KR102115708B1

KR102115708B1 - 하이드로겔에 의해 캡슐화된 불활성화 균체를 포함하는 경구 투여용 백신 조성물

Info

Publication number: KR102115708B1
Application number: KR1020190129617A
Authority: KR
Inventors: 박세창; 강정우
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2019-01-10
Filing date: 2019-10-18
Publication date: 2020-05-27
Also published as: WO2020145489A1; CN113271966A

Abstract

본 발명은 하이드로겔에 의해 캡슐화된 불활성화 균체를 포함하는 경구 투여용 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 pH의 변화에 따라 가역적으로 팽창 또는 수축하여 크기가 변화하는 하이드로겔을 이용하여 병원체를 캡슐화함으로써, pH가 낮은 위에서는 소화되지 않고, pH가 높은 장내 까지 전달 후 분해되어 체내에 효과적으로 흡수되는 육식성 어류용 경구 백신 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 상기 백신 조성물은 먹이와 혼합 투여가 가능하기 때문에 생물체의 스트레스 발생 요인을 최소화할 수 있으며, 항체 역가가 향상됨과 동시에 보조제 사용이 없어 멜라닌화, 자가 면역과 같은 부작용 발생을 억제할 수 있다.

Description

하이드로겔에 의해 캡슐화된 불활성화 균체를 포함하는 경구 투여용 백신 조성물{Vaccine composition for oral administration comprising an inactivated microbial cell encapsulated by a hydrogel}

본 발명은 하이드로겔에 의해 캡슐화된 불활성화 균체를 포함하는 경구 투여용 백신 조성물에 관한 것이다.

어류는 변온동물로서 환경에 대한 적응력을 어느 정도 갖고 있지만 그 한계를 넘어버리면 생리적 장해를 일으키게 된다. 어류에 있어서 질병은 육상동물과 같이 내적·외적 환경에 대해 더 이상 건강상태를 유지할 수 없는 상태를 말한다. 질병은 숙주의 요인, 발병인자 및 환경과의 상관관계에 의한 결과로서 나타나는 현상으로 질병 발생요인 중 발병 인자만이 반드시 질병을 발생시키는 것은 아니며, 숙주와 환경의 상호작용에 의해 질병이 발생하거나 발생하지 않는다. 즉 발병인자와 숙주의 요인 그리고 환경과의 균형이 잘 이루어진 상태에서는 질병이 발생하지 않으며 이들 균형이 깨어질 경우 발생하는데 대부분의 경우 질병의 발생은 환경조건에 크게 영향을 받는다고 볼 수 있다.

어류의 체내에 병원체가 침입하는 경로는 피부, 아가미, 비강, 소화관 등으로 볼 수 있다. 이들 기관은 점액, 효소, 항균성 및 살균성 물질, 항체, 백혈구, 대식세포 등의 분비 및 작용에 의해 침입하는 세균 등으로부터 보호되고 있으나. 선별 시에 입는 기계적인 손상 또는 기생충에 의한 상처, 사육관리의 부실 등에 의해 이들 보호 물질이 손상을 입게 되며 그곳을 통하여 병원체가 체내에 침입하게 되고 이어서 혈류를 타고 장기나 조직에 도달하여 병소를 형성하게 된다.

어류에 피해를 입히는 병원생물은 크게 나누면 원생동물(기생충), 진균류(곰팡이), 세균, 바이러스 등이 있다. 기생충은 수 십 ㎝에서부터 수 백㎛, 세균은 수 ㎛, 바이러스는 수 천분의 1 ㎛ 되는 정도로 대단히 작다. 따라서 이들이 어류에 피해를 주는 방법 및 대책법도 당연히 서로 다르게 되는 것이다.

우리나라 해산어 양식은 양식기술의 발달과 더불어 지속적인 생산성 향상을 가져왔지만 현재 양식 산업은 연안 양식 환경의 악화, 장기간의 집약적인 양식으로 인한 어장의 노화, 양식품종의 열성화 및 질병발생의 원인으로 양식생산성이 저하되고 있다. 특히, 양식어종의 다양화에 따라 어종에 빈발하는 각종 감염증 및 이들의 합병증은 화학요법제의 빈번한 사용에 의한 약제내성균의 출현과 아울러, 양식어의 품질 저하나 폐사어나 병어의 폐기에 의한 생산비용의 상승을 초래하고, 이러한 감염증에 대한 대책이 현재 양식업계의 가장 중요한 과제가 되고 있다. 게다가 질병 발생에 의한 피해가 차지하는 비중이 점점 높아지는 경향이 있어 질병발생을 사전에 예방하고 대책을 강구하여 질병치료의 근본적인 방법이 강구되고 있는 실정이다.

한편, 양식어의 세균성 질병은 병원성 세균으로부터 다른 원인에 의한 2차적인 감염으로 어류를 죽게하는 조건적 병원체에 의해 발생한다. 양식장의 사육수에는 유기질이 많기 때문에 많은 세균이 번식할 수 있는 환경임으로 어류가 건강하지 못하거나 방어력이 약해졌을 때 질병을 일으킨다. 세균성 질병은 감염세균의 종류 및 증상에 따라 질병의 종류가 구분되며, 발생빈도가 높고 전염성이 강하며 일단 감염이 되면 누적폐사량이 많기 때문에 양식장에서는 경제적 손실이 대단히 크게 된다.

