ES2206695T3 - Receptor de gdnf y utiolizacion del mismo. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN EL GDNFR AL , EL DOMINIO EXTRACELULAR (ECD) DEL GDNFR AL , LAS VARIANTES DEL GDNFR AL , EL GDNFR QUIMERICO (POR EJEMPLO, EL GDNFR AL INMUNOADHESINA) Y ANTICUERPOS QUE SE UNEN AL MISMO (INCLUYENDO LOS ANTICUERPOS AGONISTAS Y NEUTRALIZANTES). SE DESCRIBEN VARIOS USOS PARA ESTAS MOLECULAS, INCLUYENDO LOS METODOS PARA MODULAR LA ACTIVIDAD CELULAR Y SUPERVIVENCIA POR RESPUESTA A LOS LIGANDOS GDNFR AL , POR EJEMPLO GDNF, SUMINISTRANDO POR EJEMPLO GDNFR AL A LA CELULA. TAMBIEN SE PROPORCIONAN METODOS PARA EL USO DEL GDNFR AL , GNDF, O AGONISTAS DE LOS MISMOS, SEPARADAMENTE O EN COMPLEJO, PARA TRATAR ENFERMEDADES RENALES.

Description

Receptor de la GDNF y su utilización del mismo.

Esta solicitud hace referencia y reivindica los derechos disponibles en el código normativo de los Estados Unidos 35 USC \NAK 120 de las solicitudes de patentes americanas pendientes con Número de Serie 08/615.902, registradas el 14 de marzo de 1996, cuyas exposiciones completas se incluyen en la presente mediante referencias.

Introducción Campo de la técnica

La presente invención hace referencia a nuevas utilizaciones del factor neurotrófico derivado de células gliales ("GDNF") y a su receptor designado GDNFR y proporciona además el ácido nucleico que codifica para el GDNFR-\alpha y sus secuencias aminoacídicas. En particular, la invención hace referencia a la secuencia nativa de GDNFR\alpha, las variantes de GDNFR\alpha, las variantes de GDNFR\alpha solubles (incluyendo el dominio extracelular de GDNFR\alpha), el GDNFR\alpha quimérico y los anticuerpos que se unen al GDNFR\alpha (incluyendo los anticuerpos agonistas y neutralizantes), así como diversas utilizaciones de estas moléculas. También hace referencia a los sistemas de ensayo para detectar ligandos para el GDNFR\alpha, los sistemas de estudio de la función fisiológica del GDNF, las técnicas de diagnóstico para identificar condiciones relacionadas con el GDNF, los procedimientos para identificar moléculas homólogas a GDNFR\alpha y las técnicas terapéuticas para el tratamiento de condiciones relacionadas con el GDNF y relacionadas con el GDNFR\alpha, en particular las enfermedades hepáticas.

Antecedentes

Las enfermedades del sistema nervioso son generalmente devastadoras y a menudo conducen a la muerte. Las enfermedades neurológicas son frecuentemente crónicas, o que impone un enorme gasto social y económico. Por ejemplo, el accidente cerebro-vascular es la tercera causa de muerte en los Estados Unidos, después de las enfermedades del corazón y el cáncer. Los factores neurotróficos que son proteínas naturales como los factores de crecimiento similares a la insulina, el factor del sistema nervioso, el factor neurotrófico derivado del cerebro, la neurotrofina-3, el factor -4/5 y -6 neurotrófico de cilios, GDNF y la recién neurturina, se han propuesto como medios potenciales para aumentar específicamente la supervivencia de células neuronales con el fin de tratar enfermedades neurológicas como la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Alzheimer, el accidente cerebro-vascular, la epilepsia, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Parkinson y la neuropatía periférica. Los factores neurotróficos, o neurotrofinas, que influencian el crecimiento y el desarrollo del sistema nervioso de vertebrados, se cree que desempeñan una importante función al promover la diferenciación, la supervivencia y la función de diversos grupos de neuronas en el cerebro y la periferia. Se cree que los factores neurotróficos tienen funciones importantes de señalización en los tejidos neurales, según, en parte, a lo establecido con anterioridad con el factor de crecimiento nervioso (NGF). El NGF sostiene la supervivencia de neuronas simpáticas, sensoriales y del cerebro anterior tanto in vivo como in vitro. La administración de NGF exógeno rescata las neuronas de la muerte celular durante el desarrollo. A la inversa, la eliminación o el secuestro del NGF endógeno mediante administración de anticuerpos anti-NGF promueve la muerte celular (Heumann, J. Exp. Biol., 132:133-150 (1987); Hefti, J. Neurosci., 6:2155-2162 (1986); Thoenen y col., Annu. Rev. Physiol. 60:284-335 (1980)).

Los factores neurotróficos adicionales relacionados con el NGF ya se han identificado. Estos incluyen el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) (Leibrock y col., Nature, 341:149-152 (1989)), la neurotrofina-3 (NT-3) (Kaisho, y col., FEBS Lett. 266:187); Maisonpierre y col., Science, 247:1446 (1990); Rosenthal y col., Neuron, 4:767 (1990)) y la neurotrofina 4/5 (NT-4/5) (Berkmeier y col., Neuron, 7:857-866 (1991)). El GDNF, un miembro distante de la superfamilia del TGF-\beta y la neuritina ("NTN") son dos factores de supervivencia potentes, recientemente identificados y relacionados estructuralmente, para las neuronas del sistema nervioso central y sensorial simpáticas (Lin y col., Science 260:1130-1132 (1993); Henderson y col., Science 266:1062-1064 (1994); Buj-Bello y col., Neuron 15:821-828 (1995); Kotzbauer y col., Nature: 384-467-470 (1996)). El GDNF se ha considerado un agente terapéutico potencial para la enfermedad de Parkinson, ALS y la enfermedad de Alzheimer. El mecanismo por el cual las señales de GDNF y NTN se trasmiten no se ha elucidado todavía.

Las neurotrofinas, como el NGF, afectan a las células diana a través de las interacciones con los receptores de superficie celular. Según nuestro conocimiento, dos clases de glicoproteínas transmembrana actúan como receptores para las neurotrofinas conocidas. Los estudios de unión en equilibrio han mostrado que las células que responden a la neurotrofina poseen un receptor común de bajo peso molecular (65.000-80.000 Da) y baja afinidad, habitualmente denominado p75^{LNGFR} o p75, y un receptor de alto peso molecular (130.000-150.000 Da). Los receptores de afinidad elevada (trkA, trkB y trkC) son miembros de la familia trk de receptores tirosina quinasa.

Los receptores tirosina quinasas se conocen por servir como receptores para diversos factores proteicos que promueven la proliferación, la diferenciación y supervivencia celulares. Además de los receptores trk, ejemplos de otros receptores tirosina quinasas incluyen los receptores del factor de crecimiento epitelial (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF). En general, estos receptores se extienden por la membrana celular, con una porción del receptor que es intracelular y en contacto con el citoplasma y otra porción del receptor que es extracelular. La unión de un ligando con la porción extracelular del receptor induce una actividad tirosina quinasa en la porción del receptor, con la consiguiente fosforilación de diversas proteínas intracelulares implicadas en las vías de señalización celular.

La expresión anómala de los receptores de tirosina quinasas ("RTK") se correlaciona con la capacidad de transformación. Por ejemplo, los carcinomas del hígado, pulmón, mama y colon muestran una expresión elevada de Eph RTK. Al contrario que otras muchas tirosina quinasas, esta expresión elevada puede tener lugar en ausencia de amplificación o reordenamiento génico. Además, Hek, un RTK humano, se ha identificado como un marcador específico de leucemias en la superficie de una línea celular leucémica de célula pre-B. Al igual que con Eph, Hek también se sobreexpresa en ausencia de amplificación o reordenación génica en, por ejemplo, tumores hematopoyéticos y líneas celulares de tumores linfoides. Se halló una sobre-expresión de Myk-1 (un homólogo murino del humano Htk (Bennett y col., J. Biol. Chem., 269(19):14211-8 (1994)) en tumores mamarios invasivos y no diferenciados de ratones transgénicos que expresaban el encogen Ha-ras. (Andres y col., Oncogene, 9(5):1461-7 (1994) y Andres y col., Oncogene, 9(8).2431 (1994)). Ret, el producto del proto-oncogen c-ret, es un miembro de la superfamilia de receptores tirosina quinasa.

Además de sus funciones en la carcinogénesis, se han publicado diversas tirosina quinasas transmembrana que desempeñan funciones claves durante el desarrollo. Algunos receptores de tirosina quinasa están regulados durante el desarrollo y se expresan predominantemente en tejidos embrionarios. Ejemplos incluyen el CeK1, que pertenece a la subclase de FGF y las tirosinas quinasas Cek4 y Cek5 (Pasquale y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:5449-5453 (1989)), Sajjadi y col., New Biol., 3(8):769-78 (1991); y Pasquale, Cell Regulation, 2:523-534 (1991)). Los miembros de la familia Eph se expresan en muchos tejidos adultos distintos y algunos miembros de la familia se expresan en el sistema nervioso o específicamente en neuronas (Maisonpierre y col., Oncogene, 8:3277-3288 (1993); Lai y col., Neuron, 6:691-704 (1991)).

La expresión anómala o la regulación incontrolada de cualquiera de estos receptores de tirosina quinasa pueden resultar en distintos procesos malignos y trastornos patológicos. En consecuencia, es necesario identificar medios par regular, controlar y manipular los receptores tirosina quinasa ("RTK") y sus ligandos asociados o receptores unidos a GPI, con el fin de proporcionar medios nuevos y adicionales para el diagnóstico y terapia de los trastornos relacionados con la vía de los receptores tirosina-quinasa y los procesos celulares. La presente invención brinda al clínico y al investigador dichos medios al proporcionar una nueva molécula de unión a neurotrofina que es también específica para la interacción con un receptor RTK determinado. Se han identificado nuevas condiciones patológicas asociadas con esta molécula y su ligando neurotrofina. Estos compuestos y sus procedimientos de utilización, tal como se proporcionan aquí, permiten un nuevo y mejor control terapéutico y especificidad. De acuerdo con ello, es un objetivo de la presente invención el proporcionar una terapia mejorada para la prevención y/o tratamiento de condiciones neurológicas y otras condiciones, en donde las vías de señalización neurotrófica relacionadas con este nuevo receptor y su ligando desarrollen una función.

Estos y otros objetivos de la invención serán evidentes a los expertos en la materia después de considerar la especificación como un todo.

Resumen

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento actual de que los ratones GDNF-deficientes carecen completamente de riñones y de sistema nervioso entérico y muestran una pérdida parcial de neuronas de ganglios de la raíz dorsal (<23%), simpáticas (<35%) y de ganglios sensoriales nodulares (<40%). Los heterocigotos GDNF presentan enfermedad renal en etapa terminal a edad temprana. Así, el GDNF desempeña una función esencial en el desarrollo o la supervivencia de las neuronas renales metanéfricas y entéricas. Según ello, se proporcionan los procedimientos de tratamiento de estas y otras enfermedades relacionadas utilizando el GDNF y compuestos similares al GDNF, formando un complejo o en combinación con el receptor de GDNF.

En la presente invención se proporciona un nuevo receptor de GDNF denominado GDNFR\alpha, las formas solubles del receptor y un dominio extracelular del GDNFR\alpha ("ECD"). También se describen los polipéptidos del GDNFR\alpha, conjugados opcionalmente con, o fusionados a moléculas que aumentan sus vidas medias en el suero, y formulados opcionalmente como composiciones farmacéuticas con un vehículo aceptable fisiológicamente.

El GDNFR\alpha que retiene tanto la unión con GDFN y la función de señalización del receptor (vía el receptor tirosina quinasa Ret) se puede utilizar para transmitir, restaurar o aumentar la sensibilidad por el ligando-GDNFR\alpha de las células. Esta sensibilidad incluye la unión al ligando, la fosforilación de la tirosina de Ret y la actividad cadena debajo mediada por Ret, que puede resultar en la modulación de la actividad celular, por ejemplo, la supervivencia o el crecimiento. Las realizaciones tienen una utilización tanto in vivo, in vitro como ex vivo. Los compuestos de la invención hallan una utilización en el tratamiento de las condiciones conocidas por estar asociadas con GDNF, así como las condiciones identificadas de nuevo descritas aquí. El GDNFR\alphaECD que se une al GDNF, pero que no media la señal de GDNF, puede utilizarse como un antagonista para secuestrar el ligando del GDNF y reducir la activación del GDNFR\alpha endógeno. Ello es útil en condiciones caracterizadas por un exceso de ligando GDNF y/o un exceso de activación de GDNFR\alpha en un mamífero.

Las composiciones farmacéuticas del GDNFR\alpha soluble, preferentemente el ECD, incluyen además un ligando de GDNFR\alpha, preferentemente el GDNF. Dichas composiciones, que comprenden un complejo de ligando/GDNFR\alpha, se utilizan si es deseable prolongar la vida media del ligando, proporcionar una liberación prolongada y lenta del ligando, transmitir una sensibilidad por el ligando de GDNFR\alpha a una célula diana y/o activar o aumentar directamente la actividad celular endógena del GDNFR\alpha o del Ret. Opcionalmente, la composición comprende además una o más citoquinas, factores neurotróficos, o sus anticuerpos agonistas.

Se describen las moléculas de GDNFR\alpha quiméricas como las inmunoadhesinas de GDFNER\alpha (con una vida media larga en suero) y el GDNFR\alpha etiquetado epitópicamente. Estos hallan una utilización particular como formas solubles de GDNFR\alpha, en particular en los complejos para la liberación de GDNF o para la transmisión a las células de la capacidad de respuesta a GDNF. Las inmunoadhesinas (por ejemplo, combinando una actividad de unión de GDN-FR\alpha-ligando con un dominio de unión a ligando de otra citoquina o receptor de factor neurotrófico) puede formar complejos de unión de alta afinidad para ligandos de GDNFR\alpha en combinación con otros factores o para la liberación dirigida.

También se proporcionan procedimientos para la identificación de una molécula que se une a y/o activa el GDNFR\alpha. Así, se proporcionan ensayos para cribar o identificar moléculas de ligandos de GDNFR\alpha (como péptidos, anticuerpos y pequeñas moléculas) que son agonistas o antagonistas de GDNFR\alpha. Dichos procedimientos implican generalmente la exposición de un GDNFR\alpha inmovilizado a una molécula sospechosa de unirse a éste y la determinación de la unión de la molécula al GDNFR\alpha inmovilizado y/o la evaluación de si o no la molécula activa (o bloquea la activación) del GDNFR\alpha. Con el fin de identificar estos ligandos de GDNF, el GDNFR\alpha se puede expresar en la superficie de una célula y utilizar para cribar librerías de compuestos candidatos sintéticos o de compuestos que se producen de forma natural (p.ej., de fuentes endógenas como el suero o células). El GDNFR\alpha puede también utilizarse como herramienta diagnóstico para cuantificar los niveles séricos del ligando de GDNFR\alpha endógeno o exógeno.

En otra realización, se proporciona un procedimiento para la purificación de un ligando de GDNFR\alpha. Esto halla una utilización en la producción comercial y la purificación de moléculas activas terapéuticamente que se unen a este receptor. En una realización, la molécula de interés (generalmente en una composición que comprende uno o más contaminantes) se adsorbe al GDNFR\alpha inmovilizado (p.ej., inmunoadhesina de GDNFR\alpha inmovilizada en una resina de proteína A). Los contaminantes, en virtud de su incapacidad de unirse al GDNFR\alpha, no se unirán normalmente a la resina. De acuerdo con ello, es posible recuperar la molécula de interés de la resina cambiando las condiciones de elución, de modo que la molécula ligando se libere del receptor inmovilizado.

Se proporcionan anticuerpos que se unen específicamente al GDNFR\alpha. Los anticuerpos preferidos son anticuerpos monoclonales que no son inmunogénicos en el hombre y se unen a un epitopo en el dominio extracelular. Los anticuerpos preferidos se unen al GDNFR\alpha con una afinidad de por lo menos 10^{6} l/mol, más preferentemente de 10^{7}l/mol. Los anticuerpos preferidos son anticuerpos agonistas.

