KR20230068415A - 유전자 녹아웃을 갖는 포유류 세포주 - Google Patents
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Abstract
이종성 폴리펩티드를 발현하는 재조합 포유류 세포를 생성하기 위한 방법 및 상기 재조합 포유류 세포를 이용하여 이종성 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법이 본원에서 보고되는데, 여기서 상기 재조합 세포에서 적어도 내인성 유전자 MYC의 발현이 감소되었다. 포유류 세포, 예를 들면 예컨대 CHO 세포에서 적어도 내인성 유전자 MYC의 녹아웃은 이들 세포에 의한 재조합 생산성을 향상시키는 것으로 밝혀졌다.
Description
본원 발명은 치료적 폴리펩티드, 예컨대 치료 항체의 재조합 생산을 위한 세포주 개발의 분야이다. 더 상세하게는, 향상된 발현 특징을 유발하는, 적어도 하나의 내인성 유전자의 기능적 녹아웃을 갖는 포유류 세포가 본원에서 보고된다.
배경
포유류 숙주 세포주, 특히 CHO 및 HEK 세포주가 분비된 단백질, 예컨대 공급 단백질 (예를 들면 항원, 수용체 등) 및 치료 분자 (예를 들면 항체, 사이토킨 등)의 재조합 생산에 이용된다. 이들 숙주 세포주는 상응하는 치료 분자를 인코딩하는 발현 카세트를 포함하는 벡터로 형질감염된다. 차후에, 선택 압력을 적용함으로써 안정된 형질감염체가 선택된다. 이것은 개별 클론으로 구성되는 세포 풀을 유발한다. 단일 세포 클로닝 단계에서, 이들 클론은 단리되고, 그리고 차후에 상위 생산자 세포를 확인하기 위해 상이한 검정으로 선별검사된다.
숙주 세포주의 특징, 예컨대 (i) 단백질 접힘과 분비를 향상시키기 위한 접히지 않은 단백질 반응 경로에 관련된 내인성 단백질의 과다발현 (Gulis, G., et al., BMC biotechnology, 14 (2014) 26), (ii) 세포 생존력을 향상시키고 발효 과정을 연장하기 위한 항아폽토시스성 단백질의 과다발현 (Lee, J. S., et al., Biotechnol. Bioeng. 110 (2013) 2195-2207), (iii) 세포 성장과 생산성을 향상시키기 위한 miRNA 및/또는 shRNA 분자의 과다발현 (Fischer, S., et al., J. Biotechnol. 212 (2015) 32-43), (iv) 치료 분자의 글리코실화 패턴을 조정하기 위한 해당효소의 과다발현 (Ferrara, C., et al., Biotechnol. Bioeng. 93 (2006) 851-861), 그리고 많은 다른 것들 (Fischer, S., et al., Biotechnol. Adv. 33 (2015) 1878-1896)을 향상시키기 위해, 유전공학 접근법이 이들 세포주에 적용되었다.
이에 더하여, 내인성 단백질의 녹아웃은 세포 특징을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 실례는 (i) 증가된 아폽토시스 내성을 야기하는 BAX/BAK 단백질의 녹아웃 (Cost, G. J., et al., Biotechnol. Bioeng. 105 (2010) 330-340), (ii) 비푸코실화된 단백질을 생산하기 위한 PUTS의 녹아웃 (Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotechnol. Bioeng. 87 (2004) 614-622), (iii) GS 선택 시스템을 이용한 선택 효율을 증가시키기 위한 GS의 녹아웃 (Fan, L., et al., Biotechnol. Bioeng. 109 (2012) 1007-1015), 그리고 많은 다른 것들 (Fischer, S., et al., Biotechnol. Adv. 33 (2015) 1878-1896)이다. 과거에는 아연 핑거 또는 TALEN 단백질이 주로 이용되었지만, 녹아웃 목적을 위한 유전체 서열의 다능하고 단순한 표적화를 위해 CRISPR/Cas9가 최근에 확립되었다. 예를 들면, 서열 절제를 실시가능하게 하는 복수의 gRNA를 이용함으로써, CRISPR/Cas9를 이용하여 CHO 세포에서 miRNA-744가 표적화되었다 (Raab, N., et al., Biotechnol. J. (2019) 1800477).
US 2007/160586은 세포의 복제 수명을 연장하기 위한 방법을 개시한다.
EP 3 308 778은 아르기닌 및 T 세포 조절인자로서 이의 용도를 개시한다.
Fischer, S., et al.은 CHO 세포에서 마이크로RNA-30 패밀리에 의한 증강된 단백질 생산이 유비퀴틴 경로의 조정에 의해 매개된다는 것을 개시한다 (J. Biotechnol. 212 (2015) 32-43).
생산성을 증가시키는 단일 내인성 유전자의 녹아웃이, 숙주 세포주에 도입되는 이의 단순함으로 인해 매우 요망된다.
발명의 요약
본원 발명에 따른 한 가지 독립된 양상은 이종성 폴리펩티드를 발현하는 재조합 포유류 세포를 생성하기 위한 방법 및 상기 재조합 포유류 세포를 이용하여 이종성 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법인데, 여기서 재조합 포유류 세포에서 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의, 다시 말하면 적어도 하나의 내인성 유전자(들)의 활성 또는 기능 또는 발현이 감소되거나 또는 제거되거나 또는 축소되거나 또는 (완전히) 녹아웃된다.
본원 발명은 포유류 세포, 예를 들면 예컨대 CHO 세포에서 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군으로부터 유전자 중에서 적어도 하나의 기능적 녹아웃이 특히 복합적 항체 형식의 재조합 생산성을 향상시킨다는 조사 결과에 적어도 부분적으로 기초된다.
본원 발명의 경우에 재조합 포유류 세포를 생성하는 단계의 순서는 결정적이지 않다, 다시 말하면 도입유전자가 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성된 군으로부터 유전자 중에서 적어도 하나의 기능적 녹아웃에 앞서 도입되거나, 또는 먼저 기능적 녹아웃이 달성되고, 그 후에 세포가 도입유전자로 형질감염되는지의 여부는 결정적이지 않다. 모든 양상과 구체예의 바람직한 구체예에서, 도입유전자, 다시 말하면 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 내인성 유전자의 기능적 녹아웃에 앞서 도입된다. 일정한 바람직한 구체예에서, 내인성 유전자는 MYC 유전자이다.
본원 발명의 한 가지 독립된 양상은 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 활성 또는/및 기능 또는/및 발현이 감소되거나 또는 제거되거나 또는 축소되거나 또는 (완전히) 녹아웃되는 포유류 세포이다. 일정한 바람직한 구체예에서, 내인성 유전자는 MYC 유전자이다.
본원 발명의 한 가지 독립된 양상은 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 발현이 감소된 포유류 세포이고, 그리고 여기서 상기 포유류는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 상기 적어도 하나의 내인성 유전자의 동일한 유전자형, 그러나 개별 내인성 유전자 발현을 갖고 동일한 조건하에 배양되는 세포와 비교하여 이종성 폴리펩티드에 대한 증가된 생산성을 갖는다. 일정한 바람직한 구체예에서, 내인성 유전자는 MYC 유전자이다.
본원 발명의 한 가지 독립된 양상은 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 동일한 유전자형, 그러나 내인성 유전자 발현을 갖는, 동일한 조건하에 배양된 세포와 비교하여, MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 상기 적어도 하나의 내인성 유전자의 감소된 발현을 갖고, 그리고 외인성 핵산, 다시 말하면 상기 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 도입유전자를 포함하는 재조합 포유류 세포의 이종성 폴리펩티드 역가를 증가시키기 위한 방법이다. 일정한 바람직한 구체예에서, 내인성 유전자는 MYC 유전자이다.
본원 발명의 한 가지 독립된 양상은 향상된 재조합 생산성을 갖는 재조합 포유류 세포를 생산하기 위한 방법인데, 여기서 상기 방법은
a) MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자를 표적으로 하는 뉴클레아제 보조 및/또는 핵산을 포유류 세포에 적용하여 상기 내인성 유전자의 활성을 감소시키는 단계 및
b) 상기 내인성 유전자의 활성이 감소된 포유류 세포를 선택하고,
그것에 의하여 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 상기 적어도 하나의 내인성 유전자의 동일한 유전자형, 그러나 내인성 유전자 발현을 갖는, 동일한 조건하에 배양된 세포와 비교하여 증가된 재조합 생산성을 갖는 재조합 포유류 세포를 생산하는 단계를 포함한다. 일정한 바람직한 구체예에서, 내인성 유전자는 MYC 유전자이다.
본원 발명의 한 가지 독립된 양상은 이종성 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법인데, 상기 방법은
a) 임의적으로 이종성 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에, 상기 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 데옥시리보핵산을 포함하는 재조합 포유류 세포를 배양하는 단계 및
b) 상기 이종성 폴리펩티드를 상기 세포 또는 배양 배지로부터 회수하는 단계를 포함하되,
여기서 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 활성 또는/및 기능 또는/및 발현이 상기 포유류 세포에서 감소되거나 또는 제거되거나 또는 축소되거나 또는 (완전히) 녹아웃된다. 일정한 바람직한 구체예에서, 내인성 유전자는 MYC 유전자이다.
본원 발명의 다른 독립된 양상은 향상된 및/또는 증가된 재조합 생산성을 갖는 재조합 포유류 세포를 생산하기 위한 방법인데, 여기서 상기 방법은
a) MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자를 표적으로 하는 핵산 또는 효소 또는 뉴클레아제 보조 유전자 표적화 시스템을 포유류 세포에 적용하여, 상기 내인성 유전자의 활성 또는/및 기능 또는/및 발현을 감소시키거나 또는 제거하거나 또는 축소하거나 또는 (완전히) 녹아웃시키는 단계 및
b) 상기 내인성 유전자의 활성 또는/및 기능 또는/및 발현이 감소되거나 또는 제거되거나 또는 축소되거나 또는 (완전히) 녹아웃된 포유류 세포를 선택하고,
그것에 의하여 향상된 및/또는 증가된 재조합 생산성을 갖는 재조합 포유류 세포를 생산하는 단계를 포함한다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 바람직한 구체예에서, 내인성 유전자는 MYC 유전자이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 의존성 구체예에서, 포유류 세포는 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 의존성 구체예에서, 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 상기 포유류 세포에서 기능적인 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되고 상기 포유류 세포에서 기능적인 폴리아데닐화 신호에 작동가능하게 연결된다. 일정한 구체예에서, 포유류 세포는 적합한 배양 조건하에 배양될 때 이종성 폴리펩티드를 분비한다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 의존성 구체예에서, MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 녹아웃은 이형접합 녹아웃 또는 동형접합 녹아웃이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 의존성 구체예에서, 녹아웃 세포주의 생산성은 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 상기 적어도 하나의 내인성 유전자의 동일한 유전자형, 그러나 완전히 기능적인 발현을 갖는 개별 포유류 세포와 비교하여 적어도 5 %, 바람직하게는 10 % 이상, 가장 바람직하게는 20 % 이상 증가된다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 의존성 구체예에서, MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 감소 또는 제거 또는 축소 또는 녹아웃은 뉴클레아제 보조 유전자 표적화 시스템에 의해 매개된다. 일정한 구체예에서, 뉴클레아제 보조 유전자 표적화 시스템은 CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1, 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN 및 메가뉴클레아제로 구성된 군에서 선택된다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 의존성 구체예에서, MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 발현의 감소는 RNA 침묵에 의해 매개된다. 일정한 구체예에서, RNA 침묵은 siRNA 유전자 표적화 및 녹다운, shRNA 유전자 표적화 및 녹다운, 그리고 miRNA 유전자 표적화 및 녹다운으로 구성된 군에서 선택된다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 의존성 구체예에서, MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 녹아웃은 i) 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산의 도입 전, 또는 ii) 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산의 도입 후 수행된다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 의존성 구체예에서, 이종성 폴리펩티드는 항체이다. 일정한 구체예에서, 항체는 두 개 이상의 상이한 결합 부위 및 임의적으로 도메인 교환을 포함하는 항체이다. 일정한 구체예에서, 항체는 3개 이상의 결합 부위 또는 VH/VL-쌍 또는 Fab 단편 및 임의적으로 도메인 교환을 포함한다. 일정한 구체예에서, 항체는 다중특이적 항체이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 의존성 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, CDK12, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1 및 SMAD3으로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38 및 CDK12로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC 및 STK11로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 의존성 구체예에서, 재조합 포유류 세포에서 내인성 SIRT-1 유전자, 그리고 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, CDK12, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1 및 SMAD3으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의, 다시 말하면 적어도 하나의 추가 내인성 유전자(들)의 활성 또는 기능 또는 발현이 감소되거나 또는 제거되거나 또는 축소되거나 또는 (완전히) 녹아웃된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 추가 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38 및 CDK12로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 추가 내인성 유전자는 MYC 및 STK11로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 추가 내인성 유전자는 MYC이다, 다시 말하면 내인성 SIRT-1 및 내인성 MYC 유전자의 활성 또는 기능 또는 발현이 감소되거나 또는 제거되거나 또는 축소되거나 또는 (완전히) 녹아웃된다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 의존성 구체예에서, 이종성 폴리펩티드는 다중특이적 항체를 포함하는 이종성 폴리펩티드 및 항체-다합체-융합 폴리펩티드의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 이종성 폴리펩티드는 아래와 같이 구성된 군에서 선택된다:
i) 첫 번째 Fab 단편 및 두 번째 Fab 단편을 포함하는 도메인 교환을 갖는 전장 항체,
여기서 첫 번째 Fab 단편에서
a) 첫 번째 Fab 단편의 경쇄는 VL과 CH1 도메인을 포함하고 첫 번째 Fab 단편의 중쇄는 VH와 CL 도메인을 포함하거나;
b) 첫 번째 Fab 단편의 경쇄는 VH와 CL 도메인을 포함하고 첫 번째 Fab 단편의 중쇄는 VL과 CH1 도메인을 포함하거나; 또는
c) 첫 번째 Fab 단편의 경쇄는 VH와 CH1 도메인을 포함하고 첫 번째 Fab 단편의 중쇄는 VL과 CL 도메인을 포함하고;
그리고
여기서 두 번째 Fab 단편은 VL과 CL 도메인을 포함하는 경쇄 및 VH와 CH1 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하고;
ii) 도메인 교환 및 추가 중쇄 C 말단 결합 부위를 갖는 전장 항체로서, 다음을 포함하는 전장 항체:
- 전장 항체 경쇄 및 전장 항체 중쇄 각각의 2개의 쌍을 포함하는 하나의 전장 항체로서, 여기서 전장 중쇄 및 전장 경쇄의 각 쌍에 의해 형성된 결합 부위가 첫 번째 항원에 특이적으로 결합하고;
그리고
- 하나의 추가 Fab 단편으로서, 여기서 상기 추가 Fab 단편이 전장 항체의 하나의 중쇄의 C 말단에 융합되고, 여기서 상기 추가 Fab 단편의 결합 부위가 두 번째 항원에 특이적으로 결합하고,
여기서 두 번째 항원에 특이적으로 결합하는 추가 Fab 단편은 i) a) 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 중쇄 가변 도메인 (VH)이 서로 대체되거나, 또는 b) 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인 (CH1)이 서로 대체되도록 도메인 교차를 포함하거나, 또는 ii) 단일 사슬 Fab 단편이고;
iii) 첫 번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 첫 번째 결합 부위 및 두 번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 두 번째 결합 부위를 포함하는 외팔 단일 사슬 항체로서, 다음을 포함하는 외팔 단일 사슬 항체:
- 가변 경쇄 도메인 및 경쇄 카파 또는 람다 불변 도메인을 포함하는 경쇄;
- 가변 경쇄 도메인, 경쇄 불변 도메인, 펩티드성 링커, 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 노브 돌연변이를 갖는 CH3을 포함하는 조합된 경쇄/중쇄;
- 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 홀 돌연변이를 갖는 CH3 도메인을 포함하는 중쇄;
iv) 첫 번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 첫 번째 결합 부위 및 두 번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 두 번째 결합 부위를 포함하는 두팔 단일 사슬 항체로서, 다음을 포함하는 두팔 단일 사슬 항체:
- 가변 경쇄 도메인, 경쇄 불변 도메인, 펩티드성 링커, 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 홀 돌연변이를 갖는 CH3을 포함하는 첫 번째 조합된 경쇄/중쇄;
- 가변 경쇄 도메인, 경쇄 불변 도메인, 펩티드성 링커, 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 노브 돌연변이를 갖는 CH3 도메인을 포함하는 두 번째 조합된 경쇄/중쇄;
v) 첫 번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 첫 번째 결합 부위 및 두 번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 두 번째 결합 부위를 포함하는 공통 경쇄 이중특이적 항체로서, 다음을 포함하는 공통 경쇄 이중특이적 항체:
- 가변 경쇄 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄;
- 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 홀 돌연변이를 갖는 CH3 도메인을 포함하는 첫 번째 중쇄;
- 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 노브 돌연변이를 갖는 CH3 도메인을 포함하는 두 번째 중쇄;
vi) 도메인 교환을 갖는 추가 중쇄 N 말단 결합 부위를 갖는 전장 항체로서, 다음을 포함하는 전장 항체:
- 첫 번째와 두 번째 Fab 단편으로서, 여기서 첫 번째와 두 번째 Fab 단편의 각 결합 부위가 첫 번째 항원에 특이적으로 결합하고;
- 세 번째 Fab 단편으로서, 여기서 세 번째 Fab 단편의 결합 부위가 두 번째 항원에 특이적으로 결합하고, 그리고 여기서 세 번째 Fab 단편이 가변 경쇄 도메인 (VL) 및 가변 중쇄 도메인 (VH)이 서로 대체되도록 도메인 교차를 포함하고; 그리고
- 첫 번째 Fc 영역 폴리펩티드 및 두 번째 Fc 영역 폴리펩티드를 포함하는 Fc 영역;
여기서 첫 번째와 두 번째 Fab 단편은 각각, 중쇄 단편 및 전장 경쇄를 포함하고,
여기서 첫 번째 Fab 단편의 중쇄 단편의 C 말단은 첫 번째 Fc 영역 폴리펩티드의 N 말단에 융합되고,
여기서 두 번째 Fab 단편의 중쇄 단편의 C 말단은 세 번째 Fab 단편의 가변 경쇄 도메인의 N 말단에 융합되고, 그리고 세 번째 Fab 단편의 CH1 도메인의 C 말단은 두 번째 Fc 영역 폴리펩티드의 N 말단에 융합되고;
vii) 임의적으로 펩티드성 링커를 통해 서로 접합된 전장 항체 및 비면역글로불린 모이어티를 포함하는 면역접합체,
그리고
viii) 항체-다합체-융합 폴리펩티드로서, 다음을 포함하는 항체-다합체-융합 폴리펩티드:
(a) 항체 중쇄 및 항체 경쇄, 그리고
(b) N 말단에서 C 말단 방향으로 비항체 다합체 폴리펩티드의 첫 번째 부분, 항체 중쇄 CH1 도메인 또는 항체 경쇄 불변 도메인, 항체 힌지 영역, 항체 중쇄 CH2 도메인 및 항체 중쇄 CH3 도메인을 포함하는 첫 번째 융합 폴리펩티드, 그리고 N 말단에서 C 말단 방향으로 비항체 다합체 폴리펩티드의 두 번째 부분 및 만약 첫 번째 폴리펩티드가 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하면 항체 경쇄 불변 도메인 또는 만약 첫 번째 폴리펩티드가 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하면 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 두 번째 융합 폴리펩티드,
여기서,
(i) (a)의 항체 중쇄 및 (b)의 첫 번째 융합 폴리펩티드, (ii) (a)의 항체 중쇄 및 (a)의 항체 경쇄, 그리고 (iii) (b)의 첫 번째 융합 폴리펩티드 및 (b)의 두 번째 융합 폴리펩티드는 각각 서로 독립적으로, 적어도 하나의 이황화 결합에 의해 서로 공유적으로 연결되고,
여기서,
항체 중쇄 및 항체 경쇄의 가변 도메인은 항원에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성한다.
일정한 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, CDK12, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1 및 SMAD3으로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38 및 CDK12로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC 및 STK11로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC이다. 한 가지 추가의 바람직한 구체예에서, 더 나아가 내인성 SIRT-1 유전자의 활성 또는 기능 또는 발현이 감소되거나 또는 제거되거나 또는 축소되거나 또는 (완전히) 녹아웃되었다.
일정한 구체예에서, 재조합 포유류 세포에서 내인성 SIRT-1 유전자, 그리고 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, CDK12, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1 및 SMAD3으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의, 다시 말하면 적어도 하나의 추가 내인성 유전자(들)의 활성 또는 기능 또는 발현이 감소되거나 또는 제거되거나 또는 축소되거나 또는 (완전히) 녹아웃된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 추가 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38 및 CDK12로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 추가 내인성 유전자는 MYC 및 STK11로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 추가 내인성 유전자는 MYC이다, 다시 말하면 내인성 SIRT-1 유전자 및 내인성 MYC 유전자의 활성 또는 기능 또는 발현이 감소되거나 또는 제거되거나 또는 축소되거나 또는 (완전히) 녹아웃된다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 의존성 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3 및 CDKN1A로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1 및 CDK12으로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4 및 PPP2CB로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 의존성 구체예에서, 재조합 포유류 세포에서 내인성 SIRT-1 유전자, 그리고 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3 및 CDKN1A로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의, 다시 말하면 적어도 하나의 추가 내인성 유전자(들)의 활성 또는 기능 또는 발현이 감소되거나 또는 제거되거나 또는 축소되거나 또는 (완전히) 녹아웃된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 추가 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1 및 CDK12로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 추가 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4 및 PPP2CB로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 내인성 SIRT-1 유전자 및 내인성 MYC 유전자의 활성 또는 기능 또는 발현이 감소되거나 또는 제거되거나 또는 축소되거나 또는 (완전히) 녹아웃된다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 의존성 구체예에서, 이종성 폴리펩티드는 항체-다합체-융합 폴리펩티드로서,
(a) 항체 중쇄 및 항체 경쇄, 그리고
(b) N 말단에서 C 말단 방향으로 비항체 다합체 폴리펩티드의 첫 번째 부분, 항체 중쇄 CH1 도메인 또는 항체 경쇄 불변 도메인, 항체 힌지 영역, 항체 중쇄 CH2 도메인 및 항체 중쇄 CH3 도메인을 포함하는 첫 번째 융합 폴리펩티드, 그리고 N 말단에서 C 말단 방향으로 비항체 다합체 폴리펩티드의 두 번째 부분 및 만약 첫 번째 폴리펩티드가 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하면 항체 경쇄 불변 도메인 또는 만약 첫 번째 폴리펩티드가 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하면 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 두 번째 융합 폴리펩티드를 포함하는 항체-다합체-융합 폴리펩티드이고,
여기서,
(i) (a)의 항체 중쇄 및 (b)의 첫 번째 융합 폴리펩티드, (ii) (a)의 항체 중쇄 및 (a)의 항체 경쇄, 그리고 (iii) (b)의 첫 번째 융합 폴리펩티드 및 (b)의 두 번째 융합 폴리펩티드는 각각 서로 독립적으로, 적어도 하나의 이황화 결합에 의해 서로 공유적으로 연결되고,
여기서,
항체 중쇄 및 항체 경쇄의 가변 도메인은 항원에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성한다.
일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3 및 CDKN1A로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1 및 CDK12으로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4 및 PPP2CB로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC이다. 한 가지 추가의 바람직한 구체예에서, 더 나아가 내인성 SIRT-1 유전자의 활성 또는 기능 또는 발현이 감소되거나 또는 제거되거나 또는 축소되거나 또는 (완전히) 녹아웃되었다.
일정한 구체예에서, 재조합 포유류 세포에서 내인성 SIRT-1 유전자, 그리고 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3 및 CDKN1A로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의, 다시 말하면 적어도 하나의 추가 내인성 유전자(들)의 활성 또는 기능 또는 발현이 감소되거나 또는 제거되거나 또는 축소되거나 또는 (완전히) 녹아웃된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 추가 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1 및 CDK12로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 추가 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4 및 PPP2CB로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 추가 내인성 유전자는 MYC이다.
