JP2001523971A - ヘテロマルチマー及び共通成分を有する多重特異性抗体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、二重特異性抗体、二重特異性免疫付着因子及び抗体-免疫付着因子キメラのようなヘテロマルチマーを製造する方法に関する。本発明はまた、その方法を用いて製造したヘテロマルチマーにも関する。一般に、該方法は抗体結合ドメインを有している各々のヘテロマー性ポリペプチドと結合した共通の軽鎖を有する多重特異性抗体を提供する。加えて本方法は、ヘテロマルチマー形成を促進する及びホモマルチマー形成を妨げるように第１のポリペプチドの界面と第２のポリペプチドの界面で特異的且つ相補的な相互作用を；及び／又は非天然存在ジスルフィド結合が該第１の及び第二のポリペプチド間に形成されるように、第１のポリペプチドの界面で遊離チオール含有残基を、及び第２のポリペプチドの界面中に相当する遊離チオール含有残基を、多重特異性抗体に導入することをさらに包含する。本方法は、望ましくないヘテロマルチマーとホモマルチマーに相対して望まれるヘテロマルチマーの増大した形成を与える。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘテロマルチマー及び共通成分を有する多重特異性抗体の製造方法 発明の分野 本発明は、ヘテロマルチマー重鎖成分および共通する軽鎖成分を有する多重特 異性抗体の作製方法に関する。このような多重特異性抗体として、二重特異性抗 体、二重特異性免疫付着因子、ならびに本発明の方法を使用して作製される抗体 −免疫付着因子キメラおよびヘテロマルチマーポリペプチドなどが挙げられる。 発明の背景 二重特異性抗体 少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する二重特異性抗体（Ｂ ｓＡｂ）は、インビトロおよびインビボでの免疫診断および治療に必要な標的化 薬剤として、そして診断的な免疫アッセイに必要な標的化薬剤としての広範囲の 診療適用における大きな可能性を有している。 診断領域において、二重特異性抗体は、細胞表面分子の機能的特性を探る際に 、そして細胞傷害性を媒介する様々なＦｃレセプターの能力を明らかにする際に 非常に有用である(Ｆａｎｇｅｒら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２ ：１０１〜１２４(１９９２))。Ｎｏｌａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ ｓ．Ａｃｔａ．１０４０：１〜１１（１９９０）は、ＢｓＡｂに関する他の診断 適用を記載する。特に、ＢｓＡｂは、酵素免疫アッセイで使用される酵素を固定 化するために構築することができる。これを達成するために、ＢｓＡｂの一方の アーム（腕）は、酵素表面の特定のエピトープに結合するように設計することが でき、その結果、結合による酵素阻害は生じない。ＢｓＡｂのもう一方のアーム は、所望の部位において高い酵素密度を確実にする固定化マトリックスに結合す る。そのような診断的ＢｓＡｂの例には、表面抗原を探し出すために使用された 、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２８：１４６１〜１４７３ (１９６８)によって記載されたウサギ抗ＩｇＧ／抗フェリチンＢｓＡｂが含まれ る。 ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ならびにホルモンに対する結合 特異性を有するＢｓＡｂもまた開発されている。ＢｓＡｂに関する別の可能な免 疫化学的適用には、二部位免疫アッセイにおけるその使用が含まれる。例えば、 分析対象タンパク質の表面にある２つの異なるエピトープに結合する２つのＢｓ Ａｂか作製されている−一方のＢｓＡｂは複合体を不溶性マトリックスに結合さ せ、もう一方は指示酵素と結合する(Ｎｏｌａｎら（上記）を参照)。 二重特異性抗体はまた、ガンなどの様々な疾患のインビボ免疫診断またはイン ビトロ免疫診断を行うために使用することができる(Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉら 、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５(１９９０))。ＢｓＡｂの このような診断的使用を容易にするために、ＢｓＡｂの一方のアームは、腫瘍関 連抗原と結合することができ、もう一方のアームは、放射性核種と強固に結合す るキレート化剤などの検出可能なマーカーと結合することができる。このような 方法を使用して、Ｌｅ Ｄｏｕｓｓａｌらは、結腸直腸ガンおよび甲状腺（ｔｈ ｒｙｏｉｄ）ガンの放射免疫検出に有用なＢｓＡｂを作製した。このＢｓＡｂは 、ガン胎児抗原（ＣＥＡ）と結合するアームを一方に有し、ジエチレントリアミ ン五酢酸（ＤＰＴＡ）と結合するアームをもう一方に有する。Ｌｅ Ｄｏｕｓｓ ａｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．７：５８〜６２（１９９２） およひＬｅ Ｄｏｕｓｓａｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３４：１６６２〜１６ ７１（１９９３）を参照。Ｓｔｉｃｋｎｅｙらは、放射免疫検出を使用してＣＥ Ａを発現する結腸直腸ガンを検出するための方策を同様に記載する。この研究者 らは、ＣＥＡならびにヒドロキシエチルチオ尿素−ベンジル−ＥＤＴＡ（ＥＯＴ ＵＢＥ）と結合するＢｓＡｂを記載する。Ｓｔｉｃｋｎｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：６６５０〜６６５５（１９９１）を参照。 二重特異性抗体はまた、標的（例えば、病原体または腫瘍細胞）と結合する一 方のアーム、およびＴ細胞レセプターまたはＦｃγレセプターなどの細胞傷害性 誘引因子分子と結合するもう一方のアームが提供されることによって、細胞傷害 性の対象を変えることでヒトの治療に有用であり得る。従って、二重特異性抗体 を使用して、患者の細胞性免疫防御機構を腫瘍細胞または感染性病原体に特異的 に向けさせることができる。このような方策を使用して、ＦｃγＲＩＩＩ（また は、ＣＤ１６）に結合する二重特異性抗体は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞／ 大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）細胞によってインビトロでの腫瘍細胞殺傷を媒介する ことができ、インビボで腫瘍増殖を防止するのに効果的であることが明らかにさ れた。Ｓｅｇａｌら、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７：１７９（１９８９）お よびＳｅｇａｌら、ガンの生物学的治療（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）２(４)、ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ ｔ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ(１９９２)、１頁。同様に、ＦｃγＩＩＩと結合 する一方のアームと、ＨＥＲ２レセプターに結合するもう一方のアームとを有す る二重特異性抗体が、ＨＥＲ２抗原を過剰発現する卵巣腫瘍および乳腫瘍を治療 するために開発された。(Ｈｓｅｉｈ−Ｍａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ ５２：６８３２〜６８３９（１９９２）およびＷｅｉｎｅｒら、Ｃａｎｃｅ ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：９４〜１００(１９９３))。二重特異性抗体はま た、Ｔ細胞による殺傷を媒介することができる。通常、二重特異性抗体は、Ｔ細 胞上のＣＤ３複合体を腫瘍関連抗原に結合させる。抗ｐ１８５ＨＥＲ２に結合し た抗ＣＤ３からなる完全にヒト化されたＦ（ａｂ'）₂ＢｓＡｂを使用して、Ｔ細 胞の標的化が、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する腫瘍細胞を殺傷するために行 われた。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５(１)：２１７(１９９ ２)。二重特異性抗体は、いくつかの初期の臨床試験において調べられ、有望な 結果が得られている。１つの臨床試験において、肺ガン、卵巣ガンまたは乳ガン の１２名の患者が、抗ＣＤ３／抗腫瘍（ＭＯＣ３１）の二重特異性抗体で標的化 された活性化Ｔリンパ球を注入することによって処置された。ｄｅＬｅｉｊら、「 二重特異性抗体および標的化細胞の細胞傷害性」、Ｒｏｍｅｔ−Ｌｅｍｏｎｎｅ 、ＦａｎｇｅｒおよびＳｅｇａｌ編、Ｌｅｉｎｈａｒｔ（１９９１）２４９頁。 標的化された細胞において、腫瘍細胞の相当の局所的な溶解、穏和な炎症反応が 誘導されたが、毒性の副作用または抗マウス抗体の応答は誘導されなかった。Ｂ 細胞の悪性疾患の患者での抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９二重特異性抗体の非常に予備的 な試験において、末梢の腫瘍細胞数の大きな減少もまた達成された。Ｃｌａｒｋ ら、「二重特異性抗体および標的化細胞の細胞傷害性」、Ｒｏｍｅｔ−Ｌｅｍｏｎ ｎｅ、ＦａｎｇｅｒおよびＳｅｇａｌ編、Ｌｅｉｎｈａｒｔ（１９９１） ２４３頁。ＢｓＡｂの治療的適用に関してはＫｒｏｅｓｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：４００〜４０７(１９９３)、Ｋ ｒｏｅｓｅｎら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７０：６５２〜６６１(１９９４)、 およびＷｅｉｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２３８５（１９９４）も また参照。 二重特異性抗体はまた、フィブリン溶解剤またはワクチンアジュバントとして 使用することができる。さらに、このような抗体は、感染性疾患の処置において 、（例えば、エフェタター細胞を、ＨＩＶウイルスまたはインフルエンザウイル スなどのウイルスに感染した細胞あるいはトキソプラズマ ゴンディイ（Ｔｏｘ ｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）などの原生動物に対して標的化するために）使 用することができ、あるいはイムノトキシンを腫瘍細胞に送達するために、ある いは免疫複合体を細胞表面レセプターに標的化するために使用することができる (Ｆａｎｇｅｒら（上記）を参照)。 ＢｓＡｂの使用は、ＢｓＡｂを十分な量および純度で得ることが困難であると いうことによって著しく妨げられている。従来、二重特異性抗体は、ハイブリッ ド−ハイブリドーマ技術（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒ ｅ ３０５：５３７〜５３９(１９８３)）を使用して作製された。免疫グロブリ ンの重鎖および軽鎖は無作為に組み合わされるために、これらのハイブリドーマ （クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があり 、このうちの１個のみが、正しい二重特異性構造を有する(図１Ａを参照)。この 正しい分子の精製は、通常的にはアフィニティークロマトグラフィー工程によっ て行われているが、かなり面倒であり、生成物の収量は少ない。例えば、（Ｓｍ ｉｔｈ，Ｗ．ら（１９９２）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ４：８７〜９８；およびＭａ ｓｓｉｍｏ，Ｙ．Ｓ．ら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２ ０１：５７〜６６）を参照。従って、より大きな収量のＢｓＡｂを産生するため の技術が開発されている。抗体フラグメントの化学的な連結を行うために、Ｂｒ ｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）は、無傷の抗体をタ ンパク質分解的に切断して、Ｆ（ａｂ'）₂フラグメントを得る方法を記載する。 このようなフラグメントは、ジチオール複合化剤である亜ヒ酸ナトリウムの 存在下で還元され、近傍のジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド結合が 形成されないようにする。次いで、得られたＦａｂ’フラグメントは、チオニト ロ安息香酸(ＴＮＢ)誘導体に変換される。次いで、ＢｓＡｂを形成するために、 １つのＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体が、メルカプトエチルアミンを用いた還元によっ てＦａｂ’−チオールに再度変換され、もう１つのＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等 モル量と混合されて、生成したＢｓＡｂは、酵素を選択的に固定化するための薬 剤として使用することができる。 近年の進歩は、二重特異性抗体を得るために化学的に連結させることができる Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを大腸菌から直接回収することを容易にした。Ｓｈ ａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７〜２２５（１９９２）は、 ｐ１８５ＨＥＲ２と結合する一方のアームおよびＣＤ３と結合するもう一方のア ームを有する完全にヒト化されたＢｓＡｂのＦ（ａｂ'）２分子の産生を記載す る。ＢｓＡｂを形成するために、それぞれのＦａｂ’フラグメントを大腸菌から 別個に分泌させ、インビトロでの指向された化学的結合反応に供した。このよう にして形成されたＢｓＡｂは、ヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球 の溶解活性を開始させるのと同様に、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する細胞お よび正常なヒトＴ細胞に結合することができた。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、Ｉｎｔ ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｓｕｐｐｌ.）７：４５〜５０（１９９２）もまた参照 。 ＢｓＡｂフラクメントを作製し、組換え細胞の培養物から直接分離するための 様々な技術もまた記載されている。例えば、二重特異性のＦ（ａｂ'）₂ヘテロダ イマーが、ロイシンジッパーを使用して産生されている(Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８(５)：１５４７〜１５５３(１９９２))。Ｆｏｓタ ンパク質およびＪｕｎタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチドが、遺伝 子融合によって抗ＣＤ３抗体および抗インターロイキン−２レセプター（ＩＬ− ２Ｒ）抗体のＦａｂ’部分に連結された。ホモダイマーの抗体をヒンジ部で還元 してモノマーを形成させ、次いで、再酸化してヘテロダイマーの抗体を形成させ た。このようなＢｓＡｂは、インビトロでＨｕＴ−１０２細胞を溶解するために 、細胞傷害性Ｔ細胞を呼び寄せるのに非常に効果的であることが見出された。Ｈ ｏｌｌｉｎｇｅｒら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９０：６４４４〜６４４８（１９９ ３）により記載される「ジアボディ(ｄｉａｂｏｄｙ)」技術の出現は、ＢｓＡｂ フラダメントを作製するための代わりの機構をもたらした。このフラグメントは 、短すぎて同じ鎖の表面にある２つのドメインの間での対形成ができないリンカ ーによって軽鎖の可変ドメイン(Ｖ_L)に連結された重鎖の可変ドメイン(Ｖ_H)を含 む。従って、１つのフラグメントのＶ_HドメインおよびＶ_Lドメインは、別のフラ グメントの相補的なＶ_HドメインおよびＶ_Lドメインと対形成することを強いられ 、それによって２つの抗原結合部位が形成される。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）のダイマ ーの使用によるＢｓＡｂフラグメントを作製するための別の方策もまた報告され ている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４） を参照。この研究者らは、２５アミノ酸残基のリンカーによって抗フルオレセイ ン抗体のＶ_HドメインおよびＶ_Lドメインに連結されたＴ細胞レセプターに対する 抗体のＶ_HドメインおよびＶ_Lドメインを含む抗体を設計した。再生された分子は 、フルオレセインおよびＴ細胞レセプターに結合し、フルオレセインがその表面 に共有結合しているヒト腫瘍細胞を溶解させた。 組換え細胞の培養物から直接回収することができる二重特異性抗体を作製する ためのいくつかの技術が報告されているようである。しかし、完全長のＢｓＡｂ は、その血清半減期がより長いと考えられることおよび可能なエフェクター機能 のために、多くの診療的適用に関しては、ＢｓＡｂフラグメントよりも好ましい とされ得る。 免疫付着因子(Immunoadhesins) 免疫付着因子（Ｉａ）は、細胞表面レセプターまたはリガンド（「付着因子」(a dhesin)）などのタンパク質の結合ドメインを、免疫グロブリンの定常ドメイン のエフェタター機能とともに併せ持つ抗体様分子である。免疫付着因子は、ヒト 抗体の多くの貴重な化学的特性および生物学的特性を有し得る。免疫付着因子は 、適当なヒト免疫グロブリンのヒンジ配列および定常ドメイン（Ｆｃ）配列に連 結された所望の特異性を有するヒトのタンパク質配列から構築することができる ので、目的とする結合特異性は、完全なヒト成分を使用して達成することができ る。そのような免疫付着因子は、患者に対する免疫原性は最小であり、安全に長 期間 または繰り返し使用される。 文献に報告されている免疫付着因子には下記が含まれる。Ｔ細胞レセプターの 融合体(Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ ８４：２９３６〜２９４０(１９８７))；ＣＤ４の融合体(Ｃａｐｏｎら、Ｎ ａｔｕｒｅ ３３７：５２５〜５３１(１９８９)；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎ ａｔｕｒｅ ３３９：６８〜７０(１９８９)；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ ９：３４７〜３５３(１９９０)；およびＢｙｒ ｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６６７〜６７０(１９９０))；Ｌ−セレクチンま たはホーミングレセプターの融合体(Ｗａｔｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ ．１１０：２２２１〜２２２９(１９９０)；およびＷａｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒ ｅ ３４９：１６４〜１６７(１９９１))；ＣＤ４４の融合体(Ａｒｕｆｆｏら、 Ｃｅｌｌ ６１：１３０３〜１３１３(１９９０))；ＣＤ２８およびＢ７の融合 体(Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１〜７３０(１９９１ ))；ＣＴＬＡ−４の融合体(Ｌｉｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５ ６１〜５６９(１９９１))；ＣＤ２２の融合体(Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｃｅ ｌｌ ６６：１１３３〜１１４４(１９９１))；ＴＮＦレセプターの融合体(Ａｓ ｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１ ０５３５〜１０５３９(１９９１)；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍ ｕｎｏｌ．２７：２８８３〜２８８６（１９９１）；およびＰｅｐｐｅｌら、Ｊ ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３〜１４８９(１９９１))；ＮＰレセプター の融合体(Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３０６０〜 ２３０６７(１９９１))；インターフェロンγレセプターの融合体(Ｋｕｒｓｃｈ ｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９３５４〜９３６０(１９９２)) ；４−１ＢＢの融合体（Ｃｈａｌｕｐｎｙら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８９：１０３ ６０〜１０３６４(１９９２)）およびＩｇＥレセプターαの融合体(Ｒｉｄｇｗ ａｙおよびＧｏｒｍａｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１１５巻、抄録番号１４ ４８(１９９１))。 治療的使用について記載されている免疫付着因子の例には、細胞表面ＣＤ４に 対するＨＩＶの結合を阻止するためのＣＤ４−ＩｇＧ免疫付着因子が含まれる。 ＣＤ４−ＩｇＧを出産直前の妊娠女性に投与した第Ｉ相臨床試験から得られたデ ータにより、この免疫付着因子は、ＨＩＶの母−胎児間移動を防止することにお いて有用であり得ることが示唆されている。Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｉｎｔｅｒ ｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２１９〜２２７(１９９３)。腫瘍壊死因子 （ＴＮＦ）と結合する免疫付着因子もまた開発された。ＴＮＦは、敗血症性ショ ックの主要なメディエーターであることが明らかにされている前炎症性サイトカ インである。敗血症性ショックのマウスモデルに基づいて、ＴＮＦレセプター免 疫付着因子は、敗血症性ショックの処置において臨床的に使用するための候補物 として有望であることが明らかにされた(Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、上記)。免疫付 着因子は、治療以外にもまた使用される。例えば、Ｌ−セレクチンレセプター免 疫付着因子は、末梢リンパ節の高内皮細静脈（ＨＥＶ）の組織化学的染色を行う ための試薬として使用された。この試薬はまた、Ｌ−セレクチンのリガンドを分 離してその特徴づけを行うために使用された(Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、上記)。免 疫付着因子構造の２つのアームが異なる特異性を有する場合、免疫付着因子は、 二重特異性抗体に対する類推によって「二重特異性免疫付着因子」と呼ばれる。 Ｄｉｅｔｓｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６２：１２３（１ ９９３）は、接着分子（Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチン）の細胞外ドメイ ンを併せ持つそのような二重特異性免疫付着因子を記載する。結合性の研究によ り、そのようにして得られた二重特異性免疫グロブリン融合タンパク質は、それ が誘導された単一特異性の免疫付着因子と比較して、骨髄様細胞株に対する結合 能か高まったことが示された。 抗体−免疫付着因子のキメラ 抗体−免疫付着因子（Ａｂ／Ｔａ）キメラもまた文献に記載されている。この ような分子は、免疫付着因子の結合領域を抗体の結合ドメインとともに併せ持つ 。 Ｂｅｒｇら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：４７２３〜４７２７（１９９１）は、 マウスのＣＤ４−ＩｇＧから誘導された二重特異性の抗体−免疫付着因子キメラ を作製した。この研究者らは、２つのアームを有する四量体分子を構築した。一 方のアームは、抗体軽鎖の定常ドメインと融合したＣＤ４とともに、抗体重鎖の 定常ドメインと融合したＣＤ４からなった。もう一方のアームは、抗ＣＤ３抗体 の完全な軽鎖とともに、抗ＣＤ３抗体の完全な重鎖からなった。ＣＤ４−ＩｇＧ のアームによって、この二重特異性分子は、細胞傷害性Ｔ細胞の表面にあるＣＤ ３に結合する。細胞傷害性細胞およびＨＩＶ感染細胞を一緒にすると、ＨＩＶ感 染細胞が特異的に殺傷される。 Ｂｅｒｇら（上記）は四量体構造の二重特異性分子を記載しているが、１個の ＣＤ４−ＩｇＧ融合体のみを含有するトリマーのハイブリッド分子を作製するこ とができる。Ｃｈａｍｏｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４２６８（１９９ ４）を参照。この構築物の第１のアームは、ヒト化された抗ＣＤ３κ軽鎖および ヒト化された抗ＣＤ３γ重鎖によって形成される。第２のアームは、ＩｇＧのＦ ｃドメインによるｇｐ１２０の結合を担うＣＤ４の細胞外ドメインの一部を併せ 持つＣＤ４−ＩｇＧ免疫付着因子である。得られるＡｂ／Ｉａキメラは、ＨＩＶ 感染細胞の殺傷を、純粋な細胞傷害性Ｔ細胞調製物、またはＦｃレセプターを産 生する大顆粒状リンパ球エフェクター細胞をさらに含む全末梢血リンパ球（ＰＢ Ｌ）画分のいずれかを使用して媒介した。 多重特異性抗体ヘテロマルチマーの製造においては、ホモマルチマーよりも、 所望のヘテロマルチマーの産生を増大させることが望ましい。Ｆｃ含有のＢｓＡ ｂを得るために選択される現在の方法は、依然として、２つの抗体を同時に発現 するハイブリッドハイブリドーマである(ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ 、Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７〜５４０(１９８３))。 ハイブリッドハイブリドーマにおいて、重（Ｈ）鎖は、典型的には、所望のヘ テロダイマーと同様に、ホモダイマーを形成する。さらに、軽（Ｌ）鎖は、同系 でない重鎖との誤った対形成を形成することが多い。従って、２つの抗体が同時 に発現すると、重鎖および軽鎖の１０個までの対形成が生じ得る(Ｓｕｒｅｓｈ ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：２１０〜２２８(１ ９８６))。これらの望ましくない鎖の対形成は、ＢｓＡｂの産生を低下させ、そ して重大で、ときには克服できない精製問題を必然的に強いる(Ｓｍｉｔｈら(１ ９９２)上記、およびＭａｓｓｉｍｏら（１９９７）上記)。 抗体重鎖は、立体的に相補的な変異をマルチマー化ドメインのＣ_H３ドメイン 界面に導入することによるヘテロダイマー化(Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉ ｎＥｎｇ．９：６１７〜６２１(１９９６))、および本明細書中に記載されるフ ァージディスプレーによる最適化を行うために以前に操作されている。改変され たＣ_H３ドメインを含有する鎖によって、抗体／免疫付着因子ハイブリッド（Ａ ｂ／Ｉａ）の生成により判断されるように、約９０％までのヘテロダイマーが生 じる。ヘテロダイマー化した重鎖は、依然として、同系でない軽鎖との誤った対 形成を形成し得るので、目的のＢｓＡｂの回収が妨げられる。 発明の要旨 本出願は、モノマー混合物から所望するヘテロマルチマー二重特異性抗体の形 成を高めるのに役立つ方法を記載する。この方法は、共通する可変軽鎖を提供し て二重特異性抗体のヘテロマーの各可変重鎖領域と相互作用させることによるヘ テロオリゴマー化のために第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の界 面を操作することによる。３つの可能なヘテロマルチマーおよびホモマルチマー が、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドから形成され得る。そのよう なポリペプチドのそれぞれは、同様に、第１の軽鎖および第２の軽鎖とそれぞれ 会合する。これにより、鎖の対形成は合計で１０通りが可能である(図１Ａ)。所 望のヘテロマルチマー形成を高める方法によって、その産生を、望ましくないヘ テロマルチマーおよびホモマルチマーよりも大きく高めることができる。 ヘテロマルチマー抗体の第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の好 ましい界面は、抗体の定常ドメインのＣ_H３ドメインの少なくとも一部を含む。 界面で相互作用する第１および第２の各ポリペプチドのドメインは、マルチマー 化ドメインと呼ばれる。マルチマー化ドメインは、好ましくは、特定の第１のポ リペプチドと第２のポリペプチドとの問の相互作用を促進し、それによって所望 のヘテロマルチマーの産生を増大させる(図１Ｂ)。相互作用は、空洞への隆起(p rotuberance-into-cavity)の相補的な領域の形成；天然に存在しないジスルフィ ド結合の形成；ロイシンジッパー；疎水性領域；および親水性領域によって接触 面で促進され得る。「隆起」(protuberance)は、第１のポリペプチドの界面に由 来する小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプ トフ ァン）と置換することによって構築される。隆起と同一の大きさまたは類似する 大きさの代替的な「空洞」(cavity)は、任意に、大きなアミノ酸側鎖を、より小 さな側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）と置換することによって第２の ポリペプチドの界面に作製される。適切に配置され、そして適切な大きさを有す る隆起または空洞が第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのいずれかの 界面に存在する場合、隣接する接触面において、それぞれ、対応する空洞または 隆起の設計が必要とされるだけである。天然に存在しないジスルフィド結合は、 第１のポリペプチドにおいて、天然に存在するアミノ酸を、システインなどの遊 離チオールを含有する残基と置換して、遊離チオールが第２のポリペプチドの別 の遊離チオール含有側鎖と相互作用し、そしてジスルフィド結合が第１のポリペ プチドと第２のポリペプチドとの間で形成されるようにすることによって構築さ れる(図１Ｂ)。 大きな非免疫化ファージディスプレーライブラリー(Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９〜 ３１４、これは参考としてその全体が本明細書中に組込まれる）に由来する単鎖 Ｆｖフラグメントは、Ｖ-遺伝子の使用を明らかにした。この場合、いくつかの 生殖系列のＶ-遺伝子セグメントに由来するＶ_H配列およびＶ_L配列が優勢であり 、ファミリーがレパートリーにおいて優勢であった。異なるパートナー鎖との組 合せで特定の重鎖または軽鎖が見出されるレパートリーにおいて、鎖の入り交じ った状態の例が認められた(Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ら（１９９６）上記)。 所望するヘテロマルチマー多重特異性抗体の調製は、共通する軽鎖が多重特異 性抗体の可変重鎖のそれぞれと対形成するように提供される場合に増強されるこ とが本明細書中に開示される。共通する可変軽鎖の使用によって、抗原結合ドメ インを形成するために正しく対形成しなければならないモノマーの数が減少する 。これは、軽鎖の数を、（本発明が開示される前の二重特異性抗体または多重特 異性抗体のそれぞれにおける）２つ以上の軽鎖から、（本発明の多重特異性抗体 （図１Ｃを参照）における）１つの軽鎖に制限することによる。 従って、本発明は、ヘテロマルチマー多重特異性抗体を調製する方法に関する 。この抗体は、下記の１）および２）を含む：１）界面で接する第１のポリペプ チ ドおよび第２のポリペプチド(および抗体の多重度に従ってさらなるポリペプチ ド)、ただし、第１のポリペプチドおよびさらなるポリペプチド（または、第１ のポリペプチドおよび第２のポリペプチド）のそれぞれは、第１のポリペプチド と第２の（または、少なくとも１つのさらなる）ポリペプチドとの間の界面を形 成するマルチマー化ドメインを含み、そしてこのマルチマー化ドメインは、第１ のポリペプチドとさらなるポリペプチドとの間の安定な相互作用を促進する；お よび２）前記の第１のポリペプチドおよび少なくとも１つのさらなるポリペプチ ド（または、第２のポリペプチド）のそれぞれの結合ドメイン、ただし、各結合 ドメインは可変重鎖および可変軽鎖を含み、第１のポリペプチドの可変軽鎖およ び第２のポリペプチドの可変軽鎖は共通するアミノ酸配列を有し、そしてそのよ うな共通する配列は、前記ポリペプチドのそれぞれの元の軽鎖に対して、少なく とも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、 最も好ましくは１００％の配列同一性のアミノ酸配列同一性を有する。この方法 は下記の工程を含む： （ｉ）第１のポリペプチド、第２のポリペプチドおよび共通する軽鎖をコード する核酸を含む宿主細胞を培養し、この培養によって核酸を発現させる工程；お よび （ｉｉ）宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収する工程。 本発明の関連する実施態様において、第１のポリペプチドをコードする核酸ま たは第２のポリペプチドをコードする核酸、あるいはその両方は、その界面また はその一部をコードするように元の核酸から変更されている。 本発明の方法の別の実施態様において、第１のポリペプチドの界面は、第２の ポリペプチドの界面の遊離チオール含有残基と相互作用するように配置され、そ うすることによってジスルフィド結合が第１のポリペプチドと第２のポリペプチ ドとの間で形成される遊離チオール含有残基を含む。本発明により、第１のポリ ペプチドをコードする核酸は、遊離チオール含有残基をコードするように元の核 酸から変更され、あるいは第２のポリペプチドをコードする核酸は、遊離チオー ル含有残基をコードするように元の核酸から変更され、あるいはその両方である 。 本発明の方法の別の実施態様において、第１のポリペプチドおよび少なくとも １つのさらなるポリペプチド（または、第２のポリペプチド）の両方をコードす る核酸は、それぞれ、隆起および空洞をコードするように変更されている。第１ のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、それぞれ、好ましくは、ヒトＩｇ Ｇ₁のＣ_H３ドメインなどの抗体の定常ドメインを含む。 別の態様において、本発明は、界面で接する第１のポリペプチドおよび第２の ポリペプチドを含むヘテロマルチマー（二重特異性抗体、二重特異性免疫付着因 子または抗体／免疫付着因子キメラなど）を提供する。第１のポリペプチドの界 面は、少なくとも１つのさらなるポリペプチド（または、第２のポリペプチド） 上のマルチマー化ドメインと相互作用するように配置されて、第１のポリペプチ ドと第２のポリペプチドとの界面を形成するマルチマー化ドメインを含む。本発 明の好ましい実施態様において、マルチマー化ドメインは、特定の第１のポリペ プチドと特定の第２のポリペプチドとの間の相互作用が促進されるように変更さ れる。そのような変更には、隆起または空洞あるいはその両方の生成；天然に存 在しないジスルフィド結合の生成；相補的な疎水性領域；および相補的な親水性 領域の生成が含まれるが、これらに限定されない。ヘテロマルチマー多重特異性 抗体は、薬学的に受容可能な担体をさらに含む組成物の形態で提供され得る。 本発明はまた、前記のヘテロマルチマー多重特異性抗体をコードする核酸を含 む宿主細胞に関する：この場合、第１のポリペプチドおよび少なくとも１つのさ らなるポリペプチド（または、第２のポリペプチド）をコードするこの核酸は、 １つのベクターまたは別個のベクターに存在する。宿主細胞は、ヘテロマルチマ ー多重特異性抗体を作製する方法で使用することができる。この方法は、核酸を 発現するように宿主細胞を培養すること、およびその細胞培養物からヘテロマル チマー抗体を回収することを含む。 さらなる態様において、本発明は、ヘテロマルチマー多重特異性抗体を調製す る方法を提供し、この方法は下記の工程を含む： （ａ）少なくとも１つのさらなるポリペプチドの界面のアミノ酸と相互作用す るように配置されているアミノ酸残基を第１のポリペプチドの界面に含む第１の ポリペプチドをコードする第１の核酸を選択する工程。実施態様において、核酸 は、相互作用するアミノ酸残基をコードするように元の核酸から変更されている 。 別の実施態様において、第１の核酸は、より大きな側鎖容量を有するアミノ酸を コードするように変更され、それによって、隆起か第１のポリペプチドに形成さ れる； （ｂ）第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を変更し、その結果、第２ のポリペプチドの界面内のアミノ酸残基を、より小さな側鎖容量を有するアミノ 酸残基と置換し、それによって、第２のポリペプチドに空洞を形成させる工程。 この場合、前記の隆起は、この空洞と相互作用するように配置される； （ｃ）前記の第１の核酸および第２の核酸を宿主細胞に導入して、前記の第１ の核酸および第２の核酸が発現されるように宿主細胞を培養する工程；および （ｄ）細胞培養物から生成したヘテロマルチマー抗体を回収する工程。 前記の抗体が組み込まれた多重特性抗体（二重特異性抗体など）を構築するこ ともまた望ましいことであり得る。このような状況下では、元の軽鎖と対形成す る場合、目的の第２の抗原に特異的に結合する重鎖を同定することは望ましい。 Ｆｉｇｉｎｉらの方法（Ｆｉｇｉｎｉ，Ｍ．ら（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ ｌ．２３９：６８〜７８、これは参考としてその全体が本明細書中に組込まれる ）を使用して、そのような重鎖を同定することができる。最初に、ファージライ ブラリーをグアニジン塩酸で処理して、元の軽鎖を解離させる。次に、ファージ にディスプレーされた重鎖を、（透析などにより）変性剤を除くことによって目 的の軽鎖と再構成させる。次いで、目的の第２の抗原に対して選別を行い、所望 の重鎖を同定する。本発明はさらに、選択された軽鎖と対形成するように重鎖を 選択するこの方法によって調製される多重特異性抗体、そのような抗体をコード する核酸、およびそのような核酸を含む宿主細胞を含む。 本発明は、望ましくないヘテロマルチマーおよび／またはホモマルチマーなど の他の望ましくない最終産物よりもヘテロマルチマーの産生を増大させるための 機構を提供する(図１Ａ〜図１Ｃを参照)。組換え細胞の培養物から回収される所 望のヘテロマルチマーの産生量は、好ましくは、副生成物の望ましくないヘテロ ダイマーまたはホモマルチマーと比較して、少なくとも８０重量％を超え、好ま しくは少なくとも９０重量％を超える。 図面の簡単な説明 図１Ａ〜図１Ｃ。図１Ａは、ホモマルチマー化よりもヘテロマルチマー化を増 強させるための操作が行われない場合において、Ｆｃを含有する二重特異性抗体 の形成を示す略図である。図１Ｂは、所望のヘテロマルチマー化が、望ましくな いヘテロマルチマー化およびホモマルチマー化よりも好ましいように、重（Ｈ） 鎖が操作される場合に生じる対形成を示す略図である。図１Ｃは、同じ軽（Ｌ） 鎖を有する抗体を選択して、同系でない重鎖と対形成する軽鎖の問題が回避され る場合に生じる対形成を示す略図である。 図２Ａ〜図２Ｃ。図２Ａは、ファージディスプレーベクターｐＲＡ２を使用す るＣ_H３ヘテロダイマーの選択反応図式を図示する。安定なＣ_H３ヘテロダイマー をディスプレーするファージは、ｇＤフラッグに対する抗体を使用して捕獲され る。図２Ｂは、合成された遺伝子から発現されるＣ_H３が、Ｍ１３の遺伝子ＩＩ Ｉタンパク質との融合タンパク質として、天然の遺伝子（Ｅｌｌｉｓｏｎら、Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１〜４０７９(１９８２)）か ら発現されるＣ_H３の第２の複製物とともに同時に分泌されるジシストロン性オ ペロンを図示する。合成されたＣ_H３遺伝子は、単純ヘルペスウイルスの糖タン パク質Ｄから誘導されるペプチド(ｇＤフラッグ、Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．および Ｄｏｗｂｅｎｋｏ，Ｄ．Ｊ．(１９８４)ＤＮＡ ３：２３〜２９；Ｂｅｒｍａｎ ，Ｐ．Ｗ．ら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１４９０〜１４９２)、お よび部位特異的なプロテアーゼのケネナーゼ（Ｇｅｎｅｎａｓｅ）Ｊの開裂（Ｇ ）部位（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら（１９８９）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕ ｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：２４０〜２４８）の 上流に置かれる。図２Ｃは、翻訳されるＣ_H３遺伝子の残基に、Ｋａｂａｔらの Ｅｕ方式に従って番号を付けた図２Ｂのジシストロン性オペロンの核酸配列（配 列番号２）である。「免疫学的に関心が持たれるタンパク質の配列」、第５版、第 １巻、６８８〜６９６頁、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ(１９９１)。隆起の 変異Ｔ３６６Ｗを示す。そのような残基は、天然のＣ_H３遺伝子における無作為 化のために標的化される(３６６、３６８および４０７)。 図３Ａ〜図３Ｃ。図３Ａおよび図３Ｂは、免疫付着因子(Ia)とともに抗体(Ab) の重鎖および軽鎖の共-移入から得られるプロテインＡ精製された生成物のＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥをデンシトメトリー分析で走査した結果の棒グラフである。示した データは、２つの独立した実験の平均である。ｘ軸は、投入したＤＮＡの質量比 （Ｉａ：Ｈ：Ｌ）を示し、ｙ軸は、全生成物タンパク質に対する生成物マルチマ ーの各タイプの割合を示す。図３Ｃは、可能な生成物マルチマーを図示する。 図４は、Ａｘ１、Ｒｓｅ、ＩｇＥＲ、Ｏｂ−ＲおよびＶＥＧＦに対する特異性 を有する８個の異なる抗体のＶ_L配列の比較である。配列定義（Ｋａｂａｔら（ １９９１）上記）または構造定義（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ，Ａ． Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７）１９６：９０１〜９１７）に従った抗 原結合ＣＤＲ残基の位置を、それぞれ、下線および＃によって示す。Ａｘ１．７ ８配列と異なる残基を二重下線によって示す。 図５は、選択された抗Ｏｂ−Ｒクローンおよび抗ＨＥＲ３クローンの重鎖およ び軽鎖の比較である。二重特異性抗体の構築に使用した抗Ｏｂ-Ｒクローン２６ および抗ＨＥＲ３クローン１８のＶ_H配列および共通するＶ_L配列を示す。 図６。Ｍｐｌ−ＩｇＧおよびＨＥＲ３−ＩｇＧに対する同時結合を検出するた めのサンドイッチＥＬＴＳＡ。試験した抗体は、Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３ ６８Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６’Ｗ：Ｓ３５４’Ｃの変異を含有する抗Ｍｐｌ× 抗ＨＥＲ３のＢｓＩｇＧであり、Ｆｃ領域を変異させた対応する元の抗Ｍｐｌま たは抗ＨＥＲ３のＩｇＧとともに使用した。 図７は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の研究結果の棒グラフで ある。ＡＤＣＣは、変異型（Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９’Ｃ：Ｔ３６６ ’Ｓ：Ｌ３６８’Ａ：Ｙ４Ｏ７’Ｖ）または野生型のＦｃあるいはアイソタイプ が一致するコントロール抗体（Ｅ２５、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．ら（１９９３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３〜２６３２）のいずれかを含有するｈｕ ＭＡｂ４Ｄ５−５（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら（１９９２）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９ ：４２８５〜４２８９）によって媒介された。抗体（１２５ｎｇ／ｍｌ）を、ヒ ト末梢血単核エフェクター細胞およびＳＫ−ＢＲ−３標的細胞とともに示した比 でインキュベーションした。示したデータは、３連の測定値および３つの異なる 実験の平均である。 図８は、ＨＥＲ３に対して生起された抗体の軽鎖とＯｂ−Ｒに対して生起され た抗体の軽鎖との間のアミノ酸配列同一性を示す行列である。配列同一性が１０ ０％である軽鎖を有する抗体を黒四角に示す。配列同一性が９８％〜９９％であ る軽鎖を有する抗体を白四角に示す。抗体クローンの同一性を行列の下部に示す 。 Ｉ．定義 一般に、下記の用語または表現は、本説明、実施例および請求項において使用 される場合には下記の意味を有する。 「ヘテロマルチマー」，「ヘテロマルチマーポリペプチド」または「ヘテロマル チマー多重特異性抗体」は、少なくとも、第１のポリペプチドおよび第２のポリ ペプチドを含む分子である。この場合、第２のポリペプチドは、アミノ酸配列に おいて、第１のポリペプチドと少なくとも１個のアミノ酸残基が異なる。ヘテロ マルチマーは、少なくとも２つの異なるリガンドに対する複数の結合特異性また は結合部位を有する。好ましくは、ヘテロマルチマーは、第１のポリペプチドお よび第２のポリペプチドによって形成される「ヘテロダイマー」を含むことがで き、あるいはポリペプチドが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド以 外に、さらに存在する場合には、より高次の三次構造を形成することができる。 ヘテロマルチマーに関する例示的な構造には、ヘテロダイマー(例えば、Ｄｉｅ ｔｓｃｈら（上記）によって記載される二重特異性免疫付着因子)、ヘテロトリ マー(例えば、Ｃｈａｍｏｗら（上記）によって記載されるＡｂ／Ｉａキメラ)、 ヘテロ四量体（例えば二重特異性抗体）及び更なるオリゴマー構造が含まれる。 本明細書中で使用されている「マルチマー化ドメイン」は、ヘテロマルチマー の各ポリペプチドの領域をいう。「マルチマー化ドメイン」は、ヘテロマルチマ ー複合体内のキメラ分子の安定な相互作用を促進する。マルチマー化ドメインは 、好ましくは、特定の第１のポリペプチドと特定の第２のポリペプチドとの間の 相互作用を促進し、それによって所望のヘテロマルチマーの形成が増強され、そ して望ましくないヘテロマルチマーまたはホモマルチマーの形成の可能性が実質 的に低下する。マルチマー化ドメインは、免疫グロブリン配列、ロイシンジッパ ー、疎水性領域、親水性領域、またはキメラなヘテロマルチマーのキメラ分子間 での 分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを介して相互作用することがで きる。遊離チオールは、ポリペプチド間のジスルフィド結合の形成を可能にする 位置において、ポリペプチドの天然に存在する残基を、例えば、システインと置 換することによって１つまたは複数の相互作用ポリペプチドの界面に導入するこ とができる。マルチマー化ドメインは、免疫グロブリンの定常部を含むことがで きる。本発明において有用で可能なマルチマー化ドメインが、ハイブリッドの免 疫グロブリンを記載する国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６８４９号（これ は参考としてその全体が本明細書中に組込まれる）に開示されている。さらに、 マルチマー化ドメインは、立体的な相互作用によって、安定な相互作用が促進さ れるだけでなく、モノマーの混合物に由来するホモダイマーよりもヘテロダイマ ーの形成がさらに促進されるように設計することができる。例えば、国際特許出 願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１５９８号（これは参考としてその全体が本明細書中 に組込まれる）を参照。これは、ヘテロオリゴマー化のために第１のポリペプチ ドと第２のポリペプチドとの間の相互作用に関する「空洞への隆起」法を開示す る。「隆起」は、第１のポリペプチドの界面に由来する小さなアミノ酸側鎖を、 より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置換することによ って構築される。隆起と同一の大きさまたは類似する大きさの代償的な「空洞」 は、任意に、大きなアミノ酸側鎖を、より小さな側鎖（例えば、アラニンまたは トレオニン）と置換することによって第２のポリペプチドの界面に作製される。 免疫グロブリン配列は、免疫グロブリンの定常ドメインであることが好ましいが 、必ずしも、免疫グロブリンの定常ドメインである必要はない。本発明のキメラ における免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃またはＩｇＧ₄のサ ブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得ることができるが、Ｉｇ Ｇ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃またはＩｇＧ₄が好ましい。 「遊離チオール含有化合物」は、本発明のポリペプチド界面のアミノ酸に組み 込むことができるが、またはそのようなアミノ酸と反応することができる化合物 であって、この化合物の遊離チオール部分は、本発明のさらなるポリペプチドの 界面において遊離チオール部分と相互作用して、ジスルフィド結合が形成される ように配置されているそのような化合物を意味する。遊離チオール含有化合物は 、 好ましくは、システインである。 用語「標識されたエピトープ」は、本明細書で使用される場合、「標識ポリペ プチド」に融合したキメラなヘテロ付着因子の全体またはそのフラグメントを含 むキメラなポリペプチドを示す。標識ポリペプチドは、抗体が作製され得るエピ トープを提供するのに十分な残基を有するが、キメラなヘテロ付着因子の活性を 妨げないように十分に短い。標識ポリペプチドは、好ましくは、他にないほど非 常に特徴的であり、その結果、それに対する抗体は、他のエピトープと実質的に 交差反応しない。適切な標識ポリペプチドは、一般には、少なくとも６個のアミ ノ酸残基を有し、通常は、８個〜５０個の間のアミノ酸残基（好ましくは、約９ 残基〜３０残基の間）を有する。本発明の実施態様は、エピトープ標識に結合し たキメラなヘテロ付着因子を含み、そのような標識を使用して、サンプル中の付 着因子の検出またはサンプルからの付着因子の回収が行われる。 本明細書中で使用されている「共通する軽鎖」または「軽鎖の共通するアミノ 酸配列」は、本発明の多重特異性抗体における軽鎖のアミノ酸配列をいう。抗体 パネルが、ファージディスプレーライブラリーの選別を行うことによって、少な くとも２つの異なる抗原に対して作製された。そのようなファージディスプレー ライブラリーは、例えば、Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）(上記)により記載され ている(これは、ファージミドライブラリーを選択する方法を特に参照して、参 考としてその全体が本明細書中に組込まれる)。軽鎖配列を、可変軽鎖アミノ酸 配列に関して比較した。比較されたパネルに由来する有用な軽鎖は、少なくとも ８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も 好ましくは１００％の同一性のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖である。共通す る軽鎖配列は、比較された２つの軽鎖配列が近似するように考えられた配列であ る。比較される軽鎖が、アミノ酸レベルで１００％の配列同一性である場合、共 通する軽鎖は、軽鎖が多重特異性抗体の異なる結合ドメインにおいて機能すると して、選択されたライブラリーのクローンに由来する軽鎖と同一である。比較さ れる軽鎖が上記と異なる場合、共通する軽鎖は、ライブラリーのクローンに由来 する比較される軽鎖の１つまたはもう一方、あるいはその両方と異なり得る。共 通する軽鎖が、ライブラリーのクローンの１つまたはもう一方と、あるいはそ の両方と異なる場合、異なる残基は、抗体軽鎖の抗原結合ＣＤＲ残基の外側に存 在することが好ましい。例えば、抗原結合ＣＤＲ残基の位置は、配列定義（Ｋａ ｂａｔら（１９９１）上記）または構造定義（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ( １９８７)Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７）に従って決定する ことができる。 本明細書中で用いている「アミノ酸配列同一性」は、１つの配列のアミノ酸が 第２のアミノ酸配列のアミノ酸とどのくらい同じであるかの割合をいう。ポリペ プチド鎖の間において１００％の配列同一性は、鎖が同一であることを意味する 。 本明細書中で使用されている「ポリペプチド」は、一般に、約１０個よりも多 いアミノ酸を有するペプチドおよびタンパク質をいう。好ましくは、哺乳動物の ポリペプチド（哺乳生物から最初に得られたポリペプチド）が使用され、より好 ましくは、培地に直接分泌されるポリペプチドである。細菌のポリペプチドの例 には、例えば、アルカリホスファターゼおよびβ−ラクタマーゼが含まれる。哺 乳動物のポリペプチドの例には、レニン、成長ホルモンなどの分子が含まれ、下 記が含まれる：ヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子； 副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１抗トリプシン ；インシュリンＡ鎖；インシュリンＢ鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン ；カルシトニン；黄体化ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子 、組織因子およびフォンビルブランド因子などの凝固因子；プロテインＣなどの 抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺接触面活性物質；ウロキナーゼまた はヒトウリンまたは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ｐＡ）などのプラ スミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因 子−αおよび腫瘍壊死因子−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ(ｒｅｇｕ ｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ)；ヒトマクロファージ炎症タ ンパク質(ＭＩＰＩ−１−α)；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュ ーラー阻害物質；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウス性 腺刺激ホルモン関連ペプチド；β−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮ ａｓｅ；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)；ホルモ ンまたは成長（増殖）因子のレセプター；インテグリン；プロテインＡまたはプ ロテインＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)、ニューロトロフィ ン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５またはニューロトロ フィン−６(ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６)、あるいはＮＧＦ− βなどの神経増殖因子などの神経栄養因子；血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)；ａ ＦＧＦおよびｂＦＧＦなどの繊維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；Ｔ ＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を 含むＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどのトランスホーミング増殖因子(ＴＧＦ)； インシュリン様増殖因子−Ｉおよびインシュリン様増殖因子−ＩＩ(ＩＧＦ−Ｉ およびＩＧＦ−ＩＩ)；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ(脳ＩＧＦ−Ｉ)、インシ ュリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ− １９などのＣＤタンパク質；エリスロポイエチン；骨誘導因子；イムノトキシン ；骨形態形成タンパク質(ＢＭＰ)；インターフェロン−α、インターフェロン− βおよびインターフェロン−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（Ｃ ＳＦ）類、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイ キン（ＩＬ）類、例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムタ ーゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えば、ＡＩＤＳ エンベロープの一部などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミングレセプタ ー；アドレシン；調節タンパク質；抗体；および上記のポリペプチドのいずれか のフラグメント。 「第１のポリペプチド」は、第２のポリペプチドと会合し得る任意のポリペプ チドである。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、「界面」(下記 において定義)で接する。界面に加えて、第１のポリペプチドは、「結合ドメイ ン」(例えば、抗体の可変ドメイン、レセプター結合ドメイン、リガンド結合ド メインまたは酵素活性ドメイン)、またはＣ_H２、Ｃ_H１およびＣ_Lドメインを含む 抗体の定常ドメイン（またはその一部）などのさらなるドメインを１つまたは複 数含むことができる。通常、第１のポリペプチドは、抗体から誘導される少なく とも１つのドメインを含む。このようなドメインは、好都合なことに、抗体のＣ_H ３ドメインなどの定常ドメインであり、第１のポリペプチドの界面を形成す ることができる。例示的な第１のポリペプチドには下記が含まれる。抗体重鎖ポ リペプチド、異種ポリペプチドの結合ドメインとともに抗体の定常ドメインを併 せ持つキメラ(すなわち、免疫付着因子、下記の定義を参照)、レセプターポリペ プチド(特に、別のレセプターポリペプチド、例えば、インターロイキン−８レ セプター（ＩＬ−８Ｒ）およびインテグリンヘテロダイマー（例えば、ＬＦＡ− ＩまたはＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ）とダイマーを形成するポリペプチド)、リガ ンドポリペプチド(例えば、神経増殖因子(ＮＧＦ)、ニューロトロフィン−３（ ＮＴ−３）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）−Ａｒａｋａｗａら、Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９(４５)：２７８３３〜２７８３９（１９９４）および Ｒａｄｚｉｅｊｅｗｓｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２(４８)：１３５０(１９９ ３))、および抗体の可変ドメインポリペプチド(例えば、ジアボディ(ｄｉａｂｏ ｄｙ))。好ましい第１のポリペプチドは、免疫グロブリンの定常ドメインに融合 した抗体の重鎖から選択され、この場合、定常ドメインは、本発明の第２のポリ ペプチドとの優先的な相互作用が促進されるように変更されている。 「第２のポリペプチド」は、「界面」を介して第１のポリペプチドと会合し得 る任意のポリペプチドである。界面に加えて、第２のポリペプチドは、「結合ド メイン」(例えば、抗体の可変ドメイン、レセプター結合ドメイン、リガンド結 合ドメイン、または酵素活性ドメイン)、またはＣ_H２ドメイン、Ｃ_H１ドメイン およびＣ_Lドメインを含む抗体の定常ドメイン（または、その一部）などのさら なるドメインを含むことができる。通常、第２のポリペプチドは、抗体から誘導 される少なくとも１つのドメインを含む。このようなドメインは、好都合なこと に、抗体のＣ_H３ドメインなどの定常領域であり、第２のポリペプチドの界面を 形成することができる。例示的な第２のポリペプチドには下記が含まれる。抗体 重鎖ポリペプチド、異種ポリペプチドの結合ドメインとともに抗体の定常ドメイ ンを併せ持つキメラ(すなわち、免疫付着因子、下記の定義を参照)、レセプター ポリペプチド(特に、別のレセプターポリペプチド、例えば、インターロイキン −８レセプター（ＩＬ−８Ｒ）およびインテグリンヘテロダイマー（例えば、Ｌ ＦＡ−ＩまたはＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ）とダイマーを形成するポリペプチド) 、リガンドポリペプチド(例えば、神経増殖因子(ＮＧＦ)、ニューロトロ フィン−３（ＮＴ−３）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）−Ａｒａｋａｗ ａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９(４５)：２７８３３〜２７８３９（１９ ９４）およびＲａｄｚｉｅｊｅｗｓｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２(４８)：１３ ５０(１９９３))、および抗体の可変ドメインポリペプチド(例えば、ジアボディ )。好ましい第２のポリペプチドは、免疫グロブリンの定常ドメインに融合した 抗体の重鎖から選択されこの場合、この場合、定常ドメインは、本発明の第１の ポリペプチドとの優先的な相互作用が促進されるように変更されている。 「結合ドメイン」は、目的の分子（例えば、抗体、リガンド、レセプター、基 質または阻害剤）との選択的な結合を担うポリペプチドの任意の領域を含む。例 示的な結合ドメインには、抗体の可変ドメイン、レセプター結合ドメイン、リガ ンド結合ドメインおよび酵素活性ドメインが含まれる。好ましい実施態様におい て、結合ドメインは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖を含む。本発明の二重特 異性抗体およびその作製方法により、二重特異性抗体の各結合ドメインに関する 軽鎖は、共通する軽鎖であり、それによって重鎖および軽鎖の誤った対形成が存 在する望ましくないヘテロマルチマーの形成が避けられる。 用語「抗体」は、それが本発明に関連する場合、目的の抗原のエピトープと結 合するドメインを１つまたは複数含有するポリペプチドを意味するものとする。 この場合、そのようなドメインは、抗体の可変部から誘導されるか、または抗体 の可変部との配列同一性を有する。抗体の例には、全長の抗体、抗体フラグメン ト、単鎖分子、二重特異性分子または二機能性分子、ジアボディー、キメラ抗体 （例えば、ヒト化抗体およびＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ^TM抗体）および免疫付着因子 が含まれる。「抗体フラグメント」には、Ｆｖ、Ｆｖ'、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およ びＦ（ａｂ'）₂のフラグメントが含まれる。 「ヒト化(された)」形態の非ヒト（例えば、齧歯類または霊長類）抗体は、非 ヒト免疫グロブリンから誘導される最小の配列を含有する特異的でキメラな免疫 グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントである。その大部分にお いて、ヒト化抗体は、受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所 望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは霊長類 などの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって置き換えられて いるヒト免疫グロブリン（受容体抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロ ブリンのＦｖ枠組み構造領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き 換えられる。さらに、ヒト化抗体は、受容体抗体あるいは持ち込まれたＣＤＲ配 列または枠組み構造配列のいずれにおいて見出されない残基を含むことができる 。このような改変は、抗体の能力を改良して最大にするために行われる。一般に 、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全 てを含む。そのような可変ドメインにおいて、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全 ては、非ヒトの免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてＦＲ領域の全て又 は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はま た、好ましくは、免疫グロブリンの定常部(Ｆｃ)、典型的には、ヒト免疫グロブ リンの定常部（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合 領域が、目的の抗原でマカク（ｍａｃａｑｕｅ）サルを免疫化することによって 産生される抗体から誘導されるＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ^TM抗体を含む。 「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有 する分子である。そのような分子は、通常、２つの抗原と結合するだけである( すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ)が、三重特異性抗体などのさらなる特異 性を有する抗体も、本明細書中で使用される場合には本発明により含まれる。Ｂ ｓＡｂの例には、腫瘍細胞の抗原に対する一方のアームと、細胞傷害誘引因子分 子に対するもう一方のアームとを有する下記のような二重特異性抗体が含まれる 。例えば、抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ( ＣＤ１６)、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ細胞(１Ｄ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５^HER2、 抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎細胞ガン、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ−３、 抗ＣＤ３／Ｌ−Ｄ１(抗結腸ガン)、抗ＣＤ３／抗メラニン細胞刺激ホルモンアナ ログ、抗ＥＧＦレセプター／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗 ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞付着因子分子（ＮＣＡＭ）／抗Ｃ Ｄ３、抗葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗汎カルシノーマ関連抗原 （ＡＭＯＣ−３１）／抗ＣＤ−３；腫瘍抗原に特異的に結合するアームと、毒素 に結合するアームとを有するＢｓＡｂ、例えば、抗サポリン／抗Ｉｄ−１、抗 ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗Ｃ ＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）／抗ハイブリドー マイディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイドなど；変換酵素によって活 性化されるプロドラッグに対するＢｓＡｂ、例えば、抗ＣＤ３０／抗アルカリホ スファターゼ（これは、マイトマイシンホスフェートプロドラッグのマイトマシ ンアルコールへの変換を触媒する）など；フィブリン溶解剤として使用すること ができるＢｓＡｂ、例えば、抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲン活性化因子 (ｔＰＡ)、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰ Ａ）など；細胞表面レセプターに対して免疫複合体を標的化するためのＢｓＡｂ 、例えば、抗低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）／抗Ｆｃレセプター（例えば、Ｆ ｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩ）など；感染性疾患の治療におい て使用されるＢｓＡｂ、例えは、抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)、 抗Ｔ細胞レセプター：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶ など；インビトロまたはインビボで腫瘍を検出するためのＢｓＡｂ、例えば、抗 ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５^HER2／抗ハプテン ；ワクチンアジュバントとしてのＢｓＡｂ(Ｆａｎｇｅｒら（上記）を参照)；お よび診断用具としてのＢｓＡｂ、例えば、抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗ホ ースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン ／抗サブスタンスＰ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗β−ガラクトシダー ゼ（Ｎｏｌａｎら（上記）を参照）など。