[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

KR20050083855A - ＨＩＦ-1 알파의 ｓｉＲＮＡ 억제를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

ＨＩＦ-1 알파의 ｓｉＲＮＡ 억제를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20050083855A
KR20050083855A KR1020057007448A KR20057007448A KR20050083855A KR 20050083855 A KR20050083855 A KR 20050083855A KR 1020057007448 A KR1020057007448 A KR 1020057007448A KR 20057007448 A KR20057007448 A KR 20057007448A KR 20050083855 A KR20050083855 A KR 20050083855A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sirna
dna
sequence
target sequence
artificial sequence
Prior art date
Application number
KR1020057007448A
Other languages
English (en)
Inventor
사무엘 조댐 레이치
엔리코 마리아 슈라세
마이클 제이 톨렌티노
Original Assignee
더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 filed Critical 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
Publication of KR20050083855A publication Critical patent/KR20050083855A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)

Abstract

HIF-1 알파 mRNA를 표적으로 하는 작은 간섭 RNA를 사용하여 RNA를 간섭하여 HIF-1 알파 유전자의 발현을 억제한다. HIF-1 알파는 VEGF의 전사 조절인자이기 때문에 VEGF 발현 또한 억제한다. siRNA-매개된 HIF-1 알파의 하향 조절을 통해 VEGF 생성을 조절하면, 특히 당뇨망막병증, 노화 관련 황반변성 및 여러 종류의 암과 같은 질환에서 혈관형성을 억제할 수 있다.