일정한 의존성 구체예에서, 첫 번째 융합 폴리펩티드는 비항체 다합체 폴리펩티드의 첫 번째 부분으로서, 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는, TNF 리간드 패밀리 구성원 또는 이의 단편의 두 개의 엑토도메인을 포함하고, 그리고 두 번째 융합 폴리펩티드는 비항체 다합체 폴리펩티드의 두 번째 부분으로서, 상기 TNF 리간드 패밀리 구성원 또는 이의 단편의 단지 하나의 엑토도메인을 포함하거나, 또는 그 반대의 경우이다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 융합 폴리펩티드는 N 말단에서 C 말단 방향으로 비항체 다합체 폴리펩티드의 첫 번째 부분, 항체 경쇄 불변 도메인, 항체 힌지 영역, 항체 중쇄 CH2 도메인 및 항체 중쇄 CH3 도메인을 포함하고, 그리고 두 번째 융합 폴리펩티드는 N 말단에서 C 말단 방향으로 비항체 다합체 폴리펩티드의 두 번째 부분 및 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함한다. 일정한 구체예에서, 비항체 다합체 폴리펩티드의 부분에 인접한 CL 도메인 내에 위치 123 (Kabat EU 넘버링)에서 아미노산이 아르기닌 (R)에 의해 대체되고 위치 124 (Kabat EU 넘버링)에서 아미노산이 리신 (K)에 의해 치환되며, 그리고 여기서 비항체 다합체 폴리펩티드의 부분에 인접한 CH1 도메인 내에 위치 147 (Kabat EU 넘버링)에서 및 위치 213 (Kabat EU 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산 (E)에 의해 치환되었다. 일정한 구체예에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄의 가변 도메인은 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 흑색종 관련 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 (MCSP), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 암배아 항원 (CEA), CD19, CD20 및 CD33으로 구성된 군에서 선택되는 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성한다. 일정한 구체예에서, TNF 리간드 패밀리 구성원은 인간 T 세포 활성화를 동시자극한다. 일정한 구체예에서, TNF 리간드 패밀리 구성원은 4-1BBL 및 OX40L에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, TNF 리간드 패밀리 구성원은 4-1BBL이고, 그리고 세포 표면 항원은 FAP 또는 CD19 또는 CEA이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 의존성 구체예에서, 이종성 폴리펩티드는 이가, 단일특이적 또는 이중특이적 전장 항체 및 비면역글로불린 모이어티를 포함하는 융합 폴리펩티드이고, 여기서 상기 항체는 임의적으로 펩티드성 링커를 통해 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 하나의 단일 말단에서 비면역글로불린 모이어티에 접합된다 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, CDK12, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, CDK12, PARP-1, BARD1, ETS1, E2F5, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, BAD, FOXO1, PBRM1, BRCA2, NOTCH1 및 CREBBP로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11 및 CDK12로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC이다. 한 가지 추가의 바람직한 구체예에서, 더 나아가 내인성 SIRT-1 유전자의 활성 또는 기능 또는 발현이 감소되거나 또는 제거되거나 또는 축소되거나 또는 (완전히) 녹아웃되었다. 일정한 구체예에서, 이종성 폴리펩티드는 인터류킨-2에 접합된 항-PD-1 항체이다. 일정한 구체예에서, 인터류킨-2는 바람직하지 않은 CD25 매개 독성 및 Treg 확대를 방지하기 위해, IL-2Ra (CD25)에 결합이 전폐된 조작된 IL2v 모이어티이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 의존성 구체예에서, 포유류 세포는 CHO 세포 또는 HEK 세포이다. 바람직한 구체예에서, 포유류 세포는 CHO-K1 세포이다. 일정한 구체예에서, 포유류 세포는 현탁 성장 포유류 세포이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 의존성 구체예에서, 이종성 폴리펩티드에 대한 생산성은 4-일 회분식 배양에서 결정된다. 일정한 구체예에서, 4-일 회분식 배양은 적어도 1*106개 세포/ml (10E6개 세포/ml)의 세포 밀도로 접종되거나/시작된다. 일정한 구체예에서, 4-일 회분식 배양은 적어도 2*106개 세포/ml의 세포 밀도로 접종되거나/시작된다. 일정한 구체예에서, 4-일 회분식 배양은 적어도 5*106개 세포/ml의 세포 밀도로 접종되거나/시작된다. 일정한 구체예에서, 4-일 회분식 배양은 적어도 10*106개 세포/ml의 세포 밀도로 접종되거나/시작된다. 일정한 구체예에서, 4-일 회분식 배양은 화학적으로 규정된, 혈청 없는 배지에서 이루어진다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 의존성 구체예에서, 하나, 두 개 또는 그 초과의 내인성 유전자의 감소 또는 제거 또는 축소 또는 녹아웃은 CRISPR/Cas9 뉴클레아제 보조 유전자 표적화 시스템에 의한다. 바람직한 구체예에서, 내인성 유전자는 SIRT-1이고, 그리고 서열 번호: 12, 13 및 14의 3개의 가이드 RNA가 이용된다. 추가의 바람직한 구체예에서, 내인성 유전자는 MYC이고, 그리고 서열 번호: 15, 16 및 17의 3개의 가이드 RNA가 이용된다. 일정한 구체예에서, 내인성 유전자는 STK11이고, 그리고 서열 번호: 18, 19 및 20의 3개의 가이드 RNA가 이용된다. 일정한 구체예에서, 내인성 유전자는 SMAD4이고, 그리고 서열 번호: 21, 22 및 23의 3개의 가이드 RNA가 이용된다. 일정한 구체예에서, 내인성 유전자는 PPP2CB이고, 그리고 서열 번호: 24, 25 및 26의 3개의 가이드 RNA가 이용된다. 일정한 구체예에서, 내인성 유전자는 RBM38이고, 그리고 서열 번호: 27, 28 및 29의 3개의 가이드 RNA가 이용된다. 일정한 구체예에서, 내인성 유전자는 NF1이고, 그리고 서열 번호: 30, 31 및 32의 3개의 가이드 RNA가 이용된다. 일정한 구체예에서, 내인성 유전자는 CDK12이고, 그리고 서열 번호: 33, 34 및 35의 3개의 가이드 RNA가 이용된다. 일정한 구체예에서, 내인성 유전자는 SIN3A이고, 그리고 서열 번호: 36, 37 및 38의 3개의 가이드 RNA가 이용된다. 일정한 구체예에서, 내인성 유전자는 PARP-1이고, 그리고 서열 번호: 39, 40 및 41의 3개의 가이드 RNA가 이용된다. 일정한 구체예에서, 내인성 유전자는 ATM이고, 그리고 서열 번호: 42, 43 및 44의 3개의 가이드 RNA가 이용된다. 일정한 구체예에서, 내인성 유전자는 Hipk2이고, 그리고 서열 번호: 45, 46 및 47의 3개의 가이드 RNA가 이용된다. 일정한 구체예에서, 내인성 유전자는 BARD1이고, 그리고 서열 번호: 48, 49 및 50의 3개의 가이드 RNA가 이용된다. 일정한 구체예에서, 내인성 유전자는 HIF1AN이고, 그리고 서열 번호: 51, 52 및 53의 3개의 가이드 RNA가 이용된다. 일정한 구체예에서, 내인성 유전자는 SMAD3이고, 그리고 서열 번호: 54, 55 및 56의 3개의 가이드 RNA가 이용된다. 일정한 구체예에서, 내인성 유전자는 CDKN1A이고, 그리고 서열 번호: 57, 58 및 59의 3개의 가이드 RNA가 이용된다.
묘사되고 청구된 다양한 구체예에 더하여, 개시된 요부는 본원에서 개시되고 청구된 특질의 다른 조합을 갖는 다른 구체예에 또한 관계한다. 따라서, 본원에서 제시된 특정 특질은 개시된 요부가 본원에서 개시된 특질의 임의의 적합한 조합을 포함하도록, 개시된 요부의 범위 내에서 다른 방식으로 서로 조합될 수 있다. 개시된 요부의 특정한 구체예에 관한 설명은 예시 및 설명의 목적으로 제시되었다. 이것은 완전하거나 또는 개시된 요부를 개시된 구체예로만 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
본원 발명의 구체예의 상세한 설명
이종성 폴리펩티드를 발현하는 재조합 포유류 세포를 생성하기 위한 방법 및 상기 재조합 포유류 세포를 이용하여 이종성 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법이 본원에서 보고되는데, 여기서 재조합 세포에서 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 활성/기능/발현이 감소되거나/제거되거나/축소되거나/(완전히) 녹아웃된다.
본원 발명은 포유류 세포, 예를 들면 예컨대 CHO 세포에서 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 녹아웃이 예를 들면, 표준 IgG-유형 항체 및 특히 복합적 항체 형식의 재조합 생산성을 향상시킨다는 조사 결과에 적어도 부분적으로 기초된다.
I. 일반적인 정의
본원 발명을 실행하기 위한 유용한 방법과 기술은 예를 들면, Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997); Glover, N.D., and Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (1985), Oxford University Press; Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture - a practical approach, IRL Press Limited (1986); Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, Second Edition, CHSL Press (1992); Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J., ed., Cell Biology, Second Edition, Academic Press (1998); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, second edition, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987)에서 설명된다.
재조합 DNA 기술의 이용은 핵산의 유도체의 생성을 가능하게 한다. 이런 유도체는 예를 들면, 치환, 변경, 교환, 결실 또는 삽입에 의해 개별 또는 여러 뉴클레오티드 위치에서 변형될 수 있다. 변형 또는 유도체화는 예를 들면, 특정 부위 돌연변이유발에 의하여 실행될 수 있다. 이런 변형은 당업자에 의해 쉽게 실행될 수 있다 (참조: 예를 들면, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B.D., and Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England).
유의할 점은 본원에서 및 첨부된 청구항에서 이용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"가 문맥에서 별도로 명시되지 않으면 복수 지시 대상을 포함한다는 것이다. 따라서, 예를 들면, "세포"에 대한 언급은 복수의 이런 세포 및 당업자에게 공지된 이들의 등가물, 기타 등등을 포함한다. 게다가, 용어 "a" (또는 "an"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 교체가능하게 이용될 수 있다. 또한 유의할 점은 용어 "포함하는", "내포하는" 및 "갖는"이 교체가능하게 이용될 수 있다는 것이다.
용어 "약"은 그 후에 뒤따르는 수치 값의 +/- 20 %의 범위를 표시한다. 일정한 구체예에서, 용어 "약"은 그 후에 뒤따르는 수치 값의 +/- 10 %의 범위를 표시한다. 일정한 구체예에서, 용어 "약"은 그 후에 뒤따르는 수치 값의 +/- 5 %의 범위를 표시한다.
용어 "포함하는"은 용어 "구성되는"을 또한 포괄한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "재조합 포유류 세포"는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유류 세포를 표시한다. 이런 재조합 포유류 세포는 하나 이상의 외인성 핵산(들)이 도입된 세포뿐만 아니라 이런 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 용어 "이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유류 세포"는 포유류 세포의 유전체에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하고 이종성 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포를 표시한다. 일정한 구체예에서, 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유류 세포는 숙주 세포의 유전체의 좌위 내에 단일 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포이고, 여기서 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 첫 번째 선별 마커에 측접하는 첫 번째와 두 번째 재조합 인식 서열 및 첫 번째와 두 번째 재조합 인식 서열 사이에 위치된 세 번째 재조합 인식 서열을 포함하고, 그리고 모든 재조합 인식 서열은 상이하다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "재조합 세포"는 유전자 변형 후 세포, 예컨대 예를 들면, 임의의 척도에서 관심되는 이종성 폴리펩티드의 생산에 이용될 수 있는 관심되는 상기 이종성 폴리펩티드를 발현하는 세포를 표시한다. 예를 들면, "외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 포유류 세포"는 관심되는 이종성 폴리펩티드에 대한 코딩 서열이 숙주 세포의 유전체 내로 도입된 세포를 표시한다. 예를 들면, 관심되는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열이 숙주 세포의 유전체 내로 도입된, 재조합효소 매개된 카세트 교환 (RMCE)이 실행된 "외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 포유류 세포"는 "재조합 세포"이다.
"외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유류 세포" 및 "재조합 세포"는 둘 모두 "형질전환된 세포"이다. 이러한 용어는 일차 형질전환된 세포뿐만 아니라 계대의 횟수에 관계없이, 그것으로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 예를 들면, 핵산 함량에서 부모 세포와 완전하게 동일하지 않을 수도 있으며 돌연변이를 내포할 수도 있다. 최초 형질전환된 세포에 대해 선별검사된 또는 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포괄된다.
"단리된" 조성물은 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 것이다. 일부 구체예에서, 조성물은 예를 들면, 전기이동 (예를 들면, SDS-PAGE, 등전위 초점 (IEF), 모세관 전기이동, CE-SDS) 또는 크로마토그래피 (예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정될 때, 95 % 또는 99 % 이상의 순도로 정제된다. 예를 들면, 항체 순도의 사정을 위한 방법에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87을 참조한다.
"단리된" 핵산은 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산에는 핵산 분자를 통상적으로 내포하는 세포에 내포된 핵산 분자가 포함되지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 항체는 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 폴리펩티드 분자 또는 항체 분자를 지칭한다.
용어 "통합 부위"는 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입되는 세포의 유전체 내에 핵산 서열을 표시한다. 일정한 구체예에서, 통합 부위는 세포의 유전체 내에 2개의 인접한 뉴클레오티드 사이이다. 일정한 구체예에서, 통합 부위는 뉴클레오티드 서열의 스트레치를 포함한다. 일정한 구체예에서, 통합 부위는 포유류 세포의 유전체의 특정한 좌위 내에 위치된다. 일정한 구체예에서, 통합 부위는 포유류 세포의 내인성 유전자 내에 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 교체가능하게 이용될 수 있는 용어 "벡터" 또는 "플라스미드"는 자신이 연결되는 다른 핵산을 증식할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기 복제 핵산 구조로서 벡터뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 유전체 내로 통합된 벡터를 포함한다. 일정한 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 주도할 수 있다. 이런 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
용어 "결합하는"은 표적에 대한 결합 부위의 결합, 예컨대 예를 들면, 개별 항원에 대한 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 결합 부위의 결합을 표시한다. 이러한 결합은 예를 들면, BIAcore® 검정 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)을 이용하여 결정될 수 있다. 다시 말하면, 용어 "(항원)에 결합하는"은 시험관내 분석에서 항원(들)에 대한 항체의 결합을 표시한다. 일정한 구체예에서, 결합은 항체가 표면에 결합되고 항체에 대한 항원의 결합이 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 계측되는 결합 검정에서 결정된다. 용어 "결합하는"은 또한 용어 "특이적으로 결합하는"을 포함한다.
예를 들면, BIAcore® 검정의 한 가지 가능한 구체예에서, 항원이 표면에 결합되고, 그리고 항체, 다시 말하면, 이의 결합 부위(들)의 결합이 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 계측된다. 결합 친화성은 용어 ka (결합 상수: 복합체를 형성하기 위한 결합에 대한 속도 상수), kd (해리 상수; 복합체의 해리에 대한 속도 상수), 그리고 KD (kd/ka)에 의해 규정된다. 대안으로, SPR 센서그램의 결합 신호가 공명 신호 높이 및 해리 거동에 대하여, 참조의 반응 신호와 직접적으로 비교될 수 있다.
용어 "결합 부위"는 표적에 대한 결합 특이성을 보여주는 임의의 단백질성 실체를 표시한다. 이것은 예를 들면, 수용체, 수용체 리간드, 안티칼린, 어피바디, 항체 등일 수 있다. 따라서, 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "결합 부위"는 두 번째 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 두 번째 폴리펩티드에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 폴리펩티드를 표시한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "선별 마커"는 유전자를 보유하는 세포가 상응하는 선택 작용제의 존재에서, 위하여 또는 대항하여 특이적으로 선택되도록 허용하는 상기 유전자를 표시한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 선별 마커는 선별 마커 유전자로 형질전환된 숙주 세포가 개별 선택 작용제 (선택 배양 조건)의 존재에서 양성으로 선택되도록 허용할 수 있다; 비-형질전환된 숙주 세포는 선택 배양 조건하에 성장하거나 또는 생존할 수 없을 것이다. 선별 마커는 양성, 음성 또는 이중기능성일 수 있다. 양성 선별 마커는 이러한 마커를 보유하는 세포에 대한 선택을 허용할 수 있고, 반면 음성 선별 마커는 이러한 마커를 보유하는 세포가 선택적으로 제거되도록 허용할 수 있다. 선별 마커는 약물에 대한 내성을 부여하거나 또는 숙주 세포에서 대사 또는 이화 결함을 보완할 수 있다. 원핵 세포에서, 그 중에서도 특히, 암피실린, 테트라사이클린, 카나마이신 또는 클로람페니콜에 대한 내성을 부여하는 유전자가 이용될 수 있다. 진핵 세포에서 선별 마커로서 유용한 내성 유전자는 아미노글리코시드 인산전달효소 (APH) (예를 들면, 히그로마이신 인산전달효소 (HYG), 네오마이신 및 G418 APH), 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 티미딘 키나아제 (TK), 글루타민 합성효소 (GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소 (인돌), 히스티디놀 탈수소효소 (히스티디놀 D)에 대한 유전자, 그리고 푸로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 및 마이코페놀산에 대한 내성을 인코딩하는 유전자를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 추가 마커 유전자는 WO 92/08796 및 WO 94/28143에서 설명된다.
상응하는 선택 작용제의 존재에서 선택을 용이하게 하는 것을 뛰어넘어, 선별 마커는 대안으로, 세포 내에 정상적으로는 존재하지 않는 분자, 예를 들면, 녹색 형광 단백질 (GFP), 증강된 GFP (eGFP), 합성 GFP, 황색 형광 단백질 (YFP), 증강된 YFP (eYFP), 청록색 형광 단백질 (CFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-red, DsRed-단량체, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald, CyPet, mCFPm, Cerulean 및 T-Sapphire일 수 있다. 이런 분자를 발현하는 세포는 예를 들면, 인코딩된 폴리펩티드에 의해 방출된 형광의 검출 또는 부재 각각에 의해, 이러한 유전자를 보유하지 않는 세포로부터 구별될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 두 개 이상의 구성요소가 그들이 그들의 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는, 이들 구성요소의 근접위치를 지칭한다. 예를 들면, 프로모터 및/또는 인핸서는 만약 이러한 프로모터 및/또는 인핸서가 코딩 서열의 전사를 조정하는 행위를 하면, 이러한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일정한 구체예에서, "작동가능하게 연결"되는 DNA 서열은 단일 염색체 상에서 연속하고 인접한다. 일정한 구체예에서, 예를 들면, 2개의 단백질 인코딩 영역, 예컨대 분비 리더 및 폴리펩티드를 연결하는 것이 필요할 때, 이들 서열은 연속하고, 인접하고, 동일한 해독틀 내에 있다. 일정한 구체예에서, 작동가능하게 연결된 프로모터는 코딩 서열의 상류에 위치되고 이것에 인접할 수 있다. 일정한 구체예에서, 예를 들면, 코딩 서열의 발현을 조정하는 인핸서 서열에 대하여, 이들 두 가지 구성요소는 비록 인접한 것은 아니지만 작동가능하게 연결될 수 있다. 인핸서는 만약 이러한 인핸서가 코딩 서열의 전사를 증가시키면, 이러한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된 인핸서는 코딩 서열의 상류, 이들 내에, 또는 이들의 하류에 위치될 수 있고, 그리고 코딩 서열의 프로모터로부터 상당한 거리를 두고 위치될 수 있다. 작동 가능한 연쇄는 당해 분야에서 공지된 재조합 방법에 의해, 예를 들면, PCR 방법론을 이용하여 및/또는 편의한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성될 수 있다. 만약 편의한 제한 부위가 존재하지 않으면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 전통적인 관례와 일치하게 이용될 수 있다. 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)는 만약 이것이 5' 단부-독립된 방식으로 내부 위치에서 ORF의 번역의 개시를 허용하면, 개방 해독틀 (ORF)에 작동가능하게 연결된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "외인성"은 뉴클레오티드 서열이 특정 세포로부터 유래하지 않고, 그리고 DNA 전달 방법에 의해, 예를 들면, 형질감염, 전기천공 또는 형질전환 방법에 의해 상기 세포 내로 도입된다는 것을 암시한다. 따라서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 인위성이 예를 들면, 상이한 기원의 하위서열의 조합 (예를 들면, SV40 프로모터를 갖는 재조합효소 인식 서열 및 녹색 형광 단백질의 코딩 서열의 조합은 인공 핵산이다)으로부터, 또는 서열의 일부의 결실 (예를 들면, 막-결합된 수용체의 세포외 도메인만을 코딩하는 서열 또는 cDNA) 또는 핵염기의 돌연변이로부터 유래할 수 있는 인공 서열이다. 용어 "내인성"은 세포로부터 유래하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. "외인성" 뉴클레오티드 서열은 염기 조성에서 동일한 "내인성" 대응물을 가질 수 있지만, 여기서 상기 "외인성" 서열은 예를 들면, 재조합 DNA 기술을 통해 세포 내로 도입된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "이종성"은 폴리펩티드가 특정 세포로부터 유래하지 않고, 그리고 개별 인코딩 핵산이 DNA 전달 방법에 의해, 예를 들면, 형질감염, 전기천공, 또는 형질전환 방법에 의해 상기 세포 내로 도입되었다는 것을 암시한다. 따라서, 이종성 폴리펩티드는 이것을 발현하는 세포에 인위적인 폴리펩티드인데, 여기서 이것은 상기 폴리펩티드가 상이한 세포/생물체로부터 유래하는 자연 발생 폴리펩티드 또는 인공 폴리펩티드인지와 무관하다.
하기 내인성 유전자가 본 특허 출원에서 이용되었다:
용어 "시르투인-1"은 포유동물에서 신호 전달의 일부인 효소, 다시 말하면 NAD-의존성 탈아세틸화효소 시르투인-1을 표시한다. 시르투인-1은 SIRT-1 유전자에 의해 인코딩된다. 인간 시르투인-1은 UniProtKB 엔트리 Q96EB6을 갖는다. 중국 햄스터 시르투인-1은 UniProtKB 엔트리 A0A3L7IF96을 갖는다. SIRT-1 녹아웃의 효과는 본원에서 명시적으로 참조로서 편입되는 PCT/EP2020/067579에서 설명되었다.
II. 항체
인간 면역글로불린 경쇄와 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에서 제공된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 중쇄와 경쇄의 모든 불변 영역과 도메인의 아미노산 위치는 Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에서 설명된 Kabat 넘버링 시스템에 따라서 넘버링되고, 그리고 본원에서 "Kabat에 따른 넘버링"으로서 지칭된다. 구체적으로, Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)의 Kabat 넘버링 시스템 (페이지 647-660 참조)이 카파 및 람다 아이소타입의 경쇄 불변 도메인 CL에 이용되고, 그리고 Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)의 Kabat EU 색인 넘버링 시스템 (페이지 661-723 참조)이 불변 중쇄 도메인 (CH1, 힌지, CH2 및 CH3, 본원에서 이 경우에 있어서 더 명확하게는 "Kabat EU 색인에 따른 넘버링"으로 지칭됨)에 이용된다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 전장 항체, 단일클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체) 및 항체-항체 단편-융합뿐만 아니라 이들의 조합을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
용어 "선천적 항체"는 변화하는 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린 분자를 표시한다. 예를 들면, 선천적 IgG 항체는 이황화 결합되는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성되는, 약 150,000 달톤의 이종사합체성 당단백질이다. N 말단으로부터 C 말단으로, 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH), 그 이후에 3개의 중쇄 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는데, 여기서 첫 번째와 두 번째 중쇄 불변 도메인 사이에 힌지 영역이 위치된다. 유사하게, N 말단으로부터 C 말단으로, 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL), 그 이후에 경쇄 불변 도메인 (CL)을 갖는다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 두 가지 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있다.
