KR100353496B1 - 하이드로겔마이크로캡슐화백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항원을 캡슐화시켜서 백신을 생성시키기 위해 사용되는 가용성 중합체 또는 중합체 하이드로겔에 관한 것이다. 항원은 중합체 용액과 혼합되고, 미소 입자는 중합체 및 항원으로 생성되고, 임의적으로, 중합체는 교차 결합되어 안정한 미소 입자를 생성시킨다, 바람직한 중합체는 알긴산염 및 폴리포스파젠 및 이것들의 혼합물이다. 미소 입자는 비경구 또는 점막 투여될 수 있다. 경구 전달을 위해, 미소 입자는 바람직하게는 직경이 15 미크론 미만이고, 위장관의 안에 있는 점막에 점착되어 세망 내피 조직에 의한 흡수를 증가시킨다.
Description
발명의 배경
본 발명은 수용성 중합체 또는 하이드로겔을 기재로 하는 미소구체형 백신 비히클에 관한 것이다.
본 발명은 1993년 7월 12일에 출원된, 발명의 명칭이 "면역 보조제로서의 포스파젠 고분자전해질"인 미국 특허 출원 제 08/090,841호의 일부 계속 출원이다.
점막 표면을 통한 면역 반응의 유도
바이러스의 대부분은 주된 감염 자리로서 점막 표면을 이용한다. 바이러스에 따라, 감염을 점막 표면에 편중되어 지속되거나 확산되어 전신 감염시킨다. 국소적 감염을 일으키는 바이러스의 예로는 호흡기 점막에서 증식하는 인플루엔자, 파라인플루엔자 및 통상적인 감기 바이러스, 및 장의 점막에서 복제되는 로타바이러스 및 노오워크(Norwalk) 제제가 있다. 점막으로부터 확산되는 전신적 바이러스 감염을 유도하는 바이러스의 대표적 예로는 홍역, 유행성 이하선염, 풍진, 소아마비, A 및 B형 간염 및 포진 바이러스가 있다.
지난 수 년 동안, 점막 면역의 유도에 관한 많은 정보가 나왔다. 예를 들어, 소화관의 경우, 면역 반응은 소화관 점막에 묻혀있는 페이어판(Peyer's patch)에 편증된다. 상기 위치에 있는 림프 조직(소화관 관련된 림프 조직, GALT)이 소화관의 루멘에 노출되어 발광 함유물의 일정한 샘플링을 가능하게 해준다. 기관지 관련된 림프 조직(BALT)으로 불리우는 유사한 림프 조직이 호출기 점막에 위치한다.
현재, 바이러스 백신의 대부분은 살아있는 약독되거나 비활성화된 바이러스 제제의 주입 후에 전신 보호 면역 상태를 달성한다. 이러한 백신의 성공은 백신의 세포 매개성 면역 반응 및/또는 체액성 면역 반응의 유도에 의한 것이다. 이러한 전신 면역은 점막에서의 바이러스 복제를 감소시키고 중요 표적 기관으로의 바이러스의 확산을 제거하므로써 질환의 발병을 방지해준다.
주입가능한 백신의 사용은 많은 바이러스성 질환의 빈도를 현저하게 감소시켰다. 그럼에도 불구하고, 이것의 사용은 어느 정도의 부작용을 동반한다. 살아 있는 약독된 바이러스 백신은 전신 합병증을 야기시킬 수 있고, 비활성화된 백신은 국소 반응을 야기시키고 심지어는 알레르기성 질환을 유도할 수 있다. 이러한 백신 부작용의 중요한 2가지 결과는 낮은 컴플라이언스(compliance)와 리티게이션 (litigation)이다. 낮은 컴플라이언스는 면역성의 감소 및 자연적 감염율의 증가를 유도하고 낮은 리티게이션은 신규 백신에 대한 현재의 백신 개발의 개선을 방해한다.
주입가능한 백신의 사용에 대한 대안은 항원, 특히 살아 있는 약독된 바이러스를 경구 투여하는 것이다. 이러한 백신은 야생형 바이러스에 의한 자연적 감염에 의해 유도되는 면역 반응을 모방하는 강한 점막 및 전신 면역 둘 모두를 유도한다. 이러한 면역 반응의 형성은 바이러스의 전신 확산뿐만 아니라 점막에서의 바이러스 복제를 제거한다. 따라서, 복제성 경구용 백신에 의해 유도된 면역 반응은 주입가능한 살아있거나 비활성화된 백신에 의해 유도되는 면역반응 보다 우수하다. 이러한 유형의 백신의 가장 우수한 예는 살아있는 약독된 경구용 소아마비 바이러스 백신(OPV)이다. 불운하게도, 살아있는 바이러스의 경구 투여는 위 통과시에 생존하고 독성으로 쉽게 전환되지 않는 바이러스로 제한된다.
지금까지 개발된 가장 효과적인 비복제성 항바이러스 백신은 비활성화된 바이러스 입자였다. 동물 모델에서의 펩티드 및 서브유닛 백신의 효능은 제한된 성공률을 가지며, 현재 이러한 유형의 제형을 사용하는 인간 백신은 없다. 재조합 DNA 공학의 초기에, 많은 그룹은 비감염성 바이러스 항원을 생산함으로써 보호 면역의 개발 뿐만 아니라 안전성 문제의 해결을 충분히 예측하였다. 불운하게도, 고도로 정제되어 백신내로 주입되는 실험실용 발현 벡터로 생성된 바이러스 단백질이 미미하게라도 자연적 감염에서 발견되는 항원 상태에 근접하는 생체내 구조를 취할 것이라고 추정할 이유가 없음이 점점 명백해지고 있다. 지금까지, 유일한 성공적인 재조합체 유래된 백신은 진핵세포(효모) 발현 시스템에서 합성된 B형 간염 표면 (HBS) 항원이었다.
미립자 상태로의 비복제성 항원의 경구적 제공이 자연적 감염에 의해 유도되는 면역을 거의 흉내내는 점막 및 전신 면역 둘 모두를 유도함을 입증하는 증거가 많아지고 있다. 이것은, 전신 면역을 유도하지 않을 뿐만 아니라 전신 내성의 상태를 매우 자주 유도하는 비복제성 가용성 항원에 의한 경구적 면역과는 대조적인 것이다. 또한, 이러한 면역을 유도하는데 요구되는 항원 용량은 동일한 항원에 의한 비경구적 면역에 요구되는 용량 보다 훨씬 낮다. 이러한 백신 제형에 고유한 주된 장점은 투여의 용이함 및 완벽한 안전성에 있다.
보조제
현대 분자 생물학의 출현은 전례없이 용이하고 정밀하게 면역원을 생성시키는 수단을 제공하였다. 이러한 새로운 방법론은 일반적으로 효과적인 보조제의 부재하에서는 강한 면역 반응을 일반적으로 유도하지 않는 정제된 면역원을 생성시킨다는 점에서 아이러니이다. 따라서, 사람에게 사용하기 위한 개선된 백신 보조제의 개발은 우선 연구 분야가 되었다. 그럼에도 불구하고, 보조제에 대한 연구는 면역원에 대해 수행된 작업에 비해 심각하게 뒤쳐져 있다. 수 십년 동안, 사람에게 널리 사용된 유일한 보조제는 알룸(Alum)이었다. 사포닌 및 이것의 정제된 성분 퀴일(Ouil) A, 프로인트 완전 보조제, 및 연구 및 수의학 분야에 사용되는 다른 보조제는 사람 백신에서의 사용가능성을 제한하는 독성을 갖는다. 무밀 디펩티드 및 모노포스포릴 지질 A와 같은 새롭게 화학적으로 정의된 제제가 연구되고 있다.
보조제가 어떻게 효과를 발휘하는 가에 대한 통상적인 관점은 광유에멀션 또는 수산화알루미늄과 같은 보조제가 항원을 서서히 방출시키는 주입 자리에서 항원 디폿(depot)을 형성시킨다는 것이다. 그러나, 3일 후 주입 자리를 절개한 결과 면역 반응에 대한 효과가 거의 없는 것으로 밝혀졌다. 최근의 연구에서는 시토킨의 방출에 의해 면역 반응의 특이적이고 종종 매우 협소한 아암(arm)을 자극함으로써 보조제가 면역 반응을 증진시키는 것으로 나타난다[참조: A.C. Allison and N.E. Byars, in: "Vaccines: New Approaches to Immunological Problems" , R.W. Ellis, ed., p. 431(Butterworth-Heinemann, Oxford 1992)]. 장기간 동안 항원의 방출을 위한 단순한 디폿으로서 작용하는 보조제를 제공하는 것이 바람직하다.
지난 수년 동안 발달된 보조제 연구 분야에서는 백신을 제형화하는 데에 합성 중합체를 이용하고 있다. 약 10,000 미만의 분자량을 갖는 헌터, 알.엘.(Hunter, R.L.)[Topics in vaccine adjuvant research. D.R. Spriggs and W.C. Koff(Eds). pp. 89-98(CRC Press, 1991)]의 비이온성 블록 공중합체는 소수성 폴리옥시프로필렌(POP)의 단일 블록을 플랭킹하는 친수성 폴리옥시에틸렌(POE)의 2개의 블록으로 구성된 간단한 구조를 갖는다. 이들은 최소한 독성의 계면 활성제 중 하나인 것으로 고려되며, 식품, 약제 및 화장품에 널리 사용된다. 몇몇 큰 소수성 공증합체는 효과적인 보조제이나, 밀접하게 관련된 제제는 그러하지 않다. POE와 POP의 사슬 결합의 차이와 관련하여 이러한 공중합체의 보조제 활성 사이에는 상관 관계가 있다. 현재, 이들 보조제는 유성 및 수성 에멀션에 사용된다.
다양한 분자량을 갖는 광범위한 고분자전해질이 또한 보조제 활성을 갖는 것으로 입증되었다[참조: Petrov, et al. Sov. Med. Rev. Section D Immunology, 4:1-113(1992)]. 양전하 또는 음전하를 지닌 거대 분자는 유사한 면역 자극 활성을 나타내었다. 고분자전해질은 정전기적 결함 및 소수성 결합을 통해 항원과의 복합체를 생성시킨다. 다른 한편으로는, 중성 및 하전되지 않은 중합체는 면역 반응에 대한 효과가 전혀 없었다.
약제 및 항원의 조절 방출
몇 가지 현재 이용할 수 있는 백신의 주된 단점은 반복 투여의 필요성에 있으므로, 현재 조절 방출형 백신을 개발하는 데에는 상당한 관심이 있다. 조절 방출 백신은 부스터 면역에 대한 필요성을 제거할 수 있으므로 보건 요원과 백신 수용자간의 반복적인 접촉이 때로 이루어지기 어려운 개발도상국에서 특히 유용할 것이다. 모낭 수지상 세포 및 림프절 기관의 외막상에 존속하는 항원이 B 기억 세포의 보충에 관여하여 항체 분비 세포를 생성시키는 것을 보여주는 증거가 많아지고 있다. 혈중 항체의 연속 방출은 이러한 보충이 연속적으로 일어남을 시사한다. 항원 수준이 감소하는 경우, 이는 항체의 친화성 성숙의 잘 정립된 현상이 일어날 수 있게 해준다. 항원 존속 개념의 수용은 백신 개발에서 중요한 의미를 갖는다. 이상적으로는, 항원이 장기간 동안 면역계, 특히 모낭 수지상 세포에 제공되도록 하는 방식으로 백신을 제형화시킬 수 있는 것이 유리할 것이다.