Description

ＨＩＦ-1 알파의 ｓｉＲＮＡ 억제를 위한 조성물 및 방법{Compositions and methods for siRNA inhibition of HIF-1 alpha}
본 발명은 전사 조절인자 HIF-1 알파의 siRNA 유도된 분해에 의해 유전자 발현을 조절하는 것에 관한 것이다. 상세하게는 VEGF 분열촉진 경로중의 유전자를 하향 조절할 수 있다.
신생 모세혈관의 성장으로 정의되는 혈관형성은 성장 및 발생에서 근본적인 역할을 수행한다. 성숙한 사람에게 있어서, 혈관형성 반응을 개시하는 능력은 모든 조직에 존재하지만 이는 엄격하게 통제되고 있다. 혈관형성의 주요 조절인자는 혈관 투과인자("VPF")라고 불리는 혈관 내피 성장인자("VEGF")이다.
VEGF는 암, 당뇨망막병증, 건선, 노화 관련 황반변성, 류마티스성 관절염 및 기타 염증 질환과 같은 비정상 혈관형성을 특징으로 하는 질환의 특정 조직에서 비정상적인 고수준으로 발현된다. 따라서, 이러한 조직에서 VEGF 수준을 선택적으로 감소시키는 제제를 사용하여 암 및 기타 혈관형성 질환을 치료할 수 있다.
저산소증 유도인자 1(HIF-1)은 HIF-1 알파 및 HIF-1 베타 아단위로 이루어진 이종이량체의 염기성 나선-루프-나선-PAS 전사인자이다. 세포의 산소 농도가 감소함에 따라 HIF-1 알파 발현 및 HIF-1 전사 활성은 기하급수적으로 증가하게 된다. 적혈구생성인자, 글루코스 운반자, 당분해 효소 및 VEGF를 암호화하는 유전자를 포함하여, HIF-1에 의해 트랜스활성화되는 수십개의 유전자가 확인된 바 있다[참조문헌: Semenza GL (1999), Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 15: 551-578].
종양세포에서의 p53의 손실은 HIF-1 알파 수준을 증강시키고 저산소증에 반응하는 VEGF의 HIF-1 의존적 전사 활성화를 증가시킨다. p53 발현 종양세포에서 HIF-1 알파의 강제 발현은 저산소증 유도된 VEGF 발현을 증가시키고 종양 이종이식편의 혈관신생 및 성장을 증가시킨다. 이러한 결과는, p53 기능 손실을 통해 저산소증에 대한 정상 HIF-1 의존적 반응이 증폭되어 종양발생 동안에 혈관형성을 개시하는데 기여한다는 것을 나타낸다[참조문헌: Ravi R. et al. (2000), Genes Dev. 14 : 34-44].
RNA 간섭(interference)("RNAi")은 다수의 진핵세포 생물체에 보존되어 있는 전사후 유전자 조절 방법이다. RNAi는 세포에 존재하는 짧은(즉, 30개 미만의 뉴클레오타이드) 이본쇄 RNA("dsRNA") 분자에 의해 유도된다[참조문헌: Fire A et al. (1998), Nature 391: 806-811]. "짧은 간섭 RNA" 또는 "siRNA"라고 불리는 이러한 짧은 dsRNA 분자는 siRNA와 서열 상동성을 공유하는 전령 RNA("mRNA")을 한개의 뉴클레오타이드 분해내로 파괴한다[참조문헌: Elbashir SM et al. (2001), Genes Dev, 15: 188-200]. siRNA 및 표적화 mRNA는 표적 mRNA를 절단하는 RNA-유도된 사일런싱 컴플렉스(RNA-induced silencing complex; "RISC")에 결합하는 것 같다. siRNA는 다회전 효소처럼 명백하게 재활용되는데, 1개의 siRNA 분자는 대략 1000개의 mRNA 분자의 절단을 유도할 수 있다. 따라서 siRNA 매개된 RNAi는 표적 유전자의 발현을 억제하는데 이용되는 현재의 다른 기술들보다 효과적이다.
상기한 엘바샤이어 SM 등(Elbashir SM et al)은, 길이가 21개 및 22개의 뉴클레오타이드이고 짧은 3' 돌출부가 있는 합성 siRNA가 드로소필라(Drosophila) 세포 용해물에서 표적 mRNA의 RNAi를 유도할 수 있음을 보여주었다. 또한 배양된 포유동물 세포에서도 합성 siRNA에 의해 RNAi가 나타났으며[참조문헌: Elbashir SM et al. (2001) Nature, 411: 494-498], 합성 siRNA에 의해 유도된 RNAi는 살아있는 마우스에서도 최근 밝혀졌다[참조문헌: McCaffrey AP et al. (2002), Nature, 418: 38-39; Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010]. siRNA 매개된 RNAi의 치료 잠재성은, siRNA-유도된 HIV-1 감염 억제[참조문헌: Novina CD et al. (2002), Nat. Med. 8: 681-686] 및 신경독성 폴리글루타민 질환 단백질 발현의 감소[참조문헌: Xia H et al. (2002), supra]를 포함한 최근의 몇몇 시험관내 연구에 의해서 입증되었다. 또한 치료 RNAi는 공개된 미국 특허원 제US 2002/0173487호에 기술된 바와 같이, 알란 게위츠(Alan Gewirtz)에 의해 사람 암세포에서도 입증되었다.
본 발명에 이르러, HIF-1 알파의 siRNA 유도된 RNAi가 HIF-1 알파 mRNA를 파괴하고 이와 동시에 VEGF 발현을 감소시키며 혈관형성을 억제한다는 것이 밝혀졌다.
발명의 개요
본 발명은, 특이적으로 사람 HIF-1 알파 유전자로부터의 mRNA를 표적으로 하여 이의 RNAi 유도된 분해를 일으키는 siRNA에 관한 것이다. 본 발명의 siRNA 화합물 및 조성물은, 발암성 종양, 및 혈관신생 영역 내 또는 부근의 조직에서 VEGF가 과발현되는 기타 혈관형성 질환 및 비-병원성 상태를 치료하는데 사용된다.
따라서, 본 발명은 HIF-1 알파 mRNA를 표적으로 하여 표적 mRNA의 RNAi-매개된 분해를 유도하는 siRNA 및 이의 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 HIF-1 알파 mRNA에 대해 표적화된 siRNA의 유효량을 피험체에게 투여하여 HIF-1 알파 mRNA를 분해함을 포함하여, HIF-1 알파의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 HIF-1 알파 mRNA에 대해 표적화된 siRNA의 유효량을 피험체에게 투여하여 HIF-1 알파 mRNA를 분해하고 VEGF 발현을 억제함을 포함하여, 혈관형성을 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 HIF-1 알파 mRNA에 대해 표적화된 siRNA의 유효량을 피험체에게 투여하여 HIF-1 알파 mRNA를 분해하고 VEGF 발현을 억제함을 포함하여, 혈관형성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
도 1은 siRNA로 처리하지 않은("no") "비-저산소("-") 배양된 HEK-293 세포 및 siRNA로 처리하지 않거나("no"), 비특이적 siRNA로 처리하거나("EGFP"), 사람 HIF-1 알파 mRNA에 표적화된 20개의 개별적인 siRNA로 처리한("hHIF1#1-20") 저산소("+") 배양된 HEK-293 세포에서, VEGF ELISA에 의해 OD450㎚에서 측정한 VEGF 농도의 도수분포표이다.
도 2는 siRNA로 처리하지 않은("no") "비-저산소("-") 배양된 HEK-293 세포, 및 siRNA로 처리하지 않거나("no"), 비특이적 siRNA로 처리하거나("EGFP"), 사람 HIF-1 알파 mRNA에 표적화된 20개의 개별적인 siRNA로 처리한("hHIF1#1-20") 저산소("+") 배양된 HEK-293 세포에서 세포독성을 나타낸 도수분포표이다.
도 3은 대조군 마우스("대조군") 및 항-HIF-1 알파 siRNA로 처리한 마우스("HIF-1 siRNA")의 눈에서 맥락막 혈관신생 영역을 ㎟로 나타낸 도수분포표이다.
HIF-1 알파 mRNA에 대해 표적화된 siRNA을 포함하는 조성물 및 방법은, 특히 혈관형성 질환을 치료하기 위해 혈관형성을 억제하는데 유리하게 사용된다. 본 발명의 siRNA는 HIF-1 알파 mRNA의 RNAi 매개된 파괴를 일으킨다. HIF-1 알파는 VEGF의 전사 조절인자이고, 본 발명의 siRNA에 의해 유도된 HIF-1 알파 mRNA의 감소는 VEGF 생성 감소와 상호연관이 있다. 혈관형성을 개시하고 유지하는데 VEGF가 필요하기 때문에, HIF-1 알파의 siRNA 매개된 파괴는 혈관형성 과정을 느리게 하거나 정지시키거나 반전시킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "HIF-1 알파 mRNA에 대해 표적화된" siRNA는 이중체(duplex)의 첫번째 쇄가 HIF-1 알파 mRNA 서열의 일부와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가진 siRNA를 의미한다. siRNA 이중체의 두번째 쇄는 siRNA 이중체의 첫번째 쇄 및 HIF-1 알파 mRNA의 동일 부분 모두와 상보적인 것으로 이해된다.
따라서 본 발명은, 뉴클레오타이드가 약 17개 내지 약 29개, 바람직하게는 약 19개 내지 약 25개이며 표적 mRNA에 대해 표적화된 짧은 이본쇄 RNA를 포함하는 분리된 siRNA를 제공한다. siRNA는, 표준 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 상호작용에 의해 함께 어닐링되는(이후부터는 "염기쌍을 이룬") 센스 RNA 쇄 및 상보적인 안티센스 RNA 쇄를 포함한다. 하기에서 상세하게 기술되는 바와 같이, 센스 쇄는 표적 mRNA내에 포함된 표적 서열과 실질적으로 동일한 핵산 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 표적 mRNA내에 포함된 표적 서열과 "실질적으로 동일한" 핵산 서열은 표적 서열과 동일하거나 표적 서열과 하나 이상의 뉴클레오타이드가 상이한 핵산 서열이다. 표적 서열과 실질적으로 동일한 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 센스 쇄는, 이러한 센스 쇄를 포함한 siRNA가 표적 서열을 포함한 mRNA의 RNAi 매개된 분해를 유도하는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 본 발명의 siRNA는, 표적 mRNA의 RNAi 매개된 분해가 siRNA에 의해 유도되는 한, 표적 서열과는 1개, 2개 또는 3개 이상의 뉴클레오타이드가 상이한 핵산 서열을 포함한 센스 쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 siRNA의 센스 쇄 및 안티센스 쇄는 2개의 상보적인 일본쇄 RNA 분자를 포함하거나, 2개의 상보적인 부분이 염기쌍을 이루고 일본쇄 "헤어핀" 영역에 의해 공유결합되어 있는 단일 분자를 포함할 수 있다. 어떠한 이론에도 구속받지 않는다면, 후자인 siRNA 분자 형태의 헤어핀 영역은 "다이서(Dicer)" 단백질 (또는 이의 등가체)에 의해 세포내에서 절단되어 2개의 개별적인 염기쌍을 이룬 RNA 분자의 siRNA를 형성하는 것 같다[참조문헌: Tuschl, T. (2002), supra]. 하기하는 바와 같이, siRNA는 하나 이상의 리보뉴클레오타이드 염기의 변화, 치환 또는 변형을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 siRNA은 변화, 치환 또는 변형되어 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드 염기를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "분리된"은 사람이 개입하여 천연 상태로부터 변화시키거나 제거한 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 천연적으로 존재하는 siRNA는 "분리된" 것이 아니지만, 합성 siRNA, 또는 천연 상태의 공존 물질로부터 부분적 또는 완전하게 분리시킨 siRNA은 "분리된" 것이다. 분리된 siRNA은 실질적으로 순수한 형태로 존재하거나, 예를 들어 siRNA가 전달될 세포와 같이 본래의 환경이 아닌 곳에 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "표적 mRNA"는 사람 HIF-1 알파 mRNA, 사람 HIF-1 알파 mRNA의 돌연변이체 또는 선택적 스플라이싱형, 또는 동족 HIF-1 알파 유전자의 mRNA를 의미한다. 사람 HIF-1 알파 mRNA 서열에 상응하는 cDNA 서열은 서열번호 1로 나타내었다.
본원에서 참조문헌으로 전문이 인용되는, 진뱅크(Genbank) 등록 번호 제NM 001530호 및 제NM 181054호에 기술되어 있는 바와 같은 사람 HIF-1 알파 전사 변이체 1(서열번호 1) 및 2(서열번호 3)를 포함한 사람 HIF-1 알파의 스플라이싱 변이체는 공지되어 있다. 사람 HIF-1 알파 유전자로부터 전사된 mRNA은 당분야에 공지된 기술을 사용하여 또 다른 선택적 스플라이싱형에 대해 분석할 수 있다. 이러한 기술에는 역전사-폴리머라제 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯팅(northern blotting) 및 원위치(in situ) 하이브리드화가 포함된다. mRNA 서열을 분석하는 기술은, 예를 들어 본원에서 전문이 참조문헌으로 인용되는 다음 문헌에 기술되어 있다[참조문헌: Busting SA (2000), J. Mol. Endocrinol. 25: 169-193]. 선택적으로 스플라이싱된 mRNA를 확인하는 대표적인 기술은 또한 하기할 것이다.
예를 들어 소정의 질환 유전자와 관련된 뉴클레오타이드 서열을 포함한 데이타베이스를 사용하면 선택적으로 스플라이싱된 mRNA를 확인할 수 있다. 이러한 데이타베이스에는 진뱅크(GenBank), 엠베이스(Embase) 및 더 캔서 게놈 아나토미 프로젝트(the Cancer Genome Anatomy Project; CGAP) 데이타베이스가 포함된다. CGAP 데이타베이스는, 예를 들어 여러가지 형태의 사람의 암으로부터 발현된 서열 태그(EST: expressed sequence tag)을 포함한다. HIF-1 알파 유전자의 mRNA 또는 유전자 서열을 사용하여 이러한 데이타베이스를 조회하면, 선택적으로 스플라이싱된 mRNA를 나타내는 ETS가 이러한 유전자에서 발견되는지를 확인할 수 있다.
또한 "RNAse 보호"라고 불리는 기술을 사용하여 선택적으로 스플라이싱된 HIF-1 알파 mRNA를 확인할 수 있다. RNAse 보호는, 유전자 서열을 합성 RNA로 해독하고 이를 다른 세포, 예를 들어 혈관신생 부위 또는 그 근처의 조직의 세포로부터 유래된 RNA와 하이브리드화시킴을 포함한다. 그런 다음, 하이브리드화된 RNA를, RNA:RNA 하이브리드 미스매치를 인식하는 효소와 함께 항온처리한다. 예상되는 단편보다 작다는 것은, 선택적으로 스플라이싱된 mRNA가 존재함을 의미한다. 추정된 선택적으로 스플라이싱된 mRNA는 당분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 클로닝하고 서열분석할 수 있다.
또한, RT-PCR을 사용하여 선택적으로 스플라이싱된 HIF-1 알파 mRNA를 확인할 수 있다. RT-PCR에서, 조직의 mRNA는 당분야의 숙련가에게 익히 공지된 방법을 사용하여 역전사효소에 의해 cDNA로 전환시킨다. 그런 다음, 3' 비-해독 영역에 위치한 정방향 프라이머 및 5' 비-해독 영역에 위치한 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 cDNA의 전체 암호화 서열을 증폭시킨다. 증폭된 산물은, 예를 들어 아가로스 겔 전기영동에 의해 정상 스플라이싱 mRNA의 예상된 산물의 크기와 증폭된 산물의 크기를 비교함으로써 선택적 스플라이싱형에 대해 분석할 수 있다. 증폭된 산물의 크기 변화는 선택적 스플라이싱을 의미한다.
돌연변이 HIF-1 알파 유전자로부터 생성된 mRNA는, 선택적인 스플라이싱형을 확인하기 위한 상기의 기술을 통해서도 용이하게 확인할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "돌연변이" HIF-1 알파 유전자 또는 mRNA는 본원에서 앞서 기술한 HIF-1 알파 mRNA 서열과는 서열이 상이한 HIF-1 알파 유전자 또는 mRNA를 포함한다. 따라서, 본 발명의 목적에서는 HIF-1 알파 유전자의 대립유전자형 및 이로부터 생성된 mRNA를 "돌연변이체"로 간주한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 사람 HIF-1 알파에 대해 "동족"인 유전자 또는 mRNA는 사람 HIF-1 알파와 상동성인 다른 포유동물 종의 유전자 또는 mRNA이다. 예를 들어, 랫트 및 마우스로부터의 동족 HIF-1 알파 mRNA는 본원에서 참조문헌으로 전문이 인용되는 진뱅크 등록 번호 제NM 024359호 및 제NM 010431호에 각각 기술되어 있다. 랫트 HIF-1 알파 mRNA 서열은 서열번호 4로 나타내었고 마우스 HIF-1 알파 mRNA 서열은 서열번호 5로 나타내었다.
사람 HIF-1 알파 mRNA는 이들 각각의 선택적 스플라이싱형, 동족체 및 돌연변이체와 공통적인 표적 서열을 포함하는 것으로 이해할 수 있다. 따라서 이러한 공통된 표적 서열을 포함하는 단일 siRNA는 공통된 표적 서열을 포함하는 상이한 RNA 유형의 RNAi 매개된 분해를 유도할 수 있다.
본 발명의 siRNA는 부분적으로 정제된 RNA, 실질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA 또는 재조합 생산된 RNA 뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변화에 의해 천연 RNA와는 상이한 변화된 RNA를 포함할 수 있다. 이러한 변화에는, siRNA의 말단 또는 siRNA의 하나 이상의 내부 뉴클레오타이드에 비-뉴클레오타이드 물질을 부가하는 것, 뉴클레아제 분해에 대해 내성이 있도록 siRNA을 변형시키는 것, 또는 siRNA내 하나 이상의 뉴클레오타이드를 데옥시리보뉴클레오타이드로 치환하는 것이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 siRNA의 한쪽 쇄 또는 양쪽 쇄는 3' 돌출부를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "3' 돌출부"는 이중체 RNA 쇄의 3' 말단으로부터 확장된 1개 이상의 쌍을 이루지않은 뉴클레오타이드를 의미한다.
따라서 한가지 양태에서, 본 발명의 siRNA는 1개 내지 약 6개 뉴클레오타이드(리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 포함), 바람직하게는 1개 내지 약 5개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 1개 내지 약 4개의 뉴클레오타이드, 특히 바람직하게는 약 2개 내지 약 4개의 뉴클레오타이드로 이루어진 3' 돌출부를 하나 이상 포함한다.
한가지 양태에서, siRNA 분자의 양쪽 쇄는 각각의 쇄에 대해 동일하거나 상이할 수 있는 3' 돌출부를 포함한다. 가장 바람직한 양태에서, 3' 돌출부는 siRNA의 양쪽 쇄에 존재하며 2개의 뉴클레오타이드로 이루어진다. 예를 들어, 본 발명의 siRNA의 각각의 쇄는 디티미딜산("TT") 또는 디우리딜산("uu")의 3' 돌출부를 포함할 수 있다.
본 발명의 siRNA의 안정성을 향상시키기 위해, 3' 돌출부를 분해로부터 안정화시킬 수도 있다. 한가지 양태에서, 돌출부에 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오타이드와 같은 퓨린 뉴클레오타이드를 포함시켜 이를 안정화시킨다. 달리, 3' 돌출부에 있는 우리딘 뉴클레오타이드를 2'-데옥시티미딘으로 치환시키는 것과 같이 피리미딘 뉴클레오타이드를 변형된 유사체로 치환하는 것이 허용되는데, 이는 RNAi 분해 효율에 영향을 미치지 않는다. 특히 2'-데옥시티미딘내의 2' 하이드록실의 부재는 조직 배양 배지중에서 3' 돌출부의 뉴클레아제 내성을 상당히 향상시킨다.
특정 양태에서, 본 발명의 siRNA는 서열 AA(N19)TT 또는 NA(N21)(여기서, N은 임의의 뉴클레오타이드이다)을 포함한다. 이러한 siRNA는 대략 30-70% G/C, 바람직하게는 대략 50% G/C를 포함한다. 센스 siRNA 쇄의 서열은 각각 (N19)TT 또는 N21(즉, 위치 3에서 23)에 상응한다. 후자의 경우, 센스 siRNA의 3' 말단은 TT로 전환시킨다. 이러한 서열 전환의 이유는 센스 및 안티센스 쇄 3' 돌출부의 서열 구성에 대해 대칭인 이중체를 생성하기 위해서이다. 그런 다음, 센스 쇄의 위치 1 내지 21에 대한 상보체로서 안티센스 쇄를 합성한다.
상기한 양태에서, 23nt 센스쇄의 위치 1이 안티센스 쇄에 의해 서열 특이적인 방식으로 인지되지 않기 때문에, 안티센스 쇄의 3'-최대 뉴클레오타이드 잔기가 의도적으로 선택될 수 있다. 그러나, 안티센스 쇄의 끝에서 두번째 뉴클레오타이드(다른 양태에서, 23nt 센스 쇄의 위치 2에 상보적)는 일반적으로 표적 서열에 대해 상보적이다.
다른 양태에서, 본 발명의 siRNA는 서열 NAR(N17)YNN(여기서, R은 퓨린, 예를 들어 A 또는 G이고, Y는 피리미딘, 예를 들어 C 또는 U/T이다)을 포함한다. 따라서, 이러한 양태의 각각의 21nt 센스 및 안티센스 쇄는 일반적으로 퓨린 뉴클레오타이드로부터 시작한다. 첫번째로 전사되는 뉴클레오타이드가 퓨린인 경우에 polIII 프로모터로부터 RNA의 발현이 효율적이라고 여겨지기 때문에, 이러한 siRNA는 표적 위치의 변화없이 polIII 발현 벡터로부터 발현될 수 있다.
본 발명의 siRNA는 임의의 표적 mRNA 서열("표적 서열")중 대략 19 내지 25개의 임의의 연속 뉴클레오타이드 서열에 대해 표적화시킬 수 있다. siRNA에 대한 표적 서열을 선택하는 기술은, 예를 들어 본원에서 전문이 참조문헌으로 인용되는 다음 문헌에 기술되어 있다[참조문헌: Tuschl T et al, "The siRNA User Guide," revised Oct. 11, 2002]. "siRNA 사용자 지침서(siRNA User Guide)"는 닥터 토마스 투츨(Dr. Thomas Tuschl; Department of Cellular Biochemistry, AG 105, Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, 37077 Gottingen, Germany)에 의해 유지되는 웹사이트에서 수득할 수 있으며, 맥스 플랑크 인스티튜트(Max Planck Institute)의 웹사이트에 접속하여 키워드 "siRNA"을 검색하여 찾을 수 있다. 따라서, 본 발명의 siRNA의 센스 쇄는 표적 mRNA중 약 19 내지 약 25개의 임의의 연속 뉴클레오타이드 서열과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일반적으로, 표적 mRNA상의 표적 서열은, 바람직하게는 출발 코돈으로부터 50 내지 100nt 하류(즉, 3' 방향)에서 시작하는, 표적 mRNA에 상응하는 소정의 cDNA 서열로부터 선택될 수 있다. 그러나, 표적 서열은 5' 또는 3' 비-해독 영역에 위치하거나, 출발 코돈 근처의 영역에 위치할 수 있다. HIF-1 알파 cDNA 서열중 적합한 표적 서열은 다음과 같다:
AACTGGACACAGTGTGTTTGA (서열번호 6)
따라서, 상기 서열에 대해 표적화되고 3' UU 돌출부가 있는 본 발명의 siRNA은 다음과 같다(돌출부는 진하게 표시하였다):
5'-aacuaacuggacacagugugu uu-3' (서열번호 7)
3'-uu uugauugaccugugucacaca-5' (서열번호 8)
상기와 동일한 서열에 대해 표적화되지만 각각의 쇄에 3' TT 돌출부가 있는 본 발명의 siRNA는 다음과 같다(돌출부는 진하게 표시하였다):
5'-aacuaacuggacacagugugu TT-3' (서열번호 9)
3'-TT uugauugaccugugucacaca-5' (서열번호 10)
본 발명의 siRNA가 유도될 수 있는 예시적인 HIF-1 알파 표적 서열에는 표 1의 서열 및 서열번호 39 내지 296이 포함된다.
본 발명의 siRNA는 당분야의 숙련가에게 공지된 다수의 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, siRNA는 전문이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 공개된 미국 특허원 제2002/0086356호(Tuschl et al.)에 기술되어 있는 드로소필라 시험관내 시스템과 같이 당분야에 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성하거나 재조합 생산할 수 있다.
바람직하게 본 발명의 siRNA는 적절하게 보호된 리보뉴클레오사이드 포스포르아미디트 및 통상의 DNA/RNA 합성기를 사용하여 화학적으로 합성한다. siRNA는 2개의 별개의 상보적인 RNA 분자로서 합성되거나 2개의 상보적인 영역이 있는 단일 RNA 분자로서 합성될 수 있다. 합성 RNA 분자 또는 합성 시약의 상업적 공급자에는 프롤리고(Proligo; Hamburg, Germany), 다마콘 리서치(Dharmacon Research; Lafayette, CO, USA), 피어스 케미칼(Pierce Chemical; part of Perbio Science, Rockford, IL, USA), 글렌 리서치(Glen Research; Sterling, VA, USA), 켐진즈(ChemGenes; Ashland, MA, USA) 및 크루아켐(Cruachem; Glasgow, UK)이 포함된다.
달리, siRNA는 임의의 적합한 프로모터를 사용하여 재조합 원형 또는 선형 DNA 플라스미드로부터 발현시킬 수 있다. 플라스미드로부터 본 발명의 siRNA를 발현시키는데 적합한 프로모터에는, 예를 들어 U6 또는 H1 RNA pol III 프로모터 서열 및 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터가 포함된다. 당분야에서 숙련가라면 적합한 다른 프로모터를 선택할 수 있을 것이다. 또한 본 발명의 재조합 플라스미드는 특정 조직 또는 특정 세포내 환경에서 siRNA를 발현시키기 위한 유도성 또는 조절성 프로모터를 포함할 수 있다.
재조합 플라스미드로부터 발현되는 siRNA는 표준 기술에 의해 배양된 세포 발현 시스템으로부터 분리시키거나 생체내 혈관신생 영역 또는 그 근처에서 세포내적으로 발현시킬 수 있다. 생체내에서 세포에 본 발명의 siRNA를 전달하기 위해 재조합 플라스미드를 사용하는 것은 하기에서 상세히 논의할 것이다.
본 발명의 siRNA는 2개의 별개의 상보적인 RNA 분자로서 또는 2개의 상보적인 영역이 있는 단일 RNA 분자로서 재조합 플라스미드로부터 발현될 수 있다.
본 발명의 siRNA를 발현시키는데 적합한 플라스미드, siRNA을 플라스미드에서 발현시키기 위해 핵산 서열을 삽입하는 방법, 및 목적하는 세포에 재조합 플라스미드를 전달하는 방법의 선택은 당분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들어, 전문이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 다음 문헌들을 참조한다[참조문헌: Tuschl, T. (2002), Nat. Biotechnol, 20 : 446-448; Brummelkamp TR et al. (2002), Science 296: 550-553; Miyagishi M et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 497-500; Paddison PJ et al. (2002), Genes Dev. 16: 948-958; Lee NS et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 500-505; and Paul CP et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 505-508].
예를 들어, 플라스미드는 사람 U6 RNA 프로모터의 통제하에 폴리T 종결 서열이 작동가능하게 연결된 센스 RNA 쇄 암호화 서열 및 사람 U6 RNA 프로모터의 통제하에 폴리T 종결 서열이 작동가능하게 연결된 안티센스 RNA 쇄 암호화 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리T 종결 서열이 작동가능하게 연결된"은, 센스 또는 안티센스 쇄를 암호화하는 핵산 서열이 5' 방향에 있는 폴리T 종결 신호와 바로 인접함을 의미한다. 플라스미드로부터 센스 또는 안티센스 서열이 전사되는 동안, 폴리T 종결 신호가 전사를 종결시키는 작용을 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 프로모터의 "통제하에" 있다는 것은 센스 또는 안티센스 쇄를 암호화하는 핵산 서열이 프로모터의 3'에 위치하여 프로모터가 센스 또는 안티센스 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있음을 의미한다.
또한, 본 발명의 siRNA는 생체내 혈관신생 영역 또는 그 근처에서 재조합 바이러스 벡터로부터 세포내에서 발현될 수 있다. 본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 본 발명의 siRNA을 암호화하는 서열 및 siRNA 서열을 발현하는데 적합한 임의의 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터에는, 예를 들어 U6 또는 H1 RNA pol III 프로모터 서열 및 사이토메갈로바이러스 프로모터가 포함된다. 당분야의 숙련가라면 다른 적합한 프로모터를 선택할 수 있을 것이다. 또한 본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 특정 조직 또는 특정 세포내 환경에서 siRNA를 발현시키기 위한 유도성 또는 조절성 프로모터를 포함할 수 있다. 생체내에서 세포에 본 발명의 siRNA를 전달하기 위해 재조합 바이러스 벡터를 사용하는 것은 하기에서 상세히 논의할 것이다.
본 발명의 siRNA는 2개의 별개의 상보적인 핵산 분자로서, 또는 2개의 상보적인 영역이 있는 단일 핵산 분자로서 재조합 바이러스 벡터로부터 발현시킬 수 있다.
발현될 siRNA 분자에 대한 암호화 서열을 수용할 수 있는 어떠한 바이러스 벡터도 사용할 수 있는데, 예를 들어 아데노바이러스(AV), 아데노바이러스-수반 바이러스(AAV), 레트로바이러스(예: 렌티바이러스(LV), 라브도바이러스, 쥐 백혈병 바이러스), 헤르페스 바이러스 등으로부터 유래된 벡터가 있다. 또한, 바이러스 벡터의 친화성은, 다른 바이러스의 외피 단백질 또는 기타 표면 항원으로 벡터를 가성형태화시킴으로써 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 AAV 벡터는 소수포 구내염 바이러스(VSV), 광견병 바이러스, 에볼라 바이러스, 모콜라 바이러스 등의 표면 단백질로 가성형태화시킬 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 바이러스 벡터, siRNA을 발현시키기 위해 핵산 서열을 벡터에 삽입하는 방법 및 목적하는 세포에 바이러스 벡터를 전달하는 방법의 선택은 당분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들어, 전문이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 다음 문헌들을 참조한다[참조문헌: Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis MA (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller AD (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; and Anderson WF (1998), Nature 392: 25-30].
바람직한 바이러스 벡터는 AV 및 AAV로부터 유래된 것이다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 siRNA는, 예를 들어 U6 또는 H1 RNA 프로모터 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 포함한 재조합 AAV 벡터로부터 2개의 별개의 상보적인 일본쇄 RNA 분자로서 발현된다.
본 발명의 siRNA를 발현시키는데 적합한 AV 벡터, 재조합 AV 벡터를 작제하는 방법 및 표적 세포에 벡터를 전달하는 방법은 다음 문헌에 기술되어 있다[참조문헌: Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010].
본 발명의 siRNA를 발현시키는데 적합한 AAV 벡터, 재조합 AAV 벡터를 작제하는 방법 및 표적 세포에 벡터를 전달하는 방법은, 전문이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 다음 문헌들에 기술되어 있다[참조문헌: Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher KJ et al. (1996), J. Virol., 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822- 3826; 미국 특허 제5,252,479호; 미국 특허 제5,139,941호; 국제 특허원 제WO 94/13788호; 및 국제 특허원 제WO 93/24641호].
표적 mRNA의 RNAi 매개된 분해를 유발하는, 소정의 표적 서열을 포함한 siRNA의 능력은 세포에서 RNA 또는 단백질 수준을 측정하는 표준 기술을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 siRNA는 배양된 세포에 전달할 수 있으며, 표적 mRNA의 수준은 노던 블롯 또는 도트 블롯팅 기술, 또는 정량적 RT-PCR에 의해 측정할 수 있다. 달리, 배양된 세포중 HIF-1 알파 단백질의 수준은 ELISA 또는 웨스턴 블롯에 의해 측정할 수 있다. 표적 mRNA 또는 단백질 수준에 대한 본 발명의 siRNA의 효과를 측정하는데 적합한 세포 배양 시스템은 하기 실시예 1에 기술되어 있다.
HIF-1 알파의 발현 감소가 VEGF 발현을 억제하기 때문에, HIF-1 알파 mRNA에 표적화되어 이의 RNAi 매개된 분해를 유발하는, siRNA의 능력은 또한 배양된 세포중 VEGF mRNA 또는 단백질 수준을 측정함으로써 평가할 수 있다.
예를 들어, 50% 컨플루언스(confluence)한 293개 사람 신장 세포를 siRNA 함유 배양 배지(임의로 마이러스 트랜지트(Mirus Transit) TKO 형질감염 시약과 같은 형질감염 시약과 복합됨)에서 48시간 동안 배양한 다음, HIF-1 알파 또는 VEGF에 대해 ELISA 또는 mRNA 정량을 실시할 수 있다. HIF-1 알파 표적 서열과 상동성이 없는 siRNA와 항온처리된 세포를 대조군으로서 사용할 수 있다.
또한, 소정의 표적 서열을 포함한 siRNA에 의한 표적 mRNA의 RNAi 매개된 분해는, 예를 들어 미성숙 망막병증("ROP) 또는 맥락막 혈관신생("CNV") 마우스 모델과 같은 혈관신생 동물 모델을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, siRNA 투여 전 및 투여 후에 ROP 또는 CNV 마우스에서의 혈관신생 영역을 측정할 수 있다. siRNA 투여시 상기 모델에서의 혈관신생 영역 감소는 표적 mRNA가 하향 조절되었음을 의미한다(하기 실시예 2를 참조한다).
상기한 바와 같이, 본 발명의 siRNA는 HIF-1 알파 mRNA, 이의 스플라이싱형, 이의 돌연변이체 또는 이의 동족체에 표적화되어 이의 RNAi 매개된 분해를 유발한다. 본 발명의 siRNA에 의한 표적 mRNA의 분해는 HIF-1 알파 유전자의 기능적 유전자 산물의 생산을 감소시킨다. 따라서, 본 발명은, 본 발명의 siRNA의 유효량을 피험체에게 투여하여 표적 mRNA를 분해함을 포함하여, 피험체에서 HIF-1 알파의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시에 있어서, 하나 이상의 본 발명의 siRNA를 동시에 피험체에게 투여할 수 있음을 이해할 것이다.
어떠한 이론에도 구속받지 않는다면, HIF-1 알파 유전자의 산물은 VEGF 전사 조절에 연루된 것 같다. 바꾸어 말하면, VEGF는 혈관형성을 개시하고 유지하는데 필요하다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 siRNA에 의한 표적 mRNA의 RNAi 매개된 분해에 의해 피험체에서 혈관형성을 억제하는 방법을 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "피험체"에는 사람 또는 사람이 아닌 동물이 포함된다. 피험체가 사람인 것이 바람직하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, siRNA의 "유효량"은 표적 mRNA의 RNAi 매개된 분해를 유발하는데 충분한 양 또는 피험체에서 혈관형성을 억제하는데 충분한 양이다.
표적 mRNA의 RNAi 매개된 분해는, 상기한 바와 같이 mRNA 또는 단백질을 분리하고 정량화하기 위한 표준 기술을 사용하여 피험체의 세포에서 표적 mRNA 또는 단백질 수준을 측정함으로써 검출할 수 있다.
혈관형성 억제는, 예를 들어 본 발명의 siRNA로 처리하기 전 및 처리한 후에 혈관신생 영역의 크기를 관찰함으로써 피험체에서 병원성 또는 비-병원성 혈관형성의 진행을 직접 측정하여 평가할 수 있다. 혈관신생 영역의 크기가 동일하거나 감소된 경우 혈관형성이 억제되었음을 나타낸다. 피험체에서 혈관신생 영역의 크기를 관찰하고 측정하는 기술은 당분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 예를 들어 맥락막 혈관신생 영역은 검안경검사로 관찰할 수 있다.
또한, 혈관형성 억제는 혈관형성과 관련된 병원성 상태의 변화 또는 반전을 관찰함으로써 추측할 수 있다. 예를 들어, ARMD에서 시력상실이 느려지거나 정지하거나 반전되면 맥락막에서 혈관형성이 억제되었음을 나타낸다. 종양의 경우, 종양 성장이 느려지거나 정지하거나 반전되는 경우 또는 종양 전이가 느려지거나 정지하는 경우에 종양 부위 또는 그 근처에서의 혈관형성 억제를 나타낸다. 또한 비-병원성 혈관형성의 억제는, 예를 들어 본 발명의 siRNA 투여시 지방 손실 또는 콜레스테롤 수준의 감소로부터 추측할 수 있다.
본 발명의 siRNA가 화학양론적 양 이하의 표적 mRNA를 분해하여 혈관형성을 억제할 수 있음을 이해할 것이다. 어떠한 이론에도 구속받지 않는다면, 본 발명의 siRNA가 촉매적인 방식으로 표적 mNRA을 분해하도록 RISC를 유도한다고 볼 수 있다. 따라서, 표준 항-혈관형성 치료법과 비교하면, 치료 효과를 갖기 위해 혈관신생 부위 또는 그 근처에 siRNA를 전달할 필요가 훨씬 줄어든다.
당분야의 숙련가라면, 피험체의 크기 및 체중, 혈관신생 또는 질환 확장 정도, 피험체의 연령, 건강상태 및 성별, 투여경로 및 투여가 국소적이나 전신적이냐 등과 같은 인자를 고려하여 피험체에게 투여될 본 발명의 siRNA의 유효량을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 일반적으로 본 발명의 siRNA의 유효량은, 혈관신생 부위 또는 그 근처의 세포내 농도가 약 1나노몰(nM) 내지 약 100nM, 바람직하게는 약 2nM 내지 약 50nM, 보다 바람직하게는 약 2.5nM 내지 약 10nM이 되도록 하는 양을 포함한다. 보다 적거나 많은 양의 siRNA을 투여하는 것도 고려할 수 있다.
본 발명의 방법은 비-병원성 혈관형성, 즉 피험체에서 정상 진행의 결과인 혈관형성을 억제하는데 사용할 수 있다. 비-병원성 혈관형성의 예에는 자궁내막 혈관신생, 및 지방 조직 또는 콜레스테롤 생성과 연루된 진행이 포함된다. 따라서 본 발명은, 예를 들어 체중 조절, 지방 손실 촉진 또는 콜레스테롤 수준 감소의 경우나 낙태약으로써 비-병원성 혈관형성을 억제하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명의 방법은 혈관형성 질환, 즉 발병성이 부적절하거나 비조절된 혈관형성과 관련된 질환과 연관되어 있는 혈관형성을 억제할 수 있다. 예를 들어 대부분의 암성 고형종양은 종양 부위 및 그 근처에 혈관형성을 유도함으로써 스스로 적절하게 혈액을 공급한다. 이러한 종양 유도된 혈관형성은 대개 종양 성장에 필요하며 또한 전이세포가 혈류내로 들어갈 수 있게 한다.
다른 혈관형성 질환에는 당뇨망막병증, 노화 관련 황반변성(ARMD), 건선, 류마티스성 관절염 및 기타 염증 질환이 포함된다. 이러한 질환은 혈관신생 영역중 신생 혈관에 의해 정상 조직이 파괴되는 것이 특징이다. 예를 들어, ARMD에서 맥락막에 모세혈관이 침입하여 이를 파괴한다. ARMD에서 혈관형성으로 인한 맥락막 파괴는 결국 부분적 또는 완전 실명을 유도한다.
바람직하게 본 발명의 siRNA는, 예를 들어 유방암, 폐암, 두경부 암, 뇌암, 복부 암, 결장암, 직장결장암, 식도암, 위장관암, 신경아교종, 간암, 설암, 신경모세포종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 망막모세포종, 윌름즈 종양(Wilm's tumor), 다발골수종, 피부암(예: 흑색종), 림프종 및 혈액암과 같이 암과 관련된 고형 종양의 성장 또는 전이를 억제하는데 사용된다.
보다 바람직하게 본 발명의 siRNA는 노화 관련 황반변성에서 맥락막 혈관신생을 억제하는데 사용된다.
