JP2001340088A - 腸炎ビブリオ菌の毒素遺伝子の検出法 - Google Patents
腸炎ビブリオ菌の毒素遺伝子の検出法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒類似溶血毒遺伝
子（ｔｒｈ２）に由来するＲＮＡを特異的に増幅した
り、検出及び同定を高感度で行うために有用なオリゴヌ
クレオチドの組合わせを提供する。 【解決手段】試料中に存在する腸炎ビブリオ菌の耐熱性
溶血毒類似溶血毒遺伝子（ｔｒｈ２）に由来するＲＮＡ
のＲＮＡ増幅工程を利用した検出法において、第一のプ
ライマーとして配列番号１のオリゴヌクレオチド、第二
のプライマーとして配列番号２のオリゴヌクレオチドを
用いることを特徴とする、検出法。
子（ｔｒｈ２）に由来するＲＮＡを特異的に増幅した
り、検出及び同定を高感度で行うために有用なオリゴヌ
クレオチドの組合わせを提供する。 【解決手段】試料中に存在する腸炎ビブリオ菌の耐熱性
溶血毒類似溶血毒遺伝子（ｔｒｈ２）に由来するＲＮＡ
のＲＮＡ増幅工程を利用した検出法において、第一のプ
ライマーとして配列番号１のオリゴヌクレオチド、第二
のプライマーとして配列番号２のオリゴヌクレオチドを
用いることを特徴とする、検出法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査、公衆衛
生、食品検査または食中毒検査における腸炎ビブリオ菌
の検出法に関するものである。
生、食品検査または食中毒検査における腸炎ビブリオ菌
の検出法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒ
ａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）は、一般に感染性食中毒
の原因菌として知られている。胃腸炎患者から分離され
る腸炎ビブリオ菌の９５％以上が、我妻培地において溶
血活性を示す神奈川現象陽性菌であるのに対し、魚や水
から分離した菌の９９％は神奈川現象陰性菌である。こ
のことから、病原性腸炎ビブリオ菌と神奈川現象とは深
く関与しているとされてきた。
ａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）は、一般に感染性食中毒
の原因菌として知られている。胃腸炎患者から分離され
る腸炎ビブリオ菌の９５％以上が、我妻培地において溶
血活性を示す神奈川現象陽性菌であるのに対し、魚や水
から分離した菌の９９％は神奈川現象陰性菌である。こ
のことから、病原性腸炎ビブリオ菌と神奈川現象とは深
く関与しているとされてきた。
【０００３】その後、この神奈川現象は腸炎ビブリオ菌
の耐熱性溶血毒（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｄｉｒｅ
ｃｔ ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ：ｔｄｈ）が菌体外へ放出さ
れるために起こる現象であることが判明し、ｔｄｈが腸
炎ビブリオ菌の病原因子として注目されるようになって
きた。
の耐熱性溶血毒（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｄｉｒｅ
ｃｔ ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ：ｔｄｈ）が菌体外へ放出さ
れるために起こる現象であることが判明し、ｔｄｈが腸
炎ビブリオ菌の病原因子として注目されるようになって
きた。
【０００４】さらに近年では、神奈川現象陰性の菌株で
ありながら病原性を示す菌株から、ｔｄｈに類似した塩
基配列を有し、一部共通抗原性を有する溶血毒（耐熱性
溶血毒類似溶血毒（ＴＤＨ−ｒｅｌａｔｅｄ ｈｅｍｏ
ｌｙｓｉｎ：ｔｒｈ））も確認された。
ありながら病原性を示す菌株から、ｔｄｈに類似した塩
基配列を有し、一部共通抗原性を有する溶血毒（耐熱性
溶血毒類似溶血毒（ＴＤＨ−ｒｅｌａｔｅｄ ｈｅｍｏ
ｌｙｓｉｎ：ｔｒｈ））も確認された。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】これまで腸炎ビブリオ
菌の検出および同定を行うためには、増菌培養、分離培
養の後に神奈川現象を判定するといった非常に煩雑で長
時間を要するものだった。最近の腸炎ビブリオ菌の検出
および同定には、これらのｔｄｈ、ｔｒｈ遺伝子に特異
的な遺伝子プローブを用いるハイブリダイゼーション法
も試みられているが、食品検査等において十分な検出感
度を得ることは困難であった。
菌の検出および同定を行うためには、増菌培養、分離培
養の後に神奈川現象を判定するといった非常に煩雑で長
時間を要するものだった。最近の腸炎ビブリオ菌の検出
および同定には、これらのｔｄｈ、ｔｒｈ遺伝子に特異
的な遺伝子プローブを用いるハイブリダイゼーション法
も試みられているが、食品検査等において十分な検出感
度を得ることは困難であった。
【０００６】このように、腸炎ビブリオ菌の検出及び同
定には、複雑な操作と長時間を要し、また短時間で試料
中に存在する極微量の腸炎ビブリオ菌を検出することは
困難であったため、食品検査等に必要な迅速かつ高感度
な検出法の出現が望まれている。さらには、検査をより
簡便にするためには、自動化された検査装置の開発も望
まれている。
定には、複雑な操作と長時間を要し、また短時間で試料
中に存在する極微量の腸炎ビブリオ菌を検出することは
困難であったため、食品検査等に必要な迅速かつ高感度
な検出法の出現が望まれている。さらには、検査をより
簡便にするためには、自動化された検査装置の開発も望
まれている。
【０００７】検出を高感度で行うためには、検出および
同定しようとする遺伝子や該遺伝子に由来するＲＮＡ
（以下これらを標的核酸とする）中の特定の配列を増幅
した上で検出等することが好適である。
同定しようとする遺伝子や該遺伝子に由来するＲＮＡ
（以下これらを標的核酸とする）中の特定の配列を増幅
した上で検出等することが好適である。
【０００８】標的核酸がＤＮＡである場合の増幅法とし
ては、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法
が知られている。この方法は、標的ＤＮＡ中の特定の配
列の両末端部に相補的および相同な一組のプライマーと
熱耐性ＤＮＡポリメレース存在下で、熱変性、プライマ
ー・アニール、伸長反応からなるサイクルを繰り返し行
うことによって前記特定の配列を増幅する方法である。
しかし、ＰＣＲ法は急激な昇温・降温を繰り返すという
複雑操作が必要であり、そのことが自動化への障害とな
る。また前記特定の配列をＰＣＲ法で増幅するには前記
特定の配列との特異性が高いオリゴヌクレオチドが必要
であり、更にその検出及び同定を高感度で行うために