三重特異性抗体の例には、抗ＣＤ３／ 抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗CＤ３７および抗ＣＤ３／抗Ｃ Ｄ８／抗ＣＤ３７が含まれる。 本明細書中で使用されている用語「免疫付着因子」は、免疫グロブリンの定常 ドメインのエフェクター機能とともに、異種タンパク質（「付着因子」、例えば、 レセプター、リガンドまたは酵素）の「結合ドメイン」を併せ持つ抗体様の分子 を示す。構造的には、免疫付着因子は、抗体の抗原認識部位および結合部位（抗 原結合部位）以外である（すなわち、「異種である」）所望の結合特異性を有する 付着因子のアミノ酸配列と、免疫グロブリンの定常ドメイン配列との融合体を含 む。免疫付着因子における免疫グロブリンの定常ドメイン配列は、ＩｇＧ₁、 ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃もしくはＩｇＧ₄のサブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまた はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。 本明細書中で使用されている用語「リガンド結合ドメイン」は、定量的なリガ ンド結合能、および好ましくは対応する天然のレセプターの生物学的活性を少な くとも保持する任意の天然の細胞表面レセプターまたはその任意の領域もしくは 誘導体をいう。特定の実施態様において、レセプターは、免疫グロブリンスーパ ーファミリーのメンバーと相同的な細胞外ドメインを有する細胞表面ポリペプチ ドに由来する。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーではないが、それ にもかかわらず、この定義によって具体的に含まれる他の代表的なレセプターは 、サイトカインに対するレセプターであり、特にチロシンキナーゼ活性を有する レセプター（レセプターチロシンキナーゼ）であり、そしてヘマトポイエチンお よび神経増殖因子レセプタースーパーファミリーのメンバー、ならびに細胞付着 因子分子、例えは、（Ｅ、ＬおよびＰ−）セレクチンである。 用語「レセプター結合ドメイン」は、定量的なレセプター結合能、および好ま しくは対応する天然のリガンドの生物学的活性を少なくとも保持するレセプター に対する任意の天然のリガンド（細胞付着因子分子を含む）またはその任意の領 域もしくは誘導体を示すために使用される。この定義は、特に、具体的には、上 記のレセプターに対するリガンドに由来する結合配列を含む。 本明細書中で使用されている用語「多重特異性免疫付着因子」は、少なくとも ２つの結合特異性を有する（すなわち、２つ以上の付着因子結合ドメインを併せ 持つ）(上記に定義されている)免疫付着因子を示す。多重特異性免疫付着因子は 、本質的には、国際特許公開第ＷＯ８９／０２９２２号(１９８９年４月６日公 開)、欧州特許ＥＰ３１４，３１７（１９８９年５月３日公開）および米国特許 第５，１１６，９６４号(１９９２年５月２日発行)に開示されているように、ヘ テロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロ四量体として組み立てることができ る。好ましい多重特異性免疫付着因子は二重特異性である。二重特異性免疫付着 因子の例には、ＣＤ４−ＴｇＧ／ＩＮＦレセプター−ＩｇＧおよびＣＤ４−１ｇ Ｇ／Ｌ−セレクチン−ＩｇＧが含まれる。後者の分子は、リンパ球ホーミングレ セプター（ＬＨＲ、Ｌ−セレクチン）のリンパ節結合機能と、ＣＤ４のＨＩＶ 結合機能とを併せ持ち、ＨＩＶ感染、関連する症状の予防または処置において診 断薬としての適用の可能性が見出されている。 「抗体−免疫付着因子キメラ(Ａｂ／Ｉａキメラ)」は、（本出願において定義 されている）少なくとも１つの免疫付着因子とともに、（上記に定義されている ）抗体の少なくとも１つの結合ドメインを併せ持つ分子を含む。例示的なＡｂ／ Ｉａキメラは、Ｂｅｒｇら（上記）およびＣｈａｍｏｗら（上記）によって記載 されている二重特異性ＣＤ４−ＩｇＧキメラである。 「界面」は、第２のポリペプチドの界面内において１つまたは複数の「接触」 アミノ酸残基（または、アミノ酸でない他の基）と相互作用する第１のポリペプ チドにおける「接触」アミノ酸残基（あるいは、炭水化物基、ＮＡＤＨ、ピオチ ン、ＦＡＤまたはヘム基などのアミノ酸でない他の基）を含む。好ましい界面は 、可変ドメインまたは定常ドメイン（またはその領域）などの免疫グロブリンの ドメインである。しかし、ヘテロマルチマーレセプターを形成するポリペプチド 間の界面、またはＮＧＦ、ＮＴ−３およびＢＤＮＦなどの２つ以上のリガンドの 間の界面も、この用語の範囲に含まれる。好ましい界面は、好ましくはＩｇＧ抗 体から誘導され、最も好ましくはヒトＩｇＧ₁抗体から誘導される免疫グロブリ ンのＣ_H３ドメインを含む。 「元の」アミノ酸残基は、元の残基よりも小さな側鎖容量または大きな側鎖容 量を有し得る「移入」残基によって置換されるアミノ酸残基である。移入アミノ 酸残基は、天然存在アミノ酸残基または非天然存在アミノ酸残基であり得るが、 天然存在アミノ酸残基が好ましい。「天然存在」アミノ酸残基は、遺伝暗号によ ってコードされるアミノ酸残基、および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１ ５９８号（これは参考としてその全体が本明細書中に取込まれる）の表１に列記 されるアミノ酸残基である。「非天然存在」アミノ酸残基は、遺伝暗号によって コードされていないが、ポリペプチド鎖で隣のアミノ酸残基と共有結合すること ができる残基を意味する。非天然存在アミノ酸残基の例には、例えば、ノルロイ シン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、およびＥｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１〜３３６（１９９１）に記載されるアミノ酸残基 アナログなどの他のアミノ酸残基のアナログが挙げられる。天然に存在しないそ の ようなアミノ酸残基を作製するために、Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４ ：１８２（１９８９）およびＥｌｌｍａｎら（上記）の方法を使用することがで きる。簡単に記載すると、この方法は、非天然存在アミノ酸残基でサプレッサー ｔＲＮＡを化学的に活性化し、その後、インビトロでＲＮＡの転写および翻訳を 行うことを含む。本発明の方法には、少なくとも１つの元のアミノ酸残基を置換 することが含まれるが、２つ以上の元の残基を置換することができる。通常は、 第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドの界面におけるすべての残基が、 置換される元のアミノ酸残基を含むにすぎない。置換に好ましい残基は「埋もれ ている」。「埋もれている」は、残基が本質的には溶媒と接触できないことを意 味する。移入残基は、好ましくは、酸化または誤ったジスルフィド結合の形成の 可能性を避けるために、システインではない。 「元の核酸」は、アミノ酸側鎖が、第１のポリペプチドと第２のポリペプチド との間で界面で相互作用して、ポリペプチド間の安定な相互作用を促進させるア ミノ酸がマルチマー化ドメイン内でコードされるように変更することができる、 目的のポリペプチドをコードする核酸を意味する。そのような変更によって、空 洞への隆起、天然に存在しないジスルフィド結合、ロイシンジッパー、疎水性相 互作用および親水性相互作用のような安定な相互作用に限定されないが、そのよ うな安定な相互作用を生じさせることができる。このような変更は、好ましくは 、目的とする第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の特異的な相互作 用を促進し、望ましくないヘテロマーの対形成またはホモマーの形成が生じる相 互作用を効果的に除くように選択される。元の核酸または出発核酸は、天然に存 在する核酸であり得るか、または以前に変更が行われた核酸（例えば、ヒト化抗 体フラグメント）を含み得る。核酸を「変更する」は、元の核酸を、目的のアミ ノ酸残基をコードしているコドンの少なくとも１つの挿入、欠失または置換によ る遺伝子操作または変異処理を行うことを意味する。通常、元の残基をコードし ているコドンは、移入残基をコードするコドンによって置換される。このように ＤＮＡを遺伝子的に改変するための技術は、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ Ｐｒ ａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ（１９９１）に総説されており、例えば、部位 特 異的変異誘発法、カセット変異誘発法およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変 異誘発法を含む。 隆起、空洞、または（ジスルフィド結合の形成に必要なシステイン残基などの ）遊離チオールは、合成的手段によって、例えば、組換え技術、インビトロペプ チド合成、前記の天然に存在しないアミノ酸残基を導入するためのそのような技 術、ペプチドの酵素的または化学的な連結、あるいはこれらの技術のいくつかの 組合せによって、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドの界面に「導入 する」ことができる。従って、「導入される」隆起、空洞、または遊離チオール は、「天然に存在しない」、すなわち、「非天然」である。これは、自然界または 元のポリペプチド(例えば、ヒト化モノクローナル抗体)に存在しないことを意味 する。 隆起を形成するために移入アミノ酸残基は、比較的少数（例えば、約３個〜６ 個）の「回転異性体」を有することが好ましい。「回転異性体」は、アミノ酸側 鎖のエネルギー的に有利な立体配座である。様々なアミノ酸残基の回転異性体の 数は、ＰｏｎｄｅｒｓおよびＲｉｃｈａｒｄｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３ ：７７５〜７９１（１９８７）に総説されている。 「分離された」ヘテロマルチマーは、その天然の細胞培養環境の成分からの同 定および分離および／または回収が行われたヘテロマルチマーを意味する。その 天然環境の混入成分は、ヘテロマルチマーに関する診断使用または治療使用を妨 害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク 質性の溶解物を含み得る。好ましい実施態様において、ヘテロマルチマーは、（ １）ローリー法によって測定されるように９５重量％を超えるように、最も好ま しくは９９重量％を超えるように、あるいは（２）スピニングカップ配列決定装 置の使用によって、Ｎ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基が得 られるのに十分な程度に、あるいは（３）クマシーブルー染色、または好ましく は銀染色を使用して、還元条件下または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによ り均一になるまで精製される。 本発明のヘテロマルチマーは、一般には、実質的に均一になるまで精製される 。「実質的に均一」、「実質的に均一な形態」および「実質的な均一性」という表 現は、生成物が、望ましくないポリペプチドの組合せ物に由来する副生成物（例 えば、ホモマルチマー）を実質的に有していないことを示すために使用される。 純度に関して表現される場合、実質的な均一性は、副生成物の量が、１０％を超 えないこと、好ましくは５％未満であること、より好ましくは１％未満であるこ と、最も好ましくは０．５％未満であることを意味する。ただし、割合は重量比 である。 「制御配列」という表現は、特定の宿主生物において、機能的に連結されたコ ード配列を発現させるのに必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切な制御配列 には、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、リボソーム結合 部位、および可能であれば、未だあまりよく理解されていない他の配列が含まれ る。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサ ーを利用することが知られている。 核酸は、核酸が別の核酸配列と機能的な関係におかれている場合に「機能的に 連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダーに関するＤＮＡは、Ｄ ＮＡが、ポリペプチドの分泌に参加しているプロタンパク質として発現される場 合、ポリペプチドに関してＤＮＡに機能的に連結されている；プロモーターまた はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能的 に連結されている；あるいは、リボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にする ように配置されている場合、コード配列に機能的に連結されている。一般に、「 機能的に連結されている」は、連結されているＤＮＡ配列が連続していることを 、そして分泌リーダーの場合には、読み取り相で連続していることを意味する。 しかし、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、都合の良い制限部 位で結合させることによって達成される。そのような部位が存在しない場合、合 成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来的な実施に従って使用 される。 ＩＩ．ヘテロマルチマーの調製 １．出発材料の調製 最初の工程として、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド（およびヘ テロマルチマーを形成する任意のさらなるポリペプチド）が選択される。通常、 これらのポリペプチドをコードする核酸は分離しなければならず、その結果、核 酸は、本明細書中で定義されているように、隆起または空洞またはその両方をコ ードするように変更することができる。しかし、変異は、合成的な手段を使用す ることによって、例えば、ペプチド合成を使用することによって導入することが できる。同様に、移入残基が天然に存在しない残基である場合には、Ｎｏｒｅｎ ら（上記）の方法を、そのような置換を有するポリペブチドを作製するために用 いることができる。さらに、ヘテロマルチマーの一部は、細胞培養で組換え的に 適切に作製され、そのような分子の他の部分は、上記のそのような技術によって 作製される。 抗体の分離および免疫付着因子の調製に関する技法が次に行われる。しかし、 ヘテロマルチマーは、当技術分野で知られている技術を使用して、他のポリペプ チドから形成され得るか、または他のポリペプチドを組み込むことができること が理解される。例えば、目的のポリペプチド（例えば、リガンド、レセプターま たは酵素）をコードする核酸は、ポリペプチドのｍＲＮＡを有し、そのｍＲＮＡ を検出可能なレベルで発現していると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡラ イブラリーから分離することができる。ライブラリーは、目的の遺伝子またはそ れによってコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（例え ば、抗体または約２０塩基〜８０塩基のオリゴヌクレオチドなど）を用いてスク リーニングされる。選択されたプローブによるｃＤＮＡライブラリーまたはゲノ ムライブラリーのスクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒ ｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ ｓ、１９８９）の第１０章〜第１２章に記載される標準的な手順を使用して行う ことができる。 （１）抗体の調製 抗体の産生に関する技術がいくつか記載されている。そのような技術には、モ ノクローナル抗体を作製するための従来のハイブリドーマ法、抗体(キメラ抗体 、例えば、ヒト化抗体を含む)を作製するための組換え技術、トランスジェニッ ク 動物での抗体産生、および「完全なヒト」抗体を調製するために近年記載された ファージディスプレー技術が含まれる。これらの技術を下記に簡単に記載する。 目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、一般には、抗原およびアジュバン トの皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射を多数回行うことによって動物 に生起させることができる。抗原（または、標的アミノ酸配列を含有するフラグ メント）を、免疫化される種において免疫原であるタンパク質（例えば、キーホ ルリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダ イズのトリプシン阻害剤）に、二官能性薬剤または誘導化剤を使用して結合させ ることは有用であり得る。そのような二官能性薬剤または誘導化剤は、例えば、 マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する コンジュゲーション)、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(リシン残基を介する)、 グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ₂、またはＲ¹Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ただ し、ＲおよびＲ¹は異なるアルキル基である）である。動物は、免疫原性のコン ジュゲートまたは誘導体に対して、（ウサギまたはマウスに関して、それぞれ） １ｍｇのコンジュゲートを３容量のフロイント完全アジュバントと一緒にして、 その溶液を皮下に多数の部位に注射することによって免疫化される。１ヶ月後、 動物は、コンジュゲートを含むフロイント完全アジュバントの最初の量の１／５ 〜１／１０を用いて、多数の部位に皮下注射することによって追加免疫される。 ７日〜１４日の後に、動物は採血され、血清を抗体力価についてアッセイする。 動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫される。動物は、好ましくは、同 じ抗原のコンジュゲートで追加免疫されるが、異なるタンパク質に結合させたコ ンジュゲートおよび／または異なる架橋剤によるコンジュゲートで追加免疫され る。コンジュゲートはまた、タンパク質の融合体として、組換え細胞培養で作製 することができる。同様に、ミョウバンなどの凝集化剤を使用して、免疫応答を 増強することができる。 モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって初めて記載されたハイブリドーマ法を使 用して実質的に均一な抗体集団から得られるか、または、組換えＤＮＡ法(Ｃａ ｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号)によって作製することができ る。 ハイブリドーマ法において、マウス、またはハムスターなどの他の適切な宿主動 物を上記のように免疫化して、免疫化のために使用されたタンパク質に特異的に 結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球が誘導される。あるいは 、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次いで、ポリエチレングリ コールなどの適切な融合化剤を使用してリンパ球をミエローマ細胞と融合して、 ハイブリドーマ細胞を得る(Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂ ｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９頁〜１０ ３頁(Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６))。このようにして調製された ハイブリドーマ細胞を、融合していない元のミエローマ細胞の生育または生存を 阻害する物質を１つまたは複数含有することが好ましい適切な培養培地に播種し て、増殖させる。例えば、元のミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホ スホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失している 場合、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の生育を 妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む(ＨＡ Ｔ培地)。好ましいミエローマ細胞は、効率よく融合し、選択された抗体産生細 胞によって抗体の安定で高レベルの発現を維持し、ＨＡＴ培地などの培地に対し て感受性を有するミエローマ細胞である。このような細胞の中で、好ましいミエ ローマ細胞株は、ネズミのミエローマ細胞株であり、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕ ｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇ ｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰ Ｃ−１１のマウス腫瘍から誘導されるミエローマ細胞株、ならびにＡｍｅｒｉｃ ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ(Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ 、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ)から入手可能なＳＰ−２細胞などである。ヒトの ミエローマ細胞株およびマウス−ヒトのヘテロミエローマ細胞株もまた、ヒトの モノクローナル抗体の産生に関して記載されている(Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍ ｕｎｏｌ.、１３３：３００１(１９８４)；およびＢｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏ ｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１頁〜６３頁、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅ ｋｋａｒ，Ｉｎｃ.、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７)。ヒトモノクローナル抗体 の産生技術に関しては、Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.、１４７（１ ）８６：〜９５（１９９１）および国際特許公開第ＷＯ９１／１７７６９号（１ ９９１年１１月２８日公開）もまた参照。ハイブリドーマ細胞が生育する培養培 地は、目的の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。 好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合 特異性は、免疫沈降によって、あるいは放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素 結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって測 定される。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰ ｏｌｌａｎｄのスキャッチャード分析（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２ ２０(１９８０)）によって測定することができる。所望の特異性、親和性および ／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後に、クローン を限界稀釈法によってサブクローニングを行い、標準的な方法によって生育させ ることができる。Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９頁〜１０４頁(Ａｃ ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６)。この目的に適切な培養培地には、例え ば、ダルベッコ改変イーグル培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さ らに、ハイブリドーマ細胞は、動物の体内において腹水腫瘍としてインビボで生 育させることができる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は 、培養培地、腹水または血清から、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒド ロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニテ ィクロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって適切に分離 される。 あるいは、免疫化したときに、内因性の免疫グロブリンを産生することなく、 完全なレパートリーのヒト抗体を産生し得るトランスジェニック動物（例えば、 マウス）の作製が現在可能である。例えば、キメラな生殖系列の変異マウスにお ける抗体の重鎖連結領域（Ｊ_H）遺伝子のホモ接合型欠失によって、内因性の抗 体産生が完全に阻害されることが記載されている。ヒトの生殖系列の免疫グロブ リン遺伝子列をそのような生殖系列の変異マウスに移すことによって、ヒト抗体 が、抗原を投与したときに産生する。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１〜２５５（１９９３ ）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５〜２５８(１９９ ３)；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．Ｍ．ら（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ １ ４：８４５〜８５１；およびＭｅｎｄｅｚ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９７）Ｎａｔ．Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６〜１５６を参照。 さらなる実施態様において、抗体または抗体フラグメントは、ＭｃＣａｆｆｅ ｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５２２〜５５４（１９９０）に記載される技 術を使用して作製された抗体ファージライブラリーから、目的の抗原を使用して 、適切な抗体または抗体フラグメントに関する選択を行うことによって分離する ことができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（ １９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.、２２２：５８１〜５ ９７（１９９１）は、それぞれ、ファージライブラリーを使用するマウス抗体お よびヒト抗体の分離を記載する。その後の刊行物は、非常に大きなファージライ ブラリーを構築するための方法として、鎖シャッフリング(Ｍａｒｋら、Ｂｉｏ ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９〜７８３(１９９２))、ならびに結合感染およ びインビボ組換えによる高い親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の産生を記載する(Ｗ ａｔｅｒｈｏｕｓｅｓら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：２２６５〜２２ ６６(１９９３)；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．ら（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３２４５〜３２６０；およびＶａｕｇｈａｎら（１９９６）上記)。従っ て、これらの技術は、本発明により含まれる「モノクローナル」抗体（特に、ヒ ト抗体）の分離に関する、従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行 可能な代替法である。 本発明の抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して(例えば、ネズミ 抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオ チドプローブを使用することによって)容易に分離され、そして配列決定される 。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として有 用である。ＤＮＡが一旦分離されると、そのＤＮＡは、発現ベクター内に配置す ることができ、次いで、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ ）細胞、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエロー マ 細胞などの宿主細胞にトランスフェクションされ、組換え宿主細胞においてモノ クローナル抗体の合成物が得られる。ＤＮＡはまた、例えば、コード配列を、相 同的なマウス配列の代わりに、ヒトの重鎖および軽鎖の定常ドメインに置換する ことによって改変することができる。Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１(１９８４)。そのようにして、本明細書中の 抗抗原モノクローナル抗体の結合特異性を有する抗体が調製される。 非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野では十分に知られている。 一般に、ヒト化抗体は、ヒトでない供給源からヒト化抗体に導入された１つまた は複数のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒおよび共 同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５(１ ９８６)；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２７(１９ ８８)；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４〜１５３６( １９８８)）に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応配列 に置換することによって行うことができる。従って、そのような「ヒト化」抗体 は、キメラな抗体であり、(Ｃａｂｉｌｌｙ、上記)。実質的には元のままでない ヒトの可変ドメインは、ヒトでない種に由来する対応の配列によって置換されて いる。実際、典型的には、ヒト化抗体は、いくつかのＣＤＲ残基、および可能で あれば、いくつかのＦＲ残基が、齧歯類の抗体の類似する部位に由来する残基に よって置換されているヒト抗体である。抗体は、抗原に対する高い親和性および 他の有利な生物学的特性を保持してヒト化されることが重要である。このような 目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体が、元の配列および ヒト化配列の三次元モデルを使用して、元の配列および様々な考えられるヒト化 配列を解析することによって調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは、当 業者には熟知されている。選択された候補の免疫グロブリン配列の可能性な三次 元の立体配置構造を図示して表示するコンピュータープログラムを入手すること ができる。このような表示を検討することによって、候補の免疫グロブリン配列 の機能発現における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補の免疫グロブリン のその抗原に対する結合能に影響する残基の分析が可能になる。このように、Ｆ Ｒ残基は、コンセンサス配列および持ち込み配列からの選択および組合せ を行うことができ、その結果、標的抗原に対する増大した親和性などの所望の抗 体特性が達成される。さらなる詳細については、国際特許公開第ＷＯ９２／２２ ６５３号（１９９２年１２月２３日公開）を参照。 （ｉｉ）免疫付着因子調製 免疫グロブリン(Ｉｇ)、およびその変異体が知られており、その多くが、組換 え細胞培養によって調製されている。例えば、米国特許第４，７４５，０５５号 ；欧州特許第２５６，６５４号；Ｆａｕｌｋｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２９８： ２８６ (１９８２)；欧州特許第１２０，６９４号；欧州特許第１２５，０２３ 号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． １２３：７９３ (１９７９)； Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：２１９７ (１９８０)；Ｒａｓｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４１：２０ ７３ (１９８１)；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， Ａｎｎ． Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ． ２：２３９ (１９８４)；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９： １２０２ (１９８５)；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１ (１９８４)；欧州特許第２５５，６９ ４号；欧州特許第２６６，６６３号；および国際特許公開第８８／０３５５９号 を参照。再編成された免疫グロブリン鎖も知られている。例えば、米国特許第４ ，４４４，８７８号；国際特許公開第８８／０３５６５号；および欧州特許第６ ８，７６３号、ならびに、それらで引用されている参考文献を参照。 付着因子結合ドメインの配列を、適当な免疫グロブリン定常ドメイン位配列に 連結させて構築したキメラ(免疫付着因子)が当技術分野において知られている。 文献で報告されている免疫付着因子には、Ｔ細胞レセプターとの融合タンパク質 (Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ ＳＡ ８４：２９３６−２９４０ (１９８７))；ＣＤ４との融合タンパク質（ Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５−５３１ (１９８９)；Ｔｒａｕ ｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：６８−７０ (１９８９)；Ｚｅｔｔｍ ｅｉｓｓｌら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ＵＳＡ ９：３４７−３５ ３ (１９９０)；およびＢｙｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６６７−６７０(１ ９９０))；Ｌ−セレクチン（ホーミンクルセプター）との融合タンパク質(Ｗａ ｔｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１−２２２９(１９９０) ；およびＷａｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：１６４−１６７(１９９１)) ；ＣＤ４４との融合タンパク質(Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ ６１：１３０３− １３１３ (１９９０))；ＣＤ２８とＢ７との融合タンパク質(Ｌｉｎｓｌｅｙら 、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０ (１９９１))；ＣＴＬＡ−４ との融合タンパク質(Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１ −５６９ (１９９１))；ＣＤ２２との融合タンパク質(Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ ら、Ｃｅｌｌ ６６：１１３３−１１４４(１９９１))；ＴＮＦレセプターとの 融合タンパク質(Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９ (１９９１)；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３−２８８６ (１９９１)；お よびＰｅｐｐｌｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３−１４８９ (１ ９９１))；およびＩｇＥレセプターαとの融合タンパク質（ＲｉｄｇｗａｙとＧ ｏｖｍａｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１１５，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎ ｏ．１４４８ (１９９１)）などがある。 もっとも単純で、もっとも素直な免疫付着因子設計は、付着因子の結合ドメイ ン（例えば、レセプターの細胞外ドメイン(ＥＣＤ)）を、免疫グロブリン重鎖の ヒンジ領域とＦｃ領域に結合させるものである。通常、本発明の免疫付着因子を 調製するときには、付着因子の結合ドメインをコードする核酸がＣ末端になるよ うに、免疫グロブリンの定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸に融合させ るが、Ｎ末端の融合も可能である。 典型的には、このような融合配列において、コードされるキメラポリペプチド は、少なくとも、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインのヒンジ、Ｃ_H２、Ｃ_H３の 各ドメインの機能的活性を保持している。定常ドメインのＦｃドメインのＣ末端 側で融合させたり、重鎖のＣ_H１、または軽鎖の対応領域のすぐＮ末端側で融合 させたりする。正確にどの位置で融合させるかは重要ではないが、特定の部位が よく知られていて、生物学的活性、分泌、またはＩａの結合特性を最適なものに するときに選択される。 好ましい実施態様において、免疫グロブリンＧ₁（ＩｇＧ₁）のＦｃドメインの Ｎ末端に付着因子の配列を融合させる。重鎖の定常領域全体を付着因子の配列に 融合させることも可能である。しかし、より好ましくは、化学的にＩｇＧ Ｆｃ を画定するパパイン切断部位（すなわち、重鎖の定常領域の最初の残基を１１４ とすると残基２１６にあたる）のすぐ上流にあるヒンジ領域から始まる配列、ま たは、他の免疫グロブリンの同様の部位を融合に用いる。特に好ましい実施態様 においては、付着因子のアミノ酸配列を、ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、またはＩｇＧ₃の 重鎖の（ａ）ヒンジ領域、およびＣ_H２とＣ_H３からなる領域に、または、（ｂ） Ｃ_H１、ヒンジ、Ｃ_H２、およびＣ_H３ドメインに融合させる。融合させる正確な 部位は重要ではなく、最適な部位を通常の実験によって決定することができる。 双特異的免疫付着因子では、免疫付着因子はマルチマーとして集合し、ヘテロ ダイマーまたはヘテロ四量体として集合する。一般的には、これらの分子集合し た免疫グロブリンは、既知のユニット構造をもっているはずである。基本的な４ 本鎖の構造単位は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＥに見られる構造である。高分 子量の免疫グロブリンでは、４本鎖の構造単位が繰り返される。すなわち、Ｉｇ Ｍは、一般的に、４本鎖の基本ユニットをジスルフィド結合によって結合させた 五量体として存在する。ＩｇＡグロブリンと、場合によってはＩｇＧグロブリン も、血清中ではマルチマーの形で存在することがある。マルチマーの場合、４本 鎖ユニットは同じものであることもあれば、異なることもある。 本明細書の範囲に含まれる集合免疫付着因子のさまざまな例を以下に概略的に 示す： （a）AC_L-AC_L； （b）AC_H-[AC_H,AC_L-AC_H,AC_L-V_HC_H,またはV_LC_L-AC_H]； （c）AC_L-AC_H-[AC_L-AC_H,AC_L-V_HC_H,V_LC_L-AC_H,またはV_LC_L-V_HC_H]； （d）AC_L-V_HC_H-[AC_H,またはAC_L-V_HC_H,またはV_LC_L-AC_H]； （e）V_LC_L-AC_H-[AC_L-V_HC_H,またはV_LC_L-AC_H]；および （f）[A-Y]_n-[V_LC_L-V_HC_H]₂； ここで、Ａは、それぞれ、同一か異なった付着因子のアミノ酸配列を表しており 、 Ｖ_Lは、免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインであり； Ｖ_Hは、免疫グロブリン重鎖の可変ドメインであり； Ｃ_Lは、免疫グロブリン軽鎖の定常ドメインであり； Ｃ_Hは、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインであり； ｎは、１よりも大きい整数であり； Ｙは、共有結合的な架橋剤の残基を示している。 簡潔を期するために、上記の構造は、主要な特徴を示しているにすぎず、結合 ドメイン（Ｊ）や、免疫グロブリンのその他のドメインは示されていない。さら に、ジスルフィド結合も示されていない。しかし、このようなドメインが結合活 性にとって必要である場合には、それらが、免疫グロブリン分子の中で占める通 常の位置に提示されるよう構成されている。 または、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンを得るために、免疫グロブリンの重 鎖と軽鎖の配列の問に付着因子の配列を挿入することも可能である。この実施態 様では、免疫グロブリンの各アームにおける、免疫グロブリン重鎖のヒンジとＣ_H ２ドメインの間か、またはＣ_H２とＣ_H３ドメインの間の３’末端に付着因子の 配列を融合させる。同様の構築物が、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍ ｕｎｏｌ．２８：１０２７−１０３７（１９９１）によって報告されている。 免疫グロブリンの軽鎖が、付着因子−免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに 共有的に会合しているか、または、付着因子に直接融合するかして存在すること もあろう。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、典型的には 、付着因子−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡとともに発 現する。分泌されるときに、ハイブリッドの重鎖と軽鎖が共有的に会合して、ジ スルフィド会合で結ばれた免疫グロブリン重鎖−軽鎖の２組の組み合せを含む免 疫グロブリン様構造物が提供される。このような構造物を調製するのに適した方 法は、例えば、１９８９年３月２８日公開の米国特許第４，８１６，５６７号に 開示されている。 好ましい実施態様において、本発明の免疫付着因子の構築に用いる免疫グロブ リンの配列は、ＩｇＧ免疫グロブリン重鎖の定常部位からとってくる。ヒトの免 疫付着因子については、ヒトＩｇＧ₁およびＩｇＧ₃免疫グロブリンの配列が好ま しい。ＩｇＧ₁を使用することの主な利点は、固定したプロテインＡ上で、Ｉｇ Ｇ₁免疫付着因子を効率的に精製できることにある。これに対して、ＩｇＧ₃の精 製には、これよりもかなり使い勝手の悪い媒体であるプロテインＧが必要となる 。しかし、特定の免疫付着因子構築物のＩｇの融合相手を選ぶときには、免疫グ ロブリンのこの他の構造的性質および機能的性質も考慮すべきである。例えば、 ＩｇＧ₃のヒンジは、より長く、可塑性もより高いため、ＩｇＧ₁に融合させると 正しく折り畳まれて機能することができないような長い”付着因子”ドメインを 受け入れることができる。もう一つ考慮すべきなのは、原子価である。ＩｇＧ免 疫付着因子は２価性のホモダイマーであるが、ＩｇＡおよびＩｇＭなどのＩｇサ ブタイプは、それぞれ、基本的なＩｇホモダイマーユニットからなるダイマーと 五量体を生じよう。インビボでの実用に供するために設計された免疫付着因子で は、Ｆｃ領域によって特定される薬理動態的性質およびエフェクター機能も重要 である。ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂およびＩｇＧ₄はすべて、インビボでの半減期が２１ 日で、補体系を活性化する相対的能力はそれぞれ異なる。ＩｇＧ₄は、補体をほ とんど活性化せず、ＩｇＧ₂は、ＩｇＧ₁よりもかなり弱くしか補体活性を活性化 しない。さらに、ＩｇＧ₁とは異なって、ＩｇＧ₂は、単核球または好中球上のＦ ｃレセプターには結合しない。補体の活性化に関しては、ＩｇＧ₃が最適である が、インビボでの半減期が、他のＩｇＧアイソタイプの約３分の１である。ヒト の治療薬として使用するために、免疫付着因子を設計するときに考慮すべき他の 重要な点は、特定のアイソタイプがもつアロタイプの数である。一般的には、血 清学的に区別されるアロタイプの数が少ないＩｇＧのアイソタイプほど好ましい 。例えば、ＩｇＧ₁は、血清学的に区別されるアロタイプ部位を４つしかもって おらず、これらのうち２つは（Ｇｍ１とＧｍ２）はＦｃ領域に位置しているが、 このうちの１つの部位であるＧ１ｍ１は、免疫原性がない。これに対して、Ｉｇ Ｇ₃には１２の血清学的に区別されるアロタイプがあり、それらのすべてがＦｃ 領域中にあって、その内の３つの部位（Ｇ３ｍ５、１１および２１）だけが免疫 原性をもつ同一のアロタイプをもっている。したがって、γ１免疫付着因子より も、γ３免疫付着因子方が免疫原としての可能性が高い。 付着因子部分をコードするｃＤＮＡ配列を、ＩｇのｃＤＮＡ配列にフレームを 合わせて融合させることによって、もっとも好都合に免疫付着因子が構築される 。しかし、ゲノムのＩｇフラグメントに融合させることもできる(例えば、Ｇａ ｓｃｏｉｇｎｅら、上記；Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１ ３(１９９０)；およびＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｃｅｌｌ ６６：１１３３− １１４４ (１９９１)）参照)。後者のタイプの融合には、発現のためのＩｇ調 節配列が存在することが必要である。ＩｇＧの重鎖定常領域をコードするｃＤＮ Ａは、脾臓または末梢血のリンパ球由来のｃＤＮＡライブラリーからの公開され た配列をもとに、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）技術によって分離することができる。免疫付着因子の”付着因子”とＩｇ部分 をコードするｃＤＮＡを、選んだ宿主細胞の中で効率的に発現させるためのプラ スミドベクターの中にひとつながりになるように挿入する。 ２．隆起および／または空洞の作出 隆起および／または空洞を形成するもととなる残基を選択するための最初の工 程として、Ｘ線結晶解析やＮＭＲなど、当技術分野において既知の技術を用いて 、ヘテロマルチマーの三次元構造を得る。三次元構造に基づいて、当業者は、接 触面の残基を同定することができる。 好ましい接触面は、免疫グロブリン定常ドメインのＣ_H３ドメインである。各 種のＩｇＧサブタイプの接触面残基と”埋もれた”残基が同定されていたため、 ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣ_H３ドメインの接触面の残 基で、取り入れる残基と置換するのに最適な残基などの残基が同定されている( 例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１５９８を参照、その全文が、参照してここに組 み込まれる)。Ｃ_H３接触面を改変するための基礎となるのは、Ｘ線結晶解析によ って、ヒトＩｇＧ₁重鎖の間に生じる、Ｆｃ領域での分子間結合は、Ｃ_H３ドメイ ン間では広範なタンパク質／タンパク質間相互作用を含むのに対して、グリコシ ル化されたＣ_H２ドメインでは、その糖部分によって結合するということが示さ れたことである。(Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：２３６１ −２３７０ (１９８１))。さらに、哺乳動物細胞の中には、欠失により Ｃ_H２およびＣ_H３ドメインが除去されないかぎり、２つの重鎖間では、抗体が発 現されるときにジスルフィド結合が効率よく形成される(Ｋｉｎｇら、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ．Ｊ．２８１：３１７ (１９９２))。したがって、重鎖の集合は、ジス ルフィド結合を促進すると考えられ、その逆ではないと考えられる。これらの構 造および機能に関するデータをまとめて考えると、抗体の重鎖の会合はＣ_H３部 位によってもたらされるという仮説に至る。さらに、Ｃ_H３ドメイン間の接触面 を改変して、異なった重鎖のヘテロマルチマーの形成を促進して、対応するホモ マルチマーの集合を阻害することができるかもしれないという推測がなされた。 本明細書で説明する実験によって、この方法を用いれば、ホモマルチマーよりも ヘテロマルチマーの形成を促進することが可能なことが示された。したがって、 目的のポリペプチドと抗体のＣ_H３部位とを含むポリペプチド融合体を作出して 、第一または第二のポリペプチドを形成させることができる。好ましいＣ_H３ド メインは、ヒトＩｇＧ₁のようなＩｇＧ抗体に由来するものである。 隆起または空洞を形成するための候補となりうる接触面残基が同定されている 。”埋もれた”残基を選んで置き換えることが好ましい。ある残基が埋込まれて いるか否かを判定するために、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：３７９ −４００（１９７１）の表面接触プログラムを用いて、接触面にある残基と溶媒 との接触可能性（ＳＡ）を計算することができる。そして、第一と第二のポリペ プチドのそれぞれの残基について、一方のポリペプチドを除いた上で、ＳＡを別 々に計算することができる。そして、ＳＡ（ダイマー）−ＳＡ（モノマー）とい う等式を用いて、接触面のモノマー型とダイマー型の間の各残基のＳＡの差異を 計算することができる。これによって、ダイマーを形成するときにＳＡが減少す る残基のリストが示される。ダイマーの各残基のＳＡを、同じアミノ酸のトリペ プチドＧｌｙ−Ｘ−ＧｌｙのＳＡの理論値と比較する。ただし、Ｘ＝目的のアミ ノ酸(Ｒｏｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８３４−８３８(１９８５))。（ａ ）モノマーに較べてダイマーでＳＡ減少した残基、および（ｂ）ＳＡが、対応す るトリペプチドにおけるＳＡの２６％よりも少ない残基を接触面残基と考える。 ２つの分類を明らかにすることができる。すなわち、対応するトリペプチドに較 べて１０％よりも低いＳＡをもつ残基(すなわち、”埋もれた”残基)、お よび、対応するトリペプチドに較べて１０％よりも高く２５％よりは低いＳＡを もつ残基（すなわち、”一部埋もれた”残基）である（下記の表１参照） †残基番号は、IgG結晶構造にある通り（Deisenhofer,Biochemistry 20:2361- 2370(1981)） ポリペプチド鎖構造に対する残基置換の効果は、Ｉｎｓｉｇｈｔ^TMプログラム （Ｂｉｏｓｙｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの分子図形モデリングプログ ラムを用いて、調べることができる。このプログラムを用いて、第一のポリペプ チドの接触面中に埋もれた残基で、側鎖容量の小さい残基を、例えば、より大き な側鎖容量をもつ残基（すなわち、隆起）に変えることができる。そして、第二 のポリペプチドの接触面中の残基で、隆起に隣接する残基を調べて、空洞を形成 するために適した残基を見つける。通常、この残基は側鎖容量が大きいので、側 鎖容量の小さな残基と置き換える。一定の実施態様において、接触面の三次元構 造を調べると、第一のポリペプチドの接触面上に適当な位置に置かれた、適当な 大きさの隆起、または第二のポリペプチドの接触面上の空洞が明らかになるはず である。これらの例では、単一突然変異体、すなわち、合成によって導入された 隆起または空洞をモデル化する必要があるだけである。 第一および第二のポリペプチドがそれぞれＣ_H３ドメインを含む場合に、置換 することのできる元の残基を選択することに関しては、ヒトＩｇＧ₁のＣ_H３／Ｃ_H ３の接触面は、各表面から１０９０Ų埋もれた４つの逆平行β鎖上にある各ド メイン上の１６の残基を含んでいる（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ， 上記、および Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１６：９６５(１９９０)。突然変異は 、好ましくは、中央の逆平行β鎖上にある残基を標的とする。この目的は、作出 した隆起が、相手方のＣ_H３ドメインの相補的な空洞の中に入らずに、周囲の溶 媒の中に突出して親和してしまう危険を最小限にするためである。 分子モデリングによって、好ましい元／取り込み残基が一旦同定されたら、当 技術分野において周知の技術を用いて、ポリペプチドの中にアミノ酸置換を導入 する。通常は、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、突然変異誘発：実用的方法 (Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ)、上 記、に記載されている技術を用いて遺伝子工学により改変する。 オリゴヌクレオチドによる突然変異誘発が、第一または第二のポリペプチドを コードするＤＮＡの置換変異体を調製するための好ましい方法である。この技術 は、Ａｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ，２：１８３（１９８３）によって説明されてい るように、当技術分野において周知の技術である。簡単に述べると、所望の変異 をコードしているオリゴヌクレオチドをＤＮＡ鋳型とハイブリダイズさせること によって、第一または第二のポリペプチドＤＮＡを改変する。この鋳型ＤＮＡは 、ヘテロマルチマーの未変更または天然のＤＮＡ配列を含む、一本鎖のプラスミ ドまたはバクテリオファージである。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメ ラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを取り込んだ相補鎖で、ヘテロ マルチマーＤＮＡへの部位特異的な変化をコードする相補鎖である、鋳型に相補 的 な第二鎖の全長を合成する。 Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１９８５）が述べるところにしたが って、目的とするＤＮＡ領域を、相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングさ せて作製した合成変異フラグメントで置換することによって、カセット突然変異 誘発を行なうことができる。ＰＣＲ突然変異も、第一または第二ポリペプチドＤ ＮＡの変異配列を作製するのに適している。以下の考察においてはＤＮＡを引用 しているが、この技術は、ＲＮＡでも応用することができると解される。ＰＣＲ 技術とは、一般的には、次の手順をさす(Ｅｒｌｉｃｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ５２：１６４３−１６５０ (１９９１)、Ｒ． Ｈｉｇｕｃｈｉが担当した章、 ｐ．６１−７０を参照)。 隆起または空洞の突然変異以外にも、本発明は、ヘテロマルチマーのＤＮＡの 中に適当なヌクレオチド変異を導入するか、または所望のヘテロマルチマーポリ ペプチドを合成することによって調製することのできるヘテロマルチマーのアミ ノ酸配列の変異配列を含む。このような変異配列には、例えば、ヘテロマルチマ ーを形成する第一および第二のポリペプチドのアミノ酸配列中の残基の欠失、挿 入、または置換が含まれる。最終的な構築物が望ましい抗原結合特性をもってい るとすれば、最終的な構築物ができるように、欠失、挿入および置換を組み合わ せる。グリコシル化部位の数と位置を変更したりして、アミノ酸を変えることに よっても、ヘテロマルチマーの翻訳後のプロセッシングを変えることができる。 突然変異を誘発するのに好ましい位置にある、ヘテロマルチマーポリペプチド の一定の残基または領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｇｈａｍと Ｗｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５ （１９８９）によ って述べられている“アラニンスキャニング突然変異誘発法”といわれるもので ある。ここで、標的残基の残基またはそのグループが同定され(例えば、Ａｒｇ 、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、およびＧｌｕなどの荷電性残基)、中性のアミノ酸または負 に荷電したアミノ酸（もっとも好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）で置 き換えて、アミノ酸と、細胞の内外の周囲の水性環境との相互作用に影響を与え る。そして、置換部位で、またはそれに対する、および／または別の変異残基を 導入することによって、置換に対して機能的な感受性を示すドメインをさらに明 確に することができる。このように、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め 決まっていても、突然変異そのものの性質を予め測ることはできない。 通常、突然変異には、ヘテロマルチマーの非機能的な領域における保存的なア ミノ酸置換が含まれる。突然変異の例を表２に示す。 ヘテロマルチマーのポリペプチドの共有修飾も、本発明の範囲に含まれる。ヘ テロマルチマーの共有修飾は、ヘテロマルチマー、またはそのフラグメントの標 的アミノ酸残基を、Ｎ末端またはＣ末端の残基の選ばれた側鎖と反応することの できる有機的誘導化剤と反応させて、分子の中に導入することができる。ヘテロ マルチマーポリペプチドの別のタイプの共有修飾で、本発明の範囲に含まれるも のには、ポリペプチドの本来のグリコシル化パターンを改変することが含まれる 。改変とは、もとのヘテロマルチマーの中に見られる糖部分を一つ以上欠失させ るか、および／または、もとのヘテロマルチマーには存在しないグルコシル化部 位を一つ以上付加することを意味する。ヘテロマルチマーポリペプチドへのグリ コシル化部位の付加は、一つ以上のＮ結合型グリコシル化部位が含まれるよう、 アミノ酸配列を改変することによって適宜行われる。一つ以上のセリンまたはト レオニン残基を、もとのヘテロマルチマー配列に付加または置換することによっ て改変を行なうこともできる(Ｏ結合型グリコシル化部位)。簡単にするために、 好ましくは、ＤＮＡレベルでの変更によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳され るコドンを作出するよう、ヘテロマルチマーポリペプチドをコードするＤＮＡの 予め決定された塩基突然変異を起こすことによって、ヘテロマルチマーのアミノ 酸配列を改変する。ヘテロマルチマーポリペプチド上の糖部分の数を増加させる 別の方法は、化学結合または酵素結合によってグリコシドをポリペプチドに結合 させることである。これらの方法については、１９８７年９月１１日発行の国際 特許公開第８７／０５３３０号、およびＡｐｌｉｎとＷｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載 されている。ヘテロマルチマーに存在する糖部分の削除は、化学的または酵素的 に行なうことができる。 ヘテロマルチマーの別のタイプの共有修飾には、ヘテロマルチマーポリペプチ ドを、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０ １，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号；および第４ ，１７９，３３７号において提示されている方法で、例えば、ポリエチレングリ コール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンなど、さまざ まな非タンパク質性ポリマーの一つに結合させることが含まれる。 変異ヘテロマルチマーの特性を前もって予測することは困難であるため、回収 された変異体をスクリーニングして、最適な変異体を選抜することが必要である と認められよう。 ３．共通の軽鎖をもつヘテロマルチマーの発現 ＤＮＡを突然変異させて、本明細書で開示されているような共通の軽鎖を選抜 した後、当技術分野において広く利用可能な組換え技術を用いて、この分子をコ ードするＤＮＡを発現させる。しばしば、優れた発現系は、ヘテロマルチマーを 適切にグルコシル化するための(例えば、グリコシル化されている抗体部位を含 むヘテロマルチマーの場合など)、哺乳動物細胞の発現ベクターと宿主とを含ん でいる。しかし、下で詳述するように、この分子は、原核生物の発現系で産生さ せることもできる。通常、一つのベクター、または別々のベクター上に存在する 、第一ポリペプチド、第二ポリペプチド、共通の軽鎖ポリペプチド、および、ヘ テロマルチマーを形成するのに必要な別のポリペプチドのすべてコードするＤＮ Ａによっての宿主細胞を形質転換する。しかし、第一ポリペプチド、第二ポリペ プチド、および共通の軽鎖ポリペプチド（ヘテロマルチマーの成分）を、別々の 発現系で発現させ、発現したポリペプチドをインビトロで結合させることも可能 である。 ヘテロマルチマーと共通の軽鎖をコードするヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ またはゲノムＤＮＡ）を、さらなるクローニング（ＤＮＡ増幅）または発現のた めに、複製可能なベクターの中に挿入する。多くのベクターを利用することがで きる。一般的に、ベクターの構成要素として、次のものを一つ以上含むが、これ らに限定はされない。すなわち、シグナル配列、複製開始点、一つ以上のマーカ ー遺伝子、エンハンサー因子、プロモーター、および転写終結配列。 ヘテロマルチマーの成分であるポリペプチドは、シグナル配列、または、それ 以外で、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位をもつ ポリペプチドに融合したポリペプチドとして作製することができる。一般的に、 シグナル配列は、ベクターの成分であるか、または、ベクターの中に挿入される ＤＮＡの一部であろう。好んで選ばれる異種由来のシグナル配列は、宿主細胞に よって認識され、プロセッシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによ って開裂される）配列である。原核生物の宿主細胞では、シグナル配列を、例え ば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンド トキシンＩＩの先導配列からなるグループから選択される、原核生物のシグナル 配列で置き換えることができる。酵母での分泌を行なわせるためには、天然のシ グナル配列を、例えば、酵母インベルターゼ、α因子の先導配列(サッカロマイ セス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）とクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏ ｍｙｃｅｓ）α因子の先導配列、後者については、１９９１年４月２３日公開の 米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている)、または酸性ホスファター ゼの先導配列、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のグルコアミラーゼ の先導配列(１９９０年４月４日公開の欧州特許第３６２，１７９号)、または、 １９９０年１１月１５日発行の国際特許公開第９０／１３６４６号に記載されて いるシグナルなどによって置換することができる。哺乳動物細胞で発現させると きには、本来のシグナル配列（例えば、抗体または付着因子のプレ配列で、通常 、インビボで、これらの分子をヒト細胞から分泌させる配列）で十分であるが、 哺乳動物の別のシグナル配列も適しているし、また、例えば、単純ヘルペスのｇ Ｄシグナルのような、ウイルスの分泌を促す配列も適当であろう。このような前 駆体領域に対するＤＮＡを、読み枠がずれないように、ヘテロマルチマーを形成 するポリペプチドをコードするＤＮＡと連結させる。 発現ベクターもクローニングベクターも、一つ以上の選ばれた宿主細胞の中で ベクターの複製が可能になる塩基配列を含んでいる。一般的に、クローニングベ クターにおいては、この配列は、宿主の染色体ＤＮＡとは独立に、ベクターが複 製できるようにする配列であり、複製開始点または自律複製配列を含む配列であ る。このような配列は、さまざまな細菌、酵母、およびウイルスでよく知られて いる。プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始点は、ほとんどのグラム陰性菌に適合 し、２μプラスミドの開始点は酵母に適合し、また、さまざまなウイルスの開始 点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は、哺乳 動物細胞でのクローニングベクターとして有用である。一般的に、複製開始点と いう構成因子は、哺乳動物の発現ベクターには不要である(ＳＶ４０の複製開始 点は、初期プロモーターを含んでいるというだけの理由で一般的には用いられて いる)。 発現ベクターとクローニングベクターは、選抜可能マーカーとも言われる選抜 用遺伝子を持っていなければならない。典型的な選抜用遺伝子は、（ａ）例えば 、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンな どの抗生物質またはその他の毒素に対する抵抗性を付与するか、（ｂ）栄養要求 性欠損を相補するか、または（ｃ）例えば、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）のＤ −アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のように、複合培地からは摂取できな い重要な栄養分を供給する。選抜計画の一例では、宿主細胞の増殖を停止させる ための薬剤を利用する。異種由来の遺伝子によって形質転換するのに成功した細 胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を産生し、それによって、選抜試験を生き 残る。このような優性選抜の例では、ネオマイシン(Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ． Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７(１９８２))、マイコフェノー ル酸(Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２(１９８０))、ま たはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４ １０−４１３(１９８５)）という薬剤が用いられる。