JP2023077751A

JP2023077751A - コラーゲン産生促進剤、ｍｍｐ阻害剤、細胞増殖促進剤及び内用剤

Info

Publication number: JP2023077751A
Application number: JP2021191160A
Authority: JP
Inventors: 翔太野場; Shota Noba; 宏行山羽; Hiroyuki Yamaha; 勉坂井田; Tsutomu Sakaida
Original assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Current assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Priority date: 2021-11-25
Filing date: 2021-11-25
Publication date: 2023-06-06

Abstract

【課題】コラーゲン産生促進作用、ＭＭＰ阻害作用及び細胞増殖促進作用に優れた新規な外用剤または内用剤を提供する。【解決手段】ニワウメの抽出物は、優れたコラーゲン産生促進作用、ＭＭＰ阻害作用及び細胞増殖促進作用を有し、安定性にも優れていた。ニワウメの抽出物は、皮膚の老化予防といった美容分野だけでなく、老化による機能低下の抑制、ガンの予防、治療等といった医療分野にも利用でき、化粧品、食品、医薬部外品及び医薬品等への応用が期待される。【選択図】なし

Description

本発明は、コラーゲン産生促進剤、ＭＭＰ阻害剤、細胞増殖促進剤及び内用剤に関する。

真皮には線維芽細胞やコラーゲンが存在し、Ｉ型コラーゲンが全体の８０％を占める。Ｉ型コラーゲンの他には、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩＩ及びＸＩＶ型コラーゲン等の存在が知られている。シワやたるみの原因の一つとして、Ｉ型コラーゲンの減少が挙げられる。従って、Ｉ型コラーゲンの産生を促進させることがシワ・たるみの予防・改善に有効であると考えられる。また、Ｉ型コラーゲンの産生促進は皮膚の創傷治癒の改善にも有効である。

また、皮膚は紫外線の他、乾燥、寒冷、熱、薬物等の様々な物理的及び化学的ストレスに日々曝されている。その結果、皮膚の機能低下が引き起こされ、様々な皮膚の老化現象が顕在化する。皮膚の老化現象の一つにシワがある。シワには、表皮性のシワと、真皮性のシワの二種類が存在することが知られている。表皮性のシワは小ジワと呼ばれ、皮膚の乾燥により、表皮角質中の水分量が低下することによって一時的に生じるシワである。一方、真皮性のシワは、太陽光線に含まれる紫外線や加齢によって形成されるシワである。その形成メカニズムとしては、紫外線や加齢による真皮線維芽細胞におけるコラーゲン合成能の低下や、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の増加によるコラーゲンの分解促進が挙げられる。

乾燥に起因する表皮性のシワと真皮性のシワでは、組織学的形態、発症メカニズム、治療方法が異なり、紫外線や加齢により生じる真皮性のシワは、保湿効果を有する化粧品の使用によって改善することは困難である。

これまでに、紫外線によって生じる真皮性のシワを改善することを目的として、加水分解アーモンドを有効成分とする皮膚のシワ形成防止・改善剤（特許文献１）、ジョチョウケイ、テンキシ及びキセンソウの抽出物を有効成分とする紫外線照射に起因するシワの改善剤（特許文献２）が報告されている。

ＭＭＰはガン細胞の間質内湿潤、血管内への侵入及び血管新生に大きな役割を担っている。間質はＩ型コラーゲンを主体としており、ガン細胞の移動には間質コラゲナーゼ等による基質の破壊が必要となる。転移完成には血管内皮基底膜を破壊し間質内を移動することが必要で、この段階においてもＭＭＰが関与している（非特許文献１）。従って、ＭＭＰに対して阻害活性を有する物質は、ガン組織における血管新生やガンの転移を抑制する効果が期待され、ガン疾患の予防、治療に有用であると考えられる。このようにＭＭＰの阻害はガン疾患、潰瘍形成、動脈硬化、慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、歯周炎等、ＭＭＰの亢進が原因で起こる各種疾患の予防、治療及び改善に有用である。