も、標的ＤＮＡとの特異性が高いオリゴヌクレオチドが
必要である。更にはそれらのオリゴヌクレオチドの最適
な組み合わせを検討する必要がある。
ては、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法
が知られている。この方法は、標的ＤＮＡ中の特定の配
列の両末端部に相補的および相同な一組のプライマーと
熱耐性ＤＮＡポリメレース存在下で、熱変性、プライマ
ー・アニール、伸長反応からなるサイクルを繰り返し行
うことによって前記特定の配列を増幅する方法である。
しかし、ＰＣＲ法は急激な昇温・降温を繰り返すという
複雑操作が必要であり、そのことが自動化への障害とな
る。また前記特定の配列をＰＣＲ法で増幅するには前記
特定の配列との特異性が高いオリゴヌクレオチドが必要
であり、更にその検出及び同定を高感度で行うために
も、標的ＤＮＡとの特異性が高いオリゴヌクレオチドが
必要である。更にはそれらのオリゴヌクレオチドの最適
な組み合わせを検討する必要がある。
【０００９】標的核酸がＲＮＡである場合の増幅法とし
ては、逆転写酵素およびＲＮＡポリメレースの協奏的作
用によって前記特定配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や３Ｓ
Ｒ法等が知られている。この方法は、標的ＲＮＡの特定
配列に対し、プロモーター配列を含むプライマーと逆転
写酵素、およびリボヌクレエースHにより、プロモータ
ー配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを
鋳型としてＲＮＡポリメレースにより、前記特定配列を
含むＲＮＡを合成するとともに、該ＲＮＡが引き続きプ
ロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連
鎖反応を行うものである。ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法は一
定温度での核酸増幅が可能であり、自動化へ適している
方法だと考えられる。しかし、これらの増幅法は比較的
低温（例えば４１℃）で反応を行うために、標的ＲＮＡ
が分子内構造を形成し、プライマーの結合を阻害し、反
応効率を低下させる可能性が考えられる。したがって、
増幅反応の前に標的ＲＮＡの熱変性を行うことで、標的
ＲＮＡの分子内構造を壊し、プライマーの結合効率を向
上させるための操作が必要であった。
ては、逆転写酵素およびＲＮＡポリメレースの協奏的作
用によって前記特定配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や３Ｓ
Ｒ法等が知られている。この方法は、標的ＲＮＡの特定
配列に対し、プロモーター配列を含むプライマーと逆転
写酵素、およびリボヌクレエースHにより、プロモータ
ー配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを
鋳型としてＲＮＡポリメレースにより、前記特定配列を
含むＲＮＡを合成するとともに、該ＲＮＡが引き続きプ
ロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連
鎖反応を行うものである。ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法は一
定温度での核酸増幅が可能であり、自動化へ適している
方法だと考えられる。しかし、これらの増幅法は比較的
低温（例えば４１℃）で反応を行うために、標的ＲＮＡ
が分子内構造を形成し、プライマーの結合を阻害し、反
応効率を低下させる可能性が考えられる。したがって、
増幅反応の前に標的ＲＮＡの熱変性を行うことで、標的
ＲＮＡの分子内構造を壊し、プライマーの結合効率を向
上させるための操作が必要であった。
【００１０】そこで本願発明は、腸炎ビブリオ菌の耐熱
性溶血毒類似溶血毒遺伝子（ｔｒｈ２）に由来するＲＮ
Ａを比較的低温（例えば４１℃）で特異的に増幅した
り、検出及び同定を高感度で行うために有用なオリゴヌ
クレオチドの好適な組合わせを提供することを目的とす
るものである。
性溶血毒類似溶血毒遺伝子（ｔｒｈ２）に由来するＲＮ
Ａを比較的低温（例えば４１℃）で特異的に増幅した
り、検出及び同定を高感度で行うために有用なオリゴヌ
クレオチドの好適な組合わせを提供することを目的とす
るものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
になされた本願請求項１の発明は、試料中に存在するｔ
ｒｈ２に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、該特
定配列に相補的な配列を有する第一のプライマーおよび
該特定配列に相同的な配列を有する第二のプライマー
（ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方の
プライマーは、５’側にＲＮＡポリメレースのプロモー
ター配列をふかした配列を有する）を用い、ＲＮＡ依存
性ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮＡを生成することに
よりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成し、リボヌクレエース
ＨによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本
鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ
依存性ＤＮＡポリメレースにより前記ＲＮＡ配列または
前記ＲＮＡ配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可
能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、
そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下でＲ
ＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前
記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによる１本鎖ＤＮＡ
生成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程を利用した検出
法において、第一のプライマーとして配列番号１のオリ
ゴヌクレオチド、第二のプライマーとして配列番号２の
オリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする。
になされた本願請求項１の発明は、試料中に存在するｔ
