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JP5846695B2 - Ｃｄ２２に結合するヒト抗体およびその使用 - Google Patents

Ｃｄ２２に結合するヒト抗体およびその使用 Download PDF

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Description

背景
ＣＤ２２はシアロアドヘシンファミリーの細胞表面Ｉ型糖タンパク質である。ＣＤ２２はまた、他にも名称がある中でＢＬ−ＣＡＭ、Ｂ３、Ｌｅｕ−１４およびＬｙｂ−８として当該技術分野で知られている。ＣＤ２２は、抗−Ｓ−ＨＣＬ−１抗体により最初に特徴づけられた（Ｓｃｈｗａｒｔｉｎｇ Ｒ．ら（１９８５年）Ｂｌｏｏｄ ６５：９７４−９８３頁（非特許文献１））、ＨＤ３９（Ｄｏｒｋｅｎ Ｂ．ら（１９８６年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：４４７０−４４７９頁（非特許文献２））およびＲＦＢ４（Ｃａｍｐａｎａ Ｄ．ら（１９８５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：１５２４−１５３０頁（非特許文献３））。ＣＤ２２は、α２，６に連結されたシアル酸を担持するリガンドに結合するレクチン様の接着分子およびＢ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達の調節物質として確立されている。構造的にはＣＤ２２のスプライス変異体が数種存在するが、ヒトにおける主要な形態は７つの免疫グロブリン様ドメインを有する細胞外領域を有する。
ＣＤ２２は、Ｂリンパ球により特異的に発現されることが示されており、Ｂリンパ球活性化の負の調節因子として機能的に重要である（Ｎｉｔｓｃｈｋｅ Ｌ．（２００５年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：２９０−２９７頁（非特許文献４）およびＴｅｄｄｅｒ Ｔ．Ｆ．ら（２００５年）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８８：１−５０頁（非特許文献５）によりレビュー）。α２，６に連結されたシアル酸リガンドと相互作用しない突然変異体ＣＤ２２分子を発現する遺伝子標的化マウスを用いた試験では、特定の機能（成熟Ｂ細胞上での細胞表面ＣＤ２２、ＩｇＭおよびＭＨＣ クラスＩＩの発現、辺縁帯でのＢ細胞集団の維持、最適なＢ細胞抗原受容体誘発性の増殖およびＢ細胞の代謝回転など）がＣＤ２２リガンド結合により調節される一方、他の機能（ＣＤ２２のリン酸化、ＢＣＲライゲーション後のカルシウム動員のＣＤ２２による負の調節、ＳＨＰ−１のＣＤ２２への動員およびＢ細胞の遊走など）にはリガンドの関与が必要でないことが判定された（Ｐｏｅ Ｊ．Ｃ．ら（２００４年）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：１０７８−１０８７頁（非特許文献６））。
ＣＤ２２は、Ｂ細胞の過剰刺激を阻止するシグナル伝達の閾値の設定によりＢＣＲシグナル伝達を下方調節する阻害性の共受容体であると考えられる。かかる阻害性の共受容体の活性化が細胞質ＩＴＩＭ（免疫受容体のチロシンに基づく阻害モチーフ）上でのリン酸化とその後のチロシンホスファターゼＳＨＰ−１または脂質ホスファターゼＳＨＩＩＰの動員により生じる（Ｎｉｔｓｃｈｋｅ Ｌ．による（２００５年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：２９０−２９７頁（非特許文献４）でレビュー）。さらに、ＣＤ２２は、基本的なシグナル伝達の閾値を調節しかつＢＣＲライゲーション後でのＳｒｃ−ファミリーキナーゼの活性化を増強するＣＤ１９／ＣＤ２１−Ｓｒｃ−ファミリータンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の増幅経路を制御する調節性ループ内で中心的役割を果たすことが示されている（Ｔｅｄｄｅｒ Ｔ．Ｆ．ら（２００５年）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８８：１−５０頁（非特許文献５）でレビュー）。
約６０〜８０％のＢ細胞悪性腫瘍がＣＤ２２を発現することにより、それは受動免疫療法における有望な標的になる（例えばＣｅｓａｎｏ Ａ．およびＧａｙｋｏ Ｕ．（２００３年）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３０：２５３−２５７頁（非特許文献７）を参照）。さらに、ＣＤ２２の標的化を介したＢ細胞活性の選択的調節が自己免疫疾患を治療するための手段として提案されている（例えば、Ｓｔｅｉｎｆｅｌｄ Ｓ．Ｄ．およびＹｏｕｉｎｏｕ Ｐ．（２００６年）Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：９４３−９４９頁（非特許文献８）を参照）。ヒト化抗ＣＤ２２モノクローナル抗体エプラツズマブについての記載がなされている（Ｃｏｌｅｍａｎ Ｍ．ら（２００３年）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：３９９１Ｓ−３９９４Ｓ頁（非特許文献９））。しかし、追加の抗ＣＤ２２試薬は依然として必要とされる。
Ｓｃｈｗａｒｔｉｎｇ Ｒ．ら（１９８５年）Ｂｌｏｏｄ ６５：９７４−９８３頁 Ｄｏｒｋｅｎ Ｂ．ら（１９８６年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：４４７０−４４７９頁 Ｃａｍｐａｎａ Ｄ．ら（１９８５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：１５２４−１５３０頁 Ｎｉｔｓｃｈｋｅ Ｌ．（２００５年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：２９０−２９７頁 Ｔｅｄｄｅｒ Ｔ．Ｆ．ら（２００５年）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８８：１−５０頁 Ｐｏｅ Ｊ．Ｃ．ら（２００４年）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：１０７８−１０８７頁 Ｃｅｓａｎｏ Ａ．およびＧａｙｋｏ Ｕ．（２００３年）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３０：２５３−２５７頁 Ｓｔｅｉｎｆｅｌｄ Ｓ．Ｄ．およびＹｏｕｉｎｏｕ Ｐ．（２００６年）Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：９４３−９４９頁 Ｃｏｌｅｍａｎ Ｍ．ら（２００３年）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：３９９１Ｓ−３９９４Ｓ頁
概要
本開示は、ヒトＣＤ２２に結合しかつ極めて多数の望ましい特性を示す単離モノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供する。これらの特性は、ＣＤ２２への高親和性結合、ＣＤ２２＋細胞内に内在化する能力、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に対する媒介能、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）刺激によりＲａｍｏｓ細胞の細胞死を促進し、かつ／または細胞毒素に結合される場合にインビボでＣＤ２２発現細胞の成長を阻害する能力を含む。本発明の抗体を用い、例えばＣＤ２２＋Ｂ細胞悪性腫瘍の治療および／または様々な炎症性または自己免疫疾患の治療が可能である。
一局面では、本開示は単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで抗体はヒトＣＤ２２に結合し、かつ
（ａ）ＣＤ２２＋細胞に内在化する特性、
（ｂ）ＣＤ２２＋細胞に対する抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を示す特性、
（ｃ）Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）刺激によりＲａｍｏｓ細胞の細胞死を促進する特性、および
（ｄ）細胞毒素に結合される場合にＣＤ２２発現細胞のインビボでの成長を阻害する特性
のうちの少なくとも１つを示す。
別の態様では、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のうちの少なくとも２つを示す。さらに別の態様では、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のうちの３つを示す。別の態様では、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の４つすべてを示す。特定の態様では、抗体はＲａｍｏｓ細胞に対する直接的な抗増殖効果を有しない。特定の態様では、抗体はＲａｍｏｓ細胞へのカルシウム流入を誘発しない。特定の態様では、抗体はＲａｍｏｓ細胞に対する補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を媒介しない。好ましくは、抗体は、高親和性、例えば１×１０−７Ｍ以下のＫＤまたは１×１０−８Ｍ以下のＫＤまたは１×１０−９Ｍ以下のＫＤまたは１×１０−１０以下のＫＤまたは７×１０−１１以下のＫＤでヒトＣＤ２２に結合する。
別の局面では、本発明は、単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで抗体はＣＤ２２への結合に対して参照抗体と交差競合し、ここで参照抗体は、
（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、あるいは
（ｂ）配列番号３２または６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、あるいは
（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３７または３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、あるいは
（ｄ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３９または４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、あるいは
（ｅ）配列番号８１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８４または８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、あるいは
（ｆ）配列番号８２または８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、ここで抗体はヒトＣＤ２２に特異的に結合する。
さらに別の局面では、本発明は、ヒトＶＨ７−４．１遺伝子、ヒトＶＨ４−３４遺伝子、ヒトＶＨ５−５１遺伝子、またはヒトＶＨ１−６９遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで抗体はヒトＣＤ２２に特異的に結合する。さらに別の局面では、本発明は、ヒトＶλ２ｂ２遺伝子、ヒトＶＫＬ６遺伝子、ヒトＶＫＡ２７遺伝子、ヒトＶＫＡ１０遺伝子、またはヒトＬ１８遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで抗体はヒトＣＤ２２に特異的に結合する。さらに別の局面では、本発明は、
（ａ）ヒトＶＨ７−４．１遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域およびヒトＶλ２ｂ２遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域、あるいは
（ｂ）ヒトＶＨ４−３４遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ６遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域、あるいは
（ｃ）ヒトＶＨ５−５１遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域およびヒトＶＫＡ２７またはＡ１０遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域、あるいは
（ｄ）ヒトＶＨ１−６９遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ６遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域、あるいは
（ｅ）ヒトＶＨ１−６９遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ１８またはＡ２７遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域
を含む単離抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで抗体はヒトＣＤ２２に特異的に結合する。
別の局面では、本開示は、
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域とＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここでは
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ３配列は配列番号９〜１２および６９〜７１のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにその保存的修飾を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列は配列番号２５〜３０、７８〜８０のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにその保存的修飾を含み、
（ｃ）抗体はヒトＣＤ２２に結合する。
好ましい態様では、この抗体はまた、ＣＤ２２＋細胞内に内在化し、ＡＤＣＣ活性を媒介し、かつ／またはＢＣＲ刺激により誘発されるＲａｍｏｓ細胞の細胞死を促進し、かつ／または細胞毒素に結合される場合にインビボでＣＤ２２発現細胞の成長を阻害するという特性のうちの１つ以上を有する。
好ましくは、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号５〜８、６０、６６〜６８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号１９〜２４、７５〜７７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。
好ましくは、重鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号１〜４、６３〜６５のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号１３〜１８、７２〜７４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。
好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号１を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１
（ｂ）配列番号５を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号９を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１３を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１９を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２５を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号６または６０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号２６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１５または１６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２１または２２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号２７または２８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号４を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号８を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１２を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１７または１８を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２３または２４を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２９または３０を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号６３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号６６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号６９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号７２または７３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号７５または７６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号７８または７９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号６４または６５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号６７または６８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号７０または７１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号７４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号７７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号８０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
本開示の他の好ましい抗体またはその抗原結合部分は、
（ａ）配列番号３１〜３４、６１および８１〜８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号３５〜４０および８４〜８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、ここで抗体はＣＤ２２に対して特異的に結合する。
好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号３２または６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および（ｂ）配列番号３７または３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および（ｂ）配列番号３９または４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号８１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および（ｂ）配列番号８４または８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号８２または８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および（ｂ）配列番号８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
本開示の別の局面では、ＣＤ２２への結合に対して上記抗体のいずれかと競合する抗体またはその抗原結合部分が提供される。
本開示の抗体は、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの例えば完全長抗体でありうる。あるいは、抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦａｂ’２断片、または一本鎖抗体でありうる。
本開示は、治療物質、例えば細胞毒素または放射性同位体に連結された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体も提供する。特に好ましい態様では、本発明は、（例えばチオール結合を介して）化合物「サイトトキシンＡ（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ Ａ）」に結合された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体を提供する。
本開示は、抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能部分に連結された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異性分子も提供する。
本開示の抗体またはその抗原結合部分あるいは免疫複合体または二重特異性分子と薬学的に許容できる担体とを含む組成物も提供される。
本開示の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子、ならびにかかる核酸を含む発現ベクターおよびかかる発現ベクターを含む宿主細胞も本開示によって包含される。かかる発現ベクターを含む宿主細胞を用いて抗ＣＤ２２抗体を調製するための方法も提供され、それは（ｉ）宿主細胞内で抗体を発現する工程と、（ｉｉ）宿主細胞から該抗体を単離する工程とを含みうる。
本開示の別の局面は、ＣＤ２２発現腫瘍細胞の成長を阻害する方法に関する。本方法は、ＣＤ２２発現腫瘍細胞を本発明の抗体またはその抗原結合部分とＣＤ２２発現腫瘍細胞の成長が阻害されるように接触させる工程を含む。腫瘍細胞は、例えばＢ細胞リンパ腫、例えば非ホジキンリンパ腫でありうる。特定の態様では、抗体またはその抗原結合部分は治療物質、例えば細胞毒素に結合される。
本開示の別の局面は、対象における炎症性または自己免疫疾患を治療する方法に関する。本方法は、本発明の抗体またはその抗原結合部分を、対象における炎症性または自己免疫疾患が治療されるように対象に投与する工程を含む。自己免疫疾患は、例えば、全身性エリテマトーデスまたは関節リウマチでありうる。
本開示は、ＣＤ２２に高親和性で特異的に結合する単離抗ＣＤ２２抗体−パートナー分子複合体、特にヒトモノクローナル抗体を含むものも提供する。特定のかかる抗体−パートナー分子複合体は、ＣＤ２２発現細胞内に内在化される能力があり、かつ抗体依存性細胞毒性を媒介する能力がある。本開示は、本明細書中に開示される抗ＣＤ２２抗体−パートナー分子複合体を用い、癌、例えばＢ細胞リンパ腫、例えば非ホジキンリンパ腫を治療するための方法も提供する。
別の局面では、本発明は対象における炎症性または自己免疫疾患を治療する方法を提供する。本方法は、本発明の抗体またはその抗原結合部分を、対象における炎症性または自己免疫疾患が治療されるように対象に投与する工程を含む。好ましい自己免疫疾患の非限定例として、全身性エリテマトーデスおよび関節リウマチが挙げられる。自己免疫疾患の他の例として、（潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む）炎症性腸疾患、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、シェーグレン症候群、（グレーブス病および橋本甲状腺炎を含む）自己免疫性甲状腺炎、乾癬および糸球体腎炎が挙げられる。
本開示のパートナー分子に結合される抗体またはその抗原結合部分を含有する組成物も提供される。本明細書中に開示される抗体パートナー分子複合体中での抗体に有利に結合されうるパートナー分子として、限定はされないが、薬剤としての分子、毒素、マーカー分子（例えば放射性同位体）、タンパク質および治療物質が挙げられる。抗体−パートナー分子複合体および薬学的に許容できる担体を含有する組成物も本明細書中に開示される。
一局面では、かかる抗体−パートナー分子複合体は化学リンカーを介して結合される。一部の態様では、リンカーはペプチジルリンカーであり、本明細書中で（Ｌ４）ｐ−Ｆ−（Ｌ１）ｍとして示される。他のリンカーはヒドラジンおよびジスルフィドリンカーを含み、それぞれ本明細書中で（Ｌ４）ｐ−Ｈ−（Ｌ１）ｍまたは（Ｌ４）ｐ−Ｊ−（Ｌ１）ｍとして示される。パートナーに結合されているリンカーに加え、本発明は、本質的に任意の分子種への結合に適する切断可能なリンカーアームも提供する。
別の局面では、本発明はＣＤ２２発現腫瘍細胞の成長を阻害する方法に関する。本方法は、ＣＤ２２発現腫瘍細胞を本開示の抗体−パートナー分子複合体にＣＤ２２−腫瘍細胞の成長が阻害されるように接触させる工程を含む。好ましい態様では、パートナー分子は治療物質、例えば細胞毒素である。特に好ましいＣＤ２２発現腫瘍細胞はＢ細胞リンパ腫、例えば非ホジキンリンパ腫である。ＣＤ２２発現腫瘍細胞の他のタイプとして、バーキットリンパ腫およびＢ細胞慢性リンパ性白血病が挙げられる。さらに他の態様では、ＣＤ２２発現腫瘍細胞は、バーキットリンパ腫およびＢ細胞慢性リンパ性白血病からなる群から選択される癌に由来する。
別の局面では、本発明は、対象における癌を治療する方法に関する。本方法は、癌が対象において治療されるように、本開示の抗体−パートナー分子複合体を対象に投与する工程を含む。好ましい態様では、パートナー分子は治療物質、例えば細胞毒素である。治療対象の特に好ましい癌はＢ細胞リンパ腫、例えば非ホジキンリンパ腫である。癌の他のタイプとして、バーキットリンパ腫およびＢ細胞慢性リンパ性白血病が挙げられる。
[請求項101]
単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、
該抗体が、ヒトCD22に結合し、かつ、
(a)CD22+細胞に内在化する特性
(b)CD22+細胞に対して抗体依存性細胞毒性(ADCC)を示す特性
(c)B細胞受容体(BCR)の刺激により誘発されるRamos細胞の細胞死を促進する特性、および
(d)細胞毒素に結合される場合、インビボでCD22発現細胞の成長を阻害する特性
のうちの少なくとも1つを示す、
単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[請求項102]
特性(a)、(b)、(c)、および(d)のうちの少なくとも2つを示す、請求項101記載の抗体。
[請求項103]
特性(a)、(b)、(c)、および(d)のうちの3つを示す、請求項101記載の抗体。
[請求項104]
特性(a)、(b)、(c)、および(d)の4つすべてを示す、請求項101記載の抗体。
[請求項105]
Ramos細胞に対して直接の抗増殖効果を有さない、請求項101記載の抗体。
[請求項106]
Ramos細胞へのカルシウム流入を誘発しない、請求項101記載の抗体。
[請求項107]
Ramos細胞に対する補体依存性細胞毒性(CDC)を媒介しない、請求項101記載の抗体。
[請求項108]
ヒトCD22に1×10-7M以下のKDで結合する、請求項101記載の抗体。
[請求項109]
ヒトCD22に5×10-8M以下のKDで結合する、請求項108記載の抗体。
[請求項110]
単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、
該抗体が、
(a)配列番号31のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号35のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(b)配列番号32もしくは配列番号61のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号36のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(c)配列番号33のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号37もしくは38のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(d)配列番号34のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号39もしくは40のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(e)配列番号81のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号84もしくは85のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(f)配列番号82もしくは83のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号86のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む参照抗体により認識されるCD22上のエピトープに結合する、
単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[請求項111]
参照抗体が、配列番号31のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号35のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項110記載の抗体。
[請求項112]
参照抗体が、配列番号32または配列番号61のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号36のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項110記載の抗体。
[請求項113]
参照抗体が、配列番号33のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号37または38のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項110記載の抗体。
[請求項114]
参照抗体が、配列番号34のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号39または40のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項110記載の抗体。
[請求項115]
ヒトVH7-4.1遺伝子、ヒトVH4-34遺伝子、ヒトVH5-51遺伝子、またはヒトVH1-69遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がヒトCD22に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[請求項116]
ヒトVλ2b2遺伝子、ヒトVKL6遺伝子、ヒトVKA27遺伝子、ヒトVKA10遺伝子、またはヒトL18遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がヒトCD22に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[請求項117]
(a)ヒトVH7-4.1遺伝子の産物であるかもしくはそれに由来する重鎖可変領域およびヒトVλ2b2遺伝子の産物であるかもしくはそれに由来する軽鎖可変領域、または
(b)ヒトVH4-34遺伝子の産物であるかもしくはそれに由来する重鎖可変領域およびヒトVKL6遺伝子の産物であるかもしくはそれに由来する軽鎖可変領域、または
(c)ヒトVH5-51遺伝子の産物であるかもしくはそれに由来する重鎖可変領域およびヒトVKA27もしくはA10遺伝子の産物であるかもしくはそれに由来する軽鎖可変領域、または
(d)ヒトVH1-69遺伝子の産物であるかもしくはそれに由来する重鎖可変領域およびヒトVKL6遺伝子の産物であるかもしくはそれに由来する軽鎖可変領域、
(e)ヒトVH1-69遺伝子の産物であるかもしくはそれに由来する重鎖可変領域およびヒトVKL18もしくはA27遺伝子の産物であるかもしくはそれに由来する軽鎖可変領域
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、
該抗体がヒトCD22に特異的に結合する、
単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[請求項118]
(a)配列番号1を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号5を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号9を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号13を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号19を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号25を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、請求項101記載の抗体。
[請求項119]
(a)配列番号2を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号6または配列番号60を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号10を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号14を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号20を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号26を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、請求項101記載の抗体。
[請求項120]
(a)配列番号3を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号7を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号11を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号15または16を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号21または22を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号27または28を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、請求項101記載の抗体。
[請求項121]
(a)配列番号4を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号8を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号12を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号17または18を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号23または24を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号29または30を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、請求項101記載の抗体。
[請求項122]
(a)配列番号31〜34、61、および81〜83からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
(b)配列番号35〜40および84〜86からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[請求項123]
(a)配列番号31のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号35のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項122記載の抗体。
[請求項124]
(a)配列番号32または61のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号36のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項122記載の抗体。
[請求項125]
(a)配列番号33のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号37または38のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項122記載の抗体。
[請求項126]
(a)配列番号34のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号39または40のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項122記載の抗体。
[請求項127]
請求項101記載の抗体またはその抗原結合部分、および薬学的に許容できる担体を含む組成物。
[請求項128]
請求項101記載の抗体またはその抗原結合部分、および治療物質であるパートナー分子を含む抗体-パートナー分子複合体。
[請求項129]
請求項128記載の抗体-パートナー分子複合体および薬学的に許容できる担体を含む組成物。
[請求項130]
治療物質が細胞毒素である、請求項128記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項131]
請求項130記載の免疫複合体および薬学的に許容できる担体を含む組成物。
[請求項132]
治療物質が放射性同位体である、請求項128記載の免疫複合体。
[請求項133]
請求項132記載の抗体-パートナー分子複合体および薬学的に許容できる担体を含む組成物。
[請求項134]
請求項101記載の抗体またはその抗原結合部分をコードする単離核酸分子。
[請求項135]
請求項134記載の核酸分子を含む発現ベクター。
[請求項136]
請求項135記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
[請求項137]
抗CD22抗体を調製するための方法であって、請求項136記載の宿主細胞内で該抗体を発現する工程、および該宿主細胞から該抗体を単離する工程を含む、方法。
[請求項138]
CD22発現腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、CD22発現腫瘍細胞と請求項101記載の抗体またはその抗原結合部分とを、CD22発現腫瘍細胞の成長が阻害されるように接触させる工程を含む、方法。
[請求項139]
腫瘍細胞がB細胞リンパ腫である、請求項138記載の方法。
[請求項140]
B細胞リンパ腫が非ホジキンリンパ腫である、請求項139記載の方法。
[請求項141]
抗体またはその抗原結合部分が治療物質に結合される、請求項138記載の方法。
[請求項142]
治療物質が細胞毒素である、請求項141記載の方法。
[請求項143]
対象における炎症性疾患または自己免疫疾患を治療する方法であって、対象に請求項101記載の抗体またはその抗原結合部分を、対象における炎症性疾患または自己免疫疾患が治療されるように投与する工程を含む、方法。
[請求項144]
自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項143記載の方法。
[請求項145]
自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項143記載の方法。
[請求項146]
パートナー分子に結合された請求項101記載の抗体を含む抗体-パートナー分子複合体であって、該パートナー分子が化学リンカーにより該抗体に結合されている、抗体-パートナー分子複合体。
[請求項147]
化学リンカーがペプチジルリンカー、ヒドラジンリンカー、およびジスルフィドリンカーからなる群から選択される、請求項146記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項148]
ヒトCD22に7×10-11M以下のKDで結合する、請求項107記載の抗体。
[請求項149]
参照抗体が、配列番号81のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号84または85のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項109記載の抗体。
[請求項150]
参照抗体が、配列番号82または83のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号86のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項109記載の抗体。
[請求項151]
(a)配列番号63を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号66を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号69を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号72または73を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号75または76を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号78または79を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、請求項101記載の抗体。
[請求項152]
(a)配列番号64または65を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号67または68を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号70または71を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号74を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号77を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号80を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、請求項101記載の抗体。
[請求項153]
(a)配列番号81のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号84または85のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項121記載の抗体。
[請求項154]
(a)配列番号82または83のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号86のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項121記載の抗体。
本開示の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および実施例から明白となり、それらは限定するものとして解釈されるべきではない。本願の全体を通じて言及されるあらゆる参考文献の内容、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号、特許および公開された特許出願は、参照により本明細書中に明示的に援用される。
図１Ａは、１２Ｃ５ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４１）およびアミノ酸配列（配列番号３１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１）、ＣＤＲ２（配列番号５）およびＣＤＲ３（配列番号９）領域が図示され、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系由来が示される。 図１Ｂは、１２Ｃ５ヒトモノクローナル抗体のλ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４５）およびアミノ酸配列（配列番号３５）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１９）およびＣＤＲ３（配列番号２５）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系由来が示される。 図２Ａは、１９Ａ３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４２）およびアミノ酸配列（配列番号３２）ならびにＣＤ２２．１組換え抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。１９Ａ３の重鎖可変領域の配列はＣＤ２２．１の配列と同一である。ＣＤＲ１（配列番号２）、ＣＤＲ２（配列番号６）およびＣＤＲ３（配列番号１０）領域が図示され、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系由来が示される。 図２Ｂは、１９Ａ３ヒトモノクローナル抗体のκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４６）およびアミノ酸配列（配列番号３６）ならびにＣＤ２２．１組換えヒトモノクローナル抗体のκ軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２の双方のκ軽鎖可変領域の配列は１９Ａ３の配列と同一である。ＣＤＲ１（配列番号１４）、ＣＤＲ２（配列番号２０）およびＣＤＲ３（配列番号２６）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系由来が示される。 図２Ｃは、ＣＤ２２．２組換えヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号６２）およびアミノ酸配列（配列番号６１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２）、ＣＤＲ２（配列番号６０）およびＣＤＲ３（配列番号１０）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系由来が示される。 図３Ａは、１６Ｆ７ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４３）およびアミノ酸配列（配列番号３３）を示す。ＣＤＲ１（配列番号３）、ＣＤＲ２（配列番号７）およびＣＤＲ３（配列番号１１）領域が図示され、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系由来が示される。 図３Ｂは、１６Ｆ７ヒトモノクローナル抗体のＶＫ１κ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４７）およびアミノ酸配列（配列番号３７）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１５）、ＣＤＲ２（配列番号２１）およびＣＤＲ３（配列番号２７）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系由来が示される。 図３Ｃは、１６Ｆ７ヒトモノクローナル抗体のＶＫ２κ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４８）およびアミノ酸配列（配列番号３８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１６）、ＣＤＲ２（配列番号２２）およびＣＤＲ３（配列番号２８）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系由来が示される。 図４Ａは、２３Ｃ６ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４４）およびアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号４）、ＣＤＲ２（配列番号８）およびＣＤＲ３（配列番号１２）領域が図示され、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系由来が示される。 図４Ｂは、２３Ｃ６ヒトモノクローナル抗体のＶＫ１κ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４９）およびアミノ酸配列（配列番号３９）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１７）、ＣＤＲ２（配列番号２３）およびＣＤＲ３（配列番号２９）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系由来が示される。 図４Ｃは、２３Ｃ６ヒトモノクローナル抗体のＶＫ２κ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号５０）およびアミノ酸配列（配列番号４０）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１８）、ＣＤＲ２（配列番号２４）およびＣＤＲ３（配列番号３０）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系由来が示される。 図５Ａは、１２Ｃ５の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３１）とヒト生殖細胞系ＶＨ７−４．１アミノ酸配列（配列番号５１）とのアラインメントを示す。 図５Ｂは、１２Ｃ５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３５）とヒト生殖細胞系Ｖλ２ｂ２アミノ酸配列（配列番号５５）とのアラインメントを示す。 図６Ａは、１９Ａ３／ＣＤ２２．１の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３２）とヒト生殖細胞系ＶＨ４−３４アミノ酸配列（配列番号５２）とのアラインメントを示す。 図６Ｂは、１９Ａ３／ＣＤ２２．１／ＣＤ２２．２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３６）とヒト生殖細胞系ＶＫＬ６アミノ酸配列（配列番号５６）とのアラインメントを示す。 図６Ｃは、ＣＤ２２．２の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６１）とヒト生殖細胞系ＶＨ４−３４アミノ酸配列（配列番号５２）とのアラインメントを示す。 図７Ａは、１６Ｆ７の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３３）とヒト生殖細胞系ＶＨ５−５１アミノ酸配列（配列番号５３）とのアラインメントを示す。 図７Ｂは、１６Ｆ７のＶＫ１軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３７）とヒト生殖細胞系ＶＫＡ２７アミノ酸配列（配列番号５７）とのアラインメントを示す。 図７Ｃは、１６Ｆ７のＶＫ２軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３８）とヒト生殖細胞系ＶＫＡ１０アミノ酸配列（配列番号５７）とのアラインメントを示す。 図８Ａは、２３Ｃ６の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３４）とＶＨ１−６９アミノ酸配列（配列番号５４）とのアラインメントを示す。 図８Ｂは、２３Ｃ６のＶＫ１軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３９）および２３Ｃ６のＶＫ２軽鎖可変領域（配列番号４０）とヒト生殖細胞系ＶＫＬ６アミノ酸配列（配列番号５６）とのアラインメントを示す。 抗ＣＤ２２ヒト抗体１２Ｃ５、１９Ａ３、１６Ｆ７および２３Ｃ６のＲａｊｉ細胞への内在化を示す棒グラフである。 図１０Ａは、Ｄａｕｄｉ細胞に対する抗ＣＤ２２ヒト抗体１２Ｃ５、１９Ａ３、１６Ｆ７および２３Ｃ６の（溶解率により測定される）ＡＤＣＣ活性を示すグラフである。 図１０Ｂは、Ｒａｊｉ細胞に対する抗ＣＤ２２ヒト抗体１２Ｃ５、１９Ａ３、１６Ｆ７および２３Ｃ６の（溶解率により測定される）ＡＤＣＣ活性を示すグラフである。 細胞死率により測定される、固定化された抗ＣＤ２２ヒト抗体１２Ｃ５、１９Ａ３、１６Ｆ７および２３Ｃ６のＢＣＲが刺激されたＲａｍｏｓ細胞に対する効果を示す棒グラフである。 １９Ａ３親ヒト抗体の場合に対する抗ＣＤ２２組換えヒト抗体ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２によるＣＤ２２ ＥＣＤへの結合を示すグラフである。 抗ＣＤ２２組換えヒト抗体ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２によるＣＨＯ細胞の表面上に発現されるＣＤ２２への結合を示すグラフである。 抗ＣＤ２２組換えヒト抗体ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２によるＲａｊｉ細胞の表面上に発現されるＣＤ２２への結合を示すグラフである。 抗ＣＤ２２抗体１２Ｃ５、１９Ａ３、１６Ｆ７および２３Ｃ６、ならびに組換えヒト抗体ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２によるＣＤ２２ ＥＣＤアミノ末端ドメイン１および２への結合を示す棒グラフである。 抗体−薬剤複合体のＣＤ２２．１−サイトトキシンＡおよびＣＤ２２．２−サイトトキシンＡのＳＣＩＤマウスにおけるＲａｊｉ細胞の腫瘍サイズに対するインビボ効果を示す。 図１７Ａは、４Ｇ６ヒト抗体のヌクレオチド配列（配列番号８７）およびアミノ酸配列（配列番号８１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号６３）、ＣＤＲ２（配列番号６６）およびＣＤＲ３（配列番号６９）領域が図示され、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系由来が示される。 図１７Ｂは、４Ｇ６ヒトモノクローナル抗体のＶＫ１κ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号９０）およびアミノ酸配列（配列番号８４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号７２）、ＣＤＲ２（配列番号７５）およびＣＤＲ３（配列番号７８）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系由来が示される。 図１７Ｃは、４Ｇ６ヒトモノクローナル抗体のＶＫ２κ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号９１）およびアミノ酸配列（配列番号８５）を示す。ＣＤＲ１（配列番号７３）、ＣＤＲ２（配列番号７６）およびＣＤＲ３（配列番号７９）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系由来が示される。 図１８Ａは、２１Ｆ６ヒトモノクローナル抗体のＶＨ１重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号８８）およびアミノ酸配列（配列番号８２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号６４）、ＣＤＲ２（配列番号６７）およびＣＤＲ３（配列番号７０）領域が図示され、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系由来が示される。 図１８Ｂは、２１Ｆ６ヒトモノクローナル抗体のＶＨ２重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号８９）およびアミノ酸配列（配列番号８３）を示す。ＣＤＲ１（配列番号６５）、ＣＤＲ２（配列番号６８）およびＣＤＲ３（配列番号７１）領域が図示され、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系由来が示される。 図１８Ｃは、２１Ｆ６ヒトモノクローナル抗体のκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号９２）およびアミノ酸配列（配列番号８６）を示す。ＣＤＲ１（配列番号７４）、ＣＤＲ２（配列番号７７）およびＣＤＲ３（配列番号８０）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系由来が示される。 図１９Ａは、４Ｇ６の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８１）とヒト生殖細胞系ＶＨ１−６９アミノ酸配列（配列番号５４）とのアラインメントを示す。 図１９Ｂは、４Ｇ６のＶＫ１κ軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８４）とヒト生殖細胞系ＶＫＬ１８アミノ酸配列（配列番号９３）とのアラインメントを示す。 図１９Ｃは、４Ｇ６のＶＫ２κ軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８５）とヒト生殖細胞系ＶＫＡ２７アミノ酸配列（配列番号５７）とのアラインメントを示す。 図２０Ａは、２１Ｆ６のＶＨ１重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８２）とヒト生殖細胞系ＶＨ４−３４アミノ酸配列（配列番号５２）とのアラインメントを示す。 図２０Ｂは、２１Ｆ６のＶＨ２重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８３）とヒト生殖細胞系ＶＨ４−３４アミノ酸配列（配列番号５２）とのアラインメントを示す。 図２０Ｃは、２１Ｆ６のκ軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８６）とヒト生殖細胞系ＶＫＬ６アミノ酸配列（配列番号５６）とのアラインメントを示す。 抗ＣＤ２２ヒト抗体４Ｇ６によるＣＨＯ細胞の表面上に発現されるＣＤ２２への結合を示すグラフである。 抗ＣＤ２２ヒト抗体２１Ｆ６によるＣＨＯ細胞の表面上に発現されるＣＤ２２への結合を示すグラフである。 抗ＣＤ２２ヒト抗体２１Ｆ６によるＲａｊｉ細胞の表面上に発現されるＣＤ２２への結合を示すグラフである。
本開示の詳細な説明
本開示は、ヒトＣＤ２２に高親和性で特異的に結合する単離モノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体に関する。特定の態様では、本開示の抗体は、特定の重鎖および軽鎖の生殖細胞系配列に由来し、かつ／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域などの特定の構造的特徴を含む。本開示は、単離抗体、免疫パートナー分子複合体、二重特異性分子、アフィボディ、ドメイン抗体、ナノボディおよびユニボディ、前記分子を作製する方法、ならびに前記分子および医薬担体を含有する医薬組成物を提供する。本発明は、同分子を用い、例えばＣＤ２２を検出するとともにＣＤ２２の発現を伴うかまたはＢ細胞の調節を含む疾患または障害、例えばＣＤ２２＋腫瘍および炎症性または自己免疫疾患におけるＢ細胞の活性を調節する方法にも関する。本開示は、本開示の抗ＣＤ２２抗体を用い、ＣＤ２２＋腫瘍細胞の成長を阻害し、例えばＢ細胞リンパ腫を治療する方法も提供する。さらに、本開示は、本開示の抗ＣＤ２２抗体を用い、炎症性または自己免疫疾患を治療する方法を提供する。
本発明がより容易に理解されうるように、特定の用語が最初に定義される。さらなる定義が詳細な説明を通して示される。
「ＣＤ２２」、「ＢＬ−ＣＡＭ」、「Ｂ３」、「Ｌｅｕ−１４」および「Ｌｙｂ−８」という用語は同義的に用いられ、ＣＤ２２の変異体、アイソフォーム、および相同種を含む。したがって、本開示のヒト抗体は、特定の場合、ヒト以外の種由来のＣＤ２２と交差反応しうる。特定の態様では、抗体は、ヒトＣＤ２２に対して完全に特異的であり、かつ非ヒト交差反応性のある種または他のタイプを示さない場合がある。典型的なヒトＣＤ２２の完全なアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１７６２（配列番号５９）を有する。
ヒトＣＤ２２配列は、例えば非保存領域内に保存された突然変異を有することにより配列番号５９のヒトＣＤ２２と異なる場合があり、ＣＤ２２は配列番号５９のヒトＣＤ２２と実質的に同じ生物学的機能を有する。例えば、ヒトＣＤ２２の生物学的機能は、本開示の抗体により特異的に結合されたＣＤ２２の細胞外ドメイン内にエピトープを有することであるかまたはヒトＣＤ２２の生物学的機能はＢＣＲシグナル伝達の調節である。
特定のヒトＣＤ２２配列は一般にアミノ酸配列が配列番号５９のヒトＣＤ２２に対して少なくとも９０％同一となり、アミノ酸配列が他の種（例えばマウス）のＣＤ２２アミノ酸配列と比較される場合にヒトであることが同定されたアミノ酸残基を有する。特定の場合、ヒトＣＤ２２は、配列番号５９のＣＤ２２に対し、アミノ酸配列が少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一でありうる。特定の態様では、ヒトＣＤ２２配列は、配列番号５９のＣＤ２２とは１０個以下のアミノ酸の差を示すことになる。特定の態様では、ヒトＣＤ２２は、配列番号５９のＣＤ２２とは５個以下、またはさらに４、３、２、もしくは１個以下のアミノ酸の差を示すことになる。パーセント同一性は、本明細書中に記載のように決定されうる。