용어 "전장 항체"는 선천적 항체의 구조와 실제적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 표시한다. 전장 항체는 N 말단에서 C 말단 방향으로 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 도메인을 각각 포함하는 2개의 전장 항체 경쇄뿐만 아니라 N 말단에서 C 말단 방향으로 중쇄 가변 영역, 첫 번째 중쇄 불변 도메인, 힌지 영역, 두 번째 중쇄 불변 도메인 및 세 번째 중쇄 불변 도메인을 각각 포함하는 2개의 전장 항체 중쇄를 포함한다. 선천적 항체와는 대조적으로, 전장 항체는 추가 면역글로불린 도메인, 예컨대 예를 들면, 전장 항체의 상이한 사슬의 말단 중에서 하나 이상에 접합된 하나 이상의 추가 scFv, 또는 중쇄 또는 경쇄 Fab 단편, 또는 scFab, 그러나 각 말단에 단지 단일 단편만을 포함할 수 있다. 이들 접합체 또한 용어 전장 항체에 의해 포괄된다.
용어 "항체 결합 부위"는 한 쌍의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 표시한다. 항원에 대한 적절한 결합을 담보하기 위해 이들 가변 도메인은 동계 가변 도메인이다, 다시 말하면, 같은 종류이다. 항체 결합 부위는 적어도 3개의 HVR (예를 들면, VHH의 경우에) 또는 3-6개의 HVR (예를 들면, VH/VL 쌍을 갖는 자연 발생, 다시 말하면, 전통적인 항체의 경우에)을 포함한다. 일반적으로, 항원 결합을 책임지는, 항체의 아미노산 잔기가 결합 부위를 형성한다. 이들 잔기는 통상적으로, 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 상응하는 항체 경쇄 가변 도메인에 내포된다. 항체의 항원 결합 부위는 "초가변 영역" 또는 "HVR"로부터 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 영역은 본원에서 규정된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 이런 이유로, 항체의 경쇄와 중쇄 가변 도메인은 N 말단으로부터 C 말단으로 영역 FR1, HVR1, FR2, HVR2, FR3, HVR3 및 FR4를 포함한다. 특히, 중쇄 가변 도메인의 HVR3 영역은 항원 결합에 가장 많이 기여하고 항체의 결합 특이성을 규정하는 영역이다. "기능적 결합 부위"는 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 용어 "에 특이적으로 결합하는"은 시험관내 검정에서, 일정한 구체예에서 결합 검정에서 표적에 대한 결합 부위의 결합을 표시한다. 이런 결합 검정은 결합 사건이 검출될 수 있기만 하면, 임의의 검정일 수 있다. 예를 들면, 항체가 표면에 결합되고 상기 항체에 대한 항원(들)의 결합이 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 계측되는 검정. 대안으로, 가교화 ELISA가 이용될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변성 ("상보성 결정 영역" 또는 "CDR")이고 및/또는 구조적으로 규정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하고 및/또는 항원 접촉 잔기 ("항원 접촉")를 내포하는 아미노산 잔기 스트레치를 포함하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; 중쇄 가변 도메인 VH에서 3개 (H1, H2, H3), 그리고 경쇄 가변 도메인 VL에서 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다.
HVR은 다음을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 그리고 96-101 (H3)에서 발생하는 초가변 루프 (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 그리고 95-102 (H3)에서 발생하는 CDR (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 그리고 93-101 (H3)에서 발생하는 항원 접촉 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 그리고
(d) 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 그리고 94-102 (H3)를 비롯한, (a), (b) 및/또는 (c)의 조합.
별도로 표시되지 않으면, HVR 잔기 및 가변 도메인에서 다른 잔기 (예를 들면, FR 잔기)는 본원에서 Kabat et al., 위와 같음에 따라서 넘버링된다.
항체의 "부류"는 이의 중쇄에 의해 소유된 불변 도메인 또는 불변 영역, 바람직하게는 Fc 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 그리고 이들 중에서 몇몇은 하위부류 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더욱 나눠질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
용어 "중쇄 불변 영역"은 불변 도메인, 다시 말하면 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 내포하는 면역글로불린 중쇄의 영역을 표시한다. 일정한 구체예에서, 인간 IgG 불변 영역은 Ala118부터 중쇄의 카르복실 말단까지 걸쳐 있다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링). 하지만, 불변 영역의 C 말단 리신 (Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링). 용어 "불변 영역"은 힌지 영역 시스테인 잔기를 통해 서로 공유 연결되어 사슬간 이황화 결합을 형성할 수 있는 2개의 중쇄 불변 영역을 포함하는 이합체를 표시한다.
용어 "중쇄 Fc 영역"은 힌지 영역의 일부 (중간 및 하부 힌지 영역), CH2 도메인 및 CH3 도메인을 적어도 내포하는 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 표시한다. 일정한 구체예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Asp221부터, 또는 Cys226부터, 또는 Pro230부터 중쇄의 카르복실 말단까지 걸쳐 있다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링). 따라서, Fc 영역은 불변 영역보다 작지만, C 말단 부분에서 이와 동일하다. 하지만, 중쇄 Fc 영역의 C 말단 리신 (Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링). 용어 "Fc 영역"은 힌지 영역 시스테인 잔기를 통해 서로 공유 연결되어 사슬간 이황화 결합을 형성할 수 있는 2개의 중쇄 Fc 영역을 포함하는 이합체를 표시한다.
항체의 불변 영역, 더 정확하게는 Fc 영역 (및 유사하게는 불변 영역)은 보체 활성화, C1q 결합, C3 활성화 및 Fc 수용체 결합에 직접적으로 관련된다. 보체계에 대한 항체의 영향이 일정한 조건에 의존하긴 하지만, C1q에 결합은 Fc 영역 내에 규정된 결합 부위에 의해 유발된다. 이런 결합 부위는 당해 분야에서 공지되고, 그리고 예를 들면 Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; 및 EP 0 307 434에 의해 설명된다. 이런 결합 부위는 예를 들면, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329이다 (Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링). 하위부류 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체는 통상적으로 보체 활성화, C1q 결합 및 C3 활성화를 보여주고, 반면 IgG4는 보체계를 활성화시키지 못하고, C1q에 결합하지 않고, C3을 활성화시키지 못한다. "항체의 Fc 영역"은 당업자에게 널리 알려지고 항체의 파파인 개열에 근거하여 규정된 용어이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 실제적으로 동질성 항체의 모집단으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 상기 모집단을 구성하는 개별 항체는 예를 들면, 자연 발생 돌연변이를 내포하거나 또는 단일클론 항체 제조물의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체 (이런 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 단일클론 항체 제조물의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 대해 지향된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 동질성 모집단으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 표시하고, 그리고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 전시 방법, 그리고 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 내포하는 유전자도입 동물을 활용하는 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다.
본 출원 내에서 이용된 바와 같이, 용어 "가 (valent)"는 항체 내에 특정된 숫자의 결합 부위의 존재를 표시한다. 따라서, 용어 "이가", "사가" 및 "육가"는 항체 내에 각각, 2개 결합 부위, 4개 결합 부위 및 6개 결합 부위의 존재를 표시한다.
"단일특이적 항체"는 단일 결합 특이성을 갖는, 다시 말하면, 하나의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 표시한다. 단일특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들면, F(ab')2) 또는 이들의 조합 (예를 들면, 전장 항체 플러스 추가 scFv 또는 Fab 단편)으로서 제조될 수 있다. 단일특이적 항체는 일가일 필요가 없다, 다시 말하면, 단일특이적 항체는 하나의 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다. 선천적 항체는 예를 들면, 단일특이적이지만 이가이다.
"다중특이적 항체"는 동일한 항원 상에서 적어도 2개의 상이한 에피토프 또는 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 표시한다. 다중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들면, F(ab')2 이중특이적 항체) 또는 이들의 조합 (예를 들면, 전장 항체 플러스 추가 scFv 또는 Fab 단편)으로서 제조될 수 있다. 다중특이적 항체는 적어도 이가이다, 다시 말하면, 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 이에 더하여, 다중특이적 항체는 적어도 이중특이적이다. 따라서, 이가, 이중특이적 항체는 다중특이적 항체의 가장 단순한 형태이다. 2개, 3개 또는 그 초과 (예를 들면, 4개)의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 보고되었다 (참조: 예를 들면, US 2002/0004587).
일정한 구체예에서, 항체는 다중특이적 항체, 예를 들면, 적어도 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 일정한 구체예에서, 결합 특이성 중에서 하나는 첫 번째 항원에 대한 것이고, 그리고 다른 하나는 상이한 두 번째 항원에 대한 것이다. 일정한 구체예에서, 다중특이적 항체는 동일한 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다중특이적 항체는 또한, 세포독성 작용제를, 항원을 발현하는 세포로 국지화하는 데 이용될 수 있다.
다중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체-항체 단편-융합으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 만들기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동발현 (참조: Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829 및 Traunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659), 그리고 "노브-인-홀" 조작 (참조: 예를 들면, US 5,731,168)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 다중특이적 항체는 또한, 항체 Fc-이종이합체성 분자를 만들기 위해 정전 스티어링 효과를 조작함으로써 (WO 2009/089004); 두 개 이상의 항체 또는 단편을 교차연결함으로써 (참조: 예를 들면, US 4,676,980 및 Brennan, M., et al., Science 229 (1985) 81-83); 이중특이적 항체를 생산하기 위해 류신 지퍼를 이용함으로써 (참조: 예를 들면, Kostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553); 경쇄 오대합 문제를 회피하기 위해 공통 경쇄 기술을 이용함으로써 (참조: 예를 들면, WO 98/50431); 이중특이적 항체 단편을 만들기 위한 특정한 기술을 이용함으로써 (참조: 예를 들면, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); 그리고 예를 들면, Tutt, A., et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69)에서 설명된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조함으로써 만들어질 수 있다.
예를 들면, "문어 항체", 또는 DVD-Ig를 비롯한, 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체 또한 본원에 포함된다 (참조: 예를 들면, WO 2001/77342 및 WO 2008/024715). 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다중특이적 항체의 다른 실례는 WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792 및 WO 2013/026831에서 발견될 수 있다. 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한, "이중 작용 Fab" 또는 "DAF"를 포함한다 (참조: 예를 들면, US 2008/0069820 및 WO 2015/095539).
다중특이적 항체는 또한, 동일한 항원 특이성의 하나 이상의 결합 팔에서 도메인 교차로, 다시 말하면, VH/VL 도메인 (참조: 예를 들면, WO 2009/080252 및 WO 2015/150447), CH1/CL 도메인 (참조: 예를 들면, WO 2009/080253) 또는 완전한 Fab 팔 (참조: 예를 들면, WO 2009/080251, WO 2016/016299, 또한 Schaefer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 1187-1191 및 Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-1020 참조)을 교환함으로써 비대칭적 형태로 제공될 수 있다. 한 양상에서, 다중특이적 항체는 교차-Fab 단편을 포함한다. 용어 "교차-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "교차 Fab 단편"은 중쇄와 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역 중 어느 한 가지가 교환되는 Fab 단편을 지칭한다. 교차-Fab 단편은 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 불변 영역 1 (CH1)로 구성되는 폴리펩티드 사슬, 그리고 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성되는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 비대칭적 Fab 팔은 또한, 정확한 Fab 대합을 주도하기 위해 하전된 또는 비-하전된 아미노산 돌연변이를 도메인 인터페이스 내로 도입함으로써 조작될 수 있다. 참조: 예를 들면, WO 2016/172485.
항체 또는 단편은 또한, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, 또는 WO 2010/145793에서 설명된 바와 같은 다중특이적 항체일 수 있다.
항체 또는 이의 단편은 또한, WO 2012/163520에서 개시된 바와 같은 다중특이적 항체일 수 있다.
다중특이적 항체에 대한 다양한 추가의 분자 형식은 당해 분야에서 공지되고 본원에 포함된다 (참조: 예를 들면, Spiess et al., Mol. Immunol. 67 (2015) 95-106).
이중특이적 항체는 일반적으로, 동일한 항원 상에서 2개의 상이한 비중복 에피토프에 또는 상이한 항원 상에서 2개의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 분자이다.
복합체 (다중특이적) 항체는
- 도메인 교환을 갖는 전장 항체:
첫 번째 Fab 단편 및 두 번째 Fab 단편을 포함하는 다중특이적 IgG 항체로서, 여기서 첫 번째 Fab 단편에서
a) CH1과 CL 도메인만 서로 대체되거나 (다시 말하면, 첫 번째 Fab 단편의 경쇄가 VL과 CH1 도메인을 포함하고 첫 번째 Fab 단편의 중쇄가 VH와 CL 도메인을 포함하거나);
b) VH와 VL 도메인만 서로 대체되거나 (다시 말하면, 첫 번째 Fab 단편의 경쇄가 VH와 CL 도메인을 포함하고 첫 번째 Fab 단편의 중쇄가 VL과 CH1 도메인을 포함하거나); 또는
c) CH1과 CL 도메인이 서로 대체되고 VH와 VL 도메인이 서로 대체되고 (다시 말하면, 첫 번째 Fab 단편의 경쇄가 VH와 CH1 도메인을 포함하고 첫 번째 Fab 단편의 중쇄가 VL과 CL 도메인을 포함하고); 그리고
여기서 두 번째 Fab 단편은 VL과 CL 도메인을 포함하는 경쇄 및 VH와 CH1 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하고;
도메인 교환을 갖는 전장 항체는 CH3 도메인을 포함하는 첫 번째 중쇄 및 CH3 도메인을 포함하는 두 번째 중쇄를 포함할 수 있고, 여기서 양쪽 CH3 도메인은 예를 들면, WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, 또는 WO 2013/096291 (본원에서 참조로서 편입됨)에서 개시된 바와 같이, 첫 번째 중쇄 및 변형된 두 번째 중쇄의 이종이합체화를 뒷받침하기 위해, 개별 아미노산 치환에 의해 상보성 방식으로 조작되고;
- 도메인 교환 및 추가의 중쇄 C 말단 결합 부위를 갖는 전장 항체:
다음을 포함하는 다중특이적 IgG 항체로서:
a) 전장 항체 경쇄 및 전장 항체 중쇄 각각의 2개의 쌍을 포함하는 하나의 전장 항체로서, 여기서 전장 중쇄 및 전장 경쇄의 각 쌍에 의해 형성된 결합 부위가 첫 번째 항원에 특이적으로 결합하고, 그리고
b) 하나의 추가 Fab 단편으로서, 여기서 상기 추가 Fab 단편이 전장 항체의 하나의 중쇄의 C 말단에 융합되고, 여기서 상기 추가 Fab 단편의 결합 부위가 두 번째 항원에 특이적으로 결합하고,
여기서 두 번째 항원에 특이적으로 결합하는 추가 Fab 단편은 i) a) 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 중쇄 가변 도메인 (VH)이 서로 대체되거나, 또는 b) 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인 (CH1)이 서로 대체되도록 도메인 교차를 포함하거나, 또는 ii) 단일 사슬 Fab 단편이고;
- 외팔 단일 사슬 형식 (= 외팔 단일 사슬 항체):
첫 번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 첫 번째 결합 부위 및 두 번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 두 번째 결합 부위를 포함하는 항체로서, 여기서 개별 사슬은 아래와 같고:
- 경쇄 (가변 경쇄 도메인 + 경쇄 카파 불변 도메인)
- 조합된 경쇄/중쇄 (가변 경쇄 도메인 + 경쇄 불변 도메인 + 펩티드성 링커 + 가변 중쇄 도메인 + CH1 + 힌지 + CH2 + 노브 돌연변이를 갖는 CH3)
- 중쇄 (가변 중쇄 도메인 + CH1 + 힌지 + CH2 + 홀 돌연변이를 갖는 CH3);
- 두팔 단일 사슬 형식 (= 두팔 단일 사슬 항체):
첫 번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 첫 번째 결합 부위 및 두 번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 두 번째 결합 부위를 포함하는 항체로서, 여기서 개별 사슬은 아래와 같고:
- 조합된 경쇄/중쇄 1 (가변 경쇄 도메인 + 경쇄 불변 도메인 + 펩티드성 링커 + 가변 중쇄 도메인 + CH1 + 힌지 + CH2 + 홀 돌연변이를 갖는 CH3)
- 조합된 경쇄/중쇄 2 (가변 경쇄 도메인 + 경쇄 불변 도메인 + 펩티드성 링커 + 가변 중쇄 도메인 + CH1 + 힌지 + CH2 + 노브 돌연변이를 갖는 CH3);
- 공통 경쇄 이중특이적 형식 (= 공통 경쇄 이중특이적 항체):
첫 번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 첫 번째 결합 부위 및 두 번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 두 번째 결합 부위를 포함하는 항체로서, 여기서 개별 사슬은 아래와 같고:
- 경쇄 (가변 경쇄 도메인 + 경쇄 불변 도메인)
- 중쇄 1 (가변 중쇄 도메인 + CH1 + 힌지 + CH2 + 홀 돌연변이를 갖는 CH3)
- 중쇄 2 (가변 중쇄 도메인 + CH1 + 힌지 + CH2 + 노브 돌연변이를 갖는 CH3);
- T 세포 이중특이적 형식:
다음을 포함하는, 도메인 교환을 갖는 추가 중쇄 N 말단 결합 부위를 갖는 전장 항체로서:
- 첫 번째와 두 번째 Fab 단편으로서, 여기서 첫 번째와 두 번째 Fab 단편의 각 결합 부위가 첫 번째 항원에 특이적으로 결합하고,
- 세 번째 Fab 단편으로서, 여기서 세 번째 Fab 단편의 결합 부위가 두 번째 항원에 특이적으로 결합하고, 그리고 여기서 세 번째 Fab 단편이 가변 경쇄 도메인 (VL) 및 가변 중쇄 도메인 (VH)이 서로 대체되도록 도메인 교차를 포함하고, 그리고
- 첫 번째 Fc 영역 폴리펩티드 및 두 번째 Fc 영역 폴리펩티드를 포함하는 Fc 영역,
여기서 첫 번째와 두 번째 Fab 단편은 각각, 중쇄 단편 및 전장 경쇄를 포함하고,
여기서 첫 번째 Fab 단편의 중쇄 단편의 C 말단은 첫 번째 Fc 영역 폴리펩티드의 N 말단에 융합되고,
여기서 두 번째 Fab 단편의 중쇄 단편의 C 말단은 세 번째 Fab 단편의 가변 경쇄 도메인의 N 말단에 융합되고, 그리고 세 번째 Fab 단편의 CH1 도메인의 C 말단은 두 번째 Fc 영역 폴리펩티드의 N 말단에 융합되고;
- 다음을 포함하는, 항체-다합체-융합이고:
(a) 항체 중쇄 및 항체 경쇄, 그리고
(b) N 말단에서 C 말단 방향으로 비항체 다합체 폴리펩티드의 첫 번째 부분, 항체 중쇄 CH1 도메인 또는 항체 경쇄 불변 도메인, 항체 힌지 영역, 항체 중쇄 CH2 도메인 및 항체 중쇄 CH3 도메인을 포함하는 첫 번째 융합 폴리펩티드, 그리고 N 말단에서 C 말단 방향으로 비항체 다합체 폴리펩티드의 두 번째 부분 및 만약 첫 번째 폴리펩티드가 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하면 항체 경쇄 불변 도메인 또는 만약 첫 번째 폴리펩티드가 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하면 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 두 번째 융합 폴리펩티드,
여기서,
(i) (a)의 항체 중쇄 및 (b)의 첫 번째 융합 폴리펩티드, (ii) (a)의 항체 중쇄 및 (a)의 항체 경쇄, 그리고 (iii) (b)의 첫 번째 융합 폴리펩티드 및 (b)의 두 번째 융합 폴리펩티드는 각각 서로 독립적으로, 적어도 하나의 이황화 결합에 의해 서로 공유적으로 연결되고,
여기서,
항체 중쇄 및 항체 경쇄의 가변 도메인은 항원에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성한다.
항체 조작에서 "노브 인투 홀" 이합체화 모듈 및 이들의 이용은 Carter P.; Ridgway J.B.B.; Presta L.G.: Immunotechnology, Volume 2, Number 1, February 1996, pp. 73-73(1)에서 설명된다.
항체의 중쇄에서 CH3 도메인은 "노브 인투 홀" 기술에 의해 변형될 수 있는데, 이것은 예를 들면, WO 96/027011, Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; 및 Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681에서 여러 실례에 의해 상세하게 설명된다. 이러한 방법에서, 2개의 CH3 도메인의 상호작용 표면은 이들 2개의 CH3 도메인의 이종이합체화 및 그것에 의하여 이들을 포함하는 폴리펩티드의 이종이합체화를 증가시키도록 변형된다. 2개의 CH3 도메인 (2개의 중쇄의) 각각은 "노브"일 수 있고, 반면 다른 것은 "홀"이다. 이황화 다리의 도입은 이종이합체를 더욱 안정시키고 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35), 수율을 증가시킨다.
CH3 도메인 (항체 중쇄의)에서 돌연변이 T366W는 "노브-돌연변이" 또는 "돌연변이 노브"로서 표시되고, 그리고 CH3 도메인 (항체 중쇄의)에서 돌연변이 T366S, L368A, Y407V는 "홀-돌연변이" 또는 "돌연변이 홀"로서 표시된다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링). 예를 들면, S354C 돌연변이를 "노브-돌연변이"를 갖는 중쇄의 CH3 도메인 내로 도입함으로써 ("노브-cys-돌연변이" 또는 "돌연변이 노브-cys"로서 표시함), 그리고 Y349C 돌연변이를 "홀-돌연변이"를 갖는 중쇄의 CH3 도메인 내로 도입함으로써 ("홀-cys-돌연변이" 또는 "돌연변이 홀-cys"로서 표시함) (Kabat EU 색인에 따른 넘버링), CH3 도메인 사이에 추가의 사슬간 이황화 다리가 또한 이용될 수 있다 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681).
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "도메인 교차"는 적어도 하나의 중쇄 도메인이 이의 상응하는 경쇄 도메인에 의해 치환되고 그 반대의 경우도 가능하다는 점에서, 한 쌍의 항체 중쇄 VH-CH1 단편 및 이의 상응하는 동계 항체 경쇄에서, 다시 말하면, 항체 Fab (단편 항원 결합)에서, 도메인 서열이 선천적 항체에서 서열로부터 일탈한다는 것을 표시한다. 도메인 교차의 세 가지 일반적인 유형이 있다: (i) CH1과 CL 도메인의 교차, 이것은 경쇄에서 도메인 교차에 의해 VL-CH1 도메인 서열을 야기하고 중쇄 단편에서 도메인 교차에 의해 VH-CL 도메인 서열 (또는 VH-CL-힌지-CH2-CH3 도메인 서열을 갖는 전장 항체 중쇄)을 야기하며, (ii) VH와 VL 도메인의 도메인 교차, 이것은 경쇄에서 도메인 교차에 의해 VH-CL 도메인 서열을 야기하고 중쇄 단편에서 도메인 교차에 의해 VL-CH1 도메인 서열을 야기하며, (iii) 완전한 경쇄 (VL-CL) 및 완전한 VH-CH1 중쇄 단편의 도메인 교차 ("Fab 교차"), 이것은 도메인 교차에 의해 VH-CH1 도메인 서열을 갖는 경쇄를 야기하고 도메인 교차에 의해 VL-CL 도메인 서열을 갖는 중쇄 단편을 야기한다 (모든 전술된 도메인 서열은 N 말단에서 C 말단 방향으로 표시된다).