ｒｈ２に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、該特
定配列に相補的な配列を有する第一のプライマーおよび
該特定配列に相同的な配列を有する第二のプライマー
（ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方の
プライマーは、５’側にＲＮＡポリメレースのプロモー
ター配列をふかした配列を有する）を用い、ＲＮＡ依存
性ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮＡを生成することに
よりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成し、リボヌクレエース
ＨによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本
鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ
依存性ＤＮＡポリメレースにより前記ＲＮＡ配列または
前記ＲＮＡ配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可
能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、
そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下でＲ
ＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前
記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによる１本鎖ＤＮＡ
生成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程を利用した検出
法において、第一のプライマーとして配列番号１のオリ
ゴヌクレオチド、第二のプライマーとして配列番号２の
オリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする。
【００１２】本願請求項２の発明は、請求項１の発明に
係り、前記第一のプライマーが配列番号１の配列のうち
少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレ
オチドであることを特徴とする。本願請求項３の発明
は、請求項１の発明に係り、前記第二のプライマーが配
列番号２の配列のうち少なくとも連続した１０塩基以上
からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする。
そして本願請求項４の発明は、請求項１の発明に係り、
前記ＲＮＡ増幅工程を、インターカレーター性蛍光色素
で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ存在下で実施
することからなり、ここで該プローブの配列がＲＮＡ転
写産物の少なくとも一部と相補的であり、該プローブが
ＲＮＡ転写産物と相補結合によって、複合体を形成して
いない場合と比較して蛍光特性が変化するものである、
反応液の蛍光強度を測定することからなる腸炎ビブリオ
菌の毒素遺伝子の検出方法である。以下、本発明を詳細
に説明する。
係り、前記第一のプライマーが配列番号１の配列のうち
少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレ
オチドであることを特徴とする。本願請求項３の発明
は、請求項１の発明に係り、前記第二のプライマーが配
列番号２の配列のうち少なくとも連続した１０塩基以上
からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする。
そして本願請求項４の発明は、請求項１の発明に係り、
前記ＲＮＡ増幅工程を、インターカレーター性蛍光色素
で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ存在下で実施
することからなり、ここで該プローブの配列がＲＮＡ転
写産物の少なくとも一部と相補的であり、該プローブが
ＲＮＡ転写産物と相補結合によって、複合体を形成して
いない場合と比較して蛍光特性が変化するものである、
反応液の蛍光強度を測定することからなる腸炎ビブリオ
菌の毒素遺伝子の検出方法である。以下、本発明を詳細
に説明する。
【００１３】本願発明は、比較的低温かつ一定温度（３
５℃〜５０℃、好ましくは４１℃）で、腸炎ビブリオ菌
のｔｒｈ２に由来するＲＮＡを検出するためのオリゴヌ
クレオチドの組合せを提供すること、すなわちｔｒｈ２
に由来するＲＮＡの増幅用のオリゴヌクレオチドプライ
マー、及び検出用のオリゴヌクレオチドプローブの組合
わせを提供することで、それを利用した簡便、迅速かつ
高感度な腸炎ビブリオの耐熱性溶血毒類似溶血毒遺伝子
（ｔｒｈ２）の検出方法ならびに検出キットを食品検
査、食中毒検査等に提供するものである。
５℃〜５０℃、好ましくは４１℃）で、腸炎ビブリオ菌
のｔｒｈ２に由来するＲＮＡを検出するためのオリゴヌ
クレオチドの組合せを提供すること、すなわちｔｒｈ２
に由来するＲＮＡの増幅用のオリゴヌクレオチドプライ
マー、及び検出用のオリゴヌクレオチドプローブの組合
わせを提供することで、それを利用した簡便、迅速かつ
高感度な腸炎ビブリオの耐熱性溶血毒類似溶血毒遺伝子
（ｔｒｈ２）の検出方法ならびに検出キットを食品検
査、食中毒検査等に提供するものである。
【００１４】本願発明の態様の一例では、試料中に存在
する耐熱性溶血毒類似溶血毒遺伝子（ｔｒｈ２）に由来
するＲＮＡの特定配列を鋳型として、第一のプライマー
（標的ＲＮＡの特定配列の３’末端領域に相補的配列）
が相補結合し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによる
伸長反応からｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−Ｄ
ＮＡからなる２本鎖を形成し、次いでリボヌクレエース
ＨによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本
鎖ＤＮＡを生成する。その後、該１本鎖ＤＮＡに対し第
二のプライマー（標的ＲＮＡの５’末端領域に相同的配
列であり、５’末端にＲＮＡポリメレースのプロモータ
ー配列が付加されている）が相補結合し、ＤＮＡ依存性
ＤＮＡポリメレースにより前記標的ＲＮＡ配列と相同的
な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーターを有す
る２本鎖ＤＮＡを生成する。そして、該２本鎖ＤＮＡが
ＲＮＡポリメレース存在下で前記標的ＲＮＡと相同的な
