BR102022002426A2 - Nanopartículas adjuvantes para uso em composições de vacinas - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a nanopartículas adjuvantes compostas de albumina sérica bovina associada ao ácido poliinosínico-policitidílico. Essas nanopartículas funcionam como adjuvantes imunológicos e podem ser administradas sozinhas ou coadministradas com antígenos em composições de vacinas. Portanto, essas nanopartículas podem compor diferentes formulações vacinais ou imunobiológicos que visam prevenir doenças ou tratar infecciosas e tumores uma vez que possuem capacidade adjuvante.

Description

NANOPARTÍCULAS ADJUVANTES PARA USO EM COMPOSIÇÕES DE VACINAS Campo da invenção

[001] A invenção se refere à nanopartículas adjuvantes de albumina sérica bovina associada ao ácido poliinosínico-policitidílico para uso em composições de vacinas. Portanto, a invenção se refere aos campos de imunologia, vacinologia e nanotecnologia.

Fundamentos da invenção

[002] A vacinação emergiu como a descoberta médica mais eficaz e economicamente viável para melhorar a saúde pública. O uso de vacinas salvou e ainda salva milhões de vidas em todo o mundo. Certas doenças como varíola, poliomielite e sarampo foram erradicadas ou controladas através da vacinação (ORENSTEIN e AHMED, 2017). As vacinas representam a estratégia de intervenção com a melhor relação custo-benefício aplicada em saúde pública. Avanços biotecnológicos em diversas áreas de pesquisa têm contribuído para o desenvolvimento de formulações mais seguras e eficazes. Além disso, a aplicação de ferramentas biotecnológicas no desenvolvimento de vacinas tem provocado mudanças na maneira como se pensa e produz esses reagentes tanto para uso em humanos como em animais. Apesar do notável sucesso da vacinação contra alguns tipos de doenças, ainda existem várias doenças infecciosas para as quais as vacinas ainda não estão disponíveis.

[003] Para que uma vacina seja efetiva é necessário, em muitas ocasiões a administração de uma substância que possa intensificar ou otimizar a resposta imune ao antígeno a ser administrado. Essas moléculas auxiliadoras foram denominadas de adjuvantes. Originalmente os adjuvantes foram descritos como substâncias potencializadoras da resposta imune a um antígeno. Essas substâncias são capazes de aumentar a resposta imune específica e auxiliar o antígeno a desencadear uma resposta imune precoce, elevada e duradoura (AWATE, BABIUK e MUTWIRI, 2013). Muita atenção tem sido dispensada aos adjuvantes em razão do desenvolvimento de vacinas compostas de proteínas purificadas ou que utilizam subunidades de antígenos. Essas componentes vacinais geralmente se apresentam como fracos imunógenos, requerendo adjuvantes para desencadear uma resposta imunológica protetora (AZMI et al., 2014). Os adjuvantes podem ser usados para o aumento da imunogenicidade, diminuição da dosagem essencial de antígeno, aceleração da resposta imune, redução do número de imunizações recomendadas, aumento da duração da proteção, ou ainda, para a otimização da eficiência da imunização em indivíduos classificados como respondedores fracos. Os adjuvantes podem ser de substâncias naturais ou sintéticas e divididas em duas principais classes com base em seu mecanismo de ação: os adjuvantes carreadores e os imunoestimulatórios (REED, ORR e FOX, 2013).

[004] Diversos mecanismos de ação são apresentados pelos adjuvantes e devem ser selecionados com base na rota de administração e na imunidade requerida pelo tipo de vacina particular (imunidade humoral, celular ou de mucosa). Os adjuvantes podem ser agrupados por sua capacidade de gerar eventos imunológicos necessários para induzir a resposta imune desejada. Os adjuvantes podem exibir seus efeitos imunoestimuladores através dos seguintes mecanismos: 1) fornecer um depósito de antígeno no local de administração favorecendo a constante liberação do antígeno e reconhecimento do mesmo por células apresentadoras de antígenos (APCs); 2) ativação da imunidade inata através do envolvimento de receptores de reconhecimento de patógenos (PRRs); 3) ativação de sinais responsáveis pela co-estimulação de células imunes e 4) capacidade de imunomodulação e maturação de APCs (AZMI et al., 2014).