혈관형성 질환을 치료하기 위해, 본 발명의 siRNA와 상이한 약제학적 제제와 혼합하여 본 발명의 siRNA를 피험체에 투여할 수 있다. 달리, 혈관형성 질환을 치료하기 위해 고안된 다른 치료법과 병행하여 본 발명의 siRNA를 피험체에게 투여할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 siRNA는 암을 치료하거나 종양 전이를 막는데 현재 사용되고 있는 치료법(예: 방사능치료법, 화학치료법 및 수술)과 병행하여 투여할 수 있다. 종양을 치료하기 위해, 방사능치료법과 병행하거나 화학치료제(예: 시스플라틴, 카보플라틴, 사이클로포스파미드, 5-플루오로우라실, 아드리아마이신, 다우노루비신 또는 타목시펜)와 함께 본 발명의 siRNA를 피험체에 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에서, 본 발명의 siRNA는 전달 시약과 함께 나상 siRNA로 피험체에 투여하거나 siRNA를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터로써 피험체에 투여할 수 있다.
본 발명의 siRNA와 함께 투여하기에 적합한 전달 시약에는 마이러스 트랜지트(Mirus Transit) TKO 친유성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴, 다가양이온(예: 폴리라이신) 또는 리포좀이 포함된다. 바람직한 전달 시약은 리포좀이다.
리포좀은 siRNA가 망막 또는 종양 조직과 같은 특정 조직에 전달되는 것을 돕고 또한 siRNA의 혈액내 반감기를 증가시킬 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 리포좀은, 일반적으로 중성 또는 음전하 인지질 및 스테롤(예: 콜레스테롤)을 포함하는 표준 소포 형성 지질로부터 형성시킨다. 일반적으로 지질은 목적하는 리포좀의 크기 및 혈류내 리포좀 반감기와 같은 인자를 고려하여 선택한다. 리포좀을 제조하는 다양한 방법이 공지되어 있으며, 예를 들어 전문이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 다음 문헌에 기술되어 있다[참조문헌: Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467; 및 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호 및 제5,019,369호].
바람직하게, 본 발명의 siRNA를 캡슐화하는 리포좀은 혈관형성 부위 또는 그근처의 특정 세포 또는 조직에 리포좀을 표적화시키는 리간드 분자를 포함한다. 종양 항원 또는 내피세포 표면 항원에 결합하는 모노클로날 항체와 같이, 종양 또는 혈관 내피세포에 많은 수용체에 결합하는 리간드가 바람직하다.
특히 바람직하게 본 발명의 siRNA를 캡슐화하는 리포좀은, 예를 들어 구조의 표면에 옵소닌화-억제 잔기가 결합함으로써, 단핵 대식세포 및 세망내피계에 의한 제거를 피하도록 변형시킨다. 한가지 양태에서, 본 발명의 리포좀은 옵소닌화-억제 잔기 및 리간드 모두를 포함할 수 있다.
본 발명의 리포좀을 제조하는데 사용하기 위한 옵소닌화-억제 잔기는 전형적으로 리포좀 막에 결합하는 거대한 친수성 중합체이다. 본원에서 사용되는 바와 같이 옵소닌화-억제 잔기는, 예를 들어 막 자체내로 지용성 앵커를 삽입하거나 막 지질의 활성 그룹에 직접 결합함으로써 막에 화학적 또는 물리적으로 부착되는 경우에 리포좀 막에 "결합"되어 있다고 한다. 이러한 옵소닌화-억제 친수성 중합체는, 예를 들어 전문이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 미국 특허 제4,920,016호에 기술되어 있는 바와 같이, 대식세포-단핵구계("MMS") 및 세망내피계("RES")에 의한 리포좀의 흡수를 상당히 감소시키는 보호 표면층을 형성한다. 따라서, 옵소닌화-억제 잔기로 변형시킨 리포좀은 순환시 비변형 리포좀보다 훨씬 장기간 유지된다. 이러한 이유로 인해, 상기한 리포좀은 종종 "스텔스(stealth)" 리포좀이라 한다.
스텔스 리포좀은 다공성 또는 "누수" 미세맥관구조에 의해 양분이 공급되는 조직에 축적되는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 이러한 미세맥관구조 결점이 있는 표적 조직, 예를 들어 고형 종양에는 이러한 리포좀이 효율적으로 축적될 것이다[참조문헌: Gabizon, et al. (1988), P.N.A.S., USA, 18: 6949-53]. 또한 RES에 의한 흡수 감소는 간 및 비장에 상당량이 축적되는 것을 방지함으로써 스텔스 리포좀의 독성을 낮춘다. 따라서, 옵소닌화-억제 잔기로 변형시킨 본 발명의 리포좀은 본 발명의 siRNA를 종양 세포에 전달할 수 있다.
리포좀을 변형시키는데 적합한 옵소닌화-억제 잔기는, 평균 분자량이 바람직하게는 약 500 내지 약 40,000달톤, 보다 바람직하게는 약 2,000 내지 약 20,000달톤인 수용성 중합체가 바람직하다. 이러한 중합체에는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 유도체(예: 메톡시 PEG 또는 PPG, 및 PEG 또는 PPG 스테아레이트), 합성 중합체(예: 폴리아크릴아마이드 또는 폴리 N-비닐 피롤리돈), 직쇄, 분지쇄 또는 덴드리머 폴리아미도아민, 폴리아크릴산, 다가알콜(예: 카복실 그룹 또는 아미노 그룹이 화학적으로 결합되어 있는 폴리크실리톨 및 폴리비닐알콜) 뿐만 아니라 강글리오사이드(예: 강글리오사이드 GM1)가 포함된다. PEG, 메톡시 PEG 또는 메톡시 PPG의 공중합체, 또는 이의 유도체도 적합하다. 또한 옵소닌화-억제 중합체는 PEG 및 폴리아미노산, 다당류, 폴리아미도아민, 폴리에틸렌아민 또는 폴리뉴클레오타이드의 블록 공중합체일 수 있다. 또한 옵소닌화-억제 잔기는 아미노산 또는 카복실산을 포함한 천연 다당류(예: 갈락투론산, 글루쿠론산, 만누론산, 하이알우론산, 펙트산, 뉴라민산, 알긴산, 카라기난), 아민화 다당류 또는 올리고다당류(직쇄 또는 분지쇄), 또는 예를 들어 카본산 유도체와 반응하는 카복실기가 연결된 카복실화 다당류 또는 올리고다당류일 수 있다.
바람직하게는, 옵소닌화-억제 잔기는 PEG, PPG 또는 이의 유도체이다. PEG 또는 PPG 유도체로 변형시킨 리포좀은 흔히 "PEG화 리포좀"이라 한다.
옵소닌화-억제 잔기는 당분야에 공지된 다수의 방법 중 하나에 의해 리포좀 막에 결합시킬 수 있다. 예를 들어 PEG의 N-하이드록시석신이미드 에스테르를 포스파타딜-에탄올아민 지용성 앵커에 결합시킨 다음, 막에 결합시킬 수 있다. 유사하게, Na(CN)BH3 및 테트라하이드로푸란과 물의 30:12의 용매 혼합물을 사용하여 60℃에서 환원적으로 아민화시킴으로써, 덱스트란 중합체를 스테아릴아민 지용성 앵커로 유도체화시킬 수 있다.
본 발명의 siRNA를 발현하는 재조합 플라스미드는 상기에서 논의하였다. 이러한 재조합 플라스미드는 또한 피험체에 직접 투여하거나 적합한 전달 시약, 예를 들어 마이러스 트랜지트 LT1 친유성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴, 다가양이온(예: 폴리라이신) 또는 리포좀과 함께 투여할 수 있다. 본 발명의 siRNA를 발현하는 재조합 바이러스 벡터는 또한 상기에서 논의하였고 이러한 벡터를 피험체의 혈관신생 영역에 전달하는 방법은 당분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
본 발명의 siRNA는 siRNA를 혈관신생 영역 또는 그 근처 조직의 세포에 전달하기에 적합한 어떠한 방법에 의해서도 피험체에 투여할 수 있다. 예를 들어, siRNA는 유전자 총 또는 전기천공에 의해 투여하거나 다른 적합한 비경구 또는 장관 투여 경로에 의해 투여할 수 있다.
적합한 장관 투여 경로에는 경구, 직장 또는 비내 전달이 포함된다.
적합한 비경구 투여 경로에는 정맥내 투여(예: 정맥내 일시 주사, 정맥내 주입, 동맥내 일시 주사, 동맥내 주입 및 혈관구조내로 카테터 삽입); 조직주위 및 조직내 투여(예: 종양주위 및 종양내 주사, 망막내 주사 또는 망막하 주사); 피하 주입(예: 삼투압 펌프)을 포함한 피하 주사 또는 침착; 예를 들어 카테터 또는 다른 배치 장치(예: 각막 펠렛, 좌제, 안용 점적기구, 또는 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질을 포함한 임플란트)에 의한 혈관신생 부위 또는 그 근처의 영역에 직접(예: 국소) 적용; 및 흡입이 포함된다. 적합한 배치 장치에는 전문이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 미국 특허 제5,902,598호 및 제6,375,972호에 기술되어 있는 안과용 임플란트 및 미국 특허 제6,331,313호에 기술되어 있는 생체분해성 안과용 임플란트가 포함된다. 이러한 안과용 임플란트는 컨트롤 딜리버리 시스템스 인크(Control Delivery Systems, Inc.; Watertown, MA) 및 오쿨렉스 파마슈티칼스, 인크(Oculex Pharmaceuticals, Inc.; Sunnyvale, CA)로부터 구입할 수 있다.
바람직한 양태에서 siRNA의 주사 또는 주입은 혈관신생 부위 또는 그 근처에서 실시한다. 예를 들어, 본 발명의 siRNA는 눈에 있는 망막 색소 상피세포에 전달할 수 있다. 바람직하게 siRNA는 당분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이 눈에 국소 투여되는데, 예를 들어 액체형 또는 겔형으로 아래쪽 눈꺼풀 또는 결막 막힌관에 국소 투여된다[참조문헌: Acheampong AA et al, 2002, Drug Metabol. and Disposition 30: 421-429].
전형적으로, 본 발명의 siRNA는 약 5㎕ 내지 약 75㎕, 예를 들어 약 7㎕ 내지 약 50㎕, 바람직하게는 약 10㎕ 내지 약 30㎕의 용적으로 눈에 국소 투여한다. 본 발명의 siRNA는 수용액중 용해도가 크다. 75㎕ 이상의 용적으로 siRNA를 눈에 국소 점적하면 유출되고 흘러서 눈으로부터 siRNA가 소실될 수 있다. 따라서, 약 5㎕ 내지 약 75㎕의 용적으로 눈에 국소 점적함으로써 siRNA를 고농도(예: 100 내지 1000nM)로 투여하는 것이 바람직하다.
특히 바람직한 비경구 투여 경로는 안내 투여이다. 본 발명의 siRNA의 안내 투여는, 투여 경로에 의해 눈에 siRNA가 들어가는 것을 허용하는 한, 눈에 주사하거나 직접(예: 국소) 투여하여 실시할 수 있다. 상기한 눈에 대한 국소 투여 경로 외에, 적합한 안내 투여 경로에는 유리체내, 망막내, 망막하, 힘줄하, 안와주위 및 안와뒤, 각막통과 및 공막통과 투여가 포함된다. 이러한 안내 투여 경로는 당분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 예를 들어 전문이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 다음 문헌에 기술되어 있다[참조문헌: Acheampong AA et al, 2002, supra ; and Bennett et al. (1996), Hum. Gene Ther. 7: 1763-1769 and Ambati J et al. , 2002, Progress in Retinal and Eye Res. 21: 145-151].
본 발명의 siRNA는 단일 투여 또는 다수 투여로 투여할 수 있다. 본 발명의 siRNA를 주입에 의해 투여하는 경우, 주입은 단일 지속 용량이거나 다수 주입에 의해 전달할 수 있다. 혈관신생 부위 또는 그 근처의 조직으로 siRNA를 직접 주사하는 것이 바람직하다. 혈관신생 부위 또는 그 근처의 조직으로 siRNA를 다수 주사하는 것이 특히 바람직하다.
당분야의 숙련가라면 본 발명의 siRNA를 소정의 피험체에게 투여하기에 적절한 투약 계획을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, siRNA는 혈관신생 부위 또는 그 근처에서의 단일 주사 침착에 의해 피험체에 1회 투여할 수 있다. 달리, siRNA는 매일 또는 매주 피험체에게 여러번 투여할 수 있다. 예를 들어, siRNA는 약 3주 내지 약 28주, 보다 바람직하게는 약 7주 내지 약 10주 동안 매주 1회 피험체에 투여할 수 있다. 바람직한 투약 계획에서, siRNA는 7주 동안 매주 1회 혈관신생 부위(예: 유리체내) 또는 그 근처에 주사한다. 습식 ARMD 또는 당뇨망막병증과 같은 만성 혈관신생 질환으로 고통받는 환자에게는 정해지지 않은 기간 동안 본 발명의 siRNA를 정기적으로 투여하는 것이 필요할 것으로 이해된다.
투약 계획이 다수 투여를 포함하는 경우, 피험체에게 투여되는 siRNA의 유효량은 전체 투약 계획에 걸쳐 투여되는 siRNA의 총량을 포함할 수 있다.
본 발명의 siRNA는 피험체에 투여하기 전에 당분야 공지된 기술에 따라 약제학적 조성물로써 제형화시키는 것이 바람직하다. 본 발명의 약제학적 제형은 적어도 멸균이며 발열원이 없는 것이 특징이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "약제학적 제형"에는 사람 및 가축에 사용되는 제형이 포함된다. 본 발명의 약제학적 조성물을 제조하는 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 전문이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 다음 문헌에 기술되어 있다[참조문헌: Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)].
본 발명의 약제학적 조성물은 생리적으로 허용되는 담체 매질과 혼합된, 본 발명의 siRNA(예: 0.1 내지 90중량%) 또는 생리적으로 허용되는 이의 염을 포함한다. 생리적으로 허용되는 바람직한 담체 매질에는 물, 완충수, 염수(예: 정상 염수 또는 균형 염수(예: Hank 또는 Earle 균형 염 용액)), 0.4% 염수, 0.3% 글리신, 하이알우론산 등이 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 통상의 약제학적 부형제 및/또는 부가제를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 부형제에는 안정화제, 항산화제, 삼투압 조절제, 완충제 및 pH 조절제가 포함된다. 적합한 부가제에는 생리학적으로 생체적합성 완충액(예: 트로메타민 염산염), 킬레이트제 부가물(예: DTPA 또는 DTPA-비스아마이드) 또는 칼슘 킬레이트 착화물(예: 칼슘 DTPA, CaNaDTPA-비스아마이드) 또는 임의의 칼슘염 또는 나트륨염 부가물(예: 염화칼슘, 칼슘 아스코르베이트, 칼슘 글루코네이트 또는 칼슘 락테이트)이 포함된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 액체형으로 사용하기 위해 포장하거나 동결건조시킬 수 있다.
눈에 국소 투여하기 위해 통상의 안내 전달 시약을 사용할 수 있다. 예를 들어, 국소 안내 전달을 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 상기한 바와 같은 염수, 각막 침투 증진제, 불용성 입자, 석유 또는 기타 겔 기제 연고, 점안시 점도가 증가하는 중합체 또는 점막접착성 중합체를 포함할 수 있다. 바람직하게 안내 전달 시약은 각막 상피세포를 덮고 있는 뮤신층과 생리화학적으로 상호작용함으로써 또는 점도 효과를 통해 siRNA의 안구앞 보유를 연장시키거나 각막 침투를 증가시킨다.
국소 안내 전달에 적합한 불용성 입자에는, 전문이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 미국 특허 제6,355,271호(Bell et al.)에 기술되어 있는 인산칼슘 입자가 포함된다. 점안시 점도가 증가하는 적합한 조성물에는 폴록사머 407(예: 농도 25%), 셀룰로스 아세토프탈레이트(예: 농도 30%)와 같은 폴리에틸렌폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 또는 겔라이트(GelriteR; CP Kelco, Wilmington, DE)와 같은 저 아세틸 겔란고무가 포함된다. 적합한 점막접착성 중합체에는 카복실, 하이드록실, 아마이드 및/또는 설페이트기와 같은 다중 친수성 관능기가 있는 하이드로콜로이드, 예를 들어 하이드록시프로필셀룰로스, 폴리아크릴산, 고분자량 폴리에틸렌 글리콜(예: 분자량 > 200,000 ), 덱스트란, 하이알우론산, 폴리갈라투론산 및 크실로칸이 포함된다. 적합한 각막 침투 증진제에는 사이클로덱스트린, 벤즈알코늄 클로라이드, 폴리옥시에틸렌 글리콜 라우릴 에테르(예: BrijR 35), 폴리옥시에틸렌 글리콜 스테아릴 에테르((예: BrijR 78), 폴리옥시에틸렌 글리콜 올레일 에테르(예: BrijR 98), 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA), 디기토닌, 나트륨 타우로콜레이트, 사포닌 및 폴리옥시에틸화 비버유(Cremaphor EL)가 포함된다.
고체 조성물의 경우, 예를 들어 약제 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 통상의 비독성 고체 담체를 사용할 수 있다.
예를 들어, 경구 투여용 고체 약제학적 조성물은 상기한 임의의 담체 및 부형제와 함께 본 발명의 하나 이상의 siRNA를 10 내지 95%, 바람직하게는 25% 내지 75% 포함할 수 있다. 에어로졸(흡입) 투여용 약제학적 조성물은 추진제와 함께 상기한 바와 같이 리포좀에 캡슐화된 본 발명의 하나 이상의 siRNA를 0.01 내지 20중량%, 바람직하게는 1 내지 10중량% 포함할 수 있다. 비내 전달의 경우, 레시틴과 같은 담체를 포함할 수도 있다.
본 발명은 지금부터 하기하는 비제한적인 실시예를 통해 설명될 것이다. 하기의 동물 실험은 연구에서 동물의 관리 및 용도에 관한 펜실베이니아 대학 연구소 지침을 사용하여 실시하였다.
실시예 1 - 배양된 사람 배아 신장세포에서 항-HIF-1 알파 siRNA를 이용한 사람 VEGF 발현의 억제
사람 배아 신장 293(HEK-293) 세포는 24웰 플레이트에서 표준 성장 배지중 5% CO2와 함께 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 다음날 세포가 대략 50% 컨플루언스에 도달하면 실험 세포 및 대조군 세포에서 형질감염을 실시하였다. 실험 세포는 인산칼슘 시약중 혼합된 25nM 사람 HIF-1 알파 siRNA로 형질감염시켰다. 대조군 세포는 siRNA가 없는 형질감염 시약으로 처리하거나 인산칼슘 형질감염 시약중 25nM의 비특이적 siRNA(EGFP1 siRNA)로 처리하였다. 실험 세포의 경우, 사람 HIF-1 알파 알파 mRNA에 대해 표적화된 20개의 상이한 siRNA를 시험하였다. 표적 서열에 포함된 이러한 항-HIF-1 알파 siRNA는 표 2에 열거하였고 모든 siRNA는 각각의 쇄에 3'TT 돌출부를 포함하였다. 표 2에서 열거한 "샘플 #"는 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같은 실험 세포 샘플에 상응한다.
형질감염 후 4시간째, 대조군 및 실험 HEK-293 세포에서 최종 농도가 200μM인 데스페리옥사민으로 저산소증을 유도하였다. 형질감염 후 48시간째, 세포 배양 배지를 모든 웰로부터 제거하고, 다음 프로토콜(Quantikine human VEGF ELISA protocol)에 기술된 바와 같이 사람 VEGF ELISA(R & D systems, Minneapolis, MN)를 실시하였다. ELISA 결과는 AD340 플레이트 판독기(Beckman Coulter)상에서 판독하고 도 1에 나타내었다.
도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 사람 VEGF 단백질은 데스페리옥사민 매개된 저산소증 유도에 의해 HEK-293 세포에서 전기에 조절되었다. 저산소증 유도된 VEGF 단백질의 증가는 사람 항-HIF-1 알파 siRNA로 형질감염시킨 세포에서 감소되었다. 비특이적 siRNA(EGFP siRNA)로 형질감염시키거나 siRNA 없이 거짓 형질감염시킨 저산소증 세포는 VEGF 단백질 수준에 대해 아무런 효과가 없었다. 항-HIF-1 알파 siRNA hHIF1#12, hHIF1#13 및 hHIF1#16은 비저산소증 HEK-293 세포의 것과 근접한 수준으로 VEGF 단백질 발현을 감소시켰다. 항-HIF-1 알파 siRNA hHIF1#11은 비저산소증 HEK-293 세포의 것보다 낮게 VEGF 단백질 발현을 감소시켰다.
대조군 세포 및 실험 세포로부터 세포 배양 배지를 제거한 후, 다음과 같이 세포독성 분석을 실시하였다. 10% 알라마블루(AlamarBlue; Biosource, Camarillo, CA)를 포함한 완전 성장 배지를 각각의 웰에 가하고 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 3시간 동안 항온처리하였다. 세포 대사 활성으로 나타나는 알라마블루 포함 배지의 변색을 검출함으로서 세포 증식을 측정하였다. 세포독성 분석 결과는 AD340 플레이트 판독기(Beckman Coulter)상에서 판독하고 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 20개의 항 HIF-1 알파 siRNA중 어떤 것도 HEK-293 세포에서 유의한 세포독성을 나타내지 않았다.
세포독성 분석을 실시한 후, 각 웰에서 성장 배지를 완전히 제거한 다음, 제조자 지시사항에 따라 RNAqueous RNA 분리 키트(RNAqueous RNA isolation kit; Ambion, Austin, TX)를 사용하여 HEK-293 세포로부터 RNA를 추출하였다. 세포에서 사람 HIF-1 알파 및 VEGF mRNA 수준은, 내부 표준으로서 사람 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)를 사용하는 정량적 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 측정하였다.
RT-PCR 연구는, 저산소증이 비저산소증 세포중 VEGF mRNA 발현에 비해 사람 VEGF mRNA의 수준을 증가시킨다는 것을 보여준다. 저산소증 세포중 VEGF mRNA 수준은 항-HIF-1 알파 siRNA로 형질감염시키면 감소되었다. 비특이적 siRNA(EGFP siRNA)로 형질감염시키거나 siRNA 없이 거짓 형질감염시킨 저산소증 세포의 VEGF 단백질 수준은 감소되지 않았다. 따라서, 항-HIF-1 알파 siRNA를 HEK-293 세포에 도입하면, 비특이적 siRNA로 형질감염시키거나 siRNA 없이 형질감염시킨 저산소증 세포에 비해 VEGF mRNA의 파괴를 유발하였다. 항-HIF-1 알파 siRNA에 의해 유도된 VEGF mRNA의 파괴는 도 1에 나타낸 VEGF 단백질 생산 감소와 상호연관이 있다.
실시예 2 - 마우스 맥락막 혈관신생 모델에서 항-HIF-1 알파 siRNA를 이용한 혈관형성의 생체내 억제
성체 (8 내지 15주령) 암컷 C57B1/6 마우스(N=7)를 아베르틴(2,2,2-트리브로모메탄올)로 마취시키고, 이들의 동공을 1% 트로피카마이드로 확대시켰다. 콘택트 렌즈로써 커버 슬립이 있는 슬릿 램프 시스템 및 이극진공관 레이저 광응고장치(IRIS Medical, Mountain View, CA)를 사용하여 양쪽에서 레이저 광응고를 실시하였다. 시각 신경으로부터 2 내지 3디스크 직경에서 양쪽 눈에 9시, 12시 및 3시 위치에 레이저 광응고(140㎽; 스팟 크기: 75micron; 기간: 0.1s)를 적용하였다. 중요한 맥락막 혈관신생(CNV)을 만들기 위해서는 부르크 막(Bruch's membrane)을 파괴해야 하기 때문에, 부르크 막의 파괴 표시로써 광응고시의 기포 형성을 이용하였다. 부르크 막의 파괴를 유도하지 않는 레이저 화상은 본 연구로부터 배제시켰다.
레이저 처리 직후, 유리체내 주사에 의해 마우스 HIF-1 알파 mRNA에 대해 표적화된 siRNA를 시험 그룹의 각각의 동물의 양쪽 눈에 전달하였다. 대조군 동물은 담체만 유리체내에 주사하였다.
마우스 항-HIF-1 알파 mRNA의 표적 서열은 하기 서열번호 297이고 사용되는 siRNA는 하기 서열번호 298 및 299이다:
AACTAACTGGACACAGTGTGT (서열번호 297)
5'-cuaacuggacacaguguguTT-3' (서열번호 298)
3'-TTgauugaccugugucacaca-5' (서열번호 299)
레이저 광응고 후 20일이 지나면, 망막/맥락막 맥관 구조를 분류하기 위해 고분자량 덱스트란-플루오레세인(Molecular Probes, Eugene, OR)을 동물에 관류시키고 눈을 수집하였다. 맥락막 평면 표본 제조물에서 각각의 CNV의 영역을 측정하였다.
맥락막 평면 표본을 제조하기 위해, 전실을 제거하고 망막을 유리체와 함께 추출하여 세안용 컵에 둔다. 세안용 컵에서 절개부를 느슨하게 하고 맥락막을 슬라이드상에 편다. 형광 조명이 장착된 라이카 DMR 현미경(Leica DMR microscope; Wetzlar, Germany)을 사용하여, 사전 정보가 없는 조사자는 이전에 레이저광에 노출된 영역에 상응하는 원형 형광(플루오레세인 양성) 영역으로써 덱스트란-플루오레세인 관류된 평면 표준 제조물에서 병변을 확인하였다. 병변의 영상은, 오픈랩 2.2(OpenLab 2.2) 소프트웨어가 장치된 애플 매킨토시 G4 컴퓨터와 연결되어 있는 흑백 하마마쓰 CCD 카메라(Hamamatsu Photonics, Bridgewater, NJ)를 사용하여 수득하였다. 보정용 영상은 공지된 크기의 회절격자가 있는 슬라이드로부터 수득하였다. 레이저 화상 영역내 과형광 플루오레세인-덱스트란 표지된 혈관은 오픈랩 소프트웨어를 사용하여 "관심 영역"(region of interest; ROI)으로 선택하고, 이 소프트웨어를 사용하여 ROI중 백색 화소가 참여하는 영역(μ㎡)을 계산하였다. 오픈랩 소프트웨어내에서 정의한 바와 같이, 2000 내지 4090 강도 단위의 레이저 화상 부위에서 화소를 확인하기 위해 오픈랩 "요술 지팡이" 장치를 사용함으로써 동일한 통합 세팅하에 있는 영상을 수집한 후 ROI를 선택하였다. 선택된 강도 단위는 정상 플루오레세인 관류된 맥관구조에서 측정된 수준을 나타낸다. 참고로 배경의 강도인 비형광 영역은 450강도 단위 미만이다.
ROI는 일반적으로 형광이 결여된 영역에 의해 잘 둘러싸여 있다. CNV 영역을 측정한 후, 오픈랩 소프트웨어에서 "파장 적용" 기능을 사용하여 515나노미터(영상 데이타가 수득되는 파장)에서 강도 램프를 적용함으로써 오픈랩에서 영상에 색을 입힌다. 이러한 강도 램프는 영상중 모든 화소에 적용되며 가장 백색인 화소에 가장 밝은 녹색을 부여하였다. 그런 다음, 발표를 위해 아도브 포토샵(Adobe Photoshop) 소프트웨어에 영상을 보낸다. 맥락막 평면 표본의 밝은 영역을 분석한 후 레이저 화상의 증거가 없는 상황은 배제시켰다.
결과의 통계학적 분석은 단측 분포, 두 샘플 비상등분산 스튜던트 t-시험(Student's t-test)을 사용하여 실시하였다. 레이저를 쬔 항-HIF-1 알파 siRNA로 처리한 동물 및 대조군 동물간에는 CNV 영역이 통계적으로 유의하게 감소하였는데(P = 0.000354), 이는 항-HIF-1 알파 siRNA로 처리한 동물에서 혈관형성이 실질적으로 감소되었음을 나타낸다. 결과는 도 3에 나타내었다.
관련 특허원의 상호 참조
본 특허원은 2002년 11월 1일자로 출원된 미국 가특허원 제60/423,262호의 이익을 청구하고 있다.
<110> The Trustees of the University of Pennsylvania <120> Compositions and methods for siRNA inhibition of HIF-1 alpha <130> 43826-0002PC1 <150> US 60/423,262 <151> 2002-11-01 <160> 299 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2964 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggccgtccct ggcggcggag atggcggcga cagcggcgga ggctgtgacc tctggctctg 60 gagagccccg ggaggaggct ggagccctcg gccccgcctg gcatgaatcc cagttgcgca 120 gttatagctt cccgactagg cccattccgc gtctgagtca gagcgacccc cgggcagagg 180 agcttattga gaatgaggag cctgtggtgc tgaccgacac aaatcttgtg tatcctgccc 240 tgaaatggga ccttgaatac ctgcaagaga atattggcaa tggagacttc tctgtgtaca 300 gtgccagcac ccacaagttc ttgtactatg atgagaagaa gatggccaat ttccagaact 360 ttaagccgag gtccaacagg gaagaaatga aatttcatga gttcgttgag aaactgcagg 420 atatacagca gcgaggaggg gaagagaggt tgtatctgca gcaaacgctc aatgacactg 480 tgggcgggaa gattgtcatg gacttcttag gttttaactg gaactggatt aataagcaac 540 agggaaagcg tggctggggg cagcttacct ctaacctgct gctcattggc atggaaggaa 600 atgtgacacc tgctcactat gatgagcagc agaacttttt tgctcagata aaaggttaca 660 aacgatgcat cttattccct ccggatcagt tcgagtgcct ctacccatac cctgttcatc 720 acccatgtga cagacagagc caggtggact ttgacaatcc cgactacgag aggttcccta 780 atttccaaaa tgtggttggt tacgaaacag tggttggccc tggtgatgtt ctttacatcc 840 caatgtactg gtggcatcac atagagtcat tactaaatgg ggggattacc atcactgtga 900 acttctggta taagggggct cccaccccta agagaattga atatcctctc aaagctcatc 960 agaaagtggc cataatgaga aacattgaga agatgcttgg agaggccttg gggaacccac 1020 aagaggtggg gcccttgttg aacacaatga tcaagggccg gtacaactag cctgccaggg 1080 gtcaaggcct cctgccaggt gactgctatc ccgtccacac cgcttcattg atgaggacag 1140 gagactccaa gcgctagtat tgcacgctgc acttaatgga ctggactctt gccatggccc 1200 aggagtcagg tgtttggagc gaggcagggc agttggcact ccactcctat ttggagggac 1260 ttcataccct tgcctcttgt gccccagcac cttctctctc tgccccccgc ctaaagtcct 1320 gcattcagtg tgtggagtcc cagcttttgg ttgtcatcat gtctgtgtgt atgttagtct 1380 gtcaacttcg gaatgtgtgc gtgtgtgtgc atgcacacgc atgtatgtat ctgttccctg 1440 ttccttctgg gtcaggctgt cacttccggc tctcggccct atctcctgca acctcagtgc 1500 ctcagcctga gagagagatg agatgctctt ggactcccca ctgcatctgg gctgcagggc 1560 cagagctagt ctgaccatta ggtcagtctg cctcctgaca gtttttgcgt agtcaagctc 1620 taggcggtat gggaatggct accgggactc taatggggtg aaagagaggg gaggcttgcc 1680 tttgagagcc tatatagcct tcctgtgaga gaggattaga tagggttcca actgggccta 1740 caagctcaag ccatacataa aaggaccttg ggacataaga accaatgatt gtgcataagt 1800 tctaaattag agacacatat agtttctctc tttcagcacc agctcttgcc cctatgctgg 1860 gtaccaaggg agttctccta gctgtggctt ctctaggttc taggggtgca agcctctgtg 1920 tgtttgtttg tgtgtgtctg tgtgtgcgta tccacactag gggtgcaagc ctctgggtgt 1980 gtgtgtgtgt gtgcgtgcgt gtgtgtgtgt gtgtccgtgt gtgtgtgtgt gtgtccacac 2040 tggccagcct ccctacttac caaggttctc cactgcttac cttttccagt gggacagtac 2100 agtgtgagcc cccgggaagt actgcctgac ctatcctaag cttttacact tggattttag 2160 ccatcatatg ttggccaggt ttcactgcag cctgcccgag gctaactggc tagagcctcc 2220 aggccctatg atgctccctg cccaggccat atcctttatt cctgctgagc ttcctggctg 2280 aatagatgaa atggggtcaa gcccaggcag ctcattcact atctgtgatc cacctcaggg 2340 cacgggcaaa cacataggct tgcgtcttaa agccagctcc tctgccagac cccgttgtaa 2400 tgtgccacaa caccctcaat agtcagggca actggtggag catggaagtc gaatttcctt 2460 ttctgttagg agctactcct gggaacccct ctcagggctg cagcttacag gtgggcagct 2520 gtgattgcac aacttgaagg gccatcattc acatctattc agtgggagtg gggtccctgg 2580 gattgggcag tgtggtggcc ctgtgtctcc tcacctctgc tcctgtcttc atcaccttct 2640 ctctggaagg gaagaggagt tggaaggtct ctggttttct tttctttttt tttttttgcc 2700 aaaggtttac ttccagcatc tgagctctgg ctctcacccc tgaagctcag ttatagtgca 2760 ctgatgaact gagaggatgc gtgtggatgt gtgtgcatgc ctgagtgcgt tttttgggga 2820 ggggtgttta tttttagtac cccattctgg ggttctctga tgcagtgtgg atgtgaagat 2880 atggtacctt ctcaagtgta gctctttcaa atatagtcaa tgctgggaaa aaaaaaaaaa 2940 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2964 <210> 2 <211> 3958 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gtgctgcctc gtctgagggg acaggaggat caccctcttc gtcgcttcgg ccagtgtgtc 60 gggctgggcc ctgacaagcc acctgaggag aggctcggag ccgggcccgg accccggcga 120 ttgccgcccg cttctctcta gtctcacgag gggtttcccg cctcgcaccc ccacctctgg 180 acttgccttt ccttctcttc tccgcgtgtg gagggagcca gcgcttaggc cggagcgagc 240 ctgggggccg cccgccgtga agacatcgcg gggaccgatt caccatggag ggcgccggcg 300 gcgcgaacga caagaaaaag ataagttctg aacgtcgaaa agaaaagtct cgagatgcag 360 ccagatctcg gcgaagtaaa gaatctgaag ttttttatga gcttgctcat cagttgccac 420 ttccacataa tgtgagttcg catcttgata aggcctctgt gatgaggctt accatcagct 480 atttgcgtgt gaggaaactt ctggatgctg gtgatttgga tattgaagat gacatgaaag 540 cacagatgaa ttgcttttat ttgaaagcct tggatggttt tgttatggtt ctcacagatg 600 atggtgacat gatttacatt tctgataatg tgaacaaata catgggatta actcagtttg 660 aactaactgg acacagtgtg tttgatttta ctcatccatg tgaccatgag gaaatgagag 720 aaatgcttac acacagaaat ggccttgtga aaaagggtaa agaacaaaac acacagcgaa 780 gcttttttct cagaatgaag tgtaccctaa ctagccgagg aagaactatg aacataaagt 840 ctgcaacatg gaaggtattg cactgcacag gccacattca cgtatatgat accaacagta 900 accaacctca gtgtgggtat aagaaaccac ctatgacctg cttggtgctg atttgtgaac 960 ccattcctca cccatcaaat attgaaattc ctttagatag caagactttc ctcagtcgac 1020 acagcctgga tatgaaattt tcttattgtg atgaaagaat taccgaattg atgggatatg 1080 agccagaaga acttttaggc cgctcaattt atgaatatta tcatgctttg gactctgatc 1140 atctgaccaa aactcatcat gatatgttta ctaaaggaca agtcaccaca ggacagtaca 1200 ggatgcttgc caaaagaggt ggatatgtct gggttgaaac tcaagcaact gtcatatata 1260 acaccaagaa ttctcaacca cagtgcattg tatgtgtgaa ttacgttgtg agtggtatta 1320 ttcagcacga cttgattttc tcccttcaac aaacagaatg tgtccttaaa ccggttgaat 1380 cttcagatat gaaaatgact cagctattca ccaaagttga atcagaagat acaagtagcc 1440 tctttgacaa acttaagaag gaacctgatg ctttaacttt gctggcccca gccgctggag 1500 acacaatcat atctttagat tttggcagca acgacacaga aactgatgac cagcaacttg 1560 aggaagtacc attatataat gatgtaatgc tcccctcacc caacgaaaaa ttacagaata 1620 taaatttggc aatgtctcca ttacccaccg ctgaaacgcc aaagccactt cgaagtagtg 1680 ctgaccctgc actcaatcaa gaagttgcat taaaattaga accaaatcca gagtcactgg 1740 aactttcttt taccatgccc cagattcagg atcagacacc tagtccttcc gatggaagca 1800 ctagacaaag ttcacctgag cctaatagtc ccagtgaata ttgtttttat gtggatagtg 1860 atatggtcaa tgaattcaag ttggaattgg tagaaaaact ttttgctgaa gacacagaag 1920 caaagaaccc attttctact caggacacag atttagactt ggagatgtta gctccctata 1980 tcccaatgga tgatgacttc cagttacgtt ccttcgatca gttgtcacca ttagaaagca 2040 gttccgcaag ccctgaaagc gcaagtcctc aaagcacagt tacagtattc cagcagactc 2100 aaatacaaga acctactgct aatgccacca ctaccactgc caccactgat gaattaaaaa 2160 cagtgacaaa agaccgtatg gaagacatta aaatattgat tgcatctcca tctcctaccc 2220 acatacataa agaaactact agtgccacat catcaccata tagagatact caaagtcgga 2280 cagcctcacc aaacagagca ggaaaaggag tcatagaaca gacagaaaaa tctcatccaa 2340 gaagccctaa cgtgttatct gtcgctttga gtcaaagaac tacagttcct gaggaagaac 2400 taaatccaaa gatactagct ttgcagaatg ctcagagaaa gcgaaaaatg gaacatgatg 2460 gttcactttt tcaagcagta ggaattggaa cattattaca gcagccagac gatcatgcag 2520 ctactacatc actttcttgg aaacgtgtaa aaggatgcaa atctagtgaa cagaatggaa 2580 tggagcaaaa gacaattatt ttaataccct ctgatttagc atgtagactg ctggggcaat 2640 caatggatga aagtggatta ccacagctga ccagttatga ttgtgaagtt aatgctccta 2700 tacaaggcag cagaaaccta ctgcagggtg aagaattact cagagctttg gatcaagtta 2760 