JP7389465B2

JP7389465B2 - メラニン生成抑制剤、コラーゲン産生促進剤及び抗酸化剤

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Publication number: JP7389465B2
Application number: JP2019218943A
Authority: JP
Inventors: 紘介深田; 泰弘福田; 祐子村上
Original assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Current assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Priority date: 2019-12-03
Filing date: 2019-12-03
Publication date: 2023-11-30
Anticipated expiration: 2039-12-03
Also published as: JP2021088519A

Description

本発明は、メラニン生成抑制剤、コラーゲン産生促進剤、抗酸化剤及び食品組成物に関する。

一般にシミ、ソバカス、日焼け等に見られる皮膚の色素沈着は、ホルモンの異常や紫外線の刺激により、皮膚内に存在するメラニン色素生成細胞がメラニン色素を過剰に生成し、これが皮膚内に沈着することが原因と考えられている。このような色素沈着を防ぐ方法の一つに、メラニンの過剰な生成を抑制する方法が知られている。従来、色素沈着の治療にはハイドロキノンやアスコルビン酸（ビタミンＣ）等を外用する処置が行われてきた。

コラーゲンは、哺乳動物組織の約１／３を占める主要な構造タンパク質であり、軟骨、骨、腱、及び皮膚等の、多くのマトリックス組織の必須な成分である。その為、加齢等によってコラーゲン産生が低下することにより、骨粗鬆症、関節炎、腱鞘炎等の原因になることが知られている。また、創傷の治癒過程において、コラーゲンの産生量が亢進し、創傷の治癒を促進することが知られている。よって、コラーゲンの産生促進は、皮膚の創傷治癒の促進や、骨粗鬆症、関節炎及び腱鞘炎等の改善等にも有効である。

皮膚は生体の最外層に位置し、紫外線等の影響により活性酸素が発生しやすい臓器であり、絶えずその酸素ストレスに曝されている。一方、皮膚細胞内には活性酸素消去酵素が存在しており、その能力を超える活性酸素が発生しないかぎり活性酸素の傷害から皮膚細胞を防衛している。ところが、皮膚細胞内の活性酸素消去酵素の活性は加齢と共に低下することが知られており、活性酸素による傷害がその防御反応を凌駕したとき、皮膚は酸化され、細胞機能が劣化して老化してゆくと考えられる。また、皮膚以外の臓器においても、その活性酸素消去能を越える活性酸素に曝されたとき、機能低下が起こり老化したり、ガンや心筋梗塞等様々な生活習慣病が発症したりすると考えられる。そこで、活性酸素による傷害からの防御を目的として活性酸素消去剤や抗酸化剤が検討され、ＳＯＤやカタラーゼ等の活性酸素消去酵素、ＳＯＤ様活性物質等の活性酸素消去剤や抗酸化剤を含有した食品、化粧品、医薬部外品及び医薬品等が開発されている（特許文献１）。

ヨモギ属植物は、世界中いたるところに分布し、その種類は２５０に及ぶことが知られている。ヨモギ属植物の薬効としては、ヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｐｒｉｎｃｅｐｓ）の発酵物の含水エタノール抽出物がＩ型コラーゲン産生促進作用を有すること（特許文献２）等が知られている。

特開２０１５－２１２２３３号公報特開２００９－２４２２６３号公報

メラニン生成抑制効果、コラーゲン産生促進効果及び抗酸化効果に優れた素材が望まれているが、未だ十分満足し得るものが提供されていないのが現状である。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、オオヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｍｏｎｔａｎａ）の抽出物が優れたメラニン生成抑制作用、コラーゲン産生促進作用及び抗酸化作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）オオヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｍｏｎｔａｎａ）の抽出物を含有することを特徴とするメラニン生成抑制剤。
（２）オオヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｍｏｎｔａｎａ）の抽出物を含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
（３）オオヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｍｏｎｔａｎａ）の抽出物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
（４）オオヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｍｏｎｔａｎａ）の抽出物を含有することを特徴とする、メラニンによる色素沈着、骨粗鬆症、関節炎、腱鞘炎、創傷、酸化ストレスに起因する疾病及び皮膚老化の改善及び予防用食品組成物。