配列からなるＲＮＡ転写産物が増幅される。そして本願
発明は、第一のプライマーとして配列番号１のオリゴヌ
クレオチド、第二のプライマーとして配列番号２のオリ
ゴヌクレオチドを用いることを特徴とする。第一および
第二のプライマーは、それぞれ配列番号１および配列番
号２の塩基配列の全長であっても良いが、各配列の中の
少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレ
オチドの組み合わせを使用することもできる。
する耐熱性溶血毒類似溶血毒遺伝子（ｔｒｈ２）に由来
するＲＮＡの特定配列を鋳型として、第一のプライマー
（標的ＲＮＡの特定配列の３’末端領域に相補的配列）
が相補結合し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによる
伸長反応からｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−Ｄ
ＮＡからなる２本鎖を形成し、次いでリボヌクレエース
ＨによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本
鎖ＤＮＡを生成する。その後、該１本鎖ＤＮＡに対し第
二のプライマー（標的ＲＮＡの５’末端領域に相同的配
列であり、５’末端にＲＮＡポリメレースのプロモータ
ー配列が付加されている）が相補結合し、ＤＮＡ依存性
ＤＮＡポリメレースにより前記標的ＲＮＡ配列と相同的
な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーターを有す
る２本鎖ＤＮＡを生成する。そして、該２本鎖ＤＮＡが
ＲＮＡポリメレース存在下で前記標的ＲＮＡと相同的な
配列からなるＲＮＡ転写産物が増幅される。そして本願
発明は、第一のプライマーとして配列番号１のオリゴヌ
クレオチド、第二のプライマーとして配列番号２のオリ
ゴヌクレオチドを用いることを特徴とする。第一および
第二のプライマーは、それぞれ配列番号１および配列番
号２の塩基配列の全長であっても良いが、各配列の中の
少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレ
オチドの組み合わせを使用することもできる。
【００１５】上記本願発明の一態様において、標的ＲＮ
Ａは、特定配列の５’末端で切断される必要がある。こ
のように標的ＲＮＡを切断する方法としては、特定配列
の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配
列を有するオリゴヌクレオチド（切断用オリゴヌクレオ
チド）を添加することによって、標的ＲＮＡをリボヌク
レエースＨ等により切断する方法が好ましい。該切断用
オリゴヌクレオチドの３'末端はオリゴヌクレオチドプ
ライマーとして機能しないように処理されたもの、例え
ばアミノ化等されているものを使用することが望まし
い。
Ａは、特定配列の５’末端で切断される必要がある。こ
のように標的ＲＮＡを切断する方法としては、特定配列
の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配
列を有するオリゴヌクレオチド（切断用オリゴヌクレオ
チド）を添加することによって、標的ＲＮＡをリボヌク
レエースＨ等により切断する方法が好ましい。該切断用
オリゴヌクレオチドの３'末端はオリゴヌクレオチドプ
ライマーとして機能しないように処理されたもの、例え
ばアミノ化等されているものを使用することが望まし
い。
【００１６】上記本願発明の一態様においては増幅され
るＲＮＡ転写産物の配列の少なくとも一部に対して相補
的な配列を有するインタカレーター性蛍光色素で標識さ
れたオリゴヌクレオチドプローブ存在下でこの増幅工程
を実施することが好ましい。この際、該プローブがＲＮ
Ａ転写産物と相補結合によって、複合体を形成していな
い場合と比較して蛍光特性が変化するものであって、反
応液の蛍光強度を測定すれば良い。さらには、標識され
たオリゴヌクレオチドプローブを増幅工程中に共存させ
る場合には、プローブが伸長反応のプライマーとして機
能しないように、例えばその３’末端にグリコール酸を
付加する等の修飾を行うことが特に望ましい。オリゴヌ
クレオチドプローブとしては、配列番号６配列の少なく
とも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチド
を利用することが例示できる。
るＲＮＡ転写産物の配列の少なくとも一部に対して相補
的な配列を有するインタカレーター性蛍光色素で標識さ
れたオリゴヌクレオチドプローブ存在下でこの増幅工程
を実施することが好ましい。この際、該プローブがＲＮ
Ａ転写産物と相補結合によって、複合体を形成していな
い場合と比較して蛍光特性が変化するものであって、反
応液の蛍光強度を測定すれば良い。さらには、標識され
たオリゴヌクレオチドプローブを増幅工程中に共存させ
る場合には、プローブが伸長反応のプライマーとして機
能しないように、例えばその３’末端にグリコール酸を
付加する等の修飾を行うことが特に望ましい。オリゴヌ
クレオチドプローブとしては、配列番号６配列の少なく
とも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチド
を利用することが例示できる。
【００１７】また本願発明の別の態様では、試料中に存
在するｔｒｈ２に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型とし
て、第一のプライマー（標的ＲＮＡに相補的配列で、
５’側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列が付加
されている）が相補結合し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
レースによる伸長反応からｃＤＮＡを生成することによ
りＲＮＡ−ＤＮＡからなる２本鎖を形成し、次いでリボ
ヌクレエースＨによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを
分解して１本鎖ＤＮＡを生成する。その後、該１本鎖Ｄ
ＮＡに対し第二のプライマー（標的ＲＮＡに相同的配
列）が相補結合し、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースに
より前記標的ＲＮＡ配列に対して相補的な配列からなる
ＲＮＡを転写可能なプロモーターを有する２本鎖ＤＮＡ
を生成する。そして、該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレ
ース存在下で前記標的ＲＮＡとは相補的な配列からなる
ＲＮＡ転写産物を生成する。そして該ＲＮＡ転写産物
（標的ＲＮＡとは相補的配列）に対して第二のプライマ
