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ES2637063T3 - Tratamiento de enfermedades relacionadas con genes supresores de tumor mediante inhibición del transcrito antisentido natural al gen - Google Patents

Tratamiento de enfermedades relacionadas con genes supresores de tumor mediante inhibición del transcrito antisentido natural al gen Download PDF

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ES2637063T3
ES2637063T3 ES09831149.1T ES09831149T ES2637063T3 ES 2637063 T3 ES2637063 T3 ES 2637063T3 ES 09831149 T ES09831149 T ES 09831149T ES 2637063 T3 ES2637063 T3 ES 2637063T3
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ES
Spain
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oligonucleotide
tumor suppressor
antisense
suppressor gene
disease
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ES09831149.1T
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English (en)
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Joseph Collard
Olga Khorkova Sherman
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Original Assignee
Curna Inc
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Publication date
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Abstract

Un oligonucleótido que se dirige a un transcrito antisentido natural del gen supresor de tumor para uso como un compuesto terapéutico, donde el oligonucleótido aumenta la expresión de un gen supresor de tumor, y donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de ácido nucleico tal como se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 6a, 6b, 7, 8 o 9.

Description

DESCRIPCION
Tratamiento de enfermedades relacionadas con genes supresores de tumor mediante inhibicion del transcrito antisentido natural al gen 5
REFERENCIA CRUZADA
Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos n.° 61/119.973, presentada el 4 de diciembre de 2008, la Solicitud Provisional de Estados Unidos n.° 61/157.249, presentada el 4 de marzo de 2009, la 10 Solicitud Provisional de Estados Unidos n.° 61/166.381, presentada el 3 de abril de 2009, y la Solicitud Provisional de Estados Unidos n.° 61/154.594, presentada el 23 de febrero de 2009.
CAMPO DE LA INVENCION
15 Aspectos de la divulgacion comprenden oligonucleotidos que modulan la expresion y/o la funcion de genes supresores de tumor y moleculas asociadas.
ANTECEDENTES
20 La hibridacion ADN-ARN y ARN-ARN son importantes para muchos aspectos de la funcion del acido nucleico incluyendo replicacion, transcripcion y traduccion del ADN. La hibridacion tambien es fundamental para una variedad de tecnologfas que tanto detectan un acido nucleico particular como alteran su expresion. Los nucleotidos antisentido, por ejemplo, alteran la expresion genica hibridandose con ARN diana, interfiriendo asf con el splicing, la transcripcion, la traduccion y la replicacion de ARN. El ADN antisentido tiene la caracterfstica anadida de que los 25 hfbridos de ADN-ARN sirven de sustrato para la digestion por ribonucleasa H, una actividad que esta presente en la mayorfa de los tipos de celulas. Las moleculas antisentido pueden suministrarse al interior de celulas, como es el caso para oligodesoxinucleotidos (ODN), o pueden expresarse a partir de genes endogenos como moleculas de ARN. La FDA recientemente aprobo un farmaco antisentido, VITRAVENE™ (para el tratamiento de retinitis por citomegalovirus), que refleja que el antisentido tiene utilidad terapeutica.
30
RESUMEN
La invencion se define por las reivindicaciones. Aquellos aspectos/casos de la presente divulgacion que constituyen la invencion se definen por las reivindicaciones.
35
Este resumen se proporciona para presentar un resumen de la divulgacion para indicar brevemente la naturaleza y sustancia de la divulgacion. Se presenta en el entendimiento de que no se utilizara para interpretar ni limitar el alcance o significado de las reivindicaciones.
40 En un aspecto, la divulgacion proporciona procedimientos de inhibicion de la accion de un transcrito antisentido natural usando uno o mas oligonucleotidos antisentido dirigidos a cualquier region del transcrito antisentido natural produciendo la regulacion positiva del gen sentido correspondiente. Tambien esta contemplado en el presente documento que la inhibicion del transcrito antisentido natural pueda conseguirse mediante siRNA, ribozimas y moleculas pequenas, que se considera que estan dentro del alcance de la presente divulgacion.
45
Un aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o la expresion de un polinucleotido del gen supresor de tumor en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud, donde dicho oligonucleotido tiene al menos un 50 % de identidad de secuencia con un complemento inverso de un polinucleotido que comprende de 5 a 50 30 nucleotidos consecutivos dentro de los nucleotidos 1 a 1675 de la SEQ ID NO: 4 o los nucleotidos 1 a 518 de SEQ ID NO: 5 o los nucleotidos 1 a 759 de SEQ ID NO: 6 o los nucleotidos 1 a 25892 de SEQ ID NO: 6a o los nucleotidos 1 a 279 de SEQ ID NO: 6b, o los nucleotidos 1 a 1982 de SEQ ID NO: 7, o los nucleotidos 1 a 789 de SEQ ID NO: 8, o los nucleotidos 1 a 467 de SEQ ID NO: 9 (Figura 5) modulando de este modo la funcion y/o la expresion del polinucleotido del gen supresor de tumor en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro.
55
En otro caso preferido, un oligonucleotido se dirige a una secuencia antisentido natural de polinucleotidos de genes supresores de tumor, por ejemplo, nucleotidos expuestos en SEQ ID NOS: 4, 5, 6, 6a, 6b, 7, 8 o 9, y cualquier variante, alelo, homologo, mutante, derivado, fragmento y secuencia complementaria a los mismos. Ejemplos de oligonucleotidos antisentido se exponen como las SEQ ID NOS: 10 a 30 (Figura 6 a 9).
Otro aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o la expresion de un polinucleotido del gen
supresor de tumor en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro, que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud, donde dicho oligonucleotido tiene al menos un 50 % de identidad de secuencia con un complemento inverso del antisentido del polinucleotido del gen supresor de tumor; modulando de este modo la funcion y/o la expresion del polinucleotido del gen supresor de 5 tumor en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro.
Otro aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o la expresion de un polinucleotido del gen supresor de tumor en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro, que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud, donde dicho oligonucleotido 10 tiene al menos un 50 % de identidad de secuencia con un oligonucleotido antisentido con respecto a un polinucleotido antisentido del gen supresor de tumor; modulando de este modo la funcion y/o la expresion del polinucleotido del gen supresor de tumor en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro.
En un caso preferido, una composicion comprende uno o mas oligonucleotidos antisentido que se unen a 15 polinucleotidos del gen supresor de tumor sentido y/o antisentido.
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos comprenden uno o mas nucleotidos modificados o sustituidos.
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos comprenden uno o mas enlaces modificados.
20
En otro aspecto mas, los nucleotidos modificados comprenden bases modificadas que comprenden fosforotioato, metilfosfonato, acidos nucleicos peptfdicos, 2'-O-metilo, fluoro- o carbono, metileno u otras moleculas de acido nucleico bloqueado (LNA). Preferentemente, los nucleotidos modificados son moleculas de acido nucleico bloqueado, que incluyen a-L-LNA.
25
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos se administran a un paciente por via subcutanea, por via intramuscular, por via intravenosa o por via intraperitoneal.
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos se administran en una composicion farmaceutica. Un regimen de 30 tratamiento comprende administrar los compuestos antisentido al menos una vez al paciente; sin embargo, este tratamiento puede modificarse para comprender multiples dosis durante un periodo de tiempo. El tratamiento puede combinarse con uno o varios de otros tipos de terapias.
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos estan encapsulados en un liposoma o unidos a una molecula 35 portadora (por ejemplo, colesterol, peptido TAT).
Un aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion de y/o la expresion de un polinucleotido del gen supresor de tumor en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro, que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con al menos un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud, donde dicho al 40 menos un oligonucleotido tiene al menos un 50 % de identidad de secuencia con un complemento inverso de un antisentido natural de un polinucleotido del gen supresor de tumor, modulando de este modo una funcion de y/o la expresion del polinucleotido del gen supresor de tumor en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro.
Un aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de una funcion de y/o la expresion de un polinucleotido del 45 gen supresor de tumor en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro, que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud, donde dicho oligonucleotido tiene al menos un 50 % de identidad de secuencia con un oligonucleotido antisentido con respecto al polinucleotido del gen supresor de tumor; modulando de este modo una funcion de y/o la expresion del polinucleotido del gen supresor de tumor en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro.
50
Otro aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de una funcion y/o la expresion de un polinucleotido del gen supresor de tumor en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro, que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con por lo menos un oligonucleotido antisentido que se dirige a una region del antisentido natural de un polinucleotido del gen supresor de tumor; modulando de este modo una funcion y/o la expresion del 55 polinucleotido del gen supresor de tumor en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro.
En un aspecto, una funcion y/o la expresion del polinucleotido del gen supresor de tumor se aumenta in vivo o in vitro con respecto a un control.
60 En otro aspecto, al menos un oligonucleotido antisentido se dirige a una secuencia antisentido natural de un polinucleotido del gen supresor de tumor.
En un aspecto, al menos un unico oligonucleotido antisentido se dirige a una secuencia de acido nucleico que comprende secuencias de acido nucleico codificantes y/o no codificantes de un polinucleotido del gen supresor de tumor.
En un aspecto, al menos un unico oligonucleotido antisentido se dirige a las secuencias que se solapan y/o que no se solapan de un polinucleotido del gen supresor de tumor.
En un aspecto particular, al menos un unico oligonucleotido antisentido comprende una o mas modificaciones que se 10 seleccionan de entre: al menos un resto de azucar modificado, al menos un enlace internucleosido modificado, al menos un nucleotido modificado, y combinaciones de los mismos.
En un aspecto relacionado, una o mas modificaciones comprenden al menos un resto de azucar modificado seleccionado de entre: un resto de azucar modificado con 2'-O-metoxietilo, un resto de azucar modificado con 2'15 metoxi, un resto de azucar modificado con 2'-O-alquilo, un resto de azucar bicfclico, y combinaciones de los mismos.
En otro aspecto, una o mas modificaciones comprenden, al menos, un enlace internucleosfdico modificado seleccionado de entre: un fosforotioato, 2'- O-metoxietilo (MOE), 2'-fluoro, alquilfosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triester de fosfato, acetamidata, un ester carboximetflico, y 20 combinaciones de los mismos.
En un aspecto, una o mas modificaciones comprenden, al menos, un nucleotido modificado seleccionado de entre: un acido nucleico peptfdico (PNA), un acido nucleico bloqueado (LNA), un acido arabino-nucleico (FANA), un analogo, un derivado, y combinaciones de los mismos.
25
En otro aspecto, al menos un oligonucleotido comprende una de las secuencias oligonucleotidas expuestas como las SEQ ID NO: 10 al 30.
La divulgacion tambien proporciona un procedimiento para modular una funcion de y/o la expresion de un gen 30 supresor de tumor en celulas o tejido de mamffero in vivo o in vitro que comprende poner en contacto las celulas o tejidos con al menos un oligonucleotido de ARN interferente pequeno (siRNA) con una longitud de 5 a 30 nucleotidos, dicho oligonucleotido antisentido del gen supresor de tumor, donde dicho oligonucleotido siRNA tiene al menos un 50 % de identidad de secuencia con una secuencia complementaria de, al menos, aproximadamente cinco acidos nucleicos consecutivos de la molecula de acido nucleico antisentido y/o directo de un polinucleotido del 35 gen supresor de tumor; y modular una funcion de y/o la expresion del gen supresor de tumor en celulas o tejidos de mamffero in vivo o in vitro.
En un aspecto, el oligonucleotido tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con una secuencia complementaria de, al menos, aproximadamente cinco acidos nucleicos consecutivos de la molecula de acido nucleico antisentido 40 y/o sentido del polinucleotido del gen supresor de tumor.
Otro aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de una funcion y/o la expresion de un gen supresor de tumor en celulas o tejidos de mamffero in vivo o in vitro que comprende poner en contacto dichos tejidos o celulas con, al menos, un oligonucleotido antisentido con una longitud aproximadamente de 5 a 30 nucleotidos especffico 45 para secuencias no codificantes y/o secuencias codificantes de una cadena sentido y/o antisentido natural de un polinucleotido del gen supresor de tumor donde dicho, al menos, un oligonucleotido antisentido tiene, al menos, 50 % de identidad de secuencia con al menos una secuencia de acido nucleico como se expone en las SEQ ID NO: 1, 1a, 1b, 2, 2a, 2b, 3, 3a, 4, 5, 6, 6a, 6b, 7, 8 y 9; y, modular la funcion y/o la expresion del gen supresor de tumor en celulas o tejidos de mamffero in vivo o in vitro.
50
Un aspecto proporciona un oligonucleotido modificado sintetico que comprende, al menos, una modificacion, donde al menos se selecciona una modificacion de entre: al menos un resto de azucar modificado; al menos un enlace internucleotfdico modificado; al menos un nucleotido modificado; y combinaciones de los mismos; y donde ademas, dicho nucleotido es un compuesto antisentido el cual hibrida con y modula la expresion y/o funcion de un 55 polinucleotido del gen supresor de tumor in vivo o in vitro en comparacion con un control normal.
En otro aspecto relacionado, una o mas modificaciones comprenden, al menos, un enlace internucleotfdico seleccionado de entre el grupo que consiste de: un fosforotioato, alquil fosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triester de fosfato, acetamidata, ester carboximetflico, y combinaciones de los 60 mismos.
En otro aspecto, el oligonucleotido comprende al menos un enlace internucleotfdico fosforotioato.
En un aspecto relacionado, el oligonucleotido comprende un esqueleto de enlaces internucleotfdicos fosforotioato.
5 En otro aspecto, el oligonucleotido comprende, al menos, un nucleotido modificado, dicho nucleotido modificado seleccionado de entre: un acido nucleico peptfdico, un acido nucleico bloqueado (LNA), analogo, derivado, y una combinacion de los mismos.
En otro aspecto, el oligonucleotido comprende una pluralidad de modificaciones, donde dichas modificaciones 10 comprenden enlaces internucleotfdicos seleccionados de entre: fosforotioato, alquilfosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triester de fosfato, acetamidata, ester carboximetflico, y una combinacion de los mismos.
En un aspecto, el oligonucleotido comprende una pluralidad de modificaciones, donde dichas modificaciones 15 comprenden nucleotidos modificados seleccionados de entre: acidos nucleicos peptfdicos, acidos nucleicos bloqueados (LNA), analogos, derivados y una combinacion de los mismos.
En otro aspecto, el oligonucleotido comprende al menos un resto de azucar modificado seleccionado de entre: un resto de azucar modificado 2'-O-metoxietilo, un resto de azucar modificado 2'-metoxi, un resto de azucar modificado 20 2'-O-alquilo, un resto de azucar bicfclico, y una combinacion de los mismos.
En otro aspecto, el oligonucleotido comprende una pluralidad de modificaciones, donde dichas modificaciones comprenden restos de azucar modificados seleccionados de entre: un resto de azucar modificado 2'-O-metoxietilo, un resto de azucar modificado 2'-metoxi, un resto de azucar modificado 2'-O-alquilo, un resto de azucar bicfclico, y 25 combinaciones de los mismos.
En otro aspecto, el oligonucleotido es de una longitud de al menos aproximadamente 5 a 30 nucleotidos y se hibrida con una cadena sentido y/o antisentido de un polinucleotido del gen supresor de tumor donde dicho oligonucleotido tiene al menos aproximadamente 20 % de identidad de secuencia con una secuencia complementaria de al menos 5 30 acidos nucleicos consecutivos de las secuencias de acido nucleico codificantes y/o no codificantes antisentido y/o sentido del polinucleotido del gen supresor de tumor.
En otro aspecto, el oligonucleotido tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia con una secuencia complementaria de, al menos, aproximadamente cinco acidos nucleicos consecutivos de la secuencia de 35 acido nucleico codificante y/o no codificante antisentido y/o sentido de polinucleotido del gen supresor de tumor.
En otro aspecto, dicho oligonucleotido hibrida con y modula la expresion y/o funcion de, al menos, un polinucleotido del gen supresor de tumor in vivo o in vitro, en comparacion a un control normal.
40 En un aspecto, el oligonucleotido comprende una de las secuencias expuestas como las SEQ ID NOS: 10 al 30.
La divulgacion proporciona ademas una composicion que comprende uno o mas oligonucleotidos especfficos para uno o mas polinucleotidos del gen supresor de tumor, dichos polinucleotidos comprenden secuencias antisentido, secuencias complementarias, alelos, homologos, isoformas, variantes, derivados, mutantes, fragmentos, o 45 combinaciones de los mismos.
En un cierto aspecto, donde los oligonucleotidos tienen, al menos, aproximadamente 40 % de identidad de secuencia en comparacion con cualquiera de las secuencias nucleotfdicas expuestas en las SEQ ID NO: 10 al 30.
50 En un aspecto, el uno o mas oligonucleotidos comprenden cualquiera de las secuencias nucleotfdicas expuestas en las SEQ ID NO: 10 al 30.
En otro aspecto, los oligonucleotidos expuestos en las SEQ ID NO: 10 a 30 comprenden una o mas modificaciones o sustituciones nucleotfdicas.
55
En otro aspecto, una o mas modificaciones se seleccionan de entre: moleculas de fosforotioato, metilfosfonato, acido peptido nucleico, acido nucleico bloqueado (LNA), y combinaciones de los mismos.
Un aspecto de la divulgacion proporciona un metodo para prevenir o tratar una enfermedad asociada con al menos 60 un polinucleotido del gen supresor de tumor y/o al menos un producto codificado del mismo, que comprende administrar a un paciente una dosis terapeuticamente eficaz de al menos un oligonucleotido antisentido que se une a
una secuencia antisentido natural de dicho al menos un polinucleotido del gen supresor de tumor y modula la expresion de dicho al menos un polinucleotido del gen supresor de tumor; previniendo o tratando de este modo la enfermedad asociada con el al menos un polinucleotido del gen supresor de tumor y/o al menos un producto codificado del mismo.
5
En un cierto aspecto, una enfermedad asociada con el al menos un polinucleotido del gen supresor de tumor se selecciona de: una enfermedad asociada con disminucion o aumento de la apoptosis, envejecimiento tisular/celular, un cancer (incluyendo los mencionados en la Tabla 1), una enfermedad autoinmune, una enfermedad inmunodeficiente, incluyendo sida, senescencia, una enfermedad o trastorno neurodegenerativo (por ejemplo, 10 enfermedad de Alzheimer, ataxia telangiectasia, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Huntington, etc.), una enfermedad hiperplasica (por ejemplo, queloide), artritis reumatoide, enfermedad coronaria, muerte celular isquemica, un trastorno linfoproliferativo, aterosclerosis, osteoporosis, un sfndrome mielodisplasico, una enfermedad inducida por toxinas, una infeccion vfrica, cicatrizacion de heridas, enfermedad de Cowden (CD), enfermedad de Lhermitte-Duclos (LDD), sfndrome de Bannayan-Zonana (BZS, 15 tambien conocido como sfndrome de Bannayan-Riley-Ruvalcaba, sfndrome de Ruvalcaba-Myhre-Smith y sfndrome de Riley-Smith), trasplante, una enfermedad o trastorno relacionado con la apoptosis, una enfermedad o trastorno metabolico (por ejemplo, diabetes), una enfermedad o trastorno renal, infarto de miocardio/insuficiencia cardiaca, isquemia, sepsis, una enfermedad inflamatoria en la que las celulas inflamatorias hematopoyeticas son excesivas, una enfermedad proliferativa, o una enfermedad o trastorno donde hay un paradigma terapeutico para el tratamiento 20 de la enfermedad inflamatoria a traves del aumento de la apoptosis.
Un aspecto proporciona un procedimiento para identificar y seleccionar, al menos, un oligonucleotido para administracion in vivo, que comprende: seleccionar un polinucleotido diana asociado con una patologfa; identificar al menos un oligonucleotido que comprenda, al menos, cinco nucleotidos consecutivos los cuales son complementarios 25 a, o en una orientacion antisentido al polinucleotido diana seleccionado; medir el punto de fusion termico de un hfbrido de un oligonucleotido antisentido y el polinucleotido diana bajo condiciones de hibridacion rigurosas, y seleccionar, al menos, un oligonucleotido para administracion in vivo, basandose en la informacion obtenida.
Otros aspectos se describen mas adelante.
30
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1:
35 Figura 1A y 1B: es un grafico de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces en ARNm de TP73 despues del tratamiento de celulas HepG2 con oligonucleotidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparacion con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de p73 en celulas HepG2 se aumentan significativamente 48 h despues del tratamiento con los oligonucleotidos disenados para p73as (Figura 1A). En las mismas muestras los niveles de ARN de p73as se 40 redujeron significativamente despues del tratamiento con los oligos para p73as (Figura 1B). Las barras indicadas como oligo 1, oligo 2 y oligo 3 se corresponden a muestras tratadas con las SEQ ID NO: 10, 11, y 12 respectivamente.
Figura 1C: Es un grafico de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces + la desviacion estandar en ARNm de TP73 despues del tratamiento de celulas HepG2 con oligonucleotidos de siRNA introducidos 45 usando Lipofectamine 2000, en comparacion con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de p73 en celulas HepG2 se aumentan significativamente 48 h despues del tratamiento con dos de los oligos disenados para Hs.668503 antisentido de p73 y uno de los oligos disenados para Hs.674463 antisentido de p73. Las barras indicadas como Hs.668503_1 de p73, Hs.668503_2 de p73, Hs.674463_1 de p73 y Hs.674463_2 de p73 corresponden a muestras tratadas con las SEQ ID NOS 13, 14, 15 y 16 respectivamente.
50 Figura 1C: Es un grafico de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces + la desviacion estandar en ARNm de TP73 despues del tratamiento de celulas TM4 con oligonucleotidos de fosfotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparacion con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de p73 en celulas TM4 de raton se aumentan significativamente 48 h despues del tratamiento con uno de los oligos disenados para Hs.668503 antisentido de p73 de raton y uno de los oligos disenados para WDR8 55 antisentido de p73 de raton. Las barras indicadas como Hs.668503 _1 de raton de p73, Hs.668503 _10 de raton de p73, Hs.668503 _14 de raton de p73, Hs.668503 _15 de raton de p73, WDr8 _1 de raton de p73, WDr8 _7 de raton de p73, WDr8 _8 de raton de p73 y WDr8 _3 de raton de p73 corresponden a muestras tratadas con SEQ ID NOS 14 a 24 respectivamente.
60 La Figura 2 es un grafico de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces en ARNm de p53 despues del tratamiento de celulas HUVEC con oligonucleotidos de fosfotioato introducidos usando Lipofectamine
2000, en comparacion con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de p53 en celulas HUVEC se aumentan significativamente 48 h despues del tratamiento con todos los siRNA disenados para p53as (oligol, P = 0,003, oligo2 P = 0,001, y oligo2 P = 0,03). Las barras indicadas como oligol, oligo2 y oligo3 corresponden a muestras tratadas con las SEQ ID NO: 25, 26 y 27 respectivamente.
5
La Figura 3 es un grafico de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces en ARNm de PTEN despues del tratamiento de celulas HepG2 con oligonucleotidos de fosfotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparacion con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de PTEN en celulas HepG2 se incrementan significativamente 48 h despues del tratamiento con uno de los oligos 10 disenados para Hs.624903 antisentido de PTEN. Las barras indicadas como Hs.607931_2 de PTEN, Hs.624903_2 de PTEN, Hs.624903_3 de PTEN corresponden a muestras tratadas con SEQ ID NOS 28, 29, y 30 respectivamente.