[005] O adjuvante mais apropriado para cada vacina depende amplamente do tipo de resposta imune necessária para o estabelecimento de imunidade protetora. Desta forma, o estudo das características inflamatórias dos adjuvantes é importante na interpretação de sua capacidade de indução imunogênica e no entendimento dos efeitos colaterais associados ao seu uso (APOSTÓLICO et al., 2016).

[006] Nanopartículas (NPs) são definidas como dispersões particuladas ou partículas sólidas com tamanho entre 10-1000 nm que podem servir como sistema de entrega de fármacos ou adjuvantes em vacinas sendo utilizadas em tratamentos de câncer, diabetes, alergias, infecções e inflamação (CHOW e HO, 2013). Dentre as razões que fazem as NPs serem usadas em tratamentos é o fato de possuírem grande área de superfície e possuir rápida absorção e liberação (MOHANRAJ e CHEN, 2006). Nanopartículas são estruturas microscópicas que apresentam medidas na faixa de tamanho em torno de 1nm a 100nm (VERT et al., 2012). Existem diferentes tipos de nanopartículas, que podem ser compostas por metais inorgânicos, tais como o ouro, a prata e o carbono. Outras podem ser compostas por óxidos metálicos, tais como o óxido de titânio e o de ferro. Já as nanopartículas biodegradáveis podem ser compostas de materiais orgânicos, tais como lipídeos, proteínas e polissacarídeos, ou por polímeros inorgânicos, tais como o poliestireno. Regularmente as nanopartículas têm sido utilizadas como sistemas de entrega de antígenos ou carreadores vacinais, pois elas podem proteger o imunógeno carreado de fatores que induzem a sua decomposição. Além disso, podem ampliar a administração da vacina favorecendo a absorção destas pelo epitélio e disposição intracelular do imunógeno, acelerando ou melhorando a resposta imune (KHEIROLLAHPOUR et al., 2020).

[007] As NPs vêm sendo produzidas e utilizadas em uma ampla gama de produtos em todo o mundo. NPs têm sido ativamente investigadas quanto à administração de antibióticos, ácidos nucléicos, peptídeos/proteínas e quimioterapêuticos. A nanotecnologia pode desenvolver NPs capazes de carrear moléculas imunomoduladoras naturais e/ou sintéticas, que irão fornecer não apenas uma entrega melhorada de antígenos (direcionando APCs e agindo como um depósito de antígenos), mas também tem um papel importante no início da imunidade, ou seja, o efeito adjuvante (YADAV et al., 2018). Em suma, NPs podem ser usadas como plataformas vacinais ou sistemas adjuvantes, pois são capazes de melhorar a apresentação e processamento de antígenos. A modificação das superfícies das NPs com diferentes moléculas de direcionamento (ex: ligantes de receptores expressos em células imunes) permite a entrega de antígenos às APCs, estimulando assim, respostas imunes seletivas e específicas (KHEIROLLAHPOUR et al., 2020).As NPs podem ainda proteger os antígenos vacinais contra a degradação rápida e aumentando a captação celular do antígeno por células imunes do sistema imune inato. Uma das características mais desejadas dessas formulações é sua funcionalidade como um depósito de adjuvantes e antígenos, o qual pode permitir uma estimulação imunológica sustentada (GREGORY, TITBALL e WILLIAMSON, 2013).

[008] As NPs podem ser projetadas especificamente para atingir interações com o sistema imunológico. Essa vantagem é atribuída ao tamanho de partícula em nanoescala que facilita ao reconhecimento e a captação do antígeno pelas células fagocíticas, e desta forma, facilita também o processo de apresentação de antígenos. A interação das NPs com os antígenos pode ser realizada de três maneiras diferentes: conjugação (ligação covalente), adsorção (na superfície das nanopartículas) e encapsulamento (dentro das nanopartículas).

