JP7539127B2

JP7539127B2 - 細胞増殖促進剤、ｍｍｐ－２阻害剤、皮膚外用剤、医薬品及び内用剤

Info

Publication number: JP7539127B2
Application number: JP2019209598A
Authority: JP
Inventors: 大生堀場; 真志平川; 勉坂井田
Original assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Current assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Priority date: 2019-11-20
Filing date: 2019-11-20
Publication date: 2024-08-23
Anticipated expiration: 2039-11-20
Also published as: JP2021080212A

Description

本発明は、細胞増殖促進剤、ＭＭＰ－２阻害剤、皮膚外用剤、医薬品及び内用剤に関する。

加齢と共に表皮細胞の増殖・分裂能は低下し、表皮層自体は薄くなる（非特許文献１）。生体因子であるＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ（ＥＧＦ／上皮細胞成長因子）や女性ホルモン（エストロゲン）は皮膚の表皮細胞増殖に働きかけるが、加齢と共にその分泌は低下する。このような加齢による表皮細胞代謝機能の低下は、皮膚のターンオーバー速度を遅らせ、肌荒れや皮膚の老化の原因となる。また、角層表面から剥がれ落ちる角層細胞が滞留することで、表皮内メラニンの排泄がスムーズに行われなくなり、色素沈着や肌のくすみの原因となる。さらに表皮の創傷治癒が遅くなること等も知られている。これらの現象の進行を防止あるいは改善するために、表皮細胞の増殖を促進させる成分の探索や、多くの皮膚外用剤の提案がなされてきた。

マトリックスメタロプロテアーゼ（以下ＭＭＰとする）に属するゼラチナーゼ（ＭＭＰ－２）は、線維芽細胞や内皮細胞、ガン細胞等が産生する酵素であり、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン（動脈、腱、皮膚など弾性組織の特殊成分をなす構造タンパク質）等の基質や基底膜の主要構成成分であるラミニン５などを分解する。その発現及び活性は、紫外線の照射により大きく増加し、紫外線による基底膜成分の減少、基底膜の構造変化の原因となり、皮膚におけるシワやたるみの形成等の大きな要因となることが明らかとなっている（非特許文献２）。従って、ゼラチナーゼに対して阻害活性を有する物質は、皮膚におけるシワやたるみの予防だけでなく、ガン組織における血管新生やガンの転移を抑制する効果が期待され、ガン疾患の予防、治療に有用であると考えられる。さらに、ＭＭＰ－２は、潰瘍形成、慢性関節リュウマチ、骨粗鬆症、歯周炎等の種々の病態での細胞外基質の分解に関与していることが報告されている。よって、ＭＭＰ－２の阻害活性を有すれば、ガンの転移、潰瘍形成、慢性関節リュウマチ、骨粗鬆症、歯周炎等、ＭＭＰ－２の亢進が原因で起こる各種疾患の治療及び改善に有用である。

バラ目バラ科キンミズヒキ属のキンミズヒキ（Ａｇｒｉｍｏｎｉａｐｉｌｏｓａ）は、その全草の抽出物が、チロシナーゼ活性阻害作用や活性酸素阻害作用を有し、美白及び老化防止化粧料に適用されること（特許文献１）や、メラニン生成抑制作用やＭＭＰ－１活性阻害作用、コラーゲン産生促進作用を有し、皮膚化粧料に適用されること（特許文献２）、ドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有し美白剤に適用されること（特許文献３）が知られている。しかしながら、これらのキンミズヒキが、細胞増殖促進作用及びＭＭＰ－２阻害作用を有することは知られていなかった。

特開平５－９７６４８号公報特開２０１０－６５００９号公報特開２０１０－１９５７３１号公報

ＶａｒａｎｉＪｅｔａｌ．，ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ，Ｖｏｌ．３，ｐｐ５７－６０，１９９８ＧａｒｙＪ．Ｆｉｓｈｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３７９，Ｎｏ．２５，ｐｐ３３５，１９９６

安全で安定性に優れ、細胞増殖促進作用及びＭＭＰ－２阻害作用に優れた素材が望まれているが、未だ十分満足し得るものが提供されていないのが現状である。

このような事情により、本発明者らは鋭意検討した結果、キンミズヒキの抽出物が優れた細胞増殖促進作用及びＭＭＰ－２阻害作用を持ち、安定性においても優れていることを見出した。さらに、その抽出物を含有する外用剤又は内用剤が、安全で安定であり、細胞増殖促進作用及びＭＭＰ－２阻害作用に優れており、多機能性美容・健康用素材・医薬品と成り得ることを見いだし、本発明を完成するに至った。