actgagcttt ttcttaattt cattcctttt tttggacact ggtggctcac tacctaaagc 2820 agtctattta tattttctac atctaatttt agaagcctgg ctacaatact gcacaaactt 2880 ggttagttca atttttgatc ccctttctac ttaatttaca ttaatgctct tttttagtat 2940 gttctttaat gctggatcac agacagctca ttttctcagt tttttggtat ttaaaccatt 3000 gcattgcagt agcatcattt taaaaaatgc acctttttat ttatttattt ttggctaggg 3060 agtttatccc tttttcgaat tatttttaag aagatgccaa tataattttt gtaagaaggc 3120 agtaaccttt catcatgatc ataggcagtt gaaaaatttt tacacctttt ttttcacatt 3180 ttacataaat aataatgctt tgccagcagt acgtggtagc cacaattgca caatatattt 3240 tcttaaaaaa taccagcagt tactcatgga atatattctg cgtttataaa actagttttt 3300 aagaagaaat tttttttggc ctatgaaatt gttaaacctg gaacatgaca ttgttaatca 3360 tataataatg attcttaaat gctgtatggt ttattattta aatgggtaaa gccatttaca 3420 taatatagaa agatatgcat atatctagaa ggtatgtggc atttatttgg ataaaattct 3480 caattcagag aaatcatctg atgtttctat agtcactttg ccagctcaaa agaaaacaat 3540 accctatgta gttgtggaag tttatgctaa tattgtgtaa ctgatattaa acctaaatgt 3600 tctgcctacc ctgttggtat aaagatattt tgagcagact gtaaacaaga aaaaaaaaat 3660 catgcattct tagcaaaatt gcctagtatg ttaatttgct caaaatacaa tgtttgattt 3720 tatgcacttt gtcgctatta acatcctttt tttcatgtag atttcaataa ttgagtaatt 3780 ttagaagcat tattttagga atatatagtt gtcacagtaa atatcttgtt ttttctatgt 3840 acattgtaca aatttttcat tccttttgct ctttgtggtt ggatctaaca ctaactgtat 3900 tgttttgtta catcaaataa acatcttctg tggaccagga aaaaaaaaaa aaaaaaaa 3958 <210> 3 <211> 3812 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gtgctgcctc gtctgagggg acaggaggat caccctcttc gtcgcttcgg ccagtgtgtc 60 gggctgggcc ctgacaagcc acctgaggag aggctcggag ccgggcccgg accccggcga 120 ttgccgcccg cttctctcta gtctcacgag gggtttcccg cctcgcaccc ccacctctgg 180 acttgccttt ccttctcttc tccgcgtgtg gagggagcca gcgcttaggc cggagcgagc 240 ctgggggccg cccgccgtga agacatcgcg gggaccgatt caccatggag ggcgccggcg 300 gcgcgaacga caagaaaaag ataagttctg aacgtcgaaa agaaaagtct cgagatgcag 360 ccagatctcg gcgaagtaaa gaatctgaag ttttttatga gcttgctcat cagttgccac 420 ttccacataa tgtgagttcg catcttgata aggcctctgt gatgaggctt accatcagct 480 atttgcgtgt gaggaaactt ctggatgctg gtgatttgga tattgaagat gacatgaaag 540 cacagatgaa ttgcttttat ttgaaagcct tggatggttt tgttatggtt ctcacagatg 600 atggtgacat gatttacatt tctgataatg tgaacaaata catgggatta actcagtttg 660 aactaactgg acacagtgtg tttgatttta ctcatccatg tgaccatgag gaaatgagag 720 aaatgcttac acacagaaat ggccttgtga aaaagggtaa agaacaaaac acacagcgaa 780 gcttttttct cagaatgaag tgtaccctaa ctagccgagg aagaactatg aacataaagt 840 ctgcaacatg gaaggtattg cactgcacag gccacattca cgtatatgat accaacagta 900 accaacctca gtgtgggtat aagaaaccac ctatgacctg cttggtgctg atttgtgaac 960 ccattcctca cccatcaaat attgaaattc ctttagatag caagactttc ctcagtcgac 1020 acagcctgga tatgaaattt tcttattgtg atgaaagaat taccgaattg atgggatatg 1080 agccagaaga acttttaggc cgctcaattt atgaatatta tcatgctttg gactctgatc 1140 atctgaccaa aactcatcat gatatgttta ctaaaggaca agtcaccaca ggacagtaca 1200 ggatgcttgc caaaagaggt ggatatgtct gggttgaaac tcaagcaact gtcatatata 1260 acaccaagaa ttctcaacca cagtgcattg tatgtgtgaa ttacgttgtg agtggtatta 1320 ttcagcacga cttgattttc tcccttcaac aaacagaatg tgtccttaaa ccggttgaat 1380 cttcagatat gaaaatgact cagctattca ccaaagttga atcagaagat acaagtagcc 1440 tctttgacaa acttaagaag gaacctgatg ctttaacttt gctggcccca gccgctggag 1500 acacaatcat atctttagat tttggcagca acgacacaga aactgatgac cagcaacttg 1560 aggaagtacc attatataat gatgtaatgc tcccctcacc caacgaaaaa ttacagaata 1620 taaatttggc aatgtctcca ttacccaccg ctgaaacgcc aaagccactt cgaagtagtg 1680 ctgaccctgc actcaatcaa gaagttgcat taaaattaga accaaatcca gagtcactgg 1740 aactttcttt taccatgccc cagattcagg atcagacacc tagtccttcc gatggaagca 1800 ctagacaaag ttcacctgag cctaatagtc ccagtgaata ttgtttttat gtggatagtg 1860 atatggtcaa tgaattcaag ttggaattgg tagaaaaact ttttgctgaa gacacagaag 1920 caaagaaccc attttctact caggacacag atttagactt ggagatgtta gctccctata 1980 tcccaatgga tgatgacttc cagttacgtt ccttcgatca gttgtcacca ttagaaagca 2040 gttccgcaag ccctgaaagc gcaagtcctc aaagcacagt tacagtattc cagcagactc 2100 aaatacaaga acctactgct aatgccacca ctaccactgc caccactgat gaattaaaaa 2160 cagtgacaaa agaccgtatg gaagacatta aaatattgat tgcatctcca tctcctaccc 2220 acatacataa agaaactact agtgccacat catcaccata tagagatact caaagtcgga 2280 cagcctcacc aaacagagca ggaaaaggag tcatagaaca gacagaaaaa tctcatccaa 2340 gaagccctaa cgtgttatct gtcgctttga gtcaaagaac tacagttcct gaggaagaac 2400 taaatccaaa gatactagct ttgcagaatg ctcagagaaa gcgaaaaatg gaacatgatg 2460 gttcactttt tcaagcagta ggaattattt agcatgtaga ctgctggggc aatcaatgga 2520 tgaaagtgga ttaccacagc tgaccagtta tgattgtgaa gttaatgctc ctatacaagg 2580 cagcagaaac ctactgcagg gtgaagaatt actcagagct ttggatcaag ttaactgagc 2640 tttttcttaa tttcattcct ttttttggac actggtggct cactacctaa agcagtctat 2700 ttatattttc tacatctaat tttagaagcc tggctacaat actgcacaaa cttggttagt 2760 tcaatttttg atcccctttc tacttaattt acattaatgc tcttttttag tatgttcttt 2820 aatgctggat cacagacagc tcattttctc agttttttgg tatttaaacc attgcattgc 2880 agtagcatca ttttaaaaaa tgcacctttt tatttattta tttttggcta gggagtttat 2940 ccctttttcg aattattttt aagaagatgc caatataatt tttgtaagaa ggcagtaacc 3000 tttcatcatg atcataggca gttgaaaaat ttttacacct tttttttcac attttacata 3060 aataataatg ctttgccagc agtacgtggt agccacaatt gcacaatata ttttcttaaa 3120 aaataccagc agttactcat ggaatatatt ctgcgtttat aaaactagtt tttaagaaga 3180 aatttttttt ggcctatgaa attgttaaac ctggaacatg acattgttaa tcatataata 3240 atgattctta aatgctgtat ggtttattat ttaaatgggt aaagccattt acataatata 3300 gaaagatatg catatatcta gaaggtatgt ggcatttatt tggataaaat tctcaattca 3360 gagaaatcat ctgatgtttc tatagtcact ttgccagctc aaaagaaaac aataccctat 3420 gtagttgtgg aagtttatgc taatattgtg taactgatat taaacctaaa tgttctgcct 3480 accctgttgg tataaagata ttttgagcag actgtaaaca agaaaaaaaa aatcatgcat 3540 tcttagcaaa attgcctagt atgttaattt gctcaaaata caatgtttga ttttatgcac 3600 tttgtcgcta ttaacatcct ttttttcatg tagatttcaa taattgagta attttagaag 3660 cattatttta ggaatatata gttgtcacag taaatatctt gttttttcta tgtacattgt 3720 acaaattttt cattcctttt gctctttgtg gttggatcta acactaactg tattgttttg 3780 ttacatcaaa taaacatctt ctgtggacca gg 3812 <210> 4 <211> 3718 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 4 gacaccgcgg gcaccgattc gccatggagg gcgccggcgg cgagaacgag aagaaaaata 60 ggatgagttc cgaacgtcga aaagaaaagt ctagggatgc agcacgatct cggcgaagca 120 aagagtctga agttttttat gagcttgctc atcagttgcc acttccccac aacgtgagct 180 cccatcttga taaagcttct gttatgaggc tcaccatcag ttacttacgt gtgaggaaac 240 ttctaggtgc tggtgatctt gacattgaag atgaaatgaa agcacagatg aactgctttt 300 atctgaaagc cctggatggc tttgttatgg tgctaacaga tgatggtgac atgatttaca 360 tttctgataa cgtgaacaaa tacatggggt tgactcagtt tgaactaact ggacacagtg 420 tgtttgattt tacccatcca tgtgaccatg aggaaatgag agaaatgctt acacacagaa 480 atggcccagt gagaaagggg aaagaacaaa acacgcagcg aagctttttt ctcagaatga 540 aatgtaccct aacaagccgg gggaggacga tgaacatcaa gtcagcaacg tggaaggtgc 600 tgcactgcac aggccacatt catgtgtatg ataccagcag taaccagccg cagtgtggct 660 acaagaaacc gcctatgacg tgcttggtgc tgatttgtga acccattcct catccatcaa 720 acattgaaat tcctttagac agcaagacat ttctcagtcg acacagcctc gatatgaaat 780 tttcttactg tgatgaaagg attactgagt tgatgggtta tgagccagaa gaacttttgg 840 gccgttcaat ttatgaatat tatcatgctt tggactctga tcatctgacc aaaactcatc 900 atgacatgtt tactaaagga caagtcacca caggacagta caggatgctt gcaaaaagag 960 gtggatatgt ctgggttgag actcaagcaa ctgttatata taatacgaag aactctcagc 1020 cacagtgcat tgtgtgtgtg aattatgttg taagtggtat tattcagcac gacttgattt 1080 tctcccttca acaaacagaa tctgtcctca aaccagttga atcttcagat atgaaaatga 1140 cccagctgtt cactaaagtg gaatctgagg acacgagctg cctcttcgac aagcttaaga 1200 aagagcccga tgccctgact ctgctagctc cagcggctgg ggacacgatc atatcactgg 1260 acttcggcag cgatgacacg gaaactgaag accaacaact tgaagatgtc ccgttgtaca 1320 atgatgtaat gttcccctct tctaatgaga aattaaatat aaatctggca atgtctccat 1380 tacctgcctc tgaaactcca aagccacttc gaagtagtgc tgatcctgca ctgaatcaag 1440 aggttgcatt gaagttagag tcaagcccag agtcactggg actttctttt accatgcccc 1500 agattcaaga tcagccagca agtccttctg atggaagcac tagacaaagc tcacctgagc 1560 ctaacagtcc cagtgagtac tgctttgatg tggacagcga tatggtcaat gtattcaagt 1620 tggaactggt ggaaaaactg tttgctgaag acacagaagc gaagaatcca ttttcagctc 1680 aggacactga tttagacttg gaaatgctgg ctccctatat cccaatggat gatgatttcc 1740 agttacgttc ctttgatcag ttgtcaccat tagagagcaa ttctccaagc cctccgagtg 1800 tgagcacagt tacaggattc cagcagaccc agttacagaa acctaccatc actgtcactg 1860 ccaccgcaac tgccaccact gatgaatcaa aagcagtgac gaaggacaat atagaagaca 1920 ttaaaatact gattgcatct ccaccttcta cccaagtacc tcaagaaatg accactgcta 1980 aggcatcagc atacagtggt actcacagtc ggacagcctc accagacaga gcaggaaaga 2040 gagtcataga aaaaacagac aaagctcatc caaggagcct taacctatct gtcactttga 2100 atcaaagaaa tactgttcct gaagaagaat taaacccaaa gacaatagct ttgcagaatg 2160 ctcagaggaa gcgaaaaatg gaacatgatg gctccctttt tcaagcagca ggaattggaa 2220 cgttactgca gcaaccaggt gaccgtgccc ctactatgtc gctttcttgg aaacgagtga 2280 aaggatacat atctagtgaa caggatggaa tggagcagaa gacaattttt ttaataccct 2340 ctgatttagc atgtagactg ctggggcagt caatggatga gagtggatta ccacagctga 2400 ccagttacga ttgtgaagtt aatgctccca tacaaggcag cagaaaccta ctgcagggtg 2460 aagaattact cagagctttg gatcaagtta actgagcttt tcctaatctc attcctttga 2520 ttgttaattt ttgtgttcag ttgttgttgt tgtctgtggg gtttcgtttc tgttggttgt 2580 tttggacact ggtggctcag cagtctattt atattttcta tatctcattt agaggcctgg 2640 ctacagtact gcaccaactc agatagttta gtttgggccc cttcctcctt cattttcact 2700 gatgctcttt ttaccatgtc cttcgaatgc cagatcacag cacattcaca gctccccagc 2760 atttcaccaa tgcattgctg tagtgtcgtt taaaatgcac ctttttattt atttattttt 2820 ggtgagggag tttgtccctt attgaattat ttttaatgaa atgccaatat aattttttaa 2880 gaaggcagta aatcttcatc atgatgatag gcagttgaaa attttttact catttttttc 2940 atgttttaca tgaaaataat gctttgccag cagtacatgg tagccacaat tgcacaatat 3000 attttcttaa aaataccagc agttactcat gcatatattc tgcatttata aaactagttt 3060 ttaagaagaa actttttttg gcctatggaa ttgttaagcc tggatcatga tgctgttgat 3120 cttataatga ttcttaaact gtatggtttc tttatatggg taaagccatt tacatgatat 3180 agagagatat gcttatatct ggaaggtata tggcatttat ttggataaaa ttctcaattg 3240 agaagttatc tggtgtttct ttactttacc ggctcaaaag aaaacagtcc ctatgtagtt 3300 gtggaagctt atgctaatat tgtgtaattg atattaaaca ttaaatgttc tgcctatcct 3360 gttggtataa agacattttg agcatactgt aaacaaaaaa atcatgcatt gttagtaaaa 3420 ttgcctagta tgttaatttg ttgaaaatac gatgtttggt tttatgcact ttgtcgctat 3480 taacatcctt tttttcatat agatttcaat aattgagtaa ttttagaagc attattttag 3540 aaatatagag ttgtcatagt aaacatcttg tttttttttc tttttttcta tgtacattgt 3600 ataaattttt cattcccttg ctctttgtag ttgggtctaa cactaactgt actgttttgt 3660 tatatcaaat aaacatcttc tgtggaccag gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 3718 <210> 5 <211> 3973 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 cgcgaggact gtcctcgccg ccgtcgcggg cagtgtctag ccaggccttg acaagctagc 60 cggaggagcg cctaggaacc cgagccggag ctcagcgagc gcagcctgca cgcccgcctc 120 gcgtcccggg ggggtcccgc ctcccacccc gcctctggac ttgtctcttt ccccgcgcgc 180 gcggacagag ccggcgttta ggcccgagcg agcccggggg ccgccggccg ggaagacaac 240 gcgggcaccg attcgccatg gagggcgccg gcggcgagaa cgagaagaaa aagatgagtt 300 ctgaacgtcg aaaagaaaag tctagagatg cagcaagatc tcggcgaagc aaagagtctg 360 aagtttttta tgagcttgct catcagttgc cacttcccca caatgtgagc tcacatcttg 420 ataaagcttc tgttatgagg ctcaccatca gttatttacg tgtgagaaaa cttctggatg 480 ccggtggtct agacagtgaa gatgagatga aggcacagat ggactgtttt tatctgaaag 540 ccctagatgg ctttgtgatg gtgctaacag atgacggcga catggtttac atttctgata 600 acgtgaacaa atacatgggg ttaactcagt ttgaactaac tggacacagt gtgtttgatt 660 ttactcatcc atgtgaccat gaggaaatga gagaaatgct tacacacaga aatggcccag 720 tgagaaaagg gaaagaacta aacacacagc ggagcttttt tctcagaatg aagtgcaccc 780 taacaagccg ggggaggacg atgaacatca agtcagcaac gtggaaggtg cttcactgca 840 cgggccatat tcatgtctat gataccaaca gtaaccaacc tcagtgtggg tacaagaaac 900 cacccatgac gtgcttggtg ctgatttgtg aacccattcc tcatccgtca aatattgaaa 960 ttcctttaga tagcaagaca tttctcagtc gacacagcct cgatatgaaa ttttcttact 1020 gtgatgaaag aattactgag ttgatgggtt atgagccgga agaacttttg ggccgctcaa 1080 tttatgaata ttatcatgct ttggattctg atcatctgac caaaactcac catgatatgt 1140 ttactaaagg acaagtcacc acaggacagt acaggatgct tgccaaaaga ggtggatatg 1200 tctgggttga aactcaagca actgtcatat ataatacgaa gaactcccag ccacagtgca 1260 ttgtgtgtgt gaattatgtt gtaagtggta ttattcagca cgacttgatt ttctcccttc 1320 aacaaacaga atctgtgctc aaaccagttg aatcttcaga tatgaagatg actcagctgt 1380 tcaccaaagt tgaatcagag gatacaagct gcctttttga taagcttaag aaggagcctg 1440 atgctctcac tctgctggct ccagctgccg gcgacaccat catctctctg gattttggca 1500 gcgatgacac agaaactgaa gatcaacaac ttgaagatgt tccattatat aatgatgtaa 1560 tgtttccctc ttctaatgaa aaattaaata taaacctggc aatgtctcct ttaccttcat 1620 cggaaactcc aaagccactt cgaagtagtg ctgatcctgc actgaatcaa gaggttgcat 1680 taaaattaga atcaagtcca gagtcactgg gactttcttt taccatgccc cagattcaag 1740 atcagccagc aagtccttct gatggaagca ctagacaaag ttcacctgag agacttcttc 1800 aggaaaacgt aaacactcct aacttttccc agcctaacag tcccagtgaa tattgctttg 1860 atgtggatag cgatatggtc aatgtattca agttggaact ggtggaaaaa ctgtttgctg 1920 aagacacaga ggcaaagaat ccattttcaa ctcaggacac tgatttagat ttggagatgc 1980 tggctcccta tatcccaatg gatgatgatt tccagttacg ttcctttgat cagttgtcac 2040 cattagagag caattctcca agccctccaa gtatgagcac agttactggg ttccagcaga 2100 cccagttaca gaaacctacc atcactgcca ctgccaccac aactgccacc actgatgaat 2160 caaaaacaga gacgaaggac aataaagaag atattaaaat actgattgca tctccatctt 2220 ctacccaagt acctcaagaa acgaccactg ctaaggcatc agcatacagt ggcactcaca 2280 gtcggacagc ctcaccagac agagcaggaa agagagtcat agaacagaca gacaaagctc 2340 atccaaggag ccttaagctg tctgccactt tgaatcaaag aaatactgtt cctgaggaag 2400 aattaaaccc aaagacaata gcttcgcaga atgctcagag gaagcgaaaa atggaacatg 2460 atggctccct ttttcaagca gcaggaattg gaacattatt gcagcaacca ggtgactgtg 2520 cacctactat gtcactttcc tggaaacgag tgaaaggatt catatctagt gaacagaatg 2580 gaacggagca aaagactatt attttaatac cctccgattt agcatgcaga ctgctggggc 2640 agtcaatgga tgagagtgga ttaccacagc tgaccagtta cgattgtgaa gttaatgctc 2700 ccatacaagg cagcagaaac ctactgcagg gtgaagaatt actcagagct ttggatcaag 2760 ttaactgagc gtttcctaat ctcattcctt ttgattgtta atgtttttgt tcagttgttg 2820 ttgtttgttg ggtttttgtt tctgttggtt atttttggac actggtggct cagcagtcta 2880 tttatatttt ctatatctaa ttttagaagc ctggctacaa tactgcacaa actcagatag 2940 tttagttttc atcccctttc tacttaattt tcattaatgc tctttttaat atgttctttt 3000 aatgccagat cacagcacat tcacagctcc tcagcatttc accattgcat tgctgtagtg 3060 tcatttaaaa tgcacctttt tatttattta tttttggtga gggagtttgt cccttattga 3120 attattttta atgaaatgcc aatataattt tttaagaaag cagtaaattc tcatcatgat 3180 cataggcagt tgaaaacttt ttactcattt ttttcatgtt ttacatgaaa ataatgcttt 3240 gtcagcagta catggtagcc acaattgcac aatatatttt ctttaaaaaa ccagcagtta 3300 ctcatgcaat atattctgca tttataaaac tagtttttaa gaaatttttt ttggcctatg 3360 gaattgttaa gcctggatca tgaagcgttg atcttataat gattcttaaa ctgtatggtt 3420 tctttatatg ggtaaagcca tttacatgat ataaagaaat atgcttatat ctggaaggta 3480 tgtggcattt atttggataa aattctcaat tcagagaagt tatctggtgt ttcttgactt 3540 taccaactca aaacagtccc tctgtagttg tggaagctta tgctaatatt gtgtaattga 3600 ttatgaaaca taaatgttct gcccaccctg ttggtataaa gacattttga gcatactgta 3660 aacaaacaaa caaaaaatca tgctttgtta gtaaaattgc ctagtatgtt gatttgttga 3720 aaatatgatg tttggtttta tgcactttgt cgctattaac atcctttttt catatagatt 3780 tcaataagtg agtaatttta gaagcattat tttaggaata tagagttgtc atagtaaaca 3840 tcttgttttt tctatgtaca ctgtataaat ttttcgttcc cttgctcttt gtggttgggt 3900 ctaacactaa ctgtactgtt ttgttatatc aaataaacat cttctgtgga ccaggaaaaa 3960 aaaaaaaaaa aaa 3973 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 6 aactggacac agtgtgtttg a 21 <210> 7 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 7 aacuaacugg acacagugug uuu 23 <210> 8 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 8 acacacugug uccaguuagu uuu 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 9 aacuaacugg acacagugug utt 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 10 acacacugug uccaguuagu utt 23 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 11 aactaactgg acacagtgtg t 21 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 12 cgacaagaaa aagataa 17 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 13 aaagataagt tctgaac 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 14 agataagttc tgaacgt 17 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 15 gttctgaacg tcgaaaa 17 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 16 aagaaaagtc tcgagat 17 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 17 gaaaagtctc gagatgc 17 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 18 agtctcgaga tgcagcc 17 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 19 gtaaagaatc tgaagtt 17 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 20 gaatctgaag tttttta 17 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 21 gttttttatg agcttgc 17 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 22 ggcctctgtg atgaggc 17 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 23 cttctggatg ctggtga 17 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 24 agcacagatg aattgct 17 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 25 aaatgcttac acacagaaat g 21 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 26 gaaaaagata agttctg 17 <210> 27 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 27 aagataagtt ctgaacg 17 <210> 28 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 28 gataagttct gaacgtc 17 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 29 cgtcgaaaag aaaagtc 17 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 30 agaaaagtct cgagatg 17 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 31 aagtctcgag atgcagc 17 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 32 gtctcgagat gcagcca 17 <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 33 agaatctgaa gtttttt 17 <210> 34 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 34 tctgaagttt tttatga 17 <210> 35 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 35 tgtgagttcg catcttg 17 <210> 36 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 36 acttctggat gctggtg 17 <210> 37 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 37 gatgacatga aagcaca 17 <210> 38 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 38 gcacagatga attgctt 17 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 39 aagtttttta tgagcttgct c 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 40 aagtttttta tgagcttgct c 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 41 aaggcctctg tgatgaggct t 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 42 aaacttctgg atgctggtga t 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 43 aacttctgga tgctggtgat t 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 44 aagatgacat gaaagcacag a 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 45 aaagcacaga tgaattgctt t 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 46 aagcacagat gaattgcttt t 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 47 aattgctttt atttgaaagc c 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 48 aaagccttgg atggttttgt t 21 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 49 aagccttgga tggttttgtt a 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 50 aatgtgaaca aatacatggg a 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 51 aacaaataca tgggattaac t 21 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 52 aaatacatgg gattaactca g 21 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 53 aaatacatgg gattaactca g 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 54 aactcagttt gaactaactg g 21 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 55 aactaactgg acacagtgtg t 21 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 56 aactggacac agtgtgtttg a 21 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 57 aaatgagaga aatgcttaca c 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 58 aatgagagaa atgcttacac a 21 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 59 aaatgcttac acacagaaat g 21 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 60 aatgcttaca cacagaaatg g 21 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 61 aaatggcctt gtgaaaaagg g 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 62 aatggccttg tgaaaaaggg t 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 63 aaaaagggta aagaacaaaa c 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 64 aaaagggtaa agaacaaaac a 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 65 aaagggtaaa gaacaaaaca c 21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 66 aagggtaaag aacaaaacac a 21 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 67 aaagaacaaa acacacagcg a 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 68 aagaacaaaa cacacagcga a 21 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 69 aacaaaacac acagcgaagc t 21 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 70 aacaaaacac acagcgaagc t 21 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 71 aaacacacag cgaagctttt t 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 72 aacacacagc gaagcttttt t 21 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 73 aagctttttt ctcagaatga a 21 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 74 aatgaagtgt accctaacta