현재, 국내 어류 양식장에서 발생하는 세균성 질병에는 비브리오병, 에드워드병, 연쇄구균증, 활주세균증 등 여러 가지가 있지만, 양식장에 가장 많은 피해를 주는 질병은 에드워드병과 연쇄구균증으로 알려져있다.

관련하여 수생 생물에 사용되는 종래 시판 백신으로는 포르말린 사균이 널리 사용되고 있는데, 백신의 활성 유지를 위해 기름과 같은 보조제가 첨가되기 때문에 멜라닌화, 자가면역 반응 등의 부작용이 있을 뿐만 아니라, 뱀장어와 같은 육식성 어류에 대해서는 백신 주사가 곤란하다는 문제점이 존재한다.

본 발명자들은 육식성 어류에 효과적으로 적용될 수 있는 백신에 대하여 예의 연구하던 중, 녹말을 포함하는 하이드로겔로 항원을 캡슐화하여 육식성 어류에 경구 투여할 경우 생물체의 스트레스 발생 요인을 최소화함과 동시에 항체 역가가 월등히 향상될 수 있다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 육식성 어류에 효과적으로 적용될 수 있는 경구 투여용 백신 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,

하이드로겔; 및 상기 하이드로겔에 의해 캡슐화된 불활성화 균체;를 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 하이드로겔은 pH의 변화에 따라 가역적으로 팽창 또는 수축하여 크기가 변화할 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 하이드로겔은 녹말을 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 불활성화 균체는 포르말린 사균(formalin-killed cell-cultured)일 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 불활성화 균체는 어류의 세균성 질병의 병원체 또는 바이러스성 질병의 병원체일 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 조성물은 육식성 어류용 백신일 수 있다.

이때, 상기 육식성 어류는 뱀장어, 넙치(광어), 조피볼락, 우럭, 감성돔, 참돔, 능성어, 숭어, 농어, 전어, 고등어, 전갱이, 쥐치로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명은 pH의 변화에 따라 가역적으로 팽창 또는 수축하여 크기가 변화하는 하이드로겔을 이용하여 병원체를 캡슐화함으로써, pH가 낮은 위에서는 소화되지 않고, pH가 높은 장내까지 전달 후 분해되어 체내에 효과적으로 흡수되는 육식성 어류용 경구 백신 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 상기 백신 조성물은 먹이와 혼합 투여가 가능하기 때문에 생물체의 스트레스 발생 요인을 최소화할 수 있으며, 항체 역가가 향상됨과 동시에 보조제 사용이 없어 멜라닌화, 자가 면역과 같은 부작용 발생을 억제할 수 있다.

도 1은 실시예 1에 따라, 본 발명에 따른 녹말을 포함하는 하이드로겔에 의해 캡슐화된 백신(Starch vaccine)과 종래 포르말린 사균 백신(formalin-killed cell-cultured, FKC)을 경구 투여한 이후 시간에 따른 응집 역가를 나타낸 그래프이다.
도 2는 실시예 1에 따라, 본 발명에 따른 녹말을 포함하는 하이드로겔에 의해 캡슐화된 백신(Starch vaccine)을 0일차 1회 경구 투여한 군(Feed1), 매일 1회씩 총 4회 경구 투여한 군(Feed4), 매일 1회씩 총 8회 경구 투여한 군(Feed8) 및 종래 포르말린 사균 백신을 매일 1회씩 총 4회 투여한 군(FKC)들의 시간에 따른 응집 역가를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 2에 따라, 녹말을 포함하는 하이드로겔로 캡슐화된 FKC 항원을 포함하는 백신(Starch hydrogel based oral vaccine, SHO vaccine)의 형태학적 분석 결과를 FESEM으로 나타낸 것이다. (A)는 하이드로겔을 형성하기 전의 녹말, (B)는 항원을 함유하지 않는 녹말에 기초한 합성 하이드로겔, (C)는 포르말린 사균 세포(E. tarda SU53)를 함유하는 SHO 백신의 FESEM이다. 스케일 바는 1μm (A 및 C) 또는 2μm (B)이다.
도 4는 실시예 2에 따라, FKC 및 SHO 백신의 경구 투여 후 혈청 응집 역가를 측정한 결과를 나타낸 것이다(대조군: PBS 함침된(PBS-impregnated) 경구 펠릿을 한번만 경구 투여한 그룹, FKC group: FKC와 혼합된 그라운드 펠릿을(종래 포르말린 사균 백신)을 매일 1회씩 총 4회(4일) 경구 투여한 그룹, SHO 1: 본 발명에 따른 SHO 백신을 1일 동안 1회 경구 투여한 그룹, SHO 4: 본 발명에 따른 SHO 백신을 4일 동안 매일 1회씩 경구 투여한 그룹, SHO 8: 본 발명에 따른 SHO 백신을 8일 동안 매일 1회씩 경구 투여한 그룹). PBS, FKC 또는 SHO를 사용한 첫 번째 백신 접종 후 46 일에 부스트 백신 접종을 수행하였다. 막대는 평균±표준 편차를 나타낸다(n = 3). 대조군에서는 항체가 검출되지 않았다.
도 5는 실시예 2에 따라, 뱀장어를 이용한 공격실험(challenge test)에 의해 도출된 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이다. 첫 백신 접종 후 4주차에 주사 (i.p.) 챌린지를 수행하였고, 5개 그룹 (대조군, FKC, SHO 1, SHO 4 및 SHO 8)에서의 생존 백분율을 도시하였다 (n = 10). 공격실험은 이중으로 수행되었다; 결과는 각각 첫 번째 및 두 번째 시도로 표시된다.
도 6은 실시예 2에 따라, FKC 또는 SHO 백신 접종 후, 뱀장어의 간에서 IL-6, TNF-α 및 IFN-α의 상대적 mRNA 발현 측정 결과를 나타낸 것이다. 막대는 평균±표준 편차를 나타낸다 (n = 3). 대조군과 비교할 때 유의미한 차이(p < 0.05)는 별표로 표시된다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