다수의 중합체가 항원 뿐만 아니라 그 밖의 단백질 및 화합물을 포착하는 데 사용되어 왔다. 이것의 초기 예로는 다음 참고 문헌에 보고된, 이른바 나노 입자를 생성시키는 1 미크론(1000 나노미터) 미만의 직경을 갖는 메틸 메타크릴레이트 구체내에서의 인플루엔자 항원을 종합시키는 것이 있다[참고 문헌: Kreuter, J. Microcapsules and Nanoparlicles in Medicine and Pharmacology. M. Donbrow(Ed)., p. 125-148(CRC Press)]. 인플루엔자 바이러스에 의한 감염에 대한 항체 반응 및 보호작용은 항원이 수산화알루미늄과 함께 투여되는 경우 더욱 상당히 우수하였다. 다른 입자를 사용하는 실험은, 상기 중합체의 보조제 효과가 입자 크기 및 소수성에 의존함을 입증하였다.
몇몇 인자가 마이크로캡슐화를 위한 특정 중합체의 선택에 기여한다. 중합체 합성 및 마이크로캡슐화 과정의 재현성, 마이크로캡슐화 재료 및 방법의 비용, 독물학적 프로필, 방출 속도, 및 중합체와 항원의 물리화학적 양립가능성이 고려되어야 할 모든 인자이다.
생분해성 중합체는 여러 타입의 불안정 결합 중의 하나에 대해 설계될 수 있다. 예로는, 폴리카아보네이트, 플리에스테르, 폴리우레탄, 폴리오르토에스테르 및 폴리아미드가 있다. 마이크로캡슐화를 위해 천연 중합체 보다는 합성 중합체를 사용하는 장점 중 하나는 중성 조건하에서 이러할 결합의 상대적인 가수분해 속도가 중합체 주쇄에 대한 치환기에 의해 영향받을 수 있다는 점이다,
약제용 및 보다 최근에는 항원용으로 자주 선택되는 담체는 폴리 (D,L-락티드-코-글리콜리드)(PLGA)이다. 관리 당국에 의한 용인가능성은 임의의 항원 전달 시스템에 대한 상당한 장애로 남아있다. PLGA 중합체는 다년간 흡수성 봉합체로서 사용되어 온 생분해성이고, 생체적합성인 폴리에스테르이다[참조: Eldridge, J.H., et al. Current Topics in Microbiology and Immunology. 1989, 146: 59-66]. 직경이 1 내지 10 미크론인 PLGA 미소구체내로 항원을 포획시키는 것은 보조제 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
PLGA 시스템의 주요 단점은 항원의 마이크로캡슐화에 유기 용매를 사용하고 제조 시간이 길다는 것이다. 이 방법은 유중수 에멀션의 상 분리를 이용한다. 관심있는 화합물이 수용액으로서 준비되고, PLGA는 메틸렌 클로라이드 및 에틸 아세테이트와 같은 적합한 유기 용매 중에 용해된다. 상기의 2 가지 비혼화성 용액은 고속 교반에 의해 코에멀션화된다. 그 후, 중합체에 대한 비용매가 첨가되어, 수성 소적 주변에 중합체의 침전을 야기시켜 미발달(embroynic) 마이크로캡슐을 형성시킨다. 마이크로캡슐을 모으고, 폴리비닐 알코올(PVA), 젤라틴, 알긴산염, 폴리비닐피롤리돈(PVP) 또는 메틸 셀룰로오스와 같은 고분자전해질로 안정화시키고, 진공 건조 또는 용매 추출에 의해 용매를 제거한다. 상기 제조 조건은 문헌[J. H. Eldridge, et al., Infection and Immunity 9:2978(1991)]에서 입증된 바와 같이, 다양한 펩티드 약제 및 스타필로코칼 엔테로특신 B 및 키이호을 림펫트 시아닌과 같은 경질 면역원을 마이크로캡슐화시키는 데 성공적으로 사용되었지만, PLGA를 사용하는 마이크로캡슐화에 요구되는 고전단력, 유기 용매의 사용 및 긴 제조 시간은 피막성 바이러스와 같은 복합체 불안정성 면역원상의 중요한 에피토프에 유해할 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 유기 용매의 사용 또는 긴 제조 시간을 필요로 하지 않는 백신의 비경구 또는 점막 투여에 의한 전달 및 캡슐화를 위한 재료를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 특히 경구 전달을 통해 점막 표면에 항원을 전달하기 위한 시스템을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 광범위한 면역원성 반응을 유도하는 항원 전달용 전달 시스템을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 백신의 면역원성을 향상시키는 백신 전달용 전달 시스템을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 항원의 조절 방출을 제공하는 생분해성 전달 시스템을 제공하는 데에 있다.
발명의 요약
수용성 중합체 및 중합체 하이드로겔이 점막 표면으로의 전달 및 점막 표면에서 항원의 조절 방출을 위해 또는 주입(비경구적 투여)을 위해 항원을 마이크로캡슐화시키는 데에 사용된다. 가장 바람직한 구체예에서, 캡슐화된 항원은 경구 투여되거나 비내 투여된다. 중합체는 온화하고 혼입시키려는 항원을 변성시키지 않는 조건하에서 200 미크론 이하의 직경을 갖는 미세입자를 생성시키는 데 사용될 수 있는 임의의 생체적합성 가교성 수용성 중합체 또는 중합체 하이드로겔일 수 있다. 바람직한 천연 수용성 중합체로는 알긴산염, 젤라틴, 펙틴 및 콜라겐을 포함하고; 바람직한 합성 수용성 중합체로는 폴리(아크릴아미드), 폴리(메타크릴아미드), 폴리(비닐 아세테이트), 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(히드록시에틸메타크릴레이트), 폴리(에틸렌글리콜), 폴리비닐아민, 폴리(비닐피리딘), 포스파젠 고분자전해질 및 폴리(비닐 알코올)을 포함하고; 이온성 가교에 의해 하이드로겔을 생성시키는 바람직한 중합체로는 폴리(아크릴산) 또는 폴리(메타크릴산)의 염, 술폰화된 폴리스티렌, 폴리아민 또는 폴리(비닐피리딘)의 사차염; 및 이러한 중합체 또는 이들의 단량체의 혼합물 및 공중합체를 포함한다. 가장 바람직한 중합체는 알긴산염, 폴리포스파젠 및 이것들의 혼합물이다.
캡슐화된 항원을 제조하기 위해, 항원이 중합체 용액과 혼합되고, 미세입자가 상당량의 유기 용매를 사용함이 없이 중합체와 항원으로 빠르게 형성되고, 중합체가 이온적으로 또는 공유결합적으로 가교되어 안정한 생분해성 미세입자를 생성시킨다. 미세입자는 위장관의 점막 내층과 같은 점막 표면에 부착하여, 시간이 경과함에 따라 방출되므로써 항원의 세망내피에 의한 흡수를 증가시킨다. 중합체는바람직하게는 알긴산염 또는 폴리포스파젠이며, 가장 바람직하게는 폴리이온 또는 염화칼슘과 같은 이가 양이온과 이온적으로 가교된다.
실시예는 단독 또는 콜레라 독소와 같은 점막 자극제와 조합된 형태의 중합체 캡슐화된 항원의 증진된 면역원성을 입증해줄 뿐만 아니라, 비경구적, 경구적 또는 비내 투여되는 경우에 방출 속도 및 체액성 반응을 변경시키기 위해 중합체를 어떻게 조작하는 가를 입증해준다.
제 1 도는 캡슐화된 단백질 분자량과 중합체 농도의 함수로서 방출%로서 측정된, 폴리포스파젠 미소구체의 투과율에 대한 그래프이다. 레인보우 단백질 마아커는 3가지 농도, 즉 3.3%(점선 막대), 2.5%(빗금막대) 및 1.5%(검정 막대)의 폴리[디(카르복실레이토페녹시)포스파젠-코-디(글리시네이토)포스파젠](PP)로 마이크로캡슐화되고, 상등액 중의 단백질의 양이 분광학적으로 측정되기 전에 24 시간 동안 실온에서 pH 7.4의 HEPES 완충제 중에서 인큐베이션되었다.
제 2 도는 시간(일)이 지남에 따른 질량 손실%로 측정된, 폴리포스파젠 미소구체의 부식 프로파일에 대한 분자량의 효과를 나타내는 그래프이다: PC-GIP, 130 KDa(정사각형); PCPP, 3900 KDa(다이아몬드); PC-GIP, 170 KDa(원); 및 PCPP, 400 KDa(삼각형).
제 3a 도 및 3b 도는 다양한 초기 분자량의 폴리포스파젠에 의한 PCPP 하이드로겔에 대한 시간(일)이 지남에 따른 분자량 감소 프로파일을 나타낸 것이다: Mw, 분자량; Mn, 수평균 분자량; 초기 Mw 3,900 KDa(제 3a 도), 및 Mw 400 KDa(제3b도).
제 4 도는 매트릭스 중의 중합체의 분자량을 용액 중의 중합체의 분자량과 비교하는, Mw 170 KDa의 PC-GIPP 하이드로겔에 대한 시간(일)이 지남에 따른 분자량 감소 프로파일을 나타낸 것이다.
제 5 도는 다양한 분자량, 즉 12000 mw(정사각형), 62500 mw(다이아몬드), 140800 mw(원), 및 295000 mw(삼각형)의 폴리-L-리신으로 피복된 폴리포스파젠 미소구체로부터의 폴리스티렌 비이드의 방출%을 나타낸 그래프이다. 직경이 20 nm로 측정된 형광 폴리스티렌(PS) 비이드는 중합체 1로 캡슐화된 후, 다양한 분자량의 폴리-L-리신으로 피복되었다. 피복된 비이드는 실온에서 pH 7.4의 HEPES 완충제 중에서 인큐베이션되었다. 상등액으로 방출된 폴리스티렌 비드는 정량적 형광측정법에 의해 측정되고, 초기 캡슐화된 비이드의 %로서 표현되었다.
제 6a 도, 6b 도 및 6c도는 7일, 14일, 21일 및 28일 째에 항체 역가(좌측으로부터 우측으로 읽어서, IgM, 검정 막대; IgG, 빗금 막대; lgA, 점막대)로서 측정된, 현탁액 증의 인플루엔자 바이러스(제 6a도), 알긴산염 미소구체 중의 콜레라 독소(CT)와 조합된 형태로 캡슐화된 인플루엔자 바이러스(제 6b 도), 및 알긴산염 미소구체 중에 캡슐화된 인플루엔자 바이러스(제 6c 도)로 면역된 동물의 혈청에서의 인플루엔자 특이적 반응을 나타내는 그래프이다.
제 7 도는 IgM, 검정 막대; IgG, 빗금 막대; IgA, 점 막대에 대해, 면역 후 7일, 14일, 21일, 28일 및 35일 째에 측정된, CT와 함께 알긴산염 중에 캡슐화된 인플루엔자의 경구 투여에 따른 혈청에서의 인플루엔자 특이적 항체 반응을 나타내는 그래프이다.