La Figura 4 muestra:
SEQ ID NO: 1: Gen supresor de tumor de Homo sapiens (TP73), variante de transcrito 1, ARNm. (N° de acceso del 15 NCBI NM_005427.2)
SEQ ID NO: 1a muestra la secuencia genomica de p73 (se muestran exones en letras mayusculas, intrones en minuscula).
SEQ ID NO. 1b muestra la secuencia genomica de raton de p73 (se muestran exones en letras mayusculas, intrones en minuscula).
20 SEQ ID NO: 2: Protefna de tumor de Homo sapiens p53 (TP53), variante de transcrito 1, ARNm. (N° de acceso del NCBI NM_000546.4)
SEQ ID NO: 2a muestra la secuencia genomica de p53 (se muestran exones en letras mayusculas, intrones en minuscula).
SEQ ID nO: 2b muestra la secuencia genomica de la isoforma de p53 D (n.° de acceso del NCBI: NM_001126115). 25 SEQ ID NO: 3: Homologo de fosfatasa y tesina de Homo sapiens (PTEN), ARNm. (N° de acceso del NCBI NM_000314).
SEQ ID NO: 3a muestra la secuencia genomica de PTEN (se muestran exones en letras mayusculas, intrones en minuscula).
30 La Figura 5 muestra:
SEQ ID NO: 4: La secuencia antisentido natural de p73as (numero de acceso del NCBI: NM_017818.2)
SEQ ID NO: 5: Secuencia antisentido natural de p73 Hs.668503
SEQ ID NO: 6: Secuencia antisentido natural de p73 Hs.674463
SEQ ID NO: 6a: Secuencia antisentido natural de raton de p73 35 SEQ ID NO: 6b: Secuencia antisentido natural de raton de p73 Hs.668503 (Las bases pareadas en secuencias de ADNc y genomicas se indican por letras mayusculas)
SEQ iD NO: 7: Secuencia antisentido natural de p53 (n.° de acceso del NCBI: NM_018081.2)
SEQ ID NO: 8: Secuencia antisentido natural de PTEN (Hs.624903)
SEQ ID NO: 9: Secuencia antisentido natural de PTEN (Hs. 607931)
40
La Figura 6 muestra los oligonucleotidos antisentido, las SEQ ID NO: 10 al 16. "r" indica ARN y * indica enlace de fosfotioato.
La Figura 7 muestra los oligonucleotidos antisentido, las SEQ ID NO: 17 al 24. * indica enlace fosfotioato.
45
La Figura 8 muestra los oligonucleotidos antisentido de p53 con respecto a la secuencia antisentido natural NM_018081, SEQ ID NOs: 25 al 27.
La Figura 9 muestra los oligonucleotidos antisentido de PTEN con respecto a la secuencia antisentido natural 50 Hs.624903 y Hs. 607931, SEQ ID NO: 28 al 30. "r" indica ARN
La Figura 10 muestra los oligonucleotidos sentido, SEQ ID NO: 31 al 34. "r" indica ARN
El oligonucleotido sentido, la SEQ ID NO: 31 es el complemento inverso de los oligonucleotidos antisentido, SEQ ID NO: 13, el oligonucleotido sentido, SEQ ID NO: 32 es el complemento inverso de los oligonucleotidos antisentido, 55 SEQ ID NO: 14, el oligonucleotido sentido, SEQ ID NO: 33 es el complemento inverso de los oligonucleotidos antisentido, SEQ ID NO: 15; y el oligonucleotido sentido, SEQ ID NO: 34 es el complemento inverso de los oligonucleotidos antisentido, SEQ ID NO: 16.
La Figura 11 muestra las SEQ ID NO: 35 y 36 de los ensayos disenados por el ensayo de expresion genica Taqman 60 de Applied Biosystems
SEQ ID No.: 35 es la secuencia diana de p73, exon 2 (Hs00232088_ml)
SEQ ID No.: 36 es la secuencia diana de p73as, exon 7 (Hs00215135_ml y Hs00892470_gl)
La Figura 12 muestra las SEQ ID NO: 37 y 38 de los ensayos disenados por el ensayo de expresion genica Taqman de Applied Biosystems.
5 SEQ ID No.: 37 es la secuencia diana de p53 (Hs00153340_ml)
SEQ ID No.: 38 es la secuencia diana de p53as (WDR79) (Hs00216360_ml)
La Figura 13 muestra los oligonucleotidos sentido, SEQ ID NO: 39 al 41. "r" indica ARN
10 El oligonucleotido sentido, SEQ ID NO: 39 es el complemento inverso de los oligonucleotidos antisentido, SEQ ID NO: 28, el oligonucleotido sentido, SEQ ID NO: 40 es el complemento inverso de los oligonucleotidos antisentido, SEQ ID NO: 29; y el oligonucleotido sentido, SEQ ID NO: 41 es el complemento inverso de los oligonucleotidos antisentido, SEQ ID NO: 30.
15 DESCRIPCION DETALLADA
Varios aspectos de la divulgacion se describen a continuacion con referencia a aplicaciones de ejemplos para ilustracion. Debe entenderse que los numerosos detalles, relaciones y procedimientos especfficos se exponen para proporcionar un entendimiento completo de la divulgacion. Un experto en la materia relevante, sin embargo, 20 reconocera facilmente que la divulgacion puede ponerse en practica sin uno o mas de los detalles especfficos o con otros procedimientos. La presente divulgacion no esta limitada por el orden de actos o acontecimientos, ya que algunos actos pueden producirse en diferentes ordenes y/o simultaneamente con otros actos o acontecimientos. Ademas, no todos los actos o acontecimientos ilustrados son requeridos para implementar una metodologfa de acuerdo con la presente divulgacion.
25
Todos los genes, nombres de genes, y productos genicos divulgados en el presente documento pretenden corresponderse a homologos de cualquier especie para la cual las composiciones y procedimientos divulgados en el presente documento son aplicables. De este modo, los terminos incluyen, aunque sin limitarse a, genes y productos genicos de seres humanos y ratones. Se entiende que, cuando se divulga un gen o producto genico de una especie 30 particular, esta divulgacion pretende ser ejemplar solamente, y no se interpreta como una limitacion, a menos que el contexto en el que aparece lo indique claramente. De este modo, por ejemplo, para los genes divulgados en el presente documento, que en algunos casos se refieren a secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos de mamffero, pretenden englobar genes homologos y/u ortologos y productos genicos de otros animales que incluyen, aunque sin limitarse a, otros mamfferos, peces, anfibios, reptiles y aves. En casos preferidos, los genes o 35 secuencias de acidos nucleicos son humanos.
Definiciones
La terminologfa usada en el presente documento es con el fin de describir aspectos particulares solamente y no 40 pretende ser limitante de la divulgacion. Tal como se usan en la presente, se pretende que las formas en singular “un”, “una”, “el” y “la” incluyan tambien las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Ademas, siempre que las expresiones "que incluye", "incluyen", "que tiene", "tiene", "con", o variantes de los mismos se usan en la descripcion detallada y/o las reivindicaciones, dichas expresiones pretenden ser inclusivas de una manera similar a la expresion "que comprende."
45
El termino «aproximadamente» significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular como se ha determinado por un experto habitual en la materia, que dependera en parte de como se mide o determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medicion. Por ejemplo, «alrededor de» puede significar 1 o mas de 1 de desviacion estandar, conforme a la practica de la tecnica. Como alternativa, “aproximadamente” puede significar un 50 intervalo de hasta el 20%, preferentemente hasta el 10%, mas preferentemente hasta el 5%, y mas preferentemente todavfa hasta el 1% de un valor dado. De manera alternativa, en particular con respecto a los sistemas o procesos biologicos, el termino pueden significar un orden de magnitud de un valor preferentemente comprendido en 5 veces y mas preferentemente, comprendido en 2 veces. En los casos en los que se describen valores particulares en la solicitud y las reivindicaciones, a menos que se exprese lo contrario, el termino «alrededor de» significa que se debe 55 asumir que el valor se encuentra comprendido en un intervalo de error aceptable para el valor particular.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “ARNm” significa (el) los transcrito(s) de ARNm actualmente conocidos de un gen elegido como diana, y cualquier transcrito adicional que pueda ser dilucidado.
60 Por “oligonucleotidos antisentido” o “compuesto antisentido” se indica una molecula de ARN o de ADN que se une a otro ARN o ADN (ARN, ADN diana). Por ejemplo, si este es un oligonucleotido de ARN, se une a otra diana de ARN
por medio de interacciones ARN-ARN y altera la actividad del ARN diana (Eguchi et al., (1991) Ann. Rev. Biochem. 60, 631-652). Un oligonucleotido antisentido puede regular positivamente o regular negativamente la expresion y/o funcion de un polinucleotido particular. La definicion pretende comprender cualquier molecula de aRn o ADN extrana que es util desde un punto de vista terapeutico, de diagnostico u otro. Dichas moleculas incluyen, por 5 ejemplo, moleculas de ARN o ADN antisentido, ARN de interferencia (iARN), micro ARN, moleculas de ARN senuelo, siRNA, ARN enzimatico, ARN de edicion terapeutica y ARN agonista y antagonista, compuestos oligomericos antisentido, oligonucleotidos antisentido, oligonucleotidos de secuencia gufa externa (EGS), agentes de splicing alternativos, cebadores, sondas y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana. Por lo tanto, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligomericos 10 monocatenarios, bicatenarios, parcialmente monocatenarios, o circulares.
En el contexto de esta divulgacion, el termino "oligonucleotido" se refiere a un oligomero o polfmero de acido ribonucleico (ARN) o acido desoxirribonucleico (ADN) o mimeticos de los mismos. El termino “oligonucleotido” tambien incluye oligomeros lineales o circulares de monomeros o enlaces naturales y/o modificados, que incluyen 15 desoxirribonucleosidos, ribonucleosidos, formas sustituidas y alfa-anomeras de los mismos, acidos nucleicos peptfdicos (PNA), acidos nucleicos bloqueados (LNA), fosforotioato, metilfosfonato y similares. Los oligonucleotidos son capaces de unirse especfficamente a un polinucleotido diana por medio de un patron regular de interacciones monomero a monomero, tales como tipo de apareamiento de bases de Watson-Crick, tipos de apareamiento de bases de Hoogsteen o Hoogsteen inversa, o similares.
20
El oligonucleotido puede ser “quimerico”, es decir, estar compuesto de diferentes regiones. En el contexto de esta divulgacion los compuestos "quimericos" son oligonucleotidos, que contienen dos o mas regiones qufmicas, por ejemplo, una o mas regiones de ADN, una o mas regiones de aRn, una o mas regiones de PNA, etc. Cada region qufmica esta compuesta por al menos una unidad monomerica, es decir, un nucleotido en el caso de un compuesto 25 de oligonucleotidos. Estos oligonucleotidos normalmente comprenden al menos una region donde el oligonucleotido se modifica con el fin de presentar una o mas propiedades deseadas. Las propiedades deseadas del oligonucleotido incluyen, aunque sin limitarse a, por ejemplo, resistencia a la degradacion por nucleasas incrementada, captacion celular incrementada y/o afinidad de union por el acido nucleico diana incrementada. Las diferentes regiones del oligonucleotido pueden, por lo tanto, tener diferentes propiedades. Los oligonucleotidos quimericos de la presente 30 divulgacion pueden formarse como estructuras mixtas de dos o mas oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados, oligonucleosidos y/o analogos de oligonucleotido, tal como se ha descrito anteriormente.
El oligonucleotido puede estar compuesto de regiones que pueden enlazarse en “registro”, es decir, cuando los monomeros se enlazan consecutivamente, como en ADN nativo, o se enlazan mediante espaciadores. Se pretende 35 que los espaciadores constituyan un "puente" covalente entre las regiones y tengan, en casos preferidos, una longitud que no supere aproximadamente los 100 atomos de carbono. Los espaciadores pueden portar diferentes funcionalidades, por ejemplo, tener carga positiva o negativa, portar propiedades de union a acido nucleico especiales (intercaladores, ligantes de surcos, toxinas, fluoroforos, etc.), ser lipofilos, inducir estructuras secundarias especiales como, por ejemplo, peptidos que contienen alanina que inducen helices alfa.
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Tal como se usa en el presente documento, "gen supresor de tumor" y "gen supresor de tumor" son incluyentes de todos los miembros de la familia, mutantes, alelos, fragmentos, especies, secuencias codificadoras y no codificadoras, cadenas de polinucleotido sentido y antisentido, etc.
45 Como se usa en el presente documento, las palabras protefna de tumor 73, p73, TP73 se utilizan de manera intercambiable en la presente solicitud.
Como se usan en el presente documento, las palabras TRP53, p53 supresor de tumor, p53, NY-CO-13 de antfgeno de P53, p53 de antfgeno de tumor celular, FLJ92943, LFS1, y Fosfoprotefna p53 se usan de forma intercambiable en 50 la presente solicitud.
Como se usan en el presente documento, las palabras PTEN, 10q23del, BZS, MGC11227, MHAM, MMAC1, mutado en multiples canceres avanzados 1, homologo de fosfatasa y tensina, Fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfato 3-fosfatasa y fosfatasa de protefna de especificidad dual PTEN, PTEN1, TEP1 se usan de forma intercambiable en la presente 55 solicitud.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion “oligonucleotido especffico para” u “oligonucleotido que se dirige a” se refiere a un oligonucleotido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una parte del gen elegido como diana, o (ii) capaz de formar un duplex estable con una parte de un transcrito de ARNm 60 del gen elegido como diana. La estabilidad de los complejos y los duplex puede determinarse mediante calculos teoricos y/o ensayos in vitro. Ensayos a modo de ejemplo para determinar la estabilidad de complejos y duplex de
hibridacion se describen en los ejemplos mas adelante.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion “acido nucleico diana” engloba ADN, ARN (que comprende pre-ARNm y ARNm) transcrito a partir de dicho ADN, y tambien ADNc derivado de dicho ARN, secuencias 5 codificantes, no codificantes, polinucleotidos sentido o antisentido. La hibridacion especffica de un compuesto oligomerico con su acido nucleico diana interfiere en la funcion normal del acido nucleico. Esta modulacion de la funcion de un acido nucleico diana por compuestos, que se hibridan especfficamente con el, se denomina generalmente “antisentido”. Las funciones de ADN con las que interferiran incluyen, por ejemplo, la replicacion y transcripcion. Las funciones de ARN con las que interferiran incluyen todas las funciones vitales tales como, por 10 ejemplo, translocacion del ARN al sitio de traduccion de protefna, traduccion de protefna del ARN, splicing del ARN para dar una o mas especies de ARNm, y actividad catalftica que puede acoplarse en o facilitarse por el ARN. El efecto global de dicha interferencia con las funciones del acido nucleico diana es la modulacion de la expresion de un producto codificado u oligonucleotidos.
15 La interferencia de ARN "iARN" esta mediada por moleculas de ARN bicatenario (dsARN) que tienen homologfa especffica de secuencia con sus secuencias de acido nucleico «diana» (Caplen, N. J., et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9742-9747). En ciertos casos de la presente divulgacion, los mediadores son duplex de ARN “interferente pequeno” (siRNA) de 5-25 nucleotidos. Los siRNA se derivan del procesamiento de dsARN mediante una enzima ARNasa conocida como Dicer (Bernstein, E., et al. (2001) Nature 409:363-366). Los productos duplex de 20 siRNA se emplean en un complejo de siRNA multiprotefna llamado RISC (Complejo Silenciador Inducido por ARN). Sin desear cenirse a ninguna teorfa particular, se cree entonces que un RISC es guiado a un acido nucleico diana (adecuadamente ARNm), en el que el duplex de siARN interactua de una forma especffica de secuencia para mediar en la escision en un modo catalftico (Bernstein, E., et al. (2001) Nature 409:363-366; Boutla, A., et al. (2001) Curr. Biol. 11:1776-1780). Los ARN interferentes pequenos que pueden usarse de acuerdo con la presente divulgacion 25 pueden sintetizarse y usarse de acuerdo con procedimientos que son bien conocidos en la tecnica y que seran familiares para el experto en la materia. Los aRn interferentes pequenos para su uso en los procedimientos de la presente divulgacion comprenden adecuadamente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 nucleotidos (nt). En los ejemplos de aspectos no limitantes, los siRNA pueden comprender aproximadamente 5 a aproximadamente 40 nt, aproximadamente 5 a aproximadamente 30 nt, aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nt, 30 aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nt, o aproximadamente 20-25 nucleotidos.
La seleccion de los oligonucleotidos apropiados se facilita usando programas informaticos que alinean automaticamente secuencias de acido nucleico e indican regiones de identidad u homologfa. Dichos programas se usan para comparar secuencias de acidos nucleicos obtenidas, por ejemplo, buscando en bases de datos tales 35 como GenBank o secuenciando productos de PCR. La comparacion de secuencias de acidos nucleicos de un intervalo de especies permite la seleccion de secuencias de acidos nucleicos que muestran un grado de identidad apropiado entre especies. En el caso de genes que no han sido secuenciados, se realizan Southern blots para permitir una determinacion del grado de identidad entre genes en especies diana y otras especies. Realizando Southern blots a grados de astringencia variables, tal como es muy conocido en la tecnica, es posible obtener una 40 medida aproximada de la identidad. Estos procedimientos permiten la seleccion de oligonucleotidos que muestran un alto grado de complementariedad con secuencias de acido nucleico diana en un sujeto a controlar y un menor grado de complementariedad con secuencias de acido nucleico correspondientes en otras especies. Un experto en la materia se dara cuenta de que hay libertad considerable en la seleccion de regiones apropiadas de genes para su uso en la presente divulgacion.
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Por “ARN enzimatico” se indica una molecula de ARN con actividad enzimatica (Cech, (1988) J. American. Med. Assoc. 260, 3030-3035). Los acidos nucleicos enzimaticos (ribozimas) actuan uniendose primero a un ARN diana. Dicha union se produce a traves de la parte de union diana de un acido nucleico enzimatico que se mantiene en estrecha proximidad a una parte enzimatica de la molecula que actua para escindir el ARN diana. De este modo, el 50 acido nucleico enzimatico reconoce primero y luego se une a ARN diana mediante apareamiento de bases, y una vez unido al sitio correcto, actua enzimaticamente para cortar el ARN diana.
Por “ARN senuelo” se indica una molecula de ARN que imita el dominio de union natural para un ligando. El ARN senuelo compite, por lo tanto, con la diana de union natural para la union de un ligando especffico. Por ejemplo, se 55 ha mostrado que la sobreexpresion de ARN de respuesta de activacion en trans (TAR) de HIV puede actuar como un "senuelo" y se une de forma eficiente a la protrefna tat de HIV, impidiendo de este modo que se una a secuencias TAR codificadas por el ARN de HIV (Sullenger et al. (1990) Cell, 63, 601- 608). Esto se indica que es un ejemplo especffico. Los expertos en la materia reconoceran que esto es solo un ejemplo, y facilmente pueden generarse otros aspectos usando tecnicas generalmente conocidas en la tecnica.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "monomeros" normalmente indica monomeros enlazados por
enlaces fosfodiester o analogos de los mismos para formar oligonucleotidos que varfan en tamano entre unas pocas unidades monomericas, por ejemplo, entre aproximadamente 3-4, y aproximadamente varios cientos de unidades monomericas. Los analogos de enlaces fosfodiester incluyen: fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonatos, fosforoselenoato, fosforamidato y similares, tal como se describe mas completamente mas adelante.
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El termino “nucleotido” cubre nucleotidos de origen natural, asf como nucleotidos no de origen natural. Debe ser evidente para el experto en la materia que diversos nucleotidos que se consideraron anteriormente “no de origen natural” se han descubierto posteriormente en la naturaleza. De este modo, "nucleotidos" incluye no solamente las moleculas que contienen heterociclos de purina y pirimidina conocidas, sino tambien analogos heterocfdiclicos y 10 tautomeros de las mismas. Ejemplos ilustrativos de otros tipos de nucleotidos son moleculas que contienen adenina, guanina, timina, citosina, uracilo, purina, xantina, diaminopurina, 8-oxo- N6-metiladenina, 7-deazaxantina, 7- deazaguanina, N4,N4-etanocitosina, N6,N6-etano-2,6- diaminopurina, 5-metilcitosina, 5-alquinil(C3-C6)-citosina, 5- fluorouracilo, 5-bromouracilo, seudoisocitosina, 2-hidroxi-5-metil-4-triazolopiridina, isocitosina, isoguanina, inosina y los nucleotidos "no de origen natural" descritos en Benner y col., patente de EE.UU. n° 5.432.272. El termino 15 “nucleotido” pretende cubrir todos y cada uno de estos ejemplos, ademas de analogos y tautomeros de los mismos. Nucleotidos especialmente interesantes son aquellos que contienen adenina, guanina, timina, citosina y uracilo, que se consideran como los nucleotidos de origen natural en relacion con la aplicacion terapeutica y diagnostica en seres humanos. Los nucleotidos incluyen los azucares naturales 2'-desoxi y 2'-hidroxilo, por ejemplo, como se describe en Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992), ademas de sus analogos.
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“Analogos”, en referencia a nucleotidos, incluye nucleotidos sinteticos que tienen restos de bases modificados y/o restos de azucar modificados (vease, por ejemplo, descrito generalmente por Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, Nueva York, 1980; Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25(22), 4429- 4443, Toulme, J.J., (2001) Nature Biotechnology 19:17-18;Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139;Freier S. M., (1997) 25 Nucleic Acid Research, 25:4429-4443, uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin P., (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310); 2'-O, 3'-C-enlazados [3.2.0] biciclorabinonucleosidos (vease, por ejemplo, N.K Christiensen., et al, (1998) J. Am. Chem. Soc., 120: 5458-5463; Prakash TP, Bhat B. (2007) Curr Top Med Chem. 7(7):641-9; Cho EJ, et al. (2009) Annual Review of Analytical Chemistry, 2, 241-264). Dichos analogos incluyen nucleotidos sinteticos disenados para potenciar propiedades de union, por ejemplo, la estabilidad 30 especificidad del duplex o el triplex, o similares.
Tal como se usa en el presente documento, "hibridacion" significa el apareamiento de cadenas sustancialmente complementarias de compuestos oligomericos. Un mecanismo de apareamiento implica la formacion de puentes de hidrogeno, que pueden ser puentes de hidrogeno de Watson-Crick, Hoogsteen o de Hoogsteen inverso, entre bases 35 de nucleosidos o de nucleotidos (nucleotidos) complementarias de las cadenas de compuestos oligomericos. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleotidos complementarios que se aparean mediante la formacion de puentes de hidrogeno. La hibridacion puede producirse en circunstancias variables.
Un compuesto antisentido es "especificamente hibridable" cuando la union del compuesto al acido nucleico diana 40 interfiere en la funcion normal del acido nucleico diana para causar una modulacion de la funcion y/o la actividad, y existe un grado de complementariedad suficiente para evitar union inespecifica del compuesto antisentido a secuencias de acido nucleico no diana en condiciones en las que se desea union especifica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en condiciones en las que se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro.
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Tal como se usa en el presente documento, la frase "condiciones de hibridacion astringentes" o "condiciones astringentes" se refiere a condiciones en las que un compuesto de la divulgacion hibridara con su secuencia diana, pero con un numero minimo de otras secuencias. Las condiciones astringentes son dependientes de secuencia y seran diferentes en diferentes circunstancias y en el contexto de esta divulgacion, "condiciones astringentes" en las 50 que compuestos oligomericos hibridan con una secuencia diana se determinan mediante la naturaleza y la composicion de los compuestos oligomericos y los ensayos en los que estan siendo investigados. En general, las condiciones de hibridacion astringentes comprenden bajas concentraciones (<0,15 M) de sales con cationes inorganicos tales como Na++ o K++ (es decir, baja fuerza ionica), temperatura superior a 20 °C - 25 °C por debajo de la Tm del complejo de compuesto oligomerico: secuencia diana, y la presencia de desnaturalizantes tales como 55 formamida, dimetilformamida, dimetilsulfoxido, o el detergente dodecilsulfato de sodio (SDS). Por ejemplo, la tasa de hibridacion disminuye un 1,1% por cada 1% de formamida. Un ejemplo de una condicion de hibridacion de alta astringencia es 0,1X tampon cloruro sodico-citrato sodico (SSC)/0,1 % (peso/volumen) de SDS a 60 °C durante 30 minutos.