종래 수생 생물에 사용되는 백신으로 포르말린 사균이 널리 사용되고 있는데, 상기 백신의 경우 백신의 활성 유지를 위해 기름과 같은 보조제가 첨가되기 때문에 멜라닌화, 자가면역 반응 등의 부작용이 있을 뿐만 아니라, 뱀장어와 같은 육식성 어류에 대해서는 백신 주사가 곤란하다는 문제점이 존재하였다.

이에, 본 발명자들은 육식성 어류에 효과적으로 적용될 수 있는 백신에 대하여 예의 연구하던 중, 녹말을 포함하는 하이드로겔로 항원을 캡슐화하여 육식성 어류에 경구 투여할 경우 생물체의 스트레스 발생 요인을 최소화함과 동시에 항체 역가가 월등히 향상될 수 있다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

이를 위해, 본 발명은 하이드로겔; 및 상기 하이드로겔에 의해 캡슐화된 불활성화 균체;를 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 백신 조성물을 제공한다.

이때, 상기 하이드로겔은 pH의 변화에 따라 가역적으로 팽창 또는 수축하여 크기가 변화할 수 있다. 구체적으로, 상기 하이드로겔은 pH가 낮아지면 수축하고, pH가 높아지면 팽창하는 특성을 가질 수 있으며, 이러한 특성으로 인하여 본 발명에 따른 백신 조성물이 육식성 어류에 경구 투여될 경우, pH가 낮은 위장에서는 하이드로겔이 수축된 상태로 존재하여 분해되지 않고 장내까지 전달되고, pH가 높은 장내에서는 하이드로겔이 팽창하면서 분해되고, 상기 하이드로겔과 불활성화 균체가 분산되어 결과적으로 불활성화 균체(병원체)가 체내에서 효과적으로 흡수될 수 있다.

상기 하이드로겔은 pH의 변화에 따라 부피가 변화되고 소화 효소에 의해 분해될 수 있는 물질이라면 모두 가능하며, 예를 들어 녹말일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 불활성화 균체는 세균성 또는 기생충성 질병의 병원체를 불활성화시킨 것이 사용될 수 있다. 상기 불활성화 균체는 동결 처리, 열 처리 또는 포르말린 처리 등을 통해 불활성화 될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 불활성화 균체는 포르말린 사균(formalin-killed cell-cultured)이 사용될 수 있다. 상기 포르말린 처리는 0.3%~2%의 포르말린으로 4℃ 또는 상온에서 2시간 이상 또는 24~48 시간 동안 수행될 수 있으며, 상기 동결 처리는 -80 내지 0℃에서 수행될 수 있다. 상기 세균성 질병의 병원체는 열처리 또는 포르말린 처리 방법에 의하여 불활성화 처리될 수 있으며, 상기 기생충성 질병의 병원체는 동결처리 또는 포르말린 처리 방법에 의하여 불활성화 처리될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 균체는 에드워드샐라 타라(Edwardsiella tarda), 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae), 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 비브리오 하베이(Vibrio harveyi), 테나시바쿨럼 마리티멈(Tenacibaculum maritimum), 락토코커스 가배(Lactococcus garvieae) 등으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 세균을 포함하는 어류 병원체 또는 이리도바이러스(Irodovirus) 등과 같은 바이러스성 어류 병원체 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 하이드로겔로 캡슐화된 불활성화 균체는 에드워드샐라 타라의 불활성화 균체가 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 불활성화 균주, 바람직하게 사멸 균주의 세포 용해물 또는 세포 외 산물(extracellular products, ECPs) 등을 추가로 포함할 수 있으며, 이를 통해 백신 조성물의 면역력 향상 효과를 더욱 증진시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 면역 보조제를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어, 상기 면역 보조제는 폴리솔베이트계 비이온성 계면활성제, 알루미늄 하이드록사이드 겔, 스쿠알렌 및 키토산 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 백신 조성물은 면역 보조제 또는 면역 증강제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게 상기 면역 증강제는 폴리솔베이트계 비이온성 계면활성제, 알루미늄 하이드록사이드 겔, 스쿠알렌 및 키토산 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 상기 폴리솔베이트계 비이온성 계면활성제의 예는 트윈 80, 트윈 60 또는 트윈 20일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 트윈 80일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 백신 조성물은 부형제 및/또는 안정화제 등의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물에 포함되는 불활성화 균체의 함량은 적용 대상 어류 또는 병원체 등에 따라 적절히 조절하여 설정될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 어류 1 마리당 주입되는 불활성화 균체의 함량을 고려하여 제조될 수 있으며, 상기 균체의 함량은 일괄 또는 수회 나누어 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 어류에 처리하여 어류의 세균성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 예방 또는 치료 방법은 백신 조성물을 경구를 통해 투여할 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

실시예 1.