「免疫応答」という用語は、侵入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合での正常なヒト細胞もしくは組織に対する選択的損傷、それらの破壊または人体からの除去をもたらす、例えば、（抗体、サイトカイン、および補体を含む）上記の細胞または肝臓によって生成されるリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および可溶性高分子の作用を示す。
「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達を担う種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を示す。本明細書で用いられる「細胞表面受容体」という語句は、例えばシグナルの受け取りおよび細胞の原形質膜を通過するかかるシグナルの伝達が可能な分子および分子の複合体を含む。本発明の「細胞表面受容体」の例として、ＣＤ２２タンパク質が挙げられる。
本明細書で記載の「抗体」という用語は、全抗体および任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）またはその一本鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖またはその抗原結合部分を含む糖タンパク質を示す。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書中でＶＨと略記）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３という３つのドメインからなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと略記）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域はＣＬという１つのドメインからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに再分化され、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存される領域が組み入れられうる。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配列される。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む因子への結合を媒介しうる。
本明細書で用いられる抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えばＣＤ２２）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を示す。抗体の抗原結合機能が完全長抗体の断片により果たされうることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合断片の例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂであるＦａｂ’断片（「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３年）を参照）；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｖ）抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６頁）；（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；ならびに（ｖｉｉｉ）１つの可変ドメインおよび２つの定常ドメインを有する重鎖可変領域であるナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインのＶＬおよびＶＨが別々の遺伝子でコードされるが、ＶＬおよびＶＨ領域が、それらの一価分子を形成するように対をなす場合の単一のタンパク質鎖としての作製を可能にする合成リンカーによる組換え方法を用いて連結されうる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６頁、およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３頁を参照）。かかる一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されるようにも意図されている。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技術を用いて得られ、断片における有用性が無傷抗体の場合と同様の方法でスクリーニングされる。
本明細書で用いられる略語「ＶＫ」はκ軽鎖の可変ドメインを示す一方、本明細書で用いられる略語「Ｖλ」はλ軽鎖の可変ドメインを示す。本明細書で用いられる略語「ＶＬ」は免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインを示し、それ故にＶＫおよびＶλ軽鎖の双方を包含する。
本明細書で用いられる「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を示すように意図されている（例えば、ＣＤ２２に対して特異的に結合する単離抗体は、ＣＤ２２以外の抗原に対して特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ＣＤ２２に対して特異的に結合する単離抗体は、他の抗原、例えば他の種由来のＣＤ２２分子に対する交差反応性を有しうる。さらに、単離抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成物の抗体分子の調製物を示す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
本明細書で用いられる「ヒト抗体」という用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の双方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する場合の可変領域を有する抗体を含むように意図されている。さらに、抗体が定常領域を有する場合、定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされることのないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的な突然変異誘発またはインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）を含みうる。しかし、本明細書で用いられる「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳類種、例えばマウスの生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている場合の抗体を含むように意図されていない。
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の双方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する場合の可変領域を有する、単一の結合特異性を提示する抗体を示す。一態様では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
本明細書で用いられる「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段により調製、発現、作製または単離されるすべてのヒト抗体、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子におけるトランスジェニックまたはトランスクロモゾーム（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えばマウス）あるいはそれから調製されるハイブリドーマから単離される抗体（さらに下記に記載）、（ｂ）形質転換されることでヒト抗体を発現する宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離される抗体、（ｃ）組換えられたコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離される抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、作製または単離される抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する場合の可変領域を有する。しかし、特定の態様では、かかる組換えヒト抗体に対し、インビトロでの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物が用いられる場合、インビボでの体細胞突然変異誘発）を実施可能であり、それ故、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列に由来しかつそれらに関連する一方、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリーの範囲内に天然に存在することがない配列である。
本明細書で用いられる「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えばＩｇＭまたはＩｇＧｌ）を示す。
「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」という語句は、本明細書中で「抗原に対して特異的に結合する抗体」という用語と同義的に用いられる。
「ヒト抗体誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」という用語は、ヒト抗体の任意の修飾形態、例えば抗体と別の作用物質または抗体との複合体を示す。
「ヒト化抗体」という用語は、別の哺乳類種、例えばマウスの生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている場合の抗体を示すように意図されている。さらなるフレームワーク領域の修飾がヒトフレームワーク配列内でなされうる。
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１種に由来しかつ定常領域配列が別種に由来する場合の抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体に由来しかつ定常領域配列がヒト抗体に由来する場合の抗体を示すように意図されている。
「抗体模倣体」は、抗体の抗原に対する結合能を模倣する能力があるが、天然の抗体構造に限定されない分子を示すように意図されている。かかる抗体模倣体の例として、限定はされないが、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ダルピン（ＤＡＲＰｉｎ）、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）、およびバーサボディ（Ｖｅｒｓａｂｏｄｙ）が挙げられ、これらのすべては従来の抗体結合を模倣する間に異なる機序から生成されかつそれを介して機能する結合構造を用いる。
本明細書で用いられる「パートナー分子」という用語は、抗体−パートナー分子複合体内で抗体に結合された実体を示す。パートナー分子の例として、薬剤、毒素、（限定はされないが、ペプチドおよび蛍光色素マーカーなどの小分子マーカーと放射性同位体などの単一原子マーカーとを含む）マーカー分子、タンパク質ならびに治療物質が挙げられる。
本明細書で用いられる「ヒトＣＤ２２に特異的に結合する」抗体は、ヒトＣＤ２２（および場合により１種以上の非ヒト種由来のＣＤ２２）に結合するが、非ＣＤ２２タンパク質に実質的に結合することがない抗体を示すように意図されている。特定の態様では、本開示の抗体は配列番号５９のヒトＣＤ２２またはその変異体に特異的に結合する。好ましくは、抗体は、１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、より好ましくは５×１０−９Ｍ以下、より好ましくは１×１０−９Ｍ以下、さらにより好ましくは５×１０−１０Ｍ以下、およびさらにより好ましくは７×１０−１１以下のＫＤでヒトＣＤ２２に結合する。
本明細書で用いられる、タンパク質または細胞に「実質的に結合することのない」という用語は、タンパク質または細胞に高親和性で結合することのない、すなわちタンパク質または細胞に１×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１×１０−５Ｍ以上、より好ましくは１×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１×１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１×１０−２Ｍ以上のＫＤで結合することを示す。
本明細書で用いられる「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」という用語は特定の抗体−抗原相互作用の結合速度を示すように意図されている一方、本明細書で用いられる「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」という用語は特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を示すように意図されている。本明細書で用いられる「ＫＤ」という用語は解離定数を示すように意図されており、それはＫｄ対Ｋａの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、かつモル濃度（Ｍ）として表現されるものである。抗体におけるＫＤ値は、当該技術分野で十分に確立された方法を用いて決定可能である。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムの利用によるものである。
本明細書で用いられるＩｇＧ抗体における「高親和性」という用語は、標的抗原に対して１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは５×１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは１×１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは５×１０−９Ｍ以下およびさらにより好ましくは１×１０−９Ｍ以下のＫＤを有する抗体を示す。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに応じて変化しうる。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、１０−６Ｍ以下、より好ましくは１０−７Ｍ以下、さらにより好ましくは１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を示す。
本明細書で用いられる「対象」という用語は任意のヒトまたは非ヒト動物を示す。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
結合として用いられるかまたは結合に垂直に示される記号「−」は、示される部分が固体支持体などの分子の残りに結合される点を示す。
「アルキル」という用語は、それ単独でまたは別の置換基の一部として、他に明記しない限り、直鎖または分岐鎖または環状の炭化水素基、またはそれらの組み合わせを意味し、それは完全に飽和、単不飽和もしくはポリ不飽和の場合があり、かつ規定数の炭素原子を有する（すなわちＣ１〜Ｃ１０は１〜１０個の炭素を意味する）二価および多価基を含みうる。飽和炭化水素基の例として、限定はされないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチルなどの基や、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの相同体および異性体が挙げられる。不飽和アルキル基は１つ以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例として、限定はされないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびにより高級な相同体および異性体が挙げられる。「アルキル」という用語はまた、他に明記しない限り、下記により詳細に定義されるアルキルの誘導体、例えば「ヘテロアルキル」を含むように意図されている。炭化水素基に限定されたアルキル基は「ホモアルキル」と称される。
単独でのまたは別の置換基の一部としての「アルキレン」という用語は、限定はされないが、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−として例示される、アルカンから誘導される二価基を意味し、下記に「ヘテロアルキレン」として記述される基をさらに含む。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、１〜２４個の炭素原子を有することになり、本発明では１０個以下の炭素原子を有する基が好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般に８個以下の炭素原子を有する、鎖がより短いアルキルまたはアルキレン基である。
単独でのまたは別の用語と組み合わせられた「ヘテロアルキル」という用語は、他に明記しない限り、安定な直鎖または分岐鎖または環状の炭化水素基、またはそれらの組み合わせを意味し、規定数の炭素原子とＯ、Ｎ、Ｓｉ、およびＳからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなり、ここで窒素、炭素および硫黄原子は場合により酸化され、窒素ヘテロ原子は場合により四級化されうる。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｓ、およびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置または分子の残りに結合されたアルキル基の位置に配置されうる。例として、限定はされないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられる。最大で２つのヘテロ原子、例えば−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３などが連続しうる。同様に、単独でのまたは別の置換基の一部としての「ヘテロアルキレン」という用語は、限定はされないが−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−として例示される、ヘテロアルキルから誘導される二価基を意味する。ヘテロアルキレン基においては、ヘテロ原子はまた鎖末端の一方または両方を占有しうる（例えばアルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。「ヘテロアルキル」および「ヘテロアルキレン」という用語は、ポリ（エチレングリコール）およびその誘導体を包含する（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｃａｔａｌｏｇ、２００１年を参照）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基においては、記載された連結基の式の方向は連結基の方向を意味していない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’は−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２の双方を表す。
「アルキル」または「ヘテロアルキル」という用語と併用される「低級」という用語は、１〜６個の炭素原子を有する部分を示す。
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、「アルキルスルホニル」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という用語は、それらの従来の意味で用いられ、それぞれ酸素原子、アミノ基、ＳＯ２基または硫黄原子を介して分子の残りに結合されたアルキル基を示す。「アリールスルホニル」という用語はＳＯ２基を介して分子の残りに結合されたアリール基を示し、「スルフヒドリル」という用語はＳＨ基を示す。
一般に「アシル置換基」もまた上記の基から選択される。本明細書で用いられる「アシル置換基」という用語は、本発明の化合物の多環核に結合された基を示し、それに直接的または間接的に結合されたカルボニル炭素の原子価を満たしている。
単独でのまたは別の用語と組み合わせられた「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語は、他に明記しない限り、それぞれ置換もしくは未置換「アルキル」および置換もしくは未置換「ヘテロアルキル」の環状バージョンを示す。さらに、ヘテロシクロアルキルにおいては、ヘテロ原子が分子の残りに結合された複素環の位置を占有しうる。シクロアルキルの例として、限定はされないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例として、限定はされないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。環状構造のヘテロ原子および炭素原子は場合により酸化される。
単独でのまたは別の置換基の一部としての「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、他に明記しない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むように意図されている。例えば、「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」という用語は、限定はされないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むように意図されている。
「アリール」という用語は、他に明記しない限り、置換もしくは未置換のポリ不飽和の芳香族炭化水素置換基を意味し、これは共に縮合されるかまたは共有結合される単一環または複数環（好ましくは１〜３つの環）でありうる。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有するアリール基（または環）を示し、ここで窒素、炭素および硫黄原子は場合により酸化され、かつ窒素原子は場合により四級化される。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残りに結合されうる。アリールおよびヘテロアリール基の非限定例として、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンジミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上記のアリールおよびヘテロアリール環系の各々における置換基は、下記の許容できる置換基の群から選択される。「アリール」および「ヘテロアリール」は、縮合されるかまたはそれ以外ではアリールまたはヘテロアリール系に結合された１つ以上の非芳香環系といった環系も包含する。
簡略化のため、「アリール」という用語は、他の用語（例えばアリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）と併用される場合、上で定義されたアリールおよびヘテロアリール環の双方を含む。したがって、「アリールアルキル」という用語は、炭素原子（例えばメチレン基）が例えば酸素原子（例えばフェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチロキシ）プロピルなど）で置換されているアルキル基を含むアルキル基（例えばベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）に結合されたアリール基といった基を含むように意図されている。
上記の各用語（例えば「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）は、指定される基の置換および未置換形態の双方を含む。基の各タイプにおける好ましい置換基は下記に提供される。
アルキルにおける置換基およびヘテロアルキル基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルとも称されることが多い基を含む）はそれぞれ一般に「アルキル置換基」および「ヘテロアルキル置換基」と称され、限定はされないが、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２から、０〜（２ｍ’＋１）（式中、ｍ’はかかる基内での炭素原子の総数である）の範囲の数で選択される種々の基のうちの１つ以上でありうる。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’の各々は、好ましくは独立して、水素、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、例えば１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換もしくは未置換アルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を示す。本発明の化合物が例えば２つ以上のＲ基を含む場合、Ｒ基の各々はＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基の各々としてこれらの基の２つ以上が存在する場合に独立して選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に結合される場合、それらは窒素原子と結合し、５、６、もしくは７員環が形成されうる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、限定はされないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むように意図されている。置換基についての上の考察から、当業者は、「アルキル」という用語が水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基、例えばハロアルキル（例えば−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）を含むように意図されることを理解するであろう。
アルキル基について記述される置換基と同様、アリール置換基およびヘテロアリール置換基はそれぞれ、一般に「アリール置換基」および「ヘテロアリール置換基」と称され、例えば、ハロゲン、ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、ならびにフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから、０から芳香環系上の開放原子価（ｏｐｅｎ ｖａｌｅｎｃｅ）の総数の範囲の数で選択され、ここでＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、好ましくは水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル、未置換アリールおよびヘテロアリール、（未置換アリール）−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ならびに（未置換アリール）オキシ−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから独立して選択される。本発明の化合物が例えば２つ以上のＲ基を含む場合、各Ｒ基はＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基の各々としてこれらの基の２つ以上が存在する場合に独立して選択される。
アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上のアリール置換基のうちの２つが、場合により、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−（式中、ＴおよびＵは独立に−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、かつｑは０〜３の整数である）の置換基と置換されうる。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２つが、場合により式−Ａ（ＣＨ２）ｒＢ−（式中、ＡおよびＢは独立して−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、かつｒは１〜４の整数である）の置換基と置換されうる。そのように形成された新環の単結合のうちの１つが、場合により二重結合と置換されうる。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２つが、場合により式（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）ｄ−（式中、ｓおよびｄは独立して０〜３の整数であり、かつＸはＯ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である）の置換基と置換されうる。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、好ましくは水素または置換もしくは未置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから独立して選択される。
本明細書で用いられる「ジホスフェート」という用語は、限定はされないが、２つのリン酸基を有するリン酸のエステルを含む。「トリホスフェート」という用語は、限定はされないが、３つのリン酸基を有するリン酸のエステルを含む。例えば、ジホスフェートまたはトリホスフェートを有する特定の薬剤は、
Figure 0005846695
を含む。
本明細書で用いられる「ヘテロ原子」という用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）およびケイ素（Ｓｉ）を含む。
記号「Ｒ」は、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、および置換もしくは未置換ヘテロシクリル基から選択される置換基を表す一般的略語である。
本開示の様々な局面は、以下のサブセクションでさらに詳述される。
抗ＣＤ２２抗体
本開示の抗体は、抗体の特定の機能的特徴または特性により特徴づけられる。例えば、抗体はヒトＣＤ２２に特異的に結合する。好ましくは、本発明の抗体はＣＤ２２に高親和性、例えば１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合する。
本開示の抗ＣＤ２２抗体は、好ましくは
（ａ）ＣＤ２２＋細胞に内在化し、
（ｂ）ＣＤ２２＋細胞に対する抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を示し、
（ｃ）Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の刺激により誘発されるＲａｍｏｓ細胞の細胞死を促進し、かつ
（ｄ）細胞毒素に結合される場合、インビボでＣＤ２２発現細胞の成長を阻害する、
という特徴のうちの１つ以上を示す。
好ましい態様では、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のうちの少なくとも２つを示す。さらに別の態様では、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のうちの３つを示す。別の態様では、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の４つすべてを示す。
本発明の抗ＣＤ２２抗体が特定の機能特性を示す一方、特定の態様では、抗体の別の特徴はそれが他の特定の機能特性を示さないことである。例えば、特定の態様では、抗体はＲａｍｏｓ細胞に対する直接的な抗増殖効果を有しない。他の態様では、抗体はＲａｍｏｓ細胞へのカルシウム流入を誘発しない。さらに他の態様では、抗体はＲａｍｏｓ細胞に対する補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を媒介しない。
ヒト化抗ＣＤ２２抗体エプラツズマブには非ホジキンリンパ腫細胞系に対する直接的な抗増殖効果およびＣＤＣ活性が欠如しているが、抗体が同細胞系に対する細胞毒性効果を他の手段により媒介することが報告されていることは注目すべきである（Ｃａｒｎａｈａｎ Ｊ．ら（２００６年）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：１３３１−１３４１頁を参照）。
好ましくは、本開示の抗体は、ヒトＣＤ２２に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合するか、ヒトＣＤ２２に１×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合するか、ヒトＣＤ２２に５×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するか、ヒトＣＤ２２に３×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するか、ヒトＣＤ２２に１×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するか、またはヒトＣＤ２２に５×１０−１０Ｍ以下のＫＤで結合するか、またはヒトＣＤ２２に１×１０−１０のＫＤで結合するかまたはヒトＣＤ２２に７×１０−１１Ｍ以下のＫＤで結合する。
抗体のヒトＣＤ２２に対する結合親和性を評価するための標準アッセイ法は、当該技術分野で既知であり、例えば組換えＣＤ２２を用いるＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏｒｅ分析を含む（実施例３を参照）。実施例は、抗体の内在化（実施例４）、ＡＤＣＣ活性（実施例５）、ＢＣＲ刺激により誘発される細胞死の促進（実施例７）、抗体の直接的な抗増殖効果（実施例８）、カルシウム流入の誘発（実施例６）、およびＣＤＣ活性（実施例９）、ならびにインビボでの固形腫瘍細胞増殖に対する抗体−薬剤免疫複合体の抗増殖効果（実施例１０）の評価に適するアッセイ法についての詳細な説明も提供する。
モノクローナル抗体１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６
本開示の好ましい抗体はヒトモノクローナル抗体１２Ｃ５、１９Ａ３、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６と組換えヒトモノクローナル抗体ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２であり、これら全部は実施例１および２に記載のように単離され、構造的に特徴づけられた。
１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６のＶＨアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３１、３２、６１、３３、３４、８１、８２および８３で示され、ここで１９Ａ３およびＣＤ２２．１の重鎖は同一であり、配列番号３２に対応し、かつ２１Ｆ６のＶＨ重鎖は配列番号８２または８３のいずれかに対応する。
１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６のＶＬアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、８４、８５および８６で示され、ここで１９Ａ３、ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２のκ軽鎖は同一であり、配列番号３６に対応し、かつ１６Ｆ７のκ軽鎖は配列番号３７または３８のいずれかに対応し、２３Ｃ６のκ軽鎖は配列番号３９または４０のいずれかに対応し、かつ４Ｇ６のκ軽鎖は配列番号８４または８５のいずれかに対応する。
これらの各抗体がＣＤ２２に結合しうると仮定すると、ＶＨおよびＶＬ配列が「混合されて一致する」ことで本開示の他の抗ＣＤ２２結合分子の作製が可能である。かかる「混合されて一致する」抗体のＣＤ２２への結合については、上記や実施例における結合アッセイ法（例えばＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリー）を用いて試験可能である。好ましくは、ＶＨおよびＶＬ鎖が混合されて一致する場合、特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＨ配列が構造的に類似のＶＨ配列と置換される。同様に、好ましくは特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＬ配列は構造的に類似のＶＬ配列と置換される。
したがって、一局面では、本開示は、
（ａ）配列番号３１〜３４、６１および８１〜８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号３５〜４０および８４〜８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＣＤ２２、好ましくはヒトＣＤ２２に特異的に結合する。
好ましい重鎖および軽鎖の組み合わせは、
（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｂ）配列番号３２または６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３７または３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｄ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３９または４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｅ）配列番号８１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８４または８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｆ）配列番号８２または８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
別の局面では、本開示は、１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６、２１Ｆ６、またはこれらの組み合わせの重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体を提供する。
１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６のＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１〜４および６３〜６５で示される（ここで１９Ａ３、ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２のＶＨ配列のＣＤＲ１は同一であり、配列番号２で示され、かつ２１Ｆ６のＶＨ１およびＶＨ２配列のＣＤＲ１は同一であり、それぞれ配列番号６４および６５で示される）。
１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、１６Ｆ７、２３Ｃ６、ＣＤ２２．２、４Ｇ６および２１Ｆ６のＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号５〜８、６０、および６６〜６８で示される（ここで１９Ａ３およびＣＤ２２．１のＶＨ配列のＣＤＲ２は同一であり、配列番号６で示され、ＣＤ２２．２のＶＨ配列のＣＤＲ２は配列番号６０で示され、かつ２１Ｆ６のＶＨ１およびＶＨ２配列のＣＤＲ２は配列番号６７および６８で示される）。
１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６のＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号９〜１２および６９〜７１で示される（ここで１９Ａ３、ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２のＶＨ配列のＣＤＲ３は同一であり、配列番号１０で示され、かつ２１Ｆ６のＶＨ１およびＶＨ２配列のＣＤＲ３は配列番号７０および７１で示される）。
１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６のＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１３〜１８および７２〜７４で示される（ここで１９Ａ３、ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２のＶＫ配列のＣＤＲ１は同一であり、配列番号１４で示され、１６Ｆ７のＶＫ１およびＶＫ２配列のＣＤＲ１は配列番号１５および１６で示され、２３Ｃ６のＶＫ１およびＶＫ２配列のＣＤＲ１は配列番号１７および１８で示され、４Ｇ６のＶＫ１およびＶＫ２配列のＣＤＲ１は配列番号７２および７３で示される）。
１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６のＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１９〜２４および７５〜７７で示される（ここで１９Ａ３、ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２のＶＫ配列のＣＤＲ２は同一であり、配列番号２０で示され、１６Ｆ７のＶＫ１およびＶＫ２配列のＣＤＲ２は配列番号２１および２２で示され、２３Ｃ６のＶＫ１およびＶＫ２配列のＣＤＲ２は配列番号２３および２４で示され、かつ４Ｇ６のＶＫ１およびＶＫ２配列のＣＤＲ２は配列番号７５および７６で示される）。
１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６のＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２５〜３０および７８〜８０で示される（ここで１９Ａ３、ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２のＶＫ配列のＣＤＲ３は同一であり、配列番号２６で示され、１６Ｆ７のＶＫ１およびＶＫ２配列のＣＤＲ３は配列番号２７および２８で示され、２３Ｃ６のＶＫ１およびＶＫ２配列のＣＤＲ３は配列番号２９および３０で示され、かつ４Ｇ６のＶＫ１およびＶＫ２配列のＣＤＲ３は配列番号７８および７９で示される）。
ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステム（Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）」、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）を用いて図示される。
これらの各抗体がＣＤ２２に結合可能でありかつ抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域により提供されると仮定すると、ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列とＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列が「混合されて一致する」（すなわち、各抗体がＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３とＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を有する必要があるが、異なる抗体由来のＣＤＲが混合されて一致する）ことで、本開示の他の抗ＣＤ２２結合分子の作製が可能である。かかる「混合されて一致する」抗体のＣＤ２２への結合は、上記や実施例に記載の結合アッセイ法（例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析）を用いて試験可能である。好ましくは、ＶＨＣＤＲ配列が混合されて一致する場合、特定のＶＨ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は構造的に類似のＣＤＲ配列と置換される。同様に、ＶＬＣＤＲ配列が混合されて一致する場合、特定のＶＬ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、好ましくは構造的に類似のＣＤＲ配列と置換される。新規のＶＨおよびＶＬ配列の作製が、１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲ領域配列を１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６のモノクローナル抗体ＣＤＲ１における本明細書中に開示されるＣＤＲ配列由来の構造的に類似の配列と置換することにより可能であることは当業者に容易に理解されるであろう。
したがって、別の局面では、本開示は、
（ａ）配列番号１〜４および６３〜６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号５〜８、６０および６６〜６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号９〜１２および６９〜７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１３〜１８および７２〜７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１９〜２４および７５〜７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；ならびに
（ｆ）配列番号２５〜３０および７８〜８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３；
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＣＤ２２、好ましくはヒトＣＤ２２に対して特異的に結合する。
好ましい態様では、抗体は、
（ａ）配列番号１を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号５を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号９を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１３を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１９を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２５を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい態様では、抗体は、
（ａ）配列番号２を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号６または６０を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１０を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１４を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２０を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２６を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい態様では、抗体は、
（ａ）配列番号３を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号７を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１１を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１５または１６を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２１または２２を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２７または２８を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい態様では、抗体は、
（ａ）配列番号４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１７または１８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２３または２４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号２９または３０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい態様では、抗体は、
（ａ）配列番号６３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号６６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号６９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号７２または７３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号７５または７６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号７８または７９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい態様では、抗体は、
（ａ）配列番号６４または６５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号６７または６８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号７０または７１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号７４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号７７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号８０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメインから独立したＣＤＲ３ドメインが単独で抗体の同族抗原に対する結合特異性を決定しうることと、共通のＣＤＲ３配列に基づく同じ結合特異性を有する複数の抗体が予測どおりに産生されうることは、当該技術分野で周知である。例えば、（マウス抗ＣＤ３０抗体Ｋｉ−４の重鎖可変ドメインＣＤＲ３のみを用いるヒト化抗ＣＤ３０抗体の産生について記載する）Ｋｌｉｍｋａら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８３（２）：２５２−２６０頁（２０００年）；（親マウスＭＯＣ−３１抗ＥＧＰ−２抗体の重鎖ＣＤＲ３配列のみを用いる組換え上皮糖タンパク質−２（ＥＧＰ−２）抗体について記載する）Ｂｅｉｂｏｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３−８４９頁（２０００年）；（マウス抗インテグリンαｖβ３抗体ＬＭ６０９の重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ３ドメインを用いる一群のヒト化抗インテグリンαｖβ３抗体においては、各メンバー抗体は、ＣＤＲ３ドメイン外部の異なる配列を含み、親マウス抗体と同じエピトープに親マウス抗体と同程度に高いまたはそれより高い親和性で結合可能である点について記載する）Ｒａｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０−８９１５頁（１９９８年）；（ＣＤＲ３ドメインが抗原結合に対して最も有意な寄与をもたらす点を開示する）Ｂａｒｂａｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１−２１６２頁（１９９４年）；（ヒト胎盤ＤＮＡに対する３つのＦａｂ（ＳＩ−１、ＳＩ−４０、およびＳＩ−３２）の重鎖ＣＤＲ３配列の抗破傷風トキソイドＦａｂの重鎖上への移植により既存の重鎖ＣＤＲ３が置換される点を記載し、ＣＤＲ３ドメインが単独で結合特異性を与えた点について示している）Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２５２９−２５３３頁（１９９５年）；（単一特異性ＩｇＧ破傷風トキソイドに結合するＦａｂ ｐ３１３抗体の重鎖に対する親多重特異性Ｆａｂ ＬＮＡ３の重鎖ＣＤＲ３のみの転移が親Ｆａｂの結合特異性を保持するのに十分であったという移植試験について記載する）Ｄｉｔｚｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９−７４９頁（１９９６年）を参照のこと。（抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体のＣＤＲ３に基づくペプチドミメティクスについて記載する）Ｂｅｒｅｚｏｖら、ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ ８：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ８（２００１年）；（抗ホスファチジルセリン抗体のＣＤＲ３ドメインに対応する１２個のアミノ酸合成ポリペプチドについて記載する）Ｉｇａｒａｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１７：４５２−７頁（１９９５年）；（抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗体の重鎖ＣＤＲ３ドメインに由来する単一のペプチドがインビトロでウイルスを中和可能であることを示す）Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２：８０７−１０頁（１９９８年）；（マウス抗ＨＩＶ抗体の重鎖ＣＤＲ３ドメインに基づくペプチドについて記載する）Ｌｅｖｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４３７４−８頁（１９９３年）；（ｓｃＦｖの結合をＺ−ＤＮＡ結合抗体の重鎖ＣＤＲ３領域の移植により可能にすることについて記載する）ＰｏｌｙｍｅｎｉｓおよびＳｔｏｌｌｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５２１８−５３２９頁（１９９４年）；ならびに（重鎖ＣＤＲ３での多様性が通常では同一のＩｇＭ分子における種々のハプテンとタンパク質抗原との識別を可能にするのに十分であることについて記載する）ＸｕおよびＤａｖｉｓ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３７−４５頁（２０００年）。さらに、単一のＣＤＲドメインによって定義される特許化された抗体について記載する米国特許第６，９５１，６４６号明細書；米国特許第６，９１４，１２８号明細書；米国特許第６，０９０，３８２号明細書；米国特許第６，８１８，２１６号明細書；米国特許第６，１５６，３１３号明細書；米国特許第６，８２７，９２５号明細書；米国特許第５，８３３，９４３号明細書；米国特許第５，７６２，９０５号明細書および米国特許第５，７６０，１８５号明細書を参照のこと。これらの各参考文献はその全体が参照により本明細書中に援用される。
したがって、本開示は、ヒトまたは非ヒト動物に由来する抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここでモノクローナル抗体はＣＤ２２に特異的に結合可能である。特定の局面の範囲内で、本開示は、非ヒト抗体、例えばマウスまたはラット抗体に由来する１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここでモノクローナル抗体はＣＤ２２に特異的に結合可能である。一部の態様の範囲内で、非ヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む本発明の抗体は、（ａ）結合に対して競合可能であり、（ｂ）機能特性を保持し、（ｃ）同じエピトープに結合し、かつ／または（ｄ）対応する親非ヒト抗体と類似の結合親和性を有する。
他の局面の範囲内で、本開示は、例えば非ヒト動物から得られるヒト抗体などのヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここでヒト抗体はＣＤ２２に特異的に結合可能である。他の局面の範囲内で、本開示は、例えば非ヒト動物から得られるヒト抗体などの第１のヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここで第１のヒト抗体はＣＤ２２に特異的に結合可能であり、かつ第１のヒト抗体由来のＣＤＲ３ドメインはＣＤ２２への結合特異性が欠如したヒト抗体内のＣＤＲ３ドメインを置き換えることでＣＤ２２に特異的に結合可能な第２のヒト抗体が産生される。一部の態様の範囲内で、第１のヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ３ドメインを含む本発明の抗体は、（ａ）結合に対して競合可能であり、（ｂ）機能特性を保持し、（ｃ）同じエピトープに結合し、かつ／または（ｄ）対応する第１の親ヒト抗体と類似の結合親和性を有する。
特定の生殖細胞系配列を有する抗体
特定の態様では、本開示の抗体は、特定の生殖細胞系重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。
例えば、好ましい態様では、本開示は、ヒトＶＨ７−４．１遺伝子、ヒトＶＨ４−３４遺伝子、ヒトＶＨ５−５１遺伝子、またはヒトＶＨ１−６９遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＣＤ２２に特異的に結合する。
別の好ましい態様では、本開示は、ヒトＶλ２ｂ２遺伝子、ヒトＶＫＬ６遺伝子、ヒトＶＫＡ２７遺伝子、ヒトＶＫＡ１０遺伝子、またはヒトＶＫＬ１８遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＣＤ２２に特異的に結合する。
さらに別の好ましい態様では、本開示は単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はヒトＶＨ７−４．１遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含みかつヒトＶλ２ｂ２遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、ここで抗体はＣＤ２２、好ましくはヒトＣＤ２２に特異的に結合する。
さらに別の好ましい態様では、本開示は単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はヒトＶＨ４−３４遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含みかつヒトＶＫＬ６遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、ここで抗体はＣＤ２２、好ましくはヒトＣＤ２２に特異的に結合する。
さらに別の好ましい態様では、本開示は単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はヒトＶＨ５−５１遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含みかつヒトＶＫＡ２７またはＡ１０遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、ここで抗体はＣＤ２２、好ましくはヒトＣＤ２２に特異的に結合する。
さらに別の好ましい態様では、本開示は単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はヒトＶＨ１−６９遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含みかつヒトＶＫＬ６遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、ここで抗体はＣＤ２２、好ましくはヒトＣＤ２２に特異的に結合する。
さらに別の好ましい態様では、本開示は単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はヒトＶＨ１−６９遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含みかつヒトＶＫＡ２７またはＬ１８遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、ここで抗体はＣＤ２２、好ましくはヒトＣＤ２２に特異的に結合する。
かかる抗体はまた、上で詳述された機能特性、例えばＣＤ２２＋細胞への内在化、ＣＤ２２＋細胞に対するＡＤＣＣ活性および／またはＢＣＲ刺激により誘発されるＲａｍｏｓ細胞の細胞死の促進のうちの１つ以上を有しうる。
ＶＨ７−４．１およびＶλ２ｂ２のＶＨおよびＶＬを有する抗体の例が１２Ｃ５抗体である。ＶＨ４−３４およびＶＫＬ６のＶＨおよびＶＬを有する抗体の例が１９Ａ３抗体である。ＶＨ４−３４およびＶＫＬ６のＶＨおよびＶＬを有する抗体の別の例がＣＤ２２．１抗体である。ＶＨ４−３４およびＶＫＬ６のＶＨおよびＶＬを有する抗体の別の例（ここでＶＨ鎖はＮ５７Ｑ突然変異を含む）がＣＤ２２．２抗体である。ＶＨ４−３４およびＶＫＬ６生殖細胞系のＶＨおよびＶＬを有する抗体の別の例が２１Ｆ６抗体である。ＶＨ５−５１およびＶＫＡ２７またはＡ１０のＶＨおよびＶＬを有する抗体の例が１６Ｆ７抗体である。ＶＨ１−６９およびＶＫＬ６のＶＨおよびＶＬを有する抗体の例が２３Ｃ６抗体である。ＶＨ１−６９およびＶＫＡ２７またはＬ１８のＶＨおよびＶＬを有する抗体の例が４Ｇ６抗体である。
