JP2005218317A - 腸管出血性大腸菌の志賀毒素群遺伝子の検出試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】 腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）の志賀毒素群遺伝子２型（ｓｔｘ２）の迅速かつ特異的な遺伝子検査試薬を構成するのに好適なオリゴヌクレオチドの組み合わせを提供すること。
【解決手段】 ＥＨＥＣのｓｔｘ２ ＲＮＡに特異的かつ遺伝子型による変異のない位置にある塩基配列と相同的あるいは相補的な配列を有するプライマーを用いることにより、ｓｔｘ２ ＲＮＡのみを特異的に増幅させて検出する方法と、ｓｔｘ２ ＲＮＡの特定部位に結合するオリゴヌクレオチドによって、前記課題を解決する。
【選択図】 図４

Description

本発明は、臨床検査、公衆衛生、食品検査または食中毒検査における腸管出血性大腸菌の検出試薬に関するものである。

志賀毒素群（Ｓｈｉｇａ−ｔｏｘｉｎ ｆａｍｉｌｙ：ｓｔｘ）は病原性大腸菌Ｏ１５７をはじめとする腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）が産生する強力な毒素である。ＥＨＥＣによる感染症の主な症状ははじめに水様便、その後激しい腹痛と血便を示す。また有症者の一部は溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）や脳症へと重症化し、最悪の場合では死に至る例も報告されている。

ＥＨＥＣの血清型は６０種類以上と非常に多彩であるが、検出頻度から見ると最も多いのはＯ１５７：Ｈ７である。またｓｔｘには抗原性の違いから大きく分けて１型（ｓｔｘ１）と２型（ｓｔｘ２）がある。

ＥＨＥＣの検出および同定を行なう方法としてＯ１５７抗原検査等が知られているが、ＥＨＥＣの遺伝子や該遺伝子に由来するＲＮＡ中の特定の配列を増幅した上で検出する方法が、感度、迅速性、および操作性の点で好適である。特に、一定温度で標的核酸を増幅する方法は検査装置の自動化という点においても好適である。
特開２００２−２５３２５７号公報

ＥＨＥＣの検出および同定を行なう方法として、ｓｔｘ１およびｓｔｘ２に由来するＲＮＡを比較的低温（４１℃）で特異的に増幅させる方法が報告されている（特開２００２−２５３２５７号公報）。この方法では、ｓｔｘ１およびｓｔｘ２に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、該特定配列に相補的な配列を有する第一のプライマーおよび該特定配列に相同的な配列を有する第二のプライマー（ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方のプライマーは５’ 末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加した配列を有する）を用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成し、リボヌクレアーゼＨ作用によりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより前記ＲＮＡ配列または前記ＲＮＡ配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程を利用する。さらに、前記ＲＮＡ増幅工程を、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド存在下（ここで該オリゴヌクレオチドの配列はＲＮＡ転写産物の少なくとも一部の配列と相補的であり、該オリゴヌクレオチドがＲＮＡ転写産物と相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するものである）で実施することで、反応液の蛍光強度を測定する方法である。

しかしながら、上記方法は、感度および迅速性において以下の問題点を有する。すなわち、特開２００２−２５３２５７号公報によれば、初期ｓｔｘ２ ＲＮＡ量が１０²コピーの時の検出時間が約１７分と、ｓｔｘ１ ＲＮＡ検出試薬での検出時間（１０² コピーのｓｔｘ１ ＲＮＡを約１４分で検出）と比較して遅い（実施例１参照）。また、上記方法のうち第二のプライマーには遺伝子型の違いにより塩基配列のミスマッチがあり、ミスマッチのある遺伝子型を保有するＥＨＥＣは検出時間が遅れるか検出不能と考えられる（図１参照）。

そこで本発明は、遺伝子型の違いによらず迅速性および特異性に優れたｓｔｘ２ ＲＮＡ検出試薬を提供することを目的とするものである。

本願発明者らは迅速性および特異性に優れたＥＨＥＣのｓｔｘ２ ＲＮＡ検出試薬を構築するにあたり、鋭意研究を重ね、オリゴヌクレオチドの位置を遺伝子型による変異のない箇所に設計することでミスマッチの問題を解決（図１参照）し、かつ、初期ＲＮＡ量１０²コピーのｓｔｘ２ ＲＮＡを約１４分で検出が可能な試薬を構築した。