上記の３つの例は、それぞ れ、Ｇ４１８もしくはネオマイシン(ゲネチシン(ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ))、Ｘｇｐ ｔ(マイコフェノール酸)、またはハイグロマイシンという、適当な薬剤に対する 抵抗性を持ち込むために、真核生物の遺伝子の調節下に置かれた細菌遺伝子が用 いられている。 哺乳動物にとって適当な選抜マーカーのもう一つの例は、ＤＨＦＲ、またはチ ミジンキナーゼのように、ヘテロマルチマーの塩基配列を取り込む能力のある細 胞の同定を可能にする選抜マーカーである。マーカーを取り込んだために、形質 転換体だけが、唯一、適応して生き残れるという選択圧の下に、哺乳動物細胞の 形質転換体を置く。培地の中の選抜用薬剤の濃度を連続的に変化させ、それによ って選抜用遺伝子とヘテロマルチマーをコードするＤＮＡの両方の増幅がもたら されるような条件の下で形質転換体を培養することによって選択圧をかける。増 幅されたＤＮＡからは大量のヘテロマルチマーが合成される。この他に増幅可能 な遺伝子の例には、メタロチオネイン−Ｉおよび−２、好ましくは、霊長類のメ タロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラー ゼなどがある。 例えば、まず、ＤＨＦＲの競合的な拮抗剤であるメトトレキセート（Ｍｔｘ） を含む培養培地の中で、全部の形質転換細胞を培養して、ＤＨＦＲ選抜用遺伝子 によって形質転換された細胞を同定する。野生型のＤＨＦＲを用いるときに、適 当な宿主細胞は、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０）による説明にしたがって、調製 および増殖させたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系のＤＨＦＲ活性 欠損株である。次に、形質転換された細胞を、濃度を上げたメトトレキセートに 曝す。これによって、ＤＨＦＲ遺伝子のコピーが多数合成されるようになり、同 時に、ヘテロマルチマーの成分をコードするＤＮＡなど、発現ベクターを含むそ の他の遺伝子のコピーも多数合成されるようになる。この増幅技術は、例えば、 ＡＴＣＣ ＣＣＬ６２、ＣＨＯ−Ｋ１などの適当な宿主とともに用いることがで き、Ｍｔｘに高い耐性をもつ変異ＤＨＦＲ遺伝子を用いるならば、内生的なＤＨ ＦＲがあったとしても構わない(欧州特許第１１７，０６０号)。 または、ヘテロマルチマー、野生型ＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコ シド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの選抜マーカーをコードす るＤＮＡ配列によって形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に、内生 ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、または Ｇ４１８などのアミノグリコシド系抗生物質選抜マーカーに対する選抜用薬剤を 含む培地の中で細胞を増殖させることによって選抜することができる。米国特許 第４，９６５，１９９号参照。 酵母の中で用いるための適当な選抜用遺伝子は、酵母のプラスミドＹＲｐ７の 中にあるｔｒｐ１遺伝子である。(Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ ２ ８２：３９(１９７９)；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ ７：１４１(１９７９) ；または、Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ １０：１５７(１９８０))。ｔｒ ｐ１遺伝子は、トリプトファンの中では増殖できない酵母の変異株、例えば、Ａ ＴＣＣ ４４０７６、またはＰＥＰ４−１に対する選抜マーカーを提供する(Ｊ ｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５：１２(１９７７))。酵母宿主ゲノムにｔｒ ｐ１障害があることによって、トリプトファンなしで増殖させることによって、 形質転換体を検出するための効果的な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ−２欠 損酵母株（ＡＴＣＣ ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を もつ既知のプラスミドによって相補される。 さらに、クルイベロマイセス属の酵母を形質転換するためには、１．６μｍ環 状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターを用いることができる。Ｂｉａｎｃｈｉら 、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ １２：１８５(１９８７)。さらに最近、組換えウシキ モシンの大量生産のための発現系が報告された。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ、Ｂ ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５(１９９０)。クルイベロマイセス属の 工業用菌株により成熟組換えヒト血清アルブミンを分泌させるための、安定した マルチコピー発現ベクターも開示されている(Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ ９：９６８−９７５(１９９１))。 発現ベクターとクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、 ヘテロマルチマーの核酸に機能的に結合しているプロモーターを含む。宿主に可 能性のある、さまざまな細胞によって認識されるプロモーターが多数ある。制限 酵素消化によって、もととなるＤＮＡからプロモーターを除去し、分離したプロ モーターをベクターに挿入にして、これらのプロモーターは、ヘテロマルチマー をコードするＤＮＡに機能的に連結する。 原核生物宿主で使用するのに適したプロモーターには、β−ラクタマーゼおよ びラクトースのプロモーター系(Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５( １９７８)；およびＧｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４(１９７９ ))、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系(Ｇｏ ｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.，８：４０５７(１９８０ )、および欧州特許第３６，７７６号)、および、ｔａｃプロモーターなどのハイ ブリッドプロモーター（ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５(１９８３)）が含まれる。しかし、細菌のこれ以 外の既知のプロモーターが適当である。それらの塩基配列は公開されているので 、当業者は、必要な制限酵素部位をもたらすためのリンカーまたはアダプターを 用いて、ヘテロマルチマーをコードするＤＮＡに機能的にプロモーターを連結さ せることができる(Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ ２０：２６９(１９８０ ))。また、細菌の系で使用するためのプロモーターは、ヘ テロマルチマーをコードするＤＮＡに機能的に連結したシャイン−ダルガーノ（ Ｓ．Ｄ.）配列も含んでいる。 プロモーターの配列は、真核生物で知られている。実質的にすべての真核生物 遺伝子が、転写開始部位から約２５から３０塩基上流にあるＡＴに富む領域を持 っている。多くの遺伝子の転写開始点から上流７０から８０塩基のところに見つ かっている別の配列とはＣＸＣＡＡＴ領域である、ただし、Ｘを任意のヌクレオ チドである。殆どの真核生物遺伝子の３’末端には、コーディング配列の３’末 端にポリＡテールを付加するためのシグナルらしいＡＡＴＡＡＡ配列がある。こ れらの配列はすべて、真核生物の発現ベクターの中に適当に挿入する。 酵母宿主とともに使用するのに適したプロモーター配列の例には、３−ホスホ グリセリン酸キナーゼのプロモーター(Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ ｈｅｍ．２５５：２０７３(１９８０))、または、エノラーゼ、グリセルアルデ ヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシ ラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３− ホスホグリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ 、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなど、その他の解糖酵 素のプロモーター（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ．Ｒｅｇ．７：１４ ９(１９６８)；および、Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：４ ９００(１９７８)）などである。 この他の酵母プロモーターで、増殖条件によって転写を調節するという、さら に別の利点をもつ誘導的プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソ シトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関係する分解酵素、メタロチオ ネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、および、マルトー スおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母での 発現に用いるのに適したベクターとプロモーターについては、Ｈｉｔｚｅｍａｎ ら、欧州特許第７３，６５７Ａ号でさらに説明されている。また、酵母のエンハ ンサーも、酵母プロモーターとともに適宜用いられる。 哺乳動物の宿主細胞での、ベクターからのヘテロマルチマーの転写は、例えば 、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス(１９８９年７月５日発行の英国特許第２ ， ２１１，５０４号)、アデノウイルス(アデノウイルス２など)、ウシポリオーマ ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝 炎ウイルス、および、もっとも好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）な どのウイルスのゲノムから得られたプロモーター、例えば、アクチンプロモータ ーまたは免疫グロブリンプロモーターなど、異種由来の哺乳動物のプロモーター 、または、ヒートショックプロモーターによって調節される。 ＳＶ４０ウイルスの前者および後者のプロモーターは、都合のよいことに、Ｓ Ｖ４０ウイルスの複製開始点も含むＳＶ４０制限酵素フラグメントとして得られ る。Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３ (１９７８)；Ｍｕｌｌｉｇ ａｎとＢｅｒｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２−１４２７ （１９８０） ；Ｐａｖｌａｋｉｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳ Ａ ７８：７３９８−７４０２ (１９８１)。ヒトサイトメガロウイルス最早期 プロモーターは、都合よく、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限酵素フラグメントとして得 られる。Ｇｒｅｅｎａｗａｙら、Ｇｅｎｅ １８：３５５−３６０ (１９８２) 。ウシポリオーマウイルスをベクターとして用いた、哺乳動物の宿主の中でＤＮ Ａを発現させるための系が米国特許第４，４１９，４４６号に記載されている。 この系を改変したものが、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。 また、免疫インターフェロンをコードするｃＤＮＡのサル細胞での発現について は、Ｇｒａｙら、Ｎａｔｕｒｅ ２９５：５０３−５０８(１９８２)；単純ヘル ペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下での、ヒトβ−イン ターフェロンｃＤＮＡのマウス細胞における発現については、Ｒｅｙｅｓら、Ｎ ａｔｕｒｅ ２９７：５９８−６０１ (１９８２)；ヒトインターフェロンβ１ 遺伝子の培養マウス細胞とウサギ細胞における発現についてはＣａｎａａｎｉと Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：５ １６６−５１７０ (１９８２)；および、マウス肉腫ウイルスのＬＴＲ（長い末 端反復配列）をプロモーターとして用いた、ＣＶ−１サル腎臓細胞、ニワトリ胚 線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、およひマウスＮ ＴＨ−３Ｔ３細胞における、細菌のＣＡＴ配列の発現についてはＧｏｒｍａｎら 、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６７７７ −６７８１（１９８２）も参照。 高等真核生物による、ヘテロマルチマー成分をコードするＤＮＡの転写は、ベ クターの中にエンハンサー配列を挿入することによって亢進することがよくある 。エンハンサーは、方向や位置に比較的無関係であり、転写単位に対して５’側 (Ｌａｉｍｉｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８： ９９３(１９８１))、３’側（Ｌｕｓｋｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．３： １１０８(１９８３)）イントロンの内部(Ｂａｎｅｒｊｉら、Ｃｅｌｌ ３３： ７２９(１９８３))、および、コーディング配列そのものの中（Ｏｓｂｏｒｎｅ ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．４：１２９３(１９８４)）にも見つかっている 。今では、哺乳動物の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェ トプロテイン、およびインシュリン）由来の多くのエンハンサー配列が知られて いる。しかし、典型的には、真核生物細胞のウイルスに由来するエンハンサーが 使用される。例としては、複製開始点の後方側（１００−２７０ｂｐ）にあるＳ Ｖ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターのエンハンサー、 複製開始点の後方側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエン ハンサーなどがある。また、真核生物のプロモーターを活性化するための促進因 子については（Ｙａｎｉｖら、Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７−１８（１９８２） を参照。エンハンサーは、ベクターの中のヘテロマルチマーをコードする配列の ５’側か３’側の位置に挿入することができるが、好ましくは、プロモーターの ５’側の部位に存在する。 真核宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト、またはその他の多細胞 生物からの有核細胞）で用いられる発現ベクターは、転写の終結、およびｍＲＮ Ａの安定化に必要な配列も含んでいる。このような配列は、真核生物またはウイ ルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’側、場合によっては３’側にある非翻訳領域 から広く利用することができる。これらの領域には、ヘテロマルチマーをコード するｍＲＮＡの非翻訳部位のポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌク レオチド分節が含まれる。 上記で挙げた構成要素を一つ以上含む適当なベクターを構築するには、標準的 な結紮技術を用いる。分離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、必要と するプラスミドを作出するのに望ましい形になるように、開裂し、加工してから 再連結する。 構築したプラスミドの配列が正しいことを確認するための解析を行なうために 、結紮混合液を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）を 形質転換して、アンピシリン耐性またはテトラサイクリン耐性によって選抜され た、形質転換に成功した株が適正なものである。形質転換からプラスミドを調製 して、制限酵素消化によって解析し、および／または、Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕ ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.，９：３０９（１９８１）の方法、またはＭ ａｘａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５：４９９（１ ９８０）の方法によって配列決定を行なう。 本発明の実施において特に有用なのは、ヘテロマルチマーをコードするＤＮＡ を哺乳動物細胞の中で一過性発現をもたらす発現ベクターである。一般的には、 一過性発現には、宿主細胞が多くの発現ベクターのコピーをもち、次いで、発現 ベクターによってコードされる所望のポリペプチドを大量に合成するように、宿 主細胞の中で効率的に複製することのできる発現ベクターを使用することが含ま れる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、ｐｐ．１６．１７−１６．２２。適当な発現 ベクターと宿主細胞を含む一過的発現系によって、クローニングされたＤＮＡに よってコードされているポリペプチドを便利に陽性のものを同定することと、所 望の結合特性／親和性、または、本発明によって作出される、天然のジスルフィ ド結合をもたないヘテロマルチマーまたホモマルチマーに対して、所期のゲル泳 動度をもつヘテロマルチマーを迅速にスクリーニングすることが可能になる。 脊椎動物の組換え細胞培養でヘテロマルチマーを合成するように調整するのに 適した、この他の方法、ベクター、および宿主細胞については、Ｇｅｔｈｉｎｇ ら、Ｎａｔｕｒｅ ２９３：６２０−６２５(１９８１)；Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａ ｔｕｒｅ ２８１：４０−４６(１９７９)；欧州特許第１１７，０６０号；およ び欧州特許第１１７，０５８号に記載されている。哺乳動物の培養細胞でヘテロ マルチマーを発現させるのに特に役立つプラスミドは、ｐＲＫ５（欧州特許第３ ０７，２４７号）またはｐＳＶ１６Ｂ（１９９１年６月１３日発行のＰＣＴ国際 特許公開第９１／０８２９１号）である。 ヘテロマルチマーを発現させるために、どの宿主細胞系を選択するかは、主に 、発現ベクターによって決まる。もう一つ考慮すべきなのは、必要とするタンパ ク質量である。ミリグラム単位の量を、一過的形質転換によって産生することが できる。例えば、アデノウイルスＥＩＡ−によって形質転換された２９３ヒト胚 腎臓細胞系を、ヘテロマルチマーの効率的な発現が可能になるよう、リン酸カル シウム法を修正した方法によって、ｐＲＫ５を基本とするベクターで一過的に形 質転換することができる。ＣＤＭ８を基本とするベクターを用いて、ＤＥＡＥ− テキストラン法によってＣＯＳ細胞を形質転換することができる(Ａｒｕｆｆｏ ら、Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３(１９９０)；および、Ｚｅｔｔｍｅｉ ｓｓｌら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ.(ＵＳ)９：３４７−３５３(１９９０)) 。より大量のタンパク質が必要ならば、宿主細胞系を安定的に形質転換させた後 、免疫付着因子を発現させることができる。例えは、ｐＲＫ５を基本とするベク ターを、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする別のベクターの存 在下で、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の中に導入して、Ｇ４１８ に対する抵抗性を付与することができる。Ｇ４１８に抵抗性のクローンは、培養 によって選抜することができる。これらのクローンを、ＤＨＦＲのインヒビター であるメトトレキセートの量を増加させながら培養して、ＤＨＦＲとヘテロマル チマーの配列をコードする遺伝子のコピー数が共に増幅されているクローンを選 抜する。免疫付着因子が、Ｎ末端に疎水性の先導配列をもっていれば、形質転換 された細胞によって加工されて分泌される可能性が高い。より複雑な構造をもつ 免疫付着因子の発現には、特に適した宿主細胞が必要となろう。例えば、軽鎖ま たはＪ鎖などの構成成分は、一定のミエローマまたはハイブリドーマの宿主細胞 によって提供されよう(Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、上記；およびＭａｒｔｉｎら、 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３５６１−３５６８(１９９３))。 本明細書のベクターをクローニングし、発現させるのに適した、この他の宿主 細胞は、上記のような原核生物、酵母、または、高等真核生物の細胞である。こ の目的に適した原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真性細菌 で、例えば、腸内細菌である、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのエシェリ キア属(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ)、エンテロバクター属(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃ ｔｅｒ)、エルウィニア属(Ｅｒｗｉｎｉａ)、クレブシアラ(Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ ａ)、プロテウス属(Ｐｒｏｔｅｕｓ)、例えば、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎ ｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などのサルモネラ属(Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ ａ)、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）などのセラティア属(Ｓ ｅｒｒａｔｉａ)、およびシゲラ属(Ｓｈｉｇｅｌｌａ)、ならびに、枯草菌（Ｂ ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ ｍｉｓ）(例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０で開示され ているＢ．リケニフォルミス４１Ｐ)などのバシラス属、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕ ｇｉｎｏｓａ）などのシュードモナス属、およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒ ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などである。好ましい大腸菌クローニング宿主の一つは大 腸菌２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）であるが、その他、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ １７７６(ＡＴＣＣ ３１，５３７)、および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７ ，３２５）などの菌株も適している。これらの例は、例示のためのものであり、 制限のためのものではない。菌株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ産物の発酵のため の一般的な宿主菌株であるため、この菌株は、特に好ましい宿主、または宿主の 親株である。好ましくは、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌する ものでなければならない。例えば、Ｗ３１１０株を改変してタンパク質をコード する遺伝子に遺伝的変異を生じさせることができる。そのような宿主の例として 、大腸菌Ｗ３１１０の２７Ｃ７株などがある。２７Ｃ７の完全な遺伝子型は、ｔ ｏｎＡΔｐｔｒ３ ｐｈｏＡΔＥ１５ Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｏｍｐ ＴΔｄｅｇＰ４１ｋａｎｒである。２７Ｃ７株は、１９９１年１０月３０日に、 ＡＴＣＣ番号５５，２４４として、アメリカンタイプカルチャーコレクションに 寄託された。または、１９９０年８月７日発行の米国特許第４，９４６，７８３ 号で開示されている、ペリプラズマプロテアーゼの変異体をもつ大腸菌の菌株を 用いることもできる。または、例えば、ＰＣＲ、または、別の核酸のポリメラー ゼ反応などのクローニング法が適している。 原核生物の他に、糸状菌類または酵母のような真核生物微生物が、ヘテロマル チマーをコードするベクターに適したクローニングおよび発現のための宿主であ る。サッカロマイセス・セレビシアエ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ)、すなわち一般的なパン酵母が、下等な真核生物宿主微生物の中 で、もっとも一般的に用いられている。しかし、本明細書においては、分裂酵母 （Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）(ＢｅａｃｈとＮｕ ｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ ２９０：１４０(１９８１)；１９８５年５月２日発行の 欧州特許第１３９，３８３号)；クルイベロマイセス属の宿主（米国特許第４， ９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒら、上記）で、例えば、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌ ａｃｔｉｓ）(ＭＷ９８−８Ｃ，ＣＢＳ６８３，ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎ ｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.，７３７(１９８３))、Ｋ．フラジリス （Ｋ．ｆｒａｇｉｌｅｓ）(ＡＴＣＣ １２，４２４)、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）(ＡＴＣＣ １６，０４５)、Ｋ．ウィケラミイ（Ｋ．ｗ ｉｃｈｅｒａｍｉｉ）(ＡＴＣＣ ２４，１７８)、Ｋ．ワルティイ（Ｋ．ｗａｌ ｔｉｉ）(ＡＴＣＣ ５６，５００)、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐ ｈｉｌａｒｕｍ）(ＡＴＣＣ ３６，９０６；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら、上 記)、Ｋ．テルモトレランス(Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ)、およびＫ． マルキサヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）など；ヤロウィア属（ｙａｒｒｏｗｉ ａ）(欧州特許第４０２，２２６号)；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａ ｓｔｏｒｉｓ）(欧州特許第１８３，０７０号；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：２６５−２７８(１９８８))；カン ジダ属；トリコデルマ・レエシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）( 欧州特許第２４４，２３４号)；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏ ｒａ ｃｒａｓｓａ）(Ｃａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６：５２５９−５２６３(１９７９))；シュワニオマイセス・オクシ デンタリス（Ｓｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などの シュワニオマイセス属(１９９０年１０月３１日発行の欧州特許第３９４，５３ ８号)；および、例えば、ニューロスポラ属、ペニシリウム属(Ｐｅｎｉｃｉｌｌ ｉｕｍ)、トリポタラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）などの糸状菌(１ ９９１年１月１０日発行の国際特許公開第９１／００３５７号)、ならびに、ア ウペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば、Ａ．ニドランス（Ａ ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）(Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１２：２８４−２８９(１ ９８３)；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ ２６：２０５−２２１(１９８３)；Ｙ ｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７ ０−１４７４(１９８４)、およびＡ．ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）(Ｋｅｌｌｙ とＨｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．４：４７５−４７９(１９８５))など、この他数 多くの属、種、および株を用いることが可能であり、また有用でもある。 グリコシル化されたヘテロマルチマーを発現させるのに適した宿主細胞は、多 細胞生物由来のものである。そのような宿主細胞は、複雑なプロセッシングを行 なうことができ、グリコシル化活性をもつ。原則として、脊椎動物由来でも、無 脊椎動物由来でも、どのような高等真核生物の細胞培養を使うこともできる。無 脊椎動物細胞の例としては、植物細胞、昆虫細胞などがある。多数のバキュロウ イルス株とその変異株、および対応する昆虫宿主許容細胞として、スポドプテラ ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）(毛虫)、アエ デス・アエギプチ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）(蚊)、アエデス・アルボピク タス（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）(蚊)、ドロソフィラ・メラノガスタ ー（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）(ショウジョウバエ)、 およびボムビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などか確認されている。例 えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７−５５(１９ ８８)；Ｓｅｔｌｏｗら編、遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｒｒｉ ｎｇ）第８巻より、Ｍｉｌｌｅｒら、ｐｐ．２７７−２７９(プレナムパブリッ シング社(Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ)、１９８６年)；および、Ｍａ ｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２−５９４（１９８５）を参照。例えば 、アウトグラファ・カリフォニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｎｉｃ ａ）ＮＰＶのＬ−１変異株、およびカイコＮＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ ＰＶ）のＢｍ−５株など、形質転換用のさまざまなウイルス株が一般に利用可能 であり、そのようなウイルスは、本明細書において、本発明に記載されているウ イルスとして、特に、スポドプテラ・フルギペルダ（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆ ｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞の形質転換に用いることができる。 ワタ、トウモロコシ、バレイショ、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバ コの植物培養細胞を宿主として利用することができる。典型的には、予め、ヘテ ロマルチマーＤＮＡを持つように操作してあるアグロバクテリウム・ツメファシ エンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌の一定の菌 株とインキュベートして、植物細胞を形質転換する。植物培養細胞をＡ．ツメフ ァシエンスとインキュベートしている間に、ヘテロマルチマーをコードしている ＤＮＡが植物細胞宿主に移行して、それを形質転換し、適当な条件の下でヘテロ マルチマーを発現させる。さらに、ノパリンシンターゼプロモーター、およびポ リアデニル化シグナル配列のように、植物細胞と親和性のある調節配列とシグナ ル配列を利用することができる。Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ． Ｇｅｎ．１：５６１(１９８２)。なお、Ｔ−ＤＮＡ ７８０遺伝子の上流領域か ら分離したＤＮＡ分節は、組換えＤＮＡを含む植物組織において、植物で発現す る遺伝子の転写レベルを活性化あるいは上昇させることができる。１９８９年６ 月２１日発行の欧州特許第３２１，１９６号。 好ましい宿主は脊椎動物の細胞であり、脊椎動物の細胞を培養して増殖させる こと（組織培養）は、近年では日常的な処理になっている(アカデミックプレス 社(Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ)、ＫｒｕｓｅとＰａｔｔｅｒｓｏｎ編、組織 培養（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）(１９７３))。有用な哺乳動物の宿主細 胞系の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統(ＣＯＳ−７，ＡＴ ＣＣ ＣＲＬ １６５１)；ヒト胚腎臓系統(２９３、または、懸濁培養で増殖さ せるためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．３６：５９(１９７７))；仔ハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、Ｕｒ ｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７ ７：４２１６(１９８０))；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉ ｏｌ．Ｒｅｐｏｄ．２３：２４３−２５１(１９８０)）；サル腎臓細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０)；アフリカミドリザルの腎臓細胞(ＶＥＲＯ−７６、 ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７)；ヒト子宮頚部ガン細胞(ＨＥＬＡ、 ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２)；イヌ腎臓細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４)；バッファロ ーラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５)；ヒト肝 臓細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；マウス乳ガン(ＭＭＴ ０６０５６２ ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１)；ＴＲＩ細胞(Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ． Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８(１９８２))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ ４細胞；およびヒトヘパトーマ系（Ｈｅｐ Ｇ２）である。 宿主細胞を本発明の上記発現ベクターまたはクローニングベクターによって形 質転換して、プロモーターを誘導したり、形質転換体を選抜したり、または所望 の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適合するように修正した通常の培地で 培養する。用いる宿主細胞によって、その細胞に適した標準的な技術を用いて形 質転換を行なう。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記の１．８２節で説明されているよう に、一般的には、実質的な細胞壁という障壁を含む、原核生物またはその他の細 胞に対して、塩化カルシウムを用いたカルシウム処理、またはエレクトロポレー ションを用いる。Ｓｈａｗら、Ｇｅｎｅ ２３：３１５(１９８３)、および１９ ８９年６月２９日発行の国際特許公開第８９／０５８５９号に記載されているよ うにして、アクロバクテリウム・ツメファシエンスによる感染を、一定の植物細 胞を形質転換するために用いる。さらに、１９９１年１月１０日発行の国際特許 公開第９１／００３５８号に記載されているようにして、超音波を用いて、植物 を形質転換することができる。 このような細胞壁をもたない哺乳動物細胞については、Ｇｒａｈａｍとｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４５７（１９７８）のリン酸 カルシウム法が好ましい。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の一般的な態様を、１ ９８３年８月１６日発行の米国特許第４，３９９，２１６号において、Ａｘｅｌ が記述している。酵母への形質転換は、一般的には、Ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ ら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３０：９４６(１９７７)、およびＨｓｉａｏら、Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：３８２９（１９７９）の方法に したがって行われる。ＤＮＡを細胞の中に導入するために、核へのマイクロイン ジェクション、エレクトロポレーション、無処理の細胞とバクテリアのプロトプ ラストとの融合、または、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンなどのポリカチ オンのような別の方法を用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換する ためのさまざまな技術については、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ ｚｙｍｏｌｏｇｙ(１９８９)、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ ｍｏｌｏｇｙ １８５：５２７−５３７(１９９０)、およびＭａｎｓｏｕｒら、 Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照。 本発明のヘテロマルチマーポリペプチドを産生するために用いた原核生物細胞 を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記において、一般的に説明されているところにした がって、適当な培地で培養する。 本発明のヘテロマルチマーを産生するために用いた哺乳動物宿主細胞は、さま ざまな培地出培養することができる。宿主細胞を培養するには、Ｈａｍ’ｓ Ｆ １０(シグマ社(Ｓｉｇｍａ))、最小必須培地((ＭＥＭ)、シグマ社)、ＲＰＭＩ− １６４０(シグマ社)、およびダルベッコの修正イーグル培地((ＤＭＥＭ)、シグ マ社)などの市販の培地が適当である。さらに、それらの開示内容がすべて、参 照してここに組み込まれる、ＨａｍとＷａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８ ：４４(１９７９)、ＢａｒｎｅｓとＳａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０ ２：２５５(１９８０)、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６ ６号；第４，９２７，７６２号；または、第４，５６０，６５５号；国際特許公 開第９０／０３４３０号；国際特許公開第８７／００１９５号；米国特許第４， ７９１，１９２号；および米国特許（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｒｅ.）第３０， ９８５号；または、米国特許第５，１２２，４６９号に記載されている培地のい ずれかを、宿主細胞用の培養培地として用いることができる。これらの培地はど れも、必要ならは、ホルモンおよび／またはその他の増殖因子(インシュリン、 トランスフェリン、または上皮増殖因子など)、塩類(塩化ナトリウム、カルシウ ム、マグネシウム、およびリン酸)、緩衝液(ＨＥＰＥＳなど)、ヌクレオシド(ア デノシンおよびチミジンなど)、抗生物質(登録商標ゲンタマイシン薬剤)、微量 要素(最終濃度がマイクロモルの単位で存在する無機化合物と定義される)、およ びグルコースまたは同等のエネルギー源を添加することもできる。この他の添加 物も、当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。温度、ｐＨなどの 培養条件は、発現させるために選ばれた宿主細胞によって以前用いられた条件で あり、当業者にとっては明らかである。 一般的に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコー ル、および実際の技術については、ＩＲＬプレス社(ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ)、１９ ９１年、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編、哺乳動物細胞のバイオテクノロジー：実際的方法 （Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａＰｒａｃｔ ｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）に書かれている。 本開示で言及されている宿主細胞は培養細胞だけでなく、宿主動物の中の細胞 も含む。 ４．ヘテロマルチマーの回収 ヘテロマルチマーは、好ましくは、一般的に、分泌ポリペプチドとして、培養 培地から回収するが、分泌シグナルなしに、直接産生されたときには、宿主細胞 溶解物から回収する。ヘテロマルチマーに膜結合があるときには、適当な界面活 性剤（例：Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００）を用いて膜から解離することができる。 ヒトに由来しない組換え細胞の中でヘテロマルチマーが産生されたときには、 ヒト由来のタンパク質やポリペプチドを全く含まない。しかし、組換え細胞のタ ンパク質やポリペプチドからヘテロマルチマーを精製して、ヘテロマルチマーに ついて実質的に均質な調製物を得る必要がある。最初の工程として、培養培地ま たは細胞溶解物を普通に遠心分離して、微粒子化した細胞残滓を取り除く。 抗体の定常部位をもつヘテロマルチマーは、ハイドロキシアパタイトクロマト グラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーに よって、都合のよいように精製することができるが、アフィニティークロマトグ ラフィーが好ましい精製技術である。ヘテロマルチマーがＣＨ３部位を含むとき は、登録商標ベーカーボンド ＡＢＸ(Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ)樹脂(Ｊ． Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ニュージャージー州フィリップスバーグ(Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂ ｕｒｇ))が、精製するために有用である。この他に、イオン交換カラムによる分 画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、ヘパリ ンセファロースによるクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ ポリアスパラギン酸カラムなど）によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカ シング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫安沈殿などのタンパク質精製技術も、 回収するポリペプチドによっては利用可能である。親和性リガンドとしてのプロ テインＡの適合性は、キメラで用いられた免疫グロブリンＦｃドメインの種類お よびアイソタイプによって異なる。プロテインＡを用いて、ヒトγ１、γ２、ま たはγ４のＨ鎖に基づいて、免疫付着因子を精製することができる(Ｌｉｎｄｍ ａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３(１９８３))。マウ スのアイソタイプのすべてとヒトγ３（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６ ７−１５７５(１９８６)）には、プロテインＧが推奨されている。親和性リガン ドが結合する基質は、もっとも普通にはアガロースであるが、その他の基質を用 いることもできる。調節された多孔性ガラスビーズ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｐｏ ｒｅ ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンジンのような物理的に 安定した基質なら、アガロースを用いるよりも流速が早くなり、短い処理時間で できる。プロテインＡまたはＧアフィニティーカラムに免疫付着因子を結合させ る条件は、Ｆｃ部位の特徴によって全面的に決定される。すなわち、その分子種 とアイソタイプによって決まる。一般的には、適正なリガンドが選択されれば、 直接、条件付けていない培養溶液からでも、効率的な結合が起こる。免疫付着因 子の顕著な特徴の一つは、ヒトγ１分子で、同じＦｃ型の抗体に較べて、プロテ インＡに対する結合能力が幾分低下することである。結合した免疫付着因子は、 酸性ｐＨ（３．０かそれ以上）で、または、僅かにカオトロピックな塩を含む中 性ｐＨの緩衝液の中で効率的に溶出することできる。このアフィニティークロマ トグラフィー工程によって、＞９５％純粋なヘテロマルチマー調製物を作製する ことができる。 ５．共通の軽鎖をもつヘテロマルチマーの多官能性抗体の使用 ヘテロマルチマーについては、治療薬としての多くの応用が考えられる。例え ば、細胞傷害性を切り換える（例：腫瘍細胞を殺す）ために、ワクチンのアジュ バントして、血栓溶解剤を血餅まで輸送するために、標的部位（例えば、腫瘍） で、酵素的に活性化されたプロドラッグを転化するために、感染病を治療するた めに、免疫複合体を細胞表面へと向かわせるために、または、腫瘍細胞にイムノ トキシンを輸送するためにヘテロマルチマーを用いることができる。例えば、ク ラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体であるモデル内皮抗原を標的とすることによ って、抗体−リシンイムノトキシンによって、腫瘍の脈管構造を標的とすること ができた(Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ｆ．Ｊ．とＴｈｏｒｐｅ，Ｐ．Ｅ．（１９９３）Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８９９６−９０００)。 抗−内皮イムノトキシンを別のイムノトキシンと組み合わせることによって、腫 瘍細胞そのものに対する有意に高い効能が得られた(Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ｆ．Ｊ． とＴｈｏｒｐｅ，Ｐ．Ｅ．（１９９３）上記)。最近、双特異的抗体を用いて、 組織因子を腫瘍脈管構造に向かわせることに成功し、かなり高い抗腫瘍効果を生 じる局所的な血栓症を引き起こした(Ｈｕａｎｇ，Ｘら、（１９９７）Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ２７５：５４７−５５０)。さらに、双特異的抗体を用いて、細胞傷害 性Ｔ細胞に、インビトロで、標的乳ガン細胞およびＢ細胞リンパ腫細胞を殺させ ることに成功した(Ｚｈｕ，Ｚ．ら、（１９９６）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ １４：１９２−１９６；およびＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、（１９９６）Ｐ ｒｏｔｅｉｎ． Ｅｎｇｉｎ．９：２９９−３０５)。 望ましい精製度をもつヘテロマルチマーを、選択的に、生理学的に許容できる 担体、賦形剤、または安定剤（レミントンの製薬科学(Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ)、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ ．編(１９８０)）と混合して、凍結乾燥した固形または水溶液の形状で保存する ために、ヘテロマルチマーの治療用処方剤を調製する。許容される担体、賦形剤 、または安定剤は、用いられる投薬量と濃度では受容者にとって非毒性で、リン 酸、クエン酸、およびその他の有機酸などを含む緩衝液；アスコルビン酸などの 抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチ ン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの疎水 性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシン などのアミノ酸；単糖類；二糖類；および、グルコース、マンノース、またはデ キストリンなどの糖類；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトール、またはソ ルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；およ び／または、トィーン(Ｔｗｅｅｎ)、プルロニクス（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）また はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの界面活性剤を含んでいる。 ヘテロマルチマーは、例えば、コアセルベート化技術、または界面ポリマー化 （例えば、ヒドロキシメチルセルロース、または、それぞれ、ゼラチン−マイク ロカプセルおよびポリ−［メチルメトアシレート］マイクロカプセル）によって 調製されたマイクロカプセルの中に取り込んだり、コロイド剤送達システム（例 えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子 、およびナノカプセル）に取り込んだり、または、マクロエマルジョンの中に取 り込んだりすることができる。このような技術については、レミントンの製薬科 学(Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ) 、上記で開示されている。 インビボでの投与に用いるヘテロマルチマーは、滅菌されていなければならな い。これは、凍結乾燥および再構成の前か後に、滅菌フィルター膜で濾過すれば 簡単に行なえる。ヘテロマルチマーは、通常、凍結乾燥状態か水溶液の状態で保 存する。 治療用ヘテロマルチマー組成物は、一般的に、滅菌的に接触することのできる 通路をもった容器、例えば、静脈注射用のバック、または皮下注射用の注射針に よって貫通することのできる栓をもったバイアルの中に置かれる。 ヘテロマルチマーの投与経路は、例えば、静脈、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内 、動脈内、または病巣内などの経路による注射または点滴のような既知の方法、 または下記に示すような徐放性システムによる。ヘテロマルチマーは、点滴また はボーラス注射によって、連続的に投与する。 徐放性調製物の適当な例は、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透過性 基質で、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような形のあるものになっ ている基質を含む。徐放性基質の例は、Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍ ａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７(１９８１)、およびＬａｎｇｅｒ、Ｃ ｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２）に記載されているポリエス テル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチル−メトアクリル酸)、ま たはポリ(ビニルアルコール)、ポリアクチド(米国特許第３，７７３，９１９号 、欧州特許第５８，４８１号)、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタ ミン酸のコポリマー(Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５ ４７−５５６(１９８３))、非分解性エチレン−ビニル酢酸（Ｌａｎｇｅｒら、 上記）(欧州特許第１３３，９８８号)、登録商標ルプロンデポット（Ｌｕｐｒｏ ｎ Ｄｅｐｏｔ）のような分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー(乳酸−グリ コール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフィア)、およ びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）など がある。 エチレン−ビニル酢酸、および乳酸−グリコール酸などのコポリマーは、１０ ０日間にわたって分子を放出することが可能であるが、ある種のヒドロゲルでは 、タンパク質を放出する期間が短くなる。カプセルに入ったタンパク質は、長時 間体内に残留して、３７℃で湿気に曝される結果、変性するか凝集して、生物学 的活性を失うことになり、免疫原性にも変化が生じうる。関係するメカニズムに よって、タンパク質を安定化させるための合理的な方策を考え出すことができる 。例えば、凝集を起こすメカニズムが、チオ−ジスルフィド基の交換による分子 内Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見されていれば、スルフィドリル残基を修飾し 、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を調節し、適当な添加剤を使用し、また 、特異的なポリマー基質組成物を開発することによって、安定させることができ る。 また、徐放性ヘテロマルチマー組成物は、リポソームによって取り込まれたヘ テロマルチマーでもよい。ヘテロマルチマーを含むリポソームは、それ自体は既 知の方法：独国特許第３，２１８，１２１号；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）； Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４０３０ −４０３４(１９８０)；欧州特許第５２，３２２号；欧州特許第３６，６７６号 ；欧州特許第８８，０４６号：欧州特許第１４３，９４９号；欧州特許第１４２ ，６４１号；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５， ０４５号および第４，５４４，５４５号；ならびに欧州特許第１０２，３２４号 によって調製される。通常、リポソームは、小さな（２００−８００オングスト ローム）均一ラメラ型で、脂質成分が約３０ｍｏｌ．％コレステロールよりも高 く、ヘテロマルチマー治療を最適なものにするために、選ばれた部位が調整され ている。 治療に用いるヘテロマルチマーの効果的な用量は、例えば、治療目的、投与経 路、および患者の症状によって変わる。したがって、至適な治療効果を得るため には、治療者が用量を希釈したり、投与経路を変更することが必要となろう。典 型的な毎日の投与量は、上記の要素によって、約１μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋ ｇかそれよりも多い量になろう。典型的には、臨床医は、所期の効果を納めるま で、ヘテロマルチマーの投薬を続けることになろう。この治療の進行状況は、常 法によって容易に観察される。 本明細書に記述されているヘテロマルチマーは、酵素免疫測定法で用いること もできる。それを行なうためには、結合によって、酵素を阻害しないために、ヘ テロマルチマーの一方のアームを、酵素上の特異的なエピトープに結合するよう に設計することができ、ヘテロマルチマーのもう一方のアームを、所望の部位で 、酵素が確実に高濃度になるようにしながら、固定基質に結合するように設計す ることができる。このような診断用ヘテロマルチマーの例としては、ＩｇＧ、お よびフェリチンに対する特性を持ったヘテロマルチマー、および、ホースラディ ッシュパーオキシダーゼ(ＨＲＰ)、ならびに、例えば、ホルモンに対する結合特 異性をもつヘテロマルチマーなどがある。 このヘテロマルチマーは、２部位免疫測定法に用いるよう設計することもでき る。例えば、双特異的な２つのヘテロマルチマーを産生させて、解析するタンパ ク質上の２つの別々のエピトープに結合させるが、一方のヘテロマルチマーは、 不溶性の基質と複合体になるように結合し、もう一方は、指示酵素に結合する。 また、ヘテロマルチマーは、ガンなど、さまざまな病気のインビトロおよびイ ンビボでの免疫診断に用いることもできる。この診断への使用を容易にするため に、ヘテロマルチマーの一方のアームを腫瘍関連抗原に結合するように設計し、 もう一方のアームを検出用マーカー(例えは、放射性核種に結合するキレート剤) に結合するように設計することができる。例えば、腫瘍関連抗原ＣＥＡ、および 二価性ハプテンに対して特異性をもつヘテロマルチマーは、結腸直腸ガンと甲状 腺ガンを画像化するために用いることができる。この他にも、ヘテロマルチマー を、治療ではなく診断に使用できることは当業者にとって明らかであろう。 診断に応用するためには、ヘテロマルチマーの少なくとも一方のアームが、典 型的には、直接的または間接的に、検出可能な部分によって標識されている。例 えば、検出可能な部分は、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、または¹²⁵Ｉなどの放射性同 位元素；フルオロセインイソチオシアナート、ローダミン、またはルシフェリン などの蛍光化合物または化学発光化合物；または、アルカリホスファターゼ、β −ガラタトシダーゼ、またはホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）な どの酵素であろう。 ヘテロマルチマーを検出可能な部分に別々に結合させるために、当技術分野に おいて既知の方法を用いることができるが、そのような方法には、Ｈｕｎｔｅｒ ら、Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５(１９６２)；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ １３：１０１４(１９７４)；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ ｅｔｈ．４０：２１９(１９８１)；および、Ｎｙｇｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅ ｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７（１９８２）に記載されている方 法などがある。 本発明のヘテロマルチマーは、競合結合アッセイ法、直接および間接サンドイ ッチアッセイ法、および免疫沈殿法など、既知のアッセイ法に用いることができ る。Ｚｏｌａ、モノクローナル抗体：技術マニュアル(Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ)，ｐ ｐ．１４７−１５８（ＣＲＣプレス社（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ.，１９８ ７） 競合結合アッセイ法は、限られた量のヘテロマルチマーへの結合をめぐって、 標識された標準化合物が、解析対象の試験用サンプルと競合できることに基づい ている。試験サンプル中の解析化合物の量は、ヘテロマルチマーに結合した標準 化合物の量に反比例する。結合した標準化合物の量を容易に決定するために、ヘ テロマルチマーは、一般的に、競合の前か後に不溶化して、ヘテロマルチマーに 結合している標準化合物と解析化合物が、非結合のままの標準化合物と解析化合 物とから都合良く分離できるようにする。 このヘテロマルチマーは、それぞれが、検出すべきサンプルの異なった免疫原 部分またはエピトープに結合することのできる２種類の分子を使用することを含 むサンドイッチアッセイ法にとって、特に有用である。サンドイッチアッセイ法 において、試験用サンプルの解析化合物は、固体担体上に固定されたヘテロマル チマーの一方のアームに結合していて、その後、ヘテロマルチマーのもう一方の アームが解析化合物に結合して、３つの部分からなる不溶性の複合体を形成する 。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照。ヘテロマルチマー自体の第 二のアームを、検出可能部分によって標識する（直接的サンドイッチアッセイ法 ）か、または、検出可能部分によって標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて 測定することができる(間接的サンドイッチアッセイ法)。例えば、サンドイッチ アッセイ法の一つのタイプは、ＥＬＩＳＡ法であるが、この場合には、検出可能 部分は酵素である。 以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の実施例である。実施例は、 例示目的のだけに示されているのであって、いかなる意味でも、本発明の範囲を 制限するためのものではない。 本明細書において引用されている刊行物、特許、および特許出願は、上記のも のも下記のものもすべてが参照してここに組み込まれる。 実施例 計画がＦｃ-含有ＢｓＡｂ(図1C)を製造するために提供される。この計画にお いて、我々はそれがヘテロダイマー化であるがホモダイマー化されないように抗 体重鎖のＣ_H３を工作している。これは、論理的設計(Ridgwayら，上記(1996))及 びここに記載した通りのファージディスプレー選択によって得られた立体的相補 変異と共同してＣ_H３ドメイン中に相互-鎖ジスルフィド結合を設けることによっ て達成された。両方の抗原結合特異性用の単軽鎖の使用は、軽鎖誤対合の問題を 避ける(図1A-1C)。同じ軽鎖を持った抗体は、非常に大きなヒトｓｃＦｖライブ ラリーを選別することによって容易に分離された(Vaughan,T.J.ら,(1996)上記) 。 実施例１：空洞への隆起(protuberance-into-cavity)ヘテロマルチマー免疫付着 因子の生成 Chamowら,J.Imminol.153:4268(1994)により先に記載されたヒト化抗-ＣＤ３／ ＣＤ４-ＩｇＧキメラは、回収できたヘテロマルチマーのパーセンテージを最 大化するように構築した。空洞への隆起及び野生型Ｃ_H３変異体は、ヒト化抗体- 免疫付着因子キメラ(Ab/Ia)抗-CD3/CD4-IgGの形成を導くその能力を比較した。 かくして変異体は、ヒト化抗-ＣＤ３抗体重鎖のＣ_H３ドメインに及びミスマッ チオリゴヌクレオチドを用いたサイト-誘導変異誘発(Kunkelら,Methods Enzymol .154:367(1987)とP.Carter,in Mutagenesis:a Practical Approach,M.J.McPhers on,Ed.,IRL Press,Oxford,UK,pp.1-25(1991))によってＣＤ４-ＩｇＧ中で構築さ れ、且つジデオキシヌクレオチド配列によって実証した(Sangerら，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 74:5463(1977))。次の表３を参照 残基Ｔ３６６は、パートナーＣ_H３ドメイン上の残基Ｙ４０７の水素結合間隔 内にある。実際は、残基Ｔ３６６への主要な分子間接触は、残基Ｙ４０７に対す る及び逆の場合も同じである。一つの空洞への隆起ペアは、一つのＣ_H３ドメイ ン中のＴ３６６Ｙとそのパートナードメイン中のＹ４０７Ｔの相互の変異を持っ たこれらの残基を逆転することによって創製され、かくしてその界面で側鎖の容 量が維持される。変異は、Kabat数付与システム(Kabatら，(1991)上記)を用いて その位置の次の野生型残基によって、そして一文字コードで残基の置換が定義さ れる。複数変異は、コロンによって単一変異成分をリスト化することによって定 義される。 抗-ＣＤ３軽鎖(L)と重鎖(H)変異体(Shalabyら,J.Exp.Mcd.175:217(1992)とRod rigesら,Int.J.Cancer(上記)7:45(1992))をコードしているファージミドは、以 前に記載された通り(Chamowら，J．Immunol．153:4268(1994))、ファージミドを コードしているＣＤ４-ＩｇＧ変異体(Byrnら,Nature 344:667(1990))と一緒に、 ヒト胎児性腎細胞，２９３Ｓ中に共移入(co-transfected)した。移入されたファ ージミドＤＮＡの全量は固定した一方、異なるＤＮＡの比率はＡｂ／Ｉａキメラ の生産を最大化するように変えた。投入ＤＮＡｓ(15μｇトータル)Ｉａ：重鎖： 軽鎖の割合(質量で)は以下の通り：8:1:3；7:1:3；6:1:3；5:1:3；4:1:3；3:1:3 ；1:0:0。 その生産物は、レーザーデンシトメトリースキャニングに続くＳＤＳ-ＰＡＧ Ｅによる分析の前にスタヒロコッカス蛋白質(ProSep A,BioProcessing Ltd,UK) を用いてアフィニティー精製した。重鎖ＤＮＡを超える過剰軽鎖は、制限化され るものからの軽鎖を回避するために用いた。生産物の同定は、アミノ末端配列決 定に続きＰＶＤＦ膜(Matsudaira,J.Biol.Chem.262:10035(1987))での電気ブロッ ティングによって証明した。 重鎖及び野生型Ｃ_H３を組み込んでいるＩａ用のそれと一緒に軽鎖用のファー ジミドの共移入は、予期した通り、Ａｂ／Ｉａキメラ，ＩｇＧとＩａホモダイマ ー生産物の混合物となる(Chamowら，J．Immunol．153:4268(1994))。抗体重鎖プ ラス軽鎖をコードしている投入ＤＮＡのより大きなフラクション又はホモダイマ ーに一致するより高いフラクションを回収した。Ｉａ：Ｈ：Ｌの６：１：３の投 入ＤＮＡ比では、Ｉａホモダイマー(22.5％)とＩｇＧ(23.0％)の類似フラクショ ンと共に54.5％のＡｂ／Ｉａキメラを生じた。