本発明のメラニン生成抑制剤は色素沈着の治療、改善及び予防に、コラーゲン産生促進剤は、骨粗鬆症、関節炎、腱鞘炎及び創傷の治療、改善及び予防に、抗酸化剤は、酸化ストレスに起因する疾病及び皮膚老化の治療、改善及び予防に、それぞれ有効である。

本発明に用いるオオヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｍｏｎｔａｎａ）は、キク科ヨモギ属の多年草で、主に本州（近畿地方以北）、北海道に自生している。一方、ヨモギ（ＡｒｔｅｍｉｓｉａｐｒｉｎｃｅｐｓあるいはＡｒｔｅｍｉｓｉａｉｎｄｉｃａ）は、主に本州～九州、小笠原に分布し、植物体の大きさ（例えば、茎の高さ、頭花の径、葉の長さ等）は本発明のオオヨモギより小形であり、オオヨモギとは異なる種の植物である。なお、ＡｒｔｅｍｉｓｉａｐｒｉｎｃｅｐｓとＡｒｔｅｍｉｓｉａｉｎｄｉｃａとはシノニム（Ｓｙｎｏｎｙｍ）の関係になる。

本発明に用いるオオヨモギは、上記の生育地域からも入手することができるし、市販品を購入することもできる。抽出原料として使用するオオヨモギの部位は、全草であっても良いし、その一部であっても良いが、効果の面から、葉部が好ましい。また、抽出には、植物体を生のまま使用しても良く、乾燥、粉砕、細切等の処理を行っても良い。

本発明の抽出物に用いる抽出溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール等）、液状多価アルコール類（１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール及び液状多価アルコール等の極性溶媒が良く、特に好ましくは、水、エタノール、１，３－ブチレングリコール及びプロピレングリコールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。また、これらの溶媒に酸やアルカリを添加して、ｐＨを調整した溶媒を用いることもできる。また、抽出方法は、特に限定されないが、例えば、連続抽出や浸漬抽出が挙げられる。抽出温度は、加熱抽出であっても良いし、常温抽出や冷温抽出であっても良く、抽出物の使用用途や抽出溶媒等によって、適宜選択できる。

本発明の抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良いが、必要に応じて、本発明の効果を奏する範囲で、濃縮（減圧濃縮、膜濃縮等による濃縮）、希釈、濾過、活性炭等による脱色、脱臭等の処理を行ってから用いても良い。更には、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いても良い。

本発明のメラニン生成抑制剤、コラーゲン産生促進剤、抗酸化剤及び食品組成物は、上記抽出物をそのまま使用しても良く、抽出物の効果を損なわない範囲内で、化粧品、医薬部外品、医薬品又は食品等に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、皮膜剤、甘味料、酸味料等の成分が含有されていても良い。

本発明のメラニン生成抑制剤、コラーゲン産生促進剤、抗酸化剤及び食品組成物の剤形としては、例えば、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、錠菓、カプセル剤、チョコレート、ガム、飴、飲料、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤、坐剤、注射用溶液等が挙げられる。

外用の場合、本発明に用いる上記抽出物の含有量は、固形物に換算して０．０００１重量％以上が好ましく、０．００１～１０重量％がより好ましい。更に、０．０１～５重量％が最も好ましい。０．０００１重量％未満では十分な効果は望みにくい。１０重量％を越えると、効果の増強は認められにくく不経済である。

内用の場合、摂取量は年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なる。通常、成人１人当たりの１日の摂取量としては、５ｍｇ以上が好ましく、１０ｍｇ～５ｇがより好ましい。更に、２０ｍｇ～２ｇが最も好ましい。

次に、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、特に指定のない場合は、実施例に示す％とは重量％を示す。

（製造例１）オオヨモギの熱水抽出物１の調製
オオヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｍｏｎｔａｎａ）の葉の乾燥物１０ｇに２００ｍＬの水を加え、９５～１００℃で２時間抽出した。得られた抽出液を濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してオオヨモギの熱水抽出物１を１．７ｇ得た。

（製造例２）オオヨモギの５０％エタノール抽出物の調製
オオヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｍｏｎｔａｎａ）の葉の乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％エタノール水溶液に室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してオオヨモギの５０％エタノール抽出物を２．１ｇ得た。