Los anticuerpos que se unen al GDNFR\alpha, pueden fusionarse opcionalmente a un polipéptido heterólogo. El anticuerpo o fusión son especialmente útiles en el aislamiento y purificación de GDNFR\alpha de una fuente del receptor.

En otro aspecto se proporciona un procedimiento para la detección del GDNFR\alpha in vitro o in vivo que incluye las etapas de contacto de un anticuerpo GDNFR\alpha con una muestra sospechosa de contener un receptor y de detección de la unión.

En algunas aplicaciones, es deseable disponer de un anticuerpo agonista. Dichos anticuerpos agonistas son útiles para activar el GDNFR\alpha, tal como se describe para los ligandos de GDNFR\alpha como el GDNF. Además, estos anticuerpos son útiles para tratar condiciones en las que una cantidad efectiva de activación de GDNFR\alpha conduce a un beneficio terapéutico en el mamífero. Por ejemplo, el anticuerpo agonista se puede utilizar para generar una respuesta a GDNF en una célula que contiene el GDNFR\alpha y, preferentemente, Ret. Para las aplicaciones terapéuticas es deseable preparar una composición que tenga el anticuerpo agonista y un vehículo aceptable fisiológicamente. Opcionalmente, la composición contiene además uno o más citoquinas, factores neurotróficos o sus anticuerpos agonistas.

En otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante. Dichas moléculas se pueden utilizar para tratar condiciones caracterizadas por la activación no deseada o excesiva de GDNFR\alpha.

Además de lo anterior, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas, los vectores de expresión y las células huésped que codifican para GDNFR\alpha, GDNF, o agonistas de lo mismo, que pueden utilizarse en el producción de GDNFR\alpha recombinante, GDNF, o agonistas de lo mismo, tal como se describe aquí. Las moléculas de ácido nucleico aisladas y los vectores también se pueden utilizar para preparar animales transgénicos, para aplicaciones de terapia génica para tratar pacientes con defectos en el GDNFR\alpha o el GDNF, para incrementar la capacidad de respuesta de las células a los ligandos de GDNFR\alpha, o alternativamente para disminuir la actividad del GDNFR\alpha o el GDNF (utilizando un ácido nucleico antisentido).

Descripción resumida de las figuras

Las Figuras 1A-1E muestran la secuencia de ácido nucleico de la cadena de sentido de transcripción 5'-3' del cDNA que codifica para el GDNFR\alpha de tamaño completo y la secuencia aminoacídica deducida del GDNFR\alpha de tamaño completo. Los nucleótidos se enumeran desde el inicio de la cadena de sentido de transcripción 5'-3'. Los residuos aminoacídicos se enumeran desde el inicio de la secuencia aminoacídica.

La Figura 2 muestra la secuencia aminoacídica de GDNFR\alpha y sus características. El péptido señal está subrayado; el sitio de corte de la señal putativa está marcado con una flecha; los sitios potenciales de glicosilación están enmarcados en un recuadro; el elemento del dominio hidrofóbico del sitio de unión de GPI está subrayado con una doble línea; los tres aminoácidos subrayados (A-S-S) constituyen el sitio de corte/unión del anclaje de GPI; las cisteínas se muestran en negrita. El dominio extracelular ("ECD") está flanqueado por el péptido señal y el sitio de unión a GPI.

La Figura 3 muestra los resultados del PAGE de los experimentos de unión. Se muestra la unión de GDNF-I125 con las células que expresan el GDNFR\alpha (carriles 1,2) o con las células control (carriles 3, 4) en ausencia (carriles 1,3) o presencia (carriles 2, 4) de un exceso de GDNF no marcado. Las proteínas unidas (85 KD, 180 KD, 200 KD) que son desplazables por el GDNF no marcado se hallan en las células que expresan el GDNFR\alpha, pero no en las células control.

La Figura 4 muestra la unión de GDNF-I^{125} con las células que expresan el GDNFR\alpha y el desplazamiento por el GDNF. La representación de Scatchard (recuadro) muestra un valor de Kd de 63 pM determinado por el programa IGOR.

La Figura 5 muestra un análisis de selección por FACS de células que expresan el GDNFR\alpha después del tratamiento con PIPLC. Los gráficos están marcados para cada muestra. "Control" representa las células que expresan una proteína de superficie celular control. La línea de trazo ("GDNF+PIPLC") representa las células que expresan el GDNFR\alpha que se trataron durante 1 h a 37ºC con 2 \mug/ml de PIPLC. Los círculos ("GDNF") representan las células que expresan el GDNFR\alpha no tratadas con PIPLC. Un desplazamiento hacia la derecha indica la unión a GDNF. El tratamiento de las células que expresan el GDNFR\alpha con PIPLC conduce a una reducción de aproximadamente el 90% de la cantidad de unión de GDNF.

La Figura 6 muestra la respuesta de neuronas sensoriales de nódulos de pollo E6 al GDNF antes y después del tratamiento con PIPLC. El tratamiento con PIPLC reduce la supervivencia celular en presencia de GDNF por encima del 50%. En cambio, el PIPLC no cambia la respuesta a BDNF. Las neuronas de los ganglios nodales de pollo E6 se aislaron, se prepararon y plaquearon y crecieron en pocillos por triplicado tal como se describió anteriormente (Buj-Bell y col., Neuron, 15:821-828 (1995)). Se añadió PIPLC (4 \mug/Ml) a las muestras indicadas 1 hora antes al igual que 12 a 24 h después de la adición de GDNF (10 ng/ml u otra concentración indicada) y BDNF (1 ng/ml).

La Figura 7 muestra la respuesta de las motoneuronas espinales de rata E14 a GDNF antes y después del tratamiento con PIPLC. El tratamiento con PIPLC reduce la supervivencia de las motoneuronas en la presencia de GDNF por encima de un 90% sin alterar la respuesta a BDNF. Las motoneuronas de embriones de rata se prepararon, se cultivaron y se contaron tal como se describió anteriormente (Bloch-Gallego y col., Development, 111:221-232 (1991); Camu y col., J. Neurosci. Meth. 44:59-70 (1992); Henderson y col., Nature, 363:266-270 (1993)). Los experimentos se realizaron por triplicado y se muestra el número de motoneuronas supervivientes por cm^{2} después del cultivo durante 50 h. Las motoneuronas se trataron con la cantidad de PIPLC indicada 1 h antes, y 15 h después de la adición de GDNF (a las concentraciones indicadas). CNTF (10 ng/ml), factor inhibidor de leucemia (LIF) (10 ng/ml) o BDNF (1 ng/ml).

La Figura 8 muestra la respuesta de las neuronas primarias estándares sensibles a NGF en cultivo al GDNF antes y después del tratamiento con PIPLC. El tratamiento con PIPLC reduce la supervivencia de las neuronas en presencia de GDNF por encima del 50% sin alterar la respuesta a NGF.

Las Figuras 9A, 9B y 9C muestran la supervivencia dependiente de GDNFR\alpha e inducida por GDNF de las poblaciones neuronales específicas. La Figura 9A muestra la respuesta de la supervivencia de neuronas sensoriales, trigémicas, nodulares y simpáticas de embriones de pollo, de motoneuronas espinales y de neuronas dopaminérgicas de rata al GDNF u otros factores de crecimiento después del tratamiento con PIPLC. El PIPLC reduce la supervivencia en presencia de GDNF o CNTF en un 50-90% sin alterar la respuesta a BDNF, NGF o TGF\beta. La Figura 9B muestra la supervivencia aumentada de las motoneuronas tratadas con PIPLC en presencia de GDNFR\alpha soluble ("sR\alpha"), que restaura la respuesta de las motoneuronas tratadas con PIPLC a GDNF. La actividad trófica del GDNFR\alpha en estos experimentos se piensa que es debida a los niveles bajos de GDNF posiblemente asociado con esta preparación. La Figura 9C muestra la respuesta del sobrecrecimiento de neuritas de las células PC12 a la combinación de GDNFR\alpha soluble (sR\alpha) y de GDNF. El GDNFR\alpha soluble proporciona la capacidad de respuesta a GDNF por las células PC12. Se ha representado el número de neuritas portadas por las células vivas por campo microscópico.

Las Figuras 10A, 10B, 10C y 10D muestran la implicación de Ret en la respuesta a GDNF. La Figura 10A muestra que la autofosforilación de tirosinas inducida por GDNF de Ret depende de GDNFR\alpha. La estimulación de la fosforilación de tirosinas de Ret se observó en las células Neuro-2a y SK-N-SH (SK) que no fueron tratadas con PIPLC después de la exposición a únicamente GDNF (los 2 carriles de la izquierda). La fosforilación de Ret se incrementó además en presencia de GDNFR\alpha soluble ("+sR\alpha"). No se observó estimulación de la fosforilación de Ret se observó en las células tratadas con PIPLC (+PIPLC), salvo que el GDNF se añadiera junto con el GDNFR\alpha ("+PIPLC+sR\alpha"). La Figura 10B muestra la unión de competición de GDNF-I^{125} a las células que expresan el GDNFR\alpha o el Ret. El GDNF no se une con el Ret con una elevada afinidad. La Figura 10C muestra la inmunoprecipitación de un complejo de GDNF, GDNFR\alpha y Ret, que se formó sobre la superficie celular. Células no transfectadas (Co). Células transfectadas con solo el Ret (Ret). Células transfectadas con Ret y GDNFR\alpha (R\alpha +Ret). En todos los casos, las células se expusieron a GDNF (100 ng/ml) y luego se procesaron para la inmunoprecipitación con antisuero GDNF. La presencia de complejos inmunes entre el GDNF y el Ret se determinó a continuación en una transferencia de western con el antisuero Ret. Se formó el complejo GDNFR\alpha/Ret. La formación del complejo se estimuló mediante GDNF. (R\alpha)= células transfectadas con sólo el GDNFR\alpha etiquetado epitópicamente. (Ret) = células transfectadas con únicamente el Ret. (R\alpha+Ret) = células transfectadas con Ret y un GDNFR\alpha etiquetado epitópicamente. Después de la transfección, las células se trataron con GDNF (+) o no se trataron (-), a la izquierda, y luego se procesaron para la inmunoprecipitación con antisuero Ret. A continuación, se determinó la presencia de complejos inmunes entre Ret y GDNFR\alpha con una transferencia de Western con el antisuero contra la diana epitópica de GDNFR\alpha. Los complejos inmunes entre el GDNFR\alpha y el Ret se formaron en presencia de GDNF.

Descripción detallada

En la descripción de la presente invención, se utilizarán los siguientes términos que se definen a continuación.

Los términos "GDNFR\alpha" o "polipéptido GDNFR\alpha" cuando se utilizan aquí abarcan la secuencia nativa del GDNFR\alpha, las variantes del GDNFR\alpha, el dominio extracelular del GDNFR\alpha y el GDNFR\alpha quimérico (cada uno de los cuales se define aquí). Opcionalmente, el GDNFR\alpha no está asociado con la glicosilación nativa. La "glicosilación nativa" hace referencia a las porciones de carbohidrato que están unidas covalentemente con el GDNFR\alpha cuando se produce en la célula de mamífero de donde proceden de forma natural. Según ello, el GDNFR\alpha humano producido en una célula no-humana es un ejemplo de un GDNFR\alpha que puede "no estar asociado con la glicosilación nativa". A veces, el GDNFR\alpha no está glicosilado (p.ej., como resultado de ser producido de forma recombinante en un procariota).

Un "GDNFR\alpha de secuencia nativa" comprende un polipéptido con la misma secuencia aminoacídica que un GDNFR\alpha de origen natural. Así, un GDNFR\alpha de secuencia nativa puede tener la secuencia aminoacídica nativa del GDNFR\alpha de rata, del GDNFR\alpha murino, del GDNFR\alpha humano o del GDNFR\alpha de cualquier otra especie de mamíferos. Dichos polipéptidos GDNFR\alpha de secuencia nativa se pueden aislar de la naturaleza o se pueden producir mediante medios recombinantes o sintéticos. El término "GDNFR\alpha de secuencia nativa" abarca específicamente las formas truncadas de origen natural del GDNFR\alpha, las formas variante de origen natural (p.ej., las formas ayustadas de forma alternativa) y las variantes alélicas naturales del GDNFR\alpha. El GDNFR\alpha de secuencia nativa preferido es un GDNFR\alpha de secuencia nativa maduro. La secuencia del GDNFR\alpha para la rata se muestra en las Figuras 1A-1E. Las moléculas preferidas son las que comprenden una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar en condiciones de hibridación moderada, y más preferentemente en condiciones astringentes, con la secuencia de DNA que codifica para el receptor GDNF de rata que se muestra en la Figura 1A-1E. En una realización, el ácido nucleico de GDNFR hibrida a 42ºC en formamida al 20% con la secuencia del DNA que codifica para el receptor de GDNF, que se muestra en la Figura 1A-1E. En otra realización, una molécula de ácido nucleico de GDNFR es capaz de hibridar a 42ºC en formamida al 20% con una secuencia de DNA de por lo menos 10 bases contiguas y preferentemente de por lo menos 20 bases, más preferentemente al menos de unas 45 bases y aún más preferentemente con por lo menos 60 bases que codifican para el receptor de GDNF completo y que se muestra en las Figuras 1A-1E. Las secuencias preferidas no hibridan con otras secuencias del receptor de la neurotrofina en condiciones similares.

De modo similar, el "GDNF" abarca las secuencias nativas del GDNF, las variantes de GDNF, el pre-pro-GDNF, el GDNF maduro y el GDNF quimérico. Opcionalmente, el GDNF no se asocia con la glicosilación nativa. El GDNF puede no estar glicosilado (p.ej., como resultado de haber sido producido de forma recombinante en un procariota). Una "secuencia nativa de GDNF" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia aminoacídica que un GDNF de origen natural (ver Lin y col., Science, 260:1130-1132 (1993) y la patente internacional WO 93/06116, que se ha incorporado aquí en su totalidad). Así, un GDNF de secuencia nativa puede tener la secuencia aminoacídica nativa del GDNF de rata, GDFN murino, o GDNF de cualquier otra especie mamífera. Dichos polipéptidos GDNF de secuencia nativa se pueden aislar o pueden producirse por medios recombinantes o sintéticos. El término "GDNFR\alpha de secuencia nativa" abarca específicamente las formas truncadas de origen natural del GDNF, las formas variantes de origen natural (p.ej., las formas de ayuste alternativo) y las variantes alélicas naturales del GDNF. El GDNF preferido de secuencia nativa es un GDNF humano maduro de secuencia nativa.

El "dominio extracelular de GDNFR\alpha" (ECD) es una forma del GDNFR\alpha que está esencialmente libre de los dominios transmembrana y citoplasmático del GDNFR\alpha, es decir, tiene menos del 1% de dichos dominios, preferentemente del 0,5 al 0% de dichos dominios y más preferentemente del 0,1 al 0% de dichos dominios. Habitualmente, el ECD de GDNFR\alpha tendrá una secuencia aminoacídica con por lo menos un 60% de identidad de secuencia con la secuencia aminoacídica del ECD de un GDNFR\alpha, por ejemplo tal como se indica en las Figuras 1A-1E para el GDNFR\alpha o las secuencias correspondientes aquí proporcionadas, p.ej., secuencias de ratón, secuencias humanas, preferentemente por lo menos el 65%, más preferentemente por lo menos el 75% y aún más preferentemente por lo menos el 89% y todavía mejor el 90%, con una preferencia deseada del 95% y mejor del 99% de identidad de secuencia aminoacídica y por último una identidad del 100%, incluyendo las variantes del GDNFR\alpha tal como se definió anteriormente. Las secuencias preferidas serán por lo menos de 16 aminoácidos de largo, preferentemente de por lo menos 20 aminoácidos de largo e incluso de más preferentemente de por lo menos 40 aminoácidos de largo.

