JPWO2006011667A1

JPWO2006011667A1 - ヘテロ核リボヌクレオチドタンパク質Ｂ１（ｈｎＲＮＰＢ１）ｍＲＮＡの測定方法

Info

Publication number: JPWO2006011667A1
Application number: JP2006527896A
Authority: JP
Inventors: 寿一斎藤; 林　俊典; 俊典林
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2004-07-30
Filing date: 2005-07-28
Publication date: 2008-05-01
Also published as: KR20070041593A; CN1993481A; EP1783232A1; KR100872001B1; WO2006011667A1; EP1783232A4; US20080108059A1

Abstract

試料中に存在するヘテロ核リボヌクレオチドタンパク質Ｂ１（ｈｎＲＮＰＢ１）ｍＲＮＡの測定方法であって、該ＲＮＡの特定塩基配列の５’末端から下流の少なくとも一部に相同な第一のプライマー、および前記特定塩基配列の３’末端から上流の少なくとも一部に相補的な第二のプライマー（前記第一および第二のプライマーの少なくとも一方は５’末端にプロモーター配列を有する）により、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡ転写産物を生成する工程、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＤＮＡ合成の鋳型となって前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程、以上の各工程が同時に進行する条件で前記工程が繰り返される核酸増幅工程、および前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程を含む方法。

Description

本発明は、簡便、一定温度、一段階で、迅速にｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡを測定する方法に関する。本発明は、医学、特に臨床診断の分野に属し、癌の早期診断、治療のモニタリング、予後判定、治療方針決定の指標に有用である。

ヘテロ（異種）核リボタンパク質（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓｎｕｃｌｅａｒｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ：以後ｈｎＲＮＰ）Ａ２／Ｂ１はｈｎＲＮＰの主要な構成要素である。該ｈｎＲＮＰはヘテロ核ＲＮＡ（主な構成要素はメッセンジャーＲＮＡ前駆体）と複合体を形成して核内に存在し、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のプロセシングや核外輸送、安定性に関与する。ｈｎＲＮＰＡ２およびｈｎＲＮＰＢ１はスプライシング・バリアントで、ｈｎＲＮＰＡ２はｈｎＲＮＰＢ１の構造遺伝子の５’末の３６塩基が欠失した配列を有する（Ｂｕｒｄ，Ｃ．Ｇ．，ｅｔａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９７８８−９７９２およびＭａｅｄａ，Ａ．，ｅｔａｌ．，（１９９４）ＥＭＢＯＪ．，１３，５７８３−５７９５参照）。
近年、膵癌および肺癌組織においてｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１が過剰に発現していることが見出され、癌の診断マーカーとして注目されている（特表２０００−５００３２２号公報およびＺｈｏｕ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１０７６０−１０７６６、Ｆｉｅｌｄｉｎｇ，Ｐ．，ｅｔａｌ．，（１９９９）Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５，４０４８−４０５２、Ｚｈｏｕ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，（２００１）ＬｕｎｇＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，３４，３４１−３５０参照）。ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１の高感度な発現測定方法としては、ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、増幅産物量を測定する方法が報告されている（特表２０００−５００３２２号公報およびＺｈｏｕら（２００１）前掲参照）。最近の研究では、ｈｎＲＮＰＢ１が、ヒト癌細胞において初期ステージから過剰発現していることが示された。また、ＲＴ−ＰＣＲを用いたｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡ測定によって、正常組織に比べて癌組織において、ｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡ量がｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１の場合よりも特異的に上昇し、ｈｎＲＮＰＢ１の発現量を測定することが肺癌の早期診断に有用であることが報告されている。（Ｓｕｅｏｋａ，Ｅ．，ｅｔａｌ．，（１９９９）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５９，１４０４−１４０７、Ｓｕｅｏｋａ，Ｅ．，ｅｔａｌ．，（２００１）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，６１，１８９６−１９０２、Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，（２００１）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４５，１７９−１８８参照）。
以上の知見からｈｎＲＮＰＢ１はｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１より有用な癌マーカーになりえると推測できる。ｈｎＲＮＰＢ１の発現量を高感度に測定する手段としてｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅し、増幅産物量を測定する方法があげられるが、この場合、一般的には逆転写（ＲＴ）工程およびＰＣＲ工程の二段階の工程が必要で、このことは操作を煩雑にして再現性を悪化させる要因となるだけでなく、２次汚染の危険性をも増加させることになる。また、前記ＲＴ工程およびＰＣＲ工程を合わせると通例２時間以上の時間を要し、多数検体処理や検査コストの低減には不向きであった。また更に、ＲＴ−ＰＣＲではＤＮＡも増幅してしまうため、ｍＲＮＡのみを増幅する場合は核酸抽出工程においてＤＮａｓｅ処理などにより染色体ＤＮＡを完全に除去する必要があり、核酸抽出操作の煩雑化をまねいた。さらに、ＰＣＲは急激に反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。
一方、一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法としては、ＮＡＳＢＡ法（特許第２６５０１５９号および特許第３１５２９２７号参照）、およびＴＭＡ法（特許第３２４１７１７号参照）などが報告されている。該ＲＮＡ増幅方法は、標的ＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素および必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、ＲＮＡポリメラーゼによって標的ＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものである。そして、ＲＮＡ増幅後、電気泳動または検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼイション法などにより増幅されたＲＮＡを検出する。
以上のように前記ＲＮＡ増幅方法は一定温度、一段階でＲＮＡのみを増幅することから簡便なｍＲＮＡ測定に適しているが、ハイブリダイゼイション法などによる検出は煩雑な操作を必要とし、再現性良く定量できないという課題がある。
簡便にｍＲＮＡを増幅および測定する方法としては，Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（特開２０００−１４４００号公報およびＩｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，（２００３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，７７−８６参照）の方法があげられる。該方法は、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、前記ＲＮＡ増幅方法を実施し、蛍光特性の変化を測定するもので、簡便、一定温度、一段階かつ密閉容器内でＲＮＡ増幅および測定を同時に実施することが可能である。

