IT201900012540A1

IT201900012540A1 - Inibitori di CHI3L1 e loro usi

Info

Publication number: IT201900012540A1
Application number: IT102019000012540A
Authority: IT
Inventors: Maria Rescigno; Giuseppe Penna; Abbass Darwich
Original assignee: Humanitas Mirasole Spa; Humanitas Univ
Priority date: 2019-07-22
Filing date: 2019-07-22
Publication date: 2021-01-22
Also published as: WO2021013884A1; EP4003415B1; US20220370608A1; EP4003415A1; CA3147702A1

Description

Inibitori di CHI3L1 e loro usi

SETTORE TECNICO

La presente invenzione si riferisce a un soppressore o inibitore dell'espressione e/o dell'attività della chitinasi 3-simile 1 (CHI3L1) per l'uso nella prevenzione e/o nel trattamento di tumori, in cui detti tumori sono resistenti alle terapie dipendenti da citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC) e/o per l'uso nella riduzione del rischio di sviluppare resistenza alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC). TECNICA DI SFONDO

Trastuzumab e pertuzumab bersagliano il recettore 2 per il fattore di crescita epidermico umano (HER2) che è sovraespresso nel 20% circa dei tumori al seno ed è associato a prognosi clinica e sopravvivenza del paziente scarse. Nonostante il buon miglioramento della sopravvivenza libera da progressione ottenuto combinando questi anticorpi, metà dei pazienti progredisce ancora in meno di due anni. Ciò evidenzia la necessità di capire come si verifica la resistenza nonostante l'efficiente blocco del segnale HER2 da parte dei due anticorpi.

WO2011127297 riguarda metodi di trattamento del cancro, in particolare del carcinoma mammario, e in particolare del carcinoma mammario HER2/ErbB2 positivo utilizzando un inibitore di FoxM1 in associazione con trastuzumab e/o paclitaxel, composizioni farmaceutiche comprendenti un inibitore di FoxM1 in presenza di trastuzumab e/o paclitaxel e metodi per identificare e trattare il carcinoma resistente a trastuzumab e/o paclitaxel e per promuovere il differenziamento delle cellule tumorali mammarie. Poiché FOXM1 è un fattore di trascrizione, il suo bersagliamento risulta complesso, soprattutto in vivo. Inoltre, l'inibizione di FoxM1 è stata dimostrata ostacolare il processo di guarigione, come nel caso delle lesioni epatiche<1>. Inoltre, FOXM1 esiste in 4 isoforme e non è chiaro come avvengano l'interazione e il passaggio tra isoforme tra FOXM1a e FOXM1b o FOXM1c o FOXM1d.

Pertanto, si avverte tuttora la necessità di un agente terapeutico in grado di trattare pazienti che non rispondono o sono resistenti alle terapie comuni.

SOMMARIO DELL’INVENZIONE

Un importante meccanismo mediante il quale agiscono gli anticorpi anti-HER2 summenzionati è il miglioramento aggiuntivo della citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC) da parte delle cellule NK. Pertanto, gli inventori hanno ipotizzato che una compromissione dell'ADCC delle cellule NK potrebbe essere un potenziale meccanismo di resistenza alla terapia mirata a HER2.

Per verificarlo, gli inventori hanno ottenuto sieri da pazienti con carcinoma mammario HER2+ sotto terapia adiuvante con trastuzumab al basale e durante il trattamento. Cellule NK di donatori sani sono state quindi esposte a sieri di pazienti con remissione completa (CR) o malattia progressiva (PD) ed è stata misurata la loro attività ADCC. È stata quindi condotta un'analisi proteomica dei sieri dei due gruppi di pazienti (PD rispetto a RC) per rivelare molecole espresse in modo differenziale.

Gli inventori hanno osservato che la progressione della malattia al trattamento con trastuzumab era associata alla capacità dei sieri dei pazienti con malattia progressiva (PD) di inibire l'ADCC di cellule NK sane (fig. 1). Gli inventori hanno scoperto che la proteina chitinasi 3-simile 1 (CHI3L1) era ad alti livelli nei sieri dei pazienti PD, rispetto ai pazienti CR e ai controlli sani (fig. 2), quindi hanno dimostrato che la proteina CHI3L1 ricombinante inibisce direttamente l'ADCC mediata da trastuzumab delle cellule NK in vitro (fig. 3). Infine, gli inventori potrebbero invertire questa inibizione aggiungendo due diversi ligandi neutralizzanti di CHI3L1, uno specifico anticorpo monoclonale e la forma solubile del suo recettore, il recettore alfa 2 dell'interleuchina 13 (IL13ra2) (fig. 4).

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce ai ligandi, come anticorpi monoclonali o recettori solubili ingegnerizzati di CHI3L1/YKL-40, che sono in grado di ripristinare l'attività ADCC delle cellule NK neutralizzando l'attività CHI3L1/YKL40, per il trattamento di una malattia in cui l'attività ADCC delle cellule NK è un prerequisito per una terapia efficace. Ad esempio, in combinazione con trastuzumab per prevenire o superare la resistenza al trattamento nel carcinoma mammario Her2.

Gli inventori mostrano che CHI3L1 è presente ad alti livelli nei sieri dei pazienti resistenti al trastuzumab. I sieri di questi pazienti inibiscono l'attività ADCC delle cellule NK, che si è dimostrata dannosa per l'attività di trastuzumab nei pazienti. Gli inventori stabiliscono il collegamento mostrando un nuovo ruolo di CHI3L1 nell'inibizione diretta dell'ADCC delle cellule NK. Questo è un potenziale meccanismo di resistenza alla terapia mirata a HER2 ma anche a qualsiasi terapia dipendente dall'ADCC. La combinazione di trastuzumab/pertuzumab e ligandi mirati a CHI3L1 può rappresentare un nuovo approccio per evitare o superare la resistenza.

È quindi uno scopo della presente invenzione un soppressore o inibitore dell'espressione e/o dell'attività della chitinasi 3-simile 1 (CHI3L1) per l'uso nella prevenzione e/o nel trattamento dei tumori,

in cui detti tumori sono resistenti alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC)

e/o per l'uso nella riduzione del rischio di sviluppare resistenza alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC).

Detta citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC) è preferibilmente di cellule NK.

Preferibilmente, il tumore è un tumore che è resistente alle terapie anticorpali anti-HER2 o anti-CD20 o anti-GD20 o anti-CCR4 o anti-EGFR. Più preferibilmente il tumore è resistente a trastuzumab, pertuzumab, rituximab, dinituximab, obinutuzumab, mogamulizumab, cetuximab e/o panitumumab.

Preferibilmente, il tumore è un tumore al seno comprendente cellule tumorali HER2 positive che è resistente alle terapie anti-HER2, più preferibilmente è resistente a trastuzumab e/o pertuzumab.

Detto soppressore o inibitore è preferibilmente in grado di ripristinare la citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC) delle cellule NK.

In una forma di realizzazione preferita dell'invenzione, il soppressore o l'inibitore è almeno una molecola selezionata dal gruppo costituito da:

a) un anticorpo o un suo frammento;

b) un polipeptide;

c) una piccola molecola;

d) un polinucleotide codificante per detto anticorpo o polipeptide o un suo derivato funzionale; e) un polinucleotide, come un costrutto antisenso, un oligonucleotide antisenso, un costrutto pe “RNA interference” o siRNA,

e) un vettore comprendente o esprimente il polinucleotide come definito in d) o e);

f) un componente di CRISPR/Cas9, ad esempio un sgRNA;

g) una cellula ospite geneticamente modificata che esprime detto polipeptide o anticorpo o comprendente il polinucleotide come definito in d) o e) o almeno un componente di f).

Preferibilmente, detto soppressore o inibitore è un anticorpo anti-CHI3L1, più preferibilmente un anticorpo monoclonale, ancor più preferibilmente il clone mAY, o un inibitore del recettore CHI3L1, o la forma solubile del recettore CHI3L1, preferibilmente il recettore alfa 2 dell'interleuchina 13 (), o il recettore per i prodotti finali di glicazione avanzata (RAGE).

Esempi di inibitori del recettore CHI3L1 sono:

� Inibitori dell'interazione RAGE-ligando o della segnalazione RAGE: inibitori a piccole molecole (ad es. azeliragon), RAGE solubile ricombinante (sRAGE), inibitori dell'interazione del dominio citoplasmatico ctRAGE con la molecola di segnalazione Diaphanus-1 (DIAPH-1), peptidi antagonisti di RAGE, anticorpi bloccanti RAGE, cellule T CAR specifiche per RAGE o cellule NK CAR.

● Inibitori di IL13ra2: IL13Ra2 solubile ricombinante (sIL13Ra2), anticorpi bloccanti IL13ra2, cellule CAR T o CAR NK specifiche per Il13Ra2.

In una forma di realizzazione preferita, il soppressore o l'inibitore viene usato in combinazione con almeno un anticorpo terapeutico che è capace di citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC), ad esempio un anticorpo anti-HER2, anti-CD20, anti-CCR4 e/o anti-EGFR, più preferibilmente con trastuzumab, pertuzumab, rituximab, dinituximab, obinutuzumab, mogamulizumab, panitumumab e/o cetuximab, più preferibilmente trastuzumab e/o pertuzumab.

Un altro scopo dell'invenzione è una composizione farmaceutica comprendente:

i. almeno un soppressore o inibitore dell'espressione e/o dell'attività della chitinasi 3-simile 1 (CHI3L1) come definito sopra,

ii. almeno un anticorpo terapeutico capace di citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC) e

iii. almeno un eccipiente, diluente o veicolo farmaceuticamente accettabile

per l'uso nella prevenzione e/o nel trattamento dei tumori,

Preferibilmente detto anticorpo che è capace di citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC) è almeno un anticorpo selezionato dal gruppo costituito da: trastuzumab, pertuzumab, rituximab, dinituximab, obinutuzumab, mogamulizumab, panitumumab e cetuximab, preferibilmente trastuzumab e/o pertuzumab.

Preferibilmente, detta composizione farmaceutica comprende inoltre un agente terapeutico, in cui detto agente terapeutico è per il trattamento e/o la prevenzione dei tumori.

Preferibilmente, il tumore è un tumore resistente alle terapie anticorpali anti-HER2, anti-CD20, anti-GD20, anti-CCR4 o anti-EGFR, più preferibilmente il tumore è resistente a trastuzumab, pertuzumab, rituximab, dinituximab, obinutuzumab, mogamulizumab, cetuximab e/o panitumumab.

Più preferibilmente, il tumore è un tumore al seno comprendente cellule tumorali HER2 positive che è resistente alle terapie anti-HER2, preferibilmente è resistente a trastuzumab e/o pertuzumab.

Un altro scopo dell'invenzione è un metodo in vitro per identificare il paziente con un tumore che è resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC), comprendente i passaggi di:

a) rilevamento di CHI3L1 in un campione biologico isolato ottenuto dal paziente e

b) confronto rispetto a un controllo adeguato,

in cui una quantità di CHI3L1 nel campione biologico isolato ottenuto dal soggetto superiore alla quantità di controllo indica che il tumore è resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC).

Un ulteriore scopo dell'invenzione è un metodo in vitro per la prognosi e/o la diagnosi e/o la valutazione del rischio di sviluppo e/o per il monitoraggio della progressione e/o per il monitoraggio dell'efficacia di un trattamento terapeutico e/o per lo screening di un trattamento terapeutico di un tumore resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC) in un soggetto comprendente i passaggi di:

a) rilevamento di CHI3L1 in un campione biologico isolato ottenuto dal soggetto e

b) confronto rispetto a un controllo adeguato.

Nel metodo sopra, preferibilmente il passaggio a) comprende la misurazione della quantità del CHI3L1 o dei suoi frammenti o del polinucleotide codificante per detta proteina (DNA o mRNA) o dei suoi frammenti in detto campione biologico isolato ottenuto dal soggetto e il passaggio b) comprende il confronto della quantità misurata del passaggio a) con una quantità di controllo adeguata.

Un altro scopo dell'invenzione è un kit per eseguire i metodi sopra descritti, comprendente - mezzi per misurare la quantità o l'attività di CHI3L1 o di suoi frammenti e/o mezzi per misurare la quantità del polinucleotide codificante per detta proteina o di suoi frammenti e, facoltativamente,

- mezzi di controllo.

I mezzi di controllo possono essere usati per confrontare la quantità o l'aumento della quantità di CHI3L1 con un controllo adeguato. Il controllo adeguato può essere ottenuto, ad esempio, con riferimento a standard noti, da un soggetto normale o da una popolazione normale, o da un soggetto che presenta un tumore che non è resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC).

I mezzi per misurare la quantità di CHI3L1 come sopra definito sono preferibilmente almeno un anticorpo, un suo analogo funzionale o suoi derivati. Detto anticorpo, suo analogo funzionale o suoi derivati sono specifici per detto marcatore.

In una forma di realizzazione preferita, il kit dell'invenzione comprende:

- un anticorpo fatto aderire alla fase solida specifico per detto composto;

- mezzi di rilevamento del complesso marcatore specifico del ligando.

In alternativa, i reagenti possono essere forniti come un kit comprendente reagenti in sospensione o in forma sospendibile, ad esempio reagenti legati a sfere adatte per la citometria a flusso, preferibilmente sfere magnetiche con rivestimento di anticorpi di cattura. Le istruzioni possono comprendere istruzioni per condurre un saggio di citometria a flusso basato su anticorpo.

I mezzi di rilevamento sono preferibilmente mezzi in grado di rilevare e/o misurare la quantità dei marcatori descritti, ad esempio mezzi in grado di rilevare il complesso anticorpoantigene, come anticorpi secondari coniugati con enzima, substrati luminescenti, sfere magnetiche con rivestimento di anticorpi di cattura, cocktail di anticorpi essiccati personalizzati e/o colonne con cartucce dotate di filtro dimensionale e/o combinate con filtri anticorpali specifici (SAF). Altri mezzi possono essere ad esempio primer e sonde specifici per RT PCR.

In una forma di realizzazione, il metodo comprende inoltre la selezione di un regime terapeutico basato sull'analisi. In una forma di realizzazione, il metodo comprende inoltre la determinazione di un regime di trattamento per il soggetto basato sull'analisi. I kit secondo l'invenzione possono inoltre comprendere ausiliari consueti, come tamponi, supporti, marcatori, ecc. e/o istruzioni per l'uso.

Nel contesto della presente invenzione, il termine "rilevamento" può essere inteso anche come "misurazione della quantità" o "misurazione dell'alterazione". Nel caso di un metodo o di un kit per valutare il rischio e/o la diagnosi e/o la prognosi di un tumore resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC), il controllo adeguato può essere un campione prelevato da un paziente sano o da un paziente affetto da un altro disturbo o un'altra patologia o da un paziente affetto da un tumore che non è resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC), e la quantità o l'attività di controllo appropriata può essere la quantità o l'attività della stessa proteina o dello stesso polinucleotide misurata in un campione prelevato da un paziente sano o da un paziente affetto da un altro disturbo o un'altra patologia o da un paziente affetto da un tumore che non è resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC).

Nel caso di un metodo o di un kit per monitorare la progressione di un tumore resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC), viene monitorato lo sviluppo del tumore e il controllo adeguato può essere un campione prelevato dallo stesso soggetto in varie occasioni o da un altro paziente e la quantità o attività di controllo appropriata può essere determinata dalla quantità o attività della stessa proteina o dello stesso polinucleotide misurati in un campione prelevato dallo stesso soggetto in varie occasioni o da un altro paziente.

Nel metodo sopra, preferibilmente il passaggio a) comprende la misurazione della quantità di CHI3L1 o dei suoi frammenti o del polinucleotide codificante per detta proteina (DNA o mRNA) o dei suoi frammenti in detto campione biologico isolato ottenuto dal soggetto e il passaggio b) comprende il confronto della quantità misurata del passaggio a) con una quantità di controllo adeguata.