실시예 1-1. 재료 준비

(1) 어류의 준비

22.4 g의 평균 개체량을 가지며 정상인 300마리의 뱀장어과의 뱀장어(japanese eel, Anguilla japonica)를 경기도의 상업 양어장으로부터 구매하였고, 실험 시작 14일 전 서울대학교 수의학 대학에 순응시켰다. 상기 어류는 일정한 통기와 함께 인위적 식단으로 급이하였고, 일주일에 2-3 번 물을 교환하였다.

(2) 박테리아 균주 및 포르말린 사멸된 전세포의 준비

뱀장어과 뱀장어로부터 분리된 에드워드샐라 타라(Edwardsiella tarda) SU53 (1980, Japan)를 연구실 내 동결 건조된 상태로 보관하고, 본 실험에 전반적으로 사용하였다. 실험을 위해, 상기 박테리아를 트립신콩 한천 (TSA, Difco) 배지에 25℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 에드워드샐라 타라 균주 (SU53)를 트립신 콩 (TSB, Difco) 브로스에 25℃에서 18시간 동안 배양하였다. 배양된 박테리아를 1% 포르말린으로 처리하고 25℃에서 18시간 동안 유지하였다. 포르말린-처리된 배양물을 3분 동안 13,000 rpm으로 원심분리한 후, 멸균 인산염 버퍼 식염수(PBS)에 두 번 세척하고, 멸균 PBS에 재현탁하였다. 상기 현탁액을 분광광도계를 통해 1.0의 O.D 값으로 조정하였다.

실시예 1-2. 녹말을 포함하는 하이드로겔로 캡슐화된 FKC 항원을 포함하는 백신 조성물의 제조

녹말(Starch) 1.33g을 distilled water 35 ml에 풀어서 70℃에서 저어주었다. 다음으로, 과황산암모늄(Ammonium persulfate, APS) 100mg을 추가하여 10분 동안 저어주고, 아크릴산(Acrylic acid, AA) 1.5g과 2-Hydroxyethyl methacrylate(2-HEMA) 1.5g을 추가로 첨가하였다. 다음으로, 5ml distilled water에 N,N'-methylene bisacrylamide(N,N'-MBA) 100mg을 잘 풀어준 후 추가로 첨가하였다. 이들 혼합 용액의 온도를 55~60℃로 낮춰서 유지하면서 1시간 동안 교반한 후, 용액을 식히기 전에 항원(불활성화 균체)를 첨가하였으며, 1M NaOH 20ml를 조금씩 넣어 pH를 7~8로 조정한 후 Ethanol 200ml에 6시간 이상 넣어서 탈수시켰다. 마지막으로, Ethanol을 따라버리고 고체화된 gel을 6 시간 이상 동결건조시켜 본 발명에 따른, 녹말을 포함하는 하이드로겔에 의해 캡슐화된 불활성화 균체를 포함하는 백신(녹말 백신)을 제조하였으며, 상기 제조된 백신은 가루 형태로 보관하였다.

실시예 1-3. 백신 조성물의 면역 효과 실험

제조한 녹말 백신을 1x10⁸의 항원용량이 한마리에게 투여될 수 있도록 분주하여 준비하였다. 처음 백신을 경구투여한 날을 0일차로 하여 8일, 15일, 22일, 29일, 36일, 43일 등 매 7일마다 혈액 샘플을 채취하여 serum을 이용해 항원항체 응집반응을 관찰하였다.

도 1은 본 발명에 따른 녹말을 포함하는 하이드로겔에 의해 캡슐화된 백신(Starch vaccine)과 종래 포르말린 사균 백신(formalin-killed cell-cultured, FKC)을 경구 투여한 이후 시간에 따른 응집 역가를 나타낸 그래프이다. 이를 통해, 본 발명에 따른 백신이 종래 포르말린 사균 백신에 비해 항원에 대한 항체 응집 반응 결과가 월등히 향상된다는 점을 확인하였다.

도 2는 본 발명에 따른 녹말을 포함하는 하이드로겔에 의해 캡슐화된 백신(Starch vaccine)을 0일차 1회 경구 투여한 군(Feed1), 매일 1회씩 총 4회 경구 투여한 군(Feed4), 매일 1회씩 총 8회 경구 투여한 군(Feed8) 및 종래 포르말린 사균 백신을 매일 1회씩 총 4회 투여한 군(FKC)들의 시간에 따른 응집 역가를 나타낸 그래프이다. 도 2의 그래프는 E. tarda에 대한 백신 투여군의 항원항체 응집반응을 나타낸 것으로서, 측정 결과, 8일차부터 29일차까지 녹말 백신 1회 투여군과 FKC 4회 투여군에 비해 본 발명에 따른 녹말 백신을 4회, 8회 투여한 군의 항원 응집반응의 항체 역가가 더 높게 나타난다는 것을 확인하였다. 또한 녹말 백신의 1회 투여의 경우, 백신의 효과가 다회 투여에 비해 낮은 것으로 나타났으며, 4회와 8회 투여군에서 응집 반응의 결과가 비슷한 것으로 보아 일정 투여 횟수 이후에는 백신의 효과가 일정치 이상 증가하지 않는다는 것을 확인하였다.

실시예 2.

실시예 2-1. 실험 방법

박테리아 균주 및 성장 조건

뱀장어과 뱀장어로부터 분리된 에드워드샐라 타라(Edwardsiella tarda) SU53 (1980, Japan)를 연구실 내 동결 건조된 상태로 보관하고, 본 실험에 전반적으로 사용하였다. 실험을 위해, 상기 박테리아를 TSB(tryptic soy broth, Difco) 배지 또는 TSA(tryptic soy agar, Difco) 배지에서 25℃ 조건에서 배양하였다.