[009] Sistemas de entrega baseados em nanocarreadores são capazes de proteger os antígenos da degradação enzimática, de melhorar a estabilidade da formulação vacinal e também por possuir propriedades adjuvantes. As NPs podem ainda serem manipuladas para otimizar a resposta imune contra o antígeno através da indução de uma resposta específica de células apresentadoras de antígenos (ZAMAN, GOOD e TOTH, 2013; PATI, SHEVTSOV e SONAWANE, 2018). Os antígenos de interesse podem ser encapsulados dentro dos nanocarreadores ou serem adsorvidos à sua superfície. Já a adsorção superficial de antígenos e outros imunoestimuladores (por exemplo os ligantes de receptores do tipo toll) podem facilitar o processamento do antígeno e a ativação das células apresentadoras de antígenos. Essas alternativas podem resultar em uma ativação mais robusta da imunidade celular e humoral, tanto a nível sistêmico como localizado (imunidade de mucosa) se comparadas com o antígeno não-conjugado (PATI, SHEVTSOV e SONAWANE, 2018; VIJAYAN et al., 2019)

[010] O descobrimento dos receptores para o reconhecimento de padrões de microrganismos (PRRs), tais como os receptores Toll-like (TLRs) e os receptores de oligomerização de ligação de nucleotídeos (NOD), impactaram o desenvolvimento de novos adjuvantes capazes de produzir respostas imunes celulares necessárias para combater patógenos e células cancerosas. A interação dos PRRs com seus ligantes é capaz de influenciar as respostas imunes inata e adaptativa. Os TLRs podem ser expressos em na superfície celular (TLRs 1, 2, 4, 5 e 6) e meio intracelular (TLRs 3, 7, 8 e 9) (AKIRA, UEMATSU e TAKEUCHI, 2006).

[011] Receptores do tipo NOD ou receptores similares ao domínio de oligomerização ligante de nucleotídeo (NLRs), são receptores intracelulares, que possuem a capacidade de reconhecer padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), em virtude da entrada de patógenos por fagocitose ou por meio de poros na membrana. Além disso, são capazes de reconhecer padrões moleculares associados a danos (DAMPs), estes amplamente relacionados ao estresse celular (MAHLA et al., 2013).

[012] Os ligantes de TLRs são identificados por possuírem a habilidade de induzir a maturação de DCs, tendo como consequência a expressão de moléculas coestimuladoras e citocinas pró-inflamatórias (GIL-TORREGROSA et al., 2004). Muitos adjuvantes, sob investigação ou aprovados para sua aplicabilidade em formulações vacinais são ligantes de TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 ou TLR9, pois se assemelham aos PAMP bacteriano ou ao PAMP viral. De todos os TLRs, os que estão abrangidos no reconhecimento de ácidos nucléicos, tais como TLR3 e TLR7, são encontrados em compartimentos endolisossomais, (HU et al., 2016) e são, portanto, excelentes moléculas a serem usadas na composição de nanopartículas com potencial adjuvante ou vacinação. O trabalho de (LYNN et al., 2015), demonstrou a importância de combinar ligantes de TLR em nanopartículas como forma de induzir um aumento das respostas aos estímulos vacinais. Essa abordagem pode ser interessante para induzir imunidade protetora contra várias doenças, tais como influenza (NEMBRINI et al., 2011), câncer (HAMDY et al., 2008), hepatite B (CHONG et al., 2005) e encefalite do Nilo Ocidental (DEMENTO et al., 2010).

[013] Várias nanopartículas, compostas por diversos polímeros e associadas ao poli (I:C) tiveram sua ação imunoestimulatória comprovada. Nanopartículas magnéticas carreadoras de ovalbumina e associadas a ligantes de TLR3 poli (I:C), TLR7 (imiquimode) foram capazes de induzir resposta immune otimizada em modelo animal de melanoma (GONDAN et al., 2018). Segundo (JEWELL, LÓPEZ e IRVINE, 2011), as micropartículas que carregam o poli (I:C), são imunogênicas, pois possuem habilidade de gerar um depósito extracelular que possibilita a liberação equilibrada e exposição duradoura do agonista de TLR3 no tecido. Nanoparticulas de fosfato de cálcio contendo poli (I:C) também foram capazes de induzir um efeito imunoestimulatório em ensaios in vitro e in vivo (SOKOLOVA., 2017).

