나제 A) 및 MMP9(젤라티나제 B)는 집중적으로 연구되었고, 종양 성장을 포함하는 조직 리모델링 동안에 선택적으로 활성화되는 것으로 보여진다. MMP2 및 MMP9에 의하여 분리되도록 설계된 펩티드 서열은 덱스트란 및 메토트렉세이트의 접합체(Chau 등, Bioconjugate Chem. 15:931-941 (2004)); PEG (polyethylene glycol)와 독소루비신의 접합체(Bae 등, Drugs Exp . Clin . Res. 29:15-23 (2004)); 및 알부민과 독소루비신의 접합체(Kratz 등, Bioorg . Med . Chem. Lett. 11:2001-2006 (2001))에 대하여 설계되고 테스트된다. MMP와 함께 사용할 적절한 서열의 예는 ProValGlyLeuIleGly(서열번호 102), GlyProLeuGlyVal(서열번호 103), GlyProLeuGlyIleAlaGlyGln(서열번호 104), ProLeuGlyLeu(서열번호 105), GlyProLeuGlyMetLeuSerGln(서열번호 106), 및 GlyProLeuGlyLeuTrpAlaGln(서열번호 107)을 포함하나 이에 한정되지 않는다(예를 들어, Kline 등, Mol . Pharmaceut. 1:9-22 (2004) 및 Liu 등, Cancer Res. 60:6061-6067 (2000)뿐만 아니라 이전에 언급된 참조문헌을 참조). 다른 분리가능한 기질도 사용될 수 있다.
또한 다른 예는 유형 II 트랜스멤브레인 세린 프로테아제이다. 효소의 이러한 기는, 예를 들어, 헵신, 테스티신, 및 TMPRSS4를 포함한다. GlnAlaArg는 매트립타제/MT-SP1(유방 및 난소 암들에서 과대-발현됨)과 함께 유용한 하나의 기질 서열이고, LeuSerArg는 헵신(전립선 및 다른 부분의 종양 유형에서 과대-발현됨)과 함께 유용하다(예, Lee 등, J. Biol . Chem. 275:36720-36725 및 Kurachi와 Yamamoto, Handbook of Proeolytic Enzymes 제2권, 제2판 (Barrett AJ, Rawlings ND & Woessner JF, eds) pp. 1699-1702 (2004) 참조). 다른 분리가능한 기질도 사용될 수 있다.
분리가능한 기질 정렬의 다른 유형은 종양 또는 세포와 관련되는 분리가능한 기질을 분리할 수 있는 별개의 효소를 준비하는 것을 포함한다. 예를 들어, 효소는 종양-특이적 항체(또는 종양 또는 수용체 리간드와 같은 다른 표적에 우선적으로 부착되는 다른 개체)에 결합될 수 있으며, 그리고 나서 효소-항체 접합체는 환자에게 제공될 수 있다. 효소-항체 접합체는 종양과 관련된 항원을 향하고 이 항원에 결합된다. 이어서, 약물-분리가능한 기질 접합체가 전구약물로서 환자에 제공된다. 약물-분리가능한 기질 접합체가 종양과 관련되는 효소와 반응할 때 상기 약물은 종양 근처에서 방출되기만 하여, 분리가능한 기질은 분리되고 약물은 유리된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제 4,975,278호; 제 5,587,161호; 제 5,660,829호; 제 5,773,435호; 및 제 6,132,722호는 그러한 정렬을 공지하는데, 이 모든 것들은 본 명세서에 참조 문헌으로서 병합된다. 적절한 효소 및 기질의 예는 β-락타마제 및 세팔로스포린 유도체, 카르복시펩티다아제 G2 및 글루타믹 및 아스파르틱 엽산 유도체들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
한 구체예에서, 효소-항체 접합체는 관심의, 표적 세포 상에서 또는 표적 자리에서 발현되는 항원에 대한 특이성에 기초하여 선택된, 항체, 또는 항체 단편을 포함한다. 항체에 대한 논의는 상기에 주여져있다. 적절한 세팔로스포린-분리가능성 기질의 예는 다음과 같다:
Figure 112009038497318-pct00055
접합체의 예
본 발명의 링커 및 분리가능한 기질은 다양한 파트너 분자를 포함하는 접합체에 사용될 수 있다. 본 발명의 접합체의 예는 하기에 더 자세히 기술된다. 다른 지시가 없으며, 치환기들은 세포독소, 링커, 및 분리가능한 기질에 관한 부분에서 상기에 설명된 바와 같이 정의된다.
A. 링커 접합체
적절한 접합체의 한 예는 다음 식의 화합물이다:
Figure 112009038497318-pct00056
여기에서 L1은 자기-희생 링커이고; m은 정수 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며; F는 다음 구조를 포함하는 링커이다:
Figure 112009038497318-pct00057
여기에서 AA1은 천연 아미노산 및 비천연 α-아미노산으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 멤버이고; c는 1 내지 20의 정수이며; L2는 자기-희생 링커이고 다음을 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00058
여기에서 각 R17, R18, 및 R19는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 및 치환 또는 비치환 아릴로부터 독립적으로 선택되고, w는 0 내지 4에서의 정수이며; o는 1이고; L4는 링커 멤버이며; p는 0 또는 1이고; X4는 보호된 반응성 기능기, 비보호된 반응성 기능기, 검출가능한 표지, 및 표적화 제제로 구성된 군으로부터 선택된 멤버이며; D는 다음의 구조를 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00059
여기에서 고리계 A는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 기들로부터 선택된 멤버이고; E 및 G는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 헤테로원자, 단일 결합으로부터 독립적으로 선택된 멤버이거나, E및 G는 결합되어 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 고리계를 형성하며; X는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고; R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버이며; R3는 OR11인데, R11은 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 설포네이트, 아실, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O)(OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12 및 SiR12R13R14로 구성되는 군으로부터 선택된 멤버이고, R4, R4', R5 및 R5'는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 멤버들이거나, R4, R4', R5 및 R5'의 임의의 인접쌍은, 그것들이 부착되는 탄소 원자와 함께, 결합되어 4 내지 6의 멤버들을 갖는 치환 또는 비치환 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며; 여기에서 n은 1 내지 20까지로부터의 정수이고; R15 및 R16은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 및 치환 또는 비치환 펩티딜로부터 독립적으로 선택되고, 여기에서 R15 및 R16은 그것들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의로 결합되어 4 내지 6의 멤버들을 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며; R6은 존재하거나 부재하는 단일 결합이고, 존재할 때 R6 및 R7은 결합되어 사이클로프로필 고리를 형성하며; 및 R7은 상기 사이클로프로필 고리에서 R6과 결합된 CH2-X1 또는 -CH2- 이고, 여기에서 X1은 이탈기인데, 여기에서 R11은 상기 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F에 연결시킨다.
어떤 구체예에서, 약물은 상기 구조 (c) 또는 (f)를 가진다. 접합체로서 사용되기에 적당한 화합물의 특정한 예는 다음과 같다:
Figure 112009038497318-pct00060
접합체 유형의 다른 예는 다음 식의 화합물이다:
Figure 112009038497318-pct00061
여기에서 L1은 자기-희생 링커이며; m은 정수 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고; F는 다음 구조를 포함하는 링커이다:
Figure 112009038497318-pct00062
여기에서 AA1은 천연 아미노산 및 비천연 α-아미노산으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 멤버이며; c는 1 내지 20의 정수이고; L2는 자기-희생 링커이며; o는 0 이거나 1이고; L4는 링커 멤버이며; p는 0 또는 1이고; X4는 보호된 반응성 기능기, 비보호된 반응성 기능기, 검출가능한 표지, 표적화 제제로 구성되는 군으로부터 선택된 멤버이며; 그리고 D는 다음 구조를 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00063
여기에서 고리계 A는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 기들로부터 선택된 멤버이고; E 및 G는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 헤테로원자, 단일 결합으로부터 독립적으로 선택된 멤버이거나, E및 G는 결합되어 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 고리계를 형성하며; X는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고; R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버이며; R3은 (=O), SR11, NHR11 및 OR11로 구성되는 군으로부터 선택된 멤버인데, R11은 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 설포네이트, 아실, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O)(OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12 및 SiR12R13R14로 구성되는 군으로부터 선택된 멤버이고, 여기에서 R12, R13, 및 R14는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 치환 또는 비치환 아릴로부터 독립적으로 선택된 멤버인데, R12 및 R13은 그것들이 부착된 질소 또는 탄소 원자와 함께 임의적으로 결합되어, 둘 이상의 헤테로원자를 임의적으로 포함하는, 4 내지 6 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며; R4, R4', R5 및 R5'는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 멤버들이거나, R4, R4', R5 및 R5'의 임의의 인접쌍은, 그것들이 부착되는 탄소 원자와 함께, 결합되어 4 내지 6의 멤버들을 갖는 치환 또는 비치환 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하는데, 여기에서 n은 1 내지 20까지의 정수이고; R15 및 R16은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 및 치환 또는 비치환 펩티딜로부터 독립적으로 선택되는데, 여기에서 R15 및 R16은 그것들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의로 결합되어, 둘 이상의 헤테로원자를 임의로 포함하는, 4 내지 6의 멤버들을 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며; 여기에서 R4, R4', R5 및 R5' 중 적어도 하나는 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F에 연결하고, 다음을 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00064
여기에서 v는 1 내지 6까지의 정수이고; 각 R27, R27', R28, 및 R28' 은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되며; R6은 존재하거나 부재하는 단일 결합이고 존재할 때 R6 및 R7 은 결합되어 사이클로프로필 고리를 형성하며; 그리고 R7은 상기 사이클로프로필 고리에서 R6와 함께 결합되는 CH2-X1 또는 -CH2-인데, 여기에서 X1는 이탈기이다.
어떤 구체예에서, 약물은 상기 구조 (c) 또는 (f)를 가진다. 접합체로서 사용되기에 적당한 화합물의 특정한 예는 다음과 같다:
Figure 112009038497318-pct00065
여기에서 r은 0 내지 24 범위 내에서의 정수이다.
적절한 접합체의 다른 예는 다음 식의 화합물이다:
Figure 112009038497318-pct00066
여기에서 L1은 자기-희생 링커이고; m은 정수 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며; F는 다음 구조를 포함하는 링커이다:
Figure 112009038497318-pct00067
여기에서 AA1은 천연 아미노산 및 비천연 α-아미노산으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 멤버이며; c는 1 내지 20의 정수이고; L3은 1차 또는 2차 아민 또는 카르복실 기능기를 포함하는 스페이서기이며; 여기에서 L3이 존재하면, m은 0이고, L3 형태의 아민이 D의 매달린 카르복실 기능기와 아미드 결합을 형성하거나 L3 형태의 카르복실이 D의 매달린 아민 기능기와 아미드 결합을 형성하거나 둘 중의 하나이고; o은 0 또는 1이고; L4는 링커 멤버인데, 여기에서 L4는 (AA1)c의 N-말단에 직접 부착되는,
Figure 112009038497318-pct00068
을 포함하는데, 여기에서 R20은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택되는 멤버이며, 각 R25, R25', R26, 및 R26' 은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되고; s 및 t는 1 내지 6으로부터 독립적으로 선택되는 정수들이며; p는 1이고; X4는 보호된 반응성 기능기, 비보호된 반응성 기능기, 검출가능한 표지, 및 표적화 제제로 구성되는 군으로부터 선택된 멤버이며; 그리고 D는 다음 구조를 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00069
여기에서 고리계 A는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 기들로부터 선택된 멤버이고; E 및 G는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 헤테로원자, 단일 결합으로부터 독립적으로 선택된 멤버이거나, E및 G는 결합되어 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 고리계를 형성하며; X는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고; R23는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버이며; R3은 (=O), SR11, NHR11 및 OR11로 구성되는 군으로부터 선택된 멤버인데, R11은 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 설포네이트, 아실, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O)(OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12 및 SiR12R13R14로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 멤버이고, 여기에서 R12, R13, 및 R14는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 치환 또는 비치환 아릴로부터 독립적으로 선택된 멤버인데, R12 및 R13은 그것들이 부착된 질소 또는 탄소 원자와 함께 임의적으로 결합되어, 둘 이상의 헤테로원자를 임의적으로 포함하는, 4 내지 6 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며; R4, R4', R5 및 R5'는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 멤버들이거나, R4, R4', R5 및 R5'의 임의의 인접쌍은, 그것들이 부착되는 탄소 원자와 함께, 결합되어 4 내지 6의 멤버들을 갖는 치환 또는 비치환 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하는데, 여기에서 n은 1 내지 20까지의 정수이고; R15 및 R16은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 및 치환 또는 비치환 펩티딜로부터 독립적으로 선택되는데, 여기에서 R15 및 R16은 그것들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의로 결합되어, 둘 이상의 헤테로원자를 임의로 포함하는, 4 내지 6의 멤버들을 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며; R6은 존재하거나 부재하는 단일 결합이고 존재할 때 R6 및 R7 은 결합되어 사이클로프로필 고리를 형성하며; 그리고 R7은 상기 사이클로프로필 고리에서 R6와 함께 결합되는 CH2-X1 또는 -CH2-인데, 여기에서 R4 , R4', R5, R5', R15 또는 R16 중 적어도 하나는 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F에 연결한다.
어떤 구체예에서, 약물은 상기 구조 (c) 또는 (f)를 가진다. 접합체로서 사용하기에 적절한 화합물의 한 특정 예는 다음을 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00070
여기에서 r은 0 내지 24의 범위 내의 정수이다.
접합체로서의 사용하기에 적절한 화합물의 다른 예는 다음을 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00071
Figure 112009038497318-pct00072
Figure 112009038497318-pct00073
Figure 112009038497318-pct00074
및
Figure 112009038497318-pct00076
Figure 112009038497318-pct00077
Figure 112009038497318-pct00078
Figure 112009038497318-pct00079
Figure 112009038497318-pct00080
Figure 112009038497318-pct00081
Figure 112009038497318-pct00082
Figure 112009038497318-pct00083
Figure 112009038497318-pct00084
Figure 112009038497318-pct00085
여기에서 R은
Figure 112009038497318-pct00086
또는
Figure 112009038497318-pct00087
이고 r은 0 내지 24의 범위 내의 정수이다.
또한 접합체는, 다음 화합물과 같이, 구조 (g)를 갖는 약물을 사용하여 형성될 수 있다:
Figure 112009038497318-pct00088
Figure 112009038497318-pct00089
Figure 112009038497318-pct00090
Figure 112009038497318-pct00091
Figure 112009038497318-pct00092
Figure 112009038497318-pct00093
Figure 112009038497318-pct00094
Figure 112009038497318-pct00095
여기에서 r은 0 내지 24의 범위 내의 정수이다.
접합체는 다음 구조를 갖는 약물을 사용하여 형성될 수 있다:
Figure 112009038497318-pct00096
Figure 112009038497318-pct00097
Figure 112009038497318-pct00098
Figure 112009038497318-pct00099
및
Figure 112009038497318-pct00100
그러한 독소들의 합성, 뿐만 아니라 항체에 대한 그것들의 연결에 관한 설명은 일련번호 제 60/991,300호를 갖는 미국 특허출원에 공지되어 있다.
B. 분리가능한(cleavable) 링커 접합체
적절한 접합체의 예는 다음 구조를 갖는 화합물이다:
Figure 112009038497318-pct00101
여기에서 L1은 자기-희생 스페이서이며; m은 정수 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고; X2는 분리가능한 기질이며; 그리고 D는 다음 구조를 포함한다:
Figure 112009038497318-pct00102
여기에서 고리계 A는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 기들로부터 선택된 멤버이고; E 및 G는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 헤테로원자, 단일 결합으로부터 독립적으로 선택된 멤버이거나, E및 G는 결합되어 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 고리계를 형성하며; X는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고; R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버이며; R3은 (=O), SR11, NHR11 및 OR11로 구성되는 군으로부터 선택된 멤버인데, R11은 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 설포네이트, 아실, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O)(OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12 및 SiR12R13R14로 구성되는 군으로부터 선택된 멤버이고, 여기에서 R12, R13, 및 R14는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 치환 또는 비치환 아릴으로부터 독립적으로 선택된 멤버인데, R12 및 R13은 그것들이 부착된 질소 또는 탄소 원자와 함께 임의적으로 결합되어, 둘 이상의 헤테로원자를 임의적으로 포함하는, 4 내지 6 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며; R6은 존재하거나 부재하는 단일 결합이고 존재할 때 R6 및 R7 은 결합되어 사이클로프로필 고리를 형성하고 R7은 상기 사이클로프로필 고리에서 R6과 함께 결합되는 CH2-X1 또는 -CH2-인데, 여기에서 X1는 이탈기이며, R4, R4', R5 및 R5'는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 멤버들이거나, R4, R4', R5 및 R5'의 임의의 인접쌍은, 그것들이 부착되는 탄소 원자와 함께, 결합되어 4 내지 6의 멤버들을 갖는 치환 또는 비치환 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하는데, 여기에서 n은 1 내지 20까지의 정수이며; R15 및 R16은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 및 치환 또는 비치환 펩티딜로부터 독립적으로 선택되는데, 여기에서 R15 및 R16은 그것들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의로 결합되어, 둘 이상의 헤테로원자를 임의로 포함하는, 4 내지 6의 멤버들을 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며; 여기에서 R4, R4', R5, 및 R5' 중 적어도 하나는 약물을 존재한다면 L1에, 또는 X2에 연결하며, 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다:
Figure 112009038497318-pct00103
및
Figure 112009038497318-pct00104
여기에서 R30, R30', R31, 및 R31'은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택되고; v는 1 내지 6의 정수이다.