ーが相補結合し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによ
りｃＤＮＡを生成し、ＲＮＡ−ＤＮＡからなる２本鎖を
形成する。次いでリボヌクレエースＨによりＲＮＡ−Ｄ
ＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、
該１本鎖ＤＮＡに対し第一のプライマーが相補結合し、
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより前記標的ＲＮＡ
配列に対して相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能な
プロモーターを有する２本鎖ＤＮＡを生成する。そして
該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下で前記標的
ＲＮＡとは相補的な配列からなるＲＮＡ転写産物が増幅
される。そして本願発明は、第一のプライマーとして配
列番号１のオリゴヌクレオチド、第二のプライマーとし
て配列番号２のオリゴヌクレオチドを用いることを特徴
とする。第一および第二のプライマーは、それぞれ配列
番号１及び配列番号２の塩基配列の全長であっても良い
が、各配列の中の少なくとも連続した１０塩基以上から
なるオリゴヌクレオチドの組み合わせを使用することも
できる。
在するｔｒｈ２に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型とし
て、第一のプライマー（標的ＲＮＡに相補的配列で、
５’側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列が付加
されている）が相補結合し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
レースによる伸長反応からｃＤＮＡを生成することによ
りＲＮＡ−ＤＮＡからなる２本鎖を形成し、次いでリボ
ヌクレエースＨによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを
分解して１本鎖ＤＮＡを生成する。その後、該１本鎖Ｄ
ＮＡに対し第二のプライマー（標的ＲＮＡに相同的配
列）が相補結合し、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースに
より前記標的ＲＮＡ配列に対して相補的な配列からなる
ＲＮＡを転写可能なプロモーターを有する２本鎖ＤＮＡ
を生成する。そして、該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレ
ース存在下で前記標的ＲＮＡとは相補的な配列からなる
ＲＮＡ転写産物を生成する。そして該ＲＮＡ転写産物
（標的ＲＮＡとは相補的配列）に対して第二のプライマ
ーが相補結合し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによ
りｃＤＮＡを生成し、ＲＮＡ−ＤＮＡからなる２本鎖を
形成する。次いでリボヌクレエースＨによりＲＮＡ−Ｄ
ＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、
該１本鎖ＤＮＡに対し第一のプライマーが相補結合し、
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより前記標的ＲＮＡ
配列に対して相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能な
プロモーターを有する２本鎖ＤＮＡを生成する。そして
該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下で前記標的
ＲＮＡとは相補的な配列からなるＲＮＡ転写産物が増幅
される。そして本願発明は、第一のプライマーとして配
列番号１のオリゴヌクレオチド、第二のプライマーとし
て配列番号２のオリゴヌクレオチドを用いることを特徴
とする。第一および第二のプライマーは、それぞれ配列
番号１及び配列番号２の塩基配列の全長であっても良い
が、各配列の中の少なくとも連続した１０塩基以上から
なるオリゴヌクレオチドの組み合わせを使用することも
できる。
【００１８】上記本願発明の一態様においては増幅され
るＲＮＡ転写産物の配列の少なくとも一部に対して相補
的な配列を有するインタカレーター性蛍光色素で標識さ
れたオリゴヌクレオチドプローブ存在下で実施すること
が好ましい。この際、該プローブがＲＮＡ転写産物と相
補結合によって、複合体を形成していない場合と比較し
て蛍光特性が変化するものであれば、反応液の蛍光強度
を測定すれば良い。ここで、標識されたオリゴヌクレオ
チドプローブを増幅工程中に共存させる場合には、プロ
ーブが伸長反応のプライマーとして機能しないように、
例えばその３’末端にグリコール酸を付加する等の修飾
を行うことが特に望ましい。オリゴヌクレオチドプロー
ブとしては、配列番号６に記載した配列と相補的な配列
のオリゴヌクレオチドを利用することが例示できる。
るＲＮＡ転写産物の配列の少なくとも一部に対して相補
的な配列を有するインタカレーター性蛍光色素で標識さ
れたオリゴヌクレオチドプローブ存在下で実施すること
が好ましい。この際、該プローブがＲＮＡ転写産物と相
補結合によって、複合体を形成していない場合と比較し
て蛍光特性が変化するものであれば、反応液の蛍光強度
を測定すれば良い。ここで、標識されたオリゴヌクレオ
チドプローブを増幅工程中に共存させる場合には、プロ
ーブが伸長反応のプライマーとして機能しないように、
例えばその３’末端にグリコール酸を付加する等の修飾
を行うことが特に望ましい。オリゴヌクレオチドプロー
ブとしては、配列番号６に記載した配列と相補的な配列
のオリゴヌクレオチドを利用することが例示できる。
【００１９】
【発明の実施形態】以下、本発明を実施例により更に詳
細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定され
るものではない。
細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定され
るものではない。
【００２０】実施例１ 本願発明によるオリゴヌクレオチドプライマーの組合わ
せを用いて、標的ＲＮＡの特異的増幅を行った。なおｔ
ｒｈ２−ＲＮＡとは、ｔｒｈ２の塩基配列を含む２本鎖
ＤＮＡを鋳型としたインビトロ転写により合成、精製さ
れたＲＮＡである。同様にｔｒｈ１−ＲＮＡ、ｔｄｈ２
−ＲＮＡもインビトロ転写により調製した。
せを用いて、標的ＲＮＡの特異的増幅を行った。なおｔ
ｒｈ２−ＲＮＡとは、ｔｒｈ２の塩基配列を含む２本鎖
ＤＮＡを鋳型としたインビトロ転写により合成、精製さ