（製造例３）オオヨモギのエタノール抽出物の調製
オオヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｍｏｎｔａｎａ）の葉の乾燥物１０ｇを２００ｍＬのエタノールに室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してオオヨモギのエタノール抽出物を０．５ｇ得た。

（製造例４）オオヨモギの１，３－ブチレングリコール抽出物の調製
オオヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｍｏｎｔａｎａ）の葉の乾燥物１０ｇを２００ｍＬの１，３－ブチレングリコールに室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過してオオヨモギの１，３－ブチレングリコール抽出物を１９２ｇ得た。

（製造例５）オオヨモギの熱水抽出物２の調製
オオヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｍｏｎｔａｎａ）の全草の乾燥物１０ｇに２００ｍＬの水を加え、９５～１００℃で２時間抽出した。得られた抽出液を濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してオオヨモギの熱水抽出物２を１．８ｇ得た。

（比較製造例１）ヨモギの熱水抽出物の調製
ヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｐｒｉｎｃｅｐｓ）の乾燥物１０ｇに２００ｍＬの水を加え、９５～１００℃で２時間抽出した。得られた抽出液を濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してヨモギの熱水抽出物を１．７ｇ得た。

（比較製造例２）ヨモギの５０％エタノール抽出物の調製
ヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｐｒｉｎｃｅｐｓ）の乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％エタノール水溶液に室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してヨモギの５０％エタノール抽出物を１．４ｇ得た。

（比較製造例３）ヨモギのエタノール抽出物の調製
ヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｐｒｉｎｃｅｐｓ）の乾燥物１０ｇを２００ｍＬのエタノールに室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してヨモギのエタノール抽出物を０．４ｇ得た。

（処方例１）化粧水１
処方含有量（％）
１．オオヨモギの熱水抽出物１（製造例１）２．０
２．１，３－ブチレングリコール８．０
３．グリセリン２．０
４．キサンタンガム０．０２
５．クエン酸０．０１
６．クエン酸ナトリウム０．１
７．エタノール５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．）０．１
１０．香料適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～６及び１１と、成分７～１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。

（処方例２）化粧水２
処方例１において、オオヨモギの熱水抽出物１をオオヨモギの熱水抽出物２（製造例５）に置き換えたものを処方例２とした。

（処方例３）クリーム
処方含有量（％）
１．オオヨモギの５０％エタノール抽出物（製造例２）１．０
２．スクワラン５．５
３．オリーブ油３．０
４．ステアリン酸２．０
５．ミツロウ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）３．０
８．ベヘニルアルコール１．５
９．モノステアリン酸グリセリン２．５
１０．香料０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１２．１，３－ブチレングリコール８．５
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例４）乳液
処方含有量（％）
１．オオヨモギのエタノール抽出物（製造例３）０．０１
２．スクワラン５．０
３．オリーブ油５．０
４．ホホバ油５．０
５．セタノール１．５
６．モノステアリン酸グリセリン２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．）２．０
９．香料０．１
１０．プロピレングリコール１．０
１１．グリセリン２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１０～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例５）ゲル剤
処方含有量（％）
１．オオヨモギの１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４）１．０
２．エタノール５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．）０．１
５．香料適量
６．１，３－ブチレングリコール５．０
７．グリセリン５．０
８．キサンタンガム０．１
９．カルボキシビニルポリマー０．２
１０．水酸化カリウム０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～５と、成分１及び６～１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。

（処方例６）パック
処方含有量（％）
１．オオヨモギの熱水抽出物１（製造例１）１．０
２．オオヨモギの１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４）５．０
３．ポリビニルアルコール１２．０
４．エタノール５．０
５．１，３－ブチレングリコール８．０
６．パラオキシ安息香酸メチル０．２
７．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．）０．５
８．クエン酸０．１
９．クエン酸ナトリウム０．３
１０．香料適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～１１を均一に溶解し製品とする。