Preferibilmente, il metodo in vitro per monitorare la progressione e/o per monitorare l'efficacia di un trattamento terapeutico di un tumore resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC), come sopra definito, comprende i passaggi di:

a) misurazione dell'alterazione della quantità o dell'alterazione dell'attività di CHI3L1 o dei suoi frammenti o del polinucleotide codificante per dette proteine o loro frammenti in detto campione biologico isolato ottenuto dal soggetto e

b) confronto dell'alterazione misurata del passaggio a) con un'adeguata alterazione del controllo.

Nel caso di un metodo o di un kit per il monitoraggio dell'efficacia di un trattamento terapeutico, il controllo adeguato può essere un campione prelevato dallo stesso soggetto prima dell'inizio della terapia o prelevato in vari momenti durante il corso della terapia e la quantità o l'attività adeguate di controllo possono essere la quantità o l'attività della stessa proteina o dello stesso polinucleotide misurate in un campione prelevato dallo stesso soggetto prima dell'inizio della terapia o prelevato in vari momenti nel corso della terapia.

Nel caso di un metodo o di un kit per lo screening di un trattamento terapeutico, il controllo adeguato può essere un campione prelevato da soggetti non trattati e da soggetti trattati con una sostanza da saggiare o da soggetti trattati con un trattamento di riferimento e la giusta quantità o attività di controllo può essere la media delle quantità o dell'attività della stessa proteina o dello stesso polinucleotide misurati in campioni prelevati da soggetti senza trattamento e da soggetti trattati con una sostanza da analizzare o da soggetti trattati con un trattamento di riferimento. In questo caso, se la quantità o l'attività di CHI3L1 o del suo polinucleotide nel campione biologico isolato ottenuto dal soggetto è inferiore o uguale alla quantità o all'attività di controllo, questo può indicare che la sostanza testata è efficace per il trattamento del tumore.

Nella presente invenzione, l'espressione "misurazione della quantità" può essere intesa come misurazione della quantità (o dell'attività) o della concentrazione o del livello della rispettiva proteina e/o del suo mRNA e/o del suo DNA, preferibilmente semiquantitativi o quantitativi. La misurazione di una proteina può essere eseguita direttamente o indirettamente.

La misurazione diretta si riferisce alla misura della quantità o della concentrazione del marcatore, basata su un segnale ottenuto direttamente dalla proteina e che è direttamente correlata al numero di molecole proteiche presenti nel campione. Questo segnale, che può anche essere indicato come segnale di intensità, può essere ottenuto, ad esempio, misurando un valore di intensità di una proprietà chimica o fisica del marcatore. Le misurazioni indirette comprendono la misurazione ottenuta da un componente secondario (ad esempio, un componente diverso dal prodotto di espressione genica) e un sistema di misurazione biologico (ad esempio la misurazione di risposte cellulari, ligandi, "tag" o prodotti di reazione enzimatica).

Il termine "quantità", come usato nella descrizione, si riferisce, ma non è limitato alla quantità assoluta o relativa di proteine e/o mRNA e/o DNA dello stesso, e qualsiasi altro valore o parametro associato alle stesse o che può derivare da questi. Tali valori o parametri comprendono valori di intensità del segnale ottenuti dalle proprietà fisiche o chimiche della proteina, ottenuti mediante misurazione diretta, ad esempio valori di intensità in un saggio immunologico, in una spettroscopia di massa o in una risonanza magnetica nucleare. Inoltre, questi valori o parametri includono quelli ottenuti mediante misurazione indiretta, ad esempio uno qualsiasi dei sistemi di misurazione qui descritti. I metodi per la misurazione di mRNA e DNA nei campioni sono noti nel ramo. Per misurare i livelli di acido nucleico, le cellule in un campione di test possono essere lisate e i livelli di mRNA nei lisati o nell'RNA purificato o semipurificato dai lisati possono essere misurati con qualsiasi varietà di metodi familiare agli esperti del ramo. Tali metodi includono saggi di ibridazione che utilizzano sonde di DNA o RNA marcate in modo rilevabile (ad es. Northern blotting) o metodologie RT-PCR quantitative o semiquantitative che utilizzano primer oligonucleotidici appropriati. In alternativa, è possibile eseguire saggi di ibridazione in situ quantitativi o semiquantitativi utilizzando, ad esempio, sezioni di tessuto o sospensioni cellulari non lisate e sonde di DNA o RNA marcate in modo rilevabile (ad esempio marcate a fluorescenza o con enzimi). Ulteriori metodi per la quantificazione dell'mRNA includono il saggio di protezione dell'RNA (RPA), i microarray di cDNA e oligonucleotidi, l'analisi delle differenze di rappresentazione (RDA), la visualizzazione differenziale, l'analisi della sequenza EST e l'analisi seriale dell'espressione genica (SAGE).

Se confrontando la quantità o l'attività misurata della CHI3L1 o del polinucleotide codificante per detta proteina con la quantità o l'attività ottenuta da un campione di controllo, la quantità o l'attività di detto marcatore nel campione isolato dal soggetto corrisponde a un valore più elevato, il soggetto può presentare un tumore resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi(ADCC) o andare verso un aggravamento di detta malattia.

Se confrontando la quantità o l'attività misurata dei suddetti marcatori o del polinucleotide codificante per detta proteina con la quantità o l'attività ottenuta da un campione di controllo, la quantità o l'attività di detto marcatore nel campione isolato dal soggetto corrisponde a un valore simile o più basso, il soggetto potrebbe rispettivamente non essere affetto da un tumore resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi(ADCC) o andare verso un miglioramento di detto tumore.

In alternativa, l'espressione "rilevare" o "misurare la quantità" è intesa come misurazione dell'alterazione della molecola. Detta alterazione può riflettere un aumento o una diminuzione della quantità o dell'attività delle molecole come sopra definito. Un aumento della proteina o dell'attività di CHI3L1 o del polinucleotide che codifica per detto marcatore può essere correlato a un aggravamento del cancro. Una riduzione della proteina o dell'attività di CHI3L1 o del polinucleotide che codifica per detta proteina può essere correlata a un miglioramento del cancro o a un recupero del soggetto.

Il termine "soppressore o inibitore dell'espressione e/o dell'attività della chitinasi 3-simile 1 (CHI3L1)" come usato nel presente documento si riferisce a un composto chimico o a una molecola biologica che riduce l'espressione della chitinasi 3-simile 1 o inibisce l'attività della chitinasi 3-simile 1 in una cellula.

Il soppressore o l'inibitore dell'espressione e/o dell'attività della chitinasi 3-simile 1 (CHI3L1) può anche essere usato per indurre la citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC) in un soggetto.

Nel contesto della presente invenzione, "l'attività della chitinasi 3-simile 1 (CHI3L1)" comprende ad esempio:

- l'inibizione dell'ADCC delle cellule NK e della citotossicità naturale

- l'alterazione della corretta polarizzazione dei microtubuli e dei granuli litici rispetto alla sinapsi immunitaria legando e modulando la segnalazione del recettore per i prodotti finali di glicazione avanzata (RAGE)

- lo svuotamento di granuli litici non verso un bersaglio

- l'inibizione della citotossicità delle cellule T CD8 T.

Nel contesto della presente invenzione, un campione è preferibilmente un campione di siero o plasma, preferibilmente da un paziente con carcinoma mammario che è HER2 positivo.

Il rilevamento di CHI3L1 viene preferibilmente effettuato utilizzando un reagente che rileva specificamente CHI3L1.

Nel metodo secondo l'invenzione, una quantità di CHI3L1 nel campione biologico isolato ottenuto dal soggetto superiore alla quantità di controllo indica che il soggetto ha una prognosi sfavorevole e/o che è resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC), ad es. trastuzumab, pertuzumab, rituximab, dinituximab, obinutuzumab, mogamulizumab, panitumumab e/o cetuximab.

Preferibilmente, il campione biologico è un campione di fluido, una cellula o un tessuto, più preferibilmente detto campione è plasma o siero.

Il termine "campione biologico" comprende un campione clinico e comprende anche tessuti ottenuti mediante resezione chirurgica, tessuti ottenuti mediante biopsia, cellule in coltura, surnatanti cellulari, lisati cellulari, campioni di tessuto, organi, midollo osseo, sangue, plasma, siero e simili.

Un "campione" nel contesto dei presenti insegnamenti si riferisce a qualsiasi campione biologico che è isolato da un soggetto. Un campione può includere, a titolo esemplificativo, un'aliquota di fluido corporeo, sangue intero, siero, plasma, campioni di tessuto solido come biopsie di tessuti o colture di tessuti o cellule da esse derivate e loro progenie, liquido sinoviale, fluido linfatico, fluido di ascite e fluido interstiziale o extracellulare. Il termine "campione" comprende anche il fluido negli spazi intercellulari, tra cui liquido crevicolare gengivale, midollo osseo, liquido cerebrospinale (CSF), saliva, muco, espettorato, sperma, sudore, urina o altri fluidi corporei. Il "campione di sangue" può riferirsi al sangue intero o a qualsiasi sua frazione, inclusi siero e plasma. I campioni possono essere ottenuti da un soggetto mediante mezzi tra cui, senza limitazione, venipuntura, escrezione, eiaculazione, massaggio, biopsia, ago aspirato, lavaggio, raschiatura, incisione chirurgica o intervento o altri mezzi noti nel ramo. La definizione include anche campioni che sono stati manipolati in qualsiasi modo dopo la loro acquisizione, ad esempio mediante trattamento con reagenti, lavaggio o arricchimento per determinate popolazioni cellulari, come le cellule o i campioni cancerosi in cui le cellule T regolatrici vengono isolate e quindi analizzate. La definizione include anche campioni che sono stati arricchiti per particolari tipi di molecole, ad esempio acidi nucleici, polipeptidi ecc.

- mezzi di controllo.

Il metodo sopra preferibilmente comprende inoltre i passaggi di ottenere un campione di controllo da un soggetto e saggiare il campione di controllo per rilevare l'espressione di CHI3L1 in esso, in cui il cancro nel paziente è resistente al trastuzumab se l'espressione di CHI3L1 è maggiore nel campione del paziente rispetto all'espressione di CHI3L1 nel campione di controllo.

Preferibilmente, il reagente di cui sopra comprende uno o più primer specifici di CHI3L1 e il livello di espressione di CHI3L1 è determinato dalla reazione a catena della polimerasi con retro-trascrittasi (RT-PCR).

In alternativa, il reagente sopra può essere un anticorpo specifico per CHI3L1 e il livello di espressione di CHI3L1 è determinato da un saggio immunologico.

Per selezionare i pazienti che possono essere trattati con la presente composizione farmaceutica, è possibile eseguire i seguenti passaggi:

(a) ottenimento di un campione da un paziente che necessita del trattamento;

(b) rilevamento dell'espressione di CHI3L1 nel campione usando un reagente che rileva specificamente CHI3L1;

(c) ottenimento di un campione di controllo; e

(d) saggio del campione di controllo per rilevare l'espressione di CHI3L1 in esso, in cui un inibitore di CHI3L1 viene somministrato al paziente con trastuzumab se l'espressione di CHI3L1 nel campione è maggiore dell'espressione di CHI3L1 nel campione di controllo.

I mezzi di controllo possono essere usati per confrontare la quantità o l'aumento della quantità di CHI3L1 con un controllo adeguato. Il controllo adeguato può essere ottenuto, ad esempio, con riferimento a standard noti, da un soggetto normale o da una popolazione normale, o da un soggetto affetto da un tumore che non è resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC).

I mezzi per misurare la quantità di CHI3L1 come sopra definito sono preferibilmente almeno un anticorpo, un suo analogo funzionale o suoi derivati. Detto anticorpo, suo analogo funzionale o suoi derivati sono specifici per detto CHI3L1.

Il termine "campione di controllo" come qui usato può essere un campione di tessuto mammario normale, non canceroso, ottenuto da un sito prossimale o distale del tessuto mammario da un paziente con carcinoma mammario o un campione di tessuto da un tumore che non è resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC). Può anche essere ottenuto da un individuo non affetto da carcinoma mammario. Allo stesso modo, il termine "campione di tessuto di controllo" si riferisce a un campione di tessuto corrispondente da un individuo non affetto da cancro o un campione di tessuto non canceroso da un sito prossimale o distale del tessuto da un paziente affetto da cancro o un campione di tumore che non è resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC).

Nel metodo secondo l'invenzione, una quantità di CHI3L1 nel campione biologico isolato ottenuto dal soggetto superiore alla quantità di controllo indica che il soggetto ha una prognosi sfavorevole o che è affetto da un tumore resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC) o è a rischio di sviluppare un tumore resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC).

Con il termine "soppressore o inibitore" si intende una molecola che opera un cambiamento nell'espressione e/o nella funzione del bersaglio. Il cambiamento è relativo al livello normale o basale di espressione e/o funzione in assenza del soppressore o dell'inibitore, ma altrimenti in condizioni simili, e rappresenta una diminuzione dell'espressione e/o della funzione normale/basale.

La soppressione o l'inibizione dell'espressione e/o della funzione del bersaglio può essere valutata con qualsiasi mezzo noto agli esperti del ramo. La valutazione del livello di espressione o della presenza del bersaglio viene eseguita preferibilmente utilizzando tecniche di biologia molecolare classiche come (reazione a catena della polimerasi in tempo reale) qPCR, microarray, array di sferette, analisi di protezione da RNAsi o analisi Northern blot o clonazione e sequenziamento.

La valutazione della funzione bersaglio viene preferibilmente eseguita mediante saggio di soppressione in vitro, analisi del trascrittoma intero, analisi della spettrometria di massa per identificare le proteine che interagiscono con il bersaglio.

Nel contesto della presente invenzione, il bersaglio può essere il gene, l'mRNA, il cDNA o la sua proteina codificata, inclusi frammenti, derivati, varianti, isoforme ecc. Preferibilmente, il bersaglio (ovvero CHI3L1) è caratterizzato dal rispettivo numero di accesso e/o dalle rispettive sequenze di amminoacidi e nucleotidi descritte in questa sede.

I polinucleotidi come sopra descritto, come ad esempio i siRNA, possono inoltre comprendere sporgenze dTdT o UU 3′ e/o modificazioni dello scheletro di nucleotidi e/o polinucleotidi come descritto altrove nel presente documento. Nel contesto della presente invenzione, il termine "polinucleotide" include molecole di DNA (ad es. CDNA o DNA genomico) e molecole di RNA (ad es. MRNA, siRNA, shRNA) e analoghi di DNA o RNA generati usando analoghi nucleotidici. Il polinucleotide può essere a singolo filamento o a doppio filamento. Gli inibitori dell'RNAi come sopra definiti sono preferibilmente in grado di ibridarsi in tutto o in parte alla sequenza bersaglio specifica. Pertanto, gli inibitori dell'RNAi possono essere completamente o parzialmente complementari a tutta la sequenza bersaglio o a parte di essa. Gli inibitori dell'RNAi possono ibridarsi alla sequenza bersaglio specificata in condizioni di rigore medio-alto. Un inibitore di RNAi può essere definito con riferimento a una specifica identità di sequenza al complemento inverso della sequenza che questo intende bersagliare. Le sequenze antisenso avranno tipicamente almeno il 75% circa, preferibilmente almeno l'80% circa, almeno l'85% circa, almeno il 90% circa, almeno il 95% circa o almeno il 99% circa dell'identità di sequenza con i complementi inversi delle loro sequenze bersaglio.

Nel contesto della presente invenzione, il termine "CHI3L1" comprende il polinucleotide (ad esempio il gene) e il suo polipeptide (o la sua proteina).

I termini "polinucleotide" e "polipeptide" comprendono anche loro derivati e frammenti funzionali. Il polinucleotide può essere sintetizzato usando analoghi o derivati dell'oligonucleotide (ad esempio nucleotidi di inosina o fosforotioato).