れたＲＮＡである。同様にｔｒｈ１−ＲＮＡ、ｔｄｈ２
−ＲＮＡもインビトロ転写により調製した。
【００２１】（１）腸炎ビブリオ菌のｔｒｈ２−ＲＮＡ
の塩基番号１〜６１０（ＲＮＡの塩基番号は西渕ら、Ａ
ｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５
８、２４４９〜２４５７（１９９２）に従った）を含む
標準ＲＮＡ（６１６ｍｅｒ）を試料とし、２６０ｎｍの
紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒ、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用い１．０×１０4コピー
／５μｌ、１．０×１０3コピー／５μｌとなるよう希
釈した。コントロール試験区（Ｎｅｇａ）には希釈液の
みを用いた。
の塩基番号１〜６１０（ＲＮＡの塩基番号は西渕ら、Ａ
ｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５
８、２４４９〜２４５７（１９９２）に従った）を含む
標準ＲＮＡ（６１６ｍｅｒ）を試料とし、２６０ｎｍの
紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒ、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用い１．０×１０4コピー
／５μｌ、１．０×１０3コピー／５μｌとなるよう希
釈した。コントロール試験区（Ｎｅｇａ）には希釈液の
みを用いた。
【００２２】（２）以下の組成の反応液２０．８μｌを
市販の０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎ
ｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏ
ｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に分注し、こ
れに上記ＲＮＡ試料５．０μｌを添加した。
市販の０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎ
ｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏ
ｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に分注し、こ
れに上記ＲＮＡ試料５．０μｌを添加した。
【００２３】反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後の反
応系の最終濃度） ６０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液 （ｐH８．６） １３．０ｍＭ 塩化マグネシウム ９０．０ｍＭ 塩化カリウム １．０ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ 各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ ２．２５ｍＭ ＧＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各１．０μＭの第一のプライマーと第二のプライマー （プライマーの組み合わせは表１の通り、ここで配列番
号４及び配列番号５の配列中の５’端１番目の「Ａ」か
ら２８番目の「Ａ」までの部分はＴ７ポリメレースのプ
ロモータ配列として付加した配列である） ０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチドプライマー
（配列番号３、標的ＲＮＡを第２のプライマーが結合し
得る位置で切断するためのオリゴヌクレオチド、３’末
端はアミノ化してある） ３９Ｕ リボヌクレエース インヒビター（宝酒造
（株）製） １５．０％ ＤＭＳＯ 容量調製用蒸留水
応系の最終濃度） ６０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液 （ｐH８．６） １３．０ｍＭ 塩化マグネシウム ９０．０ｍＭ 塩化カリウム １．０ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ 各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ ２．２５ｍＭ ＧＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各１．０μＭの第一のプライマーと第二のプライマー （プライマーの組み合わせは表１の通り、ここで配列番
号４及び配列番号５の配列中の５’端１番目の「Ａ」か
ら２８番目の「Ａ」までの部分はＴ７ポリメレースのプ
ロモータ配列として付加した配列である） ０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチドプライマー
（配列番号３、標的ＲＮＡを第２のプライマーが結合し
得る位置で切断するためのオリゴヌクレオチド、３’末
端はアミノ化してある） ３９Ｕ リボヌクレエース インヒビター（宝酒造
（株）製） １５．０％ ＤＭＳＯ 容量調製用蒸留水
【００２４】
【表１】
【００２５】（３）上記の反応液を、４１℃で５分間保
温後、以下の組成の予め４１℃で２分間保温した酵素液
４．２μｌを添加した。
温後、以下の組成の予め４１℃で２分間保温した酵素液
４．２μｌを添加した。
【００２６】酵素液の組成（反応時の再終濃度） １．７％ ソルビトール ８ユニット ＡＭＶ逆転写酵素 （宝酒造（株）製） １４２ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメレース （ＧＩＢ
ＣＯ社製） ３μｇ 牛血清アルブミン 容量調製用蒸留水 （４）引き続きＰＣＲチューブを４１℃に３０分間保温
した後、特定の増幅産物を４％アガロースゲルを用いた
電気泳動により分析した。
ＣＯ社製） ３μｇ 牛血清アルブミン 容量調製用蒸留水 （４）引き続きＰＣＲチューブを４１℃に３０分間保温
した後、特定の増幅産物を４％アガロースゲルを用いた
電気泳動により分析した。
【００２７】（５）電気泳動後の染色には市販の染色液
（商品名；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、宝酒造（株）
製）を用いた。
（商品名；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、宝酒造（株）
製）を用いた。
【００２８】電気泳動結果を図−１（白黒反転）に示し
た。どちらの組み合わせにおいても、ｔｒｈ２−ＲＮＡ
を添加した系において、特異的なＲＮＡ増幅産物（図−