これらの比率は、分析方法によっ て導かれるバイアスを伴わず重鎖のランダムな組合せに続く各鎖の等モル発現か ら予期されたそれらと良く一致する：50％ Ａｂ／Ｉａキメラ、25％ Ｉａホモ ダイマー及び25％ ＩｇＧ。 野生型Ｃ_H３を含有している鎖に対して、Ａｂ／Ｉａキメラは、Ｙ４０７Ｔ空 洞とＴ３６６Ｙ隆起変異をそれぞれ抗-ＣＤ３重鎖とＣＤ４-ＩｇＧ Ｉａに含有 せしめた共移入体から92％までの収率で回収された。抗体/免疫付着因子キメラ の同様の収量は、もしこれらの相互変異が重鎖の隆起及びＩａ中の空洞により設 けられたならば得られた。両方のケースにおいてモノマーは、隆起を含むが空洞 のないその鎖で観測された。いずれか１つの理論に制限することなしに、Ｔ３６ ６Ｙ隆起がＹ４０７Ｔ空洞よりもホモダイマー形成のためにより分裂されると確 信する。Ａｂ／Ｉａハイブリッドのフラクションは、隆起と空洞(Ａｂ Ｔ３６６ Ｗ，Ｉａ Ｙ４０７Ａ)の両者のサイズを増加することによって有意に変更される ことはない。第２の隆起と空洞ペア(Ａｂ Ｆ４０５Ａ，ＩａＴ３９４Ｗ)は、ホ モダイマー化するＩａ Ｔ３９４Ｗ隆起変異体の予期しない傾向を補うための投 入ＤＮＡの小さいフラクションを用いてＡｂ／Ｉａの71％までを生じた。２つの 独立した空洞への隆起変異体ペア(Ab T366Y：F405A、Ia T394W：Y407T)の組合せ は、Ａｂ Ｔ３６６Ｙ，Ｉａ Ｙ４０７Ｔペア以上にはＡｂ／Ｉａハイブリッドの 生産を改善しない。 Ｔ３６６ＹとＹ４０７Ｔ変異体ペアにより得られたＡｂ／Ｉａキメラのフラク ションは、試験した範囲にわたり、投入ＤＮＡｓの比に実質的に非従属であった 。さらに汚染している種は、mono S HR 5/5カラム(Pharmacia,Piscataway,NJ)上 でイオン交換クロマトグラフィー(20mMトリス塩酸，pH8.0中0-300mM ＮａＣｌ) によってＡｂ／Ｉａキメラから容易に除去された。これは、ＡｂとＩａの相対的 な発現レベルが一時的な発現系におけるよりも容易な操作性が劣る、安定な細胞 系を用いた大量のＡｂ／Ｉａキメラの製造のために良好であると予想する。 同定した空洞への隆起変異体は、４又はそれ以下にまで下がった、可能性のあ る１０の主要な種(Sureshら，Methods Enzymol.121:210(1990))から得られた生 産物の混合物の複雑性を減じることによってＦｃ-含有ＢｓＡｂの潜在的な適用 を増加することが予期される(図1A-1B)。Ｔ３６６ＹとＹ４０７Ｔが完全に保存 され且つＩｇＧ₁のＣ_H３ドメイン界面で他の残基が高度に保存されることから、 Ｔ３６６ＹとＹ４０７Ｔ変異体ペアは、他のヒトＴｇＧアイソタイプ(IgG₂，IgG₃ 又はIgG₄のような)のヘテロマルチマーを生産するために有用とされるであろう 。 実施例２：ヘテロマルチマーの免疫付着因子中の非天然存在ジスルフィド結合の 生成 Ａ． Ｃ_H３相互鎖-ジスルフィド結合の設計 ３つの基準を、パートナーＣ_H３ドメイン間のジスルフィド結合を作るための 残基のペアを同定するために使用した：ｉ）Ｃα分離は、好ましくは自然ジスル フィド結合中に見出されるそれに類似している(5.0から6.8Å)(Srinivasan,N.等 ,Int.J.Peptides Protein Res.36:147-155(1990))。7.6Åまでの間隔は、主鎖移 動を許すことおよび低い分解能の結晶構造での原子の位置を考慮することを許し た(Deisenfofer，Biochemistry 20:2361-2370(1981))。ii）Ｃα原子は、２つの Ｃ_H３ドメイン上の異なる残基上にあるだろう。iii）その残基はジスルフィド結 合を与えるように位置付けられる(Srinivasan,N.ら,上記)。 Ｂ． ジスルフィド結合のモデル化。ジスルフィド結合は、Insight II relea se 95.0(Biosym/MSI)を用いてhumAb4D5-Fvについて記載された通り(Rodriguesら ，Cancer Res.55:63-70(1995))、ヒトＩｇＧ₁Ｆｃ(Deisenhofer，上記)中にモデ ル化した。 Ｃ． Ｃ_H３変異体。変異は、以下の合成オリゴヌクレオチドを用いて、特定 部位の突然変異誘発(Kunkelら，Methods Enzymol.154:367-382(1987))によって ヒト化した抗-ＣＤ３重鎖又はＣＤ４-ＩｇＧのＣ_H３ドメイン中に導入した： 変異は、置換アミノ酸の次の、アミノ酸残基と数(Kabatら，上記(1991)のＥｕ 数字付与スキーム)によって表した。多重変異は、コロンによって分けた単一の 変異によって表される。変異体は、シーケナーゼversion 2.0(United States Bi ochemicals，Cleveland，OH)を用いるジデオキシヌクレオチド配列決定(Sanger ら,上記(1977))によって確証した。 Ｄ． ヘテロダイマー形成を増大する相互-鎖ジスルフィド。Ｃ_H３ドメイン中 に相互-鎖ジスルフィド結合を含んでいる６ペアの分子("ジスルフィド-Ｃ_H３"変 異体；v1-v6，表４)は、Ａｂ／Ｉａハイブリッド、抗-CD3/CD4-IgG(Chamowら， 上記(1994))の形成を導くその能力において親の分子と比較した。ＣＤ４-ＩｇＧ 及び抗-ＣＤ３重鎖変異体をコードしているプラスミドは、抗-ＣＤ３軽鎖をコー ドしている過剰のプラスミドと一緒に、２９３Ｓ細胞中に共移入した。ヘテロダ イマーの収量は、Ｉａ：Ｈ鎖：Ｌ鎖ＤＮＡ比の範囲を持った移入により至適化し た。Ａｂ／Ｉａヘテロダイマー、ＩｇＧ及びＩａホモダイマー生産物は、ストレ プトコッカス蛋白質Ａアフィニティー-精製し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥとレーザーデン シトメトリースキャニング(Ridgwayら,上記(1996))によって定量した。 それぞれのジスルフィド-Ｃ_H３ペアは、親の分子に類似した、３つの主要な種 を生じる。しかしながら、ジスルフィド-Ｃ_H３変異体からのＡｂ／Ｉａヘテロマ ーは、Ｃ_H３ドメイン中の相互-鎖ジスルフィドの形成に一致する、電気泳動の移 動でシフトした。ジスルフィド結合形成の更なる証拠は、ヒンジにおいて相互- 鎖ジスルフィドによって提供された。共有結合したＡｂ／Ｉａハイブリッドは、 ジスルフィドＣ_H３変異体用の、しかしヒンジシステインがセリンに変異した野 生型Ｃ_H３ドメインを持った分子用ではないＳＤＳ-ＰＡＧＥによって観測された 。ジスルフィドＣ_H３変異体を製造し、Y349C/S354'C，Y349C/E356'C，Y349C/E35 7'C，L351C/E354'C，T394C/E397'C,及びD399C/K392Cと定義した。唯一の変異体( D399C/K392'C)は、該変異体のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析による測定として野生型を越 えるＡｂ／Ｉａハイブリッドの収量を実質的に増加した(それぞれ７６％対５２ ％)。変異は、置換アミノ酸の次の、アミノ酸残基と数(Kabatら,上記(1991)のＥ ｕ数字付与スキーム)によって表した。Ｃ_H３の第１及び第２のコピー中の変異は 、それぞれ前後にスラッシュを付す。Ｃ_H３の第２のコピー中の残基は、プ ライム符号(')によって表示される。この改善は、該変異体K392S/D399'Sが野生 型に対して類似したＡｂ／Ｉａ収量とＡｂ／Ｉａ電気泳動移動性の両方を与えた ことから、残基Ｋ３９２とＤ３９９の置換というよりむしろ、ジスルフィド結合 形成を明らかに反映する。ホモダイマーは、ヘテロダイマーのＣ_H３ドメイン中 に相互-鎖ジスルフィド結合形成を優先して行うことを実証している、野生型Ｆ ｃドメインの持つそれと同様に移動した。全てのジスルフィドＣ_H３変異体は、 ２９３Ｓ細胞中の親分子とほぼ同じレベルで発現した。 Ｅ． 空洞への隆起工学によって構築したジスルフィドは９５％までヘテロダ イマーの収率を増加する。最良のジスルフィドペアは、７６％までヘテロダイマ ーのパーセンテージを増加し、空洞への隆起方法は８７％までヘテロダイマーの パーセンテージを増加した(表４；Ridgwayら,(1996)上記も参照)。これら２つの 方法は、ヘテロダイマー精製の確率を増加することの異なる原理による。従って 、我々はヘテロダイマーにおける収率を更に改善することを意図して、その２つ の方法を組み合わせた。Ｌ３５１Ｃ又はＴ３９４Ｃを含む、２つのモデル化した ジスルフィドは、ジスルフィド結合ヘテロダイマー(L351C/S354'CとT394C/V397' C)と同じくジスルフィド結合ホモダイマーを潜在的に形成でき、かくしてそれの 単一性を減じている。残る４つのジスルフィドペアは、ファージ選択したヘテロ ダイマー(変異体ｖ９-ｖ１６)中に配置し、ヘテロダイマーの収率を分析した(表 ４)。ヘテロダイマーのほぼ９５％の収率が得られた。再度、該ヘテロダイマー は、野生型及びｖ８変異体に匹敵する電気泳動移動シフトを示した。実施例３：ヘテロマルチマー中のタンパク質-タンパク質相互作用を増大する相 補の変異のための構造-誘導ファージディスプレー選択 以下の方法は、マルチマー化ドメインを経て界面で相互作用するポリペプチト 中の相補の変異の選択において有用である。その方法は、相補の空洞への隆起変 異の選択にそれを適用するとして次に説明される。しかしながら、その実施例は 制限するためのものではなく、その方法は非天然存在ジスルフィド結合、ロイシ ンジッパーモチーフ、疎水性相互作用、親水性相互作用などの形成に適当な変異 の選択に同様に適用することができる。 Ａ． ファージディスプレー選択。ファージディスプレー方法は、安定なＣ_H ３ヘテロタイマーの選択用に発展し、図２中に概要が示される。その選択は、隆 起変異体、T366W(Ridgwayら,上記(1996))、Ｍ１３遺伝子IIIペプチドに融合した Ｃ_H３の第２のコピーと共発現されるペプチドフラッグに融合した(ｇＤペプチド フラッグ、例えばLasky，L.A.とDowbenko，D.J.(1984)DNA 3:23-29；及びBerma n，P.W.ら，(1985)Science 227:1490-1492)を用いる。空洞変異体のライブラリ ーは、第１のＣ_H３ドメイン上の隆起に最も近い残基の無作為化によってＣ_H３の この第２のコピー中に創製した。ファージディスプレー化安定Ｃ_H３ヘテロダイ マーは、次いで抗-フラッグＡｂを用いて補足した。 Ｃ_H３ファージディスプレーライブラリーの1.1ｘ10⁵の独立クローンは、ＰＣ Ｒフラグメントによる自然Ｃ_H３遺伝子のセグメントの置換によって構築した。 そのフラグメントは、標準的な技術を用いて位置366、368と407で無作為化する ために分解プライマーを用いてＰＣＲ増幅化により得られた。 選択の２から５ラウンドの後、完全長クローンのフラクションは、一本鎖ＤＮ Ａのアガロースゲル電気泳動による判断として、それぞれ９０％、６０％、５０ ％及び１０％だった。完全長クローンを含むファージミドは、選択の５ラウンド 後にゲル-精製した。二千の形質転換体がＸＬ１-ＢＬＵＥ^TM細胞(Stratagene)を 再形質転換後に得られた。 各クローンの平均＞１０⁶コピーを、選択(panning)のラウンド当たりに使用し た。かくして、該ライブラリーにおいて各クローンの多数のコピーが、たとえ幾 つかの削除変異体が選択の間に生じたとしても、選択のために利用可能であると 確信した。 選択の７ラウンド後、得られたＣ_H３変異体は、無作為化した残基でコンセン サスアミノ酸配列を研究した。実際に全てのクローンは、この位置でβ-ヒドロ キシルの非常に強い優先性を示す残基366でセリン又はトレオニンを有した。疎 水性残基のための強い優先性は、バリンとアラニン優先化によって残基368と407 で観測された。６の異なるアミノ酸の組み合わせは、１１度回収された、三重変 異体、T366S:L368A:Y407Vを含む、少なくとも２度回収された。先に定義された ヘテロダイマー、T366W/Y407'A(Ridgway,J.B.B.ら,(1996),上記)と同一の 配列を有するこれらのファージ選択物はない。そのファージ選択物は、ドメイン 界面残基の全側鎖容量において40-80ų減少により判断されるように野生型Ｃ_H ３ホモダイマーよりも劣る緊密性で詰め込まれ得る。 発現プラスミドｐＡＫ１９(Carterら，1992)上にコードされたＣ_H３変異体は 、大腸菌３３Ｂ６株中に導入し、培養槽中で高い細胞密度に増殖した大腸菌から 創製した。ＤＥＡＥ-セファデックスＦＦ、ＡＢｘ及びResource Sクロマトグラ フィーによって精製したT366S:L368A:Y407V変異体は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥの後に単 一の主要なバンドを与えた。他のＣ_H３変異体は、同様の精製により回収した。 高解析度電気スプレー質量分析法によって測定した野生型Ｃ_H３、T366S：L368A ：Y407V、T366W及びY407A変異体の分子質量は、予期した通りであった。 Ｂ． ファージ選択したヘテロダイマー安定性。Ｃ_H３ヘテロダイマーの安定 性は、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)によって残るヘテロダイマーの 希釈及び定量化に続き、グアニジン塩酸によって相当するファージを滴定するこ とによって最初に評価した。Ｃ_H３-ファージによるグアニジン塩酸分解アッセイ は、選択物を直ちにスクリーンするための手段を提供する。 ファージは、選択の７ラウンドの後の個別のクローンから及びコントロールベ クター、ｐＲＡ１からでも製造された。概略的には、XL1-BLUE^TM中のファージミ ドが、10⁹pfu/ml M13K07の存在中で50μg/mlカルベニシリンと10μg/mlテトラ サイクリンを含有する25ml ＬＢ培地に接種するために使用し、37℃で一晩イン キュベーションした。その細胞は遠心分離(6000g、10分、４℃)によってペレッ ト化した。ファージは、５ｍｌの20％(w/v)ＰＥＧ、2.5M ＮａＣｌによって沈殿 し遠心分離(12000g、10分、４℃)の後に上清から回収され、１ｍｌのＰＢＳ中に 再懸濁させた。ＰＢＳ中0-6Mのグアニジン塩酸180μｌが20μｌファージ調製物 に加えられ、5.0分間ほぼ〜25℃でインキュベーションした。各ファージサンプ ルのアリコート(20μl)は、水で十倍に希釈した。Ｃ_H３のヘテロダイマーの存在 は、５Ｂ６-被覆プレートを用い及び基質としてo-フェニレンジアミンを用いた ホースラディッシュペルオキシダーゼに接合した抗-Ｍ１３ポリクローナルＡｂ によってファージを検出するＥＬＩＳＡによって測定した。その反応は、 2.5M Ｈ₂ＳＯ₄50mlの添加によって抑止し、492nmで吸光度を測定した。その吸光 度データは、その溶融の間にグアニジン塩酸濃度に対してプロットし、且つKale idagraph 3.0.5(Synergy Software)を用いた非線形最小二乗法によって四つのパ ラメーターモデルに適用した。 最も頻繁に回収されたヘテロダイマー、T366W/T366'S：L368'A：Y407'Vは、他 のファージ-選択したヘテロダイマーと安定性において類似する。このファージ- 選択したヘテロダイマーは、設計したヘテロダイマー、T366W/Y407'Aよりも有意 により安定であるが、しかし野生型Ｃ_H３よりは安定性に劣る。全てのＣ_H３変異 体、個別及び組み合わせの両方は、これら同じ分子が熱量測定法によって研究さ れた条件下にサイズ排除クロマトグラフィーによってダイマーであることが見出 された(1.75mg/ml、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中)。唯一の例外は、Ｃ_H３ダ イマーよりも明らかに短い保持時間を有したT366S：L368A：Y407V変異体単独で あった。 Ｔ３６６Ｗの１：１混合物、隆起、及びT366S：L368A：Y407V、69.4℃で単独 転移を持つ変異体溶融物は、サブユニット交換及び安定なヘテロダイマーの形成 と密接に結びつく。一方、Ｔ３６６Ｗ隆起ホモダイマーは、T366W/T366'S：L368 'A：Y407'V空洞への隆起ヘテロダイマー(ΔＴ_m＝−15.0℃)よりもより劣った安 定性である。それ自身の上のT366S：L368A：Y407V空洞変異体は、加熱によって 集合する傾向があり、なだらかな溶融転移を成さない。 設計した空洞変異体、Ｙ４０７Ａは、Ｔ３６６Ｗ隆起変異体の不在及び存在で それぞれ58.8℃及び65.4℃で溶融する。これは、Ｔ３６６Ｗ(ΔＴ_m＝11.0℃)又 はＹ４０７Ａ(ΔＴ_m＝6.6℃)ホモダイマーのいずれか一方よりもより大きな安定 性を有するT366W/Y407'Aホモダイマーのサブユニット交換と形成と密接に結びつ く。ファージ選択したヘテロダイマー、T366W/T366'S：L368'A：Y407'Vは、設計 したヘテロダイマー、T366W/Y407'A,(ΔＴ_m＝4.0℃)よりも一層安定であるが、 しかし、野生型Ｃ_H３ホモダイマー(ΔＴ_m＝−11.0℃)よりも安定性が劣る。 Ｃ． インビボでのファージ-選択した抗体免疫付着因子のマルチマー化。フ ァージ選択した及び設計したＣ_H３変異体は、インビボでＡｂ／Ｉａハイブリッ ド、抗-CD3/CD4-IgGの形成を導くその能力を比較した(Chamowら,(1994),上記。 これは、ＣＤ４-ＩｇＧと一緒にヒト化した抗-ＣＤ３軽鎖(L)と重鎖の共発現に より達成した。ヘテロダイマーとホモダイマーの形成は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥとス キャニングレーザーデンシトメトリー(Ridgway,ら,(1996),上記)に続いてプロテ インＡ精製によって評価した。Ａｂ／Ｉａハイブリッドの比較できる収量が、抗 -ＣＤ３重鎖が設計した隆起変異体を含んだ、Ｔ３６６ＷとＩａがファージ-選択 した変異体、T366S：L368A：Y407V、又は設計した空洞変異体、Ｙ４０７Ａのい ずれかを含んだ共移入体から回収された(図３)。 ファージ-選択した及び設計したＣ_H３変異体は、次にホモダイマーを形成する ためのその傾向において評価した。隆起変異体、Ｔ３６６Ｗは、相当する重鎖と 軽鎖の共移入がＩｇＧを越える過剰のＨＬモノマー(非-ジスルフィド結合ＩｇＧ を含み得る)に至ることから、ホモダイマー化を明らかに非常に崩壊させた。一 方、ＩｇＧしかしＨＬモノマーなしでは、野生型Ｃ_H３ドメインを含む同じ抗体 が観測された。空洞変異体、T366S：L368A：Y407Vは、相当するファージミドの 遺伝子移入が幾つかのＩａモノマーを持つ優性なＩａダイマーの混合物に至るこ とから、多少ホモダイマー化を崩壊させる。空洞変異体、Y407Aは、Ｉａダイマ ーしかし相当するファージミドの移入後にＩａモノマー無し、の存在による判断 として、ホモダイマー化を最小限崩壊する。 ここに記載したファージディスプレー方法は、安定したヘテロダイマーを形成 するＣ_H３変異体の援助での選択及び安定なホモダイマーを形成する変異体に対 しての選択を与える。ホモダイマーに対するカウンター選択は、"遊離"Ｃ_H３変 異体が、利用可能なＣ_H３変異体-遺伝子III融合タンパク質への結合のためにフ ラッグ化Ｃ_H３ノブ変異体と競合するであろうことから生じる。遊離Ｃ_H３変異体 は、自然Ｃ_H３変異体とＭ１３遺伝子IIIの間のアンバー変異の結果として生じる 。XL1-Blucのようなアンバー抑制宿主において、自然Ｃ_H３遺伝子とＭ１３遺伝 子IIIの両方が創製されるだろう。 グアニジン塩酸分解は、ファージ上のＣ_H３ヘテロダイマー安定性を最初にス クリーニングするために有用なツールとして提供される。ファージは、5Mグア ニジン塩酸にさらした後でも大腸菌への感染性を維持する(Figiniら,J.Mol.Biol .239:68-78(1994))。かくして、グアニジンは変異体選択の方法を増加するため にも有用となり得る。 ファージディスプレーライブラリーの合理的な設計とスクリーニングは、ヘテ ロダイマー化を促進するためにホモダイマーのドメイン界面を再モデル化するた めの相補的なアプローチである。Ｃ_H３ドメインのケースにおいて、設計した変 異体は、ヘテロダイマー化を促進することを強化できるドメイン界面残基と同一 視される。ファージディスプレーは、ヘテロダイマーを最も有効に形成する組み 合わせのために固定した隆起の近くの３つの残基の置換をサーチするためにここ に用いた。ファージ選択物は、ドメイン界面の更なる合理的な再設計を促進する ために有効とされる一方、ここに記載したファージ選択方法は、タンパク質-タ ンパク質界面を再モデル化するためのその有用性を実証する。 実施例４：共通の軽鎖を有するヘテロマルチマー抗体又は抗体／免疫付着因子の 生成と配置 以下の実施例は、本発明に従う同じ軽鎖を共有するヘテロマルチマー二重特異 性抗体の調製とその標的抗原に結合する抗体の能力を実証する。 Ａ． 同じ軽鎖を共有する抗体の同定：抗体ライブラリーの比較は１１の抗原 に高まる。 大きいヒト一本鎖Ｆｖ(scFV)抗体ライブラリー(Vaughanら(1996)上記)は、Ａ ｘ１(ヒトレセプターチロシンキナーゼＥＣＤ)、ＧＣＳＦ-Ｒ(ヒト顆粒球コロニ ー刺激因子レセプターＥＣＤ)、ＩｇＥ(ネズミＩｇＥ)、ＩｇＥ-Ｒ(ヒトＩｇＥ レセプターα-鎖)、ＭＰＬ(ヒトトロンボポイエチンレセプターチロシンキナー ゼＥＣＤ)、ＭｕｓＫ(ヒト筋肉特異的レセプターチロシンキナーゼＥＣＤ)、Ｎ ｐｏＲ(ヒトオルファンレセプターＮｐｏＲ ＥＣＤ)、Ｒｓｅ(ヒトレセプターチ ロシンキナーゼ、Ｒｓｅ，ＥＣＤ)、ＨＥＲ３(ヒトレセプターチロシンキナーゼ ＨＥＲ３／c-erbB3 ＥＣＤ)、Ｏｂ-Ｒ(ヒトレプチンレセプターＥＣＤ)、及びＶ ＥＧＦ(ヒト脈管内皮成長因子)、ＥＣＤは細胞外ドメインに関する、を含む１１ の抗原用の抗体特異性で選択した。各抗原に生じた抗体の集団からｓｃＦｖフラ グメントのためのヌクレオチド配列データは、相当するタンパク質配列から得る ように翻訳した。Ｖ_Lは異列は、鎖の全てのペア様態組み合わせ間の同一性パー センテージを計算するためにFengとDoolittle(1985,1987,1990)のアルゴリズム によりプログラム"アライン"を用いて比較した(Feng,D.F.とDoolittle,R.F.(198 5)J.Mol.Evol.21:112-123；Feng,D.F.とDoolittle,R.F.(1987)J.Mol.Evol.25:35 1-360；及びFeng,D.F.とDoolittle,R.F.(1990)Method Enzymol.183:375-387)。 各ペア様態軽鎖アミノ酸配列比較の配列同一パーセントの結果は、マトリックス フォーマット中に調整した(追記参照)。 最もペア様態の比較品として、少なくとも１の共通軽鎖配列が見出された。表 ５は、117Ｖ_Lアミノ酸配列のアラインメントによって決定した同じ軽鎖を共有す る(100％同一性)ｓｃＦｖの頻度を示しているＶ_L鎖の比較である。例えば、その エントリー４／９(ＨＥＲ３ｘＯｂ-Ｒ、黒いボックスで表した)は、結合ＨＥＲ ３が１又はそれ以上の抗-Ｏｂ-ＲクローンによってそれのＶ_L配列を分配するこ とが見出される一方、Ｏｂ-Ｒ結合９クローンは、１又はそれ以上の抗-ＨＥＲ３ クローンによってそのＶ_L配列を分配する、４クローンを表す。対角線上の参加 物は、その集団中の１又はそれ以上のクローンによってＶ_L配列を分ける集団内 の抗体クローンの数を表す。例えば、ＭＰＬクローンの調査は、１又はそれ以上 の他のＭＰＬクローンによってそれのＶ_L配列が分けられた５クローンを明らか にした。(IgE x Ax1)又は(NpoR x IgE-R)についてのような観測された共通の軽 鎖の無いケースにおいて、少なくとも１の特異性と比較されるフラグメントの数 は非常に少なかった(５以下)。見出された共通の軽鎖の数が与えられ、それは共 通の軽鎖が、もし十分な数のクローンが比較されるなら、いずれかのＶ_L比較物 のために見出すことができることがありそうである。 軽鎖のアミノ酸配列は、選択した共通の軽鎖に対しての配列相同性が98％と99 ％であった場合、異なったアミノ酸残基の位置によって決定された。図４は、Ａ ｘ１(クローンAx1.78)、Ｒｓｅ(クローンRse.23,Rse.04,Rse.20,及びRse.15)、 ＩｇＥＲ(クローンIgER.MAT2C1G11)、Ｏｂ-Ｒ(クローンobr.4)、及びＶＥＧＦ( クローンvegf.5)に特異性を持つ８つの異なる抗体のＶ_L配列の比較である。配列 の定義(Kabat，G.A.ら(1991)上記)又は構造の定義(ChothiaとLcsk,(1987)J. Mol.Biol.196:901-917)に従う抗原結合ＣＤＲ残基の位置は、それぞれ下線と＃ によって示した。Ax1.78配列と異なる軽鎖残基は二重下線により示した。比較し た９軽鎖の、６が同一である。Rse.04とobr.4の軽鎖(ほぼ99％配列相同性)は、 抗原結合ＣＤＲｓの外側の１残基で相違するRse.20の軽鎖(ほぼ98％配列相同性) は、抗原結合ＣＤＲｓの外側の２残基で異なる。該アミノ酸残基の変化は、抗原 結合性において僅かな又は影響なしを有し得る。かくしてこれらの軽鎖の配列類 似性は、本発明の共通の軽鎖のためのその候補を作る。代替的に、期待される対 になったｓｃＦｖ(例えばAx1.78)の軽鎖との98-99％相同性を有する軽鎖のよう に、本発明に従い、対になった軽鎖と置換でき且つ結合特異性を保持し得る。 Ｂ． 同じ軽鎖を共有する抗体の同定と軽鎖のそれを共有する二重特異性抗体 の構築：抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３。 ヒトレプチンレセプター(Ｏｂ-Ｒ)又はHER3/c-erbB3遺伝子生産物(ＨＥＲ３) の細胞外ドメインを結合したＳｃＦｖフラグメントは、大きいヒトｓｃＦｖファ ージライブラリーを用いた選別の３つのラウンドによって得られた(Vaughanら(1 996)，上記)。レプチンレセプター-ＩｇＧとＨＥＲ３-ＩｇＧ(1ml ＰＢＳ中10μ g)を、４℃で一晩、分離イムノチューブ(Nunc;Maxisorp)を被覆するために使用 した。選別とファージ解放は、以下の修正を伴い、Vaugham(1996)，上記により 記載されたように実行した。1mg/mlの濃度で、ヒト化した抗体、huMAb4D5-8(Car ter,P.ら(1992)PNAS USA 89:4285-4289)又はヒト化した抗-ＩｇＥ(Presta,L.ら( 1993)J．Immunol．151:2623-2632)は、Ｆｃ-結合ファージを吸着するための各選 別工程中に含めた。加えて、溶液の選別化(Hawkins，R.E.ら(1992)J．Mol．Biol ．226:889-896)は、ｓｃＦｖ結合レプチンレセプターを同定するためにも使用し た。そのレプチンレセプターは、プロテインＡセファロースクロマトグラフィー に続いて、工作したプロテアーゼ、ジェネナーゼ(Carter,P.ら(1989)Proteins:S tructure,Function and Genetics 6:240-248)によるレプチンレセプター-ＩｇＧ の位置特異的蛋白分解によってＦｃから分離した。そのレプチンレセプターはビ オチン化し、それぞれ、選別の第１，第２，及び第３ラウンド用に100nM、25nM 及び5nMの濃度で使用した。ファージ結合ビオチン化抗原は、ストレプタビジン- 被覆パ ラ磁性ビーズ(Dynabeads,Dynal,Oslo,Norway)を用いて捕捉した。 それぞれの選別のラウンド２及び３からのクローンは、ファージ及び相当する 抗原及び制御免疫付着因子又は抗体をも用いるｓｃＦｖ ＥＬＩＳＡによってス クリーンした。抗原-陽性クローンの分割性は、プライマー、fdtetseqとPUC逆転 (Vaughamら(1996)，上記)を用いるｓｃＦｖ挿入のＰＣＲ-増幅及びBstNIによる 消化(Marksら(1991)上記)によって分析した。BstNIフィンガープリント当たり１ から５のクローンがＰＣＲ重リンクとmyc seq 10プライマー(Vaughamら(1996) 上記)を用いたcycle-sequencedusing fluorescent dideoxy chain terminat ors(Applied Biosystems)した。サンプルは、Applied Biosystems Automated DNA Sequencerを用いて分析し且つ配列をSeqEdを用いて分析した。グアニジ ン塩酸抗体分解及びファージディスプレー選択と組み合わせたFiginiのインビト ロでの鎖シャフティング方法が同じ軽鎖を有する抗体を選択する方法として有用 であることにも注目される(Figini，M.ら(1994)，上記、その全体が参照により ここに併合される)。 上記の方法を用いて、１１の異なる抗-ＨＥＲ３クローンと１８抗-Ｏｂ-Ｒク ローン(被覆した抗原を用いた選別からの１１とビオチン化抗原による選別から の７)が得られた。そのクローンは、各結合ドメインと結合した軽鎖の配列を決 定するための標準技術により配列決定した(図５)。その配列は、二重特異性抗体 を構成するために使用した抗-Ｏｂ-Ｒクローン26と抗-ＨＥＲ３クローン１８のV_H 及び共通のV_L配列である(後記参照)。その残基は(Kabat，E.A.ら(1991)上記)に 従い番号付けされる。配列の定義(Kabat，E.A.ら(1991)上記)又は構造の定義(Ch othiaとLesk,(1987)J.Mol.Biol.(1987)196:901-917)は、それぞれ下線と上線に よって示される。V_H配列中の残基間の相同性は、^*によって表示した。 軽鎖の配列は、多重抗-Ｏｂ-Ｒクローンに対する多重抗-ＨＥＲ３クローンと 比較した(図８及び表５)。１１の抗-ＨＥＲ３クローン以外の４つが、１又はそ れ以上の抗-Ｏｂ-Ｒレセプタークローンと同じV_Lを共有することが観測された。 反対に、１８の抗-Ｏｂ-Ｒクローン以外の９が抗-ＨＥＲ３クローンの一つとし て同じV_Lを共有する(表５、黒い箱を参照)。 抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３、共通の軽鎖を有する二重特異性抗体の構築は以下 の通り実行した。相補の隆起と空洞、同じく第１及び第２のポリペプチド間の非 天然存在ジスルフィド結合を有する変更したＣ_H３第１及び第２のポリペプチド を、Ｆｃ-含有二重特異性抗体の構築において用いた。同じ軽鎖を、同じく各抗 体からの重鎖を共有するクローンである、抗-Ｏｂ-Ｒクローン＃２６と抗-ＨＥ Ｒ３クローン＃１８からのＶ_Lを、ここに記載した手順に従って二重特異性抗体 を製造するために用いた。 この抗体は、非天然存在ジスルフィド結合を生成するために変更を欠くことに よってのみそれと異なる二重特異性抗体に対応する明確な分子量において電気泳 動移動性シフトを有した。非天然存在ジスルフィド結合を持った及び持たないヘ テロダイマーの抗体変異体の８％ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルは、野生型ヘテロダイマ ーのほぼ230の見かけ上のＭＷから、一つの非天然ジスルフィド結合を有してい るヘテロダイマーのほぼ200の見かけ上のＭＷまでの移動シフトを示した。その ＭＷシフトは非天然ジスルフィド結合を首尾良く形成するそれぞれの変異体のパ ーセントを与えるために十分であった。 二重特異性抗体のＯｂ-Ｒ及びＨＥＲ３の両方への特異的結合は、以下の方法 のような標準ＥＬＩＳＡ法によって試験される。Ｏｂ-Ｒ結合は、Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇ 融合タンパク質として存在するＯｂ-ＲによってＥＬＩＳＡアッセイで実証され る。該Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇ融合タンパク質は、９６-ウェルのミクロタイター板のウェ ル上に被覆され、そして二重特異性抗体が加えられる。 そのウェルは、Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇへの非特異的結合を取り除くために数回洗浄され る。同じアッセイにおける第２の成分として、ビオチン化ＨＥＲ３-Ｉｇ融合タ ンパク質が加えられ、そしてビオチン化ＨＥＲ３-Ｉｇ融合タンパク質に結合す るストレプタビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体によって測定 される。結合は、過酸化水素及びＴＭＢペルオキシダーゼ基質(Kirkegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)の添加における着色の変化の生成により 測定される。 実際に記載した条件下、Ｏｂ-Ｒ-ＩｇとＨＥＲ３-Ｉｇの両方への二重特異性 抗体の結合は、固定化Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇ／二重特異性抗体／ＨＥＲ３-Ｉｇビオチン ／検出可能に標識したストレプタビジンを含む複合体の良好な形成のためにミク ロタイター表面上に固定化した検出可能な標識として観測されるであろう。Ｏｂ -Ｒ-Ｉｇと結合するが、ＨＥＲ３-Ｉｇとはしない抗体は、陰性の結果を提供す るように、上記複合体を形成しない。同様に、ＨＥＲ３-Ｉｇと結合するが、Ｏ ｂ-Ｒ-Ｉｇとはしない抗体は、陰性の結果を提供するように、上記複合体を形成 しない。一方、Ｏｂ-Ｒ-ＩｇとＨＥＲ３-Ｉｇの両方に結合することが予期され る二重特異性抗体は、該アッセイにおいて陽性の結果を生じる複合体を形成し、 共通の軽鎖を有する、ＨＥＲ３とＯｂ-Ｒの両方に結合する、二重特異性抗体を 表示する。 抗-(Ｏｂ-Ｒ／ＨＥＲ３)二重特異性抗体の発現と精製は、以下の通り実行した 。ヒト胎芽腎臓２９３Ｓ細胞は、抗-Ｏｂ-Ｒ重鎖、抗-ＨＥＲ３重鎖、又は上述 した通りそれぞれの抗体に共通であったクローン２６又は１８からの軽鎖をそれ ぞれ独立にコードしている３つのプラスミドＤＮＡによって移入した。それぞれ の移入のために、軽鎖コード化ＤＮＡに対する重鎖コード化ＤＮＡの比率は、軽 鎖が抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３二重特異性抗体の配列を制限しないであろうよう に１：３とした。両方の重鎖は、互いに関して１：１の比で移入した。12μgの トータルのプラスミドＤＮＡは、次いでリン酸カルシウム沈降によって293S細胞 中に共移入(co-transfected)した(Gorman,C.,DNA Cloning,Vol.II,D.M.Glover,e d.,IRL Press,Oxford,p.143(1985))。その細胞は、タンパク質発現の増大を意図 して増殖培地に加える前に洗浄した。Ｆｃ-含有タンパク質は、固定化したプロ テインＡ(ProSep A,BioProcessing Ltd.,UK)を用いて細胞懸濁物から精製し、そ してＰＢＳ中に緩衝化-交換した。ヨードアセトアミドは、ジスルフィド結合の 再シャフト化を防止するために50mMの最終濃度までタンパク質調製物に加えた。 付加の実施例として、抗-(CD3/CD4)抗体／免疫付着物の発現と精製を以下の通 り実行した。ヒト胎芽腎臓２９３Ｓ細胞は、３つのプラスミドＤＮＡｓ、各プラ スミドは抗-ＣＤ３軽鎖、抗-ＣＤ３ ＩｇＧ₁重鎖、又は抗-ＣＤ４ ＩｇＧ₁免疫 付着因子を独立的にコードしている、によって移入した。それぞれの移入のため に、重鎖コード化ＤＮＡに対する軽鎖コード化ＤＮＡの比率は、軽鎖が抗-ＣＤ ３ ＩｇＧの整列のために制限されないであろうように、３：１とした。加え て、免疫付着因子が不十分に発現されるために、免疫付着因子コード化プラスミ ドの比率は、重鎖コード化プラスミドの過剰において加えた。試験したその比率 は、免疫付着因子：重鎖：軽鎖が3:1:3から8:1:3間での範囲とした。トータルで 10μgのプラスミドＤＮＡは、移入前にＰＢＳで細胞を洗浄し、次いでリン酸カ ルシウム沈降(Gorman，C.(1985),上記)により293S細胞中に共移入した。Ｆｃ-含 有タンパク質は、固定化したプロテインＡ(ProSep A,BioProcessing Ltd.,UK)を 用いて細胞懸濁物から精製し、そしてＰＢＳ中に緩衝化-交換した。ヨードアセ トアミドは、ジスルフィド結合の再シャフト化を防止するために50mMの最終濃度 までタンパク質調製物に加えた。 上記それぞれの調製において、タンパク質サンプルは、８％ポリアクリルアミ ドゲル(Novex)で電気泳動し、Serva blueによる染色によって可視化した。ゲル は、マイナーな不純物の可視化及び定量化を与える努力において見せかけのバッ クグラウンドを無くすように脱-染色化した。乾燥したゲルは、スキャニングデ ンシトメーター(GS-670，BioRad)によってスキャンし、そしてタンパク質製造物 はMolecular Analystソフトウェアによって定量化した。 Ｃ_H３ドメイン中に導入した非天然(工作した)ジスルフィド結合は、ヘテロダ イマー形成を増大するためにここに開示されている。一つのペプチド、K392/D39 9'Cは、７６％までのヘテロダイマー(表４、変異体ｖ６)を精製することによっ てヘテロダイマー形成を増大した。さらに、相互-鎖ジスルフィド結合の存在が 空洞への隆起技術と結び付けられた場合、ほぼ９５％ヘテロダイマーが得られた (表４変異体ｖ１１，ｖ１２，及びｖ１６)。かくして、二重特異性抗体の第１と 第２のポリペプチド間のタンパク質／タンパク質相互作用を特異的に増加する本 発明の方法は、望まれるヘテロマルチマーの収量を増加すると共に、望ましくな いヘテロマルチマー又はホモマルチマーの形成を最小化する。 加えて、電気泳動の移動性分析によって生産物ヘテロマルチマーを特徴付ける 方法は、望ましくない生産物に対して、望まれるヘテロマルチマーの相対的な量 の測定を与える。 ここに記載したような共通の軽鎖の選択は、多重特異性抗体の可変の重鎖と軽 鎖の間の誤対合の可能性を削除することによって望まれるヘテロマルチマーの収 量を増加する。 Ｃ． 同じ軽鎖を共有する抗体の同定とその軽鎖を共有している二重特異性抗 体の構築：抗-Mpl/抗-HER3。 本発明の別な二重特異性抗体の同定、構築及び発現がここに示される。この実 施例のパートＡとＢ中に記載した方法を、抗-Mpl/抗-HER3二重特異性抗体の製造 用に利用した。 この実施例のセクションＡ中に記載した方法(１１の抗原を生じた抗体ライブ ラリーの比較)、上記、を用い、抗-ＨＥＲ３ｓｃＦｖのＶ_HとＶ_Lアミノ酸配列を 、ヒトトロンボポイエチンレセプター、ｃ-Ｍｐｌに結合する２３ ｓｃＦｖで比 較した。１１の抗-ＨＥＲ３クローンの５つは、１又はそれ以上のＭｐｌ-結合ク ローンを持った同一のＶ_Lアミノ酸配列を共有する。反対に、２３の抗-Ｍｐｌ ｓｃＦｖ以外の７つは、抗-ＨＥＲ３クローンの一つと同じＶ_Lを共有した(表５ 、上記、白い箱を参照)。一方、Ｖ_Hアミノ酸配列は、何れかの抗-Ｍｐｌと抗-Ｈ ＥＲ３クローンの間に４０から９０％の同一性レベルを持つ、より多く相違する ものであった。 その抗-Ｍｐｌ ｓｃＦｖ，１２Ｂ５(Genbank accession number AG048775；配 列番号：２７)と抗ＨＥＲ３ ｓｃＦｖクローンＨ６(Genbank accession numbe r AG048774；配列番号：２８)は、同一のＶ_L配列及び実質的に異なるＶ_H配列を 利用する。これらのｓｃＦｖフラグメントは、共有した軽鎖に対する有効なヘテ ロダイマー化ができる抗-Ｍｐｌ／抗-ＨＥＲ３二重特異性ＩｇＧ抗体を構築する こと、同じく孔-中-ノブ変異体(ここに記載した)及びＣ_H３ドメイン間に作られ たジスルフィド結合の使用を通して用いた。同じＬ鎖を共有する抗体は、非-同 系Ｈ鎖と対合するＬ鎖の問題を避けるために選択した。２つの天然存在ヒンジ領 域ジスルフィド結合もまた存在した。その共通のＬ鎖は、変異体ｖ１１からのＣ_H ３変異を含んでいる２つのＨ鎖と共移入した。そのＩｇＧ生産物は、プロテイ ンＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、且つ標準技法を用いてＳ ＤＳ-ＰＡＧＥによって分析した。 二重特異性ＩｇＧ抗体(ＢｓＩｇＧ)調製物は、ＩｇＧ含有野生型Ｃ_H３ドメイ ンよりも、より大きい移動性を示す単一の主要バンドを生じる。電気泳動移動性 におけるこの増加は、よりコンパクトなタンパク質種を形成するＢｓＩｇＧ中に 作られたジスルフィド結合の形成と一致した。 ＭｐｌとＨＥＲ３ ＥＣＤ抗原の両方に結合する工作した抗-Ｍｐｌ／抗-ＨＥ Ｒ３ＢｓＩｇG抗体の能力は、以下の通りＥＬＩＳＡを用いて評価した。全ての 工程でＰＢＳ緩衝液を用い、９６-ウェル板(Maxisorp,Nunc)の個々のウェルは、 5μg/mlでＨＥＲ３-ＩｇＧ又はＭｐｌ-ＩｇＧで一晩被覆し、洗浄し次いで0.5％ (w/v)ＢＳＡによって１時間ブロック化した。その最初の抗体は、変異体Y349C： T366S：L368A：Y407V/T366'W：S354'Cを含み、且つ変異したＦｃ領域を持つ親の 抗-Ｍｐｌ又は抗-ＨＥＲ３ ＩｇＧに一致する抗-Ｍｐｌｘ抗-ＨＥＲ３ ＢｓＩｇ Ｇとした。最初の抗体(１μg/mL)は、ビオチン化ＨＥＲ３-ＩｇＧ及びストレプ タビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体(Boehringer Mannheim)の 1:5000希釈液と共に23℃で２時間、別個にインキュベーションし、次いで各ウェ ルに加え、23℃でさらに１時間インキュベーションした。ペルオキシダーゼ活性 は、販売者(Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.，Gaithersburg，MD)に よって指示された通りにＴＭＢ試薬によって検出した。 予想した通り、抗-Ｍｐｌ／抗-ＨＥＲ３ ＢｓＩｇＧは、個別にＭｐｌとＨＥ Ｒ３ ＥＣＤ抗原のそれぞれに有効に且つ同時に、同じく両方の抗原に同時に結 合した。これに対して、親の抗-Ｍｐｌと親の抗-ＨＥＲ３ ＩｇＧは、同系抗原 に一致するそれにのみ結合した(図６)。 Ｄ． 工作したＦｃ領域を含んでいる抗体は、有効な抗体-依存細胞介在細胞 毒性の能力がある。 本発明の実例化した二重特異性抗体の精製において用いた工作したＦ_c領域(Ｃ_H ３変異体、上記)が有効な抗体-依存細胞介在細胞毒性の能力があることを実証 するため、以下の実験を実行した。 そのＣ_H３変異体は、Lewis，G.D.ら(Lewis,G.D,ら(1993)Cancer Immunol.Immu nother.37:255-263,その全部が参考により組込まれる)の方法を用いて示した通 り、有能な抗体-依存細胞-介在細胞毒性(ADCC)をサポートする能力を維持す る。概略的には、細胞毒性アッセイは、⁵¹Ｃｒ-標識したＳＫ-ＢＲ-３及びＨＢ Ｌ-１００標的細胞(それぞれATCC受託番号HTB-30と45509)及びエフェクター細胞 としてヒト末梢血液リンパ球によって実行した。しかしながら、Lewisらと異な り、そのリンパ球はＩＬ-２で活性化されなかった。 Ｃ_H３変異体S354:T366W及びY349C：T366S：L368A：Y407Vは、Carterら(Carter ,P.ら(1992)PNAS USA 89:4285-4289)により製造されたヒト化抗-ＨＥＲ２抗体、 huMAb4D5-5のＨ鎖中に別個に導入した。再モデル化した及び野生型Ｆｃ領域を含 む抗体は、ＨＥＲ２-過剰発現乳癌細胞系、SK-BR-3によりＡＤＣＣ中で類似の能 力を有した(図７)。再モデル化した及び野生型抗体の両方は、通常の胸部上皮細 胞系に対する低い活性と比較できることを示した。Ｈ鎖中の効果は、これらBsIg G'sが抗体-依存細胞-介在細胞毒性において機能するであろうことを予報する、 結合ドメインの独立がある。 本発明は、最も実践的、且つ好適な実施態様であるとして考慮される何れかに おいてここに示され且つ記載される。それは、しかしながら、発展は本発明の範 囲内から作製できること、及び自明な修正がこの開示を熟読した当業者に生起す ることが認識される。ここに用いた全ての参考文献はそれの全体において参考に よってここに組込まれる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年７月１３日（１９９９．７．１３） 【補正内容】 請求の範囲 １． 少なくとも２つの異なる結合ドメインを含む多重特異性抗体の製造方法で あり、ここで、 第１の結合ドメインは第１の分子に結合し且つ第２の結合ドメインは第２の分 子に結合し、 それぞれの結合ドメインは、（ｉ）マルチマー化ドメインをさらに含むポリペ プチドの一部である重鎖可変ドメイン及び（ｉｉ）軽鎖の可変ドメインを含み、 該第１の結合ドメインは、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変ドメインを含 み、該第２の結合ドメインは、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変ドメインを 含み、且つ該第１及び第２の重鎖可変ドメインは異なり、及び 該ポリペプチドは上記マルチマー化ドメインの相互作用によってマルチマー化 され、 及びここで、 それぞれの軽鎖可変ドメインは同じであるか、 または該多重特異性抗体が第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメイン を含むかのいずれか一方であり、該第１及び第２の軽鎖可変ドメインは互いに異 なり、且つ上記第１の結合ドメインは、上記第１の結合ドメインが第１の軽鎖可 変ドメイン又は第２の軽鎖可変ドメインを含む上記第１の分子に結合し、及び上 記第２の結合ドメインは、上記第２の結合ドメインが第２の軽鎖可変ドメイン又 は第１の軽鎖可変ドメインを含む上記第２の分子に結合し、 工程： （ｉ）上記ポリペプチドと軽鎖又は軽鎖をコードしている核酸を含む宿主細胞 を培養すること、ただし該培養は該核酸が発現され且つ該ポリペプチドと軽鎖又 は軽鎖が生産されるものであり；且つ （ｉｉ）該宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収すること、 を含む方法。 ２． 上記第１のポリペプチドのマルチマー化ドメインをコードしている核酸又 は上記第２のポリペプチドのマルチマー化ドメインをコードしている核酸、又は 両方が、該アミノ酸配列を変更する核酸の変更により提供される請求項１記載の 方法。 ３． 上記第１のポリペプチド、上記第２のポリペプチド、又は両方のマルチマ ー化ドメインをコードしている核酸が、上記第１又は第２のポリペプチドのそれ ぞれの該マルチマー化ドメインが、上記第１又は第２のポリペプチドの他方のマ ルチマー化ドメインの遊離チオール含有残基にジスルフィド結合を形成する遊離 チオール含有残基を含むように変更される請求項２記載の方法。 ４． 上記ポリペプチドのマルチマー化が、空洞への隆起相互作用を含み、該方 法は工程（ｉ）の前に： より大きな側鎖容量を有する移入残基を持つアミノ酸残基を置換することによ ってコードされたポリペプチドのマルチマー化ドメイン中に隆起を生成する核酸 の置換によって該第１のポリペプチドをコードしている核酸を用意すること、お よび より小さな側鎖容量を有する移入残基を持つアミノ酸残基を置換することによ ってコードされたポリペプチドのマルチマー化ドメイン中に空洞を生成する核酸 の置換によって該第２のポリペプチドをコードしている核酸を用意すること、を さらに含む請求項１記載の方法。 ５． 核酸が、ファージディスプレー選択によって、隆起を有するマルチマー化 ドメインを含む第１のポリペプチド、空洞を有するマルチマー化ドメインを含む 第２のポリペプチド、又は両方のコード化を提供する請求項４記載の方法。 ６． より大きな側鎖容量を有する移入残基か、アルギニン(Ｒ)、フェニルアラ ニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、トリプトファン(Ｗ)、イソロイシン(Ｉ)及びロイシン (Ｌ)からなる群から選択される、請求項４記載の方法。 ７． より小さい側鎖容量を有する移入残基が、グリシン(Ｇ)、アラニン(Ａ)、 セリン(Ｓ)、トレオニン(Ｔ)及びバリン(Ｖ)からなる群から選択され、且つ該移 入残基がシステイン(Ｃ)ではない、請求項４記載の方法。 ８． 該第１及び第２のポリペプチドがそれぞれ抗体定常ドメインを含む請求項 １記載の方法。 ９． 該第１及び第２のポリペプチドがそれぞれ、Ｃ_H３ドメインとＩｇＧ定常 ドメインからなる群から選択される抗体定常ドメインを含む請求項８記載の方法 。 １０． 該多重特異性抗体が免疫付着因子である請求項１記載の方法。 １１． 工程（ｉ）に先行する工程をさらに含み、ここで上記核酸が宿主細胞内 に導入される請求項１記載の方法。 １２． それぞれの軽鎖可変ドメインが同一である請求項１記載の方法。 １３． 該多重特異性抗体が第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメイン を含み、且つ該第１及び第２の軽鎖可変ドメインが互いに異なるが、しかし少な くとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する請求項１記載の方法。 １４． 該第１及び第２の軽鎖可変ドメインが少なくとも９０％のアミノ酸同一 性を有する請求項１３記載の方法。 １５． 該第１及び第２の軽鎖可変ドメインが少なくとも９５％のアミノ酸同一 性を有する請求項１４記載の方法。 １６． 請求項１記載の方法によって製造された多重特異性抗体。 １７． 少なくとも２の異なる結合ドメインを含む多重特異性抗体であり、ここ で 第１の結合ドメインは第１の分子に結合し且つ第２の結合ドメインは第２の分 子に結合し、 それぞれの結合ドメインは、（ｉ）マルチマー化ドメインをさらに含むポリペ プチドの一部である重鎖可変ドメイン及び（ｉｉ）軽鎖の可変ドメインを含み、 該第１の結合ドメインは、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変ドメインを含 み、該第２の結合ドメインは、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変ドメインを 含み、且つ該第１及び第２の重鎖可変ドメインは異なり、及び 該ポリペプチドは上記マルチマー化ドメインの相互作用によってマルチマー化 され、 及びここで、 それぞれの軽鎖可変ドメインは同じであるか、 または該多重特異性抗体が第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメイン を含むかのいずれか一方であり、該第１及び第２の軽鎖可変ドメインは互いに異 なり、且つ上記第１の結合ドメインは、上記第１の結合ドメインが第１の軽鎖可 変ドメイン又は第２の軽鎖可変ドメインを含む上記第１の分子に結合し、及び上 記第２の結合ドメインは、上記第２の結合ドメインが第２の軽鎖可変ドメイン又 は第１の軽鎖可変ドメインを含む上記第２の分子に結合する、多重特異性抗体。 １８． 該第１のポリペプチドのマルチマー化ドメイン又は該第２のポリペプチ ドのマルチマー化ドメイン、又は両方が、該アミノ酸の変更により提供される請 求項１７記載の多重特異性抗体。 １９．上記第１又は第２のポリペプチドのそれぞれのマルチマー化ドメインが、 上記第１又は第２のポリペプチドの他方のマルチマー化ドメインの遊離チオール 含有残基にジスルフィド結合を形成する遊離チオール含有残基を含む請求項１８ 記載の多重特異性抗体。 ２０． 上記ポリペプチドのマルチマー化が、空洞への隆起相互作用を含み且っ 該第１のポリペプチドのマルチマー化ドメインが隆起を含み且つ第２のポリペプ チドのマルチマー化ドメインが空洞を含む請求項１８記載の多重特異性抗体。 ２１． 該隆起と空洞が、天然存在アミノ酸が該第１及び第２のポリペプチド中 に移入される置換によって生成される請求項２０記載の多重特異性抗体。 ２２．各々の軽鎖可変ドメインが同じである請求項１７記載の多重特異性抗体。 ２３． 該多重特異性抗体が第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメイン とを含み、該第１及び第２の軽鎖可変ドメインが互いに相違するが、しかし少な くとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する請求項１７記載の多重特異性抗体。 ２４． 該第１及び第２の軽鎖可変ドメインが少なくとも９０％のアミノ酸配列 同一性を有する請求項２３記載の多重特異性抗体。 ２５． 該第１及び第２の軽鎖可変ドメインが少なくとも９５％のアミノ酸配列 同一性を有する請求項２４記載の多重特異性抗体。 ２６． 請求項１７記載の多重特異性抗体とキャリアとを含んでいる組成物。 ２７．請求項１７記載の多重特異性抗体をコードしている核酸を含む宿主細胞。 ２８． 宿主細胞が哺乳動物細胞である請求項２７記載の宿主細胞。 ２９． 第１の分子に結合する第１の結合ドメインと第２の分子に結合する第２ の結合ドメインを含む多重特異性抗体の製造方法であり： （ａ）第１の重鎖可変ドメインとマルチマー化ドメインを含む第１のポリペプ チドをコードしている第１の核酸を選択すること、及び第２の重鎖可変ドメイン とマルチマー化ドメインを含む第２のポリペプチドをコードしている第２の核酸 を選択すること、ここで該第１及び第２の重鎖可変ドメインは異なっており、且 つ上記第１及び第２のポリペプチドのそれぞれのマルチマー化ドメインは、上記 第１及び第２のポリペプチドの他方のマルチマー化ドメイン中でアミノ酸残基と 特異的に相互作用するアミノ酸残基を含み、それによって該第１及び第２のポリ ペプチド間に安定な相互作用を生成すること； （ｂ）(ｉ)可変軽鎖をコードしている核酸を選択すること、ここで該可変軽鎖 は、上記第１及び第２の結合ドメインを形成するように第１及び第２のポリペプ チドのそれぞれと相互作用する、又は （ｉｉ）第１の可変軽鎖-コード化核酸と第２の可変軽鎖-コード化核酸 を選択すること、ここで該第１及び第２の可変軽鎖は互いに異なり、該第１及び 第２の可変軽鎖のそれぞれは、上記第１及び第２の結合ドメインを形成するよう に該第１及び第２のポリペプチドの一方と相互作用し、且つ上記第１の結合ドメ インは、上記第１の結合ドメインが該第１の可変軽鎖と該第１のポリペプチドの 相互作用又は該第２の可変軽鎖と該第１のポリペプチドの相互作用によって形成 される上記第１の分子に結合し、且つ上記第２の結合ドメインは、上記第２の結 合ドメインが該第２の可変軽鎖と該第２のポリペプチドの相互作用又は該第１の 可変軽鎖と該第２のポリペプチドの相互作用によって形成される上記第２の分子 に結合し、のいずれか一方； （ｃ）該第１及び第２のポリペプチドと該可変軽鎖又は可変軽鎖をコードして いる核酸を宿主細胞中に導入すること、及び該細胞を、該核酸の発現が生じ且つ コードしたポリペプチドと可変軽鎖又は可変軽鎖が生産されるように培養するこ と； （ｄ）該細胞培養物から多重特異性抗体を回収すること、 を含む方法。 ３０． 該第１のポリペプチドをコードしている上記第１の核酸、該第２のポリ ペプチドをコードしている上記第２の核酸、又は両方が、該コードしたアミノ酸 配列を変更するように変えられた核酸から選択される請求項２９記載の方法。 ３１． 該第１及び第２のポリペプチドが、空洞への隆起相互作用によって相互 作用する請求項３０記載の方法。 ３２． 核酸が、そのコードした配列中に遊離チオール含有残基を移入するよう に変更される請求項３０記載の方法。 ３３． 該第１及び第２のポリペプチドが抗体定常ドメインをそれぞれ含む請求 項２９記載の方法。 ３４． 抗体定常ドメインがＣ_H３ドメインである請求項３３記載の方法。 ３５． 抗体定常ドメインがヒトＩｇＧからのものである請求項３３記載の方法 。 ３６． 核酸が（ｉ）に従って選択される請求項２９記載の方法。 ３７． 核酸が（ｉｉ）に従って選択される請求項２９記載の方法。 ３８． 該第１及び第２の可変軽鎖が互いに異なるが、しかし少なくとも８０％ のアミノ酸配列同一性を有する請求項３７記載の方法。 ３９． 該第１及び第２の可変軽鎖が少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を 有する請求項３８記載の方法。 ４０． 該第１及び第２の可変軽鎖が少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を 有する請求項３９記載の方法。 ４１． ポリペプチドの混合物からヘテロマルチマー多重特異性抗体の形成を測 定する方法であり、ここで該多重特異性抗体は少なくとも２の結合ドメインを含 み、ここで 第１の結合ドメインは第１の分子に結合し且つ第２の結合ドメインは第２の分 子に結合し、 それぞれの結合ドメインは、（ｉ）マルチマー化ドメインをさらに含むポリペ プチドの一部である重鎖可変ドメイン及び（ｉｉ）軽鎖の可変ドメインを含み、 該第１の結合ドメインは、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変ドメインを含 み、該第２の結合ドメインは、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変ドメインを 含み、且つ該第１及び第２の重鎖可変ドメインは異なり、及び 該ポリペプチドは上記マルチマー化ドメインの相互作用によってマルチマー化 され、ここで上記第１又は第２のポリペプチドのそれぞれのマルチマー化ドメイ ンは、上記第１及び第２のポリペプチドの他方のマルチマー化ドメインの遊離チ オール含有残基とジスルフィド結合を形成する遊離チオール含有残基を含み、及 びここで、 それぞれの軽鎖可変ドメインは同じであるか、 または該多重特異性抗体が第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメイン を含むかのいずれか一方であり、該第１及び第２の軽鎖可変ドメインは互いに異 なり、且つ上記第１の結合ドメインは、上記第１の結合ドメインが第１の軽鎖可 変ドメイン又は第２の軽鎖可変ドメインを含む上記第１の分子に結合し、及び上 記第２の結合ドメインは、上記第２の結合ドメインが第２の軽鎖可変ドメイン又 は第１の軽鎖可変ドメインを含む上記第２の分子に結合し、 工程： （ａ）ゲルマトリックス中に移動するようそれぞれの多重特異性抗体を生じさ せること；及び （ｂ）該第１及び第２ポリペプチド間に非天然存在ジスルフィド結合を有する 多特異的抗体に一致するバンドの相対量を測定すること、及び該第１及び第２の ポリペプチド間に非天然存在ジスルフィド結合を欠いているヘテロマルチマーに 一致するバンドを緩やかに移動することを含む方法。 ４２． 上記ポリペプチドのマルチマー化が、該マルチマー化ドメイン問の空洞 への隆起相互作用によって促進される請求項４１記載の方法。 ４３． それぞれの軽鎖可変ドメインが同じである請求項４１記載の方法。 ４４． 該第１及び第２の軽鎖可変ドメインか互いに異なるが、しかし少なくと も８０％のアミノ酸配列同一性を有する請求項４１記載の方法。 ４５． 該第１及び第２の軽鎖可変ドメインが少なくとも９０％のアミノ酸配列 同一性を有する請求項４４記載の方法。 ４６． 該第１及び第２の軽鎖可変ドメインが少なくとも９５％のアミノ酸配列 同一性を有する請求項４５記載の方法。 ４７． 該多重特異性抗体が、抗-ヒトレプチンレセプターＥＣＤ(Ｏｂ-Ｒ)／抗 -ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３及び抗-ヒトトロンボポイエチンレセ プターチロシンキナーゼ（Ｍｐｌ）／抗-ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥ Ｒ３からなる群から選択される請求項１記載の方法。 ４８． 抗-ヒトレプチンレセプターＥＣＤ(Ｏｂ-Ｒ)／抗-ヒトレセプターチロ シンキナーゼＨＥＲ３及び抗-ヒトトロンボポイエチンレセプターチロシンキナ ーゼ(Ｍｐｌ)／抗-ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３からなる群から選 択される請求項１７記載の多重特異性抗体。 ４９． 請求項４８記載の多重特異性抗体と担体を含む組成物。 ５０． 該多重特異性抗体か、抗-ヒトレプチンレセプターＥＣＤ(Ｏｂ-Ｒ)／抗 -ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３及び抗-ヒトトロンボポイエチンレセ プターチロシンキナーゼ（Ｍｐｌ)／抗化トレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ ３からなる群から選択される請求項２７記載の宿主細胞。 【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１３年２月２２日（２００１．２．２２） 【補正内容】 明細書 ヘテロマルチマー及び共通成分を有する多重特異性抗体の製造方法 発明の分野 本発明は、ヘテロマルチマー重鎖成分および共通する軽鎖成分を有する多重特 異性抗体の作製方法に関する。このような多重特異性抗体として、二重特異性抗 体、二重特異性免疫付着因子、ならびに本発明の方法を使用して作製される抗体 −免疫付着因子キメラおよびヘテロマルチマーポリペプチドなどが挙げられる。 発明の背景 二重特異性抗体 少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する二重特異性抗体（Ｂ ｓＡｂ）は、インビトロおよびインビボでの免疫診断および治療に必要な標的化 薬剤として、そして診断的な免疫アッセイに必要な標的化薬剤としての広範囲の 診療適用における大きな可能性を有している。 診断領域において、二重特異性抗体は、細胞表面分子の機能的特性を探る際に 、そして細胞傷害性を媒介する様々なＦｃレセプターの能力を明らかにする際に 非常に有用である（Ｆａｎｇｅｒら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２ ：１０１〜１２４(１９９２))。Ｎｏｌａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ ｓ．Ａｃｔａ．１０４０：１〜１１（１９９０）は、ＢｓＡｂに関する他の診断 適用を記載する。特に、ＢｓＡｂは、酵素免疫アッセイで使用される酵素を固定 化するために構築することができる。これを達成するために、ＢｓＡｂの一方の アーム（腕）は、酵素表面の特定のエピトープに結合するように設計することが でき、その結果、結合による酵素阻害は生じない。ＢｓＡｂのもう一方のアーム は、所望の部位において高い酵素密度を確実にする固定化マトリックスに結合す る。そのような診断的ＢｓＡｂの例には、表面抗原を探し出すために使用された 、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ.Ｍｅｄ．１２８：１４６１〜１４７３( １９６８)によって記載されたウサギ抗ＩｇＧ／抗フェリチンＢｓＡｂが含まれ る。 ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ならびにホルモンに対する結合 特異性を有するＢｓＡｂもまた開発されている。ＢｓＡｂに関する別の可能な免 疫化学的適用には、二部位免疫アッセイにおけるその使用が含まれる。例えば、 分析対象タンパク質の表面にある２つの異なるエピトープに結合する２つのＢｓ Ａｂが作製されている−一方のＢｓＡｂは複合体を不溶性マトリックスに結合さ せ、もう一方は指示酵素と結合する(Ｎｏｌａｎら（上記）を参照)。 二重特異性抗体はまた、ガンなどの様々な疾患のインビボ免疫診断またはイン ビトロ免疫診断を行うために使用することができる(Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉら 、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５(１９９０))。ＢｓＡｂの このような診断的使用を容易にするために、ＢｓＡｂの一方のアームは、腫瘍関 連抗原と結合することができ、もう一方のアームは、放射性核種と強固に結合す るキレート化剤などの検出可能なマーカーと結合することができる。このような 方法を使用して、Ｌｅ Ｄｏｕｓｓａｌらは、結腸直腸ガンおよび甲状腺（ｔｈ ｒｙｏｉｄ）ガンの放射免疫検出に有用なＢｓＡｂを作製した。このＢｓＡｂは 、ガン胎児抗原（ＣＥＡ）と結合するアームを一方に有し、ジエチレントリアミ ン五酢酸（ＤＰＴＡ）と結合するアームをもう一方に有する。Ｌｅ Ｄｏｕｓｓ ａｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＳｕｐｐｌ．７：５８〜６２（１９９２）お よびＬｅ Ｄｏｕｓｓａ１ら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３４：１６６２〜１６７ １（１９９３）を参照。Ｓｔｉｃｋｎｅｙらは、放射免疫検出を使用してＣＥＡ を発現する結腸直腸ガンを検出するための方策を同様に記載する。この研究者ら は、ＣＥＡならびにヒドロキシエチルチオ尿素−ベンジル−ＥＤＴＡ（ＥＯＴＵ ＢＥ）と結合するＢｓＡｂを記載する。Ｓｔｉｃｋｎｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒ ｅｓ．５１：６６５０〜６６５５（１９９１）を参照。 二重特異性抗体はまた、標的（例えば、病原体または腫瘍細胞）と結合する一 方のアーム、およびＴ細胞レセプターまたはＦｃγレセプターなどの細胞傷害性 誘引因子分子と結合するもう一方のアームを備えることによって、細胞傷害性の 対象を変えることでヒトの治療に有用であり得る。従って、二重特異性抗体を使 用して、患者の細胞性免疫防御機構を腫瘍細胞または感染性病原体に特異的に向 けさせることができる。このような方策を使用して、ＦｃγＲＩＩＩ（または、 ＣＤ１６）に結合する二重特異性抗体は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞／大顆 粒リンパ球（ＬＧＬ）細胞によってインビトロでの腫瘍細胞殺傷を媒介すること ができ、インビボで腫瘍増殖を防止するのに効果的であることが明らかにされた 。Ｓｅｇａｌら、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７：１７９（１９８９）および Ｓｅｇａｌら、ガンの生物学的治療（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）２(４)、ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、 Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ(１９９２)、１頁。同様に、ＦｃγＲＩＩＩと結合す る一方のアームと、ＨＥＲ２レセプターに結合するもう一方のアームとを有する 二重特異性抗体が、ＨＥＲ２抗原を過剰発現する卵巣腫瘍および乳腫瘍を治療す るために開発された。(Ｈｓｅｉｈ−Ｍａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：６８３２〜６８３９（１９９２）およびＷｅｉｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：９４〜１００(１９９３))。二重特異性抗体はまた 、Ｔ細胞による殺傷を媒介することができる。通常、二重特異性抗体は、Ｔ細胞 上のＣＤ３複合体を腫瘍関連抗原に結合させる。抗ｐ１８５^HER2に結合した抗Ｃ Ｄ３からなる完全にヒト化されたＦ（ａｂ'）₂ＢｓＡｂを使用して、Ｔ細胞の標 的化が、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する腫瘍細胞を殺傷するために行われた 。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５(１)：２１７(１９９２)。二 重特異性抗体は、いくつかの初期の臨床試験において調べられ、有望な結果が得 られている。１つの臨床試験において、肺ガン、卵巣ガンまたは乳ガンの１２名 の患者が、抗ＣＤ３／抗腫瘍（ＭＯＣ３１）の二重特異性抗体で標的化された活 性化Ｔリンパ球を注入することによって処置された。ｄｅＬｅｉｊら、「二重特 異性抗体および標的化細胞の細胞傷害性」、Ｒｏｍｅｔ−Ｌｅｍｏｎｎｅ、Ｆａ ｎｇｅｒおよびＳｅｇａｌ編、Ｌｉｅｎｈａｒｔ（１９９１）２４９頁。標的化 された細胞において、腫瘍細胞の相当の局所的な溶解、穏和な炎症反応が誘導さ れたが、毒性の副作用または抗マウス抗体の応答は誘導されなかった。Ｂ細胞の 悪性疾患の患者での抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９二重特異性抗体の非常に予備的な試験 において、末梢の腫瘍細胞数の大きな減少もまた達成された。Ｃｌａｒｋら、「 二重特異性抗体および標的化細胞の細胞傷害性」、Ｒｏｍｅｔ−Ｌｅｍｏｎｎｅ 、ＦａｎｇｅｒおよびＳｅｇａｌ編、Ｌｉｅｎｈａｒｔ（１９９１）２４ ３頁。ＢｓＡｂの治療的適用に関してはＫｒｏｅｓｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍ ｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：４００〜４０７(１９９３)、Ｋｒｏ ｅｓｅｎら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７０：６５２〜６６１(１９９４)、およ びＷｅｉｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２３８５（１９９４）もまた 参照。 二重特異性抗体はまた、フィブリン溶解剤またはワクチンアジュバントとして 使用することができる。さらに、このような抗体は、感染性疾患の処置において 、（例えば、エフェクター細胞を、ＨＩＶウイルスまたはインフルエンザウイル スなどのウイルスに感染した細胞あるいはトキソプラズマ ゴンディイ（Ｔｏｘ ｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）などの原生動物に対して標的化するために）使 用することができ、あるいはイムノトキシンを腫瘍細胞に送達するために、ある いは免疫複合体を細胞表面レセプターに標的化するために使用することができる (Ｆａｎｇｅｒら（上記）を参照)。 ＢｓＡｂの使用は、ＢｓＡｂを十分な量および純度で得ることが困難であると いうことによって著しく妨げられている。従来、二重特異性抗体は、ハイブリッ ドーハイブリドーマ技術（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒ ｅ ３０５：５３７〜５３９(１９８３)）を使用して作製された。