JP2012135234A

JP2012135234A - 結核菌検出オリゴヌクレオチドプローブ及びそれを利用した検出方法

Info

Publication number: JP2012135234A
Application number: JP2010288888A
Authority: JP
Inventors: Akinori Kobuna; 昭徳小鮒; Tsurayuki Kosaka; 貫幸小坂; Masahide Kondo; 雅英近藤
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2010-12-24
Filing date: 2010-12-24
Publication date: 2012-07-19

Abstract

【課題】結核菌由来１６ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子を高感度かつ特異的に検出すること。
【解決手段】結核菌由来１６ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、相補的な配列を有する第二のプライマーからなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて核酸増幅を行い、増幅された核酸をオリゴヌクレオチドプローブにて検出する。

Description

本発明は、迅速、高感度かつ特異的に結核菌の１６ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ及びそれを利用した検出方法に関するものである。

結核は結核菌によって発症する感染性疾患である。感染性疾患の診断には感染起因菌の迅速で確実な同定が必要であることから、結核菌同定検査は臨床上極めて重要である。

従来、結核菌の同定検査は培養法により行われていたが、核酸増幅法を利用した迅速同定検査法が開発され、短時間で結核菌を同定することが可能となった。利用されている核酸増幅法の一例として、ＰＣＲ法（特許文献１、２、及び３参照）が挙げられる。しかしＰＣＲ法は、急激に反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。

一定温度で核酸を増幅する方法も知られている。そのような方法として、ＬＡＭＰ法（非特許文献１参照）、ＮＡＳＢＡ法（特許文献４及び５参照）、ＴＭＡ法（特許文献６参照）等が報告されている。これらの核酸増幅方法では、核酸増幅後、電気泳動又は検出可能な標識を結合させたオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーション法などにより、増幅された核酸を検出するが、これらの検出法は操作が煩雑であり、再現性良く定量できないという課題がある。

簡便にＲＮＡを増幅及び検出する方法としては、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素及び必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、ＲＮＡポリメラーゼによって標的となるＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡを引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型とする連鎖反応を行う方法がある（特許文献７及び非特許文献２参照）。この方法では、インターカレーター性蛍光色素で標識され、標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素が相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブの存在下、蛍光特性の変化を検出するものであり、簡便、一定温度、かつ一段階でＲＮＡ増幅及び検出を同時に実施することが可能である。

以上の各方法は、いずれもオリゴヌクレオチドプローブを使用して核酸を増幅するものであるが、結核菌１６ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子においては、結核菌に特異的な領域にダイマーやループ等の高次構造を形成しやすい箇所が含まれているため（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＸ８４２５７６の塩基番号８９００８から８９０１７で示される領域）、結核菌１６ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子を高感度かつ特異的に検出するプローブを設計することは極めて困難である。中でも比較的低温の一定温度（４０から５０℃が好ましい）条件下で標的とするＲＮＡの増幅検出を行うことが可能な増幅方法を利用する場合、プローブが高次構造を形成しやすくなるため、プローブを設計することは特に困難である。

米国特許第４，６８３，１９５号米国特許第４，６８３，２０２号米国特許第４，９６５，１８８号特許２６５０１５９号公報特許３１５２９２７号公報特許３２４１７１７号公報特開２０００−１４４００号公報

ＴｈａｉＨ．Ｔ．Ｃ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２，１９５６−６１（２００４）ＩｓｈｉｇｕｒｏＴ．ｅｔａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１４，７７−８６（２００３）

そこで本発明の目的は、臨床上重要な結核菌を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプローブと、該オリゴヌクレオチドプローブを利用する結核菌の検出方法を提供することにある。