어류의 준비

560마리의 뱀장어과의 뱀장어(japanese eel, Anguilla japonica) (평균 길이 28.0 cm; 평균 무게, 82.4±7.9 g)를 경기도의 상업 양어장에서 구매하였고, E. tarda 감염이 없음을 확인하기 위해 실험 전에 10마리의 개체를 무작위로 수집하여 종래 문헌(T. Sakai, T. Lida, K. Osatomi, K. Kanai, Detection of type 1 fimbrial genes in fish pathogenic and non-pathogenic Edwardsiella tarda strains by PCR, Fish Pathol. 42 (2007) 115-117)에 보고된 방법에 따라 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 실시하였다. 그 후 남은 550마리를 5t 탱크에서 1주일 동안 27.5 ± 0.5 ℃의 실험실 조건에 적응시켰다. 상기 어류에 일정한 통기와 함께 인위적 식단으로 급이하였고, 일주일에 1회 탱크 내 물의 약 50%를 교환해주었다. 500 마리 중 100마리는 E. tarda SU53의 반치사량(median lethal dose, LD₅₀) 결정 시험에 사용하였고, 400마리는 백신 접종 시험에 사용하였다. 모든 동물 관리 및 실험 프로토콜은 서울대학교 동물 윤리위원회의 지침에 따라 수행하였다.

뱀장어의 위 및 내장의 pH 측정

급이(feeding) 1시간 후에, 5마리의 뱀장어를 무작위로 선택한 다음 MS-222 (Sigma-Aldrich, MO, USA)를 사용하여 안락사시켰다. 이후, 뱀장어의 위장관을 절개하고 위 및 장 내용물의 pH를 pH 측정기 (Thermo Scientific, MA, USA)를 사용하여 측정하였다.

녹말을 포함하는 하이드로겔로 캡슐화된 FKC 항원을 포함하는 백신(Starch hydrogel based oral vaccine, SHO vaccine)의 제조

먼저, 포르말린 (0.4 % [v/v])을 첨가하여 1ml의 E. tarda SU53 박테리아 현탁액 (2.0×10¹⁰ 콜로니 형성 단위; CFU)을 비활성화시키고, 멸균 인산염 버퍼 식염수(PBS)에 두 번 세척하고, 멸균 PBS에 재현탁하였다.

다음으로, 녹말(Starch)(1.33 g; Fluka, Buchs, Switzerland)을 70℃에서 35 ml의 증류수 (DW)에 교반함으로써 용해시켰다. 이후, 과황산암모늄(Ammonium persulfate, APS)(100 mg; Fluka, Buchs, Switzerland)을 현탁액에 첨가한 후 10분 동안 추가로 교반하고, 아크릴산(Acrylic acid, AA) (1.5 g; Merck, Darmstadt, Germany)과 2-Hydroxyethyl methacrylate(2-HEMA) (Merck, Darmstadt, Germany) 1.5 g을 추가로 첨가 및 교반하였다. 다음으로, 5 ml의 증류수에 N,N'-methylene bisacrylamide(N,N'-MBA) 100mg을 잘 풀어준 후 추가로 첨가한 후, 이들 혼합 용액을 60 ℃로 냉각시켰다. 다음으로, 항원(불활성화 균체)(KFC)를 첨가한 다음 계속 교반시켰다. 1시간 후, 반응 생성물을 30분 동안 주위 온도로 냉각시키고, 1M NaOH 용액을 첨가하여 pH 7.5로 중화시킨 후, Ethanol 200 ml에 6시간 이상 넣어서 탈수시켰다. 마지막으로, Ethanol을 따라버리고 고체화된 gel을 6시간 동안 동결건조시켜 본 발명에 따른, 녹말을 포함하는 하이드로겔에 의해 캡슐화된 불활성화 균체를 포함하는 백신(녹말 백신)을 제조하였으며, 상기 제조된 백신은 추가 사용을 위해 -20 ℃에서 가루 형태로 보관하였다.

SHO 백신의 형태학적 분석

전계 방출 주사 전자 현미경 (FESEM; Sigma, Carl Zeiss, UK)을 사용하여 형태 분석을 수행하였다. 3개의 시편을 제조하고 스터브 상에 장착하였다: 하이드로겔 형성 전의 녹말; 항원을 함유하지 않는 녹말에 기초한 합성 하이드로겔; 및 본 발명에 따른 SHO 백신. 스캐닝하기 전에, 시편을 vacuum coater (EM ACE 200; Leica, Austria)를 사용하여 180초 동안 금으로 스퍼터 코팅 하였다.

백신 접종

SHO 백신을 제조하기 위해, 분말형 하이드로겔을 분쇄된 펠렛과 완전히 혼합한 다음, 일정량의 PBS를 혼합물에 첨가하였다. 각각의 SHO 백신의 항원 함량은 어류 당 10⁸ CFU로 조정하였다. 면역 실험 전에, MS-222를 사용하여 5마리의 뱀장어를 무작위로 선택하고 마취시켰다. SHO 백신을 이들 어류에 경구투여하고, 27.5 ± 0.5 ℃에서 유지시켰다. 백신 접종 1주 후, 뱀장어를 MS-222로 안락사시키고 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하여 SHO 백신에 의해 면역력이 생겼는지를 확인하였다.