ＭＭＰに属するコラゲナーゼ（ＭＭＰ－１）は、線維芽細胞や軟骨細胞等が産生する酵素であり、コラーゲンの分解促進に大きく関与している。コラーゲンは、哺乳動物組織の約１／３を占める主要な構造タンパク質であり、軟骨、骨、腱、歯茎、及び皮膚等の、多くのマトリックス組織の必須な成分である。コラゲナーゼにより一箇所を切断されると、通常の組織内では安定なコラーゲン分子は、変性して一本鎖のゼラチンとなり、他の様々なプロテアーゼにより分解されるようになる。その結果、マトリックス組織の構造の完全性が失われ、シワ、ガン疾患、潰瘍形成、骨粗鬆症、歯周炎等の原因となる。

コラゲナーゼの阻害活性を有する素材として、例えば、カカオ豆皮であるカカオハスク抽出物（特許文献３）、バラ科オニイチゴ抽出物（特許文献４）、ラクトフェリン（特許文献５）等が提案されている。皮膚老化や口腔衛生にますます関心が高まっている状況下で、副作用がなく、安全性が高い、コラゲナーゼ活性阻害作用の優れた素材を見出すことが求められている。

一般に、加齢と共に表皮角化細胞の増殖・分裂能は低下し、表皮層自体は薄くなる（非特許文献２）。生体因子であるＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ（ＥＧＦ／上皮細胞成長因子）や女性ホルモン（エストロゲン）は皮膚の表皮角化細胞増殖に働きかけるが、加齢と共にその分泌は低下する。このような加齢による表皮角化細胞代謝機能の低下は皮膚のターンオーバー速度を遅らせ、肌荒れや皮膚の老化の原因となる。また、角層表面から剥がれ落ちる角層細胞が滞留することで、表皮内のメラニンの排泄がスムーズに行われなくなり、色素沈着や肌のくすみの原因となる。さらに表皮の創傷治癒が遅くなること等も知られている。これらの現象の進行を防止あるいは改善するために、表皮角化細胞の増殖を促進させる成分の探索や、皮膚外用剤の提案が多くなされてきた。

ニワウメ（学名：Ｐｒｕｎｕｓｊａｐｏｎｉｃａ）は、バラ目バラ科スモモ属に属する落葉低木である。生薬の郁李仁（イクリニン）はニワウメの種子を乾燥させたもので、緩下、利尿に効用があるとして用いられている。これまでニワウメの抽出物は、メラニン生成抑制効果（特許文献６）、自然保湿因子（ＮＭＦ）成分産生促進効果（特許文献７）及びペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性化効果（特許文献８）を有すること等が知られている。しかしながら、ニワウメの抽出物がコラーゲン産生促進作用、ＭＭＰ阻害作用及び細胞増殖促進作用を有することは知られていなかった。

特開２０００－１１９１２５号公報特開２００６－１９９６１１号公報特開平３－４４３３１号公報特開２００３－１３７８０１号公報特開平５－１８６３６８号公報特開平７－１２６１４９号公報特開２００２－２０２２５号公報特開２００７－１１９４３２号公報

「消化器癌のおけるマトリックスメタロプロテアーゼ」、日本消化器病学会、１００巻、１５２項、２００３年ＶａｒａｎｉＪｅｔａｌ．，ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ，Ｖｏｌ．３，ｐｐ５７－６０，１９９８

安全で安定性に優れ、コラーゲン産生促進作用、ＭＭＰ阻害作用及び細胞増殖促進作用に優れた素材が望まれているが、未だ十分満足し得るものが提供されていないのが現状である。

このような事情により、本発明者らは鋭意検討した結果、ニワウメの抽出物が優れたコラーゲン産生促進作用、ＭＭＰ阻害作用及び細胞増殖促進作用を持ち、安定性においても優れていることを見出した。さらに、その抽出物を含有する外用剤または内用剤が、安全で安定であり、コラーゲン産生促進作用、ＭＭＰ阻害作用及び細胞増殖促進作用に優れており、多機能性美容・健康用素材、医薬品と成り得ることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）ニワウメの抽出物を含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
（２）ニワウメの抽出物を含有することを特徴とするＭＭＰ阻害剤。
（３）ニワウメの抽出物を含有することを特徴とする細胞増殖促進剤。
（４）ニワウメの抽出物を含有することを特徴とするシワ改善剤。
（５）ニワウメの抽出物を含有することを特徴とするＭＭＰの亢進が原因で起こる各種疾患の予防改善用食品組成物。

