JPH11137298A - 細菌毒素遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】検体中のベロ毒素産生性大腸菌（ＶＴＥＣ）の
産生するベロ毒素（ＶＴ１または２）遺伝子の検出と同
時にＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺伝子の型別を可能とす
るオリゴヌクレオチドを提供する。 【解決手段】配列番号１および２、または配列番号３お
よび４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸
配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸
配列を含有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオ
チドのうち、少なくとも２種をプライマーとして使用す
るＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺伝子の増幅用試薬、該増
幅方法、ならびに、これらの型別を行なう細菌毒素遺伝
子検出法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ベロ毒素産生性大
腸菌（Verotoxin-producing Escherichia coli、ＶＴＥ
Ｃと略称する）のベロ毒素（Verotoxin、ＶＴと略称す
る）とその変異型遺伝子を特異的に増幅することが可能
なオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを使用す
るＶＴ遺伝子の増幅用試薬、該増幅方法ならびに該遺伝
子の検出法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＶＴＥＣは腸管出血性大腸菌（Enterohe
morrhagic Escherichia coli、ＥＨＥＣと略称する）と
も呼ばれ、病原性因子としてＶＴを産生することを特徴
とする病原性大腸菌である。現在、該毒素に関して同一
の毒素が発見の経緯により、ＶＴまたは志賀様毒素（Sh
iga-like toxin、ＳＬＴと略称する）など複数の名称で
呼ばれており、そこで生じる混乱を避ける目的で毒素名
を志賀毒素（Shiga toxin、ＳＴＸと略称する）へ、こ
れに伴い該毒素産生菌のカテゴリー名をＶＴＥＣまたは
ＥＨＥＣから志賀毒素産生性大腸菌（Shiga toxin-prod
ucing Escherichia coli、ＳＴＥＣと略称する）へ統一
すべきという提案が示されている。しかし、これらの名
称の統一は未だ世界的な合意に達していないため、本発
明では毒素名としてＶＴを、また該毒素産生菌のカテゴ
リー名としてＶＴＥＣを使用する。したがって、本発明
における名称、ＶＴおよびＶＴＥＣには、これらと同一
の意味で使用され得るすべての名称が包含される。

【０００３】ＶＴＥＣによる感染症の主な症状は出血性
大腸炎に代表される食中毒症状であるが、場合により、
溶血性尿毒症症候群（Hemolytic Uremic Syndrome 、Ｈ
ＵＳと略称する）へと重症化することが知られている。
近年、我が国においても大規模なＶＴＥＣ集団感染が短
期間のうちに続発し、ＨＵＳ発症から死亡に至る事例が
多数報告されており、迅速なＶＴＥＣ検出方法が望まれ
ている。

【０００４】現在までに、我が国で分離同定されたＶＴ
ＥＣの大部分は血清型Ｏ１５７：Ｈ７であるが、Ｏ２
６：Ｈ１１など、他の血清型のＶＴＥＣによる集団感染
事例も報告されている。したがって、血清型によるＶＴ
ＥＣの同定を行う場合はＯ１５７：Ｈ７に限らず、過去
にＶＴＥＣと同定された様々な血清型に対する抗血清を
用いた試験を行う必要がある。

【０００５】さらに、Ｈ抗原の同定には数日を要するこ
とから、これらの方法は迅速性および簡便性の高いＶＴ
ＥＣ検出法とは言い難い。また、血清型と毒素産生性が
一致しない場合もあることから、ＶＴＥＣの同定には病
原性因子ＶＴを検出する方法がより有効であると考えら
れる。

【０００６】ＶＴには、志賀赤痢菌の産生する志賀毒素
と同一構造のベロ毒素１型（ＶＴ１）、および生物学的
性状はＶＴ１と類似しているが免疫学的性状が大きく異
なるベロ毒素２型（ＶＴ２）が存在し、それぞれについ
て一部抗原性およびアミノ酸配列の異なるバリアントが
知られている。また、これらをコードする遺伝子配列に
ついても解析が進められ、ＶＴ１では少なくとも７種
類、ＶＴ２では少なくとも２１種類の変異型（バリアン
トを含む）遺伝子が報告されている。そこで現在、あら
ゆる生物の糞便または食品または環境中に存在するＶＴ
ＥＣのＶＴ遺伝子を、ＰＣＲ（polymerase chain react
ion)法を用いて増幅する方法が注目されている。

【０００７】現在までに報告されているＶＴ遺伝子増幅
用オリゴヌクレオチド（特開平４−２９７４８８号公
報、特開平４−２９７４８９号公報、特開平７−８２８
０号公報）は、１回の増幅により、ＶＴ１およびＶＴ２
の両遺伝子の共通配列の増幅によるＶＴ遺伝子の（型別
を伴わない）検出、またはＶＴ１遺伝子の特異配列の増
幅によるＶＴ１遺伝子の検出、またはＶＴ２遺伝子の特
異配列の増幅によるＶＴ２遺伝子の検出のいずれかを行
うものである。したがって、これらのオリゴヌクレオチ
ドを用いて検体中のＶＴ遺伝子の検出と同時にＶＴ１遺
伝子またはＶＴ２遺伝子の型別を行う場合には、１検体
あたり少なくとも２サンプルの反応液による遺伝子の増
幅を行う必要がある。