本発明者らは、上記目的に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、試料中に存在する結核菌由来１６ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子の特定塩基配列を検出する方法であって、配列番号２、７、又は９に示した配列又はそれらの相補的配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを用いることを特徴とする。また本発明は、結核菌由来１６ＳｒＲＮＡの検出試薬であって、配列番号１３に示した配列からなる第一のプライマー、配列番号２１、２２又は２３のいずれかに示した配列からなる第二のプライマー、及び、配列番号２、７又は９のいずれかに示した配列又はその相補的配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを含むことを特徴とする。以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、喀痰、胃液、血液、尿、便、体腔液、組織、気管支洗浄液、気管支肺胞洗浄液等の生体由来サンプルから抽出された核酸を試料として、又はかかるサンプルをそのまま試料として、試料中に結核菌由来１６ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子の特定塩基配列が存在するか否か、更には存在量を検出するものである。なお、前記サンプルをそのまま試料とする場合及びサンプルから核酸を抽出後試料とする場合のいずれの場合においても、結核菌由来１６ＳｒＲＮＡを増幅し、その過程で又はその後に検出する場合には、後述する増幅のための酵素の活性を妨害する物質等を除去等しておくことが好ましい。

本発明は、結核菌由来１６ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子の特定塩基配列の存在等を検出するものであるが、特定塩基配列は結核菌由来１６ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子に特異的に見出される塩基配列であり、かつ、特にｒＲＮＡにおいては、高次構造を取りにくい領域に存在する塩基配列である。前述のように、１６ＳｒＲＮＡ上で結核菌に特異的であり、かつ、高次構造を取りにくい領域は極めて限られる。なお、ｒＲＮＡを増幅して検出する場合には、第一のプライマーとの相同領域の５’末端から第二のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列に相同な塩基配列ということもできる。言い換えれば、ＲＮＡの増幅工程を実施する場合には、特定塩基配列又はその相補的配列のＲＮＡ転写産物が増幅される（産生される）ことになり、該ＲＮＡ転写産物を転写するための鋳型となる２本鎖ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列下流のセンス鎖又はアンチセンス鎖に特定塩基配列を有することになる。

本発明は、配列番号２、７又は９に示した配列又はその相補的配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ、更には、ストリンジェントな条件でこれらにハイブリダイゼーション可能な配列のオリゴヌクレオチドプローブである。ストリンジェントな条件とは、既知の条件から選定可能で、特に限定されるものではないが、例えば、４２℃における５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム等が共存する条件下でハイブリダイズ可能であることを意味する。

本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いる検出は、例えば電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法により行うことができる。その他にも、オリゴヌクレオチドを例えば検出可能な標識物質と結合等し、ハイブリダイゼーション法により検出を行うことも可能である。標識物質としては例えば酵素、蛍光色素、放射性同位元素、発光色素等、公知のものを使用することができる。本発明では、以上と比較してより簡便な検出操作を可能とするｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎ（米国特許５９２５５１７号、米国特許６１０３４７６号）、ＴａｑＭａｎプローブ（米国特許５２１００１５号、米国特許５４８７９７２号）、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ（特許３４３７８１６号）、サイクリングプローブ（米国特許５０１１７６９号、米国特許５４０３７１１号）、インターカレーター性蛍光色素標識プローブ（特許文献７及び非特許文献２参照）が特に好ましいオリゴヌクレオチドプローブとして例示できる。中でもインターカレーター性蛍光色素で標識され、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブは、後述する増幅工程の過程で検出を行うことができるため、後述するオリゴヌクレオチドＤＮＡ、プライマー、酵素及び酵素基質等を含む試薬類とともに容器に投入するだけで増幅工程と検出工程を実施することが可能である。この結果、上記の試薬等を予め容器に投入しておき、一定量の試料を分注するという操作のみで本発明を迅速に実施可能であり、しかも、例えば蛍光色素が発する信号を外部から検出可能なように容器の一部を透明な材料で構成しておけば、試料を分注した後に容器を密閉し、試料間のコンタミネーションを防止することもできる。