제 8 도는 IgM, 검정 막대; lgG, 빗금 막대; lgA, 점 막대에 대해, 부스팅 후 7일, 14일, 21일, 28일 및 35일 째에 측정된, 경구 부스팅 후의, CT와 조합된 형태의 알긴산염 미소구체 중의 인플루엔자의 경구 투여에 따른 분뇨 샘플에서의 인플루엔자 특이적 항체 반응의 그래프이다.
일반적으로, 항원의 전달을 위한 미소구체는 하이드로겔을 생성시키는 중합체 또는 수용성 중합체의 공유 결합성 가교 또는 이온성 가교에 의해 생성된다. 바람직한 구체예에서, 중합체는 칼슘 이온과 같은 이가 이온과 이온적으로 가교되어 항원을 캡슐화하는 수용성 하이드로겔을 생성시키는 알긴산염 또는 폴리포스파젠과 같은 수용성 중합체로 형성된다. 항원은 가교 전에 중합체 용액과 혼합되어, 미소구체 전체에 걸친 항원의 분산을 보장한다. 더욱 안정한 미소구체는 미소구체를 폴리아미노산과 같은 고분자전해질과 추가로 가교시키므로써 형성될 수 있다.
미소구체를 제조하는 데 유용한 중합체
중합체는 혼입되는 항원을 변성시키지 않는 완만한 조건하에서 10 미크론 이하의 직경을 갖는 미소입자를 형성시키는데 사용될 수 있는 거의 모든 생체적합성 가교성 수용성 중합체 또는 중합체 하이드로겔일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 하이드로겔은 임의의 물로 팽윤된 (water-swollen) 중합체로서 규정된다. 수용성 중합체는 물, 완충된 식염 수용액, 알코올 수용액에 최소한 부분적으로 가용성(전형적으로 적어도 0.001 중량% 이상의 정도로)인 중합체이다. 바람직한 천연수용성 중합체로는 알긴산염, 젤라틴, 펙틴 및 콜라겐이 있고; 바람직한 합성 수용성 중합체로는 폴리(아크릴아미드), 폴리(메타크릴아미드), 폴리(비닐 아세테이트), 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(히드록시에틸메타크릴레이트), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리비닐아민, 폴리(비닐피리딘), 포스파젠 고분자전해질 및 폴리(비닐 알코올)이 있으며; 이온성 가교에 의해 하이드로겔을 생성시키는 바람직한 중합체로는 폴리(아크킬산) 또는 폴리(메타크릴산), 술폰화된 폴리스티렌, 폴리아민 또는 폴리(비닐피리딘)의 사차염; 및 이것들의 혼합물 및 중합체 또는 단량체의 공중합체가 있다. 가장 바람직한 중합체는 알긴산염, 폴리포스파젠 및 이것들의 혼합물이다.
중합체는 이온성 가교, 공유 결합성 가교 또는 물리적 가교에 의해 가교되어, 수용성 중합체를 수불용성이 되게 할 수 있다. 실온에서 수성 기재 중합체 용액을 이온성 가교에 의해 겔화시키는 것은 유기 용매에 대한 장시간 노출, 고온, 및 유기 용매 증에 용해된 중합체가 필요로 하는 건조를 제거시킨다. 중합체는, 중합체가 산성 측쇄 기를 갖는 경우에는 다가 양이온 또는 중합체가 염기성 측쇄 기를 갖는 경우에는 다가 음이온과 같은, 하전된 측쇄 기의 전하의 반대 전하의 다가 이온을 함유하는 수용액 중에서 가교될 수 있다. 바람직하게는, 중합체는 칼슘, 구리, 알루미늄, 미그네슘, 스트론튬, 바륨, 주석, 아연 및 철과 같은 이가 및 삼가 금속 이온, 또는 폴리(아미노산)(들), 폴리(에틸렌이민), 폴리(비닐아민), 폴리(비닐피리딘), 다당류 및 고분자전해질 복합체를 생성시킬 수 있는 그 밖의 화합물과 같은 폴리양이온에 의해 가교된다.
알긴산염
가장 잘 연구된 이온 가교성 중합체는 식품용 갈조류로부터 제조되는 천연 알긴산염, 예를 들어, 프로타날(Protanal) LF 20/60(Pronova, Inc., Portsmouth, NH, USA)이다.
중합체는 다가 이온을 사용하여 가교되며, 바람직하게는 염화 칼슘 또는 다른 이가 또는 다가 양이온을 사용하여 가교된다.
폴리포스파젠
문헌[H. R. Allcock and S. Kwon., Macromolecules 22, 75-79(1989)]에 기술된, 일군의 이온 가교성 수용성 폴리포스파젠의 종류의 설명은, 제조 동안 내내 수성 환경에 노출되는 항원을 함유하는 미소구체를 생성시킬 수 있게 해주었다.
본원에 사용되는 용어 "아미노산"은 천연 및 합성 아미노산 둘 모두를 나타내며, 알라닐, 발리닐, 류시닐, 이소류시닐, 프롤리닐, 페닐알라니닐, 트립토파닐, 메티오니닐, 글리시닐, 세리닐, 트레오니닐, 시스테이닐, 티로시닐, 아스파라기닐, 글루타미닐, 아스파르토일, 글루타오일, 리시닐, 아르기니닐 및 히스티디닐을 포함하지만, 이것들로 제한되지 않는다.
용어 "아미노산 에스테르"는 천연 또는 합성 아미노산의 지방족, 아릴, 헤테로방향족 카르복실산 에스테르를 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "알킬"은 전형적으로 C1내지 C20인 포화된 직쇄, 측쇄 또는 고리형 탄화수소, 또는 이것들의 조합물을 의미하며, 특히 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 시클로펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 이소헥실, 시클로헥실, 3-메틸펜틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 헵틸, 옥틸, 노닐 및 데실을 포함한다.
용어 "(알킬 또는 디알킬)아미노"는 각각 1개 또는 2개의 알킬 치환기를 갖는 아미노기를 나타낸다.
본원에 사용되는 용어 "알케닐 및 알키닐"은 각각 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 갖는 C2내지 C20의 직쇄 또는 측쇄 탄화수소를 나타낸다.
본원에 사용되는 용어 "아릴"은 페닐 또는 치환된 페닐을 나타내며, 여기에서 치환기는 할로, 알킬, 알콕시, 알킬티오, 할로알킬, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 메틸렌디옥시, 시아노, C(O)(저급 알킬), -CO2H, -SO3H, -PO3H, -CO2알킬, 아미드, 아미노, 알킬아미노 및 디알킬아미노이고, 여기에서 아릴기는 3개 이하의 치환기를 가질 수 있다.
용어 "지방족"은 알킬, 알켄일 또는 알킨일 부분 중 하나 또는 이들의 조합물을 함유할 수 있고, 직쇄, 측쇄 또는 고리형, 또는 이들의 조합물일 수 있는, 전형적으로 C1내지 C20인 탄화수소를 나타낸다.
용여 "할로"는 플루오로,클로로, 브로모 또는 요오도를 포함한다.
용어 "아르알킬"은 알킬 치환기를 갖는 아릴기를 나타낸다.
용어 "알크아릴"은 벤질, 치환된 벤질, 페네틸 또는 치환된 페네틸(치환기는 아릴기에 대해 상기 정의된 바와 같음)을 포함하는 아릴 치환기를 갖는 알킬기를나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로아릴 또는 헤테로방향족"은 방향족 고리 중에 하나 이상의 황, 산소 또는 질소를 포함하고, 아릴기에 대해 상기 기술된 바와 같이 임의적으로 치환될 수 있는 방향족 부분을 나타낸다. 비제한적 예로는 푸릴, 피리딜, 피리미될, 티에닐, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 테트라졸릴, 피라진일, 벤조푸란일, 벤조티오페닐, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 벤조티에닐, 이소벤조푸릴, 피라졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 푸린일, 카르보졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 1,2,4-티아디아졸릴, 이소옥사졸릴, 피롤릴, 피라졸릴, 퀴나졸린일, 피리다진일, 피라진일, 신놀린일, 프탈라진일, 퀴녹살린일, 크산틴일, 하이포크산틴일, 프테리딘일, 5-아자시티딘일, 5-아자우라실릴, 트리아졸로피리딘일, 이미다졸로피리딘일, 피롤로피리미딘일, 및 피라졸로피리미딘일이 있다.
용어 "약제학적으로 허용되는 이온"은 전하를 운반하고, 포스파젠 고분자전해질에서 대이온으로서 투여될 수 있는 유기 또는 무기 부분을 나타낸다.
본원에 사용되는 용어 "헤테로알킬"은 산소, 황 또는 질소(수소 또는 산소에 의해 채워진 원자가를 가짐)와 같은 헤테로 원자가 탄소 사슬내에 포함되거나, 탄소 사슬을 종결짓는 알킬기를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리[(카르복실레이토페녹시)(클리시네이토)포스파젠], 폴리[디(카르복실레이토페녹시)포스파젠-코-디(글리시네이토)포스파젠-코-(카르복실레이토페녹시)(글리시네이토)포스파젠] 및 폴리[디(카르복실레이토페녹시)포스파진-코-디(글리시네이토)포스파젠]은 똑같은 중합체를 나타낸다.
폴리포스파젠은 바람직하게는 하전된 측쇄기를 이의 대이온과 평형을 이루고 있는 산 또는 염기의 형태로 또는 이것의 이온성 염의 형태로 함유한다.
중합체는 사람을 포함하는 동물에 투여할 경우에 최소 독성을 나타내며 생분해성인 것이 바람직하다.
포스파젠 고분자전해질의 선택
폴리포스파젠은 교대하는 단일 및 이중 결합에 의해 분리되는 인과 질소가 교대로 구성되어 있는 주쇄를 갖는 중합체이다. 각각의 인 원자는 2개의 펜던트기 ("R")에 공유 결합되어 있다. 폴리포스파젠에서 반복 단위는 하기의 일반식을 갖는다 :
상기 식에서,
n은 정수이다.
치환기("R")은 지방족, 아릴, 아르알킬, 알크아릴, 카르복실산, 헤테로 방향족, 글루코오스를 포함하는 탄수화물, 헤테로알킬, 할로겐, 알킬아미노-를 포함하는(지방족)아미노, 헤테로아르알킬, 디알킬아미노-를 포함하는 디(지방족)아미노-, 아릴아미노-, 디아릴아미노-, 알킬아릴아미노-, -옥시페닐CO2H, -옥시페닐 SO3H, -옥시페닐히드록실 및 -옥시페닐 PO3H를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 -옥시아릴; -옥시알킬, -옥시(지방족)CO2H, -옥시(지방족)SO3H, -옥시(지방족)PO3H, 및 -옥시(알킬)히드록실을 포함하는 -옥시(지방족)히드록실을 포함하는 -옥시지방족; 옥시알크아릴, -옥시아르알킬, -티오아릴, -티오알킬을 포함하는 -티오지방족, -티오알크아릴, -티오아르알킬, -NHC(O)O-(아릴 또는 지방족), -O-[(CH2)xO]y-(CH2)xNH2, -O-[(CH2)xO]y-(CH2)xNH(CH2)xSO3H 및 -O-[(CH2)xO]y-(아릴 또는 지방족)(여기에서, x는 1 내지 8이고, y는 1 내지 20의 정수임)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 중합체에서 변할 수 있는 다양한 부분 중의 어느 하나일 수 있다. 이들 기는 예를 들어 산소, 황, 질소, 또는 탄소 원자를 통해 인 원자에 결합될 수 있다.