400마리의 뱀장어를 5개 그룹 (각 그룹, n = 80)으로 나누었다. 5개의 그룹은 다음과 같다; 대조군: PBS 함침된(PBS-impregnated) 경구 펠릿을 한번만 경구 투여한 그룹, FKC group: FKC와 혼합된 그라운드 펠릿을(종래 포르말린 사균 백신)을 매일 1회씩 총 4회(4일) 경구 투여한 그룹, SHO 1: 본 발명에 따른 SHO 백신을 1일 동안 1회 경구 투여한 그룹, SHO 4: 본 발명에 따른 SHO 백신을 4일 동안 매일 1회씩 경구 투여한 그룹, SHO 8: 본 발명에 따른 SHO 백신을 8일 동안 매일 1회씩 경구 투여한 그룹. 단일 경구 투여시, 각각의 백신 (FKC 또는 SHO)의 총 항원 함량은 어류 당 10⁸ CFU로 조정하였다.

혈액 샘플 수집 및 혈청 응집 테스트

6주 동안 매주 5개 그룹 각각에서 3마리의 물고기를 무작위로 선택하였다: SHO 8을 제외한 모든 그룹에서 첫 번째 백신 접종 후 1주일부터 샘플링을 수행하였다(SHO 8은 첫 번째 백신 접종 후 2주 후에 샘플링 수행). MS-222로 안락사 후 1 ml 주사기를 사용하여 꼬리 정맥으로부터 채혈한 혈액 샘플을 원심분리튜브 (Eppendorf, Hamburg, Germany)로 옮겼다. 6,500×g, 4℃에서 10분 동안 원심 분리 후 혈청을 수집하였다. 보체 활성(complement activity)을 불활성화시키기 위해 혈청을 열처리(44℃, 20분)하였다. 혈청 응집 실험은 96-웰 U-bottom 플레이트 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 수행하였다. 혈청을 PBS에서 2배로 연속 희석하고, 동일한 부피의 가열-사멸된 E. tarda SU53 (약 10⁷ CFU/ml)을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 25 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

부스트 백신(Boost vaccine)의 효과 측정

두 번재 백신 접종 (부스트 백신 접종)은 혈청 응집 항체 역가가 감소하는 것으로 밝혀졌을 때, 첫 번째 백신 접종 후 46일 차에 한 번만 수행하였다. 첫 번재 백신 접종 후 46일 차에 5개 그룹 각각에서 20마리의 뱀장어를 무작위로 선택하였다. 대조군의 어류에는 PBS-함침된 펠릿을 경구 투여하였다; FKC 그룹 어류에는 FKC와 혼합된 분쇄된 펠렛을 경구 투여하였고; SHO 1, SHO 4 및 SHO 8의 어류에는 SHO를 경구 투여하였다. 그런 다음 각 그룹의 물고기를 27.5 ± 0.5 ℃에서 200 L 유리 섬유 강화 플라스틱 수족관으로 별도로 옮겼다. 첫 번째 백신 접종 후 7주 및 8주에, 5개의 그룹 각각에서 3마리의 뱀장어를 무작위로 선택하고 혈액 샘플링을 수행하였다. 혈청 응집 실험은 전술한 바와 같이 수행하였다.

공격실험(Experimental challenge test)

초기 대수기(early-exponential phase)의 E. tarda SU53을 챌린지 시험에 사용하였고, PBS로 10배 연속 희석하였다. 균주의 LD₅₀ 농도를 결정하기 위해, 이중 어류 그룹(duplicate fish groups)(그룹당 n = 10)에 복강 내 (i.p.) 주사를 통해 100 ㎕의 박테리아 현탁액을 투여하였다.

최종 주사 용량은 2.0×10⁴ 내지 2.0 × 10⁷ CFU/fish 범위였다. 대조군의 어류에 100 μl의 멸균 PBS를 주사하였다. 주사 후, 15일 동안 물고기를 모니터링 하였다. 죽은 물고기는 매일 샘플링되었다; 박테리아를 신장에서 분리하고 PCR을 사용하여 확인하였다.

첫 번째 백신 접종 후 4주 후에 주사(i.p.) 공격실험을 수행하였다. 이중 어류 그룹(그룹당 n = 10)에 100 μl의 LD50 농도의 균주를 함유하는 주사를 투여하였다. 시험 어류는 흐르는 물이 공급되는 100 L 유리 섬유 강화 플라스틱 수조에서 27.5±0.5 ℃로 유지하였다. 주사 후 15일 동안 질병 및 누적 사망률의 임상 징후를 하루에 2회 모니터링 하였다. 폐사한 어류의 신장에서 샘플링을 수행하였으며, 해당 샘플은 전술된 PCR법을 이용하여 균을 동정하였다.

RNA 추출 및 역전사

혈액 샘플 수집 후, RNA 추출을 위해 각 그룹으로부터 3마리의 뱀장어를 선택하였다. TRIzol Reagent (CWBio, Beijing, China)를 사용하여 머리 신장 및 간의 조직 샘플로부터 총 RNA를 추출하였다. RNA 농도 및 순도는 분광 광도법에 의해 정량화되었으며, 이는 1.6 내지 1.8 사이의 260:280 ratio를 나타내었다; 0.5 ㎍/mL ethidium bromide가 보충된 1% 아가로스 겔상에서 전기영동을 사용하여 RNA 품질을 검증하였다. DNA 오염을 방지하기 위해, 제조업체의 지침에 따라 전체 RNA 샘플을 DNAse Ⅰ (Madison, WI, USA)로 처리하였다. 추출된 RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 PrimeScript RT 시약 키트 (TaKaRa Bio, Otsu, Japan)를 사용하여 cDNA로 역전사되었다. 생성된 cDNA는 사용전까지 -80 ℃에서 보관하였다.