【０００８】ＶＴＥＣの産生するＶＴの型別を、その検
出と同時に行うことは、感染菌および感染源を特定する
手段として非常に効果的である。さらに、ＶＴＥＣの検
出に迅速性および簡便性が要求されていることを考慮す
ると、ＶＴ遺伝子の検出と同時にその型別を行うために
最適化されたオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子の増幅
を行うことが、非常に効果的であると考えられる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＶＴ
ＥＣのＶＴとその変異型遺伝子を特異的に増幅するため
の新規なオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを
使用して、検体中のＶＴ遺伝子の検出と同時にＶＴ１遺
伝子またはＶＴ２遺伝子の型別を同時に行う方法を提供
することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＶＴＥＣ
のＶＴとその変異型遺伝子に関して、鋭意検討を重ねた
結果、ＶＴ１遺伝子とその変異型遺伝子にほぼ特異的な
核酸配列およびＶＴ２遺伝子とその変異型遺伝子にほぼ
特異的な核酸配列を見出し、それらを用いた遺伝子増幅
法を確立し、本発明を完成させるに至った。

【００１１】すなわち、本発明は配列番号１または２に
示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のう
ち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含
有することを特徴とするオリゴヌクレオチドである。

【００１２】また、本発明は配列番号３または４に示さ
れる核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、
少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有す
ることを特徴とするをオリゴヌクレオチドである。

【００１３】本発明は少なくとも２種のプライマーが、
配列番号１および２に示される核酸配列または該配列に
相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基
よりなる核酸配列を含有する、ベロ毒素産生性大腸菌の
産生するベロ毒素１型の遺伝子（ＶＴ１遺伝子）を増幅
するためのオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマ
ーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、
他方のプライマーの鋳型となるプライマー、熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことを
特徴とするＶＴ１遺伝子増幅用試薬である。

【００１４】また、本発明は少なくとも２種のプライマ
ーが、配列番号３および４に示される核酸配列または該
配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１
５塩基よりなる核酸配列を含有する、ベロ毒素産生性大
腸菌の産生するベロ毒素２型の遺伝子（ＶＴ２遺伝子）
を増幅するためのオリゴヌクレオチドであり、一方のプ
ライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場
合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含む
ことを特徴とするＶＴ２遺伝子増幅用試薬である。

【００１５】さらに、本発明は（ｉ）少なくとも２種の
プライマーが、配列番号１および２に示される核酸配列
または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連
続した１５塩基よりなる核酸配列を含有する、ＶＴ１遺
伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドであり、一方
のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離され
た場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、
および（ii）少なくとも２種のプライマーが、配列番号
３および４に示される核酸配列または該配列に相補的な
核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる
核酸配列を含有する、ＶＴ２遺伝子を増幅するためのオ
リゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸長生成
物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライ
マーの鋳型となるプライマー、（iii)熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼ、(iv)ｄＮＴＰおよび(v) 緩衝液を含むこと
を特徴とするＶＴ１遺伝子、ＶＴ２遺伝子またはそれら
の遺伝子増幅用試薬である。

【００１６】本発明は少なくとも２種のプライマーとし
て、配列番号１および２に示される核酸配列または該配
列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５
塩基よりなる核酸配列を含有する、ＶＴ１遺伝子を増幅
するためのオリゴヌクレオチドを使用し、一方のプライ
マーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合
に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とするＶ
Ｔ１遺伝子の増幅方法である。

【００１７】また、本発明は少なくとも２種のプライマ
ーとして、配列番号３および４に示される核酸配列また
は該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続し
た１５塩基よりなる核酸配列を含有する、ＶＴ２遺伝子
を増幅するためのオリゴヌクレオチドを使用し、一方の
プライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された
場合に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とす
るＶＴ２遺伝子の増幅方法である。

【００１８】さらに、本発明は少なくとも２種のプライ
マーとして、配列番号１および２に示される核酸配列ま
たは該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続
した１５塩基よりなる核酸配列を含有する、ＶＴ１遺伝
子を増幅するためのオリゴヌクレオチドを使用し、か
つ、少なくとも２種のプライマーとして、配列番号３お
よび４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸
配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸
配列を含有する、ＶＴ２遺伝子を増幅するためのオリゴ
ヌクレオチドを使用し、それぞれ、一方のプライマーの
伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方
のプライマーの鋳型となることを特徴とするＶＴ１遺伝
子、ＶＴ２遺伝子またはそれらの遺伝子の増幅方法であ
る。

【００１９】本発明は上記増幅方法で得られた増幅遺伝
子断片の鎖長より、該増幅遺伝子断片がＶＴ１遺伝子、
ＶＴ２遺伝子またはそれら両遺伝子のうちの何れに該当
するかを検出することを特徴とする細菌毒素遺伝子検出
法である。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明のオリゴヌクレオチドは、
配列番号１〜４に示される核酸配列（ただし、Ａはアデ
ニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
ていてもよい。）の少なくとも連続した１５塩基よりな
る核酸配列を含有する。