１の矢印部分）が得られた。一方、ｔｄｈ２−ＲＮＡ、
ｔｒｈ１−ＲＮＡを添加した系では増幅産物が得られな
かった。このことから、これらのオリゴヌクレオチドプ
ライマーの組合せは、腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒類
似溶血毒（ｔｒｈ２）に由来するＲＮＡの増幅・検出に
有用であることが示された。
た。どちらの組み合わせにおいても、ｔｒｈ２−ＲＮＡ
を添加した系において、特異的なＲＮＡ増幅産物（図−
１の矢印部分）が得られた。一方、ｔｄｈ２−ＲＮＡ、
ｔｒｈ１−ＲＮＡを添加した系では増幅産物が得られな
かった。このことから、これらのオリゴヌクレオチドプ
ライマーの組合せは、腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒類
似溶血毒（ｔｒｈ２）に由来するＲＮＡの増幅・検出に
有用であることが示された。
【００２９】
【発明の効果】以上の説明のように、本発明によれば、
試料中のＲＮＡが分子内構造を形成し、プライマーやプ
ローブの結合を阻害しかねない、比較的低温かつ一定温
度（３５℃〜５０℃、好ましくは４１℃）条件下でも、
腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒類似溶血毒遺伝子（ｔｒ
ｈ２）に由来するＲＮＡに特異的に結合し、標的ＲＮＡ
を迅速に増幅し、かつ検出等するためのオリゴヌクレオ
チドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブの組合わ
せとして有用である。
試料中のＲＮＡが分子内構造を形成し、プライマーやプ
ローブの結合を阻害しかねない、比較的低温かつ一定温
度（３５℃〜５０℃、好ましくは４１℃）条件下でも、
腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒類似溶血毒遺伝子（ｔｒ
ｈ２）に由来するＲＮＡに特異的に結合し、標的ＲＮＡ
を迅速に増幅し、かつ検出等するためのオリゴヌクレオ
チドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブの組合わ
せとして有用である。
【００３０】上記以外にも、本願発明のオリゴヌクレオ
チドの組合せは、ｔｒｈ２−ＲＮＡに限らず、ＲＮＡを
逆転写して得られるｃＤＮＡを検出するためには、上記
したオリゴヌクレオチドの相補的配列も有用である。
チドの組合せは、ｔｒｈ２−ＲＮＡに限らず、ＲＮＡを
逆転写して得られるｃＤＮＡを検出するためには、上記
したオリゴヌクレオチドの相補的配列も有用である。
【００３１】本願発明の組み合わせにおけるオリゴヌク
レオチドの塩基長は具体的に記載した長さに限らず、こ
れら配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなる
オリゴヌクレオチドを含む。これは、プライマーまたは
プローブの標的核酸への十分な特異性を確保するために
は１０塩基程度の塩基配列があれば十分であることか
ら、明らかである。
レオチドの塩基長は具体的に記載した長さに限らず、こ
れら配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなる
オリゴヌクレオチドを含む。これは、プライマーまたは
プローブの標的核酸への十分な特異性を確保するために
は１０塩基程度の塩基配列があれば十分であることか
ら、明らかである。
【００３２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Tosoh Corporation <120> 腸炎ビブリオ菌の毒素遺伝子の検出法 <130> PA211-0192 <160> 6 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 1 gtgaccattg atgttgactg 20 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 2 tatctaaatc attcgcgatt gatctgcca 29 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 3 gatttagata ttgaaaatat 20 <210> 4 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 4 aattctaata cgactcacta tagggagata tctaaatcat tcgcgattg 49 <210> 5 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 5 aattctaata cgactcacta tagggagaaa atcattcgcg attgatctgc ca 52 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 6 cgattgaccg tatacatctt 20
【図１】実施例１で行った初期ＲＮＡ量１０4コピー／
３０μｌ、１０3コピー／３０μｌにおいて、ＲＮＡ増
幅反応を二組のプライマーの組み合わせにより行った結
果である。ＮｅｇａとはＲＮＡ試料の代わりに希釈液の
みを用いたサンプルのことである。
３０μｌ、１０3コピー／３０μｌにおいて、ＲＮＡ増
幅反応を二組のプライマーの組み合わせにより行った結
果である。ＮｅｇａとはＲＮＡ試料の代わりに希釈液の
みを用いたサンプルのことである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｃ１２Ｒ 1:63） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:63） Ｃ１２Ｒ 1:63） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:63） Ｃ１２Ｒ 1:63） Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA28 AA35 CB21 DA12 DA13 DA14 DA77 FB01 FB02 FB07 FB12 GC15 4B024 AA13 CA11 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ16 QQ52 QR08 QR35 QR56 QR62 QS25 QS34 QX02
Claims (4)
- 【請求項１】試料中に存在する腸炎ビブリオ菌の耐熱性
溶血毒類似溶血毒遺伝子（ｔｒｈ２）に由来するＲＮＡ
の特定配列を鋳型として、該特定配列に相補的な配列を
有する第一のプライマーおよび該特定配列に相同的な配