免疫グロブリ ンの重鎖および軽鎖は無作為に組み合わされるために、これらのハイブリドーマ （クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があり 、このうちの１個のみが、正しい二重特異性構造を有する(図１Ａを参照)。この 正しい分子の精製は、通常的にはアフィニティークロマトグラフィー工程によっ て行われているが、かなり面倒であり、生成物の収量は少ない。例えば、（Ｓｍ ｉｔｈ，Ｗ．ら（１９９２）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ４：８７〜９８：およびＭａ ｓｓｉｍｏ，Ｙ．Ｓ．ら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２ ０１：５７〜６６）を参照。従って、より大きな収量のＢｓＡｂを産生するため の技術が開発されている。抗体フラグメントの化学的な連結を行うために、Ｂｒ ｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）は、無傷の抗体をタ ンパク質分解的に切断して、Ｆ（ａｂ'）₂フラグメントを得る方法を記載する。 このようなフラグメントは、ジチオール複合化剤である亜ヒ酸ナトリウムの 存在下で還元され、近傍のジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド結合が 形成されないようにする。次いで、得られたＦａｂ’フラグメントは、チオニト ロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、１つのＦａｂ’−ＴＮＢ誘 導体が、メルカプトエチルアミンを用いた還元によってＦａｂ’−チオールに再 度変換され、もう１つのＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合されて、Ｂｓ Ａｂを形成する。生成したＢｓＡｂは、酵素を選択的に固定化するための薬剤と して使用することができる。 近年の進歩は、二重特異性抗体を得るために化学的に連結させることができる Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを大腸菌から直接回収することを容易にした。Ｓｈ ａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７〜２２５（１９９２）は、 ｐ１８５^HER2と結合する一方のアームおよびCＤ３と結合するもう一方のアーム を有する完全にヒト化されたＢｓＡｂのＦ（ａｂ'）₂分子の産生を記載する。Ｂ ｓＡｂを形成するために、それぞれのＦａｂ’フラグメントを大腸菌から別個に 分泌させ、インビトロでの指向された化学的結合反応に供した。このようにして 形成されたＢｓＡｂは、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒ トＴ細胞に結合させて、ヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解 活性を開始させることができた。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ ｅｒｓ（Ｓｕｐｐｌ.）７：４５〜５０（１９９２）もまた参照。 ＢｓＡｂフラグメントを作製し、組換え細胞の培養物から直接分離するための 様々な技術もまた記載されている。例えば、二重特異性のＦ（ａｂ'）₂ヘテロダ イマーが、ロイシンジッパーを使用して産生されている(Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８(５)：１５４７〜１５５３(１９９２))。Ｆｏｓタ ンパク質およびＪｕｎタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチドが、遺伝 子融合によって抗ＣＤ３抗体および抗インターロイキン−２レセプター（ＩＬ− ２Ｒ）抗体のＦａｂ’部分に連結された。ホモダイマーの抗体をヒンジ部で還元 してモノマーを形成させ、次いで、再酸化してヘテロダイマーの抗体を形成させ た。このようなＢｓＡｂは、インビトロでＨｕＴ−１０２細胞を溶解するために 、細胞傷害性Ｔ細胞を呼び寄せるのに非常に効果的であることが見出された。Ｈ ｏｌｌｉｎｇｅｒら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９０：６４４４〜６４４８（１９９ ３）により記載される「ジアボディ(ｄｉａｂｏｄｙ)」技術の出現は、ＢｓＡｂ フラグメントを作製するための代わりの機構をもたらした。このフラグメントは 、短すぎて同じ鎖の表面にある２つのドメインの間での対形成ができないリンカ ーによって軽鎖の可変ドメイン（Ｖ_L）に連結された重鎖の可変ドメイン（Ｖ_H） を含む。従って、１つのフラグメントのＶ_HドメインおよびＶ_Lドメインは、別の フラグメントの相補的なＶ_HドメインおよびＶ_Lドメインと対形成することを強い られ、それによって２つの抗原結合部位が形成される。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）のダ イマーの使用によるＢｓＡｂフラグメントを作製するための別の方策もまた報告 されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９ ４）を参照。この研究者らは、２５アミノ酸残基のリンカーによって抗フルオレ セイン抗体のＶ_HドメインおよびＶ_Lドメインに連結されたＴ細胞レセプターに対 する抗体のＶ_HドメインおよびＶ_Lドメインを含む抗体を設計した。再生された分 子は、フルオレセインおよびＴ細胞レセプターに結合し、フルオレセインがその 表面に共有結合しているヒト腫瘍細胞を溶解させた。 組換え細胞の培養物から直接回収することができる二重特異性抗体フラグメン トを作製するためのいくつかの技術が報告されているようである。しかし、完全 長のＢｓＡｂは、その血清半減期がより長いと考えられることおよび可能なエフ ェクター機能のために、多くの診療的適用に関しては、ＢｓＡｂフラグメントよ りも好ましいとされ得る。 免疫付着因子(Immunoadhesins) 免疫付着因子（Ｉａ）は、細胞表面レセプターまたはリガンド（「付着因子」(a dhesin)）などのタンパク質の結合ドメインを、免疫グロブリンの定常ドメイン のエフェクター機能とともに併せ持つ抗体様分子である。免疫付着因子は、ヒト 抗体の多くの貴重な化学的特性および生物学的特性を有し得る。免疫付着因子は 、適当なヒト免疫グロブリンのヒンジ配列および定常ドメイン（Ｆｃ）配列に連 結された所望の特異性を有するヒトのタンパク質配列から構築することができる ので、目的とする結合特異性は、完全なヒト成分を使用して達成することができ る。そのような免疫付着因子は、患者に対する免疫原性は最小であり、安全に長 期間 または繰り返し使用される。 文献に報告されている免疫付着因子には下記が含まれる。Ｔ細胞レセプターの 融合体(Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ ８４：２９３６〜２９４０(１９８７))；ＣＤ４の融合体（Ｃａｐｏｎら、 Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５〜５３１(１９８９)；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、 Ｎａｔｕｒｅ ３３９：６８〜７０(１９８９)；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら、ＤＮ Ａ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ ９：３４７〜３５３(１９９０)；およびＢｙ ｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６６７〜６７０(１９９０))；Ｌ−セレクチン またはホーミングレセプターの融合体(Ｗａｔｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ ｌ．１１０：２２２１〜２２２９(１９９０)；およびＷａｔｓｏｎら、Ｎａｔｕ ｒｅ ３４９：１６４〜１６７(１９９１))；ＣＤ４４の融合体（Ａｒｕｆｆｏ ら、Ｃｅｌｌ ６１：１３０３〜１３１３(１９９０))；ＣＤ２８およびＢ７の 融合体(Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１〜７３０(１９ ９１))；ＣＴＬＡ−４の融合体(Ｌｉｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４ ：５６１〜５６９(１９９１))；ＣＤ２２の融合体(Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、 Ｃｅｌｌ ６６：１１３３〜１１４４(１９９１))；ＴＮＦレセプターの融合体( Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８ ：１０５３５〜１０５３９(１９９１)；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３〜２８８６（１９９１）；およびＰｅｐｐｅｌら 、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３〜１４８９(１９９１))；ＮＰレセプ ターの融合体(Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３０６ ０〜２３０６７(１９９１))；インターフェロンγレセプターの融合体(Ｋｕｒｓ ｃｈｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９３５４〜９３６０(１９９ ２))；４−１ＢＢの融合体（Ｃｈａｌｕｐｎｙら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８９：１ ０３６０〜１０３６４(１９９２))およびＩｇＥレセプターαの融合体（Ｒｉｄ ｇｗａｙおよびＧｏｒｍａｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１１５巻、抄録番号 １４４８(１９９１))。 治療的使用について記載されている免疫付着因子の例には、細胞表面ＣＤ４に 対するＨＩＶの結合を阻止するためのＣＤ４−ＩｇＧ免疫付着因子が含まれる。 ＣＤ４−ＩｇＧを出産直前の妊娠女性に投与した第Ｉ相臨床試験から得られたデ ータにより、この免疫付着因子は、ＨＩＶの母−胎児間移動を防止することにお いて有用であり得ることが示唆されている。Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｉｎｔｅｒ ｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２１９〜２２７(１９９３)。腫瘍壊死因子 （ＴＮＦ）と結合する免疫付着因子もまた開発された。ＴＮＦは、敗血症性ショ ックの主要なメディエーターであることが明らかにされている前炎症性サイトカ インである。敗血症性ショックのマウスモデルに基づいて、ＴＮＦレセプター免 疫付着因子は、敗血症性ショックの処置において臨床的に使用するための候補物 として有望であることが明らかにされた(Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、上記)。免疫付 着因子は、治療以外にもまた使用される。例えば、Ｌ−セレクチンレセプター免 疫付着因子は、末梢リンパ節の高内皮細静脈（ＨＥＶ）の組織化学的染色を行う ための試薬として使用された。この試薬はまた、Ｌ−セレクチンのリガンドを分 離してその特徴づけを行うために使用された(Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、上記)。免 疫付着因子構造の２つのアームが異なる特異性を有する場合、免疫付着因子は、 二重特異性抗体に対する類推によって「二重特異性免疫付着因子」と呼ばれる。 Ｄｉｅｔｓｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６２：１２３（１ ９９３）は、接着分子（Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチン）の細胞外ドメイ ンを併せ持つそのような二重特異性免疫付着因子を記載する。結合性の研究によ り、そのようにして得られた二重特異性免疫グロブリン融合タンパク質は、それ が誘導された単一特異性の免疫付着因子と比較して、骨髄性細胞系に対する結合 能が高まったことが示された。 抗体-免疫付着因子のキメラ 抗体−免疫付着因子（Ａｂ／Ｉａ）キメラもまた文献に記載されている。この ような分子は、免疫付着因子の結合領域を抗体の結合ドメインとともに併せ持つ 。 Ｂｅｒｇら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：４７２３〜４７２７（１９９１）は、 マウスのＣＤ４−ＩｇＧから誘導された二重特異性の抗体−免疫付着因子キメラ を作製した。この研究者らは、２つのアームを有する四量体分子を構築した。一 方のアームは、抗体軽鎖の定常ドメインと融合したＣＤ４とともに、抗体重鎖の 定常ドメインと融合したＣＤ４からなった。もう一方のアームは、抗ＣＤ３抗体 の完全な軽鎖とともに、抗ＣＤ３抗体の完全な重鎖からなった。ＣＤ４−ＩｇＧ のアームによって、この二重特異性分子は、細胞傷害性Ｔ細胞の表面にあるＣＤ ３に結合する。細胞傷害性細胞およびＨＩＶ感染細胞を一緒にすると、ＨＩＶ感 染細胞が特異的に殺傷される。 Ｂｅｒｇら（上記）は四量体構造の二重特異性分子を記載しているが、１個の ＣＤ４−ＩｇＧ融合体のみを含有するトリマーのハイブリッド分子を作製するこ とができる。Ｃｈａｍｏｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４２６８（１９９ ４）を参照。この構築物の第１のアームは、ヒト化された抗ＣＤ３κ軽鎖および ヒト化された抗ＣＤ３γ重鎖によって形成される。第２のアームは、ＩｇＧのＦ ｃドメインによるｇｐ１２０の結合を担うＣＤ４の細胞外ドメインの一部を併せ 持つＣＤ４−ＩｇＧ免疫付着因子である。得られるＡｂ／Ｉａキメラは、ＨＩＶ 感染細胞の殺傷を、純粋な細胞傷害性Ｔ細胞調製物、またはＦｃレセプターを産 生する大顆粒状リンパ球エフェクター細胞をさらに含む全末梢血リンパ球（ＰＢ Ｌ）画分のいずれかを使用して媒介した。 多重特異性抗体ヘテロマルチマーの製造においては、ホモマルチマーよりも、 所望のヘテロマルチマーの産生を増大させることが望ましい。Ｆｃ含有のＢｓＡ ｂを得るために選択される現在の方法は、依然として、２つの抗体を同時に発現 するハイブリッドハイブリドーマである(ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ 、Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７〜５４０(１９８３))。 ハイブリッドハイブリドーマにおいて、重（Ｈ）鎖は、典型的には、所望のヘ テロダイマーと同様に、ホモダイマーを形成する。さらに、軽（Ｌ）鎖は、同系 でない重鎖との誤った対形成を形成することが多い。従って、２つの抗体が同時 に発現すると、重鎖および軽鎖の１０個までの対形成が生じ得る(Ｓｕｒｅｓｈ ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：２１０〜２２８(１ ９８６))。これらの望ましくない鎖の対形成は、ＢｓＡｂの産生を低下させ、そ して重大で、ときには克服できない精製問題を必然的に強いる(Ｓｍｉｔｈら(１ ９９２)上記、およびＭａｓｓｉｍｏら（１９９７）上記)。 抗体重鎖は、立体的に相補的な変異をマルチマー化ドメインのＣ_H３ドメイン 界面に導入することによるヘテロダイマー化（Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉ ｎＥｎｇ．９：６１７〜６２１(１９９６))、および本明細書中に記載されるフ ァージディスプレーによる最適化を行うために以前に操作されている。改変され たＣ_H３ドメインを含有する鎖によって、抗体／免疫付着因子ハイブリッド（Ａ ｂ／Ｉａ）の生成により判断されるように、約９０％までのヘテロダイマーが生 じる。ヘテロダイマー化した重鎖は、依然として、同系でない軽鎖との誤った対 形成を形成し得るので、目的のＢｓＡｂの回収が妨げられる。 発明の要旨 本出願は、モノマー混合物から所望するヘテロマルチマー二重特異性抗体の形 成を高めるのに役立つ方法を記載する。この方法は、ヘテロオリゴマー化のため に第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の界面を操作し、かつ、共通 する可変軽鎖を提供して二重特異性抗体のヘテロマーの各可変重鎖領域と相互作 用させることによる。３つの可能なヘテロマルチマーおよびホモマルチマーが、 第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドから形成され得る。そのようなポ リペプチドのそれぞれは、同様に、第１の軽鎖および第２の軽鎖とそれぞれ会合 する。これにより、鎖の対形成は合計で１０通りが可能である(図１Ａ)。所望の ヘテロマルチマー形成を高める方法によって、その産生を、望ましくないヘテロ マルチマーおよびホモマルチマーよりも大きく高めることができる。 ヘテロマルチマー抗体の第Ｉのポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の好 ましい界面は、抗体の定常ドメインのＣ_H３ドメインの少なくとも一部を含む。 界面で相互作用する第１および第２の各ポリペプチドのドメインは、マルチマー 化ドメインと呼ばれる。マルチマー化ドメインは、好ましくは、特定の第１のポ リペプチドと第２のポリペプチドとの間の相互作用を促進し、それによって所望 のヘテロマルチマーの産生を増大させる(図１Ｂ)。相互作用は、空洞への隆起(p rotuberance-into-cavity)の相補的な領域の形成；天然に存在しないジスルフィ ド結合の形成；ロイシンジッパー：疎水性領域；および親水性領域によって接触 面で促進され得る。「隆起」(protuberance)は、第１のポリペプチドの界面に由 来する小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプ トフ ァン）と置換することによって構築される。隆起と同一の大きさまたは類似する 大きさの代替的な「空洞」(cavity)は、任意に、大きなアミノ酸側鎖を、より小 さな側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）と置換することによって第２の ポリペプチドの界面に作製される。適切に配置され、そして適切な大きさを有す る隆起または空洞が第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのいずれかの 界面に存在する場合、隣接する接触面において、それぞれ、対応する空洞または 隆起の設計が必要とされるだけである。天然に存在しないジスルフィド結合は、 第１のポリペプチドにおいて、天然に存在するアミノ酸を、システインなどの遊 離（フリーの）チオールを含有する残基と置換して、遊離チオールが第２のポリ ペプチドの別の遊離チオール含有側鎖と相互作用し、そしてジスルフィド結合が 第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間で形成されるようにすることに よって構築される(図１Ｂ)。 大きな非免疫化ファージディスプレーライブラリー（Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９〜 ３１４、これは参考としてその全体が本明細書中に組込まれる）に由来する単鎖 Ｆｖフラグメントは、Ｖ-遺伝子の使用を明らかにした。この場合、いくつかの 生殖系列のＶ-遺伝子セグメントに由来するＶ_H配列およびＶ_L配列が優勢であり 、ファミリーがレパートリーにおいて優勢であった。異なるパートナー鎖との組 合せで特定の重鎖または軽鎖が見出されるレパートリーにおいて、鎖の入り交じ った状態の例が認められた(Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ら（１９９６）上記)。 所望するヘテロマルチマー多重特異性抗体の調製は、共通する軽鎖が多重特異 性抗体の可変重鎖のそれぞれと対形成するように提供される場合に増強されるこ とが本明細書中に開示される。共通する可変軽鎖の使用によって、抗原結合ドメ インを形成するために正しく対形成しなければならないモノマーの数が減少する 。これは、軽鎖の数を、（本発明が開示される前の二重特異性抗体または多重特 異性抗体のそれぞれにおける）２つ以上の軽鎖から、（本発明の多重特異性抗体 （図１Ｃを参照）における）１つの軽鎖に制限することによる。 従って、本発明は、ヘテロマルチマー多重特異性抗体を調製する方法に関する 。この抗体は、下記の１）および２）を含む：１）界面で接する第１のポリペプ チ ドおよび第２のポリペプチド(および抗体の多重度に従ってさらなるポリペプチ ド)、ただし、第１のポリペプチドおよびさらなるポリペプチド（または、第１ のポリペプチドおよび第２のポリペプチド）のそれぞれは、第１のポリペプチド と第２の（または、少なくとも１つのさらなる）ポリペプチドとの間の界面を形 成するマルチマー化ドメインを含み、そしてこのマルチマー化ドメインは、第１ のポリペプチドとさらなるポリペプチドとの間の安定な相互作用を促進する；お よび２）前記の第１のポリペプチドおよび少なくとも１つのさらなるポリペプチ ド（または、第２のポリペプチド）のそれぞれの結合ドメイン、ただし、各結合 ドメインは可変重鎖および可変軽鎖を含み、第１のポリペプチドの可変軽鎖およ び第２のポリペプチドの可変軽鎖は共通するアミノ酸配列を有し、そしてそのよ うな共通する配列は、前記ポリペプチドのそれぞれの元の軽鎖に対して、少なく とも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、 最も好ましくは１００％の配列同一性のアミノ酸配列同一性を有する。この方法 は下記の工程を含む： （ｉ）第１のポリペプチド、第２のポリペプチドおよび共通する軽鎖をコード する核酸を含む宿主細胞を培養し、この培養によって核酸を発現させる工程；お よび （ｉｉ）宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収する工程。 本発明の関連する実施態様において、第１のポリペプチドをコードする核酸ま たは第２のポリペプチドをコードする核酸、あるいはその両方は、その界面また はその一部をコードするように元の核酸から変更されている。 本発明の方法の別の実施態様において、第１のポリペプチドの界面は、第２の ポリペプチドの界面の遊離チオール含有残基と相互作用するように配置され、そ うすることによってジスルフィド結合が第１のポリペプチドと第２のポリペプチ ドとの間で形成される遊離チオール含有残基を含む。本発明により、第１のポリ ペプチドをコードする核酸は、遊離チオール含有残基をコードするように元の核 酸から変更され、あるいは第２のポリペプチドをコードする核酸は、遊離チオー ル含有残基をコードするように元の核酸から変更され、あるいはその両方である 。 本発明の方法の別の実施態様において、第１のポリペプチドおよび少なくとも １つのさらなるポリペプチド（または、第２のポリペプチド）の両方をコードす ろ核酸は、それぞれ、隆起および空洞をコードするように変更されている。第１ のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、それぞれ、好ましくは、ヒトＩｇ Ｇ₁のＣ_H３ドメインなどの抗体の定常ドメインを含む。 別の態様において、本発明は、界面で接する第１のポリペプチドおよび第２の ポリペプチドを含むヘテロマルチマー（二重特異性抗体、二重特異性免疫付着因 子または抗体／免疫付着因子キメラなど）を提供する。第１のポリペプチドの界 面は、少なくとも１つのさらなるポリペプチド（または、第２のポリペプチド） 上のマルチマー化ドメインと相互作用するように配置されて、第１のポリペプチ ドと第２のポリペプチドとの界面を形成するマルチマー化ドメインを含む。本発 明の好ましい実施態様において、マルチマー化ドメインは、特定の第１のポリペ プチドと特定の第２のポリペプチドとの間の相互作用が促進されるように変更さ れる。そのような変更には、隆起または空洞あるいはその両方の生成；天然に存 在しないジスルフィド結合の生成；相補的な疎水性領域の生成；および相補的な 親水性領域の生成が含まれるが、これらに限定されない。ヘテロマルチマー多重 特異性抗体は、薬学的に受容可能な担体をさらに含む組成物の形態で提供され得 る。 本発明はまた、前記のヘテロマルチマー多重特異性抗体をコードする核酸を含 む宿主細胞に関する：この場合、第１のポリペプチドおよび少なくとも１つのさ らなるポリペプチド（または、第２のポリペプチド）をコードするこの核酸は、 １つのベクターまたは別個のベクターに存在する。宿主細胞は、ヘテロマルチマ ー多重特異性抗体を作製する方法で使用することができる。この方法は、核酸を 発現するように宿主細胞を培養すること、およびその細胞培養物からヘテロマル チマー抗体を回収することを含む。 さらなる態様において、本発明は、ヘテロマルチマー多重特異性抗体を調製す る方法を提供し、この方法は下記の工程を含む： （ａ）少なくとも１つのさらなるポリペプチドの界面のアミノ酸と相互作用す るように配置されているアミノ酸残基を第１のポリペプチドの界面に含む第１の ポリペプチドをコードする第１の核酸を選択する工程。実施態様において、核酸 は、相互作用するアミノ酸残基をコードするように元の核酸から変更されている 。別の実施態様において、第１の核酸は、より大きな側鎖容量を有するアミノ酸 をコードするように変更され、それによって、隆起が第１のポリペプチドに形成 される； （ｂ）第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を変更し、その結果、第２ のポリペプチドの界面内のアミノ酸残基を、より小さな側鎖容量を有するアミノ 酸残基と置換し、それによって、第２のポリペプチドに空洞を形成させる工程。 この場合、前記の隆起は、この空洞と相互作用するように配置される； （ｃ）前記の第１の核酸および第２の核酸を宿主細胞に導入して、前記の第１ の核酸および第２の核酸が発現されるように宿主細胞を培養する工程；および （ｄ）細胞培養物から生成したヘテロマルチマー抗体を回収する工程。 前記の抗体が組み込まれた多重特性抗体（二重特異性抗体など）を構築するこ ともまた望ましいことであり得る。このような状況下では、元の軽鎖と対形成す る場合、目的の第２の抗原に特異的に結合する重鎖を同定することは望ましい。 Ｆｉｇｉｎｉらの方法（Ｆｉｇｉｎｉ，Ｍ．ら（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ ｌ．２３９：６８〜７８、これは参考としてその全体が本明細書中に組込まれる ）を使用して、そのような重鎖を同定することができる。最初に、ファージライ ブラリーをグアニジン塩酸で処理して、元の軽鎖を解離させる。次に、ファージ にディスプレーされた重鎖を、（透析などにより）変性剤を除くことによって目 的の軽鎖と再構成させる。次いで、目的の第２の抗原に対して選別を行い、所望 の重鎖を同定する。本発明はさらに、選択された軽鎖と対形成するように重鎖を 選択するこの方法によって調製される多重特異性抗体、そのような抗体をコード する核酸、およびそのような核酸を含む宿主細胞を含む。 本発明は、望ましくないヘテロマルチマーおよび／またはホモマルチマーなど の他の望ましくない最終産物よりもヘテロマルチマーの産生を増大させるための 機構を提供する(図１Ａ〜図１Ｃを参照)。組換え細胞の培養物から回収される所 望のヘテロマルチマーの産生量は、好ましくは、副生成物の望ましくないヘテロ ダイマーまたはホモマルチマーと比較して、少なくとも８０重量％を超え、好ま しくは少なくとも９０重量％を超える。 図面の簡単な説明 図１Ａ〜図１Ｃ。図１Ａは、ホモマルチマー化よりもヘテロマルチマー化を増 強させるための操作が行われない場合において、Ｆｃを含有する二重特異性抗体 の形成を示す略図である。図１Ｂは、所望のヘテロマルチマー化が、望ましくな いヘテロマルチマー化およびホモマルチマー化よりも好ましいように、重（Ｈ） 鎖が操作される場合に生じる対形成を示す略図である。図１Ｃは、同じ軽（Ｌ） 鎖を有する抗体を選択して、同系でない重鎖と対形成する軽鎖の問題が回避され る場合に生じる対形成を示す略図である。 図２Ａ〜図２Ｃ。図２Ａは、ファージディスプレーベクターｐＲＡ２を使用す るＣ_H３ヘテロダイマーの選択反応図式を図示する。安定なＣ_H３ヘテロダイマー をディスプレーするファージは、ｇＤフラッグに対する抗体を使用して捕獲され る。図２Ｂは、合成された遺伝子から発現されるＣ_H３が、Ｍ１３の遺伝子ＩＩ Ｉタンパク質との融合タンパク質として、天然の遺伝子（Ｅｌｌｉｓｏｎら、Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１〜４０７９(１９８２)）か ら発現されるＣ_H３の第２の複製物とともに同時に分泌されるジシストロン性オ ペロンを図示する。合成されたＣ_H３遺伝子は、単純ヘルペスウイルスの糖タン パク質Ｄから誘導されるペプチドをコードする配列(ｇＤフラッグ、Ｌａｓｋｙ ，Ｌ．Ａ．およびＤｏｗｂｅｎｋｏ，Ｄ．Ｊ．（１９８４）ＤＮＡ ３：２３〜 ２９；Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１４９ ０〜１４９２)、および部位特異的なプロテアーゼのゲネナーゼ（Ｇｅｎｅｎａ ｓｅ）Ｉの開裂（Ｇ）部位（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら（１９８９）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６： ２４０〜２４８）の下流に置かれる。図２Ｃは、翻訳されるＣ_H３遺伝子の残基 に、ＫａｂａｔらのＥｕ方式に従って番号を付けた図２Ｂのジシストロン性オペ ロンの核酸配列（配列番号１）である。「免疫学的に関心が持たれるタンパク質 の配列」、第５版、第１巻、６８８〜６９６頁、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍ Ｄ(１９９１)。隆起の変異Ｔ３６６Ｗを示す。そのような残基は、天然のＣ_H３ 遺伝子における無作為化のために標的化される(３６６、３６８および４０ ７)。 図３Ａ〜図３Ｃ。図３Ａおよび図３Ｂは、免疫付着因子(Ia)とともに抗体(Ab) の重鎖および軽鎖の共-移入から得られるプロテインＡ精製された生成物のＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥをデンシトメトリー分析で走査した結果の棒グラフである。示した データは、２つの独立した実験の平均である。ｘ軸は、投入したＤＮＡの質量比 （Ｉａ：Ｈ：Ｌ）を示し、ｙ軸は、全生成物タンパク質に対する生成物マルチマ ーの各タイプの割合を示す。図３Ｃは、可能な生成物マルチマーを図示する。 図４は、Ａｘ１、Ｒｓｅ、ＩｇＥＲ、Ｏｂ−ＲおよびＶＥＧＦに対する特異性 を有する８個の異なる抗体のＶ_L配列の比較である。配列定義（Ｋａｂａｔら（ １９９１）上記）または構造定義（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ，Ａ． Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．(１９８７)１９６：９０１〜９１７）に従った抗原 結合ＣＤＲ残基の位置を、それぞれ、下線および＃によって示す。Ａｘ１．７８ 配列と異なる残基を二重下線によって示す。 図５は、選択された抗Ｏｂ−Ｒクローンおよび抗ＨＥＲ３クローンの重鎖およ び軽鎖の比較である。二重特異性抗体の構築に使用した抗Ｏｂ-Ｒクローン２６ および抗ＨＥＲ３クローン１８のＶ_H配列および共通するＶ_L配列を示す。 図６。Ｍｐｌ−ＩｇＧおよびＨＥＲ３−ＩｇＧに対する同時結合を検出するた めのサンドイッチＥＬＩＳＡ。試験した抗体は、Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３ ６８Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６’Ｗ：Ｓ３５４’Ｃの変異を含有する抗Ｍｐｌ× 抗ＨＥＲ３のＢｓＩｇＧであり、Ｆｃ領域を変異させた対応する元の抗Ｍｐｌま たは抗ＨＥＲ３のＩｇＧとともに使用した。 図７は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の研究結果の棒グラフで ある。ＡＤＣＣは、変異型（Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９’Ｃ：Ｔ３６６ ’Ｓ：Ｌ３６８’Ａ：Ｙ４Ｏ７’Ｖ）または野生型のＦｃあるいはアイソタイプ が一致するコントロール抗体（Ｅ２５、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．ら（１９９３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３〜２６３２）のいずれかを含有するｈｕ ＭＡｂ４Ｄ５−５（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら（１９９２）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９ ：４２８５〜４２８９）によって媒介された。抗体（１２５ｎｇ／ｍｌ）を、ヒ ト末梢血単核エフェクター細胞およびＳＫ−ＢＲ−３標的細胞とともに示した比 でインキュベーションした。示したデータは、３連の測定値および３つの異なる 実験の平均である。 図８は、ＨＥＲ３に対して生起された抗体の軽鎖とＯｂ−Ｒに対して生起され た抗体の軽鎖との間のアミノ酸配列同一性を示す行列である。配列同一性が１０ ０％である軽鎖を有する抗体を黒四角に示す。配列同一性が９８％〜９９％であ る軽鎖を有する抗体を白四角に示す。抗体クローンの正体を行列の下部に示す。 Ｉ．定義 一般に、下記の用語または表現は、本説明、実施例および請求項において使用 される場合には下記の意味を有する。 「ヘテロマルチマー」，「ヘテロマルチマーポリペプチド」または「ヘテロマル チマー多重特異性抗体」は、少なくとも、第１のポリペプチドおよび第２のポリ ペプチドを含む分子である。この場合、第２のポリペプチドは、アミノ酸配列に おいて、第１のポリペプチドと少なくとも１個のアミノ酸残基が異なる。好まし くはヘテロマルチマーは、少なくとも２つの異なるリガンドまたは結合部位に対 する複数の結合特異性を有する。ヘテロマルチマーは、第１のポリペプチドおよ び第２のポリペプチドによって形成される「ヘテロダイマー」を含むことができ 、あるいはポリペプチドが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド以外 に、さらに存在する場合には、より高次の三次構造を形成することができる。ヘ テロマルチマーに関する例示的な構造には、ヘテロダイマー(例えば、Ｄｉｅｔ ｓｃｈら（上記）によって記載される二重特異性免疫付着因子)、ヘテロトリマ ー(例えば、Ｃｈａｍｏｗら（上記）によって記載されるＡｂ／Ｉａキメラ)、ヘ テロ四量体（例えば二重特異性抗体）及び更なるオリゴマー構造が含まれる。 本明細書中で使用されている「マルチマー化ドメイン」は、ヘテロマルチマー の各ポリペプチドの領域をいう。「マルチマー化ドメイン」は、ヘテロマルチマ ー複合体内のキメラ分子の安定な相互作用を促進する。マルチマー化ドメインは 、好ましくは、特定の第１のポリペプチドと特定の第２のポリペプチドとの間の 相互作用を促進し、それによって所望のヘテロマルチマーの形成が増強され、そ して望ましくないヘテロマルチマーまたはホモマルチマーの形成の可能性が実質 的 に低下する。マルチマー化ドメインは、免疫グロブリン配列、ロイシンジッパー 、疎水性領域、親水性領域、またはキメラなヘテロマルチマーのキメラ分子間で の分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを介して相互作用することが できる。遊離チオールは、ポリペプチド間のジスルフィド結合の形成を可能にす る位置において、ポリペプチドの天然に存在する残基を、例えば、システインと 置換することによって１つまたは複数の相互作用ポリペプチドの界面に導入する ことができる。マルチマー化ドメインは、免疫グロブリンの定常部を含むことが できる。本発明において有用で可能なマルチマー化ドメインが、ハイブリッドの 免疫グロブリンを記載する国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６８４９号（こ れは参考としてその全体が本明細書中に組込まれる）に開示されている。さらに 、マルチマー化領域は、立体的な相互作用によって、安定な相互作用が促進され るだけでなく、モノマーの混合物に由来するホモダイマーよりもヘテロダイマー の形成がさらに促進されるように設計することができる。例えば、国際特許出願 第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１５９８号（これは参考としてその全体が本明細書中に 組込まれる）を参照。これは、ヘテロオリゴマー化のために第１のポリペプチド と第２のポリペプチドとの間の界面に関する「空洞への隆起」法を開示する。「 隆起」は、第１のポリペプチドの界面に由来する小さなアミノ酸側鎖を、より大 きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置換することによって構 築される。隆起と同一の大きさまたは類似する大きさの代償的な「空洞」は、任 意に、大きなアミノ酸側鎖を、より小さな側鎖（例えば、アラニンまたはトレオ ニン）と置換することによって第２のポリペプチドの界面に作製される。免疫グ ロブリン配列は、免疫グロブリンの定常ドメインであることが好ましいが、必ず しも、免疫グロブリンの定常ドメインである必要はない。本発明のキメラにおけ る免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃またはＩｇＧ₄のサブタイ プ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得ることができるが、ＩｇＧ₁、 ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃またはＩｇＧ₄が好ましい。 「遊離（フリーの）チオール含有化合物」は、本発明のポリペプチド界面のア ミノ酸に組み込むことができるか、またはそのようなアミノ酸と反応することが できる化合物であって、この化合物の遊離チオール部分が、本発明のさらなるポ リペプチドの界面において遊離チオール部分と相互作用して、ジスルフィド結合 を形成するように配置されている化合物を意味する。遊離チオール含有化合物は 、好ましくは、システインである。 用語「エピトープ標識化」は、本明細書で使用される場合、「標識ポリペプチ ド」に融合したキメラなヘテロ付着因子の全体またはそのフラグメントを含むキ メラなポリペプチドを示す。標識ポリペプチドは、抗体が作製され得るエピトー プを提供するのに十分な残基を有するが、キメラなヘテロ付着因子の活性を妨げ ないように十分に短い。標識ポリペプチドは、好ましくは、非常に特徴的であり 、その結果、それに対する抗体は、他のエピトープと実質的に交差反応しない。 適切な標識ポリペプチドは、一般には、少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、 通常は、８個〜５０個の間のアミノ酸残基（好ましくは、約９残基〜３０残基の 間）を有する。本発明の実施態様は、エピトープ標識に結合したキメラなヘテロ 付着因子を含み、そのような標識を使用して、サンプル中の付着因子の検出また はサンプルからの付着因子の回収が行われる。 本明細書中で使用されている「共通する軽鎖」または「軽鎖の共通するアミノ 酸配列」は、本発明の多重特異性抗体における軽鎖のアミノ酸配列をいう。抗体 パネルが、ファージディスプレーライブラリーの選別を行うことによって、少な くとも２つの異なる抗原に対して作製された。そのようなファージディスプレー ライブラリーは、例えば、Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）(上記)により記載され ている(これは、ファージミドライブラリーを選択する方法を特に参照して、参 考としてその全体が本明細書中に組込まれる)。軽鎖配列を、可変軽鎖アミノ酸 配列に関して比較した。比較されたパネルに由来する有用な軽鎖は、少なくとも ８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も 好ましくは１００％の同一性のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖である。共通す る軽鎖配列は、比較された２つの軽鎖配列の近似であろように設計された配列で ある。比較される軽鎖が、アミノ酸レベルで１００％の配列同一性である場合、 共通する軽鎖は、軽鎖が多重特異性抗体の異なる結合ドメインにおいて機能する としても、選択されたライブラリーのクローンに由来する軽鎖と同一である。比 較される軽鎖が上記と異なる場合、共通する軽鎖は、ライブラリーのクローンに 由来する比較される軽鎖の１つまたはもう一方、あるいはその両方と異なり得る 。共通する軽鎖が、ライブラリーのクローンの１つまたはもう一方と、あるいは その両方と異なる場合、異なる残基は、抗体軽鎖の抗原結合ＣＤＲ残基の外側に 存在することが好ましい。例えば、抗原結合ＣＤＲ残基の位置は、配列定義（Ｋ ａｂａｔら（１９９１）上記）または構造定義（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ （１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７）に従って決定す ることができる。 本明細書中で用いている「アミノ酸配列同一性」は、１つの配列のアミノ酸が 第２のアミノ酸配列のアミノ酸とどのくらい同じであるかの割合をいう。ポリペ プチド鎖の間において１００％の配列同一性は、鎖が同一であることを意味する 。 本明細書中で使用されている「ポリペプチド」は、一般に、約１０個よりも多 いアミノ酸を有するペプチドおよびタンパク質をいう。好ましくは、哺乳動物の ポリペプチド（哺乳生物から最初に得られたポリペプチド）が使用され、より好 ましくは、培地に直接分泌されるポリペプチドである。細菌のポリペプチドの例 には、例えば、アルカリホスファターゼおよびβ−ラクタマーゼが含まれる。哺 乳動物のポリペプチドの例には、レニン、成長ホルモンなどの分子が含まれ、下 記が含まれる：ヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子； 副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１抗トリプシン ；インシュリンＡ鎖；インシュリンＢ鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン ；カルシトニン；黄体化ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子 、組織因子およびフォンビルブランド因子などの凝固因子；プロテインＣなどの 抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺接触面活性物質；ウロキナーゼまた はヒトウリンまたは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのプラ スミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因 子−αおよび腫瘍壊死因子−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ(ｒｅｇｕ ｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ)；ヒトマクロファージ炎症タ ンパク質(ＭＩＰ−１−α)；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュー ラー阻害物質：レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウス性腺 刺激ホルモン関連ペプチド；β−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮａ ｓｅ；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン または成長（増殖）因子のレセプター；インテグリン；プロテインＡまたはプロ テインＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)、ニューロトロフィン −３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５またはニューロトロフ ィン−６(ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６)、あるいはＮＧＦ−β などの神経増殖因子などの神経栄養因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ａ ＦＧＦおよびｂＦＧＦなどの繊維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；Ｔ ＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を 含むＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどのトランスホーミング増殖因子(ＴＧＦ)； インシュリン様増殖因子−Ｉおよびインシュリン様増殖因子−ＩＩ(ＩＧＦ−Ｉ およびＩＧＦ−ＩＩ)；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ(脳ＩＧＦ−Ｉ)、インシ ュリン様増殖因子結合タンパク質：ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ− １９などのＣＤタンパク質；エリスロポイエチン；骨誘導因子；イムノトキシン ；骨形態形成タンパク質(ＢＭＰ)；インターフェロン−α、インターフェロン− βおよびインターフェロン−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（Ｃ ＳＦ）類、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイ キン（ＩＬ）類、例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムタ ーゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えば、ＡＩＤＳ エンベロープの一部などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミングレセプタ ー；アドレシン；調節タンパク質；抗体；および上記のポリペプチドのいずれか のフラグメント。 「第１のポリペプチド」は、第２のポリペプチドと結合し得る任意のポリペプ チドである。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、「界面」(下記 において定義)で接する。界面に加えて、第１のポリペプチドは、「結合ドメイ ン」(例えば、抗体の可変ドメイン、レセプター結合ドメイン、リガンド結合ド メインまたは酵素活性ドメイン)、またはＣ_H２、Ｃ_H１およびＣ_Lドメインを含む 抗体の定常ドメイン（またはその一部）などのさらなるドメインを１つまたは複 数含むことができる。通常、第１のポリペプチドは、抗体から誘導される少な くとも１つのドメインを含む。このようなドメインは、好都合なことに、抗体の Ｃ_H３ドメインなどの定常ドメインであり、第１のポリペプチドの界面を形成す ることができる。例示的な第１のポリペプチドには下記が含まれる。抗体重鎖ポ リペプチド、異種ポリペプチドの結合ドメインとともに抗体の定常ドメインを併 せ持つキメラ(すなわち、免疫付着因子、下記の定義を参照)、レセプターポリペ プチド(特に、別のレセプターポリペプチド、例えば、インターロイキン−８レ セプター（ＩＬ−８Ｒ）およびインテグリンヘテロダイマー（例えば、ＬＦＡ− ＩまたはＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ）とダイマーを形成するポリペプチド)、リガ ンドポリペプチド(例えば、神経増殖因子(ＮＧＦ)、ニューロトロフィン−３（ ＮＴ−３）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）−Ａｒａｋａｗａら、Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９(４５)：２７８３３〜２７８３９（１９９４）および Ｒａｄｚｉｅｊｅｗｓｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２(４８)：１３５０（１９９ ３）参照)、および抗体の可変ドメインポリペプチド（例えば、ジアボディ(ｄｉ ａｂｏｄｙ))。好ましい第１のポリペプチドは、免疫グロブリンの定常ドメイン に融合した抗体の重鎖から選択され、この場合、定常ドメインは、本発明の第２ のポリペプチドとの優先的な相互作用が促進されるように界面において変更され ている。 「第２のポリペプチド」は、「界面」を介して第１のポリペプチドと会合し得 る任意のポリペプチドである。界面に加えて、第２のポリペプチドは、「結合ド メイン」(例えば、抗体の可変ドメイン、レセプター結合ドメイン、リガンド結 合ドメイン、または酵素活性ドメイン)、またはＣ_H２ドメイン、Ｃ_H１ドメイン およびＣ_Lドメインを含む抗体の定常ドメイン（または、その一部）などのさら なるドメインを含むことができる。通常、第２のポリペプチドは、抗体から誘導 される少なくとも１つのドメインを含む。このようなドメインは、好都合なこと に、抗体のＣ_H３ドメインなどの定常領域であり、第２のポリペプチドの界面を 形成することができる。例示的な第２のポリペプチドには下記が含まれる。抗体 重鎖ポリペプチド、異種ポリペプチドの結合ドメインとともに抗体の定常ドメイ ンを併せ持つキメラ(すなわち、免疫付着因子、下記の定義を参照)、レセプター ポリペプチド(特に、別のレセプターポリペプチド、例えば、インターロイキ ン−８レセプター（ＩＬ−８Ｒ）およびインテグリンヘテロダイマー（例えば、 ＬＦＡ−ＩまたはＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ）とダイマーを形成するポリペプチド )、リガンドポリペプチド(例えば、神経増殖因子(ＮＧＦ)、ニューロトロフィン −３（ＮＴ−３）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）−Ａｒａｋａｗａら、 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９(４５)：２７８３３〜２７８３９（１９９４） およびＲａｄｚｉｅｊｅｗｓｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２(４８)：１３５０( １９９３))、および抗体の可変ドメインポリペプチド(例えば、ジアボディ)。好 ましい第２のポリペプチドは、免疫グロブリンの定常ドメインに融合した抗体の 重鎖から選択され、この場合、定常ドメインは、本発明の第１のポリペプチドと の優先的な相互作用が促進されるように界面において変更されている。 「結合ドメイン」は、目的の分子（例えば、抗原、リガンド、レセプター、基 質または阻害剤）との選択的な結合を担うポリペプチドの任意の領域を含む。例 示的な結合ドメインには、抗体の可変ドメイン、レセプター結合ドメイン、リガ ンド結合ドメインおよび酵素活性ドメインが含まれる。好ましい実施態様におい て、結合ドメインは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖を含む。本発明の二重特 異性抗体およびその作製方法により、二重特異性抗体の各結合ドメインに関する 軽鎖は、共通する軽鎖であり、それによって重鎖および軽鎖の誤った対形成が存 在する望ましくないヘテロマルチマーの形成が避けられる。 用語「抗体」は、それが本発明に関連する場合、目的の抗原のエピトープと結 合するドメインを１つまたは複数含有するポリペプチドを意味するものとする。 この場合、そのようなドメインは、抗体の可変部から誘導されるか、または抗体 の可変部との配列同一性を有する。抗体の例には、全長の抗体、抗体フラグメン ト、単鎖分子、二重特異性分子または二機能性分子、ジアボディー、キメラ抗体 （例えば、ヒト化抗体およびＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ^TM抗体）および免疫付着因子 が含まれる。「抗体フラグメント」には、Ｆｖ、Ｆｖ'、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およ びＦ（ａｂ'）₂のフラグメントが含まれる。 「ヒト化(された)」形態の非ヒト（例えば、齧歯類または霊長類）抗体は、非 ヒト免疫グロブリンから誘導される最小の配列を含有する特異的でキメラな免 疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントである。その大部分に おいて、ヒト化抗体は、受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、 所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは霊長類 などの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって置き換えられて いるヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロ ブリンのＦｖ枠組み構造領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き 換えられる。さらに、ヒト化抗体は、受容者抗体あるいは持ち込まれたＣＤＲ配 列または枠組み構造配列のいずれにおいても見出されない残基を含むことができ る。このような改変は、抗体の能力を改良して最大にするために行われる。一般 に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に 全てを含む。そのような可変ドメインにおいて、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に 全ては、非ヒトの免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてＦＲ領域の全て 又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は また、好ましくは、免疫グロブリンの定常部(Ｆｃ)、典型的には、ヒト免疫グロ ブリンの定常部（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。ヒト化抗体は、抗体の抗原結 合領域が、目的の抗原でマカク（ｍａｃａｑｕｅ）サルを免疫化することによっ て産生される抗体から誘導されるＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ^TM抗体を含む。 「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有 する分子である。そのような分子は、通常、２つの抗原と結合するだけである（ すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）が、三重特異性抗体などのさらなる特異 性を有する抗体も、本明細書中で使用される場合にはこの表現に含まれる。Ｂｓ Ａｂの例には、腫瘍細胞の抗原に対する一方のアームと、細胞傷害誘引因子分子 に対するもう一方のアームとを有する下記のような二重特異性抗体が含まれる。 例えば、抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５^HER2／ＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１ ６)、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ細胞(１Ｄ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５^HER2、抗ＣＤ ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎細胞ガン、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ−３、抗ＣＤ ３／Ｌ−Ｄ１(抗結腸ガン)、抗ＣＤ３／抗メラニン細胞刺激ホルモンアナログ、 抗ＥＧＦレセプター／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１ ９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞付着因子分子（ＮＣＡＭ）／抗ＣＤ３、 抗葉 酸結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗汎カルシノーマ関連抗原（ＡＭＯＣ −３１）／抗ＣＤ−３；腫瘍抗原に特異的に結合するアームと、毒素に結合する アームとを有するＢｓＡｂ、例えば、抗サポリン／抗Ｉｄ−１、抗ＣＤ２２／抗 サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシ ンＡ鎖、抗インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）／抗ハイブリドーマイディオタ イプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイドなど；変換酵素によって活性化されるプ ロドラッグに対するＢｓＡｂ、例えば、抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ （これは、マイトマイシンホスフェートプロドラッグのマイトマシンアルコール への変換を触媒する）など；フィブリン溶解剤として使用することができるＢｓ Ａｂ、例えば、抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲン活性化因子(ｔｐＡ)、抗 フィブリン／抗ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）など；細 胞表面レセプターに対して免疫複合体を標的化するためのＢｓＡｂ、例えば、抗 低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）／抗Ｆｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩ、Ｆ ｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩ）など；感染性疾患の治療において使用される ＢｓＡｂ、例えば、抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)、抗Ｔ細胞レセ プター：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶなど；インビ トロまたはインビボで腫瘍を検出するためのＢｓＡｂ、例えば、抗ＣＥＡ／抗Ｅ ＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５^HER2／抗ハプテン；ワクチンア ジュバントとしてのＢｓＡｂ(Ｆａｎｇｅｒら（上記）を参照)；および診断用具 としてのＢｓＡｂ、例えば、抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗ホースラディッ シュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗サブスタ ンスＰ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗β−ガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａ ｎら（上記）を参照）など。三重特異性抗体の例には、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗 ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７および抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ ３７が含まれる。 本明細書中で使用されている用語「免疫付着因子」は、免疫グロブリンの定常 ドメインのエフェクター機能とともに、異種タンパク質（「付着因子」、例えば、 レセプター、リガンドまたは酵素）の「結合ドメイン」を併せ持つ抗体様の分子 を示す。構造的には、免疫付着因子は、抗体の抗原認識部位および結合部位（抗 原結合部位）以外である（すなわち、「異種である」）所望の結合特異性を有する 付着因子のアミノ酸配列と、免疫グロブリンの定常ドメイン配列との融合体を含 む。免疫付着因子における免疫グロブリンの定常ドメイン配列は、ＩｇＧ₁、Ｉ ｇＧ₂、ＩｇＧ₃もしくはＩｇＧ₄のサブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたは ＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。 本明細書中で使用されている用語「リガンド結合ドメイン」は、定量的なリガ ンド結合能、および好ましくは対応する天然のレセプターの生物学的活性を少な くとも保持する任意の天然の細胞表面レセプターまたはその任意の領域もしくは 誘導体をいう。特定の実施態様において、レセプターは、免疫グロブリンスーパ ー遺伝子ファミリーのメンバーと相同的な細胞外ドメインを有する細胞表面ポリ ペプチドに由来する。免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーでは ないが、それにもかかわらず、この定義によって具体的に含まれる他の代表的な レセプターは、サイトカインに対するレセプターであり、特にチロシンキナーゼ 活性を有するレセプター（レセプターチロシンキナーゼ）であり、そしてヘマト ポイエチンおよび神経増殖因子レセプタースーパーファミリーのメンバー、なら びに細胞付着因子分子、例えば、（Ｅ、ＬおよびＰ−）セレクチンである。 用語「レセプター結合ドメイン」は、定量的なレセプター結合能、および好ま しくは対応する天然のリガンドの生物学的活性を少なくとも保持するレセプター に対する任意の天然のリガンド（細胞付着因子分子を含む）またはその任意の領 域もしくは誘導体を示すために使用される。この定義は、特に、具体的には、上 記のレセプターに対するリガンドに由来する結合配列を含む。 本明細書中で使用されている用語「多重特異性免疫付着因子」は、少なくとも ２つの結合特異性を有する（すなわち、２つ以上の付着因子結合ドメインを併せ 持つ）(上記に定義されている)免疫付着因子を示す。多重特異性免疫付着因子は 、本質的には、国際特許公開第ＷＯ８９／０２９２２号(１９８９年４月６日公 開)、欧州特許ＥＰ３１４，３１７（１９８９年５月３日公開）および米国特許 第５，１１６，９６４号（１９９２年５月２日発行）に開示されているように、 ヘテロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロ四量体として組み立てることがで きる。好ましい多重特異性免疫付着因子は二重特異性である。二重特異性免疫付 着因子の例には、ＣＤ４−ＩｇＧ／ＴＮＦレセプター−ＩｇＧおよびＣＤ４−Ｉ ｇＧ／Ｌ−セレクチン−ＩｇＧが含まれる。後者の分子は、リンパ球ホーミング レセプター（ＬＨＲＮＬ−セレクチン）のリンパ節結合機能と、ＣＤ４のＨＩＶ 結合機能とを併せ持ち、ＨＩＶ感染、関連する症状の予防または処置において、 または診断薬としての適用の可能性が見出されている。 「抗体−免疫付着因子キメラ(Ａｂ／Ｉａキメラ)」は、（本出願において定義 されている）少なくとも１つの免疫付着因子とともに、（上記に定義されている ）抗体の少なくとも１つの結合ドメインを併せ持つ分子を含む。例示的なＡｂ／ Ｉａキメラは、Ｂｅｒｇら（上記）およびＣｈａｍｏｗら（上記）によって記載 されている二重特異性ＣＤ４−ＩｇＧキメラである。 「界面」は、第２のポリペプチドの界面内において１つまたは複数の「接触」 アミノ酸残基（または、アミノ酸でない他の基）と相互作用する第１のポリペプ チドにおける「接触」アミノ酸残基（あるいは、炭水化物基、ＮＡＤＨ、ビオチ ン、ＦＡＤまたはヘム基などのアミノ酸でない他の基）を含む。好ましい界面は 、可変ドメインまたは定常ドメイン（またはその領域）などの免疫グロブリンの ドメインである。しかし、ヘテロマルチマーレセプターを形成するポリペプチド 間の界面、またはＮＧＦ、ＮＴ−３およびＢＤＮＦなどの２つ以上のリガンドの 間の界面も、この用語の範囲に含まれる。好ましい界面は、好ましくはＩｇＧ抗 体から誘導され、最も好ましくはヒトＩｇＧ₁抗体から誘導される免疫グロブリ ンのＣ_H３ドメインを含む。 「元の」アミノ酸残基は、元の残基よりも小さな側鎖容量または大きな側鎖容 量を有し得る「移入」残基によって置換されるアミノ酸残基である。移入アミノ 酸残基は、天然存在アミノ酸残基または非天然存在アミノ酸残基であり得るが、 天然存在アミノ酸残基が好ましい。「天然存在」アミノ酸残基は、遺伝暗号によ ってコードされるアミノ酸残基、および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１ ５９８号（これは参考としてその全体が本明細書中に取込まれる）の表１に列記 されるアミノ酸残基である。「非天然存在」アミノ酸残基は、遺伝暗号によって コードされていないが、ポリペプチド鎖で隣のアミノ酸残基と共有結合すること ができる残基を意味する。非天然存在アミノ酸残基の例には、例えば、ノルロイ シン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、およびＥｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１〜３３６（１９９１）に記載されるアミノ酸残基 アナログなどの他のアミノ酸残基のアナログが挙げられる。天然に存在しないそ のようなアミノ酸残基を作製するために、Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４ ４：１８２（１９８９）およびＥｌｌｍａｎら（上記）の方法を使用することが できる。簡単に記載すると、この方法は、非天然存在アミノ酸残基でサプレッサ ーｔＲＮＡを化学的に活性化し、その後、インビトロでＲＮＡの転写および翻訳 を行うことを含む。本発明の方法には、少なくとも１つの元のアミノ酸残基を置 換することが含まれるが、２つ以上の元の残基を置換することができる。通常は 、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドの界面におけるすべての残基が 、置換される元のアミノ酸残基を含むにすぎない。置換に好ましい元の残基は「 埋もれている」。「埋もれている」は、残基が本質的には溶媒と接触できないこ とを意味する。移入残基は、好ましくは、酸化または誤ったジスルフィド結合の 形成の可能性を避けるために、システインではない。 「元の核酸」は、アミノ酸側鎖が、第１のポリペプチドと第２のポリペプチド との間で界面で相互作用して、ポリペプチド間の安定な相互作用を促進させるア ミノ酸がマルチマー化ドメイン内でコードされるように変更することができる、 目的のポリペプチドをコードする核酸を意味する。そのような変更によって、空 洞への隆起、天然に存在しないジスルフィド結合、ロイシンジッパー、疎水性相 互作用および親水性相互作用のような安定な相互作用に限定されないが、そのよ うな安定な相互作用を生じさせることができる。このような変更は、好ましくは 、目的とする第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の特異的な相互作 用を促進し、望ましくないヘテロマーの対形成またはホモマーの形成が生じる相 互作用を効果的に除くように選択される。元の核酸または出発核酸は、天然に存 在する核酸であり得るか、または以前に変更が行われた核酸（例えば、ヒト化抗 体フラグメント）を含み得る。核酸を「変更する」は、元の核酸を、目的のアミ ノ酸残基をコードしているコドンの少なくとも１つの挿入、欠失または置換によ る遺伝子操作または変異処理を行うことを意味する。通常、元の残基をコードし ているコドンは、移入残基をコードするコドンによって置換される。このように Ｄ ＮＡを遺伝子的に改変するための技術は、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ Ｐｒａ ｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編、ＩＲＬ Ｐ ｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ（１９９１）に総説されており、例えば、部位特 異的変異誘発法、カセット変異誘発法およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変 異誘発法を含む。 