本発明に用いるキンミズヒキは、バラ目バラ科キンミズヒキ属の植物で、日本から東ヨーロッパにかけて広く分布している多年草である。日本では、本州、四国、九州などの林や原野、路傍などに生息している。草丈は１ｍ程にまで伸び、表面には全体的に長毛が密生している。夏から秋にかけ、長く伸びた茎の上部に、黄色の小さな花を穂状につける。この黄色い小花を細長く穂のように咲かせる姿を「金色の水引」に見立てて、「キンミズヒキ」の名がついたと言われている。生薬名は、「仙鶴草」もしくは「龍牙草」という。

本発明におけるキンミズヒキの抽出物とは、バラ目バラ科キンミズヒキ属のキンミズヒキ（学名：Ａｇｒｉｍｏｎｉａｐｉｌｏｓａ）が用いられ、部位としては、花、実、種子、葉、茎、根等の植物体の一部又は全草から抽出したものである。その抽出方法は特に限定されず、例えば、加熱抽出したものであってもよいし、常温抽出したものであってもよい。また、抽出には、植物体をそのまま使用してもよく、乾燥、粉砕、細切等の処理を行ってもよい。

抽出方法は、特に限定されないが、水もしくは熱水、又は水と有機溶媒の混合溶媒を用い、撹拌又はカラム抽出する方法等により行うことができる。抽出溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール等）、液状多価アルコール類（１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール及び液状多価アルコール等の極性溶媒が良く、特に好ましくは、水、エタノール、１，３－ブチレングリコール及びプロピレングリコールがよい。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いてもよい。特に好ましい抽出溶媒としては、水、又は水－エタノール系の混合極性溶媒が挙げられる。溶媒の使用量については、特に限定はなく、例えばキンミズヒキの全草（乾燥重量）に対し、１０倍以上、好ましくは２０倍以上であればよいが、抽出後に濃縮を行ったり、単離したりする場合の操作の便宜上１００倍以下であることが好ましい。また、抽出温度や時間は、用いる溶媒の種類や抽出時の圧力等によって適宜選択できる。

上記抽出物は、抽出した溶液のまま用いてもよいが、必要に応じて、本発明の効果を奏する範囲で、濃縮（減圧濃縮、膜濃縮等による濃縮）、希釈、濾過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理を行ってから用いてもよい。さらには、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いてもよい。

本発明は、上記抽出物をそのまま使用しても良く、抽出物の効果を損なわない範囲内で、化粧品、医薬部外品、医薬品及び食品等に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、皮膜剤、甘味料、酸味料等の成分が含有されていてもよい。

本発明は、化粧品、医薬部外品、医薬品、食品のいずれにも用いることができ、その剤形としては、例えば、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、錠菓、カプセル剤、チョコレート、ガム、飴、飲料、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤、坐剤、注射用溶液等が挙げられる。

外用の場合、本発明に用いる上記抽出物の含有量は、固形物に換算して０．０００１重量％以上が好ましく、０．００１～１０重量％がより好ましい。さらに、０．０１～５重量％が最も好ましい。０．０００１重量％未満では十分な効果は望みにくい。１０重量％を越えると、効果の増強は認められにくく不経済である。

内用の場合、摂取量は年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なる。通常、成人１人当たりの１日の摂取量としては、５ｍｇ以上が好ましく、１０ｍｇ～５ｇがより好ましい。さらに、２０ｍｇ～２ｇが最も好ましい。

次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる抽出物の製造例、実験例及び処方例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。製造例に示す％とは重量％を、処方例に示す含有量の部とは重量部を示す。

キンミズヒキの抽出物の製造例
キンミズヒキの抽出物を以下のとおり製造した。製造例１～４において抽出材料にはキンミズヒキの全草を用いた。

（製造例１）キンミズヒキの熱水抽出物の調製
キンミズヒキの乾燥物１０ｇに２００ｍＬの水を加え、９５～１００℃で２時間抽出した。得られた抽出液を濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してキンミズヒキの熱水抽出物を０．９ｇ得た。

（製造例２）キンミズヒキの５０％エタノール抽出物の調製
キンミズヒキの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％エタノール水溶液に室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してキンミズヒキの５０％エタノール抽出物を１．０ｇ得た。

（製造例３）キンミズヒキのエタノール抽出物の調製
キンミズヒキの乾燥物１０ｇを２００ｍＬのエタノールに室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してキンミズヒキのエタノール抽出物を０．２ｇ得た。