列を有する第二のプライマー（ここで第一または第二の
プライマーのいずれか一方のプライマーは、５’側にＲ
ＮＡポリメレースのプロモーター配列をふかした配列を
有する）を用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによ
りｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖
を形成し、リボヌクレエースＨによりＲＮＡ−ＤＮＡ２
本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本
鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース
により前記ＲＮＡ配列または前記ＲＮＡ配列に相補的な
配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有
する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲ
ＮＡポリメレース存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該
ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリ
メレースによる１本鎖ＤＮＡ生成の鋳型となるようなＲ
ＮＡ増幅工程を利用した検出法において、第一のプライ
マーとして配列番号１のオリゴヌクレオチド、第二のプ
ライマーとして配列番号２のオリゴヌクレオチドを用い
ることを特徴とする、検出法。 - 【請求項２】前記第一のプライマーが配列番号１の配列
のうち少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴ
ヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１の検出
法。 - 【請求項３】前記第二のプライマーが配列番号２の配列
のうち少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴ
ヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１の検出
法。 - 【請求項４】請求項第１項に記載されたＲＮＡ増幅工程
を、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴ
ヌクレオチドプローブ存在下で実施することからなり、
ここで該プローブの配列がＲＮＡ転写産物の少なくとも
一部と相補的であり、該プローブがＲＮＡ転写産物と相
補結合によって、複合体を形成していない場合と比較し
て蛍光特性が変化するものである、反応液の蛍光強度を
測定することからなる腸炎ビブリオ菌の毒素遺伝子の検
出方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000166505A JP2001340088A (ja) | 2000-05-31 | 2000-05-31 | 腸炎ビブリオ菌の毒素遺伝子の検出法 |
| US09/808,358 US6562955B2 (en) | 2000-03-17 | 2001-03-15 | Oligonucleotides for detection of Vibrio parahaemolyticus and detection method for Vibrio parahaemolyticus using the same oligonucleotides |
| EP01106364A EP1134292B1 (en) | 2000-03-17 | 2001-03-16 | Oligonucleotides for detection of 'Vibrio parahaemolyticus' and detection method for 'Vibrio parahaemolyticus' using the same oligonucleotides |
| DE60122043T DE60122043T2 (de) | 2000-03-17 | 2001-03-16 | Oligonukleotide zur Detektion von 'Vibrio parahaemolyticus' und Detektionsverfahren für 'Vibrio parahaemolyticus' unter Verwendung der gleichen Oligonukleotide |
| US10/407,461 US20030176687A1 (en) | 2000-03-17 | 2003-04-07 | Oligonucleotides for detection of Vibrio parahaemolyticus and detection method for Vibrio parahaemolyticus using the same oligonucleotides |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000166505A JP2001340088A (ja) | 2000-05-31 | 2000-05-31 | 腸炎ビブリオ菌の毒素遺伝子の検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001340088A true JP2001340088A (ja) | 2001-12-11 |
Family
ID=18669809
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000166505A Pending JP2001340088A (ja) | 2000-03-17 | 2000-05-31 | 腸炎ビブリオ菌の毒素遺伝子の検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001340088A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10201476A (ja) * | 1997-01-24 | 1998-08-04 | Tosoh Corp | 核酸配列分析方法 |
-
2000
- 2000-05-31 JP JP2000166505A patent/JP2001340088A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10201476A (ja) * | 1997-01-24 | 1998-08-04 | Tosoh Corp | 核酸配列分析方法 |
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