【００２１】本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマ
ーとして使用されるが、特に遺伝子増幅用のプライマー
として使用され得る。その際、少なくとも２種のオリゴ
ヌクレオチドが使用され、２種のプライマーは増幅しよ
うとする核酸配列の両端を規定し、一方のプライマーの
伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方
のプライマーの鋳型となるように、その塩基配列が選択
される。また、本発明のオリゴヌクレオチドはシークエ
ンス解析を行う場合のプライマーとしても使用され得
る。さらには、検出用プローブとしても使用可能であ
る。

【００２２】本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号
１〜４に示される配列またはそれらの相補配列の全域を
使用する必要はない。配列表の配列およびその相補配列
に由来する適度な長さの配列が、ＰＣＲ反応条件などに
合わせて、解離温度（Ｔｍ値）などを計算することによ
り決定され得る。しかし、プライマーに十分な特異性を
持たせるためには、少なくとも連続した１５塩基、さら
に望ましくは、少なくとも連続した２０塩基の長さが必
要である。

【００２３】プライマーが十分な特異性を有するために
は、３’末端の塩基は配列表の配列に示される３’末端
の塩基を用いることが望ましい。使用する条件、目的な
どに応じて、オリゴヌクレオチド中にある程度の置換を
行ってもよい。また、プライマーの特異性に影響を及ぼ
さない程度に、ＶＴ１とその変異型遺伝子またはＶＴ２
とその変異型遺伝子の配列に従って、プライマーの５’
末端側をさらに延長して使用してもよい。

【００２４】本発明では、オリゴヌクレオチド設計にあ
たり、オリゴヌクレオチドの３’末端に相補するターゲ
ット遺伝子中の塩基が突然変異を起こした変異体もまた
存在することを考慮して、変異する確率の少ない塩基を
オリゴヌクレオチドの３’末端の塩基として設定する。
ポリメラーゼのプライマーとなるオリゴヌクレオチドの
３’末端の塩基は、ポリメラーゼ反応の起点となる。こ
のため、ターゲット遺伝子の配列が変異した場合にはポ
リメラーゼ反応の効率が極端に低下することになる。

【００２５】配列番号１に示されるオリゴヌクレオチド
の３’末端の塩基（Ｇ）に相当するＶＴ１遺伝子の塩基
Ｇ（プラス鎖）は、すでに配列が決定されているＶＴ１
とその変異型遺伝子の間で保存されており、該塩基
（Ｇ）がＡまたはＣまたはＴに変異した場合、ＧＧＣに
よりコードされるグリシンはセリン（ＡＧＣ）またはア
ルギニン（ＣＧＣ）またはシステイン（ＴＧＣ）として
翻訳される。さらに、このＧＧＣによりコードされるグ
リシンも、すでに配列が決定されているＶＴ１とその変
異型毒素においてアミノ酸レベルで保存されている。

【００２６】また、配列番号２に示されるオリゴヌクレ
オチドの３’末端の塩基（Ｃ）に相補するＶＴ１遺伝子
の塩基Ｇ（プラス鎖）は、すでに配列が決定されている
ＶＴ１とその変異型遺伝子の間で保存されており、該塩
基（Ｇ）がＡまたはＣまたはＴに変異した場合、ＧＣＡ
によりコードされるアラニンはスレオニン（ＡＣＡ）ま
たはプロリン（ＣＣＡ）またはセリン（ＴＣＡ）として
翻訳される。さらに、このＧＣＡによりコードされるア
ラニンも、すでに配列が決定されているＶＴ１とその変
異型毒素においてアミノ酸レベルで保存されている。

【００２７】さらに、配列番号３に示されるオリゴヌク
レオチドの３’末端の塩基（Ａ）に相当するＶＴ２遺伝
子の塩基Ａ（プラス鎖）はすでに配列が決定されている
ＶＴ２とその変異型遺伝子の間で保存されており、該塩
基（Ａ）がＣまたはＧまたはＴに変異した場合、ＡＣＧ
によりコードされるスレオニンはプロリン（ＣＣＧ）ま
たはアラニン（ＧＣＧ）またはセリン（ＴＣＧ）として
翻訳される。このとき、該アミノ酸（スレオニン）のコ
ード配列（ＡＣＧ）がＡＣＡまたはＡＣＣであるＶＴ２
変異型遺伝子も存在するが、該塩基（Ａ）の変異により
翻訳され得るアミノ酸の種類に違いはみられない。さら
に、このＡＣＧによりコードされるスレオニンも、すで
に配列が決定されているＶＴ２とその変異型毒素におい
てアミノ酸レベルで保存されている。

