JP5138262B2 - 皮膚外用剤 - Google Patents
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Description
本発明は、青銭柳の抽出物を含有することにより、老化防止と美白作用に優れた皮膚外用剤に関する。
近年、生体成分を酸化させる要因として、フリーラジカルや活性酸素がとりあげられ、その悪影響が問題となっている。フリーラジカルや活性酸素は、生体内で生じ、コラーゲン等の生体組織を分解あるいは架橋し、また、脂質を酸化して、細胞に障害を与える過酸化脂質をつくると言われている。この様な障害は、肌のシワやハリが低下する等の老化の原因になると考えられており、老化を防ぐ方法の一つにフリーラジカルや活性酸素を除去する抗酸化剤を配合する方法が知られている。従来、老化防止を目的として用いられるフリーラジカル消去剤にはアスコルビン酸、トコフェロール、３，５−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）等が用いられてきた。
皮膚は、表皮、真皮、皮下組織からなるが、中でも真皮は皮膚の構造維持に極めて重要であり、ヒアルロン酸、コラーゲン等から形成される真皮結合組織によって皮膚のハリが保たれている。この結合組織が収縮力を失い、さらに弾力を失う結果として皮膚のシワやタルミが発生すると考えられている。
また、皮膚が紫外線を浴びるとコラゲナーゼ等のマトリックスメタロプロテアーゼが活性化されることが知られている。これらの酵素は、真皮の主要成分であるコラーゲンを減少させることによりシワやタルミを促進すると言われている。
近年、この皮膚のシワやタルミ等を防止する多くの化粧料が知られ、その有効成分としてレチノイン酸、α−ヒドロキシ酸、レチノール等が報告されている。しかしながら、これらの有効成分は皮膚刺激性や安定性に問題がある。また、シワやタルミを防ぐ方法の一つに、コラゲナーゼ活性阻害剤を配合することが知られている。
一般にシミ、ソバカス、日焼け等に見られる皮膚の色素沈着は、ホルモンの異常や紫外線の刺激により、皮膚内に存在するメラニン色素生成細胞がメラニン色素を過剰に生成し、これが皮膚内に沈着することが原因と考えられている。このような色素沈着を防ぐ方法の一つに、メラニンの過剰な生成を抑制する方法が知られている。従来、色素沈着の治療にはハイドロキノンやアスコルビン酸等を外用する処置が行われてきた。
しかし、以上に述べた老化防止及び美白作用の指標であるラジカル消去作用、コラゲナーゼ活性阻害作用、メラニン生成抑制作用について、植物原料の青銭柳は検討されていなかった。
しかし、以上に述べた老化防止及び美白作用の指標であるラジカル消去作用、コラゲナーゼ活性阻害作用、メラニン生成抑制作用について、植物原料の青銭柳は検討されていなかった。
皮膚の老化防止又は抗酸化を目的として用いられるＳＯＤは不安定であり、製剤化が難しく、トコフェロールも効果が充分であるとは言えない。また、合成化合物であるＢＨＴ等は安全性に問題があり、配合量に制限があることから、化学合成品ではなく、安定でかつ副作用の少ない天然原料が望まれている。同様に、安全で安定なコラゲナーゼ活性阻害作用を有することが老化防止に好ましい。また、美白剤して用いられるアスコルビン酸は経時的に分解しやすい等の欠点があるため、同様に安定性が高く、効果の優れた天然物由来の皮膚外用剤が望まれている。
以上のことから、安全で安定性に優れ、老化防止及び美白作用に優れた皮膚外用剤が望まれている。
以上のことから、安全で安定性に優れ、老化防止及び美白作用に優れた皮膚外用剤が望まれている。
このような事情により、本発明者らは鋭意検討した結果、青銭柳の抽出物が優れたＤＰＰＨラジカル消去作用、コラゲナーゼ活性阻害作用及びメラニン生成抑制作用をもち、安定性においても優れていることを見出した。さらに、その抽出物を含有する皮膚外用剤が、安全で安定であり、老化防止及び美白作用に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明に用いる青銭柳（クルミ科、別名；ゼニガタ、キクロカーヤ）は、学名がＣｙｃｌｏｃａｒｙａ ｐａｌｉｕｒｕｓ（シクロカリヤ パリウラス）で中国が原産である。砂糖の２００倍の甘さを示すシクロカリオシドが含まれ、甘味のあるお茶として飲用され、糖尿病や高血圧によいとされている。なお、本植物は、化粧料としての利用は報告されていない。
本発明に用いる青銭柳の抽出物とは、植物体の葉、茎、樹皮、花、実、根等の植物体の一部又は全草から抽出したものである。好ましくは、植物体の葉から抽出して得られるものが良い。その抽出方法は特に限定されず、例えば、加熱抽出したものであっても良いし、常温抽出したものであっても良い。
抽出する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール及び液状多価アルコール等の極性溶媒が良く、特に好ましくは、水、エタノール、１，３−ブチレングリコール及びプロピレングリコールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。
上記抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、希釈及び濾過処理、活性炭等による脱色、脱臭処理等をして用いても良い。更には、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いても良い。
本発明の皮膚外用剤には、上記抽出物をそのまま使用しても良く、抽出物の効果を損なわない範囲内で、外用剤に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤等の成分を配合することができる。
本発明の皮膚外用剤は、化粧品、医薬部外品、医薬品のいずれにも用いることができ、その剤形としては、例えば、化粧水、クリ−ム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデ−ション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤等の皮膚に適用されるものが挙げられる。