일반적으로, 폴리포스파젠이 하나 이상의 형태의 펜던트기를 갖는 경우에, 이들 기는 중합체 전체에 걸쳐 불규칙하게 변할 것이고, 따라서 폴리포스파젠은 랜럼(random) 공중합체이다. 인은 2개의 유사한 기, 또는 2개의 서로 다른 기에 결합될 수 있다. 2개 이상의 형태의 펜던트기를 갖는 폴리포스파젠은 폴리(디클로로포스파젠)을 원하는 비로 원하는 친핵체(들)과 반응시킴으로써 생성될 수 있다. 폴리포스파젠 중의 펜던트기의 결과적인 비는 중합체를 생성시키기 위해 사용되는 출발 물질의 비, 친핵성 치환 반응이 수행되는 온도, 및 사용되는 용매 시스템을 포함하는 많은 인자에 의해 결정될 것이다. 생성된 중합체에서 기들의 정확한 치환 패턴을 결정하는 것은 매우 어렵지만, 중합체 중의 기들의 비는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
일 구체예에서, 생분해성 폴리포스파젠은 하기 화학식을 지닌다:
상기 식에서,
A 및 B는 중합체에서 독립적으로 변할 수 있으며,
(i) 염소, 아미노산, 아미노산 에스테르(아미노기를 통해 결합됨), 이미다졸, 글리세롤 또는 글루코실을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 사용 조건하에서 가수분해되기 쉬운 기; 또는
(ii) 지방족, 아릴, 아르알킬, 알크아킬, 카르복실산, 헤테로방향족, 헤테로알킬, 알킬아미노-를 포함하는(지방족)아미노-, 헤테로아르알킬, 디알킬아미노-를 포함하는 디(지방족)아미노-, 아릴아미노-, 디아릴아미노-, 알킬아릴아미노-, -옥시페닐CO2H, -옥시페닐SO3H, -옥시페닐히드록실 및 -옥시페닐 PO3H를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 -옥시아릴; -옥시알킬, -옥시(지방족)CO2H, -옥시(지방족)SO3H, -옥시(지방족)PO3H, 및 -옥시(알킬)히드록실을 포함하는 -옥시(지방족)히드록실을 포함하는 -옥시지방족; 옥시알크아릴, -옥시아르알킬, -티오아릴, -티오알킬을 포함하는 -티오지방족, -티오알크아릴 또는 -티오아르알킬을 포함하며 이들로 제한되지 않는, 사용 조건하에서 가수분해되기 어려운 기일 수 있으며;
중합체는 사용 조건 하에서 가수분해되기 어려운 적어도 1% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 더욱 바람직하게는 80 내지 90% 이상, 100% 미만의 반복 단위를 함유하고,
n는 4 이상, 바람직하게는 10에서 20,000의 정수이다.
이미다졸 이외의 다른 헤테로방향족기와 같은 특정 기는 혈중에서 발견되는 것과 같은 중성 수성 조건 하에서 매우 느린 속도로 가수분해되므로, 일반적으로 본원에서는 비가수분해성 기로서 고려되는 것으로 이해되어야 한다. 그러나, 특정 조건, 예를 들어 위에서와 같은 낮은 pH 하에서, 정상적으로 비가수분해성인 기(예를 들어 이미다졸 이외의 다른 헤테로방향족기)의 가수분해 속도는 중합체의 생분해 특성이 영향 받을 수 있는 지점까지 증가할 수 있다. 당업자는 널리 공지된 기술을 사용하여 펜던트기가 사용 조건하에서 현저한 속도로 가수분해되는 지의 여부를 쉽게 결정할 수 있다. 당업자는 또한 본원에 기술된 다양한 구조의 폴리포스파젠의 가수분해 속도를 결정할 수 있고, 목적하는 용도에 대해 원하는 생분해 프로파일을 제공하는 폴리포스파젠을 선택할 수 있을 것이다.
중합체의 가수분해도는 가수분해되기 쉬운 펜던트기의 % 및 가수분해성기의 가수분해 속도의 함수일 것이다. 가수분해성기는 수성 환경 중에서 히드록실기에 의해 치환되어 중합체에 가수분해 불안정성을 제공하는 P-OH 결합을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 폴리포스파젠은, (i) 중합체 중의 펜던트기 모두 또는 실질적으로 모두가 사용 조건하에서 가수분해되기 어려운 비생분해성 폴리포스파젠, 또는 (ii) 사용 조건 하에서 모든 기가 가수분해되기 쉬운 완전히 생분해성인 폴리포스파젠(예를 들어, 폴리[디(에틸글리시네이토)-포스파젠])이다.
포스파젠 고분자전해질은 본원에서 폴리포스파젠을 음이온성, 양이온성 또는 양쪽성으로 만드는 이온화되거나 이온화될 수 있는 펜던트기를 함유하는 폴리포스파젠으로서 정의된다. 이온성 기는 염의 형태를 가질 수 있거나, 대안적으로, 적어도 일부가 해리되거나 해리될 수 있는 산 또는 염기일 수 있다. 나트륨, 칼륨 및 암모늄을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 약제학적으로 허용되는 일가 양이온이 염의 대이온으로서 사용될 수 있다. 포스파젠 고분자전해질은 또한 비이온성 측쇄 기를 함유할 수 있다.포스파젠 고분자전해질은 사용 조건 하에서 생분해성이거나 비생분해성일 수 있다. 이온화되거나 이온화될 수 있는 펜던트기는 바람직하게는 사용 조건 하에서 가수분해되기 쉽지 않다.
바람직한 포스파젠 고분자전해질은 카르복실산, 술폰산 또는 히드록실 부분을 포함하는 펜던트기를 함유한다. 산성 기는 일반적으로 비가수분해성 펜던트기 상에 있지만, 이들 기는 또한 대안적으로 또는 조합된 형태로, 가수분해성 기 위에 위치할 수 있다. 측쇄 기로서 카르복실기를 갖는 포스파젠 고분자전해질의 일례가 하기 화학식으로 표시된다:
상기 식에서,
n은 정수, 바람직하게는 10에서 10,000사이의 정수이다. 상기 중합체는 화학명이 폴리[디(카르복실레이토페녹시)포스파젠] 또는 다르게는, 폴리[비스(카르복실레이토페녹시)포스파젠](PCPP)이다.
포스파젠 고분자전해질은 바람직하게는 생분해성이다. 본원에서 사용되는 용어 "생분해성"은 약 25 내지 37℃의 온도에서 PH 6 내지 8의 생리학적 용액에 노출되는 경우, 요망되는 적용에서 허용되는 기간 내에, 일반적으로 약 5년 미만, 가장 바람직하게는 약 1년 미만내에 분해되는 중합체를 의미한다.
가장 바람직하게는, 중합체는 사용 조건 하에서 가수분해되지 않는 카르복실산 부분을 포함하는 펜던트기 및 사용 조건 하에서 가수분해되기 쉬운 펜던트기를 포함하는 폴리(오르가노포스파젠)이다. 가수분해 민감성기를 갖는 바람직한 포스파젠 고분자전해질의 예로는 폴리[디(카르복실레이토페녹시)포스파젠-코-디(아미노산)포스파젠-코-(카르복실레이토페녹시)(아미노산)포스파젠]이 있으며, 특히 폴리[디(카르복실레이포페녹시)포스파젠-코-디(글리시네이토)포스파젠-코-(카르복실레이토페녹시)(글리시네이토)포스파젠] 및 폴리[디(카르복실레이토페녹시)포스파젠-코-디(클로로)포스파젠-코-(카르복실레이토페녹시)(클로로)포스파젠]을 포함한다.
폴리포스파젠의 독성은 당업자에게 널리 공지된 세포 배양 실험을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 폴리[디(카르복실레이토페녹시)포스파젠]의 독성은 세포 배양 접시를 폴리[디(카르복실레이토페녹시)포스파젠]으로 피복시킴으로써 세포 배양으로 결정될 수 있다. 닭 배아 섬유 아세포를 피복된 페트리 접시 상에 시딩(seeding)하였다. 그 후, 닭 배아 섬유아세포를 시딩한 지 3일 후, 세포는 납작해지고, 스핀들(spindle)이 형성되었다. 상 대비 현미경 하에서, 유사 분열 형태가 관찰되었다. 이러한 결과는 복제 세포에 대한 폴리[디(카르복실레이토페녹시)-포스파젠]의 비독성의 증거를 제시한다.
가교된 폴리포스파젠은 포스파젠 고분자전해질을 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈 또는 카드뮴과 같은 금속다가 양이온과 결합시킴으로써 제조될 수 있다.
포스파젠 고분자전해질의 합성
포스파젠 고분자전해질을 포함하는 폴리포스파젠은 당업자에게 공지된 방법에 따라, 다양한 화학 시약 또는 시약의 혼합물을 사용하여 폴리(디클로로포스파젠)을 거대 분자 친핵성 치환 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 바람직하게는, 포스파젠 고분자전해질은 폴리(디클로로포스파젠)을 염소를 치환시키는 적절한 친핵체(들)과 반응시킴으로써 제조된다. 중합체 중의 가수분해성 측쇄 대 비가수분해성 측쇄의 원하는 비는 폴리(디클로로포스파젠)과 반응하는 상응하는 친핵체의 양 및 필요한 반응 조건을 조정함으로써 얻어질 수 있다.
예를 들어, 폴리[(카르복실레이토페녹시)(글리시네이토)포스파젠](PC-GIPP)는 폴리(디클로로포스파젠)의 염소 원자와 프로필 p-히드록시벤조에이트 및 에틸 글리시네이트 히드로클로라이드의 친핵성 치환 반응에 의해 제조된다(PC-GIPP 합성), 그 후, 이렇게 해서 얻어진 폴리[(아릴옥시)(글리시네이트)포스파젠] 에스테르는 상응하는 폴리(카르복실산)으로 가수분해된다. 다른 폴리포스파젠은 다음 참고 문헌에 기술된 바와 같이 제조될 수 있으며, 이 문헌의 내용, 및 여기에 기술된 중합체는 본원에 참고로 인용된다[참고 문헌: Allcock, H.R.; et al., Inorg.Chem. 11, 2584(1972); Allcock, H.R.; et al., Macromolecules 16, 715(1983); Allcock, H.R., et al., Macromolecules 19, 1508(1986); Allcock, H.R.; et al., Biomaterials 19, 500(1988); Allcock, H.R,; ef al., Macromolecules 21, 1980(1988); Allcock, H.R.; et al., Inorg. Chem. 21(2), 515521(1982); Allcock, H.R,; et al., Macromolecules 22:7579(1989); U.S. Patent No, 4,946,938 to Magill, et al., U. S. Patent No. 5,149,543 to Cohen et al., and the publication of Grolleman, et al., J. Controlled Release 3,143(1986)].