유전자 발현의 실시간 정량적 PCR 분석

인터페론(IFN)-α, 인터루킨(IL)-6 및 종양 괴사 인자(TNF)-α와 같은 면역 반응에 관여하는 유전자의 발현을 Rotor-Gene Q 실시간 정량적 PCR (RT-qPCR) 검출 시스템 (QIAGEN; Hilden, Germany)을 이용하여 모니터링하였다.

모든 qPCR 반응은 표준 프로토콜에 따라 SYBR Premix Ex TaqTM 226 Perfect Real-Time Kits (TaKaRa Bio, Otsu, Japan)를 사용하여 수행하였다. 하우스-키핑 유전자(house-keeping gene)를 사용하여 유전자 발현을 표준화하였다. 하기 표 1은 qPCR에 사용 된 PCR 프라이머 서열을 나타낸다. 반응 혼합물은 10 μl SYBR Premix Ex TaqTM 229, 1 μl의 정방향 및 역방향 프라이머 (10 mM) 및 1 μl cDNA를 포함하였다.

Reference 14: J. Feng, P. Lin, Y. Wang, S. Guo, Z. Zhang, L. Yu, Identification of a type Ⅰinterferon (IFN) gene from Japanese eel and its expression analysis in vivo and in vitro, Agri Gene 5 (2017) 19-26.

Reference 15: M. Teles, S. Mackenzie, S. Boltana, A. Callol, L. Tort, Gene expression and TNF alpha secretion profile in rainbow trout macrophages following exposures to copper and bacterial lipopolysaccharide, Fish. Shellfish Immunol. 30 (2011) 340-346.

이어서 초순수를 반응에 첨가하여 최종 총 부피가 20 μl가 되도록 하였다. 반응 조건 및 사이클 지수는 95 ℃에서 5분 동안 수행한 후, 95 ℃에서 15 초 동안, 60 ℃에서 1분 동안, 및 72 ℃에서 30초 동안 40 사이클을 수행하였다. 증폭 단계 후, 비특이적 증폭 또는 프라이머-이량체 형성 가능성을 확인하기 위해 용융 곡선 분석을 수행하였다. 샘플 cDNA의 연속 희석으로부터 표준 곡선을 생성하고, 분자수에 대한 역치 사이클 (threshold cycle, Ct)의 자연로그를 플로팅하여 그렸다. 각 유전자의 표준 곡선을 3회 실행하여 모든 표준 곡선의 결정 계수 (R²)가> 0.99이고 증폭 효율이 90% 내지 110%인지 확인하였다. FKC 그룹 및 SHO 그룹에 대한 데이터를 대조군에서 얻은 것과 비교하였다. 표적 유전자의 상대 발현을 표준 △△C_T 방법을 사용하여 분석하였다. 본 실험은 3회 반복 수행되었다.

통계 분석

일원분산분석 (ANOVA) 테스트를 사용하여 데이터를 분석하였다. 실험 그룹 간의 차이를 분석하기 위해 Tukey's test를 사용하였으며, 통계 분석에는 OriginPro 소프트웨어 (버전 8.5; OriginLab Corporation, MA, Northampton)를 사용하였다. 유의성을 P-값으로 측정하였고, P < 0.05일 때 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

실시예 2-2. 결과 및 고찰

SHO 백신의 특징

백신 제조 전에 녹말을 균일하게 분포시켰다(도 3A). 녹말은 수분 흡수 및 팽창에 의해 덩어리진 하이드로겔을 성공적으로 형성하였다(도 3B). 항원 (FKC)을 첨가하여 FKC를 녹말 하이드로겔에 코팅하고 SHO 백신을 제조하였으며, FESEM을 통해 성공적으로 제조되었음을 확인하였다(도 3C).

적응 면역 반응(Adaptive immune responses)

면역 실험 전에, 어떤 그룹에서도 검출 가능한 항체가 발견되지 않았다. 백신 접종된 그룹에서, FKC 또는 SHO 백신 접종은 백신 접종 후 2주째(2 wpv)에 응집 역가를 증가시켰다 (도 4). 응집 역가의 최고값은 3 wpv에서 관찰되었으며, 첫 번째 백신 접종후 46 일차에 두 번째 백신 접종이 수행될 때까지 감소하였다. 두 번째 백신 접종 후 응집 역가가 급격히 증가하여 SHO 8을 제외한 모든 백신 접종 그룹에서 7 wpv에서 가장 높은 값에 도달하였다(SHO 8은 8 wpv에 도달). SHO 백신 접종은 FKC 백신 접종보다 더 높은 항체 역가를 생성하였다. FKC 및 SHO 1은 상대적으로 더 작은 역가를 나타었으며(SHO 1은 두 번째 백신 접종 후 FKC보다 더 높은 역가를 생성), SHO 4 및 SHO 8은 더 높은 역가를 나타내었다. SHO 4 및 SHO 8의 어류는 3 wpv에서 가장 높은 역가를 나타내었고, 두 번째 백신 접종 후 8 wpv에서 동일한 값은 역가를 나타내는 등 유사한 패턴 변화를 나타내었다.