前記ｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡの測定は、肺癌およびその他の扁平上皮癌を早期に診断するために有用であるが、ＲＴ−ＰＣＲを用いた場合は、二段階工程が必要で、操作が煩雑、急激な反応温度の昇降が必要などの課題があり、これらは二次汚染の危険性および再現性不良をまねくとともに簡便測定や自動化への展開の障壁となっていた。本発明は、前記課題を克服し、簡便、迅速、一定温度かつ一段階で前記ｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡを測定する方法を提供する。
本発明者は上記課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、前記ＲＮＡ増幅方法を適用し、簡便、迅速、一定温度かつ一段階のｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡ測定方法を構築した。すなわち、少なくとも一方の５’末端にプロモーター配列を有する第一のプライマーおよび第二のプライマーにより、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＤＮＡ合成の鋳型となって前記２本鎖ＤＮＡを生成するＲＮＡ増幅工程において増幅されたＲＮＡ産物量を測定することによって、ｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡを簡便、一定温度かつ一段階に測定することが可能となった。

図１は実施例２で作製したインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの構造を示す。Ｂ^１、Ｂ^２、Ｂ^３、Ｂ^４は塩基を示す。Ａ）Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，（１９９６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２４，４９９２−４９９７参照）の方法に従いリン酸ジエステル部分にリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素（オキサゾールイエロー）を結合させたプローブ。なお、３’末端−ＯＨからの伸長反応を防止するために３’末端−ＯＨはグリコール酸修飾がなされている。Ｂ）市販のＬａｂｅｌ−ＯＮＲｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてアミノ基を導入し、Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（１９９６）前掲参照）の方法に従ってオキサゾールイエローを結合させたプローブ。この場合、導入位置（図中Ｂ^３部分）のヌクレオシド部分が欠失してアミノ基が導入される。なお、３’末端−ＯＨからの伸長反応を防止するために３’末端−ＯＨはビオチン修飾がなされている。
図２は実施例３の測定の結果得られた蛍光プロファイルを示す。本発明のＲＮＡ増幅を行うと同時に経時的に蛍光強度（励起光：４７０ｎｍ、蛍光：５２０ｎｍ）を測定した結果を示す。横軸は反応時間、縦軸は蛍光強度比（反応液の蛍光強度／バックグラウンド蛍光）を示す。図中のコピー数は１テストに使用したｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡ（塩基番号１５７〜１２４９を含む）の初期コピー数（２６０ｎｍの吸光度より算出）を示す。
図３は実施例４の測定の結果得られた蛍光プロファイルを示す。本発明のＲＮＡ増幅を行うと同時に経時的に蛍光強度（励起光：４７０ｎｍ、蛍光：５２０ｎｍ）を測定した結果を示す。横軸は反応時間、縦軸は蛍光強度比（反応液の蛍光強度／バックグラウンド蛍光）を示す。図中凡例の数字は１テストに使用したｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡ（塩基番号１５７〜１２４９を含む）の初期コピー数（２６０ｎｍの吸光度より算出）を示す。
図４は図３の結果から得られた検量線を示す。図３の結果において、蛍光強度比が１．２に達する時間を検出時間とし、標準ＲＮＡの初期コピー数の対数値に対する検出時間をプロットした。本検量線と本方法によって得られた未知試料の検出時間より未知試料の初期コピー数を算出する。