적절한 분리가능한 링커의 예는 β-AlaLeuAlaLeu 및
Figure 112009038497318-pct00105
을 포함한다.
약제학적 조성물
다른 관점에서, 본 발명은 조성물, 예를 들어, 본 발명의, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부(들) 중 하나 또는 조합물을 포함하고, 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된 약제학적 조성물을 제공한다. 그러한 조성물들은 본 발명의 (예를 들어, 두 개 이상의 상이한) 항체, 또는 면역접합체 또는 이중특이적 분자의 하나 또는 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물은 표적 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 또는 상보적 활성을 가지는 항체(또는 면역접합체 또는 이중특이체)의 조합을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 약제학적 조성물은 조합 요법, 즉 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 적어도 하나의 다른 항-암성 제제, 항-염증성 제제 또는 면역억제제와 조합된 본 발명의 항-CD22 항체를 포함할 수 있다. 조합 요법에 사용될 수 있는 치료제의 예들은 본 발명의 항체의 용도에 대한 부분에서 더 자세히 후술한다.
본 명세서에서 사용되는, “약제학적으로 허용가능한 담체”생리학적으로 양립할 수 있는, 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅물, 항박테리아성 및 항균성 제제, 등장액 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구적, 척추 또는 표피 투여(예, 주사 또는 주입으로)에 적합하다. 투여 경로에 의존하여, 활성 화합물, 즉, 항체, 면역접합체, 또는 이중특이적 분자는 산의 작용 및 화합물을 비활성화시키는 다른 자연적 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅할 수 있다.
본 발명의 약제학적 화합물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. “약제학적으로 허용가능한 염”은 부모 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 유지하고 임의의 원하지 않는 독소학적 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다(예, Berge, S. M. 등 (1977) J. Pharm . Sci. 66:1-19 참조). 그러한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등과 같은 비독성 무기산으로부터 유래된 것은 물론, 지방족 모노- 및 디카르복실 산, 페닐-치환된 알카노 산, 하이드록시 알카노 산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰 산 등과 같은 비독성 유기산으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가 염은, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등과 같은 알카리 토금속으로부터 유래된 것은 물론 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등과 같은 비독성 유기 아민류로부터 유래된 것을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 약제학적 허용가능 항산화제를 포함할 수 있다. 약제학적 허용가능 항산화제의 예는: (1) 아스코르브 산, 시스테인 염산염, 소듐 비설페이트, 소듐 메타비설파이트, 소듐 설파이트 등과 같은 수용성 항산화제; (2) 아스코빌 팔미테이트, 부틸레이티드 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA), 부틸레이티드 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene, BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 지용성 항산화제; 및 (3) 시트르 산, 에틸렌디아민 테트라아세트 산(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA), 소르비톨, 타르타르 산, 인산 등과 같은 금속 킬레이트화제를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적절한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올류(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은) 및 이들의 적절한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르류를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지함으로써 및 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다.
이러한 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 미생물 존재의 예방은 전술한 살균 공정 및, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브 산 등과 같은 다양한 항박테리아 및 항진균성 제제 주입으로 확립할 수 있다. 당, 염화나트륨 등과 같은 등장제제(isotonic agents)를 조성물에 포함하는 것이 또한 바람직하다. 이에 더하여, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 포함하여 주사가능한 약제학 제형의 흡수를 연장할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사용액이나 분산액의 임시 제조물용 멸균 분말을 포함한다. 약제학적 활성 물질용으로 그러한 배지 및 제제를 사용하는 것은 당해 분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 배지 또는 제제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우를 제외하고는, 본 발명의 약제학적 조성물에 이를 사용하는 것이 포함된다. 보조적인 활성 화합물 또한 조성물에 포함될 수 있다.
치료적 조성물은 일반적으로 제조 및 보관 환경하에서 반드시 멸균적이고 안정적이어야 한다. 상기 조성물은 용액, 미소유화액, 리포좀, 또는 고 약물 농도에 적합한 다른 주문된 구조로서 제형될 수 있다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적절한 혼합물을 포함하는 용매나 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지함으로써 및 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 많은 경우에 있어서, 등장제제, 예를 들어, 당, 폴리알코올류, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어 모노스테아레이트염 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 조성물에 포함시킴으로써 주사가능한 조성물의 흡수를 길게 할 수 있다.
멸균된 주사가능한 용액은, 활성 화합물을 적절한 용매에 요구되는 양으로, 필요한 경우, 상기 설명된 성분 중 하나 또는 조합물과 같이 제형화하고, 멸균 마이크로정제하여 제조될 수 있다. 일반적으로 분산액은 상기 활성 화합물을, 염기성 분산매 및 상기 설명된 것의 필요한 다른 성분을 포함하는 멸균 비이클(vehicle)에 배합하여 제조된다. 멸균된 주사용 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조(lyophilization)이고 이는 활성 성분에 더하여 이의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 산출한다.
담체 물질과 조합하여 단일 투약 형태를 생성하는 활성 성분의 양은 처리될 대상체 및 투여의 특정 방식에 따라 변할 것이다. 단일 투약 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양이다. 일반적으로, 100 퍼센트 중에, 이러한 양은 활성 성분의 약 0.01 % 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 더 바람직하게는 활성 성분의 약 1% 내지 약 30%가 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합되어 있다.
투약 섭생은 최적의 원하는 반응(예, 치료 반응)을 제공하도록 조절된다. 예를 들어, 단일 볼러스(bolus)가 투여될 수 있고, 수 개 분리된 투약물이 여러 번 투여될 수 있고 또는 투여량은 치료 상태의 긴급성에 의해 지시되는 바와 같이, 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 투여의 용이함 및 투여의 일관성을 위해 비경구 조성물을 투약 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 사용되는 투약 단위 형태는, 치료될 대상체에 단일성 투약물로서 적절한 물리적으로 분리된 단위체를 지칭하고, 각 단위체는 요구되는 약제학적 담체와 결합하여 요구되는 치료 효과를 생성하는 데 계산된 활성 화합물의 소정의 양을 포함한다. 본 발명의 투약 단위 형태에 대한 명세는 (a) 활성 화합물의 고유의 특성 및 이루어지는 특정 치료효과, 및 (b) 개인에게서 민감성의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 조제하는 당해 분야에 고유한 제한에 의해 지시되고 및 직접적으로 의존한다.
항체의 투여의 경우, 투여량은 숙주 체중의, 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 더 통상적으로는 0.01 내지 5 mg/kg의 범위이다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중이거나 1-10 mg/kg의 범위에 있다. 예시적인 치료 섭생은 일 주에 한번, 이 주에 한번, 삼 주에 한번, 사 주에 한번, 한 달에 한 번, 세 달에 한번, 또는 삼 내지 육 개월에 한 번 투여일 수 있다. 본 발명의 항-CD22 항체에 대한 바람직한 투여 섭생은 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중 정맥 내 투여를 포함하고, 상기 항체는 하기 투여 스케줄 중 하나를 이용한다: (i) 4 주마다 6 번 투여 후, 3 달 마다 투여; (ii) 3 주 마다; (iii) 3 mg/kg 체중 한 번 투여 후, 매 3 주 마다 1 mg/kg 체중 투여.
어떤 방법에서, 상이한 결합 특이성을 가지는 두 개 이상의 단일클론 항체를 동시에 투여하며, 이 경우, 투여되는 각 항체의 투여량은 지시된 범위에 속한다. 항체는 통상적으로 여러 번 투여된다. 단일 투여 간의 간격은, 예를 들어, 주간, 월간, 삼개월 또는 연간일 수 있다. 간격은 또한, 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈중 농도를 측정하여 지시되는 바에 따라, 불규칙할 수 있다. 어떤 방법에서, 투여량은 약 1-1000 μg/ml 혈장 항체 농도, 및 특정의 방법에서는 약 25-300 μg /ml의 농도를 얻도록 조절한다.
대안적으로, 항체는 지속 방출(sustained release) 제형으로서 투여될 수 있고, 이 경우, 투여 횟수가 줄어든다. 투여량 및 횟수는 환자에서 항체의 반감기에 의존하여 변한다. 일반적으로, 인간 항체들은 가장 긴 반감기를 보이며, 인간화 항체들, 키메릭 항체들, 및 비인간 항체들이 그 뒤를 따른다. 투여량 및 투여 횟수는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 변할 수 있다. 예방적 적용에서는, 상대적으로 적은 투여량이 긴 시간에 걸쳐서 상대적으로 적은 횟수로 투여된다. 특정 환자는 그들 수명의 남은 기간 동안 치료를 계속 받는다. 치료적 적용에서, 질병의 진행이 감소되거나 종결될 때까지 및 바람직하게, 환자가 질병의 증상의 부분적으로 또는 완전한 개선을 보일 때까지 상대적으로 잦은 횟수로 상대적으로 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 환자는 예방적 섭생 방식으로 투여될 수 있다.
프로피락시스(prophylaxis)에서의 사용 및/또는 비정상 세포 증식과 관련된 질병의 치료에서, 약 0.001 mM 내지 20 mM의 화합물의 농도를 순회하여 투여하는 것이 바람직한데, 약 0.01 mM 내지 5 mM이 바람직하다.
본 명세서에 설명된 화합물의 구강 투여에 관한 환자 투여량은, 전형적으로 약 1 mg/일 내지 약 10,000 mg/일, 더 전형적으로 약 10 mg/일 내지 약 1,000 mg/일, 그리고 가장 전형적으로 약 50 mg/일 내지 약 500 mg/일의 범위를 가진다. 환자 체중의 견지에서 언급했듯이, 전형적인 투여량은 약 0.01 내지 약 150 mg/kg/일, 더욱 전형적으로 약 0.1 내지 약 15 mg/kg/일, 가장 전형적으로 약 1 내지 약 10 mg/kg/일의 범위를 가지며, 예를 들면 5 mg/kg/일 또는 3 mg/kg/일이다.
적어도 어떤 구체예에서, 종양 성장을 저지하거나 억제하는 환자 투여량은 1 μmol/kg/일 이하일 수 있다. 예를 들면, 환자 투여량은 0.9, 0.6, 0.5, 0.45, 0.3, 0.2, 0.15, 또는 0.1 μmol/kg/일 이하일 수 있다(약물의 몰(mole)을 지칭). 바람직하게, 항체-약물 접합체는 적어도 5일의 기간 이상 일일 투여량으로 투여될 때 종양의 성장을 저지한다. 적어도 어떤 구체에에서, 종양은 SCID 마우스의 인간-유형 종양이다. 예로써, SCID 마우스는 CB17.SCID 마우스(Taconic, Germantown, NY로부터 입수가능)일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에서 활성 성분의 실제 투약 수준은 환자에 유독하지 않고서, 특정 환자, 조성물, 및 투여의 방식에 대하여 원하는 치료학적 반응을 성취하는데 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위하여 다양화할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 이들의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여의 경로, 투여의 시간, 사용된 특정 화합물의 배출율, 치료의 기간, 다른 약물, 사용된 특정 조성물와 조합하여 이용된 화합물 및/또는 물질, 나이, 성, 무게, 조건, 치료될 환자의 일상 건강 상태 및 이전의 병력, 및 의학 분야에서 잘 알려진 유사한 요소들을 포함하는, 다양한 약물동력학적 요소들에 달려있다.
본 발명의 항-CD22 항체의 “치료적으로 유효한 투여량”은 바람직하게는 질병 증상의 중증도를 감소시키고, 무증상질병 기간의 빈도 및 기간을 증가시키고, 또는 질병 고통으로 인한 장애나 불능을 방지하는 결과를 가져온다. 예를 들어, CD22+ 종양의 치료의 경우, “치료적으로 유효한 투여량” 미치료 대상체에 비하여, 세포 성장 또는 종양 성장을 바람직하게는 적어도 약 20%, 더 바람직하게는 적어도 약 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 60%, 및 더더욱 바람직하게는 적어도 약 80%로 억제한다. 종양 성장을 억제하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능을 예시하는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 대안적으로, 이러한 조성물의 성질은 세포 성장을 억제하는 화합물의 능력을 조사함으로써 평가될 수 있고, 그러한 억제는, 숙련된 실험자에게 알려진 분석 방법으로 시험관 내에서 측정될 수 있다. 치료 화합물의 치료적 유효량은 대상체에서 종양 크기를 감소시키거나, 그렇지 않다면 증상을 개선시킨다. 당업자는 대상체의 크기, 대상체 증상의 중증도, 및 선택된 투여의 특정 조성물이나 경로와 같은 요인에 근거하여 그러한 양을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 조성물을 당해 분야에 공지된 하나 이상의 다양한 방법을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여할 수 있다. 숙련자에 의해 이해될 바와 같이, 투여의 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 의존하여 변할 것이다. 본 발명의 항체에 대한 바람직한 투여 경로는, 정맥내, 근육내, 피부내, 복강내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 투여, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 투여를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, 어구 “비경구 투여”는, 장 및 국소 투여 외의 투여 방식, 통상적으로는 주사에 의한 방식을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수막강내, 관절낭내(intracapsular), 안와내(intraorbital), 심장내, 피부내, 복강내, 경기관(transtracheal), 피하, 표피하(subcuticular), 관절내, 피막하(subcapsular), 지주막하(subarachnoid), 척수내, 경막외(epidural) 및 흉골내(intrasternal) 주사 및 주입을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
대안적으로, 본 발명의 항체는 국소, 표피 또는 점막 투여 경로와 같은, 비경구가 아닌 경로, 예를 들어, 비강내, 경구적으로, 질내로, 직장내로, 설하내로 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
활성 화합물은, 조절된 분비 제형과 같이, 이식물, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는, 빠른 분비에 대하여 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은, 생체분해성, 생체양립성 중합체를 사용할 수 있다. 그러한 제형을 제조하기 위한 많은 방법은 특허되어 있거나 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978 참조.
치료 조성물은 당해 분야에 공지된 의료 장치로 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 치료 조성물은 미국 특허 번호 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호; 또는 제4,596,556호에 공지된 장치와 같이, 바늘없는 피하 주사 장치로 투여될 수 있다. 본 발명에 유효한 공지된 이식물 및 모듈의 예는 다음을 포함한다: 미국 특허 번호 제4,487,603호, 조절된 속도로 약물을 분배하는, 이식될 수 있는 마이크로-주입 펌프를 보여줌; 미국 특허 번호 제4,486,194호, 피부를 통해 약물을 투여하는 치료 장치를 보여줌; 미국 특허 번호 제4,447,233호, 정밀한 주입 속도로 약물을 전달하는 약물 주입 펌프를 보여줌; 미국 특허 번호 제4,447,224호, 연속적인 약물 전달용, 가변성 흐름 이식성 주입 장치를 보여줌; 미국 특허 번호 제4,439,196호, 다중-챔버 구획을 가지는 삼투압성 약물 전달 시스템을 보여줌; 및 미국 특허 번호 제4,475,196호, 삼투압성 약물 전달 시스템을 보여줌. 이러한 특허들은 본 명세서에서 참조문헌으로서 병합된다. 많은 다른 그러한 이식물, 전달 시스템, 및 모듈은 당업자에게 공지되어 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 인간 단일클론 항체들을 제형화하여 생체 내에서 적절히 분포하게 할 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier, BBB)은 많은 고도의 친수성 화합물을 배제시킨다. 본 발명의 치료 화합물이 BBB를 가로지르는 것을 확실하게 하기 위해(필요시), 상기 화합물은, 예를 들어, 리포좀 내에 제형화될 수 있다. 리포좀 제조 방법에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,522,811호; 제5,374,548호; 및 제5,399,331호를 참조. 리포좀은 선택적으로 특정 세포 또는 기관으로 운반되는 하나 이상의 분체(moieties)를 포함하며, 따라서 표적화 약물 전달을 향상시킬 수 있다(예, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685 참조). 예시적 표적화 분체들은 폴레이트 또는 비오틴(예컨대, Low 등의 미국 특허 번호 제 5,416,016호 참조); 만노시드(Umezawa 등 (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체(P.G. Bloeman 등 (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais 등 (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면활성체 단백질 A 수용체(Briscoe 등 (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier 등 (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); 또한 K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273 참조)을 포함한다.