【００２８】また、配列番号４に示されるオリゴヌクレ
オチドの３’末端の塩基（Ａ）に相補するＶＴ２遺伝子
の塩基Ｔ（プラス鎖）はすでに配列が決定されているＶ
Ｔ２とその変異型遺伝子の間で保存されており、該塩基
（Ｔ）がＡまたはＣまたはＧに変異した場合、ＴＣＴに
よりコードされるセリンはスレオニン（ＡＣＴ）または
プロリン（ＣＣＴ）またはアラニン（ＧＣＴ）として翻
訳される。さらにこのＴＣＴによりコードされるセリン
も、すでに配列が決定されているＶＴ２とその変異型毒
素においてアミノ酸レベルで保存されている。これらの
ことは、該アミノ酸が蛋白質の機能を維持する上で重要
な役割を担っており、突然変異によりこれらのアミノ酸
が他のアミノ酸に変異した場合、そのクローンは自然淘
汰により消滅する可能性が高いことを意味している。

【００２９】したがって、配列番号１および２に示され
るオリゴヌクレオチドを用いる増幅法により、存在し得
るほぼすべてのＶＴ１とその変異型遺伝子を特異的に増
幅し得る。また配列番号３および４に示されるオリゴヌ
クレオチドを用いる増幅法により、存在し得るほぼすべ
てのＶＴ２とその変異型遺伝子を特異的に増幅し得る。

【００３０】本発明では、オリゴヌクレオチド設計にあ
たり、ＶＴＥＣの保有するＶＴ遺伝子の種類が菌株によ
り異なる、すなわち、ＶＴＥＣにはＶＴ１とその変異型
遺伝子を保有する菌株またはＶＴ２とその変異型遺伝子
を保有する菌株またはそれら両遺伝子を保有する菌株が
存在することを考慮して、ＶＴ１とその変異型遺伝子増
幅用オリゴヌクレオチドおよびＶＴ２とその変異型遺伝
子増幅用オリゴヌクレオチドを混合して使用しても、Ｖ
Ｔ１とその変異型遺伝子およびＶＴ２とその変異型遺伝
子がそれぞれ独立して増幅し、さらに、それぞれの増幅
遺伝子断片を鎖長により容易に分離および分類し得るオ
リゴヌクレオチド配列を設定する。

【００３１】本発明の配列番号１に示されるオリゴヌク
レオチドは、ＶＴ１とその変異型遺伝子において、該オ
リゴヌクレオチドに相当する部分（プラス鎖）に対して
高い相同性を有するが、この部分を除いたＶＴ１とその
変異型遺伝子全長に対しては増幅可能な程度の相同性は
みられない。さらに、該オリゴヌクレオチドはＶＴ２と
その変異型遺伝子全長に対しても増幅可能な程度の相同
性はみられない。

【００３２】また、配列番号２に示されるオリゴヌクレ
オチドは、ＶＴ１とその変異型遺伝子において該オリゴ
ヌクレオチドに相補する部分（プラス鎖）に対して高い
相同性を有するが、この部分を除いたＶＴ１とその変異
型遺伝子全長に対しては増幅可能な程度の相同性はみら
れない。さらに、該オリゴヌクレオチドはＶＴ２とその
変異型遺伝子全長に対しても増幅可能な程度の相同性は
みられない。これらのことは、配列番号１および２に示
されるオリゴヌクレオチドを用いる増幅により、ＶＴ１
とその変異型遺伝子およびＶＴ２とその変異型遺伝子が
同時に存在する場合においても、ＶＴ１とその変異型遺
伝子に由来する唯一の増幅ＤＮＡ断片（６５８ｂｐ）を
生じ得ることを意味している。

【００３３】配列番号３に示されるオリゴヌクレオチド
は、ＶＴ２とその変異型遺伝子において、該オリゴヌク
レオチドに相当する部分（プラス鎖）に対して高い相同
性を有するが、この部分を除いたＶＴ２とその変異型遺
伝子全長に対しては増幅可能な程度の相同性はみられな
い。さらに、該オリゴヌクレオチドはＶＴ１とその変異
型遺伝子全長に対しても増幅可能な程度の相同性はみら
れない。

【００３４】また、配列番号４に示されるオリゴヌクレ
オチドは、ＶＴ２とその変異型遺伝子において該オリゴ
ヌクレオチドに相補する部分（プラス鎖）に対して高い
相同性を有するが、この部分を除いたＶＴ２とその変異
型遺伝子全長に対しては増幅可能な程度の相同性はみら
れない。さらに、該オリゴヌクレオチドはＶＴ１とその
変異型遺伝子全長に対しても増幅可能な程度の相同性は
みられない。これらのことは、配列番号３および４に示
されるオリゴヌクレオチドを用いる増幅により、ＶＴ１
とその変異型遺伝子およびＶＴ２とその変異型遺伝子が
同時に存在する場合においても、ＶＴ２とその変異型遺
伝子に由来する唯一の増幅ＤＮＡ断片（４２９ｂｐ）を
生じ得ることを意味している。