（製造例４）キンミズヒキの１，３－ブチレングリコール抽出物の調製
キンミズヒキの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの１，３－ブチレングリコールに室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過してキンミズヒキの１，３－ブチレングリコール抽出物を１９０ｇ得た。

（処方例１）化粧水
処方含有量（部）
１．キンミズヒキの熱水抽出物（製造例１）２．０
２．１，３－ブチレングリコール８．０
３．グリセリン２．０
４．キサンタンガム０．０２
５．クエン酸０．０１
６．クエン酸ナトリウム０．１
７．エタノール５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．）０．１
１０．香料適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～６及び１１と、成分７～１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。

（比較処方例１）従来の化粧水
処方例１において、キンミズヒキの熱水抽出物を精製水に置き換えたものを、従来の化粧水とした。

（処方例２）クリーム
処方含有量（部）
１．キンミズヒキの５０％エタノール抽出物（製造例２）１．０
２．スクワラン５．５
３．オリーブ油３．０
４．ステアリン酸２．０
５．ミツロウ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）３．０
８．ベヘニルアルコール１．５
９．モノステアリン酸グリセリン２．５
１０．香料０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１２．１，３－ブチレングリコール８．５
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。

（比較処方例２）従来のクリーム
処方例２において、キンミズヒキの５０％エタノール抽出物を精製水に置き換えたものを、従来のクリームとした。

（処方例３）乳液
処方含有量（部）
１．キンミズヒキのエタノール抽出物（製造例３）０．０１
２．スクワラン５．０
３．オリーブ油５．０
４．ホホバ油５．０
５．セタノール１．５
６．モノステアリン酸グリセリン２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．）２．０
９．香料０．１
１０．プロピレングリコール１．０
１１．グリセリン２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１０～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例４）ゲル剤
処方含有量（部）
１．キンミズヒキの１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４）１．０
２．エタノール５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．）０．１
５．香料適量
６．１，３－ブチレングリコール５．０
７．グリセリン５．０
８．キサンタンガム０．１
９．カルボキシビニルポリマー０．２
１０．水酸化カリウム０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～５と、成分１及び６～１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。

（処方例５）パック
処方含有量（部）
１．キンミズヒキの熱水抽出物（製造例１）１．０
２．キンミズヒキの１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４）５．０
３．ポリビニルアルコール１２．０
４．エタノール５．０
５．１，３－ブチレングリコール８．０
６．パラオキシ安息香酸メチル０．２
７．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．）０．５
８．クエン酸０．１
９．クエン酸ナトリウム０．３
１０．香料適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～１１を均一に溶解し製品とする。

（処方例６）ファンデーション
処方含有量（部）
１．キンミズヒキの５０％エタノール抽出物（製造例２）１．０
２．ステアリン酸２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（２０Ｅ．Ｏ．）１．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）２．０
５．セタノール１．０
６．液状ラノリン２．０
７．流動パラフィン３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル６．５
９．カルボキシメチルセルロースナトリウム０．１
１０．ベントナイト０．５
１１．プロピレングリコール４．０
１２．トリエタノールアミン１．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１４．二酸化チタン８．０
１５．タルク４．０
１６．ベンガラ１．０
１７．黄酸化鉄２．０
１８．香料適量
１９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～８を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分１９に成分９をよく膨潤させ、続いて、成分１及び１０～１３を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１４～１７を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。油相に水相をかき混ぜながら加え、乳化する。その後、冷却し、４５℃で成分１８を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例７）浴用剤
処方含有量（部）
１．キンミズヒキのエタノール抽出物（製造例３）１．０
２．炭酸水素ナトリウム５０．０
３．黄色２０２号（１）適量
４．香料適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１～５を均一に混合し製品とする。

（処方例８）軟膏
処方含有量（部）
１．キンミズヒキの熱水抽出物（製造例１）５．０
２．キンミズヒキの１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４）１．０
３．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．）２．０
４．モノステアリン酸グリセリン１０．０
５．流動パラフィン５．０
６．セタノール６．０
７．パラオキシ安息香酸メチル０．１
８．プロピレングリコール１０．０
９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分３～６を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２及び７～９を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例９）散剤
処方含有量（部）
１．キンミズヒキの熱水抽出物（製造例１）１．０
２．乾燥コーンスターチ３９．０
３．微結晶セルロース６０．０
［製造方法］成分１～３を混合し、散剤とする。