본원에서 이용된 바와 같이, 상응하는 중쇄와 경쇄 도메인에 대하여 용어 "서로 대체된"은 전술된 도메인 교차를 지칭한다. 따라서, CH1과 CL 도메인이 "서로 대체"될 때, 이것은 항목 (i)하에 언급된 도메인 교차 및 결과의 중쇄와 경쇄 도메인 서열에 대해 지칭된다. 따라서, VH와 VL이 "서로 대체"될 때, 이것은 항목 (ii)하에 언급된 도메인 교차에 대해 지칭되고; 그리고 CH1과 CL 도메인이 "서로 대체"되고 VH와 VL 도메인이 "서로 대체"될 때, 이것은 항목 (iii)하에 언급된 도메인 교차에 대해 지칭된다. 도메인 교차를 포함하는 이중특이적 항체는 예를 들면, WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254 및 Schaefer, W., et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 108 (2011) 11187-11192에서 보고된다. 이런 항체는 일반적으로 CrossMab로 명명된다.
다중특이적 항체는 또한, 한 구체예에서 상기 항목 (i)하에 언급된 바와 같은 CH1과 CL 도메인의 도메인 교차, 또는 상기 항목 (ii)하에 언급된 바와 같은 VH와 VL 도메인의 도메인 교차, 또는 상기 항목 (iii)하에 언급된 바와 같은 VH-CH1과 VL-VL 도메인의 도메인 교차 중 어느 한 가지를 포함하는 적어도 하나의 Fab 단편을 포함한다. 도메인 교차를 갖는 다중특이적 항체의 경우에, 동일한 항원(들)에 특이적으로 결합하는 Fab는 동일한 도메인 서열이 되도록 작제된다. 따라서, 도메인 교차를 갖는 하나 이상의 Fab가 다중특이적 항체에 내포되는 경우에, 상기 Fab(들)는 동일한 항원에 특이적으로 결합한다.
"인간화" 항체는 비인간 HVR로부터 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터 아미노산 잔기를 포함하는 항체를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실제적으로 모두를 포함할 것인데, 여기서 모든 또는 실제적으로 모든 HVR (예를 들면, CDR)은 비인간 항체의 것들에 상응하고, 그리고 모든 또는 실제적으로 모든 FR은 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 임의적으로, 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "재조합 항체"는 재조합 수단, 예컨대 재조합 세포에 의해 제조되거나, 발현되거나, 창출되거나 또는 단리되는 모든 항체 (키메라, 인간화 및 인간)를 표시한다. 이것은 재조합 세포 예컨대 NS0, HEK, BHK, 양수 세포 또는 CHO 세포로부터 단리된 항체를 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다, 다시 말하면, 이것은 기능적 단편이다. 항체 단편의 실례는 Fv; Fab; Fab'; Fab'-SH; F(ab')2; 이중특이적 Fab; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들면, scFv 또는 scFab)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
III. 재조합 방법과 조성물
항체는 예를 들면, US 4,816,567에서 설명된 바와 같은 재조합 방법과 조성물을 이용하여 생산될 수 있다. 이들 방법을 위해, 항체를 인코딩하는 하나 이상의 단리된 핵산(들)이 제공된다.
한 양상에서, 항체를 만드는 방법이 제공되는데, 여기서 상기 방법은 상기 제시된 바와 같은 항체의 발현에 적합한 조건하에, 상기 항체를 인코딩하는 핵산(들)을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 그리고 임의적으로, 상기 항체를 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 단계를 포함한다.
항체의 재조합 생산의 경우에, 예를 들면, 전술된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산이 단리되고, 그리고 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 이런 핵산은 쉽게 단리될 수 있고, 그리고 전통적인 절차 (예를 들면, 항체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)를 이용하여 염기서열분석되거나 또는 재조합 방법에 의해 생산되거나 또는 화학적 합성에 의해 획득될 수 있다.
일반적으로, 관심되는 폴리펩티드, 예컨대 예를 들면, 치료 항체의 재조합 대규모 생산을 위해, 상기 폴리펩티드를 안정되게 발현하고 분비하는 세포가 필요하다. 이러한 세포는 "재조합 세포" 또는 "재조합 생산 세포"로 명명되고, 그리고 이런 세포를 생성하는 데 이용되는 과정은 "세포주 개발"로 명명된다. 세포주 개발 과정의 첫 번째 단계에서 적합한 숙주 세포, 예컨대 예를 들면, CHO 세포가 관심되는 상기 폴리펩티드의 발현에 적합한 핵산 서열로 형질감염된다. 두 번째 단계에서, 관심되는 폴리펩티드를 안정되게 발현하는 세포가, 관심되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과 동시형질감염된 선별 마커의 공동발현에 근거하여 선택된다.
폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 다시 말하면, 코딩 서열은 구조 유전자로서 표시된다. 이런 구조 유전자는 순수한 코딩 정보이다. 따라서, 이들의 발현을 위해 추가 조절 요소가 필요하다. 이런 이유로, 통상적으로 구조 유전자는 이른바 발현 카세트에 통합된다. 발현 카세트가 포유류 세포에서 기능적이기 위해 필요한 최소 조절 요소는 구조 유전자의 상류, 다시 말하면, 5'에 위치되는, 상기 포유류 세포에서 기능적인 프로모터, 그리고 구조 유전자의 하류, 다시 말하면, 3'에 위치되는, 상기 포유류 세포에서 기능적인 폴리아데닐화 신호 서열이다. 프로모터, 구조 유전자 및 폴리아데닐화 신호 서열은 작동가능하게 연결된 형태로 배열된다.
관심되는 폴리펩티드가 상이한 (단량체성) 폴리펩티드로 구성되는 이종다합체성 폴리펩티드, 예컨대 예를 들면, 항체 또는 복잡한 항체 형식인 경우에, 단일 발현 카세트뿐만 아니라 내포된 구조 유전자에서 서로 다른 다수의 발현 카세트, 다시 말하면, 이종다합체성 폴리펩티드의 상이한 (단량체성) 폴리펩티드 각각에 대한 적어도 하나의 발현 카세트가 필요하다. 예를 들면, 전장 항체는 경쇄의 2개 사본뿐만 아니라 중쇄의 2개 사본을 포함하는 이종다합체성 폴리펩티드이다. 따라서, 전장 항체는 2개의 상이한 폴리펩티드로 구성된다. 이런 이유로, 전장 항체의 발현을 위해 2개의 발현 카세트: 경쇄에 대한 발현 카세트 및 중쇄에 대한 발현 카세트가 필요하다. 만약, 예를 들면, 전장 항체가 이중특이적 항체이면, 다시 말하면, 항체가 2개의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 상이한 결합 부위를 포함하면, 2개의 경쇄뿐만 아니라 2개의 중쇄가 또한 서로 상이하다. 따라서, 이런 이중특이적 전장 항체는 4개의 상이한 폴리펩티드로 구성되고, 그리고 이런 이유로, 4개의 발현 카세트가 필요하다.
관심되는 폴리펩티드에 대한 발현 카세트(들)는 하나 이상의 이른바 "발현 벡터" 내로 차례로 통합된다. "발현 벡터"는 세균 세포에서 상기 벡터의 증폭뿐만 아니라 포유류 세포에서 포함된 구조 유전자(들)의 발현을 위해 필요한 모든 요소를 제공하는 핵산이다. 전형적으로, 발현 벡터는 예를 들면, 복제 기점을 포함하는 대장균 (E. coli)에 대한 원핵 플라스미드 증식 단위, 그리고 원핵 선별 마커뿐만 아니라 진핵 선별 마커, 그리고 관심되는 구조 유전자(들)의 발현을 위해 필요한 발현 카세트를 포함한다. "발현 벡터"는 포유류 세포 내로 발현 카세트의 도입을 위한 수송 운반제이다.
선행 단락에서 개설된 바와 같이, 발현되는 폴리펩티드가 더 복잡할수록, 필요한 상이한 발현 카세트의 숫자 또한 더 높아진다. 생래적으로 발현 카세트의 숫자와 함께, 숙주 세포의 유전체 내로 통합되는 핵산의 크기 또한 증가한다. 부수적으로, 발현 벡터의 크기 또한 증가한다. 하지만, 약 15 kbps의 범위 안에서 벡터의 크기에 대한 실질적인 상한선이 있는데, 이를 초과하면 취급과 처리 효율이 극심하게 하락한다. 이러한 문제는 두 개 이상의 발현 벡터를 이용함으로써 해소될 수 있다. 그것에 의하여 발현 카세트는 이들 발현 카세트 중에서 단지 일부만을 각각 포함하는 상이한 발현 벡터 사이에 분할되어 크기가 감소될 수 있다.
이종성 폴리펩티드, 예컨대 예를 들면, 다중특이적 항체를 발현하는 재조합 세포의 생성을 위한 세포주 개발 (CLD)은 관심되는 이종성 폴리펩티드의 발현과 생산을 위해 필요한 개별 발현 카세트를 포함하는 핵산(들)의 무작위 통합 (RI) 또는 표적화된 통합 (TI) 중 어느 한 가지를 이용한다.
RI를 이용하면, 일반적으로, 여러 벡터 또는 이들의 단편이 동일하거나 또는 상이한 좌위에서 세포의 유전체 내로 통합된다.
TI를 이용하면, 일반적으로, 상이한 발현 카세트를 포함하는 도입유전자의 단일 사본이 숙주 세포의 유전체 내에 미리 결정된 "핫스팟"에서 통합된다.
(글리코실화된) 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 다세포 생물체 예컨대 예를 들면 척추동물로부터 유래된다.
IV. 숙주 세포
현탁 상태에서 성장하도록 적응되는 임의의 포유류 세포주가 본원 발명에 따른 방법에서 이용될 수 있다. 이에 더하여, 통합 방법, 다시 말하면, RI뿐만 아니라 TI와 독립적으로, 임의의 포유류 숙주 세포가 이용될 수 있다.
유용한 포유류 숙주 세포주의 실례는 인간 양수 세포 (예를 들면 Woelfel, J. et al., BMC Proc. 5 (2011) P133에서 설명된 바와 같은 CAP-T 세포); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들면 Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74에서 설명된 바와 같은 HEK293 또는 HEK293T 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 생쥐 세르톨리 세포 (예를 들면 Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252에서 설명된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 생쥐 유방 종양 (MMT 060562); TRI 세포 (예를 들면 Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68에서 설명된 바와 같음); MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 DHFR-CHO 세포를 비롯한, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 그리고 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 일정한 포유류 숙주 세포주에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268을 참조한다.
일정한 구체예에서, 포유류 숙주 세포는 예를 들면, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (예를 들면 CHO K1, CHO DG44 등), 인간 배아 신장 (HEK) 세포, 림프구양 세포 (예를 들면, Y0, NS0, Sp2/0 세포), 또는 인간 양수 세포 (예를 들면 CAP-T 등)이다. 바람직한 구체예에서 포유류 (숙주) 세포는 CHO 세포이다.
표적화된 통합은 외인성 뉴클레오티드 서열이 포유류 세포의 유전체의 미리 결정된 부위 내로 통합되도록 허용한다. 일정한 구체예에서, 표적화된 통합은 하나 이상의 재조합 인식 서열 (RRS)을 인식하는 재조합효소에 의해 매개되는데, 이들 재조합 인식 서열은 유전체 내에 및 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열 내에 존재한다. 일정한 구체예에서, 표적화된 통합은 상동성 재조합에 의해 매개된다.
"재조합 인식 서열" (RRS)은 재조합효소에 의해 인식되는 뉴클레오티드 서열이고, 그리고 재조합효소-매개된 재조합 사건에 필요하고 충분하다. RRS는 재조합 사건이 뉴클레오티드 서열 내에서 발생할 위치를 규정하는 데 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, RRS는 Cre 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 일정한 구체예에서, RRS는 FLP 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 일정한 구체예에서, RRS는 Bxb1 인테그라아제에 의해 인식될 수 있다. 일정한 구체예에서, RRS는 φC31 인테그라아제에 의해 인식될 수 있다.
RRS가 LoxP 부위인 일정한 구체예에서, 세포는 재조합을 수행하기 위해 Cre 재조합효소를 필요로 한다. RRS가 FRT 부위인 일정한 구체예에서, 세포는 재조합을 수행하기 위해 FLP 재조합효소를 필요로 한다. RRS가 Bxb1 attP 또는 Bxb1 attB 부위인 일정한 구체예에서, 세포는 재조합을 수행하기 위해 Bxb1 인테그라아제를 필요로 한다. RRS가 φC31 attP 또는 φC31 attB 부위인 일정한 구체예에서, 세포는 재조합을 수행하기 위해 φC31 인테그라아제를 필요로 한다. 이들 재조합효소는 단백질 또는 mRNA로서 이들 효소의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 이용하여 세포내로 도입될 수 있다.
TI에 대하여, 유전체의 좌위 내에 단일 부위에서 통합된 본원에서 설명된 바와 같은 착륙 부위를 포함하는 TI에 적합한 임의의 공지된 또는 장래 포유류 숙주 세포가 본원 발명에서 이용될 수 있다. 이런 세포는 포유류 TI 숙주 세포로서 표시된다. 일정한 구체예에서, 포유류 TI 숙주 세포는 본원에서 설명된 바와 같은 착륙 부위를 포함하는 햄스터 세포, 인간 세포, 쥐 세포, 또는 생쥐 세포이다. 바람직한 구체예에서, 포유류 TI 숙주 세포는 CHO 세포이다. 일정한 구체예에서, 포유류 TI 숙주 세포는 유전체의 좌위 내에 단일 부위에서 통합된 본원에서 설명된 바와 같은 착륙 부위를 포함하는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, CHO K1 세포, CHO K1SV 세포, CHO DG44 세포, CHO DUKXB-11 세포, CHO K1S 세포, 또는 CHO K1M 세포이다.
일정한 구체예에서, 포유류 TI 숙주 세포는 통합된 착륙 부위를 포함하고, 여기서 상기 착륙 부위는 하나 이상의 재조합 인식 서열 (RRS)을 포함한다. RRS는 재조합효소, 예를 들면, Cre 재조합효소, FLP 재조합효소, Bxb1 인테그라아제, 또는 φC31 인테그라아제에 의해 인식될 수 있다. RRS는 LoxP 서열, LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, Lox66 서열, FRT 서열, Bxb1 attP 서열, Bxb1 attB 서열, φC31 attP 서열, 그리고 φC31 attB 서열로 구성된 군에서 서로 독립적으로 선택될 수 있다. 만약 복수의 RRS가 존재해야 한다면, 각 서열의 선택은 비동일한 RRS가 선택되는 한에 있어서 다른 것에 의존한다.
일정한 구체예에서, 착륙 부위는 하나 이상의 재조합 인식 서열 (RRS)을 포함하고, 여기서 상기 RRS는 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 일정한 구체예에서, 통합된 착륙 부위는 적어도 2개의 RRS를 포함한다. 일정한 구체예에서, 통합된 착륙 부위는 3개의 RRS를 포함하고, 여기서 세 번째 RRS가 첫 번째와 두 번째 RRS 사이에 위치된다. 일정한 바람직한 구체예에서, 3개의 RRS 모두 상이하다. 일정한 구체예에서, 착륙 부위는 첫 번째, 두 번째와 세 번째 RRS 및 첫 번째와 두 번째 RRS 사이에 위치된 적어도 하나의 선별 마커를 포함하고, 그리고 세 번째 RRS는 첫 번째 및/또는 두 번째 RRS와 상이하다. 일정한 구체예에서, 착륙 부위는 두 번째 선별 마커를 더욱 포함하고, 그리고 첫 번째와 두 번째 선별 마커는 상이하다. 일정한 구체예에서, 착륙 부위는 세 번째 선별 마커 및 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)를 더욱 포함하고, 여기서 상기 IRES는 세 번째 선별 마커에 작동가능하게 연결된다. 세 번째 선별 마커는 첫 번째 또는 두 번째 선별 마커와 상이할 수 있다.
비록 본원 발명이 차후에 CHO 세포로 예시되긴 하지만, 이것은 단지 본원 발명을 예시하기 위해 제시되며, 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원 발명의 진정한 범위는 청구항에서 진술된다.
본원 발명에 따른 방법에서 이용에 적합한 예시적인 포유류 TI 숙주 세포는 유전체의 좌위 내에 단일 부위에서 통합된 착륙 부위를 보유하는 CHO 세포인데, 여기서 상기 착륙 부위는 Cre 재조합효소 매개된 DNA 재조합을 위한 3개의 이종특이적 loxP 부위를 포함한다.
본 실시예에서, 이종특이적 loxP 부위는 L3, LoxFas 및 2L인데 (참조: 예를 들면, Lanza et al., Biotechnol. J. 7 (2012) 898-908; Wong et al., Nucleic Acids Res. 33 (2005) e147), 여기서 L3 및 2L은 각각, 5' 단부 및 3' 단부에서 착륙 부위에 측접하고, 그리고 LoxFas는 L3 및 2L 부위 사이에 위치된다. 착륙 부위는, IRES를 통한 선별 마커의 발현을 형광 GFP 단백질의 발현에 연결하여 양성 선택에 의해 착륙 부위를 안정시킬 뿐만 아니라 형질감염 및 Cre-재조합 후 상기 부위의 부재를 선택하는 것 (음성 선택)을 가능하게 하는 이중시스트론성 단위를 더욱 내포한다. 녹색 형광 단백질 (GFP)은 RMCE 반응을 모니터링하는 데 역할을 한다.
선행 단락에서 개설된 바와 같은 착륙 부위의 이런 입체형상은 2개의 벡터, 예를 들면 L3과 LoxFas 부위를 갖는 이른바 전방 벡터 및 LoxFas와 2L 부위를 갖는 후방 벡터의 동시적 통합을 가능하게 한다. 착륙 부위 내에 존재하는 것과 상이한 선별 마커 유전자의 기능적 요소가 양쪽 벡터 사이에 분포될 수 있다: 프로모터 및 개시 코돈은 전방 벡터 상에 위치될 수 있고, 반면 코딩 영역 및 폴리 A 신호는 후방 벡터 상에 위치된다. 양쪽 벡터로부터 상기 핵산의 정확한 재조합효소-매개된 통합만 개별 선택 작용제에 대한 내성을 유도한다.
일반적으로, 포유류 TI 숙주 세포는 포유류 세포의 유전체의 좌위 내에 단일 부위에서 통합된 착륙 부위를 포함하는 포유류 세포인데, 여기서 상기 착륙 부위는 적어도 하나의 첫 번째 선별 마커에 측접하는 첫 번째와 두 번째 재조합 인식 서열 및 첫 번째와 두 번째 재조합 인식 서열 사이에 위치된 세 번째 재조합 인식 서열을 포함하고, 그리고 모든 재조합 인식 서열은 상이하다.
선별 마커(들)는 아미노글리코시드 인산전달효소 (APH) (예를 들면, 히그로마이신 인산전달효소 (HYG), 네오마이신 및 G418 APH), 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 티미딘 키나아제 (TK), 글루타민 합성효소 (GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소 (인돌), 히스티디놀 탈수소효소 (히스티디놀 D), 그리고 푸로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 및 마이코페놀산에 대한 내성을 인코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 선별 마커(들)는 또한, 녹색 형광 단백질 (GFP), 증강된 GFP (eGFP), 합성 GFP, 황색 형광 단백질 (YFP), 증강된 YFP (eYFP), 청록색 형광 단백질 (CFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-red, DsRed-단량체, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald6, CyPet, mCFPm, Cerulean 및 T-Sapphire로 구성된 군에서 선택되는 형광 단백질일 수 있다.
외인성 뉴클레오티드 서열은 특정한 세포로부터 유래하지 않으며, DNA 전달 방법에 의해, 예를 들면, 형질감염, 전기천공 또는 형질전환 방법에 의해 상기 세포 내로 도입될 수 있는 뉴클레오티드 서열이다. 일정한 구체예에서, 포유류 TI 숙주 세포는 포유류 세포의 유전체 내에 하나 이상의 통합 부위에서 통합된 적어도 하나의 착륙 부위를 포함한다. 일정한 구체예에서, 착륙 부위는 포유류 세포의 유전체의 특정한 좌위 내에 하나 이상의 통합 부위에서 통합된다.
일정한 구체예에서, 통합된 착륙 부위는 적어도 하나의 선별 마커를 포함한다. 일정한 구체예에서, 통합된 착륙 부위는 첫 번째, 두 번째와 세 번째 RRS 및 적어도 하나의 선별 마커를 포함한다. 일정한 구체예에서, 선별 마커는 첫 번째와 두 번째 RRS 사이에 위치된다. 일정한 구체예에서, 2개의 RRS는 적어도 하나의 선별 마커에 측접한다, 다시 말하면, 첫 번째 RRS는 선별 마커의 5' (상류)에 위치되고 두 번째 RRS는 선별 마커의 3' (하류)에 위치된다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 RRS는 선별 마커의 5' 단부에 인접하고 두 번째 RRS는 선별 마커의 3' 단부에 인접한다. 일정한 구체예에서, 착륙 부위는 첫 번째, 두 번째와 세 번째 RRS 및 첫 번째와 세 번째 RRS 사이에 위치된 적어도 하나의 선별 마커를 포함한다.
일정한 구체예에서, 선별 마커는 첫 번째와 두 번째 RRS 사이에 위치되고, 그리고 이들 2개의 측접 RRS는 상이하다. 일정한 바람직한 구체예에서, 첫 번째 측접 RRS는 LoxP L3 서열이고 두 번째 측접 RRS는 LoxP 2L 서열이다. 일정한 구체예에서, LoxP L3 서열은 선별 마커의 5'에 위치되고 LoxP 2L 서열은 선별 마커의 3'에 위치된다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 측접 RRS는 야생형 FRT 서열이고 두 번째 측접 RRS는 돌연변이체 FRT 서열이다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 측접 RRS는 Bxb1 attP 서열이고 두 번째 측접 RRS는 Bxb1 attB 서열이다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 측접 RRS는 φC31 attP 서열이고 두 번째 측접 RRS는 φC31 attB 서열이다. 일정한 구체예에서, 이들 2개의 RRS는 동일한 방향으로 배치된다. 일정한 구체예에서, 이들 2개의 RRS는 둘 모두 정방향 또는 역방향이다. 일정한 구체예에서, 이들 2개의 RRS는 반대의 방향으로 배치된다.
일정한 구체예에서, 통합된 착륙 부위는 첫 번째와 두 번째 선별 마커를 포함하는데, 이들은 2개의 RRS와 측접되고, 여기서 첫 번째 선별 마커는 두 번째 선별 마커와 상이하다. 일정한 구체예에서, 이들 2개의 선별 마커는 둘 모두 서로 독립적으로 글루타민 합성효소 선별 마커, 티미딘 키나아제 선별 마커, HYG 선별 마커, 그리고 푸로마이신 내성 선별 마커로 구성된 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 통합된 착륙 부위는 티미딘 키나아제 선별 마커 및 HYG 선별 마커를 포함한다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 선별 마커는 아미노글리코시드 인산전달효소 (APH) (예를 들면, 히그로마이신 인산전달효소 (HYG), 네오마이신 및 G418 APH), 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 티미딘 키나아제 (TK), 글루타민 합성효소 (GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소 (인돌), 히스티디놀 탈수소효소 (히스티디놀 D), 그리고 푸로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 및 마이코페놀산에 대한 내성을 인코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 두 번째 선별 마커는 GFP, eGFP, 합성 GFP, YFP, eYFP, CFP, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-red, DsRed-단량체, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald, CyPet, mCFPm, Cerulean 및 T-Sapphire 형광 단백질로 구성된 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 선별 마커는 글루타민 합성효소 선별 마커이고 두 번째 선별 마커는 GFP 형광 단백질이다. 일정한 구체예에서, 양쪽 선별 마커에 측접하는 이들 2개의 RRS는 상이하다.
일정한 구체예에서, 선별 마커는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 일정한 구체예에서, 선별 마커는 SV40 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일정한 구체예에서, 선별 마커는 인간 시토메갈로바이러스 (Cytomegalovirus) (CMV) 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
V. 표적화된 통합
본원 발명에 따른 재조합 포유류 세포의 생성을 위한 한 가지 방법은 표적화된 통합 (TI)이다.