g 21 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 75 aagtgtaccc taactagccg a 21 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 76 aactagccga ggaagaacta t 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 77 aagaactatg aacataaagt c 21 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 78 aactatgaac ataaagtctg c 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 79 aacataaagt ctgcaacatg g 21 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 80 aaagtctgca acatggaagg t 21 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 81 aagtctgcaa catggaaggt a 21 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 82 aacatggaag gtattgcact g 21 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 83 aaggtattgc actgcacagg c 21 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 84 aacagtaacc aacctcagtg t 21 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 85 aaccaacctc agtgtgggta t 21 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 86 aacctcagtg tgggtataag a 21 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 87 aagaaaccac ctatgacctg c 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 88 aagaaaccac ctatgacctg c 21 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 89 aaccacctat gacctgcttg g 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 90 aacccattcc tcacccatca a 21 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 91 aaatattgaa attcctttag a 21 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 92 aatattgaaa ttcctttaga t 21 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 93 aaattccttt agatagcaag a 21 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 94 aattccttta gatagcaaga c 21 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 95 aagactttcc tcagtcgaca c 21 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 96 aaattttctt attgtgatga a 21 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 97 aattttctta ttgtgatgaa a 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 98 aaagaattac cgaattgatg g 21 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 99 aattaccgaa ttgatgggat a 21 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 100 aattaccgaa ttgatgggat a 21 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 101 aagaactttt aggccgctca a 21 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 102 aacttttagg ccgctcaatt t 21 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 103 aatttatgaa tattatcatg c 21 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 104 aatattatca tgctttggac t 21 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 105 aaaactcatc atgatatgtt t 21 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 106 aaactcatca tgatatgttt a 21 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 107 aactcatcat gatatgttta c 21 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 108 aaaggacaag tcaccacagg a 21 <210> 109 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 109 aaggacaagt caccacagga c 21 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 110 aagtcaccac aggacagtac a 21 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 111 aaaagaggtg gatatgtctg g 21 <210> 112 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 112 aaagaggtgg atatgtctgg g 21 <210> 113 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 113 aagaggtgga tatgtctggg t 21 <210> 114 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 114 aaactcaagc aactgtcata t 21 <210> 115 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 115 aactcaagca actgtcatat a 21 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 116 aagcaactgt catatataac a 21 <210> 117 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 117 aactgtcata tataacacca a 21 <210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 118 aacaccaaga attctcaacc a 21 <210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 119 aagaattctc aaccacagtg c 21 <210> 120 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 120 aattctcaac cacagtgcat t 21 <210> 121 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 121 aaccacagtg cattgtatgt g 21 <210> 122 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 122 aattacgttg tgagtggtat t 21 <210> 123 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 123 aacaaacaga atgtgtcctt a 21 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 124 aaacagaatg tgtccttaaa c 21 <210> 125 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 125 aacagaatgt gtccttaaac c 21 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 126 atgtgtcctt aaaccggttg 20 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 127 aaaccggttg aatcttcaga t 21 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 128 aaccggttga atcttcagat a 21 <210> 129 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 129 aatcttcaga tatgaaaatg a 21 <210> 130 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 130 aaaatgactc agctattcac c 21 <210> 131 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 131 aaatgactca gctattcacc a 21 <210> 132 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 132 aatgactcag ctattcacca a 21 <210> 133 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 133 aaagttgaat cagaagatac a 21 <210> 134 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 134 aagttgaatc agaagataca a 21 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 135 aatcagaaga tacaagtagc c 21 <210> 136 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 136 aagatacaag tagcctcttt g 21 <210> 137 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 137 aagtagcctc tttgacaaac t 21 <210> 138 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 138 aaacttaaga aggaacctga t 21 <210> 139 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 139 aacttaagaa ggaacctgat g 21 <210> 140 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 140 aagaaggaac ctgatgcttt a 21 <210> 141 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 141 aaggaacctg atgctttaac t 21 <210> 142 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 142 aacctgatgc tttaactttg c 21 <210> 143 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 143 aactttgctg gccccagccg c 21 <210> 144 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 144 aatcatatct ttagattttg g 21 <210> 145 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 145 aacgacacag aaactgatga c 21 <210> 146 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 146 aaactgatga ccagcaactt g 21 <210> 147 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 147 aactgatgac cagcaacttg a 21 <210> 148 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 148 aacttgagga agtaccatta t 21 <210> 149 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 149 aagtaccatt atataatgat g 21 <210> 150 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 150 aatgatgtaa tgctcccctc a 21 <210> 151 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 151 aatgctcccc tcacccaacg a 21 <210> 152 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 152 aacgaaaaat tacagaatat a 21 <210> 153 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 153 aaaaattaca gaatataaat t 21 <210> 154 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 154 aaaattacag aatataaatt t 21 <210> 155 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 155 aaattacaga atataaattt g 21 <210> 156 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 156 aattacagaa tataaatttg g 21 <210> 157 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 157 aatataaatt tggcaatgtc t 21 <210> 158 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 158 aaatttggca atgtctccat t 21 <210> 159 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 159 aatttggcaa tgtctccatt a 21 <210> 160 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 160 aatgtctcca ttacccaccg c 21 <210> 161 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 161 aaacgccaaa gccacttcga a 21 <210> 162 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 162 aacgccaaag ccacttcgaa g 21 <210> 163 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 163 aaagccactt cgaagtagtg c 21 <210> 164 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 164 aagccacttc gaagtagtgc t 21 <210> 165 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 165 aagtagtgct gaccctgcac t 21 <210> 166 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 166 aatcaagaag ttgcattaaa a 21 <210> 167 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 167 aagaagttgc attaaaatta g 21 <210> 168 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 168 aagttgcatt aaaattagaa c 21 <210> 169 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 169 aaaattagaa ccaaatccag a 21 <210> 170 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 170 aaattagaac caaatccaga g 21 <210> 171 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 171 aattagaacc aaatccagag t 21 <210> 172 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 172 aaccaaatcc agagtcactg g 21 <210> 173 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 173 aaatccagag tcactggaac t 21 <210> 174 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 174 aatccagagt cactggaact t 21 <210> 175 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 175 aactttcttt taccatgccc c 21 <210> 176 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 176 aagcactaga caaagttcac c 21 <210> 177 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 177 aaagttcacc tgagcctaat a 21 <210> 178 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 178 aagttcacct gagcctaata g 21 <210> 179 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 179 aatagtccca gtgaatattg t 21 <210> 180 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 180 aatattgttt ttatgtggat a 21 <210> 181 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 181 aatgaattca agttggaatt g 21 <210> 182 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 182 aattcaagtt ggaattggta g 21 <210> 183 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 183 aagttggaat tggtagaaaa a 21 <210> 184 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 184 aattggtaga aaaacttttt g 21 <210> 185 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 185 aaaacttttt gctgaagaca c 21 <210> 186 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 186 aaactttttg ctgaagacac a 21 <210> 187 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 187 aactttttgc tgaagacaca g 21 <210> 188 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 188 aagacacaga agcaaagaac c 21 <210> 189 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 189 aagcaaagaa cccattttct a 21 <210> 190 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 190 aaagaaccca ttttctactc a 21 <210> 191 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 191 aagaacccat tttctactca g 21 <210> 192 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 192 aacccatttt ctactcagga c 21 <210> 193 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 193 aatggatgat gacttccagt t 21 <210> 194 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 194 aaagcagttc cgcaagccct g 21 <210> 195 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 195 aagcagttcc gcaagccctg a 21 <210> 196 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 196 aagccctgaa agcgcaagtc c 21 <210> 197 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 197 aaagcgcaag tcctcaaagc a 21 <210> 198 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 198 aagcgcaagt cctcaaagca c 21 <210> 199 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 199 aagtcctcaa agcacagtta c 21 <210> 200 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 200 aaagcacagt tacagtattc c 21 <210> 201 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 201 aagcacagtt acagtattcc a 21 <210> 202 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 202 aaatacaaga acctactgct a 21 <210> 203 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 203 aatacaagaa cctactgcta a 21 <210> 204 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 204 aagaacctac tgctaatgcc a 21 <210> 205 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 205 aacctactgc taatgccacc a 21 <210> 206 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 206 aatgccacca ctaccactgc c 21 <210> 207 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 207 aattaaaaac agtgacaaaa g 21 <210> 208 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 208 aaaaacagtg acaaaagacc g 21 <210> 209 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 209 aaaacagtga caaaagaccg t 21 <210> 210 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 210 aaacagtgac aaaagaccgt a 21 <210> 211 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 211 aacagtgaca aaagaccgta t 21 <210> 212 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 212 aaaagaccgt atggaagaca t 21 <210> 213 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 213 aaagaccgta tggaagacat t 21 <210> 214 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 214 aagaccgtat ggaagacatt a 21 <210> 215 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 215 aagacattaa aatattgatt g 21 <210> 216 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 216 aaaatattga ttgcatctcc a 21 <210> 217 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 217 aaatattgat tgcatctcca t 21 <210> 218 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 218 aatattgatt gcatctccat c 21 <210> 219 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 219 aaagaaacta ctagtgccac a 21 <210> 220 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 220 aagaaactac tagtgccaca t 21 <210> 221 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 221 aaactactag tgccacatca t 21 <210> 222 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 222 aactactagt gccacatcat c 21 <210> 223 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 223 aaagtcggac agcctcacca a 21 <210> 224 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 224 aagtcggaca gcctcaccaa a 21 <210> 225 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 225 aaacagagca ggaaaaggag t 21 <210> 226 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 226 aacagagcag gaaaaggagt c 21 <210> 227 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 227 aaaaggagtc atagaacaga c 21 <210> 228 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 228 aaaggagtca tagaacagac a 21 <210> 229 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 229 aaggagtcat agaacagaca g 21 <210> 230 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 230 aacagacaga aaaatctcat c 21 <210> 231 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 231 aaaaatctca tccaagaagc c 21 <210> 232 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 232 aaaatctcat ccaagaagcc c 21 <210> 233 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 233 aaatctcatc caagaagccc t 21 <210> 234 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 234 aatctcatcc aagaagccct a 21 <210> 235 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 235 aagaagccct aacgtgttat c 21 <210> 236 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 236 aagccctaac gtgttatctg t 21 <210> 237 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 237 aacgtgttat ctgtcgcttt g 21 <210> 238 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 238 aaagaactac agttcctgag g 21 <210> 239 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 239 aagaactaca gttcctgagg a 21 <210> 240 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 240 aactacagtt cctgaggaag a 21 <210> 241 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 241 aagaactaaa tccaaagata c 21 <210> 242 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 242 aactaaatcc aaagatacta g 21 <210> 243 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 243 aaatccaaag atactagctt t 21 <210> 244 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 244 aatccaaaga tactagcttt g 21 <210> 245 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 245 aaagatacta gctttgcaga a 21 <210> 246 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 246 aagatactag ctttgcagaa t 21 <210> 247 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 247 aatgctcaga gaaagcgaaa a 21 <210> 248 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 248 aaagcgaaaa atggaacatg a 21 <210> 249 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 249 aagcgaaaaa tggaacatga t 21 <210> 250 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 250 aaaaatggaa catgatggtt c 21 <210> 251 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 251 aaaatggaac atgatggttc a 21 <210> 252 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 252 aaatggaaca tgatggttca c 21 <210> 253 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 253 aatggaacat gatggttcac t 21 <210> 254 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 254 aacatgatgg ttcacttttt c 21 <210> 255 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 255 aagcagtagg aattggaaca t 21 <210> 256 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 256 aattggaaca ttattacagc a 21 <210> 257 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 257 aacattatta cagcagccag a 21 <210> 258 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 258 aaacgtgtaa aaggatgcaa a 21 <210> 259 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 259 aacgtgtaaa aggatgcaaa t 21 <210> 260 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 260 aaaaggatgc aaatctagtg a 21 <210> 261 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 261 aaaggatgca aatctagtga a 21 <210> 262 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 262 aaggatgcaa atctagtgaa c 21 <210> 263 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 263 aaatctagtg aacagaatgg a 21 <210> 264 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 264 aatctagtga acagaatgga a 21 <210> 265 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 265 aacagaatgg aatggagcaa a 21 <210> 266 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 266 aatggaatgg agcaaaagac a 21 <210> 267 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 267 aatggagcaa aagacaatta t 21 <210> 268 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 268 aaaagacaat tattttaata c 21 <210> 269 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 269 aaagacaatt attttaatac c 21 <210> 270 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 270 aagacaatta ttttaatacc c 21 <210> 271 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 271 aattatttta ataccctctg a 21 <210> 272 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 272 aataccctct gatttagcat g 21 <210> 273 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 273 aatcaatgga tgaaagtgga t 21 <210> 274 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 274 aatggatgaa agtggattac c 21 <210> 275 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 275 aaagtggatt accacagctg a 21 <210> 276 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 276 aagtggatta ccacagctga c 21 <210> 277 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 277 catcagttgc cacttccaca t 21 <210> 278 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 278 cttggatggt tttgttatgg t 21 <210> 279 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 279 atgggattaa ctcagtttga a 21 <210> 280 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 280 gtctgcaaca tggaaggtat t 21 <210> 281 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 281 cattcctcac ccatcaaata t 21 <210> 282 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 282 aggccgctca atttatgaat a 21 <210> 283 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 283 tcatatataa caccaagaat t 21 <210> 284 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 284 tgtccttaaa ccggttgaat c 21 <210> 285 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 285 agcctctttg acaaacttaa g 21 <210> 286 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 286 atgaccagca acttgaggaa g 21 <210> 287 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 287 cattacccac cgctgaaacg c 21 <210> 288 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 288 agattcagga tcagacacct a 21 <210> 289 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 289 atagtgatat ggtcaatgaa t 21 <210> 290 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 290 acacagattt agacttggag a 21 <210> 291 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 291 cacagttaca gtattccagc a 21 <210> 292 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 292 attgattgca tctccatctc c 21 <210> 293 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 293 atactagctt tgcagaatgc t 21 <210> 294 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 294 attattacag cagccagacg a 21 <210> 295 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 295 acaattattt taataccctc t 21 <210> 296 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 296 accagttatg attgtgaagt t 21 <210> 297 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 297 aactaactgg acacagtgtg t 21 <210> 298 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 298 cuaacuggac acagugugut t 21 <210> 299 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 299 acacacugug uccaguuagt t 21