본 발명의 용도 및 방법
항체, 특히 본 발명의 인간 항체, 항체 조성물 및 방법은 CD22 매개 질병 및 장애의 진단 및 치료를 포함한 수 많은 시험관내 및 생체내 진단 유용성 및 치료 유용성을 가진다. 예를 들어, 시험관내 또는 생체외, 또는 인간 대상체, 예컨대 생체내로, 이러한 분자들을 배양중인 세포로 투여하여, 다양한 질환을 치료, 예방 및 진단할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 “대상체”는 인간 및 비-인간 동물을 포함하는 것으로 의도된다. 비-인간 동물은 모든 척추동물들, 예를 들어, 포유동물, 및 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류, 및 파충류와 같은 비포유동물을 포함한다. 바람직한 대상체는 CD22 활성에 의해 매개되거나 조절되는 질병을 갖는 인간 환자를 포함한다. CD22에 대한 항체를 다른 제제와 함께 투여할 때, 이 둘은 순차적으로 또는 동시에 투여할 수 있다.
본 발명의 항체가 CD22에 대하여 특이적으로 결합하는 경우, 본 발명의 항체를 사용하여 세포 표면 상에서 CD22 발현을 특이적으로 검출할 수 있고, 또한, 면역친화성 정제를 통해 CD22를 정제할 수 있다.
본 발명의 항체 조성물(예, 인간 단일클론 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)의 적절한 생체 내 및 시험관 내 투여 경로는 당해 분야에 공지되어 있고, 당업자에 의하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 조성물을 주사(예, 정맥내 또는 피하내)로 투여할 수 있다. 상기 사용되는 분자의 적절한 투여량은 대상체의 나이와 체중, 및 항체 조성물의 농도 및/또는 제형에 따라 다르다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 인간 항-CD22 항체는 하나 이상의 다른 치료제, 예를 들어, 세포독성 제제, 방사성독성 제제 또는 면역억제제와 공동 투여될 수 있다. 상기 항체는 상기 제제에 연결되거나(면역복합체로서) 상기 제제와 별도로 투여될 수 있다. 후자의 경우(별도 투여), 상기 항체는 상기 제제 투여 전, 후 또는 동시에 투여할 수 있거나, 다른 공지된 요법, 예를 들어, 항암 요법, 예를 들어 방사능 요법과 공동투여될 수 있다. 그러한 치료제들은, 특히, 항-신생물 제제, 예를 들어, 독소루비신(아드리아마이신), 시스플라틴, 블레오마이신 설페이트, 카르무스틴, 클로람부실 및 사이클로포스파미드 하이드록시우레아를 포함하며, 이들은 그 자체로, 환자에 독성이거나 약독성(subtoxic)인 수준에서만 효과적이다. 시스플라틴은 4주에 한번씩 100 mg/kg의 투여량으로 정맥내 투여되며 아드리아마이신은 21일 마다 한번씩 60-75 mg/ml의 투여량으로 정맥내 투여된다. 본 발명의 인간 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 화학요법제와 함께 공동 투여하면, 인간 종양 세포에 세포독성 효과를 내는 상이한 메커니즘을 통해 작동하는 두 개의 항암제를 제공하게 된다. 그러한 공동 투여는, 약물에 대한 저항성의 발달로 인한 문제점 또는 종양 세포가 상기 항체에 비반응적이 되도록 하는, 종양 세포의 항원성에서의 변화로 인한 문제점을 해결할 수 있다.
또한, 표적-특이적 작동자 세포(effector cell), 예를 들어, 본 발명의 조성물(예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)에 연결된 작동자 세포는 치료제로서 사용될 수 있다. 표적화용 작동자 세포는 대식세포, 호중구 또는 단핵구와 같은 인간 백혈구일 수 있다. 다른 세포들은 호산구, 중성 살해 세포 및 다른 IgG- 또는 IgA-수용체 함유 세포를 포함한다. 필요시, 작동자 세포는 처리될 대상체로부터 얻을 수 있다. 표적-특이적 작동자 세포는 생리적으로 허용가능한 용액에서 세포 현탁액으로서 투여될 수 있다. 투여되는 세포의 수는 약 108-109 이나, 치료 목적에 따라 다르다. 일반적으로, 그 양은 표적 세포, 예를 들어, CD22를 발현하는 종양 세포에서 국소화되고 그리고 예를 들어, 대식 작용에 의해 세포 살해를 수행하기에 충분할 정도이어야 할 것이다. 또한 투여 경로도 다양화할 수 있다.
표적-특이적 작동자 세포를 이용한 요법은 표적화된 세포를 제거하는 다른 기술과 접합하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물(예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)을 사용한 항-종양 요법 및/또는 이러한 조성물로 무장한 작동자 세포를 화학요법과 접합하여 사용할 수 있다. 추가적으로, 조합 면역요법을 사용하여 두 개의 구별되는 세포독성 작동자 군이 종양 세포를 격퇴하게 할 수 있다. 예를 들어, 항-Fc-감마 RI 또는 항-CD3에 연결된 항-CD22 항체를 IgG- 또는 IgA-수용체 특이적 결합 제제와 접합하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자를 사용하여, 예를 들어, 세포 표면 상에 있는 수용체를 캡핑하거나 제거함으로써, 작동자 세포 상의 FcγR 또는 FcγR 수준을 조절할 수 있다. 또한 항-Fc 수용체들의 혼합물을 이 목적에 사용할 수 있다.
보체와 결합하는 IgG1, IgG2, 또는 IgG3, 또는 IgM의 부분과 같이, 보체 결합 자리를 가지는, 본 발명의 조성물(예, 인간, 인간화 또는 키메릭 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)을 또한 보체 존재 하에서 사용할 수 있다. 한 구체예에서, 표적 세포를 포함하는 일 군의 세포를 본 발명의 결합제 및 적절한 작동자 세포를 사용하여 생체외 처리하는 것은, 보체 또는 보체 함유 혈청을 첨가함으로써 보충될 수 있다. 본 발명의 결합제로 코팅된 표적 세포의 대식 작용은 보체 단백질의 결합으로 향상될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물(예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)로 코팅된 표적 세포는 또한 보체에 의해 용해될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 보체를 활성화시키지 않는다.
본 발명의 조성물(예, 인간, 인간화 또는 키메릭 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)은 또한 보체와 함께 투여될 수 있다. 따라서, 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 혈청이나 보체를 포함하는 조성물들은 본 발명의 범위내에 있다. 이러한 조성물들은 보체가 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자들 바로 가까이에 위치한다는 점에 있어서 유리하다. 대안적으로, 본 발명의 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 보체나 혈청은 따로 투여될 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 하나 이상의 추가적 치료 항체 또는, Ig 융합 단백질과 같은, 다른 결합제와 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 항-CD22 항체를 투여할 때 조합하는 다른 항체 또는 결합제의 비-제한적 예들은 CTLA-4, PSMA, CD30, IP-10, IFN-γ, CD70, PD-1, PD-L1, TNF, TNF-R, VEGF, VEGF-R, CCR5, IL-1, IL-18, IL-18R, CD19, Campath-1, EGFR, CD33, CD20, Her-2, CD25, gpIIb/IIIa, IgE, CD11a, α4 인테그린에 대한 항체 또는 결합제를 포함한다.
또한 본 발명의 항체 조성물(예, 인간 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자, 또는 면역접합체) 및 이의 용도에 대한 설명서를 포함하는 키트 또한 본 발명의 범위에 속한다. 상기 키트는 하나 이상의 추가적인 시약, 예를 들어, 면역억제제, 세포독성제 또는 방사능독성제, 또는 본 발명의 하나 이상의 추가적인 인간 항체(예, 상기 제 1 인간 항체와는 구별되는, CD22 항원의 에피토프에 결합하는 상보성 활성을 가지는 인간 항체)를 더 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체 조성물로 치료된 환자에 다른 치료제, 예를 들어, 세포독성 또는 방사능독성 제제를 추가로(본 발명의 인간 항체 투여 전에, 동시에, 또는 그 후에) 투여하여, 상기 인간 항체들의 치료 효과를 향상시키거나 증폭할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 대상체를 Fcγ 또는 Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 변경하는, 예를 들어, 향상시키거나 억제하는 제제로, 예를 들어, 사이토카인으로 대상체를 처리함으로써 추가로 치료할 수 있다. 다중특이적 분자로 치료 중 투여될 수 있는 바람직한 사이토카인은 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 인터페론-γ(IFN-γ), 및 종양괴사인자(TNF)를 포함한다.
또한 본 발명의 조성물(예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)은 CD22를 발현하는 세포를 표적화하는데, 예를 들어, 그러한 세포를 표지하는데 사용될 수 있다. 그러한 용도를 위하여, 검출될 수 있는 분자와 상기 결합제를 연결할 수 있다. 따라서, 본 발명은 CD22를 발현하는 세포를 생체 외에서 또는 시험관 내에서 국소화 시키는 방법을 제공한다. 검출가능한 표지는, 예를 들어, 방사능 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자(co-factor)일 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 시료 내에서 CD22 항원의 존재를 검출하는, 또는 CD22 항원의 양을 측정하는 방법을 제공하는데, 이는 상기 항체 또는 이의 결합부와 CD22 사이에 복합체를 형성하도록 허용하는 조건 하에서, 시료, 및 대조군 시료를, CD22에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부에, 접촉시키는 것을 포함한다. 그 다음, 복합체의 형성을 검출하는데, 여기에서, 시료와 대조군 시료 사이의 복합체 형성 차이는 시료에서의 CD22 항원 존재를 나타낸다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 면역접합체를 사용하여 화합물(예, 치료제, 표지, 세포독소, 방사능독소, 면역억제제, 등)을 상기 항체에 연결시킴으로써, CD22를 발현하는 세포로 상기 화합물을 표적화할 수 있다. 예를 들면, 항-CD22 항체를 미국 특허 번호 제 6,281,354호 및 제 6,548,530호, 미국 특허공개 번호 제20030050331호, 제 20030064984호, 제 20030073852호, 및 제 20040087497호에 기술된 또는 제 WO 03/022806호로 공개된 임의의 독소 화합물에 접합시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 CD22를 발현하는 세포를 생체 외에서 또는 생체 내에서 국소화 시키는 방법을 제공한다(예를 들어, 방사능 동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조 인자와 같은, 검출가능한 표지를 사용하여). 대안적으로, 상기 면역접합체를 사용하여, 세포독소 또는 방사능독소를 CD22에 표적화함으로써 CD22 세포 표면 수용체를 갖는 세포를 죽일 수 있다.
CD22는 많은 비율의 B 세포 림프종 상에서 발현되고 또한 B 세포 활성을 조절하는 것에 관련이 있어서, 자가면역장애를 CD22의 표적화를 통하여 치료할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 항-CD22 항체(및 면역접합체 및 이중 특이적 분자)를 사용하여 이러한 임상 상황들 각각에서 CD22 활성을 조절할 수 있다.
따라서, 한 관점에서, 본 발명은 CD22-발현 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 본 방법은 CD22-발현 종양 세포의 성장을 억제하기 위하여 CD22-발현 종양 세포를, 본 발명의, 항체, 또는 이의 항원 결합부와 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직하게, CD22-발현 종양 세포는, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin’s lymphoma)과 같은, B 세포 림프종이다. CD22-발현 종양 세포의 다른 유형은 브루키트 림프종(Burkitt’s lymphomas) 및 B 세포 만성 림프성 백혈병을 포함한다.
종양 세포 성장을 억제하는 방법의 한 구체예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합부는, 파트너 분자, 예를 들면, 세포독소, 방사능동위원소 또는 화학요법 제제와 같은, 치료제에 접합된다. 다른 구체예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합부는, 하나 이상의 추가적인 항-종양제와 조합하여 투여된다. 항체는, 수술 및/또는 방사선과 같은, 다른 암 치료법, 및/또는 상기에서 논의되고 설명된 항-신생물 제제와 같은, 다른 항-신생물 제제와 함께 사용될 수 있는데, 이는 화학요법 약물, 및 항-CD20 항체(예, Rituxan®)를 포함하나 이에 한정되는 않는, 다른 항-종양 항원 항체를 포함한다.
다른 관점에서, 본 발명은 대상체 내에 염증성 또는 자가면역성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상체 내의 염증성 또는 자가면역성 장애를 치료하기 위하여 대상체내에 본 발명의, 항체, 또는 이의 항원-결합부를 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 자가면역 장애의 비-제한적 예는 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus) 및 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis)을 포함한다. 자가면역성 장애의 다른 예는 염증성 장 질환(궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 크론병(Crohn’s disease)을 포함), I형 당뇨병, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 쇼그렌 증후군(Sjogren’s syndrome), 자가면역성 갑상선염(autoimmune thyroiditis)(그레이브병(Grave’s disease) 및 하시모토 갑상선염을 포함), 건선(psoriasis) 및 사구체신염(glomerulonephritis)을 포함한다. 항체는, 비-스테로이드 항-염증성 약물(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs), 코르티코스테로이드(corticosteroids)(예, 프레드니손(prednisone), 하이드로코르티손(hydrocortisone)), 메토트렉세이트(methotrexate), COX-2 억제제, TNF 길항제(예, 에타네르셉트(etanercept), 인플릭시맙(infliximab), 아달리무맙(adalimumab)) 및 면역억제제(6-메르캅토퓨린(6-mercaptopurine), 아자티오프린(azathioprine) 및 사이클로스포린 A(cyclosporine A)와 같은)와 같은, 다른 항-염증성 또는 면역억제성 제제와 조합하여 또는 단독으로 사용될 수 있다.
도 1A는 12C5 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 41) 및 아미노산 서열(서열번호 31)을 보여준다. CDR1(서열번호 1), CDR2(서열번호 5) 및 CDR3(서열번호 9) 영역들이 묘사되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유도(germline derivations)가 나타나있다.
도 1B는 12C5 인간 단일클론 항체의 람다 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 45) 및 아미노산 서열(서열번호 35)을 보여준다. CDR1(서열번호 13), CDR2(서열번호 19) 및 CDR3(서열번호 25) 영역들이 묘사되어 있고, V 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 2A는 19A3 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 42) 및 아미노산 서열(서열번호 32), 및 CD22.1 재조합 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 보여준다. 19A3의 중쇄 가변 영역의 서열들은 CD22.1의 그것과 동일하다. CDR1(서열번호 2), CDR2(서열번호 6) 및 CDR3(서열번호 10) 영역들이 묘사되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 2B는 19A3 인간 단일클론 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 46) 및 아미노산 서열(서열번호 36), 및 CD22.1 재조합 인간 단일클론 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 보여준다. 두 CD22.1 및 CD22.2의 카파 경쇄 가변 영역의 서열들은 19A3의 그것들과 동일하다. CDR1(서열번호 14), CDR2(서열번호 20) 및 CDR3(서열번호 26) 영역들이 묘사되어 있고, V 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 2C는 CD22.2 재조합 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 62) 및 아미노산 서열(서열번호 61)을 보여준다. CDR1(서열번호 2), CDR2(서열번호 60) 및 CDR3(서열번호 10) 영역들이 묘사되어 있고, V 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 3A는 16F7 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 43) 및 아미노산 서열(서열번호 33)을 보여준다. CDR1(서열번호 3), CDR2(서열번호 7) 및 CDR3(서열번호 11) 영역들이 묘사되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 3B는 16F7 인간 단일클론 항체의 VK.1 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 47) 및 아미노산 서열(서열번호 37)을 보여준다. CDR1(서열번호 15), CDR2(서열번호 21) 및 CDR3(서열번호 27) 영역들이 묘사되어 있고, V 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 3C는 16F7 인간 단일클론 항체의 VK.2 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 48) 및 아미노산 서열(서열번호 38)을 보여준다. CDR1(서열번호 16), CDR2(서열번호 22) 및 CDR3(서열번호 28) 영역들이 묘사되어 있고, V 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 4A는 23C6 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 44) 및 아미노산 서열(서열번호 34)을 보여준다. CDR1(서열번호 4), CDR2(서열번호 8) 및 CDR3(서열번호 12) 영역들이 묘사되어 있고, V, D 및 J 생식 계열 유도가 나타나있다.
