JP6281761B2

JP6281761B2 - ヒダカミセバヤエキスを含有する外用剤又は内用剤

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Publication number: JP6281761B2
Application number: JP2013223826A
Authority: JP
Inventors: 麻友美国田; 坂井田　勉; 勉坂井田; 山羽　宏行; 宏行山羽; 嘉博加藤; 美佳子小林
Original assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd; Hokkaido Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd; Hokkaido Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 2013-10-29
Filing date: 2013-10-29
Publication date: 2018-02-21
Anticipated expiration: 2033-10-29
Also published as: JP2015086145A

Description

本発明は、活性酸素消去、コラーゲン分解抑制、メラニン生成抑制及び細胞増殖促進作用に優れた新規な外用剤又は内用剤に関する。

皮膚は生体の最外層に位置し、紫外線等の影響により活性酸素が発生しやすい臓器であり、絶えずその酸素ストレスに曝されている。一方、皮膚細胞内には活性酸素消去酵素が存在しており、その能力を超える活性酸素が発生しないかぎり活性酸素の傷害から皮膚細胞を防衛している。ところが、皮膚細胞内の活性酸素消去酵素の活性は加齢とともに低下することが知られており、活性酸素による傷害がその防御反応を凌駕したとき、皮膚は酸化され、細胞機能が劣化して老化してゆくと考えられる。また、皮膚以外の臓器においても、その活性酸素消去能を越える活性酸素に曝されたとき、機能低下が起こり、ガンや心筋梗塞など様々な生活習慣病が発生すると考えられる。そこで、活性酸素による傷害からの防御を目的として活性酸素消去剤や抗酸化剤が検討され、ＳＯＤやカタラーゼ等の活性酸素消去酵素、ＳＯＤ様活性物質などの活性酸素消去剤や抗酸化剤を配合した食品、化粧品、医薬部外品及び医薬品等が開発されている（特許文献１、２）。

コラゲナーゼ等のマトリックスメタロプロテアーゼは紫外線によって活性化され、紫外線による基底膜成分の減少、基底膜の構造変化の原因となり、皮膚におけるシワやたるみの形成等の大きな要因となることが明らかとなっている（非特許文献１参照）。従って、コラゲナーゼに対して阻害活性を有する物質は、皮膚におけるシワやたるみの予防だけでなく、ガン組織における血管新生やガンの転移を抑制する効果が期待され、ガン疾患の予防、治療に有用であると考えられる。さらに、コラゲナーゼは、慢性関節リュウマチ、歯周炎等の種々の病態での細胞外基質の分解に関与していることが報告されている。よって、コラゲナーゼの阻害活性を有すれば、ガンの転移、潰瘍形成、慢性関節リュウマチ、歯周炎等、コラゲナーゼの亢進が原因で起こる各種疾患の治療及び改善に有用である。コラゲナーゼの阻害活性を有する素材として、例えば、カカオ豆皮であるカカオハスク抽出物（特許文献３）、バラ科オニイチゴ抽出物（特許文献４参照）、ラクトフェリン（特許文献５）などが提案されている。皮膚老化や口腔衛生にますます関心が高まっている状況下で、副作用がなく、安全性が高い、コラゲナーゼ活性阻害作用の優れた素材を見出すことが求められている。

一般に、シミ、ソバカス、日焼け等に見られる皮膚の色素沈着は、ホルモンの異常や紫外線の刺激により、皮膚内に存在するメラニン色素生成細胞がメラニン色素を過剰に生成し、これが皮膚内に沈着することが原因と考えられている。このような色素沈着を防ぐ方法の一つに、メラニンの過剰な生成を抑制する方法が知られている。従来、色素沈着の治療には、内用や外用などにおいて、アスコルビン酸（ビタミンＣ）等が用いられてきた。