インターカレーター性蛍光色素としては特に限定されず、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド又はこれらの誘導体を使用することが例示できる。例えばオキサゾールイエローは、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４９０ｎｍ）が顕著に増加する色素である。このような色素は、オリゴヌクレオチドプローブの末端、リン酸ジエステル部又は塩基部分に適当なリンカーを介してオリゴヌクレオチドと結合すれば良い。なお、増幅工程の過程で検出を行う場合、オリゴヌクレオチドは、その３’末端の水酸基からの伸長を防止する目的で当該水酸基を修飾しておくことが好ましい。

通常、試料中に結核菌由来の１６ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子の特定塩基配列が存在下としても、その存在量は微量である。従って本発明は、前記したようなオリゴヌクレオチドプローブを使用して１６ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子を検出する工程（以下「検出工程」ということがある）に加え、１６ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子の特定塩基配列を増幅する工程（以下「増幅工程」ということがある）を実施することを含むものである。増幅工程に採用し得る核酸増幅方法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法又はＴＭＡ法を例示できるが、本発明のオリゴヌクレオチドプローブが高次構造を取りにくい領域に存在する特定塩基配列に向けられたものであることから、一定温度（比較的低温）で簡便かつ迅速に実施可能なＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法が好ましい。

特に好適な増幅工程は、特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、及び特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーを用い（ここで前記第一又は第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されてなる）を使用し、以下（１）から（５）の各ステップを行うものである。
（１）ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とする、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定塩基配列、あるいは特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、及び、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程。

以上のような増幅工程は、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素、１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素及びＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により進行する。これらの酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用しても良く、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用しても良い。例えば、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅＨ活性及び１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性の三つの活性を有する逆転写酵素と二本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ合成酵素を組み合わせて使用することが例示できる。もっとも、この三つの活性を有する逆転写酵素とＲＮＡ合成酵素に、必要に応じてＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を更に添加する等しても良い。三つの活性を有する逆転写酵素として、例えばＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素又はこれらの誘導体、中でもＡＭＶ逆転写酵素又はその誘導体が特に好ましい。ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学的実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ又はこれらの誘導体が例示できる。

上記の増幅工程を進行させるためには、試料と前記各酵素に加えて、更に、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸及びリボヌクレオシド−三リン酸を添加し、必要に応じて反応効率を調節するためにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び糖等を添加し、適当な条件下で酵素反応を進行させる。例えばＡＭＶ逆転写酵素及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合、３５から６５℃の範囲、好ましくは４０℃から５０℃の範囲で反応温度を設定すれば良い。

上記した増幅工程において、第一のプライマーにプロモーター配列が付加されている場合、ＲＮＡ転写産物は鋳型となるＲＮＡと相同の配列を含み、第二のプライマーにプロモーター配列が付加されている場合、ＲＮＡ転写産物は鋳型となるＲＮＡの相補的配列を含むことになる。プロモーター配列としては、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始し得る配列であれば良く、種々のＲＮＡポリメラーゼに特異的な公知のプロモーター配列を使用することができる。例えば、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーター等の分子生物学的実験で通常用いられるプロモーター配列が特に制限なく使用できる。なおプロモーター配列に加えて、更に、エンハンサー等の転写効率に関わる付加配列を含んでいてもよい。

上記した増幅工程によって配列番号２、７又は９のいずれかに示した配列又はその相補的配列からなるオリゴヌクレオチドプローブによる検出対象となる特定塩基配列を増幅するための第一及び第二のプライマーの組み合わせとして、配列番号１７に示した配列中の連続する２３塩基以上からなる第一のプライマーと配列番号１９に示した配列中の連続する１８塩基以上からなる第二のプライマーの組み合わせを例示することができるが、好ましくは配列番号１６に示した配列中の連続する２３塩基以上からなる配列であって配列番号１３に示した配列を含む第一のプライマーと配列番号２１に示した配列中の連続する１８塩基以上からなる配列であって配列番号２０に示した配列を含む第二のプライマーの組み合わせであり、更に好ましくは配列番号１３に示した配列からなる第一のプライマーと配列番号２１、２２又は２３に示したいずれかの配列からなる第二のプライマーの組み合わせである。