[014] As albuminas do soro são as proteínas mais abundantes no plasma sanguíneo e correspondem a 60% do seu total de proteínas. São frequentemente utilizadas como proteínas-modelo para muitos estudos bioquímicos, físicoquímicos e biofísicos (GELAMO et al., 2002). A albumina pode ser utilizada como veículo para agentes terapêuticos, melhorando o perfil farmacocinético do fármaco, de modo que um grande número de terapias baseadas em albumina está atualmente na fase clínica de testes (WEISSIG, PETTINGER e MURDOCK, 2014). A albumina sérica tem sido considerada um material promissor para produzir nanopartículas para uso em bioimagem e administração de medicamentos (AN e ZHANG, 2017). Albumina foi uma das primeiras moléculas de escolha em sistemas carreadores de fármacos. A albumina é um polímero natural, biocompatível, biodegradável, não tóxico e não imunogênico e, em razão dessas características são prósperos sistemas de aplicação de fármacos ou antígenos (ELZOGHBY, SAMY e ELGINDY, 2012).

[015] Estudos com NPs contendo BSA (NPVs) apontam que estas são boas carreadoras de fármacos, liberando os medicamentos conjugados nos locais de interesse e aumentando a concentração da droga no tecido. A albumina tem sido uma das primeiras moléculas de escolha em sistemas carreadores de fármacos e foi uma das primeiras NPs aprovadas pela agência de Administração de Medicamentos e Alimentos dos Estados Unidos (USFDA) (ZU et al., 2009; ZHAO et al., 2010). A BSA tem sido utilizada para preparação de NPs devido a sua estrutura primária bem definida em conjunto com a vantagem de permitir a modificação da sua superfície. Essa proteína oferece vários locais alvo para modificação covalente, tais como grupos amino livres. Além disso, a técnica de preparo das NPVs já está bem estabelecida (KOUCHAKZADEH et al., 2010).

[016] As NPVs já são utilizadas por indústrias farmacêuticas como carreadoras e sistema de liberação de fármacos em tratamentos, principalmente contra câncer devido sua alta estabilidade em estoque e in vivo, alta capacidade de ligação com substâncias, atoxicidade, reprodutibilidade e facilidade no aumento de escala durante a produção (KOUCHAKZADEH et al., 2015).

[017] Estratégias para desenvolver novos veículos de entrega são críticas no desenvolvimento de novos adjuvantes vacinais. Nanopartículas que encapsulam antígenos e adjuvantes são veículos promissores para fornecer antígenos e sinais ativadores para as células apresentadoras de antígeno (APCs), permitindo respostas imunes ideais contra um patógeno específico (KHEIROLLAHPOUR et al., 2020).

[018] O ácido polinossinico-policitidílico poli (I:C)] é um análogo sintético do RNA de fita dupla (dsRNA). O dsRNA é um padrão molecular associado à infecção viral que é reconhecido por receptores de padrão molecular. O poli (I:C) ativa os receptores de reconhecimento de padrões TLR3, RIG-I/MDA5 e PKR, induzindo assim a sinalização por várias vias inflamatórias, incluindo as vias de indução da ativação do NF-kB e dos fatores regulatórios de interferon (IRF). O poli (I:C) pode estimular a liberação de citocinas inflamatórias e, ao induzir a produção de interferon-gama, pode aumentar o número e as atividades tumoricidas de várias células imunológicas (PALCHETTI et al., 2015). É sabido também que essa molécula pode influenciar a maturação de células dendríticas, modificando o fenótipo imaturo para maduro e contribuindo dessa forma, para uma melhor ativação de células T e melhor resposta do sistema imunológico.

[019] O documento WO2020136657A1 descreve nanopartículas poliméricas adjuvantes para serem utilizadas em vacinas, em particular as produzidas a partir de pelo menos um polímero selecionado do grupo que consiste em poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA), Polietilenoglicol-PLGA (PEG-PLGA), Poli (ácido láctico) (PLA), PEG-PLA, Policaprolactona (PCL) e PEG-PCL.

[020] O documento PI0621185- 2 A2 é reinvidicado uma composição imunogênica que compreende um adjuvante baseado no ácido polirriboinosínicopolirribocitidílico em combinação com antibiótico, íon positivo e um antígeno. No entanto, o documento reinvindica a composição imunogênica adjuvante a base de ácido polirriboinosínico-polirribocitidílico, sem descrever de forma específica o uso de nanopartículas associadas à essa molécula.

[021] No documento PI 0415574-2 A, os inventores reivindicam nanopartículas construídas a partir de compostos tensoativos, principalmente lipídeos, para o uso dessas como vetores de princípios ativos terapêuticos, para uso no diagnóstico, para uso em vacinas ou em cosméticos, sem citar especificamente quais princípios seriam esses.