加齢とともに表皮細胞の増殖・分裂能は低下し、表皮層自体は薄くなる（非特許文献１）。生体因子であるＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ（ＥＧＦ／上皮細胞成長因子）や女性ホルモン（エストロゲン）は皮膚の表皮細胞増殖に働きかけるが、加齢と共にその分泌は低下する。このような加齢による表皮細胞代謝機能の低下は、皮膚のターンオーバー速度を遅らせ、肌荒れや皮膚の老化の原因となる。また、角層表面から剥がれ落ちる角層細胞が滞留することで、表皮内メラニンの排泄がスムーズに行われなくなり、色素沈着や肌のくすみの原因となる。さらに表皮の創傷治癒が遅くなることなども知られている。これらの現象の進行を防止あるいは改善するために、表皮細胞の増殖を促進させる成分の探索や、多くの皮膚外用剤の提案がなされてきた。

しかしながら、これらの活性酸素消去効果、コラーゲン分解抑制効果、メラニン生成抑制効果及び細胞増殖促進効果を有する植物由来の天然原料として、本発明に用いたヒダカミセバヤは検討されていなかった。

特開平９−１１８６３０号公報特開平９−２０８４８４号公報特開平３−４４３３１号公報特開２００３−１３７８０１号公報特開平５−１８６３６８号公報特許第４０５７１７０号

ＧａｒｙＪ．Ｆｉｓｈｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３７９，Ｎｏ．２５，ｐｐ３３５，１９９６ＶａｒａｎｉＪｅｔａｌ．，ＪＩｎｖｅｓｔｉｇＤｅｒｍａｔｏｌＳｙｍｐＰｒｏｃ，１９９８，３，５７６０

安全で安定性に優れ、活性酸素消去作用、コラーゲン分解抑制作用、メラニン生成抑制作用及び細胞増殖促進作用に優れた素材が望まれているが、未だ十分満足し得るものが提供されていないのが現状である。

このような事情により、本発明者らは鋭意検討した結果、ヒダカミセバヤの抽出物が優れた活性酸素消去作用、コラーゲン分解抑制作用、メラニン生成抑制作用及び細胞増殖促進作用を持ち、安定性においても優れていることを見出した。さらに、その抽出物を含有する外用剤又は内用剤が、安全で安定であり、活性酸素消去作用、コラーゲン分解抑制作用、メラニン生成抑制作用及び細胞増殖促進作用に優れており、多機能性美容・健康用素材と成り得ることを見いだし、本発明を完成するに至った。

本発明に用いるヒダカミセバヤの抽出物とは、ベンケイソウ科ムラサキベンケイソウ属の多年草ヒダカミセバヤ（学名：Ｈｙｌｏｔｅｌｅｐｈｉｕｍｃａｕｔｉｃｏｌｕｍ）の花、茎、葉、根、種子等の植物体の一部及び／又は全草及び／又はカルスより抽出したものである。その抽出方法は特に限定されず、例えば、加熱抽出したものであっても良いし、常温抽出したものであっても良い。カルスは、一例として、以下のような方法で得られる。ヒダカミセバヤの葉の細胞から常法により準備することができ、特開２０００−０９３１６８に記載の方法等を用いることができる。得られた培養細胞を、各種植物ホルモン（ナフチル酢酸、カイネチンなど）を含むＭＳ液体培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅＴａｎｄＦ. Ｓｋｏｏｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ. Ｐｌａｎｔ，Ｖｏｌ．１８，ｐｐ．１００−１２７，１９６２）に接種し、１５℃〜３０℃の暗所で１〜３週間、回転振とう培養を行い、カルスを得る。

抽出溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１‐プロパノール、２‐プロパノール、１‐ブタノール、２‐ブタノール等）、液状多価アルコール（１，３‐ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール及び液状多価アルコール等の極性溶媒が良く、特に好ましくは、水、エタノール、１，３‐ブチレングリコール及びプロピレングリコールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。

上記抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、希釈及び濾過処理、活性炭等による脱色、脱臭処理等をして用いても良い。更には、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いても良い。

本発明の外用剤、抗酸化剤、コラーゲン分解抑制剤、美白剤及び細胞増殖促進剤には、上記抽出物をそのまま使用しても良く、抽出物の効果を損なわない範囲内で、化粧品、医薬部外品、医薬品又は食品等に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、皮膜剤、甘味料、酸味料等の成分を配合することもできる。

本発明の外用剤、抗酸化剤、コラーゲン分解抑制剤、美白剤及び細胞増殖促進剤は、化粧品、医薬部外品、医薬品、食品のいずれにも用いることができ、その剤形としては、例えば、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、錠菓、カプセル剤、チョコレート、ガム、飴、飲料、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤、坐剤、注射用溶液等が挙げられる。