本明細書で用いられるヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られる場合、特定の生殖細胞系配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含む。かかる系は、目的の抗原とともにヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを免疫化する工程または目的の抗原とともにファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリをスクリーニングする工程を含む。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」ヒト抗体が、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列においてヒト抗体の配列に対して最も近い（すなわち最大の％同一性がある）ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を選択することにより、かかるものとして同定されうる。特定のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば自然発生的体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的導入に起因し、生殖細胞系配列と比べてアミノ酸の差を有しうる。しかし、選択されたヒト抗体は、典型的にはアミノ酸配列においてヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、かつ、ヒト抗体が他種の生殖細胞系免疫グロブリンアミノ酸配列（例えばマウス生殖細胞系配列）と比較される場合にヒトであるものと同定されるアミノ酸残基を有する。特定の場合、ヒト抗体は、アミノ酸配列において生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一でありうる。典型的には、特定のヒト生殖細胞系配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列とは１０個以下のアミノ酸の差を示すことになる。特定の場合、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列とは５個以下またはさらには４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸の差を示しうる。
相同抗体
さらに別の態様では、本開示の抗体は、本明細書中に記載の好ましい抗体のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで抗体は本開示の抗ＣＤ２２抗体の所望の機能特性を保持する。
例えば、本開示は、
（ａ）重鎖可変領域が、配列番号３１〜３４、６１および８１〜８３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域が、配列番号３５〜４０および８４〜８６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み、
（ｃ）抗体が、ヒトＣＤ２２に特異的に結合する、
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
さらにまたはかわりに、抗体は、（ａ）ヒトＣＤ２２に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合する、（ｂ）ＣＤ２２＋細胞に内在化する、（ｃ）ＣＤ２２＋細胞に対してＡＤＣＣ活性を示す、（ｄ）例えばＢＣＲ刺激により誘発されるＲａｍｏｓ細胞の細胞死を促進する、かつ／または（ｅ）細胞毒素に結合される場合、インビボでＣＤ２２発現細胞の成長を阻害するという機能特性のうちの１つ以上を有しうる。
様々な態様では、抗体は、例えばヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体でありうる。
他の態様では、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、上で示される配列に８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％相同でありうる。上で示される配列のＶＨおよびＶＬ領域に対して高い（すなわち８０％以上の）相同性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体が、配列番号４１〜４４、６２または８７〜８９、あるいは配列番号４５〜５０または９０〜９２をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発）と、その後の本明細書中に記載の機能アッセイ法を用いてのコードされた改変抗体の保持された機能（すなわち上記に示される機能）についての試験により得られうる。
本明細書で用いられる２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、２つの配列間のパーセント同一性に相当する。２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列で共有される同一位置の数の関数（すなわち％相同性＝同一位置の数／位置の全体数×１００）であり、２つの配列の最適なアラインメントにおいて導入される必要がある。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、下記の非限定例にて記載のように数学的アルゴリズムを用いて行われうる。
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１−１７頁（１９８８年））を用いて決定可能であり、同アルゴリズムはＰＡＭ１２０重み残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ（Ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）および４のギャップペナルティを用いてＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に導入されている。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３頁（１９７０年））アルゴリズムを用いて決定可能であり、同アルゴリズムはブロッサム（Ｂｌｏｓｓｕｍ）６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかと、１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４のギャップ重量および１、２、３、４、５もしくは６の長さ重量を用いてＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内のＧＡＰプログラム中に包含されている。
さらにまたはかわりに、本開示のタンパク質配列をさらに「クエリー配列」として用い、公的データベースで探索を行い、例えば関連配列を同定することが可能である。かかる探索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０頁のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行可能である。ＢＬＡＳＴタンパク質の探索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことで、本開示の抗体分子に相同なアミノ酸配列が得られうる。比較目的でギャップドアラインメント（ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を得るため、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２頁に記載のようにギャップドＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）が用いられうる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、各プログラムのデフォルトパラメータ（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）が有用である。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
保存的修飾を有する抗体
特定の態様では、本開示の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここでこれらのＣＤＲ配列のうちの１つ以上は本明細書中に記載の好ましい抗体（例えば、１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６）に基づく特定のアミノ酸配列またはその保存的修飾を含み、かつここで抗体は本開示の抗ＣＤ２２抗体の所望の機能特性を保持する。抗原結合を除去することのない特定の保存的配列修飾の作製が可能であることは当該技術分野で理解されている。例えば、（サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に特異的な抗体のＣＤＲ３重鎖ドメインにおける突然変異分析について記載する）Ｂｒｕｍｍｅｌｌら（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２：１１８０−８頁；（抗ＵＡ１抗体における突然変異試験について記載する）ｄｅ Ｗｉｌｄｔら（１９９７年）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５−４１頁；（ＨＣＤＲ３の中央における変異が親和性の欠如または低下をもたらしたことを示す）Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖら（１９９７年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４−２６８７０頁；（ＣＤＲ３領域内での単一のアミノ酸変化により結合活性が失われたことを記載する）Ｈａｌｌら（１９９２年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５−１２頁；（抗原結合におけるＴｙｒ残基の寄与について記載する）ＫｅｌｌｅｙおよびＯ’Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２−３５頁；（結合における疎水性の効果について記載する）Ａｄｉｂ−Ｃｏｎｑｕｙら（１９９８年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１−６頁；ならびに（ＨＣＤＲ３アミノ酸変異体について記載する）Ｂｅｅｒｓら（２０００年）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５−４３頁を参照のこと。
したがって、本開示は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号９〜１２、６９〜７１のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号２５〜３０、７９〜８０のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ
（ｃ）抗体はヒトＣＤ２２に特異的に結合する。
さらにまたはかわりに、抗体は、（ａ）ヒトＣＤ２２に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合する、（ｂ）ＣＤ２２＋細胞に内在化する、（ｃ）ＣＤ２２＋細胞に対するＡＤＣＣ活性を示す、かつ／または（ｄ）ＢＣＲ刺激により誘発されるＲａｍｏｓ細胞の細胞死を促進する、かつ／または（ｅ）細胞毒素に結合される場合、インビボでＣＤ２２発現細胞の成長を阻害するという機能特性のうちの１つ以上を有しうる。
好ましい態様では、重鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号５〜８、６０、６６〜６８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号１９〜２４、７５〜７７からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。別の好ましい態様では、重鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号１〜４、６３〜６５のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号１３〜１８、７２〜７４からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。
様々な態様では、抗体は、例えばヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体でありうる。
本明細書で用いられる「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を有する抗体の結合特性に対して有意に作用または改変することのないアミノ酸修飾を示すように意図されている。かかる保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、当該技術分野で既知の標準技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発により本開示の抗体に導入されうる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換される場合の置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーについては当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、本開示の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置換可能であり、改変抗体は保持された機能（すなわち上記に示される機能）について本明細書中に記載の機能アッセイ法を用いて試験可能である。
抗ＣＤ２２抗体と同じエピトープに結合する抗体
別の態様では、本開示は、本開示の抗ＣＤ２２モノクローナル抗体（すなわち、ＣＤ２２への結合に対して本開示のモノクローナル抗体のいずれかと交差競合する能力を有する抗体）のいずれかにより認識される場合と同じヒトＣＤ２２上のエピトープに結合する抗体を提供する。好ましい態様では、交差競合試験における参照抗体は、モノクローナル抗体１２Ｃ５（配列番号３１および３５で示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）、またはモノクローナル抗体１９Ａ３またはモノクローナル抗体ＣＤ２２．１またはモノクローナル抗体ＣＤ２２．２（配列番号３２／６１および３６で示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）またはモノクローナル抗体１６Ｆ７（配列番号３３および３７／３８で示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）またはモノクローナル抗体２３Ｃ６（配列番号３４および３９／４０で示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）、またはモノクローナル抗体４Ｇ６（配列番号８１および８４／８５で示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）またはモノクローナル抗体２１Ｆ６（配列番号８２／８３および８６で示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）でありうる。
かかる交差競合抗体は、標準のＣＤ２２結合アッセイ法において、１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６と交差競合するその能力に基づいて同定されうる。例えば、標準ＥＬＩＳＡアッセイ法の使用が可能であり、ここでは組換えＣＤ２２がプレート上に固定化され、抗体のうちの１つが蛍光標識され、非標識抗体の標識抗体の結合に対して競合する能力が評価される。さらにまたはかわりに、（１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６のエピトープの分類に関する）実施例３に記載のように、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を用い、抗体が交差競合する能力の評価が可能である。試験抗体の、例えば１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６のヒトＣＤ２２への結合に対する阻害能は、試験抗体がヒトＣＤ２２への結合に対して１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６と競合可能であり、それ故に１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６により認識される場合と同じヒトＣＤ２２上のエピトープに結合することを示す。実施例３に詳述されるように、抗体１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６は、それぞれＣＤ２２上の異なるエピトープに結合することから、異なるエピトープ群に属する。好ましい態様では、１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６の場合と同じエピトープに結合する抗体はヒトモノクローナル抗体である。かかるヒトモノクローナル抗体は、実施例に記載のように調製され、単離されうる。
改変され修飾された抗体
さらに、本開示の抗体を出発原料として本明細書中に開示されるＶＨおよび／またはＶＬ配列のうちの１つ以上を有する抗体を用いて調製し、修飾抗体を改変することが可能であり、ここで修飾抗体は最初の抗体からの改変された特性を有しうる。抗体は、一方もしくは両方の可変領域（すなわちＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば１つ以上のＣＤＲ領域内および／または１つ以上のフレームワーク領域内での１つ以上の残基の修飾によって改変可能である。さらにまたはかわりに、抗体は、例えば定常領域内で残基を修飾し、抗体のエフェクター機能を改変することによって改変可能である。
特定の態様では、ＣＤＲ移植を用いて抗体の様々な領域を改変することが可能である。抗体は、６つの重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基全体に支配的な標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、各抗体間でＣＤＲ外部の配列よりも多様である。ＣＤＲ配列が大部分の抗体−抗原相互作用に関与することから、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上に移植された特定の天然抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターの作成により発現することは可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７頁；Ｊｏｎｅｓ Ｐ．ら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５頁；Ｑｕｅｅｎ Ｃ．ら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３頁；Ｗｉｎｔｅｒに交付された米国特許第５，２２５，５３９号明細書ならびにＱｕｅｅｎらに交付された米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
したがって、本開示の別の態様は、配列番号１〜４および６３〜６５、配列番号５〜８、６０、および６６〜６８、ならびに配列番号９〜１２および６９〜７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１３〜１８および７２〜７４、配列番号１９〜２４および７５〜７７、ならびに配列番号２５〜３０および７８〜８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とを含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。したがって、かかる抗体は、モノクローナル抗体１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６のＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を有し、さらにこれらの抗体由来の異なるフレームワーク配列を有しうる。
かかるフレームワーク配列は、生殖細胞系の抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベースまたは刊行された参考文献から得られうる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子における生殖細胞系ＤＮＡ配列は、（インターネット上のｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで入手可能な）「Ｖベース（ＶＢａｓｅ）」ヒト生殖細胞系配列データベースや、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）」、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ Ｉ．Ｍ．ら（１９９２年）「Ｔｈｅ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ＶＨ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａｂｏｕｔ Ｆｉｆｔｙ Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ＶＨ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｌｏｏｐｓ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；ならびにＣｏｘ Ｊ．Ｐ．Ｌ．ら（１９９４年）「Ａ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ ＶＨ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｓｔｒｏｎｇ Ｂｉａｓ ｉｎ ｔｈｅｉｒ Ｕｓａｇｅ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６頁（これら各々の内容は参照により本明細書中に明示的に援用される）において見出されうる。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子における生殖細胞系ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース内に見出されうる。例えば、ＨＣｏ７ ＨｕＭＡｂマウス内で見出される以下の重鎖生殖細胞系配列は、付属のＧｅｎｂａｎｋ登録番号：１−６９（ＮＧ＿００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７およびＢＣ０７０３３３）、３−３３（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）ならびに３−７（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）にて入手可能である。別の例として、ＨＣｏ１２ ＨｕＭＡｂマウス内で見出される以下の重鎖生殖細胞系配列は、付属のＧｅｎｂａｎｋ登録番号：１−６９（ＮＧ＿００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７およびＢＣ０７０３３３）、５−５１（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）、４−３４（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）、３−３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）ならびに３−２３（ＡＪ４０６６７８）にて入手可能である。
抗体タンパク質配列は、当業者に周知のギャップドＢＬＡＳＴと称される配列類似性を探索する方法（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：３３８９−３４０２頁）の１つを用いて集められたタンパク質配列データベースに対して比較される。ＢＬＡＳＴは、抗体配列とデータベース配列との間での統計的に有意なアラインメントが、整列されたワードの高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）を有する傾向が高いという点で、ヒューリスティックアルゴリズムである。延長またはトリミングによりスコアが改善されえないセグメント対はヒットと称される。つまり、Ｖベース（ＶＢＡＳＥ）由来のヌクレオチド配列（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ１／ｌｉｓｔ２．ｐｈｐ）が翻訳され、かつＦＲ１〜ＦＲ３フレームワーク領域の間の領域および同領域を含む領域が保持される。データベース配列は平均９８残基長を有する。タンパク質の全長にわたり正確に一致する二重配列が除去される。オフの低複雑性フィルタを除くデフォルトの標準パラメータおよびＢＬＯＳＵＭ６２の置換マトリックスを備えたｂｌａｓｔｐプログラムを用いるタンパク質におけるＢＬＡＳＴ探索では、配列一致をもたらす上位５つのヒットがフィルタにかけられる。ヌクレオチド配列は全部で６つのフレームで翻訳され、データベース配列の一致するセグメント内に停止コドンを全く有しないフレームはヒットの可能性があると考えられる。次いで、これはＢＬＡＳＴプログラムｔｂｌａｓｔｘを用いて確認され、これにより全部で６つのフレーム内で抗体配列が翻訳され、全部で６つのフレーム内で動的に翻訳されたＶベース（ＶＢＡＳＥ）ヌクレオチド配列に対する翻訳が比較される。
同一性は、抗体配列と配列の全長にわたるタンパク質データベースとの間の正確なアミノ酸の一致である。正（同一性＋置換の一致）は同一ではなく、ＢＬＯＳＵＭ６２置換行列によって導かれるアミノ酸置換である。抗体配列がデータベース配列のうちの２つと同じ同一性で一致する場合、大部分の正を伴うヒットであれば一致する配列ヒットであることが決定されることになる。
本開示の抗体での使用にとって好ましいフレームワーク配列は、選択される本開示の抗体により用いられるフレームワーク配列に構造的に類似し、例えば本開示の好ましいモノクローナル抗体により用いられるＶＨ７−４．１（配列番号５１）、ＶＨ４−３４（配列番号５２）、ＶＨ５−５１（配列番号５３）、またはＶＨ１−６９（配列番号５４）フレームワーク配列および／またはＶλ２ｂ２（配列番号５５）、ＶＫＬ６（配列番号５６）、ＶＫＡ２７（配列番号５７）、ＶＫＡ１０（配列番号５８）、またはＶＫＬ１８（配列番号９３）フレームワーク配列に類似するものである。ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、ならびにＶＫＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列はフレームワーク配列の元となる生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子内に見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域上に移植されうるか、あるいはＣＤＲ配列は生殖細胞系配列と比べて１つ以上の突然変異を有するフレームワーク領域上に移植されうる。例えば、特定の例ではフレームワーク領域内の残基を突然変異させ、抗原の抗体への結合能を維持または促進することが有益であることが見出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎらに交付された米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
可変領域修飾の別のタイプは、アミノ酸残基をＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内で変異させ、それにより目的の抗体の１つ以上の結合特性（例えば親和性）を改善するものである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発を行い、突然変異を導入可能であり、かつ、目的の抗体の結合または他の機能特性に対する効果が、本明細書中に記載されかつ実施例に提供されるインビトロまたはインビボアッセイ法において評価されうる。好ましくは、（上で考察の）保存的修飾が導入される。突然変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失でありうるが、好ましくは置換である。さらに典型的には、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ以下の残基が改変される。
したがって、別の態様では、本開示は、（ａ）配列番号１〜４または６３〜６５からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号１〜４または６３〜６５と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号５〜８、６０または６６〜６８からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号５〜８、６０または６６〜６８と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｃ）配列番号９〜１２または６９〜７１からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号９〜１２または６９〜７１と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；（ｄ）配列番号１３〜１８または７２〜７４からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号１３〜１８または７２〜７４と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｅ）配列番号１９〜２４または７５〜７７からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号１９〜２４または７５〜７７と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域；ならびに（ｆ）配列番号２５〜３０または７８〜８０からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号２５〜３０または７８〜８０と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む単離抗ＣＤ２２モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
本開示の改変抗体は、例えば抗体の特性を改善するためにＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾が施されている場合の抗体を含む。典型的には、かかるフレームワーク修飾を施すことで抗体の免疫原性が低下する。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系配列に「復帰突然変異する」ことである。より詳細には、体細胞突然変異を経ている抗体は、その抗体が由来する生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を有しうる。かかる残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系配列と比較することにより同定されうる。
例えば、１２Ｃ５ Ｖλ領域においては、フレームワーク領域のアミノ酸位置４０および６８（Ｋａｂａｔ番号付与システムを使用）が生殖細胞系とは異なる。これらの位置の一方または両方は、Ｌ４０ＱおよびＲ６８Ｋといった置換基の一方または両方を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。
さらに、１９Ａ３およびＣＤ２２．１ ＶＨ領域においては、フレームワーク領域のアミノ酸位置２７（Ｋａｂａｔ番号付与システムを使用）が生殖細胞系とは異なる。この位置は、Ｒ２７Ｇといった置換基を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。
さらに、ＣＤ２２．２ ＶＨ領域においては、フレームワーク領域のアミノ酸位置２７および５７（Ｋａｂａｔ番号付与システムを使用）が生殖細胞系とは異なる。この位置は、Ｒ２７ＧおよびＱ５７Ｎといった置換基を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。
さらに、１６Ｆ７ ＶＨ領域においては、フレームワーク領域のアミノ酸位置２８（Ｋａｂａｔ番号付与システムを使用）が生殖細胞系とは異なる。この位置は、Ｎ２８Ｓといった置換基を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。
さらに、１６Ｆ７ ＶＫ２領域においては、フレームワーク領域のアミノ酸位置８５（Ｋａｂａｔ番号付与システムを使用）が生殖細胞系とは異なる。この位置は、Ａ８５Ｔといった置換基を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。
さらに、２３Ｃ６ ＶＨ領域においては、フレームワーク領域のアミノ酸位置１４、７９および８８（Ｋａｂａｔ番号付与システムを使用）が生殖細胞系とは異なる。これらの位置の１つ、２つまたは３つすべては、Ｔ１４Ｐ、Ｖ７９ＡおよびＡ８８Ｓといった置換基の１つ、２つまたは３つすべてを作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。
さらに、４Ｇ６ ＶＨ領域においては、フレームワーク領域のアミノ酸位置Ｐ、Ｄ、Ｆ、Ｄ、Ｔ、ＹおよびＦ（Ｋａｂａｔ番号付与システムを使用）が生殖細胞系とは異なる。この位置は、Ｐ？Ａ；Ｄ？Ｇ；Ｎ？Ｓ；Ｆ？Ｙ；Ｄ？Ｅ；Ｔ？Ｓ；Ｙ？Ｒ；Ｆ？Ｓといった置換基の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つすべてを作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。
ＮＥＥＤ ＩＮＰＵＴ ＲＥ：ＫＡＢＡＴ番号付与
さらに、４Ｇ６ ＶＫ１領域においては、フレームワーク領域のアミノ酸位置ＴおよびＤ（Ｋａｂａｔ番号付与システムを使用）が生殖細胞系とは異なる。これらの位置は、Ｔ？ＫおよびＤ？Ｅといった置換基の１つまたは２つを作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。
さらに、２１Ｆ６ ＶＨ１領域においては、フレームワーク領域のアミノ酸位置ＳおよびＩ（Ｋａｂａｔ番号付与システムを使用）が生殖細胞系とは異なる。これらの位置は、Ｓ？ＰおよびＩ？Ｖといった置換基を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。
さらに、２１Ｆ６ ＶＨ２領域においては、フレームワーク領域のアミノ酸位置ＳおよびＭ（Ｋａｂａｔ番号付与システムを使用）が生殖細胞系とは異なる。これらの位置は、Ｓ？ＰおよびＭ？Ｖといった置換基を作製することにより生殖細胞系配列に復帰突然変異されうる。
フレームワーク修飾の別のタイプは、フレームワーク領域内またはさらに１つ以上のＣＤＲ領域内で１つ以上の残基を変異させ、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。このアプローチは、「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」とも称され、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３／０１５３０４３号明細書にさらに詳述されている。
フレームワークまたはＣＤＲ領域内でなされる修飾に加えてまたはそのかわりに、本開示の抗体は、Ｆｃ領域内で修飾を含み、典型的には抗体の１つ以上の機能特性、例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合性および／または抗原依存性の細胞毒性を変化させるように改変されうる。さらに、本開示の抗体は、化学的に修飾されうる（例えば１つ以上の化学的部分が抗体に結合されうる）か、または修飾によりそのグリコシル化が改変されさらに抗体の１つ以上の機能特性が改変されうる。これらの各態様は下記にさらに詳述されている。Ｆｃ領域内の残基の番号付与はＫａｂａｔのＥＵ指数のものである。
一態様では、ＣＨ１のヒンジ領域が、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化する、例えば増加または減少するように修飾される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号明細書にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化することで、例えば軽鎖および重鎖の構築が促進されるかあるいは抗体の安定性が増大または低下する。
別の態様では、抗体のＦｃヒンジ領域の突然変異により抗体の生物学的半減期が減少する。より詳細には、天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比べて、抗体のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合が低下するように、１つ以上のアミノ酸変異がＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入される。このアプローチは、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳述されている。
別の態様では、抗体の修飾によりその生物学的半減期が増加する。様々なアプローチが可能である。例えば、Ｗａｒｄに交付された米国特許第６，２７７，３７５号明細書に記載のように、１つ以上の以下の変異、すなわちＴ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆが導入可能である。あるいは、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書および米国特許第６，１２１，０２２号明細書に記載のように、生物学的半減期を増加させるため、抗体はＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）受容体結合エピトープを有するようにＣＨ１またはＣＬ領域内で改変されうる。
さらに他の態様では、Ｆｃ領域は少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換し、抗体のエフェクター機能を改変することによって改変される。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸が、抗体がエフェクターリガンドに対して改変された親和性を有しても親抗体の抗原への結合能を保持する程度に異なるアミノ酸残基と置換されうる。親和性が改変される対象のエフェクターリガンドは、例えばＦｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。このアプローチは、米国特許第５，６２４，８２１号明細書および米国特許第５，６４８，２６０号明細書（いずれもＷｉｎｔｅｒらによる）にさらに詳述されている。
別の例では、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸が、抗体がＣ１ｑ結合を改変しかつ／または補体依存性の細胞毒性（ＣＤＣ）を低減または根絶している程度に異なるアミノ酸残基と置換されうる。このアプローチは、米国特許第６，１９４，５５１号明細書（Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる）にさらに詳述されている。
別の例では、アミノ酸位置２３１および２３９内の１つ以上のアミノ酸残基が改変されることにより、抗体の補体を固定する能力が改変される。このアプローチは、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開、国際公開第９４／２９３５１号論説にさらに記載されている。
さらに別の例では、以下の位置、すなわち２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８もしくは４３９での１つ以上のアミノ酸の修飾によるＦｃ領域の修飾により、抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力が増大しかつ／または抗体のＦｃγ受容体に対する親和性が増大する。このアプローチは、ＰＣＴ公開、国際公開第００／４２０７２号論説（Ｐｒｅｓｔａによる）にさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対する結合部位がマッピングされており、かつ結合が改善された変異体についての記載がなされている（Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ．Ｌ．ら（２００１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４頁を参照）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特異的変異がＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善することが示された。さらに、以下の変異体の組み合わせ、すなわちＴ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４ＡがＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善することが示された。
さらに別の態様では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体が作製されうる（すなわち抗体におけるグリコシル化が失われる）。グリコシル化の改変により、例えば抗体の抗原に対する親和性が増大しうる。かかる炭水化物修飾は、例えば抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を改変することによりなされうる。例えば、１つ以上のアミノ酸置換がなされうる結果、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去によりその部位でのグリコシル化が失われる。かかるアグリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性が増大しうる。かかるアプローチは、米国特許第５，７１４，３５０号明細書および米国特許第６，３５０，８６１号明細書（Ｃｏらに付与）にさらに詳述されている。グリコシル化を改変するためのさらなるアプローチが、Ｈａｎａｉらに交付された米国特許第７，２１４，７７５号明細書、Ｐｒｅｓｔａに交付された米国特許第６，７３７，０５６号明細書、Ｐｒｅｓｔａに交付された米国特許出願公開第２００７００２０２６０号明細書、Ｄｉｃｋｅｙらに交付されたＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０８４９２６号論説、Ｚｈｕらに交付されたＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０８９２９４号論説、およびＲａｖｅｔｃｈらに交付されたＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０５５９１６号論説においてさらに詳述されており、これら各々はその全体が参照により本明細書中に援用される。
典型的な一態様では、１９Ａ３抗体のＶＨ鎖のＣＤＲ２領域内のグリコシル化部位がＮ５７Ｑ突然変異の導入により除去され（実施例１を参照）、配列番号６１で示されるＶＨアミノ酸配列を有する組換え抗体ＣＤ２２．２が得られた。
さらにまたはかわりに、グリコシル化の改変タイプを有する抗体、例えば減量されたフコシル残基を有する低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体または増強されたＧｌｃＮａｃ二分構造を有する抗体が作製されうる。かかる改変されたグリコシル化パターンにより、抗体のＡＤＣＣ能力が増大することが示されている。かかる炭水化物修飾は、例えばグリコシル化機構が改変された宿主細胞内で抗体を発現することにより行われうる。グリコシル化機構が改変された細胞については当該技術分野で記載がなされており、本開示の組換え抗体を発現することによりグリコシル化が、改変抗体が産生される宿主細胞として用いられうる。例えば、細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９は、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９細胞系内で発現される抗体がその炭水化物上にフコースを含まないように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（α（１、６）フコシルトランスフェラーゼ）を含まない。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９ ＦＵＴ８−／−細胞系は、２つの置換ベクターを用いたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞内での標的化されたＦＵＴ８遺伝子の破壊により作製された（Ｙａｍａｎｅらによる米国特許出願公開第２００４０１１０７０４号明細書およびＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら（２００４年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４−２２頁を参照）。別の例として、Ｈａｎａｉらによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、機能的に破壊されたフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系について記載している。かかる細胞系内で発現される抗体は、α１，６結合に関連した酵素の低減または除去により低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を示す。Ｈａｎａｉらは、フコースを抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンに添加するのに低い酵素活性を有するかまたは酵素活性を有することのない細胞系、例えばラット骨髄腫細胞系ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）についても記載している。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開、国際公開第０３／０３５８３５号論説には、フコースをＡｓｎ（２９７）に連結された炭水化物に結合させる能力が低下した（その宿主細胞内で発現される抗体の低フコシル化ももたらす）変異ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃ１３細胞について記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ．Ｌ．ら（２００２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０頁も参照）。米国特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／０５８５３号明細書に記載のように、修飾されたグリコシル化特性を有する抗体は鶏卵内でも産生されうる。あるいは、修飾されたグリコシル化特性を有する抗体は、植物細胞、例えばレムナ（Ｌｅｍｎａ）内で産生されうる。植物系内で抗体を産生するための方法は、２００６年８月１１日に出願されたＡｌｓｔｏｎ＆Ｂｉｒｄ ＬＬＰ代理人整理番号０４０９８９／３１４９１１に対応する米国特許出願に開示されている。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ公開、国際公開第９９／５４３４２号論説には、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えばβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を、改変された細胞系内で発現される抗体が抗体のＡＤＣＣ活性の増大をもたらすＧｌｃＮａｃ二分構造の増大を示すように発現するように改変された細胞系について記載されている（Ｕｍａｎａら（１９９９年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０頁も参照）。あるいは、抗体のフコース残基はフコシダーゼ酵素を用いて切断されうる。例えば、フコシダーゼのα−Ｌ−フコシダーゼはフコシル残基を抗体から除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ Ａ．Ｌ．ら（１９７５年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６−２３頁）。
さらにまたはかわりに、グリコシル化の改変タイプを有する抗体の作製が可能であり、ここでその改変は抗体のシアル化のレベルに関係する。かかる改変は、Ｄｉｃｋｅｙらに交付されたＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０８４９２６号論説およびＲａｖｅｔｃｈらに交付されたＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０５５９１６号論説に記載されており、それら双方はそれら全体が参照により援用される。例えば、アルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼなどのシアリダーゼとの酵素反応を用いることができる。かかる反応の条件は、一般に米国特許第５，８３１，０７７号明細書に記載されており、その全体が参照により本明細書中に援用される。適切な酵素の他の非限定例として、ノイラミニダーゼおよびＮ−グリコシダーゼＦ（それぞれＳｃｈｌｏｅｍｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５（４）、８８２−８９３頁（１９７５年）およびＬｅｉｂｉｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、３３８、５２９−５３８頁（１９９９年）に記載）が挙げられる。脱シアル化抗体が親和性クロマトグラフィーを用いてさらに精製可能である。あるいは、本方法を用い、例えばシアリルトランスフェラーゼ酵素の使用によりシアル化のレベルを上昇させることができる。かかる反応の条件は、一般にＢａｓｓｅｔら、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５１（３）、３０７−３１１頁（２０００年）に記載されている。
本開示で検討される本明細書中の抗体の別の修飾がペグ化である。抗体をペグ化することで、例えば抗体の生物学的（例えば血清）半減期が増加されうる。抗体をペグ化するため、抗体またはその断片は典型的にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１つ以上のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に結合した状態になるという条件下で反応する。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似反応性の水−可溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行われる。本明細書で用いられる「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質、例えばモノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを誘導体化するのに用いられているＰＥＧの形態のいずれかを包含するように意図されている。特定の態様では、ペグ化されるべき抗体はアグリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当該技術分野で既知であり、本開示の抗体に適用可能である。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらによる欧州特許第０１５４３１６号明細書およびＩｓｈｉｋａｗａらによる欧州特許第０４０１３８４号明細書を参照のこと。
抗体断片および抗体模倣体
本発明は、従来の抗体に限定されることなく、抗体断片および抗体模倣体の使用を通じて実施可能である。下記に詳述のように、多種多様な抗体断片および抗体模倣技術が現在では開発されており、当該技術分野で広く知られている。多数のこれら技術、例えばドメイン抗体、ナノボディ、およびユニボディでは従来の抗体構造の断片またはそれに対する他の修飾が用いられる一方、他の技術、例えば従来の抗体結合を模倣する一方、異なる機序から産生され、それを介して機能する結合構造を用いるアフィボディ、ダルピン、アンチカリン、アビマー、およびバーサボディも存在する。
ドメイン抗体（ｄＡｂ）は抗体の最小の機能結合単位であり、ヒト抗体の重鎖（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）のいずれかの可変領域に対応するものである。ドメイン抗体は約１３ｋＤａの分子量を有する。Ｄｏｍａｎｔｉｓは、完全ヒトＶＨおよびＶＬ ｄＡｂにおける一連の大規模かつ高度に機能的なライブラリ（各ライブラリ内に１００億超の異なる配列）を開発しており、これらのライブラリを用いて治療標的に特異的なｄＡｂを選択する。多数の従来の抗体に対し、ドメイン抗体は細菌、酵母、および哺乳類細胞系内で十分に発現される。ドメイン抗体およびその産生方法のさらなる詳細については、米国特許第６，２９１，１５８号明細書；米国特許第６，５８２，９１５号明細書；米国特許第６，５９３，０８１号明細書；米国特許第６，１７２，１９７号明細書；米国特許第６，６９６，２４５号明細書；米国特許出願公開第２００４／０１１０９４１号明細書；欧州特許出願第１４３３８４６号明細書および欧州特許第０３６８６８４号明細書および欧州特許第０６１６６４０号明細書；国際公開第０５／０３５５７２号論説、国際公開第０４／１０１７９０号論説、国際公開第０４／０８１０２６号論説、国際公開第０４／０５８８２１号論説、国際公開第０４／００３０１９号論説および国際公開第０３／００２６０９号論説の参照により得られうる（これら各々はその全体が参照により本明細書中に援用される）。
ナノボディは、天然の重鎖抗体の固有の構造および機能特性を有する抗体由来の治療タンパク質である。これらの重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）および２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を有する。重要なことには、クローニングされ、単離されたＶＨＨドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合能を内在する完全に安定的なポリペプチドである。ナノボディは、ヒト抗体のＶＨドメインとの高い相同性を有し、かつ活性の任意の低下を伴うことなくさらにヒト化されうる。重要なことには、ナノボディは免疫原性の低い可能性を有し、霊長動物試験でナノボディのリード化合物を用いて確認されている。
ナノボディでは、従来の抗体の利点を小分子薬物の重要な特徴と組み合わされる。ナノボディは、従来の抗体と同様、その標的および低い固有の毒性に対し、高い標的特異性、高親和性を示す。しかし、ナノボディは、小分子薬物と同様、酵素を阻害し、受容体のクレフト（ｃｌｅｆｔ）に容易に接近可能である。さらに、ナノボディは極めて安定的であり、注射以外の手段で投与可能であり（例えば国際公開第０４／０４１８６７号論説を参照（その全体が参照により本明細書中に援用される）、製造が容易である。ナノボディの他の利点は、小さいサイズに起因するまれであるかまたは隠されたエピトープの認識、タンパク質標的の空洞または活性部位へのその固有の三次元構造に起因する高い親和性および選択性による結合性、薬物形式の柔軟性、半減期の調整ならびに薬物発見の容易性および速度を含む。
ナノボディは、単一の遺伝子によりコードされ、ほぼすべての原核生物および真核生物宿主、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば米国特許第６，７６５，０８７号明細書を参照（その全体が参照により本明細書中に援用される））、カビ（例えばコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ））ならびに酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ））（例えば米国特許第６，８３８，２５４号明細書を参照（その全体が参照により本明細書中に援用される））において効率的に産生される。産生プロセスは拡張可能であり、数キログラム量のナノボディが産生されている。ナノボディは、従来の抗体と比べて優れた安定性を示すことから、貯蔵寿命が長く即使用可能な溶液として調製可能である。
ナノクローン（Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ）法（例えば国際公開第０６／０７９３７２号論説を参照（その全体が参照により本明細書中に援用される））は、Ｂ細胞の自動化された高スループットな選択に基づき所望の標的に対するナノボディを産生するための独自の方法であり、場合により本発明との関連で用いられうる。
ユニボディは別の抗体断片技術であるが、この技術はＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去に基づくものである。ヒンジ領域の欠失により、従来のＩｇＧ４抗体に対して本質的に半分のサイズでありかつＩｇＧ４抗体の二価結合領域ではなく一価結合領域を有する分子が生成される。ＩｇＧ４抗体が不活性であることから免疫系と相互作用することがないことも周知であり、これは免疫応答が望ましくない場合の疾患の治療において有利な場合があり、この利点はユニボディに受け継がれる。例えば、ユニボディは、その結合対象の細胞を殺傷することなく阻害または沈黙するように機能しうる。さらに、癌細胞に結合するユニボディは、それらを刺激して増殖させることはない。さらに、ユニボディが従来のＩｇＧ４抗体の約半分のサイズであることから、それは大きい固形腫瘍全体により適切な分布を示すとともに有利な有効性を発揮する可能性がある。ユニボディは、全ＩｇＧ４抗体と同様の速度で身体から除去され、その抗原に対して全抗体と同様の親和性で結合可能である。ユニボディのさらなる詳細は、特許出願国際公開第２００７／０５９７８２号論説（その全体が参照により本明細書中に援用される）の参照により得られうる。
アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）分子は、スタフィロコッカル（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうちの１つに由来する、５８−アミノ酸残基のタンパク質ドメインに基づく親和性タンパク質の新しいクラスを表す。この３つのヘリックスバンドル（ｈｅｌｉｘ ｂｕｎｄｌｅ）ドメインはコンビナトリアルファージミドライブラリの作成物における足場として用いられており、それから所望の分子を標的にするアフィボディ変異体がファージディスプレイ技術を用いて選択されうる（Ｎｏｒｄ Ｋ．、Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ Ｅ．、Ｒｉｎｇｄａｈｌ Ｊ．、Ｓｔａｈｌ Ｓ．、Ｕｈｌｅｎ Ｍ．、Ｎｙｇｒｅｎ Ｐ．Ａ．、「Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ ａｎ α−ｈｅｌｉｃａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｏｍａｉｎ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９７年；１５：７７２−７頁、Ｒｏｎｍａｒｋ Ｊ．、Ｇｒｏｎｌｕｎｄ Ｈ．、Ｕｈｌｅｎ Ｍ．、Ｎｙｇｒｅｎ Ｐ．Ａ．、「Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ（ＩｇＡ）−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ」、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００２年；２６９：２６４７−５５頁）。アフィボディ分子におけるその低い分子量（６ｋＤａ）とともに単純で強固な構造により、それが例えば検出試薬のような多種多様な用途に適するようになり（Ｒｏｎｍａｒｋ Ｊ．、Ｈａｎｓｓｏｎ Ｍ．、Ｎｙｇｒｅｎ Ｔ．ら、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｆｆｉｂｏｄｙ−Ｆｃ ｃｈｉｍｅｒａｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００２年；２６１：１９９−２１１頁）、かつ受容体相互作用が阻害される（Ｓａｎｄｓｔｏｒｍ Ｋ．、Ｘｕ Ｚ．、Ｆｏｒｓｂｅｒｇ Ｇ．、Ｎｙｇｒｅｎ Ｐ．Ａ．、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ２８−ＣＤ８０ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｂｙ ａ ＣＤ２８−ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｂｏｄｙ ｌｉｇａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ２００３年；１６：６９１−７頁）。アフィボディおよびそれを産生する方法のさらなる詳細が、米国特許第５，８３１，０１２号明細書により得られうる（その全体が参照により本明細書中に援用される）。
標識されたアフィボディは、多数のアイソフォームを判定するためのイメージング用途においても有用でありうる。