항원의 선택
항원은 세포, 세균, 또는 바이러스 입자 또는 이들의 일부로부터 유래될 수 있다. 본원에서 정의된 바와 같이, 항원은 동물, 예를 들어 포유 동물, 조류 또는 어류에서 면역원성 반응을 유도하는 단백질, 펩티드, 다당류, 당단백질, 다이질, 핵산 또는 이들의 조합물일 수 있다. 본원에 규정된 바와 같이, 면역원성 반응은 체액성이거나 세포 매개성일 수 있다. 면역원성 반응을 일으키는 물질이 불량하게 항원성인 경우에는, 표준 공유 결합 기술을 사용하여, 예를 들어 수 가지 시판용 시약 키트를 사용하여, 이것을 알부민과 같은 담체에 또는 합텐에 콘쥬게이션시킬 수 있다.
일 구체예에서, 중합체는 핵산이 발현되는 세포에 항원을 암호화하는 핵산을 전달하기 위해 사용된다.
바람직한 항원의 예로는 인플루엔자 단백질, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV) 단백질, 헤모필루스 인플루엔자 및 B형 간염 단백질과 같은 바이러스 단백질, 및그람 네가티브 세균 세포벽 및 나이세리아 고노리아(Neisseria gonorrhea) 단백질과 같은 세균 단백질 및 리포폴리사카라이드가 포함된다.
배양액 중의 세포의 바이러스 감염은 2 가지 종류의 바이러스 입자, 즉 성숙한 감염성 바이러스 및 핵산이 없는 일부 비감염성 바이러스 유사입자를 생성시킨다. 바이러스가 세포 배양액에서 높은 역가로 복제하는 경우에는 경구용 백신에 비활성화된 성숙한 바이러스 입자를 사용하는 것이 바람직하다. 세포 배양액에서 성장할 수 없거나 종양형성성인 바이러스의 경우, 비복제성 바이러스 유사 입자(VLP)를 생성시키기 위해 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 재조합 기술을 사용하는 경우, 고유의 복잡성으로 인해 상기 2 가지 방법 중 어느 것에도 알맞지 않은 바이러스로부터 보호성 항원을 표면에서 나타내는(슈도타이핑) 바이러스 유사 입자를 작제할 수 있다. 상기 기술된 항원은 모두, 바이러스 입자 구조 성분이지만, 보호 면역을 유도하는 모든 항원이 구조 항원은 아니다. 보호 항원이 비구조 성분인 경우, 이러한 항원을 자체 조합성 바이러스 유사 입자의 표면에 유전적으로 융합시킬 수 있다.
보조제
몇몇 구체예에서, 점막 전달 또는 비경구 전달을 위해 보조제를 캡슐화된 항원에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다.
경구 투여를 위한 보조제
미량의 콜레라 독소(CT)(콜레라 독소 서브유닛 A, 콜레라 독소 서브 유닛 B, 또는 둘 모두)와 제 2 항원의 혼합물을 경구 투여하므로써 동시 투여되는 항원에대해 점막 면역성을 자극한다는 것을 공지되어 있다. 또한, 항원 단독의 경구 전달에 의해 유도되는 면역 내성 대신에 제 2 항원에 대한 현저한 체액성 면역 반응이 존재한다. 따라서, 점막 전달된 CT는 점막 및 체액성 면역 둘 모두의 강력한 면역자극제 또는 보조제로서 작용한다. 이러한 보조제 효과에 대한 메카니즘은 페이어판의 위에 있는 돔 세포(또는 M 세포)에 특이적으로 결합하고, 돔 세포에 정상적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있는 항원에 대해 면역 반응성을 제공하는 방식으로 림프 세포를 변화시키는 CT의 능력으로 인한 것일 수 있다. 최근, 결합 기능은 콜레라 독소(CT-B) 분자의 비독성 B 서브유닛으로 국재화되었다. CT-B를 항원들에 첨가하는 것은 동일 항원에 대해 CT에 의해 유도되는 면역 반응과 유사할 것이라는 것이 현재 입증되었다. 따라서, 마이크로캡슐화된 백신에 CT를 포함시킴으로써 경구 투여된 항원의 면역원성을 향상시키는 것은 종종 바람직하다.
비경구 투여를 위한 보조제
보조제의 예로는, 무라밀 디펩티드, 무라밀 트리펩티드, 시토킨, 디프테리아 독소, 및 엑소톡신 A가 있다. 시판용 보조제로는 매사추세츠 워체스터의 캠브리지 바이오사이언스로부터의 QS-21, 및 리비 이뮤노켐으로부터의 모노포스포릴 리피드 A(MPLA)가 있다.
또한, 폴리포스파젠이 또한 경구 또는 비경구적으로 투여되는 경우에 보조제 효과를 가질 수 있다는 것이 입증되었다. 특히, 실시예는 95% 알긴산염 및 5% 폴리포스파젠(PCPP)로 형성된 미소구체의 향상된 면역원성을 입증한다.
면역원 조성물의 제조
중합체는 예를 들어, 본원에 참고 문헌으로 인용된 코헨(Cohen) 등의 미국 특허 제 5,149,543호 및 림(Lim) 등의 미국 특허 제 4,352,883호의 방법을 사용하거나 중합체 및 항원의 용액을 분무 건조시킴으로써, 항원을 캡슐화시키는 데 사용된다. 대안적으로, 항원 및 보조제를 함유하는 미소구체는 수용액 중에서 성분들을 간단히 혼합시킨 후, 기계적 힘에 의해 중합체를 성분과 함께 응고시켜서 미소입자를 생성시킴으로써 제조될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "마이크로캡슐"은 다르게 규정하지 않는 한 미소입자, 미소구체 및 마이크로캡슐을 포함한다. 일반적으로, 유용한 마이크로캡슐은 1 내지 200 미크론의 입자 직경, 바람직하게는 경구 투여를 위해 1 내지 15 미크론이고, 바람직하게는 주사용으로는 1 내지 100 미크른의 입자 직경을 가질 것이지만, 주사에 대한 제한 인자는 니들 크기이다.
바람직한 구체예에서, 먼저 1 부의 3% Na2CO3증에 항원을 용해시키면서 교반시킨 후, 용해될 때까지 PCPP를 첨가하면서 교반시킨 후, 3부의 pH 7.4의 인산염 완층액을 서서히 첨가함으로써, 폴리포스파젠/항원 용액이 제조된다. 세제 Brij58이 0.2%의 최종 농도로 교반 중합체 용액에 첨가된다. PCPP의 최종 농도는 2.5%이다. 알긴산 나트륨/항원 용액은 적절한 양의 항원을 탈이온수 중에 용해시키므로써 제조된다. 그 후, 알긴산염의 최종 농도가 1.25%가 되도록 알긴산염이 항원 용액에 서서히 첨가된다. 일정한 교반 뿐만 아니라 항원에 중합체를 서서히 첨가하는 것이 균일한 용액을 얻기 위해 필요하다.
경구 전달용 미소구체를 제조하는 가장 바람직한 구체예에서, 미소구체는 주사기 펌프를 사용하여 150㎍/분의 속도로 중합체 및 항원 용액을 18 게이지의 블런트 말단 니들이 장착된 초음파 분무 노즐(Medsonic, Inc., Farmingdale, NY) 또는 분무화 노즐(Turbotak, Ottawa Canada)로 펌핑시킴으로써 생성된다. 니들은 용액이 노즐 내의 분무화 지점에 직접 전달될 수 있게 해준다. 그 후, 분산된 항원을 함유하는 중합체 용액은 약 35 파운드/inch2의 공기압 하에서 노즐내의 1.0 mm 오리피스를 통과한다. 폴리포스파젠의 경우, 노즐로부터 35 cm 거리에서 7.5% CaCl2, 0.5% Brij58 조(bath)에 충돌할 경우에 미소 방울이 서로 가교된다. Brij58 조는 미소구체의 응집을 방지하기 위해 첨가된다. 1.5% CaCl2조(Brij58 비함유)는 알긴산염 미소구체의 겔화를 위해 사용된다. 그 후, 미소구체는 원심분리관으로 빠르게 전달되고, 약 30분 동안 서서히 록킹(rocking)되어, 가교 과정을 완결시키고, 이것이 CaCl2조로부터 가라앉음에 따라 미소구체 응집을 방지해준다. 응집은 미소구체 표면 상의 노출된 카르복실산기들 사이의 Ca++가교 및/또는 미소구체들 사이의 소수성 상호작용으로 인한 것일 수 있다. 30분 후, 미소구체는 4℃, 2800 rpm에서 15분 동안 원심분리함으로써 수집된다. 상등액은 버려지고, 펠릿은 1회 세척되고 무균 탈이온수예서 재현탁된다. 미소구체는 분석할 때까지 4℃에서 저장된다. 상기 조건하에 생성된 폴리포스파젠 미소구체의 약 90%는 1 내지 10 미크론의 직경을 지녔다.
큰 미소구체는 큰 오리피스 및 낮은 공기압을 사용함으로써 제조된다.
중합체-항원 콘쥬게이트
중합체는 또한 당업자에게 널리 공지된 방법에 따라, 일반적으로 항원 상의 아미노 또는 카르복실기와 중합체 상의 이온화될 수 있는 측쇄기 중 하나 사이의 공유 결합에 의해 항원과 공유 결합적으로 콘쥬게이션되어 수용성 콘쥬게이트를 생성시킬 수 있다.
면역원성 조성물의 투여
항원을 함유하는 하이드로겔 미소구체는 점막적으로 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 점막 표면으로의 전달 경로의 비제한적 예로는, 비내(또는 일반적으로 비강 관련된 림프 조직), 호흡기, 질내 또는 직장내 경로이다. 비경구 전달의 비제한적 예로는 피내, 피하 및 근내 전달이다.
항원은 천연 알긴산염 및 합성 폴리포스파젠 중에서 캡슐화될 수 있다. 생성되는 면역 반응을 변화시키기 위해 항원 로딩 수준, 방출 속도 및 미소구체 크기 분포가 사용된다. 용량은 하기 실시예에 의해 입증되는 바와 같이, 중합체-항원 투여에 의해 유도되는 항체의 역가를 기초로 하여, 각각의 항원에 대한 투여 용량 및 계획을 결정하기 위한 표준 기술에 의해 및 항원 로딩에 의해 결정된다.
면역원성 백신 조성물은 물, 식염 또는 광유, 예를 들어 트라케올 (Drakeol)TM, 마르콜(Markol)TM및 스쿠알렌과 같은 기타 생리학적으로 허용되는 성분을 함유하여 에멀션을 생성시키거나, 수성 완충제와 조합되거나, 캡슐 또는 장피복내에 캡슐화되어 위를 통과하는 동안 마이크로캡슐이 분해되는 것을 방지할 수 있는 것으로 당업자들에게 이해될 것이다.
면역원성 조성물의 저장
이온적으로 가교된 미소구체는 온전한 유지에 도음이 되는 완충제 중에 저장될 필요가 있다. 중합체 매트릭스내에 포획된 항원 뿐만 아니라 미소구체의 온전성을 유지시켜주는 조건이 규정되었다. 항원을 함유하는 미소구체는 무균 탈이온수에서 4℃에서 저장하여 7일간 안정하다. 인산염 완충식염(PBS)과 같은 표준 완충제는 사용될 수 없는데, 이는 칼슘 이온이 나트륨으로 치환되면 매트릭스의 액화를 유도하기 때문이다. 미소구체를 폴리L-리신과 같은 아미노산 중합체 또는 다른 가교제로 피복시키면 PBS 중에서의 저장할 수 있게 해준다.