隆起、空洞、または（ジスルフィド結合の形成に必要なシステイン残基などの ）遊離（フリーの）チオールは、合成的手段によって、例えば、組換え技術、イ ンビトロペプチド合成、前記の天然に存在しないアミノ酸残基を導入するための そのような技術、ペプチドの酵素的または化学的な連結、あるいはこれらの技術 のいくつかの組合せによって、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドの 界面に「導入する」ことができる。従って、「導入される」隆起、空洞、または 遊離チオールは、「天然に存在しない」、すなわち、「非天然」である。これは、 自然界または元のポリペプチド（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）に存在し ないことを意味する。 隆起を形成するために移入アミノ酸残基は、比較的少数（例えば、約３個〜６ 個）の「回転異性体」を有することが好ましい。「回転異性体」は、アミノ酸側 鎖のエネルギー的に有利な立体配座である。様々なアミノ酸残基の回転異性体の 数は、ＰｏｎｄｅｒｓおよびＲｉｃｈａｒｄｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３ ：７７５〜７９１（１９８７）に総説されている。 「分離された」ヘテロマルチマーは、その天然の細胞培養環境の成分からの同 定および分離および／または回収が行われたヘテロマルチマーを意味する。その 天然環境の混入成分は、ヘテロマルチマーに関する診断使用または治療使用を妨 害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク 質性の溶解物を含み得る。好ましい実施態様において、ヘテロマルチマーは、（ １）ローリー法によって測定されるように９５重量％を超えるように、最も好ま しくは９９重量％を超えるように、あるいは（２）スピニングカップ配列決定装 置の使用によって、Ｎ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基が得 られるのに十分な程度に、あるいは（３）クマシーブルー染色、または好ましく は銀染色を使用して、還元条件下または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによ り均 一になるまで精製される。 本発明のヘテロマルチマーは、一般には、実質的に均一になるまで精製される 。「実質的に均一」、「実質的に均一な形態」および「実質的な均一性」という表 現は、生成物が、望ましくないポリペプチドの組合せ物に由来する副生成物（例 えば、ホモマルチマー）を実質的に有していないことを示すために使用される。 純度に関して表現される場合、実質的な均一性は、副生成物の量が、１０％を超 えないこと、好ましくは５％未満であること、より好ましくは１％未満であるこ と、最も好ましくは０．５％未満であることを意味する。ただし、割合は重量比 である。 「制御配列」という表現は、特定の宿主生物において、機能的に連結されたコ ード配列を発現させるのに必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切な制御配列 には、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、リボソーム結合 部位、および可能であれば、未だあまりよく理解されていない他の配列が含まれ る。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサ ーを利用することが知られている。 核酸は、核酸が別の核酸配列と機能的な関係におかれている場合に「機能的に 連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダーに関するＤＮＡは、Ｄ ＮＡが、ポリペプチドの分泌に関与しているプレタンパク質として発現される場 合、ポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結されている：プロモーターまたはエン ハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能的に連結 されている；あるいは、リボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように 配置されている場合、コード配列に機能的に連結されている。一般に、「機能的 に連結されている」は、連結されているＤＮＡ配列が連続していることを、そし て分泌リーダーの場合には、読み取り相で連続していることを意味する。しかし 、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、都合の良い制限部位で結 合させることによって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリ ゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来的な実施に従って使用される 。 ＩＩ．ヘテロマルチマーの調製 １．出発材料の調製 最初の工程として、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド（およびヘ テロマルチマーを形成する任意のさらなるポリペプチド）が選択される。通常、 これらのポリペプチドをコードする核酸は分離しなければならず、その結果、核 酸は、本明細書中で定義されているように、隆起または空洞またはその両方をコ ードするように変更することができる。しかし、変異は、合成的な手段を使用す ることによって、例えば、ペプチド合成を使用することによって導入することが できる。同様に、移入残基が天然に存在しない残基である場合には、Ｎｏｒｅｎ ら（上記）の方法を、そのような置換を有するポリペプチドを作製するために用 いることができる。さらに、ヘテロマルチマーの一部は、細胞培養で組換え的に 適切に作製され、そのような分子の他の部分は、上記のそのような技術によって 作製される。 抗体の分離および免疫付着因子の調製に関する技法が次に行われる。しかし、 ヘテロマルチマーは、当技術分野で知られている技術を使用して、他のポリペプ チドから形成され得るか、または他のポリペプチドを組み込むことができること が理解される。例えば、目的のポリペプチド（例えば、リガンド、レセプターま たは酵素）をコードする核酸は、ポリペプチドのｍＲＮＡを有し、そのｍＲＮＡ を検出可能なレベルで発現していると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡラ イブラリーから分離することができる。ライブラリーは、目的の遺伝子またはそ れによってコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（例え ば、抗体または約２０塩基〜８０塩基のオリゴヌクレオチドなど）を用いてスク リーニングされる。選択されたプローブによるｃＤＮＡライブラリーまたはゲノ ムライブラリーのスクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒ ｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ ｓ、１９８９）の第１０章〜第１２章に記載される標準的な手順を使用して行う ことができる。 （１）抗体の調製 抗体の産生に関する技術がいくつか記載されている。そのような技術には、モ ノクローナル抗体を作製するための従来のハイブリドーマ法、抗体(キメラ抗体 、例えば、ヒト化抗体を含む)を作製するための組換え技術、トランスジェニッ ク動物での抗体産生、および「完全なヒト」抗体を調製するために近年記載され たファージディスプレー技術が含まれる。これらの技術を下記に簡単に記載する 。 目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、一般には、抗原およびアジュバン トの皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射を多数回行うことによって動物 に生起させることができる。抗原（または、標的アミノ酸配列を含有するフラグ メント）を、免疫化される種において免疫原であるタンパク質（例えば、キーホ ルリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダ イズのトリプシン阻害剤）に、二官能性薬剤または誘導化剤を使用して結合させ ることは有用であり得る。そのような二官能性薬剤または誘導化剤は、例えば、 マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する コンジュゲーション)、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(リシン残基を介する)、 グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ₂、またはＲ¹Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ただ し、ＲおよびＲ¹は異なるアルキル基である）である。動物は、免疫原性のコン ジュゲートまたは誘導体に対して、（ウサギまたはマウスに関して、それぞれ） １ｍｇのコンジュゲートを３容量のフロイント完全アジュバントと一緒にして、 その溶液を皮下に多数の部位に注射することによって免疫化される。１ヶ月後、 動物は、フロイント完全アジュバント中のコンジュゲートの最初の量の１／５〜 １／１０を用いて、多数の部位に皮下注射することによって追加免疫される。７ 日〜１４日の後に、動物は採血され、血清を抗体力価についてアッセイする。動 物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫される。動物は、好ましくは、同じ 抗原のコンジュゲートで追加免疫されるが、異なるタンパク質に結合させたコン ジュゲートおよび／または異なる架橋剤によるコンジュゲートで追加免疫される 。コンジュゲートはまた、タンパク質の融合体として、組換え細胞培養で作製す ることができる。同様に、ミョウバンなどの凝集化剤を使用して、免疫応答を増 強することができる。 モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって初めて記載されたハイブリドーマ法を使用 して実質的に均一な抗体集団から得られるか、または、組換えＤＮＡ法（Ｃａｂ ｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製することができる 。ハイブリドーマ法において、マウス、またはハムスターなどの他の適切な宿主 動物を上記のように免疫化して、免疫化のために使用されたタンパク質に特異的 に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球が誘導される。あるい は、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次いで、ポリエチレング リコールなどの適切な融合化剤を使用してリンパ球をミエローマ細胞と融合して 、ハイブリドーマ細胞を得る(Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ ｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９頁〜１ ０３頁(Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６))。このようにして調製され たハイブリドーマ細胞を、融合していない元のミエローマ細胞の生育または生存 を阻害する物質を１つまたは複数含有することが好ましい適切な培養培地に播種 して、増殖させる。例えば、元のミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失してい る場合、ハィブリドーマの培養培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の生育 を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む(Ｈ ＡＴ培地)。好ましいミエローマ細胞は、効率よく融合し、選択された抗体産生 細胞によって抗体の安定で高レベルの発現を維持し、ＨＡＴ培地などの培地に対 して感受性を有するミエローマ細胞である。このような細胞の中で、好ましいミ エローマ細胞株は、ネズミのミエローマ細胞株であり、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔ ｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ Ｄｉｅ ｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭ ＰＣ−１１のマウス腫瘍から誘導されるミエローマ細胞株、ならびにＡｍｅｒｉ ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌ ｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）から入手可能なＳＰ−２細胞などである。ヒト のミエローマ細胞株およびマウス−ヒトのヘテロミエローマ細胞株もまた、ヒト のモノクローナル抗体の産生に関して記載されている(Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍ ｍｕｎｏｌ.、１３３：３００１(１９８４)；およびＢｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎ ｏ ｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１頁〜６３頁、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅ ｋｋａｒ，Ｉｎｃ.、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７)。ヒトモノクローナル抗体の 産生技術に関しては、Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.、１４７（１） ８６：〜９５（１９９１）および国際特許公開第ＷＯ９１／１７７６９号（１９ ９１年１１月２８日公開）もまた参照。ハイブリドーマ細胞が生育する培養培地 は、目的の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好 ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特 異性は、免疫沈降によって、あるいは放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結 合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって測定 される。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏ ｌｌａｎｄのスキャッチャード分析（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２ ０(１９８０)）によって測定することができる。所望の特異性、親和性および／ または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後に、クローンを 限界稀釈法によってサブクローニングを行い、標準的な方法によって生育させる ことができる。Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９頁〜１０４頁(Ａｃａ ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６)。この目的に適切な培養培地には、例えば 、ダルベッコ改変イーグル培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さら に、ハイブリドーマ細胞は、動物の体内において腹水腫瘍としてインビボで生育 させることができる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、 培養培地、腹水または血清から、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロ キシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティ クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって適切に分離さ れる。 あるいは、免疫化したときに、内因性の免疫グロブリンを産生することなく、 完全なレパートリーのヒト抗体を産生し得るトランスジェニック動物（例えば、 マウス）の作製が現在可能である。例えば、キメラな生殖系列の変異マウスにお ける抗体の重鎖連結領域（Ｊ_H）遺伝子のホモ接合型欠失によって、内因性の抗 体産生が完全に阻害されることが記載されている。ヒトの生殖系列の免疫グロブ リン遺伝子列をそのような生殖系列の変異マウスに移すことによって、ヒト抗体 が、抗原を投与したときに産生する。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１〜２５５（１９９３ ）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５〜２５８（１９９ ３）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．Ｍ．ら（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ １ ４：８４５〜８５１；およびＭｅｎｄｅｚ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９７）Ｎａｔ．Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６〜１５６を参照。 さらなる実施態様において、抗体または抗体フラグメントは、ＭｃＣａｆｆｅ ｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５２２〜５５４（１９９０）に記載される技 術を使用して作製された抗体ファージライブラリーから、目的の抗原を使用して 、適切な抗体または抗体フラグメントに関する選択を行うことによって分離する ことができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（ １９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.、２２２：５８１〜５ ９７（１９９１）は、それぞれ、ファージライブラリーを使用するマウス抗体お よびヒト抗体の分離を記載する。その後の刊行物は、非常に大きなファージライ ブラリーを構築するための方法として、鎖シャッフリング(Ｍａｒｋら、Ｂｉｏ ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９〜７８３(１９９２))、ならびにコンビナトリ アル感染およびインビボ組換えによる高い親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の産生 を記載する(Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅｓら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１： ２２６５〜２２６６(１９９３)；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．ら（１９９４） ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３２４５〜３２６０；およびＶａｕｇｈａｎら（１９９６ ）上記)。従って、これらの技術は、本発明により含まれる「モノクローナル」 抗体（特に、ヒト抗体）の分離に関する、従来のモノクローナル抗体ハイブリド ーマ技術の実行可能な代替法である。 本発明の抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して(例えば、ネズミ 抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオ チドプローブを使用することによって)容易に分離され、そして配列決定される 。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として有 用 である。ＤＮＡが一旦分離されると、そのＤＮＡは、発現ベクター内に配置する ことができ、次いで、サルCＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ） 細胞、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ 細胞などの宿主細胞にトランスフェクションされ、組換え宿主細胞においてモノ クローナル抗体の合成物が得られる。ＤＮＡはまた、例えば、相同的なマウス配 列の代わりに、ヒトの重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列に置換するこ とによって改変することができる。Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１(１９８４)。そのようにして、本明細書中の抗 抗原モノクローナル抗体の結合特異性を有する“キメラ”抗体が調製される。 非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野では十分に知られている。 一般に、ヒト化抗体は、ヒトでない供給源からヒト化抗体に導入された１つまた は複数のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、本質的には、ｗｉｎｔｅｒおよび共 同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５(１ ９８６)；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２７(１９ ８８)；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４〜１５３６( １９８８)）に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応配列 に置換することによって行うことができる。従って、そのような「ヒト化」抗体 は、キメラな抗体であり(Ｃａｂｉｌｌｙ、上記)、実質的には完全とまではいか ないヒトの可変ドメインが、ヒトでない種に由来する対応の配列によって置換さ れている。実際、典型的には、ヒト化抗体は、いくつかのＣＤＲ残基、および、 おそらくいくつかのＦＲ残基が、齧歯類の抗体の類似する部位に由来する残基に よって置換されているヒト抗体である。抗体は、抗原に対する高い親和性および 他の有利な生物学的特性を保持してヒト化されることが重要である。このような 目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体が、元の配列および ヒト化配列の三次元モデルを使用して、元の配列および様々な考えられるヒト化 配列を解析することによって調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは、当 業者には熟知されている。選択された候補の免疫グロブリン配列の可能性のある 三次元の立体配置構造を図示して表示するコンピュータープログラムを入手する ことができる。このような表示を検討することによって、候補の免疫グロ ブリン配列の機能発現における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補の免疫 グロブリンのその抗原に対する結合能に影響する残基の分析が可能になる。この ように、ＦＲ残基は、コンセンサス配列および持ち込み配列からの選択および組 合せを行うことができ、その結果、標的抗原に対する増大した親和性などの所望 の抗体特性が達成される。さらなる詳細については、国際特許公開第ＷＯ９２／ ２２６５３号（１９９２年１２月２３日公開）を参照。 （ｉｉ）免疫付着因子調製 免疫グロブリン(Ｉｇ)、およびその変異体が知られており、その多くが、組換 え細胞培養によって調製されている。例えば、米国特許第４，７４５，０５５号 ；欧州特許第２５６，６５４号；Ｆａｕｌｋｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２９８： ２８６ (１９８２)；欧州特許第１２０，６９４号:欧州特許第１２５，０２３ 号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． １２３：７９３ (１９７９)； Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：２１９７ (１９８０)；Ｒａｓｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４１：２０ ７３ (１９８１)；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， Ａｎｎ． Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．２：２３９ (１９８４)；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１ ２０２ (１９８５)；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１ (１９８４)；欧州特許第２５５，６９ ４号；欧州特許第２６６，６６３号；および国際特許公開第８８／０３５５９号 を参照。再編成された免疫グロブリン鎖も知られている。例えば、米国特許第４ ，４４４，８７８号:国際特許公開第８８／０３５６５号；および欧州特許第６ ８，７６３号、ならびに、それらで引用されている参考文献を参照。 付着因子結合ドメインの配列を、適当な免疫グロブリン定常ドメイン位配列に 連結させて構築したキメラ（免疫付着因子）が当技術分野において知られている 。文献で報告されている免疫付着因子には、Ｔ細胞レセプターとの融合タンパク 質(Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：２９３６−２９４０ (１９８７))；ＣＤ４との融合タンパク質 (Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５−５３１ (１９８９)；Ｔｒａ ｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：６８−７０(１９８９)；Ｚｅｔｔｍ ｅｉｓｓｌら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ ９：３４７−３５３ ( １９９０)；およびＢｙｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６６７−６７０ (１９９ ０))；Ｌ−セレクチン（ホーミングレセプター）との融合タンパク質（Ｗａｔｓ ｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１−２２２９ (１９９０)； およびＷａｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：１６４−１６７ (１９９１)) ；ＣＤ４４との融合タンパク質（Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ ６１：１３０３− １３１３ (１９９０))；ＣＤ２８とＢ７との融合タンパク質(Ｌｉｎｓｌｅｙら 、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０ (１９９１))；ＣＴＬＡ −４との融合タンパク質（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７４ ：５６１−５６９ (１９９１))；ＣＤ２２との融合タンパク質(Ｓｔａｍｅｎｋ ｏｖｉｃら、Ｃｅｌｌ ６６：１１３３−１１４４(１９９１))；ＴＮＦレセプ ターとの融合タンパク質(Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ ｃａｄ． Ｓｃｌ． ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９ (１９９１)；Ｌ ｅｓｓｌａｕｅｒら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７：２８８３− ２８８６ (１９９１)；およびＰｅｐｐｌｅら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １ ７４：１４８３−１４８９ (１９９１))；およびＩｇＥレセプターαとの融合 タンパク質（ＲｉｄｇｗａｙとＧｏｒｍａｎ、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． Ｖ ｏｌ． １１５， Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．１４４８ (１９９１)）などがあ る。 もっとも単純で、もっとも素直な免疫付着因子設計は、付着因子の結合ドメイ ン（例えば、レセプターの細胞外ドメイン(ＥＣＤ)）を、免疫グロブリン重鎖の ヒンジ領域とＦｃ領域に結合させるものである。通常、本発明の免疫付着因子を 調製するときには、付着因子の結合ドメインをコードする核酸を、免疫グロブリ ンの定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸のＣ末端に融合させるが、Ｎ末 端の融合も可能である。 典型的には、このような融合配列において、コードされるキメラポリペプチド は、少なくとも機能的に活性なヒンジ、免疫グロブリン重鎖の定常領域のＣ_H２ およびＣ_H３ドメインを保持している。定常ドメインのＦｃ部のＣ末端側で融合 させたり、重鎖のＣ_H１のすぐＮ末端側、または軽鎖の対応領域で融合させたり する。正確にどの位置で融合させるかは重要ではないが、特定の部位がよく知ら れていて、生物学的活性、分泌、またはＩａの結合特性を最適なものにするよう に選択することができる。 好ましい実施態様において、免疫グロブリンＧ₁（ＩｇＧ₁）のＦｃドメインの Ｎ末端に付着因子の配列を融合させる。重鎖の定常領域全体を付着因子の配列に 融合させることも可能である。しかし、より好ましくは、化学的にＩｇＧ Ｆｃ を画定するパパイン切断部位（すなわち、重鎖の定常領域の最初の残基を１１４ とすると残基２１６にあたる）のすぐ上流にあるヒンジ領域から始まる配列、ま たは、他の免疫グロブリンの同様の部位を融合に用いる。特に好ましい実施態様 においては、付着因子のアミノ酸配列を、ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、またはＩｇＧ₃の 重鎖の（ａ）ヒンジ領域、およびＣ_H２とＣ_H３からなる領域に、または、（ｂ） Ｃ_H１、ヒンジ、Ｃ_H２、およびＣ_H３ドメインに融合させる。融合させる正確な 部位は重要ではなく、最適な部位を通常の実験によって決定することができる。 二重特異性免疫付着因子では、免疫付着因子はマルチマーとして集合し、ヘテ ロダイマーまたはヘテロ四量体として集合する。一般的には、これらの分子集合 した免疫グロブリンは、既知のユニット構造をもっているはずである。基本的な ４本鎖の構造単位は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＥに見られる構造である。高 分子量の免疫グロブリンでは、４本鎖の構造単位が繰り返される。すなわち、Ｉ ｇＭは、一般的に、４本鎖の基本ユニットをジスルフィド結合によって結合させ た五量体として存在する。ＩｇＡグロブリンと、場合によってはＩｇＧグロブリ ンも、血清中ではマルチマーの形で存在することがある。マルチマーの場合、４ 本鎖ユニットは同じものであることもあれば、異なることもある。 本明細書の範囲に含まれる集合免疫付着因子のさまざまな例を以下に概略的に 示す： （a）AC_L-AC_L； （b）AC_H-[AC_H,AC_L-AC_H,AC_L-V_HC_H,またはV_LC_L-AC_H]； （c）AC_L-AC_H-[AC_L-AC_H,AC_L-V_HC_H,V_LC_L-AC_H,またはV_LC_L-V_HC_H]； （d）AC_L-V_HC_H-[AC_H,またはAC_L-V_HC_H,またはV_LC_L-AC_H］； （e）V_LC_L-AC_H-[AC_L-V_HC_H,またはV_LC_L-AC_H]；および （f）[A-Y]_n-[V_LC_L-V_HC_H]₂； ここで、Ａは、それぞれ、同一か異なった付着因子のアミノ酸配列を表しており 、 Ｖ_Lは、免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインであり； Ｖ_Hは、免疫グロブリン重鎖の可変ドメインであり； Ｃ_Lは、免疫グロブリン軽鎖の定常ドメインであり； Ｃ_Hは、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインであり； ｎは、１よりも大きい整数であり； Ｙは、共有結合的な架橋剤の残基を示している。 簡潔を期するために、上記の構造は、主要な特徴を示しているにすぎず、結合 ドメイン（Ｊ）や、免疫グロブリンのその他のドメインは示されていない。さら に、ジスルフィド結合も示されていない。しかし、このようなドメインが結合活 性にとって必要である場合には、それらが、免疫グロブリン分子の中で占める通 常の位置に提示されるよう構成されるべきである。 または、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンを得るために、免疫グロブリンの重 鎖と軽鎖の配列の間に付着因子の配列を挿入することも可能である。この実施態 様では、免疫グロブリンの各アームにおける、免疫グロブリン重鎖のヒンジとＣ_H ２ドメインの間か、またはＣ_H２とＣ_H３ドメインの間の３’末端に付着因子の 配列を融合させる。同様の構築物が、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍ ｕｎｏｌ．２８：１０２７−１０３７（１９９１）によって報告されている。 免疫グロブリンの軽鎖が、付着因子−免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに 共有的に結合しているか、または、付着因子に直接融合するかして存在すること もあろう。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、典型的には 、付着因子−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡとともに発 現する。分泌されるときに、ハイブリッドの重鎖と軽鎖が共有的結合して、二つ のジスルフィド結合で結ばれた免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を含む免疫グロブリ ン様構造物が提供される。このような構造物を調製するのに適した方法は、例え ば、１９８９年３月２８日公開の米国特許第４，８１６，５６７号に開示されて いる。 好ましい実施態様において、本発明の免疫付着因子の構築に用いる免疫グロブ リンの配列は、ＩｇＧ免疫グロブリン重鎖の定常ドメインに由来する。ヒトの免 疫付着因子については、ヒトＩｇＧ₁およびＩｇＧ₃免疫グロブリンの配列が好ま しい。ＩｇＧ₁を使用することの主な利点は、固定したプロテインＡ上で、Ｉｇ Ｇ₁免疫付着因子を効率的に精製できることにある。これに対して、ＩｇＧ₃の精 製には、これよりもかなり使い勝手の悪い媒体であるプロテインＧが必要となる 。しかし、特定の免疫付着因子構築物のＩｇの融合相手を選ぶときには、免疫グ ロブリンのこの他の構造的性質および機能的性質も考慮すべきである。例えば、 ＩｇＧ₃のヒンジは、より長く、柔軟性もより高いため、ＩｇＧ₁に融合させると 折り畳まれずに正しく機能することができないような大きな”付着因子”ドメイ ンを受け入れることができる。もう一つ考慮すべきなのは、結合価である。Ｉｇ Ｇ免疫付着因子は２価性のホモダイマーであるが、ＩｇＡおよびＩｇＭなどのＩ ｇサブタイプは、それぞれ、基本的なＩｇホモダイマーユニットからなるダイマ ーと五量体を生じよう。インビボでの実用に供するために設計された免疫付着因 子では、Ｆｃ領域によって特定される薬理動態的性質およびエフェクター機能も 重要である。ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂およびＩｇＧ₄はすべて、インビボでの半減期が ２１日で、補体系を活性化する相対的能力はそれぞれ異なる。ＩｇＧ₄は、補体 を活性化せず、ＩｇＧ₂は、ＩｇＧ₁よりもかなり弱くしか補体活性を活性化しな い。さらに、ＩｇＧ₁とは異なって、ＩｇＧ₂は、単核球または好中球上のＦｃレ セプターには結合しない。補体の活性化に関しては、ＩｇＧ₃が最適であるが、 インビボでの半減期が、他のＩｇＧアイソタイプの約３分の１である。ヒトの治 療薬として使用するために、免疫付着因子を設計するときに考慮すべき他の重要 な点は、特定のアイソタイプがもつアロタイプ変異体の数である。一般的には、 血清学的に区別されるアロタイプの数が少ないＩｇＧのアイソタイプほど好まし い。例えば、ＩｇＧ₁は、血清学的に区別されるアロタイプ部位を４つしかもっ ておらず、これらのうち２つは（Ｇ１ｍと２）はＦｃ領域に位置しているが、こ のうちの１つの部位であるＧ１ｍ１は、免疫原性がない。これに対して、ＩｇＧ₃ には１２の血清学的に区別されるアロタイプがあり、それらのすべてがＦｃ領 域中にあって、その内の３つの部位（Ｇ３ｍ５、１１および２１）だけが免疫原 性の ない一つのアロタイプをもっている。したがって、γ１免疫付着因子よりも、γ ３免疫付着因子の方が免疫原としての可能性が高い。 付着因子部分をフレームにコードするｃＤＮＡ配列を、ＩｇのｃＤＮＡ配列に フレームを合わせて融合させることによって、もっとも好都合に免疫付着因子が 構築される。しかし、ゲノムのＩｇフラグメントに融合させることもできる（例 えば、Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、上記；Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ ６１：１３０ ３−１３１３(１９９０)；およびＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｃｅｌｌ ６６： １１３３−１１４４(１９９１)）参照)。後者のタイプの融合には、発現のため のＩｇ調節配列が存在することが必要である。ＩｇＧの重鎖定常領域をコードす るｃＤＮＡは、脾臓または末梢血のリンパ球由来のｃＤＮＡライブラリーからの 公開された配列をもとに、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）技術によって分離することができる。免疫付着因子の”付着因子”と Ｉｇ部分をコードするｃＤＮＡを、選んだ宿主細胞の中で効率的に発現させるた めのプラスミドベクターの中にひとつながりになるように挿入する。 ２．隆起および／または空洞の作出 隆起および／または空洞を形成するもととなる残基を選択するための最初の工 程として、Ｘ線結晶解析やＮＭＲなど、当技術分野において既知の技術を用いて 、ヘテロマルチマーの三次元構造を得る。三次元構造に基づいて、当業者は、接 触面の残基を同定することができる。 好ましい接触面は、免疫グロブリン定常ドメインのＣ_H３ドメインである。各 種のＩｇＧサブタイプの接触面残基と”埋もれた”残基が同定されていたため、 ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣ_H３ドメインの接触面の残 基が同定されており(例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１５９８を参照、その全文 が、参照してここに組み込まれる)、それらを含むことは、取り入れる残基と置 換するのに最適である。Ｃ_H３接触面を改変するための基礎となるのは、Ｘ線結 品解析によって、ヒトＩｇＧ₁重鎖の間に生じるＦｃ領域での分子間結合が、Ｃ_H ３ドメイン間では広範なタンパク質／タンパク質間相互作用を含むのに対して、 グリコシル化されたＣ_H２ドメインでは、その炭水化物を介して結合するという ことが示されたことである。(Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０ ：２３６１−２３７０(１９８１))。さらに、重鎖が切断されて、Ｃ_H２およびＣ_H ３ドメインが除去されないかぎり、哺乳動物細胞における抗体発現の際に効率 的に形成される二つの重鎖間ジスルフィド結合が存在する(Ｋｉｎｇら、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ．Ｊ．２８１：３１７(１９９２))。したがって、重鎖の集合は、ジス ルフィド結合を促進すると考えられ、その逆ではないと考えられる。これらの構 造および機能に関するデータをまとめて考えると、抗体の重鎖の結合はＣ_H３部 位によってもたらされるという仮説に至る。さらに、Ｃ_H３ドメイン間の接触面 を改変して、異なった重鎖のヘテロマルチマーの形成を促進して、対応するホモ マルチマーの集合を阻害することができるかもしれないという推測がなされた。 本明細書で説明する実験によって、この方法を用いれば、ホモマルチマーよりも ヘテロマルチマーの形成を促進することが可能なことが示された。したがって、 目的のポリペプチドと抗体のＣ_H３部位とを含むポリペプチド融合体を作出して 、第一または第二のポリペプチドを形成させることができる。好ましいＣ_H３ド メインは、ヒトＩｇＧ₁のようなＩｇＧ抗体に由来するものである。 隆起または空洞を形成するための候補となりうる接触面残基が同定されている 。”埋もれた”残基を選んで置き換えることが好ましい。ある残基が埋込まれて いるか否かを判定するために、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：３７９ −４００（１９７１）の表面接触プログラムを用いて、接触面にある残基と溶媒 との接触可能性（ＳＡ）を計算することができる。そして、第一と第二のポリペ プチドのそれぞれの残基について、他のポリペプチドを除いた上で、ＳＡを別々 に計算することができる。そして、ＳＡ（ダイマー）−ＳＡ（モノマー）という 等式を用いて、接触面のモノマー型とダイマー型の間の各残基のＳＡの差異を計 算することができる。これによって、ダイマーを形成するときにＳＡが減少する 残基のリストが示される。ダイマーの各残基のＳＡを、同じアミノ酸のトリペプ チドＧｌｙ−Ｘ−ＧｌｙのＳＡの理論値と比較する。ただし、Ｘ＝目的のアミノ 酸（Ｒｏｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８３４−８３８(１９８５))。（ａ ）モノマーに較べてダイマーでＳＡ減少した残基、および（ｂ）ＳＡが、対応す るトリペプチドにおけるＳＡの２６％よりも少ない残基を接触面残基と考え る。２つの分類を明らかにすることができる。すなわち、対応するトリペプチド に較べて１０％よりも低いＳＡをもつ残基(すなわち、”埋もれた”残基)、およ び、対応するトリペプチドに較べて１０％よりも高く２５％よりは低いＳＡをも つ残基（すなわち、”一部埋もれた”残基）である（下記の表１参照） †残基番号は、IgG結品構造にある通り（Deisenhofer,Biochemistry 20:2361- 2370(1981)） ポリペプチド鎖構造に対する残基置換の効果は、Ｉｎｓｉｇｈｔ^TMプログラム （Ｂｉｏｓｙｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの分子図形モデリングプログ ラムを用いて、調べることができろ。このプログラムを用いて、第一のポリペプ チドの接触面中に埋もれた残基で、側鎖容量の小さい残基を、例えば、より大き な側鎖容量をもつ残基（すなわち、隆起）に変えることができる。そして、第二 のポリペプチドの接触面中の残基で、隆起に隣接する残基を調べて、空洞を形成 するために適した残基を見つける。通常、この残基は側鎖容量が大きいので、側 鎖容量の小さな残基と置き換える。一定の実施態様において、接触面の三次元構 造を調べると、第一のポリペプチドの接触面上に適当な位置に置かれた、適当な 大きさの隆起、または第二のポリペプチドの接触面上の空洞が明らかになるはず である。これらの例では、単一突然変異体、すなわち、合成によって導入された 隆起または空洞をモデル化する必要があるだけである。 第一および第二のポリペプチドがそれぞれＣ_H３ドメインを含む場合に、置換 することのできる元の残基を選択することに関しては、ヒトＩｇＧ₁のＣ_H３／Ｃ_H ３の接触面は、各表面から１０９０Ų埋もれた４つの逆平行β鎖上にある各ド メイン上の１６の残基を含んでいる（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，上記、およびＭ ｉｌｌｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１６：９６５(１９９０)。突然変異は、 好ましくは、二つの中央の逆平行β鎖上にある残基を標的とする。この目的は、 作出した隆起が、相手方のＣ_H３ドメインの相補的な空洞の中に入らずに、周囲 の溶媒の中に突出して親和してしまう危険を最小限にするためである。 分子モデリングによって、好ましい元／取り込み残基が一旦同定されたら、当 技術分野において周知の技術を用いて、ポリペプチドの中にアミノ酸置換を導入 する。通常は、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、突然変異誘発：実用的方法 (Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ)、上記 、に記載されている技術を用いて遺伝子工学により改変する。 オリゴヌクレオチドによる突然変異誘発が、第一または第二のポリペプチドを コードするＤＮＡの置換変異体を調製するための好ましい方法である。この技術 は、Ａｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ，２：１８３（１９８３）によって説明されてい るように、当技術分野において周知の技術である。簡単に述べると、所望の変異 をコードしているオリゴヌクレオチドをＤＮＡ鋳型とハイブリダイズさせること によって、第一または第二のポリペプチドＤＮＡを改変する。この鋳型ＤＮＡは 、ヘテロマルチマーの未変更または天然のＤＮＡ配列を含む、一本鎖のプラスミ ドまたはバクテリオファージである。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメ ラ ーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを取り込み、かつ、ヘテロマルチ マーＤＮＡにおいて選択された変異をコードする、前記鋳型の第二の相補鎖の全 長を合成する。 Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１９８５）が述べるところにしたが って、目的とするＤＮＡ領域を、相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングさ せて作製した合成変異フラグメントで置換することによって、カセット突然変異 誘発を行なうことができる。ＰＣＲ突然変異も、第一または第二ポリペプチドＤ ＮＡの変異配列を作製するのに適している。以下の考察においてはＤＮＡを引用 しているが、この技術は、ＲＮＡでも応用することができると解される。ＰＣＲ 技術とは、一般的には、次の手順をさす（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５ ２：１６４３−１６５０(１９９１)、Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉが担当した章、ｐ．６ １−７０を参照)。 隆起または空洞の突然変異以外にも、本発明は、ヘテロマルチマーのＤＮＡの 中に適当なヌクレオチド変異を導入するか、または所望のヘテロマルチマーポリ ペプチドを合成することによって調製することのできるヘテロマルチマーのアミ ノ酸配列の変異配列を含む。このような変異配列には、例えば、ヘテロマルチマ ーを形成する第一および第二のポリペプチドのアミノ酸配列中の残基の欠失、挿 入、または置換が含まれる。最終的な構築物が望ましい抗原結合特性をもってい るとすれば、最終的な構築物ができるように、欠失、挿入および置換を組み合わ せる。グリコシル化部位の数と位置を変更したりして、アミノ酸を変えることに よっても、ヘテロマルチマーの翻訳後のプロセッシングを変えることができる。 突然変異を誘発するのに好ましい位置にある、ヘテロマルチマーポリペプチド の所定の残基または領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｇｈａｍと Ｗｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）によっ て述べられている“アラニンスキャニング突然変異誘発法”といわれるものであ る。ここで、標的残基の残基またはそのグルーブが同定され(例えば、Ａｒｇ、 Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ｌｙｓおよびＧｌｕなどの荷電性残基)、中性のアミノ酸また は負に荷電したアミノ酸（もっとも好ましくは、アラニンまたはポリアラニン） で置き換えて、アミノ酸と、細胞の内外の周囲の水性環境との相互作用に影響を 与える。そして、置換部位においてさらに、またはそれに代えて別の変異残基を 導入することによって、置換に対して機能的な感受性を示すドメインをさらに明 確にすることができる。このように、アミノ酸配列変異を導入するための部位が 予め決まっていても、突然変異の性質そのものを予め決める必要はない。 通常、突然変異には、ヘテロマルチマーの非機能的な領域における保存的なア ミノ酸置換が含まれる。突然変異の例を表２に示す。 ヘテロマルチマーのポリペプチドの共有修飾も、本発明の範囲に含まれる。ヘ テロマルチマーの共有修飾は、ヘテロマルチマー、またはそのフラグメントの標 的アミノ酸残基を、選ばれた側鎖またはＮ末端またはＣ末端の残基と反応するこ とのできる有機的誘導化剤と反応させて、分子の中に導入することができる。ヘ テロマルチマーポリペプチドの別のタイプの共有修飾で、本発明の範囲に含まれ るものには、ポリペプチドの本来のグリコシル化パターンを改変することが含ま れる。改変とは、もとのヘテロマルチマーの中に見られる炭水化物部分を一つ以 上欠失させるか、および／または、もとのヘテロマルチマーには存在しないグル コシル化部位を一つ以上付加することを意味する。ヘテロマルチマーポリペプチ ドへのグリコシル化部位の付加は、一つ以上のＮ結合型グリコシル化部位が含ま れるよう、アミノ酸配列を改変することによって適宜行われる。一つ以上のセリ ンまたはトレオニン残基を、もとのヘテロマルチマー配列に付加または置換する ことによって改変を行なうこともできる(Ｏ結合型グリコシル化部位)。簡単にす るために、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変更によって、特に、所望のアミノ酸 に翻訳されるコドンを作出するよう、ヘテロマルチマーポリペプチドをコードす るＤＮＡの予め決定された塩基において変異させることによって、ヘテロマルチ マーのアミノ酸配列を改変する。ヘテロマルチマーポリペプチド上の炭水化物部 分の数を増加させる別の方法は、化学結合または酵素結合によってグリコシドを ポリペプチドに結合させることである。これらの方法については、１９８７年９ 月１１日発行の国際特許公開第８７／０５３３０号、およびＡｐｌｉｎとＷｒｉ ｓｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｐｐ．２５９−３０６ （１９８１）に記載されている。ヘテロマルチマーに存在する炭水化物部分の削 除は、化学的または酵素的に行なうことができる。 ヘテロマルチマーの別のタイプの共有修飾には、ヘテロマルチマーポリペプチ ドを、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０ １，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号；および第４ ，１７９，３３７号において提示されている方法で、例えば、ポリエチレングリ コール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンなど、さまざ まな非タンパク質性ポリマーの一つに結合させることが含まれる。 変異ヘテロマルチマーの特性を前もって予測することは困難であるため、回収 された変異体をスクリーニングして、最適な変異体を選抜することが必要である と認められよう。 ３．共通の軽鎖をもつヘテロマルチマーの発現 ＤＮＡを突然変異させて、本明細書で開示されているような共通の軽鎖を選抜 した後、当技術分野において広く利用可能な組換え技術を用いて、この分子をコ ードするＤＮＡを発現させる。しばしば、優れた発現系は、ヘテロマルチマーを 適切にグルコシル化するための(例えば、グリコシル化されている抗体ドメイン を含むヘテロマルチマーの場合など)、哺乳動物細胞の発現ベクターと宿主とを 含んでいる。しかし、下で詳述するように、この分子は、原核生物の発現系で産 生させることもできる。通常、一つのベクター、または別々のベクター上に存在 する、第一ポリペプチド、第二ポリペプチド、共通の軽鎖ポリペプチド、および 、ヘテロマルチマーを形成するのに必要な別のポリペプチドのすべてコードする ＤＮＡによっての宿主細胞を形質転換する。しかし、第一ポリペプチド、第二ポ リペプチド、および共通の軽鎖ポリペプチド（ヘテロマルチマーの成分）を、別 々の発現系で発現させ、発現したポリペプチドをインビトロで結合させることも 可能である。 ヘテロマルチマーと共通の軽鎖をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲ ノムＤＮＡ）を、さらなるクローニング（ＤＮＡ増幅）または発現のために、複 製可能なベクターの中に挿入する。多くのベクターを利用することができる。一 般的に、ベクターの構成要素として、次のものを一つ以上含むが、これらに限定 はされない。すなわち、シグナル配列、複製開始点、一つ以上のマーカー遺伝子 、ェンハンサー因子、プロモーター、および転写終結配列。 ヘテロマルチマーの成分であるポリペプチドは、シグナル配列、または、それ 以外で、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位をもつ ポリペプチドに融合したポリペプチドとして作製することができる。一般的に、 シグナル配列は、ベクターの成分であるか、または、ベクターの中に挿入される ＤＮＡの一部であろう。好んで選ばれる異種由来のシグナル配列は、宿主細胞に よって認識され、プロセッシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによ って開裂される）配列である。原核生物の宿主細胞では、シグナル配列を、例え ば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテ ロトキシンＩＩの先導配列からなるグループから選択される、原核生物のシグナ ル配列で置き換えることができる。酵母での分泌を行なわせるためには、天然の シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼ、α因子の先導配列(サッカロマ イセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）とクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒ ｏｍｙｃｅｓ）α因子の先導配列、後者については、１９９１年４月２３日公開 の米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている)、または酸性ホスファタ ーゼの先導配列、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のグルコアミラー ゼの先導配列(１９９０年４月４日公開の欧州特許第３６２，１７９号)、または 、１９９０年１１月１５日発行の国際特許公開第９０／１３６４６号に記載され ているシグナルなどによって置換することができる。呻乳動物細胞で発現させる ときには、本来のシグナル配列(例えば、抗体または付着因子のプレ配列で、通 常、インビボで、これらの分子をヒト細胞から分泌させる配列)で十分であるが 、呻乳動物の別のシグナル配列も適しているし、また、例えば、単純ヘルペスの ｇＤシグナルのような、ウイルスの分泌リーダーも適当であろう。このような前 駆体領域に対するＤＮＡを、読み枠において、ヘテロマルチマーを形成するポリ ペプチドをコードするＤＮＡと連結させる。 発現ベクターもクローニングベクターも、一つ以上の選ばれた宿主細胞の中で ベクターの複製が可能になる塩基配列を含んでいる。一般的に、クローニングベ クターにおいては、この配列は、宿主の染色体ＤＮＡとは独立に、ベクターが複 製できるようにする配列であり、複製開始点または自律複製配列を含む配列であ る。このような配列は、さまざまな細菌、酵母、およびウイルスでよく知られて いる。プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始点は、ほとんどのグラム陰性菌に適合 し、２μプラスミドの開始点は酵母に適合し、また、さまざまなウイルスの開始 点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は、哺乳 動物細胞でのクローニングベクターに有用である。一般的に、複製開始点という 構成因子は、哺乳動物の発現ベクターには不要である(ＳＶ４０の複製開始点は 、 初期プロモーターを含んでいるというだけの理山で一般的には用いられている) 。 発現ベクターとクローニングベクターは、選抜可能マーカーとも言われる選抜 用遺伝子を持っていなければならない。典型的な選抜用遺伝子は、（ａ）例えば 、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンなど の抗生物質またはその他の毒素に対する抵抗性を付与するタンパク、（ｂ）栄養 要求性欠損を補うタンパク、または（ｃ）例えば、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｉ ）のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のように、複合培地からは摂取 できない重要な栄養分を供給するタンパクをコードする。選抜計画の一例では、 宿主細胞の増殖を停止させるための薬剤を利用する。異種由来の遺伝子によって 形質転換するのに成功した細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を産生し、そ れによって、選抜試験を生き残る。このような優性選抜の例では、ネオマイシン (Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７(１ ９８２))、マイコフェノール酸(Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９ ：１４２２(１９８０))、またはハイグロマイシン(Ｓｕｇｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃ ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３(１９８５)）という薬剤が用いられる。 上記の３つの例は、それぞれ、Ｇ４１８もしくはネオマイシン(ゲネチシン(ｇｅ ｎｅｔｉｃｉｎ))、Ｘｇｐｔ(マイコフェノール酸)、またはハイグロマイシンと いう、適当な薬剤に対する抵抗性を持ち込むために、真核生物の遺伝子の調節下 に置かれた細菌遺伝子が用いられている。 哺乳動物細胞にとって適当な選抜マーカーのもう一つの例は、ＤＨＦＲ、また はチミジンキナーゼのように、ヘテロマルチマーの核酸を取り込む細胞成分の同 定を可能にする選抜マーカーである。マーカーを取り込んだために、形質転換体 だけが、唯一、適応して生き残れるという選択圧の下に、哺乳動物細胞の形質転 換体を置く。培地の中の選抜用薬剤の濃度を連続的に変化させ、それによって選 抜用遺伝子とヘテロマルチマーをコードするＤＮＡの両方の増幅がもたらされる ような条件の下で形質転換体を培養することによって選択圧をかける。増幅され たＤＮＡからは大量のヘテロマルチマーが合成される。この他に増幅可能な遺伝 子の例には、メタロチオネイン−Ｉおよび−２、好ましくは、霊長類のメタロチ オネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど がある。 例えば、まず、ＤＨＦＲの競合的な拮抗剤であるメトトレキセート（Ｍｔｘ） を含む培養培地の中で、全部の形質転換細胞を培養して、ＤＨＦＲ選抜用遺伝子 によって形質転換された細胞を同定する。野生型のＤＨＦＲを用いるときに、適 当な宿主細胞は、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０）による説明にしたがって、調製 および増殖させたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系のＤＨＦＲ活性 欠損株である。次に、形質転換された細胞を、濃度を上げたメトトレキセートに 曝す。これによって、ＤＨＦＲ遺伝子のコピーが多数合成されるようになり、同 時に、ヘテロマルチマーの成分をコードするＤＮＡなど、発現ベクターを含むそ の他の遺伝子のコピーも多数合成されるようになる。この増幅技術は、例えば、 ＡＴＣＣ ＣＣＬ６２、ＣＨＯ−Ｋ１などの適当な宿主とともに用いることがで き、Ｍｔｘに高い耐性をもつ変異ＤＨＦＲ遺伝子を用いるならば、内生的なＤＨ ＦＲがあったとしても構わない(欧州特許第１１７，０６０号)。 または、ヘテロマルチマー、野生型ＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコ シド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの選抜マーカーをコードす るＤＮＡ配列によって形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に、内生 ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、または Ｇ４１８などのアミノグリコシド系抗生物質選抜マーカーに対する選抜用薬剤を 含む培地の中で細胞を増殖させることによって選抜することができる。米国特許 第４，９６５，１９９号参照。 酵母の中で用いるための適当な選抜用遺伝子は、酵母のプラスミドＹＲｐ７の 中にあるｔｒｐ１遺伝子である。（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ ２ ８２：３９(１９７９)；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ ７：１４１(１９７９) ；または、Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ １０：１５７(１９８０))。ｔｒ ｐ１遺伝子は、トリプトファンの中では増殖できない酵母の変異株、例えば、Ａ ＴＣＣ ４４０７６、またはＰＥＰ４−１に対する選抜マーカーを提供する(Ｊ ｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５：１２(１９７７))。酵母宿主ゲノムにｔｒ ｐ１障害があることによって、トリプトファンなしで増殖させることによって、 形質転換体を検出するための効果的な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ−２欠 損酵母株（ＡＴＣＣ ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を もつ既知のプラスミドによって相補される。 さらに、クルイベロマイセス属の酵母を形質転換するためには、１．６μｍ環 状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターを用いることができる。Ｂｉａｎｃｈｉら 、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ １２：１８５(１９８７)。さらに最近、組換えウシキ モシンの大量生産のための発現系が報告された。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ、Ｂ ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５(１９９０)。クルイベロマイセス属の 工業用菌株により成熟組換えヒト血清アルブミンを分泌させるための、安定した マルチコピー発現ベクターも開示されている(Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ ９：９６８−９７５(１９９１))。 発現ベクターとクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、 ヘテロマルチマーの核酸に機能的に結合しているプロモーターを含む。宿主に可 能性のある、さまざまな細胞によって認識されるプロモーターが多数ある。制限 酵素消化によって、もととなるＤＮＡからプロモーターを除去し、分離したプロ モーターをベクターに挿入にして、これらのプロモーターは、ヘテロマルチマー をコードするＤＮＡに機能的に連結する。 原核生物宿主で使用するのに適したプロモーターには、β−ラクタマーゼおよ びラクトースのプロモーター系(Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５( １９７８)；およびＧｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４(１９７９ ))、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系(Ｇｏ ｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.，８：４０５７(１９８０ )、および欧州特許第３６，７７６号)、および、ｔａｃプロモーターなどのハイ ブリッドプロモーター（ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５(１９８３)）が含まれる。しかし、細菌のこれ以 外の既知のプロモーターが適当である。それらの塩基配列は公開されているので 、当業者は、必要な制限酵素部位をもたらすためのリンカーまたはアダプターを 用いて、ヘテロマルチマーをコードするＤＮＡに機能的にプロモーターを連結さ せることができる(Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ ２０ ：２６９(１９８０))。また、細菌の系で使用するためのプロモーターは、ヘテ ロマルチマーをコードするＤＮＡに機能的に連結したシャイン−ダルガーノ（Ｓ ．Ｄ.）配列も含んでいる。 プロモーターの配列は、真核生物で知られている。実質的にすべての真核生物 遺伝子が、転写開始部位から約２５から３０塩基上流にあるＡＴに富む領域を持 っている。多くの遺伝子の転写開始点から上流７０から８０塩基のところに見つ かっている別の配列とはＣＸＣＡＡＴ領域である、ただし、Ｘを任意のヌクレオ チドである。殆どの真核生物遺伝子の３’末端には、コーディング配列の３’末 端にポリＡテールを付加するためのシグナルらしいＡＡＴＡＡＡ配列がある。こ れらの配列はすべて、真核生物の発現ベクターの中に適当に挿入する。 酵母宿主とともに使用するのに適したプロモーター配列の例には、３−ホスホ グリセリン酸キナーゼのプロモーター(Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ ｈｅｍ．２５５：２０７３(１９８０))、または、エノラーゼ、グリセルアルデ ヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシ ラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３− ホスホグリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ 、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなど、その他の解糖酵 素のプロモーター（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ．Ｒｅｇ．７：１４ ９(１９６８)；および、Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：４ ９００(１９７８)）が含まれる。 この他の酵母プロモーターで、増殖条件によって転写を調節するという、さら に別の利点をもつ誘導的プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソ シトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関係する分解酵素、メタロチオ ネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、および、マルトー スおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母での 発現に用いるのに適したベクターとプロモーターについては、Ｈｉｔｚｅｍａｎ ら、欧州特許第７３，６５７Ａ号でさらに説明されている。