El término "variante de GDNFR\alpha" (o variante "GDNF") hace referencia a un GDNFR\alpha (o GDNF) activo biológicamente, tal como se define más adelante con una identidad de secuencia inferior al 100% (pero con por lo menos una identidad del 60%) con un GDNFR\alpha (o GDNF humano; ver Lin y col., Science, 260:1130-1132 (1993); patente internacional WO 93/06116), por ejemplo, con la secuencia aminoacídica deducida que se muestra en las Figuras 1A-1E para GDNFR\alpha o con las secuencias proporcionadas aquí. Dichas variantes incluyen los polipéptidos en donde uno o aproximadamente uno de cada 30 residuos de aminoácidos se deleciona y opcionalmente se sustituye por uno o más residuos aminoacídicos; y derivados de los anteriores polipéptidos, en donde un residuo aminoacídico se ha modificado covalentemente de modo que el producto resultante tiene un aminoácido que no se forma de modo natural. Habitualmente, una variante biológica activa tendrá una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de por lo menos el 60% de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica de un GDNFR\alpha natural (p.ej., tal como se muestra en la Figura 1A-1E o en las secuencias correspondientes aquí proporcionadas), o de un GDNF humano, preferentemente de por lo menos el 65%, más preferentemente de por lo menos el 75%, aún más preferentemente de por lo menos el 80%, todavía más preferentemente de por lo menos el 95% de identidad de secuencia aminoacídica y por último del 100% de identidad. Un "GDNFR\alpha quimérico" es un polipéptido que comprende un GDNFR\alpha de tamaño completo o uno o más dominios de lo mismo (p.ej., el dominio extracelular) fusionado o unido a un polipéptido heterólogo. El GDNFR\alpha quimérico compartirá, generalmente, por lo menos una característica biológica en común con el GDNFR\alpha. Ejemplos de GDNFR\alpha quiméricos incluyen las inmunoadhesinas y el GDNFR\alpha etiquetado con un epitopo. Un "GDNF quimérico" es un polipéptido que comprende un GDNF maduro fusionado o unido a un péptido heterólogo, preferentemente otro factor neurotrófico o citoquina.

El término "imnunoadhesina" se utiliza de forma intercambiable con la expresión "quimera de GDNFR\alpha-inmunoglobulina" y hace referencia a una molécula quimérica que combina una porción del GDNFR \alpha (generalmente el dominio extracelular de éste) con una secuencia de inmunoglobulina. La secuencia de inmunoglobulina preferentemente, pero no necesariamente, es un dominio constante de inmunoglobulina. La porción de inmunoglobulina en las quimeras de la presente invención puede obtenerse a partir de los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA, IgE, IgD o IgM, pero preferentemente de IgG1 o IgG3.

El término "etiquetado con un epitopo" cuando se utiliza aquí hace referencia a un polipéptido quimérico que comprende el GDNFR\alpha (o el GDNF) fusionado a un "polipéptido etiqueta". Dicho polipéptido etiqueta tiene bastantes residuos para proporcionar un epitopo contra el que se pueden generar anticuerpos, pero es lo bastante corto como para no interferir con la actividad biológica del GDNFR\alpha o del GDNF. También preferentemente, el polipéptido etiqueta es casi seguramente único, a fin de que el anticuerpo contra éste no reaccione de forma cruzada con otros epitopos. Los polipéptidos etiqueta adecuados tienen generalmente 6 residuos de aminoácidos por lo menos y generalmente entre aproximadamente 8-50 residuos de aminoácidos (preferentemente entre 9-30 residuos. Las secuencias preferidas son la poli-histidina, que une el níquel, permitiendo el aislamiento de proteínas etiquetadas mediante cromatografía por Ni-NTA, tal como se describe en Lindsay y col., Neuron 17:571-574 (1996)), por ejemplo.

Los términos "GDNFR\alpha aislado" o "GDNF aislado" hacen referencia a un material que ha sido purificado a partir de una fuente natural, o se ha preparado mediante recombinación, o procedimientos sintéticos y está suficientemente libre de otros péptidos o proteínas para (1) obtener por lo menos 15 y preferentemente 20 residuos d e aminoácidos del extremo N-terminal o de una secuencia aminoacídica interna, utilizando un secuenciador "spin-cup" o el mejor secuenciador de aminoácidos disponible comercialmente, o realizando las modificaciones especificadas en los procedimientos de esta solicitud; o (2) para homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no-reductoras utilizando Coomassie blue o, preferentemente, tinción de plata. La homogeneidad aquí significa menos de aproximadamente un 5% de contaminación con otras proteínas de origen natural.

El término proteína "esencialmente pura" hace referencia una composición que comprende por lo menos el 90% en peso de la proteína, preferentemente por lo menos el 95% en peso. Proteína "esencialmente homogénea" significa una composición que comprende por lo menos el 99% en peso de proteína, según el peso total de la composición.

"Propiedad biológica" cuando se utiliza junto con "GDNF", "GDNFR\alpha", o "GDNFR\alpha aislado" significa que tiene una función o actividad inductora o antigénica que está causada directa o indirectamente, o generada por la secuencia nativa de GDNF o GDNFR\alpha (en su conformación nativa o desnaturalizada). Las funciones inductoras incluyen la unión del ligando o la unión del receptor, y el incremento de la supervivencia, diferenciación y/o proliferación de las células (especialmente la proliferación de células). Sin embargo, las funciones inductoras no incluyen la posesión de un sitio epitópico o antigénico capaz de reaccionar de forma cruzada con anticuerpos generados contra el GDNF o el GDNFR\alpha de secuencia nativa.

El término "función antigénica" hace referencia a la posesión de un sitio epitópico o antigénico capaz de reaccionar de forma cruzada con anticuerpos generados contra el GDNF o el GDNFR\alpha de secuencia nativa. La principal función antigénica de un polipéptido es que se una con una afinidad de por lo menos 10^{6} l/mol con un anticuerpo generado contra el GDNF o el GDNFR\alpha de secuencia nativa. Habitualmente, el polipéptido se une con una afinidad de por lo menos 10^{7} l/mol. Los anticuerpos que se utilizan para definir una "función antigénica" son los anticuerpos policlonales de conejo generados mediante formulación del antígeno en adyuvante completo de Freund, inyectando subcutáneamente la formulación y reforzando la respuesta inmune mediante inyección intraperitoneal de la formulación hasta que el título de anticuerpos alcance la fase de meseta en la curva de producción de anticuerpos.

El término "activo biológicamente" cuando se utiliza junto con "GDNF", "GDNFR\alpha", o el "GDNFR\alpha aislado" hace referencia a un polipéptido que presenta o comparte una función inductora de GDNF o GDNFR\alpha de secuencia nativa y que puede además (pero no lo necesita) tener una función antigénica. Una función inductora principal del GDNFR\alpha es la capacidad de unirse al GDNF. Otra función inductora principal del GDNFR\alpha es activar la Ret tirosina quinasa (dando como resultado la autofosforilación de Ret) para activar las vías cadena abajo mediadas por la función de señalización de Ret.

"Activo antigénicamente" se define como un polipéptido que posee una función inductora de GDNF o GDNFR\alpha y que puede además (pero no lo necesita) tener una función inductora.

El "porcentaje de identidad de secuencia aminoacídica" se define aquí como el porcentaje de residuos aminoacídicos en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos en la secuencia de GDNF o GDNFR\alpha, después de alinear las secuencias e introducir los huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones, deleciones, o inserciones internas, o N- o C-terminales en la secuencia de los GDNF o GDNFR\alpha candidatos deberían realizarse si afectan la identidad de secuencia.

El ligando "GDNF" es una molécula que se une a y activa preferentemente una secuencia nativa de GDNFR\alpha. La capacidad de una molécula para unirse a GDNFR\alpha puede determinarse, por ejemplo, mediante la capacidad del ligando putativo para unirse a la inmunoadhesina de GDNFR\alpha. La especificidad de unión puede determinarse comparando la unión a otros receptores de factores neurotróficos o de citoquinas, en particular de la superfamilia del TGF-\beta. Se debería observar como mínimo una diferencia de unión de dos veces. La capacidad para competir con la unión de GDNF o GDNFR\alpha es una propiedad preferida de un ligando de GDNF. El ensayo de incorporación de timidina proporciona otros medios para el cribaje de ligandos que activan la función de GDNFR\alpha.

Se puede utilizar un "ensayo de incorporación de timidina" para cribar las moléculas que activen el GDNFR\alpha. Con el fin de realizar este ensayo, las células Baf3 dependientes de IL-3 (Palacios y col., Cell, 41:727-734 (1985)) se transfectan establemente con la secuencia nativa de tamaño completo de GDNFR\alpha, tal como se describió anteriormente, y con Ret. Las células GDNFR\alpha/Ret/Baf3 generadas de este modo se privan de IL-3 durante 24 h en un incubador humidificado a 37ºC en CO2 al 5% y aire. Después de la carencia de IL-3, las células se plaquean en frascos de cultivo de 96 pocillos con, o sin, una muestra test que contenga un agonista potencial (dichas muestras test se diluyen opcionalmente) y se cultivan durante 24 h en un incubador de células en cultivo. Se añaden 20 \mul de medio RPMI sin suero con 1 \muCi de timidina-H^{3} a cada pocillo durante las últimas 6-8 horas. A continuación, las células se cosechan en placas de filtrado de 96 pocillos y se lavan con agua. Luego, se realiza el contaje de radioactividad de los filtros con un contador de centello Packard Count Microplate Scintillation Counter, por ejemplo. Se espera que los agonistas induzcan un aumento significativo estadísticamente (con un valor de P de 0,05) en la incorporación de H^{3}, en relación con el control. Los agonistas preferidos conducen a un incremento en la incorporación de H^{3} de por lo menos dos veces superior al del control. En la presente invención, se describen también otros ensayos.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que normalmente se halla asociada en origen con el ácido nucleico del GDNF o del GDNFR\alpha. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta en la forma o el ajuste en que se halla en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas se diferencian en consecuencia de las moléculas de ácido nucleico que ya existen en las células de forma natural. La molécula de ácido nucleico de GDNFR\alpha (o GDNF) aislada incluirá las moléculas de ácido nucleico del GDNFR\alpha (o GDNF) contenidas en las células que normalmente expresan el GDNFR\alpha (o GDNF), aún cuando, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se halle en una localización cromosómica distinta a la que existe en las células de forma natural.

La expresión "secuencias control" hace referencia a secuencias de DNA necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped en particular. Las secuencias control que son adecuadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente unido a una secuencia operativa, un sitio de unión a ribosomas y, posiblemente, otras secuencias todavía poco conocidas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y secuencias intensificadoras de la transcripción.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el DNA de una presecuencia o secuencia líder está unido operativamente con el DNA de un polipéptido si éste se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o secuencia intensificadora de la transcripción está unida operativamente con una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está localizado para facilitar la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de DNA unidas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en la misma fase de lectura. Sin embargo, las secuencias intensificadoras de la transcripción no tienen porqué ser contiguas. La unión se logra ligándolas en dianas de restricción convenientes. Si dichas dianas no existen, se utilizarán adaptadores o engarces oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Tal como se utiliza aquí, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se emplean de forma intercambiable, incluyendo en todas estas denominaciones la progenie. Así, los términos "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula determinada primaria y los cultivos derivados de ella sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entenderá que toda progenie no tiene porqué ser expresamente idéntica en contenido de DNA, debido a las mutaciones deliberadas o aleatorias que se produzcan. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la de la célula transformada originalmente. Si se pretendieran diferentes denominaciones, será evidente por el contexto.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y abarca específicamente los anticuerpos monoclonales, las composiciones de anticuerpo con especificidad poliepitópica, los anticuerpos biespecíficos y las moléculas de cadena sencilla, así como los fragmentos de anticuerpos (p.ej., FAb, F(ab')2 y Fv), siempre que presenten la actividad biológica deseada.

El término "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza aquí, hace referencia a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos esencialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales de la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que puedan presentarse en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y están dirigidos contra un sitio antigénico único. Además, al contrario de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que incluyen anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes (epitopos) distintos, cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un determinante único en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales presentan ventajas, ya que se sintetizan por hibridomas en cultivo sin contaminarse con otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter de un anticuerpo que ha sido obtenido a partir de una población esencialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que se necesite una producción del anticuerpo por ningún procedimiento especial. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente invención puede generarse por el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col., Nature, 256:495 (1975), o pueden producirse mediante procedimientos del DNA recombinante (ver, p.ej., la patente americana U.S. 4.816.567 (Cabilly y col.)). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de librerías de anticuerpos utilizando las técnicas descritas, por ejemplo, en Claxon y col., 624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen específicamente los anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas), en donde una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos determinados, mientras que el resto de la cadena(s) es idéntica una homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como los fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (Cabilly y col., supra; Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no-humanos (p.ej., murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, las cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de lo mismo (como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión al antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulinas no-humanas. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en donde los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una CDR de especies no-humanas (anticuerpo donante) como el ratón, rata o conejo con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos ejemplos, se reemplazan residuos de la región de entramado de Fv (FR) de las inmunoglobulinas humanas por los residuos no-humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se hallen en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de entramado o de CDR importadas. Estas modificaciones se realizan para mejorar y optimizar la realización del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá esencialmente todos, o por lo menos uno y más generalmente dos dominios variables, en los que todas o esencialmente todas las regiones CDR correspondan con las de una inmunoglobulina no-humana y todas o esencialmente todas las regiones FR sean las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimo comprenderá también por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), en general la de una inmunoglobulina humana. Para mayores detalles, ver Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann y col., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo Primatized^{TM}, en donde la región de unión antigénica del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido mediante inmunización de monos macacos con el antígeno de interés.

"No-inmunogénico en el hombre" significa que tras el contacto con el polipéptido de interés en un vehículo fisiológicamente aceptable y en una cantidad efectiva terapéuticamente con el tejido adecuado de un hombre, no se demuestra ningún estado de sensibilidad, o de resistencia con el polipéptido de interés después de la segunda administración de dicho polipéptido tras un período de latencia adecuado (p.ej., de 8 a 14 días).

El término "anticuerpo agonista" hace referencia a un anticuerpo que es un ligando de GDNFR\alpha, capaz de activar el GDNFR\alpha de secuencia nativa.

Un "anticuerpo neutralizante" es uno que es capaz de bloquear o reducir de forma significativa una función inductora del GDNF o GDNFR\alpha de secuencia nativa. Por ejemplo, un anticuerpo neutralizante puede inhibir o reducir la activación del GDNFR\alpha mediante un ligando GDNF, tal como se determinó, por ejemplo, en ensayos de supervivencia de neuritas, un ensayo de unión de GDNF, u otro ensayo mostrado aquí o conocido en la materia.

El término "aumento de la proliferación de una célula" abarca la etapa de aumento de la extensión del crecimiento y/o la reproducción de la célula en relación con una célula no tratada in vitro o in vivo. Un incremento en la proliferación celular de un cultivo de células puede detectarse contando el número de células antes y después de la exposición a una molécula de interés. La magnitud de la proliferación puede cuantificarse mediante examen microscópico o por el grado de confluencia. La proliferación celular puede también cuantificarse utilizando el ensayo de incorporación de timidina descrito aquí.

Mediante "aumento de la diferenciación de una célula" se hace referencia al acto de aumentar la magnitud de la adquisición o posesión de una o más características o funciones distintas a las de la célula original (es decir, la especialización celular). Esto se puede detectar mediante cribaje de un cambio en el fenotipo de la célula (p.ej., identificación de cambios morfológicos en la célula).

Vehículos, excipientes, o estabilizantes "aceptables fisiológicamente", son aquellos no-tóxicos para la célula o animal expuesto en las dosificaciones y concentraciones utilizadas. A menudo, el vehículo aceptable fisiológicamente es una solución acuosa de pH tamponada. Ejemplos de vehículos aceptables fisiológicamente incluyen los tampones como el fosfato, el citrato y otros ácidos orgánicos; los antioxidantes incluyendo el ácido ascórbico; los polipéptidos de bajo peso molecular (menos de 10 residuos); las proteínas, como la seroalbúmina, la gelatina o las inmunoglobulinas; los polímeros hidrofílicos como el polivinilpirrolidona; los aminoácidos como la glicina, la glutamina, la asparraguina, la arginina o la lisina; los monosacáridos, los disacáridos y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, la manosa o las dextrinas; los agentes quelantes como el EDTA; los alcoholes de azúcar como el manitol o el sorbitol; las parejas iónicas formadoras de sales como el sodio; y/o los tensoactivos no-iónicos como el Tween, el Pluronics o el polietilén glicol (PEG).