본 발명은 하기의 비제한적 실시예와 관련하여 추가로 이해될 것이다.
실시예 1 : 독성 연구
알긴산염은 사람 섭취에 대해 승인되어 있다. 폴리포스파젠은 표준방법론을 사용하여 비독성을 입증하는 데 시험될 수 있다. 폴리포스파젠은 이미 생세포에 대해 비독성인 것으로 입증되었다. 문헌[M.C. Bano, et al., Bio/Technology, 9:468(1991)]에 보고된 바와 같이, 하이브리도마 세포를 150 내지 200 미크론의 직경을 갖는 폴리포스파젠 미소구체 중에서 캡슐화시켰다. 캡슐화된 하이브리도마 세포는 세포 분열될 수 있으며, 캡슐화 후 10일 까지, 미소구체는 본질적으로 생세포로 채워져 있었다. 추가 연구가 본원에 기술된다.
제 1 연구에서, 세포 배양 접시를 폴리포스파젠으로 피복시키고, 닭배아 섬유아세포를 피복된 페트리 접시에 시딩하였다. 닭 배아 섬유아세포를 시딩한 지 3일 후에, 세포는 납작해졌으며, 스핀들이 형성되었고, 상 대비 현미경하에서 유사 분열 형태를 볼 수 있었다. 이것은 세포 배양액 중에서의 폴리포스파젠의 무해한 성질을 입증하였다.
제 2 생체내 독성 연구에서, 알긴산염 및 폴리포스파젠의 생체내 급성 독성을 6 내지 8 주령의 스프라그-다울리 래트에서 평가하였다. 1 군 당 5 마리의 수컷 래트로 이루어진 4개의 군을 대상으로 연구하였다. 밤새 금식시킨 후, 각각의 군의 각각의 동물에게 위관영양을 통해 5000 mg 중합체/kg(수중)의 단일 경구 용량을 투여하였다. 용량 부되는 20㎖/kg이었다. 제 1 군의 쥐에게 물을 섭취시켜서 대조군으로서 사용하였다. 제 2 군의 동물에게는 알긴산염 미소구체를 투여하였다. 제 3 군의 쥐에게는 폴리-L-리신(M.W. 68000)으로 피복시킨 알긴산염 미소구체를 투여하였다. 제 4 군의 동물에게는 폴리[디(카르복실레이토페녹시)포스파젠] 미소구체를 투여하였다. 동물들을 7일 동안 임상적으로 관찰하였다. 면역 1일 전 및 안락사시에 체중을 기록하였다. 안락사시 CO2에 의한 마취 후에 안와후동을 천자하여 혈액 샘플을 얻었다. 동물을 혈액 채취 전에 밤새 금식시켰다. 조직은 검시시에 시험하고, 따로 보관하였다.
미소구체가 투여된 래트와 대조군의 래트 사이에서의 체중의 차이는 크지 않았다. 각각의 군의 모든 래트에 대한 혈액학 및 임상 화학의 결과는 정상적이었다. 검시에서 어떠한 기관에서도 처리와 관련한 비정상성은 관찰되지 않았다. 이 실험은 5000 mg/kg의 경구 용량에서, 폴리포스파젠 및 알긴산염 미소구체는 사실상 독성이 아님을 입증해주었다.
실시예 2 : 단백질의 혼입 및 미소구체의 방출 특성
마이크로캡슐화된 항원이 면역 반응을 유도하기 위해, 항원은 미소구체로부터 방출되어야 한다. 항원은 두 가지의 상이하지만 상호 배타적이지 않은 확산 및 부식 작용을 통해 미소구체로부터 방출된다. 하이드로겔이 분산된 항원에 대해 투과성인 경우, 항원은 미소구체의 매트릭스를 채운 수성상을 따라 미소구체 밖으로 간단히 확산될 수 있다. 따라서, 항원의 방출은 항원에 대한 미소구체 매트릭스의 투과성의 표시이다. 반대로, 중합체 매트릭스에 대한 항원의 흡착은 미소구체 밖으로의 항원의 확산을 감소 또는 제거하는 역할을 할 것이다.
방출 속도의 특징화
단백질 분자량 마아커(Amersham) 및 FITC 표지된 우혈청 알부민(Sigma)를 마이크로캡슐화시켜서 가용성 단백질의 방출 속도를 실험하였다. 20 nm 폴리스티렌 비이드(Duke Scientific)의 방출 속도가 비교용으로 사용될 수 있다.
미소구체 중의 단백질의 정량
면역원성 실험의 경우, 혼입%를 평가하기 위해 미소구체를 생성한 직후 및 알려진 항원량의 전달을 보장하기 위해 동물로의 주입 직전에 미소 구체의 단백질 함량을 측정하였다.
미소구체의 단백질의 함량은 바이오-라드(Bio-Rad) 단백질 검정과 같은 표준검정에 의해 평가될 수 없다. 하이드로겔을 생성시키는 데 관여하는 Ca++를 킬레이트화시킴으로써 단백질이 미소구체로부터 방출될 수 있다고 하더라도, 이가 양이온을 함유하는 바이오-라드 시약의 첨가는 중합체의 재가교를 일으켜서, 항원을 염료 시약에 대해 이용할 수 없게 만든다.
알려진 양의 온전한 미소구체를 SDS-PAGE로 전기 영동시킴으로써, 이온에 의해 가교된 미소구체 중에 캡슐화된 단백질 항원의 정량이 결정된다. 전기 영동 동안에, 단백질은 미소구체로부터 폴리아크릴아미드겔로 이동한다. 미소구체 제제와 동시에 전기영동된 캡슐화된 단백질의 알려진 양과 비교하여 단백질 농도가 결정된다.
미소구체 크기의 결정
1 내지 15 미크론 미소구체가 보조제 효과를 갖는 것으로 믿어지므로 바람직하다. 알긴산염 및 폴리포스파젠 미소구체의 크기를 코올터LS100 입자 사이저 (Coulter LS 100 Particle Sizer)를 이용하여 측정한다. 크기는 1 내지 10 미크론 범위에서 %수로서 보고된다.
폴리포스파젠 미소구체로부터의 항원 방출의 조절
중합체 농도 및 항원의 분자량의 효과
폴리[디(카르복실레이토페녹시)포스파젠]의 투과성을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 통상적으로 사용되는, 14,000 내지 200,000 달톤의 분자량을 갖는 단백질 분자량 마아커(RainbowTM단백질 분자량 마아커(Amersham Corporaton))를 캡슐화시켜 연구하였다. 단백질의 방출은 상등액의 분광광도 측정에 의해 검정되었다.
결과는 제 1 도에 나타내었다. 14.3 kDa 분자량 리소자임과 같은 특정 단백질은 겔 중의 중합체의 농도에 의해 영향을 받았다. 중합체 농도가 1.5%에서 3.3%로 증가함에 따라, 마이크로캡슐 매트릭스로부터의 단백질의 확산이 현저히 감소한다. 유사하게는, 단백질의 분자량이 증가함에 따라, 매트릭스로부터의 단백질의 확산이 지연된다. 예를 들어, 200 kDa 분자량의 미오글로빈 단백질은 24시간내에 3.3% 폴리포스파젠 매트릭스로부터 확산할 수 없었다.
중합체 분자량 및 조성의 효과
미소구체로부터 항원이 방출될 수 있게 해주는 제 2 메카니즘은 미소구체를 구성하는 증합체 매트릭스의 부식를 통해 이루어진다. 부식은 겔화 반응의 역전을 통해 일어나서, 중합체 분자의 가용화 및 이들의 주변 수성환경으로의 복귀를 일으킨다. 폴리포스파젠 미소구체의 분해는 질량 손실, 중합체 매트릭스의 분자량 및 가용성 생성물의 형성을 식염수(pH 7.4) 중에서 모니터함으로써 연구하였다. 분자량이 상이한 PCPP 미소구체에 대한 부식 프로파일은 제 2도에 도시된다. 용액 중에서의 고분자량 PCPP 미소구체의 20일 인큐베이션 동안 및 180일까지의 연장된 기간 동안, 검출가능한 질량 손실은 관찰되지 않았다. 그러나, GPC 데이터는 똑같은 기간 동안 중합체 분자량이 상당히 감소하였음을 나타낸다(제 3a 도). 분해 메카니즘은 명백히 분자내 카르복실기 촉매 작용을 수반할 수 있다. 미소구체 제조를 위해 낮은 분자량 PCPP를 사용하는 것은 처음 10일 동안의 하이드로겔의 현저한 부식과 중합체 분자량의 감소를 유도한다(제 3b도). 매트릭스에서와 실제로 동일한 분자량의 수용성 중합체 생성물이 검출되었다.
상기 데이터는 상기 시스템에서의 매트릭스로부터 용액으로의 폴리포스파젠의 방출에 있어서 분자량 한계치가 약 200 KDa임을 제시한다. 그러나, 중합체 가용성은 또한 매트릭스에 의해 보유되는 칼슘 이온(또는 다른 다가 양이온 또는 중합체)의 양 및 거대분자의 이온화도에 의존한다. PCPP의 부식에서 관찰된 차이는 항원 전달 시스템의 구상에 있어서 가장 중요하다.
폴리포스파젠은 적절한 측쇄 기를 혼입시켜서 가수분해능을 포함하는 조절할 수 있는 일련의 성질을 제공하므로써 효율적으로 테일러링(tailoring)될 수 있다. 글리시네이토기와 같은 가수분해 민감성 펜던트 기의 도입은 수성 환경에서 분해 속도를 증가시킨다. 히드록시 유도체를 수득하기 위해 이러한 아미노포스파젠 중의 중성 매질 중에서 나타나는 외부 P-N 결합을 절단하는 것은 중합체에 가수분해적 불안정성을 제공한다.
미소구체의 제조 및 분해 실험을 위해 10%의 글리시네이토기를 함유하는 폴리[디(카르복실레이토페녹시)포스파젠-코-디(글리시네이토)포스파젠](PC-GIPP)을 사용하였다. 이러한 중합체 하이드로겔에 대한 부식율은 또한 폴리포스파젠의 분자량에 의존한다. 평균 분자량이 130 KDa인 PC-GIPP는 제 2 도에 도시된 바와 같이 3일 내에 질량손실이 100%이다. 매트릭스 및 가용성 생성물의 GPC 분석은 제 4 도에서, 수성 환경에서의 240일 인큐베이션이 무기 인산염 및 1 KDa 미만의 분자량을 갖는 단편으로의 증합체 주쇄의 파괴를 유발시킴을 보여준다. 고분자전해질 복합체 막을 수득하기 위해 폴리-L-리신(M.W. 62 KDa)으로 하이드로겔 미소구체를 피복시키면, 입체 장애 때문에 명백히 2.5 배까지 부식율을 현저하게 감소시키는데, 이는 폴리포스파젠 미소구체의 분해 및 안정성을 조절하기 위한 또 다른 방법을 제공한다.