本発明は、試料中に存在するＥＨＥＣの志賀毒素群遺伝子２型（ｓｔｘ２）の検出において利用するための検出試薬であって、
ｓｔｘ２遺伝子に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、該特定配列に相同的な配列を有する第一のプライマーおよび該特定配列に相補的な配列を有する第二のプライマー（ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方のプライマーは５’ 末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加した配列を有する）を用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成し、
リボヌクレアーゼＨ作用により該ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、
該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより前記ＲＮＡ配列または前記ＲＮＡ配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして
該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となる、
といった段階を含んで成るＲＮＡ増幅工程を利用した検出法において利用するための検出試薬であり、
ここで該第一のプライマーとして配列番号１に示す配列のうち、少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に示す配列のうち、少なくとも連続した１０塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加され且つ前記特定配列に相補的な配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に示す配列のうち、少なくとも連続した１０塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし且つ前記特定配列に相補的な配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチド、該第二のプライマーとして配列番号２に示す配列のうち、少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に示す配列のうち、少なくとも連続した１０塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加され且つ前記特定配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に示す配列のうち、少なくとも連続した１０塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし且つ前記特定配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチド、を含むことを特徴とする検出試薬に関する。

高ストリンジェント条件とは、例えば以下の実施例に示すような、６０ｍＭのＴｒｉｓ、１７ｍＭの塩化マグネシウム、１００〜１５０ｍＭの塩化カリウム、１ｍＭのＤＴＴの存在下、４１〜４４℃でのハイブリダイゼーション条件であってよい。

尚、ｓｔｘ２に由来するＲＮＡに対して相補的であるＲＮＡを検出の対象とする場合には、第一のプライマー及び第二のプライマーとして、それぞれ、それらの５’末端と３’末端が逆となるものと相補的なプライマーを用いればよい。

好ましくは、前記ＲＮＡ増幅工程は前記標的ＲＮＡを前記特定配列の５’末端で切断する、該特定配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有する切断用オリゴヌクレオチドの存在下で実施される。

好適な態様において、前記第一のプライマーは配列番号１の配列のオリゴヌクレオチドである。
好適な態様において、前記第二のプライマーは配列番号２の配列のオリゴヌクレオチドである。
更なる好適な態様において、前記第一のプライマーは配列番号１の配列のオリゴヌクレオチドであり、かつ前記第二のプライマーが配列番号２の配列のオリゴヌクレオチドである。

別の好適な態様において、前記ＲＮＡ増幅工程はインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施され、反応液の蛍光強度を測定することによりＥＨＥＣの検出が行われる。ここで該オリゴヌクレオチドの配列は前記ＲＮＡ転写産物の少なくとも一部の配列と相補的であり、該オリゴヌクレオチドの該ＲＮＡ転写産物との相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するものである。

好ましくは、前記インターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチドは配列番号３に示した少なくとも連続した１０塩基以上からなる。以下、本発明を詳細に説明する。

本願発明に係る検出試薬を利用する検出法は腸管出血性大腸菌のｓｔｘ２ ＲＮＡを従来の方法（特開２００２−２５３２５７号公報）と比較し、遺伝子型の違いによらず迅速にかつ特異的に検出するのに有用である。

本発明において、第一および第二のプライマーは、それぞれ各配列番号として記載した塩基配列の全長を用いることができるが、特定核酸配列等への特異的な結合は１０塩基程度あれば十分であるから、各配列の中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを使用しても良い。

本発明の増幅行程は、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの協奏的作用によって（逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが協奏的に作用するような条件下で反応させ）ｓｔｘ２ ＲＮＡ配列を増幅させるＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法、ＴＲＣ法（例えば特開２０００−１４４００号公報参照）等を含む。ここで温度については特に制限はないが３５〜５０℃が好ましい。

上記本願発明の一態様において、標的ＲＮＡは、特定配列の５’末端で切断される必要がある。このように標的ＲＮＡを切断する方法としては、特定配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（切断用オリゴヌクレオチド）を添加することによって、標的ＲＮＡをリボヌクレアーゼＨ作用等により切断する方法が好ましい。ここで、重複する塩基数は５あるいは６塩基が特に望ましい。該切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端側からの伸長反応を抑えるために、３’末端水酸基が化学的に修飾されたもの、例えばアミノ化等されているものを使用することが望ましい。