60 “Complementario”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de apareamiento preciso entre dos nucleotidos en una o dos cadenas oligomericas. Por ejemplo, si una nucleobase en cierta posicion de un
compuesto antisentido es capaz de formar puentes de hidrogeno con una nucleobase en cierta posicion de un acido nucleico diana, siendo dicho acido nucleico diana un ADN, ARN, o molecula de oligonucleotido, entonces la posicion de la formacion de puentes de hidrogeno entre el oligonucleotido y se considera que el acido nucleico diana es una posicion complementaria. El compuesto oligomerico y el ADN, ARN, o molecula de oligonucleotido, adicional son 5 complementarios entre si cuando un numero suficiente de posiciones complementarias en cada molecula estan ocupadas por nucleotidos que pueden formar puentes de hidrogeno entre si. De este modo, "especfficamente hibridable" y "complementariedad" son expresiones que se usan para indicar un grado suficiente de apareamiento preciso o complementariedad sobre un numero suficiente de nucleotidos de modo que se produzca union estable y especffica entre el compuesto oligomerico y un acido nucleico diana.
10
Se entiende en la tecnica que no es necesario que la secuencia de un compuesto oligomerico sea un 100 % complementaria a la de su acido nucleico diana para ser especfficamente hibridable. Ademas, un oligonucleotido puede hibridarse sobre uno o mas segmentos, de modo que segmentos intermedios o adyacentes no esten implicados en el acontecimiento de hibridacion (por ejemplo, una estructura en bucle, desapareamiento o estructura 15 de horquilla). Los compuestos oligomericos de la presente divulgacion comprenden al menos aproximadamente el 70%, o al menos aproximadamente el 75%, o al menos aproximadamente el 80%, o al menos aproximadamente el 85%, o al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95%, o al menos aproximadamente el 99%, de complementariedad de secuencia con una region diana dentro de la secuencia de acidos nucleicos diana a la que se dirigen. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de los 20 nucleotidos del compuesto 20 antisentido son complementarios a una region diana y, por lo tanto, hibridarfan especfficamente, representarfa el 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, los nucleotidos no complementarios restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleotidos complementarios y no necesitan ser contiguos entre si o a nucleotidos complementarios. Por lo tanto, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleotidos de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleotidos no complementarios que estan flanqueados por dos regiones de complementariedad completa con el 25 acido nucleico diana tendrfa el 77,8% de complementariedad global con el acido nucleico diana y de este modo estarfa dentro del alcance de la presente divulgacion. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una region de un acido nucleico diana puede determinarse rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de busqueda de alineamientos locales basicos) y programas PowerBLAST conocidos en la tecnica (Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol., 215, 403-410; Zhang y Madden, (1997) Genome Res., 7, 649-656). El porcentaje 30 de homologfa, identidad de secuencias o complementariedad pueden determinarse por, por ejemplo, el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando parametros por defecto, que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., (1981) 2, 482-489).
35 Tal como se usa en el presente documento, la expresion "punto de fusion termico (Tm)" se refiere a la temperatura, bajo fuerza ionica, pH y concentracion de acido nucleico definidas, a la que el 50 % de los oligonucleotidos complementarios a la secuencia diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio. Normalmente, condiciones astringentes seran aquellas en las que la concentracion de sales es la concentracion de ion Na (u otras sales) de al menos aproximadamente 0,01 a 1,0 M a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para 40 oligonucleotidos cortos (por ejemplo, de 10 a 50 nucleotidos). Tambien pueden lograrse condiciones astringentes con la adicion de agentes desestabilizantes tales como formamida.
Tal como se usa en el presente documento, "modulacion" significa un incremento (estimulacion) o una disminucion (inhibicion) de la expresion de un gen.
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El termino "variante", cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleotidos, puede englobar una secuencia de polinucleotidos relacionada con un gen de tipo silvestre. Esta definicion tambien puede comprender, por ejemplo, variantes "alelicas", de "splicing", de "especie" o "polimorficas". Una variante de splicing puede tener identidad significativa con una molecula de referencia, pero generalmente tendra un mayor o menor numero de 50 polinucleotidos debido al splicing alterno de exones durante el procesamiento de ARNm. El polipeptido correspondiente puede poseer dominios funcionales adicionales o una ausencia de dominios. Las variantes de especie son secuencias de polinucleotidos que varfan de una especie a otra. Son de particular utilidad en la divulgacion variantes de productos genicos de tipo silvestre (wild type). Las variantes pueden resultar de al menos una mutacion en la secuencia de acidos nucleicos y pueden producir ARNm alterados o polipeptidos cuya estructura 55 o funcion puede o puede no alterarse. Cualquier gen natural o recombinante dado puede tener ninguna, una o muchas formas alelicas. Cambios mutacionales comunes que dan lugar a variantes se atribuyen generalmente a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleotidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede producirse solo, o en combinacion con los otros, una o mas veces en una secuencia dada.
60 Los polipeptidos resultantes generalmente tendran identidad significativa de aminoacidos los unos con respecto a los otros. Una variante polimorfica es una variacion en la secuencia de polinucleotidos de un gen particular entre
individuos de una especie dada. Las variantes polimorficas tambien pueden englobar "polimorfismos de un solo nucleotido" (SNP), o mutaciones de una sola base en las que la secuencia de polinucleotidos varfa en una base. La presencia de SNP puede ser indicativa de, por ejemplo, una cierta poblacion con una propension por una patologfa, es decir susceptibilidad frente a resistencia.
5
Los polinucleotidos derivados incluyen acidos nucleicos sometidos a modificacion qufmica, por ejemplo, sustitucion de hidrogeno por un grupo alquilo, acilo o amino. Los derivados, por ejemplo, oligonucleotidos derivados, pueden comprender partes no de origen natural, tales como restos de azucar alterados o enlaces inter-azucar. A modo de ejemplo, entre estos estan fosforotioato y otras especies que contienen azufre que se conocen en la tecnica. Los 10 acidos nucleicos derivados tambien pueden contener etiquetas, que incluyen radionucleotidos, enzimas, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, agentes cromogenos, sustratos, cofactores, inhibidores, partfculas magneticas y similares.
Un polipeptido o peptido "derivado" es uno que se modifica, por ejemplo, por glucosilacion, pegilacion, fosforilacion, 15 sulfatacion, reduccion/alquilacion, acilacion, acoplamiento qufmico o tratamiento suave con formalina. Un derivado tambien puede modificarse para contener una etiqueta detectable, tanto directa como indirectamente, que incluye, aunque no se limita a, un radioisotopo, etiqueta fluorescente y enzimatica..
Tal como se usa en el presente documento, el termino "animal" o "paciente" pretende comprender, por ejemplo, 20 seres humanos, ovejas, alces, venados, ciervos mulos, visones, mamfferos, monos, caballos, ganado vacuno, cerdos, cabras, perros, gatos, ratas, ratones, aves, pollo, reptiles, peces, insectos y aracnidos.
"Mamffero" cubre mamfferos de sangre caliente que normalmente estan bajo atencion medica (por ejemplo, seres humanos y animales domesticados). Los ejemplos incluyen felinos, caninos, equinos, bovinos y humanos, ademas 25 de solo humanos.
"Tratar" o "tratamiento" cubre el tratamiento de una patologfa en un mamffero, e incluye: (a) prevenir que se produzca la patologfa en un mamffero, en particular, cuando dicho mamffero tiene predisposicion a la patologfa, pero todavfa no se ha diagnosticado que la tenga; (b) inhibir la patologfa, por ejemplo, detener el desarrollo; y/o (c) aliviar 30 la patologfa, por ejemplo, causando la regresion de la patologfa hasta que se alcance un criterio de valoracion deseado. Tratar tambien incluye la mejora de un sfntoma de una enfermedad (por ejemplo, reducir el dolor o molestia), donde dicha mejora puede o puede no afectar directamente la enfermedad (por ejemplo, causa, transmision, expresion, etc.).
35 Como se usa en el presente documento, el termino "cancer" se refiere a cualquier tumor maligno, particularmente en el pulmon, rinon o tiroides. El propio cancer se manifiesta como un "tumor" o tejido que comprende celulas malignas del cancer. Los ejemplos de tumores incluyen sarcomas y carcinomas como tales, pero no limitado a: fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomisarcoma, 40 rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer ovarico, cancer de prostata, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, carcinoma de glandula sudorfpara, carcinoma de glandula sebacea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma de conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrional, tumor de Wilms, cancer cervical, tumor testicular, 45 carcinoma de pulmon, carcinoma de pulmon de celulas pequenas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimona, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligondendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, y retinoblastoma. Como se ha indicado anteriormente, la divulgacion permite especfficamente el diagnostico diferencial de tumores pulmonares, renales y tiroideos. Composiciones y moleculas de polinucleotidos y oligonucleotidos 50
Dianas: En un aspecto, las dianas comprenden secuencias de acido nucleico de gen supresor de tumor, incluyendo sin limitacion secuencias no codificantes y/o codificantes, sentido y/o antisentido asociadas con el gen supresor de tumor.
55 Los supresores tumorales son genes cuyos productos actuan para controlar la division celular. Se diferencian de los oncogenes en que los supresores tumorales producen productos que inhiben la division de las celulas si las condiciones para el crecimiento no se cumplen. Las condiciones que desencadenarfan los "frenos" de la celula incluyen danos en el ADN, falta de factores de crecimiento o defectos en el aparato de division. Cuando el gen supresor de tumor esta mutado para causar una perdida o reduccion en su funcion, la celula puede progresar al 60 cancer, usualmente en combinacion con otros cambios geneticos. Esto esta en contraste con los oncogenes que han ganado funciones (o perdieron la capacidad de ser controlados) en su forma mutante. Los ejemplos de genes
supresores de tumor incluyen p53 (TP53): un factor de transcripcion que regula la division celular; Rb: altera la actividad de los factores de transcripcion y, por lo tanto, controla la division celular; APC: controla la disponibilidad del factor de transcripcion; BRCA: participa en la reparacion del ADN.
5 El supresor tumoral p53 ejerce efectos antiproliferativos, incluyendo la detencion del crecimiento, la apoptosis y la senescencia celular, en respuesta a diversos tipos de estres (Levine A.J., (1997) Cell 88:323-31; Oren M., (1999) J. Biol. Chem. 274: 36031-034). Se puede pensar en p53 como el nodo central de un circuito regulador que supervisa las rutas de senalizacion de diversas fuentes, incluyendo las respuestas de dano del ADN (por ejemplo, la activacion ATM/ATR), eventos oncogenicos anormales (por ejemplo, activacion de Myc o Ras) y procesos celulares diarios (por 10 ejemplo, estimulacion del factor de crecimiento). Aunque las mutaciones p53 han estado en mas de la mitad de todos los tumores humanos (Hollstein et al., (1999) Mutat Res. 431:199-209), se observan defectos en otros componentes de la ruta p53, tales como el supresor tumoral ARF, en celulas tumorales que retienen p53 de tipo silvestre (Sherr, C.J., (2001) Nat Rev Mol Cell Biol 2:731-737; Sharpless N.E., et al., (2004) J Clin Invest 113:160-8). La activacion de la ruta p53 parece ser una caracterfstica comun, si no universal, del cancer humano.
15
La regulacion de estos polinucleotidos serfa de gran beneficio en el tratamiento del cancer y otros trastornos en los que la proliferacion celular anormal desempena un papel. Por ejemplo, p53 es una protefna de corta vida cuya actividad se mantiene en niveles bajos en celulas normales. La funcion molecular de p53 que se requiere para la supresion tumoral implica la capacidad de p53 para actuar como un factor transcripcional en la regulacion de la 20 expresion genica endogena. Por lo tanto, la regulacion de p53 en si es importante para su efecto sobre la tumorigenesis y el mantenimiento del crecimiento celular normal. Un compuesto antisentido es especfficamente hibridable cuando la union del compuesto al ADN o de ARN diana para producir una perdida de utilidad, y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la union inespecffica del compuesto antisentido a secuencias no diana en condiciones en las que se desea la union especffica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de 25 ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en el caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que se realizan los ensayos.
La Tabla 1 muestra una lista de algunos genes supresores de tumor.
Supresor de tumor
Funcion Cancer
APC
Controla la funcion de factores de transcripcion especfficos Carcinomas colorrectales adenomatosos y no hereditarios familiares
BRCA1,2
Dano y reparacion del ADN Canceres de mama heredados; canceres de ovario
CDKN2A
Locus genico que codifica p16 y p14 ARF Tumores cerebrales
DCC
Funcion aun desconocida Carcinomas colorrectales
DPC4 (SMAD4)
Media la senalizacion de los receptores del factor de crecimiento Tumores colorrectales, neoplasia pancreatica
MADR2/JV18 (SMAD2)
Media la senalizacion de los receptores del factor de crecimiento Cancer colorrectal
MEN1
Codigos de la protefna menina que interactua con los factores de transcripcion y previene la transcripcion de ciertos genes. Neoplasia endocrina multiple tipo 1
MTS1
Inhibidor de cinasas dependientes de ciclina Melanomas
NF1
Protefna activadora de RAS GTPasa Neurofibromatosis tipo 1
NF2
Protefna activadora de RAS GTPasa Neurofibromatosis tipo 2
p53
Codifica un factor de transcripcion para p21 que detiene el ciclo celular en fase G1 Carcinomas de vejiga, mama, colorrectal, esofagico, hfgado, pulmon, prostata y ovario; tumores cerebrales, sarcomas. Linfomas y leucemias
PTEN
Fosfatasa lipfdica que regula la supervivencia celular Sfndrome de Cowden; Aumenta el riesgo de cancer de mama y tiroides; enfermedad de Lhermitte-Duclos (LDD), sfndrome de Bannayan-Zonana (BZS); Fuente: documento US20020058638]
Rb
Altera la actividad de ciertos factores de transcripcion que desempenan un papel en el control de la division celular Retinoblastoma, sarcomas; carcinomas de vejiga, mama, esofago, prostata y pulmon
VHL
Puede dirigirse a las protefnas para su degradacion Carcinomas de celulas renales
WRN
Implicado en la reparacion del ADN Sfndrome de Werner
WT1
Represor transcripcional Tumores de Wilm (cancer renal pediatrico)
TSC1
Forma complejos con la protefna TSC2, inhibe la senalizacion de los efectores aguas abajo de mTOR Convulsiones, retraso mental, angiofibromas faciales
TSC2
Vease TSC1 anteriormente Crecimientos benignos (hamartomas) en muchos tejidos, astrocitomas, rabdomiosarcomas
LKB1, una cinasa localizada nuclear, tambien llamada STK11 (serina treonina cinasa 11)
Fosforila y activa la cinasa activada por AMP (AMPK), AMPK implicada en las respuestas al estres, el metabolismo de los lfpidos y la glucosa Hiperpigmentacion, multiples polipos hamartomatosos, canceres de mama, colorrectal y de ovario
MSH1, 2
Reparacion de la falta de concordancia de ADN Cancer de colon
CDH1
Protefna de adhesion celula-celula Cancer gastrico, cancer de mama lobular
PTCH
Receptor transmembrana para sonic hedgehog (shh) Carcinoma de piel basocelular
Se entiende que esta lista no es limitativa y que la divulgacion incluye el uso de otros supresores tumorales no enumerados especfficamente en el presente documento. Un experto en la tecnica que trabaja en el campo de los supresores tumorales puede identificar supresores tumorales adicionales descritos, por ejemplo, en la bibliograffa 5 publicada.
Debe apreciarse que en la Tabla 1 anterior, un gen indicado se refiere al gen y todas las variantes actualmente conocidas del mismo, incluyendo los diferentes transcritos de ARNm que el gen y sus variantes pueden dar lugar, cualquier variante genica adicional que pueda elucidarse, y secuencias antisentido. La lista tambien incluye las 10 moleculas de ARN no codificantes o las porciones de polinucleotidos. En general, sin embargo, dichas variantes tendran una identidad de secuencia significativa con una secuencia de cualquier polinucleotido de la Tabla 1 anterior, por ejemplo, una variante tendra al menos aproximadamente un 70 por ciento de identidad de secuencia con una secuencia de la Tabla 1 anterior, tfpicamente al menos aproximadamente un 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 o un 99 por ciento de identidad de secuencia con una secuencia de la Tabla 1 anterior. La identidad de secuencia de la 15 variante puede determinarse mediante cualquier numero de tecnicas estandar tales como el programa BLAST (ncbi.nclm.nih.gov/blast/).
En otro aspecto, los oligonucleotidos son especfficos para una o mas moleculas que inhiben el crecimiento celular anormal o los tumores. Esto incluye factores que inhiben actividades moleculares tales como, por ejemplo: 20 transformar celulas, factores implicados en estadios pretumorales, neoplasia, premetastasis, metastasis y similares. Otros ejemplos incluyen, sin limitacion: productos genicos de desarrollo (por ejemplo, moleculas de adhesion, inhibidores de la cinasa dependiente de ciclina, miembros de la familia Wnt, miembros de la familia Pax, miembros de la familia de helice alada, miembros de la familia Hox, citocinas/linfocinas y sus receptores, factores de crecimiento/diferenciacion y sus receptores, neurotransmisores y sus receptores); productos oncogenicos (por 25 ejemplo, ABL1, BCL1, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSF1R, ERBA, ERBB, ERB2, ETS1, ETV6, FGR, FOS, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1, PML, RET, SRC,
TAL1, TCL3, y YES); productos de genes supresores de tumores (por ejemplo, APC, BRCA1, BRCA2, MADH4, MCC, NF1, NF2, RBI, TP53, y WT1); y enzimas (por ejemplo, aCc sintasas y oxidasas, ACP desaturasas e hidroxilasas, ADP-glucosa piroforilasas, ATPasas, alcohol deshidrogenasas, amilasas, amiloglucosidasas, catalasas, celulasas, chalcona sintasas, quitinasas, ciclooxigenasas, descarboxilasas, dextrinasas, ADN y ARN polimerasas, 5 galactosidasas, glucanasas, glucosa oxidasas, sintasas de almidon unidas a granulos, GTPasas, helicasas, hemicelulasas, integrasas, inulinasas, invertasas, isomerasas, cinasas, lactasas, lipasas, lipoxigenasas, lisozimas, pectinesterasas, peroxidasas, fosfatasas, fosfolipasas, fosforilasas, fitasas, sintesasas reguladoras del crecimiento de plantas, poligalacturonasas, proteinasas y peptidasas, pulanasas, recombinasas, trascriptasas inversas, RUBISCO, topoisomerasas y xilanasas.
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Las enfermedades y trastornos mediados por un gen supresor de tumo ejemplares que pueden tratarse con celulas/tejidos regenerados a partir de celulas madre obtenidas usando los compuestos antisentido comprenden enfermedades asociadas con la disminucion o aumento de la apoptosis, el envejecimiento tisular/celular, cancer (incluyendo los mencionados en la Tabla 1), enfermedades autoinmunes, enfermedades inmunodeficientes, 15 incluyendo sida, senescencia, enfermedad o trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, ataxia telangiectasia, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrofica (ELA), enfermedad de Huntington, etc.), enfermedades hiperplasicas (por ejemplo, queloides), artritis reumatoide, enfermedad coronaria, muerte celular isquemica, trastornos linfoproliferativos, aterosclerosis, osteoporosis, sfndromes mielodisplasicos, enfermedades inducidas por toxinas e infecciones vfricas, curacion de heridas, enfermedad de Cowden (CD), enfermedad de 20 Lhermitte-Duclos (LDD), sfndrome de Bannayan-Zonana (BZS, tambien conocido como sfndrome de Bannayan- Riley-Ruvalcaba, sfndrome de Ruvalcaba-Myhre-Smith y sfndrome de Riley-Smith), trasplante, enfermedades y trastornos relacionados con la apoptosis, enfermedad o afeccion metabolica (por ejemplo, diabetes) que modulan la apoptosis en enfermedades agudas, enfermedades y trastornos renales, infarto de miocardio/isquemia de insuficiencia cardfaca, sepsis, enfermedades inflamatorias donde las celulas inflamatorias hematopoyeticas 25 particulares estan en exceso, y enfermedades proliferativas, o cuando existe un paradigma terapeutico para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria a traves del aumento de la apoptosis.
En un aspecto preferido, los oligonucleotidos son especfficos para polinucleotidos de gen supresor de tumor, lo que incluye, sin limitacion regiones no codificantes. Las dianas del gen supresor de tumor comprenden variantes del gen 30 supresor de tumor; mutantes del gen supresor de tumores, incluyendo SNP; secuencias no codificantes del gen supresor de tumor; alelos, fragmentos, y similares. Preferentemente, el oligonucleotido es una molecula de ARN antisentido.
De acuerdo con aspectos de la divulgacion, la molecula de acido nucleico diana no esta limitada a polinucleotidos de 35 genes supresores de tumor en solitario, sino que se extiende a cualquiera de las isoformas, receptores, homologos, regiones no codificantes y similares del gen supresor de tumor.
En otro aspecto preferido, un oligonucleotido esta dirigido a una secuencia antisentido natural (antisentido natural a las regiones codificantes y no codificantes) de dianas del gen supresor de tumor, incluyendo, sin limitacion, 40 variantes, alelos, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias a estos. Preferentemente el oligonucleotido es una molecula de ARN o ADN antisentido.
En otro aspecto preferido, los compuestos oligomericos de la presente divulgacion tambien incluyen variantes en las que una base diferente esta presente en una o mas de las posiciones de nucleotido en el compuesto. Por ejemplo, si 45 el primer nucleotido es una adenina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina, citidina u otros nucleotidos naturales o no naturales en esta posicion. Esto puede hacerse en cualquiera de las posiciones del compuesto antisentido. Estos compuestos se ensayan entonces usando los procedimientos descritos en el presente documento para determinar su capacidad para inhibir la expresion de un acido nucleico diana.
50 En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad, entre el compuesto antisentido y la diana, es de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 60%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de 55 aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 90%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100%.
60 Un compuesto antisentido es especfficamente hibridable cuando la union del compuesto al acido nucleico diana interfiere en la funcion normal del acido nucleico diana para producir una perdida de actividad, y hay un grado de
complementariedad suficiente para evitar la union inespecffica del compuesto antisentido a secuencias de acidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea la union especffica. Dichas condiciones incluyen, es decir, condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y condiciones en las que se realizan los ensayos en el caso de ensayos in vitro..
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Un compuesto antisentido, ya sea ADN, ARN, quimerico, sustituido, etc., es especfficamente hibridable cuando la union del compuesto a la molecula de ADN o de ARN diana interfiere en la funcion normal del ADN o ARN diana para producir una perdida de utilidad, y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la union inespecffica del compuesto antisentido a secuencias no diana en condiciones en las que se desea la union 10 especffica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en el caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que se realizan los ensayos.