本発明によれば、ニワウメの抽出物を有効成分として含有するコラーゲン産生促進剤、ＭＭＰ阻害剤及び細胞増殖促進剤が提供される。

本発明に用いるニワウメ（学名：Ｐｒｕｎｕｓｊａｐｏｎｉｃａ、別名：コニワザクラ、チョウコウイクリ、リンショウバイ）は、バラ目バラ科スモモ属に属する落葉低木である。中国北部原産で、ニワウメの多くは日本各地で観賞用に栽培されている。主として、樹高は１～２ｍで枝葉が株元から分岐しており、５～７センチで卵形の葉をつけ、夏季にできる果実は直径８～１２ｍｍの球形で、熟すと光沢のある赤色になり、生で食べることができる。中には淡い褐色の種子が入っており、漢方ではこれを「郁李仁（イクリニン）、郁李子（イクリシ）」と呼び、薬用とされている。

本発明において、ニワウメの抽出物はその花、果実、種子、葉、茎、根等の植物体の一部または植物体全体（全草）、あるいはそれらの混合物の抽出物をいうが、本発明において抽出原料として使用する部位は、種子が好ましい。また、抽出には、植物体をそのまま使用しても良く、乾燥、粉砕、細切等の処理を行っても良い。

溶媒による抽出方法は特に限定されず、例えば、加熱抽出、常温抽出、低温抽出、撹拌抽出またはカラム抽出する方法等により行うことができる。抽出溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール等）、液状多価アルコール類（１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール及び液状多価アルコール等の極性溶媒が良く、特に好ましくは、水、エタノール、１，３－ブチレングリコール及びプロピレングリコールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。特に好ましい抽出溶媒としては、水、水－エタノールの混合極性溶媒または水－１，３－ブチレングリコールの混合極性溶媒が挙げられる。中でも、エタノールまたは１，３－ブチレングリコールを２０～１００重量％含有するのが好ましく、５０～１００重量％含有するのが最も好ましい。また、上記抽出溶媒に酸やアルカリを添加して、ｐＨ調整した溶媒を使用することもできる。

溶媒の使用量については、特に限定はなく、例えばニワウメの種子（乾燥重量）に対し、５倍以上、好ましくは１０倍以上であれば良いが、抽出後に濃縮を行ったり、単離したりする場合の操作の便宜上１００倍以下であることが好ましい。また、抽出温度や時間は、用いる溶媒の種類や抽出時の圧力等によって適宜選択できる。

上記抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良いが、必要に応じて、本発明の効果を奏する範囲で、濃縮（減圧濃縮、膜濃縮等による濃縮）、希釈、濾過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理を行ってから用いても良い。さらには、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いても良い。

本発明は、上記抽出物をそのまま使用しても良く、抽出物の効果を損なわない範囲で、化粧品、医薬部外品、医薬品または食品等に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、皮膜剤、甘味料、酸味料等の成分が含有されていても良い。

本発明は、化粧品、医薬部外品、医薬品、食品のいずれにも用いることができ、その剤形としては、例えば、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、錠菓、チョコレート、ガム、飴、飲料、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤、坐剤、注射用溶液等が挙げられる。

外用の場合、本発明に用いる上記抽出物の含有量は、固形物に換算して０．０００１重量％以上が好ましく、０．００１～１０重量％がより好ましい。さらに、０．０１～５重量％が最も好ましい。０．０００１重量％未満では十分な効果は望みにくい。１０重量％を超えると、効果の増強は認められにくく不経済である。

内用の場合、摂取量は年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なる。通常、成人１人当たりの１日の摂取量としては、５ｍｇ以上が好ましく、１０ｍｇ～５ｇがより好ましい。さらに、２０ｍｇ～２ｇが最も好ましい。