以上の核酸増幅方法で得られた増幅産物は既知の核酸検出方法で検出することができるが、好適な態様では前記核酸増幅をインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定することが望ましい。該オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中のリンにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させたもので、標的核酸（相補的核酸）と２本鎖を形成するとインターカレーター部分が２本鎖部分にインターカレートして蛍光特性が変化するため、分離分析を必要としないことを特徴とする(Ｉｓｈｉｇｕｒｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）、４９９２−４９９７（１９９６）)。

該オリゴヌクレオチドが結合する配列は、ｓｔｘ２ ＲＮＡに特異的な配列のいずれであってもよく、特に限定はないが、配列番号３に示した配列中の少なくとも連続した１０塩基からなる配列、あるいはその相補配列であることが望ましい。また、該オリゴヌクレオチドをプライマーとした伸長反応を抑えるために該オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基は、化学的に修飾することが望ましく、一例として特開２０００−３１６５８７号公報に記載の方法が挙げられる。

これにより、ＥＨＥＣのｓｔｘ２ ＲＮＡを、一チューブ内、一定温度、一段階で、迅速および高感度に増幅し、検出することが可能となり、自動化への適用も容易となる。

以下、本願発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

実施例１
特開２００２−２５３２５７号公報に記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）のｓｔｘ１ ＲＮＡおよびｓｔｘ２ ＲＮＡの様々なコピー数による検出を行なった。

（１） ＥＨＥＣのｓｔｘ１ ＲＮＡの塩基配列２２８から１５５８（ＲＮＡの塩基番号はＣａｌｄｅｒｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８４（１３）、４３６４−４３６８（１９９７）、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｍ１６６２５に従った）を含む標準ＲＮＡ１３３７塩基を試料とし、２６０ ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、５ ｍＭ ＤＴＴ、０．２５ Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製））を用い１０⁵ コピー／５ μＬから１０² コピー／５ μＬとなるよう希釈した。コントロール試験区（陰性）には希釈液のみを用いた。

（２） ＥＨＥＣのｓｔｘ２ ＲＮＡの塩基配列１２５から１４７９（ＲＮＡの塩基番号はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ０７８６５に従った）を含む標準ＲＮＡ１３６１塩基を試料とし、２６０ ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、５ ｍＭ ＤＴＴ、０．２５ Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製））を用い１０⁵ コピー／５ μＬから１０² コピー／５ μＬとなるよう希釈した。コントロール試験区（陰性）には希釈液のみを用いた。

（３） 以下の組成の反応液２０ μＬを０．５ ｍＬ容ＰＣＲチューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、アプライドバイオシステム製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５ μＬを添加した。なお、第一プライマー・第二プライマー・切断用オリゴヌクレオチドおよびインターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチドの組み合わせが表１に示す組み合わせになるよう溶液を調製した。
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．６）
１７ ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ ｍＭ（ｓｔｘ１用）または１５０ ｍＭ（ｓｔｘ２用） 塩化カリウム
６ Ｕ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
１ ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１６ μＭの切断用オリゴヌクレオチド
１．０ μＭの第一プライマー
１．０ μＭの第二プライマー
２５ ｎＭのインターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチド
１３％ ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水

（３） 上記の反応液を４４℃（ｓｔｘ１用）あるいは４１℃（ｓｔｘ２用）で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４４℃（ｓｔｘ１用）あるいは４１℃（ｓｔｘ２用）で２分間保温した酵素液５ μＬを添加した。
酵素液の組成（各数値は最終反応液量３０ μＬにおける値）
２．０ ％ ソルビトール
３．６ μｇ 牛血清アルブミン
１４２ Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン製）
６．４ Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
容量調整用蒸留水
（４） 引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４４℃（ｓｔｘ１用）あるいは４１℃（ｓｔｘ２用）で保温して、励起波長４７０ ｎｍ、蛍光波長５２０ ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
酵素添加時の時刻を０分として、ｓｔｘ１及びｓｔｘ２の試料の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）の経時変化をそれぞれ図２（Ａ）および（Ｂ）に示した。また、初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）との関係の結果をｓｔｘ１及びｓｔｘ２の試料それぞれについて図３（Ｃ）および（Ｄ）に示した。なお、初期ＲＮＡ量はｓｔｘ１、ｓｔｘ２ともに１０² コピー／試験から１０⁵ コピー／試験である。

図２より、ｓｔｘ１ ＲＮＡの１０² コピーが約１４分で、ｓｔｘ２ ＲＮＡの１０²コピーが約１７分で検出された。この結果より、特開２００２−２５３２５７号公報に記載したｓｔｘ２ ＲＮＡ検出用のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いるとｓｔｘ１ ＲＮＡ検出用と比較して検出時間が遅れることが示された。