Nel contesto della presente invenzione, i geni/le proteine come sopra definiti sono preferibilmente caratterizzati dalle sequenze identificate dai loro ID gene NCBI e dai numeri d'accesso Gen Bank. Il termine "gene" comprende anche corrispondenti geni ortologhi od omologhi, isoforme, varianti, varianti alleliche, derivati funzionali, loro frammenti funzionali. L'espressione "proteina" intende includere anche la corrispondente proteina codificata da corrispondenti geni ortologhi od omologhi, mutanti funzionali, derivati funzionali, frammenti funzionali o analoghi, loro isoforme.

Nel contesto della presente invenzione, il termine "polipeptide" o "proteina" include: i. la proteina intera, le relative varianti alleliche e i relativi ortologhi;

ii. qualsiasi frammento funzionale sintetico, ricombinante o proteolitico;

iii. qualsiasi equivalente funzionale, come ad esempio analoghi funzionali sintetici o ricombinanti.

Gli anticorpi sopra definiti comprendono anticorpi monoclonali umani e animali o loro frammenti, anticorpi a catena singola e loro frammenti e mini-anticorpi, anticorpi bispecifici, diabody, triabody o di-, oligo- o multimeri di questi. Sono anche inclusi peptidomimetici o peptidi derivati dagli anticorpi secondo l'invenzione, ad esempio essi comprendono una o più regioni CDR, preferibilmente la regione CDR3. Sono inoltre inclusi anticorpi monoclonali umani e sequenze peptidiche che, sulla base di una connessione di attività strutturale, sono prodotti attraverso un processo di modellizzazione artificiale (Greer J. et al., J. Med. Chem., 1994, Vol.

37, pagg. 1035-1054).

Preferibilmente, l'anticorpo viene selezionato dal gruppo costituito da un'immunoglobulina (o anticorpo) intatta, un Fv, un scFv (frammento Fv a catena singola), un Fab, un F(ab')2, un dominio simile ad un anticorpo, un dominio anticorpo-mimetico, un singolo dominio di anticorpo, un anticorpo multimerico, un peptide o un frammento proteolitico contenente la regione di legame dell'epitopo. Il termine "anticorpo" nella presente invenzione è usato nel senso più generale e comprende vari anticorpi e strutture mimetiche di anticorpi, tra cui, senza limitazioni, anticorpi monoclonali, anticorpi policlonali, anticorpi multispecifici (ad esempio, anticorpi bispecifici), anticorpi umani, anticorpi umanizzati, anticorpi deimmunizzati, anticorpi chimerici, nanobody, derivati di anticorpi, frammenti di anticorpi, anticaline, DARPin, affibody, affiline, affimeri, affitine, alphabody, avimeri, fonomeri, minibody e altri domini vincolanti, purché mostrino l'attività di legame desiderata per l'antigene. Un "frammento di anticorpo" si riferisce a una molecola diversa da un anticorpo intatto che comprende una porzione di un anticorpo intatto che lega l'antigene a cui si lega l'anticorpo intatto. Esempi di frammenti di anticorpi includono, ma senza limitazioni, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diabody; anticorpi lineari; molecole di anticorpi a catena singola (es. scFv); e anticorpi multispecifici costituiti da frammenti di anticorpi. Fv di VH e VL sono anche chiamati "nanobody". Il termine "anticorpo mimetico" si riferisce a quei composti organici o domini di legame che non sono derivati di anticorpi ma che possono legarsi specificamente a un antigene, allo stesso modo degli anticorpi. Essi includono anticaline, DARPin, affibody, affiline, affimeri, affitine, alphabody, avimeri, finomeri, minibody e altri. Il termine anticorpo "chimerico" si riferisce a un anticorpo in cui una parte della catena pesante e/o leggera è derivata da una sorgente o specie specifica, mentre il resto della catena pesante e/o leggera è derivato da una sorgente o specie diversa.

Nel contesto della presente invenzione, l'anticorpo della presente invenzione include modifiche dell'anticorpo secondo la presente invenzione in grado di mantenere la specificità sopra menzionata. Queste modifiche includono, ad esempio, la coniugazione con molecole effettrici come agenti chemioterapici o citotossici e/o porzioni di reporter rilevabili.

Il termine "anticorpi" può anche comprendere agenti che sono stati ottenuti mediante analisi di dati relativi alle relazioni struttura-attività. Questi composti possono anche essere usati come peptidomimetici (Grassy G. et al., Nature Biotechnol., 1998, Vol.16, pagg.748-752; Greer J. et al., J. Med. Chem., 1994, Vol. 37, pagg. 1035-1054).

Il termine "anticorpo" può anche includere proteine prodotte dall'espressione di una regione codificata da immunoglobulina alterata in una cellula ospite, ad esempio "anticorpi tecnicamente modificati" come anticorpi sintetici, anticorpi chimerici o umanizzati, o loro miscele, o frammenti di anticorpi a cui manca parzialmente o completamente la regione costante, ad esempio Fv, Fab, Fab' o F(ab)'2 ecc. In questi anticorpi tecnicamente modificati, ad esempio, una o più parti della catena leggera e/o pesante possono essere sostituite. Tali molecole possono, ad esempio, comprendere anticorpi costituiti da una catena pesante umanizzata e una catena leggera non modificata (o catena leggera chimerica), o viceversa. I termini Fv, Fc, Fd, Fab, Fab' o F(ab)2 sono usati come descritto nella tecnica nota (Harlow E. e Lane D., in "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

La presente invenzione comprende anche l'uso di frammenti Fab o frammenti F(ab)2 che sono derivati da anticorpi monoclonali (mAb), che sono diretti contro CHI3L1. Preferibilmente, le regioni quadro eterologhe e le regioni costanti sono selezionate tra le classi e gli isotipi di immunoglobuline umane, come IgG (sottotipi da 1 a 4), IgM, IgA e IgE. Nel corso della risposta immunitaria, può verificarsi un cambio di classe delle immunoglobuline, ad esempio un passaggio da IgM a IgG; in ciò, le regioni costanti vengono scambiate, ad esempio da� a y. Un cambio di classe può anche essere causato in modo diretto mediante metodi di ingegneria genetica ("ricombinazione diretta di cambio di classe"), come è noto dalla tecnica nota (Esser C. e Radbruch A., Annu. Rev. Immunol., 1990, Vol.8, pagg.717-735). Tuttavia, gli anticorpi secondo la presente invenzione non devono necessariamente comprendere sequenze esclusivamente umane delle proteine delle immunoglobuline.

Gli anticorpi della presente invenzione includono anche quelli per i quali le caratteristiche di legame sono state migliorate da mutazioni dirette, metodi di maturazione dell'affinità, visualizzazione dei fagi. L'affinità o la specificità possono essere modificate o migliorate da mutazioni in uno qualsiasi dei CDR anticorpali della presente invenzione.

Il dominio simile agli anticorpi comprende proteine di legame strutturalmente correlate agli anticorpi, come i recettori delle cellule T. Gli anticorpi della presente invenzione includono anche equivalenti funzionali che includono polipeptidi con sequenze di amminoacidi sostanzialmente identiche alla sequenza di amminoacidi delle regioni variabili o ipervariabili degli anticorpi della presente invenzione. L'anticorpo dell'invenzione può ad esempio avere una costante di dissociazione (KD) <100 nM, <10 nM, <1 nM, <0,1 nM, <0,01 nM o <0,001 nM o inferiore, ad es. da 10 -8 M a 10 -13 M, ad esempio, da 10 -9 M a 10 -13 M. Derivati ricombinanti e/o biotecnologici nonché frammenti degli anticorpi sopra descritti sono inclusi nell'invenzione, a condizione che sia mantenuta l'attività legante degli anticorpi e la loro specificità funzionale.

Nel contesto della presente invenzione, il "cancro" o il "tumore" comprendono tumori primari e metastatici, nonché tumori refrattari, tumori solidi o non solidi. Un ulteriore aspetto della presente invenzione è un acido nucleico codificante per l'anticorpo come definito sopra o ibridato con l'acido nucleico sopra indicato, o costituito da una corrispondente sequenza degenerata.

È nell'ambito dell'invenzione un vettore di espressione che codifica l'anticorpo come definito sopra.

È nell'ambito dell'invenzione una cellula ospite comprendente l'acido nucleico come definito sopra, o il vettore come definito sopra.

I termini "cellula ospite", "linea cellulare ospite" e "coltura di cellule ospiti" sono usati in modo intercambiabile e si riferiscono a cellule in cui è stato introdotto un acido nucleico esogeno, inclusa la progenie di tali cellule. Le cellule ospiti includono "trasformanti" e "cellule trasformate", che comprendono la cellula primaria trasformata e la progenie da essa derivata, senza tener conto del numero di passaggi. La discendenza potrebbe non essere del tutto identica nel contenuto di acido nucleico a una cellula madre, ma può contenere mutazioni. Nella presente invenzione sono incluse progenie mutanti, che hanno la stessa funzione o attività biologica per la quale sono state sottoposte a screening o selezionate nella cellula originariamente trasformata. Gli acidi nucleici dell'invenzione possono essere usati per trasformare una cellula ospite di mammifero adatta. Le cellule di mammiferi disponibili come ospiti di espressione sono ben note e includono, ad esempio, cellule CHO e BHK. Gli ospiti procariotici includono, ad esempio, E. coli, Pseudomonas, Bacillus, ecc. Gli anticorpi dell'invenzione possono essere fusi con ulteriori residui di amminoacidi, come etichette che ne facilitano l'isolamento. Il termine "vettore", come usato nella presente invenzione, si riferisce a una molecola di acido nucleico in grado di propagare un altro acido nucleico a cui è collegata. Il termine include il vettore come struttura di acido nucleico autoreplicante, nonché il vettore incorporato nel genoma di una cellula ospite in cui è stato introdotto. Alcuni vettori sono in grado di dirigere l'espressione degli acidi nucleici a cui sono operativamente collegati. Nella presente tali vettori sono indicati come "vettori di espressione". È possibile utilizzare qualsiasi vettore di espressione adatto, ad esempio vettori di clonazione procariotica come plasmidi di E. coli, come colE1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC. Vettori di espressione adatti per l'espressione nelle cellule di mammifero includono derivati di SV-40, adenovirus, sequenze di DNA derivate da retrovirus. I vettori di espressione utili nella presente invenzione contengono almeno una sequenza di controllo di espressione che è operativamente collegata alla sequenza o al frammento di DNA che deve essere espresso. È un ulteriore scopo dell'invenzione una composizione farmaceutica comprendente almeno l'anticorpo o un suo frammento sintetico o ricombinante come sopra definito ed eccipienti farmaceutici accettabili, preferibilmente detta composizione essendo destinata all'uso mediante somministrazione parenterale, in particolare per via endovenosa. La composizione comprende una quantità efficace dell'anticorpo e/o frammenti di legame dell'antigene ricombinanti o sintetici. Le composizioni farmaceutiche sono convenzionali in questo campo e possono essere prodotte da esperti del ramo solo sulla base delle conoscenze generali comuni. Le formulazioni utili nella terapia come qui descritte possono ad esempio comprendere l'anticorpo come sopra descritto, in una concentrazione da circa 0,1 mg/ml a circa 100 mg/ml, preferibilmente da 0,1 a 10 mg/ml, più preferibilmente da 0,1 a 5 mg/ml. In altre formulazioni, la concentrazione di anticorpi può essere inferiore, ad esempio almeno 100 pg/ml. L'anticorpo dell'invenzione viene somministrato al paziente in uno o più trattamenti. A seconda del tipo e della gravità della malattia, è possibile somministrare un dosaggio compreso tra 1 mg/kg e 20 mg/kg di anticorpo, ad esempio in una o più somministrazioni, o mediante infusione continua. Gli anticorpi della presente invenzione possono essere somministrati in combinazione con altri agenti terapeutici, in particolare con anticorpi in grado di neutralizzare altri recettori coinvolti nella crescita tumorale o nell'angiogenesi. Qualsiasi metodo di somministrazione può essere usato per somministrare l'anticorpo della presente invenzione, in particolare, ad esempio, la somministrazione può essere orale, endovenosa, intraperitoneale, sottocutanea o intramuscolare. L'anticorpo secondo la presente invenzione può anche essere somministrato come coniugato, che si lega specificamente al recettore e rilascia sostanze tossiche. In particolari forme di realizzazione, la composizione farmaceutica della presente invenzione può essere somministrata sotto forma di dosaggio singolo (ad esempio compressa, capsula, bolo, ecc.). Per applicazioni farmaceutiche, la composizione può essere sotto forma di una soluzione, ad esempio di una soluzione iniettabile, un'emulsione, una sospensione o simili. Il veicolo può essere qualsiasi veicolo adatto dal punto di vista farmaceutico. Preferibilmente, il veicolo utilizzato è in grado di aumentare l'efficacia di entrata delle molecole nella cellula bersaglio. Nella composizione farmaceutica secondo l'invenzione, l'inibitore o il soppressore può essere associato ad altri agenti terapeutici, come antagonisti di altri recettori del fattore di crescita coinvolti nella tumorigenesi o angiogenesi, come VEGFR-2, EGFR, PDGFR, inibitori delle chinasi recettoriali, inibitori di BRAF, inibitori di MEK, anticorpi immunomodulatori, agenti antitumorali, come: bevacizumab, ramucirumab, aflibercept, sunitinib, pazopanib, sorafenib, cabozantinib, axitinib, regorafenib, nintedanib, lenvatinib, vemurafenib, dabrafenib, trametinib, agenti chemioterapici come agenti di metilazione (temolozomide, dacarbazina), composti di platino (cisplatino, carboplatino, ossaliplatino), taxani (paclitaxel, nab-paclitaxel, docetaxel), fluoropirimidine (5-fluorouracile, capecitabina), inibitori della topoisomerasi I (irinotecano, topotecano), inibitori di poli(ADP-ribosio) polimerasi (PARP) (ad es. olaparib), ecc. La composizione farmaceutica viene selezionata in base alle esigenze di trattamento. Queste composizioni farmaceutiche secondo l'invenzione possono essere somministrate sotto forma di compresse, capsule, preparazioni per uso orale, polveri, granuli, pillole, soluzioni liquide per iniezione o infusione, sospensioni, supposte, preparazioni per inalazione. Un riferimento per le formulazioni è il libro di Remington ("Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott Williams & Wilkins, 2000). Gli esperti del ramo sceglieranno la forma di somministrazione e i dosaggi efficaci, selezionando opportuni diluenti, adiuvanti e/o eccipienti.

Il termine "composizione farmaceutica" si riferisce a un preparato che è in una forma tale da consentire all'attività biologica di un principio attivo in esso contenuto di essere efficace e che non contiene componenti aggiuntivi che sono inaccettabilmente tossici per un soggetto a cui la formulazione può essere somministrata. Un ulteriore aspetto dell'invenzione è un metodo per produrre l'anticorpo o un suo frammento sintetico o ricombinante come definito sopra, comprendente i passaggi di coltura della cellula ospite e purificazione dell'anticorpo o di un suo frammento sintetico o ricombinante dalla coltura cellulare.

Nel contesto della presente invenzione, il termine "comprendente" include anche i termini "avente essenzialmente" o "costituito essenzialmente (da)".

Nella presente invenzione, la "proteina(e)" menzionata nel presente documento comprende anche la proteina codificata dai corrispondenti geni ortologhi o omologhi, mutanti funzionali, derivati funzionali, frammenti o analoghi funzionali, isoforme, varianti di splicing.

Nella presente invenzione, "funzionale" è da intendersi, ad esempio, come "che mantiene la loro attività".

Come qui usato "frammenti" si riferisce a polipeptidi aventi preferibilmente una lunghezza di almeno 10 amminoacidi, più preferibilmente di almeno 15, almeno 17 amminoacidi o almeno 20 amminoacidi, ancor più preferibilmente di almeno 25 amminoacidi o di almeno 37 o 40 amminoacidi, e più preferibilmente di almeno 50, o 100, o 150 o 200 o 250 o 300 o 350 o 400 o 450 o 500 amminoacidi.