次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる抽出物の製造例、実験例及び処方例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、特に指定のない場合は、実施例に示す％とは重量％を示す。

ニワウメの抽出物の製造例
ニワウメの抽出物を以下の通り製造した。

（製造例１）ニワウメの熱水抽出物１の調製
ニワウメの種子の乾燥物１０ｇに２００ｍＬの水を加え、９５～１００℃で２時間抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してニワウメの熱水抽出物１を２．６ｇ得た。

（製造例２）ニワウメの５０％エタノール抽出物の調製
ニワウメの種子の乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％エタノール水溶液に室温で７日間浸漬し、抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してニワウメの５０％エタノール抽出物を１．７ｇ得た。

（製造例３）ニワウメのエタノール抽出物の調製
ニワウメの種子の乾燥物１０ｇを２００ｍＬのエタノールに室温で７日間浸漬し、抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してニワウメのエタノール抽出物を０．２ｇ得た。

（製造例４）ニワウメの１，３－ブチレングリコール抽出物の調製
ニワウメの種子の乾燥物１０ｇを２００ｍＬの１，３－ブチレングリコールに室温で７日間浸漬し、抽出を行った。得られた抽出液を濾過して、ニワウメの１，３－ブチレングリコール抽出物を１９０ｇ得た。

（製造例５）ニワウメの熱水抽出物２の調製
ニワウメの植物体全体の乾燥物１０ｇに２００ｍＬの水を加え、９５～１００℃で２時間抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してニワウメの熱水抽出物２を３．０ｇ得た。

（処方例１）化粧水１
処方含有量（％）
１．ニワウメの熱水抽出物１（製造例１）２．０
２．１，３－ブチレングリコール８．０
３．グリセリン２．０
４．キサンタンガム０．０２
５．クエン酸０．０１
６．クエン酸ナトリウム０．１
７．エタノール５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．）０．１
１０．香料適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～６及び１１と、成分７～１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。

（比較処方例１）従来の化粧水
処方例１において、ニワウメの熱水抽出物１を精製水に置き換えたものを、従来の化粧水とした。

（処方例２）化粧水２
処方例１において、ニワウメの熱水抽出物１（製造例１）をニワウメの熱水抽出物２（製造例５）に置き換えたものを、化粧水２とした。

（処方例３）クリーム
処方含有量（％）
１．ニワウメの５０％エタノール抽出物（製造例２）１．０
２．スクワラン５．５
３．オリーブ油３．０
４．ステアリン酸２．０
５．ミツロウ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）３．０
８．ベヘニルアルコール１．５
９．モノステアリン酸グリセリン２．５
１０．香料０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１２．１，３－ブチレングリコール８．５
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。

（比較処方例２）従来のクリーム
処方例３において、ニワウメの５０％エタノール抽出物を精製水に置き換えたものを、従来のクリームとした。

（処方例４）乳液
処方含有量（％）
１．ニワウメのエタノール抽出物（製造例３）０．０１
２．スクワラン５．０
３．オリーブ油５．０
４．ホホバ油５．０
５．セタノール１．５
６．モノステアリン酸グリセリン２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．）２．０
９．香料０．１
１０．プロピレングリコール１．０
１１．グリセリン２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１０～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例５）ゲル剤
処方含有量（％）
１．ニワウメの１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４）１．０
２．エタノール５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．）０．１
５．香料適量
６．１，３－ブチレングリコール５．０
７．グリセリン５．０
８．キサンタンガム０．１
９．カルボキシビニルポリマー０．２
１０．水酸化カリウム０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～５と、成分１及び６～１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。

（処方例６）パック
処方含有量（％）
１．ニワウメの熱水抽出物１（製造例１）１．０
２．ニワウメの１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４）５．０
３．ポリビニルアルコール１２．０
４．エタノール５．０
５．１，３－ブチレングリコール８．０
６．パラオキシ安息香酸メチル０．２
７．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．）０．５
８．クエン酸０．１
９．クエン酸ナトリウム０．３
１０．香料適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～１１を均一に溶解し製品とする。