以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、試料中に存在するヘテロ核リボヌクレオチドタンパク質Ｂ１（ｈｎＲＮＰＢ１）ｍＲＮＡの測定方法であって、該ＲＮＡの特定塩基配列の５’末端から下流の少なくとも一部に相同な第一のプライマー、および前記特定塩基配列の３’末端から上流の少なくとも一部に相補的な第二のプライマー（前記第一および第二のプライマーの少なくとも一方は５’末端にプロモーター配列を有する）により、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡ転写産物を生成する工程、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＤＮＡ合成の鋳型となって前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程、以上の各工程が同時に進行する条件で前記工程が繰り返される核酸増幅工程、および前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程を含む。
本発明中の試料とは、血液、血清、血漿、組織、癌細胞の存在が疑われる洗浄液等の検体より既知の方法によって抽出された核酸である。
本発明中の特定塩基配列とはｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列あるいは該配列の相補配列からなり、第一のプライマーおよび第二のプライマーによって規定される領域の配列を有する。本発明では、前記特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物が増幅される。第一のプライマーにプロモーター配列が付加される場合、ｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡはｃＤＮＡ合成の鋳型となる前に特定核酸配列の５’末端で切断されていることが好ましい。このような切断方法は特に限定するものではないが、ｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡの特定塩基配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（切断用オリゴヌクレオチド）を添加することによって形成されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素等により切断する方法が好ましく、該切断用オリゴヌクレオチドの３’末端−ＯＨは伸長反応を防止するために適当な修飾を施されたもの、例えばアミノ化等されているものを使用することが好ましい。
本発明中の標的核酸とは、前記特定塩基配列において、第一および第二のプライマーに相同もしくは相補的でない領域を示し、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブとの相補的結合が可能である配列を有する。よって、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは、本発明中の特定塩基配列の一部と相補的な配列となる。そのため、たとえば本発明の一態様として、特定塩基配列がｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡと相同な配列である場合は、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは配列番号３に示された配列の少なくとも連続した１５塩基を含む配列を有し、特定塩基配列がｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡと相補な配列である場合は、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは配列番号３に示された配列の相補配列の少なくとも連続した１５塩基を含む配列を有するという態様があげられる。
本発明中の第一および第二のプライマーは、少なくとも一方の５’末端にプロモーター配列を有しており、第一のプライマーはｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡの相補配列に対して、第二のプライマーはｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡに対して、それぞれ十分に相補的なオリゴヌクレオチドである。十分に相補的とは、本発明の核酸増幅工程の反応条件（反応温度および塩などの組成）において前記特定塩基配列あるいは該配列の相補配列に対して相補的結合が可能であることをさす。かかる反応条件は、例えば６０ｍＭのＴｒｉｓ、１７ｍＭの塩化マグネシウム、１００ｍＭの塩化カリウム、１ｍＭのＤＴＴの存在下、４３℃でのハイブリダイゼイション条件であってよい。
なお、前記第一のプライマーはｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡの相補配列に対して、前記第二のプライマーはｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡに対して、および前記インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは標的核酸に対して、それぞれ十分に相補的であるために、前記第一のプライマーは配列番号１に示す配列の好ましくは少なくとも連続する１５塩基、より好ましくは少なくとも２０塩基を含むこと、前記第二のプライマーは配列番号２に示す配列の好ましくは少なくとも連続する１５塩基、より好ましくは少なくとも２０塩基を含むこと、前記インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは配列番号３に示す配列あるいは該配列の相補配列の好ましくは少なくとも連続した１５塩基、より好ましくは少なくとも２０塩基を含むことがそれぞれ好ましい。
あるいは、前記の第一のプライマー、第二のプライマーおよびインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブはそれぞれ、配列番号１、２および３に示す配列の相補鎖に対し高ストリンジェント条件下で、例えば本発明の核酸増幅工程の上記反応条件下でハイブリダイゼイションする塩基配列を有してるものであってもよい。
前記第一のプライマーはｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡに含まれる配列のうち、ｈｎＲＮＰＡ２ｍＲＮＡでは欠失した配列を基に設計しているため、ｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡのみを特異的に測定することが可能である。
本発明中のプロモーター配列とはＲＮＡポリメラーゼが結合し転写を開始する配列であり、ＲＮＡポリメラーゼの種類に対応する特異配列が既知である。このようなＲＮＡポリメラーゼは特に限定されるものではないが、汎用されているＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ファージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼなどが好適であり、これらに対応するプロモーター配列が使用可能である。
本発明中のｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡの測定方法において、各酵素（１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素、１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素）が必要となる。各酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよいし、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。また、たとえば、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅＨ活性、および１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を合わせ持つ逆転写酵素に、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素だけでなく、必要に応じてＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素をさらに添加して補足すること等も可能である。前記逆転写酵素には、汎用性からいってＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、およびこれらの誘導体が特に好ましい。
前記第一のプライマーおよび第二のプライマー、およびｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡの存在下で逆転写反応を実施すると、第二のプライマーがｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡ内の特定塩基配列に結合し、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を持つ酵素によりｃＤＮＡ合成が行われる。得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドはＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素によってＲＮＡ部分が分解され、解離することによって第一のプライマーが前記ｃＤＮＡに結合する。