Claims (79)

  1. 센스 RNA 쇄와 안티센스 RNA 쇄가 RNA 이중체(duplex)를 형성하고 이때 센스 RNA 쇄가 사람 HIF-1 알파 mRNA, 또는 이의 선택적 스플라이싱형, 돌연변이체 또는 동족체중 약 19 내지 약 25개의 연속 뉴클레오타이드의 표적 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 센스 RNA 쇄 및 안티센스 RNA 쇄를 포함하는 분리된 siRNA.
  2. 제1항에 있어서, 사람 HIF-1 알파 mRNA가 서열번호 1인 siRNA.
  3. 제1항에 있어서, 사람 HIF-1 알파 mRNA 서열의 동족체가 랫트 HIF-1 알파 mRNA 또는 마우스 HIF-1 알파 mRNA인 siRNA.
  4. 제1항에 있어서, 센스 RNA 쇄가 한개의 RNA 분자를 포함하고 안티센스 RNA 쇄가 한개의 RNA 분자를 포함하는 siRNA.
  5. 제1항에 있어서, RNA 이중체를 형성하는 센스 및 안티센스 RNA 쇄가 일본쇄 헤어핀에 의해 공유 결합되어 있는 siRNA.
  6. 제1항에 있어서, siRNA가 비-뉴클레오타이드 물질을 추가로 포함하는 siRNA.
  7. 제1항에 있어서, siRNA가 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 결실, 치환 또는 변화를 추가로 포함하는 siRNA.
  8. 제1항에 있어서, 센스 및 안티센스 RNA 쇄가 뉴클레아제 분해에 대해 안정화된 siRNA.
  9. 제1항에 있어서, 3' 돌출부를 추가로 포함하는 siRNA.
  10. 제9항에 있어서, 3' 돌출부가 1 내지 약 6개의 뉴클레오타이드를 포함하는 siRNA.
  11. 제9항에 있어서, 3' 돌출부가 약 2개의 뉴클레오타이드를 포함하는 siRNA.
  12. 제5항에 있어서, 센스 RNA 쇄가 첫번째 3' 돌출부를 포함하고 안티센스 RNA 쇄가 두번째 3' 돌출부를 포함하는 siRNA.
  13. 제12항에 있어서, 첫번째 및 두번째 3' 돌출부가 각각 1 내지 약 6개의 뉴클레오타이드를 포함하는 siRNA.
  14. 제13항에 있어서, 첫번째 3' 돌출부가 디뉴클레오타이드를 포함하고 두번째 3' 돌출부가 디뉴클레오타이드를 포함하는 siRNA.
  15. 제14항에 있어서, 첫번째 및 두번째 3' 돌출부를 포함하는 디뉴클레오타이드가 디티미딜산(TT) 및 디우리딜산(uu)인 siRNA.
  16. 제9항에 있어서, 3' 돌출부가 뉴클레아제 분해에 대해 안정화된 siRNA.
  17. 제1항의 siRNA를 포함하는 망막 색소 상피세포.
  18. 센스 RNA 쇄와 안티센스 RNA 쇄가 RNA 이중체를 형성하고 이때 센스 RNA 쇄가 사람 HIF-1 알파 mRNA, 또는 이의 선택적 스플라이싱형, 돌연변이체 또는 동족체중 약 19 내지 약 25개의 연속 뉴클레오타이드의 표적 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 센스 RNA 쇄 및 안티센스 RNA 쇄를 포함하는 siRNA를 발현시키기 위한 핵산 서열을 포함하는 재조합 플라스미드.
  19. 제18항에 있어서, siRNA를 발현시키기 위한 핵산 서열이 유도성 또는 조절성 프로모터를 포함하는 재조합 플라스미드.
  20. 제18항에 있어서, siRNA를 발현시키기 위한 핵산 서열이, 사람 U6 RNA 프로모터의 통제하에 폴리T 종결 서열이 작동가능하게 연결된 센스 RNA 쇄 암호화 서열을 포함하고 또한 사람 U6 RNA 프로모터의 통제하에 폴리T 종결 서열이 작동가능하게 연결된 안티센스 RNA 쇄 암호화 서열을 포함하는 재조합 플라스미드.
  21. 제20항에 있어서, 플라스미드가 pAAVsiRNA인 재조합 플라스미드.
  22. 센스 RNA 쇄와 안티센스 RNA 쇄가 RNA 이중체를 형성하고 이때 센스 RNA 쇄가 사람 HIF-1 알파 mRNA, 또는 이의 선택적 스플라이싱형, 돌연변이체 또는 동족체중 약 19 내지 약 25개의 연속 뉴클레오타이드의 표적 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 센스 RNA 쇄 및 안티센스 RNA쇄를 포함하는 siRNA를 발현시키기 위한 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스 벡터.
  23. 제22항에 있어서, siRNA를 발현시키기 위한 핵산 서열이 유도성 또는 조절성 프로모터를 포함하는 재조합 바이러스 벡터.
  24. 제22항에 있어서, siRNA를 발현시키기 위한 핵산 서열이, 사람 U6 RNA 프로모터의 통제하에 폴리T 종결 서열이 작동가능하게 연결된 센스 RNA 쇄 암호화 서열을 포함하고 또한 사람 U6 RNA 프로모터의 통제하에 폴리T 종결 서열이 작동가능하게 연결된 안티센스 RNA 쇄 암호화 서열을 포함하는 재조합 바이러스 벡터.
  25. 제22항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노바이러스-수반 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 헤르페스 바이러스 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 재조합 바이러스 벡터.
  26. 제22항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터를 소수포 구내염 바이러스, 광견병 바이러스, 에볼라 바이러스 또는 모콜라 바이러스의 표면 단백질로 가성형태화(pseudotyping)시킨 재조합 바이러스 벡터.
  27. 제25항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터가 아데노바이러스-수반 바이러스 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 벡터.
  28. 센스 RNA 쇄와 안티센스 RNA 쇄가 RNA 이중체를 형성하고 이때 센스 RNA 쇄가 사람 HIF-1 알파 mRNA, 또는 이의 선택적 스플라이싱형, 돌연변이체 또는 동족체중 약 19 내지 약 25개의 연속 뉴클레오타이드의 표적 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 센스 RNA 쇄 및 안티센스 RNA 쇄를 포함하는 siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴, 다가양이온 또는 리포좀을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  30. 제18항의 플라스미드 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴, 다가양이온 또는 리포좀을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  32. 제22항의 바이러스 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  33. 센스 RNA 쇄와 안티센스 RNA 쇄가 RNA 이중체를 형성하고 이때 센스 RNA 쇄가 사람 HIF-1 알파 mRNA, 또는 이의 선택적 스플라이싱형, 돌연변이체 또는 동족체중 약 19 내지 약 25개의 연속 뉴클레오타이드의 표적 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 센스 RNA 쇄 및 안티센스 RNA 쇄를 포함하는 siRNA의 유효량을 피험체에게 투여하여 사람 HIF-1 알파 mRNA, 또는 이의 선택적 스플라이싱형, 돌연변이체 또는 동족체를 분해함을 포함하여, 사람 HIF-1 알파 mRNA, 또는 이의 선택적 스플라이싱형, 돌연변이체 또는 동족체의 발현을 억제하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 피험체가 사람인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 사람 HIF-1 알파 mRNA, 또는 이의 선택적 스플라이싱형, 돌연변이체 또는 동족체의 발현이 피험체의 한쪽 또는 양쪽 눈에서 억제되는 방법.
  36. 제33항에 있어서, 사람 HIF-1 알파 mRNA, 또는 이의 선택적 스플라이싱형, 돌연변이체 또는 동족체의 발현이 피험체의 망막 색소 상피세포에서 억제되는 방법.
  37. 제33항에 있어서, siRNA의 유효량이 혈관신생 부위 또는 그 근처에 약 1nM 내지 약 100nM의 세포 사이 농도를 제공하는 양인 방법.
  38. 제33항에 있어서, siRNA를 전달 시약과 함께 투여하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 전달 시약이 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴, 다가양이온 및 리포좀으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 전달 시약이 리포좀인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 리포좀이 혈관형성 부위 또는 그 근처의 세포로 당해 리포좀을 표적화시키는 리간드를 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 리간드가 종양세포 또는 혈관 내피세포상의 수용체에 결합하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 리간드가 모노클로날 항체를 포함하는 방법.
  44. 제40항에 있어서, 리포좀을 옵소닌화-억제 잔기로 변형시킨 방법.
  45. 제44항에 있어서, 옵소닌화-억제 잔기가 PEG, PPG 또는 이의 유도체를 포함하는 방법.
  46. 제33항에 있어서, siRNA가 재조합 플라스미드로부터 발현되는 방법.
  47. 제33항에 있어서, siRNA가 재조합 바이러스 벡터로부터 발현되는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노바이러스-수반 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 헤르페스 바이러스 벡터를 포함하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터를 소수포 구내염 바이러스, 광견병 바이러스, 에볼라 바이러스 또는 모콜라 바이러스의 표면 단백질로 가성형태화시킨 방법.
  50. 제47항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터가 아데노바이러스-수반 바이러스 벡터인 방법.
  51. 제33항에 있어서, siRNA가 장관 투여 경로에 의해 투여되는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 장관 투여 경로가 경구, 직장 및 비내 투여로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  53. 제33항에 있어서, siRNA가 비경구 투여 경로에 의해 투여되는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 비경구 투여 경로가 정맥내 투여, 조직주위 및 조직내 투여, 피하 주사 또는 침착, 피하 주입, 안내 투여, 및 혈관신생 부위 또는 그 근처에 대한 직접 적용으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 정맥내 투여가 정맥내 일시 주사, 정맥내 주입, 동맥내 일시 주사, 동맥내 주입 및 혈관구조내로 카테터의 삽입으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  56. 제54항에 있어서, 조직주위 및 조직내 주사가 종양주위 또는 종양내 주사를 포함하는 방법.
  57. 제54항에 있어서, 안내 투여가 유리체내, 망막내, 망막하, 힘줄하, 안와주위, 안와뒤, 각막통과 또는 공막통과 투여를 포함하는 방법.
  58. 제54항에 있어서, 혈관신생 부위 또는 그 근처에 대한 직접 적용이 카테터, 각막 펠렛, 안용 점적기구, 좌제, 다공성 물질을 포함한 임플란트, 비-다공성 물질을 포함한 임플란트 또는 젤라틴성 물질을 포함한 임플란트에 의한 적용을 포함하는 방법.
  59. 제54항에 있어서, 혈관신생 부위가 눈에 있고, 혈관신생 부위 또 그 근처에 대한 직접 적용이 안과용 임플란트에 의한 적용을 포함하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 안과용 임플란트가 생체분해성인 방법.
  61. 센스 RNA 쇄와 안티센스 RNA 쇄가 RNA 이중체를 형성하고 이때 센스 RNA 쇄가 사람 HIF-1 알파 mRNA, 또는 이의 선택적 스플라이싱형, 돌연변이체 또는 동족체중 약 19 내지 약 25개의 연속 뉴클레오타이드의 표적 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 센스 RNA 쇄 및 안티센스 RNA 쇄를 포함하는 siRNA의 유효량을 피험체에게 투여함을 포함하여, 피험체에서 혈관형성을 억제하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 혈관형성이 병원성인 방법.
  63. 제61항에 있어서, 혈관형성이 비-병원성인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 비-병원성 혈관형성이 지방 조직 생성 또는 콜레스테롤 생성과 관련된 방법.
  65. 제63항에 있어서, 비-병원성 혈관형성이 자궁내막 혈관신생을 포함하는 방법.
  66. 제61항에 있어서, 혈관형성이 피험체의 한쪽 또는 양쪽 눈에서 억제되는 방법.
  67. 센스 RNA 쇄와 안티센스 RNA 쇄가 RNA 이중체를 형성하고 이때 센스 RNA 쇄가 사람 HIF-1 알파 mRNA, 또는 이의 선택적 스플라이싱형, 돌연변이체 또는 동족체중 약 19 내지 약 25개의 연속 뉴클레오타이드의 표적 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 센스 RNA 쇄 및 안티센스 RNA 쇄를 포함하는 siRNA의 유효량을 피험체에게 투여하여 혈관형성 질환과 연관된 혈관형성을 억제함을 포함하여, 피험체에서 혈관형성 질환을 치료하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 혈관형성 질환이 암과 관련된 종양을 포함하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 두경부 암, 뇌암, 복부 암, 결장암, 직장결장암, 식도암, 위장관암, 신경아교종, 간암, 설암, 신경모세포종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 망막모세포종, 윌름즈 종양, 다발골수종, 피부암, 림프종 및 혈액암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  70. 제67항에 있어서, 혈관형성 질환이 당뇨망막병증, 노화 관련 황반변성 및 염증 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 염증 질환이 건선 또는 류마티스성 관절염인 방법.
  72. 제70항에 있어서, 혈관형성 질환이 노화 관련 황반변성인 방법.
  73. 제67항에 있어서, siRNA와는 상이한 혈관형성 질환 치료용 약제학적 제제와 함께 siRNA를 투여하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 혈관형성 질환이 암이고 약제학적 제제가 화학치료제를 포함하는 방법.
  75. 제73항에 있어서, 화학치료제가 시스플라틴, 카보플라틴, 사이클로포스파미드, 5-플루오로우라실, 아드리아마이신, 다우노루비신 및 타목시펜으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  76. 제67항에 있어서, 혈관형성 질환을 치료하기 위해 고안된 다른 치료 방법과 병행하여 siRNA를 피험체에게 투여하는 방법.
  77. 제76항에 있어서, 혈관형성 질환이 암이고, 방사능치료법, 화학치료법 또는 수술과 병행하여 siRNA를 투여하는 방법.
  78. 제1항에 있어서, 변화된 RNA를 추가로 포함하는 siRNA.
  79. 제7항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드가 데옥시리보뉴클레오타이드로 치환된 siRNA.
KR1020057007448A 2002-11-01 2003-10-31 ＨＩＦ-1 알파의 ｓｉＲＮＡ 억제를 위한 조성물 및 방법 KR20050083855A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US42326202P 2002-11-01 2002-11-01
US60/423,262 2002-11-01