【００３５】したがって、配列番号１〜４に示されるオ
リゴヌクレオチドを併用する増幅法により、得られる増
幅ＤＮＡ断片長からＶＴＥＣの保有するＶＴ遺伝子の種
類、すなわち、ＶＴＥＣがＶＴ１とその変異型遺伝子を
保有する場合（６５８ｂｐ）またはＶＴ２とその変異型
遺伝子を保有する場合（４２９ｂｐ）または、それら両
遺伝子を保有する場合（６５８ｂｐおよび４２９ｂｐ）
を判断し得る。

【００３６】本発明のＶＴ１とその変異型遺伝子を増幅
する方法は、配列番号１および２に示されるオリゴヌク
レオチドを用いることを特徴とする。本発明のＶＴ２と
その変異型遺伝子を増幅する方法は、配列番号３および
４に示されるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴と
する。本発明のＶＴ１とその変異型遺伝子またはＶＴ２
とその変異型遺伝子またはそれら両遺伝子を増幅する方
法は、配列番号１〜４に示されるオリゴヌクレオチドを
混合して用いることを特徴とする。しかし、これらの増
幅方法においては、少なくとも２種のオリゴヌレオチド
を増幅用プライマーとして使用し、一方のプライマーの
伸長生成物は、その相補体から分離された場合、他方の
プライマーの鋳型となるように配列を選択する必要があ
る。

【００３７】さらには、この方法で得られた増幅遺伝子
断片の鎖長より、該遺伝子断片がＶＴ１遺伝子またはＶ
Ｔ２遺伝子またはそれら両遺伝子のうちの何れに該当す
るかを判断することが可能である。

【００３８】本発明において、増幅する遺伝子はあらゆ
る生物の糞便または食品または環境中に存在するＶＴＥ
Ｃ由来の遺伝子であるが、単離培養された菌体の遺伝子
を増幅することも含まれる。また、本発明における試料
には、上記の各種材料や培養菌体の他、これらより単離
および精製された核酸なども含まれる。

【００３９】すなわち、本発明における試料としては、
上記の各種材料を直接用いる場合の他に、上記の各種材
料の培養液、またはそこから祖抽出または精製された核
酸などが用いられ得る。さらに、上記の各種材料から単
離された寒天培地上の菌体またはその培養液、またはそ
こから祖抽出または精製された核酸なども試料として用
いられ得る。

【００４０】遺伝子増幅に用いるプライマーとしては、
上述のすべてのオリゴヌクレオチドが挙げられる。この
遺伝子増幅には、一般的にＰＣＲ（polymerase chain r
eaction)法が用いられる。上述したように、各種試料か
らのＶＴ１とその変異型遺伝子の増幅には、配列番号１
および２にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドの組み
合わせが好適に用いられ得る。しかし、配列番号１およ
び２にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドよりも外側
のプライマーにより増幅されたＤＮＡを、さらに配列番
号１および２にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドを
用いて再増幅することによって、より高感度の増幅が可
能となることが予想される。このとき使用する外側のプ
ライマーは、ＶＴ１とその変異型遺伝子に特異的である
ことが望ましいが、特異性の低いプライマーも使用し得
る。

【００４１】また、各種試料からのＶＴ２とその変異型
遺伝子の増幅には、配列番号３および４にそれぞれ示さ
れるオリゴヌクレオチドの組み合わせが好適に用いられ
得る。しかし、配列番号３および４にそれぞれ示される
オリゴヌクレオチドよりも外側のプライマーにより増幅
されたＤＮＡを、さらに配列番号３および４にそれぞれ
示されるオリゴヌクレオチドを用いて再増幅することに
よって、より高感度の増幅が可能となる。このとき使用
する外側のプライマーは、ＶＴ２とその変異型遺伝子に
特異的であることが望ましいが、特異性の低いプライマ
ーも使用し得る。

【００４２】ＶＴ１とその変異型遺伝子の増幅におい
て、配列番号１および２にそれぞれ示されるオリゴヌク
レオチドの組み合わせを用いることが必要である。ま
た、ＶＴ２とその変異型遺伝子の増幅において、配列番
号３および４にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドの
組み合わせを用いることが必要である。これらのこと
は、増幅反応における特異性には、使用する２つのオリ
ゴヌクレオチドの相乗効果が重要であることによる。ま
た、さらに特異性を高めるためには、増幅に使用するプ
ライマーの濃度をできるだけ低く抑えることも重要であ
る。

【００４３】ＶＴ１とその変異型遺伝子およびＶＴ２と
その変異型遺伝子を同時に増幅する場合、すなわち、検
出対象のＶＴＥＣが２種類の型のＶＴ遺伝子を保有する
場合において、配列番号１〜４にそれぞれ示されるオリ
ゴヌクレオチドの組み合わせを用いることが必要であ
る。このことは、異なる遺伝子の同時増幅反応における
独立性には、互いの増幅反応に干渉しないオリゴヌクレ
オチドの使用が必要であることによる。また、該オリゴ
ヌクレオチドの組み合わせは、ＶＴ１とその変異型遺伝
子またはＶＴ２とその変異型遺伝子の一方のみを増幅す
る場合、すなわち検出対象のＶＴＥＣが２種類の型のＶ
Ｔ遺伝子の何れか一方のみを保有する場合においても好
適に用いられ得る。