また、酵母のエンハ ンサーも、酵母プロモーターとともに適宜用いられる。 哺乳動物の宿主細胞での、ベクターからのヘテロマルチマーの転写は、例えば 、 ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス(１９８９年７月５日発行の英国特許第２， ２１１，５０４号)、アデノウイルス(アデノウイルス２など)、ウシパピローマ ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝 炎ウイルス、および、もっとも好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）な どのウイルスのゲノムから得られたプロモーター、例えば、アクチンプロモータ ーまたは免疫グロブリンプロモーターなど、異種由来の哺乳動物のプロモーター 、または、ヒートショックプロモーターによって調節される。 ＳＶ４０ウイルスの前者および後者のプロモーターは、都合のよいことに、Ｓ Ｖ４０ウイルスの複製開始点も含むＳＶ４０制限酵素フラグメントとして得られ る。Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３(１９７８)；Ｍｕｌｌｉｇａ ｎとＢｅｒｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２−１４２７（１９８０）；Ｐ ａｖｌａｋｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：７ ３９８−７４０２(１９８１)。ヒトサイトメガロウイルス最早期プロモーターは 、都合よく、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限酵素フラグメントとして得られる。Ｇｒｅ ｅｎａｗａｙら、Ｇｅｎｅ １８：３５５−３６０(１９８２)。ウシパピローマ ウイルスをベクターとして用いた、哺乳動物の宿主の中でＤＮＡを発現させるた めの系が米国特許第４，４１９，４４６号に記載されている。この系を改変した ものが、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。また、免疫インタ ーフェロンをコードするｃＤＮＡのサル細胞での発現については、Ｇｒａｙら、 Ｎａｔｕｒｅ ２９５：５０３−５０８(１９８２)；単純ヘルペスウイルス由来 のチミジンキナーゼプロモーターの調節下での、ヒトβ−インターフェロンｃＤ ＮＡのマウス細胞における発現については、Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２９ ７：５９８−６０１(１９８２)；ヒトインターフェロンβ１遺伝子の培養マウス 細胞とウサギ細胞における発現についてはＣａｎａａｎｉとＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５１６６−５１７０(１９８２) ；および、マウス肉腫ウイルスのＬＴＲ（長い末端反復配列）をプロモーターと して用いた、ＣＶ−１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズハム スター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞における、細 菌のＣＡＴ配列の発現についてはＧｏ ｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６７７７ −６７８１（１９８２）も参照。 高等真核生物による、ヘテロマルチマー成分をコードするＤＮＡの転写は、ベ クターの中にエンハンサー配列を挿入することによって亢進することがよくある 。エンハンサーは、方向や位置に比較的無関係であり、転写単位に対して５’側 （Ｌａｉｍｉｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８： ９９３(１９８１))、３’側（Ｌｕｓｋｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．３： １１０８(１９８３)）イントロンの内部(Ｂａｎｅｒｊｉら、Ｃｅｌｌ ３３： ７２９(１９８３))、および、コーディング配列そのものの中（Ｏｓｂｏｒｎｅ ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．４：１２９３(１９８４)）にも見つかっている 。今では、哺乳動物の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェ トプロテイン、およびインシュリン）由来の多くのエンハンサー配列が知られて いる。しかし、典型的には、真核生物細胞のウイルスに由来するエンハンサーが 使用される。例としては、複製開始点の後方側（１００−２７０ｂｐ）にあるＳ Ｖ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターのエンハンサー、 複製開始点の後方側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエン ハンサーなどがある。また、真核生物のプロモーターを活性化するための促進因 子については（Ｙａｎｉｖら、Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７−１８（１９８２） を参照。エンハンサーは、ベクターの中のヘテロマルチマーをコードする配列の ５’側か３’側の位置に挿入することができるが、好ましくは、プロモーターの ５’側の部位に存在する。 真核宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト、またはその他の多細胞 生物からの有核細胞）で用いられる発現ベクターは、転写の終結、およびｍＲＮ Ａの安定化に必要な配列も含んでいる。このような配列は、真核生物またはウイ ルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’側、場合によっては３’側にある非翻訳領域 から広く利用することができる。これらの領域には、ヘテロマルチマーをコード するｍＲＮＡの非翻訳部位のポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌク レオチド分節が含まれる。 上記で挙げた構成要素を一つ以上含む適当なベクターを構築するには、標準的 なライゲーション技術を用いる。分離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメント は、必要とするプラスミドを作出するのに望ましい形になるように、開裂し、加 工してから再連結する。 構築したプラスミドの配列が正しいことを確認するための解析を行なうために 、ライゲーション混合液を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４（ＡＴＣＣ ３１， ４４６）を形質転換して、アンピシリン耐性またはテトラサイクリン耐性によっ て選抜された、形質転換に成功した株が適正なものである。形質転換からプラス ミドを調製して、制限酵素消化によって解析し、および／または、Ｍｅｓｓｉｎ ｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.，９：３０９（１９８１）の方法 、またはＭａｘａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５： ４９９（１９８０）の方法によって配列決定を行なう。 本発明の実施において特に有用なのは、ヘテロマルチマーをコードするＤＮＡ を哺乳動物細胞の中で一過性発現をもたらす発現ベクターである。一般的には、 一過性発現には、宿主細胞が多くの発現ベクターのコピーをもち、次いで、発現 ベクターによってコードされる所望のポリペプチドを大量に合成するように、宿 主細胞の中で効率的に複製することのできる発現ベクターを使用することが含ま れる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、ｐｐ．１６．１７−１６．２２。適当な発現 ベクターと宿主細胞を含む一過的発現系によって、クローニングされたＤＮＡに よってコードされているポリペプチドを便利に陽性のものを同定することと、所 望の結合特性／親和性、または、本発明によって作出される、非天然のジスルフ ィド結合をもたないヘテロマルチマーまたホモマルチマーに対して、所期のゲル 泳動度をもつヘテロマルチマーを迅速にスクリーニングすることが可能になる。 脊椎動物の組換え細胞培養でヘテロマルチマーを合成するように調整するのに 適した、この他の方法、ベクター、および宿主細胞については、Ｇｅｔｈｉｎｇ ら、Ｎａｔｕｒｅ ２９３：６２０−６２５(１９８１)；Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａ ｔｕｒｅ ２８１：４０−４６(１９７９)；欧州特許第１１７，０６０号；およ び欧州特許第１１７，０５８号に記載されている。哺乳動物の培養細胞でヘテロ マルチマーを発現させるのに特に役立つプラスミドは、ｐＲＫ５（欧州特許第３ ０７，２４７号）またはｐＳＶ１６Ｂ（１９９１年６月１３日発行のＰＣＴ 国際特許公開第９１／０８２９１号）である。 ヘテロマルチマーを発現させるために、どの宿主細胞系を選択するかは、主に 、発現ベクターによって決まる。もう一つ考慮すべきなのは、必要とするタンパ ク質量である。ミリグラム単位の量を、一過的形質転換によって産生することが できる。例えば、アデノウイルスＥＩＡ−によって形質転換された２９３ヒト胚 腎臓細胞系を、ヘテロマルチマーの効率的な発現が可能になるよう、リン酸カル シウム法を修正した方法によって、ｐＲＫ５を基本とするベクターで一過的に形 質転換することができる。ＣＤＭ８を基本とするベクターを用いて、ＤＥＡＥ− デキストラン法によってＣＯＳ細胞を形質転換することができる(Ａｒｕｆｆｏ ら、Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３(１９９０)；および、Ｚｅｔｔｍｅｉ ｓｓｌら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．(ＵＳ)９：３４７−３５３(１９９０) )。より大量のタンパク質が必要ならば、宿主細胞系を安定的に形質転換させた 後、免疫付着因子を発現させることができる。例えば、ｐＲＫ５を基本とするベ クターを、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする別のプラスミド の存在下で、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の中に導入して、Ｇ４ １８に対する抵抗性を付与することができる。Ｇ４１８に抵抗性のクローンは、 培養によって選抜することができる。これらのクローンを、ＤＨＦＲのインヒビ ターであるメトトレキセートの量を増加させながら培養して、ＤＨＦＲとヘテロ マルチマーの配列をコードする遺伝子のコピー数が共に増幅されているクローン を選抜する。免疫付着因子が、Ｎ末端に疎水性のリーダー配列をもっていれば、 形質転換された細胞によって加工されて分泌される可能性が高い。より複雑な構 造をもつ免疫付着因子の発現には、特に適した宿主細胞が必要となろう。例えば 、軽鎖またはＪ鎖などの構成成分は、一定のミエローマまたはハイブリドーマの 宿主細胞によって提供されよう(Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、上記；およびＭａｒｔ ｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３５６１−３５６８(１９９３))。 本明細書のベクターをクローニングし、発現させるのに適した、この他の宿主 細胞は、上記のような原核生物、酵母、または、高等真核生物の細胞である。こ の目的に適した原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌 で、例えば、腸内細菌である、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのエシェリ キア属(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ)、エンテロバクター属(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔ ｅｒ)、エルウィニア属(Ｅｒｗｉｎｉａ)、クレブシアラ(Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ )、プロテウス属(Ｐｒｏｔｅｕｓ)、例えば、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅ ｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などのサルモネラ属(Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ) 、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）などのセラティア属(Ｓｅ ｒｒａｔｉａ)、およびシゲラ属(Ｓｈｉｇｅｌｌａ)、ならびに、枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ ｉｓ）(例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０で開示されて いるＢ．リケニフォルミス４１Ｐ)などのバシラス属、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇ ｉｎｏｓａ）などのシュードモナス属、およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅ ｐｔｏｍｙｃｅｓ）などである。好ましい大腸菌クローニング宿主の一つは大腸 菌２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）であるが、その他、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１ ７７６(ＡＴＣＣ ３１，５３７)、および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７， ３２５）などの菌株も適している。これらの例は、例示のためのものであり、制 限のためのものではない。菌株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ産物の発酵のための 一般的な宿主菌株であるため、この菌株は、特に好ましい宿主、または宿主の親 株である。好ましくは、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌するも のでなければならない。例えば、Ｗ３１１０株を改変してタンパク質をコードす る遺伝子に遺伝的変異を生じさせることができる。そのような宿主の例として、 大腸菌Ｗ３１１０の２７Ｃ７株などがある。２７Ｃ７の完全な遺伝子型は、ｔｏ ｎＡΔｐｔｒ３ ｐｈｏＡΔＥ１５ Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｏｍｐＴ ΔｄｅｇＰ４１ｋａｎ^rである。２７Ｃ７株は、１９９１年１０月３０日に、Ａ ＴＣＣ番号５５，２４４として、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄 託された。または、１９９０年８月７日発行の米国特許第４，９４６，７８３号 で開示されている、ペリプラズマプロテアーゼの変異体をもつ大腸菌の菌株を用 いることもできる。または、例えば、ＰＣＲ、または、別の核酸のポリメラーゼ 反応などのクローニング法が適している。 原核生物の他に、糸状菌類または酵母のような真核生物微生物が、ヘテロマル チマーをコードするベクターに適したクローニングおよび発現のための宿主であ る。サッカロマイセス・セレビシアエ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ)、すなわち一般的なパン酵母が、下等な真核生物宿主微生物の中 で、もっとも一般的に用いられている。しかし、本明細書においては、分裂酵母 （Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）(ＢｅａｃｈとＮｕ ｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ ２９０：１４０(１９８１)；１９８５年５月２日発行の 欧州特許第１３９，３８３号)；クルイベロマイセス属の宿主（米国特許第４， ９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒら、上記）で、例えば、Ｋ．ラクティス(Ｋ．Ｉ ａｃｔｉｓ）(ＭＷ９８−８Ｃ，ＣＢＳ６８３，ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎ ｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.，７３７(１９８３))、Ｋ．フラジリス （Ｋ．ｆｒａｇｉｌｅｓ）(ＡＴＣＣ １２，４２４)、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）(ＡＴＣＣ １６，０４５)、Ｋ．ウィケラミイ（Ｋ．ｗ ｉｃｈｅｒａｍｉｉ）(ＡＴＣＣ ２４，１７８)、Ｋ．ワルティイ（Ｋ．ｗａｌ ｔｉｉ）(ＡＴＣＣ ５６，５００)、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐ ｈｉｌａｒｕｍ）(ＡＴＣＣ ３６，９０６；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら、上 記)、Ｋ．テルモトレランス(Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ)、およびＫ． マルキサヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）など；ヤロウィア属（ｙａｒｒｏｗｉ ａ）(欧州特許第４０２，２２６号)；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａ ｓｔｏｒｉｓ）(欧州特許第１８３，０７０号：Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：２６５−２７８(１９８８))；カン ジダ属；トリコデルマ・レエシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）( 欧州特許第２４４，２３４号)；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏ ｒａ ｃｒａｓｓａ）(Ｃａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６：５２５９−５２６３(１９７９))；シュワニオマイセス・オクシ デンタリス（Ｓｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などの シュワニオマイセス属(１９９０年１０月３１日発行の欧州特許第３９４，５３ ８号)；および、例えば、ニューロスポラ属、ペニシリウム属(Ｐｅｎｉｃｉｌｌ ｉｕｍ)、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）などの糸状菌(１ ９９１年１月１０日発行の国際特許公開第９１／００３５７号)、ならびに、ア ウペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例え ば、Ａ．ニドランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）(Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１２：２８４−２８９(１ ９８３)；Ｔｉ１ｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ ２６：２０５−２２１(１９８３)；Ｙ ｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７ ０−１４７４(１９８４)、およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）(Ｋｅｌｌｙと Ｈｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．４：４７５−４７９(１９８５))など、この他数多 くの属、種、および株を用いることが可能であり、また有用でもある。 グリコシル化されたヘテロマルチマーを発現させるのに適した宿主細胞は、多 細胞生物由来のものである。そのような宿主細胞は、複雑なプロセッシングを行 なうことができ、グリコシル化活性をもつ。原則として、脊椎動物由来でも、無 脊椎動物由来でも、どのような高等真核生物の細胞培養を使うこともできる。無 脊椎動物細胞の例としては、植物細胞、昆虫細胞などがある。多数のバキュロウ イルス株とその変異株、および対応する昆虫宿主許容細胞として、スポドプテラ ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）(毛虫)、アエ デス・アエギプチ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）(蚊)、アエデス・アルボピク タス（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）(蚊)、ドロソフィラ・メラノガスタ ー（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）(ショウジョウバエ)、 およびボムビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などが確認されている。例 えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７−５５(１９ ８８)；Ｓｅｔｌｏｗら編、遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｒｒｉ ｎｇ）第８巻より、Ｍｉｌｌｅｒら、ｐｐ．２７７−２７９(プレナムパブリッ シング社(Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ)、１９８６年)；および、Ｍａ ｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２−５９４（１９８５）を参照。例えば 、アウトグラファ・カリフォニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｎｉｃ ａ）ＮＰＶのＬ−１変異株、およびカイコＮＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ ＰＶ）のＢｍ−５株など、形質転換用のさまざまなウイルス株が一般に利用可能 であり、そのようなウイルスは、本明細書において、本発明に記載されているウ イルスとして、特に、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆ ｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞の形質転換に用いることができる。 ワタ、トウモロコシ、バレイショ、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバ コの植物培養細胞を宿主として利用することができる。典型的には、予め、ヘテ ロマルチマーＤＮＡを持つように操作してあるアグロバクテリウム・ツメファシ エンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌の一定の菌 株とインキュベートして、植物細胞を形質転換する。植物培養細胞をＡ．ツメフ ァシエンスとインキュベートしている間に、ヘテロマルチマーをコードしている ＤＮＡが植物細胞宿主に移行して、それを形質転換し、適当な条件の下でヘテロ マルチマーＤＮＡを発現する。さらに、ノパリンシンターゼプロモーター、およ びポリアデニル化シグナル配列のように、植物細胞に適した調節配列とシグナル 配列を利用することができる。Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇ ｅｎ．１：５６１(１９８２)。なお、Ｔ−ＤＮＡ ７８０遺伝子の上流領域から 分離したＤＮＡ分節は、組換えＤＮＡを含む植物組織において、植物で発現する 遺伝子の転写レベルを活性化あるいは上昇させることができる。１９８９年６月 ２１日発行の欧州特許第３２１，１９６号。 好ましい宿主は脊椎動物の細胞であり、脊椎動物の細胞を培養して増殖させる こと（組織培養）は、近年では日常的な処理になっている(アカデミックプレス 社(Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ)、ＫｒｕｓｅとＰａｔｔｅｒｓｏｎ編、組織 培養（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）(１９７３))。有用な哺乳動物の宿主細 胞系の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統(ＣＯＳ−７，ＡＴ ＣＣ ＣＲＬ １６５１)；ヒト胚腎臓系統(２９３、または、懸濁培養で増殖さ せるためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．３６：５９(１９７７))；仔ハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕ ｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６(１９８０))；マウスセルトリ細胞(ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉ ｏｌ．Ｒｅｐｏｄ．２３：２４３−２５１(１９８０))；サル腎臓細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０)；アフリカミドリザルの腎臓細胞(ＶＥＲＯ−７６、Ａ ＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７)；ヒト子宮頚部ガン細胞(ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣ Ｌ ２)；イヌ腎臓細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣ Ｃ ＣＣＬ ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ， ＡＴＣＣ Ｃ ＲＬ １４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５)；ヒト肝臓 細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；マウス乳ガン(ＭＭＴ ０６０５６２， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１)；ＴＲＩ細胞(Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８(１９８２))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４ 細胞；およびヒトヘパトーマ系（Ｈｅｐ Ｇ２）である。 宿主細胞を本発明の上記発現ベクターまたはクローニングベクターによって形 質転換して、プロモーターを誘導したり、形質転換体を選抜したり、または所望 の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適合するように修正した通常の培地で 培養する。用いる宿主細胞によって、その細胞に適した標準的な技術を用いて形 質転換を行なう。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記の１．８２節で説明されているよう に、一般的には、実質的な細胞壁という障壁を含む、原核生物またはその他の細 胞に対して、塩化カルシウムを用いたカルシウム処理、またはエレクトロポレー ションを用いる。Ｓｈａｗら、Ｇｅｎｅ ２３：３１５(１９８３)、および１９ ８９年６月２９日発行の国際特許公開第８９／０５８５９号に記載されているよ うにして、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによる感染を、一定の植物細 胞を形質転換するために用いる。さらに、１９９１年１月１０日発行の国際特許 公開第９１／００３５８号に記載されているようにして、超音波を用いて、植物 を形質転換することができる。 このような細胞壁をもたない哺乳動物細胞については、Ｇｒａｈａｍとｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４５７（１９７８）のリン酸 カルシウム法が好ましい。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の一般的な態様を、１ ９８３年８月１６日発行の米国特許第４，３９９，２１６号において、Ａｘｅｌ が記述している。酵母への形質転換は、一般的には、Ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ ら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３０：９４６(１９７７)、およびＨｓｉａｏら、Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：３８２９（１９７９）の方法に したがって行われる。ＤＮＡを細胞の中に導入するために、核へのマイクロイン ジェクション、エレクトロポレーション、無処理の細胞とバクテリアのプロトプ ラストとの融合、または、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンなどのポリ カチオンのような別の方法を用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換する ためのさまざまな技術にりいては、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ ｚｙｍｏｌｏｇｙ(１９８９)、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ ｍｏｌｏｇｙ １８５：５２７−５３７(１９９０)、およびＭａｎｓｏｕｒら、 Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照。 本発明のヘテロマルチマーポリペプチドを産生するために用いた原核生物細胞 を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記において、一般的に説明されているところにした がって、適当な培地で培養する。 本発明のヘテロマルチマーを産生するために用いた哺乳動物宿主細胞は、さま ざまな培地で培養することができる。宿主細胞を培養するには、Ｈａｍ’ｓ Ｆ １０(シグマ社(Ｓｉｇｍａ))、最小必須培地((ＭＥＭ)、シグマ社)、ＲＰＭＩ− １６４０(シグマ社)、およびダルベッコの修正イーグル培地((ＤＭＥＭ)、シグ マ社)などの市販の培地が適当である。さらに、それらの開示内容がすべて、参 照してここに組み込まれる、ＨａｍとＷａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８ ：４４(１９７９)、ＢａｒｎｅｓとＳａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０ ２：２５５(１９８０)、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６ ６号；第４，９２７，７６２号；または、第４，５６０，６５５号；国際特許公 開第９０／０３４３０号；国際特許公開第８７／００１９５号；米国特許第４， ７９１，１９２号；および米国特許（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｒｅ.）第３０， ９８５号；または、米国特許第５，１２２，４６９号に記載されている培地のい ずれかを、宿主細胞用の培養培地として用いることができる。これらの培地はど れも、必要ならば、ホルモンおよび／またはその他の増殖因子(インシュリン、 トランスフェリン、または上皮増殖因子など)、塩類(塩化ナトリウム、カルシウ ム、マグネシウム、およびリン酸)、緩衝液(ＨＥＰＥＳなど)、ヌクレオシド(ア デノシンおよびチミジンなど)、抗生物質(登録商標ゲンタマイシン薬剤)、微量 要素(最終濃度がマイクロモルの単位で存在する無機化合物と定義される)、およ びグルコースまたは同等のエネルギー源を添加することもできる。この他の添加 物も、当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。温度、ｐＨなどの 培養条件は、発現させるために選ばれた宿主細胞によって以前用いら れた条件であり、当業者にとっては明らかである。 一般的に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコー ル、および実際の技術については、ＩＲＬプレス社(ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ)、１９ ９１年、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編、哺乳動物細胞のバイオテクノロジー：実際的方法 （Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｐｒａｃ ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）に書かれている。 本開示で言及されている宿主細胞は培養細胞だけでなく、宿主動物の中の細胞 も含む。 ４．ヘテロマルチマーの回収 ヘテロマルチマーは、好ましくは、一般的に、分泌ポリペプチドとして、培養 培地から回収するが、分泌シグナルなしに、直接産生されたときには、宿主細胞 溶解物から回収する。ヘテロマルチマーに膜結合があるときには、適当な界面活 性剤（例：Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００）を用いて膜から解離することができる。 ヒトに由来しない組換え細胞の中でヘテロマルチマーが産生されたときには、 ヒト由来のタンパク質やポリペプチドを全く含まない。しかし、組換え細胞のタ ンパク質やポリペプチドからヘテロマルチマーを精製して、ヘテロマルチマーに ついて実質的に均質な調製物を得る必要がある。最初の工程として、培養培地ま たは細胞溶解物を普通に遠心分離して、微粒子化した細胞残滓を取り除く。 抗体の定常部位をもつヘテロダイマーは、ハイドロキシアパタイトクロマトグ ラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーによ って、都合のよいように精製することができるが、アフィニティークロマトグラ フィーが好ましい精製技術である。ヘテロマルチマーがＣ_H３部位を含むときは 、登録商標ベーカーボンド ＡＢＸ（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ）樹脂（Ｊ． Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ニュージャージー州フィリップスバーグ(Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂ ｕｒｇ)）が、精製するために有用である。この他に、イオン交換カラムによる 分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、ヘパ リンセファロースによるクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂 (ポリアスパラギン酸カラムなど)によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカ シ ング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫安沈殿などのタンパク質精製技術も、回収す るポリペプチドによっては利用可能である。親和性リガンドとしてのプロテイン Ａの適合性は、キメラで用いられた免疫グロブリンＦｃドメインの種類およびア イソタイプによって異なる。プロテインＡを用いて、ヒトγ１、γ２、またはγ ４のＨ鎖に基づいて、免疫付着因子を精製することができる(Ｌｉｎｄｍａｒｋ ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３(１９８３))。マウスのア イソタイプのすべてとヒトγ３(Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７−１ ５７５(１９８６))には、プロテインＧが推奨されている。親和性リガンドが結 合する基質は、もっとも普通にはアガロースであるが、その他の基質を用いるこ ともできる。調節された多孔性ガラスビーズ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定し たマトリックスなら、アガロースを用いるよりも流速が早くなり、短い処理時間 でできる。プロテインＡまたはＧアフィニティーカラムに免疫付着因子を結合さ せる条件は、Ｆｃドメインの特徴によって全面的に決定される。すなわち、その 分子種とアイソタイプによって決まる。一般的には、適正なリガンドが選択され れば、直接、条件付けていない培養溶液からでも、効率的な結合が起こる。免疫 付着因子の顕著な特徴の一つは、ヒトγ１分子で、同じＦｃ型の抗体に較べて、 プロテインＡに対する結合能力が幾分低下することである。結合した免疫付着因 子は、酸性ｐＨ（３．０かそれ以上）で、または、僅かにカオトロピックな塩を 含む中性ｐＨの緩衝液の中で効率的に溶出することできる。このアフィニティー クロマトグラフィー工程によって、＞９５％純粋なヘテロダイマー調製物を作製 することができる。 ５．共通の軽鎖をもつヘテロマルチマーの多官能性抗体の使用 ヘテロマルチマーについては、治療薬としての多くの応用が考えられる。例え ば、細胞傷害性を切り換える（例：腫瘍細胞を殺す）ために、ワクチンのアジュ バントして、血栓溶解剤を血餅まで輸送するために、標的部位（例えば、腫瘍） で、酵素的に活性化されたプロドラッグを転化するために、感染病を治療するた めに、免疫複合体を細胞表面レセプターへと向かわせるために、または、腫瘍細 胞にイムノトキシンを輸送するためにヘテロマルチマーを用いることができる。 例えば、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体であるモデル内皮抗原を標的とす ることによって、抗体−リシンイムノトキシンによって、腫瘍の脈管構造を標的 とすることができた(Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ｆ．Ｊ．とＴｈｏｒｐｅ，Ｐ．Ｅ．(１９ ９３)Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８９９６−９０ ００)。抗−内皮イムノトキシンを腫瘍細胞そのものに対する別のイムノトキシ ンと組み合わせることによって、有意に高い効能が得られた(Ｂｕｒｒｏｗｓ， Ｆ．Ｊ．とＴｈｏｒｐｅ，Ｐ．Ｅ．（１９９３）上記)。最近、二重特異性抗体 を用いて、組織因子を腫瘍脈管構造に向かわせることに成功し、かなり高い抗腫 瘍効果を生じる局所的な血栓症を引き起こした(Ｈｕａｎｇ，Ｘら、（１９９７ ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：５４７−５５０)。さらに、二重特異性ジアボディ を用いて、細胞傷害性Ｔ細胞に、インビトロで、標的乳ガン細胞およびＢ細胞リ ンパ腫細胞を殺させることに成功した（Ｚｈｕ，Ｚ．ら、（１９９６）Ｂｉｏ／ Ｔｅｃｈｎｏ１ｏｇｙ １４：１９２−１９６；およびＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ． ら、（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅｎｇｉｎ．９：２９９−３０５)。 望ましい精製度をもつヘテロマルチマーを、任意に、生理学的に許容できる担 体、賦形剤、または安定剤（レミントンの製薬科学(Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰ ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ)、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編( １９８０)）と混合して、凍結乾燥した固形または水溶液の形状で保存するため に、ヘテロマルチマーの治療用処方剤を調製する。許容される担体、賦形剤、ま たは安定剤は、用いられる投薬量と濃度では受容者にとって非毒性で、リン酸、 クエン酸、およびその他の有機酸などを含む緩衝液；アスコルビン酸などの抗酸 化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、 または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポ リマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンなど のアミノ酸；単糖類；二糖類；および、グルコース、マンノース、またはデキス トリンなどの炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトール、またはソ ルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；およ び／または、トィーン(Ｔｗｅｅｎ)、プルロニクス（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）ま たはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの界面活性剤を含んでいる。 ヘテロマルチマーは、例えば、コアセルベート化技術、または界面ポリマー化 （例えば、ヒドロキシメチルセルロース、または、それぞれ、ゼラチン−マイク ロカプセルおよびポリ−［メチルメトアシレート］マイクロカプセル）によって 調製されたマイクロカプセルの中に取り込んだり、コロイド剤送達システム（例 えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子 、およびナノカプセル）に取り込んだり、または、マクロエマルジョンの中に取 り込んだりすることができる。このような技術については、レミントンの製薬科 学(Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ) 、上記で開示されている。 インビボでの投与に用いるヘテロマルチマーは、滅菌されていなければならな い。これは、凍結乾燥および再構成の前か後に、滅菌フィルター膜で濾過すれば 簡単に行なえる。ヘテロマルチマーは、通常、凍結乾燥状態か水溶液の状態で保 存する。 治療用ヘテロマルチマー組成物は、一般的に、滅菌的に接触することのできる 通路をもった容器、例えば、静脈注射用のバック、または皮下注射用の注射針に よって貫通することのできる栓をもったバイアルの中に置かれる。 ヘテロマルチマーの投与経路は、例えば、静脈、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内 、動脈内、または病巣内などの経路による注射または点滴のような既知の方法、 または下記に示すような徐放性システムによる。ヘテロマルチマーは、点滴また はボーラス注射によって、連続的に投与する。 徐放性調製物の適当な例は、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透過性 基質で、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような形のあるものになっ ている基質を含む。徐放性基質の例は、Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍ ａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７(１９８１)、およびＬａｎｇｅｒ、Ｃ ｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２）に記載されているポリエス テル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリラート)、ま たはポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３，７７３，９１９号 、欧州特許第５８，４８１号)、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グ ルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５ ４７−５５６(１９８３))、非分解性エチレン−ビニル酢酸(Ｌａｎｇｅｒら、上 記)、登録商標ルプロンデポット（Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ）のような分解性 の乳酸−グリコール酸コポリマー(乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプ ロリドからなる注射用ミクロスフィア)、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロ キシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）などがある。 エチレン−ビニル酢酸、および乳酸−グリコール酸などのコポリマーは、１０ ０日間にわたって分子を放出することが可能であるが、ある種のヒドロゲルでは 、タンパク質を放出する期間が短くなる。カプセルに入ったタンパク質は、長時 間体内に残留して、３７℃で湿気に曝される結果、変性するか凝集して、生物学 的活性を失うことになり、免疫原性にも変化が生じうる。関係するメカニズムに よって、タンパク質を安定化させるための合理的な方策を考え出すことができる 。例えば、凝集を起こすメカニズムが、チオ−ジスルフィドインターチェンジの 分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見されていれば、スルフヒドリル残基を修 飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を調節し、適当な添加剤を使用し、 また、特異的なポリマー基質組成物を開発することによって、安定させることが できる。 また、徐放性ヘテロマルチマー組成物は、リポソームによって取り込まれたヘ テロマルチマーでもよい。ヘテロマルチマーを含むリポソームは、それ自体は既 知の方法：独国特許第３，２１８，１２１号；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２(１９８５)；Ｈ ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４０３０− ４０３４(１９８０)；欧州特許第５２，３２２号；欧州特許第３６，６７６号； 欧州特許第８８，０４６号；欧州特許第１４３，９４９号；欧州特許第１４２， ６４１号；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０ ４５号および第４，５４４，５４５号；ならびに欧州特許第１０２，３２４号に よって調製される。通常、リポソームは、小さな（２００−８００オングストロ ーム）均一ラメラ型で、脂質成分が約３０ｍｏｌ．％コレステロールよりも高く 、ヘテロマルチマー治療を最適なものにするために、選ばれた比率を調 節する。 治療に用いるヘテロマルチマーの効果的な用量は、例えば、治療目的、投与経 路、および患者の症状によって変わる。したがって、至適な治療効果を得るため には、治療者が用量を希釈したり、投与経路を変更することが必要となろう。典 型的な毎日の投与量は、上記の要素によって、約１μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋ ｇかそれよりも多い量になろう。典型的には、臨床医は、所期の効果を納めるま で、ヘテロマルチマーの投薬を続けることになろう。この治療の進行状況は、常 法によって容易に観察される。 本明細書に記述されているヘテロマルチマーは、酵素免疫測定法で用いること もできる。それを行なうためには、結合によって、酵素を阻害しないように、ヘ テロマルチマーの一方のアームを、酵素上の特異的なエピトープに結合するよう に設計し、ヘテロマルチマーのもう一方のアームを、所望の部位で高い酵素密度 とする固定基質に結合するように設計することができる。このような診断用ヘテ ロマルチマーの例としては、ＩｇＧ、およびフェリチンに対する特性を持ったヘ テロマルチマー、および、ホースラディッシュパーオキシダーゼ(ＨＲＰ)、なら びに、例えば、ホルモンに対する結合特異性をもつヘテロマルチマーなどがある 。 このヘテロマルチマーは、２部位免疫測定法に用いるよう設計することもでき る。例えば、二重特異的な２つのヘテロマルチマーを、解析するタンパク質上の ２つの別々のエピトープに結合するように産生し、一方のヘテロマルチマーは、 不溶性の基質にその複合体を結合させ、もう一方は、指示酵素に結合する。 また、ヘテロマルチマーは、ガンなど、さまざまな病気のインビトロおよびイ ンビボでの免疫診断に用いることもできる。この診断への使用を容易にするため に、ヘテロマルチマーの一方のアームを腫瘍関連抗原に結合するように設計し、 もう一方のアームを検出用マーカー（例えば、放射性核種に結合するキレート剤 ）に結合するように設計することができる。例えば、腫瘍関連抗原ＣＥＡ、およ び二価性ハプテンに対して特異性をもつヘテロマルチマーは、結腸直腸ガンと甲 状腺ガンを画像化するために用いることができる。この他にも、ヘテロマルチマ ーを、治療ではなく診断に使用できることは当業者にとって明らかであろう。 診断に応用するためには、ヘテロマルチマーの少なくとも一方のアームが、典 型的には、直接的または間接的に、検出可能な部分によって標識されている。検 出可能な部分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生じるものとする ことができる。例えば、検出可能な部分は、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、または¹²⁵ Ｉなどの放射性同位元素；フルオロセインイソチオシアナート、ローダミン、ま たはルシフェリンなどの蛍光化合物または化学発光化合物；または、アルカリホ スファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはホースラディッシュパーオキシダ ーゼ（ＨＲＰ）などの酵素であろう。 ヘテロマルチマーを検出可能な部分に別々に結合させるために、当技術分野に おいて既知の方法を用いることができるが、そのような方法には、Ｈｕｎｔｅｒ ら、Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５(１９６２)；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ １３：１０１４(１９７４)；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ ｅｔｈ．４０：２１９(１９８１)；および、Ｎｙｇｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅ ｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７（１９８２）に記載されている方 法などがある。 本発明のヘテロマルチマーは、競合結合アッセイ法、直接および間接サンドイ ッチアッセイ法、および免疫沈殿法など、既知のアッセイ法に用いることができ る。Ｚｏｌａ、モノクローナル抗体：技術マニュアル(ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡ ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ)，ｐｐ ．１４７−１５８（ＣＲＣプレス社（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ.，１９８７ ） 競合結合アッセイ法は、限られた量のヘテロマルチマーへの結合をめぐって、 標識された標準化合物が、解析対象の試験用サンプルと競合できることに基づい ている。試験サンプル中の解析化合物の量は、ヘテロマルチマーに結合した標準 化合物の量に反比例する。結合した標準化合物の量を容易に決定するために、ヘ テロマルチマーは、一般的に、競合の前か後に不溶化して、ヘテロマルチマーに 結合している標準化合物と解析化合物が、非結合のままの標準化合物と解析化合 物とから都合良く分離できるようにする。 このヘテロマルチマーは、それぞれが、検出すべきサンプルの異なった免疫原 部分またはエピトープに結合することのできる２種類の分子を使用することを含 むサンドイッチアッセイ法にとって、特に有用である。サンドイッチアッセイ法 において、試験用サンプルの解析化合物は、固体担体上に固定されたヘテロマル チマーの一方のアームに結合していて、その後、ヘテロマルチマーのもう一方の アームが解析化合物に結合して、３つの部分からなる不溶性の複合体を形成する 。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照。ヘテロマルチマー自体の第 二のアームを、検出可能部分によって標識する（直接的サンドイッチアッセイ法 ）か、または、検出可能部分によって標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて 測定することができる(間接的サンドイッチアッセイ法)。例えば、サンドイッチ アッセイ法の一つのタイプは、ＥＬＩＳＡ法であるが、この場合には、検出可能 部分は酵素である。 以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の実施例である。実施例は、 例示目的のだけに示されているのであって、いかなる意味でも、本発明の範囲を 制限するためのものではない。 本明細書において引用されている刊行物、特許、および特許出願は、上記のも のも下記のものもすべてが参照してここに組み込まれる。 実施例 Ｆｃ-含有ＢｓＡｂ（図1C)を製造する方法を提供する。この計画において、我 々はそれがヘテロダイマー化するがホモダイマー化されないように抗体重鎖のＣ_H ３を設計した。これは、論理的設計(Ridgwayら，上記(1996))及びここに記載し た通りのファージディスプレー選択によって得られた立体的相補変異と共同して Ｃ_H３ドメイン中に相互-鎖ジスルフィド結合を設けることによって達成された。 両方の抗原結合特異性用の単軽鎖の使用は、軽鎖誤対合の問題を避ける(図1A-1C )。同じ軽鎖を持った抗体は、非常に大きなヒトｓｃＦｖライブラリーを選別す ることによって容易に分離された(Vaughan,T.J.ら，(1996)上記)。 実施例１：空洞への隆起(protuberance-into-cavity)ヘテロマルチマー免疫付着 因子の生成 Chamowら,J.Imminol.153:4268(1994)により先に記載されたヒト化抗-ＣＤ３／ ＣＤ４-ＩｇＧキメラ間のＣ_H３界面は、回収できたヘテロマルチマーのパーセン テージを最大化するように構築した。空洞への隆起及び野生型Ｃ_H３変異体は、 ヒト化抗体-免疫付着因子キメラ(Ab/Ia)抗-CD3/CD4-IgGの形成を導くその能力を 比較した。 かくして変異体は、ヒト化抗-ＣＤ３抗体重鎖のＣ_H３ドメインに及びミスマッ チオリゴヌクレオチドを用いたサイト-誘導変異誘発(Kunkelら,Methods Enzymol .154:367(1987)とP.Carter,in Mutagenesis:a Practical Approach,M.J.McPhers on,Ed.,IRL Press,0xford,UK,pp.1-25(1991))によってＣＤ４-ＩｇＧ中で構築さ れ、且つジデオキシヌクレオチド配列によって実証した(Sangerら，Proc.Natl． Acad．Sci.USA 74:5463(1977))。次の表３を参照 残基Ｔ３６６は、パートナーＣ_H３ドメイン上の残基Ｙ４０７の水素結合間隔 内にある。実際は、残基Ｔ３６６への主要な分子間接触は、残基Ｙ４０７に対す るものであり逆の場合も同じである。一つの空洞への隆起ペアは、一つのＣ_H３ ドメイン中のＴ３６６Ｙとそのパートナードメイン中のＹ４０７Ｔの相互の変異 を持ったこれらの残基を逆転することによって創製され、かくしてその界面で側 鎖の容量が維持される。変異は、Kabat数付与システム(Kabatら，(1991)上記)を 用いて、野生型残基の後にその位置が示され、さらにその後に一文字コードの置 換残基として示されている。複数変異は、コロンによって分けられた単一変異成 分をリスト化することによって定義される。 抗-ＣＤ３軽鎖(L)と重鎖(H)変異体(Shalabyら，J．Exp．Med．175:217(1992) とRodrigesら，Int.J.Cancer(上記)7:45(1992))をコードしているファージミド は、以前に記載された通り(Chamowら，J.Immunol．153:4268(1994))、ファージ ミドをコードしているＣＤ４-ＩｇＧ変異体(Bymら,Nature 344667(1990))と一緒 に、ヒト胎児性腎細胞，２９３Ｓ中に共移入(co-transfected)した。移入された ファージミドＤＮＡの全量は固定した一方、異なるＤＮＡの比率はＡｂ／Ｉａキ メラの生産を最大化するように変えた。Ｉａ：重鎖：軽鎖インプットＤＮＡ(15 μｇトータル)の割合(質量で)は以下の通り：8:1:3；7:1:3；6:1:3；5:1:3；4:1 :3；3:1:3；1:0:0；0:1:3。 その生産物は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ後のレーザーデンシトメトリースキャニング による分析の前にスタヒロコッカス蛋白質(ProSep A,BioProcessing Ltd,UK)を 用いてアフィニティー精製した。重鎖ＤＮＡを超える過剰軽鎖を、軽鎖が制限化 されないように用いた。生産物の同定は、ＰＶＤＦ膜(Matsudaira，J．Biol．Ch em．262:10035(1987))での電気ブロッティング後にアミノ末端配列決定によって 証明した。 軽鎖のファージミドと野生型Ｃ_H３を組み込んでいるＩａおよび重鎖のファー ジミドとの共移入（コトランスフェクション）は、予期した通り、Ａｂ／Ｉａキ メラ，ＩｇＧとＩａホモダイマー生産物の混合物を生じる（Chamowら，J．Immun ol．1534268(1994))。抗体重鎖プラス軽鎖またはＩａをコードしている投入ＤＮ Ａのフラクションが多いほど、回収された対応するホモダイマーのフラクション が多くなる。Ｉａ：Ｈ：Ｌの６：１：３の投入ＤＮＡ比では、Ｉａホモダイマー (22.5％)とＩｇＧ(23.0％)の類似フラクションと共に54.5％のＡｂ／Ｉａキメラ を生じた。これらの比率は、各鎖の等モル発現の後に、分析方法によって導入さ れる偏りを伴わない重鎖のランダムな分類から予期された比率：50％ Ａｂ／Ｉ ａキメラ、25％Ｉａホモダイマー及び25％ＩｇＧとよく一致する。 野生型Ｃ_H３を含有している鎖に対して、Ａｂ／Ｉａキメラは、抗-ＣＤ３重鎖 とＣＤ４-ＩｇＧ Ｉａが、それぞれＹ４０７Ｔ空洞とＴ３６６Ｙ隆起変異を含有 する共移入体から92％までの収率で回収された。もしこれらの相互変異が重鎖の 隆起及びＩａ中の空洞により設けられたならば、抗体/免疫付着因子キメラの同 様の収量が得られた。両方のケースにおいてモノマーは、隆起を含むが空洞のな いその鎖で観測された。いずれか１つの理論に制限することなしに、Ｔ３６６Ｙ 隆起がＹ４０７Ｔ空洞よりもホモダイマー形成に対してより分裂的であると確信 する。Ａｂ／Ｉａハイブリッドのフラクションは、隆起と空洞(Ａｂ Ｔ３６６Ｗ ，Ｉａ Ｙ４０７Ａ)の両者のサイズを増加することによって有意に変更されるこ とはない。第２の隆起と空洞ペア(Ａｂ Ｆ４０５Ａ，ＩａＴ３９４Ｗ)は、ホモ ダイマー化するＩａ Ｔ３９４Ｗ隆起変異体の予期しない傾向を補うための投入 ＤＮＡの小さいフラクションを用いてＡｂ／Ｉａの71％までを生じた。２つの独 立した空洞への隆起変異体ペア(Ab T366Y：F405A、Ia T394W：Y407T)の組合せは 、Ａｂ Ｔ３６６Ｙ，Ｉａ Ｙ４０７Ｔペア以上にはＡｂ／Ｉａハイブリッドの生 産を改善しなかった。 Ｔ３６６ＹとＹ４０７Ｔ変異体ペアにより得られたＡｂ／Ｉａキメラのフラク ションは、試験した範囲にわたり、投入ＤＮＡｓの比に実質的に非従属であった 。さらに汚染している種は、mono S HR 5/5カラム(Pharmacia,Piscataway,NJ)上 でイオン交換クロマトグラフィー(20mMトリス塩酸，pH８.0中0-300mM ＮａＣｌ) によってＡｂ／Ｉａキメラから容易に除去された。これは、ＡｂとＩａの相対的 な発現レベルが一時的な発現系におけるよりも容易な操作性が劣る、安定な細胞 系を用いて大量のＡｂ／Ｉａキメラの製造のために良好であると予想する。 同定した空洞への隆起変異体は、得られた生産物の混合物の複雑性を可能性の ある１０の主要な種(Sureshら，Methods Enzymol.121:210(1990))から４又はそ れ以下にまで減じることによって、Ｆｃ-含有ＢｓＡｂの潜在的な適用を増加す ることが予期される(図1A-1B)。Ｔ３６６とＹ４０７が完全に保存され且つＩｇ Ｇ₁のＣ_H３ドメイン界面で他の残基が高度に保存されることから、Ｔ３６６Ｙと Ｙ４０７Ｔ変異体ペアは、他のヒトＩｇＧアイソタイプ(IgG₂，IgG₃又はIgG₄の ような)のヘテロマルチマーを生産するために有用とされるであろう。 実施例２：ヘテロマルチマーの免疫付着因子中の非天然存在ジスルフィド結合の 生成 Ａ． Ｃ_H３鎖間-ジスルフィド結合の設計 ３つの基準を、パートナ−Ｃ_H３ドメイン間のジスルフィド結合を作るための 残基のペアを同定するために使用した：ｉ）Ｃα分離は、好ましくは自然ジスル フィド結合中に見出されるそれに類似している(5.0から6.8Å)(Srinivasan，N. 等，Int.J.Peptides Protein Res.36:147-155(1990))。7.6Åまでの間隔は、主 鎖移動を許すことおよび低い分解能の結晶構造での原子の位置の不確実性を考慮 することを許した(Deisenfofer,Biochemistry 20:2361-2370(1981))。ii）Ｃα 原子は、２つのＣ_H３ドメイン上の異なろ残基上にあるべきである。iii）その残 基はジスルフィド結合を与えるように位置付けられる(Srinivasan,N.ら,上記)。 Ｂ． ジスルフィド結合のモデル化。ジスルフィド結合は、InsightII releas e 95.0(Biosym/MSI)を用いてhumAb4D5-Fvについて記載された通り(Rodnguesら， Cancer Res.55:63-70(1995))、ヒトＩｇＧ₁Ｆｃ(Deisenhofer,上記)中にモデル 化した。 Ｃ． Ｃ_H３変異体の構成。変異は、以下の合成オリゴヌクレオチドを用いて 、特定部位の突然変異誘発(Kunkelら,Methods Enzymol.154.367-382(1987))によ ってヒト化した抗-ＣＤ３重鎖又はＣＤ４-ＩｇＧのＣ_H３ドメイン中に導入した ： 変異は、アミノ酸残基と番号(Kabatら，上記(1991)のＥｕ番号付与スキーム) 次いで、置換アミノ酸で表した。多重変異は、コロンによって分けた単一の変異 によって表される。変異体は、シーケナーゼversion2.0(United States Biochem icals,Cleveland,OH)を用いるジデオキシヌクレオチド配列決定(Sangerら,上記( 1977))によって確証した。 Ｄ． 鎖間ジスルフィドはヘテロダイマー形成を増大する。Ｃ_H３ドメイン中 に鎖間ジスルフィド結合を含んでいる６ペアの分子("ジスルフィド-Ｃ_H３"変異 体；v1-v6，表４)は、Ａｂ／Ｉａハイブリッド、抗-CD3/CD4-IgG(Chamowら，上 記(1994))の形成を導くその能力において親の分子と比較した。ＣＤ４-ＩｇＧ及 び抗-ＣＤ３重鎖変異体をコードしているプラスミドは、抗-ＣＤ３軽鎖をコード している過剰のプラスミドと一緒に、２９３Ｓ細胞中に共移入した。ヘテロダイ マーの収量は、ある範囲のＩａ：Ｈ鎖：Ｌ鎖ＤＮＡ比で移入することにより至適 化した。Ａｂ／Ｉａヘテロダイマー、ＩｇＧ及びＩａホモダイマー生産物は、ブ ドウ球菌プロテインＡアフィニティー-精製し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥとレーザーデン シトメトリースキャニング(Ridgwayら,上記(1996))によって定量した。 それぞれのジスルフィド-Ｃ_H３ペアは、親の分子に類似した、３つの主要な種 を生じる。しかしながら、ジスルフィド-Ｃ_H３変異体からのＡｂ／Ｉａヘテロダ イマーは、Ｃ_H３ドメイン中の鎖間ジスルフィドの形成に一致して、電気泳動の 移動でシフトした。ジスルフィド結合形成の更なる証拠は、ヒンジにおける鎖間 ジスルフィドによって提供された。共有結合したＡｂ／Ｉａハイブリッドは、Ｓ ＤＳ-ＰＡＧＥによりジスルフィドＣ_H３変異体が観察されたが、ヒンジシステイ ンがセリンに変異した野生型Ｃ_H３ドメインを持った分子はＳＤＳ-ＰＡＧＥによ って観測されなかった。ジスルフィドＣ_H３変異体を製造し、Y349C/S354'C,Y349 C/E356'C,Y349C/E35T'C,L351C/E354'C,T394C/E397'C,及びD399C/K392Cと定義し た。唯一の変異体(D399C/K392'C)は、該変異体のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析による測 定として野生型を越えるＡｂ／Ｉａハイブリッドの収量を実質的に増加した(そ れぞれ７６％対５２％)。変異は、アミノ酸残基と番号(Kabatら,上記(1991)のＥ ｕ番号付与スキーム)、それに次ぐ置換アミノ酸によって表した。Ｃ_H３の第１及 び第２のコピー中の変異は、それぞれ前後にスラッシュを付す。Ｃ_H３の第 ２のコピー中の残基は、プライム符号(')によって表示される。この改善は、該 変異体K392S/D399'Sが野生型と比較して類似したＡｂ／Ｉａ収量とＡｂ／Ｉａ電 気泳動移動性の両方を与えたことから、残基Ｋ３９２とＤ３９９の置換というよ りむしろ、ジスルフィド結合形成を明らかに反映する。ホモダイマーは、野生型 Ｆｃドメインを持つものと同様に移動し、これはヘテロダイマーのＣ_H３ドメイ ン中に鎖間ジスルフィド結合形成が優先して行われたことを実証している。全て のジスルフィドＣ_H３変異体は、２９３Ｓ細胞中において親分子とほぼ同じレベ ルで発現した。 Ｅ． 空洞への隆起計画と組み合わされたジスルフィドは９５％までヘテロダ イマーの収率を増加する。最良のジスルフィドペアは、７６％までヘテロダイマ ーのパーセンテージを増加し、空洞への隆起方法は８７％までヘテロダイマーの パーセンテージを増加した(表４；Ridgwayら,(1996)上記も参照)。これら２つの 方法は、異なる原理に基づいて、ヘテロダイマー生成の確率を増加する。従って 、我々はヘテロダイマーにおける収率を更に改善することを意図して、その２つ の方法を組み合わせた。Ｌ３５１Ｃ又はＴ３９４Ｃを含む、２つのモデル化した ジスルフィドは、ジスルフィド結合ヘテロダイマー(L351C/S354'CとT394C/V397' C)と同じくジスルフィド結合ホモダイマーを潜在的に形成でき、利用価値が低い 。残る４つのジスルフィドペアは、ファージ選択したヘテロダイマー（変異体ｖ ９-ｖ１６)中に配置し、ヘテロダイマーの収率を分析した(表４)。ヘテロダイマ ーのほぼ９５％の収率が得られた。さらに、該ヘテロダイマーは、野生型及びｖ ８変異体に匹敵する電気泳動移動シフトを示した。実施例３：ヘテロマルチマー中のタンパク質-タンパク質相互作用を増大する相 補の変異のための構造-誘導ファージディスプレー選択 以下の方法は、マルチマー化ドメインを経て界面で相互作用するポリペプチド 中の相補の変異の選択において有用である。その方法は、相補的な空洞への隆起 変異の選択にそれを適用するとして次に説明される。しかしながら、その実施例 は制限するためのものではなく、その方法は非天然存在ジスルフィド結合、ロイ シンジッパーモチーフ、疎水性相互作用、親水性相互作用などの形成に適当な変 異の選択に同様に適用すろことができる。 Ａ． ファージディスプレー選択。ファージディスプレー方法は、安定なＣ_H ３ヘテロダイマーの選択用に開発され、図２中に概要が示されている。その選択 は、Ｍ１３遺伝子IIIタンパクに融合したＣ_H３の第２のコピーと共発現されるペ プチドフラッグに融合した(ｇＤペプチドフラッグ、例えばLasky，L.A.とDowben ko，DJ.