Tal como se utiliza aquí, el término "epitopo de unión al receptor reciclable" hace referencia a un epitopo de la región Fc de una molécula de IgG (p.ej., IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), que es responsable del incremento in vivo de la vida media en suero de la molécula de IgG. Ejemplos de secuencias de epitopos de unión al receptor reciclable incluyen: HQNLSDGK, HQNISDGK, HQSLGTQ, VISSHLGQ y PKNSSMINSNTP.

El término "citoquina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población de células que actúan sobre otras células como mediadores intercelulares. Ejemplos de dichas citoquinas son las linfoquinas, las monoquinas y las hormonas polipeptídicas tradicionales. Se incluyen dentro de las citoquinas las hormonas de crecimiento como la hormona de crecimiento humano, la N-metionil-hormona de crecimiento humano y la hormona de crecimiento bovino; la hormona paratifoidea; la tiroxina; la insulina; la proinsulina; la relaxina; la prorelaxina; las hormonas glicoproteicas como la hormona estimulante del folículo (FSH), la hormona estimulante del tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH); el factor de crecimiento hepático; el factor de crecimiento de fibroblastos; la prolactina; el lactógeno placental; el factor-\alpha y \beta de necrosis tumoral; la sustancia inhibidora mulleriana; el péptido asociado a gonadotropina de ratón; la inhibina; la activina; el factor de crecimiento endotelio-vascular; la trombopoyetina (TPO); los factores neurotróficos o los factores de crecimiento nervioso como el NGF-\beta, NT-3, NT-4, NT-6, BDNF, CTNF, GDNF, AL-1 y otros ligandos de la familia de receptores de eph; el factor de crecimiento de plaquetas; los factores de crecimiento transformante (TGFs) como el TGF-\alpha y el TGF-\beta; el factor de crecimiento similar a la insulina I y II; la eritropoyetina (EPO); los factores osteoinductores; los interferones como el interferón-\alpha, -\beta y \gamma, los factores estimuladores de la formación de colonias (CSFs) como el CSF de macrófagos (M-CSF); el CSF de macrófagos y granulocitos (GM-CSF; y el CSF de granulocitos (G-CSF); las interleucinas (ILs) como la IL-1, IL-1\alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; y otros factores polipeptídicos incluyendo el LIF y el ligando del equipo (KL). Tal como se utiliza aquí, el término citoquina incluye las proteínas de fuentes naturales o del cultivo de células recombinantes y los equivalentes activos biológicamente de las citoquinas de secuencia nativa. También se incluyen las moléculas diseñadas genéticamente con actividad citoquina como la TrkA-IgG u otros receptores quiméricos solubles.

El término "tratamiento" hace referencia tanto al tratamiento terapéutico y profiláctico como a las medidas preventivas. Aquellos con necesidad de tratamiento incluyen los que ya presentan la enfermedad así como aquellos en los que se desea prevenirla.

El término "mamífero" con propósitos de tratamiento hace referencia a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo el hombre, los animales domésticos y de granja, del zoo, de competición o animales de compañía como los perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente, es el hombre.

El término "fase sólida" hace referencia a una matriz no acuosa a la que se puede adherir un reactivo de interés (p.ej., el GDNFR\alpha o un anticuerpo de lo mismo). Ejemplos de fases sólidas abarcadas aquí incluyen las formadas parcial o totalmente por vidrio (p.ej., vidrio poroso controlado), polisacáridos (p.ej., agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, polivinil alcohol y siliconas. En algunas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (p.ej., una columna de cromatografía por afinidad). Este término también incluye una fase sólida de partículas discretas en la patente americana U.S. 4.275.149.

A continuación se presentan los modos para llevar a cabo la invención. El GDNF (Lin y col., Science, 260:1130-1132 (1993); patente internacional WO 93/06116, que se han incorporado aquí en su totalidad) es un factor de supervivencia potente para neuronas dopaminérgicas del cerebro medio (Lin y col., Science, 260:1130-1132 (1993); Stromberg y col., Exp. Neurol., 124:401-412 (1993); motoneuronas de la médula espinal (Henderson y col., Science, 266:1062-1064 (1994)) y neuronas noradrenérgicas (Arenas y col., Neuron, 15:1465-1473 (1995)), que degeneran en la enfermedad de Parkinson (Hirsch y col., Nature, 334:345-348 (1988); Hormykiewicz, Mt. SINAB J. Med., 55:11-20 (1988)), esclerosis lateral amiotrópica (Hirano, Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neuron diseases, P. Roward, ed. (New Cork; Raven Press, Inc.) pp. 91-101 (1991)) y la enfermedad de Alzheimer (Marcynik y col., J. Neurol. Sci, 76:335-345 (1986); Cash y col., Neurology, 37:42-46 (1987); Chan-Palay y col., Comp. Neurol., 287:373-392 (1989)), respectivamente. Basándose, en parte, en la ingeniería genética de ratones que carecen de GDNF, se describen en la presente invención funciones biológicas adicionales para el GDNF: el desarrollo y/o supervivencia de neuronas entéricas, simpáticas y sensoriales y células del sistema renal. Los resultados presentados en los ejemplos también demuestran que el GDNF no es necesario para el desarrollo de neuronas catecolaminérgicas en el sistema nervioso central (CNS).

También se describen aquí el aislamiento, la secuencia y la distribución tisular de una nueva proteína unida a GPI y su gen, denominado GDNFR\alpha, del cual se demuestra que modula la respuesta celular al GDNF. El ligando unido al GDNFR\alpha induce la fosforilación de la tirosina del receptor tirosina quinasa Ret. Estos hallazgos identifican Ret y GDNFR\alpha, respectivamente, como componentes de señalización y unión del ligando de un complejo receptor para GDNF.

Los receptores de citoquina forman a menudo complejos de multi-subunidades. A veces, la subunidad \alpha de este complejo está implicada en la unión al factor de crecimiento afín y la subunidad \beta puede contener una capacidad para transducir una señal a la célula. Sin querer limitarse a la teoría, estos receptores se han asignado a tres subfamilias dependiendo de los complejos formados. La subfamilia 1 incluye los receptores para EPO, el factor estimulador de la formación de colonias de granulocitos (G-CSF), la interleucina-4 (IL-4), la interleucina-7 (IL-7), la hormona de crecimiento (GH) y la prolactina (PRL). La unión del ligando a los receptores pertenecientes a esta subfamilia es el resultado de la homodimerización del receptor. La subfamilia 2 incluye los receptores para la IL-3, el factor estimulador de la formación de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), la interleucina-5 (IL-5), la interleucina-6 IL-6), el factor inhibidor de leucemia (LIF), la oncostatina M (OSM) y el factor neurotrófico ciliar (CNTF). Los receptores de la subfamilia 2 son heterodímeros con una subunidad \alpha para la unión al ligando y una subunidad \beta (bien la subunidad \beta compartida de los receptores de la IL-3, GM-CSF e IL-5 o la subunidad gp 130 de la IL-6, LIF, OSM y los receptores de CNTF) para la transducción de señal. La subfamilia 3 contiene únicamente el receptor de la interleucina-2 (IL-2). Las subunidades \beta y \gamma del complejo del receptor de IL-2 son los polipéptidos citoquina-receptor que se asocian con la subunidad \alpha del antígeno no relacionado Tac.

En un aspecto, la presente invención está basada en el descubrimiento del GDNFR\alpha, una proteína que se une al GDNF con una elevada afinidad. Los experimentos descritos aquí demuestran que esta molécula es un receptor que parece desempeñar una función en la mediación de respuestas al GDNF. En particular, este receptor se ha hallado que está presente en diversos tejidos y poblaciones celulares, incluyendo neuronas, lo que indica que los ligandos GDNF, al igual que los anticuerpos agonistas, pueden utilizarse para estimular la proliferación, el crecimiento, la supervivencia, la diferenciación y el metabolismo o la regeneración de las células que contienen el GDNFR\alpha y el Ret.

En una realización preferida, el GDNF se produce mediante procedimientos del DNA recombinante, utilizando genes que codifican para el GDNF (ver la patente internacional WO 93/06116 para las secuencias de GDNF humano y de rata, su expresión y los procedimientos de ensayo). La presente invención incluye (1) un vector para utilizar en la producción de un GDNF activo biológicamente de elementos reguladores de la expresión ligados operativamente a una secuencia de ácido nucleico para el GDNF maduro o pre-pro, y una célula huésped transformada por un tal vector, que comprende los elementos reguladores necesarios para expresar la secuencia de DNA; la transformación de una célula huésped con dicho vector de expresión; (2) el cultivo de las células huésped en condiciones de amplificación del vector y la expresión del GDNF; y (3) la obtención del GDNF.

Se describe un procedimiento del DNA recombinante para la producción de GDNF que comprende: el cultivo de células huésped de esta invención en condiciones para la amplificación del vector y la expresión de GDNF; y la recolección del GDNF.

El material aislado después de la expresión es esencialmente inactivo biológicamente y existe como un monómero. Después del plegamiento, el GDNF se presenta como un dímero unido por un puente disulfuro activo biológicamente. El GDNF, en consecuencia, es un dímero unido por un puente disulfuro en su forma natural y activa biológicamente. Esta invención, sin embargo, incluye el GDNF en su forma monomérica y dimérica, y en su forma inactiva y activa biológicamente.

Por toda la especificación, cualquier referencia al factor neurotrófico derivado de glías debería interpretarse como una referencia a los factores neurotróficos de cualquier origen que son esencialmente homólogos a, y que son biológicamente equivalentes al GDNF caracterizado y descrito aquí. El grado de identidad entre la proteína de rata y la humana es de aproximadamente el 93%, presentando todos los GDNF de mamíferos un elevado grado de identidad. Dichos GDNFs pueden existir como dímeros en su forma activa biológicamente.

La presente invención abarca las formas glicosiladas y no-glicosiladas del GDNF así como las formas truncadas del GDNF de origen natural y recombinante, tal como se describe aquí. En otra realización, el GDFN se modifica por la unión de uno o más polietilén glicol (PEG) u otras porciones poliméricas repetidas. La presente invención también abarca los sistemas de expresión producidos de forma recombinante en bacterias que contienen un residuo metionina amino-terminal.

También se incluyen los procedimientos para la prevención o el tratamiento de los trastornos aquí discutidos. En una realización se describe un procedimiento de implantación de células secretoras de GDNF en el cuerpo de pacientes que necesitan una terapia con GDNF. El implante puede, opcionalmente, contener células que secreten el GDNFR\alpha soluble. La presente invención también incluye un dispositivo de implantación para la prevención o el tratamiento de trastornos aquí discutidos, que comprenden una membrana semipermeable y una célula secretora de GDNF encapsulada dentro de una membrana, que es permeable al GDNF e impermeable a los factores perjudiciales para las células.

La presente descripción para los vectores, células huésped, proteínas de fusión, modificaciones y procedimientos y vías de administración, etc., para la realización de la expresión y utilización del GDNFR se refiere al GDNF y a sus variantes, tal como debería ser conocido por el experto en la materia.

Las técnicas adecuadas para la producción del GDNFR\alpha son bien conocidas en la materia e incluyen el aislamiento del GDNFR\alpha procedente de una fuente endógena del polipéptido, la síntesis peptídica (utilizando un sintetizador de péptidos) y técnicas recombinantes (o cualquier otra combinación de estas técnicas). La técnica preferida para la producción del GDNFR\alpha es una técnica recombinante que se describe más adelante.

Gran parte de la discusión de más adelante corresponde a la producción recombinante del GDNFR\alpha mediante el cultivo de células transformadas con un vector que contiene el ácido nucleico del GDNFR\alpha y la posterior recuperación del polipéptido a partir del cultivo celular. Además, se prevé que el GDNFR\alpha de la presente invención pueda producirse mediante recombinación homóloga, tal como se describe en la patente internacional WO 91/06667, publicado el 16 de mayo de 1991.

En resumen, este procedimiento implica la transformación de células humanas primarias que contienen un gen que codifica para el GDNFR\alpha en una construcción (es decir, vector) que comprende un gen amplificable (como el de la dihidrofolato reductasa (DHFR) u otros descritos más adelante) y por lo menos una región flanqueante de una longitud de al menos unas 150 pb, que es homóloga con una secuencia de DNA en un locus de la región codificante del gen GDNFR\alpha, para proporcionar la amplificación del gen GDNFR\alpha. El gen amplificable debe hallarse en un sitio que no interfiera con la expresión del gen GDNFR\alpha. La transformación se realiza de forma que la construcción se integre de forma homóloga en el genoma de las células primarias para definir una región amplificable.

Las células primarias que comprenden la construcción se seleccionan gracias a su gen amplificable u otro marcador presente en la construcción. La presencia del gen marcador establece la presencia e integración de la construcción en el genoma del huésped. No se necesita realizar ninguna selección posterior de las células primarias, ya que la selección se realizará en el segundo huésped. Si se desea, la recombinación homóloga se puede determinar utilizando la PCR y secuenciando las secuencias de DNA amplificadas, o determinando la longitud adecuada del fragmento de PCR cuando el DNA de los integrantes homólogos y correctos esté presente y se propague únicamente en las células que contengan dichos fragmentos. También, si se desea, las células seleccionadas pueden amplificarse en este punto, estresando las células con el agente amplificador adecuado (como el metrotexato si el amplificable es el DHFR) a fin de obtener múltiples copias del gen diana. Preferentemente, sin embargo, la etapa de amplificación no se realiza hasta después de la segunda transformación descrita aquí.

Después de la etapa de selección, se aislan de las células primarias seleccionadas las porciones de DNA del genoma, suficientemente grandes para incluir toda la región amplificable. Las células huésped secundarias de expresión en mamíferos se transforman a continuación con estas porciones de DNA genómicas y se clonan, y luego se seleccionan los clones que contienen la región amplificable. Dicha región se amplifica mediante un agente amplificador si no está ya amplificada en las células primarias. Por último, las células huésped de expresión secundaria que ahora comprenden múltiples copias de la región amplificable con el GDNFR\alpha son crecidas en cultivo para expresar el gen y producir la proteína.

La estructura y secuencia conservadas del GDNFR\alpha de mamífero y la elucidación de la secuencia del cDNA que codifica para el receptor de rata y ratón, así como para las secuencias descritas aquí, hacen posible el clonaje de secuencias génicas de otros mamíferos que codifican para el GDNFR\alpha. De particular interés para la presente invención es la capacidad para clonar las moléculas de GDNFR\alpha humanas utilizando las secuencias aquí descritas. El DNA que codifica para el GDNFR\alpha puede obtenerse de cualquier librería de cDNA preparada a partir de un tejido que presente el GDNFR\alpha y lo exprese a un nivel detectable, tal como se muestra en los Ejemplos. Según ello, el DNA del GDNFR\alpha puede obtenerse de forma adecuada a partir de una librería de cDNA fetal de mamífero de, por ejemplo, hígado, cerebro, músculo, intestino y nervios periféricos. El gen que codifica para el GDNFR\alpha también puede obtenerse a partir de una librería genómica o mediante síntesis con oligonucleótidos.

Las librerías se rastrean con sondas (como los anticuerpos contra el GDNFR\alpha o los oligonucleótidos de aproximadamente 20-80 bases) diseñados para identificar el gen de interés o la proteína codificada por éste. El rastreo de la librería de cDNA o la genómica con las sondas seleccionadas se puede realizar utilizando procedimientos estándares, tal como se describe en los capítulos 10-12 de Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica para el GDNFR\alpha es utilizar la metodología de la PCR tal como se describe en la sección 14 de Sambrook y col., supra.