前記した増幅工程を実施する場合、第一又は第二のプライマーのいずれか一方にプロモーター配列を付加しておけば良いが、第一のプライマーにプロモーター配列を付加する場合には、結核菌由来１６ＳｒＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成するステップ（前記したステップ（１））に先立ち、又は当該ステップと同時に、該ＲＮＡを特定塩基配列の５’末端部位で切断しておくことが好ましい。このように特定塩基配列の５’末端部位で切断しておくことで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、ｃＤＮＡの３’末端を伸長させることで効率的に合成でき、結果として効率的に機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成することができるからである。切断方法としては、当該部位を特異的に切断できれば特に限定されないが、結核菌由来１６ＳｒＲＮＡ内の特定塩基配列の５’末端部位（該特定塩基配列内の５’末端部位を含む部分配列）に重複し、かつ５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドＤＮＡ（以下、「切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡ」とする）を添加してＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成させ、当該２本鎖中のＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素などにより切断する方法が、切断特異性及び簡便性から好ましい。また切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡの３’末端にある水酸基は、伸長反応を防止するために、例えばアミノ化等、適当な修飾を行っておくことが好ましい。

切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡとして、配列番号２９に示した配列中の連続する２４塩基以上からなるものが例示でき、更に好ましくは配列番号３０に示した配列からなるものが例示できる。

増幅工程を更に実施する場合、検出工程は、増幅の過程で又は増幅の後、前記したように配列番号２、７又は９のいずれかに示した配列又はその相補的配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを用い、ＲＮＡ転写産物を検出すれば良い。また増幅の過程で検出工程を実施する、即ちＲＮＡの増幅とＲＮＡ転写産物の検出を同時に実施するためには、オリゴヌクレオチドプローブとして、前記したインターカレーター性蛍光色素標識プローブを使用することが特に好ましい。

増幅工程を実施する本発明の結核菌由来の１６ＳｒＲＮＡの検出は、好ましくは切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡとして配列番号２９に示した配列中の連続する２４塩基以上からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーとして配列番号１７に示した配列中の連続する２３塩基以上からなるオリゴヌクレオチド、第二のプライマーとして配列番号１９に示した配列中の連続する１９塩基以上からなるオリゴヌクレオチド、そして、インターカレーター性蛍光色素で標識した配列番号２、７又は９のいずれかに示した配列からなるオリゴヌクレオチドを使用して実施される。更に好ましくは、切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡとして配列番号２９に示した配列中の連続する２４塩基以上からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーとして配列番号１６に示した配列中の連続する２３塩基以上からなる配列であって配列番号１３に示した配列を含むオリゴヌクレオチド、第二のプライマーとして配列番号２１に示した配列中の連続する１８塩基以上からなる配列であって配列番号２０に示した配列を含むオリゴヌクレオチド、インターカレーター性蛍光色素で標識した配列番号２、７又は９のいずれかに示した配列からなるオリゴヌクレオチドを使用して実施される。特に好ましくは、切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡとして配列番号３０に示した配列からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーとして、配列番号１３に示した配列からなるオリゴヌクレオチドであって、その５’末端にプロモーター配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号１４のオリゴヌクレオチド）、第二のプライマーとして配列番号２１、２２又は２３のいずれかに示した配列からなるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブとして、インターカレーター性蛍光色素で標識した配列番号２、７又は９のいずれかに示した配列からなるオリゴヌクレオチドを使用して実施される。

本発明のオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより、結核菌由来１６ＳｒＲＮＡ中に見出される、結核菌に特異的な配列（特定塩基配列）を検出することが可能である。しかもこのオリゴヌクレオチドプローブは、４０℃から５０℃という、比較的低温条件でもダイマーやループ等の高次構造を形成しにくいため、温度変化を必要としないＲＮＡを特異的に増幅する増幅方法を用いて増幅工程を実施し、その過程で特定塩基配列を検出する際に特に有効である。