（処方例７）ファンデーション
処方含有量（％）
１．ニワウメの５０％エタノール抽出物（製造例２）１．０
２．ステアリン酸２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（２０Ｅ．Ｏ．）１．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）２．０
５．セタノール１．０
６．液状ラノリン２．０
７．流動パラフィン３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル６．５
９．カルボキシメチルセルロースナトリウム０．１
１０．ベントナイト０．５
１１．プロピレングリコール４．０
１２．トリエタノールアミン１．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１４．二酸化チタン８．０
１５．タルク４．０
１６．ベンガラ１．０
１７．黄酸化鉄２．０
１８．香料適量
１９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～８を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分１９に成分９をよく膨潤させ、続いて、成分１及び１０～１３を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１４～１７を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。油相に水相をかき混ぜながら加え、乳化する。その後、冷却し、４５℃で成分１８を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例８）浴用剤
処方含有量（％）
１．ニワウメのエタノール抽出物（製造例３）１．０
２．炭酸水素ナトリウム５０．０
３．黄色２０２号（１）適量
４．香料適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１～５を均一に混合し製品とする。

（処方例９）軟膏１
処方含有量（％）
１．ニワウメの熱水抽出物１（製造例１）５．０
２．ニワウメの１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４）１．０
３．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．）２．０
４．モノステアリン酸グリセリン１０．０
５．流動パラフィン５．０
６．セタノール６．０
７．パラオキシ安息香酸メチル０．１
８．プロピレングリコール１０．０
９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分３～６を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２及び７～９を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例１０）軟膏２
処方例９において、ニワウメの熱水抽出物１（製造例１）をニワウメの熱水抽出物２（製造例５）に置き換えたものを、軟膏２とした。

（処方例１１）散剤１
処方含有量（％）
１．ニワウメの熱水抽出物１（製造例１）１．０
２．乾燥コーンスターチ３９．０
３．微結晶セルロース６０．０
［製造方法］成分１～３を混合し、散剤とする。

（処方例１２）散剤２
処方例１１において、ニワウメの熱水抽出物１（製造例１）をニワウメの熱水抽出物２（製造例５）に置き換えたものを、散剤２とした。

（処方例１３）錠剤
処方含有量（％）
１．ニワウメのエタノール抽出物（製造例３）５．０
２．乾燥コーンスターチ２５．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム２０．０
４．微結晶セルロース４０．０
５．ポリビニルピロリドン７．０
６．タルク３．０
［製造方法］成分１～４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成型する。成型した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。

（処方例１４）錠菓
処方含有量（％）
１．ニワウメのエタノール抽出物（製造例３）２．０
２．乾燥コーンスターチ４９．８
３．エリスリトール４０．０
４．クエン酸５．０
５．ショ糖脂肪酸エステル３．０
６．香料０．１
７．精製水０．１
［製造方法］成分１～４及び７を混合し、顆粒成型する。成型した顆粒に成分５及び６を加えて打錠する。１粒１．０ｇとする。

（処方例１５）飲料１
処方含有量（％）
１．ニワウメの熱水抽出物１（製造例１）０．０５
２．ステビア０．０５
３．リンゴ酸５．０
４．香料０．１
５．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～３を少量の水に溶解する。次いで、成分４及び５を加えて混合する。

（処方例１６）飲料２
処方例１５において、ニワウメの熱水抽出物１（製造例１）をニワウメの熱水抽出物２（製造例５）に置き換えたものを、飲料２とした。

次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。

実験例１Ｉ型コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）及びＭＭＰ－１ｍＲＮＡ発現量の測定
ＣＯＬ１Ａ１及びＭＭＰ－１ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。ヒト皮膚線維芽細胞をφ６０ｍｍｄｉｓｈに１×１０^５個播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液にて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。コンフルエントな状態になったところで、各試料を最終濃度１、１０μｇ／ｍＬとなるように添加したＤＭＥＭ（－）培養液にて２４時間培養した後、総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ（タカラバイオ）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法には、ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＳＹＢＲＳｅｌｅｃｔＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。即ち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：６０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従い、ＣＯＬ１Ａ１及びＭＭＰ－１ｍＲＮＡの発現量を、内部標準であるＧＡＰＤＨｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。ＣＯＬ１Ａ１発現促進率は、コントロール（試料未添加）群のＣＯＬ１Ａ１ｍＲＮＡの発現量に対する試料添加群のＣＯＬ１Ａ１ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。ＭＭＰ－１発現抑制率についても、同様に算出した。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。