Un procedimiento preferido para la práctica de la presente invención es utilizar secuencias oligonucleotídicas seleccionadas cuidadosamente para rastrear las librerías de cDNA de distintos tejidos humanos, preferentemente de hígado fetal humano. Las secuencias oligonucleotídicas seleccionadas como sonda deberían ser de longitud suficiente y lo suficientemente no ambiguas para minimizar los falsos positivos. Las secuencias preferidas se obtienen del GDNFR\alpha de origen natural que se describe en la presente invención.

El oligonucleótido ha de estar marcado de modo que pueda detectarse después de la hibridación del DNA en la librería a rastrear. El procedimiento preferido de marcaje es utilizar el ATP marcado con P^{32} mediante la polinucleótido quinasa, tal como se conoce en la materia para marcar isotópicamente oligonucleótidos. Sin embargo, se pueden utilizar otros procedimientos para marcar oligonucleótidos, incluyendo, pero sin limitarse a, biotinilación o marcaje enzimático.

Las variantes de secuencia aminoacídica del GDNFR\alpha se preparan introduciendo cambios nucleotídicos en el DNA del GDNFR\alpha, o mediante síntesis del polipéptido de GDNFR\alpha deseado. Dichas variantes representan inserciones, sustituciones y/o deleciones específicas de, residuos dentro de o en uno de ambos extremos de la secuencia aminoacídica de un GDNFR\alpha de origen natural, como el GDNFR\alpha que se muestra en las Figuras 1A-1E o las secuencias descritas aquí. Preferentemente, estas variantes representan inserciones y/o sustituciones dentro o en uno de ambos extremos de la secuencia madura, y/o inserciones, sustituciones y/o deleciones específicas dentro o en uno de ambos extremos de la secuencia señal del GDNFR\alpha. Toda combinación de inserción, sustitución y/o deleción específica se realiza para lograr una construcción final, siempre que dicha construcción final posea la actividad biológica deseada, tal como se define en la presente invención. Los cambios aminoacídicos también pueden alterar los procesos post-traduccionales del GDNFR\alpha, como cambiar el número o posición de los sitios de glicosilación, alterar las características de anclaje a membrana y/o alterar la localización intracelular del GDNFR\alpha mediante inserción, deleción o afectando la secuencia líder del GDNFR\alpha. Las realizaciones preferidas son las que presentan diversas sustituciones aminoacídicas, deleciones o inserciones. Más preferentemente sustituciones, deleciones o inserciones de 1 a 3 aminoácidos. Las más preferidas son las sustituciones, deleciones, o inserciones de 1 aminoácido. Los cambios preferidos son generalmente conservadores con el original.

Las variaciones en la secuencia nativa, tal como se describió anteriormente, pueden realizarse utilizando cualquiera de las técnicas y directrices de mutaciones conservadoras y no-conservadoras indicadas en la patente americana U.S. 5.364.934, especialmente incorporada por referencia. Estas técnicas incluyen la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (mutagénesis dirigida), el rastreo por alaninas y la mutagénesis por PCR. Ver, también, por ejemplo, la Tabla I y la discusión relativa a la tabla como una guía de selección de aminoácidos a cambiar, añadir o delecionar.

El ácido nucleico que codifica (p.ej., para el cDNA o el DNA genómico) del GDNFR\alpha se inserta en un vector replicable para el posterior clonaje (amplificación del DNA) o para la expresión. Existen disponibles muchos vectores. Los componentes del vector incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más de un gen marcador, un elemento intensificador de la transcripción, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

Los GDNFR\alphas de la presente invención pueden producirse de forma recombinante, no sólo directamente, pero también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferentemente una secuencia señal u otro polipéptido que tenga una diana de corte específica en el extremo N-terminal de la proteína madura o del polipéptido. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser una parte del DNA de GDNFR\alpha que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada es preferentemente una secuencia reconocida y procesada por la célula huésped. Para las células huésped procariotas que no reconozcan ni procesen la secuencia señal de GDNFR\alpha, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal de procariotas seleccionada, por ejemplo, de entre el grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o las secuencias líder de la enterotoxina II termo-estable. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal puede sustituirse por ejemplo por la secuencia señal de la invertasa de levadura, el líder del factor \alpha (incluyendo los líderes de factores-\alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, el último descrito en la patente americana U.S. 5.010.182, publicada el 23 de abril de 1991), o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans (patente europea EP 362.179, publicada el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en la patente internacional WO 90/13646 publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamífero, la secuencia señal nativa (p.ej., la presecuencia de GDNFR\alpha que normalmente dirige la secreción de GDNFR\alpha de células humanas o de rata in vivo) es satisfactoria, aunque otras secuencias señal de mamíferos pueden ser también adecuadas, como las secuencias señal de otros GDNFR\alpha de animales y las secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma o especies relacionadas, así como también de los líderes secretores virales, por ejemplo, la secuencia señal gD del virus herpes simplex.

El DNA de dicha región precursora se liga en el mismo marco de lectura con el DNA codificante del GDNFR\alpha maduro o de una variante soluble de lo mismo.

Tanto los vectores de expresión como los de clonaje contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células huéspedes seleccionadas. En general, en los vectores de clonaje, esta secuencia es una secuencia capaz de replicarse de forma independiente al DNA cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Dichas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2\mu es adecuado para levaduras y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son de utilidad para los vectores de clonaje en las células de mamífero. En general, el origen del componente de replicación no es necesario para los vectores de expresión en mamíferos (el origen de SV40 puede utilizarse generalmente sólo porque contiene el promotor temprano).

La mayoría de vectores de expresión son vectores "lanzadera", es decir, son capaces de replicarse en por lo menos una clase de organismos, pero pueden transfectarse en otro organismo para la expresión. Por ejemplo, un vector se clona en E. coli y el mismo vector se transfecta en células de mamífero para la expresión aún cuando no sea capaz de replicarse independientemente del cromosoma de la célula huésped.

El DNA puede también amplificarse mediante inserción en el genoma del huésped. Esto se logra fácilmente utilizando especies de Bacillus como huéspedes, por ejemplo, incluyendo en el vector una secuencia de DNA que sea complementaria a una secuencia hallada en el DNA genómico de Bacillus. La transfección de Bacillus con este vector da como resultado la recombinación homóloga con el genoma y la inserción del DNA de GDNFR\alpha. Sin embargo, la recuperación del DNA genómico que codifica para GDNFR\alpha es más compleja que la de un vector replicado exógenamente, ya que se necesita una digestión con enzimas de restricción para extraer el DNA de GDNFR\alpha.

Los vectores de expresión y clonaje deberían contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Este gen codifica para una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de las células transformadas crecidas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene un gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección característicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, p.ej., ampicilina, neomicina, metrotexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias autotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles por el medio nutritivo; p.ej., el gen codificante para D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para parar el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y en consecuencia sobrevive al régimen de selección. Ejemplos de dicha selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables para células de mamífero son las que permiten la identificación de células competentes para incorporar el ácido nucleico de GDNFR\alpha, como el DHFR o la timidina quinasa. Los transformantes de células de mamífero se colocan bajo una presión de selección tal que únicamente los transformantes se adaptan a sobrevivir gracias a la incorporación del gen marcador. La presión de selección se impone cultivando los transformantes en condiciones en las que la concentración del agente de selección en el medio se cambia sucesivamente, lo que conduce a una amplificación del gen de selección y del DNA que codifica para el GDNFR\alpha. La amplificación es el proceso por el que los genes de mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento se repiten en tándem dentro de los cromosomas de sucesivas generaciones de células recombinantes. Las cantidades aumentadas de GDNFR\alpha se sintetizan a partir del DNA amplificado. Otros ejemplos de genes amplificables incluyen la metalotioneína I y II, preferentemente los genes de la metalotioneína de primates, la adenosina desaminasa, la ornitina descarboxilasa, etc. Un sistema de vectores preferidos se proporciona en la patente americana 5.561.053.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican en primer lugar cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contenga metrotexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Cuando se utiliza el DHFR, una célula huésped adecuada es la línea de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como se describe en Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Las células transformadas se exponen a continuación a niveles incrementados de metotrexato. Ello conduce a la síntesis de copias múltiples del gen DHFR, y, concomitantemente, a múltiples copias del otro DNA comprendido en los vectores de expresión, como el DNA que codifica para el GDNFR\alpha. Esta técnica de amplificación puede utilizarse con cualquier huésped adecuado, p.ej., ATCC Nº CCL61 CHO-K1, no obstante, la presencia de DHFR endógeno si, por ejemplo, se utiliza un gen mutante DHFR que sea altamente resistente al Mtx (patente europea EP 117.060).

Alternativamente, las células huésped (en particular los huéspedes de tipo salvaje) que contienen DHFR endógeno) transformadas o cotransformadas con las secuencias de DNA que codifican para el GDNFR\alpha, la proteína DHFR de tipo salvaje y otros marcadores seleccionables como el aminoglicósido 3'-fosfotransferasas (APH) se pueden seleccionar mediante crecimiento celular en medio que contenga un agente de selección para el marcador seleccionable como un antibiótico aminoglicósido, p.ej., la canamicina, la neomicina, o el G418. Ver la patente americana U.S. 4.965.199.

Un gen de selección adecuado para utilizar en levaduras es el gen trp 1 presente en el plásmido de levaduras YRp7 (Stinchcomb y col., Nature, 282:39 (1979)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura carente de la capacidad para crecer con triptófano, por ejemplo, ATCC nº 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona a continuación un entorno efectivo para la detección de la transformación mediante el crecimiento en ausencia de triptófano. De modo similar, las cepas de levadura Leu2-deficientes (ATCC 20.622 ó 38.626) se complementan con plásmidos conocidos que portan el gen Leu2.

También se pueden utilizar los vectores derivados del plásmido circular 1,6 \mum para la transformación de levaduras Kluyveromyces. Bianchi y col., Curr. Genet., 12:185 (1987). Más recientemente, se ha descrito un sistema de expresión para la producción a gran escala de la quimosina vacuna recombinante por K. lactis (Vand den Berg. Biol/Technology, 8:135 (1990)). También se han descrito los vectores multicopias de expresión estable para la secreción de seroalbúmina humana recombinante por las cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer y col., Biol Technology, 9:968-975 (1991).

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Los vectores de expresión y clonaje contienen generalmente un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está unido al ácido nucleico de GDNFR\alpha. Los promotores son secuencias que no se traducen, que están localizadas cadena arriba (5') del codón de inicio de un gen estructural (generalmente entre unos 100 a 1000 pb) y que controlan la transcripción y la traducción de una secuencia de ácido nucleico particular, como la secuencia del ácido nucleico de GDNFR\alpha, a la que está unido de forma operativa. Dichos promotores se clasifican generalmente en inducibles y constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician niveles aumentados de transcripción del DNA bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, p.ej., la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. En la actualidad, un gran número de promotores son reconocidos por una gran variedad de células huésped potenciales conocidas. Estos promotores están unidos operativamente al DNA que codifica para el GDNFR\alpha, mediante eliminación del promotor del DNA original por digestión con enzimas de restricción e inserción de la secuencia promotora en el vector. Tanto la secuencia promotora del GDNFR\alpha nativo como muchos promotores heterólogos pueden utilizarse para amplificar directamente y/o expresar el DNA de GDNFR\alpha. Sin embargo, los promotores heterólogos son preferibles, ya que permiten, generalmente, una mayor transcripción y mayores rendimientos de GDNFR\alpha comparados con el promotor del GDNFR\alpha nativo.

Los promotores adecuados para utilizar con huéspedes procariotas incluyen los sistemas del promotor de la \beta-lactamasa y la lactosa (Chang y col., Nature, 275:615 (1978); Goeddel y col., Nature, 281:544 (1979)), la fosfatasa alcalina, el sistema del promotor de triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); la patente europea EP 36.776) y los promotores como los del promotor tac. deBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. USA, 80:21-25 (1983). Sin embargo, otros promotores bacterianos conocidos son adecuados. Sus secuencias nucleotídicas se han publicado, con lo que se facilita a un experto en la materia el ligarlas operativamente con el DNA codificante para el GDNFR\alpha (Siebenlist y col., Cell, 20:269 (1980)), utilizando engarces o adaptadores para proporcionar los sitios de restricción requeridos. Los promotores para utilizar en los sistemas de bacterias también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al DNA que codifica para el GDNFR\alpha.

Las secuencias promotoras son conocidas por los eucariotas. Virtualmente todos los genes eucariotas tienen una región rica en A-T localizada a aproximadamente 25 a 30 bases cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción. Otra secuencia hallada 70 a 80 basescadena arriba del inicio de la transcripción de muchos genes es la región CXCAAT, pudiendo ser X cualquier nucleótido. En el extremo 3' de muchos genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A en el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan de forma adecuada en vectores de expresión eucariotas.

Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para utilizar con huéspedes de levaduras incluye los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 2552073 (1980)) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), como la enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la glucosa-6-fosfato isomerasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son inducibles y tienen la ventaja adicional de una transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, las enzimas de degradación asociada con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y las enzimas responsables para la utilización de la maltosa y la galactosa. Los vectores y los promotores adecuados para utilizar en la expresión de levaduras se describen además en la patente europea EP 73.657. Las secuencias intensificadoras de la transcripción de levaduras también son ventajosamente utilizadas con los promotores de levadura.

La transcripción del GDNFR\alpha de vectores en células huésped de mamífero se controla, por ejemplo, por los promotores obtenidos de los genomas de virus como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (patente británica UK 2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), los adenovirus (como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y más preferentemente el Simian Virus 40 (SV40); de promotores heterólogos de mamífero, p.ej., el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, de los promotores termo-estables y del promotor normalmente asociado con la secuencia del GDNFR\alpha, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen de forma conveniente como un fragmento de restricción que también contiene un origen viral de replicación SV40. Fiers y col., Nature, 273:113 (1978); Mulligan y col., Science, 209: 1422-1427 (1980); Pavlakis y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 (1981). El promotor inmediatamente temprano del citomegalovirus humano se obtuvo de forma conveniente como un fragmento de restricción de la enzima HindIII. Greenaway y col., Gene, 18:355-360 (1982). Un sistema para la expresión del DNA en huéspedes mamíferos que utiliza el virus del papiloma bovino como un vector se describe en la patente americana U.S. 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente americana U.S. 4.601.978. Ver también Gray y col., Nature, 295:503-508 (1982) sobre la expresión del cDNA que codifica para el interferón inmune en células de mono; Reyes y col., Nature, 297:598-601 (1982) sobre la expresión del cDNA del interferón-\beta humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus herpes simplex; Canaani y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5166-5170 (1982) sobre la expresión del gen del interferón-\beta1 humano en el cultivo de células de ratón y de conejo; y Gorman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781 (1982) sobre la expresión de secuencias CAT de bacterias en células de riñón de mono CV-1, fibroblastos embrionales de pollo, células de ovario de hámster chino, células HeLa y células NIH-3T3 de ratón utilizando como promotor la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous.

La transcripción de un DNA que codifica para el GDNFR\alpha de esta invención por los eucariotas superiores se incrementa a menudo insertando una secuencia intensificadora en el vector. Las secuencias intensificadoras de la transcripción son elementos del DNA que actúan en cis, generalmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para incrementar la transcripción. Las secuencias intensificadoras de la transcripción están orientadas y posicionadas de forma relativamente independiente, habiéndose hallado en 5' (Laimins y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993 (1981)) y en 3' (Lusky y col., Mol. Cell Biol., 3:1108 (1983) con la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji y col., Cell, 33:729 (1983)), así como dentro de la propia secuencia codificante. Osborne y col., Mol. Cell. Biol., 4:1293 (1984). En la actualidad se conocen muchas secuencias intensificadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Típicamente, se utilizará un intensificador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el intensificador del SV40 en el sitio tardío del origen de replicación (pb 100-270), el intensificador del promotor temprano del virus citomegalovirus, el intensificador del polioma en el sitio tardío del origen de replicación y los intensificadores de adenovirus. Ver también, Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) sobre elementos intensificadores para la activación de promotores eucariotas. El intensificador puede ayustarse en el vector en una posición 5' a 3' de la secuencia codificante de GDNFR\alpha, pero se localiza preferentemente en un sitio 5' del promotor.