Nel contesto della presente invenzione, il tumore può essere carcinoma mammario, carcinoma ovarico, carcinoma polmonare a piccole cellule, carcinoma polmonare non a piccole cellule, carcinoma del colon-retto, tumori maligni della guaina del nervo periferico, carcinoma cervicale, leucemia, carcinoma della prostata, sarcoma di Kaposi, melanoma metastatico, carcinoma pancreatico, tumori della testa e del collo, meningiomi, carcinoma a cellule basali e gliomi.

Le composizioni farmaceutiche ottimali possono essere determinate da un esperto del ramo a seconda, ad esempio, della via di somministrazione prevista, del formato di rilascio e del dosaggio desiderato. Si veda, ad esempio, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Id. Tali composizioni possono influenzare lo stato fisico, la stabilità, la velocità di rilascio in vivo e la velocità di clearance in vivo degli anticorpi dell'invenzione. Le vie di somministrazione per le composizioni farmaceutiche dell'invenzione comprendono la via orale, mediante iniezione per via endovenosa, intraperitoneale, intramuscolare, intravascolare, intraarteriosa, intraportale o intralesionale; mediante sistemi di rilascio prolungato o dispositivi di impianto. Le composizioni farmaceutiche possono essere somministrate mediante iniezione in bolo o continuamente per infusione o mediante dispositivo di impianto. La composizione farmaceutica può anche essere somministrata localmente tramite l'impianto di una membrana, una spugna o un altro materiale appropriato su cui la molecola desiderata è stata assorbita o incapsulata. Laddove viene utilizzato un dispositivo di impianto, il dispositivo può essere impiantato in qualsiasi tessuto o organo adatto e il rilascio della molecola desiderata può avvenire tramite diffusione, bolo a rilascio temporizzato o somministrazione continua.

Preferibilmente le molecole della presente invenzione sono da utilizzare in combinazione con un ulteriore intervento terapeutico, preferibilmente l'ulteriore intervento terapeutico è la radioterapia, la chemioterapia o un agente terapeutico.

La chemioterapia può essere qualsiasi chemioterapia nota usata nel ramo, ad esempio come descritto in https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/drugs e rivisto in https://juniperpublishers.com/oajt/pdf/OAJT.MS.ID.555600.pdf (incorporato per riferimento).

L'agente terapeutico è un agente comunemente usato in combinazione con il trattamento del cancro come un agente antinfiammatorio o antiemetico. L'agente terapeutico è noto nel ramo.

La presente invenzione riguarda anche l'uso di una cellula tumorale umana ingegnerizzata, ad esempio le cellule CAR T e CAR NK, in cui l'espressione di CHI3L1 è stata inibita per indurre o modulare una risposta immunitaria rispetto a un tumore o un antigene tumorale e, a sua volta, per applicazioni profilattiche e terapeutiche antitumorali/anticancro. In un ulteriore aspetto, la presente invenzione riguarda una composizione (ad esempio una composizione farmaceutica o vaccinale o immunogenica) comprendente la suddetta cellula tumorale umana ingegnerizzata come molecola stimolante o sua variante e un trasportatore o eccipiente farmaceuticamente accettabile.

Detto soppressore o inibitore può essere utilizzato nel trasferimento adottivo di cellule (ACT), trattamento terapeutico cellulare.

Salvo diversa definizione, tutti i termini scientifici e tecnologici qui usati hanno lo stesso significato comunemente inteso da una persona di competenza ordinaria nel ramo al quale appartiene questa invenzione. Generalmente, le procedure per colture cellulari, trasfezione, metodi di biologia molecolare e simili, purificazione di anticorpi e simili, sono metodi comuni usati nel ramo. Tali tecniche standard possono essere trovate in manuali di riferimento come ad esempio Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories), Ausubel et al. (1994, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York), Campbell 1984, in "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science Publisher, Amsterdam, Paesi Bassi), in Harlow et al.

1988 (in: Antibody-A Laboratory Manual, CSH Laboratories), Klein 1982 (in: Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, Wiley & Sons, N.Y.), in Immunology Today 10: 254 (1989) e in Kanoff, M. E. 1991: Immunological studies in humans. In Current protocols in Immunology, Vol. 1. Wiley & Sons, New York, pag. 7.1.

Al fine di fornire una comprensione chiara e coerente dei termini utilizzati nella presente descrizione, di seguito vengono fornite alcune definizioni.

Il termine "ligando" è ben noto nel ramo dell'immunologia e altri ligandi includono, ad esempio, anticorpi che legano un recettore. Per certezza, il termine "ligando" come qui usato è usato in senso lato per riferirsi a una molecola che può legarsi specificamente a un'altra.

I termini "antigene" o "determinante antigenico" o ("frammento antigenico") sono ben note nell’arte. La forza di un antigene viene spesso definita come l'antigenicità o l'immunogenicità e si riferisce alla proprietà (che è spesso quantificabile) di stimolare o indurre una risposta immunitaria.

Le sequenze di nucleotidi e amminoacidi della CHI3L1 umana sono ben note e disponibili nel database Genbank, con i seguenti codici di accesso

In una forma di realizzazione preferita le sequenze di nucleotidi e amminoacidi della CHI3L1 umana sono:

CDS nucleotidiche di CHI3L1:

>NM_001276.3:82-1233 Homo sapiens, chitinasi 3 simile 1 (CHI3L1), mRNA

ATGGGTGTGAAGGCGTCTCAAACAGGCTTTGTGGTCCTGGTGCTGCTCCAGTGCTG CTCTGCATACAAAC TGGTCTGCTACTACACCAGCTGGTCCCAGTACCGGGAAGGCGATGGGAGCTGCTTC CCAGATGCCCTTGA CCGCTTCCTCTGTACCCACATCATCTACAGCTTTGCCAATATAAGCAACGATCACAT CGACACCTGGGAG TGGAATGATGTGACGCTCTACGGCATGCTCAACACACTCAAGAACAGGAACCCCA ACCTGAAGACTCTCT TGTCTGTCGGAGGATGGAACTTTGGGTCTCAAAGATTTTCCAAGATAGCCTCCAAC ACCCAGAGTCGCCG GACTTTCATCAAGTCAGTACCGCCATTTCTGCGCACCCATGGCTTTGATGGGCTGGA CCTTGCCTGGCTC TACCCTGGACGGAGAGACAAACAGCATTTTACCACCCTAATCAAGGAAATGAAGG CCGAATTTATAAAGG AAGCCCAGCCAGGGAAAAAGCAGCTCCTGCTCAGCGCAGCACTGTCTGCGGGGAA GGTCACCATTGACAG CAGCTATGACATTGCCAAGATATCCCAACACCTGGATTTCATTAGCATCATGACCT ACGATTTTCATGGA GCCTGGCGTGGGACCACAGGCCATCACAGTCCCCTGTTCCGAGGTCAGGAGGATGC AAGTCCTGACAGAT TCAGCAACACTGACTATGCTGTGGGGTACATGTTGAGGCTGGGGGCTCCTGCCAGT AAGCTGGTGATGGG CATCCCCACCTTCGGGAGGAGCTTCACTCTGGCTTCTTCTGAGACTGGTGTTGGAGC CCCAATCTCAGGA CCGGGAATTCCAGGCCGGTTCACCAAGGAGGCAGGGACCCTTGCCTACTATGAGAT CTGTGACTTCCTCC GCGGAGCCACAGTCCATAGAATCCTCGGCCAGCAGGTCCCCTATGCCACCAAGGGC AACCAGTGGGTAGG ATACGACGACCAGGAAAGCGTCAAAAGCAAGGTGCAGTACCTGAAGGACAGGCAG CTGGCGGGCGCCATG GTATGGGCCCTGGACCTGGATGACTTCCAGGGCTCCTTCTGCGGCCAGGATCTGCG CTTCCCTCTCACCA ATGCCATCAAGGATGCACTCGCTGCAACGTAG (SEQ ID NO: 1)

Sequenza di amminoacidi di CHI3L1:

MGVKASQTGFVVLVLLQCCSAYKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSF

ANISNDHIDTWEWNDVTLYGMLNTLKNRNPNLKTLLSVGGWNFGSQRFSKIASNTQS

RRTFIKSVPPFLRTHGFDGLDLAWLYPGRRDKQHFTTLIKEMKAEFIKEAQPGKKQLLL

SAALSAGKVTIDSSYDIAKISQHLDFISIMTYDFHGAWRGTTGHHSPLFRGQEDASPDRF

SNTDYAVGYMLRLGAPASKLVMGIPTFGRSFTLASSETGVGAPISGPGIPGRFTKEAGT

LAYYEICDFLRGATVHRILGQQVPYATKGNQWVGYDDQESVKSKVQYLKDRQLAGA

MVWALDLDDFQGSFCGQDLRFPLTNAIKDALAAT (SEQ ID NO: 2)

Le sequenze di nucleotidi e amminoacidi della IL13ra2 umana sono ben note e disponibili nel database Genbank, con i seguenti codici di accesso

Codici di accesso IL13ra2:

Nel contesto dell'invenzione sono anche presenti polipeptidi e acidi nucleici che sono omologhi o sostanzialmente identici a, in base alla sequenza, a un polipeptide o acido nucleico dell'invenzione e mantengono la relativa funzione.

"Omologia" e "omologo" si riferiscono alla similitudine di sequenza tra due peptidi o due molecole di acido nucleico. L'omologia può essere determinata confrontando ciascuna posizione nelle sequenze allineate. Un grado di omologia tra acido nucleico o tra sequenze di amminoacidi è una funzione del numero di nucleotidi o amminoacidi identici o corrispondenti in posizioni condivise dalle sequenze. Poiché il termine è usato nel presente documento, una sequenza di acido nucleico è "omologa" a un'altra sequenza se le due sequenze sono sostanzialmente identiche e l'attività funzionale delle sequenze è conservata (come qui utilizzato, il termine "omologa" non implica una relazione evolutiva). Due sequenze di acidi nucleici sono considerate sostanzialmente identiche se, quando allineate in modo ottimale (con lacune consentite), condividono almeno il 50% di somiglianza o identità di sequenza, o se le sequenze condividono motivi funzionali definiti. In forme di realizzazione alternative, la somiglianza di sequenza in sequenze sostanzialmente identiche allineate in modo ottimale può essere almeno del 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%. Come qui utilizzato, una determinata percentuale di omologia tra sequenze indica il grado di identità della sequenza in sequenze allineate in modo ottimale. Una sequenza "non correlata" o "non omologa" condivide un'identità inferiore al 40%, sebbene preferibilmente inferiore all'identità del 25% circa, con una sequenza di acido nucleico della presente invenzione.

Gli acidi nucleici sostanzialmente complementari sono acidi nucleici in cui il complemento di una molecola è sostanzialmente identico all'altra molecola. Due sequenze di acido nucleico o di proteine sono considerate "sostanzialmente identiche" se, quando allineate in modo ottimale, condividono almeno il 70% circa dell'identità di sequenza. In forme di realizzazione alternative, l'identità di sequenza può essere ad esempio almeno il 75%, almeno l'80%, almeno l'85%, almeno il 90% o almeno il 95%. L'allineamento ottimale delle sequenze per i confronti di identità può essere condotto utilizzando una varietà di algoritmi, come l'algoritmo di omologia locale di Smith e Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2. 482, l'algoritmo di allineamento dell'omologia di Needleman e Wunsch, 1970, J. MoI. Biol. 48:443, il metodo della ricerca della somiglianza di Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 e le implementazioni computerizzate di questi algoritmi (come GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA nel pacchetto software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, Madison, WI, USA). L'identità di sequenza può anche essere determinata usando l'algoritmo BLAST, descritto in Altschul et al., 1990, J. MoI. Biol. 215:403-10 (utilizzando le impostazioni predefinite pubblicate). Il software per l'esecuzione dell'analisi BLAST può essere disponibile tramite il National Center for Biotechnology Information (tramite Internet all'indirizzo http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). L'algoritmo BLAST prevede innanzitutto l'identificazione di coppie di sequenze di punteggio elevato (HSP) identificando parole brevi di lunghezza W nella sequenza della query che corrispondono o soddisfano un punteggio di soglia T con valore positivo se allineate a una parola della stessa lunghezza in una sequenza del database. T viene definita soglia del punteggio della parola vicina. Le parole vicine iniziali individuate fungono da seed per l'avvio di ricerche per trovare HSP più lunghi. I risultati delle parole vengono estesi in entrambe le direzioni lungo ciascuna sequenza per quanto è possibile aumentare il punteggio di allineamento cumulativo. L'estensione delle corrispondenze relative alle parole in ciascuna direzione viene interrotta quando vengono soddisfatti i seguenti parametri: il punteggio di allineamento cumulativo diminuisce della quantità X dal suo valore massimo raggiunto; il punteggio cumulativo arriva a zero o a un valore inferiore, a causa dell'accumulo di uno o più allineamenti di residui con punteggio negativo; oppure viene raggiunta la fine di entrambe le sequenze. I parametri dell'algoritmo BLAST W, T e X determinano la sensibilità e la velocità dell'allineamento. Il programma BLAST può usare come default una lunghezza di parola (W) di 11, la matrice di punteggio BLOSUM62 (Henikoff e Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) allineamenti (B) di 50, aspettativa (E) di 10 (o 1 o 0,1 o 0,01 o 0,001 o 0,0001), M = 5, N = 4 e un confronto di entrambi i filamenti. Una misura della somiglianza statistica tra due sequenze che utilizzano l'algoritmo BLAST è la minima probabilità sommata (P(N)), che fornisce un'indicazione della probabilità con cui si verificherebbe per caso una corrispondenza tra due sequenze di nucleotidi o amminoacidi. In forme di realizzazione alternative dell'invenzione, le sequenze di nucleotidi o amminoacidi sono considerate sostanzialmente identiche se la minima probabilità sommata in un confronto delle sequenze di test è inferiore a circa 1, preferibilmente inferiore a circa 0,1, più preferibilmente inferiore a circa 0,01, e più preferibilmente inferiore a circa 0,001.

Un'indicazione alternativa che due sequenze di acidi nucleici sono sostanzialmente complementari è che le due sequenze si ibridano tra loro in condizioni moderatamente stringenti o preferibilmente stringenti. L'ibridazione a sequenze legate al filtro in condizioni moderatamente stringenti può, ad esempio, essere eseguita in NaHPO40,5 M, sodio dodecil solfato (SDS) 7%, EDTA 1 mM a 65°C e lavaggio in SDS 0,2 x SSC/0,1% a 42°C (si vedano Ausubel, et al. (edd.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., e John Wiley & Sons, Inc., New York, a pag. 2.10.3). In alternativa, l'ibridazione a sequenze legate al filtro in condizioni moderatamente stringenti può, ad esempio, essere eseguita in NaHPO4 0,5 M, sodio dodecil solfato (SDS) 7%, EDTA 1 mM a 65<0>C e lavaggio in 0,1 x SSC/SDS 0,1% a 68°C (si vedano Ausubel, et al. (edd.), 1989, supra). Le condizioni di ibridazione possono essere modificate secondo metodi noti a seconda della sequenza di interesse (si veda Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capitolo 2 Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York). Generalmente, le condizioni stringenti sono selezionate per essere inferiori di circa 5 °C rispetto al punto di fusione termica per la sequenza specifica ad una forza ionica e pH definiti.

Il termine "vettore" è comunemente noto nel ramo e definisce ad esempio un DNA plasmidico, un DNA fagico, un DNA virale e simili, che possono servire da veicolo in cui è possibile clonare l'acido nucleico della presente invenzione. Esistono numerosi tipi di vettori e sono ben noti nel ramo. In una particolare forma di realizzazione, il vettore è un vettore virale che può introdurre una molecola, ad esempio una molecola chimerica co-stimolatoria, in una cellula o in un organismo vivente. In una forma di realizzazione il vettore virale è un vettore retrovirale, un vettore lentivirale, un vettore adenovirale o un vettore adeno-associato (AAV).