가교제의 효과
미소구체로부터 항원의 방출을 조절할 수 있는 제 3 수단은 폴리포스파젠 미소구체를 폴리-L-리신 또는 유사한 폴리이온으로 피복시켜서 미소구체의 외측에 반투과성 막을 형성시키는 것이다, 그 후, 미소구체 코에는 겔화 과정을 역전시켜서 폴리포스파젠 매트릭스의 가용화를 유발시키는 EDTA와 같은 킬레이팅제를 첨가함으로써 액화될 수 있다. 투과도는 피복 공정에 사용되는 폴리이온의 크기에 의해 조절될 수 있다. 12 내지 295 KDa의 분자량 범위의 폴리-L-리신과 가교된 미소구체로부터의 방출%는 제 5 도에 도시되어 있다. 폴리-L-리신의 분자량이 증가함에 따라, 피막의 투과성이 증가하여, 미소구체로부터의 20 nm 폴리스티렌 비이드의 방출을 증가시킨다.
미소구체중의 폴리포스파젠 농도를 변화시킬 수 있는 능력은 중합체상의 측쇄를 변화시키며, 미소구체를 폴리-L-리신으로 피복시키는 능력은 박동성 및/또는 지연된 방출 속도를 지니면서 항원을 방출시키는 미소구체를 제형화할 수 있게 해준다. 겔화 및 미소구체 형성을 위한 매우 원만한 조건과 결합되는 상기 중합체 시스템의 조작가능성은 상기 중합체를 항체 및 세포 면역 반응 둘 모두를 유도할 수 있는 단일 용량 백신을 개발하는데 있어서 특히 바람직하게 한다.
실시예 3: 시험관내 및 생체내 면역 반응 실험에 의해 측정되는 마우스에 경구 투여되는 알긴산염 중에 캡슐화된 인플루엔자 백신의 효능.
마이크로캡슐화된 항원을 사용하여, 경구 경로에 의해 마우스를 면역시켰다. 면역 반응의 속도를 체액성 면역에 대해 시험관내 검정에 의해 먼저 측정하였다. 생체내 실험을 이용하는 것은 항체 클래스 스위칭을 수행할 수 있는 능력, 면역 반응의 신속성, 증폭 및 지속 기간에 대한 면역화 용량 및 경로의 효과 및 면역 반응을 부스팅할 필요성을 결정할 수 있게 해준다. 하기에 기술되는 바와 같이, 전체 항원 특이적 반응 뿐만 아니라 lgG 반응의 서브클래스를 평가하기 위해 ELISA를 사용하였다. CTL 검정은 세포 매개 성 반응을 평가하기 위해 수행될 수 있다.
하기에 상세히 기술되는 바와 같이, 면역원성 실험을를 위해, 파상풍독소 (Connaught Laboratories) 및 인플루엔자 바이러스를 캡슐화시켰다. 상기 기슬된 바와 같이 마이크로캡슐화된 항원을 제조하고 정량하였다. SDS-PAGE에 의해 측정되는 알긴산염 및 폴리포스파젠 미소구체 중의 항원 농도를 투여 전에 무균 탈이온수로 조정하였다.
생후 7 내지 8주령의 BALB/c 암컷 마우스를 5개의 군으로 무작위화시켰다. 30㎍의 인플루엔자 항원을 삽관법에 의해 경구적으로 투여하였다. 혈액 샘플을 CO2마취된 마우스의 안와후동으로부터 채취하였다. 마우스를 흡입 챔버에서 CO2로 안락사시켰다.
노복(Novok) 등[Vaccine, 11:55-60(1992)]에 의해 개발된 인플루엔자 마우스 질환 모델 시스템이, 마이크로캡슐화된 인플루엔자에 의한 면역에 의해 제공되는보호작용을 실험하기 위해 사용될 수 있다. 마우스를 면역시킨 후에 여러번 시험감염시키고, 다양한 기관에서 바이러스 복제 수준을 측정하였다. 이전 연구에서 비경구적 면역화가 코 및 기도를 완전히 보호하지는 못했지만, 폐에서의 바이러스 증식에 대해서는 완전히 보호하였다. 따라서, 백신 효율은 폐에서의 바이러스 복제의 수준을 근거로 평가될 수 있다.
인플루엔자를 표준 방법에 따라 난(egg)에서 성장시키고, 단백질, 적혈구 응집 반응 및 플라크 검정에 의해 정량하였다. 인플루엔자는 1 : 4000의 최종 희석율로 38% 포름알데히드 용액을 첨가하여 포르말린 비활성화시켰다. 바이러스 감염능은 또한60CO 공급원으로부터 1.2 ×106rad까지의 감마 방사선에 노출시켜서 비활성화시켰다.
마우스 혈청 중의 항인플루엔자 특이적 합체를 pH 9.6의 탄산나트륨 완충액 중의 10㎍/㎖의 인플루엔자 감염된 MDCK 세포 용해질로 회복된 96-웰 미세역가 플레이트에서 ELISA에 의해 측정하였다. 피복 및 세척 후의 단백질의 비특이적 결합에 이용될 수 있는 부위를 PBS 용액 증의 2.5% BSA를 첨가함으로써 차단하였다. 차단 및 세척 후에, 1% BSA/PBS 중의 혈청의 2배 연속 희석액을 웰에 첨가하였다. 결합되지 않은 혈청을 세척하고, 양고추냉이 과산화효소 표지된 염소 항마우스 lgG를 첨가하였다. 결함되지 않은 콘쥬게이트를 세척하고 기질 o-페닐렌디아민 디클로라이드를 첨가하여 혈청 항체를 검출하였다. 2M 황산을 첨가하여 반응을 중단시키고, 490 nm에서의 흡광도를 판독하였다. 종말점 역가는 똑같은 희석율에서 항체 네가티브 샘플보다 상당히 더 큰 신호를 발생시키는 최대 샘플 희석율의 역수이다.
ELISA 반응성 인플루엔자 특이적 항체의 lgG의 이소타입을 항원에 결합된 뮤린 항체를 검출하므로써 결정하였다. 마우스 lgG 서브클래스 1, 2a, 2b 및 3에 대해 특이적인 양고추냉이 과산화효소 표지된 양 항마우스 항체를 ELISA플레이트에서 항원에 결합된 마우스 항체와 반응시켰다.
인플루엔자 혈구응집반응 억제 항체 검정이 10% 닭 적혈구 세포와 30분 동안 인큐베이션된 열불활성화된 마우스 혈청에 의해 수행되어 비특이적 억제제를 제거하였다. 혈청의 2배 희석액을 96-웰 미세역가 플레이트에 첨가되고, 동부피로 바이러스 현탁액 8 HA 유닛을 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 단 적혈구 세포 0.5% 현탁액을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 45 내지 60분 동안 인큐베이션시켰다. HI 역가는 적혈구의 혈구응집반응을 완전히 억제시키는 최고 희석율의 역수로서 표현된다.
실험의 첫 번째 군의 경우, 군 당 2 마리의 마우스로 구성된 5군의 BALB/c 마우스를 무균 탈이온수(제 1 군), 속이 빈 알긴산염 미소구체(제 II 군), 30㎍의 인플루엔자를 함유하는 알긴산염 미소구체(제 III 군), 30㎍의 인플루엔자 및 첨가 혼합되는 10㎍의 콜레라 독소(CT)를 혼합된 형태로 함유하는 알긴산염 미소구체(제 IV군), 또는 30㎍의 가용성 인플루엔자(제 V 군)으로 경구 삽관법에 의해 면역시켰다. 혈액 및 분노 샘플을 면역 후 7일, 14일, 21일 및 28일째에 수집하고, 인플루엔자 항체 반응성의 클래스 특이성을 측정하였다.
동물을 단독으로 또는 콜레라 독소와 함께 알긴산염 중에 캡슐화된 인플루엔자 항원으로 상기 기술된 바와 같이 면역시켰다.
알긴산염 캡슐화된 인플루엔자 항원을 사용한 결과가 제 6a, 6b, 및 6c 도에 도시된다. 인플루엔자 항원이 전혀 투여되지 않은 대조 마우스(제 I 및 제 II 군)은 인플루엔자 특이적 혈청 lgM 또는 IgG 반응을 보이지 않았다. 가용성 인플루엔자(제 V 군)는 7일 째에 낮은 IgM 역가를 유도하고 이는 적어도 14일째를 거쳐 지속되었지만, 제 6a도에 나타난 바와 같이 검출 가능한 lgG 반응은 없었다. CT와 함께 캡슐화된 인플루엔자 바이러스는 제 6b 도에 도시된 바와 같이 면역 후 14일 째에 고수준의 인플루엔자-특이적 lgG를 유도시켰다. 이 수준은 28일까지 유지되었다. 알긴산염 캡슐화된 인플루엔자는 단독으로, 제 6c 도에 도시된 바와 같이, 미소구체 인플루엔자 CT 혼합물이 투여된 동물에서 나타나는 역가와 균등한 인플루엔자 특이적 역가를 유도하였다. 우수한 항체 역가가 14일만에 관찰되었고, lgG의 높은 역가는 적어도 77일째 이상까지 존재하였다.
알긴산염 캡슐화된 인플루엔자 및 콜레라 독소로 면역된 동물을 일차면역 후 35일 째에 부스팅시켰다. 결과가 제 7 도에 도시된다. 콜레라 독소와 함께 인플루엔자에 의한 부스팅은, 분뇨 샘플에서 측정된 바와 같이, lgA를 생성시켰다.
요약하면, 알긴산염 캡슐화된 인플루엔자는 혈청에서 항원 특이성 lgM 및 lgG를 유도하는데 있어서 점막 보조제 CT를 필요로 하지 않았다. 알긴산염 캡슐화된 인플루엔자를 사용하여 얻은 결과는 CT의 부재하에서의 단일 경구 용량이 높은 인플루엔자 특이적 혈청 lgG 반응을 유도함을 보여준다. 제 7 도의 결과는 CT와 함께 알긴산염 중에 캡슐화된 인플루엔자에 의한 단일 경구 부스팅 후에 lgA 항체가유도됨을 나타낸다.
실시예 4: 시험관내 및 생체내 면역 반응 실험에 의해 측정되는 폴리포스파젠 중에 캡슐화된 인플루엔자 백신의 마우스로의 경구 투여에 의한 항체의 생성.
상기 기술된 바와 같이 동일한 프로토콜을 수행하여 폴리포스파젠 미소구체 중에 캡슐화된, 인플루엔자 단독 또는 콜레라 독소와 조합된 형태로 동물을 면역시켰다.
결과가 제 8도에 도시된다. 콜레라 독소의 부재하에서는 혈청 또는 분뇨 중에서 측정가능한 항-인플루엔자 항체가 생성되지 않았다. 인플루엔자 항원과 콜레라 독소가 함께 조합된 경우에는, 알긴산염 캡슐화된 항원을 사용하여 입증된 것(제 6b 도)과 유사한 방식으로 lgM이 생성되었지만, 발현이 약간 지연되었다.
실시예 5: 마이크로캡슐화된 파상풍 독소에 의한 마우스의 비내 면역.
마우스를 4개의 군으로 나누어,(1) 수중의 파상풍 독소(9 마리);(2) 알긴산염 미소구체 중의 파상풍 독소(9 마리); (3) PCPP 미소구체 중의 파상풍 독소(10 마리); 및 (4) 95% 알긴산염/5% PCPP로 구성된 미소구체 중의 파상풍 독소(9 마리)로 비내 접종시켰다. 각각의 경우에, 50㎍의 항원을 투여하였다. 마우스를 2 주(혈청) 및 3 주(기관지 및 비강 세척물) 후에 항체 생생에 대해 ELISA로 검정하였다. 결과가 표 1 에 기재된다.