Los vectores de expresión utilizados en las células huésped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del mRNA. Dichas secuencias también están comúnmente disponibles en las regiones 5' no traducidas, y ocasionalmente 3', de los DNAs o cDNAs virales o eucarióticos (Crowley y col., Cell 76:1001-1011 (1994)). Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no-transcrita del mRNA que codifica para el GDNFR\alpha.

La construcción de vectores adecuados que contiene uno o más de los componentes anteriormente mencionados utiliza técnicas de ligación estándar. Los plásmidos aislados o los fragmentos de DNA se cortan, se convierten sus extremos en romos y se religan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

Para analizar las secuencias correctas en las construcciones plasmídicas, las mezclas de ligación se utilizan para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31.446) y se seleccinan los transformantes con éxito por su resistencia a ampicilina y tetraciclina cuando es necesario. Los plásmidos de los transformantes se preparan y se analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción y/o se secuencian por el procedimiento de Messing y col., Nucleic Acids Res., 9.309 (1981) o mediante el procedimiento de Maxam y col., Methods in Enzymology, 65:499 (1980).

Los vectores de expresión son de especial utilidad en la práctica de esta invención, ya que proporcionan la expresión transitoria en células de mamífero del DNA que codifica el GDNFR\alpha. En general, la expresión transitoria implica la utilización de un vector de expresión capaz de replicarse eficientemente en una célula huésped, a fin de que la célula huésped acumule muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetice niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Sambrook y col., supra, pág. 16-17-16.22. Los sistemas de expresión transitoria, que comprenden un vector de expresión y una célula huésped, permiten la identificación positiva de los polipéptidos codificados por el cDNA, así como del cribaje rápido de dichos polipéptidos por sus propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. Así, los sistemas de expresión transitoria son especialmente útiles en la invención con los propósitos de identificar análogos y variantes del GDNFR\alpha que sean biológicamente activos.

Otros procedimientos, vectores y células huésped son adecuados para la adaptación a la síntesis del GDNFR\alpha en el cultivo de células de vertebrados recombinantes, tal como se describe en Gething y col., Nature, 293:620-625 (1981); Mantel y col., Nature, 281:40-46 (1979); la patente europea EP 117.060; y la patente europea EP 117.058. Un plásmido particularmente útil para la expresión del GDNFR\alpha en el cultivo de células de mamífero es el pRK5 (patente europea EP 307.247) o el pSVI6B (patente internacional WO 91/08291 publicada el 13 de junio de 1991).

Las células huésped adecuadas para el clonaje o la expresión del DNA en los vectores de la presente invención son las procariotas, las levaduras o las células superiores eucariotas descritas anteriormente. Procariotas adecuados para este propósito incluyen las eubacterias, como los organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, las enterobacteriáceas como Escherichia, p.ej., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, p.ej., Salmonella typhimurium, Serratia, p.ej., Serratia marcescans y Shigella, así como Bacilli como el B. subtilis y B. licheniformis (p.ej., B. licheniformis 41P descrito en la patente DD 266.710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa y Streptomyces. Un huésped de clonaje en E. coli es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque otras cepas como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325) también son adecuados. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de ser limitantes. La cepa W3110 es un huésped preferido o un huésped parental en particular porque es una cepa huésped común para las fermentaciones de productos de DNA recombinante. Preferentemente, la célula huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para generar una mutación genética en los genes que codifican para proteínas, ejemplos de dichos huéspedes incluyen la cepa 27C7 de E. coli W3110., El genotipo completo de 27C7 es tonA \Delta ptr3 phoA \DeltaE15 \Delta(argF-lac) 169 ompT\Delta degP41kan^{r}. La cepa 27C7 se depositó el 30 de octubre de 1991 en el American Type Cultura Collection como ATCC nº 55.244. Alternativamente, puede utilizarse la cepa de E. coli con una proteasa periplásmica mutante, descrita en la patente americana U.S. 4.946.783 y publicada el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados los procedimientos de clonaje, p.ej., PCR u otras reacciones de la polimerasa de ácido nucleico.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas como los hongos filamentosos o las levaduras son huéspedes adecuados para el clonaje o la expresión de vectores codificantes para el GDNFR\alpha. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura del pan, es el más utilizado entre los microorganismos huéspedes eucariotas inferiores. Sin embargo, diversos géneros, especies y cepas están normalmente disponibles y son de utilidad en la presente invención, como Saccharomyces pombe (Beach y col., Nature, 290:140 (1981); la patente europea EP 139.383 publicada el 2 de mayo de 1985); huéspedes de Kluyveromyces (patente americana U.S. 4.943.529; Fleer y col., supra) como por ejemplo K.lactis (MW98-8C, CB683, CB4574;Louvencourt y col., J. Bacterial., 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. drosphilarum (ATCC 36.906; Van der Berg y col., supra), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (patente europea EP 402.226); Pichia pastoris (patente europea EP183.070; Srrekrishna y col., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)); Candida; Trichoderma recia (patente europea EP 244.234); Neurospora crassa (Case y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)); Schawnniomyces como Schawnniomyces occidentalis (patente europea EP 394.538 publicada el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos como p.ej., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (patente internacional WO 91/00357 publicada e 10 de enero de 1991) y huéspedes de Aspergillus como A. nidulans (Ballance y col., Biochem. Biophys. Común., 112:284-289 (1983); Tilburn y col., Gene, 26:205-221 (1983); Yelton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)) y A. Níger. Nelly y col., EMBO J., 4:475-479 (1985).

Las células huésped adecuadas para la expresión del GDNFR\alpha glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Dichas células huésped son capaces de realizar procesos complejos y actividades de glicosilación. En principio, cualquier cultivo de célula eucariota superior es factible, bien a partir del cultivo de células de vertebrados o invertebrados. Ejemplos de células de invertebrados incluyen las células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus y variantes y sus correspondientes células huésped de insectos permisivas, como por ejemplo Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes eagypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bómbix mori. Ver, p.ej., (Luckow y col., Biol/Technology, 6:47-55 (1988); Millar y col., in Genetic Engineering, Setlow y col., eds., vol 8 (Plenum Publishing, 1986), pág. 277-279; y Maeda y col., Nature, 315:592-594 (1985). Una gran variedad de cepas virales para la transfección están disponibles al público, p.ej., la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bómbix mori NPV, y dichos virus pueden utilizarse al igual que el virus de la presente invención, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Se pueden utilizar como huéspedes los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco. Generalmente, las células vegetales se transfectan incubándolas con ciertas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que han sido previamente manipuladas para contener el DNA que codifica para el GDNFR\alpha. Durante la incubación del cultivo de células vegetales con A. tumefaciens, el DNA que codifica para el GDNFR\alpha se transfiere a la célula vegetal huésped de modo que ésta se transfecta y, en condiciones adecuadas, expresará el DNA que codifica para el GDNFR\alpha. Además, están disponibles las secuencias reguladoras y las secuencias señal compatibles con las células vegetales, como el promotor de la nopalina sintasa y las secuencias señal de poliadenilación. Depicker y col., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982). Además, los segmentos de DNA aislados de la región cadena arriba del gen T-DNA 80 son capaces de activar o incrementar los niveles de transcripción de genes expresables en plantas, en el tejido vegetal que contiene el DNA recombinante. Patente europea EP 321.196, publicada el 21 de junio de 1989. Sin embargo, se ha prestado un mayor interés a las células de vertebrados y en consecuencia la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Ver p.ej., Tissue Cultura, Academia Press, Kruse y Patterson, editores (1973). Ejemplos de líneas celulares huéspedes de mamíferos son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón de mono embrional humano (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham y col., J. Gen. Virol., 36:59 (1977)); las células de riñón de bebé hámster (BHK, ATCC CCL 10); las células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77:4216 (1980)); las células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); las células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); las células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); las células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); las células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); las células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); las células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); las células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y col.,Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC5; células FS4; y la línea de hematoma humano (Hep G2).

Las células huésped se transfectan y transforman preferentemente con los vectores de expresión o clonaje anteriormente descritos para la producción del GDNFR\alpha y se cultivan en medios nutritivos convencionales, modificados de forma adecuada para la inducción de promotores, la selección de transformantes, o la amplificación de genes que codifiquen para las secuencias deseadas.

La transfección hace referencia a la incorporación de un vector de expresión por una célula huésped, independientemente de que se expresen o no las secuencias codificantes. Muchos procedimientos de transfección son conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, el método del CaPO_{4} y la electroporación. Una transfección con éxito se reconoce generalmente cuando tiene lugar cualquier indicación de operatibilidad de este vector en la célula huésped.

La transformación significa la introducción de un DNA en un organismo para que el DNA sea replicable, bien como un elemento cromosómico o como un integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándares adecuadas a dichas células. El tratamiento con calcio utilizando cloruro cálcico, tal como se describe en la sección 1.82 de Sambrook y col., supra, o la electroporación se utiliza generalmente para células procariotas u otras células que contienen importantes barreras de paredes celulares. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de algunas células vegetales, tal como se describió por Shaw y col., Gene, 23:315 (1983) y la patente internacional WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Además, las plantas se pueden transfectar utilizando el tratamiento de ultrasonidos tal como se describe en la patente internacional WO 91/00358 publicada el 10 de enero de 1991.

Para las células de mamífero sin dicha pared celular, es preferible el procedimiento del fosfato cálcico de Graham y col., Virology, 52:456-457 (1978). En la patente americana U.S. 4.399.216, publicada el 16 de agosto de 1983, se describen los aspectos generales de las transformaciones de sistemas de huéspedes celulares de mamífero. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo de forma característica de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen y col., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979). Sin embargo, pueden también utilizarse otros procedimientos para la introducción del DNA en las células, como la microinyección, la electroporación, la fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o los policationes, p.ej., polibreno, poliomitina, etc. Ver también Keown y col., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Manssur y col., Nature, 336:348-352 (1988), para diversas técnicas de transformación de células de mamífero.

Las células procariotas utilizadas aquí para producir el polipéptido GDNFR\alpha de la presente invención se cultivan en medios adecuados tal como se describe generalmente en Sambrook y col., supra.

Las células huésped de mamífero utilizadas para producir el GDNFR\alpha de la presente invención se pueden cultivar en muy diversos medios. Los medios disponibles comercialmente como el Ham F10 (Sigma), Minimal Essential Médium (MEM, Sigma), RPMI 1640 (Sigma) y Dulbecco's Modified Eagle's Médium (DMEM, Sigma) son adecuados para el cultivo de células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y col., Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes y col., Anal. Biochem., 102:255 (1980), patente americana U.S. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762: 4.560.655; o 5.122.469; la patente internacional WO 90/03430; WO 87/00195; o la patente americana U.S. nº de referencia 30.985 se pueden utilizar como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (como la insulina, la transferían, o el factor de crecimiento epitelial), las sales (como el cloruro sódico, el calcio, el magnesio y el fosfato), los tampones (como el HEPES), los nucleósidos (como la adenosina y la timidina), los antibióticos (como el fármaco GENTAMYCIN^{TM}), los oligoelementos como los compuestos inorgánicos generalmente presentes a concentraciones finales del orden de micromolar) y la glucosa o una fuente de energía equivalente. También se puede incluir cualquier otro suplemento necesario a las concentraciones adecuadas que serán conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, como la temperatura, el pH, y similares, son las utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión y serán evidentes a un experto en la materia.

En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos de células de mamífero se pueden hallar en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991).

Las células huésped referidas en esta descripción abarcan las células en cultivo, así como las células que se mantienen dentro de un animal huésped.

La amplificación génica y/o la expresión pueden cuantificarse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante transferencia de Southern, transferencia de Northern para cuantificar la transcripción del mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77:5201-5205 (1980)), la transferencia puntual (análisis de DNA), o la hibridación in situ, utilizando una sonda marcada adecuadamente, basada en las secuencias proporcionadas aquí. Se pueden utilizar diversos marcajes, generalmente radioisótopos, en particular el P^{32}. Sin embargo, también se pueden utilizar otras técnicas, como los nucleótidos modificados con biotina para la introducción en un polinucleótido. La biotina sirve entonces como el sitio de unión para la avidina o anticuerpos, que pueden estar marcados con una gran variedad de marcajes, como radionúclidos, fluorocromos, enzimas, o similares. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos que reconozcan dúplex específicos, incluyendo dúplex de DNA, dúplex de RNA, dúplex de híbridos DNA-RNA o dúplex de DNA-proteína. Los anticuerpos a su vez, pueden marcarse y el ensayo se puede llevar a cabo si el dúplex se une a una superficie, para que, después de la formación del dúplex en la superficie, pueda detectarse la presencia del anticuerpo unido al dúplex.

Alternativamente, la expresión génica se puede cuantificar mediante procedimientos inmunológicos, como la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido del cultivo celular o de los fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Con las técnicas de tinción inmunohistoquímica, una muestra celular se prepara, de forma característica mediante deshidratación y fijación, seguido por la reacción con anticuerpos específicos para el producto génico acoplado, si los marcajes son visualmente detectables, como los marcajes enzimáticos, marcajes fluorescentes, luminiscentes y similares. Una técnica de tinción especialmente sensible y adecuada para utilizar en la presente invención es la descrita por Hsu y col., Am. J. Clin. Path., 75:734-738 (1980).

Los anticuerpos utilizados para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de muestras de fluido pueden ser mono o policlonales y se pueden preparar tal como se describe aquí.

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El GDNFR\alpha (p.ej., el GDNFR\alpha ECD) se recupera preferentemente del medio de cultivo como un polipéptido secretado, aunque también se puede recuperar de los lisados de células huésped. Si el GDNFR\alpha está unido a la membrana, se puede liberar de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (p.ej., Triton-X 100).

Cuando el GDNFR\alpha se produce en una célula recombinante distinta a la de origen humano, el GDNFR\alpha está completamente libre de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar el GDNFR\alpha de las proteínas o polipéptidos de células recombinantes para obtener preparaciones que sean esencialmente homogéneas, como el GDNFR\alpha. Como primera etapa, el medio de cultivo o el lisado se puede centrifugar para eliminar los restos de deshechos celulares. A continuación, se puede purificar el GDNFR\alpha de las proteínas solubles contaminantes y de los polipéptidos con los procedimientos siguientes, que son un ejemplo de procedimientos adecuados de purificación: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice; cromatoenfoque; inmunoafinidad; resina de unión a un marcador epitópico; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; y columnas de Sepharose-proteína A para eliminar los contaminantes como la IgG.

Las variantes del GDNFR\alpha en las que los residuos se han delecionado, insertado, o sustituido se recuperan de igual manera que una secuencia de GDNFR\alpha nativa, teniendo en cuenta cualquier cambio esencial en las propiedades ocasionadas por la variación. Las resinas de inmunoafinidad, como una resina de anti-GDNFR\alpha monoclonal, se pueden utilizar para absorber la variante del GDNFR\alpha mediante unión con por lo menos un epitopo restante.

Un inhibidor de proteasas como el fluoruro de fenil metil (PMSF) también puede ser útil para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación y los anticuerpos pueden incluirse para prevenir el crecimiento de contaminantes aleatorios.

Las modificaciones covalentes de los polipéptidos de GDNFR\alpha se incluyen dentro del ámbito de la presente invención. Tanto la secuencia nativa de GDNFR\alpha como las variantes de secuencia de éste pueden estar modificadas covalentemente. Un tipo de modificación covalente del GDNFR\alpha se introduce en la molécula haciendo reaccionar los residuos de aminoácidos del GDNFR\alpha con un agente modificador orgánico capaz de reaccionar con el residuo N-terminal, el residuo C-terminal o con las cadenas laterales seleccionadas.