도 4B는 23C6 인간 단일클론 항체의 VK.1 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 49) 및 아미노산 서열(서열번호 39)을 보여준다. CDR1(서열번호 17), CDR2(서열번호 23) 및 CDR3(서열번호 29) 영역들이 묘사되어 있고, V 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 4C는 23C6 인간 단일클론 항체의 VK.2 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 50) 및 아미노산 서열(서열번호 40)을 보여준다. CDR1(서열번호 18), CDR2(서열번호 24) 및 CDR3(서열번호 30) 영역들이 묘사되어 있고, V 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 5A는 12C5의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 31)을 인간 생식계열 VH 7-4.1 아미노산 서열(서열번호 51)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 5B는 12C5의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 35)을 인간 생식계열 Vλ 2b2 아미노산 서열(서열번호 55)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 6A는 19A3/CD22.1의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 32)을 인간 생식계열 VH 4-34 아미노산 서열(서열번호 52)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 6B는 19A3/CD22.1/CD22.2의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 36)을 인간 생식계열 VK L6 아미노산 서열(서열번호 56)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 6C는 CD22.2의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 61)을 인간 생 식계열 VH 4-34 아미노산 서열(서열번호 52)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 7A는 16F7의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 33)을 인간 생식계열 VH 5-51 아미노산 서열(서열번호 53)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 7B는 16F7의 VK.1 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 37)을 인간 생식계열 VK A27 아미노산 서열(서열번호 57)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 7C는 16F7의 VK.2 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 38)을 인간 생식계열 VK A10 아미노산 서열(서열번호 57)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 8A는 23C6의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 34)을 인간 생식계열 VH 1-69 아미노산 서열(서열번호 54)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 8B는 23C6의 VK.1 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 39) 및 23C6의 VK.2 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 40)을 인간 생식계열 VK L6 아미노산 서열(서열번호 56)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 9는 라지 세포에서 항-CD22 인간 항체 12C5, 19A3, 16F7 및 23C6의 내재화를 보여주는 막대그래프이다.
도 10A는 다우디 세포에 대항하는 항-CD22 인간 항체 12C5, 19A3, 16F7 및 23C6의 ADCC 활성(% 용해(lysis)에 의해 측정)을 보여주는 그래프이다.
도 10B는 라지 세포에 대항하는 항-CD22 인간 항체 12C5, 19A3, 16F7 및 23C6의 ADCC 활성(% 용해에 의해 측정)을 보여주는 그래프이다.
도 11은, % 세포 사멸에 의하여 측정되는, BCR-자극 라모스 세포에 대한 고정화(immobilized) 항-CD22 인간 항체 12C5, 19A3, 16F7 및 23C6의 영향을 보여주는 막대그래프이다.
도 12는 항-CD22 재조합 인간 항체 CD22.1 및 CD22.2에 의한 CD22 EDC 결합을 19A3 부모 인간 항체의 것과 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 13은 항-CD22 재조합 인간 항체 CD22.1 및 CD22.2에 의한 CHO 세포의 표면 상에 발현되는 CD22의 결합을 보여주는 그래프이다.
도 14는 항-CD22 재조합 인간 항체 CD22.1 및 CD22.2에 의한 라지 세포의 표면 상에 발현되는 CD22의 결합을 보여주는 그래프이다.
도 15는 항-CD22 항체 12C5, 19A3, 16F7 및 23C6 의한, 및 재조합 인간 항체 CD22.1 및 CD22.2에 의한, CD22 ECD 아미노-말단 도메인 1 및 2의 결합을 보여주는 그래프이다.
도 16은 SCID 마우스에서 라지-세포 종양 크기에 대한 항체-약물 접합체 CD22.1-사이토톡신 A 및 CD22.2-사이토톡신 A의 생체내 영향을 보여준다.
도 17A는 4G6 인간 항체의 뉴클레오티드 서열(서열번호 87) 및 아미노산 서열(서열번호 81)을 보여준다. CDR1(서열번호 63), CDR2(서열번호 66) 및 CDR3(서열번호 69) 영역들이 묘사되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 17B는 4G6 인간 단일클론 항체의 VK1 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티 드 서열(서열번호 90) 및 아미노산 서열(서열번호 84)을 보여준다. CDR1(서열번호 72), CDR2(서열번호 75) 및 CDR3(서열번호 78) 영역들이 묘사되어 있고, V 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 17C는 4G6 인간 단일클론 항체의 VK2 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 91) 및 아미노산 서열(서열번호 85)을 보여준다. CDR1(서열번호 73), CDR2(서열번호 76) 및 CDR3(서열번호 79) 영역들이 묘사되어 있고, V 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 18A는 21F6 인간 단일클론 항체의 VH1중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 88) 및 아미노산 서열(서열번호 82)을 보여준다. CDR1(서열번호 64), CDR2(서열번호 67) 및 CDR3(서열번호 70) 영역들이 묘사되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 18B는 21F6 인간 단일클론 항체의 VH2중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 89) 및 아미노산 서열(서열번호 83)을 보여준다. CDR1(서열번호 65), CDR2(서열번호 68) 및 CDR3(서열번호 71) 영역들이 묘사되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 18C는 21F6 인간 단일클론 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 92) 및 아미노산 서열(서열번호 86)을 보여준다. CDR1(서열번호 74), CDR2(서열번호 77) 및 CDR3(서열번호 80) 영역들이 묘사되어 있고, V 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 19A는 4G6의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 81)을 인간 생식계열 VH 1-69 아미노산 서열(서열번호 54)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 19B는 4G6의 VK1 카파 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 84)을 인간 생식계열 VK L18 아미노산 서열(서열번호 93)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 19C는 4G6의 VK2 카파 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 85)을 인간 생식계열 VK A27 아미노산 서열(서열번호 57)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 20A는 21F6의 VH1 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 82)을 인간 생식계열 VH 4-34 아미노산 서열(서열번호 52)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 20B는 21F6의 VH2 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 83)을 인간 생식계열 VH 4-34 아미노산 서열(서열번호 52)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 20C는 21F6의 카파 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 86)을 인간 생식계열 VK L6 아미노산 서열(서열번호 56)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 21은 항-CD22 인간 항체 4G6에 의한 CHO 세포의 표면 상에 발현된 CD22의 결합을 보여주는 그래프이다.
도 22는 항-CD22 인간 항체 21F6에 의한 CHO 세포의 표면 상에 발현된 CD22의 결합을 보여주는 그래프이다.
도 23은 항-CD22 인간 항체 21F6에 의한 라지 세포의 표면 상에 발현된 CD22 의 결합을 보여주는 그래프이다.
본 발명은 다음의 실시예들에 의해 더 자세히 설명될 것이고, 이는 본 발명을 더 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서 전체에서 인용된 모든 도면 및 모든 참조물, 특허, 및 공개된 특허 출원서는 참조문헌으로서 본 명세서에 명백히 병합된다.
실시예 1: CD22 에 대한 인간 단일클론 항체의 생성
항-CD22 인간 단일클론 항체를, 다음과 같이, 인간 항체 유전자를 발현하는 트랜스유전자성 마우스를 이용하여 생성하였다.
항원
항 CD-22 항체를 키우는데 사용되는 항원은 인간 CD22의 세포외 도메인 및 CHO 세포 상에서 발현되는 전장 CD22 단백질이었다. 세포외 도메인을 얻기 위하여, 인간 CD22를 암호화하는 cDNA(Open Biosystems, Inc.에서 상업적으로 입수가능)를 사용하여 C-말단 헥사히스티딘(C-terminal hexahistidine) 태그에 융합된 전체 CD22β 세포외 도메인(CD22 extracellular domain, CD22 ECD)을 암호화하는 발현 벡터를 구성하였다. 표준 기술에 의한 CHO 세포의 형질감염 및 안정한 형질감염체의 선택 후, CD22 ECD를 금속 킬레이트 크로마토그래피를 이용하여 세포 배양 배지로부터 정제하였다. 덧붙여, 상기 세포를 전장 CD22 cDNA를 포함한 발현 벡터로 형 질감염시킴으로써 세포 표면에 전장 CD22를 발현하는 재조합 CHO 세포를 만들었다. 형질감염된 세포의 선택 후, 세포 표면 상에서 높은 수준의 CD22를 발현하는 세포들을, 플루오르세인-표지 항-CD22(Becton-Dickinson-Pharmingen으로부터 상업적으로 입수가능)와의 반응에 근거하여, 형광-활성화 세포 분류법에 의하여 분리하였다.
마우스 종( strains )
트랜스유전자성 HuMAb 마우스®의 HCo7/HCo12 및 HCo12/Balbc 종들, 및 트랜스유전자성 트랜스염생체성 마우스의 KM 및 KM-λHAC 종들을 이용하여 CD22에 대한 완전 인간 단일클론 항체를 제조하였는데, 상기 모든 것들은 인간 항체 유전자를 발현한다.
이러한 마우스 종들의 각각에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자를 Chen 등 (1993) EMBO J. 12:811-820에 서술된 바와 같이 동형접합적으로 파괴하였으며 내인성 마우스 중쇄 유전자를 PCT 공개번호 제WO 01/09187호의 실시예 1에 서술된 바와 같이 동형접합적으로 파괴하였다. 이 종들의 각각은, 인간 카파 경쇄 트랜스유전자, KCo5(Fishwild 등 (1996) Nature Biotechnology 14:845-851에 기술됨)를 보유하고, 또한 PCT 공개번호 제WO 02/43478호에 기술된 바와 같이, 인간 Ig 중쇄 자리(locus)를 지닌, SC20 트랜스 염색체를 보유한다.
HCo7 종은 미국 특허 번호 제 5,545,806호; 제 5,625,825호; 및 제 5,545,807호에 기술된 바와 같이 HCo7 중쇄 트랜스유전자를 지닌다. HCo12 종은 PCT 공개번호 제 WO 01/09187호의 실시예 2에 기술된 바와 같이 HCo12 인간 중쇄 트랜스유전자를 지닌다.
KM 마우스®종은 미국 출원번호 제 20020199213호에 자세히 기술되어 있다.
KM-λHAC 종은, 내인성 마우스 중쇄 및 카파 경쇄 자리(loci)가 파괴되었고 SC20 트랜스염색체 및 KCo5 트랜스유전자가 삽입되었다는 점에 있어서, KM 종과 매우 유사하나, KM-λHAC 종은 또한 인간 람다 경쇄 자리를 지닌 인간 염색체 22번으로부터 유래된 인간 인공 염색체를 지닌다. 따라서, KM-λHAC 종은 람다 경쇄 또는 카파 경쇄를 사용하는 인간 항체를 발현할 수 있다. 또한 KM-λHAC 마우스 종은 미국 출원번호 제 20060015958호에 자세히 기술되어 있다.
면역화
CD22에 대한 완전 인간 단일클론 항체를 키우기 위해, 상술된 종들의 동물들을 재조합 인간 CD22 ECD 및 CD22-발현 CHO 세포(항원에 대하여 상기한 바와 같이 제조됨)로 면역화하였다. 인간 항체 유전자를 지닌 마우스 종에서 인간 항체를 키우기 위한 일반적인 면역화 계획은, 예를 들어, Lonberg, N. 등 (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. 등 (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 및 PCT 공개번호 제 WO 98/24884호에 기술되어 있다. 마우스는 면역화가 시작되었을 때 10-12주령이었다. 리비(RIBI)를 보조제로 사용하여, 20 μg의 CD22 ECD 또는 107 개의 형질감염된 CHO 세포로, 마우스를 복강내로 및 피하로 매주마다 면역화하였다. 처음 두 번의 면역화는 리비 보조제 내의 CD22 ECD로 실시하였고, 이어서 CD22 ECD 또는 형질감염된 세포를 이용하여 번갈아가며 여섯 번을 추가적으로 매주마다 면역화하였다(총 여덟 번까지 면역화). 면역 반응을 안와후(방) 출혈(retroorbital bleeds)에 의하여 얻어진 혈액에서 조사하였다. 혈청을 ELISA 및 FACS에 의하여 스크린하였다. 항-CD22 인간 IgG 면역글로불린의 충분한 역가를 가진 마우스를 융합용으로 사용하였다. 4일 및 3일 전에 마우스를 각각 CD22 ECD로 한번 그리고 CD22 발현 CHO 세포로 한번, 정맥내 및 복강내로 투여한 후, 희생시키고 비장을 제거하였다.
항체 선택
CD22를 결합하는 항체를 생산하는 마우스를 확인하기 위하여, 부모 CHO 세포뿐만 아니라 인간 CD22를 발현하는 CHO 세포에 결합시키기 위하여, 면역화된 마우스의 혈청을 유세포 분석법에 의하여 스크린하였다. 또한 CD22를 발현하는, 인간 다우디 B 세포(human Daudi B cells) 상에서 유세포 분석법(FACS)에 의하여 혈청을 스크린하였다. 면역화된 마우스의 혈청을 FACS 실험에서 1:50의 희석에서 테스트하였다. 희석된 혈청을 세포에 첨가하고 37℃ 에서 30분동안 배양한 후, 세포를 세척하고 결합을 PE-표지 항-인간 IgG Ab로 검출하였다. FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 유세포 분석을 실시하였다. 쥐 항 -CD22 단일클론 항체(M 항-CD22)를 실험에서 양성 대조군으로서 사용하였다. 테스트된 세마리의 쥐 모두는 CHO-CD22 및 CHO 부모 세포(CHO-S)에 대한 역가를 나타내었다. CHO-S 세포에 대한 결합은 CHO 세포의 표면 상에서 CD22 이외의 분자에 대한 항체 결합의 존재를 나타낸다. 마우스를 CHO 형질감염된 세포로 면역화하였기 때문에 이 결과는 예상되었다. 인간 다우디 세포에 대한 역가 역시 세 마리 쥐에서 검출되었는데, 이는 비-재조합 소스(source)로부터의 CD22에 결합할 수 있었던, CD22에 특이적인 항체의 잠재적 존재를 나타낸다.
인간 CD22 ECD에 대한 결합에 대하여 혈청을 ELISA에 의하여 더 테스트하였다. 간단히 말하면, 미세역가 평판을 CHO 세포에서 생산된 정제된 CD22 ECD 단백질로 실온에서 2시간 동안 PBS(50 μl/웰) 중 1-2.5 μg/웰로 도말하였다. 그리고 나서 이 평판을 300 μl/웰의 PBS 중 1 %의 BSA로 블로킹하였다. CD22-면역화 마우스로부터 얻은 혈청의 희석액(100에서 20000)을 각각의 웰에 첨가하고, 주위 온도에서 1∼2 시간 동안 배양하였다. 이 평판을 PBS/Tween으로 세척한 다음, 호스라디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)와 접합된 염소-항-인간 IgG 폴리클론 항체와 함께 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 세척한 다음, 이 평판을 퍼보레이트(perborate)(Sigma #P4922) 또는 Moss ABTS-1000으로 인산 구연산 버퍼에서 ABTS 기질(Sigma, #A9941)로 전개시키고, OD 415-495 nm에서 분광 측정계로 분석하였다. 테스트된 세 마리 마우스가 항-CD22 항체의 좋은 역가를 가졌고 따라서 융합용으로 사용하였다.