【００４４】従来のＶＴ遺伝子を増幅する方法（特開平
４−２９７４８８号公報、特開平４−２９７４８９号公
報、特開平７−８２８０号公報）は、ＶＴ１およびＶＴ
２両遺伝子に共通した配列を有するオリゴヌクレオチド
をプライマーとしたＰＣＲ増幅によるＶＴ遺伝子の（型
別を伴わない）検出、またはＶＴ１遺伝子に特異的な配
列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣ
Ｒ増幅によるＶＴ１遺伝子の検出、またはＶＴ２遺伝子
に特異的な配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとしたＰＣＲ増幅によるＶＴ２遺伝子の検出のいずれ
かを１回のＰＣＲにより行うものである。したがって、
検体中のＶＴ遺伝子の検出と同時にＶＴ１遺伝子または
ＶＴ２遺伝子の型別を行う場合には、１検体あたり少な
くとも２サンプルの反応液によるＰＣＲを行う必要があ
った。

【００４５】しかし、本発明では、組み合わせを最適化
した複数のオリゴヌクレオチドを用いた１回のＰＣＲに
より、ＶＴ遺伝子の検出と同時に増幅遺伝子断片の鎖長
よりＶＴ１遺伝子とその変異型遺伝子またはＶＴ２遺伝
子とその変異型遺伝子の型別を行うことが可能となる。
すなわち本発明では、プライマーとして配列番号１〜４
にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドの組み合わせて
用いるＰＣＲにより、ＶＴＥＣのＶＴ遺伝子の検出と同
時にＶＴ１とその変異型遺伝子またはＶＴ２とその変異
型遺伝子の型別を行うことが可能となる。

【００４６】本発明のＶＴ１遺伝子増幅用試薬、ＶＴ２
遺伝子増幅用試薬ならびにＶＴ１遺伝子、ＶＴ２遺伝子
またはそれらの遺伝子増幅用試薬は、上記ＶＴ１遺伝子
を増幅するためのオリゴヌクレオチドまたはＶＴ２遺伝
子を増幅するためのオリゴヌクレオチドを少なくとも２
種のプライマーとして含み、さらに、熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含む。

【００４７】プライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼ、ｄＮＴＰは当該増幅工程を十分に行い得る量が含ま
れるが、例えばＤＮＡポリメラーゼは１〜２００Ｕ／ｍ
ｌ、ｄＮＴＰは５０〜５００μＭ、プライマーは１〜１
０００ｎＭ程度が含められる。さらに本発明の試薬に
は、ＶＴ１遺伝子、ＶＴ２遺伝子を単離するための工程
に適した緩衝液および当該遺伝子を増幅するに適した緩
衝液を併せて含めてもよい。さらに増幅した遺伝子を検
出するための試薬も、検出法に併せて各種組み合わせて
おくこともできる。

【００４８】

【実施例】以下に、本発明を実施例を用いて、具体的に
説明する。実施例１ （１）オリゴヌクレオチドの合成 ＶＴ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドは、ＡＢＩ社ＤＮ
Ａシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト
法にて、配列番号１〜４にそれぞれ示される配列を有す
るオリゴヌクレオチド（プライマー１：配列番号１のう
ち、１〜３３番目、プライマー２：配列番号２のうち、
１〜２１番目、プライマー３：配列番号３のうち、１〜
３１番目、プライマー４：配列番号４のうち、１〜２２
番目）を合成することにより得た。手法はＡＢＩ社のマ
ニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はア
ンモニア水で５５℃にて一夜実施した。精製はＨＰＬＣ
（ベックマン製）を用い、逆相クロマトカラム（ナカラ
イテスク製）にて実施した。

【００４９】（２）試料の調製 患者、家畜および食品などから分離されたＶＴＥＣ菌
株、合計３７株の菌体コロニーをそれぞれ直接、ＰＣＲ
の試料として使用した。いずれのＶＴＥＣ菌株も、従来
の各種毒素産生試験により産生するＶＴの型（ＶＴ１ま
たはＶＴ２またはそれら両方）がすでに同定されている
ものである。寒天培地上のＶＴＥＣコロニー（１白金
耳）を水１００μｌに懸濁し、そのうちの１μｌのコロ
ニーをＰＣＲに使用した。

【００５０】（３）ＰＣＲ 配列番号１および２に示されるオリゴヌクレオチド（プ
ライマー１および２）、または配列番号３および４に示
されるオリゴヌクレオチド（プライマー３および４）、
または配列番号１〜４に示されるオリゴヌクレオチド
（プライマー１、プライマー２、プライマー３、プライ
マー４）を、ＰＣＲのプライマーとして用いた。反応液
組成は、プライマー１および２、または３および４、ま
たは１〜４をそれぞれ０．２μＭ、ｄＡＴＰおよびｄＧ
ＴＰおよびｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ各０．２ｍＭ、熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ Ｄａｓｈ：東洋紡
製）２５単位／ｍｌ、および１倍濃度の増幅用緩衝液
（東洋紡製）である。実際の使用にあたっては、反応液
に試料溶液（ＶＴＥＣコロニー懸濁液）１μｌを添加
し、反応液量を１００μｌとして、以下の反応に供し
た。