本発明に用いる上記抽出物の配合量は、本発明の外用剤、抗酸化剤、コラーゲン分解抑制剤、美白剤及び細胞増殖促進剤に対し、固形物に換算して０．０００１重量％以上が好ましく、０．００１〜１０重量％がより好ましい。さらに、０．０１〜５重量％が最も好ましい。０．０００１重量％未満では十分な効果は望みにくい。１０重量％を越えて配合した場合、効果の増強は認められにくく不経済である。一方、内用の場合、投与量は年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人１人当たりの１日の量としては、５ｍｇ以上が好ましく、１０ｍｇ〜０．５ｇがより好ましい。さらに、２０ｍｇ〜０．２ｇが最も好ましい。

次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる抽出物の製造例、実験例及び処方例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。製造例に示す％とは重量％を、処方例に示す配合量の部とは重量部を示す。

製造例Ａヒダカミセバヤのカルス
ヒダカミセバヤの葉の細胞を１０^−５Ｍナフタレン酢酸、１０^−５Ｍカイネチンを含むＭＳ寒天培地に置床し、常法によりカルスを誘導した。一ヶ月後、このカルスを同液体培地に入れて９０ｒｐｍで回転振とう培養し、その懸濁培養細胞を調製した。この培養細胞を１０^−５Ｍナフタレン酢酸、１０^−５Ｍカイネチンを含むＭＳ液体培地６Ｌに接種し、暗所で２週間、回転振とう培養した。得られた培養細胞を凍結乾燥し、乾燥物を１００ｇ得た。
製造例１ヒダカミセバヤの地上部の熱水抽出物
ヒダカミセバヤの地上部の乾燥物２０ｇに精製水４００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してヒダカミセバヤの地上部の熱水抽出物を２．５ｇ得た。

製造例２ヒダカミセバヤのカルスの熱水抽出物
ヒダカミセバヤのカルスの乾燥物（製造例Ａ）２０ｇに精製水４００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してヒダカミセバヤのカルスの熱水抽出物を３．６ｇ得た。

製造例３ヒダカミセバヤの地上部の５０％エタノール抽出物
ヒダカミセバヤの地上部の乾燥物１００ｇに５０％エタノール水溶液１Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ヒダカミセバヤの地上部の５０％エタノール抽出物を９．５ｇ得た。

製造例４ヒダカミセバヤのカルスの５０％エタノール抽出物
ヒダカミセバヤのカルスの乾燥物（製造例Ａ）１００ｇに５０％エタノール水溶液１Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ヒダカミセバヤのカルスの５０％エタノール抽出物を９．７ｇ得た。

製造例５ヒダカミセバヤの地上部のエタノール抽出物
ヒダカミセバヤの地上部の乾燥物１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ヒダカミセバヤの地上部のエタノール抽出物を６．５ｇ得た。

製造例６ヒダカミセバヤのカルスのエタノール抽出物
ヒダカミセバヤのカルスの乾燥物（製造例Ａ）１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ヒダカミセバヤのカルスのエタノール抽出物を７．８ｇ得た。

製造例７ヒダカミセバヤの地上部の５０％１，３−ブチレングリコール抽出物
ヒダカミセバヤの地上部の乾燥物２０ｇに５０％１，３−ブチレングリコール水溶液４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、ヒダカミセバヤの地上部の５０％１，３−ブチレングリコール抽出物を３３７ｇ得た。

製造例８ヒダカミセバヤのカルスの５０％１，３−ブチレングリコール抽出物
ヒダカミセバヤのカルスの乾燥物（製造例Ａ）２０ｇに５０％１，３−ブチレングリコール水溶液４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、ヒダカミセバヤのカルスの５０％１，３−ブチレングリコール抽出物を３４９ｇ得た。

処方例１化粧水
処方配合量（部）
１．ヒダカミセバヤの地上部の熱水抽出物（製造例１）２．０
２．１，３−ブチレングリコール８．０
３．グリセリン２．０
４．キサンタンガム０．０２
５．クエン酸０．０１
６．クエン酸ナトリウム０．１
７．エタノール５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．）０．１
１０．香料適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜６及び１１と、成分７〜１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。