Vari geni e varie sequenze di acidi nucleici dell'invenzione possono essere sequenze ricombinanti. Il termine "ricombinante" significa che qualcosa è stato ricombinato, in modo che, quando fatto in riferimento a un costrutto di acido nucleico, il termine si riferisce a una molecola composta da sequenze di acido nucleico che sono unite tra loro o prodotte mediante tecniche biologiche molecolari. Il termine "ricombinante" quando usato con riferimento a una proteina o un polipeptide si riferisce a una molecola proteica o polipeptidica che viene espressa usando un costrutto di acido nucleico ricombinante creato mediante tecniche biologiche molecolari. Il termine "ricombinante" quando usato in riferimento alla composizione genetica si riferisce a un gamete o progenie o cellula o genoma con nuove combinazioni di alleli che non si sono verificate nei genomi dei genitori. I costrutti di acido nucleico ricombinante possono includere una sequenza di nucleotidi che è ligata a, o manipolata per diventare ligata a, una sequenza di acido nucleico a cui non è ligata in natura o alla quale viene ligata in una posizione diversa rispetto a quanto avviene in natura. Il riferimento a un costrutto di acido nucleico come "ricombinante" indica quindi che la molecola di acido nucleico è stata manipolata usando l'ingegneria genetica, ovvero mediante l'intervento umano. I costrutti di acido nucleico ricombinante possono ad esempio essere introdotti in una cellula ospite mediante trasformazione. Tali costrutti di acido nucleico ricombinante possono includere sequenze derivate dalle stesse specie di cellule ospiti o da diverse specie di cellule ospiti, che sono state isolate e reintrodotte nelle cellule della specie ospite. Le sequenze di costrutti ricombinanti di acido nucleico possono essere integrate in un genoma della cellula ospite, sia come risultato della trasformazione originale delle cellule ospiti, sia come risultato dei successivi eventi di ricombinazione e/o riparazione.

Il termine "espressione" definisce il processo mediante il quale un gene viene trascritto nell'mRNA (trascrizione), quindi l'mRNA viene trasdotto (trasduzione) in un polipeptide (o proteina) o in più di uno di essi.

Il termine "vettore di espressione" definisce un vettore o un veicolo come descritto sopra ma progettato per consentire l'espressione di una sequenza inserita in seguito a trasformazione o trasfezione in un ospite. Il gene clonato (sequenza inserita) viene generalmente posto sotto il controllo dell'elemento di controllo o delle sequenze regolatrici trascrizionali come le sequenze del promotore. Il posizionamento di un gene clonato in tali sequenze di controllo viene spesso definito come operativamente collegato a elementi o sequenze di controllo.

Una prima sequenza di acido nucleico è "operativamente collegata" con una seconda sequenza di acido nucleico quando la prima sequenza di acido nucleico è posta in una relazione funzionale con la seconda sequenza di acido nucleico. Ad esempio, un promotore è operativamente collegato a una sequenza di codifica se il promotore influenza la trascrizione o l'espressione delle sequenze di codifica. Generalmente, le sequenze di DNA collegate operativamente sono contigue e, ove necessario, uniscono due regioni di codifica proteica, nel quadro di lettura. Tuttavia, poiché ad esempio i potenziatori generalmente funzionano quando separati dai promotori da diverse chilobasi e le sequenze introniche possono avere lunghezze variabili, alcuni elementi polinucleotidici possono essere collegati operativamente ma non contigui. "Elemento regolatorio trascrizionale" è un termine generico che si riferisce a sequenze di DNA, come segnali di inizio e fine, potenziatori e promotori, segnali di splicing, segnali di poliadenilazione che inducono o controllano la trascrizione di sequenze di codifica proteica con le quali sono operativamente collegati.

Le sequenze collegate operativamente possono anche includere due segmenti che sono trascritti sullo stesso trascritto dell'RNA. Pertanto, due sequenze, come una sequenza di promotore e di reporter, sono collegate operativamente se la trascrizione che inizia nel promotore produrrà un trascritto di RNA della sequenza di reporter. Per essere "collegate operativamente" non è necessario che due sequenze siano immediatamente adiacenti l'una all'altra.

Le sequenze di controllo dell'espressione varieranno a seconda che il vettore sia progettato per esprimere il gene operativamente collegato in un ospite procariotico o eucariotico o entrambi (vettori bifunzionali) e possono inoltre contenere elementi trascrizionali come elementi di potenziamento, sequenze di terminazione, elementi di specificità tissutale e/o siti di apertura e terminazione traslazionali.

Le espressioni procariotiche sono utili per la preparazione di grandi quantità di proteine codificate dalla sequenza di DNA di interesse. Questa proteina può essere purificata secondo protocolli standard che sfruttano le sue proprietà intrinseche, come dimensioni e carica (ad esempio elettroforesi su gel SDS, filtrazione su gel, centrifugazione, cromatografia a scambio ionico, ecc.). Inoltre, la proteina di interesse può essere purificata mediante cromatografia di affinità utilizzando anticorpi policlonali o monoclonali o un ligando specifico. La proteina purificata può essere utilizzata per applicazioni terapeutiche. Le proteine eucariotiche espresse procarioticamente spesso non sono glicosilate.

Il costrutto di DNA (o RNA) può essere un vettore comprendente un promotore operativamente collegato a una sequenza oligonucleotidica della presente invenzione, che a sua volta è operativamente collegata a un gene eterologo, come il gene della molecola reporter della luciferasi. "Promotore" si riferisce a una regione regolatrice del DNA in grado di legarsi direttamente o indirettamente all'RNA polimerasi in una cellula e iniziare la trascrizione di una sequenza di codifica a valle (direzione 3'). Ai fini della presente invenzione, il promotore è preferibilmente legato al suo terminale 3' dal sito di inizio della trascrizione e si estende a monte (direzione 5') per includere il numero minimo di basi o elementi necessari per iniziare la trascrizione a livelli rilevabili sopra lo sfondo. All'interno del promotore verrà trovato un sito di inizio della trascrizione (opportunamente definito dalla mappatura con nucleasi S1), nonché domini di legame alle proteine (sequenze di consenso) responsabili del legame dell'RNA polimerasi. I promotori eucariotici conterranno spesso, ma non sempre, "TATA" box e "CCAT" box. I promotori procariotici contengono sequenze di consenso -10 e -35, che servono per iniziare la trascrizione e i prodotti di trascrizione contengono sequenze Shine-Dalgarno, che servono come sequenze di legame ribosomiale durante l'inizio della trasduzione. Esempi non limitativi di vettori che possono essere usati secondo la presente invenzione includono vettori adenovirali, vettori poxvirali, vettori derivati da VSV e vettori retrovirali. Tali vettori e altri sono ben noti nel ramo. Come qui usato, la designazione "derivato funzionale" o "variante funzionale" indica, nel contesto di un derivato funzionale di una sequenza, sia una sequenza di acidi nucleici o di amminoacidi, una molecola che mantiene un'attività biologica (sia funzionale che strutturale) che è sostanzialmente simile a quello della sequenza originale. Questo derivato funzionale o equivalente può essere un derivato naturale o può essere preparato sinteticamente. Tali derivati comprendono sequenze di amminoacidi che hanno sostituzioni, delezioni o addizioni di uno o più amminoacidi, a condizione che l'attività biologica della proteina venga preservata. Lo stesso vale per i derivati delle sequenze di acidi nucleici che possono avere sostituzioni, delezioni o aggiunte di uno o più nucleotidi, a condizione che l'attività biologica della sequenza sia generalmente mantenuta. In relazione a una sequenza proteica, l'amminoacido sostitutivo ha generalmente proprietà chimico-fisiche simili a quelle dell'amminoacido sostituito. Le proprietà chimico-fisiche simili includono analogie di carica, voluminosità, idrofobicità, idrofilia e simili. Il termine "derivati funzionali" intende includere "frammenti", "segmenti", "varianti", "analoghi" o "derivati chimici" della materia oggetto della presente invenzione. In una forma di realizzazione, il derivato, la variante o il frammento sopra menzionato è un "derivato, variante o frammento antigenico" (ad esempio, che ha la capacità di indurre/suscitare una risposta immunitaria contro l'antigene parentale).

Pertanto, il termine "variante" si riferisce qui a una molecola proteica o di acido nucleico che è sostanzialmente simile nella struttura e nell'attività biologica alla proteina o all'acido nucleico della presente invenzione ma non è limitata a una variante che conserva tutte le attività biologiche della proteina parentale, ad esempio.

I derivati funzionali della presente invenzione possono essere sintetizzati chimicamente o prodotti mediante tecnologia del DNA ricombinante. Tutti questi metodi sono ben noti nel ramo. Come qui utilizzato, "derivati chimici" intende coprire ulteriori porzioni chimiche che normalmente non fanno parte della materia oggetto dell'invenzione. Tali porzioni potrebbero influire sulle caratteristiche fisico-chimiche del derivato (ad esempio solubilità, assorbimento, emivita, diminuzione della tossicità e simili). Tali frazioni sono esemplificate in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). I metodi per accoppiare queste frazioni chimico-fisiche a una sequenza polipeptidica o di acido nucleico sono ben noti nel ramo.

Come qui usati, i termini "molecola", "composto" o "agente" sono usati in modo intercambiabile e in senso ampio per riferirsi a molecole o composti naturali, sintetici o semisintetici. Il termine "molecola" indica quindi ad esempio sostanze chimiche, macromolecole, estratti di cellule o tessuti (da piante o animali) e simili. Esempi non limitativi di molecole includono molecole di acido nucleico, peptidi, anticorpi, carboidrati e agenti farmaceutici. Gli agenti possono essere selezionati e schermati con una varietà di mezzi tra cui screening casuale, selezione razionale e design razionale usando ad esempio metodi di modellizzazione di proteine o ligandi come la modellizzazione computerizzata. I termini "razionalmente selezionati" o "razionalmente progettati" hanno lo scopo di definire composti che sono stati scelti in base alla configurazione, ad esempio di domini interagenti della presente invenzione. Come sarà compreso dalla persona di competenza ordinaria, anche le macromolecole che presentano modifiche non naturali rientrano nell'ambito del termine "molecola". Ad esempio, i peptidomimetici, ben noti nell'industria farmaceutica e generalmente indicati come analoghi peptidici, possono essere generati mediante modellizzazione come menzionato sopra. Analogamente, in una forma di realizzazione preferita, i polipeptidi della presente invenzione sono modificati per migliorarne la stabilità. Dovrebbe essere chiaro che nella maggior parte dei casi questa modifica non dovrebbe alterare l'attività biologica del dominio di interazione. Le molecole identificate secondo gli insegnamenti della presente invenzione hanno un valore terapeutico in malattie o condizioni in cui le terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC) non sono efficienti. Come definito sopra, il termine "ligando" comprende anche molecole come peptidi, anticorpi e carboidrati.

Per certezza, le sequenze e i polipeptidi utili per mettere in pratica l'invenzione includono, senza limitazioni, tali mutanti, omologhi, sottotipi, alleli e simili. Sarà chiaro alla persona di competenza ordinaria che se un dominio di interazione della presente invenzione, una sua variante, un suo derivato o un suo frammento mantiene la sua funzione in legame con il suo partner, questo può essere facilmente determinato usando gli insegnamenti e i saggi della presente invenzione e gli insegnamenti generali del ramo.

Rientra nel contesto della presente invenzione anche la somministrazione in vivo di un acido nucleico dell'invenzione a un soggetto, come i metodi di terapia genica.

Gli acidi nucleici possono essere somministrati alle cellule in vivo usando metodi come iniezione diretta di DNA, assorbimento di DNA mediato dal recettore, trasfezione virale mediata o trasfezione non virale e trasfezione a base lipidica, che possono comportare l'uso di vettori di terapia genica. L'iniezione diretta è stata utilizzata per introdurre il DNA nudo nelle cellule in vivo (si vedano, ad esempio, Acsadi et al. (1991) Nature 332:815-818; Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468). Può essere utilizzato un apparato di rilascio (ad esempio, un "cannone genico") per iniettare DNA nelle cellule in vivo. Un tale apparato può essere disponibile in commercio (ad esempio, presso BioRad). Il DNA nudo può anche essere introdotto nelle cellule complessando il DNA in un catione, come la polilisina, che è accoppiata a un ligando per un recettore della superficie cellulare (si vedano, ad esempio, Wu, G. e Wu, CH (1988) J. Biol. Chem. 263:14621; Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967; e il brevetto statunitense n. 5.166.320). Il legame del complesso DNA-ligando al recettore può facilitare l'assorbimento del DNA mediante endocitosi mediata dal recettore. Un complesso ligando-DNA collegato a capsidi di adenovirus che interrompono gli endosomi, rilasciando così materiale nel citoplasma, può essere usato per evitare la degradazione del complesso da parte dei lisosomi intracellulari (si vedano, ad esempio, Curiel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8850; Cristiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2122-2126). I retrovirus difettosi sono ben caratterizzati per l'uso come vettori di terapia genica (per una recensione si veda Miller, A. D. (1990) Blood 76:271). I protocolli per la produzione di retrovirus ricombinanti e per l'infezione di cellule in vitro o in vivo con tali virus sono reperibili negli attuali protocolli di biologia molecolare, Ausubel, F. M. et al. (edd.) Greene Publishing Associates, (1989), sezioni 9.10-9.14 e altri manuali di laboratorio standard. Esempi di retrovirus adatti includono pLJ, pZIP, pWE e pEM che sono ben noti agli esperti del ramo. Esempi di linee di virus di packaging adatte includono .psi.Crip, .psi.Cre, .psi.2 e .psi.Am. I retrovirus sono stati usati per introdurre una varietà di geni in molti tipi diversi di cellule, tra cui cellule epiteliali, cellule endoteliali, linfociti, mioblasti, epatociti, cellule del midollo osseo, in vitro e/o in vivo (si vedano ad esempio Eglitis, et al. (1985) Science 230:1395-1398; Danos e Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381 ; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115; brevetto statunitense n. 4.868.116; brevetto statunitense n. 4.980.286; domanda PCT WO 89/07136; domanda PCT WO 89/02468; domanda PCT WO 89/05345; e domanda PCT WO 92/07573).

Il virus adeno-associato (AAV) può essere usato come vettore di terapia genica per il rilascio di DNA ai fini della terapia genica. L'AAV è un virus difettoso presente in natura che richiede un altro virus, come un adenovirus o un herpesvirus, come virus helper per una replicazione efficiente e un ciclo di vita produttivo (Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro, e Immunol. (1992) 158:97-129). L'AAV può essere usato per integrare il DNA in cellule non divisibili (si vedano, ad esempio, Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; e McLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62:1963-1973). Un vettore AAV come quello descritto in Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 può essere usato per introdurre DNA nelle cellule (si vedano ad esempio Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol.4:2072-2081; Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51 :611-619; e Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790). I vettori della terapia genica lentivirale possono anche essere adatti per l'uso nell'invenzione.

Dalle specifiche e dalle rivendicazioni allegate, il termine agente terapeutico dovrebbe essere preso in senso lato in modo da includere anche una combinazione di almeno due di tali agenti terapeutici. Inoltre, i segmenti di DNA o le proteine secondo la presente invenzione possono essere introdotti negli individui in vari modi. Ad esempio, le cellule possono essere isolate da un individuo affetto o a rischio di essere affetto da un cancro, trasfettate con un costrutto di DNA secondo l'invenzione e reintrodotte nell'individuo affetto in vari modi, inclusa l'iniezione endovenosa. In alternativa, il costrutto del DNA può essere somministrato direttamente all'individuo malato, ad esempio mediante iniezione nel timo. Il costrutto del DNA può anche essere consegnato attraverso un veicolo come un liposoma, che può essere progettato per essere mirato a un tipo di cellula specifica e progettato per essere somministrato attraverso percorsi diversi. Naturalmente, è possibile somministrare anche proteine o peptidi. Una persona di ordinaria abilità può adattare il metodo di trasfezione, il tipo di cellule trasfettate, il tipo di malattia o condizione, il co-stimolo (generale o specifico) ecc. per soddisfare esigenze particolari.