本発明に用いる上記抽出物の配合量は、本発明の皮膚外用剤全量に対し、固形物に換算して０．０００１重量％以上、好ましくは０．００１〜１０重量％の配合が良い。０．０００１重量％未満では十分な効果は望みにくい。１０重量％を越えて配合した場合、効果の増強は認められにくく不経済である。また、添加の方法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。
本発明の青銭柳の抽出物は、優れたＤＰＰＨラジカル消去作用、コラゲナーゼ活性阻害及びメラニン生成抑制作用を有し、安定性にも優れていた。さらに、これらの抽出物を含有する皮膚外用剤は、安全で優れた老化防止及び美白作用を示した。
次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる抽出物の製造例、本発明の処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す配合量の部とは重量部を、％とは重量％を示す。
製造例１ 青銭柳の熱水抽出物
青銭柳の葉の乾燥物３０ｇに精製水９００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して青銭柳の熱水抽出物を３．３ｇ得た。
青銭柳の葉の乾燥物３０ｇに精製水９００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して青銭柳の熱水抽出物を３．３ｇ得た。
製造例２ 青銭柳のエタノール抽出物
青銭柳の葉の乾燥物１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、青銭柳のエタノール抽出物を９．５ｇ得た。
青銭柳の葉の乾燥物１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、青銭柳のエタノール抽出物を９．５ｇ得た。
製造例３ 青銭柳の５０％１，３−ブチレングリコール抽出物
青銭柳の葉及び樹皮の乾燥物２０ｇに精製水２００ｇ及び１，３−ブチレングリコール２００ｇを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、青銭柳の５０％１，３−ブチレングリコール抽出物を３６０ｇ得た。
青銭柳の葉及び樹皮の乾燥物２０ｇに精製水２００ｇ及び１，３−ブチレングリコール２００ｇを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、青銭柳の５０％１，３−ブチレングリコール抽出物を３６０ｇ得た。
処方例１ 化粧水
処方 配合量
１．青銭柳の熱水抽出物（製造例１） ０．１部
２．１，３−ブチレングリコール ８．０
３．グリセリン ２．０
４．キサンタンガム ０．０２
５．クエン酸 ０．０１
６．クエン酸ナトリウム ０．１
７．エタノール ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜６及び１１と、成分７〜１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。
処方 配合量
１．青銭柳の熱水抽出物（製造例１） ０．１部
２．１，３−ブチレングリコール ８．０
３．グリセリン ２．０
４．キサンタンガム ０．０２
５．クエン酸 ０．０１
６．クエン酸ナトリウム ０．１
７．エタノール ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜６及び１１と、成分７〜１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。
比較例１ 従来の化粧水
処方例１において、青銭柳の熱水抽出物を精製水に置き換えたものを従来の化粧水とした。
処方例１において、青銭柳の熱水抽出物を精製水に置き換えたものを従来の化粧水とした。
処方例２ クリーム
処方 配合量
１．青銭柳のエタノール抽出物（製造例２） ０．０５部
２．スクワラン ５．５
３．オリーブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１２．パラオキシ安息香酸エチル ０．０５
１３．１，３−ブチレングリコール ８．５
１４．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
処方 配合量
１．青銭柳のエタノール抽出物（製造例２） ０．０５部
２．スクワラン ５．５
３．オリーブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１２．パラオキシ安息香酸エチル ０．０５
１３．１，３−ブチレングリコール ８．５
１４．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
比較例２ 従来のクリーム
処方例２において、青銭柳のエタノール抽出物を精製水に置き換えたものを従来のクリームとした。
処方例２において、青銭柳のエタノール抽出物を精製水に置き換えたものを従来のクリームとした。
処方例３ 乳液
処方 配合量
１．青銭柳の熱水抽出物（製造例１） ０．００１部
２．スクワラン ５．０
３．オリーブ油 ５．０
４．ホホバ油 ５．０
５．セタノール １．５
６．モノステアリン酸グリセリン ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート
（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
９．香料 ０．１
１０．プロピレングリコール １．０
１１．グリセリン ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１０〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
処方 配合量
１．青銭柳の熱水抽出物（製造例１） ０．００１部
２．スクワラン ５．０
３．オリーブ油 ５．０
４．ホホバ油 ５．０
５．セタノール １．５