비장세포 융합( Splenocyte Fusions )
Cyto Pulse 대형 챔버 세포 융합 전기천공기(Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD)를 사용하는 전기장 기반 전기융합을 이용하여 마우스 비장세포(splenocytes)를 마우스 골수종 세포주에 융합시켰다. 면역화된 마우스로부터의 비장세포의 단일 세포 현탁액을 Ag8.653 마우스 골수종 세포(ATCC, CRL 1581)에 1:1의 비율로 융합시켰다. 평평한 바닥 미세역가 평판(flat bottom microtiter plate)에서 세포를 대략 2x104/웰로 도말하였다. L-글루타민, 소듐 피루베이트(Mediatech, Inc., Herndon, VA), 10% 소 태아 혈청(Hyclone, Logan, UT), 18% P388DI 조건 배지(conditional media), 5% 오리겐 하이브리도마 클로닝 요소(Origen Hybridoma cloning factor)(BioVeris, Gaithersburg, VA), 4 mM L-글루타민, 5 mM HEPES, 0.055 mM β-메르캅토에탄올, 50 units/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신 및 1X 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘(Hypoxanthine-aminopterin-thymidine, HAT)을 함유한 DMEM 고당질 배지에서 평판을 일주일동안 배양하였다. 일주일 후(7일), HAT 성장 배지를 HT를 함유한 배지로 대체하였다. 집중적인 하이브리도마 성장이 일어났을 때(9-11일), HTRF 균질 검사(HTRF homogeneous assay)에서 인간 IgG 항체의 존재에 대하여 하이브리도마 상청액을 테스트하였다. 인간 카파 또는 인간 람다 경쇄 중의 하나를 지닌 인간 IgG의 존재에 대하여 KM-λHMC 마우스로부터의 융합물을 스크린하였다. 그리고나서 인간 IgG 항체에 특이적인 CD22의 존재에 대하여 다우디 세포 상의 FACS에 의하여 그리고 ELISA에 의하여 양성 하이브리도마를 스크린하였다. 하이브리도마 상청액((50-100 μl/well)이 혈청 희석액 대신에 사용되었던 것을 제외하고는 ELISA 및 FACS 실험을 상기에서 설명된 바와 같이 실시하였다. 부모 하이브리도마 주에 특이적인 항원을 24 웰 평판에 옮기고 다시 스크린하였고, 인간 IgG에 대하여 여전히 양성이면, 희색액을 제한함으로써 한번 서브클론화하였다. 그리고나서 안정한 서브클론을 시험관 내에서 규모를 확대시켰고(scaled up) 항체를 이후의 특성화 규명을 위하여 정제하였다.
항체 정제를 위한 확장을 위하여 18개의 서브클론을 선택하였다. 확장된 서브클론의 이소타입은 다음 이소타입들을 포함하였다: IgG1; IgG4; IgG4/IgM; IgG1/IgM; IgG1/IgG2/λ 및 IgG4/λ. 13개의 정제된 항체를 ELISA 및 FACS에 의하여 적정하였고 각각은 두 분석법에서 인간 CD22에 대하여 특이적 결합을 나타내었다. 4개의 서브클론, 12C5, 19A3, 16F7, 23C6을 이후의 구조 분석 및 배열을 위하여 선택하였다.
재조합 항체 CD221.1 및 CD22.2의 생산
항-CD22 항체 19A3은 인간 IgG1(f 알로타입(allotype))로서CHO 세포에서 발현되었고 재조합 항체를 CD22.1로 지정하였다. 덧붙여, CD22.2로 지정된 19A3의 변이체(variant)를 생성하였는데, 이것은 돌연변이 N57Q가 VH 사슬의 CDR2 영역에서 N-글리코실화 자리를 제거하도록 만든다.
19A3의 VK 및 VH 영역을 PCR에 의하여 cDNA 클론으로부터 증폭시키고 pCR4Blunt-TOPO(Invitrogen)로 클론화시켜 클로닝을 위한 제한 자리(restriction sites)를 유도하였다. 그리고나서 자리 지정 돌연변이생성(site directed mutagenesis)을 실시하여 N57Q 돌연변이를 중쇄 서열로 유도하고 CDR2에서 N-글리코실화 자리를 제거하였다. 19A3 VK를 pICOFSneoK2.hCMV2.1kb으로 서브클론화시켜 벡터 pICOFSneoK2.hCMV2.1kb(CD22.19A3)를 생산하고, VH(야생형이고 N57Q 돌연변이) 영역을 pICOFSpurG 벡터로 서브클론화시켜 벡터 pICOFSpurG(CD22.19A3) 및 pICOFSpurG(CD22.19A3.VH.N57Q)를 생산하였다. 경쇄 및 중쇄의 발현을 위한 이러한 구성체를 직선화시켰고 DMRIE-C (Invitrogen)를 이용하여 CHO-S 세포로 공동-형질감염시켰고 표준 기법을 이용하여 안정한 클론을 선택하였다.
CHO-S 클론 8G9를 CD22.1 발현을 위하여 선택하였다. 이 클론을 과성장으로 배양하여 대략 75mg/리터의 항체를 생산하였다. CHO-S 클론 17E11을 CD22.2 발현을 위하여 선택하였고 이것은 대략 과성장 배양에서 413mg/리터를 생산하였다. 이후, 재조합 항체 CD22.1 및 CD22.2의 구조 및 기능을 결정하였다(하기 실시예 3 및 실시예 10을 참조).
실시예 2: 인간 항- CD22 단일클론 항체의 구조적 특성화
실시예 1에 기술된 12C5, 19A3, 16F7, 23C6, CD22.1, CD22.2, 4G6 및 21F6 클론에 의하여 발현되는 mAbs의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암하호화는 cDNA 서열을 표준 DNA 서열화 기술을 이용하여 서열화하였고 발현된 단백질을 표준 단백질 화학 분석법에 의하여 특성화하였다.
12 C5 , 19A3, CD22 .1, CD22 .2, 16F7 및 23 C6 의 특성화
12C5 클론이 IgG1 중쇄 및 람다 경쇄를 포함하는 항체를 발현한다는 것을 알게 되었다. 19A3 클론이 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄를 포함하는 항체를 발현한다는 것을 알게 되었다. 8G9 클론에 의하여 발현되는 재조합 mAb의 중쇄 및 경쇄는 19A3 클론에 의하여 발현되는 그것들과 동일하였다. 17E11에 의하여 발현되는 재조합 mAb의 중쇄는 유도된 N57Q 돌연변이를 제외하고는 19A3의 그것과 동일하였다. 17E11 클론에 의하여 발현되는 재조합 mAb의 경쇄는 19A3 클론에 의하여 발현되는 그것과 동일하였다. 16F7 클론은 IgG1 중쇄 및 두 개의 상이한 카파 경쇄(본 명세서에서 VK.1 및 VK.2로 지칭되는데, 여기에서 항체 단백질의 43%는 VK.1을 포함하고 항체 단백질의 57%는 VK.2를 포함하였다) 중 하나를 포함하는 항체를 발현한다는 것을 알게 되었다. 또한 23C6 클론은 IgG1 중쇄 및 두 개의 상이한 카파 경쇄(VK.1 및 VK.2, 여기에서 항체 단백질의 40%는 VK.1을 포함하고 항체 단백질의 60%는 VK.2를 포함하였다) 중 하나를 포함하는 항체를 발현한다는 것을 알게 되었다. 4G6 클론은 IgG1 중쇄 및 두 개의 상이한 카파 경쇄(본 명세서에서 VK.1 및 VK.2로 지칭됨) 중 하나를 포함하는 항체를 발현한다는 것을 알게 되었다. 또한 21F6 클론은 두 개의 상이한 IgG1 중쇄(본 명세서에서 VH1 및 VH2로 지칭됨) 중 하나를 포함하는 항체를 발현한다는 것을 알게 되었다.
12C5의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 1A 및 서열번호 41 및 서열번호 31에 보인다.
12C5의 람다 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이, 각각, 도 1B 및 서열번호 45 및 35에 보인다.
12C5 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교한 결과, 12C5 중쇄가 인간 생식계열 VH 7-4.1로부터의 VH 분절, 인간 생식계열 3-3로부터의 D 분절, 및 인간 생식계열 JH 6B로부터의 JH 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 12C5 VH 서열의 추가 분석은 도 1A 및 서열번호 1, 5 및 9에 각각 보인 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들을 묘사하게 하였다.
12C5 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교한 결과, 12C5 람다 경쇄가 인간 생식계열 Vλ 2b2로부터의 Vλ 분절 및 인간 생식계열 JL 2로부터의 Jλ 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 12C5 Vλ 서열의 추가 분석은 도 1B 및 서열번호 13, 19 및 25에 각각 보인 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들을 묘사하게 하였다.
19A3의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이, 각각, 도 2A 및 서열번호 42 및 32에 보인다. CD22.1의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 19A3의 그것들과 동일하고, 도 2A 및 서열번호 42 및 32에 각각 보인 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대응한다.
CD22.2의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이, 각각, 도 2C 및 서열번호 61 및 60에 보인다.
19A3의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이, 각각, 도 2B 및 서열번호 46 및 36에 보인다. 두 CD22.1 및 CD22.2의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 19A3의 그것들과 동일하고, 도 2A 및 서열번호 46 및 36에 각각 보인 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대응한다.
19A3/CD22.1 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교한 결과, 19A3 중쇄가 인간 생식계열 VH 4-34로부터의 VH 분절, 인간 생식계열 3-9로부터의 D 분절, 및 인간 생식계열 JH 4B로부터의 JH 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 19A3/CD22.1 VH 서열의 추가 분석은 도 2A 및 서열번호 2, 6 및 10에 각각 보인 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들을 묘사하게 하였다.
CD22.2 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교한 결과, CD22.2 중쇄가 인간 생식계열 VH 4-34로부터의 VH 분절, 인간 생식계열 3-9로부터의 D 분절, 및 인간 생식계열 JH 4B로부터의 JH 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 CD22.2 VH 서열의 추가 분석은 도 2C 및 서열번호 2, 60 및 10에 각각 보인 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들을 묘사하게 하였다.
19A3/CD22.1/CD22.2 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교한 결과, 19A3/CD22.1/CD22.2 카파 경쇄가 인간 생식계열 VK L6으로부터의 VK 분절 및 인간 생식계열 JK 1로부터의 JK 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 19A3/CD22.1/CD22.2 VK 서열의 추가 분석은 도 2B 및 서열번호 14, 20 및 26에 각각 보인 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들을 묘사하게 하였다.
16F7의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 3A 및 서열번호 43 및 33에 보인다.
16F7의 VK.1 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 3B 및 서열번호 47 및 37에 보인다.
16F7의 VK.2 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 3C 및 서열번호 48 및 38에 보인다.
16F7 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교한 결과, 16F7 중쇄가 인간 생식계열 VH 5-51로부터의 VH 분절, 인간 생식계열 3-10으로부터의 D 분절 및 인간 생식계열 JH 3B로부터의 JH 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 16F7 VH 서열의 추가 분석은 도 3A 및 서열번호 3, 7 및 11에 각각 보인 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들을 묘사하게 하였다.
16F7 VK.1 카파 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 카파 경쇄 서열과 비교한 결과, 16F7 VK.1 카파 경쇄가 인간 생식계열 VK A27로부터의 VK 분절 및 인간 생식계열 JK 1으로부터의 JK 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 16F7 VK 서열의 추가 분석은 도 3B 및 서열번호 15, 21 및 27에 각각 보인 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들을 묘사하게 하였다.
16F7 VK.2 카파 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 카파 경쇄 서열과 비교한 결과, 16F7 VK.2 카파 경쇄가 인간 생식계열 VK A10으로부터의 VK 분절 및 인간 생식계열JK 2으로부터의 JK 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 16F7 VK 서열의 추가 분석은 도 3C 및 서열번호 16, 22 및 28에 각각 보인 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들을 묘사하게 하였다.
23C6의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 4A 및 서열번호 44 및 34에 보인다.
23C6의 VK.1 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 4B 및 서열번호 49 및 39에 보인다.
23C6의 VK.2 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 4C 및 서열번호 50 및 40에 보인다.
23C6 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교한 결과, 23C6 중쇄가 인간 생식계열 VH 1-69로부터의 VH 분절, 인간 생식계열 2-15로부터의 D 분절 및 인간 생식계열 JH 6B로부터의 JH 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 23C6 VH 서열의 추가 분석은 도 4A 및 서열번호 4, 8 및 12에 각각 보인 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들을 묘사하게 하였다.
23C6 VK.1 카파 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 카파 경쇄 서열과 비교한 결과, VK.1 카파 경쇄가 인간 생식계열 VK L6으로부터의 VK 분절 및 인간 생식계열 JK 1로부터의 JK 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 23C6 VK.1 서열의 추가 분석은 도 4B 및 서열번호 17, 23 및 29에 각각 보인 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들을 묘사하게 하였다.
23C6 VK.2 카파 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 카파 경쇄 서열과 비교한 결과, VK.2 카파 경쇄가 인간 생식계열 VK L6으로부터 의 VK 분절 및 인간 생식계열JK 1로부터의 JK 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 23C6 VK.2 서열의 추가 분석은 도 4B 및 서열번호 18, 24 및 30에 각각 보인 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들을 묘사하게 하였다.
도 5A는 12C5의 중쇄 가변 아미노산 서열(서열번호 31)을 생식계열 VH 7-4.1 암호화된 아미노산 서열(서열번호 51)과 정렬시킨 것을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들이 묘사되어 있다.
도 5B는 12C5의 람다 경쇄 가변 아미노산 서열(서열번호 35)을 생식계열 Vλ 2b2 암호화된 아미노산 서열(서열번호 55)과 정렬시킨 것을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들이 묘사되어 있다.
도 6A는 19A3의 중쇄 가변 아미노산 서열 및 CD22.1 중쇄 가변 아미노산 서열(서열번호 32)을 생식계열 VH 4-34 암호화된 아미노산 서열(서열번호 52)과 정렬시킨 것을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들이 묘사되어 있다.
도 6B는 19A3, CD22.1 및 CD22.2의 카파 경쇄 가변 아미노산 서열(모두 서열번호 36과 동일함)을 생식계열 VK L6 암호화된 아미노산 서열(서열번호 56)과 정렬시킨 것을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들이 묘사되어 있다.
도 6C는 CD22.2의 중쇄 가변 아미노산 서열(서열번호 32)을 생식계열 VH 4-34 암호화된 아미노산 서열(서열번호 52)과 정렬시킨 것을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들이 묘사되어 있다.
도 7A는 16F7의 중쇄 가변 아미노산 서열(서열번호 33)을 생식계열 VH 5-51 암호화된 아미노산 서열(서열번호 53)과 정렬시킨 것을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들이 묘사되어 있다.
도 7B는 16F7 VK.1 카파 경쇄 가변 아미노산 서열(서열번호 37)을 생식계열 VK A27 암호화된 아미노산 서열(서열번호 57)과 정렬시킨 것을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들이 묘사되어 있다.
도 7C는 16F7 VK.2 카파 경쇄 가변 아미노산 서열(서열번호 38)을 생식계열 VK A10 암호화된 아미노산 서열(서열번호 58)과 정렬시킨 것을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들이 묘사되어 있다.
도 8A는 23C6의 중쇄 가변 아미노산 서열(서열번호 34)을 생식계열 VH 1-69 암호화된 아미노산 서열(서열번호 54)과 정렬시킨 것을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들이 묘사되어 있다.
도 8B는 23C6의 VK.1 카파 경쇄 가변 아미노산 서열(서열번호 39) 및 VK.2 카파 경쇄 가변 아미노산 서열(서열번호 40)을 생식계열 VK L6 암호화된 아미노산 서열(서열번호 56)과 정렬시킨 것을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들이 묘사되어 있다.
4 G6 및 21F6의 특성화
4G6의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 17A 및 서열번호 87 및 81에 보인다.
4G6의 VK.1 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 17B 및 서열번호 90 및 84에 보인다.
4G6의 VK.2 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 17C 및 서열번호 91 및 85에 보인다.
4G6 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교한 결과, 4G6 중쇄가 인간 생식계열 VH 1-69로부터의 VH 분절, 인간 생식계열 7-27로부터의 D 분절 및 인간 생식계열 JH 4B로부터의 JH 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 4G6 VH 서열의 추가 분석은 도 17A 및 서열번호 63, 66 및 69에 각각 보인 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들을 묘사하게 하였다.
4G6 VK.1 카파 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 카파 경쇄 서열과 비교한 결과, 4G6 VK.1 카파 경쇄가 인간 생식계열 VK L18로부터의 VK 분절 및 인간 생식계열 JK 2로부터의 JK 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 4G6 VK 서열의 추가 분석은 도 3B 및 서열번호 72, 75 및 78에 각각 보인 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들을 묘사하게 하였다.
4G6 VK.2 카파 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 카파 경쇄 서열과 비교한 결과, 4G6 VK.2 카파 경쇄가 인간 생식계열 VK A27로부터의 VK 분절 및 인간 생식계열JK 4로부터의 JK 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 4G6 VK 서열의 추가 분석은 도 17C 및 서열번호 73, 76 및 79에 각각 보인 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들을 묘사하게 하였다.
21F6의 VH.1 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 18A 및 서열번호 88 및 82에 보인다.
21F6의 VH.2 중쇄 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 18B 및 서열번호 89 및 83에 보인다.
21F6의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 18C 및 서열번호 92 및 86에 보인다.
21F6 VH.1 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교한 결과, 21F6 중쇄가 인간 생식계열 VH 4-34로부터의 VH 분절, 인간 생식계열 3-9로부터의 D 분절, 및 인간 생식계열 JH 4B로부터의 JH 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 21F6 VH 서열의 추 가 분석은 도 3A 및 서열번호 64, 67 및 70에 각각 보인 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들을 묘사하게 하였다.