ダルピン（設計されたアンキリンリピートタンパク質）は、非抗体ポリペプチドの結合能を用いるように開発された抗体模倣ＤＲＰ（設計されたリピートタンパク質）技術の一例である。アンキリンまたはロイシンリッチのリピートタンパク質などのリピートタンパク質は、偏在する結合分子であり、抗体と異なり細胞内および細胞外に生じる。それら固有のモジュール構造は、構造単位の反復（リピート）を特徴とし、共に蓄積され、可変でかつモジュール式の標的に結合する表面を示す伸長されたリピートドメインが形成される。このモジュール性に基づき、非常に多様化された結合特異性を有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリが生成されうる。この方法は、可変の表面残基およびリピートドメインへのランダムアセンブリを示す自家和合性リピートに共通の設計を含む。
ダルピンは、細菌発現系内で極めて高収量に産生可能であり、既知の最も安定なタンパク質に属する。ヒト受容体、サイトカイン、キナーゼ、ヒトプロテアーゼ、ウイルスおよび膜タンパク質を含む広範囲の標的タンパク質に対して極めて特異的な高親和性のダルピンが選択されている。１桁のナノモル〜ピコモルの範囲内の親和性を有するダルピンが得られうる。
ダルピンは、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、チップ用途、親和性精製またはウエスタンブロッティングを含む広範囲の用途で用いられている。ダルピンは、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合された細胞内マーカータンパク質としての細胞内区画内で活性が高いことも判明した。ダルピンは、ｐＭ範囲内のＩＣ５０でウイルスの侵入を阻害するのにさらに用いられた。ダルピンは、タンパク質−タンパク質相互作用の遮断に望ましいだけでなく酵素の阻害に望ましい。プロテアーゼ、キナーゼおよびトランスポーターの阻害に奏功しており、ほとんどの場合、アロステリック阻害様式である。腫瘍に対する極めて迅速で特異的な濃縮および極めて好ましい腫瘍対血液比により、インビボでの診断的または治療的アプローチに十分に適合するダルピンが作製される。
ダルピンおよび他のＤＲＰ技術に関するさらなる情報が、米国特許出願公開第２００４／０１３２０２８号明細書および国際特許出願公開、国際公開第０２／２０５６５号論説に見出されうる（それら双方はそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。
アンチカリンはさらなる抗体模倣技術であるが、この場合、結合特異性は、ヒト組織内および体液中で自然にかつ豊富に発現される低分子量タンパク質のファミリーであるリポカリンに由来する。リポカリンは、進化することで、化学的感受性があるかまたは不可溶性の化合物の生理的輸送および保存に関連したインビボでの機能の範囲を果たしている。リポカリンは、タンパク質の一末端で４つのループを支持する高度に保存されたβ−バレルを含む強固な固有の構造を有する。これらのループは結合ポケットに対する入口（ｅｎｔｒａｎｃｅ）を形成し、分子のこの部分における高次構造上の差は各リポカリン間の結合特異性におけるばらつきを示している。
保存されたβシートフレームワークにより支持される超可変ループの全体構造から免疫グロブリンが連想されるが、リポカリンはサイズの観点で抗体とはかなり異なり、単一の免疫グロブリンドメインよりもわずかに大きい１６０〜１８０個のアミノ酸の単一のポリペプチド鎖からなる。
リポカリンはクローニングされ、アンチカリンの作製のため、そのループには改変がなされる。構造的に多様なアンチカリンのライブラリが生成されており、アンチカリンの提示は、結合機能の選択およびスクリーニング、それに続く、原核系または真核系におけるさらなる分析のための可溶性タンパク質の発現および産生を可能にする。試験によると、仮想的に任意のヒト標的タンパク質に特異的なアンチカリンの開発が可能で、その単離が可能であり、ナノモルのまたはより高い範囲での結合親和性が得られうることを示すことに奏功している。
アンチカリンは、二重標的化された（ｄｕａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）タンパク質、いわゆるデュオカリンとしても形式化されうる。デュオカリンは、標準の作製プロセスを用いて１つの容易に生成される単量体タンパク質内の２つの別々の治療標的に結合する一方、その２つの結合ドメインの構造的方向性にかかわらず標的の特異性および親和性を保持する。
単一の分子を通じての複数の標的の調節は、２つ以上の病原因子を含むことで知られる疾患において特に有利である。さらに、デュオカリンなどの二価または多価の結合形式は、疾患における細胞表面分子の標的化において有意な可能性を有し、シグナル伝達経路に対して作動効果を媒介するか、または細胞表面受容体の結合およびクラスタリングを介して内在化効果の増大を誘発する。さらに、デュオカリンの固有の高い安定性は単量体アンチカリンに匹敵し、デュオカリンに対して柔軟な製剤および送達の可能性をもたらす。
アンチカリンに関するさらなる情報が、米国特許第７，２５０，２９７号明細書および国際特許出願公開番号、国際公開第９９／１６８７３号論説に見出されうる（それら双方はそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。
本発明との関連で有用な別の抗体模倣技術がアビマーである。アビマーは、インビトロでのエクソンシャッフリングおよびファージディスプレイによりヒト細胞外受容体ドメインの大きいファミリーから進化したものであり、結合および阻害特性を備えた多重ドメインタンパク質を生成する。複数の独立した結合ドメインの連結により結合活性がもたらされることが示されており、結果として従来の単一のエピトープ結合タンパク質に対して親和性および特異性が改善される。他の有望な利点として、大腸菌内での多重標的に特異的な分子の単純かつ効率的な産生、プロテアーゼに対する改善された熱安定性および耐性が挙げられる。ナノメートル以下の親和性を有するアビマーが種々の標的に対して得られている。
アビマーに関するさらなる情報が、米国特許出願公開第２００６／０２８６６０３号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２３４２９９号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２２３１１４号明細書、米国特許出願公開第２００６／０１７７８３１号明細書、米国特許出願公開第２００６／０００８８４４号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２２１３８４号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１６４３０１号明細書、米国特許出願公開第２００５／００８９９３２号明細書、米国特許出願公開第２００５／００５３９７３号明細書、米国特許出願公開第２００５／００４８５１２号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１７５７５６号明細書に見出されうる（それらすべてはそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。
バーサボディは、本発明との関連で利用可能な別の抗体模倣技術である。バーサボディは、１５％を超えるシステインを有する３〜５ｋＤａの小さいタンパク質であり、高いジスルフィド密度の足場を形成し、典型的なタンパク質が有する疎水性コアの代わりとなる。疎水性コアを含む多数の疎水性アミノ酸の少数のジスルフィドとの置換により、より小さくより親水性が高く（低下した凝集および非特異的結合）、プロテアーゼおよび熱に対してより耐性があり、かつＭＨＣ提示の大部分に寄与する残基が疎水性であることからより低いＴ細胞エピトープの密度を有するタンパク質が生成される。これらの特性の４つすべてが免疫原性に作用することで周知であり、それらは共に免疫原性の大幅な低下の原因になると予想される。
バーサボディについての着想は、ヒル、ヘビ、クモ、サソリ、カタツムリ、およびアネモネにより生成される天然の注射可能な生物医薬品から得られるものであり、予想外に低い免疫原性を示すことが知られている。選択された天然タンパク質ファミリーから、サイズの設計およびスクリーニングにより、疎水性、タンパク質分解の抗原プロセシング、およびエピトープ密度が注射可能な天然タンパク質における平均を大幅に下回るレベルまで最小化される。
バーサボディの構造を仮定すると、これらの抗体模倣体は多価、多重特異性、半減期機構の多様性、組織標的化モジュールおよび抗体Ｆｃ領域の非存在を含む多目的形式を提供する。さらに、バーサボディは、高収量で大腸菌内で作製され、かつ、バーサボディはその親水性および小サイズ故に可溶性が高く、高濃度に調製されうる。バーサボディは、特に熱安定的であり（それは沸騰可能であり）、長い貯蔵寿命をもたらす。
バーサボディに関するさらなる情報が、米国特許出願公開第２００７／０１９１２７２号明細書に見出されうる（その全体が参照により本明細書中に援用される）。
上で提供された抗体断片および抗体模倣技術の詳細な説明は、本明細書との関連で用いられうるあらゆる技術の包括的リストであるように意図されていない。例えば、また限定を目的としない場合、他のポリペプチドに基づく技術、例えばＱｕｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５（８）９２１−９２９頁（２００７年）（その全体が参照により本明細書中に援用される）で概説された相補性決定領域の融合、ならびに核酸に基づく技術、例えば米国特許第５，７８９，１５７号明細書、米国特許第５，８６４，０２６号明細書、米国特許第５，７１２，３７５号明細書、米国特許第５，７６３，５６６号明細書、米国特許第６，０１３，４４３号明細書、米国特許第６，３７６，４７４号明細書、米国特許第６，６１３，５２６号明細書、米国特許第６，１１４，１２０号明細書、米国特許第６，２６１，７７４号明細書、および米国特許第６，３８７，６２０号明細書（これらのすべては参照により本明細書中に援用される）に記載のＲＮＡアプタマー技術を含む種々のさらなる技術が本発明との関連で利用可能である。
抗体の物理的特性
本開示の抗体は、抗ＣＤ２２抗体の様々な物理的特性によりさらに特徴づけられうる。様々なアッセイ法を用い、これらの物理的特性に基づいて抗体の異なるクラスの検出および／または識別が可能である。
いくつかの態様では、本開示の抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかにおいて１つ以上のグリコシル化部位を有しうる。可変領域内に１つ以上のグリコシル化部位が存在する結果、抗原結合の改変により抗体の免疫原性または抗体のｐＫの変化が増大しうる（Ｍａｒｓｈａｌｌら（１９７２年）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１：６７３−７０２頁；Ｇａｌａ Ｆ．Ａ．およびＭｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．Ｌ．（２００４年） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：５４８９−９４頁；Ｗａｌｌｉｃｋら（１９８８年）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６８：１０９９−１０９頁；Ｓｐｉｒｏ Ｒ．Ｇ．（２００２年）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：４３Ｒ−５６Ｒ；Ｐａｒｅｋｈら（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ ３１６：４５２−７頁；Ｍｉｍｕｒａら（２０００年）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７：６９７−７０６頁）。グリコシル化はＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を有するモチーフで生じることが知られている。可変領域のグリコシル化はグライコブロット（Ｇｌｙｃｏｂｌｏｔ）アッセイ法を用いて試験可能であり、同アッセイ法では、抗体の切断によりＦａｂが産生され、次いで過ヨウ素酸酸化およびシッフ（Ｓｃｈｉｆｆ）塩基形成を測定するアッセイ法を用いてグリコシル化が試験される。あるいは、可変領域のグリコシル化はディオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）光クロマトグラフィー（ディオネックス−ＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ−ＬＣ））を用いて試験可能であり、そこでは糖類がＦａｂから切断されて単糖類にされ、各糖類の含量が分析される。いくつかの例では、可変領域のグリコシル化を有することのない抗ＣＤ２２抗体を有することが好ましい。これは、可変領域内にグリコシル化モチーフを有することのない抗体を選択するかまたはグリコシル化モチーフ内の残基を当該技術分野で周知の標準技術を用いて突然変異させることにより実現されうる。
好ましい態様では、本開示の抗体はアスパラギン異性部位を有することがない。脱アミドまたはイソアスパラギン酸効果が各々、Ｎ−ＧまたはＤ−Ｇ配列上で生じうる。脱アミドまたはイソアスパラギン酸効果の結果、主鎖ではなく側鎖のカルボキシ末端から離れてキンク構造を生成することにより抗体の安定性を低下させるイソアスパラギン酸が生成される。イソアスパラギン酸の生成は等量（ｉｓｏ−ｑｕａｎｔ）アッセイ法を用いて測定可能であり、そこでは逆相ＨＰＬＣを用いてイソアスパラギン酸についての試験が行われる。
各抗体は特有の等電点（ｐＩ）を有することになるが、一般に抗体は６〜９．５のｐＨ範囲に収まることになる。ＩｇＧ１抗体におけるｐＩは典型的には７〜９．５のｐＨ範囲内に収まり、かつＩｇＧ４抗体におけるｐＩは典型的には６〜８のｐＨ範囲内に収まる。抗体はこの範囲外のｐＩを有する場合がある。効果は一般に未知であるが、正常な範囲外のｐＩを有する抗体がインビボ条件下である程度のアンフォールディングおよび不安定性を有しうることが推定される。等電点はキャピラリー等電点電気泳動アッセイ法を用いて試験可能であり、それはｐＨ勾配を生成し、そこでは精度向上のためにレーザー集光が用いられうる（Ｊａｎｉｎｉら（２００２年）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２３：１６０５−１１頁；Ｍａら（２００１年）Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ ５３：Ｓ７５−８９頁；Ｈｕｎｔら（１９９８年）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ ８００：３５５−６７頁）。いくつかの例では、正常な範囲内に収まるｐＩ値を有する抗ＣＤ２２抗体を有することが好ましい。これは正常な範囲内のｐＩを有する抗体を分泌するかまたは帯電した表面残基を当該技術分野で周知の標準の技術を用いて突然変異することによりなされうる。
各抗体は、熱安定性を示す融解温度を有することになる（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ Ｒ．およびＭａｎｎｉｎｇ Ｍ．Ｃ．（２００２年）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３：３６１−７１頁）。より高い熱安定性は、インビボで全体的により高い抗体安定性を示す。抗体の融解点は、示差走査熱量測定などの技術を用いて測定されうる（Ｃｈｅｎら（２００３年）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２０：１９５２−６０頁；Ｇｈｉｒｌａｎｄｏら（１９９９年）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ６８：４７−５２頁）。ＴＭ１は抗体の初期のアンフォールディングの温度を示す。ＴＭ２は抗体の完全なアンフォールディングの温度を示す。一般に、本開示の抗体のＴＭ１が６０℃超、好ましくは６５℃超、さらにより好ましくは７０℃超であることが好ましい。あるいは、抗体の熱安定性は円二色性を用いて測定されうる。（Ｍｕｒｒａｙら（２００２年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｓｃｉ ４０：３４３−９頁）。
好ましい態様では、急速に分解することのない抗体が選択される。抗ＣＤ２２抗体の断片化は、当該技術分野で十分に理解されているようにキャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて測定されうる（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ａ．Ｊ．およびＨｕｇｈｅｓ Ｄ．Ｅ．（１９９５年）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ６７：３６２６−３２頁）。
別の好ましい態様では、最小の凝集効果を有する抗体が選択される。凝集が、望ましくない免疫応答および／または改変されるかもしくは好ましくない薬物動態学的特性の誘因となりうる。一般に、抗体では、２５％以下、好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１５％以下、さらにより好ましくは１０％以下およびさらにより好ましくは５％以下の凝集が許容される。凝集は、単量体、二量体、三量体または多量体を同定するためのサイズ排除カラム（ＳＥＣ）高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および光散乱を含む、当該技術分野で周知のいくつかの技術により測定されうる。
抗体を改変する方法
上で考察のように、本明細書中に開示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する抗ＣＤ２２抗体を用い、ＶＨおよび／またはＶＬ配列またはそれらに結合される定常領域を修飾することにより、新しい抗ＣＤ２２抗体の産生が可能である。したがって、本開示の別の局面では、本開示の抗ＣＤ２２抗体、例えば１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６の構造的特徴を用い、ヒトＣＤ２２への結合など、本開示の抗体の少なくとも１つの機能特性を保持する構造的に関連した抗ＣＤ２２抗体が産生される。例えば、上で考察のように、１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６またはそれらの変異体のうちの１つ以上のＣＤＲ領域を既知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組換え的に結合させることで、組換え操作されたさらなる本開示の抗ＣＤ２２抗体の作製が可能である。修飾の他のタイプとして、前セクションに記載のタイプが挙げられる。改変方法における出発原料は、本明細書中に提供される１つ以上のＶＨおよび／もしくはＶＬ配列またはそれらの１つ以上のＣＤＲ領域である。改変抗体を作製するのに、本明細書中に提供される１つ以上のＶＨおよび／もしくはＶＬ配列またはそれらの１つ以上のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわちタンパク質として発現させる）必要はない。それに対し、配列内に含まれる情報を出発原料として用い、元の配列に由来する「第二世代」配列が作製され、次いで「第二世代」配列が調製され、タンパク質として発現される。
したがって、別の態様では、本開示は、抗ＣＤ２２抗体を調製するための方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号１〜４および６３〜６５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号５〜８、６０および６６〜６８からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号９〜１２および６９〜７１からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列；ならびに／あるいは（ｉｉ）配列番号１３〜１８および７２〜７４からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１９〜２４および７５〜７７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号２５〜３０および７８〜８０からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供する工程と、
（ｂ）重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列の内部の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変し、少なくとも１つの改変抗体配列を作製する工程と、
（ｃ）改変抗体配列をタンパク質として発現する工程と、
を含む方法を提供する。
例えば、標準の分子生物学技術を用い、改変抗体配列の調製および発現が可能である。
好ましくは、改変された抗体配列によりコードされる抗体は、本明細書中に記載の抗ＣＤ２２抗体の機能特性のうちの１つ、一部または全部を保持する抗体であり、ここでの機能特性は、限定はされないが、
（ａ）ＣＤ２２＋細胞に内在化し、
（ｂ）ＣＤ２２＋細胞に対してＡＤＣＣ活性を示し、
（ｃ）ＢＣＲ刺激により誘発されるＲａｍｏｓ細胞の細胞死を促進し、
（ｄ）Ｒａｍｏｓ細胞に対する直接の抗増殖効果を有することなく、
（ｄ）Ｒａｍｏｓ細胞へのカルシウム流入を誘発せず、
（ｅ）Ｒａｍｏｓ細胞に対するＣＤＣ活性を媒介せず、かつ／または
（ｆ）細胞毒素に結合される場合、インビボでＣＤ２２発現細胞の成長を阻害する
という機能特性を含む。
改変抗体の機能特性は、当該技術分野で使用可能でありかつ／または本明細書中に記載の標準アッセイ法、例えば実施例で示されるアッセイ法を用いて評価可能である。
本開示の抗体を改変する方法の特定の態様では、変異が、抗ＣＤ２２抗体のコード配列の全部もしくは一部に沿ってランダムまたは選択的に導入可能であり、かつ、得られる修飾された抗ＣＤ２２抗体における結合活性および／または本明細書中に記載の他の機能特性についてスクリーニング可能である。突然変異方法については当該技術分野で記載がなされている。例えば、ＳｈｏｒｔによるＰＣＴ公開、国際公開第０２／０９２７８０号論説では、抗体変異を飽和突然変異誘発、合成的ライゲーションアセンブリー（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）またはそれらの組み合わせを用いて作製しスクリーニングするための方法が記載されている。あるいは、ＬａｚａｒらによるＰＣＴ公開、国際公開第０３／０７４６７９号論説では、コンピュータによるスクリーニング方法を用いて抗体の生理化学的特性を最適化する方法が記載されている。
本開示の抗体をコードする核酸分子
本開示の別の局面は、本開示の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞内に、細胞溶解液中にまたは部分精製形態もしくは実質的に純粋な形態で存在しうる。核酸は、当該技術分野で周知のアルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動およびその他を含む標準技術により、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば他の細胞核酸もしくはタンパク質から除去精製される場合、「単離される」かまたは「実質的に純粋な状態にされる」。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８７年）「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）のＧｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅを参照のこと。本開示の核酸が例えばＤＮＡまたはＲＮＡでありうるとともに、イントロン配列を有するかまたは有しない場合がある。好ましい態様では核酸はｃＤＮＡ分子である。
本開示の核酸は、標準の分子生物学技術を用いて得られうる。ハイブリドーマ（例えばさらに下記のヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ）により発現される抗体においては、ハイブリドーマにより作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡが標準のＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得られうる。（例えばファージディスプレイ技術を用いる）免疫グロブリン遺伝子ライブラリから得られる抗体については、かかる抗体をコードする核酸が遺伝子ライブラリから回収されうる。
本開示の好ましい核酸分子は、１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードするものである。１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、１６Ｆ７、２３Ｃ６、ＣＤ２２．２、４Ｇ６および２１Ｆ６のＶＨ配列をコードするＤＮＡ配列はそれぞれ配列番号４１〜４４、６２および８７〜８９で示される（ここで１９Ａ３およびＣＤ２２．１の重鎖は同一でありかつ配列番号４２に対応し、ＣＤ２２．２の重鎖は配列番号６２に対応し、かつ２１Ｆ６の重鎖は配列番号８２および８３に対応する）。１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７、２３Ｃ６、４Ｇ６および２１Ｆ６のＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列はそれぞれ配列番号４５〜５０および９０〜９２で示される（ここで１９Ａ３、ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２のκ軽鎖は同一でありかつ配列番号４６に対応し、１６Ｆ７のκ軽鎖は配列番号４７または４８のいずれかに対応し、２３Ｃ６のκ軽鎖は配列番号４９または５０のいずれかに対応し、かつ４Ｇ６のκ軽鎖は配列番号９０または９１のいずれかに対応する）。
一旦ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片を標準の組換えＤＮＡ技術によりさらに操作することで、例えば可変領域遺伝子が完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換されうる。これらの操作では、ＶＬもしくはＶＨをコードするＤＮＡ断片が別のタンパク質、例えば抗体の定常領域またはフレキシブルリンカー（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。これに関連して用いられる「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片が２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームに保持するように連結されることを意味するように意図されている。
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより完全長重鎖遺伝子に変換されうる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で既知であり（例えばＫａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片が標準のＰＣＲ増幅により得られうる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＱ１、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域でありうるが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、ＶＨをコードするＤＮＡは重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結されうる。
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより完全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換されうる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で既知であり（例えばＫａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準のＰＣＲ増幅により得られうる。好ましい態様では、軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域でありうる。
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するのに、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片がフレキシブルリンカー、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結されることで、ＶＨおよびＶＬ配列はフレキシブルリンカーで連結されたＶＬおよびＶＨ領域を有する隣接した一本鎖タンパク質として発現されうる（例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６頁；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３頁；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０年）、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４頁を参照）。
本開示のモノクローナル抗体の産生
本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体の方法、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５頁の標準の体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む種々の技術により産生可能である。原理上、体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、モノクローナル抗体を産生するための他の技術、例えばＢリンパ球のウイルス性または発癌性の形質転換が用いられうる。
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ生成は極めて十分に確立された方法である。融合のために免疫化された脾細胞を単離するための免疫プロトコルおよび技術は当該技術分野で既知である。融合相手（例えばマウス骨髄腫細胞）および融合方法についても既知である。
本開示のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製される非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて調製されうる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的の非ヒトハイブリドーマから得られ、標準の分子生物学技術を用いて非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を有するように改変されうる。例えば、キメラ抗体を作製するため、マウス可変領域は当該技術分野で既知の方法を用いてヒト定常領域に連結されうる（例えばＣａｂｉｌｌｙらに交付された米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。ヒト化抗体を作製するため、マウスＣＤＲ領域は当該技術分野で既知の方法を用いてヒトフレームワークに挿入されうる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒに交付された米国特許第５，２２５，５３９号明細書ならびにＱｕｅｅｎらに交付された米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
好ましい態様では、本開示の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ＣＤ２２に特異的なかかるヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックまたはトランスクロモゾームマウスを用いて産生されうる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモゾームマウスは、本明細書中で各々ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）およびＫＭマウス（登録商標）と称されるマウスを含み、本明細書中で総称して「ヒトＩｇマウス」と称される。
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ（登録商標），Ｉｎｃ．）は、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化された変異とともに未転位のヒト重鎖（μおよびγ）ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｉ）を有する（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら １９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９頁を参照）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低下を示し、免疫に応答し、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子がクラススイッチおよび体細胞突然変異を受け、高親和性のヒトＩｇＧκモノクローナル抗体が産生される（Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ．ら（１９９４年）上記；Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ．（１９９４年）「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」１１３：４９−１０１頁にレビュー；Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ．およびＨｕｓｚａｒ Ｄ．（１９９５年）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３頁；ならびにＨａｒｄｉｎｇ Ｆ．およびＬｏｎｂｅｒｇ Ｎ．（１９９５年）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６頁）。ＨｕＭａｂマウス（登録商標）の調製および使用ならびにかかるマウスにより保有されるゲノム修飾については、Ｔａｙｌｏｒ Ｌ．ら（１９９２年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７−６２９５頁；Ｃｈｅｎ Ｊ．ら（１９９３年）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７−６５６頁；Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３７２０−３７２４頁；Ｃｈｏｉら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１７−１２３頁；Ｃｈｅｎ Ｊ．ら（１９９３年）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：８２１−８３０頁；Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０頁；Ｔａｙｌｏｒ Ｌ．ら（１９９４年）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９−５９１頁；ならびにＦｉｓｈｗｉｌｄ Ｄ．ら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１頁にさらに記載されている（これらすべての内容はそれら全体が参照により本明細書中に具体的に援用される）。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号明細書；米国特許第５，５６９，８２５号明細書；米国特許第５，６２５，１２６号明細書；米国特許第５，６３３，４２５号明細書；米国特許第５，７８９，６５０号明細書；米国特許第５，８７７，３９７号明細書；米国特許第５，６６１，０１６号明細書；米国特許第５，８１４，３１８号明細書；米国特許第５，８７４，２９９号明細書；および米国特許第５，７７０，４２９号明細書（すべてはＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに交付）、Ｓｕｒａｎｉらに交付された米国特許第５，５４５，８０７号明細書；ＰＣＴ公開、国際公開第９２／０３９１８号論説、国際公開第９３／１２２２７号論説、国際公開第９４／２５５８５号論説、国際公開第９７／１３８５２号論説、国際公開第９８／２４８８４号論説および国際公開第９９／４５９６２号論説（すべてはＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに交付）、ならびにＫｏｒｍａｎらに交付されたＰＣＴ公開、国際公開第０１／１４４２４号論説を参照のこと。
別の態様では、本開示のヒト抗体は、導入遺伝子およびトランスクロモゾーム上でヒト免疫グロブリン配列を保有するマウス、例えばヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖トランスクロモゾームを保有するマウスを用いて産生されうる。このマウスは、本明細書中で「ＫＭマウス（登録商標）」と称され、Ｉｓｈｉｄａらに交付されたＰＣＴ公開、国際公開第０２／４３４７８号論説に詳述されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランスジェニック動物系は当該技術分野で使用可能であり、その使用により、本開示の抗ＣＤ２２抗体が産生されうる。例えば、キセノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）として称される他のトランスジェニック系の使用が可能であり、かかるマウスは、例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらに交付された米国特許第５，９３９，５９８号明細書；米国特許第６，０７５，１８１号明細書；米国特許第６，１１４，５９８号明細書；米国特許第６，１５０，５８４号明細書および米国特許第６，１６２，９６３号明細書に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランスクロモゾーム動物系は当該技術分野で使用可能であり、その使用により、本開示の抗ＣＤ２２抗体の産生が可能である。例えば、「ＴＣマウス」と称される、ヒト重鎖トランスクロモゾームとヒト軽鎖トランスクロモゾームとの双方を保有するマウスの使用が可能であり、かかるマウスについてはＴｏｍｉｚｕｋａら（２０００年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：７２２−７２７頁に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモゾームを保有するウシについての記載が当該技術分野でなされており（例えば、Ｋｕｒｏｉｗａら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：８８９−８９４頁およびＰＣＴ出願の国際公開第２００２／０９２８１２号論説）、その使用により、本開示の抗ＣＤ２２抗体の産生が可能である。
本開示のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を用いても調製可能である。ヒト抗体を単離するためのかかるファージディスプレイ法は、当該技術分野で確立されたものである。例えば、Ｌａｄｎｅｒらに交付された米国特許第５，２２３，４０９号明細書；米国特許第５，４０３，４８４号明細書；および米国特許第５，５７１，６９８号明細書；Ｄｏｗｅｒらに交付された米国特許第５，４２７，９０８号明細書および米国特許第５，５８０，７１７号明細書；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらに交付された米国特許第５，９６９，１０８号明細書および米国特許第６，１７２，１９７号明細書；ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらに交付された米国特許第５，８８５，７９３号明細書；米国特許第６，５２１，４０４号明細書；米国特許第６，５４４，７３１号明細書；米国特許第６，５５５，３１３号明細書；米国特許第６，５８２，９１５号明細書および米国特許第６，５９３，０８１号明細書を参照のこと。
本開示のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト抗体反応が免疫化時に生成されうるようにヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを用いて調製されうる。かかるマウスは、例えばＷｉｌｓｏｎらに交付された米国特許第５，４７６，９９６号明細書および米国特許第５，６９８，７６７号明細書に記載されている。
別の態様では、ヒト抗ＣＤ２２抗体が、Ｂｕｅｃｈｌｅｒらによる米国特許第６，７９４，１３２号明細書に記載のようにヒトＩｇマウスとファージディスプレイ技術を併用して調製される。より詳細には、本方法は最初に、（上記のＨｕＭａｂマウスまたはＫＭマウスなどの）ヒトＩｇマウスにおけるマウスのＣＤ２２抗原での免疫化による抗ＣＤ２２抗体応答の生成と、その後のマウスのリンパ細胞由来のヒト抗体鎖をコードする核酸の単離およびこれらの核酸のディスプレイベクター（例えばファージ）への導入によるディスプレイパッケージのライブラリの提供を含む。したがって、各ライブラリメンバーはヒト抗体鎖をコードする核酸を含み、各抗体鎖がディスプレイパッケージから提示される。次いで、ライブラリを、ＣＤ２２抗原を用いてスクリーニングし、ＣＤ２２に特異的に結合するライブラリメンバーが単離される。次いで、選択されたライブラリメンバーの核酸挿入物が単離され、標準の方法により配列決定され、選択されたＣＤ２２結合剤の軽鎖および重鎖可変配列が決定される。可変領域は、標準の組換えＤＮＡ技術、例えば可変領域のヒト重鎖および軽鎖定常領域をＶＨ領域がＣＨ領域に動作可能に連結されかつＶＬ領域がＣＬ領域に動作可能に連結されるように保有する発現ベクターへのクローニングにより、完全長抗体鎖に変換されうる。
ヒトＩｇマウスの免疫化
ヒトＩｇマウスの使用により本開示のヒト抗体が産生される場合、かかるマウスは、Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ．ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９頁；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ Ｄ．ら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１頁；ならびにＰＣＴ公開の国際公開第９８／２４８８４号論説および国際公開第０１／１４４２４号論説に記載のように、ＣＤ２２抗原および／または組換えＣＤ２２、またはＣＤ２２を発現する細胞、またはＣＤ２２融合タンパク質の精製または濃縮された調製物で免疫化されうる。好ましくは、マウスは１回目の注入時には６〜１６週齢となる。例えば、ＣＤ２２抗原の精製または組換え調製物（５〜５０μｇ）を用い、ヒトＩｇマウスの腹腔内での免疫化が可能である。最も好ましくは、本開示の抗体の産生に用いられる免疫原は、組換えヒトＣＤ２２細胞外ドメインと細胞表面上で完全長ヒトＣＤ２２を発現するように改変されたＣＨＯ細胞の組み合わせである（実施例１でさらに記載）。
ＣＤ２２に対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するための詳細な方法が下記の実施例１に記載されている。様々な抗原を用いる試験を重ねることで、トランスジェニックマウスが、最初に完全フロインドアジュバント中の抗原で腹腔内（ＩＰ）に免疫化され、それに続き、不完全フロインドアジュバント中の抗原で隔週、最大で全６回ＩＰ免疫化される時、応答することが示されている。しかし、フロインド以外のアジュバントについても有効であることが見出されている。さらに、アジュバントの非存在下では全細胞における免疫原性が高いことが見出されている。免疫応答は、後眼窩（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ）の出血により得られる血漿試料を用いる免疫プロトコルを通して監視可能である。血漿はＥＬＩＳＡでスクリーニング可能であり（後述するように）、十分な力価の抗ＣＤ２２ヒト免疫グロブリンを有するマウスが融合において用いられうる。マウスは、屠殺および脾臓摘出の３日前、抗原で静脈内に追加免疫されうる。免疫化ごとに２〜３の融合がなされる必要がありうることが想定される。典型的にはマウス６〜２４匹が各抗原に対して免疫化される。通常、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２株の双方が用いられる。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２導入遺伝子は共に２つの異なるヒト重鎖導入遺伝子（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）を有する単一のマウスに育種されうる。その他としてまたはさらに、ＫＭマウス（登録商標）および／またはＫＭ−λＨＡＣ株が実施例１に記載のように用いられうる。
本開示のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成
本開示のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するため、免疫化されたマウス由来の脾細胞および／またはリンパ節細胞が単離され、適切な不死化細胞系、例えばマウス骨髄腫細胞系に融合されうる。生成されたハイブリドーマでは、抗原特異的な抗体の産生についてスクリーニング可能である。例えば、免疫化されたマウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液が、５０％ＰＥＧとともにＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）の数の１／６に融合されうる。あるいは、免疫マウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液は、ＣｙｔｏＰｕｌｓｅ大型チャンバ細胞融合エレクトロポレーター（メリーランド州グレンバーニー（Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ）のＣｙｔｏＰｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いる、電場に基づく電気融合法を用いて融合されうる。細胞は、平底マイクロタイタープレート内に約２×１０５でプレーティング後、２０％胎仔クローン血清、１８％「６５３」馴化培地、５％オリゲン（ｏｒｉｇｅｎ）（ＩＧＥＮ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのヘペス、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；ＨＡＴは融合の２４時間後に添加される）を含有する選択培地内で２週間インキュベートされる。約２週間後、細胞はＨＡＴがＨＴと交換された培地内で培養されうる。次いで、各ウェルにおけるヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてはＥＬＩＳＡによりスクリーニング可能である。一旦多数のハイブリドーマの成長が生じると、培地は通常１０〜１４日後に観察されうる。抗体を分泌するハイブリドーマは、再プレーティングされ、再びスクリーニングされ、依然としてヒトＩｇＧ陽性である場合、モノクローナル抗体は限界希釈により少なくとも２回サブクローニングされうる。次いで、特徴づけのため、安定なサブクローンをインビトロで培養することで、組織培地内に少量の抗体が産生されうる。
ヒトモノクローナル抗体を精製するため、選択されたハイブリドーマはモノクローナル抗体の精製用の２リットルのスピナーフラスコ内で成長されうる。親和性クロマトグラフィー前、上清がプロテインＡ−セファローズ（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）のＰｈａｒｍａｃｉａ）を用いて濾過され、濃縮される。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーで検査することで純度が保証されうる。緩衝溶液はＰＢＳに交換可能であり、濃度は１．４３の減衰係数を用い、ＯＤ２８０により判定可能である。モノクローナル抗体は、一定量に分割され、−８０℃で保存されうる。
本開示のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの生成
本開示の抗体は、例えば当該技術分野で周知のように組換えＤＮＡ技術と遺伝子形質移入方法を併用し、宿主細胞のトランスフェクトーマ内でも産生されうる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２頁）。
例えば、抗体またはその抗体断片を発現するため、部分長または完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡが標準の分子生物学技術（例えば目的の抗体を発現するハイブリドーマを用いるＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング）により得られ、ＤＮＡは、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように発現ベクターに挿入されうる。これに関連し、「作動可能に連結される」という用語は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図された機能を果たすようにベクターにライゲートされることを意味するように意図されている。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いられる発現宿主細胞と適合可能であるように選択される。
抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入されうるかまたは、より典型的には両遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準の方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上での相補的制限部位のライゲーションまたは制限部位が全く存在しない場合での平滑末端ライゲーション）により発現ベクターに挿入される。本明細書中に記載の抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用い、それらを、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターに、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結されかつＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製可能である。さらにまたはかわりに、組換え発現ベクターは、抗体鎖の宿主細胞からの分泌を促進するシグナルペプチドをコードしうる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームに連結されるようにベクターにクローニングされうる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種のシグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）でありうる。
抗体鎖遺伝子に加え、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞内で抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。「調節配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御因子（例えばポリアデニル化シグナル）を含むように意図されている。かかる調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ（「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）（１９９０年））に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が形質転換対象の宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの要素に依存しうることが当業者により理解されるであろう。哺乳類宿主細胞の発現における好ましい調節配列は、哺乳類細胞内で高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス因子、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えばアデノウィルスメジャー後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。あるいは、非ウイルス調節配列、例えばユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターが用いられうる。さらに、異なる供給源由来の配列からなる調節因子、例えばＳＲαプロモーター系は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１のＳＶ４０初期プロモーターおよび長い末端リピートに由来する配列を有するものである（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ら（１９８８年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２頁）。
抗体鎖遺伝子および調節配列に加え、本開示の組換え発現ベクターは、追加配列、例えば宿主細胞内でのベクターの複製（例えば複製の起点）を調節する配列および選択可能マーカー遺伝子を保有しうる。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号明細書、米国特許第４，６３４，６６５号明細書および米国特許第５，１７９，０１７号明細書（いずれもＡｘｅｌらに付与）を参照）。例えば典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上で薬物、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートに耐性を与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、（メトトレキセートの選択／増幅の場合にｄｈｆｒ−宿主細胞内で用いられる）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子および（Ｇ４１８の選択用の）ネオ遺伝子を含む。
軽鎖および重鎖の発現においては、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、標準技術により宿主細胞に形質移入される。「形質移入」という用語の様々な形態は、外因性ＤＮＡの原核または真核宿主細胞への導入のための一般に用いられる多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストランによる形質移入などを包含するように意図されている。原核または真核宿主細胞のいずれかにおいて本開示の抗体を発現することは理論的に可能であるが、真核細胞内および最も好ましくは哺乳類宿主細胞内での抗体の発現が、かかる真核細胞および特に哺乳類細胞が適切に折り畳まれ免疫学的に活性な抗体を構築し分泌する可能性が原核細胞よりも高いことから最も好ましい。原核生物での抗体遺伝子の発現は、高収量の活性抗体の産生にとって無効であることが報告されている（Ｂｏｓｓ，Ｍ．Ａ．およびＷｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．（１９８５年）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ６：１２−１３頁）。
本開示の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばＲ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２年）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１頁に記載のように、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに用いられる、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：４２１６−４２２０頁に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞の場合の使用においては、別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号論説（Ｗｉｌｓｏｎに付与）、国際公開第８９／０１０３６号論説（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎに付与）および欧州特許第３３８，８４１号明細書（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎに付与）に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞内での抗体の発現またはより好ましくは抗体の宿主細胞が成長される培地への分泌を実現するのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより産生される。抗体は、標準のタンパク質精製方法を用いて培地から回収されうる。
抗原に結合する抗体の特徴づけ
本発明の抗体のＣＤ２２への結合については、例えば標準ＥＬＩＳＡにより試験可能である。つまり、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中、０．２５μｇ／ｍｌで精製および／または組換えＣＤ２２（例えば実施例１で記載のＣＤ２２ ＥＣＤ）でコートし、次いでＰＢＳ中、５％ウシ血清アルブミンでブロッキングする。抗体の希釈物（例えばＣＤ２２免疫マウス由来の血漿の希釈物）を各ウェルに添加し、３７℃で１〜２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／トゥイーンで洗浄し、次いでアルカリホスファターゼに結合された二次試薬（例えばヒト抗体においてはヤギ−抗ヒトＩｇＧ Ｆｃに特異的なポリクローナル試薬）とともに３７℃で１時間インキュベートする。洗浄後、プレートをｐＮＰＰ基質（１ｍｇ／ｍｌ）で発色させ、４０５〜６５０のＯＤで分析する。好ましくは、最高の力価を生じるマウスが融合に用いられることになる。
上記のＥＬＩＳＡアッセイ法を用い、ＣＤ２２免疫原と陽性の反応性を示すハイブリドーマについてのスクリーニングも可能である。ＣＤ２２に高い結合活性で結合するハイブリドーマがサブクローニングされ、さらに特徴づけられる。各ハイブリドーマ由来の１つのクローンは、（ＥＬＩＳＡにより）親細胞の反応性を保持し、−１４０℃で保存された５〜１０のバイアルの細胞バンクの作製および抗体精製のために選択されうる。
抗ＣＤ２２抗体を精製するため、選択されたハイブリドーマを２リットルのスピナーフラスコ内で成長させ、モノクローナル抗体の精製を行ってもよい。上清を、プロテインＡ−セファローズ（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）のＰｈａｒｍａｃｉａ）を用いる親和性クロマトグラフィー前に濾過し、濃縮してもよい。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーにより検査し、純度を保証してもよい。緩衝溶液をＰＢＳに交換し、濃度を、１．４３消衰係数を用いるＯＤ２８０によって決定してもよい。モノクローナル抗体を一定量に分割し、−８０℃で保存してもよい。
選択された抗ＣＤ２２モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するか否かを判定するため、各抗体が市販の試薬（イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）のＰｉｅｒｃｅ）を用いてビオチン化されうる。未標識のモノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を用いる競合試験が、上記のようなＣＤ２２でコートされるＥＬＩＳＡプレートを用いて実施可能である。ビオチン化ｍＡｂの結合がストレプトアビジン−アルカリホスファターゼプローブで検出可能である。
精製抗体アイソタイプを判定するため、アイソタイプＥＬＩＳＡを特定のアイソタイプの抗体に対して特異的な試薬を用いて行ってもよい。例えば、ヒトモノクローナル抗体アイソタイプを判定するため、マイクロタイタープレートのウェルを１μｇ／ｍｌの抗ヒト免疫グロブリンで４℃で一晩コートしてもよい。１％ ＢＳＡでブロック後、プレートを１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体または精製されたアイソタイプ対照と周囲温度で１〜２時間反応させる。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭのいずれかに特異的なアルカリホスファターゼと結合されたプローブと反応させてもよい。プレートを発色させ、上記のように分析する。
抗ＣＤ２２ヒトＩｇＧでは、ウエスタンブロッティングにより、ＣＤ２２抗原との反応性についてさらに試験してもよい。つまり、ＣＤ２２に対し、調製し、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ってもよい。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に移し、１０％ウシ胎仔血清でブロックし、試験対象のモノクローナル抗体でプローブする。ヒトＩｇＧの結合性を、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを用いて検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質タブレット（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）を用いて発色させてもよい。