表１は本実験系で用いた第一プライマー・第二プライマー・切断用オリゴヌクレオチドおよびインターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチドの組み合わせを示す。ｓｔｘ２検出用オリゴヌクレオチドの組み合わせでの、ＥＨＥＣのｓｔｘ２ ＲＮＡにおけるオリゴヌクレオチドの位置は図１に示している。切断用オリゴヌクレオチドの塩基配列のうち、３’末端の水酸基はアミノ化されている。第一プライマーの塩基配列のうち、５’末端側第１番目の「Ａ」から第２２番目の「Ａ」までの領域はＴ７プロモーター領域であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から第２８番目の「Ａ」までの領域はエンハンサー配列である。インターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチドのうちＹＯ−ＶＴ１−Ｓ−Ｇ（配列番号９）は５'末端側から６塩基目の「Ｃ」と７塩基目の「Ｇ」との間のリンに、ＹＯ−ＶＴ２−Ｓ−Ｇ（配列番号３）は５'末端から１２番目の「Ｔ」と１３番目の「Ａ」との間のリンにそれぞれインターカレーター性色素が標識されており、また３'末端側の水酸基はグリコール基で修飾されている。

切断用オリゴヌクレオチド
ＶＴ１−５Ｓ（配列番号４）
ＶＴ２−５Ｓ（配列番号５）
第一プライマー
ＶＴ１−５Ｆ（配列番号６）
ＶＴ２−５Ｆ（配列番号７）
第二プライマー
ＶＴ１−６Ｒ（配列番号８）
ＶＴ２−７Ｒ（配列番号２）
インターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチド
ＹＯ−ＶＴ１−Ｓ−Ｇ（配列番号９）
ＹＯ−ＶＴ２−Ｓ−Ｇ（配列番号３）

実施例２
本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いてＥＨＥＣのｓｔｘ２ ＲＮＡの様々な初期コピー数における検出を行なった。
（１） 実施例１と同様のＥＨＥＣのｓｔｘ２ ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ、０．２５ Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製））を用い、１０⁵ コピー／５μＬから１０² コピー／５μＬまでとなるよう希釈した。コントロール試験区（陰性）には希釈液のみを用いた。

（２） 以下の組成の反応液２０ μＬをＰＣＲ用チューブ（容量０．５ ｍＬ；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、アプライドバイオシステム製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５ μＬを添加した。
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．６）
１８ ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ ｍＭ 塩化カリウム
６ Ｕ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
１ ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１６ μＭの切断用オリゴヌクレオチド（ＶＴ２−１２Ｓ、配列番号１０、３’末端の水酸基はアミノ化されている。）
１．０ μＭの第一プライマー（ＶＴ２−１２Ｆ、配列番号１１）
１．０ μＭの第二プライマー（ＶＴ２−７Ｒ、配列番号２）
２５ ｎＭのインターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＶＴ２−Ｓ−Ｇ、配列番号３、５’末端から１２番目の「Ｔ」と１３番目の「Ａ」との間のリンにインターカレーター性蛍光色素が標識されている。また３’末端の水酸基はグリコール基で修飾されている。）
１３％ ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水

（３） 上記の反応液を４３℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４３℃で２分間保温した酵素液５ μＬを添加した。
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
２．０％ ソルビトール
３．６ μｇ 牛血清アルブミン
１４２ Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン製）
６．４ Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
容量調整用蒸留水

（４） 引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で保温して、励起波長４７０ ｎｍ、蛍光波長５２０ ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
酵素添加時の時刻を０分として、試料の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）の経時変化を図４（Ａ）に示した。また、初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）との関係の結果を図４（Ｂ）に示した。なお、初期ＲＮＡ量は１０² コピー／試験から１０⁵ コピー／試験である。

図４より、１０² コピーが約１４分で検出され、従来の方法（特開２００２−２５３２５７号公報および実施例１）と比較して迅速な検出が可能となっている。また、本願発明で使用したオリゴヌクレオチドはいずれも遺伝子型による変異のない箇所に設計している（図１参照）ため、特異性においても従来の方法（特開２００２−２５３２５７号公報）よりも優れていると思われる。

以上の説明のように、本願発明の検出法は腸管出血性大腸菌のｓｔｘ２ ＲＮＡを従来の方法（特開２００２−２５３２５７号公報）と比較し、遺伝子型の違いによらず迅速にかつ特異的に検出するのに有用である。