Le composizioni nell'ambito della presente invenzione dovrebbero contenere l'agente attivo (ad esempio una proteina di fusione, un peptide, un acido nucleico e una molecola, un antigene, un anticorpo o un APC) in una quantità efficace per ottenere l'attivazione ADCC desiderata evitando effetti collaterali negativi. Tipicamente, gli acidi nucleici secondo la presente invenzione possono essere somministrati ai mammiferi (ad esempio, esseri umani) in dosi che vanno da 0,005 a 1 mg per kg di peso corporeo al giorno del mammifero che viene trattato. Le preparazioni e i sali farmaceuticamente accettabili dell'agente attivo rientrano nell'ambito della presente invenzione e sono ben noti nella tecnica (Remington's Pharmaceutical Science, 16<a >ed., ed. Mack). L'invenzione pertanto fornisce inoltre una composizione comprendente un agente attivo e un trasportatore farmaceuticamente accettabile. Per la somministrazione di polipeptidi, antagonisti, agonisti e simili, la quantità somministrata deve essere selezionata in modo da evitare effetti collaterali negativi. Il dosaggio verrà adattato dal medico in base a fattori convenzionali come l'estensione della malattia e parametri diversi dal paziente. In genere, al mammifero vengono somministrati da 0,001 a 50 mg/kg/giorno.

Come qui usato, le composizioni dell'invenzione vengono somministrate essenzialmente in colture di cellule tumorali intra-tumorali o in vivo, può per via convenzionale conoscere il campo, ad esempio a una mucosa (ad esempio, oculare, intranasale, polmonare, orale, gastrica, superficie intestinale, rettale, vaginale o urinaria), attraverso una via parenterale (ad esempio sottocutanea, intradermica, intramuscolare, endovenosa o intraperitoneale) o una somministrazione topica (ad esempio tramite cerotto). La scelta della via di somministrazione dipende da una serie di parametri, come l'adiuvante associato al polipeptide. Se si utilizza un adiuvante della mucosa, è preferibile la via intranasale od orale. Se si utilizza una formulazione lipidica o un composto di alluminio, la via parenterale è preferita e la via sottocutanea o intramuscolare sono maggiormente preferite. Per l'uso in una composizione dell'invenzione, un polipeptide o un suo derivato può essere formulato all'interno di o con liposomi, preferibilmente liposomi neutri o anionici, microsfere, ISCOM o particelle simili a virus (VLP) per facilitare il rilascio e/o migliorare la risposta immunitaria. Questi composti sono prontamente disponibili per un esperto del ramo; ad esempio, si veda Liposomes: A Practical Approach, RCP New Ed, IRL press (1990).

Vengono utilizzati anche adiuvanti diversi dai liposomi e simili, che sono noti nel ramo. Un polinucleotide dell'invenzione può anche essere utile come terapia. Esistono due vie principali, che utilizzano un ospite virale o batterico come veicolo di rilascio del gene (vettore) o somministrano il gene in una forma libera, ad esempio, mediante inserimento in un plasmide. L'efficacia terapeutica o profilattica di un polinucleotide dell'invenzione viene valutata come descritto di seguito.

Di conseguenza, un ulteriore aspetto dell'invenzione fornisce (i) un vettore come un adenovirus, contenente una molecola di acido nucleico dell'invenzione, posto sotto il controllo di elementi richiesti per l'espressione; (ii) una composizione di materia comprendente un vettore dell'invenzione, insieme a un diluente o veicolo; in particolare (iii) una composizione farmaceutica contenente una quantità terapeuticamente e/o profilatticamente efficace di un vettore dell'invenzione; (iv) una cellula (ad esempio una cellula tumorale umana) trasfettata o trasformata con l'acido nucleico o il vettore della presente invenzione; (v) un metodo per indurre una risposta immunitaria contro un tumore in un mammifero (ad es. un essere umano; in alternativa, il metodo può essere utilizzato in applicazioni veterinarie per il trattamento o la prevenzione della crescita del tumore o del cancro negli animali non umani), che prevede la somministrazione al mammifero una quantità efficace di un vettore dell'invenzione per stimolare una risposta immunitaria protettiva o terapeutica contro un tumore; e in particolare, (v) un metodo per prevenire e/o curare il cancro resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC), che prevede la somministrazione di una quantità profilattica o terapeutica di un vettore dell'invenzione a un individuo affetto da, o a rischio di sviluppo di, un cancro. Inoltre, l'invenzione fornisce anche un uso di un vettore dell'invenzione nella preparazione di un medicamento per prevenire e/o trattare il cancro resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC).

L'invenzione fornisce inoltre una composizione comprendente diversi polipeptidi o loro derivati dell'invenzione o vettori (ciascuno di essi in grado di esprimere un polipeptide o suo derivato dell'invenzione).

Il trattamento può essere effettuato in una singola dose o ripetuto ad intervalli. Il dosaggio appropriato dipende da vari parametri compresi da tecnici esperti come la via di somministrazione o le condizioni del mammifero da trattare (peso, età e simili). I vettori disponibili nella tecnica includono vettori virali come adenovirus e poxvirus nonché vettori batterici, ad esempio Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus, bacillo di Calmette-Guérin (BCG) e Streptococcus.

Un esempio di un vettore di adenovirus, nonché un metodo per costruire un vettore di adenovirus in grado di esprimere una molecola di acido nucleico dell'invenzione, sono descritti nel brevetto statunitense n. 4.920.209. I vettori di poxvirus comprendono vaccinia e canary poxvirus, descritti rispettivamente nel brevetto statunitense n. 4.722.848 e nel brevetto statunitense n. 5.364.773 (si vedano anche, ad esempio, Tartaglia et al., Virology (1992) 188:217) per una descrizione di un vettore di virus vaccinia e Taylor et al., Vaccine (1995) 13:539 per una descrizione di un vettore di canary poxvirus). I vettori del poxvirus in grado di esprimere un polinucleotide dell'invenzione sono ottenuti mediante ricombinazione omologa come descritto in Kieny et al., Nature (1984) 312:163 in modo che il polinucleotide dell'invenzione sia inserito nel genoma virale in condizioni appropriate per l'espressione nei mammiferi le cellule. Generalmente, la dose del vettore virale, per uso terapeutico o profilattico, può essere compresa tra circa 1x10<4 >e circa 1x10<11>, vantaggiosamente tra circa 1x10<7 >e circa 1x10<10>, preferibilmente tra circa 1x10<7 >e circa 1x10<9 >unità formanti placche per chilogrammo. Preferibilmente, i vettori virali vengono somministrati per via parenterale; ad esempio, in 3 dosi, a 4 settimane di distanza. È preferibile evitare di aggiungere un adiuvante chimico a una composizione contenente un vettore virale dell'invenzione e quindi minimizzare la risposta immunitaria al vettore virale stesso.

La composizione della presente invenzione può contenere inoltre un adiuvante. Numerosi adiuvanti sono noti agli esperti del ramo. Esempi di adiuvanti sono descritti di seguito. L'uso degli acidi nucleici dell'invenzione include la loro somministrazione a un mammifero come vaccino o agente immunogenico, a scopo terapeutico o profilattico. Tali acidi nucleici sono usati sotto forma di DNA come parte di un plasmide che non è in grado di replicarsi in una cellula di mammifero e non è in grado di integrarsi nel genoma dei mammiferi. Tipicamente, una tale molecola di DNA viene posta sotto il controllo di un promotore adatto all'espressione in una cellula di mammifero. Il promotore funziona in modo ubiquitario o specifico per i tessuti. Esempi di promotori non specifici del tessuto includono il promotore precoce del citomegalovirus (CMV) (descritto nel brevetto statunitense n. 4.168.062) e il promotore del virus del sarcoma di Rous (descritto in Norton & Coffin, Mol. Cell Biol. (1985) 5:281). Un esempio di promotore specifico del tessuto è il promotore desmina che guida l'espressione nelle cellule muscolari (Li et al., Gene (1989) 78:243, Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1991) 266:6562 e Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1993) 268:10403). I metodi per la trasformazione cellulare sono noti agli esperti del ramo. Vettori utili sono descritti in numerose pubblicazioni, in particolare WO 94/21797 e Hartikka et al., Human Gene Therapy (1996) 7:1205. I polinucleotidi dell'invenzione che sono usati come vaccini codificano un precursore o una forma matura del polipeptide corrispondente. Nella forma precursore, il peptide segnale è omologo o eterologo. In quest'ultimo caso, è preferita una sequenza leader eucariotica come la sequenza leader del fattore plasminogeno di tipo tissutale (tPA). Le tecniche standard di biologia molecolare per preparare e purificare i polinucleotidi sono utilizzate nella preparazione della terapia polinucleotidica dell'invenzione. Per l'uso come vaccino, un polinucleotide dell'invenzione è formulato secondo vari metodi descritti di seguito. Un metodo utilizza il polinucleotide in una forma nuda, privo di qualsiasi veicolo di consegna. Tale polinucleotide viene semplicemente diluito in una soluzione fisiologicamente accettabile come soluzione salina sterile o soluzione salina tamponata sterile, con o senza trasportatore. Quando presente, il vettore è preferibilmente isotonico, ipotonico o debolmente ipertonico, e ha una forza ionica relativamente bassa, come quella fornita da una soluzione di saccarosio, ad esempio una soluzione contenente il 20% di saccarosio.

Un metodo alternativo utilizza il polinucleotide in associazione con agenti che aiutano l'assorbimento cellulare. Esempi di tali agenti sono (i) sostanze chimiche che modificano la permeabilità cellulare, come la bupivacaina (vedere, ad esempio, WO 94/16737), (ii) liposomi per l'incapsulamento del polinucleotide, o (iii) lipidi cationici o microparticelle di silice, oro o tungsteno che si associano ai polinucleotidi.

I liposomi anionici e neutri sono ben noti nel ramo (si veda, ad esempio, Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press (1990), per una descrizione dettagliata dei metodi per produrre liposomi) e sono utili per fornire una vasta gamma di prodotti, inclusi i polinucleotidi.

Anche i lipidi cationici sono noti nel ramo e sono comunemente usati per il rilascio di geni. Tali lipidi includono Lipofectin (TM), noto anche come DOTMA (N-[1-(2,3-dioleilossi)propil]-N,N,N-cloruro di trimetilammonio), DOTAP (1,2-bis(oleilossi)-3-(trimetilammonio)propano), DDAB (bromuro di dimetildioctadecilammonio), DOGS (diottadecilammidologlicil spermina) e derivati del colesterolo come DC-Chol (3 beta-(N-(N',N'-dimetilamminometano)-carbamoil)colesterolo). Una descrizione di questi lipidi cationici può essere trovata in EP 187.702, in WO 90/11092, nel brevetto statunitense n. 5.283.185, in WO 91/15501, in WO 95/26356 e nel brevetto statunitense n.5.527.928. I lipidi cationici per il rilascio genico sono preferibilmente usati in associazione con un lipide neutro come DOPE (dioleil fosfatidiletanolammina), come descritto in WO 90/11092 come esempio.

Le formulazioni contenenti liposomi cationici possono eventualmente contenere altri composti che facilitano la trasfezione. Alcuni di essi sono descritti in WO 93/18759, WO 93/19768, WO 94/25608 e WO 95/02397. Includono derivati di spermina utili per facilitare il trasporto del DNA attraverso la membrana nucleare (si veda, ad esempio, WO 93/18759) e composti permeabilizzanti della membrana come GALA, Gramicidina S e sali biliari cationici (si veda, ad esempio, WO 93/19768).

Le microparticelle di oro o tungsteno sono utilizzate per la consegna genica, come descritto in WO 91/00359, WO 93/17706 e Tang et al. Nature (1992) 356:152. Il polinucleotide rivestito di microparticelle viene iniettato per via intradermica o intraepidermica mediante un dispositivo di iniezione senza ago ("cannone genico"), come quelli descritti nel brevetto statunitense n. 4.945.050, nel brevetto statunitense n. 5.015.580 e in WO 94/24263.

La quantità di DNA da utilizzare in un ricevente di vaccino dipende, ad esempio, dalla forza del promotore utilizzato nella struttura del DNA, dall'immunogenicità del prodotto genico espresso, dalle condizioni del mammifero destinato alla somministrazione (ad es. peso, età e condizioni di salute generali del mammifero), dalla modalità di somministrazione e dal tipo di formulazione. In generale, una dose terapeuticamente o profilatticamente efficace da circa 1 µg a circa 1 mg, preferibilmente, da circa 10 µg a circa 800 [mu]g e, più preferibilmente, da circa 25 µg a circa 250 µg, può essere somministrata a soggetti umani adulti. La somministrazione può essere eseguita in una singola dose o ripetuta a intervalli.

Sebbene non sia assolutamente necessario, tale composizione può contenere anche un adiuvante. In tal caso, è preferibile un adiuvante sistemico che non richiede la somministrazione concomitante per esibire un effetto adiuvante come, ad esempio, QS21, che è descritto nel brevetto statunitense n. 5.057.546.

Il trattamento viene ottenuto in una singola dose o ripetuto secondo necessità a intervalli, come può essere prontamente determinato da un esperto del ramo. Ad esempio, una dose di priming è seguita da tre dosi di richiamo a intervalli settimanali o mensili. Una dose appropriata dipende da vari parametri tra cui il ricevente (ad esempio adulto o neonato), il particolare antigene del vaccino, la via e la frequenza di somministrazione, la presenza/assenza o il tipo di adiuvante e l'effetto desiderato (ad esempio protezione e/o trattamento), come può essere determinato da un esperto del ramo. In una forma di realizzazione, un polipeptide dell'invenzione, somministrato come vaccino, viene somministrato per via mucosa in una quantità da circa 10 µg a circa 500 mg, preferibilmente da circa 1 mg a circa 200 mg. Per la via di somministrazione parenterale, la dose di solito non supera circa 1 mg, preferibilmente circa 100 µg. Quando usati come agenti vaccinali, polipeptidi e polinucleotidi dell'invenzione possono essere usati sequenzialmente come parte di un processo di immunizzazione a più passaggi. Ad esempio, un mammifero viene inizialmente innescato con un vettore vaccinale dell'invenzione come un adenovirus, ad esempio attraverso la via parenterale, e quindi potenziato due volte con il polipeptide codificato dal vettore vaccinale, ad esempio attraverso la via mucosale. In un altro esempio, i liposomi associati a un polipeptide o un derivato dell'invenzione sono anche usati per il priming, con l'amplificazione effettuata a livello mucosale usando un polipeptide solubile o un derivato dell'invenzione in combinazione con un adiuvante della mucosa (ad esempio, LT). Esempi di adiuvanti utili in una qualsiasi delle vaccinazioni/composizioni immunogene sopra descritte sono i seguenti.

Gli adiuvanti per la somministrazione parenterale comprendono composti di alluminio, come idrossido di alluminio, fosfato di alluminio e idrossifosfato di alluminio. L'antigene viene precipitato o adsorbito sul composto di alluminio secondo i protocolli standard. Altri adiuvanti, come RIBI (ImmunoChem, Hamilton, MT), vengono utilizzati nella somministrazione parenterale.

Gli adiuvanti per la somministrazione della mucosa includono tossine batteriche, ad esempio la tossina colera (CT), la tossina E. coli termo-labile (LT), la tossina A di Clostridium difficile e la tossina pertosse (PT), o loro combinazioni, subunità, tossine o mutanti come una preparazione purificata della subunità B della tossina colerica nativa (CTB). Anche frammenti, omologhi, derivati e fusioni a una qualsiasi di queste tossine sono adatti, a condizione che mantengano l'attività adiuvante. Preferibilmente, viene utilizzato un mutante con ridotta tossicità. Mutanti adatti sono descritti, ad esempio, in WO 95/17211 (mutante Arg-7-Lys CT), WO 96/06627 (mutante Arg-192-Gly LT) e WO 95/34323 (mutante Arg-9-Lys e Glu-129-Gly PT). Ulteriori mutanti LT utilizzati nei metodi e nelle composizioni dell'invenzione includono, ad esempio, i mutanti Ser-63-Lys, Ala-69Gly, Glu-110-Asp e Glu-112-Asp. Altri adiuvanti, come un lipide monofosforico batterico A (MPLA), ad esempio E. coli, Salmonella minnesota, Salmonella typhimurium o Shigella flexneri; saponine, o microsfere di glicolide polilattico (PLGA), sono anche usati nella somministrazione mucosale.