[022] O documento US10265407 B2 é reivindicado uma composição vacinal baseada em nanopartículas poliméricas que podem ativar o sistema imunológico. Essas nanopartículas devem estar associadas a um ou mais antígenos e adjuvantes, porém o documento não faz menção de forma específica qual o tipo de polímero a ser utilizado e quais as moléculas a serem incorporadas nas nanopartículas.

[023] O documento AU2020103603A4 é reivindicado nanopavacinas miméticas para o vírus influenza caracterizada por partículas de ouro revestidas polímeros catiônicos fluorados capazes de entregar vacina de DNA.

[024] O objetivo da presente invenção consiste em nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico com ação adjuvante e que, portanto, possam ser usadas na preparação de composições de vacinas destinadas ao tratamento ou prevenção de doenças.

[025] Os adjuvantes são substâncias que aumentam a resposta do organismo (humano ou animal) a um estímulo antigênico e por serem extremamente úteis no desenvolvimento de vacinas são amplamente utilizados na composição de vacinas para uso humano e veterinário. Várias vacinas necessitam da inclusão de adjuvantes em sua composição, de forma a induzir uma resposta imune mais robusta do organismo frente a um antígeno e dessa forma induzir proteção sustentada pela formação de memória imunológica. Existem poucos adjuvantes no mercado, os quais podem induzir reações adversas e ainda serem de custo elevado. Um adjuvante é uma substância adicionada a uma vacina para estimular e aumentar a magnitude e a durabilidade da resposta imune. O desenvolvimento de novos adjuvantes para vacinas é lento e ainda existem poucas substâncias aprovadas e, portanto a presente invenção contribui para a deficiência existente no mercado, pois acrescenta mais uma opção de uso de adjuvantes em vacinas para prevenção de doenças em animais e homem. Por mais de sete décadas, desde o seu licenciamento inicial na década de 1920, os sais insolúveis de alumínio (alúmen) permaneceram como uma das únicas opções de adjuvante a ser incluído nas mais diversas vacinas. Somente em 1990, o adjuvante de emulsão de óleo em água MF59 foi incluído na composição de vacinas licenciadas para uso na Europa (influenza sazonal indicada para adultos com mais de 65 anos de idade). Outros adjuvantes foram desenvolvidos nos anos seguintes, tais como o AS0, AS04, AS03 e citosina fosfoguanosina (CpG) 1018. Embora muitos outros adjuvantes tenham demonstrado alta potência e efetividade em modelos pré-clínicos, a maioria ainda não obteve licença em humanos, muitas vezes devido a questões de segurança ou tolerabilidade. Além disso, apesar de seu uso difundido, os mecanismos moleculares pelos quais os adjuvantes disponíveis - incluindo alúmen, MF59 e os adjuvantes do Sistema de Adjuvante AS0 - realmente funcionam em humanos não são bem compreendidos.

[026] Assim sendo, a presente invenção é importante para que possa aumentar a gama de adjuvantes no mercado, uma vez que existem poucas opções e dentre as atuais, existem problemas em relação à toxicidade e indução de reações adversas. O uso dessas nanopartículas com capacidade adjuvante mostrou, em modelos animais, uma atividade inflamatória e potencializadora do sistema imunológico. Ao ser administrada em conjunto com uma proteína de interesse (antígeno), foi possível verificar que os animais inoculados com essa formulação demonstraram uma significativa produção de anticorpos contra a proteína de interesse. A matriz dessas nanopartículas é composta de albumina sérica bovina e ácido poliinosínico-policitidílico. Os dados experimentais demonstraram que essa combinação de moléculas apresenta forte ação adjuvante do sistema imunológico e, portanto, pode ser extremamente útil se utilizado na composição de vacinas para a prevenção de doenças que afetam animais e humanos. O diferencial dessa tecnologia, portanto, está baseado em seu baixo custo de produção, elevada capacidade adjuvante, ser bem tolerada e ser biodegradável. Além de utilizar um polímero não-tóxico de baixo custo (albumina), a síntese química dessa nanopartícula apresenta um número reduzido de reações, as quais geram uma quantidade mínima de resíduos. Portanto, devido ao fato de serem biodegradáveis, gerar uma forte resposta imunológica ao antígeno vacinal e serem de baixo custo de produção. Assim sendo, essas nanopartículas podem reduzir o custo final por dose de vacina, tornando-as mais acessíveis aos mercados de interesse (saúde humana e veterinária).