本開示の抗体の結合特異性は、例えばフローサイトメトリーにより、抗体のＣＤ２２を発現する細胞への結合を監視することによっても判定可能である。Ｄａｕｄｉ細胞またはＲａｊｉ細胞のようなＣＤ２２を自然に発現する細胞系の使用が可能であるか、または、細胞系、例えばＣＨＯ細胞系には、ＣＤ２２の膜貫通形態をコードする発現ベクターの形質移入が可能である。タグに対する抗体を用いる検出においては、形質移入されたタンパク質は、好ましくはＮ末端にタグ、例えばｍｙｃタグを含みうる。本開示の抗体のＣＤ２２への結合性は、形質移入細胞を抗体とともにインキュベートし、結合抗体を検出することにより判定可能である。形質移入されたタンパク質上での抗体のタグへの結合は、陽性対照として用いられうる。
二重特異性分子
別の局面では、本開示は、本開示の抗ＣＤ２２抗体またはその断片を含む二重特異性分子を特徴とする。本開示の抗体またはその抗原結合部分が別の機能分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えば別の抗体または受容体のリガンド）に誘導体化または連結され、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子が生成されうる。本開示の抗体が実際に２つ以上の他の機能分子に誘導体化または連結され、３つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子が生成される可能性があり、かかる多重特異性分子は本明細書で用いられる「二重特異性分子」という用語に包含されるようにも意図されている。本開示の二重特異性分子を作製するため、本開示の抗体は、二重特異性分子が生成されるように、１つ以上の他の結合分子、例えば別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｉｍｅｔｉｃ）に（例えば化学共役、遺伝子融合、非共有結合またはその他により）機能的に連結されうる。
したがって、本開示は、ＣＤ２２に対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。本開示の特定の態様では、第２の標的エピトープはＦｃ受容体、例えばヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）またはヒトＦｃα受容体（ＣＤ８９）である。したがって、本開示は、ＦｃγＲまたはＦｃαＲを発現するエフェクター細胞（例えば、単球、マクロファージまたは多形核球細胞（ＰＭＮ））とＣＤ２２を発現する標的細胞の双方に結合可能な二重特異性分子を含む。これらの二重特異性分子は、エフェクター細胞に対するＣＤ２２発現細胞を標的にし、かつ、Ｆｃ受容体媒介性のエフェクター細胞活性、例えばＣＤ２２発現細胞の食作用、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、サイトカイン放出あるいはスーパーオキシドアニオンの生成を引き起こす。
二重特異性分子が多重特異性である場合の本開示の態様では、同分子は、抗Ｆｃ結合特異性および抗ＣＤ２２結合特異性に加え、第３の結合特異性をさらに含みうる。一態様では、第３の結合特異性は、抗促進因子（ａｎｔｉ−ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ）（ＥＦ）部分、例えば細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合し、それにより標的細胞に対する免疫応答を高める分子である。「抗促進因子部分」は、所与の分子、例えば抗原または受容体に結合し、それによりＦｃ受容体または標的細胞抗原における結合決定因子の効果の促進をもたらす抗体、機能抗体断片またはリガンドでありうる。「抗促進因子部分」はＦｃ受容体または標的細胞抗原に結合しうる。あるいは、抗促進因子部分は、第１および第２の結合特異性の結合対象である実体とは異なる実体に結合しうる。例えば、抗促進因子部分は、（例えば標的細胞に対する免疫応答の増大をもたらすＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１または他の免疫細胞を介して）細胞毒性Ｔ細胞に結合しうる。
一態様では、本開示の二重特異性分子は、結合特異性として、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、または一本鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体またはその抗体断片を含む。Ｌａｄｎｅｒらに交付された米国特許第４，９４６，７７８号明細書（その全体は参照により明示的に援用される）に記載のように、抗体は、Ｆｖまたは一本鎖コンストラクトなどの軽鎖または重鎖二量体またはその任意の最小断片でもありうる。
一態様では、Ｆｃγ受容体に対する結合特異性はモノクローナル抗体により提供され、その結合はヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）により遮断されることはない。本明細書で用いられる「ＩｇＧ受容体」という用語は、染色体１上に位置する８つのγ鎖遺伝子のいずれかを示す。これらの遺伝子は、３つのＦｃγ受容体クラス：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）にグループ化された全部で１２の膜貫通または可溶性受容体アイソフォームをコードする。好ましい一態様では、Ｆｃγ受容体はヒト高親和性ＦｃγＲＩである。ヒトＦｃγＲＩは７２ｋＤａの分子であり、単量体ＩｇＧに対して高い親和性を示す（１０８〜１０９Ｍ−１）。
特定の好ましい抗Ｆｃγモノクローナル抗体の産生および特徴づけについては、Ｆａｎｇｅｒらに交付されたＰＣＴ公開、国際公開第８８／０００５２号論説および米国特許第４，９５４，６１７号明細書において記載されており、それらの教示内容は参照により本明細書中に十分に援用される。これらの抗体は受容体のＦｃγ結合部位から離れた部位でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩのエピトープに結合することから、それらの結合がＩｇＧの生理的レベルにより実質的に遮断されることはない。本開示で有用な特異的な抗ＦｃγＲＩ抗体は、ｍＡｂ２２、ｍＡｂ３２、ｍＡｂ４４、ｍＡｂ６２およびｍＡｂ１９７である。ｍＡｂ３２を産生するハイブリドーマは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ９４６９から入手可能である。他の態様では、抗Ｆｃγ受容体抗体はモノクローナル抗体２２のヒト化形態である（Ｈ２２）。Ｈ２２抗体の産生および特徴づけについては、Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｒ．Ｆ．ら（１９９５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１５５（１０）：４９９６−５００２頁およびＴｅｍｐｅｓｔらに交付されたＰＣＴ公開、国際公開第９４／１０３３２号論説に記載されている。Ｈ２２抗体産生細胞系は、ＨＡ０２２ＣＬ１の指定の下でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されたものであり、登録番号ＣＲＬ１１１７７を有する。
さらに他の好ましい態様では、Ｆｃ受容体に対する結合特異性はヒトＩｇＡ受容体、例えばＦｃ−α受容体（ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９））に結合する抗体により提供され、その結合は好ましくはヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）により遮断されることはない。「ＩｇＡ受容体」という用語は、染色体１９上に位置する１つのα遺伝子の遺伝子産物（ＦｃαＲＩ）を含むように意図されている。この遺伝子は、５〜１１０ｋＤａの数種の交互にスプライスされた膜貫通アイソフォームをコードすることが知られている。ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）は、単球／マクロファージ、好酸性および好中性顆粒球上に構成的に発現されるが、非エフェクター細胞集団上に発現されることはない。ＦｃαＲＩは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２の双方に対して中程度の親和性（約５×１０７Ｍ−１）を有し、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインへの暴露時に増加する（Ｍｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｃ．ら（１９９６年）、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６：４２３−４４０頁）。Ａ３、Ａ５９、Ａ６２およびＡ７７として同定された４つのＦｃαＲＩに特異的なモノクローナル抗体は、ＩｇＡリガンド結合ドメイン外部のＦｃαＲＩに結合するものであり、記載がなされている（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｒ．Ｃ．ら（１９９２年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１７６４頁）。
ＦｃαＲＩおよびＦｃγＲＩは、（１）主に免疫エフェクター細胞、例えば単球、ＰＭＮ、マクロファージおよび樹状細胞の上で発現され、（２）高レベルで発現され（例えば１細胞当たり５，０００〜１００，０００）、（３）細胞毒性活性のメディエーター（例えばＡＤＣＣ、食作用）であり、かつ（４）それらに対して標的とされる、自己抗原を含む抗原の抗原提示の促進を媒介することから、本開示の二重特異性分子において用いられる要因となる好ましい誘発受容体である。
ヒトモノクローナル抗体が好ましい一方、本開示の二重特異性分子において用いられうる他の抗体がマウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
本開示の二重特異性分子は、構成要素の結合特異性、例えば抗ＦｃＲおよび抗ＣＤ２２結合特異性を当該技術分野で既知の方法を用いて複合することにより調製されうる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性は、別々にもたらされ、次いで互いに結合されうる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、種々の共役剤または架橋剤が共有結合に用いられうる。架橋剤の例として、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら（１９８４年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６頁；Ｌｉｕ Ｍ．Ａ．ら（１９８５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：８６４８頁を参照）。他の方法として、Ｐａｕｌｕｓ（１９８５年）Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．Ｎｏ．７８：１１８−１３２頁；Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１−８３頁およびＧｌｅｎｎｉｅら（１９８７年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５頁に記載の方法が挙げられる。好ましい複合剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、いずれもＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ））から入手可能である。
結合特異性が抗体である場合、それらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して結合されうる。特に好ましい態様では、ヒンジ領域は、複合に先立ち、奇数、好ましくは１つのスルフヒドリル残基を有するように修飾される。
あるいは、両方の結合特異性は同じベクター内にコードされ、かつ同じ宿主細胞内で発現され、構築されうる。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本開示の二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および結合決定因子を含む一本鎖分子、または２つの結合決定因子を含む一本鎖二重特異性分子でありうる。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含みうる。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば米国特許第５，２６０，２０３号明細書；米国特許第５，４５５，０３０号明細書；米国特許第４，８８１，１７５号明細書；米国特許第５，１３２，４０５号明細書；米国特許第５，０９１，５１３号明細書；米国特許第５，４７６，７８６号明細書；米国特許第５，０１３，６５３号明細書；米国特許第５，２５８，４９８号明細書；および米国特許第５，４８２，８５８号明細書に記載されている（これらのすべては参照により本明細書中に明示的に援用される）。
二重特異性分子のその特異的な標的に対する結合は、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ法（例えば成長阻害）またはウエスタンブロットアッセイ法によって確認されうる。これらの各アッセイ法では、一般に、特別な目的のタンパク質−抗体複合体の存在が目的の複合体に対して特異的な標識試薬（例えば抗体）の使用により検出される。例えば、ＦｃＲ−抗体複合体は、例えば、抗体−ＦｃＲ複合体を認識しかつそれに対して特異的に結合する酵素結合抗体または抗体断片を用いて検出されうる。あるいは、複合体は種々の他のイムノアッセイ法のいずれかを用いて検出されうる。例えば、抗体は放射活性物質で標識され、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）で用いられうる（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ Ｂ．、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９８６年３月（参照により本明細書中に援用される）を参照）。放射性同位体は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用などの手段あるいはオートラジオグラフィーにより検出されうる。
リンカー
本発明は、抗体が化学リンカーを介してパートナーに連結された抗体−パートナー複合体を提供する。一部の態様では、リンカーはペプチジルリンカーであり、本明細書中で（Ｌ４）ｐ−Ｆ−（Ｌ１）ｍとして表される。他のリンカーは、ヒドラジンおよびジスルフィドリンカーを含み、それぞれ本明細書中で（Ｌ４）ｐ−Ｈ−（Ｌ１）ｍまたは（Ｌ４）ｐ−Ｊ−（Ｌ１）ｍとして表される。本発明は、パートナーに結合されているリンカーに加え、本質的に任意の分子種への結合に適する切断可能なリンカーアームも提供する。本発明のリンカーアームの局面は、本明細書中でその治療部分への結合を参照することにより例示される。しかし、リンカーが限定はされないが診断剤、分析剤、生体分子、標的化剤、検出可能な標識などを含む多様な種に結合可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。
抗体−パートナー複合体におけるペプチジルおよび他のリンカーの使用については、米国仮特許出願第６０／２９５，１９６号明細書；米国仮特許出願第６０／２９５，２５９号明細書；米国仮特許出願第６０／２９５３４２号明細書；米国仮特許出願第６０／３０４，９０８号明細書；米国仮特許出願第６０／５７２，６６７号明細書；米国仮特許出願第６０／６６１，１７４号明細書；米国仮特許出願第６０／６６９，８７１号明細書；米国仮特許出願第６０／７２０，４９９号明細書；米国仮特許出願第６０／７３０，８０４号明細書；米国仮特許出願第６０／７３５，６５７号明細書；米国仮特許出願第６０／８９１，０２８号明細書、および米国特許出願第１０／１６０，９７２号明細書；米国特許出願第１０／１６１，２３４号明細書；米国特許出願第１１／１３４，６８５号明細書；米国特許出願第１１／１３４，８２６号明細書、米国特許出願第１１／３９８，８５４号明細書および米国特許第６，９８９，４５２号明細書、ならびにＰＣＴ特許出願のＰＣＴ／ＵＳ２００６／３７７９３号明細書において記載され、これら全部は参照により本明細書中に援用される。
さらなるリンカーが、米国特許第６，２１４，３４５号明細書（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、米国特許出願公開第２００３／００９６７４３号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１３０１８９号明細書（いずれもＳｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓに付与）、ｄｅ Ｇｒｏｏｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２、５２７７頁（１９９９年）；ｄｅ Ｇｒｏｏｔら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３、３０９３頁（２０００年）；ｄｅ Ｇｒｏｏｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６６、８８１５頁、（２００１年）；国際公開第０２／０８３１８０号論説（Ｓｙｎｔａｒｇａ）；Ｃａｒｌら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２４、４７９頁、（１９８１年）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら、Ｂｉｏｏｒｇ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８、３３４７頁（１９９８年）において記載されている。
一局面では、本発明は、治療物質およびマーカーに対する標的化基への結合に有用なリンカーに関する。別の局面では、本発明は、化合物に安定性をもたらすか、そのインビボでの毒性を低減するか、またはそれ以外ではその薬動力学、バイオアベイラビリティおよび／または薬力学に好ましい作用をもたらすといったリンカーを提供する。かかる態様では、一旦薬剤がその作用部位に送達されると、リンカーが切断され活性薬剤が放出されることが一般に好ましい。したがって、本発明の一態様では、本発明のリンカーは、一旦治療物質またはマーカーから除去されると（活性化される間など）リンカーの存在の痕跡が全く残らないようにトレースレスである。
本発明の別の態様では、リンカーは、治療作用またはマーカー活性の部位など、標的細胞内またはその近傍の部位でのその切断される能力により特徴づけられる。かかる切断は本質的に酵素によるものでありうる。この特徴は、治療物質またはマーカーの全身活性化の低減や、毒性および全身性副作用の低減に役立つ。酵素的切断にとって好ましい切断可能な基は、ペプチド結合、エステル結合、およびジスルフィド結合を含む。他の態様では、リンカーはｐＨに感受性があり、ｐＨの変化を通じて切断される。
本発明の重要な局面は、リンカーの切断速度を制御する能力である。速やかに切断されるリンカーが望ましい場合が多い。しかし、一部の態様では、より緩やかに切断されるリンカーが好ましい場合がある。例えば、徐放製剤または速やかな放出成分と緩やかな放出成分の双方を有する製剤では、より緩やかに切断されるリンカーを提供することが有用でありうる。国際公開第０２／０９６９１０号論説は、ヒドラジンリンカーを有する数種の特異的リガンド−薬剤複合体を提供する。しかし、リンカー組成物を要求される環化速度に応じて「調節する（ｔｕｎｅ）」見込みはなく、リガンドを記載の特定の化合物よりも緩やかな速度で薬剤から切断することが多数の薬剤−リンカー複合体にとって好ましい。それに対し、本発明のヒドラジンリンカーが環化速度の非常に高速から非常に低速までの範囲を備えることにより、所望の環化速度に基づく特定のヒドラジンリンカーの選択が可能になる。
例えば、切断時に単一の５員環を生成するヒドラジンリンカーの場合、非常に高速な環化が得られうる。細胞毒性物質の細胞への標的化送達にとって好ましい環化速度は、切断時にジェミナル（ｇｅｍｉｎａｌ）位置に２つのメチル基を有するリンカーから得られる２つの５員環または単一の６員環のいずれかを生成するヒドラジンリンカーを用いて得られる。ｇｅｍ−ジメチル効果により、ジェミナル位置に２つのメチル基を有しない単一の６員環の場合と比べて環化反応の速度が加速されることが示されている。これは同環内に解放されている株から得られる。しかし時として、置換基は反応速度を高めるのではなく低下させうる。遅延の理由が立体障害に帰着されうることが多い。例えば、ｇｅｍジメチル置換により、ジェミナル炭素がＣＨ２である場合よりも極めて迅速な環化反応が生じうる。
しかし、一部の態様ではより緩やかに切断されるリンカーが好ましい場合があることに着目することが重要である。例えば、徐放製剤または速やかな放出および緩やかな放出成分の双方を有する製剤では、より緩やかに切断されるリンカーを提供することが有用でありうる。特定の態様では、低速の環化が、切断時にｇｅｍ−ジメチル置換基を有しない単一の６員環、または単一の７員環を生成するヒドラジンリンカーを用いてなされる。
リンカーはまた、治療物質またはマーカーを循環中での分解に対して安定化させるのに役立つ。この特徴は、かかる安定化の結果、結合された治療物質またはマーカーの循環半減期が延長されることから有意な効果をもたらす。リンカーはまた、結合された治療物質またはマーカーの活性を複合体が循環中に比較的良性であるように弱めるのに役立ち、かつ、所望の作用部位での活性化後に望ましい効果を有し、例えば毒性を示す。治療物質複合体においては、リンカーのこの特徴は同剤の治療指数を改善するのに役立つ。
安定化基は、好ましくは、治療物質またはマーカーのクリアランスおよび代謝を血液中または非標的組織内に存在しうる酵素により制限するように選択され、さらに同剤またはマーカーの細胞への輸送を制限するように選択される。安定化基は、同剤またはマーカーの分解を遮断するのに役立ち、また同剤またはマーカーの他の物理的特性をもたらすように作用しうる。安定化基はまた、同剤またはマーカーの安定性を製剤または非製剤形態のいずれかで保存される間に改善しうる。
望ましくは、安定化基は、治療物質またはマーカーのヒト血液中、３７℃で２時間の保存により試験される場合に同剤またはマーカーを分解から保護するのに役立ち、かつ所与のアッセイ条件下でヒト血液中に存在する酵素により、２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満およびさらにより好ましくは２％未満の同剤またはマーカーの切断をもたらす場合、治療物質またはマーカーの安定化に有用である。
本発明は、これらのリンカーを有する複合体にも関する。より詳細には、本発明は疾患の治療、特に癌化学療法に用いられうるプロドラッグに関する。詳細には、本明細書中に記載のリンカーの使用により、類似構造のプロドラッグと比べて、活性の高い特異性、低下した毒性、および血中での改善された安定性を示すプロドラッグが提供される。
本明細書中に記載の本発明のリンカーは、パートナー分子内部の種々の位置に存在しうる。
したがって、インビボ、例えば血流中で、かかる基が欠如した構築物の速度よりも高い速度で切断されることになる、種々の基のいずれかをその鎖の一部として有しうるリンカーが提供される。リンカーアームと治療物質および診断剤との複合体も提供される。リンカーは、治療物質のプロドラッグ類似体を形成しかつ治療物質または診断剤を標的化剤、検出可能な標識、または固体支持体に可逆的に連結するのに有用である。リンカーは、本発明の細胞毒素を含む複合体に組み込まれうる。
切断可能なペプチド、ヒドラジン、またはジスルフィド基に加え、１つ以上の自己犠牲リンカー（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｌｉｎｋｅｒ）基Ｌ１が場合により細胞毒素と標的化剤の間に導入される。これらのリンカー基はまた、スペーサー基として記述され、少なくとも２つの反応官能基を有しうる。典型的には、スペーサー基の一方の化学官能基が治療物質の化学官能基、例えば細胞毒素に結合する間、スペーサー基の他方の化学官能基は標的化剤または切断可能なリンカーの化学官能基に結合するように用いられる。スペーサー基の化学官能基の例として、ヒドロキシ基、メルカプト基、カルボニル基、カルボキシ基、アミノ基、ケトン基、およびメルカプト基が挙げられる。
Ｌ１で表される自己犠牲リンカーは、一般に置換もしくは未置換アルキル基、置換もしくは未置換アリール基、置換もしくは未置換ヘテロアリール基または置換もしくは未置換ヘテロアルキル基である。一態様では、アルキルまたはアリール基は１〜２０個の炭素原子を含みうる。それらはまた、ポリエチレングリコール部分を含みうる。
典型的なスペーサー基として、例えば、６−アミノヘキサノール、６−メルカプトヘキサノール、１０−ヒドロキシデカン酸、グリシンおよび他のアミノ酸、１，６−ヘキサンジオール、β−アラニン、２−アミノエタノール、システアミン（２−アミノエタンチオール）、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、３−マレイミド安息香酸、フタリド、α−置換フタリド、カルボニル基、アミナールエステル、核酸、ペプチドなどが挙げられる。
スペーサーは、さらなる分子量および化学官能基を細胞毒素−標的化剤複合体に導入するのに役立ちうる。一般に、さらなる分子量および官能基は複合体の血清半減期および他の特性に作用することになる。したがって、スペーサー基の注意深い選択を通じ、ある範囲の血清半減期を有する細胞毒素複合体が生成されうる。
薬剤成分の直近に位置するスペーサーは、（Ｌ１）ｍ（式中、ｍは０、１、２、３、４、５、および６から選択される整数である）としても示される。複数のＬ１スペーサーが存在する場合、同一のまたは異なるスペーサーのいずれかが用いられうる。Ｌ１は任意の自己犠牲的な基でありうる。
Ｌ４は好ましくは複合体に同部分を有するリンカーを用いて溶解度の増大または凝集特性の低下をもたらすかまたは複合体の加水分解速度を変化させるリンカー部分である。Ｌ４リンカーは自己犠牲的である必要がない。一態様では、Ｌ４部分は、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアルキル、または未置換ヘテロアルキルであり、これらのいずれかが直鎖状、分岐鎖状、または環状でありうる。置換基は、例えば、低級（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノでありうる。特定の態様では、Ｌ４は非環状部分を含む。別の態様では、Ｌ４は任意の正または負に帯電したアミノ酸重合体、例えばポリリシンまたはポリアルギニンを含む。Ｌ４はポリエチレングリコール部分などの重合体を含みうる。さらに、Ｌ４リンカーは、例えば重合体成分と小さい化学的成分の双方を含みうる。
好ましい態様では、Ｌ４はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む。Ｌ４のＰＥＧ部分は１〜５０単位の長さでありうる。好ましくは、ＰＥＧは１〜１２の繰り返し単位、より好ましくは３〜１２の繰り返し単位、より好ましくは２〜６の繰り返し単位、またはさらにより好ましくは３〜５の繰り返し単位および最も好ましくは４の繰り返し単位を有することになる。Ｌ４は、単にＰＥＧ部分からなりうるか、あるいはさらなる置換もしくは未置換のアルキルまたはヘテロアルキルも有しうる。ＰＥＧとＬ４部分の一部として結合し、複合体の水溶性を高めることは有用である。さらに、ＰＥＧ部分は薬剤と抗体との複合の間に生じうる凝集の程度を低下させる。
一部の態様では、Ｌ４は、（ＡＡ１）ｃのＮ末端に直接結合される
Figure 0005846695
を含む。Ｒ２０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６、およびＲ２６’の各々は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、および置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択され、かつｓおよびｔは独立して１〜６の整数である。好ましくは、Ｒ２０、Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６およびＲ２６’は疎水性である。一部の態様では、Ｒ２０はＨまたはアルキル（好ましくは未置換低級アルキル）である。一部の態様では、Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６およびＲ２６’は、独立してＨまたはアルキル（好ましくは未置換Ｃ１〜Ｃ４アルキル）である。一部の態様では、Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６およびＲ２６’はすべてがＨである。一部の態様では、ｔは１でありかつｓは１または２である。
ペプチドリンカー（Ｆ）
上で考察のように、本発明のペプチジルリンカーは、一般式：（Ｌ４）ｐ−Ｆ−（Ｌ１）ｍ（式中、Ｆはペプチジル部分を含むリンカー部分を表す）により表されうる。一態様では、Ｆ部分は任意の追加の自己犠牲リンカーＬ２およびカルボニル基を含む。別の態様では、Ｆ部分はアミノ基および任意のスペーサー基Ｌ３を含む。
したがって、一態様では、ペプチジルリンカーを含む複合体は、式（ａ）：
Figure 0005846695
の構造を含む。
この態様では、Ｌ１は上記のような自己犠牲リンカーであり、かつ、Ｌ４は上記のように好ましくは溶解度の増大または凝集特性の低下をもたらすかあるいは加水分解速度を変化させる部分である。Ｌ２は自己犠牲リンカーを表す。さらに、ｍは０、１、２、３、４、５、もしくは６であり、かつｏおよびｐは独立して０もしくは１である。ＡＡ１は１種以上の天然アミノ酸および／または非天然α−アミノ酸を表し、ｃは１〜２０の整数である。一部の態様では、ｃは２〜５の範囲内であるかまたは２もしくは３である。
上記式（ａ）の本発明のペプチドリンカーにおいては、ＡＡ１は、そのアミノ末端で、Ｌ４に直接連結されるか、またはＬ４が不在の場合にはＸ４基（すなわち、標的化剤、検出可能な標識、保護反応官能基または非保護反応官能基）に直接連結される。一部の態様では、Ｌ４が存在する場合、Ｌ４は（ＡＡ１）ｃのＮ末端に直接結合されたカルボン酸アシル基を含まない。したがって、これらの態様では、米国特許第６，２１４，３４５号明細書に記載のペプチドリンカーにおいて必要であるように、Ｌ４またはＸ４のいずれかとＡＡ１の間に直接カルボン酸アシル単位が必ずしも存在する必要がない。
別の態様では、ペプチジルリンカーを含む複合体は、式（ｂ）：
Figure 0005846695
の構造を含む。
この態様では、Ｌ４は上記のように、好ましくは溶解度の増大または凝集特性の低下をもたらすかあるいは加水分解速度を変化させる部分であり、Ｌ３は第一級もしくは第二級アミンまたはカルボキシル官能基を含むスペーサー基であり、かつＬ３のアミンがＤの懸垂カルボキシル官能基とアミド結合を形成するか、またはＬ３のカルボキシル基がＤの懸垂アミン官能基とアミド結合を形成し、かつｏおよびｐは独立して０または１である。ＡＡ１は１種以上の天然アミノ酸および／または非天然α−アミノ酸を表し、ｃは１〜２０の整数である。この態様では、Ｌ１は存在しない（すなわち一般式中でｍは０である）。
上記式（ｂ）の本発明のペプチドリンカーにおいては、ＡＡ１は、そのアミノ末端で、Ｌ４に直接連結されるか、またはＬ４が不在の場合にはＸ４基（すなわち、標的化剤、検出可能な標識、保護反応官能基または非保護反応官能基）に直接連結される。一部の態様では、Ｌ４が存在する場合、Ｌ４は（ＡＡ１）ｃのＮ末端に直接結合されたカルボン酸アシル基を含まない。したがって、これらの態様では、米国特許第６，２１４，３４５号明細書に記載のペプチドリンカーにおいて必要であるように、Ｌ４またはＸ４のいずれかとＡＡ１の間に直接カルボン酸アシル単位が必ずしも存在する必要がない。
自己犠牲リンカーＬ２
自己犠牲リンカーＬ２は、２つの距離が離れた化学的部分を共に通常は安定なトリパーテート（ｔｒｉｐａｒｔａｔｅ）分子に共有結合可能な二機能の化学的部分であり、それにより酵素切断を用いてトリパーテート分子から前記距離が離れた化学的部分のうちの一方が放たれ、前記酵素切断後、分子の残りから自発的切断が生じ、前記距離が離れた化学的部分の他方が放たれる。本発明によると、自己犠牲スペーサーは、その一方の末端でペプチド部分に共有結合されかつその他方の末端で薬剤部分（その誘導化が薬理学的活性を阻害する）の化学反応性がある部位に共有結合されることで、距離が離れ、ペプチド部分および薬剤部分を共に標的酵素の不在下で安定でかつ薬理学的に不活性であるトリパーテート分子に共有結合させるが、それはスペーサー部分およびペプチド部分に共有結合することによりトリパーテート分子からのペプチド部分の放出を有効にする結合でかかる標的酵素により酵素的に切断可能である。次いで、かかる酵素切断は、スペーサー部分の自己犠牲的特徴を活性化し、スペーサー部分を薬剤部分に共有結合させることにより薬理活性形態での薬剤の放出を有効にする結合の自発切断を開始させることになる。
自己犠牲リンカーＬ２は任意の自己犠牲的な基でありうる。好ましくは、Ｌ２は、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換および未置換アリール、ならびに置換および未置換ヘテロアリールである。
１つの特に好ましい自己犠牲スペーサーＬ２は、式（ｃ）：
Figure 0005846695
で表されうる。
アミノベンジル基の芳香環は１つ以上の「Ｋ」基で置換されうる。「Ｋ」基は、通常では環構造の一部である４つの非置換炭素のうちの１つに結合される水素を置き換える芳香環上の置換基である。「Ｋ」基は単一の原子、例えばハロゲンでありうるか、または多重原子群、例えばアルキル、ヘテロアルキル、アミノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキル、およびシアノでありうる。各Ｋは、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ２１Ｒ２２、ＮＲ２１ＣＯＲ２２、ＯＣＯＮＲ２１Ｒ２２、ＯＣＯＲ２１、およびＯＲ２１（式中、Ｒ２１およびＲ２２は独立してＨ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキルおよび未置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される）からなる群から独立して選択される。典型的なＫ置換基は、限定はされないが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＮＨＣＯＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＣＦ３およびメチルを含む。「Ｋｉ」においては、ｉは０、１、２、３、もしくは４の整数である。好ましい一態様では、ｉは０である。
上記の構造のエーテル酸素原子はカルボニル基に結合される。ＮＲ２４官能基から芳香環への系統は、アミンの官能基が５個の炭素（いずれも環を形成し、−ＣＨ２−Ｏ−基で置換されない）のいずれかに結合されうることを示す。好ましくは、ＸのＮＲ２４官能基は−ＣＨ２−Ｏ−基に対するパラ配位で芳香環に共有結合される。Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群から選択されるメンバーである。特定の態様では、Ｒ２４は水素である。
一態様では、本発明は、上記の式（ａ）のペプチドリンカーを提供し、ここでＦは構造：
Figure 0005846695
を含み、ここでＲ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群から選択される）を提供する。各Ｋは、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ２１Ｒ２２、ＮＲ２１ＣＯＲ２２、ＯＣＯＮＲ２１Ｒ２２、ＯＣＯＲ２１、およびＯＲ２１（式中、Ｒ２１およびＲ２２は独立してＨ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される）からなる群から独立して選択されるメンバーであり、かつｉは０、１、２、３、もしくは４の整数である。
別の態様では、上記式（ａ）のペプチドリンカーは、構造：
Figure 0005846695
を含む−Ｆ−（Ｌ１）ｍ−を含み、ここで各Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群から独立して選択されるメンバーである。
一部の態様では、自己犠牲スペーサーＬ１またはＬ２は、
Figure 0005846695
を含み、ここでＲ１７、Ｒ１８、およびＲ１９の各々は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換のヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換アリールから独立して選択され、かつｗは０〜４の整数である。一部の態様では、Ｒ１７およびＲ１８は独立してＨまたはアルキル（好ましくは未置換Ｃ１〜Ｃ４アルキル）である。好ましくは、Ｒ１７およびＲ１８はＣ１〜Ｃ４アルキル、例えばメチルまたはエチルである。一部の態様では、ｗは０である。任意の特定の理論に拘束されたくないが、この特定の自己犠牲スペーサーが比較的速やかに環化することが実験的に見出されている。
一部の態様では、Ｌ１またはＬ２は、
Figure 0005846695
を含む。
スペーサー基Ｌ３
スペーサー基Ｌ３は第一級もしくは第二級アミンまたはカルボキシル官能基を含むように特徴づけられ、かつ、Ｌ３基のアミンがＤの懸垂カルボキシル官能基とアミド結合を形成するか、またはＬ３のカルボキシルがＤの懸垂アミン官能基とアミド結合を形成する。Ｌ３は、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、または置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択されうる。好ましい態様では、Ｌ３は芳香族性基を含む。より好ましくは、Ｌ３は安息香酸基、アニリン基またはインドール基を含む。−Ｌ３−ＮＨ−スペーサーとして機能しうる構造の非限定例として、
Figure 0005846695
といった構造が挙げられ、ここでＺはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり、かつＲ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。
Ｌ３を有する本発明のリンカーの切断時、Ｌ３部分は薬剤Ｄに結合されたままである。したがって、Ｌ３部分はＤに結合されたその存在がＤの活性を有意に変化させないように選択される。別の態様では、薬剤Ｄ自体の一部がＬ３スペーサーとして機能する。例えば、一態様では、薬剤Ｄは薬剤の一部がＬ３スペーサーとして機能するデュオカルマイシン誘導体である。かかる態様の非限定例として、ＮＨ２−（Ｌ３）−Ｄが
Figure 0005846695
からなる群から選択される構造を有する場合が挙げられ、ここでＺはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり、Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり、かつ各構造上のＮＨ２基は（ＡＡ１）ｃと反応して−（ＡＡ１）ｃ−ＮＨ−を形成する。
ペプチド配列ＡＡ１
ＡＡ１基は、単一のアミノ酸またはアミド結合により結合された複数のアミノ酸を表す。アミノ酸は天然アミノ酸および／または非天然α−アミノ酸でありうる。
ペプチド配列（ＡＡ１）ｃは、機能的に、単一のアミノ酸（ｃ＝１の場合）またはアミド結合により互いに結合された複数のアミノ酸のアミド化残基である。本発明のペプチドは、生体系における目的の位置で酵素によるペプチドの酵素触媒化切断を誘導するように選択される。例えば、標的化剤を用いて細胞に標的化されるがその細胞により内在化されない複合体においては、例えばペプチドが細胞外で切断されるように近隣での死滅に向かう細胞の細胞内容物の放出により、細胞外マトリックス内に存在しうる１種以上のプロテアーゼにより切断されるペプチドが選択される。ペプチド内部のアミノ酸の数は１〜２０個の範囲でありうるが、より好ましくは（ＡＡ１）ｃを含む、１〜８個のアミノ酸、１〜６個のアミノ酸または１、２、３もしくは４個のアミノ酸が存在することになる。特異的酵素により切断されやすいペプチド配列または酵素のクラスは当該技術分野で周知である。
血清、肝臓、腸管などにおける酵素により切断される多数のペプチド配列は、当該技術分野で既知である。本発明の典型的なペプチド配列は、プロテアーゼにより切断されるペプチド配列を含む。プロテアーゼ感受性配列の使用についてなされる考察の中心は、図示の簡素化を意図したものであり、本発明の範囲を限定することに役立つものではない。
ペプチドを切断する酵素がプロテアーゼである場合、リンカーは一般にプロテアーゼに対する切断認識配列を有するペプチドを含む。プロテアーゼに対する切断認識配列は、タンパク質分解切断の間にプロテアーゼにより認識される特定のアミノ酸配列である。多数のプロテアーゼ切断部位が当該技術分野で既知であり、これらおよび他の切断部位は、リンカー部分内に含まれうる。例えば、Ｍａｔａｙｏｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：９５４頁（１９９０年）；Ｄｕｎｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４１：２５４頁（１９９４年）；Ｓｅｉｄａｈら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：１７５頁（１９９４年）；Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：６１５頁（１９９４年）；Ｗｅｂｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：５９５頁（１９９４年）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：４１２頁（１９９４年）；Ｂｏｕｖｉｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４８：６１４頁（１９９５年）、Ｈａｒｄｙら、ｉｎ Ａｍｉｌｏｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ａｇｉｎｇ，ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｍａｓｔｅｒｓら編、１９０−１９８頁（１９９４年）を参照のこと。
ペプチド配列（ＡＡ１）ｃのアミノ酸は、腫瘍関連プロテアーゼなどの特定の分子による選択的酵素切断に対するその適合性に基づいて選択される。用いられるアミノ酸は天然または非天然アミノ酸でありうる。それらはＬまたはＤ配置でありうる。一態様では、少なくとも３種の異なるアミノ酸が用いられる。別の態様では、２種のアミノ酸のみが用いられる。
好ましい態様では、ペプチド配列（ＡＡ１）ｃはリソソームプロテアーゼにより切断されるその能力に基づいて選択され、その非限定例としてカテプシンＢ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、ＬおよびＳが挙げられる。好ましくは、ペプチド配列（ＡＡ１）ｃはインビトロでカテプシンＢにより切断可能であり、それは当該技術分野で既知のインビトロでのプロテアーゼ切断アッセイ法を用いて試験されうる。
別の態様では、ペプチド配列（ＡＡ１）ｃは、腫瘍関連プロテアーゼ、例えば腫瘍細胞近傍で細胞外に見出されるプロテアーゼにより切断されるその能力に基づいて選択され、その非限定例として、チメット（ｔｈｉｍｅｔ）オリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）およびＣＤ１０が挙げられる。ペプチドのＴＯＰまたはＣＤ１０により切断される能力は、当該技術分野で既知のインビトロでのプロテアーゼ切断アッセイ法を用いて試験されうる。
本発明の複合体での使用に適するペプチド配列の適例として、限定はされないが、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号９４）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号９５）およびＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号９６）、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号９７）、Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ、ならびにＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌが挙げられる。好ましいペプチド配列はＶａｌ−ＣｉｔおよびＶａｌ−Ｌｙｓである。
別の態様では、薬剤部分の直近に位置するアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｉｔ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択される。さらに別の態様では、薬剤部分の直近に位置するアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択される。
プロテアーゼは癌転移に関与している。プロテアーゼウロキナーゼの合成の増大が、多数の癌内での転移能の増強と相関していた。ウロキナーゼは細胞外空間内に偏在するプラスミノゲンからプラスミンを活性化し、その活性化により転移性腫瘍細胞の浸潤を媒介する細胞外マトリックス内でタンパク質の分解が引き起こされうる。プラスミンはまたコラゲナーゼを活性化する故、毛細管およびリンパ系の周囲の基底膜内でのコラーゲンの分解を促進可能であり、それにより腫瘍細胞の標的組織への浸潤が可能になる（Ｄａｎｏら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．、４４：１３９頁（１９８５年））。したがって、ウロキナーゼにより切断されるペプチド配列のリンカーとしての使用は本発明の範囲内に含まれる。
本発明は、トリプターゼによる切断に感受性があるペプチド配列の使用についても提供する。ヒトマスト細胞は、α、βＩ、βＩＩ、およびβＩＩＩと称される少なくとも４種の異なるトリプターゼを発現する。これらの酵素は血漿プロテアーゼ阻害剤により制御されることがなく、インビトロで数種の生理的基質を切断するだけである。セリンプロテアーゼのトリプターゼファミリーは、マスト細胞を含む種々のアレルギー性および炎症性疾患に関与しており、その理由はこれらの障害を有する患者由来の体液中で見出されるトリプターゼレベルの上昇にある。しかし、疾患の病態生理におけるトリプターゼの正確な役割はいまだに明らかにされていない。トリプターゼの生物学的機能および対応する生理学的結果の範囲は、それらの基質特異性により実質的に画定される。
トリプターゼは、腫瘍転移および浸潤に関連したプロテアーゼのチモーゲン形態であるプロウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）の強力な活性化因子である。細胞溢出および移動において細胞外マトリックスの破壊をまねくプラスミノゲンカスケードの活性化は、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＬｙｓのＰ４〜Ｐ１配列（配列番号９８）のプロウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子のトリプターゼ活性化の機能でありうる（Ｓｔａｃｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９（１３）：９４１６−９４１９頁（１９９４年））。血管透過性の調節に関与する神経ペプチドＶＩＰ（血管作動性腸管ペプチド）もまた主にＴｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号９９）配列でトリプターゼにより切断される（Ｔａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３：２７−３２頁（１９９０年））。Ｇタンパク質共役受容体ＰＡＲ−２をＳｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号１００）配列でトリプターゼにより切断し活性化することで、線維芽細胞の増殖が促進されうる一方、トロンビン活性化受容体ＰＡＲ−１がＰｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１０１）配列でトリプターゼにより不活性化される（Ｍｏｌｉｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２（７）：４０４３−４０４９頁（１９９７年））。総合すれば、このエビデンスは、トリプターゼにおける疾患の結果としての組織リモデリングでの中心的役割を示唆する。これはいくつかのマスト細胞媒介性の障害において観察される重大な変化に合致する。慢性喘息および他の長期の呼吸器疾患の１つの特質は、その生理的標的のトリプターゼ活性化の結果でありうる下層組織の線維化および肥厚である。同様に、血管新生が種々の癌におけるマスト細胞密度、トリプターゼ活性および予後不良に関連することを一連の報告が示している（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３（１１）：１３８２−９７頁（１９９９年））；Ｔａｋａｎａｍｉら、Ｃａｎｃｅｒ ８８（１２）：２６８６−９２頁（２０００年）；Ｔｏｔｈ−Ｊａｋａｔｉｃｓら、Ｈｕｍａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３１（８）：９５５−９６０頁（２０００年）；Ｒｉｂａｔｔｉら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８５（２）：１７１−５頁（２０００年））。
特定のプロテアーゼが選択されたペプチド配列を切断するか否かを評価するための方法は当該技術分野で既知である。例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）蛍光発生ペプチド基質の使用は、プロテアーゼ特異性を測定するための十分に確立された方法である（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ Ｍ．ら（１９７７年）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７８：４７−５１頁）。アニリド結合の特異的切断により蛍光発生ＡＭＣ脱離基が遊離し、各基質における切断速度の簡易な測定が可能になる。より最近では、ＡＭＣペプチド基質ライブラリのアレイ（Ｌｅｅ Ｄ．ら（１９９９年）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ９：１６６７−７２頁）および位置走査ライブラリ（Ｒａｎｏ Ｔ．Ａ．ら（１９９７年）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：１４９−５５頁）を用い、単一の実験での広範囲の基質のサンプリングによるプロテアーゼのＮ末端特異性の迅速なプロファイリングが行われている。したがって、当業者は、過度の実験に依存することなく、ペプチド配列のアレイを評価し、本発明におけるその有用性を判定することが容易にできる。
本発明の抗体−パートナー複合体は、場合により２種以上のリンカーを有しうる。これらのリンカーは同じかまたは異なる場合がある。例えば、ペプチジルリンカーを用いて薬剤のリガンドへの連結が可能であり、第２のペプチジルリンカーにより診断剤の複合体への結合が可能である。追加のリンカーにおける他の使用として、分析剤、生体分子、標的化剤、および検出可能な標識の抗体−パートナー複合体への連結が含まれる。
また、例えば本発明の化合物の二量体、三量体、四量体およびより高級な相同体またはそれらの反応類似体などの種を含む多価種である本発明の化合物は、本発明の範囲内に含まれる。多価種は、本発明の単一種または２種以上の種から構築可能である。例えば、二量体構築物は「ホモ二量体」または「ヘテロ二量体」でありうる。さらに、本発明の化合物またはその反応類似体がオリゴマーまたはポリマーフレームワーク（例えばポリリシン、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプンなど）に結合された多価構築物は本発明の範囲内に含まれる。フレームワークは、好ましくは多官能性である（すなわち本発明の化合物に結合するための一連の反応部位を有する）。さらに、フレームワークは、本発明の単一種または本発明の２種以上の種で誘導体化されうる。
さらに、本発明は、類似官能基でない類似化合物よりも高い水溶性を有する化合物が得られる官能化された化合物を含む。したがって、本明細書中に示される置換基のいずれかが水溶性を高めている類似基と置換されうる。例えば、水酸基をジオールまたは第４級アミン、ヒドロキシアミンもしくは類似の水溶性がより高い部分を有するアミンと置換することは本発明の範囲内に含まれる。好ましい態様では、さらなる水溶性が、本明細書中に示される化合物のイオンチャネルに対する活性にとって本質的でない部位での、親化合物の水溶性を高める部分との置換により与えられる。有機化合物の水溶性を高める方法は当該技術分野で既知である。かかる方法は、限定はされないが、常に帯電した部分、例えば第４級アンモニウムまたは生理学的関連ｐＨで帯電した基、例えばカルボン酸、アミンで有機核を官能化する工程を含む。他の方法は、有機核にヒドロキシルまたはアミンを有する基、例えばアルコール、ポリオール、ポリエーテルなどを付加する工程を含む。代表例は、限定はされないが、ポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（プロピレングリコール）を含む。これらの化合物に適する官能化の化学反応および戦略は当該技術分野で既知である。例えば、Ｄｕｎｎ Ｒ．Ｌ．ら編、「ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ 第４６９巻」、ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９１年を参照のこと。
ヒドラジンリンカー（Ｈ）
第２の態様では、本発明の複合体はヒドラジン自己犠牲リンカーを含み、ここで複合体は構造：
Figure 0005846695
を有し、ここで、Ｄ、Ｌ１、Ｌ４、およびＸ４は上で定義された通りであり、かつ本明細書中にさらに記載され、かつＨは構造：
Figure 0005846695
を含むリンカーであり、ここで、ｎ１は１〜１０の整数であり、ｎ２は０、１、もしくは２であり、各Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群から独立して選択されるメンバーであり、かつＩは結合（すなわち骨格の炭素と隣接窒素の間の結合）かまたは
Figure 0005846695
のいずれかであり、ここで、ｎ３が０である場合、ｎ２が０でないという条件でｎ３は０もしくは１であり、かつｎ４は１、２、もしくは３であり、ここでＩが結合である場合、ｎ１は３でありかつｎ２は１であり、Ｄは
Figure 0005846695
である可能性がなく、ここで、ＲはＭｅまたはＣＨ２−ＣＨ２−ＮＭｅ２である。
一態様では、フェニル環上での置換はパラ置換である。好ましい態様では、ｎ１は２、３、もしくは４であるかまたはｎ１は３である。好ましい態様では、ｎ２は１である。好ましい態様では、Ｉは結合（すなわち骨格の炭素と隣接窒素の間の結合）である。一局面では、ヒドラジンリンカーＨは、例えばｎ３が０でかつｎ４が２である場合、切断時に６員の自己犠牲リンカーを形成しうる。別の局面では、ヒドラジンリンカーＨは切断時に２つの５員の自己犠牲リンカーを形成しうる。さらに他の局面では、切断時、Ｈは５員の自己犠牲リンカーを形成するか、Ｈは７員の自己犠牲リンカーを形成するか、またはＨは５員の自己犠牲リンカーおよび６員の自己犠牲リンカーを形成する。切断の速度は、切断時に形成される環の大きさに影響される。したがって、望まれる切断の速度に依存して切断時に形成されるべき適切な大きさの環が選択されうる。
５員のヒドラジンリンカー
一態様では、ヒドラジンリンカーは５員のヒドラジンリンカーを含み、ここでＨは構造：
Figure 0005846695
を含む。
好ましい態様では、ｎ１は２、３、もしくは４である。別の好ましい態様では、ｎ１は３である。
上記の構造では、各Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群から独立して選択されるメンバーである。一態様では、各Ｒ２４はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。別の態様では、各Ｒ２４は独立してＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキル、より好ましくはＨまたはＣＨ３である。別の態様では、少なくとも１つのＲ２４はメチル基である。別の態様では、各Ｒ２４はＨである。各Ｒ２４は、化合物の立体効果を調整しかつ溶解度を変化させるように選択される。
５員のヒドラジンリンカーは、薬剤をリンカーから分離する１つ以上の環化反応を受ける可能性があり、例えば、
Figure 0005846695
で記述されうる。
本発明の５員のリンカーを調製するための典型的な合成経路は、
Figure 0005846695
である。
Ｃｂｚで保護されたＤＭＤＡ ｂは塩化チオニルを含有する溶液中の２，２−ジメチル−マロン酸ａと反応し、Ｃｂｚ−ＤＭＤＡ−２，２−ジメチルマロン酸ｃが形成される。化合物ｃはＥＤＣの存在下でＢｏｃ−Ｎ−メチルヒドラジンｄと反応し、ＤＭＤＡ−２，２−ジメチルマロニック（ｄｉｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｉｃ）−Ｂｏｃ−Ｎ−メチルヒドラジンｅが形成される。
６員のヒドラジンリンカー
別の態様では、ヒドラジンリンカーは６員のヒドラジンリンカーを含み、ここでＨは構造：
Figure 0005846695
を含む。
好ましい態様では、ｎ１は３である。上記構造では、各Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群から独立して選択されるメンバーである。一態様では、各Ｒ２４は独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。別の態様では、各Ｒ２４は独立してＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキル、より好ましくはＨまたはＣＨ３である。別の態様では、少なくとも１つのＲ２４はメチル基である。別の態様では、各Ｒ２４はＨである。各Ｒ２４は、化合物の立体効果を調整しかつ溶解度を変化させるように選択される。好ましい態様では、Ｈは構造：
Figure 0005846695
を含む。
一態様では、Ｈはジェミナルジメチル置換を含む。上記構造の一態様では、各Ｒ２４は独立してＨまたは置換もしくは未置換アルキルである。
６員のヒドラジンリンカーは薬剤をリンカーから分離する環化反応を受けることになり、
Figure 0005846695
のように記述されうる。
本発明の６員のリンカーを調製するための典型的な合成経路は、
Figure 0005846695
である。
ジクロロメタンを含有する溶液中のＣｂｚで保護されたジメチルアラニンａはＨＯＡｔおよびＣＰＩと反応し、Ｃｂｚで保護されたジメチルアラニンヒドラジンｂが形成された。ヒドラジンｂはメタノールの作用により脱保護され、化合物ｃが形成される。
他のヒドラジンリンカー
本発明が７員を有するリンカーを含む点が検討される。このリンカーであれば５員または６員のリンカーと同程度に速やかに環化しない可能性が高いことになるが、これは一部の抗体−パートナー複合体にとって好ましい場合がある。同様に、ヒドラジンリンカーは２つの６員環を含むか、またはヒドラジンリンカーは１つの６員および１つの５員の環化生成物を有しうる。５員および７員のリンカーならびに６員および７員のリンカーについても検討される。
別のヒドラジン構造Ｈは、式：
Figure 0005846695
を有し、ここで、ｑは０、１、２、３、４、５、もしくは６であり、かつ各Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群から独立して選択されるメンバーである。このヒドラジン構造は５員環、６員環、または７員環も形成し、追加成分の添加によって複数の環が形成される可能性がある。
ジスルフィドリンカー（Ｊ）
さらに別の態様では、リンカーは酵素的に切断可能なジスルフィド基を含む。一態様では、本発明は、式（ｄ）：
Figure 0005846695
による構造を有する細胞毒性抗体−パートナー化合物を提供し、ここで、Ｄ、Ｌ１、Ｌ４、およびＸ４は上で定義された通りであり、かつ本明細書中にさらに記載され、かつＪは構造：
Figure 0005846695
を有する基を含むジスルフィドリンカーであり、ここで、各Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群から独立して選択されるメンバーであり；各Ｋは、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ２１Ｒ２２、ＮＲ２１ＣＯＲ２２、ＯＣＯＮＲ２１Ｒ２２、ＯＣＯＲ２１、およびＯＲ２１（式中、Ｒ２１およびＲ２２は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキルおよび未置換ヘテロシクロアルキルからなる群から独立して選択される）からなる群から独立して選択されるメンバーであり；ｉは０、１、２、３、もしくは４の整数であり；ならびにｄは０、１、２、３、４、５、もしくは６の整数である。
ジスルフィドリンカーの芳香環は１つ以上の「Ｋ」基と置換されうる。「Ｋ」基は、通常では環構造の一部である４つの非置換炭素のうちの１つに結合される水素を置換する芳香環上の置換基である。「Ｋ」基は、単一原子、例えばハロゲンでありうるか、または多原子基、例えばアルキル、ヘテロアルキル、アミノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキル、およびシアノでありうる。典型的なＫ置換基は、限定はされないが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＮＨＣＯＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＣＦ３およびメチルを独立して含む。「Ｋｉ」においては、ｉは０、１、２、３、もしくは４の整数である。特定の態様では、ｉは０である。