En otro aspecto preferido, la eleccion como diana del gen supresor de tumor, incluyendo sin limitacion, secuencias antisentido que se identifican y se expanden, usando, por ejemplo, PCR, hibridacion etc., una o mas de las 15 secuencias expuestas como las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 6a, 6b, 7, 8 y 9, y similares, modulan la expresion o funcion del gel supresor de tumor. En un aspecto, la expresion o funcion esta regulada positivamente en comparacion con un control. En otro aspecto preferido, la expresion o funcion esta regulada negativamente en comparacion con un control.
20 En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos comprenden secuencias expuestas como las SEQ ID NO: 10 a 30 incluyendo secuencias antisentido que se identifican y expanden, usando, por ejemplo PCR, hibridacion, etc. Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares. Los ejemplos de enlaces modificados o enlaces internucleotfdicos comprenden fosforotioato, fosforoditioato o similares. En otro aspecto preferido, los nucleotidos comprenden un derivado de 25 fosforo. El derivado de fosforo (o grupo fosfato modificado) que puede unirse al resto de azucar o de analogo de azucar en los oligonucleotidos modificados de la presente divulgacion puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparacion de los analogos de fosfato indicados anteriormente, y su incorporacion en nucleotidos, nucleotidos modificados y oligonucleotidos, tambien es en sf conocida y no es necesario describirla aquf.
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La especificidad y sensibilidad de antisentido tambien es empleada por los expertos en la materia para usos terapeuticos. Se han empleado oligonucleotidos antisentido como restos terapeuticos en el tratamiento de patologfas en animales y el ser humano. Los oligonucleotidos antisentido se han administrado con seguridad y eficazmente a seres humanos y numerosos ensayos clfnicos estan actualmente en marcha. De este modo, se establece que los 35 oligonucleotidos pueden ser modalidades terapeuticas utiles que pueden configurarse para ser utiles en regfmenes de tratamiento para el tratamiento de celulas, tejidos y animales, especialmente seres humanos.
En aspectos de la presente divulgacion, los compuestos antisentido oligomericos, particularmente oligonucleotidos, se unen a moleculas de acidos nucleicos diana y modulan la expresion y/o funcion de moleculas codificadas por un 40 gen diana. Las funciones de ADN con las que interferiran comprenden, por ejemplo, replicacion y transcripcion. Las funciones de ARN con las que interferiran comprenden todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, translocalizacion del ARN al sitio de traduccion de protefna, traduccion de protefna desde ARN, splicing del ARN para dar una o mas especies de ARNm, y actividad catalftica que puede acoplarse en o facilitarse por el ARN. Las funciones pueden regularse positivamente o inhibirse dependiendo de las funciones deseadas.
45
Los compuestos antisentido incluyen compuestos antisentido oligomericos, oligonucleotidos antisentido, oligonucleotidos de secuencia de gufa externa (EGS), agentes de splicing alterno, cebadores, sondas, y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana. Por lo tanto, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, parcialmente 50 monocatenarios, o circulares.
El direccionamiento de un compuesto antisentido a una molecula de acido nucleico particular, en el contexto de esta divulgacion, puede ser un proceso multietapa. El proceso normalmente empieza con la identificacion de un acido nucleico diana cuya funcion va a modularse. Este acido nucleico diana puede ser, por ejemplo, un gen celular (o 55 ARNm transcrito del gen) cuya expresion esta asociada a un trastorno o patologfa particular, o una molecula de acido nucleico de un agente infeccioso. En la presente divulgacion, el acido nucleico diana codifica el gen supresor de tumor.
El proceso de direccionamiento normalmente tambien incluye la determinacion de al menos una region diana, 60 segmento, o sitio dentro del acido nucleico diana para que la interaccion antisentido se produzca de forma que resulte el efecto deseado, por ejemplo, la modulacion de la expresion. Dentro del contexto de la presente
divulgacion, el termino "region" se define como una parte del acido nucleico diana que tiene al menos una estructura, funcion o caractenstica identificable. Dentro de las regiones de acidos nucleicos diana estan segmentos. Los "segmentos" se definen como partes mas pequenas o sub-partes de regiones dentro de un acido nucleico diana. "Sitios", tal como se usa en la presente divulgacion, se define como posiciones dentro de un acido nucleico diana.
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En un aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a las secuencias antisentido naturales del gen supresor de tumor y modulan la expresion y/o funcion del gen supresor de tumor (SEQ ID NO: 1, 2 y 3). Los ejemplos de secuencias antisentido incluyen las SEQ ID NO: 4 a 30.
10 En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a uno o mas segmentos de los polinucleotidos del gen supresor de tumor y modulan la expresion y/o funcion del gen supresor de tumor. Los segmentos comprenden al menos cinco nucleotidos consecutivos de los polinucleotidos sentido o antisentido del gen supresor de tumor.
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido son espedficos para secuencias antisentido naturales del 15 gen supresor de tumor donde la union de los oligonucleotidos a las secuencias antisentido naturales del gen supresor de tumor modulan la expresion y/o la funcion del gen supresor de tumor.
En otro aspecto preferido, los compuestos de oligonucleotido comprenden secuencias expuestas como las SEQ ID NO: 10 a 30, secuencias antisentido que se identifican y expanden usando, por ejemplo, PCR, hibridacion etc. Estos 20 oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares. Los ejemplos de enlaces modificados o enlaces internucleotfdicos comprenden fosforotioato, fosforoditioato o similares. En otro aspecto preferido, los nucleotidos comprenden un derivado de fosforo. El derivado de fosforo (o grupo fosfato modificado) que puede unirse al resto de azucar o de analogo de azucar en los oligonucleotidos modificados de la presente divulgacion puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, 25 alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparacion de los analogos de fosfato indicados anteriormente, y su incorporacion en nucleotidos, nucleotidos modificados y oligonucleotidos, tambien es en sf conocida y no es necesario describirla aqrn.
Ya que, tal como se conoce en la tecnica, el codon de iniciacion de la traduccion normalmente es 5'-AUG (en 30 moleculas de ARNm transcrito; 5'-ATG en la molecula de ADN correspondiente), el codon de iniciacion de la traduccion tambien se denomina el "codon AUG", el "codon de iniciacion" o el "codon de iniciacion AUG". Una minona de genes tiene un codon de iniciacion de la traduccion que tiene la secuencia de ARN 5'-GUG, 5'-UUG o 5'- CUG; y se ha demostrado que 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG funcionan in vivo. De este modo, las expresiones "codon de iniciacion de la traduccion" y "codon de iniciacion" pueden englobar muchas secuencias de codon, aun cuando el 35 aminoacido iniciador en cada caso normalmente sea metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). Los genes eucariotas y procariotas pueden tener dos o mas codones de iniciacion alternativos, uno cualquiera de los cuales puede utilizarse preferencialmente para la iniciacion de la traduccion en un tipo particular de celula o tejido, o en un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la divulgacion, "codon de iniciacion" y "codon de iniciacion de la traduccion" se refieren al codon o codones que se usan in vivo para iniciar la traduccion de un ARNm 40 transcrito de un gen que codifica el gen supresor de tumor, a pesar de la(s) secuencia(s) de dichos codones. Un codon de terminacion de la traduccion (o "codon de terminacion") de un gen puede tener una de tres secuencias, es decir, 5'-UAA, 5'-UAG y 5'-UGA (las secuencias de ADN correspondientes son 5'-TAA, 5'-TAG y 5'-TGA, respectivamente).
45 Las expresiones "region de codon de iniciacion" y "region de codon de iniciacion de la traduccion" se refieren a una parte de dicho ARNm o gen que engloba de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleotidos contiguos en cualquier direccion (es decir, 5' o 3') desde un codon de iniciacion de la traduccion. Analogamente, las expresiones "region de codon de terminacion" y "region de codon de terminacion de la traduccion" se refieren a una parte de dicho ARNm o gen que engloba de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleotidos contiguos en cualquier 50 direccion (es decir, 5' o 3') desde un codon de terminacion de la traduccion. Por consiguiente, la "region de codon de iniciacion" (o "region de codon de iniciacion de la traduccion") y la "region de codon de terminacion" (o "region de codon de terminacion de la traduccion") son todas las regiones que pueden ser eficazmente elegidas como diana con los compuestos antisentido de la presente divulgacion.
55 El marco de lectura abierto (ORF) o "region codificante", que se conoce en la tecnica para referirse a la region entre el codon de iniciacion de la traduccion y el codon de terminacion de la traduccion, tambien es una region que puede ser eficazmente elegida como diana. Dentro del contexto de la presente divulgacion, una region elegida como diana es la region intragenica que engloba el codon de iniciacion o de terminacion de la traduccion del marco de lectura abierto (ORF) de un gen.
Otra region diana incluye la region no traducida 5' (5'UTR), conocida en la tecnica para referirse a la parte de un
ARNm en la direccion 5' desde el codon de iniciacion de la traduccion, y que incluye, por lo tanto, nucleotidos entre el sitio caperuza 5' (5' cap) y el codon de iniciacion de la traduccion de un ARNm (o nucleotidos correspondientes en el gen). Otra region diana mas incluye la region no traducida 3' (3'UTR), conocida en la tecnica para referirse a la parte de un ARNm en la direccion 3' desde el codon de terminacion de la traduccion, y que incluye, por lo tanto, 5 nucleotidos entre el codon de terminacion de la traduccion y el extremo 3' de un ARNm (o nucleotidos correspondientes en el gen). El sitio caperuza 5' de un ARNm comprende un residuo de guanosina N7-metilado unido al residuo mas 5' del ARNm mediante un enlace trifosfato 5'-5'. La region caperuza 5' de un ARNm se considera que incluye la propia estructura caperuza 5', ademas de los primeros 50 nucleotidos adyacentes al sitio caperuza. Otra region diana para esta divulgacion es la region caperuza 5'.
10
Aunque algunos transcritos de ARNm eucariotas se traducen directamente, muchos contienen una o mas regiones, conocidas como "intrones", que se escinden de un transcrito antes de que se traduzca. Las regiones restantes (y, por tanto, traducidas) se conocen como "exones" y se someten a splicing juntas para formar una secuencia de ARNm continua. En un aspecto, la eleccion como diana de sitios de splicing, es decir, empalmes intron-exon o 15 empalmes exon-intron, es particularmente util en situaciones en las que el splicing aberrante participa en la enfermedad, o en las que una produccion en exceso de un producto de splicing particular participa en la enfermedad. Un empalme de fusion aberrante debido a la transposicion o delecion es otro aspecto de un sitio diana. Los ARNm transcritos producidos mediante el proceso de splicing de dos (o mas) ARNm de diferentes fuentes de genes se conocen como "transcritos de fusion". Los intrones pueden ser eficazmente elegidos como diana usando 20 compuestos antisentido dirigidos a, por ejemplo, ADN o pre-ARNm.
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a regiones codificantes y/o no codificantes de un polinucleotido diana y modulan la expresion y/o funcion de la molecula diana.
25 En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a polinucleotidos antisentido naturales y modulan la expresion y/o funcion de la molecula diana.
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a polinucleotidos sentido y modulan la expresion y/o funcion de la molecula diana.
30
Pueden producirse transcritos de ARN alternativos a partir de la misma region genomica de ADN. Estos transcritos alternativos son generalmente conocidos como "variantes". Mas especfficamente, "variantes de pre-ARNm" son transcritos producidos a partir del mismo ADN genomico que se diferencian de otros transcritos producidos a partir del mismo ADN genomico en su posicion de inicio o de parada y contienen tanto secuencia intronica como exonica. 35
Tras la escision de una o mas regiones de exon o intron, o partes de las mismas durante el corte y empalme, las variantes de pre-ARNm producen "variantes de ARNm" mas pequenas. Por consiguiente, las variantes de ARNm son variantes de pre-ARNm procesadas y cada variante de pre-ARNm unica siempre debe producir una variante de ARNm unica como resultado del corte y empalme. Estas variantes de ARNm tambien se conocen como "variantes 40 de splicing alternativas". Si no se produce splicing de la variante de pre-ARNm, entonces la variante de pre-ARNm es identica a la variante de ARNm.
Las variantes pueden producirse mediante el uso de senales alternativas para la transcripcion de inicio o de parada. Los Pre-ARNm y ARNm pueden poseer mas de un codon de iniciacion o codon de terminacion. Las variantes que se 45 originan a partir de un pre-ARNm o ARNm que usan codones de iniciacion alternativos se conocen como "variantes de inicio alternativas" de ese pre-ARNm o ARNm. Aquellos transcritos que usan un codon de terminacion alternativo se conocen como "variantes de parada alternativas" de ese pre-ARNm o ARNm. Un tipo especffico de variante de parada alternativa es la "variante de poliA", en la que los multiples transcritos producidos resultan de la seleccion alternativa de una de las "senales de parada de poliA" por la maquinaria de transcripcion, produciendo de este modo 50 transcritos que terminan en sitios de poliA unicos. Dentro del contexto de la divulgacion, los tipos de variantes descritos en el presente documento tambien son aspectos de acidos nucleicos diana.
Las ubicaciones en el acido nucleico diana con las que los compuestos antisentido hibridan se definen como al menos una parte de 5 nucleotidos de longitud de una region diana a la que se dirige un compuesto antisentido 55 activo.
Aunque las secuencias especfficas de ciertos segmentos diana a modo de ejemplo se exponen en el presente documento, un experto en la materia reconocera que estas sirven para ilustrar y describir aspectos particulares dentro del alcance de la presente divulgacion. Segmentos diana adicionales son facilmente identificables por un 60 experto en la materia en vista de esta divulgacion.
Se considera que segmentos diana de 5-100 nucleotidos de longitud que comprenden un tramo de al menos cinco (5) nucleotidos consecutivos seleccionados de dentro de los segmentos diana preferidos ilustrativos tambien son adecuados para el direccionamiento.
5 Los segmentos diana pueden comprender secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos los 5 nucleotidos consecutivos desde el extremo 5' de uno de los segmentos diana preferidos ilustrativos (siendo los restantes nucleotidos un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que empieza inmediatamente cadena arriba del extremo 5' del segmento diana y que continua hasta que el ADN o ARN contenga de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleotidos). Segmentos diana similarmente preferidos se representan por secuencias de ADN o ARN que 10 comprenden al menos los 5 nucleotidos consecutivos desde el extremo 3' de uno de los segmentos diana preferidos ilustrativos (siendo los restantes nucleotidos un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que empieza inmediatamente cadena abajo del extremo 3' del segmento diana y que continua hasta que el ADN o ARN contenga de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleotidos). Un experto en la materia armado con los segmentos diana ilustrados en el presente documento sera capaz, sin excesiva experimentacion, de identificar segmentos diana 15 preferidos adicionales.
Una vez se han identificado una o mas regiones, segmentos o sitios diana, se eligen compuestos antisentido que son suficientemente complementarios a la diana, es decir, hibridan suficientemente bien y con suficiente especificidad, para dar el efecto deseado.
20
En aspectos de la divulgacion, los oligonucleotidos se unen a una cadena antisentido de una diana particular. Los oligonucleotidos tienen al menos 5 nucleotidos de longitud y pueden sintetizarse de manera que cada oligonucleotido se dirija a secuencias solapantes de forma que los oligonucleotidos se sinteticen para cubrir toda la longitud del polinucleotido diana. Las dianas tambien incluyen regiones codificantes, ademas de no codificantes.
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En un aspecto, se prefiere dirigirse a acidos nucleicos especfficos por oligonucleotidos antisentido. El direccionamiento de un compuesto antisentido a un acido nucleico particular es un proceso multietapa. El proceso normalmente empieza con la identificacion de una secuencia de acidos nucleicos cuya funcion va a modularse. Esta puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito a partir del gen) cuya expresion esta asociada a un 30 trastorno o patologfa particular, o un polinucleotido no codificante tal como, por ejemplo, ARN no codificante (ARNnc).
Los ARN pueden clasificarse en (1) ARN mensajeros (ARNm), que se traducen en protefnas, y (2) ARN no codificantes de protefna (ARNnc). Los ARNnc comprenden microARN, transcritos antisentido y otras unidades 35 transcripcionales (TU) que contienen una alta densidad de codones de terminacion y que carecen de cualquier amplio "marco de lectura abierto". Muchos ARNnc parecen empezar a partir de sitios de iniciacion en regiones no traducidas 3' (3'UTRs) de loci codificantes de protefnas. Los ARNnc son frecuentemente raros y al menos la mitad de los ARNnc que se han secuenciado por el consorcio FANTOM no parecen estar poliadenilados. La mayorfa de los investigadores se han basado, por motivos obvios, en ARNm poliadenilados que se procesan y se exportan al 40 citoplasma. Recientemente, se demostro que el conjunto de aRn nucleares no poliadenilados puede ser muy grande, y que muchos de dichos transcritos surgen de las llamadas regiones intergenicas (Cheng, J. et al. (2005) Science 308 (5725), 1149-1154; Kapranov, P. et al. (2005). Genome Res 15 (7), 987-997). El mecanismo por el que los ARNnc pueden regular la expresion genica es por apareamiento de bases con transcritos diana. Los ARN que funcionan por apareamiento de bases pueden agruparse en (1) ARN codificados en cis que estan codificados en la 45 misma ubicacion genetica, pero en la cadena opuesta a los ARN en los que actuan y, por lo tanto, muestran complementariedad perfecta con su diana, y (2) ARN codificados en trans que estan codificados en una ubicacion cromosomica distinta de los ARN en los que actuan y generalmente no presentan potencial de apareamiento de bases perfecto con sus dianas.
50 Sin desear cenirse a ninguna teorfa, la perturbacion de un polinucleotido antisentido por los oligonucleotidos antisentido descritos en el presente documento puede alterar la expresion de los ARN mensajeros sentido correspondientes. Sin embargo, esta regulacion puede tanto ser discordante (la inactivacion antisentido produce elevacion de ARN mensajero) como concordante (la inactivacion antisentido produce reduccion concomitante de ARN mensajero). En estos casos, los oligonucleotidos antisentido pueden ser dirigidos a partes solapantes o no 55 solapantes del transcrito antisentido que producen su inactivacion o secuestro. El antisentido codificante, ademas de no codificante, puede ser dirigido de una manera identica y que cualquier categorfa es capaz de regular los transcritos sentido correspondientes - tanto de una manera concordante como discordante. Las estrategias que se emplean en identificar nuevos oligonucleotidos para su uso contra una diana pueden basarse en la inactivacion de transcritos de ARN antisentido por oligonucleotidos antisentido o cualquier otro medio de modulacion de la diana 60 deseada.
Estrategia 1: En el caso de regulacion discordante, la inactivacion del transcrito antisentido eleva la expresion del gen convencional (sentido). Si el ultimo gen debe codificar un farmaco diana conocido o supuesto, entonces la inactivacion de su homologo antisentido podna imitar posiblemente la accion de un agonista receptor o una enzima estimulante.
5
Estrategia 2: En el caso de regulacion concordante, podnan inactivarse de forma concomitante tanto los transcritos antisentido como sentido y asf lograr una reduccion sinergica de la expresion genica (sentido) convencional. Si, por ejemplo, un oligonucleotido antisentido se usa para lograr la inactivacion, entonces esta estrategia puede usarse para aplicar un oligonucleotido antisentido dirigido al transcrito sentido y otro oligonucleotido antisentido al transcrito 10 antisentido correspondiente, o un unico oligonucleotido antisentido energeticamente simetrico que se dirige simultaneamente a transcritos sentido y antisentido solapantes.
De acuerdo con la presente divulgacion, los compuestos antisentido incluyen oligonucleotidos antisentido, ribozimas, oligonucleotidos de secuencia de grna externa (EGS), compuestos de siRNA, compuestos de interferencia (iARN) de 15 ARN mono- o bicatenario tales como compuestos de siRNA, y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana y modulan su funcion. Por lo tanto, pueden ser ADN, ARN, similares a ADN, similares a ARN, o mezclas de los mismos, o pueden ser mimeticos de uno o mas de estos. Estos compuestos pueden ser compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, circulares o de horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias internas o terminales, desapareamientos o bucles. Los 20 compuestos antisentido se preparan de forma rutinaria linealmente, pero pueden unirse o prepararse de otro modo para ser circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden comprender construcciones tales como, por ejemplo, dos cadenas hibridadas para formar un compuesto completa o parcialmente bicatenario o una unica cadena con auto-complementariedad suficiente para permitir la hibridacion y formacion de un compuesto completa o parcialmente bicatenario. Las dos cadenas pueden enlazarse internamente, dejando los extremos 3' o 5' libres o 25 pueden enlazarse para formar una estructura de horquilla continua o bucle. La estructura de horquilla puede contener un nucleotido protuberante en cualquiera de los extremos 5' o 3' que produce una extension del caracter monocatenario. Los compuestos bicatenarios opcionalmente pueden comprender nucleotidos protuberantes en los extremos. Modificaciones adicionales pueden comprender grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleotido seleccionadas, posiciones de azucar o a uno de los enlaces internucleosfdicos. Como 30 alternativa, las dos cadenas pueden enlazarse mediante un resto no de acido nucleico o grupo conector. Cuando se forma a partir de solo una cadena, el dsARN puede tomar la forma de una molecula tipo horquilla auto- complementaria que se dobla sobre sf misma para formar un duplex. De este modo, el dsARN puede ser completa o parcialmente bicatenario. Puede lograrse modulacion espedfica de la expresion genica por expresion estable de horquillas de dsARN en lmeas celulares transgenicas, sin embargo, en algunos casos, la expresion o funcion genica 35 esta regulada positivamente. Cuando se forma a partir de dos cadenas, o una unica cadena que adopta la forma de una molecula de tipo horquilla auto-complementaria que se dobla sobre sf misma para formar un duplex, las dos cadenas (o regiones formadoras de duplex de una sola cadena) son cadenas de ARN complementarias que se aparean con bases en el modo de Watson-Crick.
40 Una vez introducidos a un sistema, los compuestos de la divulgacion pueden provocar la accion de una o mas enzimas o protemas estructurales para efectuar la escision u otra modificacion del acido nucleico diana o pueden trabajar mediante mecanismos basados en la ocupacion. En general, los acidos nucleicos (incluyendo oligonucleotidos) pueden describirse como "similares a ADN" (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'- desoxiazucares y, generalmente, bases T en vez de U) o "similares a ARN" (es decir, que generalmente tienen uno o 45 mas 2'-hidroxilazucares o azucares modificados en 2' y, generalmente bases U en vez de T). Las helices de acido nucleico pueden adoptar mas de un tipo de estructura, mas comunmente las formas A y B. Se cree que, en general, los oligonucleotidos que tienen estructura similar a la forma B son "similares a ADN" y aquellos que tienen estructura similar a la forma A son "similares a ARN". En algunos casos (quimericos), un compuesto antisentido puede contener tanto regiones en forma A como B.
50
ARN antisentido, ADN antisentido, oligonucleotidos antisentido quimericos, oligonucleotidos antisentido que comprenden enlaces modificados, ARN de interferencia (iARN), ARN interferente pequeno (siRNA); un microARN interferente (miARN); un ARN temporal pequeno (ARNtp); o un ARN de horquilla corta (ARNhc); activacion genica inducida por ARN pequeno (aARN); ARN activantes pequenos (ARNap), o combinaciones de los mismos.
55
Los dsARN tambien pueden activar la expresion genica, un mecanismo que se ha llamado "activacion genica inducida por ARN pequeno" o aARN. Los promotores genicos que se dirigen a dsARN inducen la potente activacion transcripcional de genes asociados. El aARN se demostro en celulas humanas usando dsARN sinteticos, llamados "ARN activantes pequenos" (ARNap). No se sabe actualmente si el aARN esta conservado en otros organismos.