표적화된 통합에서, 부위 특이적 재조합이 포유류 TI 숙주 세포의 유전체 내에 특정한 좌위 내로 외인성 핵산의 도입에 이용된다. 이것은 유전체 내에 통합 부위에서 서열이 외인성 핵산으로 교환되는 효소적 과정이다. 이런 핵산 교환을 달성하는 데 이용되는 한 가지 시스템은 Cre-lox 시스템이다. 교환을 촉매하는 효소는 Cre 재조합효소이다. 교환되는 서열은 유전체에서뿐만 아니라 외인성 핵산에서 2개의 lox(P)-부위의 위치에 의해 규정된다. 이들 lox(P)-부위는 Cre 재조합효소에 의해 인식된다. 다른 무언가, 다시 말하면, ATP 등은 필요하지 않다. Cre-lox 시스템은 박테리오파지 P1에서 최초 발견되었다.
Cre-lox 시스템은 포유동물, 식물, 세균 및 효모와 같은 상이한 세포 유형에서 작동한다.
일정한 구체예에서, 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산은 단일 또는 이중 재조합효소 매개된 카세트 교환 (RMCE)에 의해 포유류 TI 숙주 세포 내로 통합되었다. 그것에 의하여, 규정되고 특정한 발현 카세트 서열이 단일 좌위에서 유전체 내로 통합된 재조합 포유류 세포, 예컨대 재조합 CHO 세포가 획득되는데, 이것은 차례로 이종성 폴리펩티드의 효율적인 발현과 생산을 유발한다.
Cre-LoxP 부위 특이적 재조합 시스템은 많은 생물학적 실험 시스템에서 폭넓게 이용되었다. Cre 재조합효소는 34개 bp LoxP 서열을 인식하는 38-kDa 부위 특이적 DNA 재조합효소이다. Cre 재조합효소는 박테리오파지 P1로부터 유래되고 티로신 패밀리 부위 특이적 재조합효소에 속한다. Cre 재조합효소는 LoxP 서열 사이에 분자내와 분자간 재조합 둘 모두를 매개할 수 있다. LoxP 서열은 2개의 13개 bp 반전된 반복과 측접된 8개 bp 비-회문 코어 영역으로 구성된다. Cre 재조합효소는 13개 bp 반복에 결합하고, 그것에 의하여 8개 bp 코어 영역 내에 재조합을 매개한다. Cre-LoxP-매개된 재조합은 높은 효율에서 일어나고 어떤 다른 숙주 인자도 필요로 하지 않는다. 만약 2개의 LoxP 서열이 동일한 뉴클레오티드 서열 상에서 동일한 방향으로 배치되면, Cre 재조합효소-매개된 재조합은 이들 2개의 LoxP 서열 사이에 위치된 DNA 서열을, 공유적으로 닫힌 원으로서 절제할 것이다. 만약 2개의 LoxP 서열이 동일한 뉴클레오티드 서열 상에서 반전된 위치로 배치되면, Cre 재조합효소-매개된 재조합은 이들 두 서열 사이에 위치된 DNA 서열의 방향을 반전시킬 것이다. 만약 2개의 LoxP 서열이 2개의 상이한 DNA 분자 상에 있고, 그리고 만약 하나의 DNA 분자가 환상이면, Cre 재조합효소-매개된 재조합은 환상 DNA 서열의 통합을 유발할 것이다.
용어 "정합 RRS"는 재조합이 2개의 RRS 사이에 일어난다는 것을 암시한다. 일정한 구체예에서, 2개의 정합 RRS는 동일하다. 일정한 구체예에서, 양쪽 RRS는 야생형 LoxP 서열이다. 일정한 구체예에서, 양쪽 RRS는 돌연변이체 LoxP 서열이다. 일정한 구체예에서, 양쪽 RRS는 야생형 FRT 서열이다. 일정한 구체예에서, 양쪽 RRS는 돌연변이체 FRT 서열이다. 일정한 구체예에서, 2개의 정합 RRS는 상이한 서열이지만, 동일한 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 정합 RRS는 Bxb1 attP 서열이고, 그리고 두 번째 정합 RRS는 Bxb1 attB 서열이다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 정합 RRS는 φC31 attB 서열이고, 그리고 두 번째 정합 RRS는 φC31 attB 서열이다.
"2-플라스미드 RMCE" 전략 또는 "이중 RMCE"는 2개의 벡터 조합을 이용할 때, 본원 발명에 따른 방법에서 이용된다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 통합된 착륙 부위는 3개의 RRS, 예를 들면, 세 번째 RRS ("RRS3")가 첫 번째 RRS ("RRS1") 및 두 번째 RRS ("RRS2") 사이에 존재하는 배열을 포함할 수 있었고, 반면 첫 번째 벡터는 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상에서 첫 번째와 세 번째 RRS에 정합하는 2개의 RRS를 포함하고, 그리고 두 번째 벡터는 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상에서 세 번째와 두 번째 RRS에 정합하는 2개의 RRS를 포함한다.
2-플라스미드 RMCE 전략은 2번의 독립된 RMCE를 동시에 실행하기 위해 3개의 RRS 부위를 이용하는 것을 수반한다. 이런 이유로, 2-플라스미드 RMCE 전략을 이용한 포유류 TI 숙주 세포에서 착륙 부위는 첫 번째 RRS 부위 (RRS1) 또는 두 번째 RRS 부위 (RRS2) 중 어느 것과도 교차 활성을 갖지 않는 세 번째 RRS 부위 (RRS3)를 포함한다. 표적화되는 2개의 플라스미드는 효율적인 표적화를 위한 동일한 측접 RRS 부위, RRS1 및 RRS3과 측접된 하나의 플라스미드 (전방), 그리고 RRS3 및 RRS2와 측접된 다른 플라스미드 (후방)를 필요로 한다. 이에 더하여, 2개의 선별 마커가 2-플라스미드 RMCE에서 필요하다. 하나의 선별 마커 발현 카세트는 2개의 부분으로 분할되었다. 전방 플라스미드는 프로모터, 그 이후에 개시 코돈 및 RRS3 서열을 내포할 것이다. 후방 플라스미드는 개시 코돈 (ATG)이 없는 선별 마커 코딩 영역의 N 말단에 융합된 RRS3 서열을 가질 것이다. 추가 뉴클레오티드는 융합 단백질에 대한 인프레임 번역, 다시 말하면, 작동 가능한 연쇄를 담보하기 위해 RRS3 부위 및 선별 마커 서열 사이에 삽입될 필요가 있을 수 있다. 양쪽 플라스미드가 정확하게 삽입될 때에만, 선별 마커의 완전한 발현 카세트가 조립되고, 그리고 따라서, 세포가 개별 선택 작용제에 대해 내성이 되도록 만들 것이다.
2-플라스미드 RMCE는 표적 유전체 좌위 내에 2개의 이종특이적 RRS 및 공여자 DNA 분자 사이에, 재조합효소에 의해 촉매된 이중 재조합 교차 사건을 수반한다. 2-플라스미드 RMCE는 전방과 후방 벡터로부터 DNA 서열의 사본을 포유류 TI 숙주 세포의 유전체의 미리 결정된 좌위 내로 조합으로 도입하도록 설계된다. RMCE는 원핵 벡터 서열이 포유류 TI 숙주 세포의 유전체 내로 도입되지 않고, 따라서 숙주 면역 또는 방어 기전의 원치 않는 촉발을 감소시키고 및/또는 예방하도록 실행될 수 있다. 이러한 RMCE 절차는 복수의 DNA 서열로 반복될 수 있다.
일정한 구체예에서, 표적화된 통합은 2번의 RMCE에 의해 달성되고, 여기서 이종다합체성 폴리펩티드의 부분을 인코딩하는 적어도 하나의 발현 카세트 및/또는 2개의 이종특이적 RRS와 측접된 적어도 하나의 선별 마커 또는 이의 부분을 각각 포함하는 2개의 상이한 DNA 서열 둘 모두 RRS 정합 포유류 TI 숙주 세포의 유전체의 미리 결정된 부위 내로 통합된다. 일정한 구체예에서, 표적화된 통합은 복수의 RMCE에 의해 달성되고, 여기서 이종다합체성 폴리펩티드의 부분을 인코딩하는 적어도 하나의 발현 카세트 및/또는 2개의 이종특이적 RRS와 측접된 적어도 하나의 선별 마커 또는 이의 부분을 각각 포함하는 복수의 벡터로부터 DNA 서열 모두 포유류 TI 숙주 세포의 유전체의 미리 결정된 부위 내로 통합된다. 일정한 구체예에서 선별 마커는 이중 RMCE에 의한 양쪽의 정확한 통합만 선별 마커의 발현을 가능하게 하도록, 첫 번째 벡터에서 부분적으로 인코딩되고 두 번째 벡터에서 부분적으로 인코딩될 수 있다.
일정한 구체예에서, 재조합효소-매개된 재조합을 통한 표적화된 통합은 선별 마커 및/또는 다합체 폴리펩티드에 대한 상이한 발현 카세트가, 원핵 벡터로부터 서열이 없는 숙주 세포 유전체의 하나 이상의 미리 결정된 통합 부위 내로 통합되도록 야기한다.
일정한 구체예의 경우에서와 같이, 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산의 도입 전 또는 그 후에, 녹아웃이 수행될 수 있다는 점이 지적되어야 한다.
VI. 본원 발명에 따른 조성물과 방법
이종성 폴리펩티드를 발현하는 재조합 포유류 세포를 생성하기 위한 방법 및 상기 재조합 포유류 세포를 이용하여 이종성 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법이 본원에서 보고되는데, 여기서 재조합 포유류 세포에서 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 군으로부터 유전자 중에서 적어도 하나의 활성/기능/발현이 감소되거나/제거되거나/축소되거나/(완전히) 녹아웃된다.
본원 발명은 포유류 세포, 예를 들면 예컨대 CHO 세포에서 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 군으로부터 유전자 중에서 적어도 하나의 녹아웃이 예를 들면, 표준 IgG-유형 항체 및 특히 복합적 항체 형식의 재조합 생산성을 향상시킨다는 조사 결과에 적어도 부분적으로 기초된다.
본원 발명은 예시적인 세포주 및 예시적인 이종성 폴리펩티드를 이용하여 하기에서 예시된다. 하지만, 이종성 폴리펩티드 발현에 적합한 임의의 세포가 이용될 수 있다. 본원 발명은 CRISPR-Cas9 매개 유전자 녹아웃을 이용하여 더욱 예시된다. 하지만, 표적 유전자를 감소시키거나 또는 교란하기 위한 임의의 방법 또는 기술, 예를 들면 RNAi, 아연 핑거 또는 TALEN 단백질이 이용될 수 있다. 따라서, 이 모든 것은 본원 발명의 기초가 되는 일반적인 개념의 단순한 예시로서 제시되고 이것을 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구항에서 진술된다.
예시적인 세포주로서, 이전에 생성되고 대규모 치료 단백질 생산에 대한 적절한 성과를 갖는 CHO 세포주가 이용되었다 (참조: 예를 들면, WO 2019/126634).
상이한 개별 유전자 녹아웃 (KO)이 2가지의 항체-생산 CHO 세포주 내로 도입되었다. 한 가지 세포주는 항-PD1-항체-IL2v 융합을 생산하였고, 그리고 다른 것은 항-FAP 항체-CD137 융합을 생산하였다.
이들 녹아웃은 CRISPR-Cas9를 이용하여 생성되었다. CRISPR-Cas9 매개 유전자 녹아웃을 위해, 3가지의 상이한 gRNA를 이용하여 개별 유전자의 코딩 서열 (CDS) 내에 3개의 상이한 부위가, 멀티플렉스 리보핵산단백질 전달을 이용하여 동시에 표적화되었다. 멀티플렉스 리보핵산단백질 전달은 통상적인 플라스미드 기반 CRISPR-Cas9 편집과 비교하여 더 높은 유전자 편집 효능과 특이성을 보여준다. 유전자 표적 부위에서 이중 가닥 절단은 삽입-결실 형성을 유도하거나, 또는 멀티플렉스 gRNA 용법으로 인해 또한, 엑손의 결실은 표적 단백질의 CDS의 프레임시프트를 야기한다.
하기 유전자가 개별적으로 녹아웃되었다:
MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, HIPK2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, LATS2, NF2, PALB2, TP73, FUBP1, NR3C1, PIK3R1, PTCH1, APC, TRPV4, PML, RPS6KA3, RBP2, EGLN2, MAPK14, GPS2, ETS1, E2F5, JUN, p53, CDKN2D, LATS1, NFKBIA, GSK3B, CDKN1A, CDKN2A, RNF43, HTATIP2, EEF2K, RBP1, BNIP3, AKT1, HIF1A, EPHA2, KEAP1, MAPK8IP3, ERK1/MAPK3, ERK2/MAPK1, E2F1, CDKN1C, NUPR1, CAMK1, BAP1, CHK2, CDKN2C, BRCA1, RASA1, RIPK3, EGLN3, ERK5/MAPK7, RPS6KA5, MAPK9, CDKN1B, MXI1, PRKAG2, ATR, SMAD2, FOXO3, BAD, EIF4EBP1, E2F7, FOXO1, CTNNB1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, AJUBA, MAPK8, FBXW7, EGLN1, RIPK1, VHL, CREBBP, CHK1, RBX1, CUL3, WEE1.
항체 생산성 및 성장에 대한 개별 녹아웃의 영향을 보여주기 위해, 4-일 회분식 배양이 수행되었다 (실시예 7 참조). CRISPR-Cas9 표적내 효율에 대한 대조 및 비표적 대조가 포함되었다. 발효 과정에서 이용된 세포 밀도는 꾸준히 증가한다. 결과는 하기 표에서 제시된다:
-: 발현 없음/결과 없음
CHK1 및 WEE1 녹아웃에 의해 알 수 있는 바와 같이, 단백질 발현에 유관할 것으로 예측된 유전자의 변형이 긍정적인 또는 부정적인 효과를 야기할 것인지는 예측가능하지 않다, 다시 말하면 이것은 의도된 바와 반대의 효과, 예컨대, 이들 2가지 사례의 경우에서와 같은 세포 분열의 실속을 야기할 수 있다.
4-일 회분식 발효 과정에서, 상이한 복합적 항체 형식을 발현하는 MYC KO 세포 풀의 경우에, 변형되지 않은 세포 풀 또는 클론과 비교하여 적어도 5 % 및 49% 또는 심지어 99%까지의 생산성 증가, 다시 말하면 생산성의 거의 배증이 획득되었다. 이들 세포 풀이 편집되지 않은, 동형접합성 및 이형접합성 MYC 좌위를 내포하는 세포의 혼합물을 포함한다는 점이 지적되어야 한다. 따라서, 단리된 클론으로 획득되는 향상은 훨씬 높을 것이다.
MYC 유전자 비활성화에 대해 획득된 결과는 14-일 높은 세포 밀도 유가식 배양에서 확증되었다 (실시예 9 참조). 결과는 하기 표에서 도시된다.
검사된 80여 가지의 녹아웃에 대한 상기 데이터는 생산성에 대한 유전자 녹아웃의 비예측성을 증명한다. 알 수 있는 바와 같이, 이들 녹아웃 중 단지 40 %만 생산성 증가를 야기하였고, 나머지는 세포 성장 또는 생산성에 대한 효과가 없거나 또는 유해한 효과를 나타냈다. 일부 녹아웃은 세포에 치명적인 세포 사멸을 야기하거나, 또는 세포 증식이 없거나 낮았다.
MYC 유전자 녹아웃이 양쪽 세포주에서 생산성에 가장 심대한 영향을 주었다. MYC 녹아웃 세포 풀 내에 PCR-증폭된 MYC 좌위의 염기서열분석은 첫 번째 gRNA 결합 부위에서 연쇄 반응의 갑작스런 중단을 드러냈다. 이러한 이론에 한정됨 없이, 결과적으로, 표적 유전자의 인코딩된 단백질의 발현이 차후에, 발현 수준에서 실제적으로 감소되거나 또는 교란된다.
MYC 녹아웃의 효과는 하기 표에서 도시된 바와 같이, 다양한 상이한 단백질로 확증되었다.
MYC 유전자 녹아웃 이외에, 유전자 STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1의 녹아웃이 이종성 항체의 증가된 발현을 야기하였다.
상기 열거된 유전자 활성/발현 중에서 하나의 녹아웃이 이종성 폴리펩티드의 생산에 이용되는 임의의 진핵 세포에서, 특이적으로 재조합 폴리펩티드, 특히 항체를 생산하는 데 이용되거나 또는 이용되도록 의도되는 재조합 CHO 세포에서, 더 특이적으로 표적화된 통합 재조합 CHO 세포에서 유리하다. 이러한 녹아웃은 유의미한 생산성 증가를 야기한다. 이것은 대규모 생산 과정을 위해 경제적으로 매우 중요한데, 그 이유는 이것이, 개별 유가식 배양으로부터 획득 가능한 산물의 높은 수율을 야기하기 때문이다.
상기 목록의 유전자의 녹아웃은 CHO 세포에 한정되지 않으며, 다른 숙주 세포주, 예컨대 HEK293 세포, CAP 세포 및 BHK 세포에서 또한 이용될 수 있다.
유전자 활성/발현을 녹아웃시키기 위해, CRISPR/Cas9 기술이 이용되었다. 유사하게, 임의의 다른 기술 예컨대 아연 핑거-뉴클레아제 또는 TALENS가 이용될 수 있다. 이에 더하여, RNA 침묵 종류, 예컨대 siRNA/shRNA/miRNA가 mRNA 수준 및 그 결과로서 유전자 활성/발현을 녹다운시키는 데 이용될 수 있다.
이러한 이론에 한정됨 없이, 동형접합 녹아웃이 이형접합 녹아웃보다, 생산성 증가에 더 유리한 영향을 주는 것으로 가정된다.
본원 발명은 포유류 세포, 예를 들면 예컨대 CHO 세포에서 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군으로부터 유전자 중에서 적어도 하나의 기능적 녹아웃이 특히 복합적 항체 형식의 재조합 생산성을 향상시킨다는 조사 결과에 적어도 부분적으로 기초된다.
본원 발명은 아래에 요약된다:
본원 발명의 한 가지 독립된 양상은 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 활성 또는/및 기능 또는/및 발현이 감소되거나 또는 제거되거나 또는 축소되거나 또는 (완전히) 녹아웃되는 포유류 세포이다.
본원 발명의 한 가지 독립된 양상은 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 발현이 감소된 포유류 세포이고, 그리고 여기서 상기 포유류는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 상기 적어도 하나의 내인성 유전자의 동일한 유전자형, 그러나 개별 내인성 유전자 발현을 갖고 동일한 조건하에 배양되는 세포와 비교하여 이종성 폴리펩티드에 대한 증가된 생산성을 갖는다.
본원 발명의 한 가지 독립된 양상은 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 동일한 유전자형, 그러나 내인성 유전자 발현을 갖는, 동일한 조건하에 배양된 세포와 비교하여, MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 상기 적어도 하나의 내인성 유전자의 감소된 발현을 갖고, 그리고 외인성 핵산, 다시 말하면 상기 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 도입유전자를 포함하는 재조합 포유류 세포의 이종성 폴리펩티드 역가를 증가시키기 위한 방법이다.
본원 발명의 한 가지 독립된 양상은 향상된 재조합 생산성을 갖는 재조합 포유류 세포를 생산하기 위한 방법인데, 여기서 상기 방법은
a) MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자를 표적으로 하는 뉴클레아제 보조 및/또는 핵산을 포유류 세포에 적용하여 상기 내인성 유전자의 활성을 감소시키는 단계 및
b) 상기 내인성 유전자의 활성이 감소된 포유류 세포를 선택하고,
그것에 의하여 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 상기 적어도 하나의 내인성 유전자의 동일한 유전자형, 그러나 내인성 유전자 발현을 갖는, 동일한 조건하에 배양된 세포와 비교하여 증가된 재조합 생산성을 갖는 재조합 포유류 세포를 생산하는 단계를 포함한다.
본원 발명의 한 가지 독립된 양상은 이종성 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법인데, 상기 방법은
a) 임의적으로 이종성 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에, 상기 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 데옥시리보핵산을 포함하는 재조합 포유류 세포를 배양하는 단계 및
b) 상기 이종성 폴리펩티드를 상기 세포 또는 배양 배지로부터 회수하는 단계를 포함하되,
여기서 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 활성 또는/및 기능 또는/및 발현이 상기 포유류 세포에서 감소되거나 또는 제거되거나 또는 축소되거나 또는 (완전히) 녹아웃된다.