本願発明のオリゴヌクレオチドは、配列表に記載した塩基配列（２０塩基から２３塩基）の物に限られず、これら配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドであれば良い。これらは、比較的低温（好ましくは４３℃）条件下で、プライマーまたはプローブの標的核酸への特異性を確保するためには１０塩基程度の塩基配列があれば十分であることから明らかである。

実施例１および２で使用したｓｔｘ２ ＲＮＡ検出用の各オリゴヌクレオチドの結合位置、および３種類のｓｔｘ２遺伝子（Ｉｔｏら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、８、４７−６０（１９９０）およびＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ０７８６５参照）についてＲＮＡ増幅領域およびその周辺の塩基配列を示す。塩基配列のうち「−」で示した位置はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ０７８６５の塩基配列と同一であることを示す。本願発明で使用したオリゴヌクレオチドはいずれも遺伝子型による変異のない箇所に設計した。 実施例１で行なったｓｔｘ１初期ＲＮＡ量１０² コピー／試験から１０⁵コピー／試験において、反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光強度比のグラフ（Ａ）、およびｓｔｘ２ 初期ＲＮＡ量１０² コピー／試験から１０⁵ コピー／試験において、反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光強度比のグラフ（Ｂ）を示す。Ｎｅｇａとは、ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いたサンプルのことである。ｓｔｘ１ ＲＮＡの１０² コピーが約１４分で、ｓｔｘ２ ＲＮＡの１０² コピーが約１７分でそれぞれ検出され、ｓｔｘ２ ＲＮＡの検出時間がｓｔｘ１ ＲＮＡの検出時間と比較し遅れていることが示された。 実施例１で行なったｓｔｘ１初期ＲＮＡ量１０² コピー／試験から１０⁵コピー／試験において、初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間との間で得られた検量線（Ｃ）、およびｓｔｘ２ 初期ＲＮＡ量１０² コピー／試験から１０⁵ コピー／試験において、初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間との間で得られた検量線（Ｄ）を示す。 実施例２で行なったｓｔｘ２初期ＲＮＡ量１０² コピー／試験から１０⁵ コピー／試験において、反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光強度比のグラフ（Ａ）と初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間との間で得られた検量線（Ｂ）である。Ｎｅｇａとは、ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いたサンプルのことである。ｓｔｘ２ ＲＮＡの１０² コピーが約１４分で検出され、従来の方法（特開２００２−２５３２５７号公報）と比較して検出時間が早くなったことが示された。

Claims (6)

1. 試料中に存在する腸管出血性大腸菌の志賀毒素群遺伝子２型（ｓｔｘ２）の検出において利用するための検出試薬であって、
   ｓｔｘ２に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、該特定配列に相同的な配列を有する第一のプライマーおよび該特定配列に相補的な配列を有する第二のプライマーを用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成し、ここで該第一または第二のプライマーのいずれか一方のプライマーは５’ 末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加した配列を有するものであり、
   リボヌクレアーゼＨ作用により該ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、
   該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより前記ＲＮＡの特定配列または前記ＲＮＡの特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして
   該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となる、
   といった段階を含んで成るＲＮＡ増幅工程を利用した検出法において利用するための検出試薬であり、ここで該第一のプライマーとして配列番号１に示す配列のうち、少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に示す配列のうち、少なくとも連続した１０塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加され且つ前記特定配列に相補的な配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチド、該第二のプライマーとして配列番号２に示す配列のうち、少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に示す配列のうち、少なくとも連続した１０塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加され且つ前記特定配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチド、を含むことを特徴とする、検出試薬。
2. 前記第一のプライマーが配列番号１の配列のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１記載の検出試薬。
3. 前記第二のプライマーが配列番号２の配列のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１記載の検出試薬。
4. 前記第一のプライマーが配列番号１の配列のオリゴヌクレオチドで、前記第二のプライマーが配列番号２の配列のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１の検出試薬。
5. 前記ＲＮＡ増幅工程がインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施され、反応液の蛍光強度を測定することにより腸管出血性大腸菌の検出が行われ、ここで該オリゴヌクレオチドの配列はＲＮＡ転写産物の少なくとも一部の配列と相補的であり、該オリゴヌクレオチドがＲＮＡ転写産物と相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するものである、請求項１〜４のいずれか１項記載の検出試薬。
6. 前記インターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチドが配列番号３に示した少なくとも連続した１０塩基以上からなることを特徴とする、請求項５記載の検出試薬。

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