Se ha descubierto que el ARN bicatenario pequeno (dsARN), tal como ARN interferente pequeno (siRNA) y
microARN (miARN), es el desencadenante de un mecanismo evolutivamente conservado conocido como interferencia de ARN (iARN). La iARN conduce invariablemente al silenciamiento genico mediante la remodelacion de cromatina para suprimir de este modo la transcripcion, degradacion de ARNm complementario, o bloqueo de la traduccion de protefnas. Sin embargo, en los aspectos descritos en detalle en la seccion de ejemplos a continuacion, 5 se muestra que los oligonucleotidos aumentan la expresion y/o funcion de los polinucleotidos del gen supresor de tumor y productos codificados por los mismos. Los dsARN tambien pueden actuar como ARN activantes pequenos (ARNap). Sin desear cenirse a ninguna teorfa, direccionando secuencias a promotores genicos, los ARNap induciran la expresion de genes diana en un fenomeno denominado activacion transcripcional inducida por dsARN (aARN).
10 En un aspecto adicional, los "segmentos diana preferidos" identificados en el presente documento pueden emplearse en un cribado para compuestos adicionales que modulan la expresion de polinucleotidos del gen supresor de tumor. Los "moduladores" son aquellos compuestos que disminuyen o aumentan la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica el gen supresor de tumor y que comprenden al menos una parte de 5 nucleotidos que es complementaria a un segmento diana preferido. El procedimiento de cribado comprende las etapas de poner en 15 contacto un segmento diana preferido de una molecula de acido nucleico que codifica polinucleotidos sentido o antisentido naturales del gen supresor de tumor con uno o mas moduladores candidatos, y seleccionar uno o mas moduladores candidatos que disminuyen o aumentan la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica polinucleotidos del gen supresor de tumor, por ejemplo, las SEQ ID NO: 10 al 30. Una vez que se demuestra que el modulador o moduladores candidatos son capaces de modular (por ejemplo, tanto disminuir como aumentar) la 20 expresion de una molecula de acido nucleico que codifica polinucleotidos del gen supresor de tumor, el modulador puede entonces emplearse en estudios de investigacion adicionales de la funcion de polinucleotidos del gen supresor de tumor, o para su uso como un agente de investigacion, diagnostico o terapeutico de acuerdo con la presente divulgacion.
25 El direccionamiento de la secuencia antisentido natural prefe rente me nte modula la funcion del gen diana, por ejemplo, el gen p73 (numero de acceso del NCBI NM_005427.2), el gen p53 (n.° de acceso del NCBI: NM_000546.4) y el gen PTEN (n.° de acceso del NCBI: NM_000314). En un aspecto preferido, la diana es un polinucleotido antisentido del gen supresor de tumor. En un aspecto preferido, un oligonucleotido antisentido se dirige a secuencias sentido y/o antisentido naturales de los polinucleotidos del gen supresor de tumor (p73: N° de 30 acceso del NCBI NM_005427.2; p53: N° de acceso del NCBI NM_000546.4; PTEN: N° de acceso del NCBI NM_000314), y variantes, alelos, isoformas, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias a los mismos. Prefe re nte me nte, el oligonucleotido es una molecula antisentido y las dianas incluyen regiones codificantes y no codificantes de polinucleotidos antisentido y/o sentido del gen supresor de tumor.
35 Los segmentos diana preferidos de la presente divulgacion tambien pueden combinarse con sus compuestos antisentido complementarios respectivos de la presente divulgacion para formar oligonucleotidos (duplexados) bicatenarios estabilizados.
Se ha demostrado en la materia que dichos restos de oligonucleotido bicatenario modulan la expresion de la diana y 40 regulan la traduccion, ademas del procesamiento de ARN mediante un mecanismo antisentido. Ademas, los restos de doble cadena se pueden someter a modificaciones qufmicas (Fire et al., (1998) Nature, 391, 806-811; Timmons y Fire, (1998) Nature, 395, 854; Timmons et al., (2001) gene, 263, 103-112; Tabara et al., (1998) Science, 282, 430431; Montgomery et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 15502-15507; Tuschl et al., (1999) genes Dev., 13, 3191-3197; Elbashir et al., (2001) Nature, 411, 494-498; Elbashir et al., (2001) genes Dev. 15, 188-200). Por 45 ejemplo, se ha demostrado que dichos restos bicatenarios inhiben la diana por la hibridacion clasica de la cadena antisentido del duplex con la diana, produciendo de este modo la degradacion enzimatica de la diana (Tijsterman et al., (2002) Science, 295, 694-697).
En un aspecto preferido, un oligonucleotido antisentido se dirige a polinucleotidos del gen supresor de tumor (p73: 50 N° de acceso del NCBI NM_005427.2; p53: N° de acceso del NCBI NM_000546.4; PTEN: N° de acceso del NCBI NM_000314), y variantes, alelos, isoformas, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias a los mismos. Preferentemente, el oligonucleotido es una molecula antisentido.
De acuerdo con aspectos de la divulgacion, la molecula de acido nucleico diana no esta limitada a genes supresores 55 de tumor en solitario, sino que se extiende a cualquiera de las isoformas, receptores, homologos, y similares de moleculas del gen supresor de tumor.
En otro caso preferido, un oligonucleotido se dirige a una secuencia antisentido natural de polinucleotidos de genes supresores de tumor, por ejemplo, polinucleotidos expuestos como SEQ ID NOS: 4, 5, 6, 6a, 6b, 7, 8 y 9, y cualquier 60 variante, alelo, homologo, mutante, derivado, fragmento y secuencia complementaria a los mismos. Ejemplos de oligonucleotidos antisentido se exponen como las SEQ ID NOS: 10 al 30.
En un aspecto, los oligonucleotidos son complementarios a, o se unen a, secuencias de acido nucleico del gen supresor de tumor antisentido, incluyendo sin limitacion secuencias sentido y/o antisentido no codificantes asociadas con polinucleotidos del gen supresor de tumor y modulan la expresion y/o funcion de moleculas del gen supresor de 5 tumor.
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos son complementarios a, o se unen a, secuencias de acido nucleico del antisentido natural del gen supresor de tumor, expuesto como SEQ ID NO: 4, 5, 6, 6a, 6b, 7, 8 y 9, y modulan la expresion y/o funcion de las moleculas del gen supresor de tumor.
10
En un aspecto preferido, los oligonucleotidos comprenden secuencias de al menos 5 nucleotidos consecutivos de las SEQ ID NO: 10 a 30 y modula la expresion y/o la funcion de moleculas del gen supresor de tumor.
Las dianas de polinucleotido comprenden un gen supresor de tumor, incluyendo los miembros de la familia del 15 mismo, variantes del gen supresor de tumor; mutantes del gen supresor de tumor, incluyendo SNP; secuencias no codificantes del gen supresor de tumor; alelos del gen supresor de tumor, variantes de especies, fragmentos, y similares. Preferentemente, el oligonucleotido es una molecula antisentido.
En otro aspecto preferido, el oligonucleotido que se dirige a polinucleotidos del gen supresor de tumor, comprende: 20 ARN antisentido, ARN de interferencia (iARN), ARN interferente pequeno (siRNA); microARN interferente (miARN); un ARN temporal pequeno (ARNtp); o un ARN de horquilla corta (ARNhc); activacion genica inducida por ARN pequeno (aARN); o, ARN activante pequeno (ARNap).
En otro aspecto preferido, la seleccion como diana de los polinucleotidos del gen supresor de tumor, por ejemplo, la 25 SEQ ID NO: 4, 5, 6, 6a, 6b, 7, 8 y 9, modula la expresion o funcion de estas dianas. En un aspecto, la expresion o funcion esta regulada positivamente en comparacion con un control. En otro aspecto preferido, la expresion o funcion esta regulada negativamente en comparacion con un control.
En otro aspecto preferido, los compuestos antisentido comprenden secuencias expuestas como SEQ ID NO: 10 al 30 30. Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares.
En otro aspecto preferido, las SEQ ID NO: 10 a 30 comprenden uno o mas nucleotidos de LNA.
35 La modulacion de un acido nucleico diana deseado puede llevarse a cabo de varias formas conocidas en la tecnica. Por ejemplo, oligonucleotidos antisentido, siRNA, etc. Las moleculas de acidos nucleicos enzimaticos (por ejemplo, ribozimas) son moleculas de acidos nucleicos capaces de catalizar una o mas de diversas reacciones, que incluyen la capacidad para escindir repetidamente otras moleculas de acidos nucleicos separadas en un modo especffico de secuencia de bases de nucleotidos. Estas moleculas de acido nucleico, enzimaticas, se pueden usar, por ejemplo, 40 para seleccionar como diana virtualmente cualquier transcrito de ARN (Zaug et al., 324, Nature 429 1986; Cech, 260 JAMA 3030, 1988; y Jefferies et al., 17 Nucleic Acids Research 1371, 1989).
Debido a su especificidad de secuencia, las moleculas de acidos nucleicos enzimaticos que se escinden en trans muestran promesa como agentes terapeuticos para enfermedad humana (Usman & McSwiggen, (1995) Ann. Rep. 45 Med. Chem. 30, 285-294; Christoffersen y Marr, (1995) J. Med. Chem. 38, 2023-2037). Las moleculas de acidos nucleicos enzimaticos pueden disenarse para escindir dianas de ARN especfficas dentro del fondo del ARN celular. Un acontecimiento de escision de este tipo convierte el ARNm en no funcional y anula la expresion de protefnas de ese ARN. De este modo puede inhibirse selectivamente la sfntesis de una protefna asociada a una patologfa.
50 En general, los acidos nucleicos enzimaticos con actividad de escision de ARN actuan uniendose primero a un ARN diana. Dicha union se produce mediante la parte de union de diana de un acido nucleico enzimatico que se mantiene en estrecha proximidad a una parte enzimatica de la molecula que actua para escindir el ARN diana. De este modo, el acido nucleico enzimatico se reconoce primero y a continuacion se une a ARN diana mediante apareamiento de bases complementario, y una vez se une al sitio correcto, actua enzimaticamente para cortar el ARN diana. La 55 escision estrategica de dicho ARN diana destruira su capacidad para dirigir la sfntesis de una protefna codificada. Despues de unirse un acido nucleico enzimatico y escindir su ARN diana, se libera de ese ARN para buscar otra diana y puede unirse repetidamente y escindir nuevas dianas.
Se han usado varias estrategias como la seleccion in vitro (evolucion) (Orgel, (1979) Proc. R. Soc. London, B 205, 60 435) para desarrollar nuevos catalizadores de acido nucleico capaces de catalizar una variedad de reacciones, como la escision y ligacion de enlaces de fosfodiester y enlaces amida, (Joyce, (1989) Gene, 82, 83-87; Beaudry et al.,
(1992) Science 257, 635-641; Joyce, (1992) Scientific American 267, 90-97; Breaker et al., (1994) TIBTECH 12, 268; Bartel et al., (1993) Science 261:1411- 1418; Szostak, (1993) TIBS 17, 89-93; Kumar et al., (1995) FASEB J., 9, 1183; Breaker, (1996) Curr. Op. Biotech., 7, 442).
5 El desarrollo de ribozimas que son optimas para la actividad catalftica contribuirfa significativamente a cualquier estrategia que empleara ribozimas que escinden ARN con el fin de regular la expresion genica. La ribozima de cabeza de martillo, por ejemplo, funciona con una velocidad catalftica (kcat) de aproximadamente 1 min-1 en presencia de concentraciones saturantes (10 mM) de cofactor de Mg2+. Se ha demostrado que una ribozima de "ligasa de ARN" artificial cataliza la reaccion de auto-modificacion correspondiente con una velocidad de 10 aproximadamente 100 min-1. Ademas, se sabe que ciertas ribozimas de cabeza de martillo modificadas que tienen brazos de union al sustrato hechos de ADN catalizan la escision de ARN con multiples velocidades de recuperacion que se aproximan a 100 min-1. Finalmente, la sustitucion de un residuo especffico dentro del nucleo catalftico de la cabeza de martillo con ciertos analogos de nucleotido da ribozimas modificadas que muestran una mejora de hasta 10 veces en la velocidad catalftica. Estos descubrimientos demuestran que las ribozimas pueden promover 15 transformaciones qufmicas con velocidades catalfticas que son significativamente superiores a aquellas mostradas in vitro por la mayorfa de las ribozimas que se auto-escinden naturales. Entonces es posible que las estructuras de ciertas ribozimas que se auto-escinden puedan optimizarse para dar la maxima actividad catalftica, o que puedan prepararse motivos de ARN completamente nuevos que muestran velocidades significativamente mas rapidas para la escision de fosfodiester de ARN.
20
La escision intermolecular de un sustrato de ARN por un catalizador de ARN que se ajusta al modelo de "cabeza de martillo" se demostro por primera vez en 1987 (Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600). Se recupero el catalizador de ARN y se hizo reaccionar con multiples moleculas de ARN, demostrando que era verdaderamente catalftico.
25
ARN catalfticos disenados en base al motivo "cabeza de martillo" se han usado para escindir secuencias diana especfficas al producir cambios de bases apropiados en el ARN catalftico para mantener el apareamiento necesario de bases con las secuencias diana (Haseloff y Gerlach, (1988) Nature, 334, 585; Walbot y Bruening, (1988) Nature, 334, 196; Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600; Koizumi, M., et al. (1988) FEBS Lett., 228: 228-230). Esto 30 ha permitido el uso del ARN catalftico para escindir secuencias diana especfficas e indica que los ARN catalfticos disenados segun el modelo de "cabeza de martillo" pueden escindir posiblemente ARN de sustrato especffico in vivo. (vease Haseloff and Gerlach, (1988) Nature, 334, 585; Walbot and Bruening, (1988) Nature, 334, 196; Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600).
35 La interferencia de ARN (iARN) se ha convertido en una poderosa herramienta para modular la expresion genica en mamfferos y celulas de mamffero. Este enfoque requiere la administracion de ARN interferente pequeno (siRNA) bien como el propio ARN o bien como ADN, usando un plasmido de expresion o virus y la secuencia codificante para ARN de horquilla pequeno que se procesa a siRNA. Este sistema permite el eficaz transporte de los pre-siRNA al citoplasma en el que son activos y permiten el uso de promotores regulados y especfficos de tejido para la expresion 40 genica.
En un aspecto preferido, un oligonucleotido o compuesto antisentido comprende un oligomero o polfmero de acido ribonucleico (ARN) y/o acido desoxirribonucleico (ADN), o un mimetico, quimera, analogo u homologo de los mismos. Este termino incluye oligonucleotidos compuestos de nucleotidos de origen natural, azucares y enlaces 45 internucleosfdicos covalentes (esqueleto), ademas de oligonucleotidos que tienen partes no de origen natural que funcionan similarmente. Dichos oligonucleotidos modificados o sustituidos son frecuentemente deseados con respecto a formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captacion celular potenciada, afinidad potenciada por un acido nucleico diana y elevada estabilidad en presencia de nucleasas.
50 De acuerdo con la presente divulgacion, los oligonucleotidos o "compuestos antisentido" incluyen oligonucleotidos
antisentido (por ejemplo, ARN, ADN, mimetico, quimera, analogo u homologo de los mismos), ribozimas,
oligonucleotidos de secuencia de gufa externa (EGS), compuestos de siRNA, compuestos de interferencia (iARN) de ARN mono- o bicatenario tales como compuestos de siRNA, ARNap, aARN, y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana y modulan su funcion. Por lo tanto, pueden ser ADN, aRn,
55 similares a ADN, similares a ARN, o mezclas de los mismos, o pueden ser mimeticos de uno o mas de estos. Estos
compuestos pueden ser compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, circulares o de horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias internas o terminales, desapareamientos o bucles. Los compuestos antisentido se preparan de forma rutinaria linealmente, pero pueden unirse o prepararse de otro modo para ser circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden comprender construcciones tales como, por 60 ejemplo, dos cadenas hibridadas para formar un compuesto completa o parcialmente bicatenario o una unica cadena con auto-complementariedad suficiente para permitir la hibridacion y formacion de un compuesto completa o
parcialmente bicatenario. Las dos cadenas pueden enlazarse intern amente, dejando los extremos 3' o 5' libres o pueden enlazarse para formar una estructura de horquilla continua o bucle. La estructura de horquilla puede contener un nucleotido protuberante en cualquiera de los extremos 5' o 3' que produce una extension del caracter monocatenario. Los compuestos bicatenarios opcionalmente pueden comprender nucleotidos protuberantes en los 5 extremos. Modificaciones adicionales pueden comprender grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleotido seleccionadas, posiciones de azucar o a uno de los enlaces internucleosfdicos. Como alternativa, las dos cadenas pueden enlazarse mediante un resto no de acido nucleico o grupo conector. Cuando se forma a partir de solo una cadena, el dsARN puede tomar la forma de una molecula tipo horquilla auto- complementaria que se dobla sobre si misma para formar un duplex. De este modo, el dsARN puede ser completa o 10 parcialmente bicatenario. La modulacion especffica de la expresion genica se puede lograr por expresion estable de las horquillas de dsARN en lfneas de celulas transgenicas (Hammond et al., (1991) Nat. Rev. Genet., 2, 110-119; Matzke et al., (2001) Curr. Opin. genet. Dev., 11, 221-227; Sharp, (2001) genes Dev., 15, 485-490). Cuando se forma a partir de dos cadenas, o una unica cadena que adopta la forma de una molecula de tipo horquilla auto- complementaria que se dobla sobre si misma para formar un duplex, las dos cadenas (o regiones formadoras de 15 duplex de una sola cadena) son cadenas de ARN complementarias que se aparean con bases en el modo de Watson-Crick.
Una vez introducidos a un sistema, los compuestos de la divulgacion pueden provocar la accion de una o mas enzimas o protefnas estructurales para efectuar la escision u otra modificacion del acido nucleico diana o pueden 20 trabajar mediante mecanismos basados en la ocupacion. En general, los acidos nucleicos (incluyendo oligonucleotidos) pueden describirse como "similares a ADN" (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'- desoxiazucares y, generalmente, bases T en vez de U) o "similares a ARN" (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'-hidroxilazucares o azucares modificados en 2' y, generalmente bases U en vez de T). Las helices de acido nucleico pueden adoptar mas de un tipo de estructura, mas comunmente las formas A y B. Se cree que, en general, 25 los oligonucleotidos que tienen estructura similar a la forma B son "similares a ADN" y aquellos que tienen estructura similar a la forma A son "similares a ARN". En algunos casos (quimericos), un compuesto antisentido puede contener tanto regiones en forma A como B.
Los compuestos antisentido de acuerdo con esta divulgacion pueden comprender una parte antisentido de 30 aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleotidos (es decir, de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleosidos enlazados) de longitud. Esto se refiere a la longitud de la cadena antisentido o parte del compuesto antisentido. En otras palabras, un compuesto antisentido monocatenario de la divulgacion comprende de 5 a aproximadamente 80 nucleotidos, y un compuesto antisentido bicatenario de la divulgacion (tal como un dsARN, por ejemplo) comprende una cadena sentido y antisentido o parte de 5 a aproximadamente 80 nucleotidos de longitud. 35 Un experto habitual en la materia apreciara que este comprenda partes antisentido de 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,
46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76,
77, 78, 79 u 80 nucleotidos de longitud, o cualquier intervalo entremedias.
40 En un aspecto, los compuestos antisentido de la divulgacion tienen partes antisentido de 10 a 50 nucleotidos de longitud. Un experto habitual en la materia apreciara que estos integran oligonucleotidos que tienen partes antisentido de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,
37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 nucleotidos de longitud, o cualquier intervalo entremedias. En
algunos aspectos, los oligonucleotidos tienen 15 nucleotidos de longitud.
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En un aspecto, los compuestos antisentido o de oligonucleotido de la divulgacion tienen partes antisentido de 12 o 13 a 30 nucleotidos de longitud. Un experto en la materia apreciara que estos integran compuestos antisentido que tienen partes antisentido de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleotidos de longitud, o cualquier intervalo entremedias.
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En otro aspecto preferido, los compuestos oligomericos de la presente divulgacion tambien incluyen variantes en las que una base diferente esta presente en una o mas de las posiciones de nucleotido en el compuesto. Por ejemplo, si el primer nucleotido es una adenosina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina o citidina en esta posicion. Esto puede hacerse en cualquiera de las posiciones de los compuestos antisentido o de dsARN. Estos 55 compuestos se ensayan entonces usando los procedimientos descritos en el presente documento para determinar su capacidad para inhibir la expresion de un acido nucleico diana.
En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad, entre el compuesto antisentido y la diana, es de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 60 %. En algunos aspectos, la homologfa, identidad 60 de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 70% a
aproximadamente el 80%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 90%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, 5 aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100%.
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido, como, por ejemplo, las moleculas de acidos nucleicos expuestas en las SEQ ID NO: 10 a 30 comprenden una o mas sustituciones o modificaciones. En un aspecto, los nucleotidos estan sustituidos con acidos nucleicos bloqueados (LNA).
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En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos se dirigen a una o mas regiones de las moleculas de acidos nucleicos sentido y/o antisentido de secuencias codificantes y/o no codificantes asociadas al gen supresor de tumor y las secuencias expuestas como SEQ ID NO: 1, 1a, 1b, 2, 2a, 2b, 3, 3a, 4, 5, 6, 6a, 6b, 7, 8 y 9. Los oligonucleotidos tambien se dirigen a regiones solapantes de las SEQ ID NO: 1, 1a, 1b, 2, 2a, 2b, 3, 3a, 4, 5, 6, 6a, 6b, 7, 8 y 9.
15
Ciertos oligonucleotidos preferidos de esta divulgacion son oligonucleotidos quimericos. "Oligonucleotidos quimericos" o "quimeras", en el contexto de esta divulgacion, son oligonucleotidos que contienen dos o mas regiones qufmicamente distintas, cada una constituida por al menos un nucleotido. Estos oligonucleotidos normalmente contienen al menos una region de nucleotidos modificados que confiere una o mas propiedades beneficiosas (tales 20 como, por ejemplo, resistencia a nucleasas incrementada, captacion en celulas incrementada, afinidad de union por la diana incrementada) y una region que es un sustrato para enzimas capaces de escindir hfbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un duplex de ARN:ADN. La activacion de ARNasa H, por lo tanto, produce la escision del ARN diana, potenciando asf enormemente la eficiencia de la modulacion antisentido de la expresion genica. Por consiguiente, frecuentemente 25 pueden obtenerse resultados comparables con oligonucleotidos mas cortos cuando se usan oligonucleotidos quimericos, en comparacion con desoxioligonucleotidos de fosforotioato que hibridan con la misma region diana. La escision del ARN diana puede detectarse rutinariamente por electroforesis en gel y, si fuera necesario, tecnicas de hibridacion de acidos nucleicos asociadas conocidas en la tecnica. En un aspecto preferido, un oligonucleotido quimerico comprende al menos una region modificada para aumentar la afinidad de union de la diana, y, 30 normalmente, una region que actua de sustrato para ARNasa H. La afinidad de un oligonucleotido por su diana (en este caso, un acido nucleico que codifica ras) se determina rutinariamente midiendo la Tm de un par de oligonucleotido/diana, que es la temperatura a la que se disocian el oligonucleotido y la diana; la disociacion se detecta espectrofotometricamente. Cuanto mayor sea la Tm, mayor sera la afinidad del oligonucleotido por la diana.