Los residuos cisteinil más comúnmente utilizados se hacen reaccionar con los \alpha-haloacetatos (y aminas correspondientes), como el ácido cloroacético o la cloroacetamida, para generar derivados de carboximetil o carboximidometil. Los residuos cisteinil también se modifican mediante reacción con la bromotrifluoroacetona, \alpha-bromo-\beta-(5-imidozoil) ácido propiónico, cloroacetil fosfato, N-alquimaleimidas, 3-nitro-2-piridil disulfuro,metil 2-piridil disulfuro, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos histidil se modifican mediante reacción con el dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0, ya que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidil. También se utiliza el para-bromofenacil bromuro; la reacción se realiza preferentemente en cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos lisinil y amino-terminales se hacen reaccionar con ácido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. La modificación con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos lisinil. Otros reactivos adecuados para la modificación de residuos que contienen \alpha-amino incluyen los imidoésteres como metil-picolinimidato, piridoxal fosfato, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea, 2,4-pentanediona y la reacción catalizada por la transaminasa con el glioxilato.

Los residuos arginil se modifican mediante reacción con uno o varios reactivos convencionales, destacándose entre ellos el fenilglioxal, la 2,3-butanediona, la 1,2-ciclohexanediona y la nihidrina. La modificación de residuos de arginina necesita que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al elevado pK_{a} del grupo funcional de guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, al igual que con el grupo épsilon-amino de la arginina.

La modificación específica de los residuos tirosil puede realizarse, con especial interés en la introducción de marcajes espectrales en los residuos de tirosil, mediante reacción con los compuestos de diazonio aromáticos o con el tetranitrometano. Más frecuentemente, se utilizan el N-acetil-imidizol y el tetranitrometano para formar especies de O-acetil tirosil y derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosil se yodan utilizando I^{125} o I^{131} para preparar proteínas marcadas para utilizar en radioinmunoensayos, siendo adecuado el procedimiento de la cloramina T.

Los grupos laterales carboxilo (aspartil o glutamil) se modifican selectivamente mediante reacción con las carbodiimidas (R-N=C=N-R'), en donde R y R' son diferentes grupos alquilo, como el 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4, 4-dimetilpentil) carbodiimida. Además, los residuos aspartil y glutamil se convierten en residuos asparraguinil y glutaminil mediante reacción con iones amoníaco.

La modificación con agentes bifuncionales es útil para la unión del GDNFR\alpha con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para utilizar en el procedimiento por purificación con anticuerpos anti-GDNFR\alpha, y vice-versa. Agentes de unión comúnmente utilizados incluyen, p.ej., el 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, el glutaraldehído, los ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, los ésteres con el ácido 4-azidosalicílico, los imidoésteres homobifuncionales, incluyendo los ésteres de disuccinimidil como el 3-3'-ditiobis (succinimilpropionato) y las maleimidas bifuncionales como la bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes modificantes como el metil-3-((p-azidofenil)ditio)propioimidato proporcionan intermediarios fotoactivables que son capaces de formar uniones en presencia de luz. Alternativamente, las matrices reactivas e insolubles en agua como los carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes americanas U.S. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440 se utilizan para la inmovilización de proteínas.

Los residuos glutaminil y asparaginil se desaminan frecuentemente a los residuos glutamil y aspartil, respectivamente. Estos residuos se desaminan en condiciones neutras o básicas. La forma desaminada de estos residuos se halla dentro del ámbito de la invención.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos seril o treonil, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pág. 79-86 (1983)), la acetilación la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación del polipéptido GDNFR\alpha, incluido dentro del ámbito de la presente invención, comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo del polipéptido. Mediante alteración se quiere significar que la deleción de una o más porciones de carbohidratos hallados en el GDNFR\alpha nativo, y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el GDNFR\alpha nativo.

La glicosilación de polipéptidos es generalmente N- u O-glicosilación. N- hace referencia a la unión de la porción de carbohidrato con la cadena lateral de un residuo de asparraguina. Las secuencias tripépticas asparraguina-X-serina y asparraguina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido, excepto la prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidrato con la cadena lateral de asparraguina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La O-glicosilación hace referencia a la unión de uno de los azúcares N-acetogalactosamina, galactosa, o xilosa a un ácido hidroxilamino, más comúnmente la serina o la treonina, aunque también se puede utilizar la 5-hidroxiprolina o la 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al polipéptido GDNFR\alpha se logra de forma adecuada alterando la secuencia aminoacídica para que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas anteriormente descritas (para sitios de N-glicosilación). La alteración puede también realizarse mediante adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina en la secuencia nativa de GDNFR\alpha (para los sitios de O-glicosilación). Para mayor sencillez, la secuencia aminoacídica de GDNFR\alpha se altera preferentemente con cambios a nivel del DNA, en particular mediante mutación del DNA que codifica para el polipéptido GDNFR\alpha en las bases preseleccionadas, para que los codones que se generen se traduzcan en los aminoácidos deseados. Las mutaciones del DNA pueden generarse utilizando los procedimientos descritos anteriormente en la patente americana U.S. 5.364.934, supra.

Otros medios de aumentar el número de porciones de carbohidrato en los polipéptidos de GDNFR\alpha es mediante acoplamiento químico de glicósidos al polipéptido. Estos procedimientos son ventajosos ya que no requieren la producción del polipéptido en una célula huésped que tenga capacidades de glicosilación para N- u O-glicosilación. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el azúcar(es) se pueden unir a: a) una arginina e histidina, b) grupos carboxilo libres, c) grupos sulfidrilo libres como los de la cisteína, d) grupos hidroxilo libres como los de la serina, treonina o hidroxiprolina, e) residuos aromáticos como los de la fenilalanina, tirosina, o triptófano, o f) el grupo amida de la glutamina. Estos procedimientos se describen en la patente internacional WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987 y en Aplin y col., CRC Crt. Rev. Biochem., 259-306 (1981).

La eliminación de porciones de carbohidrato presentes en el polipéptido GDNFR\alpha se puede lograr química o enzimáticamente. La desglicosilación química requiere la exposición del polipéptido al compuesto de ácido trifluorometansulfónico o a un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado el corte de la mayoría de los azúcares, excepto el azúcar de unión (A-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando el polipéptido intacto. La desglicosilación química se describe por Hakimuddin, y col., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y por Edge y col., Anal. Biochem., 118:131(1981). El corte enzimático de las porciones de carbohidratos en los polipéptidos se puede lograr utilizando una gran variedad de endo- y exo-glicosidasas, tal como se describe en Thotakura y col., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

La glicosilación en los sitios potenciales de glicosilación se puede evitar utilizando el compuesto de tucamicina, tal como se describe por Duskin y col., J. Biol. Chem., 257:3105 (1982). La tucamicina bloquea la formación de las uniones de proteína-N-glicósido.

Otro tipo de modificación covalente del GDNFR\alpha comprende la unión del polipéptido GDNFR\alpha a uno de los diversos polímeros no-proteicos, p.ej., el polietilén glicol, el propilén glicol, o los polioxialquilenos, de la forma indicada en las patentes americanas U.S. 4.640.835, 4.496.689; 4.301.144, 4.670417, 4.791.192 ó 4.179.337.

Las variantes se pueden analizar tal como se enseñan aquí. Un cambio en el carácter inmunológico de la molécula de GDNFR\alpha, como la afinidad para un anticuerpo dado, se puede cuantificar mediante un inmunoensayo de tipo competitivo. Otras modificaciones de las propiedades de la proteína o de los polipéptidos como la estabilidad redox o térmica, la hidrofobicidad, la susceptibilidad a la degradación proteolítica o la tendencia a formar agregados con los vehículos o con multímeros se analizan por procedimientos bien conocidos en la materia.

La presente invención abarca los polipéptidos quiméricos que comprenden el GDNFR\alpha fusionado con un polipéptido heterólogo. Un GDNFR\alpha quimérico, tal como se define aquí, es un tipo de GDNFR\alpha variante. En una realización preferida, el polipéptido quimérico comprende una fusión del GDNFR\alpha con un polipéptido etiqueta que proporciona un epitopo al que un anticuerpo o molécula anti-etiqueta puede unirse selectivamente. El epitopo-etiqueta se proporciona generalmente en el extremo amino- o carboxilo-terminal del GDNFR\alpha. Dichas formas del GDNFR\alpha etiquetadas con epitopos son deseables, ya que su presencia se puede detectar utilizando un anticuerpo marcado contra el polipéptido etiqueta. Asimismo, el péptido etiqueta permite la purificación rápida del GDNFR\alpha mediante purificación por afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta. Las técnicas de afinidad y ensayos diagnósticos implicando anticuerpos se describen más adelante.

Los polipéptidos etiqueta y sus anticuerpos respectivos son bien conocidos en la materia. Ejemplos incluyen el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 (Field y col., Mol. Cell Biol., 8:2159-2165 (1988)); la etiqueta de c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 de lo mismo (Evan y col., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)); y la glicoproteína D (gD) del virus Herpes Simplex y su anticuerpo. Paborsky y col., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990). Se han descrito otros polipéptidos etiqueta. Ejemplos incluyen el péptido-Flag (Hopp y col., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)); el péptido epitópico KT3 (Martin y col., Science, 255:192-194 (1992)); y un péptido epitópico de la \alpha-tubulina (Skinner y col., J. biol. Chem., 266.15163-15166 (1991)); y el péptido etiqueta de la proteína 10 del gen T7. Lutz-Freyermuth y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990). Una vez seleccionado el péptido etiqueta, se puede generar un anticuerpo contra éste utilizando las técnicas descritas en la presente invención. Es preferible una secuencia etiqueta de poli-histidina C-terminal. Las secuencias de poli-histidina permiten el aislamiento de la proteína etiquetada por cromatografía de Ni-NTA, tal como se describe por Lindsay y col., (Neuron 17:571-574 (1996), por ejemplo.

Los procedimientos generales para la construcción del GDNFR\alpha etiquetado epitópicamente son los mismos que los descritos anteriormente. Las fusiones del GDNFR\alpha-polipéptido etiqueta se construyen de forma más conveniente fusionando la secuencia del cDNA que codifica para la porción del GDNFR\alpha en el mismo marco de lectura con la secuencia del DNA del polipéptido etiqueta y expresando la fusión de la construcción del DNA resultante en las células huésped adecuadas. Generalmente, cuando se preparan las quimeras del GDNFR\alpha-polipéptido etiqueta de la presente invención, el ácido nucleico que codifica para el GDNFR\alpha se fusionará por su extremo 3' con el ácido nucleico que codifica el extremo N-terminal del polipéptido etiqueta, sin embargo también son posibles las fusiones 5'.

El GDNFR\alpha etiquetado con el epitopo se puede purificar convenientemente mediante cromatografía de afinidad utilizando el anticuerpo anti-etiqueta. La matriz a la cual se engancha el anticuerpo de afinidad es a menudo la agarosa, pero otras matrices están disponibles (p.ej., vidrio poroso controlado o poli (estirendivinil) benceno). El GDNFR\alpha etiquetado con el epitopo se puede eluir de la columna de afinidad variando, por ejemplo, el pH o la fuerza iónica del tampón, o añadiendo agentes caotrópicos.

Las quimeras construidas a partir de una secuencia de receptor unida a una secuencia adecuada de un dominio constante de inmunoglobulina (inmunoadhesinas) son bien conocidas en la materia. Las inmunoadhesinas publicadas en la literatura incluyen las fusiones del receptor de célula T* (Gascoigne y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84:2936-2940 (1987)); CD4* (Capon y col., Nature 337:525-531 (1989); Traunecker y col., Nature, 339:68-70 (1989); Zettmeissi y col., DNA Cell Biol., USA, 9:347-352 (1990); Bym y col., Nature, 344:667-670 (1990)); L-selectina (receptor autoguiado) (Watson y col., J. Cell. Biol., 110:22201-2229 (1990); Watson y col., Nature, 349:164-167 (1991)); CD44* (Aruffo y col., Cell, 61:1303-1313 (1990)); CD28* and B7* (Linsley y col., J. Exp. Med., 173:721-730 (1991)); CTLA-4* (lisley y col., J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)); CD22* (Stamenkovic y col., Cell, 66:1133-1144 (1991)); receptor del TNF (Ashkenazi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. UA, 88:10535-10539 (1991); Lesslauer y col., Eur. J. Immunol., 27:2883-2886 (1991); Peppel y col., J. Exp. Med., 174:1483-1489 (1991)); receptores NP (Bennett y col., J. Biol. Chem. 266:23060-23067 (1991)); y el receptor \alpha de IgE* (Ridgway y col., J. Cell. Biol., 115: abstr. 1448 (1991)), en donde los asteriscos (*) indican que el receptor es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas.

El diseño más simple y sencillo de inmunoadhesinas combina la región(es) de la proteína "adhesina" con la bisagra de las regiones Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina. Generalmente, cuando se preparan las quimeras de GDNFR\alpha-inmunoglobulina de la presente invención, el ácido nucleico que codifica para el dominio extracelular de l GNDFR\alpha se fusionará por el extremo C-terminal con el ácido nucleico que codifica el extremo N-terminal de una secuencia de un dominio constante de inmunoglobulina, aunque, también son posibles las fusiones N-terminales.

En general, en dichas fusiones el polipéptido quimérico codificado retendrá por lo menos la bisagra activa funcionalmente y los dominios CH2 y CH3 de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. Las fusiones también se realizan con el extremo C-terminal de la porción Fc de un dominio constante, o inmediatamente N-terminal al CH1 de la cadena pesada o de la región correspondiente de la cadena ligera.

El sitio preciso en el cual se realiza la fusión no es crítico; los sitios particulares son bien conocidos y pueden seleccionarse con el fin de optimizar la actividad biológica, o las características de secreción o unión de las quimeras de GDNFR\alpha-inmunoglobulina.

En algunas realizaciones, las quimeras de GDNFR\alpha-inmunoglobulina se ensamblan como monómeros, o hetero- u homo-multímeros, y en particular como dímeros o tetrámeros, esencialmente tal como se describe en la patente internacional WO 91/08298.

En una realización preferida, la secuencia del dominio extracelular del GDNFR\alpha se fusiona con el extremo N-terminal o con la porción C-terminal de un anticuerpo (en particular el dominio Fc), que contiene las funciones inductoras de una inmunoglobulina, p.ej. la inmunoglobulina G1 (IgG1). Es posible fusionar la región constante de cadena pesada con la secuencia del dominio extracelular del GFNFR\alpha. Sin embargo, más preferentemente, se utiliza en la fusión una secuencia que se inicia en la región bisagra justo cadena arriba del sitio de corte de la papaína (que define químicamente la IgGFc; residuo 216, considerando el primer residuo de la región constante de cadena pesada el 114, o sitios análogos de otras inmunoglobulinas). En una realización preferida en particular, la secuencia aminoacídica del GDNFR\alpha se fusiona con la región bisagra y los dominios CH2 y CH3, o CH1, bisagra, CH2 y CH3 de una cadena pesada de IgG1, IgG2, o IgG3. El sitio preciso en el cual la fusión se realiza no es crítico y el sito óptimo se puede determinar mediante experimentación de rutina.

En algunas realizaciones, las quimeras de GDNFR\alpha-inmunoglobulina se ensamblan como multímeros, y en especial como homo-dímeros u homo-tetrámeros. En general, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán una unidad estructural conocida. Una unidad estructural básica de cuatro cadenas es la forma característica de la IgG, IgD e IgE. Una unidad de cuatro cadenas se repite en las inmunoglobulinas de elevado peso molecular; la IgM existe generalmente como un pentámero de cuatro unidades básicas que se mantienen unidas por puentes disulfuro. La globulina IgA y ocasionalmente la globulina IgG, puede existir en una forma multimérica en el suero. En el caso de multímeros, cada unidad de cuatro cadenas puede ser la misma u otra distinta.