６．モノステアリン酸グリセリン ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート
（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
９．香料 ０．１
１０．プロピレングリコール １．０
１１．グリセリン ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１０〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
処方例４ ゲル剤
処方 配合量
１．青銭柳の５０％１，３−ブチレングリコール抽出物
（製造例３） １．０部
２．エタノール ５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．） ０．１
５．香料 適量
６．１，３−ブチレングリコール ５．０
７．グリセリン ５．０
８．キサンタンガム ０．１
９．カルボキシビニルポリマー ０．２
１０．水酸化カリウム ０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜５と、成分１及び６〜１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。
処方 配合量
１．青銭柳の５０％１，３−ブチレングリコール抽出物
（製造例３） １．０部
２．エタノール ５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．） ０．１
５．香料 適量
６．１，３−ブチレングリコール ５．０
７．グリセリン ５．０
８．キサンタンガム ０．１
９．カルボキシビニルポリマー ０．２
１０．水酸化カリウム ０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜５と、成分１及び６〜１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。
処方例５ パック
処方 配合量
１．青銭柳の熱水抽出物（製造例１） ０．１部
２．青銭柳のエタノール抽出物（製造例２） ０．１
３．ポリビニルアルコール １２．０
４．エタノール ５．０
５．１，３−ブチレングリコール ８．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
７．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．） ０．５
８．クエン酸 ０．１
９．クエン酸ナトリウム ０．３
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜１１を均一に溶解し製品とする。
処方 配合量
１．青銭柳の熱水抽出物（製造例１） ０．１部
２．青銭柳のエタノール抽出物（製造例２） ０．１
３．ポリビニルアルコール １２．０
４．エタノール ５．０
５．１，３−ブチレングリコール ８．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
７．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．） ０．５
８．クエン酸 ０．１
９．クエン酸ナトリウム ０．３
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜１１を均一に溶解し製品とする。
処方例６ ファンデーション
処方 配合量
１．青銭柳のエタノール抽出物（製造例２） １．０部
２．ステアリン酸 ２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート
（２０Ｅ．Ｏ．） １．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
５．セタノール １．０
６．液状ラノリン ２．０
７．流動パラフィン ３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル ６．５
９．カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．１
１０．ベントナイト ０．５
１１．プロピレングリコール ４．０
１２．トリエタノールアミン １．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１４．二酸化チタン ８．０
１５．タルク ４．０
１６．ベンガラ １．０
１７．黄酸化鉄 ２．０
１８．香料 適量
１９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分１９に成分９をよく膨潤させ、続いて、成分１及び１０〜１３を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１４〜１７を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。この水相に油相をかき混ぜながら加え、冷却し、４５℃で成分１８を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
処方 配合量
１．青銭柳のエタノール抽出物（製造例２） １．０部
２．ステアリン酸 ２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート
（２０Ｅ．Ｏ．） １．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
５．セタノール １．０
６．液状ラノリン ２．０
７．流動パラフィン ３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル ６．５
９．カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．１
１０．ベントナイト ０．５
１１．プロピレングリコール ４．０
１２．トリエタノールアミン １．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１４．二酸化チタン ８．０