35 Se pueden formar compuestos antisentido quimericos de la divulgacion como estructuras compuestas de dos o mas oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados, oligonucleosidos y/o mimeticos de oligonucleotidos, tal como se ha descrito anteriormente. Como tales, estos compuestos tambien se han referido en la tecnica como hfbridos o gapmeros. Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de estas estructuras hfbridas comprenden, pero no se limitan a, las patentes de los eE.UU con nos. 5.013.830; 5.149.797; 5. 220.007; 40 5.256.775; 5.366.878;5.403.711; 5.491.133; 5.565.350; 5.623.065; 5.652.355; 5.652.356; y 5.700.922.
En otro aspecto preferido, la region del oligonucleotido que se modifica comprende al menos un nucleotido modificado en la posicion 2' del azucar, de la forma mas preferente un nucleotido modificado con 2'-O-alquilo, 2'-O- alquil-O-alquilo o 2'-fluor. En otros aspectos preferidos, las modificaciones de ARN incluyen modificaciones de 2'45 fluor, 2'-amino y 2'-O-metilo en la ribosa de pirimidinas, residuos abasicos o una base invertida en el extremo 3' del ARN. Dichas modificaciones se incorporan rutinariamente en oligonucleotidos y se ha demostrado que estos oligonucleotidos tienen una mayor Tm (es decir, mayor afinidad de union a diana) que los 2'-desoxioligonucleotidos contra una diana dada. El efecto de dicha afinidad incrementada es potenciar enormemente la inhibicion por oligonucleotidos de iARN de la expresion genica. La ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena 50 de ARN de los duplex de ARN:ADN; por lo tanto, la activacion de esta enzima produce la escision del ARN diana, y de este modo puede potenciar enormemente la eficiencia de inhibicion de iARN. La escision del ARN diana puede demostrarse rutinariamente por electroforesis en gel. En otro aspecto preferido, el oligonucleotido quimerico tambien se modifica para potenciar la resistencia a nucleasas. Las celulas contienen diversas exo- y endo-nucleasas que pueden degradar acidos nucleicos. Se ha demostrado que varias modificaciones de nucleotidos y nucleosidos hacen 55 que el oligonucleotido en el que se incorporan sea mas resistente a la digestion por nucleasa que el oligodesoxinucleotido nativo. La resistencia a nucleasas se mide rutinariamente incubando oligonucleotidos con extractos celulares o soluciones de nucleasa aisladas y midiendo el grado de oligonucleotido intacto que queda con el tiempo, normalmente por electroforesis en gel. Los oligonucleotidos que se han modificado para potenciar su resistencia a nucleasas sobreviven intactos durante mas tiempo que los oligonucleotidos sin modificar. Se ha 60 demostrado que diversas modificaciones de oligonucleotidos potencian o confieren resistencia a nucleasas. Los oligonucleotidos que contienen al menos una modificacion de fosforotioato son actualmente mas preferidos. En
algunos casos, las modificaciones de oligonucleotidos que potencian la afinidad de union a diana son, tambien, independientemente, capaces de potenciar la resistencia a nucleasas. Algunas modificaciones deseables pueden encontrarse en De Mesmaeker et al. (1995) Acc. Chem. Res., 28:366-374.
5 Ejemplos especfficos de algunos oligonucleotidos preferidos concebidos por esta divulgacion incluyen aquellos que comprenden esqueletos modificados, por ejemplo, fosforotioatos, fosfotriesteres, metilfosfonatos, enlaces entre azucares de alquilo o cicloalquilo de cadena corta o enlaces entre azucares heteroatomicos o heterocfclicos de cadena corta. Los mas preferidos son oligonucleotidos con esqueletos de fosforotioato y aquellos con esqueletos de heteroatomo, particularmente esqueletos de CH2 --NH--O--CH2, CH,--N(CH3)--O--CH2 [conocido como un 10 esqueleto de metilen(metilimino) o MMI], CH2--O--N(CH3)--CH2, CH2-N(CH3)--N (CH3)--CH2 y O-- N(CH3)--CH2--, donde el esqueleto de fosfodiester nativo se representa como O--P--O--CH,). Los esqueletos de amida divulgados por De Mesmaeker et al. (1995) Acc. Chem. Res. 28:366-374 tambien se prefieren. Tambien se prefieren oligonucleotidos que tienen esqueletos de morfolino (Summerton and Weller, Patente de EE.UU. N°. 5.034.506. En otros aspectos preferidos, tal como el esqueleto de acido nucleico peptfdico (PNA), el esqueleto de fosfodiester del 15 oligonucleotido se sustituye por un esqueleto de poliamida, estando los nucleotidos unidos directamente o indirectamente a los atomos de nitrogeno azo del esqueleto de poliamida (Nielsen et al. (1991) Science 254, 1497). Los oligonucleotidos tambien pueden comprender uno o mas restos de azucar sustituidos. Oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posicion 2': OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)nNH2 o O(CH2)nCH3 en los que n es de 1 a aproximadamente 10; alquilo C1 a C10 inferior, 20 alcoxialcoxi, alquilo, alcarilo o aralquilo inferior sustituido; CI; Br; CN; CF3; OCF3; O--, S--, o N-alquilo; O--, S--, o N- alquenilo; SOCH3; SO2 CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; un grupo de escision de ARN; un grupo de genes supresores de tumor; un intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocineticas de un oligonucleotido; o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinamicas de un oligonucleotido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una 25 modificacion preferida incluye 2'-metoxietoxi [2'-O-CH2 CH2 OCH3, tambien conocido como 2'-O-(2-metoxietilo)] Martin et al., (1995) Helv. Chim. Acta, 78, 486). Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi (2'-O--CH3), 2'-propoxi(2'-OCH2 CH2CH3) y 2'-fluor (2'-F). Tambien pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones sobre el oligonucleotido, particularmente la posicion 3' del azucar en el nucleotido del extremo 3' y la posicion 5' del nucleotido del extremo 5'. Los oligonucleotidos tambien pueden tener mimeticos de azucar tales como ciclobutilos en 30 lugar del grupo pentofuranosilo.
Los oligonucleotidos tambien pueden comprender, adicionalmente o como alternativa, modificaciones o sustituciones de nucleobases (frecuentemente denominadas en la tecnica simplemente "base"). Tal como se usa en el presente documento, nucleotidos "no modificados" o "naturales" incluyen adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y 35 uracilo (U). Los nucleotidos modificados incluyen nucleotidos encontrados solo poco frecuentemente o transitoriamente en acidos nucleicos naturales, por ejemplo, hipoxantina, 6-metiladenina, 5-Me-pirimidinas, particularmente 5-metilcitosina (tambien denominada 5-metil-2'-desoxicitosina y frecuentemente denominada en la tecnica 5-Me-C), 5-hidroximetilcitosina (HMC), glicosil HMC y gentobiosil HMC, ademas de nucleotidos sinteticos, por ejemplo, 2-aminoadenina, 2-(metilamino)adenina, 2-(imidazolilalquil)adenina, 2-(aminoalquilamino)adenina u 40 otras alquiladeninas heterosustituidas, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5-bromouracilo, 5-hidroximetiluracilo, 8-azaguanina, 7-deazaguanina, N6(6-aminohexil)adenina y 2,6-diaminopurina (Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1980, pp75-77; Gebeyehu, G., (1987) et al. Nucl. Acids Res. 15:4513). Puede incluirse una base "universal" conocida en la tecnica, por ejemplo, inosina. Se ha mostrado que las sustituciones de 5-Me-C incrementan la estabilidad duplex del acido nucleico alrededor de 0,6-1,2 °C. (Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. y 45 Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) y actualmente son las sustituciones base preferidas.
Otra modificacion de los oligonucleotidos de la divulgacion implica enlazar qufmicamente al oligonucleotido uno o mas restos o conjugados que potencian la actividad o captacion celular del oligonucleotido. Estos restos incluyen, 50 pero no se limitan a, restos de lfpidos como es un resto de colesterol, un resto de colesterilo (Letsinger et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553), cholic acid (Manoharan et al. (1994) Bioorg. Med. Chem. Let. 4, 1053), un tioeter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 306; Manoharan et al. (1993) Bioorg. Med. Chem. Let. 3, 2765), un tiocolesterol (Oberhauser et al., (1992) Nucl. Acids Res. 20, 533), una cadena alifatica, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al. EMBO J. 1991, 10, 111; 55 Kabanov et al. (1990) FEBS Lett. 259, 327; Svinarchuk et al. (1993) Biochimie 75, 49), un fosfolfpido, por ejemplo, di- hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero- 3-H-fosfonato (Manoharan et al. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 3651; Shea et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18, 3777), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al. (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14, 969), o un acido adamantano-acetico (Manoharan et al. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 3651). Los oligonucleotidos que comprenden restos lipofilos, y 60 procedimientos para preparar dichos oligonucleotidos, son conocidos en la tecnica, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 5,138,045, 5,218,105 y 5,459,255.
No es necesario que todas las posiciones en un oligonucleotido dado esten uniformemente modificadas, y de hecho mas de una de las modificaciones mencionadas anteriormente puede incorporarse en un unico oligonucleotido o incluso dentro de un unico nucleosido dentro de un oligonucleotido. La presente divulgacion tambien incluye 5 oligonucleotidos que son oligonucleotidos quimericos, tal como se ha definido anteriormente en el presente documento.
En otro aspecto, la molecula de acido nucleico de la presente divulgacion esta conjugada con otro resto que incluye, aunque no se limita a, nucleotidos abasicos, polieter, poliamina, poliamidas, peptidos, hidratos de carbono, lfpido, o 10 compuestos de polihidrocarburo. Los expertos en la materia reconoceran que estas moleculas pueden enlazarse a uno o mas de cualquiera de los nucleotidos que comprenden la molecula de acido nucleico en varias posiciones en el azucar, base o grupo fosfato.
Los oligonucleotidos usados de acuerdo con esta divulgacion pueden prepararse comoda y rutinariamente mediante 15 la tecnica muy conocida de sfntesis en fase solida. Equipo para dichas sfntesis es comercializado por varios proveedores que incluyen Applied Biosystems. Tambien puede emplearse cualquier otro medio para dicha sfntesis; la sfntesis real de los oligonucleotidos esta perfectamente dentro de las aptitudes de un experto en la materia. Tambien es muy conocido usar tecnicas similares para preparar otros oligonucleotidos tales como fosforotioatos y derivados alquilados. Tambien es muy conocido usar tecnicas similares y amiditos modificados disponibles en el 20 mercado y productos de vidrio de poro controlado (CPG) tales como biotina, fluorescefna, acridina o amiditos modificados con psoraleno y/o CPG (disponible de Glen Research, Sterling VA) para sintetizar oligonucleotidos marcados de forma fluorescente, biotinilados u otros oligonucleotidos modificados tales como oligonucleotidos modificados con colesterol.
25 De acuerdo con la divulgacion, el uso de modificaciones tales como el uso de monomeros de LNA para potenciar la potencia, especificidad y duracion de la accion y ampliar las vfas de administracion de oligonucleotidos comprende qufmicas actuales tales como MOE, ANA, FANA, PS, etc. (Uhlman, et al. (2000) Current Opinions in Drug Discovery & Development Vol. 3 No 2). Esto puede lograrse sustituyendo algunos de los monomeros en los presentes oligonucleotidos por monomeros de LNA. El oligonucleotido modificado con LNA puede tener un tamano similar al 30 compuesto parental o puede ser mas grande o preferentemente mas pequeno. Se prefiere que dichas oligonucleotidos modificados con LNA contengan menos de aproximadamente el 70%, mas preferentemente menos de aproximadamente el 60%, de la manera mas preferente menos de aproximadamente el 50% de monomeros de LNA y que sus tamanos esten entre aproximadamente 5 y 25 nucleotidos, mas preferentemente entre aproximadamente 12 y 20 nucleotidos.
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Esqueletos de oligonucleotidos modificados preferidos comprenden, aunque no se limitan a, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriesteres, aminoalquilfosfotriesteres, metil y otros alquil fosfonatos que comprenden 3'-alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que comprenden 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriesteres y 40 boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, analogos enlazados en 2'-5' de estos, y aquellos que tienen polaridad invertida, donde los pares adyacentes de unidades de nucleosidos estan enlazados 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'2'. Tambien se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de acido libre.
Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de los enlaces anteriores que 45 contienen fosforo comprenden, pero no se limitan a, lasPatentes de Estados Unidos n.° 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5. 177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455. 233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; y 5.625.050.
50 Esqueletos de oligonucleotido modificados preferidos que no incluyen un atomo de fosforo en ellos tienen esqueletos que se forman por enlaces internucleosfdicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosfdicos de heteroatomo y alquilo o cicloalquilo mixtos, o uno o mas enlaces internucleosfdicos heteroatomicos o heterocfclicos de cadena corta. Estos comprenden aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la parte de azucar de un nucleosido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfuro, sulfoxido y sulfona; esqueletos de 55 formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de metilenformacetilo y tioformacetilo; esqueletos que contienen alqueno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que tienen partes de componentes de N, O, S y CH2 mixtos.
Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de los oligonucleosidos 60 comprenden, pero no se limitan a, las patentes de los EE.UU. con nos. 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264. 562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307;
5.561.225; 5.596. 086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623. 070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439.
En otros mimeticos de oligonucleotidos preferidos, tanto el azucar como el enlace internucleosfdico, es decir, el 5 esqueleto, de las unidades de nucleotido se sustituyen por grupos novedosos. Las unidades de base se mantienen para la hibridacion con un compuesto de acido nucleico diana apropiado. Dicho compuesto oligomerico, un oligonucleotido mimetico que se ha demostrado que tiene excelente propiedades de hibridacion, se denomina acido nucleico peptfdico (PNA). En compuestos de PNA, el esqueleto de azucar de un oligonucleotido se sustituye por un esqueleto que contiene amida, en particular un esqueleto de aminoetilglicina. Las nucleobases son retenidas y se 10 unen directamente o indirectamente a atomos de nitrogeno azo de la parte de amida del esqueleto. Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de compuestos PNA comprenden, pero no se limitan a, las patentes de los EE.UU. con nos. 5,539,082; 5,714,331; y 5,719,262. Ensenanzas adicionales de compuestos de PNA pueden encontrarse en Nielsen, et al. (1991) Science 254, 1497-1500.
15 En otro aspecto preferido de la divulgacion, los oligonucleotidos con esqueletos de fosforotioato y oligonucleosidos con esqueletos de heteroatomo, y en particular -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-, conocidos como un esqueleto de metileno (metilimino) o MMI, -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2N(CH3)-N(CH3)CH2- y -O-N(CH3)-CH2- CH2- donde el esqueleto de fosfodiester nativo se representa como -O-P-O-CH2- de la patente de EE.UU. n° 5.489.677, citada anteriormente, y los esqueletos de amida de la patente de EE.UU. n° 5.602.240, citada 20 anteriormente. Tambien se prefieren oligonucleotidos que tienen esqueletos de morfolino de la patente de EE.UU. n° 5.034.506, citada anteriormente.
Los oligonucleotidos modificados tambien pueden contener uno o mas restos de azucar sustituidos. Oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posicion 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S- 25 o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C a CO sustituido o sin sustituir o alquenilo y alquinilo C2 a CO. Se prefieren particularmente O(CH2)n OmCH3, O(CH2)n, OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2nON(CH2)nCH3)2 en las que n y m pueden ser de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posicion 2': C a CO, (alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo o O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, CI, Br, CN, 30 CF3, OCF3, SOcH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escision de ARN, un grupo de genes supresores de tumor, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocineticas de un oligonucleotido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinamicas de un oligonucleotido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificacion preferida comprende 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3, tambien conocido como 2'-O-(2- 35 metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin et al., (1995) Helv. Chim. Acta, 78, 486-504) por ejemplo, un grupo alcoxialcoxi. Otra modificacion preferida comprende 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, tambien conocido como 2'-DMAOE, tal como se describe en los ejemplos en el presente documento mas adelante, y 2'- dimetilaminoetoxietoxi (tambien conocido en la tecnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'- O-CH2-O-CH2-N(CH2)2..
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Otras modificaciones preferidas comprenden 2'-metoxi (2'-OCH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2) y 2'-fluor (2'-F). Tambien pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones en el oligonucleotido, particularmente la posicion 3' del azucar en el nucleotido del extremo 3' o en oligonucleotidos enlazados 2'-5' y la posicion 5' del nucleotido del extremo 5'. Los oligonucleotidos tambien pueden tener mimeticos de azucar tales como restos 45 ciclobutilo en lugar del azucar pentofuranosilo. Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de dichas estructuras de azucar modificadas comprenden, pero no se limitan a, las patentes de los EE.UU. con nos. 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646. 265;
5.658.873;5.670.633; y 5.700.920.
50
Los oligonucleotidos tambien pueden comprender modificaciones o sustituciones de nucleobases (frecuentemente denominadas en la tecnica simplemente "base"). Tal como se usa en el presente documento, nucleotidos "no modificados" o "naturales" comprenden las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Los nucleotidos modificados comprenden otros nucleotidos sinteticos y naturales 55 tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6- metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6- azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudo-uracilo), 4-tiouracilo, 8-halogeno, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8- hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en 8, 5-halogeno, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros 60 uracilos y citosinas sustituidos en 5, 7-metilquanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.
Ademas, los nucleotidos comprenden los divulgados en la patente de Estados Unidos n° 3.687.808, aquellos divulgados en "The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering", paginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellos divulgados por Englisch et al., "Angewandle Chemie, International Edition", 5 1991, 30, pagina 613, y aquellos divulgados por Sanghvi, Y.S., Capftulo 15, "Antisense Research and Applications", paginas 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Algunos de estos nucleotidos son particularmente utiles para incrementar la afinidad de union de los compuestos oligomericos de la divulgacion. Estos comprenden pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en N-2, N-6 y O-6, que comprenden 2- aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha mostrado que las sustituciones de 5-metilcistosina 10 incrementan la estabilidad del duplex de acido nucleico alrededor de 0,6-1,2 °C. (Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) y actualmente son las sustituciones base preferidas, de manera aun mas particular cuando se combinan con modificaciones de azucar de 2'-Ometoxietilo
15 Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de los nucleotidos modificados citados anteriormente, asf como otros nucleotidos modificados, comprenden, pero no se limitan a, las patentes de los EE.UU. con nos. 3.687.808, asf como 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175. 273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711;5.552.540; 5.587.469; 5.596.091; 5.614.617; 5.750.692, y 5.681,941.
20
Otra modificacion de los oligonucleotidos de la divulgacion implica enlazar qufmicamente al oligonucleotido uno o mas restos o conjugados, que potencian la actividad, distribucion celular o captacion celular del oligonucleotido
Dichos restos comprenden, aunque no se limitan a, restos de lfpido tales como un resto colesterol (Letsinger et al., 25 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 86, 6553-6556), acido colico (Manoharan et al., (1994) Bioorg. Med. Chem. Let., 4, 1053-1060), un tioeter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci., 660, 306- 309;Manoharan et al., (1993) Bioorg. Med. Chem. Let., 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., (1992) Nucl. Acids Res., 20, 533-538), una cadena alifatica, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecilo (Kabanov et al., (1990) FEBS Lett., 259, 327-330; Svinarchuk et al., (1993) Biochimie 75, 49-54), un fosfolfpido, por ejemplo, di- 30 hexadecil-rac-glicerol o 1, 2-di-0- hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36, 3651-3654; Shea et al., (1990) Nucl. Acids Res., 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polientilenglicol (Mancharan et al., (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14, 969-973), o acido adamantano-acetico (Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36, 3651-3654), un resto de palmitilo (Mishra et al., (1995) Biochim. Biophys. Acta, 1264, 229-237), o un resto de 35
octadecilamina o hexilamino-carbonil-t-oxicolesterol (Crooke et al., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther., 277, 923-937).
Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de estos conjugados de oligonucleotidos comprenden, pero no se limitan a, las patentes de los EE.Uu con nos. 4.828.979; 4.948.882; 40 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717, 5.580.731; 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486. 603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762. 779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013;5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241, 5.391. 723; 5.416.203, 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 45 5.585.481;5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941.
Descubrimiento de farmacos: Los compuestos de la presente divulgacion tambien pueden aplicarse en las areas del descubrimiento de farmacos y validacion de dianas. La presente divulgacion comprende el uso de los compuestos y segmentos diana preferidos e identificados en el presente documento en un esfuerzo por descubrir farmacos para 50 esclarecer las relaciones que existen entre polinucleotidos del gen supresor de tumor y una patologfa, fenotipo o afeccion. Estos procedimientos incluyen detectar o modular los polinucleotidos del gen supresor de tumor que comprenden poner en contacto una muestra, tejido, celula u organismo con los compuestos de la presente divulgacion, medir el nivel de acido nucleico o de protefna de los polinucleotidos del gen supresor de tumor y/o un criterio de valoracion fenotfpico o qufmico relacionado en algun momento despues del tratamiento, y opcionalmente 55 comparar el valor medido con una muestra no tratada o muestra tratada con otro compuesto de la divulgacion. Estos procedimientos tambien pueden realizarse en paralelo o en combinacion con otros experimentos para determinar la funcion de genes desconocidos para el proceso de validacion de dianas o para determinar la validez de un producto genico particular como diana para el tratamiento o prevencion de una enfermedad, afeccion o fenotipo particular.
60 Evaluation de la regulation positiva o inhibition de la expresion genica:
La transferencia de un acido nucleico exogeno a una celula u organismo huesped puede evaluarse detectando directamente la presencia del acido nucleico en la celula u organismo. Dicha deteccion puede lograrse mediante varios procedimientos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la presencia del acido nucleico exogeno puede detectarse por Southern blot o por una tecnica de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores 5 que amplifican especfficamente secuencias de nucleotidos asociadas al acido nucleico. La expresion de los acidos nucleicos exogenos tambien puede medirse usando procedimientos convencionales que incluyen analisis de expresion genica. Por ejemplo, el ARNm producido a partir de un acido nucleico exogeno puede detectarse y cuantificarse usando una Northern blot y PCR con transcripcion inversa (RT-PCR).
10 La expresion de ARN del acido nucleico exogeno tambien puede detectarse midiendo una actividad enzimatica o una actividad de protefna reportera. Por ejemplo, puede medirse la actividad moduladora antisentido indirectamente como una disminucion o aumento en la expresion de acido nucleico diana como una indicacion de que el acido nucleico exogeno esta produciendo el ARN efector. Basandose en conservacion de secuencias, pueden disenarse cebadores y usarse para amplificar regiones codificantes de los genes diana. Inicialmente, la region codificante mas 15 altamente expresada de cada gen puede usarse para construir un gen de control modelo, aunque puede usarse cualquier region codificante o no codificante. Cada gen de control se ensambla insertando cada region codificante entre una region codificante reportera y su senal de poli(A). Estos plasmidos producirfan un ARNm con un gen supresor de tumor en la parte cadena arriba del gen y una posible diana de iARN en la region no codificante 3'. La eficacia de oligonucleotidos antisentido individuales se ensayarfa por modulacion del gen supresor de tumor. Los 20 genes supresores de tumor utiles en los procedimientos de la presente divulgacion incluyen acetohidroxiacido sintasa (AHAS), fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa (LacZ), beta-glucuronidasa (GUS), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), protefna verde fluorescente (GFP), protefna roja fluorescente (RFP), protefna amarilla fluorescente (YFP), protefna cian fluorescente (CFP), peroxidasa de rabano picante (HRP), luciferasa (Luc), nopalina sintasa (NOS), octopina sintasa (OCS), y derivados de los mismos. Estan disponibles multiples marcadores de 25 seleccion que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina y tetraciclina. Los procedimientos de determinacion de la modulacion de un gen supresor de tumor son muy conocidos en la tecnica, e incluyen, aunque no se limitan a, procedimientos fluorimetricos (por ejemplo, espectroscopfa de fluorescencia, clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS), microscopfa de fluorescencia), determinacion de la resistencia a antibioticos.