好ましい態様では、リンカーは、式：
Figure 0005846695
の酵素的に切断可能なジスルフィド基を含む。
この態様では、Ｌ４、Ｘ４、ｐ、およびＲ２４の属性は上で定義された通りであり、かつｄは０、１、２、３、４、５、もしくは６である。特定の態様では、ｄは１または２である。
より特異的なジスルフィドリンカーは下記の式で示される。
Figure 0005846695
この態様の具体例は以下の通りである。
Figure 0005846695
好ましくは、ｄは１もしくは２である。
別のジスルフィドリンカーは下記の式で示される。
Figure 0005846695
この態様の具体例は以下の通りである。
Figure 0005846695
好ましくは、ｄは１または２である。
様々な態様では、ジスルフィドはアミンに対してオルトである。別の特定の態様では、ａは０である。好ましい態様では、Ｒ２４はＨおよびＣＨ３から独立して選択される。
本発明のジスルフィドリンカーを調製するための典型的な合成経路は以下の通りである。
Figure 0005846695
３−メルカプトプロピオン酸ａの溶液はアルドリチオール−２と反応し、３−メチルベンゾチアゾリウムヨージドｂが形成される。３−メチルベンゾチアゾリウムヨージドｃは水酸化ナトリウムと反応し、化合物ｄが形成される。メタノールを含有する化合物ｄの溶液はさらに化合物ｂと反応し、化合物ｅが形成される。化合物ｅは塩化アセチルおよびメタノールの作用により脱保護され、化合物ｆが形成される。
数種の細胞毒素、リンカーおよび治療物質を抗体に結合させるための他の方法についてのさらなる考察として、Ｇａｎｇｗａｒらに交付され、「Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ａｎｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」という表題のＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０５９４０４号論説、Ｓａｉｔｏ Ｇ．ら（２００３年）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９−２１５頁；Ｔｒａｉｌ Ｐ．Ａ．ら（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８−３３７頁；Ｐａｙｎｅ Ｇ．（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：２０７−２１２頁；Ａｌｌｅｎ Ｔ．Ｍ．（２００２年）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ２：７５０−７６３頁；Ｐａｓｔａｎ Ｉ．およびＫｒｅｉｔｍａｎ Ｒ．Ｊ．（２００２年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ３：１０８９−１０９１頁；Ｓｅｎｔｅｒ Ｐ．Ｄ．およびＳｐｒｉｎｇｅｒ Ｃ．Ｊ．（２００１年）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７−２６４頁（これら各々はそれら全体が参照により本明細書中に援用される）も参照のこと。
パートナー分子
一局面では、本発明は、パートナー分子、例えば細胞毒素、薬剤（例えば免疫抑制剤）または放射性毒素に結合された抗体を特徴とする。かかる複合体は、本明細書中で「免疫複合体」とも称される。１種以上の細胞毒素を含有する免疫複合体は「免疫毒素」と称される。細胞毒素または細胞毒性物質は、細胞に対して有害な（例えば殺傷する）任意の作用物質を含む。
本発明のパートナー分子の例として、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または相同体が挙げられる。パートナー分子の例として、例えば、アンチメタボライト（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（元はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（元はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）も挙げられる。
本発明の抗体に複合可能なパートナー分子の他の好ましい例として、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイタンシンおよびアウリスタチン、ならびにこれらの誘導体が挙げられる。カリケアマイシン抗体複合体の例は市販されている（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｏｍｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）。
パートナー分子の好ましい例として、ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシンが挙げられる。ＣＣ−１０６５は、Ｕｐｊｏｈｎ Ｃｏｍｐａｎｙにより１９８１年にストレプトマイセス・ゼレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｚｅｌｅｎｓｉｓ）から最初に単離され（Ｈａｎｋａら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３１：１２１１頁（１９７８年）；Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３３：９０２頁（１９８０年）；Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３４：１１１９頁（１９８１年））、インビトロおよび実験動物の双方で強力な抗腫瘍および抗菌活性を有することが見出された（Ｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４２：９９９頁（１９８２年））。ＣＣ−１０６５は、好ましくは５’−ｄ（Ａ／ＧＮＴＴＡ）−３’および５’−ｄ（ＡＡＡＡＡ）−３’の配列を有するマイナーグルーブ内の二本鎖Ｂ−ＤＮＡに結合し（Ｓｗｅｎｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４２：２８２１頁（１９８２年））、３’−アデニンのＮ３位を分子内に存在するそのＣＰＩの左側ユニットによりアルキル化する（Ｈｕｒｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：８４３頁（１９８４年））。ＣＣ−１０６５は、その強力かつ広範な抗腫瘍活性に反し、実験動物において遅発性死亡を引き起こすことからヒトでは使用できない。
ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシンの多数の類似体および誘導体は当該技術分野で既知である。多数の化合物の構造、合成および特性の研究についてのレビューがなされている。例えば、Ｂｏｇｅｒら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５：１４３８頁（１９９６年）およびＢｏｇｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：７８７頁（１９９７年）を参照のこと。
Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙａ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．のあるグループが多数のＣＣ−１０６５誘導体を調製している。例えば、米国特許第５，１０１，０３８号明細書；米国特許第５，６４１，７８０号明細書；米国特許第５，１８７，１８６号明細書；米国特許第５，０７０，０９２号明細書；米国特許第５，７０３，０８０号明細書；米国特許第５，０７０，０９２号明細書；米国特許第５，６４１，７８０号明細書；米国特許第５，１０１，０３８号明細書および米国特許第５，０８４，４６８号明細書、ならびにＰＣＴ出願の国際公開第９６／１０４０５号論説および欧州特許出願公開第０５３７５７５Ａ１号明細書を参照のこと。
Ｕｐｊｏｈｎ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｕｐｊｏｈｎ）はまた、ＣＣ−１０６５の誘導体の調製に積極的に取り組んでいる。例えば、米国特許第５，７３９，３５０号明細書；米国特許第４，９７８，７５７号明細書、米国特許第５，３３２，８３７号明細書および米国特許第４，９１２，２２７号明細書を参照のこと。
本発明の特に好ましい局面は、式（ｅ）：
Figure 0005846695
による構造を有する細胞毒性化合物を提供し、ここで環系Ａは、置換もしくは未置換アリール置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル基から選択されるメンバーである。典型的な環系はフェニルおよびピロールを含む。
記号ＥおよびＧは、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から独立して選択されるか、またはＥおよびＧは、場合により結合し、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから選択される環系が形成される。
記号Ｘは、Ｏ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーを表す。Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。
記号Ｒ３は、（＝Ｏ）、ＳＲ１１、ＮＨＲ１１およびＯＲ１１から選択されるメンバーを表し、ここでＲ１１は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、スルホネート、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２またはＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４である。記号Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換アリールを独立して表し、ここでＲ１２およびＲ１３は、それらの結合対象である窒素または炭素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成される。Ｒ１２、Ｒ１３、またはＲ１４のうちの１つ以上は、その構造内部に切断可能な基を含みうる。
Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２（式中、ｎは１〜２０の整数である）から独立して選択されるメンバーであるか、またはＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’の任意の隣接対は、それらの結合対象の炭素原子とともに結合し、４〜６員を有する置換もしくは未置換シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環系が形成される。Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルおよび置換もしくは未置換ペプチジルを独立して表し、ここでＲ１５およびＲ１６は、それらの結合対象の窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成される。１つの典型的な構造がアニリンである。
Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５およびＲ１６は、場合によりそれらの構造内部に１つ以上の切断可能な基、例えば切断可能なリンカーまたは切断可能な基質を有する。典型的な切断可能な基は、限定はされないが、ペプチド、アミノ酸、ヒドラジン、ジスルフィド、およびセファロスポリン誘導体を含む。
一部の態様では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５およびＲ１６の少なくとも１つを用い、本明細書中に記載のように、薬剤が本発明のリンカーまたは酵素切断可能な基質、例えばＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２、またはＪに結合される。
さらなる典型的な態様では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５およびＲ１６の少なくとも１つは化合物への複合に適する反応基を担持する。さらなる典型的な態様では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換アルキルおよび置換ヘテロアルキルから独立して選択され、かつアルキルまたはヘテロアルキル部分の遊離末端に反応官能基を有する。Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５およびＲ１６のうちの１つ以上は、別種、例えば標的化剤、検出可能な標識、固体支持体などに結合されうる。
Ｒ６は、存在するかまたは存在しない単結合である。Ｒ６が存在する場合、Ｒ６およびＲ７は結合し、シクロプロピル環が形成される。Ｒ７はＣＨ２−Ｘ１もしくは−ＣＨ２−である。Ｒ７が−ＣＨ２−である場合、それはシクロプロパン環の成分である。記号Ｘ１は、ハロゲン、例えばＣｌ、ＢｒもしくはＦなどの離脱基を表す。Ｒ６およびＲ７の結合は、化学価の原理に反しないように解釈される。
Ｘ１は任意の離脱基でありうる。有用な離脱基は、限定はされないが、ハロゲン、アジド、スルホン酸エステル（例えばアルキルスルホニル、アリールスルホニル）、オキソニウムイオン、アルキルパークロレート、アンモニオアルカンスルホネートエステル、アルキルフルオロスルホネートおよびフッ素化物（例えばトリフレート、ノナフレート、トレシレート）などを含む。離脱基として有用な特定のハロゲンは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒである。特定の一連の反応条件に適するこれらおよび他の離脱基の選択は当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｍａｒｃｈ Ｊ．、「Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９２年；Ｓａｎｄｌｅｒ ＳＲ、Ｋａｒｏ Ｗ、「Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ」、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８３年；およびＷａｄｅ ＬＧ、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９８０年を参照）。
６員環内部の曲線は、環が１以上の不飽和度を有し、それは芳香族性でありうることを示す。したがって、下記などの環構造およびそれに関連する構造が、式（ｆ）：
Figure 0005846695
の範囲内に含まれる。
一部の態様では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、およびＲ５’の少なくとも１つは前記薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させ、かつ
Figure 0005846695
を含み、ここで、ｖは１〜６の整数であり；かつＲ２７、Ｒ２７’、Ｒ２８、およびＲ２８’の各々は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、および置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択される。一部の態様では、Ｒ２７、Ｒ２７’、Ｒ２８、およびＲ２８’はすべてＨである。一部の態様では、ｖは１〜３の整数（好ましくは１）である。この単位を用い、アリール置換基を薬剤から分離することで、多剤耐性のための基質である化合物の生成に対する抵抗または回避がなされうる。
一態様では、Ｒ１１は、自己環化することなく、薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させる部分Ｘ５を含む。部分Ｘ５は、好ましくは酵素を用いて切断可能であり、切断される場合、活性薬剤を提供する。例として、Ｒ１１は構造（右側が薬剤の残りに共役した状態）：
Figure 0005846695
を有しうる。
典型的な態様では、式（ｅ）の環系Ａは、置換もしくは未置換フェニル環である。環系Ａは、本明細書中の定義セクションで示される１つ以上のアリール置換基で置換されうる。一部の態様では、フェニル環は、ＣＮまたはメトキシ部分で置換される。
一部の態様では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、およびＲ５’の少なくとも１つは前記薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させ、かつＲ３はＳＲ１１、ＮＨＲ１１およびＯＲ１１から選択される。Ｒ１１は、ＳＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＡＡｎ、−Ｓｉ（ＣＨ３）２Ｃ（ＣＨ３）３、−Ｃ（Ｏ）ＯＰｈＮＨ（ＡＡ）ｍ、
Figure 0005846695
または任意の他の糖もしくは糖の組み合わせ、
Figure 0005846695
およびその薬学的に許容できる塩から選択され、ここでｎは１〜１０の範囲内の任意の整数であり、ｍは１〜４の範囲内の任意の整数であり、ｐは１〜６の範囲内の任意の整数であり、かつＡＡは任意の天然または非天然アミノ酸である。一部の態様では、ＡＡｎまたはＡＡｍはペプチドリンカー（Ｆ）における上記と同じアミノ酸配列から選択され、場合によりＲ４、Ｒ４’、Ｒ５、もしくはＲ５’のリンカー部分で用いられるアミノ酸配列と同じである。少なくとも一部の態様では、Ｒ３はインビボで切断可能であることで活性薬剤化合物がもたらされる。少なくとも一部の態様では、Ｒ３はインビボでの化合物の溶解度を増大させる。一部の態様では、血中での活性薬剤の濃度の低下速度はＲ３の切断速度よりも実質的に速いことで活性薬剤がもたらされる。これは、活性薬剤の毒性がプロドラッグ形態の毒性よりも実質的に高い場合、特に有用でありうる。他の態様では、活性薬剤をもたらすためのＲ３の切断の速度は血中での活性薬剤の濃度の低下の速度よりも速い。
別の典型的な態様では、本発明は、式（ｇ）：
Figure 0005846695
による構造を有する化合物を提供する。
この態様では、置換基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｒ７およびＸの属性は式（ａ）における上記と実質的に同じであるとともに、特定の態様において好ましい。記号Ｚは、Ｏ、ＳおよびＮＲ２３から独立して選択されるメンバーである。記号Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーを表す。各Ｒ２３は独立して選択される。記号Ｒ１は、Ｈ、置換もしくは未置換低級アルキル、またはＣ（Ｏ）Ｒ８もしくはＣＯ２Ｒ８を表す。Ｒ８は、置換アルキル、未置換アルキル、ＮＲ９Ｒ１０、ＮＲ９ＮＨＲ１０およびＯＲ９から選択されるメンバーである。Ｒ９およびＲ１０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキルおよび置換もしくは未置換ヘテロアルキルから独立して選択される。Ｒ２はＨまたは置換もしくは未置換低級アルキルである。Ｒ２が置換アルキルである場合、それはペルフルオロアルキル、例えばＣＦ３以外であることが一般に好ましい。一態様では、Ｒ２は置換アルキルであり、ここでは置換基はハロゲンではない。別の態様では、Ｒ２は未置換アルキルである。
一部の態様では、Ｒ１はエステル部分、例えばＣＯ２ＣＨ３である。一部の態様では、Ｒ２は低級アルキル基であり、それは置換もしくは未置換でありうる。ここで好ましい低級アルキル基はＣＨ３である。一部の好ましい態様では、Ｒ１はＣＯ２ＣＨ３でありかつＲ２はＣＨ３である。
一部の態様では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、およびＲ５’は、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ２、ＯＭｅ、Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（Ｒ２９）２およびＮＯ２から独立して選択されるメンバーである。各Ｒ２９は、独立してＨまたは低級アルキル（例えばメチル）である。
一部の態様では、薬剤は、離脱基Ｘ１がハロゲン、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、およびアジドから選択されるメンバーであるように選択される。一部の態様では、Ｘ１はＦ、Ｃｌ、またはＢｒである。
一部の態様では、ＺはＯまたはＮＨである。一部の態様では、ＸはＯである。
さらに別の典型的な態様では、本発明は、式（ｈ）または（ｉ）：
Figure 0005846695
による構造を有する化合物を提供する。
式（ｅ）のデュオカルマイシン類似体の別の好ましい構造は、環系Ａが未置換もしくは置換フェニル環である場合の構造である。環系Ａがピロールである場合での式７の構造における上記の薬剤分子上の好ましい置換基はまた、環系Ａが未置換もしくは置換フェニル環である場合での好ましい置換基である。
例えば、好ましい態様では、薬剤（Ｄ）は、構造（ｊ）：
Figure 0005846695
を含む。
この構造では、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ７、Ｘは式（ｅ）において上記の通りである。さらに、ＺはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり、ここでＲ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。
Ｒ１は、Ｈ、置換もしくは未置換低級アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ８、またはＣＯ２Ｒ８であり、ここでＲ８はＮＲ９Ｒ１０およびＯＲ９から選択されるメンバーであり、ここでＲ９およびＲ１０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキルおよび置換もしくは未置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーである。
Ｒ１’は、Ｈ、置換もしくは未置換低級アルキル、またはＣ（Ｏ）Ｒ８であり、ここでＲ８はＮＲ９Ｒ１０およびＯＲ９から選択されるメンバーであり、ここでＲ９およびＲ１０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキルおよび置換もしくは未置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーである。
Ｒ２は、Ｈ、または置換もしくは未置換低級アルキルまたは未置換ヘテロアルキルまたはシアノまたはアルコキシであり、かつＲ２’は、Ｈ、または置換もしくは未置換低級アルキルまたは未置換ヘテロアルキルである。
Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５またはＲ１６の少なくとも１つは、薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させる。
薬剤（Ｄ）の別の態様は構造（ｋ）を含み、ここでＲ４およびＲ４’は結合し、ヘテロシクロアルキル：
Figure 0005846695
が形成される。
この構造では、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｒ７、Ｘは式（ｅ）において上記の通りである。さらに、ＺはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり、ここでＲ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。
Ｒ３２は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２から選択され、ここでｎは１〜２０の整数である。Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルおよび置換もしくは未置換ペプチジルを独立して表し、ここでＲ１５およびＲ１６はそれらの結合対象である窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成される。Ｒ３２は、場合により、その構造内部に１つ以上の切断可能な基、例えば切断可能なリンカーまたは切断可能な基質を有する。典型的な切断可能な基は、限定はされないが、ペプチド、アミノ酸、ヒドラジン、ジスルフィド、およびセファロスポリン誘導体を含む。さらに、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１５、およびＲ１６に対する本明細書中に記載の置換基の選択はＲ３２にも適用可能である。
Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５、Ｒ１６、またはＲ３２の少なくとも１つは、薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させる。少なくとも一部の態様では、Ｒ３２は薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させる。
この化合物の好ましい一態様は、
Figure 0005846695
である。
Ｒ１は、Ｈ、置換もしくは未置換低級アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ８、またはＣＯ２Ｒ８であり、ここでＲ８はＮＲ９Ｒ１０およびＯＲ９から選択されるメンバーであり、ここでＲ９およびＲ１０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキルおよび置換もしくは未置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーである。
Ｒ１’は、Ｈ、置換もしくは未置換低級アルキル、またはＣ（Ｏ）Ｒ８であり、ここでＲ８はＮＲ９Ｒ１０およびＯＲ９から選択されるメンバーであり、ここでＲ９およびＲ１０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキルおよび置換もしくは未置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーである。
Ｒ２は、Ｈ、または置換もしくは未置換低級アルキルまたは未置換ヘテロアルキルまたはシアノまたはアルコキシであり、かつＲ２’は、Ｈ、または置換もしくは未置換低級アルキルまたは未置換ヘテロアルキルである。
さらなる態様は、式：
Figure 0005846695
を有する。
この構造では、Ａ、Ｒ６、Ｒ７、Ｘ、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、およびＲ５’は式（ｅ）において上記の通りである。さらに、ＺはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり、ここでＲ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。
Ｒ３３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、ならびにＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２から選択され、ここでｎは１〜２０の整数である。Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルおよび置換もしくは未置換ペプチジルを独立して表し、ここでＲ１５およびＲ１６はそれらの結合対象である窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成される。Ｒ３３は薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させる。
好ましくは、Ａは置換もしくは未置換フェニルまたは置換もしくは未置換ピロールである。さらに、Ｒ１１に対する本明細書中に記載の置換基の選択はＲ３３にも適用可能である。
リガンド
Ｘ４は保護反応官能基、非保護反応官能基、検出可能な標識、および標的化剤からなる群から選択されるリガンドを表す。好ましいリガンドは標的化剤、例えば抗体およびその断片である。
一部の態様では、Ｘ４基はＲ２９、ＣＯＯＲ２９、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２９、およびＣ（Ｏ）ＮＮＲ２９から選択されるメンバーとして記述可能であり、ここでＲ２９は、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換ヘテロアリールから選択されるメンバーである。さらに別の典型的な態様では、Ｒ２９はチオール反応性メンバーである。さらに典型的な態様では、Ｒ２９は、ハロアセチルおよびアルキルハロゲン化誘導体、マレイミド、アジリジン、およびアクリロイル誘導体から選択されるチオール反応性メンバーである。上記チオール反応性メンバーは、例えば標的化剤のアミノ酸の側鎖、例えば抗体と反応しうる反応性保護基として作用することで、標的化剤をリンカー−薬剤部分に結合させうる。
検出可能な標識
本発明の化合物および方法と併用される特定の標識または検出可能な基は、本発明の化合物の活性または有用性と有意に干渉することがない限り、一般に本発明の重要な局面ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の材料でありうる。かかる検出可能な標識はイムノアッセイ法の分野で十分に開発されており、一般にかかる方法で有用な大部分の任意の標識が本発明に適用可能である。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の組成物である。本発明で有用な標識は、磁気ビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光色素（例えばフルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡで一般に用いられるその他のもの）、ならびにコロイド状金または着色ガラスまたはプラスチックビーズ（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）などの比色標識を含む。
標識は、当該技術分野で周知の方法に従い、本発明の化合物に直接的または間接的に共役されうる。上記のように、多種多様な標識の使用が可能であり、そこでの標識の選択は、要求される感受性、化合物との複合の容易性、安定性の要求、使用可能な器具類、および使い捨ての設備（ｄｉｓｐｏｓａｌ ｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）に依存する。
本発明の化合物が検出可能な標識に結合される場合、標識は好ましくは放射性同位体、蛍光物質、蛍光物質前駆体、発色団、酵素およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーである。様々な基を抗体に複合するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、抗体に結合されることが多い検出可能な標識は、酵素、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼである。
非放射性標識は間接的手段により結合されることが多い。一般に、リガンド分子（例えばビオチン）は複合体の成分に共有結合される。次いで、リガンドは別の分子（例えばストレプトアビジン分子）に結合し、それは本質的に検出可能であるかあるいはシグナル系、例えば検出可能な酵素、蛍光化合物、または化学発光化合物に共有結合される。
本発明の複合体の成分はまた、例えば酵素またはフルオロフォアとの複合により、シグナル生成化合物に直接結合されうる。標識としての目的の酵素は、主に加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドターゼ（ｏｘｉｄｏｔａｓｅ）、特にペルオキシダーゼとなる。蛍光化合物は、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどを含む。化学発光化合物は、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールを含む。使用可能な様々な標識またはシグナル生成系についてのレビューとしては、米国特許第４，３９１，９０４号明細書を参照のこと。
標識を検出する手段は当業者に周知である。したがって、例えば、標識が放射性標識である場合、検出用手段はオートラジオグラフィーなどではシンチレーションカウンターまたは写真フィルムを含む。標識が蛍光標識である場合、それは蛍光色素を適切な光の波長で励起し、得られる蛍光を検出することで検出可能である。蛍光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管などの電子検出器の使用により、写真フィルムを用いて視覚的に検出可能である。同様に、酵素標識は、酵素に適する基質を提供し、得られた反応生成物を検出することにより検出可能である。最後に、簡素な比色標識は、単に標識に関連する色を観察することにより検出可能である。したがって、様々なディップスティックアッセイ法では、結合された金がピンク色を呈することが多い一方、様々な複合ビーズがビーズの色を呈する。
蛍光標識は取扱い上の注意がほとんど要求されないという利点を有し、高スループット画像化技術（コンピュータを含む集積システムにおける分析用の画像のデジタル化を含む光学分析）への適合性が高いことから、ここでは好ましい。好ましい標識は、典型的には、標識における高い感受性、高い安定性、低いバックグラウンド、低い環境感受性および高い特異性のうちの１つ以上で特徴づけられる。多数の蛍光標識が、ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（ミズーリ州セントルイス（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ））、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ユージン（Ｅｕｇｅｎｅ））、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ））、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ））、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ））、Ｃｈｅｍ Ｇｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ））、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（メリーランド州ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ））、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ Ａｎａｌｙｔｉｋａ（スイス、ブッフス（Ｂｕｃｈｓ）のＦｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ）、およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ））、ならびに当業者に既知の多数の他の市販元から市販されている。さらに、当業者は、特定の用途に適するフルオロフォアの選択方法を理解し、市販品として容易に入手できない場合、必要なフルオロフォアを新規に合成するかまたは市販の蛍光化合物を合成的に修飾し、所望の蛍光標識の入手に至ることができるであろう。
小分子のフルオロフォアに加え、天然蛍光タンパク質およびかかるタンパク質の改変類似体は本発明で有用である。かかるタンパク質として、例えば、刺胞動物の緑色蛍光タンパク質（Ｗａｒｄら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．３５：８０３−８０８頁（１９８２年）；Ｌｅｖｉｎｅら、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、７２Ｂ：７７−８５頁（１９８２年））、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）株由来の黄色蛍光タンパク質（Ｂａｌｄｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：５５０９−１５頁（１９９０年））、渦鞭毛藻のシンビオジニウム種（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．）由来のペリジニン−クロロフィル（Ｍｏｒｒｉｓら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４：６７３：７７頁（１９９４年））、海洋シアノバクテリア、例えばシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）由来のフィコビリンタンパク質、例えばフィコエリトリンおよびフィコシアニン（Ｗｉｌｂａｎｋｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２２６−３５（１９９３年））などが挙げられる。
一般に、細胞毒素と標的化剤（または他の作用物質）、場合によりスペーサー基の間での結合の形成に先立ち、化学官能基の少なくとも１つが活性化されることになる。当業者は、ヒドロキシ、アミノ、およびカルボキシ基を含む種々の化学官能基が種々の標準の方法および条件を用いて活性化されうることを理解するであろう。例えば、細胞毒素または標的化剤の水酸基がホスゲンでの処理を通じて活性化され、対応するクロロホルメート（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）またはクロロホルメートｐ−ニトロフェニル（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）が形成され、対応するカルボネートが形成されうる。
典型的な態様では、本発明ではカルボキシル官能基を含む標的化剤が使用される。カルボキシル基は、例えば対応するアシルハロゲン化物または活性エステルへの変換により活性化されうる。この反応は、Ｍａｒｃｈ、上記、３８８−８９頁で例示のように種々の条件下で行われうる。典型的な態様では、ハロゲン化アシルは、カルボキシル含有基と塩化オキサリルとの反応を通じて調製される。活性化剤は細胞毒素または細胞毒素−リンカーアーム複合体と反応し、本発明の複合体が形成される。当業者は、カルボキシル含有標的化剤の使用はあくまで例示であり、多数の他の官能基を有する作用物質が本発明のリンカーに結合されうることを理解するであろう。
反応官能基
例示の簡素化のため、以下の考察では本発明の細胞毒素と標的化剤との複合について着目される。その着目により本発明の一態様が例示され、その他は当業者により容易に推定される。本発明が単一の態様に関する考察に着目することによって限定されることは全く意図されていない。
本発明の典型的な化合物は一般に置換もしくは未置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖上に位置する反応官能基を担持することから、それらの別種への容易な結合が可能になる。反応基にとって好都合な位置は鎖の末端位置である。
本発明の実施において有用な反応の反応基およびクラスは、一般にバイオコンジュゲート化学の技術分野で周知のものである。反応官能基は保護または非保護の場合があり、基の保護性は有機合成の技術分野で既知の方法により変化しうる。反応性の細胞毒素類似体の場合に使用可能な好ましい反応のクラスは比較的穏やかな条件下で進行するものである。これらは、限定はされないが、求核置換基（例えばアミンおよびアルコールとハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換基（例えばエナミン反応）、ならびに炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子の複数の結合の付加（例えばマイケル反応、ディールス−アルダー付加）を含む。これらおよび他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ、「Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８５年；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、１９９６年、およびＦｅｅｎｅｙら、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ」、第１９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）、１９８２年において考察されている。
典型的な反応タイプは、カルボキシル基と、限定はされないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステルを含むその様々な誘導体との反応を含む。水酸基は、エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換されうる。ハロアルキル基は、例えば、アミン、カルボン酸アニオン、チオールアニオン、カルボアニオン、またはアルコキシドイオンとの反応により新種に変換される。求ジエン体（例えばマレイミド）基はディールス−アルダー付加に関与する。アルデヒドまたはケトン基は、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンもしくはオキシムにまたはグリニャール付加またはアルキルリチウム付加のような機序を介して変換されうる。ハロゲン化スルホニルは例えばアミンと容易に反応し、スルホンアミドが形成される。アミンまたはスルフヒドリル基は、例えばアシル化、アルキル化または酸化される。アルケンは、付加環化、アシル化、マイケル付加などを用いて一連の新種に変換されうる。エポキシドは、アミンおよびヒドロキシル化合物と容易に反応する。
当業者は、これら結合の多数が種々の方法でかつ種々の条件を用いて生成可能であることを容易に理解するであろう。エステルの調製においては例えばＭａｒｃｈ、上記、１１５７頁を参照し；チオエステルにおいてはＭａｒｃｈ、上記、３６２−３６３頁、４９１頁、７２０−７２２頁、８２９頁、９４１頁、および１１７２頁を参照し；カルボネートにおいてはＭａｒｃｈ、上記、３４６−３４７頁を参照し；カルバメートにおいてはＭａｒｃｈ、上記、１１５６−５７頁を参照し；アミドにおいてはＭａｒｃｈ、上記、１１５２頁を参照し；尿素およびチオ尿素においてはＭａｒｃｈ、上記、１１７４頁を参照し；アセタールおよびケタールにおいてはＧｒｅｅｎｅら、上記、１７８−２１０頁およびＭａｒｃｈ、上記、１１４６頁を参照し；アシルオキシアルキル誘導体においては「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ｔｏｐｉｃａｌ ａｎｄ Ｏｃｕｌａｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｋ．Ｂ．Ｓｌｏａｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９２年を参照し；エノールエステルにおいてはＭａｒｃｈ、上記、１１６０頁を参照し；Ｎ−スルホニルイミデートにおいてはＢｕｎｄｇａａｒｄら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３１：２０６６頁（１９８８年）を参照し；無水物においてはＭａｒｃｈ、上記、３５５−５６頁、６３６−３７頁、９９０−９１頁、および１１５４頁を参照し；Ｎ−アシルアミドにおいてはＭａｒｃｈ、上記、３７９頁を参照し；Ｎ−マンニッヒ塩基においてはＭａｒｃｈ、上記、８００−０２頁および８２８頁を参照し；ヒドロキシメチルケトンエステルにおいてはＰｅｔｒａｃｅｋら、Ａｎｎａｌｓ ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、５０７：３５３−５４頁（１９８７年）を参照し；ジスルフィドにおいてはＭａｒｃｈ、上記、１１６０頁を参照し；かつホスホン酸エステルおよびホスホンアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｍｉｄａｔｅ）においては。
反応官能基は非保護であり、反応に関与または干渉しないように選択されうる。あるいは、反応官能基は保護基の存在により反応への関与から保護されうる。当業者は、特定の官能基を選択された一連の反応条件への干渉から保護する方法を理解するであろう。有用な保護基の例として、Ｇｒｅｅｎｅら、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９１年を参照のこと。
典型的には、標的化剤は、その各化学官能基による標準の化学技術を用いて細胞毒素に共有結合される。場合により、リンカーまたは作用物質は１つ以上のスペーサー基を介して作用物質に共役される。スペーサー基は、併用される場合、等しいかまたは異なりうる。
一般に細胞毒素と反応官能基、場合によりスペーサー基の間での結合の形成に先立ち、化学官能基の少なくとも１つが活性化されることになる。当業者は、ヒドロキシ、アミノ、およびカルボキシ基を含む種々の化学官能基が種々の標準の方法および条件を用いて活性化されうることを理解するであろう。典型的な態様では、本発明は反応官能基としてカルボキシル官能基を含む。カルボキシル基は上記のように活性化されうる。
切断可能な基質
本発明の切断可能な基質は「Ｘ２」として表される。好ましくは、切断可能な基質は酵素により切断されうる切断可能な酵素基質である。好ましくは、酵素は、治療されるべき腫瘍または他の標的細胞と直接的または間接的に優先的に結合される。酵素は、治療されるべき腫瘍または他の標的細胞により生成されうる。例えば、切断可能な基質は、腫瘍または他の標的細胞の近傍もしくは内部に見出される酵素により優先的に切断可能なペプチドでありうる。さらにまたはかわりに、酵素は、腫瘍細胞に特異的に結合する標的化剤、例えば腫瘍抗原に特異的な抗体に結合されうる。
上記の薬剤への共役に適する酵素切断可能な基質の例として、ＰＣＴ特許出願公開の国際公開第００／３３８８８号論説、国際公開第０１／９５９４３号論説、国際公開第０１／９５９４５号論説、国際公開第０２／００２６３号論説、および国際公開第０２／１００３５３号論説（これらのすべては参照により本明細書中に援用される）は、切断可能なペプチドの薬剤への結合について開示している。ペプチドは、腫瘍に関連した酵素、例えばｔｒｏｕａｓｅ（チメットオリゴペプチダーゼなど）、ＣＤ１０（ネプリリシン）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ２またはＭＭＰ９など）、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ（ヘプシン、テスチシン、ＴＭＰＲＳＳ４、またはマトリプターゼ／ＭＴ−ＳＰ１など）、またはカテプシンにより切断可能である。この態様では、プロドラッグは、上記の薬剤、ペプチド、安定化基、また場合により薬剤とペプチドの間の連結基を含む。安定化基がペプチドの末端に結合されることで、プロドラッグが腫瘍または他の標的細胞に到達するまで分解から保護される。適切な安定化基の例として、非アミノ酸、例えばコハク酸、ジグリコール酸、マレイン酸、ポリエチレングリコール、ピログルタミン酸、酢酸、ナフチルカルボン酸、テレフタル酸、およびグルタル酸誘導体；ならびにアスパラギン酸のβ−カルボキシ基またはグルタミン酸のγ−カルボキシル基でのペプチドのＮ末端に結合された遺伝的にコードされないアミノ酸またはアスパラギン酸またはグルタミン酸が挙げられる。
ペプチドは、典型的には３〜１２個（またはそれより多数）のアミノ酸を含む。特定のアミノ酸の選択は、少なくとも部分的にペプチドの切断に用いられる酵素、ならびにインビボでのペプチドの安定性に依存することになる。適切な切断可能なペプチドの一例がβ−ＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕである。これが安定化基と結合することで、スクシニル−β−ＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕが形成されうる。適切な切断可能なペプチドの他の例が上記の参考文献にて提供される。
一具体例として、ネプリリシン、中性エンドペプチターゼ（ＮＥＰ）、および急性リンパ芽球性白血病共通抗原（ＣＡＬＬＡ）としても知られるＣＤ１０はＩＩ型細胞表面亜鉛依存性メタロプロテアーゼである。ＣＤ１０との使用に適する切断可能な基質として、ＬｅｕＡｌａＬｅｕおよびＩｌｅＡｌａＬｅｕが挙げられる。ＣＤ１０に対する他の既知の基質が最大で５０アミノ酸長のペプチドを含むが、基質が大きくなると触媒効率は低下することが多い。
別の具体例はマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に基づく。おそらくは最良に特徴づけられたタンパク質分解酵素は腫瘍に関連し、腫瘍微小環境内でのＭＭＰの活性化には明らかな相関がある。特に、可溶性のマトリックス酵素ＭＭＰ２（ゼラチナーゼＡ）およびＭＭＰ９（ゼラチナーゼＢ）については徹底した試験が行われ、腫瘍成長を含む組織リモデリングの間に選択的に活性化されることが示されている。デキストランとメトトレキサートの複合体については、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９により切断されるように設計されたペプチド配列の設計および試験が行われている（Ｃｈａｕら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１５：９３１−９４１頁（２００４年））；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）およびドキソルビシン（Ｂａｅら、Ｄｒｕｇｓ Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．２９：１５−２３頁（２００４年））、ならびにアルブミンおよびドキソルビシン（Ｋｒａｔｚら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１１：２００１−２００６頁（２００１年））。ＭＭＰとの使用に適する配列の例として、限定はされないが、ＰｒｏＶａｌＧｌｙＬｅｕＩｌｅＧｌｙ（配列番号１０２）、ＧｌｙＰｒｏＬｅｕＧｌｙＶａｌ（配列番号１０３）、ＧｌｙＰｒｏＬｅｕＧｌｙＩｌｅＡｌａＧｌｙＧｌｎ（配列番号１０４）、ＰｒｏＬｅｕＧｌｙＬｅｕ（配列番号１０５）、ＧｌｙＰｒｏＬｅｕＧｌｙＭｅｔＬｅｕＳｅｒＧｌｎ（配列番号１０６）、およびＧｌｙＰｒｏＬｅｕＧｌｙＬｅｕＴｒｐＡｌａＧｌｎ（配列番号１０７）が挙げられる（例えば上記の参考文献ならびにＫｌｉｎｅら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．１：９−２２頁（２００４年）およびＬｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：６０６１−６０６７頁（２０００年）を参照）。他の切断可能な基質の使用も可能である。
さらに別の例がＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼである。この酵素の基として、例えばヘプシン、テスチシン、およびＴＭＰＲＳＳ４が挙げられる。ＧｌｎＡｌａＡｒｇは（乳癌および卵巣癌において過剰発現される）マトリプターゼ／ＭＴ−ＳＰ１の場合に有用な１つの基質配列であり、ＬｅｕＳｅｒＡｒｇは（前立腺癌および一部の他の腫瘍タイプにおいて過剰発現される）ヘプシンの場合に有用である（例えば、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３６７２０−３６７２５頁およびＫｕｒａｃｈｉおよびＹａｍａｍｏｔｏ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｖｏｌ．２」、第２版（Ｂａｒｒｅｔｔ ＡＪ、Ｒａｗｌｉｎｇｓ ＮＤおよびＷｏｅｓｓｎｅｒ ＪＦ編）、１６９９−１７０２頁（２００４年）を参照）。他の切断可能な基質の使用も可能である。
切断可能な基質配列の別のタイプとして、腫瘍または細胞と結合状態になる切断可能な基質を切断する能力がある別の酵素の調製が含まれる。例えば、酵素が腫瘍特異抗体（または腫瘍もしくは受容体リガンドなどの他の標的細胞に優先的に引き付けられる他の実体）に共役され、次いで酵素−抗体複合体が患者に提供されうる。酵素−抗体複合体は、腫瘍に関連した抗原に導かれ、結合される。次いで、薬剤−切断可能な基質複合体がプロドラッグとして患者に提供される。薬剤は、薬剤−切断可能な基質複合体が腫瘍と結合状態になっている酵素と、切断可能な基質が切断されかつ薬剤が遊離されるように相互作用する場合に、腫瘍の近傍でのみ放出される。例えば、米国特許第４，９７５，２７８号明細書；米国特許第５，５８７，１６１号明細書；米国特許第５，６６０，８２９号明細書；米国特許第５，７７３，４３５号明細書、および米国特許第６，１３２，７２２号明細書（これらのすべては参照により本明細書中に援用される）はかかる配列を開示している。適切な酵素および基質の例として、限定はされないが、β−ラクタマーゼおよびセファロスポリン誘導体、カルボキシペプチターゼＧ２およびグルタミン酸およびアスパラギン酸および葉酸誘導体が挙げられる。
一態様では、酵素−抗体複合体は、目的の標的細胞上または標的部位で発現される抗原に対するその特異性に基づいて選択される抗体または抗体断片を含む。抗体についての考察が上記に与えられる。適切なセファロスポリン−切断可能な基質の一例が、
Figure 0005846695
である。
複合体の例
本発明のリンカーおよび切断可能な基質は、種々のパートナー分子を有する複合体内で用いられうる。本発明の複合体の例が、下記にさらに詳述される。他に指定がない限り、置換基は、細胞毒素、リンカー、および切断可能な基質に関するセクションで上記のように定義される。
Ａ．リンカー複合体
適切な複合体の一例が、式：
Figure 0005846695
の化合物であり、ここでＬ１は自己犠牲リンカーであり；ｍは０、１、２、３、４、５、もしくは６の整数であり；Ｆは構造：
Figure 0005846695
を含むリンカーであり、ここでＡＡ１は天然アミノ酸および非天然α−アミノ酸からなる群から独立して選択される１種以上のメンバーであり；ｃは１〜２０の整数であり；Ｌ２は自己犠牲リンカーでありかつ
Figure 0005846695
を含み、ここでＲ１７、Ｒ１８、およびＲ１９の各々は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換アリールから独立して選択され、かつｗは０〜４の整数であり；ｏは１であり；Ｌ４はリンカーメンバーであり；ｐは０もしくは１であり；Ｘ４は保護反応官能基、非保護反応官能基、検出可能な標識、および標的化剤からなる群から選択されるメンバーであり；かつＤは構造：
Figure 0005846695
を含み、ここで環系Ａは、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル基から選択されるメンバーであり；ＥおよびＧは、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から独立して選択されるメンバーであるか、またはＥおよびＧは結合し、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから選択される環系が形成され；ＸはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり；Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり；Ｒ３はＯＲ１１であり、ここでＲ１１は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、スルホネート、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２およびＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４からなる群から選択されるメンバーであり、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２からなる群から独立して選択されるメンバーであるか、またはＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’の任意の隣接対はそれらの結合対象である炭素原子とともに結合し、４〜６員を有する置換もしくは未置換シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環系が形成され；ここでｎは１〜２０の整数であり；Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、および置換もしくは未置換ペプチジルから独立して選択され、ここでＲ１５およびＲ１６はそれらの結合対象である窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され；Ｒ６は存在するかまたは存在しない単結合であり、存在する場合、Ｒ６およびＲ７は結合し、シクロプロピル環が形成され；かつＲ７はＲ６と前記シクロプロピル環内でＣＨ２−Ｘ１もしくは−ＣＨ２−で結合され、ここでＸ１は離脱基であり、ここでＲ１１は前記薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦに結合させる。
一部の態様では、薬剤は上記の構造（ｃ）または（ｆ）を有する。複合体としての使用に適する化合物の一例として、
Figure 0005846695
が挙げられる。
複合体のタイプの別の例が、式：
Figure 0005846695
の化合物であり、ここでＬ１は自己犠牲リンカーであり；ｍは０、１、２、３、４、５、もしくは６の整数であり；Ｆは構造：
Figure 0005846695
を含むリンカーであり、ここでＡＡ１は天然アミノ酸および非天然α−アミノ酸からなる群から独立して選択される１種以上のメンバーであり；ｃは１〜２０の整数であり；Ｌ２は自己犠牲リンカーであり；ｏは０もしくは１であり；Ｌ４はリンカーメンバーであり；ｐは０もしくは１であり；Ｘ４は保護反応官能基、非保護反応官能基、検出可能な標識、および標的化剤からなる群から選択されるメンバーであり；かつＤは構造：
Figure 0005846695
を含み、ここで環系Ａは、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル基から選択されるメンバーであり；ＥおよびＧは、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から独立して選択されるメンバーであるか、またはＥおよびＧは結合し、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから選択される環系が形成され；ＸはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり；Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり；Ｒ３は（＝Ｏ）、ＳＲ１１、ＮＨＲ１１およびＯＲ１１からなる群から選択されるメンバーであり、ここでＲ１１は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、スルホネート、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２およびＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４からなる群から選択されるメンバーであり、ここでＲ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換アリールから独立して選択されるメンバーであり、ここでＲ１２およびＲ１３はそれらの結合対象である窒素または炭素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され；Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２からなる群から独立して選択されるメンバーであるか、またはＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’の任意の隣接対はそれらの結合対象である炭素原子とともに結合し、４〜６員を有する置換もしくは未置換シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環系が形成され、ここでｎは１〜２０の整数であり；Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、および置換もしくは未置換ペプチジルから独立して選択され、ここでＲ１５およびＲ１６はそれらの結合対象である窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され；ここでＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’の少なくとも１つは前記薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦに結合させ、かつ
Figure 0005846695
を含み、ここでｖは１〜６の整数であり；かつＲ２７、Ｒ２７’、Ｒ２８、およびＲ２８’の各々は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、および置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択され；Ｒ６は存在するかまたは存在しない単結合であり、存在する場合、Ｒ６およびＲ７は結合し、シクロプロピル環が形成され；かつＲ７はＲ６と前記シクロプロピル環内でＣＨ２−Ｘ１もしくは−ＣＨ２−で結合され、ここでＸ１は離脱基である。
一部の態様では、薬剤は上記の構造（ｃ）または（ｆ）を有する。複合体としての使用に適する化合物の１つの具体例が、
Figure 0005846695
であり、ここでｒは０〜２４の範囲内の整数である。
適切な複合体の別の例が、式：
Figure 0005846695
の化合物であり、ここでＬ１は自己犠牲リンカーであり、ｍは０、１、２、３、４、５、もしくは６の整数であり、Ｆは構造：
Figure 0005846695
を含むリンカーであり、ここでＡＡ１は天然アミノ酸および非天然α−アミノ酸からなる群から独立して選択される１つ以上のメンバーであり；ｃは１〜２０の整数であり；Ｌ３は第一級もしくは第二級アミンを含むスペーサー基またはカルボキシル官能基であり；ここでＬ３が存在する場合、ｍは０でありかつＬ３のアミンがＤの懸垂カルボキシル官能基とアミド結合を形成するか、またはＬ３のカルボキシルがＤの懸垂アミン官能基とアミド結合を形成し；ｏは０もしくは１であり；Ｌ４はリンカーメンバーであり、ここでＬ４は（ＡＡ１）ｃのＮ末端に直接結合された