（処方例１０）錠剤
処方含有量（部）
１．キンミズヒキのエタノール抽出物（製造例３）５．０
２．乾燥コーンスターチ２５．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム２０．０
４．微結晶セルロース４０．０
５．ポリビニルピロリドン７．０
６．タルク３．０
［製造方法］成分１～４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成型する。成型した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。

（処方例１１）錠菓
処方含有量（部）
１．キンミズヒキのエタノール抽出物（製造例３）２．０
２．乾燥コーンスターチ４９．８
３．エリスリトール４０．０
４．クエン酸５．０
５．ショ糖脂肪酸エステル３．０
６．香料０．１
７．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～４及び７を混合し、顆粒成型する。成型した顆粒に成分５及び６を加えて打錠する。１粒１．０ｇとする。

（処方例１２）飲料
処方含有量（部）
１．キンミズヒキの熱水抽出物（製造例１）０．０５
２．ステビア０．０５
３．リンゴ酸５．０
４．香料０．１
５．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２及び３を少量の水に溶解する。次いで、成分１、４及び５を加えて混合する。

次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。

実験例１細胞増殖促進試験
ＨａＣａＴ細胞を、０．１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液にて、９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり５×１０^３個播種し、各試料を添加した後、３７℃、５％ＣＯ_２条件下にて４日間培養した。細胞数の測定は、染色法により行った。すなわち、培養終了後、培養液を除き、メタノールを用いて細胞を固定した。続いて、０．１％メチレンブルーを加え、１時間細胞の染色を行った。乾燥させた後、０．１ＮＨＣｌを各ｗｅｌｌに１００μＬずつ加えてよく撹拌させ、マイクロプレートリーダーを用いて６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

これらの実験結果を表１に示した。その結果、本発明のキンミズヒキの熱水抽出物（製造例１）、５０％エタノール抽出物（製造例２）及びエタノール抽出物（製造例３）は、優れた細胞増殖促進作用を示した。

実験例２ＭＭＰ－２ｍＲＮＡ発現量の測定
ヒト線維芽細胞ＮＢ１ＲＧＢをφ６０ｍｍｄｉｓｈに１×１０^５個播種し、コンフルエントになった時点で、終濃度が１μｇ／ｍＬになるように試料を添加した。コントロールには、試料を希釈した溶媒を添加した。２４時間培養後、総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ（タカラバイオ）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法には、ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡＫｉｔ（アプライドバイオシステムズ）及びＳＹＢＲＳｅｌｅｃｔＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ライフテクノロジーズ）を用いた。すなわち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：６０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従い、ＭＭＰ－２ｍＲＮＡの発現量を、内部標準であるβ－ａｃｔｉｎｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。ＭＭＰ－２発現率は、コントロールのＭＭＰ－２ｍＲＮＡの発現量に対する試料添加群のＭＭＰ－２ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。

ＭＭＰ－２用のプライマーセット
ＣＣＧＴＣＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡ（配列番号１）
ＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴＴＡＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴ（配列番号２）
β－Ａｃｔｉｎ用のプライマーセット
ＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣ（配列番号３）
ＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号４）

これらの実験結果を表２に示した。その結果、本発明のキンミズヒキの抽出物には、顕著なＭＭＰ－２発現抑制効果（ＭＭＰ－２阻害効果）が認められた。さらに、キンミズヒキの５０％エタノール抽出物（製造例２）のＭＭＰ－２発現抑制効果が特に高かった。

実験例５使用試験
処方例１の化粧水及び比較処方例１の従来の化粧水を用いて、シワ、たるみがある５人（２７～６５才）を対象に１ヶ月間の使用試験を行った。使用後、シワ、たるみの程度をアンケートにより判定した。

その結果、本発明の抽出物を含有する皮膚外用剤により、シワ、たるみが軽減した。尚、試験期間中、皮膚トラブルは一人もなく、安全性においても問題なかった。また、処方成分の劣化についても問題なかった。

以上のことから、本発明のキンミズヒキの抽出物は、優れた細胞増殖促進効果及びＭＭＰ－２阻害作用を有し、安定性にも優れていた。よって、本発明のキンミズヒキの抽出物は、皮膚の老化といった美容分野だけでなく、老化による機能低下の抑制、ガンの予防、治療等といった医療分野にも利用でき、食品、化粧品、医薬部外品及び医薬品等への応用が期待される。

Claims

キンミズヒキのエタノール又はエタノールを５０重量％以上含有する含水エタノールによる抽出物を含有することを特徴とする経口用ケラチノサイト増殖促進剤（しわ又はたるみ状態の改善用を除く）。