（処方例７）ファンデーション
処方含有量（％）
１．オオヨモギの５０％エタノール抽出物（製造例２）１．０
２．ステアリン酸２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（２０Ｅ．Ｏ．）１．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）２．０
５．セタノール１．０
６．液状ラノリン２．０
７．流動パラフィン３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル６．５
９．カルボキシメチルセルロースナトリウム０．１
１０．ベントナイト０．５
１１．プロピレングリコール４．０
１２．トリエタノールアミン１．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１４．二酸化チタン８．０
１５．タルク４．０
１６．ベンガラ１．０
１７．黄酸化鉄２．０
１８．香料適量
１９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～８を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分１９に成分９をよく膨潤させ、続いて、成分１及び１０～１３を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１４～１７を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。この油相に水相をかき混ぜながら加え、乳化する。その後、冷却し、４５℃で成分１８を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例８）浴用剤
処方含有量（％）
１．オオヨモギのエタノール抽出物（製造例３）１．０
２．炭酸水素ナトリウム５０．０
３．黄色２０２号（１）適量
４．香料適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１～５を均一に混合し製品とする。

（処方例９）軟膏
処方含有量（％）
１．オオヨモギの１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４）１．０
２．オオヨモギの熱水抽出物２（製造例５）５．０
３．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．）２．０
４．モノステアリン酸グリセリン１０．０
５．流動パラフィン５．０
６．セタノール６．０
７．パラオキシ安息香酸メチル０．１
８．プロピレングリコール１０．０
９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分３～６を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２及び７～９を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例１０）散剤１
処方含有量（％）
１．オオヨモギの熱水抽出物１（製造例１）１．０
２．乾燥コーンスターチ３９．０
３．微結晶セルロース６０．０
［製造方法］成分１～３を混合し、製品とする。

（処方例１１）散剤２
処方例１０において、オオヨモギの熱水抽出物１（製造例１）をオオヨモギの熱水抽出物２（製造例５）に置き換えたものを散剤２とした。

（処方例１２）散剤３
処方例１０において、オオヨモギの熱水抽出物１（製造例１）をオオヨモギの５０％エタノール抽出物（製造例２）に置き換えたものを散剤３とした。

（処方例１３）錠剤
処方含有量（％）
１．オオヨモギのエタノール抽出物（製造例３）５．０
２．乾燥コーンスターチ２５．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム２０．０
４．微結晶セルロース４０．０
５．ポリビニルピロリドン７．０
６．タルク３．０
［製造方法］成分１～４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成型する。成型した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。

（処方例１４）錠菓１
処方含有量（％）
１．オオヨモギのエタノール抽出物（製造例３）２．０
２．乾燥コーンスターチ４９．８
３．エリスリトール４０．０
４．クエン酸５．０
５．ショ糖脂肪酸エステル３．０
６．香料０．１
７．精製水０．１
［製造方法］成分１～４及び７を混合し、顆粒成型する。成型した顆粒に成分５及び６を加えて打錠する。１粒１．０ｇとする。

（処方例１５）錠菓２
処方例１４において、オオヨモギのエタノール抽出物（製造例３）をオオヨモギの熱水抽出物２（製造例５）に置き換えたものを錠菓２とした。

（処方例１６）錠菓３
処方例１４において、オオヨモギのエタノール抽出物（製造例３）をオオヨモギの５０％エタノール抽出物（製造例２）に置き換えたものを錠菓３とした。

（処方例１７）飲料
処方含有量（％）
１．オオヨモギの熱水抽出物１（製造例１）０．０５
２．ステビア０．０５
３．リンゴ酸５．０
４．香料０．１
５．精製水９４．８
［製造方法］成分２及び３を少量の水に溶解する。次いで、成分１、４及び５を加えて混合する。

実験例１メラニン生成抑制試験
対数増殖期にあるＢ１６マウスメラノーマを６０ｍｍｄｉｓｈに３×１０^４個播種し、各試料（終濃度は表１に記載）を含むＥａｇｌｅ’ｓＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）培地にて、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で５日間培養した。次に、細胞をｄｉｓｈから剥離し、超音波破砕した後、４ＮＮａＯＨを加え６０℃で２時間の処理を行い、分光光度計を用いて４７５ｎｍにおける吸光度を測定することでメラニンを定量した。なお、超音波処理後の細胞破砕液についてＬｏｗｒｙの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３，２６５－２７５，１９５１）にてタンパク定量し、タンパク量当りのメラニン量を算出すると共に、試料未添加時のメラニン量をコントロールとし、コントロールに対する試料添加時のメラニン量の値から、メラニン生成抑制率を算出した。