30
Kits, reactivos de investigacion, diagnosticos y terapeuticos
Los compuestos de la presente divulgacion pueden utilizarse para diagnostico, agentes terapeuticos y profilaxis, y como reactivos de investigacion y componentes de kits. Ademas, los oligonucleotidos antisentido, que son capaces 35 de inhibir la expresion genica con exquisita especificidad, son usados frecuentemente por los expertos en la materia para aclarar la funcion de genes particulares o para distinguir entre funciones de diversos miembros de una via biologica.
Para su uso en kits y diagnosticos y en diversos sistemas biologicos, los compuestos de la presente divulgacion, 40 tanto solos como en combinacion con otros compuestos o terapeuticos, son utiles como herramientas en analisis diferenciales y/o combinatorios para aclarar patrones de expresion de una parte o de todo el complemento de genes expresados dentro de celulas y tejidos.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion "sistema biologico" o "sistema" se define como cualquier 45 organismo, celula, cultivo celular o tejido que expresa, o se ha hecho competente para expresar productos de genes del gen supresor de tumor. Estos incluyen, aunque no se limitan a, seres humanos, animales transgenicos, celulas, cultivos celulares, tejidos, xenoinjertos, trasplantes y combinaciones de los mismos.
Como un ejemplo no limitante, patrones de expresion dentro de celulas o tejidos tratados con uno o mas compuestos 50 antisentido se comparan con celulas o tejidos de control no tratados con compuestos antisentido y los patrones producidos se analizan para niveles diferenciales de expresion genica, ya que estan relacionados, por ejemplo, con asociacion de enfermedad, via de senalizacion, localizacion celular, nivel de expresion, tamano, estructura o funcion de los genes examinados. Estos analisis pueden realizarse en celulas estimuladas o sin estimular y en presencia o ausencia de otros compuestos que afectan los patrones de expresion.
55
Ejemplos de procedimientos de analisis de la expresion genica conocidos en la tecnica incluyen matrices o micromatrices de ADN, (Brazma y Vilo, (2000) FEBS Lett., 480, 17-24; Celis, et al., (2000) FEBS Lett., 480, 2-16), SAGE (analisis en serie de expresion genica) (Madden, et al., (2000) Drug Discov. Today, 5, 415- 425), READS (amplificacion por enzimas de restriccion de los ADNc digeridos) (Prashar and Weissman, (1999) Methods Enzymol., 60 303, 258-72), TOGA (analisis de expresion genica total) (Sutcliffe, et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 97, 1976-81), matrices de protefnas y proteomicos (Celis, et al., (2000) FeBS Lett., 480, 2-16; Jungblut, et al.,
Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), secuenciacion de marca de secuencia expresada (EST) (Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson, et al., J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57), huella de ADN sustractiva (SuRF) (Fuchs, et al., (2000) Anal. Biochem. 286, 91-98; Larson, et al., (2000) Cytometry 41, 203-208), clonacion sustractiva, presentacion diferencial (DD) (Jurecic y Belmont, (2000) Curr. Opin. Microbiol. 3, 316-21), hibridacion genomica 5 comparativa (Carulli, et al., (1998) J. Cell Biochem. Suppl., 31, 286-96), tecnicas de FISH (hibridacion in situ fluorescente) (Going y Gusterson, (1999) Eur. J. Cancer, 35, 1895-904) y procedimientos de espectrometrfa de masas (To, Comb. (2000) Chem. High Throughput Screen, 3, 235-41).
Los compuestos de la divulgacion son utiles para investigacion y diagnostico, debido a que estos compuestos 10 hibridan con acidos nucleicos que codifican el gen supresor de tumor. Por ejemplo, los oligonucleotidos que hibridan con dicha eficiencia y en dichas condiciones que se han descrito en el presente documento como moduladores eficaces del gen supresor de tumor son cebadores o sondas eficaces en condiciones que favorecen la amplificacion genica o deteccion, respectivamente. Estos cebadores y sondas son utiles en procedimientos que requieren la deteccion especffica de moleculas de acidos nucleicos que codifican el gen supresor de tumor y en la amplificacion 15 de dichas moleculas de acidos nucleicos para la deteccion o para su uso en estudios adicionales del gen supresor de tumor. La hibridacion de los oligonucleotidos antisentido, particularmente los cebadores y sondas de la divulgacion con un acido nucleico que codifica el gen supresor de tumor, puede detectarse por medios conocidos en la tecnica. Dichos medios pueden comprender conjugacion de una enzima con el oligonucleotido, radiomarcado del oligonucleotido, o cualquier otro medio de deteccion adecuado. Tambien pueden prepararse kits que usan dichos 20 medios de deteccion para detectar el nivel del gen supresor de tumor en una muestra.
La especificidad y sensibilidad del antisentido tambien son empleadas por los expertos en la materia para usos terapeuticos. Se han empleado oligonucleotidos antisentido como restos terapeuticos en el tratamiento de patologfas en animales, que incluyen seres humanos. Los farmacos de oligonucleotido antisentido se han administrado con 25 seguridad y eficazmente a seres humanos y numerosos ensayos clfnicos estan actualmente en marcha. De este modo, se establece que los compuestos antisentido pueden ser modalidades terapeuticas utiles que pueden configurarse para ser utiles en regfmenes de tratamiento para el tratamiento de celulas, tejidos y animales, especialmente seres humanos.
30 Para terapeuticos, un animal, preferentemente un ser humano, que se sospecha o tiene una enfermedad o trastorno que puede tratarse modulando la expresion del gen supresor de tumor se trata administrando compuestos antisentido de acuerdo con esta divulgacion. Por ejemplo, en un aspecto no limitante, los procedimientos comprenden la etapa de administrar al animal que necesita tratamiento una cantidad terapeuticamente eficaz del modulador del gen supresor de tumor. Los moduladores del gen supresor de tumor de la presente divulgacion 35 modulan de manera efectiva la actividad del gen supresor de tumor o modulan la expresion de la protefna del gen supresor de tumor. En un aspecto, la actividad o expresion del gen supresor de tumor en un animal se inhibe aproximadamente el 10 % en comparacion con un control. Preferentemente, la actividad o expresion del gen supresor de tumor en un animal se inhibe aproximadamente el 30 %. Mas preferentemente, la actividad o expresion del gen supresor de tumor en un animal se inhibe el 50 % o mas. De este modo, los compuestos oligomericos 40 modulan la expresion del ARNm del gen supresor de tumor al menos el 10 %, al menos el 50 %, al menos el 25 %,
al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al
menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98%, al menos el 99%, o el 100 % en comparacion con un control.
45 En un aspecto, la actividad o expresion del gen supresor de tumor y/o en un animal aumenta aproximadamente el 10 % en comparacion con un control. Preferentemente, la actividad o expresion del gen supresor de tumor en un animal aumenta aproximadamente el 30 %. Mas preferentemente, la actividad o expresion del gen supresor de tumor en un animal aumenta el 50 % o mas. De este modo, los compuestos oligomericos modulan la expresion del ARNm del gen supresor de tumor al menos el 10 %, al menos el 50 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, 50 al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al
menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98%, al menos el 99%, o el 100 % en comparacion con un control.
Por ejemplo, se puede medir la reduccion de la expresion del gen supresor de tumor en suero, sangre, tejido adiposo, hfgado o cualquier otro lfquido corporal, tejido u organo del animal. Preferentemente, las celulas contenidas 55 dentro de dichos lfquidos, tejidos u organos que se analizan contienen una molecula de acido nucleico que codifica peptidos del gen supresor de tumor y/o la propia protefna del gen supresor de tumor.
Los compuestos de la divulgacion pueden utilizarse en composiciones farmaceuticas anadiendo una cantidad eficaz de un compuesto a un diluyente o vehfculo farmaceuticamente aceptable adecuado. El uso de los compuestos y 60 procedimientos de la divulgacion tambien pueden ser utiles profilacticamente.
Conjugados
Otra modificacion de los oligonucleotidos de la divulgacion implica enlazar qufmicamente al oligonucleotido uno o mas restos o conjugados, que potencian la actividad, distribucion celular o captacion celular del oligonucleotido 5 Estos restos o conjugados pueden comprender grupos conjugados covalentemente unidos a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Grupos conjugados de la divulgacion incluyen intercaladores, moleculas de genes supresores de tumor, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, polieteres, grupos que potencian las propiedades farmacodinamicas de oligomeros, y grupos que potencian las propiedades farmacocineticas de oligomeros. Grupos conjugados tfpicos incluyen colesteroles, lfpidos, fosfolfpidos, biotina, fenazina, folato, 10 fenantridina, antraquinona, acridina, fluorescefnas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Grupos que potencian las propiedades farmacodinamicas, en el contexto de esta divulgacion, incluyen grupos que mejoran la captacion, potencian la resistencia a la degradacion y/o fortalecen la hibridacion especffica de secuencia con el acido nucleico diana. Grupos que potencian las propiedades farmacocineticas, en el contexto de esta divulgacion, incluyen grupos que mejoran la captacion, distribucion, metabolismo o eliminacion de los compuestos de la presente divulgacion. 15 Grupos conjugados representativos se describen en la solicitud de patente internacional n°. PCT/US92/09196, depositada el 23 de 1992, y la patente de EE.UU. con No. 6,287,860. Restos conjugados incluyen, aunque no se limitan a, restos de lfpido tales como un resto colesterol, acido colico, un tioeter, por ejemplo, hexil-5-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifatica, por ejemplo, residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosfolfpido, por ejemplo, di- hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de 20 polietilenglicol, o acido adamantano acetico, un resto palmitilo, o un resto octadecilamina o hexilamino-carbonil- oxicolesterol. Los oligonucleotidos de la divulgacion tambien pueden conjugarse con principios activos, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, acido 2,3,5-triyodobenzoico, acido flufenamico, acido folfnico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometacina, un barbiturico, una cefalosporina, un farmaco sulfa, un antidiabetico, un antibacteriano o un 25 antibiotico.
Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de estos conjuados de oligonucleotidos incluyen, pero no se limitan a, las Patentes de los EE.UU. con N° 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717, 5.580.731; 5.580.731; 5.591.584;5.109.124; 5.118.802; 30 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025;
4.762.779;4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241, 5.391.723; 5.416.203. 5.451.463; 5.510.475;5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941.
35
Formulaciones
Los compuestos de la divulgacion tambien pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo a otras moleculas, estructuras de molecula o mezclas de compuestos, como, por ejemplo, liposomas, moleculas 40 dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, topica u otras, para ayudar en la captacion, distribucion y/o absorcion. Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de estas formulaciones de ayuda en la captacion, distribucion y/o absorcion incluyen, pero no se limitan a, las patentes de los EE.UU. con N.° 5.108.921; 5.354.844; 5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.165; 5.547.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330; 4.534.899; 5.013.556; 5.108.921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016; 5.417.978; 45 5.462.854; 5.469.854; 5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5.556.948;5.580.575; y 5.595.756.
Aunque los oligonucleotidos antisentido no necesitan administrarse en el contexto de un vector con el fin de modular la expresion y/o funcion de una diana, aspectos de la divulgacion se refieren a construcciones de vector de expresion para la expresion de oligonucleotidos antisentido, que comprende promotores, secuencias de genes 50 promotores hfbridos y poseen una fuerte actividad promotora constitutiva, o una actividad promotora que puede inducirse en el caso deseado.
En un aspecto, la practica de la divulgacion implica administrar al menos uno de los oligonucleotidos antisentido anteriores con un sistema de administracion de acidos nucleicos adecuado. En un aspecto, ese sistema incluye un 55 vector no viral enlazado operativamente al polinucleotido. Ejemplos de dichos vectores no virales incluyen el oligonucleotido solo (por ejemplo, una cualquiera o mas de las SEQ ID NO: 10 a 30) o en combinacion con una formulacion de protefna, polisacarido o lfpido adecuada.
Sistemas de administracion de acidos nucleicos adecuados adicionales incluyen vector viral, normalmente secuencia 60 de al menos uno de un adenovirus, virus asociado a adenovirus (AAV), adenovirus dependiente de cooperador, retrovirus, o complejo de virus hemaglutinante de Japon-liposoma (HVJ). Preferentemente, el vector viral comprende
un promotor de eucariota fuerte operativamente enlazado al polinucleotido, por ejemplo, un promotor del citomegalovirus (CMV).
Vectores preferidos adicionales incluyen vectores virales, protemas de fusion y conjugados qmmicos. Los vectores 5 retrovirales incluyen virus de la leucemia murina de Moloney y virus basados en el HIV. Un vector viral basado en el HIV preferido comprende al menos dos vectores en los que los genes gag y pol son de un genoma del HIV y el gen env es de otro virus. Se prefieren vectores virales de ADN. Estos vectores incluyen vectores de pox tales como vectores de ortopox o avipox, vectores del virus del herpes tales como un vector del virus del herpes simple I (HSV) [Geller, A.I. et al., (1995) J. Neurochem, 64: 487; Lim, F., et al., en DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, 10 Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A.I. et al., (1993) Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.:90 7603; Geller, A.I., et al., (1990) Proc Natl. Acad. Sci USA: 87:1149], Adenovirus Vectors (LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., (1993) Nat. genet. 3: 219; Yang, et al., (1995) J. Virol. 69: 2004) y Adeno- associated Virus Vectors (Kaplitt, M.G., et al., (1994) Nat. genet. 8:148).
15 Los compuestos antisentido de la divulgacion engloban cualquier sal, ester o sal de dichos esteres farmaceuticamente aceptables, o cualquier otro compuesto que, tras la administracion a un animal, que incluye un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biologicamente activo o residuo del mismo.
20 La expresion "sales farmaceuticamente aceptables" se refiere a sales fisiologicamente y farmaceuticamente aceptables de los compuestos de la divulgacion: es decir, sales que retienen la actividad biologica deseada del compuesto parental y no confieren efectos toxicologicos no deseados al mismo. Para oligonucleotidos, ejemplos preferidos de sales farmaceuticamente aceptables y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos No. 6,287,860.
25
La presente divulgacion tambien incluye composiciones y formulaciones farmaceuticas que incluyen los compuestos antisentido de la divulgacion. Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion pueden administrarse en varias formas que dependen de si se desea tratamiento local o sistemico y del area que va a tratarse. La administracion puede ser topica (incluyendo oftalmica y a membranas mucosas que incluyen administracion vaginal 30 y rectal), pulmonar, por ejemplo, por inhalacion o insuflacion de polvos o aerosoles, que incluye por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidermica y transdermica), oral o parenteral. La administracion parenteral incluye inyeccion o infusion intravenosa, intraarterial, subcutanea, intraperitoneal o intramuscular; o administracion intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular. Se cree que los oligonucleotidos con al menos una modificacion de 2'-O- metoxietilo son particularmente utiles para administracion por via oral. Composiciones y formulaciones farmaceuticas 35 para administracion topica pueden comprender parches transdermicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, esprais, lfquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vetuculos farmaceuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y similares. Tambien pueden ser utiles preservativos recubiertos, guantes y similares.
40 Las formulaciones farmaceuticas de la presente divulgacion, que pueden presentarse convenientemente en forma de dosificacion unitaria, pueden prepararse de acuerdo con tecnicas convencionales muy conocidas en la industria farmaceutica. Dichas tecnicas incluyen la etapa de poner en asociacion los principios activos con el (los) vetnculo(s) farmaceutico(s) o excipiente(s). En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociacion uniforme e mtimamente los principios activos con vetuculos lfquidos o vetuculos solidos finamente divididos, o ambos, y luego, 45 si fuera necesario, moldeando el producto.
Las composiciones de la presente divulgacion pueden formularse en cualquiera de muchas formas de dosificacion posibles tales como, aunque no se limitan a, comprimidos, capsulas, capsulas de gel, jarabes lfquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente divulgacion tambien pueden formularse como 50 suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener adicionalmente sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sodica, sorbitol y/o dextrano. La suspension tambien puede contener estabilizantes.
Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion incluyen, aunque no se limitan a, soluciones, 55 emulsiones, espumas y formulaciones que contienen liposomas. Las composiciones y formulaciones farmaceuticas de la presente divulgacion pueden comprender uno o mas potenciadores de la penetracion, vetuculos, excipientes u otros principios activos o inactivos.
Las emulsiones normalmente son sistemas heterogeneos de un lfquido dispersado en otro en forma de gotitas que 60 normalmente superan 0,1 pm de diametro. Las emulsiones pueden contener componentes adicionales, ademas de las fases dispersas, y el farmaco activo que puede estar presente como una solucion en o bien la fase acuosa, fase
oleosa o bien el mismo como una fase independiente. Las microemulsiones estan incluidas como un aspecto de la presente divulgacion. Las emulsiones y sus usos son muy conocidos en la tecnica y se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos No. 6,287,860.
5 Formulaciones de la presente divulgacion incluyen formulaciones liposomales. Tal como se usa en la presente divulgacion, el termino "liposoma" significa una vesfcula compuesta por lfpidos anfifflicos dispuestos en una bicapa o bicapas esfericas. Los liposomas son vesfculas unilaminares o multilaminares que tienen una membrana formada por un material lipofilo y un interior acuoso que contiene la composicion que va a administrarse. Los liposomas cationicos son liposomas positivamente cargados que se cree que interaction con moleculas de ADN negativamente 10 cargadas para formar un complejo estable. Se cree que los liposomas que son sensibles al pH o estan cargados negativamente atrapan el ADN en vez de complejarse con el. Se han usado tanto liposomas cationicos como no cationicos para administrar ADN a celulas.
Los liposomas tambien incluyen liposomas "estericamente estabilizados", una expresion que, tal como se usa en el 15 presente documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o mas lfpidos especializados. Cuando se incorporan en liposomas, estos lfpidos especializados producen liposomas con vidas en circulacion mejoradas con respecto a los liposomas que carecen de dichos lfpidos especializados. Ejemplos de liposomas estericamente estabilizados son aquellos en los que parte de la parte de lfpido formado de vesfcula del liposoma comprende uno o mas glucolfpidos o se derivatiza con uno o mas polfmeros hidrofilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). 20 Los liposomas y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos No. 6,287,860.
Las formulaciones y composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion tambien pueden comprender tensioactivos. El uso de tensioactivos en medicamentos, formulaciones y en emulsiones es muy conocido en la tecnica. Los agentes tensioactivos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de EE.UU. No. 6,287,860. 25
En un aspecto, la presente divulgacion emplea diversos potenciadores de la penetracion para efectuar la administracion eficiente de acidos nucleicos, particularmente oligonucleotidos. Ademas de ayudar en la difusion de farmacos no lipofilos a traves de membranas celulares, los potenciadores de la penetracion tambien potencian la permeabilidad de farmacos lipofilos. Los potenciadores de la penetracion pueden clasificarse como pertenecientes a 30 una de cinco amplias categorfas, es decir, tensioactivos, acidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes. Los mejoradores de penetracion y sus usos se describen adicionalmente en la patente de EE.UU. No. 6,287,860.
Un experto en la materia reconocera que las formulaciones se disenan rutinariamente segun su uso previsto, es 35 decir, su via de administracion.
Formulaciones preferidas para administracion topica incluyen aquellas en las que los oligonucleotidos de la divulgacion estan en mezcla con un agente de administracion topica tal como lfpidos, liposomas, acidos grasos, esteres de acidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Lfpidos y liposomas preferidos incluyen 40 neutros (por ejemplo, dioleoil-fosfatidiletanolamina DOPE, dimiristoilfosfatidilcolina DmPc, diestearoilfosfatidilcolina) negativos (por ejemplo, dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG) y cationicos (por ejemplo, dioleoiltetrametilaminopropilo DOTAP y dioleoil-fosfatidiletanolamina DOTMA).
Para administracion topica u otra, los oligonucleotidos de la divulgacion pueden encapsularse dentro de liposomas o 45 pueden formar complejos con los mismos, en particular con liposomas cationicos. Como alternativa, los oligonucleotidos pueden estar complejados con lfpidos, en particular con lfpidos cationicos. Acidos grasos y esteres preferidos, sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos No. 6,287,860.
50 Las composiciones y formulaciones para administracion por via oral incluyen polvos o granulos, micropartfculas, nanopartfculas, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, capsulas, capsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersion o aglutinantes. Formulaciones orales preferidas son aquellas en las que los oligonucleotidos de la divulgacion se administran conjuntamente con uno o mas potenciadores de la penetracion, 55 tensioactivos y quelantes. Tensioactivos preferidos incluyen acidos grasos y/o esteres o sales de los mismos, acidos biliares y/o sales de los mismos. Acidos biliares/sales y acidos grasos preferidos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos No. 6,287,860. Tambien se prefieren combinaciones de potenciadores de la penetracion, por ejemplo, acidos grasos/sales en combinacion con acidos biliares/sales. Una combinacion particularmente preferida es la sal de sodio de acido laurico, acido caprico y UDCA. Potenciadores de 60 la penetracion adicionales incluyen eter polioxietilen-9-laurflico, eter polioxietilen-20-cetflico. Los oligonucleotidos de la divulgacion pueden administrarse por via oral, en forma granulada que incluye partfculas secadas por
pulverizacion, o complejados para formar micro o nanopartfculas. Los agentes complejantes de oligonucleotidos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos No. 6,287,860.
Las composiciones y formulaciones para administracion parenteral, intratecal o intraventricular pueden comprender 5 soluciones acuosas esteriles que tambien pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, aunque no se limitan a, potenciadores de la penetracion, compuestos portadores y otros vehfculos o excipientes farmaceuticamente aceptables
Ciertos aspectos de la divulgacion proporcionan composiciones farmaceuticas que contienen uno o mas compuestos 10 oligomericos y uno o mas de otros agentes quimioterapeuticos que funcionan por un mecanismo no antisentido. Ejemplos de dichos agentes quimioterapeuticos incluyen, aunque no se limitan a, farmacos quimioterapeuticos para el cancer tales como daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, esorrubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina arabinosido, biscloroetil-nitrosurea, busulfano, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, 15 procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclohexilnitrosurea, mostazas de nitrogeno, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, desoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclo-fosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5- fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etoposido (VP-16), trimetrexato, irinotecan, topotecan, gemcitabina, teniposido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Cuando se usan con 20 los compuestos de la divulgacion, dichos agentes quimioterapeuticos pueden usarse individualmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleotido), secuencialmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleotido durante un periodo de tiempo seguido de MTX y oligonucleotido), o en combinacion con uno o mas de otros de dichos agentes quimioterapeuticos (por ejemplo, 5-FU, MTX y oligonucleotido, o 5-FU, radioterapia y oligonucleotido). Farmacos antiinflamatorios, que incluyen, aunque no se limitan a, farmacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, y farmacos antivirales, 25 que incluyen, aunque no se limitan a, ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, tambien pueden combinarse en composiciones de la divulgacion. Las combinaciones de compuestos antisentido y otros farmacos no antisentido tambien estan dentro del alcance de la presente divulgacion. Pueden usarse dos o mas compuestos combinados juntos o secuencialmente.
30 En otro aspecto relacionado, las composiciones de la divulgacion pueden contener uno o mas compuestos antisentido, particularmente oligonucleotidos, dirigidos a un primer acido nucleico y uno o mas compuestos antisentido adicionales dirigidos a un segundo acido nucleico diana. Por ejemplo, la primera diana puede ser una secuencia antisentido particular del gen supresor de tumor, y la segunda diana puede ser una region de otra secuencia de nucleotidos. Como alternativa, las composiciones de la divulgacion pueden contener dos o mas 35 compuestos antisentido dirigidos a diferentes regiones del mismo acido nucleico diana del gen supresor de tumor. Se ilustran numerosos ejemplos de compuestos antisentido en el presente documento y otros pueden seleccionarse de entre compuestos adecuados conocidos en la tecnica. Pueden usarse dos o mas compuestos combinados juntos o secuencialmente.