処方例１において、ヒダカミセバヤの地上部の熱水抽出物をヒダカミセバヤのカルスの熱水抽出物（製造例２）に置き換えたものを処方例２とした。

比較処方例１従来の化粧水
処方例１において、ヒダカミセバヤの地上部の熱水抽出物（製造例１）を精製水に置き換えたものを、従来の化粧水とした。

処方例３クリーム
処方配合量（部）
１．ヒダカミセバヤのカルスの５０％エタノール抽出物（製造例４）１．０
２．スクワラン５．５
３．オリーブ油３．０
４．ステアリン酸２．０
５．ミツロウ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）３．０
８．ベヘニルアルコール１．５
９．モノステアリン酸グリセリン２．５
１０．香料０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１２．パラオキシ安息香酸エチル０．０５
１３．１，３−ブチレングリコール８．５
１４．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

処方例３において、ヒダカミセバヤのカルスの５０％エタノール抽出物を製造例３に置き換えたものを処方例４とした。

処方例５乳液
処方配合量（部）
１．ヒダカミセバヤのカルスのエタノール抽出物（製造例６）０．０１
２．スクワラン５．０
３．オリーブ油５．０
４．ホホバ油５．０
５．セタノール１．５
６．モノステアリン酸グリセリン２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．）２．０
９．香料０．１
１０．プロピレングリコール１．０
１１．グリセリン２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１０〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

処方例５において、ヒダカミセバヤのカルスのエタノール抽出物を製造例５に置き換えたものを処方例６とした。

処方例７ゲル剤
処方配合量（部）
１．ヒダカミセバヤのカルスの５０％エタノール抽出物（製造例４）１．０
２．エタノール５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．）０．１
５．香料適量
６．１，３−ブチレングリコール５．０
７．グリセリン５．０
８．キサンタンガム０．１
９．カルボキシビニルポリマー０．２
１０．水酸化カリウム０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜５と、成分１及び６〜１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。

処方例７において、ヒダカミセバヤのカルスの５０％エタノール抽出物を製造例３に置き換えたものを処方例８とした。

処方例９パック
処方配合量（部）
１．ヒダカミセバヤのカルスの熱水抽出物（製造例２）１．０
２．ヒダカミセバヤのカルスの
５０％１，３−ブチレングリコール抽出物（製造例８）５．０
３．ポリビニルアルコール１２．０
４．エタノール５．０
５．１，３−ブチレングリコール８．０
６．パラオキシ安息香酸メチル０．２
７．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．）０．５
８．クエン酸０．１
９．クエン酸ナトリウム０．３
１０．香料適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜１１を均一に溶解し製品とする。

処方例１０ファンデーション
処方配合量（部）
１．ヒダカミセバヤの地上部のエタノール抽出物（製造例５）１．０
２．ステアリン酸２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（２０Ｅ．Ｏ．）１．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）２．０
５．セタノール１．０
６．液状ラノリン２．０
７．流動パラフィン３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル６．５
９．カルボキシメチルセルロースナトリウム０．１
１０．ベントナイト０．５
１１．プロピレングリコール４．０
１２．トリエタノールアミン１．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１４．二酸化チタン８．０
１５．タルク４．０
１６．ベンガラ１．０
１７．黄酸化鉄２．０
１８．香料適量
１９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分１９に成分９をよく膨潤させ、続いて、成分１及び１０〜１３を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１４〜１７を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。この油相に水相をかき混ぜながら加え、乳化する。その後、冷却し、４５℃で成分１８を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

処方例１１浴用剤
処方配合量（部）
１．ヒダカミセバヤのカルスのエタノール抽出物（製造例６）１．０
２．炭酸水素ナトリウム５０．０
３．黄色２０２号（１）適量
４．香料適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜５を均一に混合し製品とする。

処方例１２軟膏
処方配合量（部）
１．ヒダカミセバヤのカルスの熱水抽出物（製造例２）１．０
２．ヒダカミセバヤの地上部の
５０％１，３−ブチレングリコール抽出物２（製造例7）５．０
３．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．）２．０
４．モノステアリン酸グリセリン１０．０
５．流動パラフィン５．０
６．セタノール６．０
７．パラオキシ安息香酸メチル０．１
８．プロピレングリコール１０．０
９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分３〜６を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２及び７〜９を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