21F6 VH.2 카파 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 카파 경쇄 서열과 비교한 결과, 21F6 VH.2 중쇄가 인간 생식계열 VH 4-34로부터의 VH 분절, 인간 생식계열 3-9로부터의 D 분절, 및 인간 생식계열 JH 4B로부터의 JH 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 21F6 VH 서열의 추가 분석은 도 18B 및 서열번호 65, 68 및 71에 각각 보인 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들을 묘사하게 하였다.
21F6 카파 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 카파 경쇄 서열과 비교한 결과, 21F6 카파 경쇄가 인간 생식계열 VK L6으로부터의 VK 분절 및 인간 생식계열 JK 4로부터의 JK 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 21F6 VH 서열의 추가 분석은 도 18C 및 서열번호 74, 77 및 80에 각각 보인 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들을 묘사하게 하였다.
도 19A는 4G6의 중쇄 가변 아미노산 서열(서열번호 81)을 생식계열 VH 1-69 암호화된 아미노산 서열(서열번호 54)과 정렬시킨 것을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들이 묘사되어 있다.
도 19B는 4G6 VK.1 카파 경쇄 가변 아미노산 서열(서열번호 84)을 생식계열 VK1 L18 암호화된 아미노산 서열(서열번호 93)과 정렬시킨 것을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들이 묘사되어 있다.
도 19C는 4G6 VK.2 카파 경쇄 가변 아미노산 서열(서열번호 85)을 생식계열 VK A27 암호화된 아미노산 서열(서열번호 57)과 정렬시킨 것을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들이 묘사되어 있다.
도 20A는 21F6 VH.1 중쇄 가변 아미노산 서열(서열번호 82)을 생식계열 VH 4-34 암호화된 아미노산 서열(서열번호 52)과 정렬시킨 것을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들이 묘사되어 있다.
도 20B는 21F6 VH.2 카파 경쇄 가변 아미노산 서열(서열번호 83)을 생식계열 VH 4-34 암호화된 아미노산 서열(서열번호 52)과 정렬시킨 것을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들이 묘사되어 있다.
도 20C는 21F6 카파 경쇄 가변 아미노산 서열(서열번호 86)을 생식계열 VK L6 암호화된 아미노산 서열(서열번호 56)과 정렬시킨 것을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들이 묘사되어 있다.
재조합 이소타입 전환( Recombinant Isotype Conversion )
12C5, 19A3, 16F7, 23C6, CD22.1, CD22.2, 4G6 및 21F6의 가변 영역을 표준 재조합 DNA 기법을 이용하여 임의의 원하는 이소타입의 전장 항체로 변환시킬 수 있다. 예를 들면, VH 및 VL 영역들을 암호화하는 DNA를 중쇄 및 경쇄 불변 영역들을 지닌 발현 벡터로 클론화하여 가변 영역들을 작동적으로 불변 영역들에 연결시킬 수 있다. 대안적으로, 별개의 벡터를 전장 중쇄 및 전장 경쇄의 발현에 사용할 수 있다. 전장 항체를 만드는데 사용되는 적절한 발현 벡터의 비-제한적 예는 Black의 미국 특허출원 번호 제 20050153394호에 기술된 pIE 벡터를 포함한다.
실시예 3 : 항- CD22 인간 단일클론 항체의 결합 특성
이 실시예에서, 항-CD22 항체 12C5, 19A3, 16F7, 23C6 및 4G6의 결합 친화성을 비아코어 분석법에 의해 검사하였다. 19A32 재조합 유도성 항체 CD22.1 및 CD22.2에 의한 CD22 결합 친화성의 보유력을 ELISA 분석법 및 FACS 유세포 분석법에 의하여 확인하였다.
12C5, 19A3, 16F7 및 23C6 항체의 에피토프 그루핑(epitope grouping)을 비아코어 분석법에 의하여 실시하였다.
마지막으로, CD22의 아미노 말단 도메인 1 및 2 만을 포함하는 융합 단백질을 표현하는 CHO 세포를 이용하여, 본 발명의 항-CD22 항체가 특이적으로 결합하는 CD22 도메인을 맵핑(mapping)하였다.
결합 친화도 및 동력학( kinetics )
항체 친화도(KD)를 결정하기 위하여, CD22 항원을 상기 항원 상에 존재하는 His 태그(tag)에 대한 항체를 이용하여 비아코어 칩 상에서 포획하는 실험을 실시하였다. 제조자의 충고에 따라, 항-His 단일클론 항체 ab15149(Abcam, Stock conc.0.5 mg/mL)를 CM5 칩 상에 높은 밀도(3500RUs)로 코팅하였다. CD22 ECD(6.6 μg/mL)를 이 표면 상에서 60초 동안 6μL/min의 유속으로 포획하였다. 단일 농도(20μg/mL)의 항-CD22 정제 mAbs를, 5분의 결합 시간 및 8분의 해리 시간을 가지고, 25μg/mL의 유속으로, 포획된 항원 위로 주사하였다. 각 주기 후에 10μL의 25 mM NaOH로 칩 표면을 재생하였다. 이소타입 대조군을 칩 상에 전개시켰고 데이터를 비-특이적 결합을 빼는데 사용하였다. BIAcore Control 소프트웨어 v 3.2을 이용하여, 모든 실험을 비아코어 3000 표면 플라즈몬 공명 기구 상에서 실시하였다. BiaEvaluation 소프트웨어 v. 3.2를 이용하여, 데이터 분석을 실시하였다.
14개의 선택된 항-CD22 항체를 친화도 실험에서 테스트하였다. 12개의 항체에서 얻은 친화도 값의 범위는 0.07-9.95 x 10-9 M이다. 실시예 2에서 구조적으로 특성화된 4개의 항체의 결과는 하기 표 1에 요약되어 있다.
항- CD22 HuMAbs에서의 비아코어 결합 데이터
항-CD22 항체 비아코어 친화도(KD)
10-9 M
양성 대조군 1.48
12C5 0.23
19A3 0.15
16F7 1.03
23C6 0.87
4G6 0.07
재조합 유도 항체 CD22 .1 및 CD22 .2에 의한 CD22 결합 친화도의 보유
CD22.1 및 CD22.2가 CD22 결합 친화도를 보유하는 지의 여부를 결정하기 위하여, CD22.1 및 CD22.2에 의하여 CD22 ECD에 대한 결합을 하이브리도마-유래성 부모 항체 19A3에 의한 결합에 비교하는, ELISA 분석을 실시하였다.
재조합 CD22 세포외 도메인(CD22 ECD)을 96-웰 ELISA 평판 상에 2μg/ml로 코팅하였고, 세척 후, 5% 소 혈청 알부민으로 블로킹하고 다시 세척하였고, 테스트 항체를 1:3의 희석액에서 10μg/ml부터 하향시켜 적정하였다. 1시간의 배양 후, 평판을 세척하였고, 염소 항-인간 IgG HRP 접합체를 각 웰에 첨가하였다. 한 시간 더 배양한 후, 평판을 다시 세척하고 TMB 기질의 첨가를 통하여 검출된 HRP 접합체를 결합하였고, 색이 전개될 때까지 배양하고, 1M의 염산으로 중지시켰다. 그리고 나서 흡광도를 450 nm에서 평판 리더(plate reader)로 읽었다, 결과(도 12)는 CD22 ECD에 결합하는 CD22.1 및 CD22.2의 능력이 부포 항체 19A3에 상당하다는 것을 확실히 보여주었다. 이것은 CHO 세포에서 항체의 발현이 성공적이었으며, N-글리코실화 자리를 제거하는 돌연변이가 항원 결합에 영향을 주지 않는다는 것을 나타냈다.
또한 CD22 ECD에 결합하는 4G6 및 21F6 항-CD22 단일클론 항체의 능력을 조사하였고, CD22 ECD에 특이적으로 결합하는 것을 알게 되었다.
세포 표면에 발현되는 CD22 의 FACS 분석
또한 CD22에 결합하는 CD22.1 및 CD22.2의 능력을 유세포 분석법에 의하여 확인하였다. 전장 CD22로 형질감염된 CHO 세포(CHO-CD22)나 라지(Raji) 세포 둘 중의 하나를 FACS 버퍼 내에 2x105 세포/웰로 재현탁시켰고, 세포를 펠렛팅(pelleting)한 후, 항체를 10μg/ml에서 시작하여 연속적으로 1:3으로 희석하면서 웰 내로 적정하였다. 혼합하고 45분 동안 얼음 위에서 배양한 후, FACS 버퍼를 첨가하고 세포를 4번 세척하였다. 세척후, 염소 항-인간 IgG PE 접합체를 첨가한 다음, 30분 더 얼음 위에서 배양한 후, 세포를 다시 4번 세척한 다음, FACS 버퍼 내에서 재현탁하고 FACS 어레이(array) 기계 상에서 PE형광을 읽었다. 결과(도 13 및 도 14)는 CD22.1 및 CD22.2가 CHO-CD22 형질감염체 및 라지 세포 둘 다에 강하고 동등하게 결합한다는 것을 보여주었다.
또한 라지 세포 및 CD22로 형질전환된 CHO 세포의 표면 상에서 발현된 CD22에 대한 4G6 및 21F6의 결합도를 FACS 분석법에 의하여 분석하였다. 결과는 높은 수준의 세포 결합도를 얻을 수 있다는 것을 증명하였다. 도 21, 22A 및 22B 참조. CD22에 의한 형질감염이 없을때는 어떠한 항체도 CHO 세포에 결합할 수 없다.
에피토프 그루핑( Epitope Grouping )
표준 고정화 프로토콜을 기반으로, CM5 칩 상에 선택된 항체를 고정시키고 표면 위로 항체-항원 복합체를 흐르게 함으로써 에피토프 비닝(epitope binning)을 실시하였다. 비-중첩 에피토프를 갖는 항체들이 항원에 동시 결합하도록 하게 한 반면에 중첩 에피토프를 갖는 항체들은 경쟁시켰다. 증가하는 신호는 칩 상에 코팅된 항체와는 다른 에피토프를 나타내고, 신호가 줄어들면 그 반대이다. 더 빠른 오프-레이트 상수(off-rate constants)를 나타낸 항체를 선택하여 비아코어 CM5 칩 상에 코팅하여, 칩의 반복 사용을 위하여 그것들의 재생을 더 용이하게 하도록 하였다. 정제된 항-CD22 항체를 상이한 CM5 칩의 상이한 표면 상에 높은 밀도로 코팅하였다. 여러 회의 반복적 비닝을 개개의 에피토프 그룹들을 구별할 때까지 실시하였다. 항체의 농도가 50-200μg/mL 사이에서 바뀌었고, 이것을 RT에서 2시간 동안 4 nM-50 nM CD22 ECD로 배양하였다. 배양된 복합체를 5-10μL /min로 2-6 분 동안 각 칩 상의 항체가 코팅된 표면을 지나가게 하였다. 각 사이클을 15-30 mM NaOH에 의하여 재생하였다. 2-5 분 동안의 주사 후에 얻은 신호를 항체 농도에 대하여 플롯(plot)시켜 에피토프 그룹을 결정하였다. 실험 관찰에 대한 상기 해석을 기초로 하여 항체를 다양한 에피토프로 그룹화하였다.
상기 에피토프 그루핑 실험의 결과는 4개의 구별된 에피토프 그룹들을 확인할 수 있다는 것이었다. 검사된 14 개의 항-CD22 항체에서, 5개를 에피토프 그룹 1에서 발견하였고, 3개를 에피토프 그룹 2에서 발견하였으며, 4개를 에피토프 그룹 3에서 발견하였고, 1개를 에피토프 그룹 4에서 발견하였고 1개를 에피토프 그룹 3 및 4에서 발견하였는데, 이것은 에피토프 그룹 3 및 4 사이에 약간의 중첩이 있다는 것을 나타낸다. 실시예 2에서 구조적으로 특성화된 4개의 항체들에 대한 결과를 하기 표 2에 요약하였다.
비아코어에 의하여 매핑(mapping)된 CD22 에피토프 그룹
항-CD22 항체 에피토프 그룹
양성 대조군 1
12C5 4
19A3 1
16F7 3
23C6 2
CD22 아미노 말단 도메인의 인식
CD22의 세포외 영역은 7개의 면역글로불린-타입 도메인들을 포함하는데, 그것들의 아미노 말단 2 Ig-타입 도메인들은 CD22 리간드 결합에서 특히 중요할 수 있다. 인간 항체가 어떤 도메인에 결합하는 지를 매핑하기 위하여, ECD의 아미노 말단 도메인들 1 및 2만을 마우스 IgG 중쇄의 힌지 및 Fc 영역들에 융합시켜 재조합 구성체를 만들었다. CD22 d1d2-mFc로 지정된, 결과의 융합 단백질을 CHO 세포에서 발현시켰고, 결합 분석에 사용하기 위하여 정제하였다. 그리고 나서, 이전에 CD22의 전체 ECD에 결합하는 것을 보인, 인간 항체에 있어서 CD22 d1d2-mFc에 결합하는 그의 능력을 테스트하였다.
염소 항-마우스 IgG를 96-웰 ELISA 평판 상에 5μg/ml로 코팅하였다. 4℃에서 밤새 배양한 후, 평판을 세척하였고 CD22 d1d2-mFc를 각 웰에 2μg/ml로 첨가한 후, 실온에서 1 시간동안 배양하였다. 평판을 세척하고, 5% 소 혈청 알부민으로 블로킹하였으며, 다시 세척한 후, 테스트 항체를 10 μg/ml로 첨가하였다. 한 시간 동안 배양한 후, 평판을 세척하였고, 염소 항-인간 IgG HRP 접합체를 각 웰에 첨가하였다. 한 시간 더 배양한 후, 평판을 다시 세척하였고 TMB 기질의 첨가를 통하여 검출된 HRP 접합체를 결합하였으며, 색이 전개될 때가지 배양하고 1M 염산으로 중지시켰다. 그리고 나서 450nm에서 평판 리더기로 흡광도를 읽었다.
결과(도 15)는 항체가 두 그룹으로 나뉘는 것을 보여주었다. 23C6, 19A3, 및 19A3의 재조합 유도체, CD22.1 및 CD22.2에 의하여 나타낸 그룹 1은 CD22 d1d2-mFc에 결합하였고 반면에 12C5 및 16F7에 의하여 나타낸 그룹 2는 그렇지 못했다. 이것은 12C5 및 16F7가 아미노-말단 도메인 밖에서 CD22 ECD 상의 에피토프를 인식한다는 것을 암시한다.
세포 표면 상에 발현되는 CD22 의 FACS 분석
또한 CD22에 대한 CD22.1 및 CD22.2의 결합을 유세포 분석법에 의하여 확인하였다. 전장 CD22로 형질감염된 CHO 세포(CHO-CD22)나 라지(Raji) 세포 둘 중의 하나를 FACS 버퍼 내에 2x105 세포/웰로 재현탁하였고, 세포를 펠렛팅(pelleting)한 후, 항체를 10 μg/ml에서 시작하여 연속적으로 1:3으로 희석하면서 웰 내로 적정하였다. 혼합하고 45분 동안 얼음 위에서 배양한 후, FACS 버퍼를 첨가하고 세포를 4번 세척하였다. 세척 후, 염소 항-인간 IgG PE 접합체를 첨가한 다음, 30분 더 얼음 위에서 배양한 후, 세포를 다시 4번 세척한 다음, FACS 버퍼 내에서 재현탁하고 FACS 어레이 기계 상에서 PE형광을 읽었다. 결과(도 13 및 도 14)는 CD22.1 및 CD22.2가 CHO-CD22 형질감염체 및 라지 세포 둘 다에 강하고 동등하게 결합한다는 것을 보여주었다.
라지 세포 및 CD22로 형질전환된 CHO 세포의 표면 상에서 발현된 CD22에 대한 4G6 및 21F6의 결합도를 FACS 분석법에 의하여 분석하였다. 결과는 높은 수준의 세포 결합도를 얻을 수 있다는 것을 증명하였다. 도 21, 22A 및 22B 참조. CD22에 의한 형질감염이 없을 때 어떤 항체도 CHO 세포에 결합할 수 없다.
실시예 4 : 항- CD22 항체의 내재화( Internalization )
항-CD22 인간 단일클론 항체의 CD22-발현 세포로의 내재화 능력을 결정화하기 위하여, Hum-ZAP 내재화 분석법을, CD22를 발현하는, 부르키트 림프종 세포 주 라지(Raji)와 함께 사용하였다. Hum-ZAP 분석은 독소 사포린에 접합된 인간 IgG에 대한 친화도를 갖는 제2 항체의 결합을 통하여 제1 항체의 내재화에 대하여 테스트한다.