引き続いて、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を持つ酵素により特定塩基配列由来で５’末端にプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡが生成される。該２本鎖ＤＮＡは、プロモーター配列下流に特定塩基配列を含み、ＲＮＡポリメラーゼ活性を持つ酵素により特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物を生産する。該ＲＮＡ転写産物は、前記第一および第二のプライマーによる前記２本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型となって、一連の反応が連鎖的に進行し、前記ＲＮＡ転写産物が増幅されていく。
このような連鎖反応を進行させるために、前記各酵素に必須な既知の要素として、少なくとも、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸を含むことはいうまでもない。また、反応効率を調節するための添加剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、糖などを添加することも可能である。
たとえば、ＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合は３５℃〜６５℃の範囲で反応温度を設定することが好ましく、４０℃〜４４℃の範囲で設定することが特に好ましい。前記ＲＮＡ増幅工程は一定温度で進行し、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが活性を示す任意の温度に反応温度を設定することが可能である。
増幅されたＲＮＡ転写産物量は、既知の核酸測定法により測定することが可能である。このような測定法としては、電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、検出可能な標識で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼイション法などが利用できる。しかし、これらは操作は多工程であり、また増幅産物を系外に取り出して分析するため二次汚染の原因となる増幅産物の環境への飛散の危険性が大きい。これらの課題を克服するためには標的核酸と相補結合することによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブを用いることが好ましい。さらに好適な方法として、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、前記核酸増幅工程を実施し、蛍光特性の変化を測定する方法があげられる（特開２０００−１４４００号公報およびＩｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，（２００３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，７７−８６参照）。
前記インターカレーター性蛍光色素としては特に限定されないが汎用されているオキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、およびこれらの誘導体などが利用できる。前記蛍光特性の変化としては蛍光強度の変化があげられる。たとえばオキサゾールイエローの場合、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４９０ｎｍ）が顕著に増加することが既知である。前記インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは、前記ＲＮＡ転写産物に対して十分に相補的なオリゴヌクレオチドで、末端あるいはリン酸ジエステル部あるいは塩基部分に適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素が結合され、さらに、３’末端−ＯＨからの伸長を防止する目的で該３’末端−ＯＨが適当な修飾をなされている構造を有する（特開平８−２１１０５０号公報参照）。
オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の標識は、既知の方法でオリゴヌクレオチドに官能基を導入し、インターカレーター性蛍光色素を結合させることが可能である（特開２００１−１３１４７号公報およびＩｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，（１９９６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２４，４９９２−４９９７参照）。また、前記官能基の導入方法としては、汎用されているＬａｂｅｌ−ＯＮＲｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を用いることも可能である。
本発明の一態様として、試料に、少なくとも、５’末端にＴ７プロモーター配列を有する第一のプライマー（配列番号１に示す配列の少なくとも連続する１５塩基を含む）、第二のプライマー（配列番号２に示す少なくとも連続した１５塩基を含む）、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（配列番号３に示す配列の少なくとも連続する１５塩基を含む）、切断用オリゴヌクレオチド（配列番号１８〜２１より選ばれた配列の少なくとも１５塩基を含み、特定塩基配列の５’末端と重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有する）、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む測定試薬を添加し、反応温度３５〜６５℃（好ましくは４０〜４４℃）の一定温度で反応させると同時に反応液の蛍光強度を経時的に測定する方法を提供する。この場合、蛍光強度は初期ＲＮＡ量に応じた増加曲線を示すことから、既知濃度の標準ＲＮＡを用いて検量線を作成することによって未知試料の初期ＲＮＡ量を定量することも可能である。さらに、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、通例１時間以内、最適な系では３０分以内に測定結果を得ることが可能である。
また、前記測定試薬に含まれる全ての試料を単一の容器に封入可能な点は特筆すべきである。即ち、一定量の試料をかかる単一容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡを増幅し検出することができる。この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいれば良く、試料を分注した後に密閉することが可能なものはコンタミネーションの防止のうえで特に好ましい。
前記態様のＲＮＡ増幅・測定方法は、一段階、一定温度で実施可能であるため、ＲＴ−ＰＣＲに比べて簡便で自動化に適した方法であるといえる。しかし、一方でＲＴ−ＰＣＲのような熱変性およびアニールを実施せず、３５〜６５℃という比較的低温の一定温度で反応させるため、プライマーダイマーなどの非特異増幅産物や測定対象であるＲＮＡの高次構造の影響を受けやすく、測定系を構築するにはＲＴ−ＰＣＲの場合に比べてきわめて綿密な設計が必要であり、前記ＲＮＡ増幅・測定方法を用いた迅速、簡便、一定温度かつ一段階のｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡ測定は未だに実現されていなかった。本発明によりｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡの高特異性、高感度、迅速、簡便、一定温度かつ一段階の測定が初めて可能となった。
本発明は、肺癌およびその他の扁平上皮癌の早期診断、化学療法等の治療効果モニタリング、微小転移診断、予後予測および治療方針決定のための指標として適用することが可能である。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
実施例１
ｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡは、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター下流にｈｎＲＮＰＢ１ｃＤＮＡ（塩基番号１５７〜１２４９を含む、塩基番号はＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿０３１２４３に従った）を有する２本鎖ＤＮＡを鋳型としてインビトロ転写を実施し、引き続いてＤＮａｓｅＩ処理により前記２本鎖ＤＮＡを完全消化した後ＲＮＡを精製して調製した。該ＲＮＡは２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
以下の実施例では該ＲＮＡを測定対象としているが、本発明の測定対象であるｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡの測定に十分適用可能である。