処方例１３散剤１
処方配合量（部）
１．ヒダカミセバヤのカルスの熱水抽出物（製造例２）１．０
２．乾燥コーンスターチ３９．０
３．微結晶セルロース６０．０
［製造方法］成分１〜３を混合し、散剤とする。

処方例１４散剤２
処方例１３において、ヒダカミセバヤのカルスの熱水抽出物を製造例１に置き換えたものを散剤２とした。

処方例１５錠剤
処方配合量（部）
１．ヒダカミセバヤのカルスのエタノール抽出物（製造例６）５．０
２．乾燥コーンスターチ２５．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム２０．０
４．微結晶セルロース４０．０
５．ポリビニルピロリドン７．０
６．タルク３．０
［製造方法］成分１〜４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成型する。成型した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。

処方例１６錠菓
処方配合量（部）
１．ヒダカミセバヤの地上部のエタノール抽出物（製造例５）２．０
２．乾燥コーンスターチ４９．８
３．エリスリトール４０．０
４．クエン酸５．０
５．ショ糖脂肪酸エステル３．０
６．香料０．１
７．精製水０．１
［製造方法］成分１〜４及び７を混合し、顆粒成型する。成型した顆粒に成分５及び６を加えて打錠する。１粒１．０ｇとする。

処方例１７飲料
処方配合量（部）
１．ヒダカミセバヤのカルスの熱水抽出物（製造例２）０．０５
２．ステビア０．０５
３．リンゴ酸５．０
４．香料０．１
５．精製水９４．８
［製造方法］成分２及び３を少量の水に溶解する。次いで、成分１、４及び５を加えて混合する。

次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。

実験例１活性酸素消去作用
フリーラジカル捕捉除去作用の評価を行った。陽性対照としてはアスコルビン酸を用いた。フリーラジカルのモデルとしては、安定なフリーラジカルであるα，α−ジフェニル−β−ピクリルヒドラジル（以下ＤＰＰＨとする）を用い、試料と一定の割合で一定時間反応させ、減少するラジカルの量を波長５１７ｎｍの吸光度の減少量から測定した。

フリーラジカル捕捉除去作用の測定方法
各試料を、最終濃度１ｍｇ／ｍＬ（アスコルビン酸は０．１ｍｇ／ｍＬ）となるように加えた０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍＬに無水エタノール２ｍＬ及び０．５ｍＭＤＰＰＨ無水エタノール溶液１ｍＬを加えて反応液とした。また、油溶性の試料の場合は無水エタノール２ｍＬに試料を加えて反応液とした。その後、３７℃で３０分間反応させ、水を対照として波長５１７ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。また、ブランクとして試料の代わりに精製水を用いて吸光度（Ｂ）を測定した。フリーラジカル捕捉除去率は、以下に示す式より算出した。
フリーラジカル捕捉除去率（％）＝（１−Ａ／Ｂ）×１００

これらの試験結果を表１に示した。その結果、本発明のヒダカミセバヤの熱水抽出物及び５０％エタノール抽出物は、安定で優れたフリーラジカル捕捉除去作用を有していることが認められた。また、その他の抽出物についても効果が認められた。なお、アスコルビン酸は、１００℃、１時間の熱処理で失活するが、本発明のヒダカミセバヤの抽出物は、活性に変化はなかった。

実験例２コラゲナーゼ活性阻害試験
試料液５０μＬ（最終濃度が１ｍｇ／ｍＬ）に酵素液として５０Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＴｙｐｅＩＶ（シグマ製）水溶液を５０μＬ加えた。基質溶液として０．３９ｍｇ／ｍＬのＰｚ−ペプタイド（Ｐｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ、シグマ製）を含む２０ｍＭ塩化カルシウム入りトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）を４００μＬ加えて混合し、３７℃、３０分反応させた後、２５ｍＭクエン酸０．５ｍＬを加えて反応を停止させた。酢酸エチル２．５ｍＬを加え、酢酸エチル層について３２０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、各試料の阻害作用は、次の式から求められる阻害率で算出した。なお、対照には試料の代わりに精製水を用い、ブランクとしてコラゲナーゼの代わりに２０ｍＭ塩化カルシウム入りトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）を用いた。
阻害率（％）＝〔１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）〕×１００
Ａ：対照の３２０ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ．３２０）
Ｂ：対照ブランクのＯ．Ｄ．３２０
Ｃ：試料のＯ．Ｄ．３２０
Ｄ：試料ブランクのＯ．Ｄ．３２０