本発明のオリゴヌクレオチドプローブとして、特に好ましくはインターカレーター性蛍光色素で標識したオリゴヌクレオチドの存在下で増幅工程を行い、その過程で蛍光強度を経時的に検出すれば、有意な蛍光増加が認められた任意の時間で検出を終了することが可能であり、増幅に要する時間を加えても、なお結核菌由来１６ＳｒＲＮＡを３０分程度で終了することが可能である。

このように、本発明によれば、試料中に含まれる結核菌由来１６ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子を迅速、高感度かつ特異的に検出することが可能となる。

以下実施例により本発明の実施の形態を説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

実施例１インターカレーター性蛍光色素で標識したオリゴヌクレオチドの調製
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを非特許文献２に記載の方法を参照して作製した。

配列番号１に記載の配列の５’末端から１０番目のＣ、配列番号２に記載の配列の５’末端から７番目のＡ、配列番号３に記載の配列の５’末端から６番目のＣ、配列番号４に記載の配列の５’末端から１２番目のＣ、配列番号６に記載の配列の５’末端から１４番目のＴ、配列番号８に記載の配列の５’末端から７番目のＧ、配列番号９に記載の配列の５’末端から６番目のＡ、配列番号１０に記載の配列の５’末端から１１番目のＡ、配列番号１１に記載の配列の５’末端から１４番目のＴ、配列番号１２に記載の配列の５’末端から９番目のＣの位置に、市販の試薬（Ｌａｂｅｌ−ＯＮＲｅａｇｅｎｔｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いてアミノ基を導入し、さらに３’末端をビオチンで修飾した。導入したアミノ基にインターカレーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローを結合し、オキサゾールイエローで標識したオリゴヌクレオチド（配列番号１から４、６、８から１２）を調製した。

また、同文献を参照して、配列番号５に記載の配列の５’末端から１３番目のＣと１４番目のＡ、配列番号７に記載の配列の５’末端から４番目のＣと５番目のＡとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介してオキサゾールイエローを結合させたオキサゾールイエローで標識したオリゴヌクレオチドを調製した。

実施例２結核菌由来１６ＳｒＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの評価
表１に示した組み合わせのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（以下、「ＩＮＡＦプローブ」と記載する）、第一のプライマー、第二のプライマー及び切断用オリゴヌクレオチドを用いて、（１）から（５）に示す方法でＲＮＡの検出を行い、検出性能と特異性について評価を行った。

（１）結核菌１６ＳｒＲＮＡ、Ｍ．ａｖｉｕｍ１６ＳｒＲＮＡ及びＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ１６ＳｒＲＮＡについては、それぞれ１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をクローニングし、インビトロ転写した後、精製により作製した（以下、「標準ＲＮＡ」と記載する）。Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍＲＮＡについては、ＯＤ６００＝０．１の培養液を市販の抽出試薬（ＥＸＴＲＡＧＥＮＭＢ、東ソー株式会社製）で抽出することにより作製した。

（２）ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μＬリボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭＤＴＴ）を用いて、結核菌１６ＳｒＲＮＡは１０^３コピー／５μＬ、Ｍ．ａｖｉｕｍ１６ＳｒＲＮＡは１０^８コピー／５μＬ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ１６ＳｒＲＮＡは１０^８コピー／５μＬとなるように希釈し、これらを試料として用いた。一方、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍは、抽出物の原液をＲＮＡ試料として用いた。

（３）以下の組成の反応液２０μＬを市販の０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＩｎｄｉｖｉｄｕａｌＤｏｍｅＣａｐＰＣＲＴｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。また、ＲＮＡ試料の代わりに注射用水５μＬを添加した場合をネガティブコントロール（以下「Ｎｅｇａ」と記載する）とした。