【００５１】反応条件は以下の通りである： 熱変性： ９４℃、２０秒 アニーリング： ６５℃、２秒 伸長反応： ７４℃、３０秒 上記熱変性、アニーリングおよび伸長反応を３０回繰り
返した。これらの操作はパーキンエルマー社のＤＮＡサ
ーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ２４００）を用いて
行った。

【００５２】（４）検出 増幅反応後の反応液１０μｌを２％アガロースゲルにて
電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線
照射下での蛍光を検出した。電気泳動の条件は、定電圧
１００Ｖ、３０分間にて行った。操作方法ならびに他の
条件は、マニアティス（Maniatis）らのモレキュラー・
クローニング(Molecular Cloning)(1982年) に記載の技
法に従った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動
し、相対泳動度の比較により、検出されたＤＮＡ断片の
長さを算出した。

【００５３】（５）結果 前述のように、ＶＴＥＣのＶＴ１遺伝子およびＶＴ２遺
伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオ
リゴヌクレオチドをプライマー（プライマー１〜４）と
して用いたＰＣＲにより増幅されるＤＮＡ断片の長さ
は、容易に推定できる。それによると、試料中にＶＴ１
遺伝子が存在する場合には、プライマー１および２に示
されるオリゴヌクレオチドにより６５８ｂｐの長さのＤ
ＮＡ断片が増幅され、ＶＴ２遺伝子が存在する場合に
は、プライマー３および４に示されるオリゴヌクレオチ
ドにより４２９ｂｐの長さのＤＮＡ断片が増幅されるは
ずである。これらの推定値と増幅されたＤＮＡ断片の長
さが一致した場合、これらのオリゴヌクレオチド、すな
わち、プライマーは遺伝子中の標的としている領域を正
しく増幅しており、かつ、試料中の菌株は増幅ＤＮＡ断
片の長さに対応したＶＴ遺伝子を有していると判断し
た。

【００５４】由来の異なるＶＴＥＣ菌株３７株のコロニ
ーについて行ったＰＣＲ増幅実験の結果を表１に示す。

【００５５】

【表１】

【００５６】また、増幅遺伝子断片の検出に用いたアガ
ロースゲル電気泳動の一部を図１に示す。

【００５７】

【表２】

【００５８】表１および図１（レーン１〜４）から明ら
かなように、プライマー１および２は、従来の各種毒素
産生試験によりＶＴ１陽性と判断された菌株の遺伝子の
みを増幅して６５８ｂｐの長さのＤＮＡ断片を生じ、Ｖ
Ｔ１陰性と判断された菌株の遺伝子とは全く反応しなか
った。すなわち、該オリゴヌクレオチドがＶＴ１遺伝子
を特異的に増幅し、ＶＴ１遺伝子を保有するＶＴＥＣを
正確に検出できることを示している。

【００５９】また、表１および図１（レーン５〜８）か
ら明らかなように、プライマー３および４に示されるオ
リゴヌクレオチドは、従来の各種毒素産生試験によりＶ
Ｔ２陽性と判断された菌株の遺伝子のみを増幅して４２
９ｂｐの長さのＤＮＡ断片を生じ、ＶＴ２陰性と判断さ
れた菌株の遺伝子とは全く反応しなかった。すなわち、
該オリゴヌクレオチドがＶＴ２遺伝子を特異的に増幅
し、ＶＴ２遺伝子を保有するＶＴＥＣを正確に検出でき
ることを示している。

【００６０】さらに、表１および図１（レーン９〜１
２）から明らかなように、プライマー１〜４に示される
オリゴヌクレオチドを混合して用いた場合でも、該オリ
ゴヌクレオチドによる特異的な増幅に悪影響はみられ
ず、ＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺伝子またはそれらの遺
伝子を保有するＶＴＥＣを正確に検出することができ
た。すなわち、該オリゴヌクレオチドの組み合わせを用
いることにより、ＶＴＥＣの検出と同時に、増幅ＤＮＡ
断片の鎖長より、該菌が産生するＶＴの型をＶＴ１また
はＶＴ２またはそれら両方の何れかに分類できることを
示している。

【００６１】

【発明の効果】本発明により、多くの生物の糞便または
食品または環境中から簡便、迅速、かつ特異的にＶＴＥ
ＣのＶＴ遺伝子を増幅し得る。また、本発明により、Ｖ
ＴＥＣの保有するＶＴ遺伝子の検出と同時にその型別、
すなわち、ＶＴ１とその変異型遺伝子を保有する場合
（６５８ｂｐ）またはＶＴ２とその変異型遺伝子を保有
する場合（４２９ｂｐ）またはそれら両遺伝子を保有す
る場合（６５８ｂｐおよび４２９ｂｐ）の分類を、増幅
ＤＮＡ断片の鎖長より簡便かつ迅速に行うことができ
る。