본원 발명의 다른 독립된 양상은 향상된 및/또는 증가된 재조합 생산성을 갖는 재조합 포유류 세포를 생산하기 위한 방법인데, 여기서 상기 방법은
a) MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자를 표적으로 하는 핵산 또는 효소 또는 뉴클레아제 보조 유전자 표적화 시스템을 포유류 세포에 적용하여, 상기 내인성 유전자의 활성 또는/및 기능 또는/및 발현을 감소시키거나 또는 제거하거나 또는 축소하거나 또는 (완전히) 녹아웃시키는 단계 및
b) 상기 내인성 유전자의 활성 또는/및 기능 또는/및 발현이 감소되거나 또는 제거되거나 또는 축소되거나 또는 (완전히) 녹아웃된 포유류 세포를 선택하고,
그것에 의하여 향상된 및/또는 증가된 재조합 생산성을 갖는 재조합 포유류 세포를 생산하는 단계를 포함한다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 의존성 구체예에서, 포유류 세포는 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 상기 포유류 세포에서 기능적인 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되고 상기 포유류 세포에서 기능적인 폴리아데닐화 신호에 작동가능하게 연결된다. 일정한 구체예에서, 포유류 세포는 적합한 배양 조건하에 배양될 때 이종성 폴리펩티드를 분비한다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 녹아웃은 이형접합 녹아웃 또는 동형접합 녹아웃이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 녹아웃 세포주의 생산성은 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 상기 적어도 하나의 내인성 유전자의 동일한 유전자형, 그러나 완전히 기능적인 발현을 갖는 개별 포유류 세포와 비교하여 적어도 5 %, 바람직하게는 10 % 이상, 가장 바람직하게는 20 % 이상 증가된다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 감소 또는 제거 또는 축소 또는 녹아웃은 뉴클레아제 보조 유전자 표적화 시스템에 의해 매개된다. 일정한 구체예에서, 뉴클레아제 보조 유전자 표적화 시스템은 CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1, 아연 핑거 뉴클레아제 및 TALEN으로 구성된 군에서 선택된다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 발현의 감소는 RNA 침묵에 의해 매개된다. 일정한 구체예에서, RNA 침묵은 siRNA 유전자 표적화 및 녹다운, shRNA 유전자 표적화 및 녹다운, 그리고 miRNA 유전자 표적화 및 녹다운으로 구성된 군에서 선택된다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 녹아웃은 i) 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산의 도입 전, 또는 ii) 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산의 도입 후 수행된다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 이종성 폴리펩티드는 항체이다. 일정한 구체예에서, 항체는 두 개 이상의 상이한 결합 부위 및 임의적으로 도메인 교환을 포함하는 항체이다. 일정한 구체예에서, 항체는 3개 이상의 결합 부위 또는 VH/VL-쌍 또는 Fab 단편 및 임의적으로 도메인 교환을 포함한다. 일정한 구체예에서, 항체는 다중특이적 항체이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 이종성 폴리펩티드는 다중특이적 항체를 포함하는 이종성 폴리펩티드 및 항체-다합체-융합 폴리펩티드의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 이종성 폴리펩티드는 아래와 같이 구성된 군에서 선택된다:
i) 첫 번째 Fab 단편 및 두 번째 Fab 단편을 포함하는 도메인 교환을 갖는 전장 항체,
여기서 첫 번째 Fab 단편에서
a) 첫 번째 Fab 단편의 경쇄는 VL과 CH1 도메인을 포함하고 첫 번째 Fab 단편의 중쇄는 VH와 CL 도메인을 포함하거나;
b) 첫 번째 Fab 단편의 경쇄는 VH와 CL 도메인을 포함하고 첫 번째 Fab 단편의 중쇄는 VL과 CH1 도메인을 포함하거나; 또는
c) 첫 번째 Fab 단편의 경쇄는 VH와 CH1 도메인을 포함하고 첫 번째 Fab 단편의 중쇄는 VL과 CL 도메인을 포함하고;
그리고
여기서 두 번째 Fab 단편은 VL과 CL 도메인을 포함하는 경쇄 및 VH와 CH1 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하고;
ii) 도메인 교환 및 추가 중쇄 C 말단 결합 부위를 갖는 전장 항체로서, 다음을 포함하는 전장 항체:
- 전장 항체 경쇄 및 전장 항체 중쇄 각각의 2개의 쌍을 포함하는 하나의 전장 항체로서, 여기서 전장 중쇄 및 전장 경쇄의 각 쌍에 의해 형성된 결합 부위가 첫 번째 항원에 특이적으로 결합하고;
그리고
- 하나의 추가 Fab 단편으로서, 여기서 상기 추가 Fab 단편이 전장 항체의 하나의 중쇄의 C 말단에 융합되고, 여기서 상기 추가 Fab 단편의 결합 부위가 두 번째 항원에 특이적으로 결합하고,
여기서 두 번째 항원에 특이적으로 결합하는 추가 Fab 단편은 i) a) 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 중쇄 가변 도메인 (VH)이 서로 대체되거나, 또는 b) 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인 (CH1)이 서로 대체되도록 도메인 교차를 포함하거나, 또는 ii) 단일 사슬 Fab 단편이고;
iii) 첫 번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 첫 번째 결합 부위 및 두 번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 두 번째 결합 부위를 포함하는 외팔 단일 사슬 항체로서, 다음을 포함하는 외팔 단일 사슬 항체:
- 가변 경쇄 도메인 및 경쇄 카파 또는 람다 불변 도메인을 포함하는 경쇄;
- 가변 경쇄 도메인, 경쇄 불변 도메인, 펩티드성 링커, 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 노브 돌연변이를 갖는 CH3을 포함하는 조합된 경쇄/중쇄;
- 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 홀 돌연변이를 갖는 CH3 도메인을 포함하는 중쇄;
iv) 첫 번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 첫 번째 결합 부위 및 두 번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 두 번째 결합 부위를 포함하는 두팔 단일 사슬 항체로서, 다음을 포함하는 두팔 단일 사슬 항체:
- 가변 경쇄 도메인, 경쇄 불변 도메인, 펩티드성 링커, 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 홀 돌연변이를 갖는 CH3을 포함하는 첫 번째 조합된 경쇄/중쇄;
- 가변 경쇄 도메인, 경쇄 불변 도메인, 펩티드성 링커, 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 노브 돌연변이를 갖는 CH3 도메인을 포함하는 두 번째 조합된 경쇄/중쇄;
v) 첫 번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 첫 번째 결합 부위 및 두 번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 두 번째 결합 부위를 포함하는 공통 경쇄 이중특이적 항체로서, 다음을 포함하는 공통 경쇄 이중특이적 항체:
- 가변 경쇄 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄;
- 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 홀 돌연변이를 갖는 CH3 도메인을 포함하는 첫 번째 중쇄;
- 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 노브 돌연변이를 갖는 CH3 도메인을 포함하는 두 번째 중쇄;
vi) 도메인 교환을 갖는 추가 중쇄 N 말단 결합 부위를 갖는 전장 항체로서, 다음을 포함하는 전장 항체:
- 첫 번째와 두 번째 Fab 단편으로서, 여기서 첫 번째와 두 번째 Fab 단편의 각 결합 부위가 첫 번째 항원에 특이적으로 결합하고;
- 세 번째 Fab 단편으로서, 여기서 세 번째 Fab 단편의 결합 부위가 두 번째 항원에 특이적으로 결합하고, 그리고 여기서 세 번째 Fab 단편이 가변 경쇄 도메인 (VL) 및 가변 중쇄 도메인 (VH)이 서로 대체되도록 도메인 교차를 포함하고; 그리고
- 첫 번째 Fc 영역 폴리펩티드 및 두 번째 Fc 영역 폴리펩티드를 포함하는 Fc 영역;
여기서 첫 번째와 두 번째 Fab 단편은 각각, 중쇄 단편 및 전장 경쇄를 포함하고,
여기서 첫 번째 Fab 단편의 중쇄 단편의 C 말단은 첫 번째 Fc 영역 폴리펩티드의 N 말단에 융합되고,
여기서 두 번째 Fab 단편의 중쇄 단편의 C 말단은 세 번째 Fab 단편의 가변 경쇄 도메인의 N 말단에 융합되고, 그리고 세 번째 Fab 단편의 CH1 도메인의 C 말단은 두 번째 Fc 영역 폴리펩티드의 N 말단에 융합되고;
vii) 임의적으로 펩티드성 링커를 통해 서로 접합된 전장 항체 및 비면역글로불린 모이어티를 포함하는 면역접합체,
그리고
viii) 항체-다합체-융합 폴리펩티드로서, 다음을 포함하는 항체-다합체-융합 폴리펩티드:
(a) 항체 중쇄 및 항체 경쇄, 그리고
(b) N 말단에서 C 말단 방향으로 비항체 다합체 폴리펩티드의 첫 번째 부분, 항체 중쇄 CH1 도메인 또는 항체 경쇄 불변 도메인, 항체 힌지 영역, 항체 중쇄 CH2 도메인 및 항체 중쇄 CH3 도메인을 포함하는 첫 번째 융합 폴리펩티드, 그리고 N 말단에서 C 말단 방향으로 비항체 다합체 폴리펩티드의 두 번째 부분 및 만약 첫 번째 폴리펩티드가 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하면 항체 경쇄 불변 도메인 또는 만약 첫 번째 폴리펩티드가 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하면 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 두 번째 융합 폴리펩티드,
여기서,
(i) (a)의 항체 중쇄 및 (b)의 첫 번째 융합 폴리펩티드, (ii) (a)의 항체 중쇄 및 (a)의 항체 경쇄, 그리고 (iii) (b)의 첫 번째 융합 폴리펩티드 및 (b)의 두 번째 융합 폴리펩티드는 각각 서로 독립적으로, 적어도 하나의 이황화 결합에 의해 서로 공유적으로 연결되고,
여기서,
항체 중쇄 및 항체 경쇄의 가변 도메인은 항원에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성한다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, CDK12, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1 및 SMAD3으로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38 및 CDK12로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC 및 STK11로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 이종성 폴리펩티드는 항체-다합체-융합 폴리펩티드로서,
(a) 항체 중쇄 및 항체 경쇄, 그리고
(b) N 말단에서 C 말단 방향으로 비항체 다합체 폴리펩티드의 첫 번째 부분, 항체 중쇄 CH1 도메인 또는 항체 경쇄 불변 도메인, 항체 힌지 영역, 항체 중쇄 CH2 도메인 및 항체 중쇄 CH3 도메인을 포함하는 첫 번째 융합 폴리펩티드, 그리고 N 말단에서 C 말단 방향으로 비항체 다합체 폴리펩티드의 두 번째 부분 및 만약 첫 번째 폴리펩티드가 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하면 항체 경쇄 불변 도메인 또는 만약 첫 번째 폴리펩티드가 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하면 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 두 번째 융합 폴리펩티드를 포함하는 항체-다합체-융합 폴리펩티드이고,
여기서,
(i) (a)의 항체 중쇄 및 (b)의 첫 번째 융합 폴리펩티드, (ii) (a)의 항체 중쇄 및 (a)의 항체 경쇄, 그리고 (iii) (b)의 첫 번째 융합 폴리펩티드 및 (b)의 두 번째 융합 폴리펩티드는 각각 서로 독립적으로, 적어도 하나의 이황화 결합에 의해 서로 공유적으로 연결되고,
여기서,
항체 중쇄 및 항체 경쇄의 가변 도메인은 항원에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성한다.
일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3 및 CDKN1A로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1 및 CDK12으로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4 및 PPP2CB로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC이다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 융합 폴리펩티드는 비항체 다합체 폴리펩티드의 첫 번째 부분으로서, 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는, TNF 리간드 패밀리 구성원 또는 이의 단편의 두 개의 엑토도메인을 포함하고, 그리고 두 번째 융합 폴리펩티드는 비항체 다합체 폴리펩티드의 두 번째 부분으로서, 상기 TNF 리간드 패밀리 구성원 또는 이의 단편의 단지 하나의 엑토도메인을 포함하거나, 또는 그 반대의 경우이다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 융합 폴리펩티드는 N 말단에서 C 말단 방향으로 비항체 다합체 폴리펩티드의 첫 번째 부분, 항체 경쇄 불변 도메인, 항체 힌지 영역, 항체 중쇄 CH2 도메인 및 항체 중쇄 CH3 도메인을 포함하고, 그리고 두 번째 융합 폴리펩티드는 N 말단에서 C 말단 방향으로 비항체 다합체 폴리펩티드의 두 번째 부분 및 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함한다. 일정한 구체예에서, 비항체 다합체 폴리펩티드의 부분에 인접한 CL 도메인 내에 위치 123 (Kabat EU 넘버링)에서 아미노산이 아르기닌 (R)에 의해 대체되고 위치 124 (Kabat EU 넘버링)에서 아미노산이 리신 (K)에 의해 치환되며, 그리고 여기서 비항체 다합체 폴리펩티드의 부분에 인접한 CH1 도메인 내에 위치 147 (Kabat EU 넘버링)에서 및 위치 213 (Kabat EU 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산 (E)에 의해 치환되었다. 일정한 구체예에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄의 가변 도메인은 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 흑색종 관련 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 (MCSP), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 암배아 항원 (CEA), CD19, CD20 및 CD33으로 구성된 군에서 선택되는 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성한다. 일정한 구체예에서, TNF 리간드 패밀리 구성원은 인간 T 세포 활성화를 동시자극한다. 일정한 구체예에서, TNF 리간드 패밀리 구성원은 4-1BBL 및 OX40L에서 선택된다. 일정한 구체예에서, TNF 리간드 패밀리 구성원은 4-1BBL이고, 그리고 세포 표면 항원은 FAP이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 이종성 폴리펩티드는 이가, 단일특이적 또는 이중특이적 전장 항체 및 비면역글로불린 모이어티를 포함하는 융합 폴리펩티드이고, 여기서 상기 항체는 임의적으로 펩티드성 링커를 통해 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 하나의 단일 말단에서 비면역글로불린 모이어티에 접합된다 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, CDK12, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, CDK12, PARP-1, BARD1, ETS1, E2F5, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, BAD, FOXO1, PBRM1, BRCA2, NOTCH1 및 CREBBP로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC, STK11 및 CDK12로 구성되는 유전자의 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 내인성 유전자는 MYC이다. 일정한 구체예에서, 이종성 폴리펩티드는 인터류킨 2에 접합된 항-PD-1 항체이다. 일정한 구체예에서, 인터류킨-2는 바람직하지 않은 CD25 매개 독성 및 Treg 확대를 방지하기 위해, IL-2Ra (CD25)에 결합이 전폐된 조작된 IL2v 모이어티이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 포유류 세포는 CHO 세포 또는 HEK 세포이다. 일정한 구체예에서, 포유류 세포는 CHO-K1 세포이다. 일정한 구체예에서, 포유류 세포는 현탁 성장 포유류 세포이다.
본원 발명의 다른 독립된 양상은 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하고 상기 이종성 폴리펩티드를 분비하는 재조합 포유류 세포를 생산하기 위한 방법인데, 상기 방법은
a) 포유류 세포의 유전체의 좌위 내에 단일 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유류 세포를 제공하되, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열이 적어도 하나의 첫 번째 선별 마커에 측접하는 첫 번째와 두 번째 재조합 인식 서열 및 첫 번째와 두 번째 재조합 인식 서열 사이에 위치된 세 번째 재조합 인식 서열을 포함하고, 그리고 모든 재조합 인식 서열이 상이하며, 여기서 MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 활성/발현/기능이 감소되거나/제거되거나/녹아웃되는 단계;
b) a) 단계에서 제공된 세포 내로, 3개의 상이한 재조합 인식 서열 및 이종성 폴리펩티드의 폴리펩티드에 대한 1 내지 8개의 발현 카세트를 포함하는 2개의 데옥시리보핵산의 조성물을 도입하되,
첫 번째 데옥시리보핵산이 5'에서 3' 방향으로,
- 첫 번째 재조합 인식 서열,
- 하나 이상의 발현 카세트(들),
- 하나의 두 번째 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 5'-말단 부분 및
- 세 번째 재조합 인식 서열의 첫 번째 사본을 포함하고,
그리고
두 번째 데옥시리보핵산이 5'에서 3' 방향으로,
- 세 번째 재조합 인식 서열의 두 번째 사본,
- 하나의 두 번째 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 3'-말단 부분,
- 하나 이상의 발현 카세트(들) 및
- 두 번째 재조합 인식 서열을 포함하고,
여기서 첫 번째와 두 번째 데옥시리보핵산의 첫 번째 내지 세 번째 재조합 인식 서열은 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상에서 첫 번째 내지 세 번째 재조합 인식 서열에 정합하고,
여기서 하나의 두 번째 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 5'-말단 부분 및 3'-말단 부분은 합쳐질 때 상기 하나의 두 번째 선별 마커의 기능적 발현 카세트를 형성하는 단계;
c)
i) b) 단계의 첫 번째와 두 번째 데옥시리보핵산과 동시에; 또는
ii) 순차적으로 그 후에
하나 이상의 재조합효소를 도입하되,
상기 하나 이상의 재조합효소가 첫 번째와 두 번째 데옥시리보핵산의 재조합 인식 서열을 인식하고; (그리고 임의적으로 여기서 상기 하나 이상의 재조합효소가 2번의 재조합효소 매개된 카세트 교환을 수행하는) 단계;
그리고
d) 두 번째 선별 마커를 발현하고 이종성 폴리펩티드를 분비하는 세포를 선택하고,
그것에 의하여 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하고 이종성 폴리펩티드를 분비하는 재조합 포유류 세포를 생산하는 단계를 포함한다.
본원 발명의 다른 독립된 양상은 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하고 상기 이종성 폴리펩티드를 분비하는 재조합 포유류 세포를 생산하기 위한 방법인데, 상기 방법은
a) 포유류 세포의 유전체의 좌위 내에 단일 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유류 세포를 제공하되, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열이 적어도 하나의 첫 번째 선별 마커에 측접하는 첫 번째와 두 번째 재조합 인식 서열 및 첫 번째와 두 번째 재조합 인식 서열 사이에 위치된 세 번째 재조합 인식 서열을 포함하고, 그리고 모든 재조합 인식 서열이 상이한 단계;
b) a) 단계에서 제공된 세포 내로, 3개의 상이한 재조합 인식 서열 및 이종성 폴리펩티드의 폴리펩티드에 대한 1 내지 8개의 발현 카세트를 포함하는 2개의 데옥시리보핵산의 조성물을 도입하되,
첫 번째 데옥시리보핵산이 5'에서 3' 방향으로,
- 첫 번째 재조합 인식 서열,
- 하나 이상의 발현 카세트(들),
- 하나의 두 번째 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 5'-말단 부분 및
- 세 번째 재조합 인식 서열의 첫 번째 사본을 포함하고,
그리고
두 번째 데옥시리보핵산이 5'에서 3' 방향으로,
- 세 번째 재조합 인식 서열의 두 번째 사본,
- 하나의 두 번째 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 3'-말단 부분,
- 하나 이상의 발현 카세트(들) 및
- 두 번째 재조합 인식 서열을 포함하고,
여기서 첫 번째와 두 번째 데옥시리보핵산의 첫 번째 내지 세 번째 재조합 인식 서열은 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상에서 첫 번째 내지 세 번째 재조합 인식 서열에 정합하고,
여기서 하나의 두 번째 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 5'-말단 부분 및 3'-말단 부분은 합쳐질 때 상기 하나의 두 번째 선별 마커의 기능적 발현 카세트를 형성하는 단계;
c)
i) b) 단계의 첫 번째와 두 번째 데옥시리보핵산과 동시에; 또는
ii) 순차적으로 그 후에
하나 이상의 재조합효소를 도입하되,
상기 하나 이상의 재조합효소가 첫 번째와 두 번째 데옥시리보핵산의 재조합 인식 서열을 인식하고; (그리고 임의적으로 여기서 상기 하나 이상의 재조합효소가 2번의 재조합효소 매개된 카세트 교환을 수행하는) 단계;
d) 임의적으로 두 번째 선별 마커를 발현하고 이종성 폴리펩티드를 분비하는 세포를 선택하는 단계,
e) MYC, STK11, SMAD4, PPP2CB, RBM38, NF1, CDK12, SIN3A, PARP-1, ATM, Hipk2, BARD1, HIF1AN, SMAD3, PALB2, FUBP1, RBL2, RPS6KA3, GPS2, ETS1, E2F5, CDKN1A, RNF43, EEF2K, AKT1, BRCA1, ATR, SMAD2, BAD, FOXO1, PBRM1, NRAS, BRCA2, NOTCH1, CREBBP 및 RBX1로 구성되는 유전자의 군에서 선택되는 적어도 하나의 내인성 유전자의 활성/발현/기능을 감소시키는/제거하는/녹아웃시키는 단계;
그리고
f) 임의적으로 d) 단계의 것들보다 더 높은 역가로, 이종성 폴리펩티드를 발현하고 분비하는 세포를 선택하고,
그것에 의하여 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하고 이종성 폴리펩티드를 분비하는 재조합 포유류 세포를 생산하는 단계를 포함한다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 재조합효소는 Cre 재조합효소이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 데옥시리보핵산은 단일 부위 또는 좌위에서 포유류 세포의 유전체 내로 안정되게 통합된다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 적어도 4개의 발현 카세트를 포함하고, 여기서
- 첫 번째 재조합 인식 서열은 가장 5' (다시 말하면, 첫 번째) 발현 카세트의 5'에 위치되고,
- 두 번째 재조합 인식 서열은 가장 3' 발현 카세트의 3'에 위치되고, 그리고
- 세 번째 재조합 인식 서열은
- 첫 번째와 두 번째 재조합 인식 서열 사이에 및
- 2개의 발현 카세트 사이에 위치되고,
그리고
여기서 모든 재조합 인식 서열은 상이하다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 세 번째 재조합 인식 서열은 네 번째와 다섯 번째 발현 카세트 사이에 위치된다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 선별 마커를 인코딩하는 추가 발현 카세트를 포함한다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 선별 마커를 인코딩하는 추가 발현 카세트를 포함하고, 그리고 상기 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트는 세 번째 재조합 인식 서열의 부분적으로 5' 및 부분적으로 3'에 위치되고, 여기서 상기 발현 카세트의 5' 위치된 부분은 프로모터 및 개시 코돈을 포함하고, 그리고 상기 발현 카세트의 3' 위치된 부분은 개시 코돈이 없는 코딩 서열 및 폴리A 신호를 포함하고, 여기서 상기 개시 코돈은 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트는 세 번째 재조합 인식 서열의
i) 5', 또는
ii) 3', 또는
iii) 부분적으로 5' 및 부분적으로 3'
중 어느 한 가지에 위치된다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트는 세 번째 재조합 인식 서열의 부분적으로 5' 및 부분적으로 3'에 위치되고, 여기서 상기 발현 카세트의 5' 위치된 부분은 프로모터 및 개시 코돈을 포함하고, 그리고 상기 발현 카세트의 3' 위치된 부분은 개시 코돈이 없는 코딩 서열 및 폴리A 신호를 포함한다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 5' 위치된 부분은 개시 코돈에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고, 여기서 상기 프로모터 서열은 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 발현 카세트 각각에 의해 상류에 측접되고 (다시 말하면, 이의 하류에 위치되고), 그리고 상기 개시 코돈은 세 번째 재조합 인식 서열에 의해 하류에 측접되고 (다시 말하면, 이의 상류에 위치되고); 그리고 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 3' 위치된 부분은 개시 코돈을 결여하는 선별 마커를 인코딩하는 핵산을 포함하고, 세 번째 재조합 인식 서열에 의해 상류에 측접되고, 세 번째, 네 번째 또는 다섯 번째 발현 카세트 각각에 의해 하류에 측접된다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 개시 코돈은 번역 개시 코돈이다. 일정한 구체예에서, 개시 코돈은 ATG이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 첫 번째 데옥시리보핵산은 첫 번째 벡터 내로 통합되고, 그리고 두 번째 데옥시리보핵산은 두 번째 벡터 내로 통합된다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 각각의 발현 카세트는 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 코딩 서열 및 폴리아데닐화 신호 서열, 임의적으로 그 이후에 종결자 서열을 포함한다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 이종성 폴리펩티드는 이가 단일특이적 항체, 적어도 하나의 도메인 교환을 포함하는 이가 이중특이적 항체, 그리고 적어도 하나의 도메인 교환을 포함하는 삼가 이중특이적 항체로 구성되는 폴리펩티드의 군에서 선택된다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 재조합효소 인식 서열은 L3, 2L 및 LoxFas이다. 일정한 구체예에서, L3은 서열 번호: 01의 서열을 갖고, 2L은 서열 번호: 02의 서열을 갖고, 그리고 LoxFas는 서열 번호: 03의 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 재조합효소 인식 서열은 L3이고, 두 번째 재조합효소 인식 서열은 2L이고, 그리고 세 번째 재조합효소 인식 서열은 LoxFas이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 프로모터는 인트론 A를 갖는 인간 CMV 프로모터이고, 폴리아데닐화 신호 서열은 bGH 폴리A 부위이고, 그리고 종결자 서열은 hGT 종결자이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 프로모터는 인트론 A를 갖는 인간 CMV 프로모터이고, 폴리아데닐화 신호 서열은 bGH 폴리A 부위이고, 그리고 종결자 서열은, 프로모터가 SV40 프로모터이고, 폴리아데닐화 신호 서열이 SV40 폴리A 부위이고, 종결자 서열이 부재하는 선별 마커(들)의 발현 카세트(들)를 제외하고, hGT 종결자이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, 인간 CMV 프로모터는 서열 번호: 04의 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 인간 CMV 프로모터는 서열 번호: 05의 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 인간 CMV 프로모터는 서열 번호: 06의 서열을 갖는다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, SV40 폴리아데닐화 신호 서열은 서열 번호: 07이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, bGH 폴리아데닐화 신호 서열은 서열 번호: 08이다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, hGT 종결자는 서열 번호: 09의 서열을 갖는다.
본원 발명의 모든 양상과 구체예의 일정한 구체예에서, SV40 프로모터는 서열 번호: 10의 서열을 갖는다.
하기 실시예, 도면 및 서열은 본원 발명에 관한 이해를 보조하기 위해 제공되고, 이의 진정한 범위는 첨부된 청구항에서 진술된다. 발명의 사상으로부터 벗어나지 않으면서, 진술된 절차에서 변형이 만들어질 수 있는 것으로 이해된다.
도면에 관한 설명
모든 도면: CHO 세포 내에 예시적인 유전자에 대한 3개의 독립된 gRNA로 획득된 녹아웃의 검증. 변형되지 않은 부모 세포 (위쪽 크로마토그램; "1.WT.ab1"로서 표시됨) 및 RNP 뉴클레오펙션 7 일 후에 획득된, 녹아웃을 갖는 세포 (아래쪽 크로마토그램; "2.KO.ab1"로서 표시됨)에 대해, 결실 영역에 걸쳐 있는 DNA 서열의 크로마토그램이 제공된다. 삽입 및 결실 사건의 위치와 성격을 검증하기 위해 생어 염기서열분석이 수행되었다. gRNA 및 PAM 모티프의 위치는 각각, 각 gRNA 서열에 대해 표시된다. 개별 가이드의 개열 부위는 수직선에 의해 표시된다. CHO 유전체에서 공개된 유전체 위치: (PICR 유전체); https://www.ncbi. nlm.nih.gov/assembly/GCF_003668045.3/ 참조.
도 1: MYC 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000002.1: 8,114,040-8,118,048.
도 2: STK11 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000219.1 (10540304..10556926).
도 3: PPP2CB 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000044.1 (18735335..18754967).