CD22-발현 라지 세포를 2.0 x 104 세포/웰(35μl/웰)로 접종하였다. 항-CD22 항체를 1.5μg/ml(35μl/웰)로 웰에 첨가하였다. 배지 단독을 음성 대조군으로서 사용하였다. 그리고나서 Hum-ZAP 시약(Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, IT-22-25)을 3.0μg/mL(35μl/웰)의 농도로 웰들의 반에 첨가하였고 반면에 웰들의 다른 반은 배지만을 받았다. 평판을 37℃에서 72시간동안 배양하였다. 세포 생존력(viability)을 CellTiter-Glo 발광 세포 생존력 분석기(Luminescent Cell Viability Assay)(Promega, Madison, WI, #G7571)를 이용하여 결정하였다. CellTiter-Glo 버퍼를 CellTiter-Glo 기질과 함께 혼합하였고, 100μL의 혼합물을 각 웰에 첨가하였다. 제조자의 지시에 따라 Veritas 미세평판 발광측정기(Microplate Luminometer) 및 Veritas 소프트웨어(Turner BioSystems, Sunnyvale, CA)를 사용하여 발광을 검출하였다.
12개의 상이한 항-CD22 항체를 테스트하였고 모두가 내재화 능력을 보여주었다. 실시예 2에서 구조적으로 특성화된 4개의 항체에 대한 결과가 도 9의 막대 그래프에 보인다. 도 9에 설명된 바와 같이, 라지 세포 생존력의 현저한 감소를, 양성 대조군을 갖는 웰을 포함하여, 항-CD22 항체 및 HumZAP 시약을 함유한 모든 웰에서 관찰하였고, 반면에 HumZAP 시약이 없이 항-CD22 항체만을 포함한 웰에서 세포 생존력을 영향을 받지 않았는데, 이것은 항-CD22 항체가 그들 스스로 세포 살해(cell killing)를 개시하지 않는다는 것을 입증한다. 예상했듯이, 항-CD22 항체의 부재시에, 음성 대조군(배지로 지칭된)은 HumZAP 시약이 존재하거나 부재하거나 세포 살해를 보여주지 않았다. 이러한 데이터는 HumZAP 시약의 존재하에서 항-CD22 항체가 효율적으로 내재화하고 세포 내에서의 사포린 방출은 CD-발현 라지 세포를 살해하게 된다는 것을 입증한다.
실시예 5 : 항- CD22 항체의 ADCC 활성의 평가
항체 의존성 세포독성(antibody dependent cellular cyotoxicity, ADCC)에 의하여 작동자 세포의 존재하에 CD22+ 세포주를 살해하는 항-CD22 인간 항체의 능력을 결정하기 위하여, 형광 세포독성 분석법을 이용하였다.
인간 작동자 세포를 다음과 같이 전혈(whole blood)로부터 제조하였다. 인간의 말초 혈액 단일핵 세포(peripheral blood mononuclear cells)를 표준 Ficoll-paque 분리에 의하여 헤파린으로 처리된 전혈로부터 정제하였다. 세포를 10% FBS(열-비활성화됨) 및 200U/ml의 인간 IL-2을 포함하는 RPMI1640 배지에 재현탁하였고 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 세포를 수거하여 배양 배지에서 4번 세척하였고 1 x 107 세포/ml로 재현탁하였다. 표적 CD22+ 세포를 BATDA 시약(Perkin Elmer, Wellesley, MA)으로 37℃에서 20분동안 1 x 106 표적세포/mL 당 2.5 μl BATDA로 배양하였다. 표적 세포를 4번 세척하였고 스핀 다운(spin down)시켜 1x105 세포/ml의 최종 부피를 만들었다.
CD22+ 세포주 라지(인간 B 림프구 부르키트 림프종; ATCC 기탁번호 CCL-86) 및 다우디(인간 B 림프구 브루키트 림프종; ATCC 기탁번호 CCL-213)를 다음과 같이 Delfia 형광 방출 분석법을 이용하여 인간 항-CD22 단일클론 항체에 대한 항체 특이적 ADCC에 대하여 테스트하였다. 각 세포주(100μl의 표지된 표적 세포, 104 세포/웰)를 50μl의 작동자 세포(106 세포/웰) 및 50μl의 항체(10μg/ml 최종 농도)로 배양하였다. 1:50의 표적 대 작동자의 비율을 실험 내내 이용하였다. 모든 연구에서, 인간 IgG1 이소타입 대조군을 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 2000 rpm으로 회전시키고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그리고 나서 상청액을 수거하였고, 원심분리하여 20μl의 상청액을, 180μl의 Eu 용액(Perkin Elmer, Wellesley, MA)이 첨가된 평평한 바닥 평판으로 옮겼고, RubyStar 리더기(BMG Labtech)에서 읽었다. 다음과 같이 %용해를 계산하였다:(시료 방출-자발적 방출*100)/(최대 방출-자발적 방출), 여기에서 자발적 방출은 표적 세포에 작동자 세포를 더한 것을 함유한 웰으로부터의 형광도이고 최대 방출은 표적 세포를 함유한 웰으로부터의 형광도이고 2% Triton-X로 처리되었다.
라지 및 다우디 세포 ADCC 분석에서, 13개의 상이한 항-CD22 항체를 음성 및 양성 대조군 항체(각각, hIgG1 및 CD20)와 함께 테스트하였다. 각 분석에서, 13개의 항-CD22 항체 중 10개가 양성 대조군 항체보다 같거나 큰 수준의 ADCC 활성을 보여 주었다. 실시예 2에서 구조적으로 특성화된 4개의 항체에 대한 결과는, % 세포 용해를 나타낸, 도 10A(다우디 세포) 및 도 10B(라지 세포)의 그래프에 보인다. CD22+ 세포에 대한 각 항체의 세포독성의 정도가 표적 세포로서 이용된 세포주에 따라 다를 수 있다하더라도, 상기 데이터는 ADCC 활성을 나타낸 인간 항-CD22 항체를 선택할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 6 : 항- CD22 항체에 의한 칼슘 플럭스의 자극
CD22+ 세포에서 칼슘 플럭스를 자극하는 항-CD22 인간 항체의 능력을 평가하기 위하여, 다음의 칼슘 플럭스 분석법을 이용하였다. 살아있는 라모스 세포(ATCC 기탁번호 CRL-1596)를 트립판 청색 배제 현미경(trypan blue exclusion microscopy)으로 계수하였고 RPMI +10%FBS 배양 배지에서 2x106 세포/ml로 희석하였다. 이 세포 현탁액에서, 2x105 세포(100 μl/웰)를 폴리 D-리신 표면 검은색 클리어 바닥을 가진 96 웰 평판(Poly D-Lysine surface black with clear bottom 96 well plate)(Corning #3667)의 모든 웰 내로 분주하였다. 로딩 안료(loading dye)(Molecular Devices catalog # R7181)를 세포 현탁액, 100 μl/웰에 첨가하였다. 평판을 4분동안 1100 rpm으로 원심분리하고 나서 30분동안 37℃에서 배양하였다. 항-CD22 항체 및 인간 IgG1 이소타입 대조군의 5-배 희석계(5-fold dilution series)를, 50μg/ml 에서 40 ng/m까지 하여, Component B(Molecular Devices # R7181)+0.1%BSA 버퍼에서 제조하였다. 항체를 이전에 제조한 96-웰 평판의 A-F 열들(rows)로 삼중으로(in triplicate) 분주하였다. Component B + 0.1% BSA를 분석 평판 상에서 G & H 열의 모든 웰로 분주하였다. 17초에 웰당 22μl 시약을 분석 평판에 첨가하여, 칼슘 플럭스를 Flex Station(Molecular Devices)를 이용하여 분석하였다. 데이터를 FI Max-Min로서 분석하여 GraphPadTM PRISM, 비-선형 회귀(non-linear regression), S자형 투여량 반응, 가변 기울기를 이용하여 대 항체 농도를 플로팅(plotting)시켰다.
분석에서 17개의 상이한 항-CD22 인간 항체를 평가하였다. 결과는, 인간 IgG1 이소타입 대조군 또는 버퍼 단독에 비교하여, 테스트된 17개의 항-CD22 항체의 어느 것도 유의하게 칼슘 플럭스를 자극하지 않았다는 것을, 보여주었다. 라모스 세포가 염소 항-인간 IgM F(ab’)2를 사용한 BCR 자극에 반응한 칼슘 플럭스는 이전에 입증되었다.
실시예 7 : 항- CD22 항체에 의한 BCR 자극-유도성 효과의 조절
이 실시예에서, B 세포 수용체(BCR) 자극-유도성 효과를 조절하는 고정화 항-CD22 항체의 능력을 검사하였다. 이 분석에서, 항-CD22 인간 항체 및 인간 IgG 이소타입 대조군을 RPMI + 10% FBS에서 5μg/ml로 희석하였고 100 μl/웰을 3중으로 마이크로라이트 1 평평한 바닥 평판(Microlite 1 Flat Bottom plates)(Corning #7416)으로 분주하였다. 4℃에서 밤새 배양한 후, 평판을 냉 PBS로 한번 그리고 RPMI 1640(Mediatech) + 10% FBS (GIBCO)로 한번 세척하였다. 살아있는 라모스 세포(ATCC 기탁번호 CRL-1596)를 트립판 청색 배제 현미경(trypan blue exclusion microscopy)으로 계수하였고 RPMI + 10%FBS에서 2x105 세포/ml로 희석하였다. 20,000세포(50 μl/웰)를 항체가 코팅된 96-웰 평판으로 분주하였다. 항-인간 IgM F(ab’)2(Jackson catalog #109-006-129)를 RPMI + 10% FBS에서 5 μg/ml로 희석하였고 2.5 μg/ml의 최종 농도를 위하여 100 μl/웰을 분주하였다. 분석 평판을 72 시간동안 배양하였다. 세포 생존력을 CellTiter-Glo 시약(Promega G7571), 100 μl/웰을 첨가하여, 10분동안 분석하였다. Pherastar GMB Labtech 상에서 Luminescence Test 1 plate Nunc 96을 이용하여 발광을 측정하였다. 데이터를 100% 세포 생존력을 나타냈던 인간 IgG1 이소타입 대조군에 상대적인 % 세포 사멸(cell death)로 분석하였다.
분석에서, 17개의 상이한 항-CD22 항체를 테스트하였고, 이 패널은, 특정 항체에 따라, 대략 80%의 관찰 % 세포 사멸 값부터 이소타입 대조군과 대략 동일한 관찰 % 세포 사멸 값까지, 넓은 범위의 활성을 보였다. 실시예 2에서 구조적으로 특성화된 4개의 항체에 대한 결과가 도 11이 막대그래프로 보이는데, 이것은 고정화 19A3, 23C6 및 12C5 각각이 BCR 자극 세포 사멸의 항-증식성 효과를 매우 향상시키고 반면에 16F7은 이소타입 대조군과 유의하게 다르지는 않는 것을 보여준다.
실시예 8 : 세포 증식에 대한 항- CD22 항체의 효과
이 실시예에서, 세포 증식에 대한 용해성 항-CD22 항체의 직접 효과를, 항체 교차-결합으로 또는 이것 없이, 검사하였다. 사용된 분석법에서, 생존하는 라모스 세포(ATCC 기탁번호 CRL-1596)를 트립판 청색 배제 현미경(trypan blue exclusion microscopy)으로 계수하였고 RPMI + 10%FBS에서 2x105 세포/ml로 희석하였다. 20,000세포(50 μl/웰)를 96-웰 배양 처리 평판으로 분주하였다. 교차-결합 항체 염소 항-인간 IgG Fc(Rockland catalog #709-1117)를 RPMI+10% FBS에서 80 μg/ml로 희석하였고 25μl/웰을 라모스 세포 분석 평판의 반에 분주하였다. 희석제 단독으로 평판의 나머지에 분배하였다(25μl/웰). 항-CD22 인간 항체 및 인간 IgG1 이소타입 대조군을 RPMI + 10% FBS에서 20 μg/ml으로 희석하였고 25 μl/웰을 웰들을 포함하는 라모스 + 교차-링커 및 라모스 + 희석제 둘 다에 삼중으로 분주하여 최종 항체 농도가 5 μg/ml의 항-CD22 +/- 20 μg/ml의 교차-결합 항 체가되게 하였다. 분석 평판을 37℃에서 72 시간동안 배양하였다. 세포 생존력을, CellTiter-Glo 시약(Promega G7571), 100 μl/웰을 첨가하여, 10분동안 분석하였다. Pherastar GMB Labtech 상에서 Luminescence Test 1 plate Nunc96을 이용하여 발광을 측정하였다. 데이터를, 0% 억제를 나타냈던 인간 IgG1 이소타입 대조군에 대한 상대적인 % 성장 억제로서, 분석하였다.
분석에서 17개의 상이한 항-CD22 인간 항체를 평가하였다. 결과는, 항체가 교차-결합되어 있지 않을 때나 그것들이 교차-결합되어 있을 때나, 테스트된 17개의 항-CD22 항체의 어느 것도 유의하게 라모스 세포 증식율을 변경하지 않았다는 것을 보여주었다. 이 결과들은, 항체가 교차-결합되어 있을지라도, 항-CD22 항체의 어느 것도 라모스 세포에 직접적인 항-증식성 효과를 가지지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 9 : 항- CD22 항체의 CDC 활성의 평가
이 실시예에서, 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 조절하는 용해성 항-CD22 인간 항체의 능력을 검사하였다. 사용된 분석법에서, 생존하는 라모스 세포(ATCC 기탁번호 CRL-1596)를 트립판 청색 배제 현미경(trypan blue exclusion microscopy)으로 계수하였고 CDC 버퍼(RPMI 1640 + 0.1% BSA+20 mM HEPES + 1% Pen/strep)에서 1x106 세포/ml로 희석하였다. 세포 현탁액을 96-웰 평평한 바닥 조직 배양 처리 평판(96-well flat-bottomed tissue culture plate)내에 50,000세포(50 μl/웰)로 분주하였다. 인간 보체(Quidel catalog # A113)를 56℃에서 1시간동안 배양함으로써 열-비활성화시켰다. 활성 보체 및 열-비활성화된 보체를 각각 CDC 버퍼에 1:3으로 희석하였고 50μl/웰을 라모스 세포 분석 평판으로 분주하였다. 항-CD22 인간 항체, 인간 IgG1 이소타입 대조군 및 항-CD22 양성 대조군 항체를 각각 CDC 버퍼에서 40 μg/ml으로 희석하였다. 희석된 항체 50 μl/웰을 이중으로(in duplicate) 활성 보체 및 열-비활성화된 보체를 갖는 라모스 분석 평판으로 분주하여 최종 항체 농도를 10 μg/ml가 되게 하였다. 분석 평판을 37℃에서 2 시간동안 배양하였다. 세포 생존력을 분석하기 위하여, alamar blue 시약(BioSource catalog # DAL1100), 50 μl/웰을 첨가하였고, 평판을 37℃에서 21시간동안 더 배양하였다. SPECTROMAX GEMINI 형광 평판 리더기(Molecular Devices S/N G 02243)를 이용하여, 측정된 형광도에 비례하는 세포 생존력을 분석하였다.
18개의 상이한 항-CD22 항체를, 활성 보체는 존재하나 열-비활성화된 보체가 없는 상태에서, 양성 대조군으로서, 강한 세포독성을 나타내는 것으로 알려진 항-CD22 항체와 함께 평가하였다. 결과는, 테스트된 항-CD22 항체의 어느 것도 인간 IgG1 이소타입 대조군에 비하여 유의한 CDC 활성을 나타내지 못했다는 것을, 보여주었다.
실시예 10 : 항- CD22 항체-약물 접합체에 의한 생체내 고형 종양 세포 증식의 억제
CD22.1 및 CD22.2의 약물 접합체가 생체 내에서 만성화된 고형 암의 증식을 효과적으로 억제할 수 있도록 만들어졌는지를 결정하기 위하여, 항-CD22 재조합 항체 CD22.1 및 CD22.2를 세포독성 약물 사이토톡신 A에 접합하였고 그 결과의 ADC 화합물의 효능을 라모스 피하 종양 세포 모델을 이용하여 검사하였다.