이들 결과는 플리포스파젠 또는 알긴산염/폴리포스파젠 미소구체 중의 항원의 비내 투여가 혈청 lgG 반응을 유도함을 명백히 입증해준다. 더욱이, 결과는, 항원이 알긴산염 및 PCPP의 조합물내에 캡슐화되는 경우, 상기 투여 방법이 lgA 분자의 생성시키는 데 사용될 수 있음을 입증해준다.
표 1 : 마이크로캡슐화된 파상풍 독소에 의한 비내 접종
실시예 6: 미소구체 중에 캡슐화된 파상풍 독소에 의한 마우스의 비경구적 면역 및 통상적인 보조제에 의한 면역과의 비교.
통상적으로, 대부분의 주사되는 비복제성 백신은 보호성이 되기에 충분한 혈청 항체의 역가를 달성하도록 다회의 용량을 필요로 한다. 명백한 이유로, 단일 접종으로 보호 작용을 달성시키는 것이 훨씬 바람직할 것이다. 따라서, 항원의 면역원성에 대한 폴리포스파젠의 효과를 단일 용량으로 피하면역된 마우스에서 시험하였다. 물, 알룸 및 프로인트 완전 보조제 중에서 제형화된 항원을 비교물질로서 많은 실험에 포함시켰다.
알긴산염 또는 폴리포스파젠으로 구성된 중합체 미소구체 중에 제형화된 파상풍 독소 항원의 면역원성을 가용성 파상풍 독소, 및 표준 보조제인 알룸 및 프로인트 완전 보조제(CFA) 증의 파상풍 독소와 비교하였다. 5 마리의 마우스로 된 군들을 20㎍의 파상풍 독소로 피하 경로에 의해 면역시켰다.
결과가 표 2에 기재된다. 항-파상풍 독소 혈청 면역 반응을 ELISA에 의해 검정하였다. 가용성 파상풍 독소 항원 및 알긴산염 마이크로캡슐화된 파상풍 독소는13주까지 최대 512의 역가를 유도하였다. 파상풍 독소를 함유하는 폴리포스파젠 미소구체는 알룸 또는 프로인트 완전 보조제 첨가된 파상풍 독소 보다 면역 후 더 이른 시기에 더 높은 항체 역가를 유도하였다. 또한, 파상풍 독소를 함유하는 폴리포스파젠 미소구체는 면역후 13주째에도 여전히 상승하는 항체 역가를 유도시켰다. 이러한 나중 시점에서, 폴리포스파젠 미소구체 중의 파상풍 독소는 65,536의 역가를 유도하였으며, 이는 가용성 파상풍 독소에 대해 나타나는 것보다 약 100 매 더 강한 반응이었고, 알룸 및 프로인트 완전 보조제에 대해 나타나는 것 보다 우수하거나 약간 더 우수하였다 (2 내지 4 배). 폴리포스파젠 미소구체가 파상풍 독소에 대한 항체의 유도에 있어서 알긴산염 미소구체 보다 명백히 우수하였다.
표 2 : 파상풍 독소에 의해 피하 접종된 마우스에서의 ELISA 역가
파상풍 독소에 의한 면역의 용량 의존성 효과를 폴리포스파젠 미소구체 또는 프로인트 완전 보조제로 제형화된 다양한 양의 파상풍 독소로 마우스를 면역시키므로써 시험하였다.
결과가 표 3에 기재된다. 폴리포스파젠 미소구체 중의 파상풍 독소의 면역원성은 프로인트 완전 보조제 제형화된 파상풍 독소에 매우 필적하였다. 모든 시점및 파상풍 독소 용량에서, 두 제형에 대한 ELISA 역가는 서로의 2배 희석도내에 있다.
표 3 : 파상풍 독소에 의해 피하 접종된 마우스에서의 ELISA 역가
실시예 7: 중합체 미소구체 또는 보조제로 제형화된 인플루엔자
입자에 의한 마우스의 비경구적 면역.
마우스를 중합체 미소구체 중에 제형화된 5㎍의 포르말린 비활성화된 인플루엔자 바이러스 입자, 알룸 및 프로인트 완전 보조제로 면역시켜 제형의 상대적 효율이 외피보유 바이러스에 대해서도 파상풍 독소에 대한 것과 같은 지를 결정하였다.
결과가 표 4에 기재된다. 다시 한번, 폴리포스파젠 미소구체는 프로인트 완전 보조제만큼 효과적이지만, 매우 높은 역가의 항인플루엔자 면역반응을 유도시키는 데에 있어서는 물, 알룸 또는 알긴산염 미소구체보다 훨씬 더 효과적이었다. 파상풍 독소 결과와는 대조적으로, 알룸 보조제 첨가된 인플루엔자는 다소 낮은 역가의 항인플루엔자 반응을 유도하는 데에 있어서 가용성 인플루엔자 및 알긴산염 마이크로캡슐화된 인플루엔자 보다 우수하지 않았다. 종해해보면, 상기 결과는 항원을 함유하는 폴리포스파젠 미소구체가 프로인트 완전 보조제 제형화된 항원과 동등한 정도로 항체 반응을 야기시킴을 입증해준다.
표 4: x-31 인플루엔자에 의해 피하 접종된 마우스에서의 ELISA 역가
마우스 혈청을 혈구응집반응 억제 및 중화 검정에 의해 작용성 항체의 존재에 대해 시험하였다. 혈구응집반응 검정의 결과가 표 5에 기재된다. HAI 검정에 의해 측정한 바와 같이, 인플루엔자 바이러스를 함유하는 폴리포스파젠 미소구체는 7주까지 1280의 항체 역가를 유도한 반면, 프로인트 보조제 첨가된 인플루엔자 바이러스 뿐만 아니라, 알룸 및 알긴산염 미소구체 증의 인플루엔자 바이러스는 검출될 수 없거나 매우 낮은 HAI 역가를 유도하였다.
표 5. x-31 인플루엔자에 의해 피하 접종된 마우스에서의 혈구응집반응 억제 검정 역가
"네가티브 대조군은 비특이적 혈청 적혈구 응집 반응 억제제로 인해 역가가 20이었다. 네가티브 ≤ 20
인플루엔자 감염성을 중화시키는 항체를 50% 플라크 감소 검정으로 검정하였다. 폴리포스파젠 미소구체 중의 인플루엔자 바이러스는 13주까지 800의 검출가능한 역가를 유도한 반면, 물 및 프로인트 완전 보조제 중의 인플루엔자는 검출할 수 있는 중화 항체 역가를 유도하지 못했다. HAI 및 중화 검정은 인플루엔자에 대한 민감성 작용성 항체 검정이다. 따라서, 폴리포스파젠 미소구체에 의해 유발되는 면역 반응은 프로인트 완전 보조제보다 우수하다.
표 6: 인플루엔자 플라크 감소 검정
이러한 제형에 의해 유도되는 항체의 lgG 이소타입을 ELISA 검정에 의해 결정하였다. 결과가 표 7에 기재된다. 알룸 보조제첨가된 인플루엔자는 기대되는 바와 같이 순수하게 lgG1 반응을 유도하였다. 프로인트 완전 보조제로 제형화된 인플루엔자 바이러스는 7주째에 피크를 이루고 13주까지 쇠퇴하는 lgG1 반응을 주로 유도하였다. 알긴산염 및 폴리포스파젠 미소구체 중에 제형화된 인플루엔자 바이러스는 7주째까지 알룸으로 제형화된 인플루엔자 바이러스보다 높은 lgG1 반응을 주로 유도하였다. 폴리포스파젠 미소구체 제형화된 항원은 프로인트 완전 보조제 제형화된 항원에 의해 유도되는 역가에 매우 필적하는 역가를 유도하였다. 프로인트 완전 보조제와 같은 폴리포스파젠 미소구체는 상당한 수준의 lgG2a 및 lgG2b 항체를 유도할 수 있었다. lgG3 이소타입에서 검출된 활성의 수준에서 면역 반응의 상당한 차가 나타난다. 폴리포스파젠 미소구체는 상당한 lgG3 항체 역가를 유도할 수 있는 유일한 제형이었다.
표 7 : 인플루엔자 ELISA 이소타이핑 결과
상기의 상세한 설명으로부터 본 발명의 중합체 보조제, 및 합성 방법 및 백신 조성물에서의 사용의 변형 및 변동이 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형 및 변동은 첨부한 특허 청구의 범위내에 있게 된다.
Claims (18)
- 점막 투여에 의해 동물에게서 면역 반응을 유도시키기 위한 하이드로겔 미소입자를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 미소입자가 폴리포스파젠 중합체를 포함하고, 면역 반응을 일으키기에 유효한 양의 항원을 함유하며, 상기 미소입자의 직경이 200 미크론 이하인 백신 조성물.
- 제 1항에 있어서, 미소 입자의 직경에 1 내지 15 미크론임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1항에 있어서, 플리포스파젠 중합체가 다가 양이온 또는 고분자전해질과 이온적으로 가교됨을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1항에 있어서, 미소입자가 폴리포스파젠 및 알긴산염을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1항에 있어서, 항원이 세포, 세균 및 바이러스 입자로부터 유래된 화합물로 구성된 군으로부터 선택되며, 이러한 화합물이 단백질, 펩티드, 다당류, 당단백질, 당지질 및 핵산으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 항원이 로타바이러스, 홍역, 유행성 이하선염, 풍진, 소아마비, A 및 B형 간염 및 포진 바이러스, 사람 면역 결핍 바이러스, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 톨로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 인플루엔자, 코리네박테리우스 디프테리아(Corynebacterius diphtheria), 및 나이세리아 고노리아(Neisseria gonorrhea)로 구성된 군으로부터 선택된 생물체로부터 유래됨을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 폴리포스파젠 중합체가 항원과 공유 결합적으로 컨쥬게이션됨을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1항에 있어서, 무라밀 디펩티드, 무라밀 트리펩티드, 시토킨, 디프테리아 독소, 및 엑소특신 A, 콜레라 독소-A, 콜레라 독소-B 및 가용성 포스파젠으로 구성된 군으로부터 선택된 보조제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1항에 있어서, 미소 입자가 위(胃)의 산 pH로부터 미소입자를 보호해주는 코팅 내에 함유됨을 특징으로 하는 백신 조성물.
- 제 1항에 있어서, 미소 입자가 서로 다른 방출 속도를 가짐을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1항에 있어서, 미소입자가 점막 표면에 투여됨을 특징으로 하는 조성물.
- 제 11항에 있어서, 점막 표면이 직장(rectal) 및 질(vaginal)로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
- 제 11항에 있어서, 점막 표면에 이르는 경로가 비내 경로임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 11항에 있어서, 점막 표면에 이르는 경로가 기도내 경로임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 11항에 있어서, 점막 표면에 이르는 경로가 경구 경로임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1항에 있어서, 플리포스파젠이 폴리[(디(카르복실레이토페녹시)]포스파젠을 포함하는 공중합체임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1항에 있어서, 폴리포스파젠이 폴리[디(카르복실레이토페녹시)포스파젠-코-디(클로로)포스파젠-코-(카르복실레이토페녹시)(클로로)포스파젠]임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1항에 있어서, 폴리포스파젠이 폴리[디카르복실레이토 페녹시 포스파젠]임을 특징으로 하는 조성물.
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