１５．タルク ４．０
１６．ベンガラ １．０
１７．黄酸化鉄 ２．０
１８．香料 適量
１９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分１９に成分９をよく膨潤させ、続いて、成分１及び１０〜１３を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１４〜１７を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。この水相に油相をかき混ぜながら加え、冷却し、４５℃で成分１８を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
実施例７ 浴用剤
処方 配合量
１．青銭柳の熱水抽出物（製造例１） ５．０部
２．炭酸水素ナトリウム ５０．０
３．黄色２０２号（１） 適量
４．香料 適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜５を均一に混合し製品とする。
処方 配合量
１．青銭柳の熱水抽出物（製造例１） ５．０部
２．炭酸水素ナトリウム ５０．０
３．黄色２０２号（１） 適量
４．香料 適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜５を均一に混合し製品とする。
処方例８ 軟膏
処方 配合量
１．青銭柳の熱水抽出物（製造例１） ０．０１部
２．青銭柳の５０％１，３−ブチレングリコール抽出物
（製造例３） ０．５
３．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
４．モノステアリン酸グリセリン １０．０
５．流動パラフィン ５．０
６．セタノール ６．０
７．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
８．プロピレングリコール １０．０
９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分３〜６を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２及び７〜９を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。
処方 配合量
１．青銭柳の熱水抽出物（製造例１） ０．０１部
２．青銭柳の５０％１，３−ブチレングリコール抽出物
（製造例３） ０．５
３．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
４．モノステアリン酸グリセリン １０．０
５．流動パラフィン ５．０
６．セタノール ６．０
７．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
８．プロピレングリコール １０．０
９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分３〜６を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２及び７〜９を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。
実験例１ ＤＰＰＨラジカル消去作用
製造例１、２を試料として用い、フリーラジカルの一種であるＤＰＰＨラジカルの消去作用を測定した。陽性対照として、アスコルビン酸を用いた。また、試料の安定性を確認するために、試料を４０℃で２週間保存して同様に測定を行った。
製造例１、２を試料として用い、フリーラジカルの一種であるＤＰＰＨラジカルの消去作用を測定した。陽性対照として、アスコルビン酸を用いた。また、試料の安定性を確認するために、試料を４０℃で２週間保存して同様に測定を行った。
各濃度の試料水溶液０．３ｍＬに０．１ｍＬの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）と０．４ｍＬのエタノールと０．２ｍＬの０．５ｍＭのＤＰＰＨ（ｄｉｐｈｅｎｙｌｐｙｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）エタノール溶液を加え、３７℃で３０分間反応させた後、波長５１７ｎｍにおける吸光度を測定した。各試料の消去率は、次の式で算出した。
消去率（％）＝（１−試料吸光度／ブランク吸光度）×１００
これらの試験結果を表１に示した。アスコルビン酸は４０℃で２週間の保存により、ＤＰＰＨラジカル消去作用が大きく減少したが、青銭柳の抽出物は消去作用に変化はなかった。以上のことから、青銭柳の抽出物は、安定で優れたＤＰＰＨラジカル消去作用を示した。
消去率（％）＝（１−試料吸光度／ブランク吸光度）×１００
これらの試験結果を表１に示した。アスコルビン酸は４０℃で２週間の保存により、ＤＰＰＨラジカル消去作用が大きく減少したが、青銭柳の抽出物は消去作用に変化はなかった。以上のことから、青銭柳の抽出物は、安定で優れたＤＰＰＨラジカル消去作用を示した。
実験例２ コラゲナーゼ活性阻害作用
製造例１、２を試料として用い、コラゲナーゼ活性阻害作用を測定した。マイクロプレートを用いて、試料液５０μＬに酵素液として０．１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ Ｔｙｐｅ ＩＶ（シグマ製）水溶液を５０μＬ加えた。基質溶液として０．３９ｍｇ／ｍＬのＰｚ−ペプタイド（Ｐｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ、シグマ製）・２０ｍＭ塩化カルシウム入りトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）を加えて混合し、３７℃、３０分反応させた後、１ｍＬの２５ｍＭクエン酸を加えて反応を停止させた。５ｍＬの酢酸エチルを加えて抽出して、酢酸エチル層を３２０ｎｍの吸光度を測定した。また、各試料の阻害作用は、次の式から求められる阻害率で算出した。なお、対照には試料の代わりに精製水を用い、ブランクとしてコラゲナーゼの代わりに２０ｍＭ塩化カルシウム入りトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）を用いた。