Breve descrição dos desenhos

[027] A Figura 1 apresenta a morfologia determinada por microscopia de força atômica das nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico.

[028] A Figura 2 apresenta a avaliação do encapsulamento do ácido poliinosínicopolicitidílico nas nanopartículas de albumina sérica. A figura 2A apresenta a quantificação por espectrofotometria a 290 nm dos sobrenadantes coletados antes e após a formação das nanopartículas. O gráfico representa o resultado representativo de três experimentos realizados de forma independente. A figura 2B representa um gel de agarose a 1,5% onde foi adicionado à superfície do mesmo diferentes concentrações de nanopartículas de albumina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico e nanopartículas compostas apenas de albumina (NPV). A fluorescência observada é resultado da emissão da fluorescência do corante GelRed® associado ao ácido poliinosínico-policitidílico.

[029] A Figura 3 apresenta o teste de estabilidade das nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico nas temperaturas de 4ºC e 37ºC. Legenda: As nanopartículas foram incubadas a 4ºC e 37ºC durante 1, 2 e 4 dias. Após o tempo de incubação, as nanonopartículas associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico foram processadas para quantificação da liberação de poli (I:C) no sobrenadante (a); determinação do tamanho (b), PDI (c) e potencial Zeta (d).

[030] A Figura 4 apresenta a análise da captura de nanopartículas associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico por células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos. Legenda: A) Fotos representativas demonstrando a captura das nanopartículas pelas células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos. CC: controle de célula; NPVs: nanopartículas compostas de BSA (vazias); NPPI: nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico. B) Quantificação das células FITC+ /DAPI+ por Microscopia de fluorescência.

[031] A Figura 5 apresenta imagens microscópicas representativas da pele de camundongos tratados com nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico (Coloração: hematoxilina e eosina. Aumento 400×). Legenda: PBS: tampão fosfato de sódio, nanopartículas compostas de BSA (vazias), NPPI: nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico, poli (I:C): ácido poliinosínico-policitidílico. Barra: 50 µm.

[032] A figura 6 apresenta a análise da celularidade dérmica na pele de camundongos C57BL/6 tratados com nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico. Legenda: A) Diagrama de campo com a categorização semi-quantitativa da celularidade dérmica na pele de camundongos. Sem alteração, 1: aumento leve, 2: aumento moderado. A linha contínua azul representa a influência simultânea dos grupos sobre o escore histopatológico. A linha apresenta maior deslocamento em direção aos grupos com maior efeito sobre o escore histopatológico. B) Total de células por mm² no tecido dérmico de camundongos. a: indica significância de p <0,001 em relação ao grupo PBS; b: indica significância de P <0,01 em relação ao grupo NPV e poli (I:C). PBS: tampão fosfato de sódio, NPV: nanopartículas compostas de BSA (vazias), NPPI: nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico, poli (I:C): ácido poliinosínico-policitidílico.

[033] A figura 7 apresenta o resultado da imunização de camundongos C57BL/6 com uma proteína recombinante (domínio III da proteína do envelope do Zika vírus) na presença das nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico. Legenda: NPV: nanopartículas compostas de BSA (vazias), NPPI: nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico; PBS+EDIII: solução salina tamponada e domínio III da proteína do envelope do Zika vírus; NPV+EDIII: nanopartículas compostas de BSA (vazias) e domínio III da proteína do envelope do Zika vírus; NPPI+EDIII: nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínicopolicitidílico e domínio III da proteína do envelope do Zika vírus. **: <0,01; **** p <0,001.

[034] A figura 8 apresenta o resultado da titulação de anticorpos anti-EDIII antes e depois da infecção dos animais imunizados por Zika vírus. Legenda: NPV: nanopartículas compostas de BSA (vazias), NPPI: nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico; PBS+EDIII: solução salina tamponada e domínio III da proteína do envelope do Zika vírus; NPV+EDIII: nanopartículas compostas de BSA (vazias) e domínio III da proteína do envelope do Zika vírus; NPPI+EDIII: nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico e domínio III da proteína do envelope do Zika vírus.