백신 접종 후 생존 평가

E. tarda SU53의 15-day LD₅₀ 농도를 결정하기 위해, 실험적 챌린지 테스트를 2회 반복하였다 (데이터 미도시). 대조군 및 최저 농도 (2.0×10₄ CFU/fish)를 투여한 군에서, 어류의 감염 실험 동안 사망률은 관찰되지 않았다. 다른 투여 그룹에서, 사망은 공격접종 후 3일 (3 dpc)부터 발생하였고, 최대 9 dpc까지 계속되었으며, 9 dpc 후에, 실험 기간의 나머지 기간동안 생존하였고 어떠한 증상도 나타나지 않았다. 생존률은 각각 2.0×10⁵ CFU/fish에서는 70%(1st trial), 70%(2nd trial), 2.0×10⁶ CFU/fish에서는 40%(1st trial), 50%(2nd trial), 2.0×10⁷ CFU/fish에서는 0%(1st trial), 0%(2nd trial)로, 최종 주사 용량에 비례하였다. 모든 죽은 어류는 edwardsiellosis의 전형적인 임상 징후를 나타내었다. 이들로부터 분리된 박테리아를 TSA 플레이트에서 배양하고, 전술한 PCR 결과 E. tarda로 확인되었다.

Edwardsiellosis에 대한 FKC 및 SHO 백신의 보호 효과에 대한 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 4 wpv에서 모든 백신 접종된 그룹의 공격접종 후 폐사율은 대조군의 것보다 낮았다. 모든 그룹에서, 공격접종 후 폐사율의 진행은 E. tarda SU53의 LD₅₀ 농도를 결정하기 위해 수행된 공격실험의 결과와 일치하였다: 폐사율은 3 dpc 내지 9 dpc로 기록된 후 더 이상의 추가 폐사율은 관찰되지 않았다. FKC 그룹에서 어류의 생존율은 첫 번째와 두 번째 시도에서 각각 60%와 70%였다. SHO 백신이 접종된 어류의 생존율은 FKC 백신이 접종된 그룹보다 더 높았다. SHO 백신 접종 그룹의 생존율은 다음과 같다: SHO 1에서 70%(first trial) 및 80%(second trial); SHO 4에서 80%(first trial) 및 90%(second trial); 및 SHO 8에서 80%(first trial) 및 90%(second trial). SHO 4와 SHO 8 사이의 생존율에는 유의 한 차이가 없었으며, 둘 다 최고 및 동일한 수준의 질병 방어 효과를 나타내었다.

사이토카인 유전자 발현에 대한 백신 접종의 효과

도 6은 백신 접종 후 각 그룹에서 뱀장어의 머리 신장 또는 간에서의 사이토 카인 유전자 발현을 나타낸 것이다. 모든 면역화된 그룹에서, 백신 접종은 대조군과 비교할 때 사이토카인 유전자의 수준을 증가시켰다. SHO 백신 접종은 FKC 백신 접종시 보다 더 높은 수준의 사이토카인 유전자 발현을 유도하였다; 발현 수준은 SHO 1 대비 SHO 4 및 SHO 8에서 더 높았다 (도 6). SHO 4 및 SHO 8의 사이토카인 유전자 발현은 3 wpv에서 증가하였고, 4 wpv에서 감소하였으며, 8 wpv에서 다시 증가하는 경향을 보였으며, SHO 8의 8 wpv에서 가장 높은 발현 수준을 나타내었다. 시간에 따른 사이토카인 유전자 발현의 차이는 SHO 1 또는 FKC 그룹에서 유의하지 않았다. 그러나, IL-6 발현의 경우 이들 두 그룹 모두 3 wpv 부터 8 wpv 까지 증가하는 경향을 나타내었다. SHO 1 및 FKC 그룹에서 IFN-α 발현은 SHO 4 및 SHO 8에서와 동일한 방식으로 변화하여, 3 wpv에서 증가, 4 wpv에서 감소 및 8 wpv에서 다시 증가하였다. TNF-α 발현은 FKC 그룹에서 증가하는 경향을 나타낸 반면, SHO 1에서는 3 내지 4 wpv에서 감소한 후, 8 wpv 까지 증가하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시형태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

육식성 어류를 대상으로 하는 경구 투여용 백신 조성물에 있어서,
녹말을 포함하는 하이드로겔; 및 상기 하이드로겔에 의해 캡슐화된 불활성화 균체;를 유효성분으로 포함하고,
상기 하이드로겔은 pH의 변화에 따라 가역적으로 팽창 또는 수축하여 크기가 변화하되,
상기 육식성 어류의 장내 pH보다 낮은 pH 범위에서 수축하고, 상기 장내 pH 범위 이상에서 팽창하여 분해되는 것을 특징으로 하는 경구 투여용 백신 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 불활성화 균체는 포르말린 사균(formalin-killed cell-cultured)인 것을 특징으로 하는 경구 투여용 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 불활성화 균체는 어류의 세균성 질병의 병원체 또는 바이러스성 질병의 병원체인 것을 특징으로 하는 경구 투여용 백신 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 육식성 어류는 뱀장어, 넙치(광어), 조피볼락, 우럭, 감성돔, 참돔, 능성어, 숭어, 농어, 전어, 고등어, 전갱이, 쥐치로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 경구 투여용 백신 조성물.