Gli adiuvanti utili sia per la mucosa che per la somministrazione parenterale includono il polifosfazene (WO 95/02415), il colesterolo DC-chol (3 b'N'N'.N'-dimetil amminometano)-carbamoile); il brevetto statunitense n. 5.283.185 e WO 96/14831) e QS-21 (WO 88/09336).

La composizione per il trattamento del cancro della presente invenzione può essere utilizzata in combinazione con farmaci chemioterapici esistenti o può essere prodotta come miscela con essi. Tale farmaco chemioterapico include, ad esempio, agenti alchilanti, agenti di nitrourea, antimetaboliti, antibiotici antitumorali, alcaloidi derivati da piante, inibitori della topoisomerasi, medicinali per terapia ormonale, antagonisti ormonali, inibitori dell'aromatasi, inibitori della glicoproteina P, derivati del complesso del platino, altri farmaci immunoterapici e altri agenti antitumorali. Inoltre, possono essere utilizzati insieme a medicinali per ipoleucocitosi (neutrofili) che sono adiuvanti per il trattamento del cancro, medicinali per trombopenia, farmaci antiemetici e antidolorifici per il recupero della QOL del paziente o che possono essere preparati come una miscela con essi. La composizione della presente invenzione e gli altri agenti (ad esempio un agente chemioterapico) possono essere somministrati in concomitanza o in sequenza.

La composizione per il trattamento del cancro della presente invenzione può essere utilizzata insieme a una o più sostanze immunopotenziative o può essere realizzata come una miscela delle stesse. Tali sostanze immunopotenziatrici comprendono, ad esempio, varie citochine e un antigene tumorale, ecc. Le citochine che stimolano le reazioni immunitarie comprendono, ad esempio, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, interferone-[beta] e Y, IL-1, IL-2, IL-3 e IL-12, anticorpi anti-CD3 possono anche migliorare le reazioni immunitarie. La composizione della presente invenzione e le una o più sostanze immunopotenziatrici (ad esempio una citochina o una chemochina) possono essere somministrate in concomitanza o in sequenza.

Il termine "cancro" e "tumore" sono intercambiabili nella presente invenzione. Il termine "trattare il cancro" o "trattamento del cancro" come utilizzato nel presente documento comprende almeno una delle seguenti caratteristiche (risultati profilattici/terapeutici): attenuazione dei sintomi associati al cancro, riduzione dell'estensione del cancro (ad esempio una riduzione della crescita del tumore), una stabilizzazione dello stato del tumore (ad esempio un'inibizione della crescita del tumore), una prevenzione di ulteriore diffusione del tumore (ad esempio una metastasi), una prevenzione dell'insorgenza o recidiva di un tumore, un ritardo o un rallentamento della progressione del cancro (ad esempio una riduzione della crescita del tumore) o un miglioramento dello stato del cancro (ad esempio una riduzione delle dimensioni del tumore).

Una "quantità terapeuticamente efficace" indica una quantità efficace, ai dosaggi e per i periodi di tempo necessari, per ottenere il risultato terapeutico desiderato sopra menzionato. Una quantità terapeuticamente efficace può variare in base a fattori quali lo stato della malattia, l'età, il sesso e il peso dell'individuo e la capacità del composto di ottenere una risposta desiderata nell'individuo. I regimi di dosaggio possono essere regolati per fornire la risposta terapeutica ottimale. Una quantità terapeuticamente efficace è anche una quantità in cui qualsiasi effetto tossico o dannoso del composto è compensato dagli effetti terapeuticamente benefici. Una "quantità profilatticamente efficace" si riferisce a una quantità efficace, ai dosaggi e per i periodi di tempo necessari, per ottenere il risultato profilattico desiderato, come prevenire o inibire l'insorgenza o la progressione del cancro e dei sintomi e delle malattie associati. Una quantità profilatticamente efficace può essere determinata come descritto sopra per la quantità terapeuticamente efficace. Per qualsiasi argomento particolare, specifici regimi posologici possono essere modificati nel tempo in base alle esigenze individuali e al giudizio professionale della persona che somministra o supervisiona la somministrazione delle composizioni.

I tumori a cui possono essere applicate le composizioni e i metodi della presente invenzione comprendono gonfiori e tumori effettivi, inclusi tumori benigni e maligni. Esempi specifici di tali tumori sono gliomi come astrocitoma, glioblastoma, medulloblastoma, oligodendroglioma, ependimoma e papilloma del plesso coroideo; tumori cerebrali come meningioma, adenoma ipofisario, neurioma, tumore congenito, tumore cerebrale metastatico; carcinoma a cellule squamose, linfoma, una varietà di adenomi e tumori faringei dovuti a questi adenomi come il cancro epifaringeo, il cancro rinofaringeo e il cancro ipofaringeo; carcinoma laringeo, timoma; mesotelioma come mesotelioma pleurico, mesotelioma peritoneale e mesotelioma pericardico; tumori al seno come carcinoma del dotto toracico, carcinoma lobulare e carcinoma papillare; tumori polmonari come carcinoma a piccole cellule, adenocarcinoma, carcinoma a cellule squamose, carcinoma a grandi cellule e carcinoma adenosquamoso; carcinoma gastrico; carcinomi esofagei come carcinomi esofagei cervicali, carcinomi esofagei toracici e carcinomi esofagei addominali; carcinomi dell'intestino crasso come carcinoma rettale, carcinoma del colon simil-S(sigmoidale), carcinoma del colon ascendente, carcinoma del colon laterale, carcinoma del cieco e carcinoma del colon discendente; epatomi come carcinoma epatocellulare, carcinoma del dotto epatico intraepatico, blastoma epatocellulare e cistoadenocarcinoma del dotto epatico; carcinoma pancreatico; tumori pancreatici dipendenti dall'ormone come insulinoma, gastrinoma, adenoma produttore di VIP, carcinoma del dotto epatico extraepatico, carcinoma della capsula epatica, carcinoma perianale, carcinoma renale pelvico e uretrale; carcinoma uretrale; tumori renali come carcinoma a cellule renali (tumore di Grawitz), tumore di Wilms<1> (nefroblastoma) e angiomiolipoma renale; tumori testicolari o tumori a cellule germinali come seminoma, carcinoma embrionale, tumore del sacco vitellino, coriocarcinoma e teratoma; carcinoma prostatico, carcinoma della vescica, carcinoma della vulva; isterocarcinomi come carcinoma della cervice uterina, carcinoma del corpo uterino e solenoma; isteromioma, sarcoma uterino, malattie dei villi, carcinoma della vagina; tumori a cellule germinali ovariche come disgerminoma, tumore del sacco vitellino, teratoma prematuro, carcinoma dermoidale e tumori ovarici come carcinoma ovarico; melanomi come nevociti e melanomi; linfomi cutanei come micosi fungoidi, tumori cutanei come tumori endoepidermici derivano da tumori cutanei, tumori prodromici o simili e carcinoma spinocellulare, sarcomi dei tessuti molli come istiocitomatosi fibrosa, liposarcoma, rabdomiosarcoma, leiomiosarcoma, sarcoma sinoviale, sarcoma fibroplastico (fibrosarcoma), neurioma, emangiosarcoma, fibrosarcoma, neurofibrosarcoma, peritelioma (emangiopericitoma) e sarcoma della parte molle alveolare, linfomi come linfoma di Hodgkin e linfoma non Hodgkin, mieloma, plasmacitoma, leucemia mielocitica (mieloide) acuta e leucemia mieloide cronica, leucemia come linfoma leucemico a grandi cellule T e leucemia linfocitica cronica, malattie mieloproliferative croniche come pletora vera, trombocitemia essenziale e mielofibrosi idiopatica, ingrossamento (o rigonfiamento) dei linfonodi, tumore del versamento pleurico, tumore ascitico, altri vari tipi di adenomi, lipoma, fibroma, emangioma, fibromioma ed endotelioma.

In un ulteriore aspetto, l'invenzione fornisce una cellula ricombinante comprendente il vettore menzionato sopra. In un'ulteriore forma di realizzazione, la cellula sopra menzionata è una cellula presentante l'antigene (ad esempio una cellula tumorale).

In un ulteriore aspetto, l'invenzione fornisce una composizione comprendente la suddetta cellula e un veicolo o eccipiente farmaceuticamente accettabile.

Nell'ambito dell'invenzione sono presenti cellule (ad esempio cellule ospiti) trasfettate o trasformate con l'acido nucleico o il vettore dell'invenzione. I metodi per trasformare/trasfettare cellule ospiti con acidi/vettori nucleici sono ben noti nella tecnica e dipendono dal sistema ospite selezionato come descritto in Ausubel et al. (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994). I termini "trasformazione" e "trasfezione" si riferiscono a tecniche per l'introduzione di acido nucleico estraneo in una cellula ospite, tra cui coprecipitazione con fosfato di calcio o cloruro di calcio, trasfezione mediata da destrano-DEAE, lipofezione, elettroporazione, microiniezione e trasfezione mediata da virus. Le cellule ospiti trasfettate o trasformate con l'acido nucleico o il vettore dell'invenzione possono essere utilizzate come vaccino (ad esempio vaccino a cellule autologhe) al fine di indurre o aumentare una risposta immunitaria contro un epitopo antigenico o un antigene (ad esempio, STEAP) in un soggetto. Ad esempio, le cellule ospiti (ad esempio, APC, cellule dendritiche) possono essere rimosse da un soggetto (ad esempio, un malato di cancro), trasfettate o trasformate secondo la presente invenzione e somministrate nuovamente al paziente. Ovviamente, passaggi noti per coltivare o modificare ulteriormente queste cellule potrebbero essere eseguiti prima di reiniettarli/trapiantarli in un soggetto. Ad esempio, citochine/chemochine o mitogeni o molecole potrebbero essere aggiunti al terreno di coltura.

Sebbene siano qui descritte varie forme di realizzazione dell'invenzione, molti adattamenti e modifiche possono essere apportati nell'ambito dell'invenzione secondo la conoscenza generale comune degli esperti del settore. Tali modifiche includono la sostituzione di equivalenti noti per qualsiasi aspetto dell'invenzione al fine di ottenere lo stesso risultato sostanzialmente nello stesso modo. Gli intervalli numerici sono comprensivi dei numeri che definiscono l'intervallo. Nelle rivendicazioni, il termine "comprendente" è usato come termine a tempo indeterminato, sostanzialmente equivalente alla frase "che include, ma senza limitazioni".

L'invenzione verrà illustrata mediante esempi non limitativi in riferimento alle figure seguenti.

Fig. 1: L'ADCC delle cellule NK di donatori sani è modulata negativamente dai sieri dei pazienti resistenti a trastuzumab (PD) ma non con remissione completa (RC)

Fig. 2: I livelli di CHI3L1 sono correlati alla progressione della malattia e alla prognosi sfavorevole nel carcinoma mammario. (a) livelli di CHI3L1 nei sieri di pazienti PO con carcinoma mammario HER2 (N = 10), pazienti CR (N = 10) e controlli sani (N = 9) durante il trattamento (riquadro sinistro) o all'endpoint dello studio (pannello destro), (b) sopravvivenza globale dei pazienti con carcinoma mammario HER-2 positivo secondo l'espressione CHI3L1 nel tumore primario (n=95, cutoff =mediano), fonte: Kmplotter (carcinoma

mammario), (c) sopravvivenza globale dei pazienti con carcinoma mammario di tutti i sottotipi in base all'espressione genica CHI3L1 nel tumore primario (n=508, cutoff = mediano), fonte: E-GEOD-25066. (d) ed (e) Sopravvivenza libera da recidiva di pazienti con carcinoma mammario in base all'espressione genica di CHI3L1 nel tumore primario (cutoff=più significativo), fonte: rispettivamente E-GEOD-42568 e GSE29271.

Fig. 3: CHI3L1 inibisce l'ADCC e la citotossicità naturale delle cellule NK e delle cellule T CD8 compromettendo la polarizzazione dei granuli litici nella sinapsi immunitaria.

(a) Inibizione dose-dipendente dell'ADCC delle cellule NK da rhCHI3L1 contro cellule bersaglio SKBR3 sovraesprimenti Her2, (b) effetto di rhCHI3L150 ng/ml sull'ADCC di cellule NK da diversi donatori sani (N=7). (c) Effetto di 50 ng/ml di rhCHI3L1 sulla citotossicità naturale delle cellule NK contro bersagli mancanti di K562 MHC-I (N«5 donatori sani), (d) effetto di rhCHI3Ll sulla citotossicità di cellule T CD8 contro le cellule MEC-1 caricate con super-antigene (SEB). (e) Effetto di rhCHI3L1 50 ng/ml sulle cellule NK murine ADCC (N=6 topi), (f) quantificazione di immagini di microscopia confocale che mostrano le frequenze di granuli litici correttamente polarizzati nelle cellule NK coniugate in ADCC con cellule bersaglio SKBR3 (N=numero di coniugati NK contati da 4 donatori sani). Tutti i grafici sono rappresentativi di almeno due valutazioni indipendenti. I valori in tutti i grafici rappresentano la media ± DS (Cl 95%, *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001, NS, non significativo).

Fig. 4: L'ADCC delle cellule NK e l'efficacia di trastuzumab vengono ripristinate bloccando l'attività di CHI3L1

Fig. 5: CHI3L1 lega RAGE e blocca la sua segnalazione JNK a valle.

(a) Diagrammi per l'espressione di RAGE su cellule NK (a sinistra) e MFI dell'espressione di RAGE su cellule NK trattate con rhCHI3L1. (b) MFI di granuli litici colorati in NK trattate con CHI3L1 (50 ng/ml) o anticorpo bloccante anti-RAGE (10 ug/ml) per lh. (c) effetto del blocco RAGE sulla citotossicità delle cellule NK (d) Livelli basali di P-JNK nelle cellule NK trattate con CHI3L1 (e) livelli di P-JNK nelle cellule NK dopo 10 minuti di stimolazione dal ligando RAGE S100A8/A9 (10 ug/ml) da solo o con rhCHI3L1 (100 ng/ml) e (f) livelli di P-JNK nel tempo durante l'ADCC delle cellule NK incubate con obiettivi SKBR3 al rapporto E:T (5:1). Tutti i grafici sono rappresentativi di almeno due valutazioni indipendenti. I valori in tutti i grafici rappresentano la media ± DS (Cl 95%, *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001, NS, non significativo) Fig. 6: Effetto della sovraespressione di CHI3L sulla crescita tumorale e risposta al trattamento nello Xenotrapianto del carcinoma mammario HER2+

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

ESEMPI

Esempio 1

Materiali e metodi

Pazienti

Le donne con diagnosi istologica di BC invasivo o metastatico localmente avanzato sono state considerate ammissibili allo studio se classificate come HER-2 positive, ovvero punteggio 3+ (mediante analisi immunoistochimica: IHC) o punteggio IHC 2+ e FISH (ibridazione in situ a fluorescenza) amplificati. Trenta pazienti affetti da BC sottoposti a una chemioterapia di prima linea in combinazione con trastuzumab sono stati arruolati nello studio. La risposta a trastuzumab è stata valutata sulla base dell'esame clinico, patologico e radiologico del tumore prima e dopo il trattamento. I criteri RECIST rivisti (versione 1.1) sono stati usati per valutare la risposta al trattamento che è stata classificata come risposta completa (CR) e progressione della malattia (PD). I campioni di sangue sono stati raccolti a livello basale (prima della terapia con trastuzumab) e successivamente fino a quando i pazienti non hanno raggiunto lo stato PD o RC (12 mesi).