反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ塩化マグネシウム
１００ｍＭ塩化カリウム
１ｍＭＤＴＴ
各０．２５ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭＩＴＰ
０．１６μＭ切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡ
（３’末端の水酸基をアミノ基で修飾）
１μＭ第一のプライマー
（各配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７プロモータ配列（配列番号１５）を付加したもの）
１μＭ第二のプライマー
１０ｎＭＩＮＡＦプローブ
（実施例１で調製したもの）
１０．４％ＤＭＳＯ
（４）上記の反応液を４３℃で５分間保温後、予め４３℃で２分間保温した酵素液（組成は以下に記載）５μＬを添加した。

酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
２．０％ソルビトール
６．４ＵＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
１４２ＵＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン製）
３．６μｇ牛血清アルブミン
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接検出可能な温調機能付き蛍光分光光度計に供し、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間検出した。

表１に、結核菌に対する検出性能評価及び非結核性抗酸菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）に対する特異性評価の結果を示す。検出性能評価については結核菌のＲＮＡ試料及びＮｅｇａを検出し、酵素添加時を０分として反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度値で割った比）が１．３以上の場合を陽性とし、そのときの時間を検出時間とした。蛍光強度比１．３未満の場合は陰性とし、「（−）」と表記した。また、結核菌の標準ＲＮＡにおける３０分後の蛍光強度比の値も示した。

特異性評価については、非結核性抗酸菌のＲＮＡ試料を検出した際の３０分後の蛍光強度比が、Ｎｅｇａを検出した際の３０分後の蛍光強度比＋０．２以上の場合を陽性、＋０．２未満の場合を陰性とし、非結核性抗酸菌のいずれかに対して陽性となった場合を「＋」、いずれの菌に対しても陰性となった場合を「（−）」と表記した。

表１の結果より、２、６又は８の組み合わせが結核菌に対する検出性能が良く、Ｎｅｇａで陰性を示し、さらに非結核性抗酸菌の高濃度ＲＮＡに対して交差反応性を示さない組み合わせであることが分かる。組み合わせ２のオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号２に示した配列からなるオリゴヌクレオチド）は、組み合わせ１のオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１に示した配列からなるオリゴヌクレオチド）の３‘末端側を３塩基削ったものであり、組み合わせ６のオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号７に示した配列からなるオリゴヌクレオチド）と組み合わせ５のオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号６に示した配列からなるオリゴヌクレオチド）は１７塩基が同じ配列であり、組み合わせ８のオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号９に示した配列からなるオリゴヌクレオチド）は組み合わせ７のオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号８に示した配列からなるオリゴヌクレオチド）の５‘末端側を２塩基削ったものである。このように、似通った配列のオリゴヌクレオチドプローブであっても検出性能と特異性が大きく変化すること、即ち結核菌由来１６ＳｒＲＮＡを特異的かつ高感度に検出するためには、極めて厳密な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブが必須であることが分かる。

実施例３結核菌由来１６ＳｒＲＮＡ検出用プライマーセット及び切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡの検討
表２に示した組み合わせのＩＮＡＦプローブ、第一のプライマー、第二のプライマー及び切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡを用いて、実施例２と同様にして標準ＲＮＡの検出（５コピー／５μＬ、１０コピー／５μＬ、３０コピー／５μＬ、１００コピー／μＬ、５及び１０コピーはｎ＝４、３０及び１００コピーはｎ＝３）を行い、検出率を調査した。結果を表２に示す。

表２から、組み合わせ１２（配列番号３０に示した配列からなる切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡ、配列番号１３に示した配列からなる第一のプライマー）、組み合わせ１３（配列番号３１に示した配列からなる切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡ、配列番号１６に示した配列からなる第一のプライマー）、組み合わせ１４（配列番号３２に示した配列からなる切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡ、配列番号１７に示した配列からなる第一のプライマー）では、３０コピー／テスト以上で検出率１００％となり、これらの切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡと第一のプライマーの組み合わせによれば結核菌由来１６ＳｒＲＮＡを良好に検出できることが分かる。また、組み合わせ１２と組み合わせ１３では１０コピー／テストを検出でき、特に組み合わせ１２によれば高感度の検出が可能であることが分かる。