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127005480A Division KR20120038546A (ko) 2002-11-01 2003-10-31 ＨＩＦ-1 알파의 ｓｉＲＮＡ 억제를 위한 조성물 및 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20050083855A true KR20050083855A (ko) 2005-08-26

Family

ID=32312630

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057007448A KR20050083855A (ko) 2002-11-01 2003-10-31 ＨＩＦ-1 알파의 ｓｉＲＮＡ 억제를 위한 조성물 및 방법
KR1020127005480A KR20120038546A (ko) 2002-11-01 2003-10-31 ＨＩＦ-1 알파의 ｓｉＲＮＡ 억제를 위한 조성물 및 방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127005480A KR20120038546A (ko) 2002-11-01 2003-10-31 ＨＩＦ-1 알파의 ｓｉＲＮＡ 억제를 위한 조성물 및 방법

Country Status (10)

Country Link
US (4) US7521431B2 (ko)
EP (1) EP1562970A4 (ko)
JP (2) JP5449639B2 (ko)
KR (2) KR20050083855A (ko)
AU (1) AU2003291678B2 (ko)
CA (1) CA2504926C (ko)
IL (1) IL168224A (ko)
MX (1) MXPA05004722A (ko)
NZ (1) NZ540779A (ko)
WO (1) WO2004042024A2 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100749859B1 (ko) * 2005-10-18 2007-08-16 연세대학교 산학협력단 ＶＥＧＦ―Ａ 특이적 ｓｉＲＮＡ를 발현하는 개선된 종양살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스
KR101492435B1 (ko) * 2012-12-28 2015-02-10 고려대학교 산학협력단 ＨＩＦ­１α ｓｉＲＮＡ를 유효성분으로 함유하는 ＴＳＬＰ에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물