実施例２
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを作製した。配列番号１６および１７に記載の配列の５’末端から１３番目の塩基（配列番号１６においてはＡ、配列番号１７においてはＴ）の位置にＬａｂｅｌ−ＯＮＲｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてアミノ基を導入し、さらに３’末端をビオチンで修飾した。前記アミノ基にＩｓｈｉｇｕｒｏら（１９９６）前掲に記載の方法でオキサゾールイエローを結合させた（図１Ｂ）。また、Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（１９９６）前掲に記載の方法で、配列番号１６に記載の配列の５’末端から１２番目のＧと１３番目のＡの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させたオキサゾールイエロー標識核酸プローブを調製した（図１Ａ）。
実施例３
本願発明の方法を用いて、種々の初期コピー数のｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡの検出を行った。
（１）前記ｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡ（塩基番号１５７〜１２４９を含む）をＲＮＡ希釈液（１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μｌリボヌクレアーゼ・インヒビター、５ｍＭＤＴＴ）を用いて２５、５０、１００、１０００コピー／５μｌとなるようそれぞれ希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。陰性標準（０コピー）はＲＮＡ希釈液を用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μｌを０．５ｍｌ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐＴｈｉｎ−ＷａｌｌｅｄＲｅａｃｔｉｏｎＴｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μｌ中）の最終濃度
６０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ塩化マグネシウム
１００ｍＭ塩化カリウム
１ｍＭＤＴＴ
各０．２５ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
２．２５ｍＭＧＴＰ
３．６ｍＭＩＴＰ
１μＭ第一のプライマー（配列番号７）：第一のプライマーは、配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７ポリメラーゼ・プロモーター配列（配列番号２２）が付加されてなる
１μＭ第二のプライマー（配列番号１４）
２５ｎＭインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（配列番号１６）：該核酸プローブは実施例２においてＬａｂｅｌ−ＯＮＲｅａｇｅｎｔｓを用いて調製したもの
０．１６μＭ切断用オリゴヌクレオチド（配列番号２０）：該オリゴヌクレオチドの３’末端−ＯＨはアミノ基で修飾
６Ｕ／３０μｌリボヌクレアーゼ・インヒビター（タカラバイオ社製）
１３％ＤＭＳＯ。
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μｌを添加した。
酵素液の組成：反応時（３０μｌ中）の最終濃度
２％ソルビトール
８Ｕ／３０μｌＡＭＶ逆転写酵素（タカラバイオ社製）
１４２Ｕ／３０μｌＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ製）
３．６μｇ／３０μｌ牛血清アルブミン。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）の経時変化を図２に示した。
図２の結果において、ｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡの初期濃度に依存した蛍光プロファイルを示し、２５コピー／テストのｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡが２０分以内に検出できた。以上のことは、本発明の方法によればｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡを高感度かつ迅速に定量可能であることを示している。
実施例４
本願発明の方法において、種々の組合わせの第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ、切断用オリゴヌクレオチドを用いて、ｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡの測定を行った。
（１）前記ｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡ（塩基番号１５７〜１２４９を含む）をＲＮＡ希釈液（１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ、０２．５Ｕ／μｌリボヌクレアーゼ・インヒビター、５．０ｍＭＤＴＴ）を用いて１０^３あるいは１０^２コピー／５μｌとなるよう希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μｌを０．５ｍｌ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐＴｈｉｎ−ＷａｌｌｅｄＲｅａｃｔｉｏｎＴｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μｌ中）の最終濃度
６０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ塩化マグネシウム
１００ｍＭ塩化カリウム
１ｍＭＤＴＴ
各０．２５ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
２．２５ｍＭＧＴＰ
３．６ｍＭＩＴＰ
１μＭ第一のプライマー（配列番号は表１あるいは表２に記載）：第一のプライマーは、配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７ポリメラーゼ・プロモーター配列（配列番号２２）が付加されてなる
１μＭ第二のプライマー（配列番号は表１あるいは表２に記載）
２５ｎＭインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（配列番号は表１あるいは表２に記載）：該核酸プローブは実施例２においてＬａｂｅｌ−ＯＮＲｅａｇｅｎｔｓを用いて調製したもの
０．１６μＭ切断用オリゴヌクレオチド（配列番号は表１あるいは表２に記載）：該オリゴヌクレオチドの３’末端−ＯＨはアミノ基で修飾。
６Ｕ／３０μｌリボヌクレアーゼ・インヒビター（タカラバイオ社製）
１３％ＤＭＳＯ。
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μｌを添加した。
酵素液の組成：反応時（３０μｌ中）の最終濃度
２％ソルビトール
８Ｕ／３０μｌＡＭＶ逆転写酵素（タカラバイオ社製）
１４２Ｕ／３０μｌＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ製）
３．６μｇ／３０μｌ牛血清アルブミン。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表１および表２に示した。
表１および表２に記載の第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ、切断用オリゴヌクレオチドの組合わせを用いた場合、１０^２あるいは１０^３コピー／テストのｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡが３０分以内に検出された。すなわち、第一のプライマーとして配列番号４〜８より選ばれた配列、第二のプライマーとして配列番号９〜１５より選ばれた配列、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブとして配列番号１６あるいは１７の配列、切断用オリゴヌクレオチドとして配列番号１８〜２１より選ばれた配列、からなる組合わせを用いた場合ｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡが迅速に検出可能であった。ここで、配列番号４〜８のそれぞれは配列番号１の部分配列であり、配列番号９〜１５のそれぞれは配列番号２の部分配列であり、配列番号１６あるいは１７はそれぞれ配列番号３の部分配列である。以上から、本発明に記載の第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブを用いたＲＮＡ増幅・測定法により、ｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡが迅速に検出可能であることが示された。
各種組合わせのオリゴヌクレオチドを用いた場合の測定結果を表１に示した。