Figure 0005846695
を含み、ここでＲ２０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり、Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６、およびＲ２６’の各々は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、および置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択され、かつｓおよびｔは独立して１〜６の整数であり；ｐは１であり；Ｘ４は保護反応官能基、非保護反応官能基、検出可能な標識、および標的化剤からなる群から選択されるメンバーであり、かつＤは構造：
Figure 0005846695
を含み、ここで環系Ａは、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル基から選択されるメンバーであり；ＥおよびＧは、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から独立して選択されるメンバーであるか、またはＥおよびＧは結合し、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから選択される環系が形成され；ＸはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり；Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり；Ｒ３は（＝Ｏ）、ＳＲ１１、ＮＨＲ１１およびＯＲ１１からなる群から選択されるメンバーであり、ここでＲ１１は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、スルホネート、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２およびＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４からなる群から選択されるメンバーであり、ここでＲ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換アリールから独立して選択されるメンバーであり、ここでＲ１２およびＲ１３はそれらの結合対象である窒素または炭素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され；Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２からなる群から独立して選択されるメンバーであるか、またはＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’の任意の隣接対はそれらの結合対象である炭素原子とともに結合し、４〜６員を有する置換もしくは未置換シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環系が形成され、ここでｎは１〜２０の整数であり；Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、および置換もしくは未置換ペプチジルから独立して選択され、ここでＲ１５およびＲ１６はそれらの結合対象である窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され；Ｒ６は存在するかまたは存在しない単結合であり、存在する場合、Ｒ６およびＲ７は結合し、シクロプロピル環が形成され；かつＲ７はＲ６と前記シクロプロピル環内でＣＨ２−Ｘ１もしくは−ＣＨ２−で結合され、ここでＸ１は離脱基であり、ここでＲ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１５またはＲ１６のうちの少なくとも１つは前記薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦに結合させる。
一部の態様では、薬剤は上記の構造（ｃ）または（ｆ）を有する。複合体としての使用に適する化合物の１つの具体例が、
Figure 0005846695
であり、ここでｒは０〜２４の範囲内の整数である。
複合体としての使用に適する化合物の他の例として、
Figure 0005846695
Figure 0005846695
Figure 0005846695
Figure 0005846695
が挙げられ、ここでＲは
Figure 0005846695
であり、かつｒは０〜２４の範囲内の整数である。
複合体はまた、構造（ｇ）、例えば化合物：
Figure 0005846695
Figure 0005846695
Figure 0005846695
を有する薬剤を用いて形成可能であり、ここでｒは０〜２４の範囲内の整数である。
複合体はまた、構造：
Figure 0005846695
Figure 0005846695
を有する薬剤を用いて形成されうる。
かかる毒素の合成に加え、抗体へのその結合に関する詳細が、米国仮特許出願第６０／９９１，３００号明細書に開示されている。
Ｂ．切断可能なリンカー複合体
適切な複合体の一例が、構造：
Figure 0005846695
を有する化合物であり、ここでＬ１は自己犠牲スペーサーであり、ｍは０、１、２、３、４、５、もしくは６の整数であり；Ｘ２は切断可能な基質であり；かつＤは構造：
Figure 0005846695
を含み、ここで環系Ａは、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル基から選択されるメンバーであり；ＥおよびＧは、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から独立して選択されるメンバーであるか、またはＥおよびＧは結合し、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから選択される環系が形成され；ＸはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり；Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり；Ｒ３は（＝Ｏ）、ＳＲ１１、ＮＨＲ１１およびＯＲ１１からなる群から選択されるメンバーであり、ここでＲ１１は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、スルホネート、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２およびＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４からなる群から選択されるメンバーであり、ここでＲ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換アリールから独立して選択されるメンバーであり、ここでＲ１２およびＲ１３はそれらの結合対象である窒素または炭素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され；Ｒ６は存在するかまたは存在しない単結合であり、存在する場合、Ｒ６およびＲ７は結合し、シクロプロピル環が形成され；かつＲ７はＲ６と前記シクロプロピル環内でＣＨ２−Ｘ１もしくは−ＣＨ２−で結合され、ここでＸ１は離脱基であり、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２からなる群から独立して選択されるメンバーであるか、またはＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’の任意の隣接対はそれらの結合対象である炭素原子とともに結合し、４〜６員を有する置換もしくは未置換シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環系が形成され、ここでｎは１〜２０の整数であり；Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、および置換もしくは未置換ペプチジルから独立して選択され、ここでＲ１５およびＲ１６はそれらの結合対象である窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され、ここでＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’のメンバーうちの少なくとも１つは前記薬剤をＬ１（存在する場合）またはＸ２に結合させ、かつ
Figure 0005846695
からなる群から選択され、ここでＲ３０、Ｒ３０’、Ｒ３１、およびＲ３１’は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、および置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択され；かつｖは１〜６の整数である。
適切な切断可能なリンカーの例として、β−ＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕおよび
Figure 0005846695
が挙げられる。
医薬組成物
別の局面では、本開示は、組成物、例えば薬学的に許容できる担体とともに調製された本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分のうちの１つまたは組み合わせを含有する医薬組成物を提供する。かかる組成物は、本開示の（例えば２種もしくは３種以上の異なる）抗体または免疫複合体または二重特異性分子のうちの１つまたはそれらの組み合わせを含有しうる。例えば、本開示の医薬組成物は、標的抗原上で異なるエピトープに結合するかまたは相補的活性を有する抗体（または免疫複合体または二重特異性抗体）の組み合わせを含有しうる。
本開示の医薬組成物は、併用療法、すなわち他の作用物質との併用であっても投与可能である。例えば、併用療法は、本開示の抗ＣＤ２２抗体と、少なくとも１つの他の抗癌剤、抗炎症物質または免疫抑制剤との併用を含みうる。併用療法で用いられうる治療物質の例が、本開示の抗体の使用に関する下記セクションにおいてより詳細に記載される。
本明細書で用いられる「薬学的に許容できる担体」は、生理学的に適合可能な、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば注射または注入による）に適する。投与経路に依存し、活性化合物、すなわち抗体、免疫複合体または二重特異性分子は、化合物を酸の活性および化合物を不活性化しうる他の天然条件から保護するための材料でコートされうる。
本開示の医薬品化合物は、１つ以上の薬学的に許容できる塩を含む。「薬学的に許容できる塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持する塩を示し、任意の望ましくない毒物学的効果を与えることがない（例えば、ベルゲ（Ｂｅｒｇｅ），Ｓ．Ｍ．ら（１９７７年）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９頁を参照）。かかる塩の例として、酸添加塩および塩基添加塩が挙げられる。酸添加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性無機酸や、脂肪族モノカルボキシル酸およびジカルボキシル酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸から誘導される塩を含む。塩基添加塩は、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどや、非毒性有機アミン、例えばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどから誘導される塩を含む。
本開示の医薬組成物は、薬学的に許容できる酸化防止剤も含有しうる。薬学的に許容できる酸化防止剤の例として、（１）水溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油可溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
本開示の医薬組成物中に用いられうる適切な水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物、植物オイル、例えばオリーブオイルならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。適切な液性が、例えば、コーティング材、例えばレシチンの使用、分散の場合に必要とされる粒径の維持ならびに界面活性剤の使用により維持されうる。
これらの組成物は、防腐剤、浸潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有しうる。微生物の出現の防止は、上記の滅菌法と、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの封入との双方により保証されうる。組成物中に等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含めることも望ましい場合がある。さらに、注射可能な医薬形態の吸収遅延がモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる作用物質の封入によりもたらされうる。
薬学的に許容できる担体は、注射可能な無菌溶液または分散系の即時調製のための無菌水溶液または分散系および無菌粉末を含む。医薬活性物質におけるかかる媒体および作用物質の使用については当該技術分野で既知である。任意の従来の媒体または作用物質が活性化合物と混合できない場合を除き、本開示の医薬組成物におけるそれらの使用が検討される。補助活性化合物も組成物中に組み込み可能である。
治療組成物は、典型的には製造および保存の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、高い薬物濃度に適する溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の規則的構造として調製されうる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散系でありうる。適切な液性が、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用、分散の場合に必要とされる粒径の維持ならびに界面活性剤の使用により維持されうる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコールまたは塩化ナトリウムを含めることが好ましいことになる。注射可能な組成物の遅延された吸収は、組成物中に吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアレート塩（ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ ｓａｌｔ）およびゼラチンを含めることによりもたらされうる。
注射可能な無菌溶液は、必要に応じ、上掲の原料の１つもしくは組み合わせを有する適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、その後に滅菌および精密ろ過を施すことにより調製されうる。一般に、分散系は、塩基性分散系および上掲の原料由来の必要な他の原料を含有する無菌溶媒に活性化合物を組み込むことにより調製される。注射可能な無菌溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末に加え任意の所望の追加原料をその予め無菌濾過された溶液から生成する真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
担体材料と組み合わせることで単一の剤形を生成可能な活性成分の量は、治療される対象および特定の投与方法に依存して変化することになる。単一の剤形を生成するための担体材料と併用可能な活性成分の量は、一般に治療効果をもたらす組成物の量となる。一般に、この量は、薬学的に許容できる担体との併用で、１００％のうち、活性成分の約０．０１％〜約９９％、好ましくは活性成分の約０．１％〜約７０％、最も好ましくは活性成分の約１％〜約３０％の範囲となる。
投与計画を調節することで最適な所望の応答（例えば治療応答）がもたらされる。例えば、単回ボーラスが投与されうるか、数回の分割用量が長期にわたり投与されうるかまたは同用量が治療状況の要件で示されるように比例的に漸減または増加されうる。投与の容易さおよび用量の均一性を意図し、非経口組成物を投与単位形態で調製することが特に有利である。本明細書で用いられる投与単位形態は、試験されるべき対象に対する単一の用量として適合する物理的に別々の単位であり、各単位は必要とされる医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された既定量の活性化合物を有する。本開示の投与単位形態における仕様は、（ａ）活性化合物固有の特性および達成されるべき特定の治療効果と、（ｂ）個体における感受性を治療するためにかかる活性化合物を化合する当該技術分野に内在する制限により決定づけられ、かつそれらに直接依存している。
抗体の投与においては、用量は、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、およびより一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば用量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。典型的な治療計画では、毎週１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、１か月に１回、３か月ごとに１回または３〜６か月ごとに１回の投与が必要とされる。本開示の抗ＣＤ２２抗体に対する好ましい投与計画は、抗体の静脈内投与を介した１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、ここで抗体は（ｉ）６回投与を４週ごと、次いで３か月ごと；（ｉｉ）３週ごと；（ｉｉｉ）１回の３ｍｇ／ｋｇ体重、次いで３週ごとに１ｍｇ／ｋｇ体重といった投与計画のうちの１つを用いて投与される。
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する、２つ以上のモノクローナル抗体が同時投与され、いずれの場合でも投与される各抗体の用量は指定範囲内に含まれる。多くの場合、抗体が通常投与される。単回投与間の間隔は、例えば、週単位、月単位、３か月単位または年単位であってもよい。患者における抗体の標的抗原に対する血中濃度の測定により示されるように、間隔は不規則であってもよい。用量は、ある方法では約１〜１０００μｇ／ｍｌ、またある方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を得るように調節される。
あるいは、抗体は徐放製剤として投与可能であり、いずれの場合でも低頻度の投与が必要とされる。用量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変化する。一般に、ヒト抗体は最長の半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体がそれに続く。投与の用量および頻度は、治療が予防的であるかまたは治療的であるかに依存して変化しうる。予防的適用においては、比較的低用量が長期にわたり比較的低頻度の間隔で投与される。一部の患者が、余生にわたって治療を受け続けている。治療的適用においては、疾患の進行が低下または終結されるまで、好ましくは患者が疾患の徴候の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が必要とされる場合がある。その後、患者は予防計画通りに投与されうる。
異常な細胞増殖に関連する疾患の予防および／または治療での使用においては、約０．００１μＭ〜２０μＭの投与化合物の血中濃度が好ましく、ここで約０．０１μＭ〜５μＭが好ましい。
本明細書中に記載の化合物の経口投与における患者への用量は、典型的には約１ｍｇ／日〜約１０，０００ｍｇ／日、より典型的には約１０ｍｇ／日〜約１，０００ｍｇ／日、および最も典型的には約５０ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日の範囲である。患者の体重について述べると、典型的用量は、約０．０１〜約１５０ｍｇ／ｋｇ／日、より典型的には約０．１〜約１５ｍｇ／ｋｇ／日、および最も典型的には約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日、例えば５ｍｇ／ｋｇ／日または３ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
少なくとも一部の態様では、腫瘍成長を遅らせるかまたは阻害する患者への用量は１μｍｏｌ／ｋｇ／日以下であってもよい。例えば、患者への用量は、（薬剤のモルについては）０．９、０．６、０．５、０．４５、０．３、０．２、０．１５、もしくは０．１μｍｏｌ／ｋｇ／日以下であってもよい。好ましくは、抗体−薬剤複合体は、少なくとも５日間にわたり日用量で投与される場合、腫瘍の成長を遅らせる。少なくとも一部の態様では、腫瘍はＳＣＩＤマウスにおけるヒト型腫瘍である。例として、ＳＣＩＤマウスは（ニューヨーク州ジャーマンタウン（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ）のＴａｃｏｎｉｃから入手可能な）ＣＢ１７．ＳＣＩＤマウスであってもよい。
本開示の医薬組成物中での活性成分の実際の用量レベルは、患者に毒性をもたらすことなく、特定の患者、組成物および投与様式について所望の治療応答を得るのに有効な活性成分の量を得るように変化しうる。選択される用量レベルは、用いられる本開示の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、用いられる特定の化合物の投与経路、投与時間、排出速度、用いられる特定の組成物と併用される治療薬、他の薬物、化合物および／または材料の持続時間、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般健康および過去の病歴、ならびに医術において周知の要素のようなものを含む種々の薬物動態学的因子に依存することになる。
本開示の抗ＣＤ２２抗体の「治療有効用量」は、好ましくは疾患徴候の重症度の低下、疾患徴候のない期間の頻度および持続時間の増大あるいは疾患の苦しみに起因する機能障害または身体障害の予防をもたらす。例えば、ＣＤ２２＋腫瘍の治療における「治療有効用量」は、好ましくは細胞成長または腫瘍成長を、未治療の対象に対し、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約８０％阻害する。化合物の腫瘍成長に対する阻害能は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価可能である。あるいは、組成物のこの特性は、化合物の細胞成長に対する阻害能の試験により評価可能であり、かかる阻害は当業者に既知のアッセイ法によりインビトロで測定可能である。治療有効量の治療化合物により、腫瘍サイズが低減しうるかまたはそうでなくても対象における徴候が改善しうる。当業者であれば、対象の大きさ、対象の徴候の重症度および選択された投与における特定の組成物または経路などの要素に基づき、かかる量を決定できるであろう。
本開示の組成物は、種々の当該技術分野で既知の方法のうちの１つ以上を用い、１つ以上の投与経路を介して投与されうる。当業者に理解されるように、投与の経路および／または方法は所望の結果に応じて変化することになる。本開示の抗体における好ましい投与経路は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、例えば注射もしくは注入によるものを含む。本明細書で用いられる「非経口投与」という語句は、経腸および局所投与以外の投与方法、通常は注射によるものを意味し、限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内への注射および注入を含む。
あるいは、本開示の抗体は、非経口でない（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路、例えば局所経路、表皮または粘膜の投与経路を介し、例えば、経鼻的、経口的、経膣的、経直腸的、舌下的または局所的に投与されうる。
活性化合物は、迅速な放出に対する化合物、例えばインプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤を保護することになる担体とともに調製されうる。生体分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が用いられうる。かかる製剤を調製するための多数の方法が特許化されているかまたは一般に当業者に既知である。例えば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９７８年を参照のこと。
治療組成物は、当該技術分野で既知の医療器具を用いて投与可能である。例えば、好ましい態様では、本開示の治療組成物は、ニードルレス皮下注射器具、例えば米国特許第５，３９９，１６３号明細書；米国特許第５，３８３，８５１号明細書；米国特許第５，３１２，３３５号明細書；米国特許第５，０６４，４１３号明細書；米国特許第４，９４１，８８０号明細書；米国特許第４，７９０，８２４号明細書；または米国特許第４，５９６，５５６号明細書に開示された器具を用いて投与可能である。本開示において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例として、薬物を制御された速度で小出しするための埋め込み式マイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号明細書、皮膚を通してメディカント（ｍｅｄｉｃａｎｔ）を投与するための治療器具を開示する米国特許第４，４８６，１９４号明細書、薬物を正確な注入速度で送達するための薬物注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号明細書、連続的薬物送達のための流量可変の埋め込み式注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号明細書、マルチチャンバ式の区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号明細書、ならびに浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号明細書が挙げられる。これらの特許は参照により本明細書中に援用される。多数の他のかかるインプラント、送達システムおよびモジュールは当業者に既知である。
特定の態様では、本開示のヒトモノクローナル抗体を調製し、インビボで適切な分布を保証することが可能である。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多数の親水性の高い化合物を排除する。（必要に応じて）本開示の治療化合物がＢＢＢを通過することを保証するため、それらを例えばリポソームの形で調製してもよい。リポソームを作製する方法については、例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書；米国特許第５，３７４，５４８号明細書；および米国特許第５，３９９，３３１号明細書を参照のこと。リポソームは特定の細胞または器官に選択的に輸送される１つ以上の部分を含みうることから、標的化された薬剤送達が促進される（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５頁を参照）。典型的な標的化部分は、葉酸またはビオチン（例えばＬｏｗらに交付された米国特許第５，４１６，０１６号明細書を参照）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら（１９８８年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８頁）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら（１９９５年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０頁；Ｍ．Ｏｗａｉｓら（１９９５年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０頁）；界面活性剤のプロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅら（１９９５年）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４頁）；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９９４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０頁）を含み、Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３頁；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４年）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ４：２７３頁も参照のこと。
本発明の使用および方法
本開示の抗体、特にヒト抗体、抗体組成物および方法は、ＣＤ２２に関与する疾病および障害の診断および治療を含む、極めて多数のインビトロおよびインビボでの診断的および治療的有用性を有する。例えば、これらの分子を、インビトロまたは生体外で培地内の細胞にまたは例えばインビボでヒト対象に投与し、種々の障害を治療し、予防し、かつ診断してもよい。
本明細書で用いられる「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むように意図されている。非ヒト動物は、あらゆる脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類および爬虫類を含む。好ましい対象は、ＣＤ２２活性に媒介されるかまたは調節される障害を有するヒト患者を含む。ＣＤ２２に対する抗体が別の作用物質とともに投与される場合、２剤は順次投与または同時投与のいずれであってもよい。
本開示の抗体がＣＤ２２に対して特異的に結合することを仮定すると、本開示の抗体を用い、細胞の表面上でのＣＤ２２の発現の特異的検出が可能であり、さらにそれを用い、免疫親和性精製を介するＣＤ２２の精製が可能である。
本開示の抗体組成物（例えばヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体）をインビボおよびインビトロで投与する適切な経路は当該技術分野で周知であり、当業者により選択されうる。例えば、抗体組成物を注射（例えば静脈内または皮下）により投与してもよい。用いられる分子の適切な用量は、対象の年齢および体重ならびに抗体組成物の濃度および／または調合に依存することになる。
上記のように、本開示のヒト抗ＣＤ２２抗体を、１つもしくは他の複数の治療物質、例えば細胞毒性物質、放射性毒性物質（ｒａｄｉｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ）または免疫抑制剤と同時投与してもよい。抗体を（免疫複合体としての）作用物質に連結するかまたは作用物質とは別々に投与してもよい。後者（別々の投与）の場合、作用物質の前、後またはそれと同時に抗体を投与するかまたは他の既知の治療、例えば抗癌治療、例えば放射線と併せて同時投与してもよい。かかる治療物質は、特にドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシルおよびシクロホスファミド、ヒドロキシウレアなどの抗悪性腫瘍薬を含み、それら単独では患者に対して毒性または亜毒性のレベルでのみ有効である。シスプラチンは、４週ごとに１回、１００ｍｇ／ｋｇ用量で静脈内投与され、アドリアマイシンは、２１日ごとに１回、６０〜７５ｍｇ／ｍｌ用量で静脈内投与される。本開示のヒト抗ＣＤ２２抗体またはそれらの抗原結合断片と化学療法剤の同時投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞毒性効果をもたらす異なる機序を介して作用する２つの抗癌剤を提供する。かかる同時投与は、抗体に反応しなくなる薬剤に対する耐性または腫瘍細胞の抗原性における変化が生じることによる問題を解決しうる。
標的特異的なエフェクター細胞、例えば本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）に連結したエフェクター細胞は、治療物質としても用いられうる。標的化のためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球または単球などのヒト白血球でありうる。他の細胞は、好酸球、ナチュラルキラー細胞および他のＩｇＧ−もしくはＩｇＡ−受容体担持細胞を含む。必要に応じ、エフェクター細胞を試験されるべき対象から得てもよい。標的特異的なエフェクター細胞を生理学的に許容できる溶液中の細胞の懸濁液として投与してもよい。投与される細胞の数は１０８〜１０９程度でありうるが、治療目的に応じて変化することになる。一般に、数は、標的細胞、例えばＣＤ２２を発現する腫瘍細胞で局在化を得、かつ例えば食作用による細胞死を有効にするのに十分な数となる。投与経路もまた変化しうる。
標的特異的なエフェクター細胞による治療を、標的化細胞を除去するための他の技術と併せて行ってもよい。例えば、本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）および／またはこれらの組成物が備えられたエフェクター細胞を用いる抗腫瘍療法を化学療法と併用してもよい。さらに、併用免疫療法を用い、２つの異なる細胞毒性のあるエフェクター集団を指令し、腫瘍細胞を拒絶することが可能である。例えば、抗Ｆｃ−γ ＲＩまたは抗ＣＤ３に連結された抗ＣＤ２２抗体は、ＩｇＧ−またはＩｇＡ−受容体に特異的な結合剤と併用可能である。
本開示の二重特異性および多重特異性分子を用い、エフェクター細胞上のＦｃγＲまたはＦｃγＲレベルの例えば細胞表面上の受容体のキャッピングおよび除去による調節も可能である。抗Ｆｃ受容体の混合物もこの目的で用いられうる。
補体結合部位、例えば補体に結合するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＭ由来の部分を有する本開示の組成物（例えばヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体）も補体の存在下で用いられうる。一態様では、本開示の結合剤および適切なエフェクター細胞による標的細胞を含む細胞の集団の生体外治療は、補体または補体を含有する血清の添加により補完されうる。本開示の結合剤でコートされた標的細胞の食作用は補体タンパク質の結合により改善されうる。別の態様では、本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）でコートされた標的細胞も補体により溶解されうる。さらに別の態様では、本開示の組成物は補体を活性化することがない。
本開示の組成物（例えばヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体）はまた、補体とともに投与可能である。したがって、ヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子および血清または補体を含有する組成物は本開示の範囲内に含まれる。これらの組成物は、補体がヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子の近接位置に存在する点で有利である。あるいは、本開示のヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子と補体または血清を別々に投与してもよい。
本開示の抗体は、１つ以上の追加の治療抗体または他の結合剤、例えばＩｇ融合タンパク質とも併用可能である。投与可能な本開示の抗ＣＤ２２抗体との併用対象の他の抗体または結合剤の非限定例として、ＣＴＬＡ−４、ＰＳＭＡ、ＣＤ３０、ＩＰ−１０、ＩＦＮ−γ、ＣＤ７０、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＮＦ、ＴＮＦ−Ｒ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ、ＣＣＲ５、ＩＬ−１、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ、ＣＤ１９、キャンパス−１（Ｃａｍｐａｔｈ−１）、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、ＣＤ２０、Ｈｅｒ−２、ＣＤ２５、ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＩｇＥ、ＣＤ１１ａ、α４インテグリンに対する抗体または結合剤が挙げられる。
本開示の抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性または多重特異性分子または免疫複合体）と使用説明書を含むキットも本開示の範囲内に含まれる。キットは、１つ以上の追加試薬、例えば免疫抑制試薬、細胞毒性物質または放射性毒性物質あるいは１つ以上の追加の本開示のヒト抗体（例えば、第１のヒト抗体とは異なる、異なるＣＤ２２抗原内のエピトープに対して結合する相補活性を有するヒト抗体）をさらに含みうる。
したがって、本開示の抗体組成物で治療される患者に、別の治療物質、例えばヒト抗体の治療効果を促進または増強する細胞毒性物質または放射性毒性物質を（本開示のヒト抗体の投与の前、投与と同時または投与後に）さらに投与してもよい。
他の態様では、対象をさらに、ＦｃγまたはＦｃγ受容体の発現または活性を調節する、例えば促進または阻害する作用物質で治療する、例えば対象をサイトカインで治療することが可能である。多重特異性分子による治療の間での投与における好ましいサイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。
本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）を用い、ＣＤ２２を発現する細胞を、例えばかかる細胞を標識する目的で標的にすることも可能である。かかる使用においては、結合剤を検出可能な分子に連結してもよい。したがって、本開示は、ＣＤ２２を発現する細胞を生体外またはインビトロで局在化するための方法を提供する。検出可能な標識は、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素共同因子でありうる。
特定の態様では、本開示は、試料中のＣＤ２２抗原の存在を検出するか、またはＣＤ２２抗原の量を測定するための方法であって、試料および対照試料を、ＣＤ２２に、抗体またはその一部とＣＤ２２との複合体の形成を可能にする条件下で特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触させる工程を含む方法を提供する。次いで、複合体の形成が検出され、ここで対照試料と比べた場合の試料間での複合体形成の差は試料中でのＣＤ２２抗原の存在を示す。
さらに別の態様では、本発明の免疫複合体を用い、化合物（例えば、治療物質、標識、細胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剤など）がＣＤ２２を発現する細胞に、かかる化合物を抗体に結合することにより標的化されうる。例えば、抗ＣＤ２２抗体は、米国特許第６，２８１，３５４号明細書および米国特許第６，５４８，５３０号明細書、米国特許出願公開第２００３００５０３３１号明細書、米国特許出願公開第２００３００６４９８４号明細書、米国特許出願公開第２００３００７３８５２号明細書、および米国特許出願公開第２００４００８７４９７号明細書で記載されるかまたは国際公開第０３／０２２８０６号論説で公開された毒素化合物のいずれかに結合されうる。したがって、本発明は、（例えば、検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素共同因子を用いて）生体外またはインビボでＣＤ２２を発現する細胞を局在化するための方法も提供する。あるいは、免疫複合体を用い、ＣＤ２２細胞表面受容体を有する細胞が細胞毒素または放射性毒素のＣＤ２２への標的化により死滅されうる。
ＣＤ２２は、大きい割合を占めるＢ細胞リンパ腫上で発現されることが知られ、また自己免疫疾患がＣＤ２２の標的化を介して治療されうるようにＢ細胞活性の調節に関与することが知られている。したがって、これらの各臨床状況では、本開示の抗ＣＤ２２抗体（および免疫複合体および二重特異性分子）を用い、ＣＤ２２活性の調節が可能である。
したがって、一局面では、本発明は、ＣＤ２２発現腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供する。本方法は、ＣＤ２２発現腫瘍細胞を本発明の抗体またはその抗原結合部分とＣＤ２２発現腫瘍細胞の成長が阻害されるように接触させる工程を含む。好ましくは、ＣＤ２２発現腫瘍細胞はＢ細胞リンパ腫、例えば非ホジキンリンパ腫である。ＣＤ２２発現腫瘍細胞の他のタイプは、バーキットリンパ腫およびＢ細胞慢性リンパ性白血病を含む。
腫瘍細胞成長を阻害する方法の一態様では、抗体またはその抗原結合部分は、パートナー分子、例えば治療物質、例えば細胞毒素、放射性同位体または化学療法剤に結合される。他の態様では、抗体またはその抗原結合部分は、１種以上の追加の抗腫瘍剤と併用投与される。抗体は、他の癌治療、例えば手術および／または放射線と併用され、かつ／または他の抗腫瘍剤、例えば上で考察され示された抗腫瘍剤（化学療法薬と限定はされないが抗ＣＤ２０抗体（例えばＲｉｔｕｘａｎ（登録商標））を含む他の抗腫瘍抗原抗体とを含む）と併用可能である。
別の局面では、本発明は、対象における炎症性または自己免疫疾患を治療する方法を提供する。本方法は、本発明の抗体またはその抗原結合部分を、対象における炎症性または自己免疫疾患が治療されるように対象に投与する工程を含む。好ましい自己免疫疾患の非限定例として、全身性エリテマトーデスおよび関節リウマチが挙げられる。自己免疫疾患の他の例として、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む）、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、シェーグレン症候群、自己免疫性甲状腺炎（グレーブス病および橋本甲状腺炎を含む）、乾癬、ならびに糸球体腎炎が挙げられる。抗体は、単独使用されうるか、または他の抗炎症剤または免疫抑制剤、例えば非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド（例えばプレドニゾン、ヒドロコルチゾン）、メトトレキサート、ＣＯＸ−２阻害剤、ＴＮＦ拮抗剤（例えば、エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ））、ならびに免疫抑制剤（６−メルカプトプリン、アザチオプリンおよびシクロスポリンＡなど）と併用されうる。
本開示は以下の実施例によりさらに例示され、実施例はさらに限定するものとして解釈されるべきでない。本願を通して言及されるあらゆる図面およびあらゆる参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書中に明示的に援用される。
実施例１：ＣＤ２２に対するヒトモノクローナル抗体の産生
抗ＣＤ２２ヒトモノクローナル抗体を、以下のようにヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを用いて産生した。
抗原
抗ＣＤ２２抗体の産生に用いられる抗原は、ＣＨＯ細胞上で発現されるヒトＣＤ２２および完全長ＣＤ２２タンパク質の細胞外ドメインであった。細胞外ドメインを得るため、（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販の）ヒトＣＤ２２をコードするｃＤＮＡを用い、Ｃ末端のヘキサヒスチジンタグに融合されたＣＤ２２β細胞外ドメイン（ＣＤ２２ ＥＣＤ）全体をコードする発現ベクターを作成した。ＣＨＯ細胞の形質移入および標準技術による安定なトランスフェクタントの選択の後、金属キレートクロマトグラフィーを用い、ＣＤ２２ ＥＣＤを細胞用培地から精製した。さらに、細胞表面上で完全長ＣＤ２２を発現する組換えＣＨＯ細胞を、細胞に完全長ＣＤ２２ ｃＤＮＡを有した発現ベクターを形質移入することにより作製した。形質移入細胞の選択後、細胞表面上で高レベルのＣＤ２２を発現する細胞を、フルオレセイン標識抗ＣＤ２２（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから市販）との反応性に基づき、蛍光活性化細胞選別により単離した。
マウス株
ＣＤ２２に対する完全ヒトモノクローナル抗体を、トランスジェニックＨｕＭＡｂマウス（登録商標）のＨＣｏ７／ＨＣｏ１２およびＨＣｏ１２／Ｂａｌｂｃ株ならびにトランスジェニックトランスクロモゾームマウスのＫＭおよびＫＭ−λＨＡＣ株（これらすべてはヒト抗体遺伝子を発現する）を用いて調製した。
これらのマウス株の各々では、Ｃｈｅｎら（１９９３年）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：８１１−８２０頁に記載のように内因性マウスκ軽鎖遺伝子のホモ接合が破壊されており、ＰＣＴ公開の国際公開第０１／０９１８７号論説の実施例１に記載のように内因性マウス重鎖遺伝子のホモ接合が破壊されている。さらに、これらの株の各々は、（Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１頁に記載のように）ヒトκ軽鎖導入遺伝子ＫＣｏ５を保有し、さらにＰＣＴ公開の国際公開第０２／４３４７８号論説に記載のように、ヒトＩｇ重鎖遺伝子座を保有するＳＣ２０トランスクロモゾームを有する。
ＨＣｏ７株は、米国特許第５，５４５，８０６号明細書；米国特許第５，６２５，８２５号明細書；および米国特許第５，５４５，８０７号明細書に記載のようにＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子を保有する。ＨＣｏ１２株は、ＰＣＴ公開の国際公開第０１／０９１８７号論説の実施例２に記載のようにＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子を保有する。
ＫＭマウス（登録商標）株は、米国特許出願公開第２００２０１９９２１３号明細書に詳述されている。
ＫＭ−λＨＡＣ株は内因性のマウスの重鎖およびκ軽鎖遺伝子座が破壊されておりかつＳＣ２０トランスクロモゾームおよびＫＣｏ５導入遺伝子が挿入されている点でＫＭ株に酷似するが、ＫＭ−λＨＡＣ株はヒトλ軽鎖遺伝子座を保有するヒト染色体２２に由来するヒト人工染色体も保有する。したがって、ＫＭ−λＨＡＣ株はλ軽鎖またはκ軽鎖のいずれかを用いるヒト抗体を発現しうる。ＫＭ−λＨＡＣマウスはまた、米国特許出願公開第２００６００１５９５８号明細書に詳述されている。
免疫化
ＣＤ２２に対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するため、上記の株の動物を組換えヒトＣＤ２２ ＥＣＤおよびＣＤ２２発現ＣＨＯ細胞（抗原として上記のように調製）で免疫化した。ヒト抗体遺伝子を保有するマウス株においてヒト抗体を産生するための一般の免疫化スキームは、例えばＬｏｎｂｅｒｇ Ｎ．ら （１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９頁；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ Ｄ．ら （１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１頁およびＰＣＴ公開の国際公開第９８／２４８８４号論説に記載されている。免疫化を開始した時、マウスは１０〜１２週齢であった。マウスを、毎週、腹腔内および皮下に、２０μｇのＣＤ２２ ＥＣＤまたはアジュバントとしてＲＩＢＩを有する１０７個の形質移入ＣＨＯ細胞で免疫化した。最初の２回の免疫化をＲＩＢＩアジュバント中のＣＤ２２ ＥＣＤで行った後、毎週６回の追加免疫を、ＣＤ２２ ＥＣＤまたは形質移入細胞を交互に用いて行った（最大で全部で８回の免疫化）。眼窩後方からの採血（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ ｂｌｅｅｄ）により採取した血液中で免疫応答を監視した。血清をＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによりスクリーニングした。抗ＣＤ２２ヒトＩｇＧ免疫グロブリンの適正な力価を有するマウスを融合に用いた。マウスの静脈内および腹腔内の双方に、ＣＤ２２ ＥＣＤで１回、ＣＤ２２発現ＣＨＯ細胞で１回、それぞれ犠死および脾臓の摘出の４日前と３日前に追加免疫した。
抗体の選択
ＣＤ２２に結合した抗体を産生するマウスを同定するため、免疫マウス由来の血清のヒトＣＤ２２を発現するＣＨＯ細胞および親ＣＨＯ細胞への結合について、フローサイトメトリーによりスクリーニングした。ＣＤ２２を発現するヒトＤａｕｄｉ Ｂ細胞上での血清を、さらにフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によりスクリーニングした。すべての免疫マウス由来の血清を、ＦＡＣＳ実験において１：５０の希釈で試験した。希釈血清の細胞への添加および３７℃で３０分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、結合をＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ Ａｂを用いて検出した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）のＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてフローサイトメトリー分析を行った。マウス抗ＣＤ２２モノクローナル抗体（Ｍ抗ＣＤ２２）を実験における陽性対照として用いた。試験対象のマウス３匹全部が、ＣＨＯ−ＣＤ２２およびＣＨＯ親細胞（ＣＨＯ−Ｓ）に対する力価を示した。ＣＨＯ−Ｓ細胞への結合は、ＣＨＯ細胞の表面上でのＣＤ２２以外の分子に結合する抗体の存在を示す。マウスをＣＨＯ形質移入細胞で免疫化したことから、この結果は予想された。マウス３匹においてヒトＤａｕｄｉ細胞に対する力価も検出し、それは非組換え供給源由来のＣＤ２２に結合しうるＣＤ２２に特異的な抗体の存在可能性を示す。
血清のヒトＣＤ２２ ＥＣＤへの結合についてＥＬＩＳＡによりさらに試験した。つまり、マイクロタイタープレートを、室温で２時間、ＰＢＳ中１〜２．５μｇ／ｍｌ（５０μｌ／ウェル）のＣＨＯ細胞内で生成した精製ＣＤ２２ ＥＣＤタンパク質でコートした。次いで、プレートを３００μｌ／ウェルのＰＢＳ中１％ＢＳＡでブロッキングした。ＣＤ２２免疫マウス由来の血清の希釈物（１００〜２００００）を各ウェルに添加し、周囲温度で１〜２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／トゥイーンで洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したヤギ−抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、パーボレート（シグマ＃Ｐ４９２２）またはＭｏｓｓ ＡＢＴＳ−１０００を有するホスフェートシトレート緩衝液中のＡＢＴＳ基質（シグマ＃Ａ９９４１）で発色させ、ＯＤ４１５〜４９５ｎｍでの分光測光により分析した。試験対象のマウス３匹は良好な力価の抗ＣＤ２２抗体を有したことから、それらを融合に用いた。
脾細胞融合物
マウス脾細胞をマウス骨髄腫細胞系に、Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ大型チャンバ式の細胞融合エレクトロポレーター（メリーランド州グレンバーニー（Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ）のＣｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いる電場に基づく電気融合を用いて融合した。免疫マウス由来の脾細胞の単一の細胞懸濁液をＡｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８１）に１：１の比で融合した。細胞を平底マイクロタイタープレート内に約２×１０４／ウェルでプレーティングした。プレートを、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム（バージニア州ハーンドン（Ｈｅｒｎｄｏｎ）のＭｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、１０％ウシ胎仔血清（ユタ州ローガン（Ｌｏｇａｎ）のＨｙｃｌｏｎｅ）、１８％Ｐ３８８ＤＩ条件培地、５％Ｏｒｉｇｅｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ クローニング因子（バージニア州ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）のＢｉｏＶｅｒｉｓ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、５ｍＭヘペス、０．０５５ｍＭ β−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１×ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）を含有するＤＭＥＭ高グルコース培地内で１週間インキュベートした。１週間（７日）後、ＨＡＴ成長培地をＨＴを含有する培地と交換した。多数のハイブリドーマの成長が生じたら（１０〜１１日目）、ＨＴＲＦホモジニアスアッセイ法においてハイブリドーマ上清におけるヒトＩｇＧ抗体の存在について試験した。ＫＭ−λＨＡＣマウス由来の融合物におけるヒトκまたはヒトλ軽鎖のいずれかを担持するヒトＩｇＧの存在についてスクリーニングした。次いで、陽性のハイブリドーマにおけるＣＤ２２に特異的なヒトＩｇＧ抗体の存在について、Ｄａｕｄｉ細胞上でＦＡＣＳにより、またＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ実験を、ハイブリドーマ上清（５０〜１００μｌ／ウェル）を血清希釈物の代わりに用いた以外では上記のように行った。抗原特異的な親ハイブリドーマ系を２４ウェルプレートに移し、再びスクリーニングし、ヒトＩｇＧに対してまだ陽性であれば、限界希釈により１回サブクローニングした。次いで、さらなる特徴づけのため、安定なサブクローンをインビトロで増殖させ、抗体を精製した。
抗体精製における増殖のため、１８のサブクローンを選択した。増殖させたサブクローンのアイソタイプは、ＩｇＧ１；ＩｇＧ４；ＩｇＧ４／ＩｇＭ；ＩｇＧ１／ＩｇＭ；ＩｇＧ１／ＩｇＧ２／λやＩｇＧ４／λといったアイソタイプを含んだ。精製抗体のうちの１３をＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳにより力価測定し、両方のアッセイ法においてそれぞれがヒトＣＤ２２に対する特異的結合を示した。さらなる構造分析および配列決定のため、４つのサブクローン１２Ｃ５、１９Ａ３、１６Ｆ７、２３Ｃ６を選択した。
組換え抗体ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２の産生
抗ＣＤ２２抗体１９Ａ３をヒトＩｇＧ１（ｆアロタイプ）としてＣＨＯ細胞内で発現させ、組換え抗体をＣＤ２２．１と称した。さらに、ＣＤ２２．２と称される１９Ａ３の変異体を作製し、そこでは突然変異Ｎ５７ＱをＶＨ鎖のＣＤＲ２領域内でのＮ−グリコシル化部位を除去するように作製した。
１９Ａ３のＶＫおよびＶＨ領域をｃＤＮＡクローンからＰＣＲで増幅し、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、クローニングにおける制限部位を導入した。次いで、部位特異的突然変異誘発を行い、Ｎ５７Ｑ突然変異を重鎖配列に導入し、ＣＤＲ２内でのＮ−グリコシル化部位を除去した。１９Ａ３ ＶＫをｐＩＣＯＦＳｎｅｏＫ２．ｈＣＭＶ２．１ｋｂベクターにサブクローニングし、ベクターｐＩＣＯＦＳｎｅｏＫ２．ｈＣＭＶ２．１ｋｂ（ＣＤ２２．１９Ａ３）を生成し、ＶＨ（野生型およびＮ５７Ｑ突然変異の双方）領域をｐＩＣＯＦＳｐｕｒＧベクターにサブクローニングし、ベクターｐＩＣＯＦＳｐｕｒＧ（ＣＤ２２．１９Ａ３）およびｐＩＣＯＦＳｐｕｒＧ（ＣＤ２２．１９Ａ３．ＶＨＮ５７Ｑ）を生成した。軽鎖および重鎖を発現するためのこれらの構築物を直線化し、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＨＯ−Ｓ細胞に同時形質移入し、標準技術を用いて安定なクローンを選択した。
ＣＤ２２．１の発現においてはＣＨＯ−Ｓクローン８Ｇ９を選択した。このクローンの過剰成長した培養物は約７５ｍｇ／ｌの抗体を産生した。ＣＤ２２．２の発現においてはＣＨＯ−Ｓクローン１７Ｅ１１を選択し、それは過剰成長した培養物中で約４１３ｍｇ／ｌを産生した。次いで、組換え抗体ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２の構造および機能を判定した（下記の実施例３および実施例１０を参照）。
実施例２：ヒト抗ＣＤ２２モノクローナル抗体の構造的特徴づけ
実施例１に記載の１２Ｃ５、１９Ａ３、１６Ｆ７、２３Ｃ６、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、４Ｇ６および２１Ｆ６クローンにより発現されたｍＡｂの重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を標準のＤＮＡ配列決定技術を用いて配列決定し、発現されたタンパク質を標準のタンパク質化学分析により特徴づけた。
１２Ｃ５、１９Ａ３、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、１６Ｆ７および２３Ｃ６の特徴づけ
１２Ｃ５クローンは、ＩｇＧ１重鎖およびλ軽鎖を含む抗体を発現することが見出された。１９Ａ３クローンは、ＩｇＧ１重鎖およびκ軽鎖を含む抗体を発現することが見出された。８Ｇ９クローンにより発現された組換えｍＡｂの重鎖および軽鎖は、１９Ａ３クローンにより発現されたものと同一であった。１７Ｅ１１により発現された組換えｍＡｂの重鎖は、導入されたＮ５７Ｑ突然変異以外では１９Ａ３の重鎖と同一であった。１７Ｅ１１クローンにより発現された組換えｍＡｂの軽鎖は、１９Ａ３クローンにより発現された軽鎖と同一であった。１６Ｆ７クローンは、ＩｇＧ１重鎖および２つの異なるκ軽鎖（本明細書中でＶＫ１およびＶＫ２と称され、抗体タンパク質の４３％はＶＫ１を含みかつ抗体タンパク質の５７％はＶＫ２を含んでいた）のうちの１つを含む抗体を発現することが見出された。２３Ｃ６クローンもまた、ＩｇＧ１重鎖および２つの異なるκ軽鎖（ＶＫ１およびＶＫ２、抗体タンパク質の４０％はＶＫ１を含みかつ抗体タンパク質の６０％はＶＫ２を含んでいた）のうちの１つを含む抗体を発現することが見出された。４Ｇ６クローンは、ＩｇＧ１重鎖および２つの異なるκ軽鎖（本明細書中でＶＫ１およびＶＫ２と称される）のうちの１つを含む抗体を発現することが見出された。２１Ｆ６クローンは、２つの異なるＩｇＧ１重鎖（本明細書中でＶＨ１およびＶＨ２と称される）のうちの１つおよびκ軽鎖を含む抗体を発現することが見出された。
１２Ｃ５の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図１Ａと配列番号４１および３１に示す。
１２Ｃ５のλ軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図１Ｂと配列番号４５および３５に示す。
１２Ｃ５重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、１２Ｃ５重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ７−４．１由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−３由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ６Ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる１２Ｃ５ ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域がそれぞれ図１Ａと配列番号１、５および９に図示されるに至った。
１２Ｃ５軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、１２Ｃ５λ軽鎖ではヒト生殖細胞系Ｖλ２ｂ２由来のＶλセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＬ２由来のＪλセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる１２Ｃ５Ｖλ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域がそれぞれ図１Ｂと配列番号１３、１９および２５に図示されるに至った。
１９Ａ３の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図２Ａと配列番号４２および３２に示す。ＣＤ２２．１の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、１９Ａ３のそれらと同一であり、かつ図２Ａと配列番号４２および３２にそれぞれ示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列に対応する。
ＣＤ２２．２の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図２Ｃと配列番号６１および６０に示す。
１９Ａ３の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図２Ｂと配列番号４６および３６に示す。ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２の双方の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、１９Ａ３のそれらと同一であり、かつ図２Ａと配列番号４６および３６にそれぞれ示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列に対応する。