【００６２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：1...33 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：ＶＴＥＣの産生するＶＴ１遺伝子の配列と相
補的な配列を有する。 配列 CAGGAGGTAC GTCTTTACTG ATGATTGATA GTG 33

【００６３】配列番号：2 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：1..21 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：ＶＴＥＣの産生するＶＴ１遺伝子の配列と相
補的な配列を有する。 配列 CATTCTGGCA ACTCGCGATG C 21

【００６４】配列番号：3 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：1..31 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：ＶＴＥＣの産生するＶＴ２遺伝子の配列と相
補的な配列を有する。 配列 CAGGCACTGT CTGAAACTGC TCCTGTGTAT A 31

【００６５】配列番号：4 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：1..22 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：ＶＴＥＣの産生するＶＴ２遺伝子の配列と相
補的な配列を有する。 配列 CCGCCGCCAT TGCATTAACA GA 22

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＶＴＥＣ菌株３７株の菌体コロニー中の遺伝
子を本発明のプライマーを用いて増幅した後、増幅遺伝
子をアガロースゲルにて電気泳動した結果を示す図面に
代わる電気泳動写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川上 文清 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１または２に示される核酸配列
   または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連
   続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴
   とするオリゴヌクレオチド。
2. 【請求項２】 配列番号３または４に示される核酸配列
   または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連
   続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴
   とするオリゴヌクレオチド。
3. 【請求項３】 少なくとも２種のプライマーが、配列番
   号１および２に示される核酸配列または該配列に相補的
   な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりな
   る核酸配列を含有する、ベロ毒素産生性大腸菌の産生す
   るベロ毒素１型の遺伝子（ＶＴ１遺伝子）を増幅するた
   めのオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸
   長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方の
   プライマーの鋳型となるプライマー、熱安定性ＤＮＡポ
   リメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴と
   するＶＴ１遺伝子増幅用試薬。
4. 【請求項４】 少なくとも２種のプライマーが、配列番
   号３および４に示される核酸配列または該配列に相補的
   な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりな
   る核酸配列を含有する、ベロ毒素産生性大腸菌の産生す
   るベロ毒素２型の遺伝子（ＶＴ２遺伝子）を増幅するた
   めのオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸
   長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方の
   プライマーの鋳型となるプライマー、熱安定性ＤＮＡポ
   リメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴と
   するＶＴ２遺伝子増幅用試薬。
5. 【請求項５】 （ｉ）少なくとも２種のプライマーが、
   配列番号１および２に示される核酸配列または該配列に
   相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基
   よりなる核酸配列を含有する、ＶＴ１遺伝子を増幅する
   ためのオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの
   伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方
   のプライマーの鋳型となるプライマー、および（ii）少
   なくとも２種のプライマーが、配列番号３および４に示
   される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のう
   ち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含
   有する、ＶＴ２遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオ
   チドであり、一方のプライマーの伸長生成物が、その相
   補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型と
   なるプライマー、（iii)熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、
   (iv)ｄＮＴＰおよび(v) 緩衝液を含むことを特徴とする
   ＶＴ１遺伝子、ＶＴ２遺伝子またはそれらの遺伝子増幅
   用試薬。
6. 【請求項６】 少なくとも２種のプライマーとして、配
   列番号１および２に示される核酸配列または該配列に相
   補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よ
   りなる核酸配列を含有する、ＶＴ１遺伝子を増幅するた
   めのオリゴヌクレオチドを使用し、一方のプライマーの
   伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方
   のプライマーの鋳型となることを特徴とするＶＴ１遺伝
   子の増幅方法。
7. 【請求項７】 少なくとも２種のプライマーとして、配
   列番号３および４に示される核酸配列または該配列に相
   補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よ
   りなる核酸配列を含有する、ＶＴ２遺伝子を増幅するた
   めのオリゴヌクレオチドを使用し、一方のプライマーの
   伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方
   のプライマーの鋳型となることを特徴とするＶＴ２遺伝
   子の増幅方法。
8. 【請求項８】 少なくとも２種のプライマーとして、配
   列番号１および２に示される核酸配列または該配列に相
   補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よ
   りなる核酸配列を含有する、ＶＴ１遺伝子を増幅するた
   めのオリゴヌクレオチドを使用し、かつ、少なくとも２
   種のプライマーとして、配列番号３および４に示される
   核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少な
   くとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有する、
   ＶＴ２遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドを使
   用し、それぞれ、一方のプライマーの伸長生成物が、そ
   の相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳
   型となることを特徴とするＶＴ１遺伝子、ＶＴ２遺伝子
   またはそれらの遺伝子の増幅方法。
9. 【請求項９】 請求項８記載の方法で得られた増幅遺伝
   子断片の鎖長より、該増幅遺伝子断片がＶＴ１遺伝子、
   ＶＴ２遺伝子またはそれらの遺伝子のうちの何れに該当
   するかを検出することを特徴とする細菌毒素遺伝子検出
   法。