阻害率（％）＝〔１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）〕×１００
Ａ：対照の３２０ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ．３２０）
Ｂ：対照ブランクのＯ．Ｄ．３２０
Ｃ：試料のＯ．Ｄ．３２０
Ｄ：試料ブランクのＯ．Ｄ．３２０
製造例１、２を試料として用い、コラゲナーゼ活性阻害作用を測定した。マイクロプレートを用いて、試料液５０μＬに酵素液として０．１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ Ｔｙｐｅ ＩＶ（シグマ製）水溶液を５０μＬ加えた。基質溶液として０．３９ｍｇ／ｍＬのＰｚ−ペプタイド（Ｐｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ、シグマ製）・２０ｍＭ塩化カルシウム入りトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）を加えて混合し、３７℃、３０分反応させた後、１ｍＬの２５ｍＭクエン酸を加えて反応を停止させた。５ｍＬの酢酸エチルを加えて抽出して、酢酸エチル層を３２０ｎｍの吸光度を測定した。また、各試料の阻害作用は、次の式から求められる阻害率で算出した。なお、対照には試料の代わりに精製水を用い、ブランクとしてコラゲナーゼの代わりに２０ｍＭ塩化カルシウム入りトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）を用いた。
阻害率（％）＝〔１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）〕×１００
Ａ：対照の３２０ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ．３２０）
Ｂ：対照ブランクのＯ．Ｄ．３２０
Ｃ：試料のＯ．Ｄ．３２０
Ｄ：試料ブランクのＯ．Ｄ．３２０
これらの実験結果を表２に示した。その結果、青銭柳の抽出物は優れたコラゲナーゼ活性阻害作用を示した。
実験例３ Ｂ１６マウスメラノーマを用いたメラニン生成抑制試験
製造例１、２を試料として用い、メラニン生成抑制作用を測定した。
製造例１、２を試料として用い、メラニン生成抑制作用を測定した。
マウスメラノーマ由来細胞株であるＢ１６細胞を６ｃｍディッシュに３×１０４個播種し、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ ｗｉｔｈ ＮＥＡＡにて５％ＣＯ２、３７℃条件下で５日間培養した。その時、それぞれの試料は、最終濃度を調整して添加した。次に、細胞をＰＢＳ（−）にて２回洗浄した後、ＰＢＳ（−）１ｍＬを加え、ラバーポリスマンにて集めた。遠心操作をして得られたペレットにＰＢＳ（−）０．５ｍＬを加え、超音波破砕操作をしてペレットを溶解させた。タンパク定量はＬｏｗｒｙ法｛Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３，２６５−２７５（１９５１）｝により測定した。また、１ｍｇタンパクあたりのメラニン量を測定する場合、タンパク定量用に取った残りの細胞破砕溶液に４Ｎ水酸化ナトリウム０．５ｍＬを加え、６０℃で２時間反応させた後Ｏ．Ｄ．４７５を測定し、検量線からメラニン定量を行った。データは１ｍｇタンパクあたりのメラニン量を算出し、試料未添加のメラニン生成量をコントロールとし、コントロールに対する試料添加時のメラニン生成抑制量の値をメラニン抑制率とした。
これらの実験結果を表３に示した。青銭柳の抽出物は、低濃度において優れたメラニン生成抑制作用を示した。
実験例４ 使用試験１
処方例１の化粧水、処方例２のクリーム、比較例１の従来の化粧水及び比較例２の従来のクリームを用いて、女性２０人（２１〜４６才）を対象に１ヶ月間の使用試験を行った。使用後、肌のシワ、タルミの改善効果をアンケートにより判定した。
処方例１の化粧水、処方例２のクリーム、比較例１の従来の化粧水及び比較例２の従来のクリームを用いて、女性２０人（２１〜４６才）を対象に１ヶ月間の使用試験を行った。使用後、肌のシワ、タルミの改善効果をアンケートにより判定した。
これらの試験結果を表４に示した。青銭柳の抽出物を含有する皮膚外用剤は優れたシワ、タルミの改善作用を示した。なお、試験期間中、皮膚トラブルは一人もなく、安全性においても問題なかった。また、処方成分の劣化についても問題なかった。
実験例５ 使用試験２
処方例１の化粧水、処方例２のクリーム、比較例１の従来の化粧水及び比較例２の従来のクリームを用いて、シミ、ソバカスに悩む女性２０人（２１〜４６才）を対象に１ヶ月間の使用試験を行った。使用後、シミ、ソバカスの改善効果をアンケートにより判定した。
処方例１の化粧水、処方例２のクリーム、比較例１の従来の化粧水及び比較例２の従来のクリームを用いて、シミ、ソバカスに悩む女性２０人（２１〜４６才）を対象に１ヶ月間の使用試験を行った。使用後、シミ、ソバカスの改善効果をアンケートにより判定した。
これらの試験結果を表５に示した。青銭柳の抽出物を含有する皮膚外用剤は、優れたシミ、ソバカスの改善作用を示した。なお、試験期間中、皮膚トラブルは一人もなく、安全性においても問題なかった。また、処方成分の劣化についても問題なかった。
実施例３〜８についても同様に使用試験を行ったところ、優れたシワ、タルミ、シミ、ソバカス等の改善作用を示した。
Claims (3)
- 青銭柳の抽出物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
- 青銭柳の抽出物を含有することを特徴とするコラゲナーゼ活性阻害剤。
- 青銭柳の抽出物を含有することを特徴とする美白剤。
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