Families Citing this family (173)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1295611T3 (da) * 2000-06-20 2010-10-04 Dainippon Sumitomo Pharma Co Oligonukleotid-transformerende forbindelser
US20030228320A1 (en) * 2000-08-18 2003-12-11 Ashdown Martin Leonard Retroviral immunotherapy
PT1407787E (pt) * 2001-06-20 2009-07-07 Koken Kk Método de promoção da transferência de ácido nucleico
FR2832154B1 (fr) 2001-11-09 2007-03-16 Centre Nat Rech Scient Oligonucleotides inhibiteurs et leur utilisation pour reprimer specifiquement un gene
PT2264172T (pt) 2002-04-05 2017-12-06 Roche Innovation Ct Copenhagen As Compostos oligoméricos para a modulação da expressão do hif-1α.
CA2482903A1 (en) 2002-04-18 2003-10-23 Lynkeus Biotech Gmbh Means and methods for the specific inhibition of genes in cells and tissue of the cns and/or eye
US7148342B2 (en) 2002-07-24 2006-12-12 The Trustees Of The University Of Pennyslvania Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
US7521431B2 (en) 2002-11-01 2009-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for siRNA inhibition of HIF-1 alpha
US9719092B2 (en) 2002-11-14 2017-08-01 Thermo Fisher Scientific Inc. RNAi targeting CNTD2
US7635770B2 (en) * 2002-11-14 2009-12-22 Dharmacon, Inc. siRNA targeting protein kinase N-3 (PKN-3)
US20080268457A1 (en) * 2002-11-14 2008-10-30 Dharmacon, Inc. siRNA targeting forkhead box P3 (FOXP3)
US7592442B2 (en) * 2002-11-14 2009-09-22 Dharmacon, Inc. siRNA targeting ribonucleotide reductase M2 polypeptide (RRM2 or RNR-R2)
US10011836B2 (en) 2002-11-14 2018-07-03 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US7612196B2 (en) 2002-11-14 2009-11-03 Dharmacon, Inc. siRNA targeting cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (p27, Kip1) (CDKN1B)
US9228186B2 (en) 2002-11-14 2016-01-05 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
DK2284266T3 (da) * 2002-11-14 2014-01-13 Thermo Fisher Scient Biosciences Inc sIRNA-MOLEKYLE MOD TP53
US9879266B2 (en) 2002-11-14 2018-01-30 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
WO2006006948A2 (en) * 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
US7977471B2 (en) * 2002-11-14 2011-07-12 Dharmacon, Inc. siRNA targeting TNFα
US8198427B1 (en) 2002-11-14 2012-06-12 Dharmacon, Inc. SiRNA targeting catenin, beta-1 (CTNNB1)
US7951935B2 (en) 2002-11-14 2011-05-31 Dharmacon, Inc. siRNA targeting v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (MYC)
US7619081B2 (en) * 2002-11-14 2009-11-17 Dharmacon, Inc. siRNA targeting coatomer protein complex, subunit beta 2 (COPB2)
US9771586B2 (en) 2002-11-14 2017-09-26 Thermo Fisher Scientific Inc. RNAi targeting ZNF205
US7691998B2 (en) * 2002-11-14 2010-04-06 Dharmacon, Inc. siRNA targeting nucleoporin 62kDa (Nup62)
US9719094B2 (en) 2002-11-14 2017-08-01 Thermo Fisher Scientific Inc. RNAi targeting SEC61G
US20100113307A1 (en) * 2002-11-14 2010-05-06 Dharmacon, Inc. siRNA targeting vascular endothelial growth factor (VEGF)
US7781575B2 (en) 2002-11-14 2010-08-24 Dharmacon, Inc. siRNA targeting tumor protein 53 (p53)
US9839649B2 (en) 2002-11-14 2017-12-12 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US20090227780A1 (en) * 2002-11-14 2009-09-10 Dharmacon, Inc. siRNA targeting connexin 43
US7144999B2 (en) * 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
AU2004231740A1 (en) * 2003-04-17 2004-11-04 The Trustees Of Columbia University In The City Ofnew York Desmoglein 4 is a novel gene involved in hair growth
WO2005035759A2 (en) * 2003-08-20 2005-04-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR 1 (HIF1) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2005032486A2 (en) * 2003-10-02 2005-04-14 Duke University A NOVEL SIRNA-BASED APPROACH TO TARGET THE HIF-α FACTOR FOR GENE THERAPY
EP2270511A3 (en) 2003-10-24 2011-08-24 Immunaid Pty Ltd Method of therapy
US7605250B2 (en) * 2004-05-12 2009-10-20 Dharmacon, Inc. siRNA targeting cAMP-specific phosphodiesterase 4D
IL162276A0 (en) * 2004-06-01 2005-11-20 Hadasit Med Res Service Nucleic acid molecules as heparanase potent inhibitors, compositions and methods of use thereof
US8168601B2 (en) 2004-08-16 2012-05-01 Immune Disease Institute, Inc. Method of delivering RNA interference and uses thereof
DK2319925T3 (da) 2004-08-16 2018-11-05 Quark Pharmaceuticals Inc Terapeutiske anvendelser af RTP801-hæmmere
GB0418762D0 (en) * 2004-08-23 2004-09-22 Genomica Sau Methods and compositions to treat glaucoma
CA2578064C (en) 2004-08-23 2015-10-13 Sylentis S.A.U. Treatment of eye disorders characterized by an elevated intraocular pressure by sirnas
US7618947B2 (en) * 2004-08-25 2009-11-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of HIF-1 beta expression
US7718624B2 (en) * 2004-09-01 2010-05-18 Sitkovsky Michail V Modulation of immune response and inflammation by targeting hypoxia inducible factors
WO2006039656A2 (en) * 2004-10-01 2006-04-13 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Modified small interfering rna molecules and methods of use
US8765704B1 (en) 2008-02-28 2014-07-01 Novartis Ag Modified small interfering RNA molecules and methods of use
US7790878B2 (en) 2004-10-22 2010-09-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi modulation of RSV, PIV and other respiratory viruses and uses thereof
US7592322B2 (en) * 2004-10-22 2009-09-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi modulation of RSV, PIV and other respiratory viruses and uses thereof
DK1833840T3 (da) 2004-11-09 2010-10-18 Santaris Pharma As Micromirs
US9447138B2 (en) 2004-11-09 2016-09-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Potent LNA oligonucleotides for the inhibition of HIF-1a expression
KR100780548B1 (ko) 2004-12-08 2007-11-29 한국원자력연구원 Ｓ-아데노실 메티오닌 디카르복실라제 ｍＲＮＡ에특이적인 작은 간섭 ＲＮＡ 및 그를 유효성분으로포함하는 악성종양 치료제
TW200639253A (en) * 2005-02-01 2006-11-16 Alcon Inc RNAi-mediated inhibition of ocular targets
US20100196509A1 (en) 2005-02-28 2010-08-05 Jonathan Braun Methods for Diagnosis and Treatment of Endometrial Cancer
GB0505081D0 (en) 2005-03-14 2005-04-20 Genomica Sau Downregulation of interleukin-12 expression by means of rnai technology
WO2006113526A2 (en) 2005-04-15 2006-10-26 The Regents Of The University Of California Prevention of chlamydia infection using a protective antibody
US8318906B2 (en) 2005-04-15 2012-11-27 The Regents Of The University Of California EMP2 antibodies and their therapeutic uses
US8648052B2 (en) * 2005-04-15 2014-02-11 The Regents Of The University Of California Prevention of chlamydia infection using SIRNA
BRPI0611670A2 (pt) * 2005-06-15 2016-11-16 Fibrogen Inc método para o tratamento ou prevenção de câncer em um indivíduo
US7737265B2 (en) * 2005-06-27 2010-06-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi modulation of HIF-1 and therapeutic uses thereof
WO2007011819A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 The Penn State Research Foundation Ferritin as a therapeutic target in abnormal cells
US20080306002A1 (en) * 2005-08-18 2008-12-11 The General Hospital Corporation Combination Therapy for Preventing Angiogenesis
GB0521351D0 (en) * 2005-10-20 2005-11-30 Genomica Sau Modulation of TRPV expression levels
GB0521716D0 (en) * 2005-10-25 2005-11-30 Genomica Sau Modulation of 11beta-hydroxysteriod dehydrogenase 1 expression for the treatment of ocular diseases
US8288354B2 (en) 2005-12-28 2012-10-16 The Scripps Research Institute Natural antisense and non-coding RNA transcripts as drug targets
US8673873B1 (en) * 2005-12-28 2014-03-18 Alcon Research, Ltd. RNAi-mediated inhibition of phosphodiesterase type 4 for treatment of cAMP-related ocular disorders
TW200731980A (en) 2005-12-29 2007-09-01 Alcon Mfg Ltd RNAi-mediated inhibition of HIF1A for treatment of ocular angiogenesis
US20090175930A1 (en) * 2006-01-11 2009-07-09 Nobuhiro Yagi Composition Suppressing The Expression of Target Gene in Eyeball and Medicament For Treating of Disease in Eyeball
WO2007133758A1 (en) * 2006-05-15 2007-11-22 Physical Pharmaceutica, Llc Composition and improved method for preparation of small particles
TW200808328A (en) * 2006-06-02 2008-02-16 Alcon Mfg Ltd RNAi-mediated inhibition of stromal cell-derived factor 1-related targets for treatment of neovascularization-related conditions
DK2029746T3 (da) * 2006-06-12 2012-10-08 Exegenics Inc D B A Opko Health Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til siRNA-hæmning af angiogenese
US8138160B2 (en) * 2006-08-03 2012-03-20 Warsaw Orthopedic, Inc. Reagents, methods and systems to suppress pro-inflammatory cytokines
US7872118B2 (en) * 2006-09-08 2011-01-18 Opko Ophthalmics, Llc siRNA and methods of manufacture
US20090018094A1 (en) * 2006-12-01 2009-01-15 Loma Linda University Medical Center Inhibition of brain enzymes involved in cerebral amyloid angiopathy and macular degeneration
US20100074897A1 (en) * 2006-12-01 2010-03-25 University Of Utah Research Foundation Methods and Compositions related to HIF-1 alpha
EP2137205A2 (en) 2007-02-26 2009-12-30 Quark Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of rtp801 and their use in disease treatment
EP2121925A2 (en) * 2007-03-02 2009-11-25 MDRNA, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting ras gene expression and uses thereof
US20100112687A1 (en) * 2007-03-02 2010-05-06 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting erbb family gene expression and uses thereof
CA2679342A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting hif1a gene expression and uses thereof
US20080286866A1 (en) * 2007-03-02 2008-11-20 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting vegf gene expression and uses thereof
US20100055784A1 (en) * 2007-03-02 2010-03-04 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting wnt gene expression and uses thereof
US20080287383A1 (en) * 2007-03-02 2008-11-20 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting erbb gene expression and uses thereof
WO2008109352A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting akt gene expression and uses thereof
CN103120653B (zh) 2007-04-04 2015-09-30 希格默伊德药业有限公司 一种口服药物组合物
ES2462416T3 (es) 2007-08-06 2014-05-22 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. Producto farmacéutico que contiene un inhibidor de la expresión de HIF-1 alfa y HIF-2 alfa
WO2009039300A2 (en) * 2007-09-18 2009-03-26 Intradigm Corporation Compositions comprising hif-1 alpha sirna and methods of use thereof
JP5886523B2 (ja) * 2008-01-09 2016-03-16 ザ スキーペンズ アイ リサーチ インスティチュート インコーポレイテッド 眼の炎症性障害を処置するための治療組成物
GB0811625D0 (en) * 2008-06-25 2008-07-30 Univ Dundee Treatment of epithelial fragility disorders
US20100011138A1 (en) * 2008-07-09 2010-01-14 International Business Machines Corporation Design structure for automated means for determining internet access on a system on a chip
DE102008035012A1 (de) 2008-07-25 2010-02-04 Fritz Egger Gmbh & Co. Leichtbauplatte für den Möbelbau
CA2746527A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna interference in skin indications
MX339820B (es) 2008-10-03 2016-06-13 Curna Inc Compuestos oligonucleottidos designados para inhibir el transcrito antisentido natrual apra apolipoproteina-a1.
WO2010043630A2 (en) * 2008-10-13 2010-04-22 Sigmoid Pharma Limited A delivery system for rna
MX2011005851A (es) 2008-12-04 2011-07-29 Opko Opthalmics Llc Composiciones y metodos para la inhibicion selectiva de isoformas vegf proangiogenicas.
KR20110091796A (ko) 2008-12-04 2011-08-12 오피케이오 큐알엔에이, 엘엘씨 종양 억제 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 종양 억제 유전자 관련된 질환의 치료
KR101761424B1 (ko) 2008-12-04 2017-07-26 큐알엔에이, 인크. Ｖｅｇｆ에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 맥관 내피 성장 인자(ｖｅｇｆ) 관련된 질환의 치료
US8921329B2 (en) 2008-12-04 2014-12-30 Curna, Inc. Treatment of erythropoietin (EPO) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to EPO
US9745574B2 (en) 2009-02-04 2017-08-29 Rxi Pharmaceuticals Corporation RNA duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
DK2396038T3 (en) 2009-02-12 2016-02-01 Curna Inc TREATMENT OF BRAIN-DERIVATED NEUROTROPHIC FACTOR- (BDNF) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENCE TRANSCRIPTION TO BDNF
ES2656290T3 (es) 2009-03-16 2018-02-26 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con el factor nuclear (derivado de eritroide 2) similar al 2 (NRF2) mediante inhibición del transcrito antisentido natural a NRF2
EP2408920B1 (en) 2009-03-17 2017-03-08 CuRNA, Inc. Treatment of delta-like 1 homolog (dlk1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlk1
US20110045080A1 (en) * 2009-03-24 2011-02-24 William Marsh Rice University Single-Walled Carbon Nanotube/Bioactive Substance Complexes and Methods Related Thereto
FR2944437B1 (fr) * 2009-04-16 2013-05-10 Oreal Utilisation d'inhibiteurs de l'expression d'hif 1 alpha pour proteger la peau des dommages deleteres induits par le rayonnement uva
US8283332B2 (en) * 2009-04-17 2012-10-09 University Of Louisville Research Foundation, Inc. PFKFB4 inhibitors and methods of using the same
CN102803492B (zh) 2009-05-06 2016-06-29 库尔纳公司 通过抑制针对三重四脯氨酸(ttp)的天然反义转录物来治疗ttp相关疾病
JP5883782B2 (ja) 2009-05-06 2016-03-15 クルナ・インコーポレーテッド 脂質輸送代謝遺伝子に対する天然アンチセンス転写物の抑制による脂質輸送代謝遺伝子関連疾患の治療
JP5931720B2 (ja) 2009-05-08 2016-06-08 クルナ・インコーポレーテッド Ｄｍｄファミリーに対する天然アンチセンス転写物の抑制によるジストロフィンファミリー関連疾患の治療
DK2432455T3 (en) 2009-05-18 2015-02-16 Sigmoid Pharma Ltd A composition comprising oil droplets
NO2432881T3 (ko) 2009-05-18 2018-04-14
JP2012527248A (ja) 2009-05-22 2012-11-08 クルナ・インコーポレーテッド 転写因子ｅ３（ｔｆｅ３）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｔｆｅ３およびインスリン受容体基質２（ｉｒｓ２）関連疾患の処置
EP2982978A1 (en) 2009-05-27 2016-02-10 Immunaid Pty Ltd Methods of treating diseases
EP2435571B1 (en) 2009-05-28 2016-12-14 CuRNA, Inc. Treatment of antiviral gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an antiviral gene
JP6128846B2 (ja) 2009-06-16 2017-05-17 クルナ・インコーポレーテッド パラオキソナーゼ（ｐｏｎ１）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるｐｏｎ１遺伝子関連疾患の治療
CN102695797B (zh) 2009-06-16 2018-05-25 库尔纳公司 通过抑制针对胶原基因的天然反义转录物来治疗胶原基因相关的疾病
WO2010151671A2 (en) 2009-06-24 2010-12-29 Curna, Inc. Treatment of tumor necrosis factor receptor 2 (tnfr2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to tnfr2
KR101807324B1 (ko) 2009-06-26 2017-12-08 큐알엔에이, 인크. 다운 증후군 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 다운 증후군 유전자 관련된 질환의 치료
CA2768947C (en) 2009-07-24 2018-06-19 Opko Curna, Llc Treatment of sirtuin (sirt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (sirt)
CA2769665A1 (en) 2009-08-05 2011-02-10 Opko Curna, Llc Treatment of insulin gene (ins) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an insulin gene (ins)
CN104313027B (zh) 2009-08-11 2018-11-20 库尔纳公司 通过抑制脂连蛋白(adipoq)的天然反义转录物治疗脂连蛋白(adipoq)相关疾病
CA2770570A1 (en) 2009-08-12 2011-02-17 Sigmoid Pharma Limited Immunomodulatory compositions comprising a polymer matrix and an oil phase
WO2011022606A2 (en) 2009-08-21 2011-02-24 Curna, Inc. Treatment of 'c terminus of hsp70-interacting protein' (chip) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to chip
US9023822B2 (en) 2009-08-25 2015-05-05 Curna, Inc. Treatment of 'IQ motif containing GTPase activating protein' (IQGAP) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IQGAP
EP2480669B1 (en) 2009-09-25 2017-11-08 CuRNA, Inc. Treatment of filaggrin (flg) related diseases by modulation of flg expression and activity
US9799416B2 (en) * 2009-11-06 2017-10-24 Terrapower, Llc Methods and systems for migrating fuel assemblies in a nuclear fission reactor
EP2501409A4 (en) 2009-11-20 2015-02-18 Univ California EPITHELIAL MEMBRANE PROTEIN 2 (EMP2) AND PROLIFERATIVE VITREORETINOPATHY (PVR)
ES2661813T3 (es) 2009-12-16 2018-04-04 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con la peptidasa del factor de transcripción de membrana, sitio 1 (mbtps1) mediante inhibición del transcrito antisentido natural al gen mbtps1
JP5934106B2 (ja) 2009-12-23 2016-06-15 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド 肝細胞増殖因子（ｈｇｆ）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｈｇｆ関連性疾患の治療
EP2515947B1 (en) 2009-12-23 2021-10-06 CuRNA, Inc. Treatment of uncoupling protein 2 (ucp2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ucp2
RU2615450C2 (ru) 2009-12-29 2017-04-04 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с ядерным респираторным фактором 1(nrf1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к nrf1
WO2011090741A2 (en) 2009-12-29 2011-07-28 Opko Curna, Llc TREATMENT OF TUMOR PROTEIN 63 (p63) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO p63
JP6083735B2 (ja) 2009-12-31 2017-02-22 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド インスリン受容体基質２（ｉｒｓ２）および転写因子３（ｔｆｅ３）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるインスリン受容体基質２（ｉｒｓ２）関連疾患の治療
DK2521784T3 (en) 2010-01-04 2018-03-12 Curna Inc TREATMENT OF INTERFERON REGULATORY FACTOR 8- (IRF8) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENCE TRANSCRIPT TO IRF8
JP5963680B2 (ja) 2010-01-06 2016-08-03 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド 膵臓発生遺伝子に対する天然アンチセンス転写物の阻害による膵臓発生遺伝子疾患の治療
ES2664866T3 (es) 2010-01-11 2018-04-23 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con la globulina fijadora de hormonas sexuales (shbg) mediante inhibición del transcrito antisentido natural a shbg
CA2786568A1 (en) 2010-01-25 2011-07-28 Curna, Inc. Treatment of rnase h1 related diseases by inhibition of natural antisense transcript to rnase h1
US8962586B2 (en) 2010-02-22 2015-02-24 Curna, Inc. Treatment of pyrroline-5-carboxylate reductase 1 (PYCR1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to PYCR1
US9095504B2 (en) 2010-03-24 2015-08-04 Rxi Pharmaceuticals Corporation RNA interference in ocular indications
EP2550000A4 (en) 2010-03-24 2014-03-26 Advirna Inc RNAI COMPOUNDS OF REDUCED SIZE ADMINISTERING
CN102869777B (zh) 2010-04-02 2018-11-02 库尔纳公司 通过抑制集落刺激因子3(csf3)的天然反义转录物而治疗csf3相关疾病
TWI644675B (zh) 2010-04-09 2018-12-21 可娜公司 藉由抑制纖維母細胞生長因子２１（ｆｇｆ２１）之天然反義轉錄物以治療ｆｇｆ２１相關疾病
KR20130101442A (ko) 2010-05-03 2013-09-13 큐알엔에이, 인크. 시르투인 (sirt)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 시르투인 (sirt) 관련된 질환의 치료
TWI586356B (zh) 2010-05-14 2017-06-11 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
WO2011150005A2 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Opko Curna Llc Treatment of atonal homolog 1 (atoh1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to atoh1
RU2620978C2 (ru) 2010-05-26 2017-05-30 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с метионинсульфоксидредуктазой а (msra), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена msra
KR102008708B1 (ko) 2010-06-23 2019-08-08 큐알엔에이, 인크. 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(scna)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(scna) 관련된 질환의 치료
NO2593547T3 (ko) 2010-07-14 2018-04-14
CA2813901C (en) 2010-10-06 2019-11-12 Curna, Inc. Treatment of sialidase 4 (neu4) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to neu4
CA2815212A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Curna, Inc. Treatment of alpha-l-iduronidase (idua) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to idua
WO2012068340A2 (en) 2010-11-18 2012-05-24 Opko Curna Llc Antagonat compositions and methods of use
EP2643463B1 (en) 2010-11-23 2017-09-27 CuRNA, Inc. Treatment of nanog related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nanog
GB201020032D0 (en) 2010-11-25 2011-01-12 Sigmoid Pharma Ltd Composition
US20120310140A1 (en) 2010-12-01 2012-12-06 Spinal Modulation, Inc. Directed delivery of agents to neural anatomy
CA2823138A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Samyang Biopharmaceuticals Corporation Sirna for inhibition of hif1a expression and anticancer composition containing the same
WO2012100172A2 (en) * 2011-01-22 2012-07-26 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of hif-1a by double stranded rna
MX360349B (es) * 2011-03-29 2018-10-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para inhibir la expresion del gen de proteasa transmembrana, serina 6 (tmprss6).
CA2838588C (en) 2011-06-09 2021-09-14 Curna, Inc. Treatment of frataxin (fxn) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to fxn
KR101337767B1 (ko) * 2011-07-26 2013-12-09 서울대학교산학협력단 Ｖｅｇｆ 발현을 증가시키는 신규한 펩타이드 및 이를 함유하는 약학적 조성물
CN103874486A (zh) 2011-09-06 2014-06-18 库尔纳公司 用小分子治疗与电压门控钠通道的α亚基(SCNxA)相关的疾病
CN104427980A (zh) * 2012-03-09 2015-03-18 菲布罗根有限公司 高胆固醇的治疗
CA2867262C (en) 2012-03-15 2021-03-16 Curna, Inc. Treatment of brain derived neurotrophic factor (bdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bdnf
US9833523B2 (en) 2012-04-24 2017-12-05 The Ohio State University Pharmacokinetic determination of intravitreal agents
GB201212010D0 (en) 2012-07-05 2012-08-22 Sigmoid Pharma Ltd Formulations
GB201215857D0 (en) 2012-09-05 2012-10-24 Sylentis Sau siRNA and their use in methods and compositions for the treatment and/or prevention of eye conditions
RU2653766C2 (ru) 2012-09-05 2018-05-14 Силентис С.А.У. КиРНК И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В СПОСОБАХ И КОМПОЗИЦИЯХ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ ГЛАЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
EP2999786A1 (en) 2013-05-22 2016-03-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Tmprss6 irna compositions and methods of use thereof
WO2015020993A2 (en) * 2013-08-05 2015-02-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNAi COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF FRIEDREICH'S ATAXIA
GB201319791D0 (en) 2013-11-08 2013-12-25 Sigmoid Pharma Ltd Formulations
EP3079707A4 (en) 2013-12-02 2017-10-18 RXi Pharmaceuticals Corporation Immunotherapy of cancer
US10011837B2 (en) 2014-03-04 2018-07-03 Sylentis Sau SiRNAs and their use in methods and compositions for the treatment and/or prevention of eye conditions
CA2947270A1 (en) 2014-04-28 2015-11-05 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treating cancer using nucleic acids targeting mdm2 or mycn
KR102506169B1 (ko) 2014-09-05 2023-03-08 피오 파마슈티칼스 코프. Tyr 또는 mmp1을 표적화하는 핵산을 사용한 노화 및 피부 장애의 치료 방법
DK3215127T3 (da) 2014-11-07 2021-02-01 Sublimity Therapeutics Ltd Sammensætninger omfattende cyclosporin
WO2016085852A1 (en) 2014-11-24 2016-06-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Tmprss6 irna compositions and methods of use thereof
CA2995582A1 (en) * 2015-08-19 2017-02-23 Children's Research Institute, Children's National Medical Center Compositions and methods for treating graft versus host disease
EP4330392A1 (en) 2021-04-26 2024-03-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transmembrane protease, serine 6 (tmprss6) irna compositions and methods of use thereof
EP4372007A1 (en) * 2021-07-16 2024-05-22 NOVELTY NOBILITY Inc. HIF-1alpha INHIBITOR

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5731294A (en) * 1993-07-27 1998-03-24 Hybridon, Inc. Inhibition of neovasularization using VEGF-specific oligonucleotides
US5624803A (en) * 1993-10-14 1997-04-29 The Regents Of The University Of California In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom
US5882914A (en) * 1995-06-06 1999-03-16 The Johns Hopkins University School Of Medicine Nucleic acids encoding the hypoxia inducible factor-1
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
EP1272630A2 (en) 2000-03-16 2003-01-08 Genetica, Inc. Methods and compositions for rna interference
AU2001249622B2 (en) 2000-03-30 2007-06-07 Massachusetts Institute Of Technology RNA sequence-specific mediators of RNA interference
US20020132788A1 (en) 2000-11-06 2002-09-19 David Lewis Inhibition of gene expression by delivery of small interfering RNA to post-embryonic animal cells in vivo
US20020173478A1 (en) 2000-11-14 2002-11-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Post-transcriptional gene silencing by RNAi in mammalian cells
RU2322500C2 (ru) * 2000-12-01 2008-04-20 Макс-Планк-Гезелльшафт Цур Фердерунг Дер Виссеншафтен Е.Ф. Малые молекулы рнк, опосредующие интерференцию рнк
AU2002241154A1 (en) 2001-03-21 2002-10-03 Isis Innovation Ltd. Assays, methods and means relating to hypoxia inducible factor (hif) hydroxylase
KR20050044517A (ko) 2001-11-22 2005-05-12 바이오비트럼 에이비 11-베타-히드록시 스테로이드 탈수소효소 유형 1 의억제제
PT2264172T (pt) 2002-04-05 2017-12-06 Roche Innovation Ct Copenhagen As Compostos oligoméricos para a modulação da expressão do hif-1α.
US7521431B2 (en) * 2002-11-01 2009-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for siRNA inhibition of HIF-1 alpha

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100749859B1 (ko) * 2005-10-18 2007-08-16 연세대학교 산학협력단 ＶＥＧＦ―Ａ 특이적 ｓｉＲＮＡ를 발현하는 개선된 종양살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스
KR101492435B1 (ko) * 2012-12-28 2015-02-10 고려대학교 산학협력단 ＨＩＦ­１α ｓｉＲＮＡ를 유효성분으로 함유하는 ＴＳＬＰ에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004042024B1 (en) 2004-11-11
MXPA05004722A (es) 2005-08-03
US8236775B2 (en) 2012-08-07
US7521431B2 (en) 2009-04-21
KR20120038546A (ko) 2012-04-23
EP1562970A2 (en) 2005-08-17
US20090191263A1 (en) 2009-07-30
AU2003291678B2 (en) 2009-01-15
CA2504926C (en) 2014-01-14
IL168224A (en) 2010-12-30
US7645744B2 (en) 2010-01-12
US20100136101A1 (en) 2010-06-03
NZ540779A (en) 2008-05-30
CA2504926A1 (en) 2004-05-21
JP2006504433A (ja) 2006-02-09
WO2004042024A2 (en) 2004-05-21
EP1562970A4 (en) 2006-04-12
JP5449639B2 (ja) 2014-03-19
US20040180357A1 (en) 2004-09-16
US20120308645A1 (en) 2012-12-06
WO2004042024A3 (en) 2004-09-23
JP2011057677A (ja) 2011-03-24
AU2003291678A1 (en) 2004-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20050083855A (ko) ＨＩＦ-1 알파의 ｓｉＲＮＡ 억제를 위한 조성물 및 방법
US9150863B2 (en) Compositions and methods for siRNA inhibition of angiogenesis
US8470792B2 (en) Compositions and methods for selective inhibition of VEGF
US8227444B2 (en) Compositions and methods for inhibition of VEGF
JP2006523464A (ja) アンジオポエチン１、２、及びそれらの受容体ＴＩＥ２のｓｉＲＮＡ阻害のための組成物及びその方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
B701 Decision to grant