Descrição da invenção

[035] A invenção se refere à nanopartículas com ação adjuvante compostas de albumina sérica bovina associada ao ácido poliinosínico-policitidílico que podem ser utilizadas na preparação de composições de vacinas.

[036] Empregam-se como reagentes na síntese das nanopartículas de albumina sérica bovina associada ao ácido poliinosínico-policitidílico, os monômeros de albumina sérica bovina e o ácido poliinosínico-policitidílico, sendo esse um ligante de receptor do tipo toll .

[037] Empregam-se como reagente na síntese das nanopartículas de albumina sérica bovina associada ao ácido poliinosínico-policitidílico, o solvente etanol ou outro que induz o processo de co-acervação da albumina;

[038] Empregam-se como reagente na síntese das nanopartículas de albumina sérica bovina associada ao ácido poliinosínico-policitidílico, o agente de ligação cruzada glutaraldeído;

[039] A síntese é executada solubilizando-se a solução de albumina de 0,1 a 10%, sendo preferencialmente na faixa de 1 a 3% em água deionizada ou destilada estéril. O ácido poliinosínico-policitidílico é solubilizado em água estéril em concentrações de 0,01 a 0,5%, sendo preferencialmente na faixa de 0,1 a 0,2%. Ambas as soluções devem ser misturadas em diferentes proporções, sendo preferencialmente utilizada a faixa de 10 a 20 partes da solução de BSA para 1 a 5 partes do ácido poliinosínico-policitidílico. A mistura deve ser agitada por 30 minutos utilizando agitador magnético. O solvente, preferencialmente o etanol, é adicionado gota a gota na solução em agitação até a formação das nanopartículas. A formação das nanopartículas se caracteriza pela mudança da solução com coloração transparente para uma com coloração opalescente. Após, a formação das nanopartículas o agente de ligação cruzada é adicionado, sendo a faixa preferencial utilizada de 10 a 25 microlitros de glutaraldeído a 25% por ml de solução inicial (albumina e ácido poliinosínico-policitidílico).

[040] Após a síntese, as nanopartículas de interesse devem ser purificadas por ciclos de centrifugação, sendo preferencialmente utilizada a temperatura ambiente por 15 minutos e 12500 rotações por minuto. Após a sedimentação, as nanopartículas são ressuspendidas em solução estéril de interesse na concentração desejada, sendo preferencialmente a faixa de 1 a 20 mg/ml. Essa etapa é importante para que os reagentes remanescentes da síntese sejam eliminados. A solução empregada para ressuspensão pode ser água estéril, solução salina estéril ou outra solução que não afete a estabilidade das nanopartículas.

[041] O tamanho de tais nanopartículas apresentaram-se na faixa de 1 a 900 nm, preferencialmente de 100 a 600 nm, com morfologia esférica-ovalada e com valores baixos de índice de polidispersividade, preferencialmente abaixo de 0,500. O potencial elétrico em torno da nanopartícula apresentaram valores variando de - 40,0 mV a +30,0, mV; no entanto, as nanopartículas propostas apresentam uma superioridade de cargas negativas, preferencialmente de -40 mV a – 10 mV.

[042] As nanopartículas sintetizadas possuem ação adjuvante e podem fazer parte de uma composição vacinal. As nanopartículas poderão ser incluídas em diferentes concentrações na preparação de composições de vacinas destinadas à prevenção ou tratamento de doenças infecciosas e tumores. Para tal, as nanopartículas deverão ser misturadas ao antígeno que se deseja induzir resposta imune contra ele. As concentrações de antígeno variam de 0,01% a 50%, sendo preferencialmente a faixa de concentração de 0,1 a 30%. Esse antígeno pode ser um micro-organismo atenuado, um micro-organismo morto ou uma subunidade do micro-organismo (proteína, polissacarídeo, DNA ou RNA) ou algum antígeno tumoral purificado.

[043] Como exemplo, descrevemos a síntese de nanopartículas de albumina sérica bovina associada ao ácido poliinosínico-policitidílico e seu uso em formulação vacinal contendo uma proteína do Zika virus.