세포독성 화합물 사이토톡신 A에 대한 CD22 .1 및 CD22 .2의 접합
CD22.1 및 CD22.2를 대략 5mg/ml로 농축하였고, 50 mM NaCl, 2 mM DTPA, 3% 글리세롤을 포함하는 pH 7.5의 20 mM 포스페이트 버퍼로 버퍼-교환하였고(buffer exchanged), 실온에서 60분동안 14-배 몰 과량(molar excess)의 2-임미노티올란(2-Imminothiolane)으로 티올화하였다. 티올화 후에, 항체를 5mM 글리신, 2mM DTPA, 및 0.5% 포비돈(10 K)을 포함하는 pH 5.5의 50mM HEPES 버퍼로 버퍼-교환하였다. 티올화는 324nM에서 티오피리딘(thiopyridine) 방출을 측정함으로써 4, 4”디티오디피리딘(4, 4”dithiodipyridine)으로 정량화하였다. 사이토톡신 A 대 티올의 3:1 몰 비율로 사이토톡신 A를 첨가함으로써 접합을 실시하였다. 배양을 실내 온도에서 60분 동안 실시하였고 이어서 10:1 몰 비율의 N-에틸말레이미드(ethylmaleimide) 대 티올을 반응 혼합물에 첨가함으로써 잔여 티올을 블로킹시켰다.
결과의 접합체를 이온-교환 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 각 반응 혼합물을 여과하고 버퍼 A(50mM HEPES, 5mM 글리신, 0.5% 포비돈(10K), pH 5.5)로 균형을 맞춘 SP-세파로즈 고성능 컬럼(SP-Sepharose High Performance column) 상으로 로딩시켰다. 항체 접합체를 24% 버퍼 B(50mM HEPES, 5mM 글리신, 1M NaCl, 0.5% 포비돈 (10K), pH 5.5)로 용출시켰다. 단량체의 항체-사이토톡신 A 접합체를 포함하는 단편들을 고이게 하고(pooled) 50mM HEPES, 5mM 글리신, 100mM NaCl, 0.5% 포비돈 (10K), pH 6.0에 대하여 투석하였다. 280 nm 및 340 nm에서 흡광도를 측정함으로써 치환 비율을 측정하였고, 접합체를 SEC-HPLC에 의하여 분석하였다.
CD22.1-사이토톡신 A 접합체를 1.7의 치환 비율로 만들었고, CD22.2 접합체를 1.6의 치환 비율로 만들었다.
항- CD22 항체-약물 접합물 CD22 .1- 사이토톡신 A 및 CD22 .2- 사이토톡신 A의 생체내 효능
마트리겔(matrigel)에서 마우스 당 10만 세포로 라지 세포를 SCID 마우스들에 피하로 이식시켰고, 약 190 mm3의 중간 크기로 잘 정착할 때까지 종양을 자라게 했다. 그리고 나서 8 마리가 있는 마우스기들을, CD22.1-사이토톡신 A 항체 접합체, CD22.2-사이토톡신 A 접합체, 라지 세포에 결합하지 않는 대조군 인간 IgG1-사이토톡신 A 접합체, 또는 비이클(vehicle) 단독을 이용하여, 1회 투여량으로 처리하였다. 투여 후 63일 동안, 또는 동물이 1500 mm3 넘는 종양 성장으로 인하여 안락사될 때까지 종양 크기를 모니터하였다. CD22.1-사이토톡신 A를 0.18μmol/kg 약물 상당량으로 투여하였고, CD22.2-사이토톡신 A 및 대조군 ab-사이토톡신 A를 0.3 μmol/kg 약물 상당량으로 투여하였다. 결과는 CD22.1 및 CD22.2 접합체 둘 다에 우수한 항-종양 효능을 입증하였다(도 16).
서열 목록화 요약
서열번호 서열 서열번호 서열
1 VH CDR1 a.a. 12C5 31 VH a.a. 12C5
2 VH CDR1 a.a. 19A3 32 VH a.a. 19A3
3 VH CDR1 a.a. 16F7 33 VH a.a. 16F7
4 VH CDR1 a.a. 23C6 34 VH a.a. 23C6
5 VH CDR2 a.a. 12C5 35 VK a.a. 12C5
6 VH CDR2 a.a. 19A3 36 VK a.a. 19A3
7 VH CDR2 a.a. 16F7 37 VK.1 a.a. 16F7
8 VH CDR2 a.a. 23C6 38 VK.2 a.a. 16F7
39 VK.1 a.a. 23C6
9 VH CDR3 a.a. 12C5 40 VK.2 a.a. 23C6
10 VH CDR3 a.a. 19A3
11 VH CDR3 a.a. 16F7 41 VH n.t. 12C5
12 VH CDR3 a.a. 23C6 42 VH n.t. 19A3
43 VH n.t. 16F7
13 VK CDR1 a.a. 12C5 44 VH n.t. 23C6
14 VK CDR1 a.a. 19A3
15 VK.1 CDR1 a.a. 16F7 45 VK n.t. 12C5
16 VK.2 CDR1 a.a. 16F7 46 VK n.t. 19A3
17 VK.1 CDR1 a.a. 23C6 47 VK.1 n.t. 16F7
18 VK.2 CDR1 a.a. 23C6 48 VK.2 n.t. 16F7
49 VK.1 n.t. 23C6
19 VK CDR2 a.a. 12C5 50 VK.2 n.t. 23C6
20 VK CDR2 a.a. 19A3
21 VK.1 CDR2 a.a. 16F7 51 VH 7-4.1 생식계열a.a.
22 VK.2 CDR2 a.a. 16F7 52 VH 4-34 생식계열 a.a.
23 VK.1 CDR2 a.a. 23C6 53 VH 5-51 생식계열 a.a.
24 VK.2 CDR2 a.a. 23C6 54 VH 1-69 생식계열 a.a.
25 VK CDR3 a.a. 12C5 55 Vλ 2b2 생식계열 a.a.
26 VK CDR3 a.a. 19A3 56 VK L6 생식계열 a.a.
27 VK.1 CDR3 a.a. 16F7 57 VK A27 생식계열 a.a.
28 VK.2 CDR3 a.a. 16F7 58 VK A10 생식계열 a.a.
29 VK.1 CDR3 a.a. 23C6
30 VK.2 CDR3 a.a. 23C6 59 인간 CD22 (NP_001762)
60 VH CDR2 a.a. CD22.2 61 VH a.a. CD22.2
62 VH n.t. CD22.2
63 VH CDR1 a.a. 4G6 81 VH a.a. 4G6
64 VH1 CDR1 a.a.21F6 82 VH1 a.a. 21F6
65 VH2 CDR1 a.a. 21F6 83 VH2 a.a. 21F6
66 VH CDR2 a.a. 4G6 84 VK1 a.a. 4G6
67 VH1 CDR2 a.a. 21F6 85 VK2 a.a. 4G6
68 VH2 CDR2 a.a. 21F6 86 VK a.a. 21F6
69 VH CDR3 a.a. 4G6
70 VH1 CDR3 a.a. 21F6 87 VH n.t. 4G6
71 VH2 CDR3 a.a. 21F6 88 VH1 n.t. 21F6
89 VH2 n.t. 21F6
72 VK1 CDR1 a.a. 4G6
73 VK2 CDR1 a.a. 4G6 90 VK1 n.t. 4G6
74 VK CDR1 a.a. 21F6 91 VK2 n.t. 4F6
92 VK2 n.t. 21F6
75 VK1 CDR2 a.a. 4G6
76 VK2 CDR2 a.a. 4G6 93 VK1 L18 생식계열 a.a.
77 VK CDR2 a.a. 21F6
94 펩티드 링커
78 VK1 CDR3 a.a. 4G6 95 펩티드 링커
79 VK2 CDR3 a.a. 4G6 96 펩티드 링커
80 VK CDR3 a.a. 21F6 97 펩티드 링커
98 펩티드 링커
99 펩티드 링커
100 펩티드 링커
101 펩티드 링커
102 펩티드 링커
103 펩티드 링커
104 펩티드 링커
105 펩티드 링커
106 펩티드 링커
107 펩티드 링커
108 12C5 JH6b 생식계열 118 21F6 4-34 생식계열
VH1
109 JL2 생식계열 119 21F6 JH4b 생식계열VH1
110 JK1 생식계열 120 21F6 4-34 생식계열
VH2
111 JK4b 생식계열 121 21F6 JH4b 생식계열
VH2
112 JK3b 생식계열 122 21F6 VK L6 생식계열
113 JK1 생식계열 123 21F6 VK JK4 생식계열
114 JK2 생식계열 124 4G6 VH 1-69 생식계열
115 2-15 생식계열 125 4G6 VH JH4b 생식계열
116 JK1 생식계열 126 4G6 VK1 JK2 생식계열
117 JH4b 생식계열 127 4G6 VK2 A27 생식계열
128 4G6 VK2 JK4 생식계열
SEQUENCE LISTING <110> Medarex King, David J <120> Human Antibodies That Bind CD22 And Uses Thereof <130> MEDX-0152PCT1 <140> WO 00/000,000 <141> 2007-11-00 <150> US 60/868,231 <151> 2006-12-01 <160> 114 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Tyr Gly Ile Asn 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Thr 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Leu Phe Tyr Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Thr Phe Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Pro Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Pro Thr Tyr Tyr Phe Gly Ser Val Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Gln Gly Val Val Val Val Ala Ala Thr His Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 1 5 10 15 Met Asp Val <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr Asn Leu Val Ser 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser Leu His 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Cys Ser Tyr Ala Asn Ser Ser Thr Leu Val 1 5 10 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro 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<400> 47 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc gacgttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaa 324 <210> 48 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60 atcacctgcc gggccagtca gagcattggt agtagcttac actggtacca gcagaaacca 120 gatcagtctc caaagctcct catcaagtat gcttcccagt ccttctcagg ggtcccctcg 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240 gaagatgctg cagcgtatta ctgtcatcag agtagtagtt taccgtacac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 49 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 50 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc aacttcttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 51 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn 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Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Pro <210> 58 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro 85 90 95 <210> 59 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Gln Leu Val Gln 1 <210> 60 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Asp Ile Gln His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 61 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Arg Ser Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Gln His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Gly Thr Phe Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Pro Leu Gly Tyr Trp 100 105 110 Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 62 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtag gtccttcagt agttactact ggagctggat ccgccagccc 120 ccagggaagg ggctggagtg gattggggac atccaacata gtggaagcac caactacaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcggg aacgttttac 300 gatattttga ctggttatta tccccttggg tactggggcc cgggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 63 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 1 5 10 15 Val Ser Ser <210> 64 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 66 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Asp Ile Val Val Val Val Ala Ala Thr 1 5 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 72 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 73 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 caggtccagt tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagc cttctggaga caccttcagc aactatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat ggctatctac 180 gcaccgaagt tccagggcag agttacgatt accgcggaca aatccacgaa cacagccttc 240 atggatctta ccagcctgta ttttgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagcccca 300 acttactggg gatcgaagga ctactttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 74 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Pro Ser Gly Asp Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Met Ala Ile Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Phe 65 70 75 80 Met Asp Leu Thr Ser Leu Tyr Phe Glu Asp Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Pro Thr Tyr Trp Gly Ser Lys Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 75 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Asn Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 76 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Met Ala Ile Tyr Ala Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 77 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Ala Pro Thr Tyr Trp Gly Ser Lys Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 78 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggacattagc agtggtttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggacagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gacgattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt tcccgtacac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 79 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Gly Leu Ala 1 5 10 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Gln Gln Phe Asn Ser Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 83 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacccac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 84 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 85 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 87 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Thr 1 5 <210> 88 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggtcactact ggagctggat ccgccagtcc 120 ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa accgatcata gtggaagcac caactacaat 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatatca atagacacgt ccaagaatca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag gacgtattac 300 gatattttga ctgattatta cccctttgac tcctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 89 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly His 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Thr Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Pro Phe Asp Ser Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 90 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Gly His Tyr Trp Ser 1 5 <210> 91 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Glu Thr Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 92 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Thr Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Pro Phe Asp Ser 1 5 10 <210> 93 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggtcactact ggagctggat ccgccagtcc 120 ccagggaagg gactggagtg gattggggaa atcgatcata gtggaagcac caactacaat 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctatgtatt actgtgcgag gacgtattac 300 gatattttga ctgattatta cccctttgac tcctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 94 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly His 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Pro Phe Asp Ser Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 95 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Gly His Tyr Trp Ser 1 5 <210> 96 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 97 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Thr Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Pro Phe Asp Ser Trp Gly 1 5 10 15 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 20 25 <210> 98 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 98 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc ggctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gtatcctaca gggccactgg catcctagtc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcccatcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 99 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Val Ser Tyr Arg Ala Thr Gly Ile Leu Val Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 100 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 101 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Asp Val Ser Tyr Arg Ala Thr 1 5 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr 1 5 <210> 103 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg <210> 104 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 105 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg <210> 106 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 107 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro 85 90 95 <210> 108 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 109 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 110 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 111 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser 85 90 <210> 112 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 113 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 <210> 114 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 NY02:654669.11

Claims (54)

  1. 삭제
  2. (a) 서열번호 2에 제시된 서열을 가지는 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 6 또는 서열번호 60에 제시된 서열을 가지는 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 10에 제시된 서열을 가지는 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 14에 제시된 서열을 가지는 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 20에 제시된 서열을 가지는 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 26에 제시된 서열을 가지는 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3; 을 포함하는,
    단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제2항에 있어서,
    (a) 서열번호 32 또는 61에 제시된 서열을 가지는 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 36에 제시된 서열을 가지는 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역; 을 포함하는,
    단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제2항 또는 제6항의 항체 또는 이의 항원-결합부 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는,
    암을 치료하기 위한 조성물.
  12. 제2항 또는 제6항의 항체 또는 이의 항원-결합부 및 파트너 분자를 포함하며, 상기 파트너 분자가 치료 제제인,
    항체-파트너 분자 접합체.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 치료 제제는 세포독소인,
    항체-파트너 분자 접합체.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 치료 제제는 방사성 동위원소인,
    항체-파트너 분자 접합체.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 파트너 분자가 화학 링커에 의하여 상기 항체 또는 이의 항원-결합부에 접합되는,
    항체-파트너 분자 접합체.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 화학 링커는 펩티딜 링커, 하이드라진 링커, 및 디설파이드 링커로 구성되는 군으로부터 선택되는,
    항체-파트너 분자 접합체.
  17. 제12항의 항체-파트너 분자 접합체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는,
    암을 치료하기 위한 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 암은 B 세포 림프종인,
    조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 B 세포 림프종은 비-호지킨 림프종인,
    조성물.
  20. 제2항 또는 제6항의 항체 또는 이의 항원-결합부를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  21. 제20항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  22. 제21항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  23. 제22항의 숙주 세포 내에 항체를 발현하는 것과 상기 숙주 세포로부터 항체를 분리하는 것을 포함하는 항-CD22 항체를 제조하는 방법.
  24. CD22-발현 종양 세포의 성장을 억제하기 위하여 상기 CD22-발현 종양 세포를 제2항 또는 제6항의 항체 또는 이의 항원-결합부에 접촉시키는 것을 포함하는,
    실험실 내에서 CD22-발현 종양 세포의 성장을 억제하는 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 종양 세포는 B 세포 림프종인,
    방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 B 세포 림프종은 비-호지킨 림프종인,
    방법.
  27. 제24항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합부는 치료 제제에 접합되는,
    방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 치료 제제는 세포독소 또는 방사성 동위원소인,
    방법.
  29. 제2항 또는 제6항의 항체 또는 이의 항원-결합부 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는,
    염증성 또는 자가면역성 장애를 치료하기 위한 조성물.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 자가면역성 장애는 전신성 홍반성 낭창인,
    조성물.
  31. 제29항에 있어서,
    상기 자가면역성 장애는 류마티스 관절염인,
    조성물.
  32. 제2항 또는 제6항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합부는 1　x　10-9 M 이하의 KD 로 인간 CD22에 결합하는,
    항체 또는 이의 항원-결합부.
  33. 제2항 또는 제6항에 있어서,
    IgG1 이소타입의 전-길이 항체인,
    항체 또는 이의 항원-결합부.
  34. 제2항 또는 제6항에 있어서,
    IgG4 이소타입의 전-길이 항체인,
    항체 또는 이의 항원-결합부.
  35. 제2항 또는 제6항에 있어서,
    항체 단편 또는 단일 사슬 항체인,
    항체 또는 이의 항원-결합부.
  36. 제2항 또는 제6항에 있어서,
    인간 항체인,
    항체 또는 이의 항원-결합부.
  37. 제2항 또는 제6항에 있어서,
    인체적응된 항체 또는 키메르 항체인,
    항체 또는 이의 항원-결합부.
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