(1984)DNA 323-29；及びBerman，P.W.ら，（1985）Science 227:1490- 1492)隆起変異体、T366W(Ridgwayら,上記(1996))を用いる。空洞変異体のライブ ラリーは、第１のＣ_H３ドメイン上の隆起に最も近い残基の無作為化によってＣ_H ３のこの第２のコピー中に創製した。次いで、安定なＣ_H３ヘテロダイマーを提 示しているファージを、抗-フラッグＡｂを用いて補足した。 Ｃ_H３ファージディスプレーライブラリーの1.1 x 10⁵の独立クローンは、ＰＣ Ｒフラグメントによる自然Ｃ_H３遺伝子のセグメントの置換によって構築した。 そのフラグメントは、標準的な技術を用いて位置366、368と407を無作為化する ために分解プライマーを用いてＰＣＲ増幅化により得られた。 ２から５ラウンドの選択の後、完全長クローンのフラクションは、一本鎖ＤＮ Ａのアガロースゲル電気泳動によると、それぞれ９０％、６０％、５０％及び１ ０％だった。完全長クローンを含むファージミドは、５ラウンドの選択の後にゲ ル一精製した。二千の形質転換体がＸＬＩ-ＢＬＵＥ^TM細胞(Stratagene)を再形 質転換後に得られた。 各クローンの平均＞１０⁶コピーを、選択(panning)のラウンド当たりに使用し た。かくして、該ライブラリーにおいて各クローンの多数のコピーが、たとえ幾 つかの削除変異体が選択の間に生じたとしても、選択のために利用可能であろう 。 ７ラウンドの選択の後、得られたＣ_H３変異体は、無作為化した残基でコンセ ンサスアミノ酸配列に近づいた。実際に全てのクローンは、残基366でセリン又 はトレオニンを有し、この位置でβ-ヒドロキシルに非常に強い優先性を示した 。疎水性残基のための強い優先性は、バリンとアラニンが優位を占める残基368 と407で観測された。６の異なるアミノ酸の組み合わせは、１１度回収された、 三重変異体、T366S:L368A:Y407Vを含む、少なくとも２度回収された。これらの ファージ選択物はいずれも、先に定義されたヘテロダイマー、T366W/Y407'A(Rid gway，J.B.B.ら,(1996)，上記)と同一の配列を有しない。そのファージ選択物 は、ドメイン界面残基の全側鎖容量において40-80ų減少により判断されるよう に野生型Ｃ_H３ホモダイマーよりも劣る緊密性で詰め込まれ得る。 発現プラスミドｐＡＫ１９(Carterら，1992)上にコードされたＣ_H３変異体を 、大腸菌３３Ｂ６株中に導入し、発現させ、培養槽中で高い細胞密度に増殖した 大腸菌から分泌させた。ＤＥＡＥ-セファロースＦＦ、ＡＢｘ及びResource Sク ロマトグラフィーによって精製したT366S:L368A:Y407V変異体は、ＳＤＳ-ＰＡＧ Ｅの後に単一の主要なバンドを与えた。他のＣ_H３変異体は、同様の純度で回収 した。高解析度電気スプレー質量分析法によって測定した野生型Ｃ_H３、T366S:L 368A：Y407V、T366W及びY407A変異体の分子質量は、予期した通りであった。 Ｂ． ファージ選択したヘテロダイマー安定性。Ｃ_H３ヘテロダイマーの安定 性を、グアニジン塩酸によって相当するファージを滴定することによって最初に 評価し、次いで希釈し、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)によって残る ヘテロダイマーを定量した。Ｃ_H３-ファージによるグアニジン塩酸分解アッセイ は、選択物を直ちにスクリーンするための手段を提供する。 ファージは、７ラウンドの選択の後の個別クローンから調製し、また、コント ロールベクター、ｐＲＡ１からも調製した。概略的には、XLI-BLUE^TM中のファー ジミドを、10⁹pfu/ml M13K07の存在中で50μg/mlカルベニシリンと10μg/mlテト ラサイクリンを含有する25ml ＬＢ培地に接種するために使用し、37℃で一晩イ ンキュベーションした。その細胞は遠心分離(6000g、10分、４℃)によってぺレ ット化した。ファージは、５ｍｌの20％(w/v)ＰＥＧ、2.5M ＮａＣｌによって沈 殿し遠心分離(12000g、10分、４℃)の後に上清から回収され、１ｍｌのＰＢＳ中 に再懸濁させた。ＰＢＳ中0-6Mのグアニジン塩酸180μlが20μｌファージ調製物 に加えられ、5.0分間ほぼ〜25℃でインキュベーションした。各ファージサンプ ルのアリコート(20μl)は、水で十倍に希釈した。Ｃ_H３のヘテロダイマーの存在 は、５Ｂ６-被覆プレートを用い及び基質としてｏ-フェニレンジアミンを用いた ホースラディッシュペルオキシダーゼに接合した抗-Ｍ１３ポリクローナルＡｂ によってファージを検出するＥＬＩＳＡによって測定した。その反応 は、2.5M Ｈ₂ＳＯ₄50μlの添加によって抑止し、492nmで吸光度を測定した。そ の吸光度データは、その溶融の間にグアニジン塩酸濃度に対してプロットし、且 つKaleidagraph3.0.5(Synergy Soflware)を用いた非線形最小二乗法によって四 つのパラメーターモデルに適用した。 最も頻繁に回収されたヘテロダイマー、T366W/T366'S：L368'A:Y407'Vは、他 のファージ-選択したヘテロダイマーと安定性において類似する。このファージ- 選択したヘテロダイマーは、設計したヘテロダイマー、T366W/Y407'Aよりも有意 により安定であるが、しかし野生型Ｃ_H３よりは安定性に劣る。全てのＣ_H３変異 体、個別及び組み合わせの両方は、これら同じ分子が熱量測定法によって研究さ れた条件下にサイズ排除クロマトグラフィーによってダイマーであることが見出 された(175mg/ml、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中)。唯一の例外は、Ｃ_H３ダイ マーよりもわずかに短い保持時間を有したT366S：L368A：Y407V変異体のみであ った。 Ｔ３６６Ｗ隆起、及びT366S：L368A：Y407V空洞変異体の１：１混合物は、69. 4℃における単独転移で溶融し、サブユニット交換及び安定なヘテロダイマーの 形成と一致する。一方、Ｔ３６６Ｗ隆起ホモダイマーは、T366W/T366'S：L368'A ：Y407'V空洞への隆起ヘテロダイマー(ΔＴ_m＝−15.0℃)よりも安定性に劣る。 それ自身の上のT366S：L368A：Y407V空洞変異体は、加熱によって集合する傾向 があり、滑らかな溶融転移を成さない。 設計した空洞変異体、Ｙ４０７Ａは、Ｔ３６６Ｗ隆起変異体の不在下及び存在 下でそれぞれ58.8℃及び65.4℃で溶融する。これは、サブユニット交換とＴ３６ ６Ｗ(ΔＴ_m＝11.0℃)又はＹ４０７Ａ(ΔＴ_m＝6.6℃)ホモダイマーより大きな安 定性を有するT366W/Y407'Aホモダイマーの形成に一致する。ファージ選択したヘ テロダイマー、T366W/T366'S：L368'A：Y407'Vは、設計したヘテロダイマー、T3 66W/Y407'A,(ΔＴ_m＝４０℃)よりも一層安定であるが、しかし、野生型Ｃ_H３ホ モダイマー(ΔＴ_m＝−11.0℃)よりも安定性が劣る。 Ｃ． インビボでのファージ-選択した抗体免疫付着因子（Ａｂ／Ｉａ）のマ ルチマー化。ファージ選択され、かつ設計されたＣ_H３変異体は、インビボでＡ ｂ／Ｉａハイブリッド、抗-CD3/CD4-IgGの形成を導くその能力を比較した(Chamo wら，(1994),上記。これは、ＣＤ４-ＩｇＧと一緒にヒト化した抗-ＣＤ３軽鎖(L )と重鎖の共発現により達成した。ヘテロダイマーとホモダイマーの形成は、プ ロテインＡ精製後、ＳＤＳ-ＰＡＧＥとスキャニングレーザーデンシトメトリー( Ridgway,ら,(1996),上記)によって評価した。Ａｂ／Ｉａハイブリッドの比較で きる収量が、抗-ＣＤ３重鎖が設計した隆起変異体Ｔ３６６Ｗを含み、Ｉａがフ ァージ-選択した変異体、T366S：L368A：Y407V、又は設計した空洞変異体、Ｙ４ ０７Ａのいずれかを含んだ共移入体から回収された(図３)。 ファージ-選択され、かつ、設計されたＣ_H３変異体は、次にホモダイマーを形 成する傾向において評価した。隆起変異体、Ｔ３６６Ｗは、相当する抗体重鎖と 軽鎖の共移入がＩｇＧを越える過剰のＨＬモノマー(非−ジスルフィド結合Ｉｇ Ｇを含み得る)に至ることから、ホモダイマー化に対して明らかに破壊的である 。一方、ＨＬモノマーではないＩｇＧが、野生型Ｃ_H３ドメインを含む同じ抗体 に観測された。空洞変異体、T366S：L368A：Y407Vは、相当するファージミドの 遺伝子移入が幾つかのＩａモノマーを持つ優性なＩａダイマーの混合物を導くこ とから、多少ホモダイマー化を崩壊させる。空洞変異体、Y407Aは、相当するフ ァージミドの移入後にＩａモノマーではないＩａダイマーの存在による判断とし て、ホモダイマー化を最小限崩壊する。 ここに記載したファージディスプレー選択方法は、安定したヘテロダイマーを 形成するＣ_H３変異体の援助での選択及び安定なホモダイマーを形成する変異体 に対しての選択を可能にする。ホモダイマーに対するカウンター選択は、"遊離" Ｃ_H３変異体が、利用可能なＣ_H３変異体-遺伝子III融合タンパク質への結合のた めにフラッグ化Ｃ_H３ノブ変異体と競合するであろうことから生じる。遊離Ｃ_H３ 変異体は、自然Ｃ_H３遺伝子とＭ１３遺伝子IIIの間のアンバー変異の結果として 生じる。XL1-Blueのようなアンバー抑制宿主において、Ｃ_H３遺伝子III融合タン パクと対応するフリーのＣ_H３の両方が分泌されるだろう。 グアニジン塩酸分解は、ファージ上のＣ_H３ヘテロダイマー安定性を最初にス クリーニングするために有用なツールであることを立証した。ファージは、5Mグ アニジン塩酸にさらした後でも大腸菌への感染性を維持する(Figiniら，J.Mol. Biol.239:68-78(1994))。かくして、グアニジンは変異体選択の厳密さを増加す るためにも有用となり得る。 ファージディスプレーライブラリーの合理的な設計とスクリーニングは、ヘテ ロダイマー化を促進するためにホモダイマーのドメイン界面を再モデル化するた めの相補的なアプローチである。Ｃ_H３ドメインのケースにおいて、設計した変 異体は、ヘテロダイマー化を促進するために補充されたドメイン界面残基を同定 した。ファージディスプレーは、ヘテロダイマーを最も有効に形成する組み合わ せのために固定した隆起の近くの３つの残基の置換をサーチするためにここに用 いた。ファージ選択物は、ドメイン界面の更なる合理的な再設計を促進するため に有効とされる一方、ここに記載したファージ選択方法は、タンパク質-タンパ ク質界面を再モデル化するためのその有用性を実証する。 実施例４：共通の軽鎖を有するヘテロマルチマー抗体又は抗体／免疫付着因子の 生成と組立 以下の実施例は、本発明に従う同じ軽鎖を共有するヘテロマルチマー二重特異 性抗体の調製とその標的抗原に結合する抗体の能力を実証する。 Ａ． 同じ軽鎖を共有する抗体の同定：１１の抗原に対して生じた抗体ライブ ラリーの比較 大きいヒト一本鎖Ｆｖ(scFV)抗体ライブラリー(Vaughanら(1996)上記)を、Ａ ｘ１(ヒトレセプターチロシンキナーゼＥＣＤ)、ＧＣＳＦ-Ｒ(ヒト顆粒球コロニ ー刺激因子レセプターＥＣＤ)、ＩｇＥ(ネズミＩｇＥ)、ＩｇＥ-Ｒ(ヒトＩｇＥ レセプターα-鎖)、ＭＰＬ(ヒトトロンボポイエチンレセプターチロシンキナー ゼＥＣＤ)、ＭｕｓＫ(ヒト筋肉特異的レセプターチロシンキナーゼＥＣＤ)、Ｎ ｐｏＲ(ヒトオルファンレセプターＮｐｏＲ ＥＣＤ)、Ｒｓｅ(ヒトレセプターチ ロシンキナーゼ、Ｒｓｅ，ＥＣＤ)、ＨＥＲ３(ヒトレセプターチロシンキナーゼ ＨＥＲ３／c-erbB3 ＥＣＤ)、Ｏｂ-Ｒ(ヒトレプチンレセプターＥＣＤ)、及びＶ ＥＧＦ(ヒト脈管内皮成長因子)、［ＥＣＤは細胞外ドメインに関する］を含む１ １の抗原に特異的な抗体について選択した。各抗原に対して生じた抗体の集団か らｓｃＦｖフラグメントのヌクレオチド配列データを翻訳して、相当するタンパ ク質配列を誘導した。Ｖ_L配列は、鎖の全てのペア様態組み合わせ間の同一性パ ーセンテージを計算するためにFengとDoolittle(1985,1987,1990)のアルゴリズ ムを有するプログラム"アライン"を用いて比較した(Feng，D.F.とDoolittle，R. F(1985)J.Mol.Evol.21:112-123；Feng,D.FとDoolittle,R.F.(1987)J.Mol.Evol.2 5:351-360:及びFeng,D.FとDoolittle,R.F.(1990)Method Enzymol.183:375-387) 。各ペア様態軽鎖アミノ酸配列比較の配列同一パーセントの結果は、マトリック スフォーマット中に調整した(追記参照)。 ほとんどのペア様態の比較に、少なくとも１の共通軽鎖配列が見出された。表 ５は、117Ｖ_Lアミノ酸配列のアラインメントによって決定した同じ軽鎖を共有す る(100％同一性)ｓｃＦｖの頻度を示しているＶ_L鎖の比較である。例えば、その エントリー４／９(ＨＥＲ３ｘＯｂ-Ｒ、黒いボックスで表した)は、ＨＥＲ３を 結合する４つのクローンが１又はそれ以上の抗-Ｏｂ-ＲクローンとＶ_L配列を共 有することが見出されたが、Ｏｂ-Ｒを結合する９のクローンは、１又はそれ以 上の抗-ＨＥＲ３クローンとＶ_L配列を共有することを表す。対角線上のエントリ ーは、その集団中の１又はそれ以上のクローンとＶ_L配列を共有する集団内の抗 体クローンの数を表す。例えば、ＭＰＬクローンの調査は、１又はそれ以上の他 のＭＰＬクローンとＶ_L配列を共有した５つのクローンを明らかにした。(IgE x Ax1)又は(NpoR x IgE-R)のように、共通の軽鎖が観察されないケースにおいて、 少なくとも１の特異性について比較されるフラグメントの数は非常に少なかった (５以下)。見出された共通の軽鎖の数が与えられ、もし十分な数のクローンが比 較されるなら、いずれかのＶ_L比較物について、共通の軽鎖が見出されるだろう 。 軽鎖のアミノ酸配列は、選択した共通の軽鎖に対しての配列同一性が98％と99 ％であった場合、アミノ酸残基差異の位置について調べられた。図４は、Ａｘ１ (クローンAx1.78)、Ｒｓｅ(クローンRse.23,Rse.04,Rse.20,及びRse.15)、Ｉｇ ＥＲ(クローンIgER．MAT2C1G11)、Ｏｂ-Ｒ(クローンobr.4)、及びＶＥＧＦ(クロ ーンvegf.5)に特異性を持つ８つの異なる抗体のＶ_L配列の比較である。配列の定 義(Kabat，G.A.ら(1991)上記)又は構造の定義(ChothiaとLesk,(1987)J．Mol.Bio l．196901-917)に従う抗原結合ＣＤＲ残基の位置は、それぞれ下線と＃によっ て示した。Ax1.78配列と異なる軽鎖残基は二重下線により示した。比較した９つ 軽鎖の、６つが同一である。Rse.04とobr.4の軽鎖(ほぼ99％配列相同性)は、抗 原結合ＣＤＲｓの外側の１残基で相違する。Rse.20の軽鎖(ほぼ98％配列同一性) は、抗原結合ＣＤＲｓの外側の２残基で異なる。該アミノ酸残基の変化は、抗原 結合性において殆ど、あるいは全く影響しない。かくしてこれらの軽鎖の配列類 似性が、それらを本発明の共通の軽鎖のための候補とする。代替的に、本発明に 従えば、期待される対になったｓｃＦｖ(例えばAx1.78)の軽鎖と98-99％配列同 一性を有する軽鎖が、対になった軽鎖と置換され、且つ結合特異性を保持し得る 。 Ｂ． 同じ軽鎖を共有する抗体の同定と、その軽鎖を共有する二重特異性抗体 の作製：抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３。 ヒトレプチンレセプター(Ｏｂ-Ｒ)又はHER3/c-erbB3遺伝子生産物(ＨＥＲ３) の細胞外ドメインを結合したＳｃＦｖフラグメントは、大きいヒトｓｃＦｖファ ージライブラリーを用いた選別の３つのラウンドによって得られた(Vaughanら(1 996)，上記)。レプチンレセプター-ＩｇＧとＨＥＲ３-ＩｇＧ(1mlＰＢＳ中10μg )を、４℃で一晩、分離イムノチューブ(Nunc;Maxisorp)を被覆するために使用し た。選別とファージ解放は、以下の修正を伴い、Vaugham(1996)，上記により記 載されたように実行した。ヒト化した抗体、huMAb4D5-8(Carter,P.ら(1992)PNAS USA 89:4285-4289)又はヒト化した抗-ＩｇＥ(Presta,L.ら(1993)J.Immunol.151 :2623-2632)を、1mg/mlの濃度で、Ｆｃ-結合ファージを吸着するための各選別工 程中に含めた。加えて、溶液における選別(Hawkins,R.E.ら(1992)J.Mol.Biol.22 6:889-896)も、ｓｃＦｖ結合レプチンレセプターを同定するために使用した。そ のレプチンレセプターを、工作したプロテアーゼ、ジェネナーゼ(Carter，P.ら （1989）Proteins:Stmcture,Function and Genetics 6:240-248)によるレプチン レセプター-ＩｇＧの部位特異的蛋白分解およびその後のプロテインＡセファロ ースクロマトグラフィーによってＦｃから分離した。そのレプチンレセプターを ビオチン化し、それぞれ、第１，第２，及び第３ラウンドの選別用に100nM、25n M及び5nMの濃度で使用した。ファージ結合ビオチン化抗原を、ストレプトアビジ ン-被覆パラ磁性ビーズ(Dynabeads,Dynal,Oslo,NorNvay)を用いて捕捉した。 それぞれの選別のラウンド２及び３からのクローンを、対応する抗原及びコン トロールの免疫付着因子又は抗体を用いたファージ及びｓｃＦｖ ＥＬＩＳＡに よってスクリーンした。抗原-陽性クローンの多様性を、プライマー、fdtetseq およびPUCリバース(Vaughamら(1996)，上記)を用いるｓｃＦｖ挿入物のＰＣＲ- 増幅及びBstNIによる切断(Marksら(1991)上記)によって分析した。BstNIフィン ガープリント当たり１から５のクローンをＰＣＲ重リンクとmyc seq 10プライマ ー(Vaughamら(1996)上記)を用いて蛍光ジデオキシ鎖ターミネーター(Applied Bi osystems)を用いてサイクル配列決定した。サンプルは、Applied Biosystems Au tomated DNA Sequencerを用いて分析し且つ配列をSeqEdを用いて分析した。グア ニジン塩酸抗体変性及びファージディスプレー選択と組み合わせたFiginiのイン ビトロでの鎖シャフリング方法が同じ軽鎖を有する抗体を選択する方法として有 用であることにも注目される(Figini，Ｍ.ら(1994)，上記、その全体が参照によ りここに併合される)。 上記の方法を用いて、１１の異なる抗-ＨＥＲ３クローンと１８の抗-Ｏｂ-Ｒ クローン(そのうちの１１は被覆した抗原を用いた選別から得られ、７つはビオ チニル化抗原を用いた選別から得られた)が得られた。そのクローンは、各結合 ドメインと結合した軽鎖の配列を決定するための標準技術により配列決定した( 図５)。その配列は、二重特異性抗体を構成するために使用した抗-Ｏｂ-Ｒクロ ーン26と抗-ＨＥＲ３クローン１８のV_H及び共通のV_L配列である(後記参照)。そ の残基は(Kabat,E.A.ら(1991)上記)に従い番号付けされる。配列の定義(Kabat,E .A.ら(1991)上記)又は構造の定義(ChothiaとLesk,(1987)J．Mol．Biol．(1987)1 96901-917)に従った抗原結合ＣＤＲ残基の位置は、それぞれ下線と上線によって 示される。V_H配列中の残基間の同一は、^*によって表示した。 軽鎖の配列は、多重抗-Ｏｂ-Ｒクローンに対する多重抗-ＨＥＲ３クローンと 比較した(図８及び表５)。１１の抗-ＨＥＲ３クローンのうちの４つが、１又は それ以上の抗-Ｏｂ-Ｒレセプタークローンと同じV_Lを共有することが観測された 。反対に、１８の抗-Ｏｂ-Ｒクローンのうちの９つが抗-ＨＥＲ３クローンの一 つと同じV_Lを共有する(表５、黒い箱を参照)。 抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３（共通の軽鎖を有する二重特異性抗体）の構築は以 下の通り実行した。相補の隆起と空洞、同じく第１及び第２のポリペプチド間の 非天然存在ジスルフィド結合を有する変更したＣ_H３第１及び第２のポリペプチ ドを、Ｆｃ-含有二重特異性抗体の構築において用いた。同じ軽鎖を共有するク ローンである、抗-Ｏｂ-Ｒクローン＃２６と抗-ＨＥＲ３クローン＃１８からの Ｖ_L、並びに各抗体の重鎖を、ここに記載した手順に従って二重特異性抗体を製 造するために用いた。 この抗体は、非天然存在ジスルフィド結合を生じる変更を欠くことによっての み異なる二重特異性抗体と比べて、見かけの分子量において電気泳動移動性シフ トを有した。非天然存在ジスルフィド結合を持った及び持たないヘテロダイマー の抗体変異体の８％ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルは、野生型ヘテロダイマーのほぼ230の 見かけ上のＭＷから、一つの非天然ジスルフィド結合を有しているヘテロダイマ ーのほぼ200の見かけ上のＭＷまでの移動シフトを示した。そのＭＷシフトは非 天然ジスルフィド結合を首尾良く形成するそれぞれの変異体のパーセントを与え るために十分であった。 二重特異性抗体のＯｂ-Ｒ及びＨＥＲ３の両方へ結合特異性は、以下の方法の ような標準ＥＬＩＳＡ法によって試験される。Ｏｂ-Ｒ結合は、Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇ融 合タンパク質として存在するＯｂ-ＲによってＥＬＩＳＡアッセイで実証される 。該Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇ融合タンパク質は、９６-ウェルのミクロタイター板のウェル 上に被覆され、そして二重特異性抗体が加えられる。 そのウェルは、Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇへの非特異的結合を取り除くために数回洗浄され る。このアッセイにおける第２の成分として、ビオチニル化ＨＥＲ３-Ｉｇ融合 タンパク質が加えられ、そしてビオチニル化ＨＥＲ３-Ｉｇ融合タンパク質に結 合するストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体によっ て測定される。結合は、過酸化水素及びＴＭＢペルオキシダーゼ基質(Kirkegaar d and Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)の添加における着色の変化の生成 により測定される。 ここに記載した条件下、Ｏｂ-Ｒ-ＩｇとＨＥＲ３-Ｉｇの両方への二重特異性 抗体の結合は、固定化Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇ／二重特異性抗体／ＨＥＲ３-Ｉｇビオチン ／検出可能に標識したストレプトアビジンを含む複合体の形成によりミクロタイ ターウェルの表面上に固定化した検出可能な標識として観測される。Ｏｂ-Ｒ-Ｉ ｇと結合するが、ＨＥＲ３-Ｉｇとは結合しない抗体は、上記複合体を形成せず 、陰性の結果を示す。同様に、ＨＥＲ３-Ｉｇと結合するが、Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇとは 結合しない抗体は、上記複合体を形成せず、陰性の結果を示す。一方、Ｏｂ-Ｒ- ＩｇとＨＥＲ３-Ｉｇの両方に結合することが予期される二重特異性抗体は、該 アッセイにおいて陽性の結果を生じる複合体を形成し、これは共通の軽鎖を有す る二重特異性抗体がＨＥＲ３とＯｂ-Ｒの両方に結合することを証明する。 抗-(Ｏｂ−Ｒ／ＨＥＲ３)二重特異性抗体の発現と精製は、以下の通り実行し た。ヒト胎芽腎臓２９３Ｓ細胞を、それぞれ独立に抗-Ｏｂ-Ｒ重鎖、抗-ＨＥＲ ３重鎖、又は上述した通りそれぞれの抗体に共通であったクローン２６又は１８ からの軽鎖をコードしている３つのプラスミドＤＮＡを用いて移入（トランスフ ェクション）した。それぞれの移入のために、重鎖コード化ＤＮＡに対する軽鎖 コード化ＤＮＡの比率は、軽鎖が抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３二重特異性抗体の組 立を制限しないように１：３とした。両方の重鎖を、互いに対して１：１の比で 移入した。12μｇのトータルのプラスミドＤＮＡを、次いでリン酸カルシウム沈 降によって293S細胞中に共移入(co-transfected)した(Gorman,C.,DNA Cloning,V ol.II,D.M.Glover,ed,IRL Press,Oxford,p.143(1985))。その細胞を、ＰＢＳで 洗浄した後に、タンパク質発現の増大を意図して増殖培地に加えた。Ｆｃ-含有 タンパク質は、固定化したプロテインＡ(ProSep A,BioProcessing Ltd.,UK)を用 いて細胞上清から精製し、そしてＰＢＳにバッファー交換した。ジスルフィド結 合の再シャフリングを防止するためにヨードアセトアミドを50mMの最終濃度まで タンパク質調製物に加えた。 さらなる実施例として、抗-(CD3/CD4)抗体／免疫付着因子の発現と精製を以下 の通り実行した。ヒト胎芽腎臓２９３Ｓ細胞を、３つのプラスミドＤＮＡを用い てトランスフェクションした。各プラスミドは抗-ＣＤ３軽鎖、抗-ＣＤ３ Ｉｇ Ｇ₁重鎖、又は抗-ＣＤ４ ＩｇＧ₁免疫付着因子を独立にコードする。それぞれ の移入のために、軽鎖コード化ＤＮＡに対する重鎖コード化ＤＮＡの比率は、軽 鎖が抗-ＣＤ３ ＩｇＧの組立を制限しないように、３：１とした。加えて、免 疫 付着因子があまり発現されないために、免疫付着因子コード化プラスミドの比率 を、重鎖コード化プラスミドに過剰に加えた。試験した比率は、免疫付着因子： 重鎖：軽鎖ファージミドに対し、3:1:3から8:1:3間の範囲とした。トータルで10 μｇのプラスミドＤＮＡは、移入前にＰＢＳで細胞を洗浄し、リン酸カルシウム 沈降(Gorman，C.(1985),上記)により293S細胞中に共移入した。Ｆｃ-含有タンパ ク質は、固定化したプロテインA(ProSep A,BioProcessing Ltd.,UK)を用いて細 胞上清から精製し、そしてＰＢＳ中にバッファー交換した。ジスルフィド結合の 再シャフリングを防止するために、ヨードアセトアミドを50mMの最終濃度までタ ンパク質調製物に加えた。 上記それぞれの調製において、タンパク質サンプルは、８％ポリアクリルアミ ドゲル(Novex)で電気泳動し、Serva blueによる染色によって可視化した。ゲル を脱色して、マイナーな不純物の可視化及び定量化を可能にすべく僅かなバック グラウンドとした。乾燥したゲルを、スキャニングデンシトメーター(GS-670,Bi oRad)によってスキャンし、そしてタンパク質製造物をMolecular Analystソフ トウェアによって定量化した。 Ｃ_H３ドメイン中に導入した非天然(工作した)ジスルフィド結合は、ヘテロダ イマー形成を増大するためにここに開示されている。一対のポリペプチド、K392 /D399'Cは、ヘテロダイマー形成を増大し、７６％までのヘテロダイマーを生成 した(表４、変異体ｖ６)。さらに、鎖間ジスルフィド結合の存在が空洞への隆起 技術と結び付けられた場合、ほぼ９５％のヘテロダイマーが得られた(表４変異 体ｖ１１，ｖ１２，及びｖ１６)。かくして、二重特異性抗体の第１と第２のポ リペプチド間の特異的なタンパク質／タンパク質相互作用を増加する本発明の方 法は、望まれるヘテロマルチマーの収量を増加すると共に、望ましくないヘテロ マルチマー又はホモマルチマーの形成を最小化する。 加えて、電気泳動の移動度の分析によって生産物ヘテロマルチマーを特徴付け る方法は、望ましくない生産物に対する、所望のヘテロマルチマーの相対的な量 の測定を可能にする。 ここに記載したような共通の軽鎖の選択は、多重特異性抗体の可変の重鎖と軽 鎖の間の誤対合の可能性を削除することによって望まれるヘテロマルチマーの収 量をさらに増加する。 Ｃ． 同一の軽鎖を共有する抗体の同定とその軽鎖を共有している二重特異性 抗体の構築：抗-Mpl/抗-HER3。 本発明の別の二重特異性抗体の同定、構築及び発現がここに示される。この実 施例のパートＡとＢ中に記載した方法を、抗-Mpl/抗-HER3二重特異性抗体の製造 用に利用した。 この実施例のセクションＡ中に記載した方法(１１の抗原に対して生じた抗体 ライブラリーの比較)、上記、を用い、抗-ＨＥＲ３ｓｃＦｖのＶ_HとＶ_Lアミノ酸 配列を、ヒトトロンボポイエチンレセプター、ｃ-Ｍｐｌに結合する２３ ｓｃＦ ｖと比較した。１１の抗-ＨＥＲ３クローンの５つは、１又はそれ以上のＭｐｌ- 結合クローンと同一のＶ_Lアミノ酸配列を共有する。反対に、２３の抗-Ｍｐｌｓ ｃＦｖの７つは、抗-ＨＥＲ３クローンの一つと同じＶ_Lを共有していた(表５、 上記、白枠を参照)。対照的に、Ｖ_Hアミノ酸配列は、抗-Ｍｐｌと抗-ＨＥＲ３ク ローンの間に４０から９０％の同一性レベルを持ち、より多様であった。 その抗-Ｍｐｌ ｓｃＦｖ，１２Ｂ５(Genbank accession number AG048775；配 列番号：２７)と抗ＨＥＲ３ ｓｃＦｖクローンＨ６(Genbank accession numbe r AG048774；配列番号：２８)は、同一のＶ_L配列及び実質的に異なるＶ_H配列を 利用する。これらのｓｃＦｖフラグメントは、共有した軽鎖、並びに、孔-ノブ 変異体の使用(ここに記載した)及びＣ_H３ドメイン間に設計されたジスルフィド 結合の使用により、有効なヘテロダイマー化ができる抗-Ｍｐｌ／抗-ＨＥＲ３二 重特異性ＩｇＧ抗体を構築するために用いられた。同じＬ鎖を共有する抗体は、 非-同系Ｈ鎖と対合するＬ鎖の問題を避けるために選択した。２つの天然存在ヒ ンジ領域ジスルフィド結合もまた存在した。その共通のＬ鎖は、変異体ｖ１１か らのＣ_H３変異を含んでいる２つのＨ鎖と共移入した。そのＩｇＧ生産物は、プ ロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、且つ標準技法を用 いてＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析した。 二重特異性ＩｇＧ抗体(ＢｓＩｇＧ)調製物は、野生型Ｃ_H３ドメインを含有す るＩｇＧよりも、より大きい移動性を示す単一の主要バンドを生じた。電気泳動 移動性におけるこの増加は、よりコンパクトなタンパク質種を形成するＢｓＩｇ Ｇ中に作られたジスルフィド結合の形成と一致した。 ＭｐｌとＨＥＲ３ ＥＣＤ抗原の両方に結合する工作した抗-Ｍｐｌ／抗-ＨＥ Ｒ３ＢｓＩｇＧ抗体の能力は、以下の通りＥＬＩＳＡを用いて評価した。全ての 工程でＰＢＳ緩衝液を用い、９６-ウェル板(Maxisorp,Nunc)の個々のウェルは、 5μg/mlのＨＥＲ３-ＩｇＧ又はＭｐｌ-ＩｇＧで一晩被覆し、洗浄し次いで0.5％ (w/v)ＢＳＡで１時間ブロック化した。その最初の抗体は、変異Y349C：T366S：L 368A：Y407V/T366'W：S354'Cを含む抗-Ｍｐｌｘ抗-ＨＥＲ３ ＢｓＩｇＧおよび 変異したＦｃ領域を持つ対応する親の抗-Ｍｐｌ又は抗-ＨＥＲ３ ＩｇＧとした 。最初の抗体(1μg/mL)は、ビオチニル化ＨＥＲ３-ＩｇＧ及びストレプトアビジ ン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体(Boehringer Mannheim)の1:500 0希釈液と共に23℃で２時間、別個にインキュベーションし、次いで各ウェルに 加え、23℃でさらに１時間インキュベーションした。ペルオキシダーゼ活性は、 販売者(Kirkegaard and Perry Laboratories,Inc.,Gaithersburg，MD)によって 指示された通りにＴＭＢ試薬によって検出した。 予想した通り、抗-Ｍｐｌ／抗-ＨＥＲ３ ＢｓＩｇＧは、個別にＭｐｌとＨＥ Ｒ３ ＥＣＤ抗原のそれぞれに効率的且つ同時に、同じく両方の抗原に同時に結 合した。これに対して、親の抗-Ｍｐｌと親の抗-ＨＥＲ３ ＩｇＧは、対応する 同系抗原にのみ結合した(図６)。 Ｄ． 工作したＦｃ領域を含んでいる抗体は、有効な抗体-依存細胞介在細胞 毒性の能力がある。 本発明の実例化した二重特異性抗体の生成において用いた工作したＦ_c領域(Ｃ_H ３変異体、上記)が有効な抗体-依存細胞介在細胞毒性の能力があることを実証 するため、以下の実験を実行した。 そのＣ_H３変異は、Lewis，G.D.ら(Lewis,G.D,ら(1993)Cancer Immunol.Immun other.37255-263,その全部が参考により組込まれる)の方法を用いて示した通り 、効率的な抗体-依存細胞-介在細胞毒性(ADCC)をサポートする能力を維持する。 概略的には、細胞毒性アッセイは、⁵¹Ｃｒ-標識したＳＫ-ＢＲ-３及びＨ ＢＬ-１００標的細胞(それぞれATCC受託番号HTB-30と45509)及びエフェクター細 胞としてヒト末梢血液リンパ球を用いて実行した。しかしながら、Lewisらと異 なり、そのリンパ球はＩＬ-２で活性化されなかった。 Ｃ_H３変異体S354:T366W及びY349C：T366S：L368A：Y407Vは、Carterら(Carter ,P.ら(1992)PNAS USA 89:4285-4289)により製造されたヒト化抗-ＨＥＲ２抗体、 huMAb4D5-5のＨ鎖中に別個に導入した。再モデル化した及び野生型Ｆｃ領域を含 む抗体は、ＨＥＲ２-過剰発現乳癌細胞系、SK-BR-3によりＡＤＣＣ中で類似の能 力を有した(図７)。再モデル化した及び野生型抗体の両方は、通常の胸部上皮細 胞系に対して、低い活性を示した。Ｈ鎖における効果は、結合ドメインから独立 しており、このことから、これらBsIgG'sが抗体-依存細胞-介在細胞毒性におい て機能するといえる。 本発明は、最も実践的、且つ好適な実施態様であるとして考慮される何れかに おいてここに示され且つ記載される。それは、しかしながら、発展は本発明の範 囲内から作製できること、及び自明な修正がこの開示を熟読した当業者に生起す ることが認識される。ここに用いた全ての参考文献はそれの全体において参考に よってここに組込まれる。 特許請求の範囲 １． 第１のポリペプチドと少なくとも１の付加ポリペプチドとを含む多重特異 性抗体の製造方法であって、ここで （ａ）該第１のポリペプチドは、該付加ポリペプチドのマルチマー化ドメイ ンの界面と相互作用するように位置付けられる界面を形成するマルチマー化ドメ インを含み、 （ｂ）該第１の及び付加ポリペプチドは、それぞれ結合ドメインを含み、該 結合ドメインは、軽鎖と重鎖を含み、該第１の及び付加ポリペプチドの可変軽鎖 は共通配列を含み、該方法は： （ｉ）該第１のポリペプチドと付加ポリペプチド、及び可変軽鎖をコー ドしている核酸を含む宿主細胞を培養すること、該培養は該核酸が発現されるよ うになされる；及び （ｉｉ）該宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収すること、 を含む、多重特異性抗体の製造方法。 ２． 該第１のポリペプチドをコードしている核酸、該付加ポリペプチドをコー ドしている核酸、又は両方が、該界面又はその部分をコードするように本来の核 酸から変更されている、請求項１記載の方法。 ３． 該第１のポリペプチド又は付加ポリペプチドの一方又は両方のマルチマー 化ドメインが、該第１のポリペプチドと付加ポリペプチドとの間にジスルフィド 結合が形成されるように、該第１のポリペプチド又は付加ポリペプチドの他方の 界面のフリーのチオール含有残基と相互作用するように位置付けられたフリーの チオール含有残基を含むように変更され、該第１のポリペプチドをコードしてい る核酸がフリーのチオール含有残基をコードするように本来の核酸から変更され るか、付加ポリペプチドをコードしている核酸がフリーのチオール含有残基をコ ードするように本来の核酸から変更されるか、あるいはこれらの両方である、請 求項２記載の方法。 ４． 該第１のポリペプチド及び付加ポリペプチドのマルチマー化ドメインが空 洞への隆起相互作用を含み、該方法がさらに： 本来の残基よりも大きな側鎖容量を有する移入残基をコードするように該第 １のポリペプチドをコードしている本来の核酸を変更することによって隆起を生 成すること、および 本来の残基よりも小さい側鎖容量を有する移入残基をコードするように該付 加ポリペプチドをコードしている本来の核酸を変更することによって空洞を生成 すること、を含む請求項１記載の方法。 ５． 隆起を生成する工程、または空洞を生成する工程、もしくはこれらの両方 の工程が、ファージディスプレー選択によって生起する請求項４記載の方法。 ６． 本来の残基より大きな側鎖容量を有する移入残基が、アルギニン(Ｒ)、フ ェニルアラニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、トリプトファン(Ｗ)、イソロイシン(Ｉ)及 びロイシン(Ｌ)からなる群から選択される、請求項４記載の方法。 ７． 本来の残基より小さい側鎖容量を有する移入残基が、グリシン(Ｇ)、アラ ニン(Ａ)、セリン(Ｓ)、トレオニン(Ｔ)及びバリン(Ｖ／)からなる群から選択さ れ、且つ移入残基がシステイン(Ｃ)ではない、請求項４記載の方法。 ８． 該第１の及び付加ポリペプチドがそれぞれ抗体定常ドメインを含む請求項 １記載の方法。 ９． 該第１のポリペプチド及び付加ポリペプチドがそれぞれ、Ｃ_H３ドメイン とＩｇＧからなる群から選択される抗体定常ドメインを含む請求項８記載の方法 。 １０． 多重特異性抗体が免疫付着因子である請求項１記載の方法。 １１． 工程（ｉ）の前に、該第１のポリペプチド及び付加ポリペプチドをコー ドしている核酸が宿主細胞内に導入される工程を含む請求項１記載の方法。 １２． 請求項１記載の方法によって製造された多重特異性抗体。 １３． 界面で接する第１のポリペプチドと少なくとも１の付加ポリペプチドを 含み、 （ａ）該第１のポリペプチドは、該付加ポリペプチドのマルチマー化ドメイ ンの界面と相互作用するように位置する界面を形成するマルチマー化ドメインを 含み、 （ｂ）該第１のポリペプチド及び付加ポリペプチドは、それぞれ結合ドメイ ンを含み、該結合ドメインは、可変重鎖と可変軽鎖を含み、該第１のポリペプチ ド及び付加ポリペプチドの可変軽鎖が共通配列を含む、多重特異性抗体。 １４． 該第１のポリペプチドをコードしている核酸、または該付加ポリペプチ ドをコードしている核酸、もしくはこれらの両方の核酸が、前記界面又はその一 部をコードするように本来の核酸から変更された、請求項１３記載の多重特異性 抗体。 １５． 該第１のポリペプチド界面が、該第１のポリペプチドと付加ポリペプチ ドとの間にジスルフィド結合を形成するように該付加ポリペプチドの界面のフリ ーのチオール含有残基と相互作用するように位置したフリーのチオール含有残基 を含み、該第１のポリペプチドをコードしている核酸がフリーのチオール含有残 基をコードするように本来の核酸から変更されているか、又は該付加ポリペプチ ドをコードしている核酸がフリーのチオール含有残基をコードするように本来の 核酸から変更されているか、あるいはこれらの両方である、請求項１４記載の多 重特異性抗体。 １６． 該第１のポリペプチド及び付加ポリペプチドのマルチマー化ドメインの 界面が、それぞれ隆起と空洞を含む請求項１４記載の多重特異性抗体。 １７． 該隆起と空洞が、天然存在アミノ酸が該第１のポリペプチド及び付加ポ リペプチド内に移入される変更によって生成される請求項１６記載の多重特異性 抗体。 １８． 請求項１３記載の多重特異性抗体と担体とを含んでいる組成物。 １９．請求項１３記載の多重特異性抗体をコードしている核酸を含む宿主細胞。 ２０． 宿主細胞が哺乳動物細胞である請求項１９記載の宿主細胞。 ２１． （ａ）付加ポリペプチド上のアミノ酸残基と置換される第１のポリペプ チドの界面のアミノ酸残基を含む第１のポリペプチドをコードしている第１の核 酸を選択すること、及び付加ポリペプチド上のアミノ酸残基が該第１のポリペプ チド上のアミノ酸残基と特異的に相互作用するような、少なくとも１の付加ポリ ペプチドをコードしている少なくとも１の付加核酸を選択すること、それによっ て該第１のポリペプチドと付加ポリペプチドとの間に安定な相互作用を生成する こと； （ｂ）軽鎖をコードする核酸配列を選択すること、ここで該軽鎖は多重 特異性抗体の第１の及び付加ポリペプチドのそれぞれの結合領域と結合する； （ｃ）該第１の核酸及び付加核酸及び軽鎖をコードする核酸を宿主細胞 中に導入すること、及び該第１の核酸及び付加核酸、並びに該軽鎖をコードする 核酸の発現が二重特異性抗体の形成を生じるように該細胞を培養すること； （ｄ）該細胞の培養物から多重特異性抗体を回収すること、 を含む多重特異性抗体の製造方法。 ２２． 工程(ａ)の第１の核酸及び付加核酸の少なくとも一方が、第１のアミノ 酸残基又は付加アミノ酸残基のアミノ酸と相互作用して、安定な相互作用を生じ る界面のアミノ酸をコードするように本来の核酸から変更される、請求項２１記 載の方法。 ２３． 該変更が、該第１のポリペプチドと付加ポリペプチドとの間の界面で空 洞への隆起相互作用を生成することを含む請求項２２記載の方法。 ２４． 該変更が、フリーのチオール含有残基が相互作用して該第１のポリペプ チドと付加ポリペプチドとの間にジスルフィド結合を形成するように、第１のポ リペプチド又は付加ポリペプチド又はこれらの両方にフリーのチオール含有残基 を移入することを含む請求項２２記載の方法。 ２５． 第１のポリペプチド及び付加ポリペプチドのそれぞれが抗体定常ドメイ ンを含む請求項２１記載の方法。 ２６． 抗体定常ドメインがＣ_H３ドメインである請求項２５記載の方法。 ２７． 抗体定常ドメインがヒトＩｇＧである請求項２６記載の方法。 ２８． ポリペプチドの混合物から第１のポリペプチド及び少なくとも１の付加 ポリペプチドを含んでいるヘテロマルチマーの多重特異性抗体の形成を測定する 方法であり、 （ａ）該第１のポリペプチド及び付加ポリペプチドは、該第１のポリペプチ ド及び付加ポリペプチドのそれぞれのマルチマー化ドメインの界面で接し、 （ｂ）該第１のポリペプチドの界面は、ジスルフィド結合が形成されるよう に該付加ポリペプチドの界面のフリーのチオール含有残基と相互作用するように 位置づけられるフリーのチオール含有残基を含み、該方法は： （ｉ）各多重特異性抗体をゲルマトリックス中で移動させる工程；及び （ｉｉ）第１のポリペプチドと付加ポリペプチドとの間に非天然存在ジ スルフィド結合を有する多重特異性抗体に対応するバンドと、第１のポリペプチ ドと付加ポリペプチドとの間に非天然存在ジスルフィド結合を欠いているヘテロ マルチマーに対応した遅く移動するバンドの相対量を測定する工程 を含む方法。 ２９． 該マルチマー化ドメインが、その界面で空洞への隆起相互作用をコード し、それによって該第１のポリペプチドと付加ポリペプチドとの間の特異的相互 作用を促進する、請求項２８記載の方法。 ３０． 多重特異性抗体が、抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３及び抗-Ｍｐ１／抗-ＨＥ Ｒ３からなる群から選択される請求項１記載の方法。 ３１． 抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３及び抗-Ｍｐ１／抗-ＨＥＲ３からなる群から 選択される請求項１３記載の多重特異性抗体。 ３２． 多重特異性抗体が、抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３及び抗-Ｍｐ１／抗-ＨＥ Ｒ３からなる群から選択される請求項１９記載の宿主細胞。 ３３． 多重特異性抗体が、抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３及び抗-Ｍｐ１／抗-ＨＥ Ｒ３からなる群から選択される請求項１８記載の組成物。 【手続補正書】 【提出日】平成１２年１月７日（２０００．１．７） 【補正内容】 （１）明細書の第８８頁の表５の全体を、別紙の表５に補正する。 （２）明細書の第１０４頁下から第６行〜第１０５頁下から第４行に「（２）配 列番号：２３の情報：……（２）配列番号：２５の情報：」とあるのを、以下の 通り補正する。 「（２）配列番号：２３の情報： (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：１２２アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直鎖状 (xi)配列の詳細：配列番号：２３（２）配列番号：２４の情報： (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：１２３アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直鎖状 (xi)配列の詳細：配列番号：２４ （２）配列番号：２５の情報：」【手続補正書】 【提出日】平成１３年２月２３日（２００１．２．２３） 【補正内容】 特許請求の範囲 １． 少なくとも２つの異なる結合ドメインを含む多重特異性抗体の製造方法で あり、ここで、 第１の結合ドメインは第１の分子に結合し且つ第２の結合ドメインは第２の分 子に結合し、 それぞれの結合ドメインは、（ｉ）マルチマー化ドメインをさらに含むポリペ プチドの一部である重鎖可変ドメイン及び（ｉｉ）軽鎖の可変ドメインを含み、 該第１の結合ドメインは、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変ドメインを含 み、該第２の結合ドメインは、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変ドメインを 含み、且つ該第１及び第２の重鎖可変ドメインは異なり、及び 該ポリペプチドは上記マルチマー化ドメインの相互作用によってマルチマー化 され、 及びここで、 それぞれの軽鎖可変ドメインは同じであるか、 または該多重特異性抗体が第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメイン を含み、該第１及び第２の軽鎖可変ドメインは互いに異なり、且つ上記第１の結 合ドメインは、第１の軽鎖可変ドメイン又は第２の軽鎖可変ドメインを含み上記 第１の分子に結合し、及び上記第２の結合ドメインは、第２の軽鎖可変ドメイン 又は第１の軽鎖可変ドメインを含み上記第２の分子に結合し、 工程： （ｉ）上記ポリペプチドと軽鎖をコードしている核酸を含む宿主細胞を培養す ること、ただし該培養は該核酸が発現され且つ該ポリペプチドと軽鎖が生産され るものであり；且つ （ｉｉ）該宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収すること、 を含む方法。 ２． 上記第１のポリペプチドのマルチマー化ドメインをコードしている核酸又 は上記第２のポリペプチドのマルチマー化ドメインをコードしている核酸、又は 両方が、コードされたアミノ酸配列を変更するような核酸の変更により提供され る請求項１記載の方法。 ３． 上記第１のポリペプチド、上記第２のポリペプチド、又は両方のマルチマ ー化ドメインをコードしている核酸が、上記第１又は第２のポリペプチドのそれ ぞれの該マルチマー化ドメインが、上記第１又は第２のポリペプチドの他方のマ ルチマー化ドメインのフリーのチオール含有残基とジスルフィド結合を形成する フリーのチオール含有残基を含むように変更される請求項２記載の方法。 ４． 上記ポリペプチドのマルチマー化が、空洞への隆起相互作用を含み、該方 法は工程（ｉ）の前に： より大きな側鎖容量を有する移入残基でアミノ酸残基を置換することによって コードされたポリペプチドのマルチマー化ドメイン中に隆起を生成するように核 酸を置換することによって該第１のポリペプチドをコードしている核酸を用意す ること、および より小さな側鎖容量を有する移入残基でアミノ酸残基を置換することによって コードされたポリペプチドのマルチマー化ドメイン中に空洞を生成するように核 酸を置換することによって該第２のポリペプチドをコードしている核酸を用意す ること、をさらに含む請求項１記載の方法。 ５． ファージディスプレー選択によって、隆起を有するマルチマー化ドメイン を含む第１のポリペプチド、空洞を有するマルチマー化ドメインを 含む第２のポリペプチド、又は両方をコードする核酸を準備する請求項４記載の 方法。 ６． より大きな側鎖容量を有する移入残基が、アルギニン(Ｒ)、フェニルアラ ニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、トリプトファン(Ｗ)、イソロイシン(Ｉ)及びロイシン (Ｌ)からなる群から選択される、請求項４記載の方法。 ７． より小さい側鎖容量を有する移入残基が、グリシン(Ｇ)、アラニン(Ａ)、 セリン(Ｓ)、トレオニン(Ｔ)及びバリン(Ｖ)からなる群から選択され、且つ該移 入残基がシステイン(Ｃ)ではない、請求項４記載の方法。 ８． 該第１及び第２のポリペプチドがそれぞれ抗体定常ドメインを含む請求項 １記載の方法。 ９． 該第１及び第２のポリペプチドがそれぞれ、Ｃ_H３ドメインとＩｇＧ定常 ドメインからなる群から選択される抗体定常ドメインを含む請求項８記載の方法 。 １０． 該多重特異性抗体が免疫付着因子である請求項１記載の方法。 １１． 工程（ｉ）に先行する工程をさらに含み、ここで上記核酸が宿主細胞内 に導入される請求項１記載の方法。 １２． それぞれの軽鎖可変ドメインが同一である請求項１記載の方法。 １３． 該多重特異性抗体が第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメイン を含み、且つ該第１及び第２の軽鎖可変ドメインが互いに異なるが、しかし少な くとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する請求項１記載の 方法。 １４． 該第１及び第２の軽鎖可変ドメインが少なくとも９０％のアミノ酸配列 同一性を有する請求項１３記載の方法。 １５． 該第１及び第２の軽鎖可変ドメインが少なくとも９５％のアミノ酸配列 同一性を有する請求項１４記載の方法。 １６． 請求項１記載の方法によって製造された多重特異性抗体。 １７． 少なくとも２の異なる結合ドメインを含む多重特異性抗体であり、ここ で 第１の結合ドメインは第１の分子に結合し且つ第２の結合ドメインは第２の分 子に結合し、 それぞれの結合ドメインは、（ｉ）マルチマー化ドメインをさらに含むポリペ プチドの一部である重鎖可変ドメイン及び（ｉｉ）軽鎖の可変ドメインを含み、 該第１の結合ドメインは、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変ドメインを含 み、該第２の結合ドメインは、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変ドメインを 含み、且つ該第１及び第２の重鎖可変ドメインは異なり、及び 該ポリペプチドは上記マルチマー化ドメインの相互作用によってマルチマー化 され、 及びここで、 それぞれの軽鎖可変ドメインは同じであるか、 または該多重特異性抗体が第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメイン を含み、該第１及び第２の軽鎖可変ドメインは互いに異なり、且つ上記第１の結 合ドメインは、第１の軽鎖可変ドメイン又は第２の軽鎖可変 ドメインを含み上記第１の分子に結合し、及び上記第２の結合ドメインは、第２ の軽鎖可変ドメイン又は第１の軽鎖可変ドメインを含み上記第２の分子に結合す る、多重特異性抗体。 １８． 該第１のポリペプチドのマルチマー化ドメイン又は該第２のポリペプチ ドのマルチマー化ドメイン、又は両方が、アミノ酸の変更により提供される請求 項１７記載の多重特異性抗体。 １９． 上記第１又は第２のポリペプチドのそれぞれのマルチマー化ドメインが 、上記第１又は第２のポリペプチドの他方のマルチマー化ドメインのフリーのチ オール含有残基とジスルフィド結合を形成するフリーのチオール含有残基を含む 請求項１８記載の多重特異性抗体。 ２０． 上記ポリペプチドのマルチマー化が、空洞への隆起相互作用を含み且つ 該第１のポリペプチドのマルチマー化ドメインが隆起を含み且つ第２のポリペプ チドのマルチマー化ドメインが空洞を含む請求項１８記載の多重特異性抗体。 ２１． 該隆起と空洞が、天然存在アミノ酸が該第１及び第２のポリペプチド中 に移入される置換によって生成される請求項２０記載の多重特異性抗体。 ２２． 各々の軽鎖可変ドメインが同じである請求項１７記載の多重特異性抗体 。 ２３． 該多重特異性抗体が第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメイン とを含み、該第１及び第２の軽鎖可変ドメインが互いに相違するが、しかし少な くとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する請求項１７記載 の多重特異性抗体。 ２４． 該第１及び第２の軽鎖可変ドメインが少なくとも９０％のアミノ酸配列 同一性を有する請求項２３記載の多重特異性抗体。 ２５． 該第１及び第２の軽鎖可変ドメインが少なくとも９５％のアミノ酸配列 同一性を有する請求項２４記載の多重特異性抗体。 ２６． 請求項１７記載の多重特異性抗体とキャリアとを含んでいる組成物。 ２７． 請求項１７記載の多重特異性抗体をコードしている核酸を含む宿主細胞 。 ２８． 宿主細胞が哺乳動物細胞である請求項２７記載の宿主細胞。 ２９． 第１の分子に結合する第１の結合ドメインと第２の分子に結合する第２ の結合ドメインを含む多重特異性抗体の製造方法であり： （ａ）第１の重鎖可変ドメインとマルチマー化ドメインを含む第１のポリペプ チドをコードしている第１の核酸を選択すること、及び第２の重鎖可変ドメイン とマルチマー化ドメインを含む第２のポリペプチドをコードしている第２の核酸 を選択すること、ここで該第１及び第２の重鎖可変ドメインは異なっており、且 つ上記第１及び第２のポリペプチドのそれぞれのマルチマー化ドメインは、上記 第１及び第２のポリペプチドの他方のマルチマー化ドメインのアミノ酸残基と特 異的に相互作用するアミノ酸残基を含み、それによって該第１及び第２のポリペ プチド間に安定な相互作用を生成する； （ｂ）（ｉ）１つの可変軽鎖をコードしている核酸を選択すること、こ こで該可変軽鎖は、第１及び第２のポリペプチドのそれぞれと相互作用して、上 記第１及び第２の結合ドメインを形成する、又は （ｉｉ）第１の可変軽鎖-コード化核酸と第２の可変軽鎖-コード化核酸 を選択すること、ここで該第１及び第２の可変軽鎖は互いに異なり、該第１及び 第２の可変軽鎖のそれぞれは、該第１及び第２のポリペプチドの一方と相互作用 して、上記第１及び第２の結合ドメインを形成し、且つ上記第１の結合ドメイン は、該第１の可変軽鎖と該第１のポリペプチドの相互作用又は該第２の可変軽鎖 と該第１のポリペプチドの相互作用によって形成され、上記第１の分子に結合し 、且つ上記第２の結合ドメインは、該第２の可変軽鎖と該第２のポリペプチドの 相互作用又は該第１の可変軽鎖と該第２のポリペプチドの相互作用によって形成 され、上記第２の分子に結合する、のいずれか一方： （ｃ）該第１及び第２のポリペプチドと該可変軽鎖をコードしている核酸を宿 主細胞中に導入すること、及び該細胞を、該核酸の発現が生じ且つコードされた ポリペプチドと可変軽鎖が生産されるように培養すること； （ｄ）該細胞培養物から多重特異性抗体を回収すること、 を含む方法。 ３０． 該第１のポリペプチドをコードしている上記第１の核酸、該第２のポリ ペプチドをコードしている上記第２の核酸、又は両方が、コードされたアミノ酸 配列を変更するように変えられた核酸から選択される請求項２９記載の方法。 ３１． 該第１及び第２のポリペプチドが、空洞への隆起相互作用によって相互 作用する請求項３０記載の方法。 ３２． 核酸が、そのコードされたアミノ酸配列中にフリーのチオール含 有残基を移入するように変更される請求項３０記載の方法。 ３３． 該第１及び第２のポリペプチドが抗体定常ドメインをそれぞれ含む請求 項２９記載の方法。 ３４． 抗体定常ドメインがＣ_H３ドメインである請求項３３記載の方法。 ３５． 抗体定常ドメインがヒトＩｇＧからのものである請求項３３記載の方法 。 ３６． 核酸が（ｉ）に従って選択される請求項２９記載の方法。 ３７． 核酸が（ｉｉ）に従って選択される請求項２９記載の方法。 ３８． 該第１及び第２の可変軽鎖が互いに異なるが、しかし少なくとも８０％ のアミノ酸配列同一性を有する請求項３７記載の方法。 ３９． 該第１及び第２の可変軽鎖が少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を 有する請求項３８記載の方法。 ４０． 該第１及び第２の可変軽鎖が少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を 有する請求項３９記載の方法。 ４１． ポリペプチドの混合物からヘテロマルチマー多重特異性抗体の形成を測 定する方法であり、ここで該多重特異性抗体は少なくとも２の結合ドメインを含 み、ここで 第１の結合ドメインは第１の分子に結合し且つ第２の結合ドメインは第 ２の分子に結合し、 それぞれの結合ドメインは、（ｉ）マルチマー化ドメインをさらに含むポリペ プチドの一部である重鎖可変ドメイン及び（ｉｉ）軽鎖の可変ドメインを含み、 該第１の結合ドメインは、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変ドメインを含 み、該第２の結合ドメインは、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変ドメインを 含み、且つ該第１及び第２の重鎖可変ドメインは異なり、及び 該ポリペプチドは上記マルチマー化ドメインの相互作用によってマルチマー化 され、ここで上記第１又は第２のポリペプチドのぞれぞれのマルチマー化ドメイ ンは、上記第１又は第２のポリペプチドの他方のマルチマー化ドメインのフリー のチオール含有残基とジスルフィド結合を形成するフリーのチオール含有残基を 含み、 及びここで、 それぞれの軽鎖可変ドメインは同じであるか、 または該多重特異性抗体が第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメイン を含み、該第１及び第２の軽鎖可変ドメインは互いに異なり、且つ上記第１の結 合ドメインは、第１の軽鎖可変ドメイン又は第２の軽鎖可変ドメインを含み上記 第１の分子に結合し、及び上記第２の結合ドメインは、第２の軽鎖可変ドメイン 又は第１の軽鎖可変ドメインを含み上記第２の分子に結合し、 工程： （ａ）それぞれの多重特異性抗体をゲルマトリックスにおいて移動させること ；及び （ｂ）該第１及び第２ポリペプチド間に非天然存在ジスルフィド結合を有する 多重特異性抗体に対応するバンドと、該第１及び第２のポリペプチド間に非天然 存在ジスルフィド結合を欠いているヘテロマルチマーに対応 する、遅く移動するバンドの相対量を測定すること、を含む方法。 ４２． 上記ポリペプチドのマルチマー化が、該マルチマー化ドメイン間の空洞 への隆起相互作用によって促進される請求項４１記載の方法。 ４３． それぞれの軽鎖可変ドメインが同じである請求項４１記載の方法。 ４４． 該第１及び第２の軽鎖可変ドメインが互いに異なるが、しかし少なくと も８０％のアミノ酸配列同一性を有する請求項４１記載の方法。 ４５． 該第１及び第２の軽鎖可変ドメインが少なくとも９０％のアミノ酸配列 同一性を有する請求項４４記載の方法。 ４６． 該第１及び第２の軽鎖可変ドメインが少なくとも９５％のアミノ酸配列 同一性を有する請求項４５記載の方法。 ４７． 該多重特異性抗体が、抗-ヒトレプチンレセプターＥＣＤ(Ｏｂ-Ｒ)／抗 -ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３及び抗-ヒトトロンボポイエチンレセ プターチロシンキナーゼ(Ｍｐ１)／抗-ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ ３からなる群から選択される請求項１記載の方法。 ４８． 抗-ヒトレプチンレセプターＥＣＤ(Ｏｂ-Ｒ)／抗-ヒトレセプターチロ シンキナーゼＨＥＲ３及び抗-ヒトトロンボポイエチンレセプターチロシンキナ ーゼ(Ｍｐ１)／抗-ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３からなる群から選 択される請求項１７記載の多重特異性抗体。 ４９． 請求項４８記載の多重特異性抗体と担体を含む組成物。 ５０． 該多重特異性抗体が、抗-ヒトレプチンレセプタ−ＥＣＤ(Ｏｂ-Ｒ)／抗 -ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３及び抗-ヒトトロンボポイエチンレセ プターチロシンキナーゼ(Ｍｐ１)／抗-ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ ３からなる群から選択される請求項２７記載の宿主細胞。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 マーチャント，アン エム アメリカ合衆国 カリフォルニア 94116 サン ブルノ クリスタル スプリング ス ロード 2000 アパートメント １― 31 (72)発明者 プレスタ，レオナード ジー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94109 サン フランシスコ ゴフ ストリート 1900 ナンバー 206

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 第１のポリペプチドと少なくとも１の付加ペプチドを含む多重特異性抗体 の製造方法であって、ここで （ａ）該第１のポリペプチドは、該付加ポリペプチドのマルチマー化ドメイ ンの界面と相互作用するように位置付けられる界面を形成するマルチマー化ドメ インを含み、 （ｂ）該第１の及び付加ポリペプチドは、それぞれ結合ドメインを含み、該 結合ドメインは、軽鎖と重鎖を含み、該第１の及び付加ポリペプチドの可変の軽 鎖は共通の配列を含み、該方法は： （ｉ）該第１のポリペプチドと付加ポリペプチド、及び可変の軽鎖をコ ードしている核酸を含む宿主細胞を培養すること、該培養は該核酸が発現される ようになされる；及び （ｉｉ）該宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収すること、 を含む、多重特異性抗体の製造方法。 ２． 該第１のポリペプチドをコードしている核酸、該付加ポリペプチドをコー ドしている核酸、又は両方が、該界面又はその部分をコードする本来の核酸から 変更されている、請求項１記載の方法。 ３． 該第１の又は付加ポリペプチドの一方又は両方のマルチマー化ドメインが 、ジスルフィド結合が該第１の又は付加ポリペプチドの間に形成されるように該 第１の又は付加ペプチドの他方の界面の遊離チオール含有残基とが相互作用する ように位置付けられる遊離チオール含有残基を含むように変更され、該第１のポ リペプチドをコードしている核酸が遊離チオール含有残基をコードするように本 来の核酸から変えられているか又は付加ポリペプチドをコードしている核酸が遊 離チオール含有残基をコードするように本来の核酸から変更され、又は両方であ る、請求項２記載の方法。 ４． 該第１の及び付加ポリペプチドのマルチマー化ドメインが空洞への隆起相 互作用を含み、該方法がさらに： 本来の残基よりも大きな側鎖容量を有する移入残基をコードするように該第 １のポリペプチドをコードしている本来の核酸を変更することによって隆起を生 成すること、および 本来の残基よりも小さい側鎖容量を有する移入残基をコードするように該付 加ポリペプチドをコードしている本来の核酸を変更することによって空洞を生成 すること、を含む請求項１記載の方法。 ５． 隆起を生成する及び空洞を生成する工程、又は両方が、ファージディスプ レー選択によって生起する請求項４記載の方法。 ６． 本来の残基より大きな側鎖容量を有する移入残基が、アルギニン(Ｒ)、フ ェニルアラニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、トリプトファン(Ｗ)、イソロイシン(Ｉ)及 びロイシン(Ｌ)からなる群から選択される、請求項４記載の方法。 ７． 本来の残基より小さい側鎖容量を有する移入残基が、グリシン(Ｇ)、アラ ニン(Ａ)、セリン(Ｓ)、トレオニン(Ｔ)及びバリン(Ｖ)からなる群から選択され 、且つ移入残基がシステイン(Ｃ)ではない、請求項４記載の方法。 ８． 該第１の及び付加ポリペプチドがそれぞれ抗体定常ドメインを含む請求項 １記載の方法。 ９． 該第１の及び付加ポリペプチドがそれぞれ、Ｃ_H３ドメインとＩｇＧから なる群から選択される抗体定常ドメインを含む請求項８記載の方法。 １０． 多重特異性抗体が免疫付着因子である請求項１記載の方法。 １１． 工程（ｉ）が、該第１の及び付加ポリペプチドをコードしている核酸が 宿主細胞内に導入される工程によって先行される請求項１記載の方法。 １２． 請求項１記載の方法によって製造された多重特異性抗体。 １３． 界面で会合する第１のポリペプチドと少なくとも１の付加ポリペプチド を含み、 （ａ）該第１のポリペプチドは、該付加ポリペプチドのマルチマー化ドメイ ンの界面と相互作用するように位置した界面を形成するマルチマー化ドメインを 含み、 （ｂ）該第１の及び付加ポリペプチドは、それぞれ結合ドメインを含み、該 結合ドメインは、軽鎖と重鎖を含み、該第１の及び付加ポリペプチドの可変の軽 鎖は共通の配列を含む、多重特異性抗体。 １４． 該第１のポリペプチドをコードしている核酸、該付加ポリペプチドをコ ードしている核酸、又は両方が、界面又はその部分をコードする本来の核酸から 変更される、請求項１３記載の多重特異性抗体。 １５． 該第１のポリペプチド界面が、該第１の及び付加ポリペプチド間にジス ルフィド結合を形成するように該付加ポリペプチドの界面の遊離チオール含有残 基と相互作用するように位置した遊離チオール含有残基を含み、該第１のポリペ プチドをコードしている核酸が遊離チオール含有残基をコードするように本来の 核酸から変更され、又は該付加ポリペプチドをコードしている核酸が遊離チオー ル含有残基をコードするように本来の核酸から変更され、又は両方である、請求 項１４記載の多重特異性抗体。 １６． 該第１の及び付加ポリペプチドのマルチマー化ドメインの界面が、それ ぞれ隆起と空洞を含む請求項１４記載の多重特異性抗体。 １７． 該隆起と空洞が、天然存在アミノ酸が該第１の及び付加ポリペプチド内 に移入される置換によって生成される請求項１６記載の多重特異性抗体。 １８． 請求項１３記載の多重特異性抗体と担体とを含んでいる組成物。 １９．請求項１３記載の多重特異性抗体をコードしている核酸を含む宿主細胞。 ２０． 宿主細胞が哺乳動物細胞である請求項１９記載の宿主細胞。 ２１． （ａ）付加ポリペプチド上のアミノ酸残基と置換される第１のポリペプ チドの界面中のアミノ酸残基を含む第１のポリペプチドをコードしている第１の 核酸を選択すること、及び付加ポリペプチド上のアミノ酸残基が該第１のポリペ プチド上のアミノ酸残基と特異的に相互作用するような少なくとも１の付加アミ ノ酸をコードしている少なくとも１の付加核酸を選択すること、それによって該 第１の及び付加ポリペプチド間に安定な相互作用を生成すること； （ｂ）核酸配列をコードしている軽鎖を選択すること、該軽鎖は多重特 異性抗体の第１の及び付加ポリペプチドのそれぞれの結合領域との結合を生じさ せる； （ｃ）該第１の及び付加核酸及び軽鎖-コード化核酸を宿主細胞中に導 入すること、及び該第１の及び付加核酸の発現と、該軽鎖-コード化核酸が二重 特異性抗体の形成を生じるように該細胞を培養すること； （ｄ）該細胞の培養物から多重特異性抗体を回収すること、 を含む多重特異性抗体の製造方法。 ２２． 工程(ａ)の少なくとも１の第１の及び付加核酸が、該第１の又は付加ア ミノ酸のアミノ酸と相互作用する界面中のアミノ酸をコードするように本来の核 酸から変更され、それによって安定な相互作用を生成する請求項２１記載の方法 。 ２３． 該変更が、該第１の及び付加ポリペプチド間の界面で空洞への隆起相互 作用を生成することを含む請求項２２記載の方法。 ２４． 該変更が、遊離チオール含有残基が該第１の及び付加ポリペプチド間に ジスルフィド結合を形成する相互作用をするように、第１の又は付加ポリペプチ ド又は両方の中に遊離チオール含有残基を移入することを含む請求項２２記載の 方法。 ２５． 第１の及び付加ポリペプチドのそれぞれが抗体定常ドメインを含む請求 項２１記載の方法。 ２６． 抗体定常ドメインがＣ_H３ドメインである請求項２５記載の方法。 ２７． 抗体定常ドメインがヒトＩｇＧである請求項２６記載の方法。 ２８． ポリペプチドの混合物から第１の及び少なくとも１の付加ポリペプチド を含んでいるヘテロマルチマーの多重特異性抗体の形成を測定する方法であり、 （ａ）該第１の及び付加ポリペプチドは、該第１の及び付加ポリペプチドの それぞれのマルチマー化ドメインの界面で会合する、 （ｂ）該第１のポリペプチドの界面は、ジスルフィド結合が形成されるよう に該付加ポリペプチドの界面の遊離チオール含有残基と相互作用するように配さ れる遊離チオール含有残基を含み、該方法は： （ｉ）ゲルマトリックス中に移動するようそれぞれの多重特異性抗体を 生じさせること；及び （ｉｉ）第１の及び付加ポリペプチド間に非天然存在ジスルフィド結合 を有する多特異的抗体に一致するバンドの相対量を測定すること、及び第１の及 び付加ポリペプチド間に非天然存在ジスルフィド結合を欠いているヘテロマルチ マーに一致するバンドを緩やかに移動することを含む方法。 ２９． 該マルチマー化ドメインが、その界面で空洞への隆起相互作用をコード し、それによって該第１の及び付加ポリペプチド間の特異的相互作用を促進する 、請求項２８記載の方法。 ３０． 多重特異性抗体が、抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３及び抗-Ｍｐ１／抗-ＨＥ Ｒ３からなる群から選択される請求項１記載の方法。 ３１． 抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３及び抗-Ｍｐ１／抗-ＨＥＲ３からなる群から 選択される請求項１３記載の多重特異性抗体。 ３２． 多重特異性抗体が、抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３及び抗-Ｍｐ１／抗-ＨＥ Ｒ３からなる群から選択される請求項１９記載の宿主細胞。 ３３． 多重特異性抗体が、抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３及び抗-Ｍｐ１／抗-ＨＥ Ｒ３からなる群から選択される請求項１８記載の組成物。