上表の組合わせのオリゴヌクレオチドを用い、１０^３コピー／テストのｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡをサンプルとしてＲＮＡ増幅・蛍光測定を実施した。蛍光強度比１．２を超えたものを（＋）と判定し、そのときの時間を検出時間とした。
各種組合わせのオリゴヌクレオチドを用いた場合の測定結果を表２に示した。

上表の組合わせのオリゴヌクレオチドを用い、１０^２コピー／テストのｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡをサンプルとしてＲＮＡ増幅・蛍光測定を実施した。蛍光強度比１．２を超えたものを（＋）と判定し、そのときの時間を検出時間とした。
実施例５
本願発明の方法を用いて、ｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡの定量を行った。
（１）前記ｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡ（塩基番号１５７〜１２４９を含む）をＲＮＡ希釈液（１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μｌリボヌクレアーゼ・インヒビター、５．０ｍＭＤＴＴ）を用いて１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６コピー／５μｌとなるよう希釈し、検量線用標準ＲＮＡとして用いた。陰性標準（ＮＥＧ）は希釈液を用いた。同様に、サンプルＬ（１０^３コピー／５μｌ）、Ｍ（１０^４コピー／５μｌ）、Ｈ（１０^５コピー／５μｌ）を調製した。
（２）以下の組成の反応液２０μｌを０．５ｍｌ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐＴｈｉｎ−ＷａｌｌｅｄＲｅａｃｔｉｏｎＴｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに前記標準ＲＮＡおよびサンプル５μｌをそれぞれ添加した。
反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μｌ中）の最終濃度
６０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ塩化マグネシウム
１００ｍＭ塩化カリウム
１ｍＭＤＴＴ
各０．２５ｍＭｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
各３ｍＭＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
２．２５ｍＭＧＴＰ
３．６ｍＭＩＴＰ
１μＭの第１のプライマー（配列番号７）：第１のプライマーは、配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７ポリメラーゼ・プロモーター配列（配列番号２２）が付加されてなる
１μＭ第２のプライマー（配列番号１４）
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（配列番号１６）：該核酸プローブは実施例２においてリン酸ジエステルにリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させたもの
０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチド（配列番号２０）：該オリゴヌクレオチドの３’末端−ＯＨはアミノ基で修飾
６Ｕ／３０μｌリボヌクレアーゼ・インヒビター（タカラバイオ社製）
１３％ＤＭＳＯ。
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μｌを添加した。
酵素液の組成：反応時（３０μｌ）の最終濃度
２％ソルビトール
８Ｕ／３０μｌＡＭＶ逆転写酵素（タカラバイオ社製）
１４２Ｕ／３０μｌＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ製）
３．６μｇ／３０μｌ牛血清アルブミン。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）の経時変化を図３に示した。図３の結果において、蛍光強度比が１．２に達する時間を検出時間とし、該検出時間と初期コピー数の対数値から作成した検量線を図４に示した。さらに、該検量線からサンプルＬ、Ｍ、Ｈのコピー数を定量した結果を表３に示した。
図４の結果では、１０^２コピー／テストが約１２分で検出されており、検出時間と初期コピー数の対数値との間に良好な直線性が得られた。また、表３の結果において、サンプルＬ、Ｍ、Ｈの定量結果はｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡの添加量に相当する値が得られた。以上より本発明の方法により、ｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡを迅速、高感度、かつ特異的に定量可能であることが示された。
ｈｎＲＮＰＢ１ＲＮＡの定量の結果を表３に示した。