実施例４
実施例３における組み合わせ１２の切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡと第一のプライマーを用いて、これらと最適な組み合わせとなる第二のプライマーを探索するために、表３に示したオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い、実施例２と同様にして結核菌に対する検出性能（１０^２コピー／５μＬ）及びＭ．ａｖｉｕｍに対する特異性（１０^３コピー／５μＬ）を調査した。結果を表３に示す。

表３から、組み合わせ１２、１６、１７、１８又は１９（配列番号２１から２５のいずれかに示した配列からなる第二プライマー）では検出時間に差がなく、第二のプライマーとして良好であることが分かる。また、組み合わせ１２、１６又は１７が、特異性の面で特に良好であることが分かる。

Claims

試料中に存在する結核菌由来１６ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子の特定塩基配列を検出する方法であって、配列番号２、７又は９に示した配列又はそれらの相補的配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを用いることを特徴とする、結核菌由来１６ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子を検出する方法。
請求項１に記載の結核菌由来１６ＳｒＲＮＡの検出方法であって、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、及び特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ここで前記第一又は第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されてなる）を使用し、以下（１）から（５）の工程によりＲＮＡを増幅し、増幅の過程で又は増幅の後、配列番号２、７又は９のいずれかに示した配列又はその相補的配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを用いて前記ＲＮＡ転写産物を検出することを特徴とする方法。
（１）ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とする、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定塩基配列、あるいは特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、及び、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程。
配列番号１７に示した配列中の連続する２３塩基以上からなる第一のプライマーと、配列番号１９に示した配列中の連続する１８塩基以上からなる第二のプライマーを用いて結核菌由来１６ＳｒＲＮＡの特定塩基配列を増幅する工程を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の結核菌由来１６ＳｒＲＮＡの検出方法。
配列番号１６に示した配列中の連続する２３塩基以上からなる配列であって配列番号１３に示した配列を含む第一のプライマーと、配列番号２１に示した配列中の連続する１８塩基以上からなる配列であって配列番号２０に示した配列を含む第二のプライマーを用いて結核菌由来１６ＳｒＲＮＡの特定塩基配列を増幅する工程を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の結核菌由来１６ＳｒＲＮＡの検出方法。
配列番号１３に示した配列からなる第一のプライマーと、配列番号２１、２２又は２３に示したいずれかの配列からなる第二のプライマーを用いて結核菌由来１６ＳｒＲＮＡの特定塩基配列を増幅する工程を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の結核菌由来１６ＳｒＲＮＡの検出方法。
前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複して該部位から５’方向に隣接する領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡとＲＮａｓｅＨにより前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程を、５’末端にプロモーター配列を付加した前記第一のプライマーと前記第二のプライマーを用いて結核菌由来１６ＳｒＲＮＡの特定塩基配列を増幅する工程に先立ち又は同時に行う、請求項３から５のいずれかに記載の方法であって、該切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡが、配列番号２９に示した配列中の連続する２４塩基以上からなることを特徴とする、結核菌由来１６ＳｒＲＮＡの検出方法。
前記切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡが、配列番号３０に示した配列からなることを特徴とする、請求項６に記載の結核菌由来１６ＳｒＲＮＡの検出方法。
結核菌由来１６ＳｒＲＮＡの検出試薬であって、配列番号１３に示した配列からなる第一のプライマー、配列番号２１、２２又は２３のいずれかに示した配列からなる第二のプライマー、及び、配列番号２、７又は９のいずれかに示した配列又はその相補的配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを含むことを特徴とする、前記試薬。