この試験結果を表１に示した。本発明のオオヨモギの抽出物は、ヨモギの抽出物よりも顕著に優れたメラニン生成抑制効果を有していることが認められた。なお、ヨモギのエタノール抽出物については、１０μｇ／ｍＬで細胞毒性が認められた。これに対して、オオヨモギのエタノール抽出物は、同濃度でも細胞毒性は認められず、優れたメラニン生成抑制効果を示したことから、安全性についても優れていることが確認された。

実験例２コラーゲン産生促進試験
ＣＯＬ１Ａ１ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。ヒト皮膚線維芽細胞を６０ｍｍｄｉｓｈに１×１０^５個播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液にて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。コンフルエントな状態になったところで、各試料（終濃度は表２に記載）を添加したＤＭＥＭ（－）培養液にて２４時間培養した後、総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ（タカラバイオ）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法には、ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＳＹＢＲＳｅｌｅｃｔＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。即ち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：６０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従い、ＣＯＬ１Ａ１ｍＲＮＡの発現量を、内部標準であるβ―ａｃｔｉｎｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。ＣＯＬ１Ａ１発現促進率は、コントロール（試料未添加）群のＣＯＬ１Ａ１ｍＲＮＡの発現量に対する試料添加群のＣＯＬ１Ａ１ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。なお、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。

ＣＯＬ１Ａ１用のプライマーセット
ＡＧＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＡＴＧＴＣＴＧＧＴＴ（配列番号１）
ＴＴＧＣＡＧＴＧＧＴＡＧＧＴＧＡＴＧＴＴＣＴＧ（配列番号２）
β―ａｃｔｉｎ用のプライマーセット
ＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣ（配列番号３）
ＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号４）

この実験結果を表２に示した。その結果、本発明のオオヨモギの抽出物は、ヨモギの抽出物よりも顕著に優れたコラーゲン産生促進効果を有していることが認められた。

実験例３ＤＰＰＨラジカル消去試験（抗酸化試験）
活性酸素種として、安定なフリーラジカルであるα，α－ジフェニル－β－ピクリルヒドラジル（以下ＤＰＰＨとする）を用い、試料と一定の割合で一定時間反応させ、減少するＤＰＰＨの量を、分光光度計を用いて５１７ｎｍにおける吸光度の減少量から測定した。

ＤＰＰＨラジカル消去効果の測定方法
各試料（終濃度は表３に記載）を添加した０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）０．４ｍＬに無水エタノール０．４ｍＬ及び０．５ｍＭＤＰＰＨ無水エタノール溶液０．２ｍＬを加えて反応液とした。また、油溶性の試料の場合は無水エタノール０．４ｍＬに試料を加えて反応液とした。その後、３７℃で３０分間反応させ、水を対照として５１７ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。また、コントロールとして試料の代わりに精製水を用いて吸光度（Ｂ）を測定した。ＤＰＰＨラジカル消去率は、以下に示す式より算出した。
ＤＰＰＨラジカル消去率（％）＝（１－Ａ／Ｂ）×１００

これらの試験結果を表３に示した。本発明のオオヨモギの抽出物は、ヨモギの抽出物よりも顕著に優れたＤＰＰＨラジカル消去効果を有していることが認められた。

以上のことから、本発明のオオヨモギの抽出物は、優れたメラニン生成抑制効果、コラーゲン産生促進効果及び抗酸化効果を有しているので、本発明のオオヨモギの抽出物は、美容分野だけでなく、医療分野にも利用でき、食品、化粧品、医薬部外品及び医薬品等への応用が期待される。

Claims

オオヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｍｏｎｔａｎａ）のエタノール抽出物を０．００１～１０重量％含有することを特徴とするメラニン生成抑制剤。
オオヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｍｏｎｔａｎａ）のエタノール抽出物を０．００１～１０重量％含有することを特徴とする、メラニンによる色素沈着の改善及び予防用食品組成物。