サンプルＬ（１０^３コピー／５μｌ）、Ｍ（１０^４コピー／５μｌ）、Ｈ（１０^５コピー／５μｌ）の測定結果の蛍光プロファイルから得られた検出時間と図４の検量線よりコピー数を算出した結果。

本発明により、ｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡを一定温度かつ一段階で、簡便、迅速、高感度に測定することが可能となった。したがって、本発明は、肺癌、その他の扁平上皮癌の早期診断に適用可能であり、化学療法などの治療効果モニタリング、予後の予測、治療方針の決定の指標として有用である。本発明は、一段階かつ密閉容器内で実施することが可能であるため、２次汚染の原因となる増幅産物による環境の汚染の危険性を最小限にすることが可能である。また、一段階、簡便かつ迅速であることから、用手法の場合でも多数の検体処理が可能であり、再現性を悪化させる要因である操作数を最小限にすることができる。さらに、本発明のＲＮＡ増幅法はＲＮＡのみを増幅することから、ＲＴ−ＰＣＲのように２本鎖ＤＮＡを完全に除去する工程なしに、厳密にｍＲＮＡを増幅、測定することが可能である。すなわち、本発明の方法は高感度かつ迅速な発現解析に最適である。また、一定温度かつ一段階で実施できることから、ＰＣＲのようなサーマルサイクリング機構を設ける必要がなく、自動化が容易である。