ＣＯＬ１Ａ１用のプライマーセット
ＡＧＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＡＴＧＴＣＴＧＧＴＴ（配列番号１）
ＴＴＧＣＡＧＴＧＧＴＡＧＧＴＧＡＴＧＴＴＣＴＧ（配列番号２）
ＭＭＰ－１用のプライマーセット
ＧＧＧＡＧＡＴＣＡＴＣＧＧＧＡＣＡＡＣＴＣ（配列番号３）
ＴＧＡＧＣＡＴＣＣＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＣ（配列番号４）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号５）
ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ（配列番号６）

これらの実験結果を表１～２に示した。その結果、本発明のニワウメの抽出物には、優れたＣＯＬ１Ａ１発現促進効果（コラーゲン産生促進作用）及びＭＭＰ－１発現抑制効果（ＭＭＰ－１阻害作用）が認められた。特にニワウメの５０％エタノール抽出物（製造例２）のＣＯＬ１Ａ１発現促進効果及びＭＭＰ－１発現抑制効果、ニワウメのエタノール抽出物（製造例３）のＭＭＰ－１発現抑制効果において、顕著に効果が高かった。

実験例２細胞増殖促進試験
ヒト由来ケラチノサイトを、０．２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液にて、９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり１×１０^３個播種し、各試料を最終濃度が１、１０、１００μｇ／ｍＬとなるように添加した後、３７℃、５％ＣＯ_２条件下にて５日間培養した。細胞数の測定は、染色法により行った。即ち、培養終了後、培養液を除き、メタノールを用いて細胞を固定した。続いて、０．１％メチレンブルーを加え、１時間細胞の染色を行った。乾燥させた後、０．１ＮＨＣｌを各ｗｅｌｌに１００μＬずつ加えてよく撹拌させ、マイクロプレートリーダーを用いて６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。細胞増殖率は、コントロール（試料未添加）群の細胞量に対する試料添加群の細胞量の比率として算出した。

これらの実験結果を表３に示した。その結果、本発明のニワウメの抽出物は優れた細胞増殖促進作用を示した。特にニワウメの５０％エタノール抽出物（製造例２）及びニワウメのエタノール抽出物（製造例３）の細胞増殖促進効果が顕著に高かった。

実験例３使用試験
処方例３のクリーム及び比較処方例２の従来のクリームを用いて、シワ、たるみがある５人（２５～６５歳）を対象に１ヶ月間の使用試験を行った。使用後、シワ、たるみの程度をアンケートにより判定した。

その結果、本発明の抽出物を含有するクリームにより、シワ、たるみが軽減した。尚、試験期間中、皮膚トラブルは１人もなく、安全性においても問題なかった。また、処方成分の劣化についても問題なかった。

また、処方例１の化粧水１及び比較処方例１の従来の化粧水を用い、同様に使用試験を行った。その結果、本発明の抽出物を含有する化粧水により、シワ、たるみの軽減が認められた。

以上のことから、本発明のニワウメの抽出物は、優れたコラーゲン産生促進作用、ＭＭＰ阻害作用及び細胞増殖促進作用を有し、安定性にも優れていた。よって、本発明のニワウメの抽出物は、皮膚の老化といった美容分野だけではなく、老化による機能低下の抑制、ガンの予防、治療等といった医療分野にも利用でき、化粧品、食品、医薬部外品及び医薬品への応用が期待される。

Claims

ニワウメの抽出物を含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
ニワウメの抽出物を含有することを特徴とするＭＭＰ阻害剤。
ニワウメの抽出物を含有することを特徴とする細胞増殖促進剤。
ニワウメの抽出物を含有することを特徴とするシワ改善剤。
ニワウメの抽出物を含有することを特徴とするＭＭＰの亢進が原因で起こる各種疾患の予防改善用食品組成物。