[044] O ácido poliinosínico-policitidílico foi dissolvido em água deionizada estéril na concentração de 5mg/ml. Foi também produzida uma solução de BSA em água estéril, com a concentração final de 2%. Ambas foram filtradas em filtros de 0,5 micrômetros e essas foram misturadas e incubadas por 30 minutos em agitação à temperatura ambiente. Nesse exemplo foram utilizadas 2 ml de uma solução de albumina sérica bovina a 2% e 200 microlitros de uma solução de ácido poliinosínico-policitidílico a 5 mg/ml. Em seguida foi realizada a etapa de dessolvatação, que consiste na adição de álcool etílico absoluto gota a gota sob agitação. Nesse caso foi adicionado 1,5 ml de etanol.

[045] Após a formação da nanopartícula contendo o ácido poliinosínicopolicitidílico, foi realizado a ligação cruzada através da adição de 25µL de glutaraldeído a 25%. A solução foi mantida sob agitação magnética por 2 horas à temperatura ambiente. Ao término do tempo necessário para promover a ligação cruzada, as nanopartículas foram submetidas à centrifugação a 12.500 rpm durante 15 minutos. Os sedimentos foram lavados uma vez com 10 mL de solução salina fosfatada tamponada (PBS) estéril e centrifugado novamente conforme as condições descritas anteriormente. O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido em PBS estéril na concentração de 1 mg/mL.

[046] Como exemplo descrevemos formulação vacinal contendo as nanopartículas de albumina sérica bovina associada ao ácido poliinosínicopolicitidílico e a uma proteína do Zika vírus. Nesse caso foi utilizada uma proteína recombinante referente ao domínio III da proteína do envelope do Zika vírus na concentração de 1 mg/ml em PBS e a concentração de nanopartículas utilizada foi de 1 mg/ml em PBS. A proporção utilizada para geração da formulação vacinal foi de 2:1 (nanopartícula:antígeno). A concentração de antígeno na suspensão foi de 33%.

[047] As soluções foram misturadas, e 100 microlitros dessa mistura foram inoculados em camundongos C57Bl/6. A dose administrada compreende, portanto 100 microgramas de nanopartículas e 50 microgramas de antígeno. Os animais receberam três doses em intervalos de sete dias e após vinte e um dias da última imunização, o sangue dos animais foi coletado e utilizado para a dosagem de anticorpos. Os animais imunizados com as nanopartículas propostas nessa invenção em conjunto com a proteína de interesse (antígeno) apresentaram quantidades maiores de anticorpos se comparado aos outros grupos (Figura 7). De forma semelhante, quando esses animais foram infectados com o Zika vírus foi observado também uma quantidade maior de anticorpos nos animais imunizados nanopartículas propostas nessa invenção em conjunto com a proteína de interesse (antígeno) (Figura 8).

Claims (8)

1. NANOPARTÍCULAS ADJUVANTES para uso em composições de vacinas caracterizado pelo fato de compreender nanopartículas de albumina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico.
2. NANOPARTÍCULAS ADJUVANTES de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreenderem preferencialmente albumina sérica bovina em concentrações de 0,1 a 10%, sendo preferencialmente na faixa de 1 a 3%.
3. NANOPARTÍCULAS ADJUVANTES de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizada pelo fato de compreenderem ácido poliinosínico-policitidílico em concentrações de 0,01 a 0,5%, sendo preferencialmente na faixa de 0,1 a 0,2%.
4. NANOPARTÍCULAS ADJUVANTES, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de tais nanopartículas apresentarem morfologia esférica-ovalada e tamanho médio na faixa de 1 a 900 nm, preferencialmente de 100 a 600 nm com valores baixos de índice de polidispersividade, abaixo de 0,500.
5. NANOPARTÍCULAS ADJUVANTES, de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de tais nanopartículas apresentarem valores de potencial zeta variando de -40,0 mV a +30,0 mV, preferencialmente de -40 mV a – 10 mV.
6. USO DAS NANOPARTÍCULAS ADJUVANTES, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizada pelo fato de serem aplicadas em composições vacinais.
7. USO DAS NANOPARTÍCULAS ADJUVANTES, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser utilizado em conjunto com antígenos, preferencialmente imunogênicos.
8. USO DAS NANOPARTÍCULAS ADJUVANTES, de acordo com a reivindicação 1 a 7, caracterizado pelo fato de que as concentrações dos antígenos de interesse variam de 0,01% a 50%, sendo preferencialmente a faixa de concentração de 0,1 a 30%.

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