Claims

試料中に存在するヘテロ核リボヌクレオチドタンパク質Ｂ１（ｈｎＲＮＰＢ１）ｍＲＮＡの測定方法であって、
（１）該ＲＮＡの特定塩基配列の５’末端から下流の少なくとも一部に相同な第一のプライマー、および前記特定塩基配列の３’末端から上流の少なくとも一部に相補的な第二のプライマーにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、ここで前記第一および第二のプライマーの少なくとも一方は５’末端にプロモーター配列を有する、
（２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（３）該ＲＮＡ転写産物が引き続きＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物が増幅する工程、および
（４）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
を含むことを特徴とするヘテロ核リボヌクレオチドタンパク質Ｂ１（ｈｎＲＮＰＢ１）ｍＲＮＡの測定方法。
前記ＲＮＡ転写産物量の測定が、インターカレーター性色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの蛍光特性の変化を測定することによってなされることを特徴とする請求項１に記載のｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡの測定方法。
前記第一のプライマーが配列番号１に示された配列の少なくとも連続した１５塩基を含むこと、および／または前記第二のプライマーが配列番号２で示された配列の少なくとも連続した１５塩基を含むことを特徴とする請求項１または請求項２に記載のｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡの測定方法。
前記第一のプライマーが配列番号１に示された配列の少なくとも連続した１５塩基、前記第二のプライマーが配列番号２で示された配列の少なくとも連続した１５塩基をそれぞれ含み、前記第一および第二のプライマーの少なくとも一方は５’末端にプロモーター配列を有し、第一のプライマーがプロモーター配列を有する場合は配列番号３に示された配列の少なくとも連続した１５塩基を含むインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ、第二のプライマーがプロモーター配列を有する場合は配列番号３に示された配列の相補配列の少なくとも連続した１５塩基を含むインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブを、それぞれ含むことを特徴とする請求項２に記載のｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡの測定方法。
第一のプライマーとしての配列番号１に示された配列の少なくとも連続した１５塩基を含むオリゴヌクレオチド：
第二のプライマーとしての配列番号２で示された配列の少なくとも連続した１５塩基を含むオリゴヌクレオチド；ここで前記第一および第二のプライマーの少なくとも一方は５’末端にプロモーター配列を有する、と
第一のプライマーがプロモーター配列を有する場合は配列番号３に示された配列の少なくとも連続した１５塩基を含むインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ、第二のプライマーがプロモーター配列を有する場合は配列番号３に示された配列の相補配列の少なくとも連続した１５塩基を含むインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ；
を構成要素とすることを特徴とするｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡの測定試薬。