１９Ａ３／ＣＤ２２．１重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、１９Ａ３重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ４−３４由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−９由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ４Ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる１９Ａ３／ＣＤ２２．１ ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域がそれぞれ図２Ａと配列番号２、６および１０に図示されるに至った。
ＣＤ２２．２重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、ＣＤ２２．２重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ４−３４由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−９由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ４Ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いるＣＤ２２．２ ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域がそれぞれ図２Ｃと配列番号２、６０および１０に図示されるに至った。
１９Ａ３／ＣＤ２２．１／ＣＤ２２．２軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、１９Ａ３／ＣＤ２２．１／ＣＤ２２．２κ軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ６由来のＶＫセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ１由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる１９Ａ３／ＣＤ２２．１／ＣＤ２２．２ ＶＫ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域がそれぞれ図２Ｂと配列番号１４、２０および２６に図示されるに至った。
１６Ｆ７の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図３Ａと配列番号４３および３３に示す。
１６Ｆ７のＶＫ１κ軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図３Ｂと配列番号４７および３７に示す。
１６Ｆ７のＶＫ２κ軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図３Ｃと配列番号４８および３８に示す。
１６Ｆ７重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、１６Ｆ７重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ５−５１由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−１０由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ３Ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる１６Ｆ７ ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域がそれぞれ図３Ａと配列番号３、７および１１に図示されるに至った。
１６Ｆ７ ＶＫ１κ軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリンκ軽鎖配列との比較によると、１６Ｆ７ ＶＫ１κ軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＡ２７由来のＶＫセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ１由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる１６Ｆ７ ＶＫ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域がそれぞれ図３Ｂと配列番号１５、２１および２７に図示されるに至った。
１６Ｆ７ ＶＫ２κ軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリンκ軽鎖配列との比較によると、１６Ｆ７ ＶＫ２κ軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＡ１０由来のＶＫセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ２由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる１６Ｆ７ ＶＫ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域がそれぞれ図３Ｃと配列番号１６、２２および２８に図示されるに至った。
２３Ｃ６の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図４Ａと配列番号４４および３４に示す。
２３Ｃ６のＶＫ１κ軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図４Ｂと配列番号４９および３９に示す。
２３Ｃ６のＶＫ２κ軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図４Ｃと配列番号５０および４０に示す。
２３Ｃ６重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、２３Ｃ６重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ１−６９由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系２−１５由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ６Ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる２３Ｃ６ ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域がそれぞれ図４Ａと配列番号４、８および１２に図示されるに至った。
２３Ｃ６ ＶＫ１κ軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリンκ軽鎖配列との比較によると、ＶＫ１κ軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ６由来のＶＫセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ１由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる２３Ｃ６ ＶＫ１配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域がそれぞれ図４Ｂと配列番号１７、２３および２９に図示されるに至った。
２３Ｃ６ ＶＫ２κ軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリンκ軽鎖配列との比較によると、ＶＫ２κ軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ６由来のＶＫセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ１由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる２３Ｃ６ ＶＫ２配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域がそれぞれ図４Ｂと配列番号１８、２４および３０に図示されるに至った。
図５Ａは、１２Ｃ５重鎖可変アミノ酸配列（配列番号３１）と生殖細胞系ＶＨ７−４．１がコードされたアミノ酸配列（配列番号５１）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図５Ｂは、１２Ｃ５λ軽鎖可変アミノ酸配列（配列番号３５）と生殖細胞系Ｖλ２ｂ２がコードされたアミノ酸配列（配列番号５５）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図６Ａは、１９Ａ３重鎖可変アミノ酸配列およびＣＤ２２．１重鎖可変アミノ酸配列（配列番号３２）と生殖細胞系ＶＨ４−３４がコードされたアミノ酸配列（配列番号５２）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図６Ｂは、１９Ａ３、ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２κ軽鎖可変アミノ酸配列（これら全部は配列番号３６と一致する）と生殖細胞系ＶＫＬ６がコードされたアミノ酸配列（配列番号５６）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図６Ｃは、ＣＤ２２．２重鎖可変アミノ酸配列（配列番号３２）と生殖細胞系ＶＨ４−３４がコードされたアミノ酸配列（配列番号５２）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図７Ａは、１６Ｆ７重鎖可変アミノ酸配列（配列番号３３）と生殖細胞系ＶＨ５−５１がコードされたアミノ酸配列（配列番号５３）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図７Ｂは、１６Ｆ７ ＶＫ１κ軽鎖可変アミノ酸配列（配列番号３７）と生殖細胞系ＶＫＡ２７がコードされたアミノ酸配列（配列番号５７）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図７Ｃは、１６Ｆ７ ＶＫ２κ軽鎖可変アミノ酸配列（配列番号３８）と生殖細胞系ＶＫＡ１０がコードされたアミノ酸配列（配列番号５８）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図８Ａは、２３Ｃ６重鎖可変アミノ酸配列（配列番号３４）と生殖細胞系ＶＨ１−６９がコードされたアミノ酸配列（配列番号５４）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図８Ｂは、２３Ｃ６ ＶＫ１κ軽鎖可変アミノ酸配列（配列番号３９）およびＶＫ２κ軽鎖可変アミノ酸配列（配列番号４０）と生殖細胞系ＶＫＬ６がコードされたアミノ酸配列（配列番号５６）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
４Ｇ６および２１Ｆ６の特徴づけ
４Ｇ６の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図１７Ａと配列番号８７および８１に示す。
４Ｇ６のＶＫ１κ軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図１７Ｂと配列番号９０および８４に示す。
４Ｇ６のＶＫ２κ軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図１７Ｃと配列番号９１および８５に示す。
４Ｇ６重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、４Ｇ６重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ１−６９由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系７−２７由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ４Ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる４Ｇ６ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域がそれぞれ図１７Ａと配列番号６３、６６および６９に図示されるに至った。
４Ｇ６ ＶＫ１κ軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリンκ軽鎖配列との比較によると、１６Ｆ７ ＶＫ１κ軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ１８由来のＶＫセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ２由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる４Ｇ６ ＶＫ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域がそれぞれ図３Ｂと配列番号７２、７５および７８に図示されるに至った。
４Ｇ６ ＶＫ２κ軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリンκ軽鎖配列との比較によると、４Ｇ６ ＶＫ２κ軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＡ２７由来のＶＫセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ４由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる４Ｇ６ ＶＫ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域がそれぞれ図１７Ｃと配列番号７３、７６および７９に図示されるに至った。
２１Ｆ６のＶＨ１重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図１８Ａと配列番号８８および８２に示す。
２１Ｆ６のＶＨ２重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図１８Ｂと配列番号８９および８３に示す。
２１Ｆ６のκ軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図１８Ｃと配列番号９２および８６に示す。
２１Ｆ６ ＶＨ１重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、２１Ｆ６重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ４−３４由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−９由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ４Ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる２１Ｆ６ ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域がそれぞれ図３Ａと配列番号６４、６７および７０に図示されるに至った。
２１Ｆ６ ＶＨ２κ軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリンκ軽鎖配列との比較によると、２１Ｆ６ ＶＨ２重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ４−３４由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−９由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ４Ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる２１Ｆ６ ＶＨ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域がそれぞれ図１８Ｂと配列番号６５、６８および７１に図示されるに至った。
２１Ｆ６κ軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリンκ軽鎖配列との比較によると、２１Ｆ６κ軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ６由来のＶＫセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ４由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる２１Ｆ６ ＶＨ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域がそれぞれ図１８Ｃと配列番号７４、７７および８０に図示されるに至った。
図１９Ａは、４Ｇ６重鎖可変アミノ酸配列（配列番号８１）と生殖細胞系ＶＨ１−６９がコードされたアミノ酸配列（配列番号５４）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図１９Ｂは、４Ｇ６ ＶＫ１κ軽鎖可変アミノ酸配列（配列番号８４）と生殖細胞系ＶＫ１Ｌ１８がコードされたアミノ酸配列（配列番号９３）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図１８Ｃは、４Ｇ６ ＶＫ２κ軽鎖可変アミノ酸配列（配列番号８５）と生殖細胞系ＶＫＡ２７がコードされたアミノ酸配列（配列番号５７）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図２０Ａは、２１Ｆ６ ＶＨ１重鎖可変アミノ酸配列（配列番号８２）と生殖細胞系ＶＨ４−３４がコードされたアミノ酸配列（配列番号５２）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図２０Ｂは、２１Ｆ６ ＶＨ２κ軽鎖可変アミノ酸配列（配列番号８３）と生殖細胞系ＶＨ４−３４がコードされたアミノ酸配列（配列番号５２）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
図２０Ｃは、２１Ｆ６κ軽鎖可変アミノ酸配列（配列番号８６）と生殖細胞系ＶＫＬ６がコードされたアミノ酸配列（配列番号５６）とのアラインメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図示される。
組換えアイソタイプの変換
１２Ｃ５、１９Ａ３、１６Ｆ７、２３Ｃ６、ＣＤ２２．１、ＣＤ２２．２、４Ｇ６および２１Ｆ６可変領域は、標準の組換えＤＮＡ技術を用いて任意の所望のアイソタイプの完全長抗体に変換されうる。例えば、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡは、重鎖および軽鎖の定常領域を可変領域が定常領域に作動可能に連結されるように保有する発現ベクターにクローニングされうる。あるいは、完全長重鎖および完全長軽鎖の発現には別々のベクターが用いられうる。完全長抗体の作製における使用に適する発現ベクターの非限定例として、Ｂｌａｃｋによる米国特許出願公開第２００５０１５３３９４号明細書に記載のｐＩＥベクターが挙げられる。
実施例３：抗ＣＤ２２ヒトモノクローナル抗体の結合特性
この実施例では、抗ＣＤ２２抗体１２Ｃ５、１９Ａ３、１６Ｆ７、２３Ｃ６および４Ｇ６の結合親和性をＢＩＡｃｏｒｅ分析により試験した。１９Ａ３２組換え誘導体抗体ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２によりＣＤ２２結合親和性が保持されることを、ＥＬＩＳＡ分析およびＦＡＣＳフローサイトメトリーを用いて確認した。
１２Ｃ５、１９Ａ３、１６Ｆ７、および２３Ｃ６抗体のエピトープの分類をＢＩＡｃｏｒｅ分析により行った。
最終的に、本発明の抗ＣＤ２２抗体が特異的に結合する対象のＣＤ２２ドメインを、ＣＤ２２のアミノ末端ドメイン１および２のみを有する融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞を用いてマッピングした。
結合親和性および結合動態
抗体親和性（ＫＤ）の測定においては、ＣＤ２２抗原が抗原上に存在するＨｉｓタグに対する抗体を用いてＢＩＡｃｏｒｅチップ上に捕捉されるという実験を行った。抗Ｈｉｓモノクローナル抗体ａｂ１５１４９（Ａｂｃａｍ、ストック濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）を、製造業者の推奨に従い、高密度（３５００ＲＵ）でＣＭ５チップ上にコートした。ＣＤ２２ ＥＣＤ（６．６μｇ／ｍＬ）を６μＬ／分の流速でこの表面上に６０秒間捕捉した。単一の濃度（２０μｇ／ｍＬ）の抗ＣＤ２２精製ｍＡｂを捕捉された抗原上に５分の結合時間および８分の解離時間、２５μｇ／ｍＬの流速でインジェクションした。各サイクル後、チップ表面を２５ｍＭ ＮａＯＨ１０μＬで再生した。アイソタイプ対照をチップ上に流し、そのデータを用いて非特異的結合を差し引いた。すべての実験を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェアｖ３．２を用い、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００表面プラズモン共鳴装置上で行った。データ分析をＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖ．３．２ソフトウェアを用いて行った。
１４の選択された抗ＣＤ２２抗体を親和性実験で試験した。１２の抗体において得られた親和性値の範囲は０．０７〜９．９５×１０−９Ｍであった。実施例２で構造的に特徴づけた４つの抗体における結果を下記の表１にまとめる。
（表１）抗ＣＤ２２ＨｕＭＡｂにおけるＢＩＡｃｏｒｅ結合データ
Figure 0005846695
組換え誘導体抗体ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２によるＣＤ２２結合親和性の保持
ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２がＣＤ２２結合親和性を保持したか否かを判定するため、ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２によるＣＤ２２ ＥＣＤへの結合をハイブリドーマ由来の親抗体１９Ａ３による結合と比較するＥＬＩＳＡ分析を行った。
組換えＣＤ２２細胞外ドメイン（ＣＤ２２ ＥＣＤ）を２μｇ／ｍｌで９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上でコートし、洗浄、５％ウシ血清アルブミンでのブロッキング、および再洗浄の後、試験抗体を、１０μｇ／ｍｌから下向きに１：３希釈で力価測定した。１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ複合体を各ウェルに添加した。さらに１時間後、インキュベーションプレートを再洗浄し、結合されたＨＲＰ複合体を、ＴＭＢ基質を添加し、着色するまでインキュベートし、１Ｍ塩酸で停止することを通じて検出した。次いで、吸光度を４５０ｎｍでのプレートリーダーで読み取った。結果（図１２）によると、ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２のＣＤ２２ ＥＣＤに対する結合能が親抗体１９Ａ３に匹敵することが明示された。これは、ＣＨＯ細胞内での抗体の発現が奏功し、かつＮ−グリコシル化部位を除去するための突然変異が抗原への結合に作用しないことを示した。
４Ｇ６および２１Ｆ６抗ＣＤ２２モノクローナル抗体のＣＤ２２ ＥＣＤに対する結合能についても検討し、ＣＤ２２ ＥＣＤへの特異的結合が見出された。
細胞表面上に発現されるＣＤ２２のＦＡＣＳ分析
ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２のＣＤ２２に対する結合能についてもフローサイトメトリーにより確認した。完全長ＣＤ２２が形質移入されたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＣＤ２２）またはＲａｊｉ細胞のいずれかをＦＡＣＳ緩衝液中に２×１０５細胞／ウェルで再懸濁し、細胞のペレット化後、抗体を、ウェルで１０μｇ／ｍｌから始めて段階的に１：３に希釈して力価測定した。混合し氷上で４５分間インキュベートしてから、ＦＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞を４回洗浄した。洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＰＥ複合体を添加し、氷上でさらに３０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁しＦＡＣＳアレイ機器上でＰＥ蛍光を読み取る前に細胞を再び４回洗浄した。結果（図１３および１４）は、ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２がＣＨＯ−ＣＤ２２トランスフェクタントおよびＲａｊｉ細胞の双方に強力かつ同等に結合することを示した。
４Ｇ６および２１Ｆ６のＲａｊｉ細胞およびＣＤ２２で形質転換されたＣＨＯ細胞の表面上に発現されたＣＤ２２への結合についてもＦＡＣＳ分析により分析した。結果は、高レベルの細胞結合が得られることを示した。図２１、２２Ａおよび２２Ｂを参照のこと。いずれの抗体もＣＤ２２の形質移入のないＣＨＯ細胞に結合できなかった。
エピトープの分類
選択された抗体を標準の固定化プロトコルに基づいてＣＭ５チップ上に固定化し、抗体−抗原複合体を表面上に流すことにより、エピトープビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）を行った。重複エピトープを有する抗体は、非重複エピトープを有する抗体による抗原への同時結合が生じる間にわたり競合した。シグナルの上昇はチップ上にコートされた抗体と異なるエピトープを意味し、その逆はシグナルが低下する場合に該当する。より速いオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）定数を示す抗体を選択し、この抗体がチップを反復使用する場合により容易な再生を促進することになるようにＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５チップ上にコートした。精製抗ＣＤ２２抗体を異なるＣＭ５チップの異なる表面上に高密度でコートした。異なるエピトープ群が同定されるまで、数回の反復ビニングを行った。抗体の濃度は５０〜２００μｇ／ｍＬで変化し、それらを４ｎＭ〜５０ｎＭのＣＤ２２ ＥＣＤとともに室温で２時間インキュベートした。インキュベートされた複合体を、各チップ上の抗体でコートされた表面全体に５〜１０μＬ／分で２〜６分間通過させた。各サイクルを１５〜３０ｍＭ ＮａＯＨにより再生した。インジェクションの２〜５分後に得られたシグナルを抗体濃度に対してプロットし、エピトープ群を判定した。実験観察の上記の解釈に基づき、抗体を様々なエピトープに分類した。
エピトープの分類実験の結果は、４つの異なるエピトープ群が同定可能であることであった。試験対象の１４の抗ＣＤ２２抗体のうち、５つがエピトープ群１内に存在することが見出され、３つがエピトープ群２内に存在することが見出され、４つがエピトープ群３内に存在することが見出され、１つがエピトープ群４内に存在することが見出され、かつ１つがエピトープ群３および４内に存在することが見出されたが、これはエピトープ群３および４の間に一部重複が存在することを示す。実施例２で構造的に特徴づけられた４つの抗体における結果を下記の表２にまとめる。
（表２）ＢＩＡｃｏｒｅによりマッピングされたＣＤ２２エピトープ群
Figure 0005846695
ＣＤ２２アミノ末端ドメインの認識
ＣＤ２２の細胞外領域は、７つの免疫グロブリン型ドメインを有し、それらのうちのアミノ末端２ Ｉｇ型ドメインはＣＤ２２リガンドへの結合にとって特に重要でありうる。ヒト抗体がいずれのドメインに結合するかをマッピングするため、ＥＣＤのアミノ末端ドメイン１および２のみがマウスＩｇＧ重鎖のヒンジおよびＦｃ領域に融合された組換え構築物を作成した。結合アッセイ法で用いるため、ＣＤ２２ ｄ１ｄ２−ｍＦｃと称される得られた融合タンパク質をＣＨＯ細胞内で発現させ、精製した。次いで、ＣＤ２２のＥＣＤ全体に結合することが先に示されたヒト抗体のＣＤ２２ ｄ１ｄ２−ｍＦｃに対する結合能について試験した。
ヤギ抗−マウスＩｇＧを９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート上に５μｇ／ｍｌでコートした。４℃で一晩インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＣＤ２２ ｄ１ｄ２−ｍＦｃを２μｇ／ｍｌで各ウェルに添加してから室温で１時間インキュベートした。プレート洗浄、５％ウシ血清アルブミンでのブロッキングおよび再洗浄の後、試験抗体を１０μｇ／ｍｌで添加した。１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ複合体を各ウェルに添加した。さらに１時間のインキュベーション後、プレートを再洗浄し、結合されたＨＲＰ複合体を、ＴＭＢ基質を添加し、着色するまでインキュベートし、１Ｍ塩酸で停止することを通じて検出した。次いで、吸光度を４５０ｎｍでのプレートリーダーで読み取った。
結果（図１５）によると、抗体が２群に分類されることが示された。２３Ｃ６、１９Ａ３、ならびに１９Ａ３、ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２の組換え誘導体で表される１群がＣＤ２２ ｄ１ｄ２−ｍＦｃに結合した一方、１２Ｃ５および１６Ｆ７で表される２群は結合しなかった。これは、１２Ｃ５および１６Ｆ７がアミノ末端ドメイン外部のＣＤ２２ ＥＣＤ上のエピトープを認識することを示唆する。
細胞表面上に発現されるＣＤ２２のＦＡＣＳ分析
ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２のＣＤ２２への結合についてもフローサイトメトリーにより確認した。完全長ＣＤ２２が形質移入されたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＣＤ２２）またはＲａｊｉ細胞のいずれかをＦＡＣＳ緩衝液中に２×１０５細胞／ウェルで再懸濁し、細胞のペレット化後、抗体を、ウェルで１０μｇ／ｍｌから始めて段階的に１：３に希釈して力価測定した。混合し氷上で４５分間インキュベートしてから、ＦＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞を４回洗浄した。洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＰＥ複合体を添加し、氷上でさらに３０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ＦＡＣＳアレイ機器上でＰＥ蛍光を読み取る前、細胞を再び４回洗浄した。結果（図１３および１４）は、ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２がＣＨＯ−ＣＤ２２トランスフェクタントおよびＲａｊｉ細胞の双方に強力かつ同等に結合することを示した。
Ｒａｊｉ細胞およびＣＤ２２で形質転換されたＣＨＯ細胞の表面上に発現されたＣＤ２２への、４Ｇ６および２１Ｆ６の結合についてもＦＡＣＳ分析により分析した。結果は、高レベルの細胞結合が得られることを示した。図２１、２２Ａおよび２２Ｂを参照のこと。いずれの抗体もＣＤ２２の形質移入のないＣＨＯ細胞に結合できなかった。
実施例４：抗ＣＤ２２抗体の内在化
抗ＣＤ２２ヒト抗体がＣＤ２２発現細胞に内在化する能力を測定するため、ＣＤ２２を発現するバーキットリンパ腫細胞系Ｒａｊｉを用いるＨｕｍ−ＺＡＰ内在化アッセイ法を用いた。Ｈｕｍ−ＺＡＰアッセイ法では、一次抗体の、毒素サポリンに結合されたヒトＩｇＧに対する親和性での二次抗体への結合を通じての内在化について試験する。
ＣＤ２２を発現するＲａｊｉ細胞を２．０×１０４細胞／ウェル（３５μｌ／ウェル）で播種した。抗ＣＤ２２抗体をウェルに１．５μｇ／ｍｌ（３５μｌ／ウェル）で添加した。陰性対照として培地のみを用いた。次いで、Ｈｕｍ−ＺＡＰ試薬（カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）のＡｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＩＴ−２２−２５）を半分のウェルに３．０μｇ／ｍＬ（３５μｌ／ウェル）の濃度で添加する一方、残り半分のウェルに培地のみを入れた。プレートを３７℃で７２時間インキュベートした。細胞生存度をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のＰｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ７５７１）を用いて測定した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ緩衝液をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ基質と混合し、混合物１００μＬを各ウェルに添加した。発光を、製造業者の指示によりＶｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ＬｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒおよびＶｅｒｉｔａｓソフトウェア（カリフォルニア州サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）のＴｕｒｎｅｒ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出した。
１２の異なる抗ＣＤ２２抗体について試験し、全部が内在化する能力を示した。実施例２で構造的に特徴づけられた４つの抗体における結果を図９の棒グラフに示す。図９に図示されるように、Ｒａｊｉ細胞の生存度の顕著な低下が、陽性対照を有するウェルを含む、抗ＣＤ２２抗体およびＨｕｍＺＡＰ試薬を有するすべてのウェル内で観察された一方、ＨｕｍＺＡＰ試薬を全く有しないで抗ＣＤ２２抗体のみを有するウェル内での細胞生存度は影響を受けず、これは抗ＣＤ２２抗体が単独で細胞死を引き起こさないことを示す。想定どおり、抗ＣＤ２２抗体の不在下では、陰性対照（培地と称される）はＨｕｍＺＡＰ試薬の存在下または不在下で細胞死を全く示さなかった。これらのデータは、抗ＣＤ２２抗体が効率的に内在化し、かつ細胞内でのサポリンの放出がＨｕｍＺＡＰ試薬の存在下でＣＤ２２を発現するＲａｊｉ細胞の死滅に関与することを示す。
実施例５：抗ＣＤ２２抗体のＡＤＣＣ活性の評価
抗ＣＤ２２ヒト抗体が抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を介してエフェクター細胞の存在下でＣＤ２２＋細胞系を殺傷する能力を測定するため、蛍光細胞毒性アッセイ法を用いた。
ヒトエフェクター細胞を以下のように全血から調製した。ヒト末梢血単核球を標準のＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ分離によりヘパリン化全血から精製した。細胞を１０％ＦＢＳ（熱不活性化）および２００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ１６４０培地内で再懸濁し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を採取し、培地内で４回洗浄し、１×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。標的ＣＤ２２＋細胞を、１×１０６個の標的細胞／ｍＬ当たりＢＡＴＤＡ２．５μｌでのＢＡＴＤＡ試薬（マサチューセッツ州ウェレズリー（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ）のＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）とともに３７℃で２０分間インキュベートした。標的細胞を４回洗浄し、遠心沈殿させ、最終容量を１×１０５細胞／ｍｌにした。
ＣＤ２２＋細胞系Ｒａｊｉ（ヒトＢリンパ球バーキットリンパ腫；ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−８６）およびＤａｕｄｉ（ヒトＢリンパ球バーキットリンパ腫；ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−２１３）のヒト抗ＣＤ２２モノクローナル抗体に対する抗体特異的なＡＤＣＣについて、以下のようにＤｅｌｆｉａ蛍光放射分析を用いて試験した。各標的細胞系（標識標的細胞１００μｌ、１０４細胞／ウェル）をエフェクター細胞５０μｌ（１０６細胞／ウェル）および抗体５０μｌ（１０ｕｇ／ｍｌの最終濃度）とともにインキュベートした。実験を通して１：５０の標的対エフェクター比を用いた。すべての試験において、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照を陰性対照として用いた。細胞を２０００ｒｐｍで遠心沈殿させ、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、上清を採取し、遠心分離にかけ、上清２０μｌを平底プレートに移し、そこにＥｕ溶液（マサチューセッツ州ウェレズリー（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ）のＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）１８０μｌを添加し、ＲｕｂｙＳｔａｒリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で読み取った。溶解率を、（試料放出−自然放出＊１００）／（最大放出−自然放出）（式中、自然放出は標的細胞＋エフェクター細胞を有するウェルからの蛍光であり、かつ最大放出は標的細胞を含有し、２％トリトン−Ｘで処理されているウェルからの蛍光である）に従って計算した。
ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ細胞のＡＤＣＣアッセイ法においては、１３の異なる抗ＣＤ３３抗体について、陰性および陽性対照抗体（それぞれｈＩｇＧ１およびＣＤ２０）とともに試験した。各アッセイ法では、１３の抗ＣＤ２２抗体のうちの１０が陽性対照抗体以上のＡＤＣＣ活性のレベルを示した。実施例２で構造的に特徴づけられた４つの抗体における結果を、細胞溶解率を示す図１０Ａ（Ｄａｕｄｉ細胞）および１０Ｂ（Ｒａｊｉ細胞）のグラフで示す。データは、ＡＤＣＣ活性を示すヒト抗ＣＤ２２抗体が選択されうるが、ＣＤ２２＋細胞に対する各抗体の細胞毒性の程度はいずれの細胞系が標的細胞として用いられるかに応じて異なりうることを示す。
実施例６：抗ＣＤ２２抗体によるカルシウム流入の刺激
抗ＣＤ２２ヒト抗体のＣＤ２２＋細胞へのカルシウム流入に対する刺激能を評価するため、以下のカルシウム流入アッセイ法を用いた。生存可能なＲａｍｏｓ細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１５９６）をトリパンブルー排除顕微鏡検査によりカウントし、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ培地内で２×１０６細胞／ｍｌに希釈した。この細胞懸濁液から、２×１０５個の細胞（１００μｌ／ウェル）を平底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３６６７）を用いてポリＤ−リジン黒色表面のすべてのウェルに分注した。ローディングダイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カタログ番号Ｒ７１８１）を細胞懸濁液１００μｌ／ウェルに添加した。プレートを１１００ｒｐｍで４分間遠心分離し、次いで３７℃で３０分間インキュベートした。抗ＣＤ２２抗体およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照の５倍連続希釈物５０μｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌをＣｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ＃Ｒ７１８１）＋０．１％ＢＳＡ緩衝液中で調製した。抗体を予め調製した９６ウェルプレートのＡ〜Ｆ列に３通りに分注した。成分Ｂ＋０．１％ＢＳＡをアッセイプレート上のＧおよびＨ列の全ウェルに分注した。カルシウム流入をＦｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて分析し、試薬２２μｌ／ウェルをアッセイプレートに１７秒で添加した。データをＦＩ Ｍａｘ−Ｍｉｎとして分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）ＰＲＩＳＭ、非直線回帰、シグモイド用量応答、可変スロープを用い、抗体濃度に対してプロットした。
分析において１７の異なる抗ＣＤ２２ヒト抗体を評価した。結果は、１７の試験対象の抗ＣＤ２２抗体のうち、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照または緩衝液のみと比較し、有意なカルシウム流入を刺激するものが全くないことを示した。Ｒａｍｏｓ細胞では、ヤギ抗ヒトＩｇＭ Ｆ（ａｂ’）２でのＢＣＲ刺激に応答してカルシウム流入が生じることが先行的に示された。
実施例７：抗ＣＤ２２抗体によるＢＣＲ刺激誘発性の効果の調節
この実施例では、固定化された抗ＣＤ２２抗体の、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の刺激誘発性の効果に対する調節能について試験した。分析では、抗ＣＤ２２ヒト抗体およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中で５μｇ／ｍｌに希釈し、Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ １ Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃７４１６）に３通りに１００μｌ／ウェルで分注した。４℃で一晩のインキュベーション後、プレートを冷却ＰＢＳで１回、次いでＲＰＭＩ１６４０（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）＋１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）で１回洗浄した。生存可能なＲａｍｏｓ細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１５９６）をトリパンブルー排除顕微鏡検査によりカウントし、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中で２×１０５細胞／ｍｌに希釈した。２０，０００個の細胞（５０μｌ／ウェル）を抗体でコートした９６ウェルプレートに分注した。抗ヒトＩｇＭ Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号１０９−００６−１２９）をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中で５μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルで分注して最終濃度を２．５μｇ／ｍｌにした。アッセイプレートを７２時間インキュベートした。細胞生存度を、１００μｌ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ７５７１）を１０分間添加して分析した。発光をＰｈｅｒａｓｔａｒ ＧＭＢ Ｌａｂｔｅｃｈ上のＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｔｅｓｔ １プレートＮｕｎｃ９６を用いて測定した。データを、１００％の細胞生存度を示すヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照に対する細胞死率として分析した。
分析では１７の異なる抗ＣＤ２２抗体について試験し、このパネルは、特異的抗体に応じ、約８０％の細胞死率の観察値からアイソタイプ対照の場合にほぼ等しい細胞死率の観察値を範囲とする広範囲の活性を示した。実施例２で構造的に特徴づけられた４つの抗体における結果を、図１１の棒グラフに示し、それは固定化された１９Ａ３、２３Ｃ６および１２Ｃ５のそれぞれがＢＣＲ刺激による細胞死の抗増殖効果を強力に高めた一方、１６Ｆ７とアイソタイプ対照との差が有意でなかったことを示す。
実施例８：細胞増殖に対する抗ＣＤ２２抗体の効果
この実施例では、抗体の架橋を伴う場合または伴わない場合での可溶性抗ＣＤ２２抗体の細胞増殖に対する直接的効果について試験した。用いたアッセイ法では、生存可能なＲａｍｏｓ細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１５９６）をトリパンブルー排除顕微鏡検査によりカウントし、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中で２×１０５細胞／ｍｌに希釈した。２０，０００個の細胞（５０μｌ／ウェル）を９６ウェル培養処理プレートに分注した。架橋抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄカタログ番号７０９−１１１７）をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中、８０μｇ／ｍｌに希釈し、２５μｌ／ウェルをＲａｍｏｓ細胞アッセイプレートの半分に分注した。希釈剤のみをプレートの残りに分注した（２５μｌ／ウェル）。抗ＣＤ２２ヒト抗体およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中、２０μｇ／ｍｌに希釈し、２５μｌ／ウェルを、Ｒａｍｏｓ＋クロスリンカーおよびＲａｍｏｓ＋希釈剤の双方を含有するウェルに最終抗体濃度が５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２２＋／−２０μｇ／ｍｌの架橋抗体であるように３通りに分注した。アッセイプレートを３７℃で７２時間インキュベートした。細胞生存度を、１００μｌ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ７５７１）を１０分間添加して分析した。発光をＰｈｅｒａｓｔａｒ ＧＭＢ Ｌａｂｔｅｃｈ上のＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｔｅｓｔ １プレートＮｕｎｃ９６を用いて測定した。データを、０％の阻害を示すヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照に対する成長阻害率として分析した。
分析では１７の異なる抗ＣＤ２２ヒト抗体について評価した。結果は、試験対象の１７の抗ＣＤ２２抗体のうち、抗体が架橋されない場合または架橋される場合のいずれであってもＲａｍｏｓ細胞増殖の速度を有意に変化させるものが全くないことを示した。これらの結果は、抗ＣＤ２２抗体のうち、たとえ抗体が架橋される場合であってもＲａｍｏｓ細胞に対して直接的な抗増殖効果を有するものが全くないことを示す。
実施例９：抗ＣＤ２２抗体のＣＤＣ活性の評価
この実施例では、可溶性抗ＣＤ２２ヒト抗体の補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）に対する媒介能について試験した。用いたアッセイ法では、生存可能なＲａｍｏｓ細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１５９６）をトリパンブルー排除顕微鏡検査によりカウントし、ＣＤＣ緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０＋０．１％ＢＳＡ＋２０ｍＭヘペス＋１％Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）中で２×１０６細胞／ｍｌに希釈した。細胞懸濁液を、９６ウェル平底組織培養処理プレート内に５０，０００個の細胞（５０μｌ／ウェル）として分注した。ヒト補体（Ｑｕｉｄｅｌカタログ番号Ａ１１３）を５６℃で１時間インキュベートすることにより熱不活性化した。活性を有する補体と熱不活性化した補体をそれぞれＣＤＣ緩衝液中で１：３に希釈し、Ｒａｍｏｓアッセイプレート内に５０μｌ／ウェルで分注した。抗ＣＤ２２ヒト抗体、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照および抗ＣＤ２０陽性対照抗体をそれぞれＣＤＣ緩衝液中で４０μｇ／ｍｌに希釈した。希釈抗体を、抗体の最終濃度が１０μｇ／ｍｌであるように、活性を有する補体と熱不活性化した補体の双方を有するＲａｍｏｓアッセイプレート内に５０μｌ／ウェルで２通りに分注した。アッセイプレートを３７℃で２時間インキュベートした。細胞生存度を分析するため、アラマーブルー試薬（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅカタログ番号ＤＡＬ１１００）を５０μｌ／ウェルに添加し、プレートを３７℃でさらに２１時間インキュベートした。細胞生存度を、ＳＰＥＣＴＲＯＭＡＸ ＧＥＭＩＮＩ蛍光プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓ／Ｎ Ｇ０２２４３）を用い、蛍光測定値に比例するものとして分析した。
１８の異なる抗ＣＤ２２抗体を、陽性対照として、活性があるが熱不活性化していない補体の存在下で強力な細胞毒性を示すことで知られる抗ＣＤ２０抗体とともに試験した。結果は、試験対象の抗ＣＤ２２抗体のうち、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比べて有意なＣＤＣ活性を示すものが全くないことを示した。
実施例１０：抗ＣＤ２２抗体−薬剤複合体によるインビボでの固形腫瘍細胞増殖の阻害
ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２の薬剤複合体を作製し、確立された固形腫瘍の増殖がインビボで有効に阻害されうるか否かを判定するため、抗ＣＤ２２組換え抗体のＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２を細胞毒性薬剤のサイトトキシンＡに結合し、得られたＡＤＣ化合物の有効性を、Ｒａｍｏｓ皮下腫瘍細胞モデルを用いて試験した。
ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２の細胞毒性化合物サイトトキシンＡへの複合
ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２を約５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、緩衝液を２０ｍＭホスフェート緩衝液、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＰＡ、３％グリセリン、ｐＨ７．５に交換し、１４倍モル過剰な２−イミノチオレーン（２−Ｉｍｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）で室温で６０分間チオール化した。チオール化後、抗体に対し、緩衝液を、５ｍＭグリシン、２ｍＭ ＤＴＰＡ、および０．５％ポビドン（１０Ｋ）、ｐＨ５．５を含有する５０ｍＭヘペス緩衝液に交換した。チオール化を、３２４ｎＭでのチオピリジン（ｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）の放出の測定により４，４’’−ジチオジピリジンで定量した。サイトトキシンＡをサイトトキシンＡ対チオールのモル比を３：１で添加することにより、複合を行った。室温で６０分間インキュベート後、任意の残存チオールを、Ｎ−エチルマレイミド対チオールのモル比１０：１で反応混合物に添加してブロッキングした。
得られた複合体をイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。各反応混合物を濾過し、緩衝液Ａ（５０ｍＭヘペス、５ｍＭグリシン、０．５％ポビドン（１０Ｋ）、ｐＨ５．５）で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムに充填した。抗体複合体を２４％緩衝液Ｂ（５０ｍＭヘペス、５ｍＭグリシン、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ポビドン（１０Ｋ）、ｐＨ５．５）で溶出した。単量体抗体−サイトトキシンＡ複合体を含有する画分をプールし、５０ｍＭヘペス、５ｍＭグリシン、１００ｍＭＮａＣｌ、０．５％ポビドン（１０Ｋ）、ｐＨ６．０に対して透析した。置換比を２８０および３４０ｎｍでの吸光度の測定により判定し、複合体をＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析した。
ＣＤ２２．１−サイトトキシンＡ複合体を１．７の置換比で作製し、ＣＤ２２．２複合体を１．６の置換比で作製した。
抗ＣＤ２２抗体−薬剤複合体のＣＤ２２．１−サイトトキシンＡおよびＣＤ２２．２−サイトトキシンＡのインビボでの有効性
ＳＣＩＤマウスの皮下に、マトリゲル内、マウス１匹当たり１０００万個の細胞のＲａｊｉ細胞を移植し、腫瘍を約１９０ｍｍ３のサイズ中央値で十分に確立されるまで成長させておいた。次いで、マウス８匹からなる群に、ＣＤ２２．１−サイトトキシンＡ抗体複合体、ＣＤ２２．２−サイトトキシンＡ複合体、Ｒａｊｉ細胞に結合しない対照ヒトＩｇＧ１−サイトトキシンＡ複合体、または賦形剤単独のいずれかを単回投与して処置した。腫瘍サイズを、投与後６３日間または動物が１５００ｍｍ３を超える腫瘍成長が原因で安楽死するまで監視した。ＣＤ２２．１−サイトトキシンＡを０．１８μｍｏｌ／ｋｇ相当の薬剤で投与し、ＣＤ２２．２−サイトトキシンＡおよび対照ａｂ−サイトトキシンＡを０．３μｍｏｌ／ｋｇ相当の薬剤で投与した。結果は、ＣＤ２２．１およびＣＤ２２．２複合体の双方において良好な抗腫瘍有効性を示した（図１６）。
配列表の概要
Figure 0005846695
Figure 0005846695

Claims (29)

  1. （ａ）配列番号２において示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
    （ｂ）配列番号６または配列番号６０において示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
    （ｃ）配列番号１０において示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
    （ｄ）配列番号１４において示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
    （ｅ）配列番号２０において示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
    （ｆ）配列番号２６において示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
    を含み、１×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＣＤ２２に特異的に結合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  2. （ａ）配列番号２において示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
    （ｂ）配列番号６において示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
    （ｃ）配列番号１０において示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
    （ｄ）配列番号１４において示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
    （ｅ）配列番号２０において示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
    （ｆ）配列番号２６において示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
    を含む、請求項１記載の抗体またはその抗原結合部分。
  3. （ａ）配列番号２において示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
    （ｂ）配列番号６０において示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
    （ｃ）配列番号１０において示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
    （ｄ）配列番号１４において示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
    （ｅ）配列番号２０において示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
    （ｆ）配列番号２６において示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
    を含む、請求項１記載の抗体またはその抗原結合部分。
  4. （ａ）配列番号３２において示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域、および
    （ｂ）配列番号３６において示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項１記載の抗体またはその抗原結合部分。
  5. （ａ）配列番号６１において示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域、および
    （ｂ）配列番号３６において示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項１記載の抗体またはその抗原結合部分。
  6. ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分。
  7. ヒト抗体である、請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分。
  8. ＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分。
  9. ＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分。
  10. ヒト抗体またはその部分である、請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分。
  11. キメラ抗体またはヒト化抗体もしくはそれらの部分である、請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分。
  12. ５×１０−１０Ｍ以下のＫＤでヒトＣＤ２２に特異的に結合する、請求項１〜１１のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分。
  13. （ａ）ＣＤ２２＋細胞に内在化する特性
    （ｂ）ＣＤ２２＋細胞に対して抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を示す特性
    （ｃ）Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の刺激により誘発されるＲａｍｏｓ細胞の細胞死を促進する特性、および
    （ｄ）細胞毒素に結合される場合、インビボでＣＤ２２発現細胞の成長を阻害する特性
    のうちの少なくとも１つを示す、請求項１〜１１のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分。
  14. 請求項１〜１３のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分、および薬学的に許容できる担体を含む組成物。
  15. 請求項１〜１３のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分、および治療物質であるパートナー分子を含む免疫複合体。
  16. パートナー分子が化学リンカーにより抗体に結合されている、請求項１５記載の免疫複合体。
  17. 化学リンカーがペプチジルリンカー、ヒドラジンリンカー、およびジスルフィドリンカーからなる群から選択される、請求項１６記載の免疫複合体。
  18. 治療物質が細胞毒素である、請求項１５〜１７のいずれか一項記載の免疫複合体。
  19. 治療物質が放射性同位体である、請求項１５〜１７のいずれか一項記載の免疫複合体。
  20. 請求項１５〜１９のいずれか一項記載の免疫複合体および薬学的に許容できる担体を含む、組成物。
  21. 請求項１〜１３のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分をコードする、単離核酸。
  22. 請求項２１記載の核酸を含む発現ベクター。
  23. 請求項２２記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  24. ＣＤ２２発現腫瘍細胞の成長を阻害するのに使用するための医薬の調製のための、請求項１〜１３のいずれか一項記載の抗体もしくはその抗原結合部分または請求項１５〜１９のいずれか一項記載の免疫複合体の使用。
  25. 腫瘍細胞がＢ細胞リンパ腫である、請求項２４記載の使用。
  26. Ｂ細胞リンパ腫が非ホジキンリンパ腫である、請求項２５記載の使用。
  27. 炎症性疾患または自己免疫疾患を治療するのに使用するための医薬の調製のための、請求項１〜１３のいずれか一項記載の抗体もしくはその抗原結合部分または請求項１５〜１９のいずれか一項記載の免疫複合体の使用。
  28. 自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項２７記載の使用。
  29. 自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項２７記載の使用。
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