도 4: RBM38 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치 RAZU01000236.1 (501782..514198).
도 5: NF1 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01001831.1 (12672140..12907880).
도 6: CDK12 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000239.1 (886868..960350).
도 7: SIN3A 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000166.1 (7107379..7169085).
도 8: PARP-1 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000210.1 (10105791..10139187).
도 9: ATM 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000166.1 (10510024..10617455).
도 10: Hipk2 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000045.1 (12630354..12820847).
도 11: BARD1 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000074.1 (44502103..44567572).
도 12: SMAD3 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000166.1 (480665..597614).
도 13: CDKN1A 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000063.1 (8736827..8768979).
모든 도면: CHO 세포 내에 예시적인 유전자에 대한 3개의 독립된 gRNA로 획득된 녹아웃의 검증. 변형되지 않은 부모 세포 (위쪽 크로마토그램; "1.WT.ab1"로서 표시됨) 및 RNP 뉴클레오펙션 7 일 후에 획득된, 녹아웃을 갖는 세포 (아래쪽 크로마토그램; "2.KO.ab1"로서 표시됨)에 대해, 결실 영역에 걸쳐 있는 DNA 서열의 크로마토그램이 제공된다. 삽입 및 결실 사건의 위치와 성격을 검증하기 위해 생어 염기서열분석이 수행되었다. gRNA 및 PAM 모티프의 위치는 각각, 각 gRNA 서열에 대해 표시된다. 개별 가이드의 개열 부위는 수직선에 의해 표시된다. CHO 유전체에서 공개된 유전체 위치: (PICR 유전체); https://www.ncbi. nlm.nih.gov/assembly/GCF_003668045.3/ 참조.
도 1: MYC 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000002.1: 8,114,040-8,118,048.
도 2: STK11 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000219.1 (10540304..10556926).
도 3: PPP2CB 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000044.1 (18735335..18754967).
도 4: RBM38 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치 RAZU01000236.1 (501782..514198).
도 5: NF1 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01001831.1 (12672140..12907880).
도 6: CDK12 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000239.1 (886868..960350).
도 7: SIN3A 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000166.1 (7107379..7169085).
도 8: PARP-1 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000210.1 (10105791..10139187).
도 9: ATM 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000166.1 (10510024..10617455).
도 10: Hipk2 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000045.1 (12630354..12820847).
도 11: BARD1 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000074.1 (44502103..44567572).
도 12: SMAD3 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000166.1 (480665..597614).
도 13: CDKN1A 녹아웃 생어 염기서열분석 결과; 유전체 위치: RAZU01000063.1 (8736827..8768979).
서열에 관한 설명
서열 번호: 01: L3 재조합효소 인식 서열의 예시적인 서열
서열 번호: 02: 2L 재조합효소 인식 서열의 예시적인 서열
서열 번호: 03: LoxFas 재조합효소 인식 서열의 예시적인 서열
서열 번호: 04-06: 인간 CMV 프로모터의 예시적인 변이체
서열 번호: 07: 예시적인 SV40 폴리아데닐화 신호 서열
서열 번호: 08: 예시적인 bGH 폴리아데닐화 신호 서열
서열 번호: 09: 예시적인 hGT 종결자 서열
서열 번호: 10: 예시적인 SV40 프로모터 서열
서열 번호: 11: 예시적인 GFP 핵산 서열
서열 번호: 12-14: SIRT-1 가이드 RNA
서열 번호: 15-17: MYC 가이드 RNA
서열 번호: 18-20: STK11 가이드 RNA
서열 번호: 21-23: SMAD4 가이드 RNA
서열 번호: 24-26: PPP2CB 가이드 RNA
서열 번호: 27-29: RBM38 가이드 RNA
서열 번호: 30-32: NF1 가이드 RNA
서열 번호: 33-35: CDK12 가이드 RNA
서열 번호: 36-38: SIN3A 가이드 RNA
서열 번호: 39-41: PARP-1 가이드 RNA
서열 번호: 42-44: ATM 가이드 RNA
서열 번호: 45-47: Hipk2 가이드 RNA
서열 번호: 48-50: BARD1 가이드 RNA
서열 번호: 51-53: HIF1AN 가이드 RNA
서열 번호: 54-56: SMAD3 가이드 RNA
서열 번호: 57-59: CDKN1A 가이드 RNA
서열 번호: 60+61: MYC 검증 프라이머 정방향과 역방향
서열 번호: 62+63: STK11 검증 프라이머 정방향과 역방향
서열 번호: 64+65: SMAD4 검증 프라이머 정방향과 역방향
서열 번호: 66+67: PPP2CB 검증 프라이머 정방향과 역방향
서열 번호: 68+69: RBM38 검증 프라이머 정방향과 역방향
서열 번호: 70+71: NF1 검증 프라이머 정방향과 역방향
서열 번호: 72+73: CDK12 검증 프라이머 정방향과 역방향
서열 번호: 74+75: SIN3A 검증 프라이머 정방향과 역방향
서열 번호: 76+77: PARP-1 검증 프라이머 정방향과 역방향
서열 번호: 78+79: ATM 검증 프라이머 정방향과 역방향
서열 번호: 80+81: Hipk2 검증 프라이머 정방향과 역방향
서열 번호: 82+83: BARD1 검증 프라이머 정방향과 역방향
서열 번호: 84+85: HIF1AN 검증 프라이머 정방향과 역방향
서열 번호: 86+87: SMAD3 검증 프라이머 정방향과 역방향
서열 번호: 88+89: CDKN1A 검증 프라이머 정방향과 역방향.
실시예
실시예 1
일반적인 기술
1) 재조합 DNA 기술
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, (1989)에서 설명된 바와 같은 표준 방법이 DNA를 조작하는 데 이용되었다. 분자 생물학 시약은 제조업체의 사용설명서에 따라서 이용되었다.
2) DNA 서열 결정
DNA 염기서열분석이 SequiServe GmbH (Vaterstetten, Germany) 또는 Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany) 또는 Microsynth AG (Balgach, Switzerland)에서 수행되었다.
3) DNA와 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
EMBOSS (유럽 분자생물학 개방 소프트웨어 스위트) 소프트웨어 패키지 및 Geneious prime 2019 (Auckland, New Zealand)가 서열 창출, 매핑, 분석, 주해 및 도해에 이용되었다.
4) 유전자와 올리고뉴클레오티드 합성
원하는 유전자 분절이 Geneart GmbH (Regensburg, Germany) 또는 Twist Bioscience (San Francisco, USA)에서 화학적 합성에 의해 제조되었다. 합성된 유전자 단편이 증식/증폭을 위해 대장균 (E. coli) 플라스미드 내로 클로닝되었다. 하위클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열이 DNA 염기서열분석에 의해 실증되었다. 대안으로, 짧은 합성 DNA 단편이 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 어닐링함으로써 또는 PCR을 통해 조립되었다. 이들 개별 올리고뉴클레오티드는 metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Germany)에 의해 제조되었다.
5) 시약
모든 상업적인 화학물질, 항체 및 키트는 별도로 명시되지 않으면, 제조업체의 프로토콜에 따라서 제공된 그대로 이용되었다.
6) TI 숙주 세포주의 배양
TI CHO 숙주 세포가 85% 습도 및 5% CO2를 갖는 가습된 인큐베이터에서 37℃에서 배양되었다. 이들은 300 μg/ml 히그로마이신 B 및 4 μg/ml의 두 번째 선별 마커를 내포하는 독점적인 DMEM/F12 기반 배지에 배양되었다. 이들 세포는 30 ml의 총 용적에서 0.3x10E6개 세포/ml의 농도로 3 또는 4 일마다 분할되었다. 배양을 위해 125 ml 비-배플 Erlenmeyer 진탕 플라스크가 이용되었다. 세포가 5 cm의 진탕 진폭에서 150 rpm으로 진탕되었다. 세포 수가 Cedex HiRes 세포 계수기 (Roche)로 결정되었다. 세포는 60 일령에 도달할 때까지 배양 상태로 유지되었다.
7) 클로닝
일반적:
R-부위를 이용한 클로닝은 후속 단편에 위치하는 서열과 동등한, 관심되는 유전자 (GOI) 바로 다음의 DNA 서열에 의존한다. 그런 식으로, 단편의 조립이 동등한 서열의 중첩 및 DNA 연결효소에 의한 조립된 DNA에서 틈새의 후속 밀봉에 의해 가능하다. 이런 이유로, 오른쪽 R-부위를 내포하는 특정 예비 벡터에서 단일 유전자의 클로닝이 필요하다. 이들 예비 벡터의 성공적인 클로닝 후, R-부위와 측접된 관심되는 유전자가 R-부위 바로 다음을 직접적으로 절단하는 효소에 의한 제한 절단을 통해 절단된다. 마지막 단계는 한 단계에서 모든 DNA 단편의 조립이다. 더 상세하게는, 5'-엑소뉴클레아제가 중첩 영역 (R-부위)의 5' 단부를 제거한다. 그 후, R-부위의 어닐링이 발생할 수 있고, 그리고 DNA 중합효소가 3' 단부를 연장하여 서열 내에 갭을 채운다. 최종적으로, DNA 연결효소가 뉴클레오티드 중간에 틈새를 밀봉한다. 엑소뉴클레아제, DNA 중합효소 및 리가아제와 같은 상이한 효소를 내포하는 조립 마스터 믹스의 첨가, 그리고 50 ℃에서 반응 믹스의 후속 인큐베이션이 이들 단일 단편의 하나의 플라스미드로의 조립을 야기한다. 그 후, 적격성 대장균 (E. coli) 세포가 상기 플라스미드로 형질전환된다.
일부 벡터의 경우에, 제한 효소를 통한 클로닝 전략이 이용되었다. 적합한 제한 효소의 선택에 의해, 원하는 관심 유전자가 절단되고, 그리고 그 후에 결찰에 의해 상이한 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이런 이유로, 바람직하게는, 정확한 어레이에서 단편의 결찰이 수행될 수 있도록, 복수의 클로닝 부위 (MCS)를 절단하는 효소가 스마트한 방식으로 이용되고 선택된다. 만약 벡터와 단편이 동일한 제한 효소로 미리 절단되면, 단편과 벡터의 점착 말단이 완벽하게 함께 적합되고, 그리고 차후에 DNA 연결효소에 의해 결찰될 수 있다. 결찰 후, 적격성 대장균 (E. coli) 세포가 이러한 새로 생성된 플라스미드로 형질전환된다.
제한 절단을 통한 클로닝:
제한 효소로 플라스미드의 절단을 위해, 하기 성분이 얼음 위에 함께 피펫팅되었다:
표: 제한 절단 반응 믹스
만약 더 많은 효소가 한 번의 절단에서 이용되면, 1 μl의 각 효소가 이용되었고, 그리고 용적이 더 많은 또는 더 적은 PCR-등급 물의 첨가에 의해 조정되었다. 모든 효소는 그들이 new England Biolabs로부터 CutSmart 완충액 (100% 활성)과 함께 이용에 유자격이고 동일한 인큐베이션 온도 (모두 37℃)를 갖는다는 전제조건하에 선택되었다.
샘플을 일정한 온도 (37℃)에서 인큐베이션하는 것을 가능하게 하는, 열혼합기 또는 유전자 증폭기를 이용한 인큐베이션이 수행되었다. 인큐베이션 동안, 이들 샘플은 교반되지 않았다. 인큐베이션 시간이 60 분에 세팅되었다. 그 후에 이들 샘플은 부하 염료와 직접적으로 혼합되고, 그리고 아가로오스 전기이동 겔 위에 부하되거나 또는 추가 이용을 위해 4℃에서/얼음 위에서 보관되었다.
겔 전기이동을 위해 1% 아가로오스 겔이 준비되었다. 그 때문에 1.5 g의 다목적 아가로오스가 125 Erlenmeyer 진탕 플라스크 내로 계량되고 150 ml TAE-완충액으로 채워졌다. 아가로오스가 완전히 용해될 때까지, 혼합물이 극초단파 오븐에서 가열되었다. 0.5 μg/ml 브롬화에티듐이 아가로오스 용액 내로 첨가되었다. 그 후에 겔이 주형에서 주조되었다. 아가로오스가 세팅된 후, 주형이 전기이동 챔버 내로 배치되었고, 그리고 상기 챔버가 TAE-완충액으로 채워졌다. 그 후에 샘플이 부하되었다. 첫 번째 포켓 (왼쪽으로부터)에서 적합한 DNA 분자량 마커가 부하되었고, 그 이후에 샘플이 부하되었다. 겔이 <130V에서 대략 60 분 동안 이동되었다. 전기이동 후, 겔이 챔버로부터 이전되고 UV-영상장치에서 분석되었다.
표적 띠가 절단되고 1.5 ml Eppendorf 튜브로 이전되었다. 겔의 정제를 위해, Qiagen로부터 QIAquick Gel 추출 키트가 제조업체의 사용설명서에 따라서 이용되었다. DNA 단편이 추가 이용을 위해 -20℃에서 보관되었다.
결찰을 위한 단편이 삽입물 및 벡터-단편의 길이, 그리고 이들의 서로에 대한 상관에 따라서, 1:2, 1:3 또는 1:5 벡터 대 삽입물의 몰 비율로 함께 피펫팅되었다. 만약 벡터 내로 삽입되어야 하는 단편이 짧으면, 1:5-비율이 이용되었다. 만약 삽입물이 더 길면, 벡터와 관련하여 더 적은 양의 이것이 이용되었다. 50 ng의 양의 벡터가 각 결찰에서 이용되었고, 그리고 특정한 양의 삽입물이 NEBioCalculator로 계산되었다. 결찰을 위해, NEB로부터 T4 DNA 결찰 키트가 이용되었다. 결찰 혼합물에 대한 실례는 다음의 표에서 묘사된다:
표: 결찰 반응 믹스
모든 성분이 얼음 위에 함께 피펫팅되고, DNA 및 물의 혼합으로 시작하여, 완충액의 첨가 및 최종적으로 효소의 첨가가 이어졌다. 반응물이 위아래로 피펫팅에 의해 온화하게 혼합되고, 짧게 마이크로퓨지되고, 그리고 이후 실온에서 10 분 동안 인큐베이션되었다. 인큐베이션 후, T4 리가아제가 65 ℃에서 10 분 동안 열 비활성화되었다. 샘플이 얼음 위에서 냉각되었다. 최종 단계에서, 10-베타 적격성 대장균 (E. coli) 세포가 2 μl의 결찰된 플라스미드로 형질전환되었다 (하기 참조).
R-부위 조립을 통한 클로닝:
조립을 위해, 각 단부에서 R-부위를 갖는 모든 DNA 단편이 얼음 위에서 함께 피펫팅되었다. 4개 초과의 단편이 조립될 때, 동몰 비율 (0.05 ng)의 모든 단편이 제조업체에 의해 권장된 대로 이용되었다. 반응 믹스의 절반은 NEBuilder HiFi DNA 조립 마스터 믹스에 의해 구현되었다. 총 반응 용적이 40 μl이었고 PCR-clean 물로 채움에 의해 도달되었다. 다음의 표에서, 예시적인 피펫팅 기법이 묘사된다.
표: 조립 반응 믹스
반응 혼합물의 설정 후, 튜브가 끊임없이 50℃에서 60 분 동안 유전자증폭기에서 인큐베이션되었다. 성공적인 조립 후, 10-베타 적격성 대장균 (E. coli) 세균이 2 μl의 조립된 플라스미드 DNA로 형질전환되었다 (하기 참조).
10-베타 적격성 대장균 (E. coli) 세포의 형질전환:
형질전환을 위해, 10-베타 적격성 대장균 (E. coli) 세포가 얼음 위에서 해동되었다. 그 후, 2 μl의 플라스미드 DNA가 세포 현탁액 내로 직접적으로 피펫팅되었다. 튜브가 튕겨지고 30 분 동안 얼음 위에 놓였다. 그 후에, 이들 세포는 42℃-온도 장방형 발열체 내로 배치되고 정확하게 30 초 동안 열 충격을 받았다. 그 직후에, 이들 세포는 얼음 위에서 2 분 동안 냉각되었다. 950 μl의 NEB 10-베타 생장 배지가 세포 현탁액에 첨가되었다. 이들 세포는 37℃에서 1 시간 동안 진탕하에 인큐베이션되었다. 이후, 50-100 μl가 미리 가온된 (37℃) LB-Amp 한천 평판 위에 피펫팅되고 일회용 주걱으로 확산되었다. 평판이 37 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션되었다. 암피실린에 대한 내성 유전자를 보유하는 플라스미드를 성공적으로 통합한 세균만 이들 평판에서 성장할 수 있다. 단일 집락이 다음 날 선발되었고, 그리고 후속 플라스미드 제조를 위해 LB-Amp 배지에 배양되었다.
세균 배양:
대장균 (E. coli)의 배양이 0.1 mg/ml의 암피실린 농도를 야기하는 1 ml/L 100 mg/ml 암피실린으로 스파이킹된 LB (루리아 베르타니, Luria Bertani)-배지에서 행위되었다. 상이한 플라스미드 제조 수량을 위해, 하기 양이 단일 세균 집락에 접종되었다.
표: 대장균 (E. coli) 배양 용적
미니-프렙의 경우에, 96 웰 2 ml 딥 웰 평판이 웰마다 1.5 ml LB-Amp 배지로 채워졌다. 집락이 선발되었고, 그리고 이쑤시개가 배지에 밀어 넣어졌다. 모든 집락이 선발될 때, 평판이 점착성 공기 다공성 막으로 폐쇄되었다. 평판이 200 rpm의 진탕 속도로 37℃ 인큐베이터에서 23 시간 동안 인큐베이션되었다.
미니-프렙의 경우에 15 ml-튜브 (환기 뚜껑이 있음)가 3.6 ml LB-Amp 배지로 채워지고 세균 집락으로 동등하게 접종되었다. 인큐베이션 동안 이쑤시개가 제거되지 않고 튜브에 남겨졌다. 96 웰 평판과 유사하게, 이들 튜브는 37℃, 200 rpm에서 23 시간 동안 인큐베이션되었다.
맥시-프렙의 경우에 200 ml의 LB-Amp 배지가 고압멸균된 유리 1 L Erlenmeyer 플라스크 내로 채워지고, 그리고 대략 5 시간된 1 ml의 세균 하루-배양액이 접종되었다. Erlenmeyer 플라스크가 페이퍼 플러그로 폐쇄되고 37℃, 200 rpm에서 16 시간 동안 인큐베이션되었다.
플라스미드 제조:
미니-프렙의 경우에, 50 μl의 세균 현탁액이 1 ml 딥 웰 평판 내로 이전되었다. 그 후, 세균 세포가 평판에서 3000 rpm, 4℃에서 5 분 동안 원심분리되었다. 상층액이 제거되었고, 그리고 세균 펠렛이 포함된 평판이 EpMotion 내로 배치되었다. ca. 90 분 후, 이동이 실행되었고, 그리고 용리된 플라스미드-DNA가 추가 이용을 위해 EpMotion으로부터 이전될 수 있었다.
미니-프렙의 경우에, 15 ml 튜브가 인큐베이터로부터 꺼내지고, 그리고 3.6 ml 세균 배양액이 2개의 2 ml Eppendorf 튜브 내로 분할되었다. 이들 튜브는 실온에서 3 분 동안 테이블톱 마이크로원심분리기에서 6,800xg로 원심분리되었다. 그 후, 미니-프렙이 제조업체의 사용설명서에 따라서 Qiagen QIAprep Spin Miniprep 키트로 수행되었다. 플라스미드 DNA 농도가 나노드롭으로 계측되었다.
제조업체의 사용설명서에 따라서 Macherey-Nagel NucleoBond® Xtra Maxi EF 키트를 이용하여 맥시-프렙이 수행되었다. DNA 농도가 나노드롭으로 계측되었다.
에탄올 침전:
DNA 용액의 용적이 2.5배 용적 에탄올 100%와 혼합되었다. 혼합물이 -20℃에서 10 분 동안 인큐베이션되었다. 이후 DNA가 14,000 rpm, 4℃에서 30 분 동안 원심분리되었다. 상층액이 조심스럽게 제거되었고, 그리고 펠렛이 70% 에탄올로 세척되었다. 다시 한 번, 튜브가 14,000 rpm, 4℃에서 5 분 동안 원심분리되었다. 상층액이 피펫팅에 의해 조심스럽게 제거되었고, 그리고 펠렛이 건조되었다. 에탄올이 증발될 때, 적합한 양의 내독소-없는 물이 첨가되었다. 상기 DNA는 4 ℃에서 하룻밤 동안 물에서 재용해될 때까지 시간이 제공되었다. 적은 분취량이 채취되었고, 그리고 DNA 농도가 나노드롭 장치로 계측되었다.
실시예 2
플라스미드 생성
발현 카세트 조성
항체 사슬의 발현을 위해, 하기의 기능적 요소를 포함하는 전사 단위가 이용되었다:
- 인트론 A를 포함하는 인간 시토메갈로바이러스로부터 극초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역 (5'UTR),
- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 개별 항체 사슬을 인코딩하는 핵산,
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA), 그리고
- 임의적으로 인간 가스트린 종결자 (hGT).
발현되는 원하는 유전자를 포함하는 발현 단위/카세트 이외에, 기본/표준 포유류 발현 플라스미드는
- 대장균 (E. coli)에서 이러한 플라스미드의 복제를 가능하게 하는, 벡터 pUC18로부터 복제 기점, 그리고
- 대장균 (E. coli)에서 암피실린 내성을 부여하는 베타 락타마아제 유전자를 내포한다.
전방과 후방 벡터 클로닝
2-플라스미드 항체 작제물을 작제하기 위해, 항체 HC와 LC 단편이 L3 및 LoxFas 서열을 내포하는 전방 벡터 백본, 그리고 LoxFas와 2L 서열 및 Pac 선별가능 마커를 내포하는 후방 벡터 내로 클로닝되었다. Cre 재조합효소 플라스미드 pOG231 (Wong, E.T., et al., Nucl. Acids Res. 33 (2005) e147; O'Gorman, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 14602-14607)이 모든 RMCE 과정에 이용되었다.
개별 항체 사슬을 인코딩하는 cDNA가 유전자 합성 (Geneart, Life Technologies Inc.)에 의해 생성되었다. 유전자 합성 및 백본-벡터가 37 ℃에서 1 시간 동안 HindIII-HF 및 EcoRI-HF (NEB)로 절단되고 아가로즈 겔 전기이동에 의해 분리되었다. 삽입물 및 백본의 DNA-단편이 아가로오스 겔로부터 절단되고 QIAquick Gel 추출 키트 (Qiagen)에 의해 추출되었다. 정제된 삽입물 및 백본 단편이 3:1의 삽입물/중추 비율에서 제조업체의 프로토콜에 따라서 신속 결찰 키트 (Roche)를 통해 결찰되었다. 결찰 접근법이 이후, 42 ℃에서 30 초 동안 열 충격을 통해 적격성 대장균 (E. coli) DH5α에서 형질전환되었고, 그리고 그들이 선택을 위해 암피실린이 포함된 한천 평판에서 도말되기 전 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션되었다. 평판이 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션되었다.
다음 날에 클론이 선발되었고, 그리고 각각, EpMotion® 5075 (Eppendorf)로 또는 QIAprep Spin Mini-Prep 키트 (Qiagen)/ NucleoBond Xtra Maxi EF 키트 (Macherey & Nagel)로 수행된 미니 또는 맥시-제조를 위해 37 ℃에서 진탕하에 하룻밤 동안 인큐베이션되었다. 임의의 바람직하지 않은 돌연변이의 부재를 담보하기 위해 모든 작제물이 염기서열분석되었다 (SequiServe GmbH).