40 Dosificacion:
Se cree que la formulacion de composiciones terapeuticas y su posterior administracion (dosificacion) estan dentro de la experiencia de los expertos en la materia. La dosificacion depende de la gravedad y sensibilidad de la patologfa que va a tratarse, durando el ciclo de tratamiento de varios dfas a varios meses, o hasta que se efectue 45 una cura o se logre una disminucion de la patologfa. Pueden calcularse programas de dosificacion optimos a partir de mediciones de acumulacion de farmaco en el cuerpo del paciente. Los expertos pueden determinar facilmente dosificaciones optimas, metodologfas de dosificacion y tasas de repeticion. Las dosificaciones optimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de oligonucleotidos individuales, y generalmente pueden estimarse basandose en las CE50 que se ha descubierto que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la 50 dosificacion es de 0,01 pg a 100 g por kg de peso corporal, y puede administrarse una vez o mas diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente, o incluso una vez cada 4 a 30 anos. Los expertos en la materia pueden estimar facilmente tasas de repeticion para la dosificacion basandose en tiempos de residencia medidos y concentraciones del farmaco en fluidos corporales o tejidos. Tras el tratamiento satisfactorio, puede desearse que el paciente reciba terapia de mantenimiento para prevenir la reaparicion de la patologfa, en el que el oligonucleotido se 55 administra en dosis de mantenimiento, que oscilan de 0,01 p g a 100 g por kg de peso corporal, una vez o mas diariamente, a una vez cada 20 anos.
Aunque diversos aspectos de la presente divulgacion se han descrito anteriormente, debe entenderse que se han presentado a modo de ejemplo solamente, y no de limitacion. Pueden realizarse numerosos cambios a los aspectos 60 descritos de acuerdo con la divulgacion en el presente documento sin alejarse del espfritu o alcance de la divulgacion. Por lo tanto, la amplitud y el alcance de la presente divulgacion no deben estar limitados por ninguno de
los aspectos descritos anteriormente.
Por su citacion de diversas referencias en este documento, los solicitantes no admiten que ninguna referencia particular sea "tecnica anterior" a su invencion. Realizaciones de composiciones y procedimientos inventivos se 5 ilustran en los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos no limitantes sirven para ilustrar realizaciones seleccionadas de la invencion. Se apreciara 10 que variaciones en proporciones y alternativas en elementos de los componentes mostrados seran evidentes para los expertos en la materia y estan dentro del alcance de aspectos de la presente divulgacion.
Ejemplo 1: Diseno de oligonucleotidos antisentido especificos para una molecula de acido nucleico antisentido para una cadena sentido del polinucleotido del gen supresor de tumor
15
Tal como se ha indicado anteriormente, la expresion “oligonucleotido especffico para” o “dianas de oligonucleotido” se refiere a un oligonucleotido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una parte del gen elegido como diana, o (ii) capaz de formar un duplex estable con una parte de un transcrito de ARNm del gen elegido como diana.
20
La seleccion de los oligonucleotidos apropiados se facilita usando programas informaticos que alinean automaticamente secuencias de acido nucleico e indican regiones de identidad u homologfa. Dichos programas se usan para comparar secuencias de acidos nucleicos obtenidas, por ejemplo, buscando en bases de datos tales como GenBank o secuenciando productos de PCR. La comparacion de secuencias de acidos nucleicos de un 25 intervalo de especies permite la seleccion de secuencias de acidos nucleicos que muestran un grado de identidad apropiado entre especies. En el caso de genes que no han sido secuenciados, se realizan Southern blots para permitir una determinacion del grado de identidad entre genes en especies diana y otras especies. Realizando Southern blots a grados de astringencia variables, tal como es muy conocido en la tecnica, es posible obtener una medida aproximada de la identidad. Estos procedimientos permiten la seleccion de oligonucleotidos que muestran un 30 alto grado de complementariedad con secuencias de acido nucleico diana en un sujeto a controlar y un menor grado de complementariedad con secuencias de acido nucleico correspondientes en otras especies. Un experto en la materia se dara cuenta de que hay libertad considerable en la seleccion de regiones apropiadas de genes para su uso en la presente invencion.
35 Un compuesto antisentido es "especfficamente hibridable" cuando la union del compuesto al acido nucleico diana interfiere en la funcion normal del acido nucleico diana para causar una modulacion de la funcion y/o la actividad, y existe un grado de complementariedad suficiente para evitar union inespecffica del compuesto antisentido a secuencias de acido nucleico no diana en condiciones en las que se desea union especffica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en condiciones en las que se 40 realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro.
Las propiedades de hibridacion de los oligonucleotidos descritos en el presente documento pueden determinarse por uno o mas ensayos in vitro, tal como se conoce en la tecnica. Por ejemplo, las propiedades de los oligonucleotidos descritos en el presente documento pueden obtenerse por determinacion de la intensidad de union entre el 45 antisentido natural diana y una posible molecula de farmaco usando el ensayo de la curva de fusion.
La intensidad de union entre el antisentido natural diana y una posible molecula de farmaco (Molecula) puede estimarse usando cualquiera de los procedimientos establecidos de medicion de la intensidad de interacciones intermoleculares, por ejemplo, un ensayo de la curva de fusion.
50
El ensayo de la curva de fusion determina la temperatura a la que se produce una rapida transicion de conformacion bicatenaria a monocatenaria para el complejo de antisentido natural/molecula. Esta temperatura es ampliamente aceptada como una medida fiable de la intensidad de interaccion entre las dos moleculas.
55 Puede realizarse un ensayo de la curva de fusion usando una copia de ADNc de la molecula de ARN antisentido natural real o un nucleotido de ADN o ARN sintetico correspondiente al sitio de union de la molecula. Estan disponibles multiples kits que contienen todos los reactivos necesarios para realizar este ensayo (por ejemplo, kit MeltDoctor de Applied Biosystems lnc.). Estos kits incluyen una solucion tampon adecuada que contiene uno de los colorantes de union a ADN bicatenario (dsADN) (tales como los colorantes aBi HRM, SYBR Green, SYTO, etc.). Las 60 propiedades de los colorantes de dsADN son tales que casi no emiten fluorescencia en forma libre, pero son altamente fluorescentes cuando se unen a dsADN.
Para realizar el ensayo, el ADNc o un oligonucleotido correspondiente se mezclan con la molecula en concentraciones definidas por los protocolos del fabricante particulares. La mezcla se calienta a 95°C para disociar todos los complejos de dsADN previamente formados, luego se enfrfa lentamente a temperature ambiente u otra 5 temperature menor definida por el fabricante del kit para permitir que se hibriden las moleculas de ADN. Entonces, los complejos recientemente formados se calientan lentamente a 95°C con recopilacion de datos continua simultanea sobre la cantidad de fluorescencia que se produce por la reaccion. La intensidad de fluorescencia es inversamente proporcional a las cantidades de dsADN presentes en la reaccion. Los datos pueden recogerse usando un instrumento de PCR en tiempo real compatible con el kit (por ejemplo, sistema de PCR en tiempo real 10 StepOne Plus de ABI o el instrumento LightTyper, Roche Diagnostics, Lewes, Reino Unido).
Los picos de fusion se construyen representando la derivada negativa de la fluorescencia con respecto a la temperatura (-d(Fluorescencia)/dT) sobre el eje y) contra la temperatura (eje x) usando software apropiado (por ejemplo, LightTyper (Roche) o SDS Dissociation Curve, ABI). Los datos se analizan para identificar la temperatura 15 de la rapida transicion del complejo de dsADN a moleculas monocatenarias. Esta temperatura se llama Tm y es directamente proporcional a la intensidad de la interaccion entre las dos moleculas. Normalmente, la Tm superara los 40°C.
Ejemplo 2: Modulacion de la expresion genica de oligonucleotidos de genes supresores de tumor
20
Tratamiento de celulas HEPG2 con oligonucleotidos antisentido
Se cultivaron celulas HepG2 de ATCC (n° de cat HB-8065) en medio de cultivo (MEM/EBSS (Hyclone n° de cat SH30024, o Mediatech n° de cat MT-10-010-CV) +10 % FBS (Mediatech n° de cat MT35- 011-CV)+ 25 penicilina/estreptomicina (Mediatech n° de cat MT30-002-CI)) a 37°C y el 5 % de CO2. Un dfa antes del experimento, las celulas volvieron a sembrarse a la densidad de 1,5 x 107ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37°C y con el 5% de CO2. El dfa del experimento, el medio en las placas de 6 pocillos se cambio a medio de cultivo fresco. Todos los oligonucleotidos antisentido se diluyeron a la concentracion de 20 pM. Se incubaron dos pI de esta solucion con 400 pI de medio Opti-MEM (Gibco, n° de cat 31985-070) y 4 pI de Lipofectamine 2000 (Invitrogen, n° de 30 cat 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con celulas HepG2. Se uso una mezcla similar que incluye 2 pI de agua en lugar de la solucion de oligonucleotido para los controles transfectados con vector simulado. Despues de 3-18 horas de incubacion a 37°C y con el 5% de CO2 , el medio se cambio a medio fresco de crecimiento. 48 h despues de la adicion de oligonucleotidos antisentido, el medio se elimino y se extrajo ARN de las celulas usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (n° 35 de cat Z3105) o el kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (n° de cat 74181) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se anadieron 600 ng de ARN a la reaccion de transcripcion inversa realizada usando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (n° de cat AB1453B) o el kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (n° de cat 4368813) tal como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reaccion de transcripcion inversa se uso para monitorizar la expresion genica por PCR en tiempo real usando la mezcla de expresion genica Taqman de 40 ABI (n° de cat 4369510) y cebadores/sondas disenados por ABI. Se uso el siguiente ciclo de PCR: 50°C durante 2 min, 95°C durante 10 min, 40 ciclos de (95°C durante 15 segundos, 60°C durante 1 min) usando la maquina de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems Inc.) o el ciclador termico Mx4000 (Stratagene).
El cambio de veces en la expresion genica despues del tratamiento con oligonucleotidos antisentido se calculo 45 basandose en la diferente de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada.
Ensayos de expresion de p73 usados (ABI cat#s), todas las sondas con MGB:
p73: Hs00232088_ml (secuencia diana ACCTCTGGAGCTCTCTGGAAC, exon 2 SEQ ID No.: 35)
50 p73as: Hs00215135_ml (secuencia diana TATGATGGAAAGGTGCGCATCCTTA, exon 7 SEQ ID No.: 36) y
Hs00892470_g1
Resultados:
55 Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm del gen supresor de tumor en celulas HepG2 se incrementan significativamente 48 h despues del tratamiento con dos de los siRNA disenados para el gen supresor de tumor (Gen supresor de tumor _1, P = 0,02, y gen supresor de tumor _2, P = 0,04, Figura 1A). En las mismas muestras los niveles de ARN del gen supresor de tumor posiblemente estan disminuidos despues del tratamiento con los siRNA para el gen supresor de tumor (Figura 1B).
En la Figura 1C, los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm del gen supresor de tumor
en celulas HepG2 se aumentan significativamente 48 h despues del tratamiento con dos de los oligos disenados para Hs.668503 antisentido del gen supresor de tumor y uno de los oligos disenados para Hs.674463 antisentido del gen supresor de tumor.
5 Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de PTEN en celulas HepG2 se incrementan significativamente 48 h despues del tratamiento con uno de los oligonucleotidos disenados para hs.624903 antisentido de PTEN (Figura 3). (Sondas de deteccion: Ensayo de expresion genica Taqman de Applied Biosystems: Hs02621230_s1)
10 Tratamiento de celulas TM4 con oligonucleotidos antisentido
Se cultivaron celulas TM4 de ATCC (n° de cat CRL-1715) en medio de cultivo (MEM/EBSS (Hyclone n° de cat SH30024, o Mediatech n° de cat MT-10-010-CV) +10 % FBS (Mediatech n° de cat MT35- 011-CV)+ penicilina/estreptomicina (Mediatech n° de cat MT30-002-CI)) a 37°C y el 5 % de CO2. Un dfa antes del experimento, 15 las celulas volvieron a sembrarse a la densidad de 1,5 x 107ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37°C y con el 5% de CO2. El dfa del experimento, el medio en las placas de 6 pocillos se cambio a medio de cultivo fresco. Todos los oligonucleotidos antisentido se diluyeron a la concentracion de 20 pM. Se incubaron dos pI de esta solucion con 400 pI de medio Opti-MEM (Gibco, n° de cat 31985-070) y 4 pI de Lipofectamine 2000 (Invitrogen, n° de cat 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con 20 celulas TM4. Se uso una mezcla similar que incluye 2 pI de agua en lugar de la solucion de oligonucleotido para los controles transfectados con vector simulado. Despues de 3-18 horas de incubacion a 37°C y con el 5% de CO2 , el medio se cambio a medio fresco de crecimiento. 48 h despues de la adicion de oligonucleotidos antisentido, el medio se elimino y se extrajo ARN de las celulas usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (n° de cat Z3105) o el kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (n° de cat 74181) siguiendo las instrucciones del 25 fabricante. Se anadieron 600 ng de ARN a la reaccion de transcripcion inversa realizada usando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (n° de cat AB1453B) o el kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (n° de cat 4368813) tal como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reaccion de transcripcion inversa se uso para monitorizar la expresion genica por PCR en tiempo real usando la mezcla de expresion genica Taqman de ABI (n° de cat 4369510) y cebadores/sondas disenados por ABI (ensayo de expresion genica Taqman de Applied 30 Biosystems: Mn0066020_ml de Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Se uso el siguiente ciclo de PCR: 50°C durante 2 min, 95°C durante 10 min, 40 ciclos de (95°C durante 15 segundos, 60°C durante 1 min) usando la maquina de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems).
El cambio de veces en la expresion genica despues del tratamiento con oligonucleotidos antisentido se calculo 35 basandose en la diferente de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada.
Resultados:
40 Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm del gen supresor de tumor en celulas TM4 de raton se aumentan significativamente 48 h despues del tratamiento con uno de los oligos disenados para Hs.668503 antisentido del gen supresor de tumor y uno de los oligos disenados para WDR8 antisentido del gen supresor de tumor (Figura 1D).
45 Tratamiento de celulas HUVEC con oligonucleotidos antisentido
Las celulas HUVEC de la ATCC (Promo Cell cat. n.° C-12253) se cultivaron en medio de crecimiento epitelial (Promo Cell cat. n.° C-22010) a 37 °C y CO2 al 5 %. Un dfa antes del experimento, las celulas volvieron a sembrarse usando el kit Promo Cell Detach (cat. n.° C-41200) a la densidad de 1,5 x 10A5/ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 50 37 °C y CO2 al 5 %. El dfa del experimento, el medio en las placas de 6 pocillos se cambio a medio de crecimiento epitelial. Todos los oligonucleotidos antisentido se diluyeron a la concentracion de 20 pM. Se incubaron dos pI de esta solucion con 400 pI de medio Opti-MEM (Gibco, n° de cat 31985-070) y 4 pI de Lipofectamine 2000 (Invitrogen, n° de cat 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con celulas HUVEC. Se uso una mezcla similar que incluye 2 pI de agua en lugar de la solucion de oligonucleotido 55 para los controles transfectados con vector simulado. Despues de 3-18 horas de incubacion a 37°C y con el 5% de CO2 , el medio se cambio a medio fresco de crecimiento. 48 h despues de la adicion de oligonucleotidos
antisentido, el medio se elimino y se extrajo ARN de las celulas usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (n° de cat Z3105) o el kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (n° de cat 74181) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se anadieron 600 ng de ARN a la reaccion de transcripcion inversa realizada usando 60 el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (n° de cat AB1453B) tal como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reaccion de transcripcion inversa se uso para monitorizar la expresion genica por PCR en tiempo
real usando la mezcla de expresion genica Taqman de ABI (n° de cat 4369510) y cebadores/sondas disenados por ABI (ensayos de expresion genica Taqman de Applied Biosystems: Hs00153340_ml y Hs00216360_ml de Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Se uso el siguiente ciclo de PCR: 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) usando la maquina de PCR en tiempo real StepOne 5 Plus (Applied Biosystems Inc.) o el ciclador termico Mx4000 (Stratagene).
El cambio de veces en la expresion genica despues del tratamiento con oligonucleotidos antisentido se calculo basandose en la diferente de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada.
10
Ensayos de expresion de p73 usados (ABI cat#s), todas las sondas con FAM/MGB: 18S: 4319413E P53: Hs00153340_ml (secuencia diana CTTCCCTGGATTGGCAGCCAGACTG, SEQ ID No.: 37)
P53as: Hs00216360_ml (secuencia diana ATATGCAGAAATGGTCCCTGTCCTT, SEQ ID No.: 38)
15 Resultados:
Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de p53 en celulas HUVEC se incrementan significativamente 48 h despues del tratamiento con todos los siRNA disenados para p53as (Figura 2).
20 Ademas, aunque se ha descrito una caracterfstica particular de la divulgacion con respecto a solo una de varias implementaciones, dicha caracterfstica puede combinarse con una o mas de otras caracterfsticas de las otras implementaciones, ya que puede desearse y ser ventajoso para cualquier aplicacion dada o particular.
El resumen de la divulgacion permitira al lector determinar rapidamente la naturaleza de la divulgacion tecnica. Esta 25 se presenta con la comprension de que no se usara para interpretar o limitar el alcance o el significado de las siguientes reivindicaciones.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural del gen supresor de tumor para uso como un compuesto terapeutico, donde el oligonucleotido aumenta la expresion de un gen supresor de tumor, y
    5 donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 6a, 6b, 7, 8 o 9.
  2. 2. Un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural del gen supresor de tumor para uso en la prevencion o el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado al gen supresor de tumor, donde dicho
    10 oligonucleotido aumenta la expresion del gen supresor de tumor y donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 6a, 6b, 7, 8 o 9.
  3. 3. Uso de un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural del gen supresor de tumor para la fabricacion de un medicamento para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado
    15 al gen supresor de tumor, donde dicho oligonucleotido aumenta la expresion del gen supresor de tumor y donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 6a, 6b, 7, 8 o 9.
  4. 4. Uso de acuerdo con la reivindicacion 3, o el oligonucleotido para uso de acuerdo con la reivindicacion 20 2, donde la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad asociada con
    disminucion o aumento de la apoptosis, envejecimiento tisular/celular, un cancer (incluyendo los mencionados en la Tabla 1), una enfermedad autoinmune, una enfermedad inmunodeficiente, incluyendo sida, senescencia, una enfermedad o trastorno neurodegenerativo (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, ataxia telangiectasia, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Huntington, etc.), una enfermedad 25 hiperplasica (por ejemplo, queloide), artritis reumatoide, enfermedad coronaria, muerte celular isquemica, un trastorno linfoproliferativo, aterosclerosis, osteoporosis, un sfndrome mielodisplasico, una enfermedad inducida por toxinas, una infeccion vfrica, cicatrizacion de heridas, enfermedad de Cowden (CD), enfermedad de Lhermitte- Duclos (LDD), sfndrome de Bannayan-Zonana (BZS, tambien conocido como sfndrome de Bannayan-Riley- Ruvalcaba, sfndrome de Ruvalcaba-Myhre-Smith y sfndrome de Riley-Smith), trasplante, una enfermedad o 30 trastorno relacionado con la apoptosis, una enfermedad o trastorno metabolico (por ejemplo, diabetes), una enfermedad o trastorno renal, infarto de miocardio/insuficiencia cardiaca, isquemia, sepsis, una enfermedad inflamatoria en la que las celulas inflamatorias hematopoyeticas son excesivas, una enfermedad proliferativa, o una enfermedad o trastorno donde hay un paradigma terapeutico para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria a traves del aumento de la apoptosis.
    35
  5. 5. Un procedimiento in vitro de aumento de la expresion de un gen supresor de tumor en celulas o tejidos de un paciente que comprende: poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural del gen supresor de tumor; aumentando de este modo la expresion del gen supresor de tumor, donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en una
    40 cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 6a, 6b, 7, 8 o 9.
  6. 6. Un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural del gen supresor de tumor, donde el oligonucleotido aumenta la expresion de un gen supresor de tumor, y donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 6a, 6b, 7, 8 o 9.
    45
  7. 7. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, o el oligonucleotido para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, o 4, o el procedimiento in vitrode acuerdo con la reivindicacion 5, o el oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 6, donde el oligonucleotido tiene entre 10 y 30 nucleotidos de longitud.
    50
  8. 8. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7, o el oligonucleotido para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 7, o el procedimiento in vitro de acuerdo con la reivindicacion 5 o la reivindicacion 7, o el oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 6 o la reivindicacion 7, donde el oligonucleotido tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con un complemento de un transcrito
    55 antisentido natural del gen supresor de tumor.
  9. 9. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 7 u 8, o el oligonucleotido para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 7 u 8, o el procedimiento in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5, 7 u 8, o el oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las
    60 reivindicaciones 6 a 8, donde el oligonucleotido es monocatenario.
  10. 10. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 7 u 8, o el oligonucleotido para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 7 u 8, o el procedimiento in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5, 7 u 8, o el oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde el oligonucleotido es un compuesto de siRNA.
    5
  11. 11. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7 a 10, o el oligonucleotido para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, o 7 a 10 o el procedimiento in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 10, o el oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde el oligonucleotido comprende al menos una de las SEQ ID NO: 10 al 30.
    10
  12. 12. Un uso de acuerdo con la reivindicacion 10, o el oligonucleotido para uso de acuerdo con la reivindicacion 10, o el procedimiento in vitro de acuerdo con la reivindicacion 10, o el oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 10, donde el compuesto de siRNA comprende al menos un oligonucleotido seleccionado de entre las SEQ ID NO: 13 a 16 y 28 a 30, y una secuencia complemento inversa de dicho oligonucleotido seleccionado de
    15 entre las SEQ ID NO: 31 a 34 y 39 a 41.
  13. 13. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7 a 12, o el oligonucleotido para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, o 7 a 12 o el procedimiento in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 12, o el oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las
    20 reivindicaciones 6 a 12, donde la expresion del gen supresor de tumor se aumenta al menos un 10 %.
  14. 14. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7 a 13, o el oligonucleotido para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, o 7 a 13 o el procedimiento in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 13, o el oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las
    25 reivindicaciones 6 a 13, donde el oligonucleotido comprende, ademas, una o mas modificaciones que comprenden:
    a. al menos un enlace internucleosfdico modificado seleccionado de entre: un fosforotioato, 2'- O-metoxietilo (MOE), 2'-fluoro, alquilfosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triester de fosfato, acetamidata, un ester carboximetflico, y combinaciones de los mismos;
    30 b. al menos un nucleotido modificado seleccionado de entre: un acido nucleico peptfdico (PNA), un acido nucleico bloqueado (LNA), un acido arabino-nucleico, un analogo, un derivado, y combinaciones de los mismos; o c. al menos un resto de azucar modificado seleccionado de entre: un resto de azucar modificado con 2'-O- metoxietilo, un resto de azucar modificado con 2'-metoxi, un resto de azucar modificado con 2'-O-alquilo, un resto de azucar bicfclico, y combinaciones de los mismos.
    35
  15. 15. Una composicion farmaceutica que comprende al menos un oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
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