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'ospedale dell'Istituto Europeo di Oncologia di Milano, Italia, ed è stato ottenuto un consenso informato da ciascun paziente. Saggio di citotossicità

La citotossicità mediata da cellule NK e CD8 T mediata dalle cellule T è stata determinata utilizzando i reagenti di citotossicità DELFIA® EuTDA (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA, USA), secondo le istruzioni del produttore. In breve, le cellule bersaglio (1X10<6 >cellule/ml) sono state incubate con BATDA appena preparato (un ligando che migliora la fluorescenza) 10 μM in 2 ml di terreno di coltura per 30 minuti a 37 °C e lavate. Successivamente, 100�l di cellule bersaglio marcate con BATDA (5.000 cellule) sono state trasferite in una piastra sterile con fondo a V. Nei saggi ADCC, le cellule SKBR3 (commerciali di ATCC, HTB30) sono state trattate con Truguzumab (Roche) 10 ug/ml per 20 minuti a 37 °C e in cellule T CD8 primarie [da donatori sani, previo consenso informato] bersagli di citotossicità MEC1 (banca di linee cellulari IEO) sono stati caricati con SEB sAg 2 ug/ml (SIGMA) per 30 minuti a 37 °C. Le cellule effettrici sono state trattate come descritto in ciascun esperimento e quindi coltivate in co-coltura con cellule bersaglio per 1 ora e 30 minuti in caso di ADCC e 2 ore in caso di citotossicità NK naturale o citotossicità delle cellule T CD8 con rapporto effettore/bersaglio di 10:1. Dopo l'incubazione, 20 microlitri di surnatante da ciascun pozzetto sono stati trasferiti nei pozzetti di piastre a 96 pozzetti a fondo piatto. Sono stati quindi aggiunti 180�l di soluzione di europio (Eu) per formare chelati altamente fluorescenti e stabili (EuTDA) e le fluorescenze di questi chelati sono state misurate mediante fluorometria risolta nel tempo (Victor3, PerkinElmer). La percentuale di rilascio specifico è stata calcolata utilizzando (rilascio sperimentale - rilascio spontaneo)/(rilascio massimo - rilascio spontaneo) X 100(%). Negli esperimenti di blocco, l'anti-CHI3L1 (clone MaY, MABC196, Sigma-Aldrich) o l'isotipo mIgG1 (EMD millipore) o rhsIL13ra2 (abcam) è stato preincubato con l'agente di trattamento (siero paziente o rhCHI3L1) per 1 ora prima di aggiungere la miscela a sospensioni di cellule NK e incubazione per 1 ora prima della co-coltura con cellule bersaglio. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato.

Citometria a flusso

Sospensioni a singola cellula, di sangue o da coltura cellulare, sono state ottenute e incubate con anticorpo bloccante il recettore Fc prima di essere colorate su ghiaccio. Le cellule morte sono state escluse dalla colorazione vivo/morto usando coloranti fissi/morti fissi fissabili (Thermofisher scientific). Le cellule NK primarie [da donatori sani, dopo il consenso informato] sono state isolate come singoletti, CD14neg, FSC-. SSC appropriati per linfociti, cellule CD3neg, CD16/CD56pos. La colorazione intracellulare è stata eseguita utilizzando un tampone di fissazione e permeabilizzazione (BD Bioscience). Per esperimenti con tecnica PhosphoFlow, le cellule NK sono state fissate con PFA 4% per 12 minuti a 37 °C immediatamente dopo il tempo di trattamento e permeabilizzate con tampone PermIII ghiacciato (BDbioscience) per 30 minuti su ghiaccio. Le cellule colorate sono state analizzate sul citometro FACSCanto II (BD Biosciences). I doppietti di cellule sono stati esclusi confrontando la larghezza di dispersione laterale con l'area di dispersione in avanti. I dati della citometria a flusso sono stati analizzati con il software FlowJo v10 (Tree Star).

RISULTATI

Per studiare il coinvolgimento dell'ADCC mediata da cellule NK nella resistenza al trastuzumab, gli inventori hanno raccolto sieri da pazienti con carcinoma mammario metastatico trattati con trastuzumab nella terapia adiuvante. Le cellule NK isolate da donatori sani sono state incubate con i sieri dei pazienti e testate per l'attività citotossica. Gli inventori hanno scoperto che la risposta a trastuzumab può essere prevista in base alla capacità del siero di pazienti trattati di influire sull'attività delle cellule NK sane in cui i sieri dei non responder (N=8) hanno ridotto l'attività delle cellule NK, mentre i sieri dei responder non hanno avuto alcun effetto sull'attività delle cellule NK (N=11) (Figura 1).

Per identificare le molecole coinvolte nel fenomeno osservato, gli inventori hanno effettuato un'analisi proteomica comparativa dei sieri dei pazienti responder rispetto ai pazienti non responder e hanno identificato alcuni candidati molecolari che potrebbero spiegare sia la resistenza innata che la resistenza acquisita al trastuzumab. Tra questi, la proteina chitinasi 3-simile 1 (CHI3L1) è stata trovata elevata al basale nei sieri dei non responder o aumentata durante la terapia nei sieri dei pazienti con resistenza acquisita (Fig. 2a). In linea con questi risultati, un'alta espressione di CHI3L1 nei tumori primari era correlata a una peggior sopravvivenza globale (OS) e sopravvivenza libera da progressione (PFS) in diverse coorti pubbliche di carcinoma mammario (Fig. 2b-e).

Per verificare se CHI3L1 è direttamente responsabile della ridotta attività citotossica, abbiamo pretrattato le cellule NK con rCHI3L1 prima di incubarle con cellule bersaglio. Gli inventori hanno scoperto che l'aggiunta di CHI3L1 altera la citotossicità sia anticorpale che naturale delle cellule NK umane e murine in modo dose-dipendente (Fig. 3a-c,e). È interessante notare che gli inventori hanno osservato una simile inibizione della citotossicità delle cellule T CD8 contro bersagli MEC-1 caricati con super-antigene SEB (Fig.3d). L'imaging confocale della sinapsi immunitaria tra le cellule NK e le cellule bersaglio ha rivelato una polarizzazione alterata dei granuli litici verso la sinapsi immunitaria nelle cellule trattate con CHI3l1 (Fig. 3e).

Per testare la possibilità di ripristinare la citotossicità dipendente dal trastuzumab delle cellule NK, gli inventori hanno co-incubato con un anticorpo neutralizzante CHI3L1 (mAY) o rhIL13ra2 solubile. Entrambi i metodi hanno annullato l'effetto inibitorio di CHI3L1 (Fig. 4).

Per chiarire il meccanismo molecolare con cui CHI3L1 agisce sulle cellule NK, gli inventori hanno prima analizzato l'espressione del recettore dei prodotti finali di glicazione avanzata (RAGE). Coerentemente con una funzione di attivatore precedentemente descritta di RAGE nelle cellule NK murine, gli inventori hanno riscontrato che questo recettore è stato espresso ad alti livelli su cellule NK CD56+. Inoltre, l'espressione di RAGE è stata sottomodulata dopo l'incubazione con CHI3L1 suggerendo l'internalizzazione di RAGE al legame con CHI3L1 (Fig. 5a).

Successivamente gli inventori hanno cercato di convalidare il ruolo di RAGE nella citotossicità delle cellule NK. L'anticorpo anti-RAGE, analogamente al CHI3L1, ha inibito l'ADCC delle cellule NK e ha indotto una diminuzione dei granuli litici (Fig. 5b, c). Questo ha suggerito che CHI3L1 abbia svolto una funzione inibitoria piuttosto che attivatrice attraverso il legame con RAGE. Per risolvere questo problema, gli inventori hanno valutato l'effetto del legame con CHI3L1 sulla via di segnalazione a valle di RAGE. Gli inventori si sono concentrati su percorsi che si sono dimostrati importanti per la citotossicità delle cellule NK, tra cui biologia e polarizzazione dei granuli, in particolare ERK1/2 e JNK. Mentre il trattamento con CHI3L1 non ha influito sui livelli di fosforilazione di ERK1/2, i livelli basali di P-JNK sono diminuiti in modo dose-dipendente nelle cellule NK trattate con CHI3L1 (Fig. 4d). Inoltre, CHI3L1 si è opposto all'induzione della fosforilazione di JNK da parte dell'agonista RAGE S100A8/A9, che è stato descritto per attivare le cellule NK murine attraverso RAGE (Fig.4e). Gli inventori hanno scoperto che l'attivazione di JNK si è verificata in modo dipendente dal tempo durante l'ADCC delle cellule NK e il pretrattamento con CHI3L1 o anti-RAGE ha portato a livelli significativamente più bassi di P-JNK durante l'ADCC, suggerendo una fosforilazione JNK subottimale nelle cellule trattate con CHI3L1 (Fig. 5f).

Esempio 2

Modelli in vivo

Gli inventori useranno due diversi modelli di xenotrapianto di carcinoma mammario HER2+ in topi nudi per valutare l'effetto di CHI3L1 sull'efficacia del trastuzumab in vivo (dipendente dall'ADCC delle cellule NK):

Modello 1: "modello di dimostrazione di fattibilità"

Modello di xenotrapianto SKBR3 in cui le cellule SKBR3 vengono trasfettate per sovraesprimere la proteina CHI3L1. I tumori SKBR3 sono sensibili a trastuzumab come condizione di partenza; gli inventori valuteranno se la sovraespressione di CHI3L1 annullerà la loro sensibilità al trattamento con trastuzumab. Come menzionato, queste cellule sono fatte per sovraesprimere il CHI3L1 murino che ha azione sulle cellule stesse (SKBR3 sono cellule umane). Pertanto, qualsiasi effetto osservato sarà attribuito all'influenza di CHI3L1 solo sull'ospite (come l'inibizione dell'ADCC delle cellule NK) (si veda la Figura 6).

Modello 2: "modello terapeutico HER2"

In questo modello verranno utilizzate cellule Her2+ HCC1569. Queste cellule sono isolate da pazienti resistenti al trastuzumab e secernono alti livelli di CHI3L1 endogeno (non manipolati dalla trasfezione come il modello precedente). Gli inventori testeranno se la somministrazione di un ligando neutralizzante CHI3L1 da solo o in combinazione con trastuzumab può influire sulla crescita tumorale. Questo modello rispecchia da vicino la malattia umana HER2+, resistente al trastuzumab, con livello elevato di CHI3L1. Il successo del trattamento anti-CHI3L1 in questo modello fornirà grande rilevanza per la sua applicazione clinica. Naturalmente, gli inventori valuteranno se l'effetto che gli inventori vedono dipende dal sistema immunitario, direttamente dal tumore o da entrambi.

Tabella 1 - Anticorpi terapeutici approvati in cui l'ADCC è un fattore determinante dell'efficacia del trattamento:

Claims

Rivendicazioni 1. Un soppressore o inibitore dell'espressione e/o dell'attività della chitinasi 3-simile 1 (CHI3L1) per l'uso nella prevenzione e/o nel trattamento dei tumori, in cui detti tumori sono resistenti alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC) e/o per l'uso nella riduzione del rischio di sviluppare resistenza alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC).
2. Il soppressore o inibitore per l'uso secondo la rivendicazione 1, in cui il tumore è un tumore resistente alle terapie anticorpali anti-HER2, anti-CD20, anti-GD20, anti-CCR4 o anti-EGFR, preferibilmente il tumore è resistente a trastuzumab, pertuzumab, rituximab, dinituximab, obinutuzumab, mogamulizumab, cetuximab e/o panitumumab.
3. Il soppressore o inibitore per l'uso secondo qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il tumore è un tumore al seno comprendente cellule tumorali HER2 positive che è resistente alle terapie anti-HER2, preferibilmente è resistente a trastuzumab e/o pertuzumab.
4. Il soppressore o inibitore per l'uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, che è in grado di ripristinare la citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC) delle cellule NK.
5. Il soppressore o inibitore per l'uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il soppressore o l'inibitore è almeno una molecola selezionata dal gruppo costituito da: a) un anticorpo o un suo frammento; b) un polipeptide; c) una piccola molecola; d) un polinucleotide codificante per detto anticorpo o polipeptide o un suo derivato funzionale; e) un polinucleotide, come un costrutto antisenso, un oligonucleotide antisenso, un costrutto per “RNA interference” o siRNA, e) un vettore comprendente o esprimente il polinucleotide come definito in d) o e); f) un componente di CRISPR/Cas9, ad esempio un sgRNA; g) una cellula ospite geneticamente modificata che esprime detto polipeptide o anticorpo o comprendente il polinucleotide come definito in d) o e) o almeno un componente di f).
6. Il soppressore o inibitore per l'uso secondo qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto soppressore o inibitore è un anticorpo anti-CHI3L1, preferibilmente un anticorpo monoclonale, più preferibilmente il clone mAY, o un inibitore del recettore CHI3L1, o la forma solubile del recettore CHI3L1, preferibilmente il recettore alfa 2 dell'interleuchina 13 (IL13ra2), o il recettore per i prodotti finali di glicazione avanzata (RAGE).
7. Il soppressore o inibitore per l'uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, usato in combinazione con almeno un anticorpo terapeutico che è capace di citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC), preferibilmente con un anticorpo anti-HER2, anti-CD20, anti-CCR4 e/o anti-EGFR, più preferibilmente con trastuzumab, pertuzumab, rituximab, dinituximab, obinutuzumab, mogamulizumab, panitumumab e/o cetuximab, più preferibilmente trastuzumab e/o pertuzumab.
8. Una composizione farmaceutica comprendente: i. almeno un soppressore o inibitore dell'espressione e/o dell'attività della chitinasi 3-simile 1 (CHI3L1) come definito in qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, ii. almeno un anticorpo terapeutico capace di citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC) e iii. almeno un eccipiente, diluente o veicolo farmaceuticamente accettabile per l'uso nella prevenzione e/o nel trattamento dei tumori, in cui detti tumori sono resistenti alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC) e/o per l'uso nella riduzione del rischio di sviluppare resistenza alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC), preferibilmente detto anticorpo che è capace di citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC) è almeno un anticorpo selezionato dal gruppo costituito da: trastuzumab, pertuzumab, rituximab, dinituximab, obinutuzumab, mogamulizumab, panitumumab e cetuximab, preferibilmente trastuzumab e/o pertuzumab.
9. La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 8, comprendente inoltre un agente terapeutico, in cui detto agente terapeutico è per il trattamento e/o la prevenzione dei tumori.
10. La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 8 o 9, in cui il tumore è un tumore resistente alle terapie anticorpali anti-HER2, anti-CD20, anti-GD20, anti-CCR4 o anti-EGFR, preferibilmente il tumore è resistente a trastuzumab, pertuzumab, rituximab, dinituximab, obinutuzumab, mogamulizumab, cetuximab e/o panitumumab.
11. La composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 10, in cui il tumore è un tumore al seno comprendente cellule tumorali HER2 positive che è resistente alle terapie anti-HER2, preferibilmente è resistente a trastuzumab e/o pertuzumab.
12. Un metodo in vitro per identificare il paziente con un tumore che è resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC), comprendente i passaggi di: a) rilevamento di CHI3L1 in un campione biologico isolato ottenuto dal paziente e b) confronto rispetto a un controllo adeguato, in cui una quantità di CHI3L1 nel campione biologico isolato ottenuto dal soggetto superiore alla quantità di controllo indica che il tumore è resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC).
13. Un metodo in vitro per la prognosi e/o la diagnosi e/o la valutazione del rischio di sviluppo e/o per il monitoraggio della progressione e/o per il monitoraggio dell'efficacia di un trattamento terapeutico e/o per lo screening di un trattamento terapeutico di un tumore resistente alle terapie dipendenti dalla citotossicità mediata da cellule dipendente da anticorpi (ADCC) in un soggetto comprendente i passaggi di: a) rilevamento di CHI3L1 in un campione biologico isolato ottenuto dal soggetto e b) confronto rispetto a un controllo adeguato.