두 번째 클로닝 단계에서, 사전에 클로닝된 벡터가 첫 번째 클로닝에서와 동일한 조건에서 KpnI-HF/SalI-HF 및 SalI-HF/MfeI-HF로 절단되었다. TI 백본 벡터가 KpnI-HF 및 MfeI - HF로 절단되었다. 분리와 추출이 상기에서 설명된 바와 같이 수행되었다. 정제된 삽입물 및 백본의 결찰이 4 ℃에서 하룻밤 동안 1:1:1의 삽입물/삽입물/중추 비율에서 제조 프로토콜에 따라서 T4 DNA 연결효소 (NEB)를 이용하여 수행되었고, 그리고 65 ℃에서 10 분 동안 비활성화되었다. 하기 클로닝 단계가 전술된 바와 같이 수행되었다.
클로닝된 플라스미드는 TI 형질감염 및 풀 생성에 이용되었다.
실시예 3
배양, 형질감염, 선택 및 단일 세포 클로닝
TI 숙주 세포가 독점적인 DMEM/F12 기반 배지에서 150 rpm의 일정한 교반 속도에서 표준 가습된 조건 (95% rH, 37℃ 및 5% CO2)하에 일회용 125 ml 배기된 진탕 플라스크에서 증식되었다. 3-4 일마다 세포가 선별 마커 1 및 선별 마커 2를 유효 농도로 내포하는 화학적으로 규정된 배지에서 3x10E5 세포/ml의 농도로 파종되었다. 배양액의 밀도와 생존력이 Cedex HiRes 세포 계수기 (F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerland)로 계측되었다.
안정된 형질감염을 위해, 동몰량의 전방과 후방 벡터가 혼합되었다. 1 μg Cre 발현 플라스미드가 5 μg의 혼합물마다 첨가되었다, 다시 말하면, 5 μg Cre 발현 플라스미드 또는 Cre mRNA가 25 μg의 전방과 후방 벡터 혼합물에 첨가되었다.
형질감염보다 2일 앞서, TI 숙주 세포가 신선한 배지에서 4x10E5 세포/ml의 밀도로 파종되었다. 형질감염이 제조업체의 프로토콜에 따라서 뉴클레오펙터 키트 V (Lonza, Switzerland)를 이용한 뉴클레오펙터 장치로 수행되었다. 3x10E7 세포가 총 30 μg 핵산으로, 다시 말하면, 30 μg 플라스미드 (5 μg Cre 플라스미드 및 25 μg 전방과 후방 벡터 혼합물) 또는 5 μg Cre mRNA 및 25 μg 전방과 후방 벡터 혼합물 중 어느 한 가지로 형질감염되었다. 형질감염 후, 이들 세포는 선택 작용제가 없는 30 ml 배지에 파종되었다.
파종 후 5일 자에, 이들 세포는 원심분리되고, 그리고 재조합 세포의 선택을 위해 6x10E5 세포/ml의 유효 농도에서 푸로마이신 (선택 작용제 1) 및 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-1-베타-D-아라비노푸라노실-5-요오드)우라실 (FIAU; 선택 작용제 2)을 내포하는 80 mL 화학적으로 규정된 배지로 이전되었다. 이들 세포는 그날부터, 분할 없이 37℃, 150 rpm, 5% CO2 및 85% 습도에서 배양되었다. 배양액의 세포 밀도와 생존력이 규칙적으로 모니터링되었다. 배양액의 생존력이 다시 증가하기 시작할 때, 선택 작용제 1과 2의 농도가 이전에 이용된 양의 약 절반까지 감소되었다. 더 상세하게는, 세포의 회수를 증진하기 위해, 만약 생존력이 > 40 %이고 생존가능 세포 밀도 (VCD)가 > 0.5x10E6개 세포/mL이면, 선택 압력이 감소되었다. 이런 이유로, 4x10E5 세포/ml가 원심분리되고 40 ml 선별 배지 II (화학적으로-규정된 배지, ½ 선별 마커 1 & 2)에서 재현탁되었다. 이들 세포는 앞서와 동일한 조건에서 인큐베이션되고, 그리고 또한 분할되지 않았다.
선택을 시작하고 10 일 후, Cre 매개된 카세트 교환의 성공이 세포내 GFP 및 세포 표면에 결합된 세포외 이종성 폴리펩티드의 발현을 계측하는 유세포분석법에 의해 검사되었다. 인간 항체 경쇄와 중쇄에 대한 APC 항체 (알로피코시아닌-표지화된 F(ab')2 단편 염소 항인간 IgG)가 FACS 염색에 이용되었다. 유세포분석법이 BD FACS Canto II 유세포분석기 (BD, Heidelberg, Germany)로 수행되었다. 샘플마다 만 개의 사건이 계측되었다. 생존 세포가 측면 산란 (SSC)에 대한 전방 산란 (FSC)의 플롯에서 게이팅되었다. 생존 세포 게이트가 비-형질감염된 TI 숙주 세포로 규정되고, 그리고 FlowJo 7.6.5 EN 소프트웨어 (TreeStar, Olten, Switzerland)를 이용함으로써 모든 샘플에 적용되었다. GFP의 형광이 FITC 통로 (488 nm에서 여기, 530 nm에서 검출)에서 정량되었다. 이종성 폴리펩티드가 APC 통로 (645 nm에서 여기, 660 nm에서 검출)에서 계측되었다. 부모 CHO 세포, 다시 말하면, TI 숙주 세포의 생성에 이용된 세포는 GFP 및 이종성 폴리펩티드 발현에 대하여 음성 대조로서 이용되었다. 선택이 시작되고 14 일 내지 21 일 후, 생존력이 90%를 초과하였고, 그리고 선택이 완료된 것으로 고려되었다.
선택 후, 안정되게 형질감염된 세포의 풀에 제한 희석에 의한 단세포 클로닝이 실행될 수 있다. 이러한 목적으로, 세포가 Cell Tracker GreenTM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)으로 염색되고 384-웰 평판에 0.6개 세포/웰로 도말된다. 단세포 클로닝 및 모든 추가 배양 단계의 경우에, 선택 작용제 2가 배지로부터 제외된다. 단지 하나의 세포만을 내포하는 웰이 명시야 및 형광 기반 평판 영상화에 의해 확인된다. 하나의 세포를 내포하는 웰만 추가로 고려된다. 도말 후 대략 3주에, 집락이 합류성 웰로부터 선발되고 96 웰 평판에서 더욱 배양된다.
실시예 4
FACS 선별검사
형질감염 효율 및 형질감염의 RMCE 효율을 검사하기 위해, FACS 분석이 수행되었다. 형질감염된 접근법의 4x10E5 세포가 원심분리되고 (1200 rpm, 4 분) 1 mL PBS로 2회 세척되었다. PBS로 세척 단계 후, 펠렛이 400 μL PBS에서 재현탁되고 FACS 튜브 (셀 스트레이너 캡이 달린 Falcon ® 둥근 바닥 튜브; Corning)에 이전되었다. 계측이 FACS Canto II로 수행되었고, 그리고 데이터가 소프트웨어 FlowJo에 의해 분석되었다.
실시예 5
유가식 배양
유가식 생산 배양이 독점적인 화학적으로 규정된 배지를 포함하는 진탕 플라스크 또는 Ambr15 용기 (Sartorius Stedim)에서 수행되었다. 세포가 0일 자에 2x10E6개 세포/ml로 파종되었다. 배양액은 3, 7 및 10일 자에 독점적인 유가 배지를 제공받았다. 배양 중인 세포의 생존가능 세포 수 (VCC) 및 생존력 퍼센트가 0, 3, 7, 10 및 14일 자에 Cedex HiRes 기기 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 이용하여 계측되었다. 글루코오스, 유산염 및 산물 역가 농도가 3, 5, 7, 10, 12 및 14일 자에 Cobas 분석기 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 이용하여 계측되었다. 상층액이 원심분리 (10 분, 1000 rpm 및 10 분, 4000 rpm)에 의해 유가식 배양의 시작 후 14 일째에 수확되고 여과 (0.22 μm)에 의해 정화되었다. 14일 자 역가가 UV 검출과 함께 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 결정되었다. 산물 품질이 Caliper의 LabChip (Caliper Life Sciences)에 의해 결정되었다.
실시예 6
CHO 세포에서 RNP 기반 CRISPR-Cas9 유전자 녹아웃
재료/공급원:
ㆍ 가이드 및 프라이머 설계를 위한 Geneious 11.1.5 소프트웨어
ㆍ CHO TI 숙주 세포주; 배양 상태: 30-60일 자
ㆍ TrueCut™ Cas9 단백질 v2 (Invitrogen™)
ㆍ TrueGuide 합성 gRNA (표적 유전자에 대해 맞춤 설계됨, 3nm 변형되지 않은 gRNA, Thermo Fisher)
ㆍ TrueGuide™ sgRNA 음성 대조, 비표적화 1 (Thermo Fisher)
ㆍ 배지 (200 μg/ml 히그로마이신 B, 4 μg/ml 선택 작용제 2)
ㆍ DPBS - Ca 및 Mg가 없는 Dulbecco의 인산염 완충된 식염수 (Thermo Fisher)
ㆍ 덮개 (자체 제작)가 있는 마이크로평판 24 딥 웰 평판 (Agilent Technologies, Porvoir science)
ㆍ OC-100 카세트를 부하하기 위한 얇고, 긴 RNA분해효소, DNA분해효소, 발열원 없는 필터 팁 (Biozyme)
ㆍ Hera Safe 후드 (Thermo Fisher)
ㆍ Cedex HiRes 분석기 (Innovatis)
ㆍ Liconic 인큐베이터 Storex IC
ㆍ HyClone 전기천공 완충액
ㆍ MaxCyte OC-100 카세트
ㆍ MaxCyte STX 전기천공 시스템
CRISPR-Cas9 RNP 전달
RNP가 10 μL PBS에서 5 μg Cas9를 1 μg gRNA 믹스 (동등한 비율의 각 gRNA - 예시적인 유전자 특이적 gRNA 서열에 대해 아래의 표를 참조한다)와 혼합함으로써 선조립되고 실온에서 20 분 동안 인큐베이션되었다. 2-4x10E6개 세포/mL 사이의 농도를 갖는 세포가 원심분리되고 (3 분, 300 g), 500 μL PBS로 세척되었다. 세척 단계 후, 이들 세포는 다시 한 번 원심분리되고 (3 분, 300 g), 90 μL Hyclone 전기천공 완충액에서 재현탁되었다. 예비인큐베이션된 RNP 믹스가 이들 세포에 첨가되고 5 분 동안 인큐베이션되었다. 세포/RNP 용액은 이후, OC-100 큐벳 내로 이전되고, 그리고 MaxCyte 전기천공 시스템을 이용하여 프로그램 "CHO2"로 전기천공되었다. 전기천공 직후에, 세포 현탁액이 24 dwell 내로 이전되고 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션되었다. 신선하고 미리 가온된 배지가 1x10E6개의 최종 세포 농도로 첨가되고, 그리고 세포 확대를 위해 350 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 인큐베이션되었다. 유전체 DNA 준비 (6 또는 8일 자)를 위해, QuickExtract 키트 (Lucigen)가 세포에 추가되고 PCR 주형으로서 역할을 하였다. 특이적 유전자 앰플리콘이 표준 Q5 Hot Start 중합효소 프로토콜 (NEB) 및 gRNA 표적 부위에 걸쳐 있는 유전자 특이적 프라이머 (예를 들면 아래의 표 참조)를 이용하여 PCR-증폭되었다. 개별 앰플리콘이 QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen)를 이용하여 정제되고, 그리고 녹아웃에 의한 유전자 비활성화를 실증하기 위해 Eurofins Genomics GmbH에 의한 생어 염기서열분석 (예를 들면 도 1 내지 13을 참조한다)에 의해 분석되었다.
실시예 7
4-일 회분식 배양
회분식 생산 배양이 6 웰, 딥 웰 평판 또는 24 웰, 딥 웰 평판 또는 독점적인 화학적으로 규정된 배지를 포함하는 진탕 플라스크에서 수행되었다. 세포가 5x10E6개 세포/ml로 파종되었다. 배양 중인 세포의 생존가능 세포 수 (VCC) 및 생존력 퍼센트가 0, 2, 4일 자에 Cedex HiRes (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 또는 Cellavista (Synentec GmbH, Elmshorn, Germany)를 이용하여 계측되었다. 글루코오스 농도, 유산염 농도 및 산물 역가가 0, 2, 4일 자에 Cobas 분석기 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 이용하여 계측되었다. 상층액이 원심분리 (10 분, 1000 rpm, 그 이후에 10 분, 4000 rpm)에 의해 회분식 배양의 시작 후 4 일째에 수확되고 여과 (0.22 μm)에 의해 정화되었다. 역가가 UV 검출과 함께 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 결정되었다. 산물 품질이 Caliper의 LabChip (Caliper Life Sciences)에 의해 결정되었다.
실시예 8
유가식 배양
유가식 생산 배양이 독점적인 화학적으로 규정된 배지를 포함하는 진탕 플라스크 또는 Ambr15 용기 (Sartorius Stedim)에서 수행되었다. 세포가 2x10E6개 세포/ml로 파종되었다. 배양액은 3, 7 및 10일 자에 독점적인 유가 배지를 제공받았다. 배양 중인 세포의 생존가능 세포 수 (VCC) 및 생존력 퍼센트가 0, 3, 7, 10 및 14일 자에 Cedex HiRes (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 이용하여 계측되었다. 글루코오스 농도, 유산염 농도 및 산물 역가가 3, 5, 7, 10, 12 및 14일 자에 Cobas 분석기 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 이용하여 계측되었다. 상층액이 원심분리 (10 분, 1000 rpm, 그 이후에 10 분, 4000 rpm)에 의해 유가식 배양의 시작 후 14 일째에 수확되고 여과 (0.22 μm)에 의해 정화되었다. 14일 자 역가가 UV 검출과 함께 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 더욱 결정되었다. 산물 품질이 Caliper의 LabChip (Caliper Life Sciences)에 의해 결정되었다.
실시예 9
높은 세포 밀도 유가식 배양
유가식 생산 배양이 독점적인 화학적으로 규정된 배지를 포함하는 Ambr 15 또는 Ambr 250 용기 (Sartorius Stedim)에서 수행되었다. 세포가 0일 자에 15x10E6개 세포/ml로 파종되었다. 배양액은 1, 3 및 6일 자에 독점적인 유가 배지를 제공받았다. 배양 중인 세포의 생존가능 세포 수 (VCC) 및 생존력 퍼센트가 0, 3, 7, 10 및 14일 자에 Cedex HiRes 기기 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 이용하여 계측되었다. 글루코오스 농도, 유산염 농도 및 산물 역가가 3, 5, 7, 10, 12 및 14일 자에 Cobas 분석기 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 이용하여 계측되었다. 상층액이 원심분리 (10 분, 1000 rpm, 그 이후에 10 분, 4000 rpm)에 의해 배양의 시작 후 14 일째에 수확되고 여과 (0.22 μm)에 의해 정화되었다. 14일 자 역가가 UV 검출과 함께 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 더욱 결정되었다. 산물 품질이 Caliper의 LabChip (Caliper Life Sciences)에 의해 결정되었다.
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<400> 11
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tctgcagtcg acggtaccgc gggcccggga 780
tccaccggat ctagatga 798
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SIRT-1 guide RNA
<400> 12
tatcatccaa ctcaggtgga 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SIRT-1 guide RNA
<400> 13
gcagcatctc atgattggca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SIRT-1 guide RNA
<400> 14
gcattcttga agtaacttca 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MYC guide RNA
<400> 15
ctatgacctc gactacgact 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MYC guide RNA
<400> 16
ggacgcagcg accgtcacat 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MYC guide RNA
<400> 17
caccatctcc agctgatccg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STK11 guide RNA
<400> 18
cagccacccg agatcgccaa 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STK11 guide RNA
<400> 19
gacacctgcc ggacgagcca 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STK11 guide RNA
<400> 20
ccaggccgtc aatcagctgg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMAD4 guide RNA
<400> 21
ctgcctgcca gaatactggc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMAD4 guide RNA
<400> 22
tctgcaacag tccttcacta 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMAD4 guide RNA
<400> 23
gtaacaatag ggcagcttga 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PPP2CB guide RNA
<400> 24
gagcgtatta caatattgag 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PPP2CB guide RNA
<400> 25
tgtaaagtat ttccatacgt 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PPP2CB guide RNA
<400> 26
ccatctacta aagctgtaag 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RBM38 guide RNA
<400> 27
aggtgcctgg tactgcacga 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RBM38 guide RNA
<400> 28
atatgggtac tggtcgtagg 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RBM38 guide RNA
<400> 29
cgtatattca aggtagggcg 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NF1 guide RNA
<400> 30
aataattcag gatatatcca 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NF1 guide RNA
<400> 31
aatttgcagt ggccaaactg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NF1 guide RNA
<400> 32
ccaaactgcg gctttacgtt 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDK12 guide RNA
<400> 33
actatgacct tagccccccg 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDK12 guide RNA
<400> 34
ttagcaagtc tcgggaccgc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDK12 guide RNA
<400> 35
gcttgtgctt cgacaccaag 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SIN3A guide RNA
<400> 36
attctgtgag aaatgaccat 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SIN3A guide RNA
<400> 37
acgtctcttc aaaaaccagg 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SIN3A guide RNA
<400> 38
ttttgaagag acgtgccacc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PARP-1 guide RNA
<400> 39
ttgctttgtc aagaaccggg 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PARP-1 guide RNA
<400> 40
tatagtgcca gccagctcaa 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PARP-1 guide RNA
<400> 41
cggttcttga caaagcaagt 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATM guide RNA
<400> 42
cttctacctc aacaacgtcg 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATM guide RNA
<400> 43
tcacagttag gtaaactgga 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATM guide RNA
<400> 44
atatgtgtta cgatgcctta 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hipk2 guide RNA
<400> 45
tggtagagaa ggcggaccga 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hipk2 guide RNA
<400> 46
ataggtcaat gaattcccgt 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hipk2 guide RNA
<400> 47
gtgtcattgt gacaaagggg 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BARD1 guide RNA
<400> 48
gcttgcagaa aatatactgt 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BARD1 guide RNA
<400> 49
tagctgagat caacaagaag 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BARD1 guide RNA
<400> 50
catctaacct tcttacttcg 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIF1AN guide RNA
<400> 51
tgtgtaccct gctctgaagt 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIF1AN guide RNA
<400> 52
cttcaaacca aggtccagca 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIF1AN guide RNA
<400> 53
acaggatata cagcatcgag 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMAD3 guide RNA
<400> 54
ggtcaggcca tcgccacagg 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMAD3 guide RNA
<400> 55
ggcaaactca catagctcca 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMAD3 guide RNA
<400> 56
gccgggatct cggtgtggcg 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDKN1A guide RNA
<400> 57
gagaggttcc gggtccaccg 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDKN1A guide RNA
<400> 58
accgttctcg ggcctcctgg 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDKN1A guide RNA
<400> 59
ccacgggacc gaagagacgg 20
<210> 60
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MYC verfication primer forward
<400> 60
cacacacaca cttggaag 18
<210> 61
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MYC verfication primer reverse
<400> 61
cttgatgaag gtctcgtc 18
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STK11 verfication primer forward
<400> 62
ctagagaaaa cccacagttc 20
<210> 63
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STK11 verfication primer reverse
<400> 63
tctggccttc taattgtc 18
<210> 64
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMAD4 verfication primer forward
<400> 64
taggtgtgta tggtgcag 18
<210> 65
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMAD4 verfication primer reverse
<400> 65
aggtcttctc ctagtgctc 19
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PPP2CB verfication primer forward
<400> 66
cttgtaaata cagatcctga g 21
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PPP2CB verfication primer reverse
<400> 67
cccacaagat tactctagc 19
<210> 68
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RBM38 verfication primer forward
<400> 68
tctcatgtcc ttcctcag 18
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RBM38 verfication primer reverse
<400> 69
gttttgtaga tggggttg 18
<210> 70
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NF1 verfication primer forward
<400> 70
acagagctaa gagccttc 18
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NF1 verfication primer reverse
<400> 71
ctgtaagacc ctaatagtat gac 23
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDK12 verfication primer forward
<400> 72
caggactctt cttgtaggag 20
<210> 73
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDK12 verfication primer reverse
<400> 73
gattcagaca ccttctcc 18
<210> 74
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SIN3A verfication primer forward
<400> 74
gtggcctata ctaacgtg 18
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SIN3A verfication primer reverse
<400> 75
ctcccttagt gtgtatcg 18
<210> 76
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PARP-1 verfication primer forward
<400> 76
ctctctgcag ttccctac 18
<210> 77
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PARP-1 verfication primer reverse
<400> 77
atgtaagtgc aaggtgtc 18
<210> 78
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATM verfication primer forward
<400> 78
gtaaagagct agccagaag 19
<210> 79
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATM verfication primer reverse
<400> 79
gaaggtttac aggctgag 18
<210> 80
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hipk2 verfication primer forward
<400> 80
acgtacgtat gtgaatcc 18
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hipk2 verfication primer reverse
<400> 81
ggtaaactac agtcttaggc 20
<210> 82
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BARD1 verfication primer forward
<400> 82
ggctaaggga gttatctg 18
<210> 83
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BARD1 verfication primer reverse
<400> 83
caacacatct aggacagg 18
<210> 84
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIF1AN verfication primer forward
<400> 84
gttcagtaat ggaaccag 18
<210> 85
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIF1AN verfication primer reverse
<400> 85
ctcatctcta tggtgtgc 18
<210> 86
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMAD3 verfication primer forward
<400> 86
acttcactga caccttctg 19
<210> 87
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMAD3 verfication primer reverse
<400> 87
gaacaacgac atggagag 18
<210> 88
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDKN1A verfication primer forward
<400> 88
tacctgtccc tacctgtc 18
<210> 89
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDKN1A verfication primer reverse
<400> 89
gggaagattg tgacttatg 19
Claims (13)
- 동일한 유전자형을 갖지만 발현 감소 유전자인 내인성 유전자 MYC의 내인성 발현을 갖는, 동일한 조건하에 배양된 포유류 세포와 비교하여, 적어도 상기 내인성 유전자 MYC의 발현을 감소시킴으로써 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 재조합 포유류 세포의 이종성 폴리펩티드 발현을 증가시키기 위한 방법.
- 이종성 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법으로서,
a) 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하는 포유류 세포를 배양하는 단계 및
b) 상기 이종성 폴리펩티드를 상기 세포 또는 배양 배지로부터 회수하는 단계를 포함하되,
여기서 적어도 내인성 유전자 MYC의 발현이 감소된, 방법. - 향상된 재조합 생산성을 갖는 재조합 포유류 세포를 생산하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
a) 내인성 유전자 MYC를 표적으로 하는 뉴클레아제 보조 및/또는 핵산을 포유류 세포에 적용하여, 상기 내인성 유전자의 활성을 감소시키는 단계 및
b) 상기 내인성 유전자의 활성이 감소된 포유류 세포를 선택하고,
그것에 의하여 동일한 유전자형을 갖지만 상기 유전자의 내인성 발현을 갖는, 동일한 조건하에 배양된 포유류 세포와 비교하여 증가된 재조합 생산성을 갖는 재조합 포유류 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 녹아웃은 이형접합 녹아웃 또는 동형접합 녹아웃인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포의 생산성은 상기 유전자를 제외하고 동일한 유전형을 갖는 부모 포유류 세포와 비교하여 적어도 10 % 증가되는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 발현의 감소는 뉴클레아제 보조 유전자 표적화 시스템에 의해 매개되는, 방법.
- 제6항에 있어서, 뉴클레아제 보조 유전자 표적화 시스템은 CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1, 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN 또는 메가뉴클레아제로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 발현의 감소는 RNA 침묵에 의해 매개되는, 방법.
- 제8항에 있어서, RNA 침묵은 siRNA 유전자 표적화 및 녹다운, shRNA 유전자 표적화 및 녹다운, 그리고 miRNA 유전자 표적화 및 녹다운으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 폴리펩티드는 항체인, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 녹아웃은 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산의 도입 전 또는 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산의 도입 후 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 세포는 CHO 세포인, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 유전자 SIRT-1 및 MYC의 발현이 감소된, 방법.
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