これらの実験結果を表２に示した。その結果、本発明のヒダカミセバヤの熱水抽出物及びカルスの熱水抽出物はコラゲナーゼ活性阻害作用を示した。

実験例３Ｂ１６マウスメラノーマを用いたメラニン生成抑制試験
対数増殖期にあるＢ１６マウスメラノーマをφ６０ｍｍｄｉｓｈに３×１０^４個の細胞を播種し、各試料（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＥａｇｌｅｓ’ＭＥＭ（１０％牛胎児血清含有）培地を加え、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下にて培養した。培養５日後に細胞をｄｉｓｈから剥離し、細胞を超音波破砕した後、４ＮＮａＯＨを加え６０℃で２時間の処理を行い、分光光度計でＯ．Ｄ．４７５ｎｍを測定した。尚、超音波処理後の細胞破砕液をＬｏｗｒｙの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３，２６５−２７５，１９５１）でタンパク定量し、タンパク量当りのメラニン量を比較することによって、メラニン生成抑制効果の指標とした。

これらの試験結果を表３に示した。その結果、本発明のヒダカミセバヤのカルスの熱水抽出物及びカルスの５０％エタノール抽出物は、優れたメラニン生成抑制作用を有していることが認められた。

実験例４細胞増殖促進試験
ＨａＣａＴ細胞を、０．１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液にて、９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり５，０００個播種し、各試料を添加した後、３７℃、５％ＣＯ_２条件下にて３日間培養した。細胞数の測定は、ＭＴＴ法により行った。すなわち、培養終了後、培養液を除き、５００μｇ／ｍＬの濃度にて、ＭＴＴを溶解させたＤＭＥＭに培地を入れ替え、２時間培養した後、１５０μＬのＤＭＥＭに細胞を溶解させ、マイクロプレートリーダーをもちいて５９０及び６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。細胞数は、５９０ｎｍの吸光度値から、６５０ｎｍの吸光度値を引いた値にて算出し、試料を添加しない細胞群（未添加細胞群）を１００％とした換算値として示した。

これらの実験結果を表４に示した。その結果、本発明のヒダカミセバヤのカルスの熱水抽出物及びカルスの５０％エタノール抽出物は、優れた細胞増殖促進作用を示した。

実験例５使用試験１
処方例１の化粧水及び比較処方例１の従来の化粧水を用いて、しわ、たるみに悩む女性１０人（２３〜５０才）を対象に１ヶ月間の使用試験を行った。使用後、しわ、たるみの改善効果をアンケートにより判定した。

その結果、本発明の抽出物を含有する処方例１の化粧水は、優れたしわ、たるみの改善作用を示した。なお、試験期間中、皮膚トラブルは一人もなく、安全性においても問題なかった。また、処方成分の劣化についても問題なかった。

以上のことから、本発明のヒダカミセバヤの抽出物は、優れた活性酸素消去作用、コラーゲン分解抑制作用、メラニン生成抑制作用及び細胞増殖促進作用を有し、安定性にも優れていた。よって、本発明のヒダカミセバヤの抽出物は、皮膚の老化や美白といった美容分野だけでなく、老化による機能低下の抑制、ガンの予防、治療や創傷治癒などといった医療分野にも利用ででき、食品、化粧品、医薬部外品及び医薬品等への応用が期待される。

Claims

ヒダカミセバヤのカルスの抽出物を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
ヒダカミセバヤのカルスの抽出物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
ヒダカミセバヤのカルスの抽出物を含有することを特徴とするコラーゲン分解抑制剤。
ヒダカミセバヤのカルスの抽出物を含有することを特徴とする美白剤。
ヒダカミセバヤのカルスの抽出物を含有することを特徴とする細胞増殖促進剤。