Alternativamente, se puede insertar la secuencia del dominio extracelular entre las secuencias de cadena pesada y de cadena ligera para obtener una inmunoglobulina que comprenda una cadena pesada quimérica. En esta realización, la secuencia del GDNFR\alpha se fusiona con el extremo 3' de una cadena pesada de inmunoglobulina en cada brazo de una inmunoglobulina, bien entre la bisagra y el dominio CH2 o entre los dominios CH2 y CH3. Construcciones similares se han publicado por Hoogenboom y col., Mol. Immunol., 28:1027-1037 (1991).

Aunque la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina no se requiere en las inmunoadhesinas de la presente invención, una cadena ligera de inmunoglobulina puede estar presente bien asociada de forma covalente con un polipéptido de fusión de cadena pesada de inmunoglobulina y GDFNR\alpha, o fusionada directamente con el dominio extracelular. En el primer caso, el DNA que codifica para una cadena ligera de inmunoglobulina se coexpresa con el DNA que codifica para la proteína de fusión GDNFR\alpha-cadena pesada de inmunoglobulina. Después de la secreción, la cadena pesada híbrida y la cadena ligera estarán asociadas covalentemente para proporcionar una estructura similar a la inmunoglobulina que comprende dos pares de cadenas pesadas y cadena ligeras de inmunoglobulinas unidas por dos puentes disulfuro. Los procedimientos adecuados para la preparación de dichas estructuras se describen, por ejemplo, en la patente americana U.S. 4.816.567, publicada el 28 de marzo de 1989.

En una realización preferida, las secuencias de inmunoglobulina utilizadas en la construcción de las inmunoadhesinas de la presente invención proceden del dominio constante de cadena pesada de una inmunoglobulina IgG. Para las inmunoadhesinas, es preferible la utilización de las secuencias de inmunoglobulinas IgG1 e IgG3. Una ventaja importante de la utilización de IgG1 es que las inmunoadhesinas de IgG1 pueden purificarse de forma eficaz sobre proteína-A inmovilizada. En cambio, la purificación de IgG3 requiere la proteína G, un medio significativamente menos versátil. Sin embargo, deberían considerarse otras propiedades estructurales y funcionales de las inmunoglobulinas cuando se elige la pareja de fusión para una construcción de inmunoadhesina determinada. Por ejemplo, la bisagra de IgG3 es más larga y más flexible, por lo que puede acomodar dominios de adhesinas mayores que puede que no se plieguen o funcionen adecuadamente al fusionarse con la IgG1. Otra consideración puede ser la valencia; las inmunoadhesinas de IgG son homodímeros bivalentes, mientras que los subtipos Ig como IgA e IgM pueden producir estructuras diméricas o pentaméricas, respectivamente, en base a la unidad homodimérica de Ig para las inmunoadhesinas de GDNFR\alpha diseñadas para una aplicación in vivo, las propiedades y las funciones inductoras especificadas por la región Fc son también importantes. Aunque, la IgG1, IgG2 e IgG4 tienen todas ellas una vida media in vivo de 21 días, sus potencias relativas para activar el sistema del complemento son distintas. La IgG4 no activa el complemento y la IgG2 es significativamente más débil en la activación del complemento que la IgG1. Además, al contrario que la IgG1, la IgG2 no se une a los receptores de Fc en las células mononucleares o neutrófilos. Mientras que la IgG3 es óptima para la activación del complemento, su vida media in vivo es aproximadamente un tercio de los otros isotipos de IgG. Otra consideración importante para las inmunoadhesinas diseñadas para utilizar como moléculas terapéuticas humanas es el número de variantes alotípicas del isotipo determinado. En general, son preferibles los isotipos de IgG con menos alotipos definidos serológicamente. Por ejemplo, la IgG1 tiene únicamente cuatro sitios definidos serológicamente, dos de los cuales (G1m y 2) se localizan en la región Fc; siendo uno deestos sitios, G1m1, no inmunogénico. Por el contrario, existen 12 alotipos definidos serológicamente en IgG3, todos ellos en la región Fc; únicamente tres de estos sitios (G3m5, 11 y 21) tienen un alotipo que no es inmunogénico. Así, el potencial inmunogénico de una inmunoadhesina \gamma3 es superior al de una inmunoadhesina \gamma1.

En relación con la inmunoglobulina parental, un punto de unión útil se halla justo cadena arriba de las cisteínas de la bisagra que forman los puentes disulfuro entre las dos cadenas pesadas. En un diseño utilizado con frecuencia, el codón para el residuo C-terminal de la parte de GDNFR\alpha de la molécula se coloca directamente cadena arriba de los codones para la secuencia DKTHTCPPCP de la región de bisagra de IgG1.

Los procedimientos generales adecuados para la construcción y la expresión de las inmunoadhesinas son los mismos que los descritos anteriormente respecto al GDNFR\alpha. Las inmunoadhesinas del GDNFR\alpha se construyen de forma más conveniente mediante fusión de la secuencia del cDNA que codifica para la porción del GDNFR\alpha en el mismo marco de lectura con una secuencia de cDNA de Ig. Sin embargo, también se puede utilizar la fusión con los fragmentos de Ig genómicos (ver, p.ej., Gascogine y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:2936-2940 (1987); Arufo y col., Cell, 61:1303-1313 (1990); Stamenkovic y col., Cell, 66:1133-1144 (1991)). El último tipo de fusión requiere la presencia de secuencias de Ig reguladoras para la expresión. Los cDNAs que codifican para las regiones constantes de cadena pesada de IgG pueden aislarse basándose en la secuencia publicada de las librerías de cDNA derivadas de linfocitos del bazo o de sangre periférica, mediante técnicas de hibridación o de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los cDNAs que codifican para el GDNFR\alpha y porciones Ig de la inmunoadhesina se insertan en tandem en un vector plasmídico que dirige la expresión eficiente en las células huésped elegidas. Para la expresión en células de mamífero, se pueden utilizar los vectores basados en pRK5 (Schall y col., Cell, 61:361-370 (1990)) y los basados en CDM-8 (Seed, Nature, 329:840 (1989)). La unión exacta puede crearse eliminando las secuencias extras entre los codones de unión diseñados, utilizando mutagénesis delecional dirigida por oligonucleótidos (Zoller y col., Nucleic. Acids Res., 10:6487 (1982); Capon y col., Nature, 337:525-531 (1989)). Pueden utilizarse oligonucleótidos sintéticos, en los que la mitad es complementaria a la secuencia del otro lado de la unión deseada; idealmente, estos oligonucleótidos son de 36 a 48-meros. Alternativamente, las técnicas de PCR se pueden utilizar para unir las dos partes de la molécula en la misma fase de lectura con un vector adecuado.

La elección de la línea celular huésped para la expresión de las inmunoadhesinas de GDNFR\alpha depende principalmente del vector de expresión. Otra consideración es la cantidad de proteína que se necesita. Cantidades del orden de miligramos, a menudo, pueden producirse mediante transfecciones transitorias. Por ejemplo, la línea celular de riñón embrional humano 293 transformada con el adenovirus EIA puede transfectarse transitoriamente con vectores basados en pRK5 mediante una modificación del procedimiento del fosfato cálcico para permitir la expresión eficiente de inmunoadhesinas. Los vectores basados en CDM-8 se pueden utilizar para transfectar células COS mediante el procedimiento del DEAE-dextrano (Aruffo y col., Cell, 61:1303-1313 (1990); Zettmeissi y col., DNA Cell Biol. US, 9:347-353 (1990)). Si se desean grandes cantidades de proteína, la inmunoadhesina se puede expresar después de una transfección estable de una línea de células huésped. Por ejemplo, se puede introducir un vector basado en pRK5 en las células de ovario de hámster chino (CHO) en presencia de un plásmido adicional que codifique para la dihidrofolato reductasa (DHFR) y que confiera resistencia a G418. Los clones resistentes a G418 se pueden seleccionar en cultivo; estos clones se crecen en presencia de niveles aumentados de metrotexato inhibidor de DHFR; se seleccionan los clones, en los que se coamplifica el número de genes que codifican para el DHFR y las secuencias de inmunoadhesina. Si la inmunoadhesina contiene una secuencia líder hidrofóbica en su extremo N-terminal, probablemente se procesará y secretará por las células transfectadas. La expresión de las inmunoadhesinas con estructuras más complejas puede necesitar únicamente células huésped adecuadas; por ejemplo, componentes como la cadena ligera o la cadena J pueden proporcionarse por algunos células huéspedes de mielomas o hibridomas (Gascoigne y col., 1987, supra Martin y col., J. Virol., 67:3561-3568 (1993).

Las inmunoadhesinas pueden purificarse de forma conveniente mediante cromatografía de afinidad. La adecuación de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie e isotipo del dominio Fc de inmunoglobulina que se utilice en la quimera. La proteína A puede utilizarse para purificar inmunoadhesinas basadas en las cadenas pesadas humanas \gamma1, \gamma2, o \gamma4 (Lindmark y col., J. Immunol. Meth., 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para el \gamma3 humano (Guss y col., EMBO J, 5:1575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad es generalmente la agarosa, pero también existen otras matrices disponibles. Las matrices estables mecánicamente como el vidrio poroso controlado o el poli(estirenvidinil)benceno permiten velocidades de flujo mayores y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con la agarosa. Las condiciones para la unión de una inmunoadhesina a una columna de afinidad con proteína A o G están dictadas directamente por las características del dominio Fc; es decir, su especie e isotipo. En general, cuando se elige el ligando adecuado, tiene lugar directamente una unión eficiente del medio de cultivo no condicionado. Una característica indistinguible de las inmunoadhesinas es que, para las moléculas de \gamma1 humanas, la capacidad de unión para la proteína A está reducida a veces en relación con un anticuerpo del mismo tipo Fc. La inmunoadhesina unida se puede eluir de forma eficaz en un tampón a pH acídico (a aproximadamente 3,0), o a pH neutro que contenga una sal ligeramente caotrópica. Esta etapa de cromatografía de afinidad puede dar como resultado una preparación de inmunoadhesina de una pureza >95%.

Para purificar inmuoadhesinas, pueden utilizarse otros procedimientos conocidos en la materia en lugar de, o además de, la cromatografía de afinidad con proteína A o G. Las inmuoadhesinas se comportan de forma similar a los anticuerpos en la cromatografía de gel tiofílico (Hutchens y col, Anal. Biochem., 159:217-226 (1986)) y la cromatografía de quelatos metálicos inmovilizados (Al-Mashikhi y col., J. Dairy Sci., 71:1756-1763 (1988)). Al contrario que los anticuerpos, sin embargo, su comportamiento en columnas de intercambio iónico viene dictado no sólo por su punto isoeléctrico, sino también por una carga bipolar que puede existir en las moléculas debida a su naturaleza quimérica.

También, según los requerimientos deseados, las inmunoadhesinas pueden ser biespecíficas. Así, las inmunoadhesinas de la presente invención pueden combinar un dominio extracelular GDNFR\alpha y un dominio, como el domino extracelular, de otra citoquina o subunidad del receptor neurotrófico. Ejemplos de receptores de citoquina de los que se pueden generar moléculas de inmunoadhesina biespecíficas incluyen el TPO (o el ligando mpl), EPO, G-CSF, IL-4, IL-7,GH, PRL, IL-3, GM-CSF, IL-5, IL-6, LIF, OSM, CNTF y receptores de IL-2. Como moléculas biespecíficas, las moléculas triméricas, compuestas de una cadena pesada de anticuerpo quimérico en un brazo y una pareja de cadena ligera-cadena pesada de un anticuerpo quimérico en el otro brazo de su estructura similar al anticuerpo, son ventajosas debido a su facilidad de purificación. Al contrario que los quadromas productores de anticuerpos utilizados tradicionalmente para la producción de inmunoadhesinas biespecíficas, que producen generalmente una mezcla de tetrámeros, las células transfectadas con el ácido nucleico que codifica para las tres cadenas de una estructura de inmunoadhesina trimérica producen una mezcla de sólo tres moléculas y la purificación del producto deseado de esta mezcla es en consecuencia más sencilla.

Se cree que la proteína GDNFR\alpha y el gen GDNFR\alpha (y GDNF y el gen GDNF) tienen una utilidad terapéutica ex vivo o in vivo para la administración a un mamífero, en particular en humanos, en el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con la actividad GDNF o que se beneficien por la capacidad de respuesta a GDNF. Las condiciones especialmente adaptables al tratamiento con las realizaciones de la invención son las relacionadas con la expresión de Ret o las que se benefician de la activación de Ret, en particular de las vías cadena abajo mediadas por Ret. Los trastornos que se pueden beneficiar de dicha terapia son los trastornos neurológicos, preferentemente los trastornos del sistema nervioso central, los trastornos del riñón, los trastornos hematopoyéticos relacionados con el bazo y los trastornos del sistema nervioso entérico. En una realización, se administra al paciente una cantidad eficaz de GDNFR\alpha, GDNF o un agonista de lo mismo, o un fragmento peptídico activo o una variante de lo mismo. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden GDNFR\alpha, GDNF, o un agonista de lo mismo, o un fragmento o derivado peptídico activo, en un vehículo aceptable farmacéuticamente. El material se puede administrar por vía sistémica u oral. De acuerdo con los procedimientos de la presente invención, la proteína receptora puede administrarse opcionalmente antes, después o preferentemente al mismo tiempo que el GDNF (o formando un complejo) u otro ligando de GDNFR\alpha. Tal como se ha indicado aquí, el GDNFR\alpha puede proporcionarse a las células diana en ausencia de GNDF, para incrementar la capacidad de respuesta de aquellas células al GDNF o agonista de GDNF administrado posteriormente.

Puede ser beneficioso disminuir el efecto trófico del GDNF endógeno. En consecuencia, en áreas de trauma en el sistema nervioso, puede ser deseable proporcionar antagonistas de GDNF, incluyendo, pero sin limitarse a, un GDNFR\alpha libre sin células y defectuoso en la activación de Ret, que pueda competir con el receptor celular endógeno por la unión de GDNF. En dichas circunstancias, puede ser deseable proporcionar el antagonista de GDNF localmente en el sitio de la lesión en lugar de sistémicamente. La utilización de un implante que suministre el GDNFR\alpha puede ser deseable para la administración local.

Alternativamente, algunas condiciones se pueden beneficiar de un aumento de la capacidad de respuesta a GDNF (o de otro ligando de GDNFR\alpha). Por lo tanto, puede ser beneficioso incrementar el número de GDNFR\alpha, o la afinidad de unión del GDNFR\alpha en las células de los pacientes que padecen dichas condiciones. Ello se puede lograr mediante la administración de GDNFR\alpha soluble, opcionalmente formando un complejo con el ligando de GDNFR\alpha, preferentemente el GDNF, o mediante terapia génica utilizando el ácido nucleico que codifica para el GDNFR\alpha. La expresión selectiva del GDNFR recombinante en las células adecuadas puede lograrse utilizando genes de GDNFR controlados por promotores específicos de tejido o inducibles, o produciendo una infección localizada con los virus defectuosos en la replicación que portan el gen GDNFR recombinante. Las condiciones que pueden beneficiarse de una sensibilidad aumentada al GDNF incluyen, pero no se limitan a, trastornos de motoneuronas incluyendo la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Wernig-Hoffmann, la atrofia muscular espinal próxima crónica y el síndrome de Guillain-Barre. Condiciones adicionales incluyen las que implican las neuronas simpáticas, en particular si se desea un aumento de la supervivencia o la capacidad de respuesta al GDNF. Cuando se desee dicho aumento de la supervivencia o de la capacidad de respuesta a GDNF de las neuronas sensoriales, incluyendo las neuronas sensoriales periféricas y las neuronas del sistema nervioso central, incluyendo las neuronas dopaminérgicas, dichas condiciones también se tratan de forma adecuada con las realizaciones de la presente invención. Según ello, se proporciona en la presente invención el tratamiento de trastornos neurológicos asociados con la diabetes, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la Corea de Hungtinton. Las composiciones y procedimientos actuales pueden también aplicarse a condiciones relacionadas con células no-neuronales que expresan el GDNFR\alpha. De hecho, ya que el GDNFR\alpha sirve para activar el Ret, las condiciones asociadas con las vías de Ret-activado en las células que expresan Ret se pueden tratar con las realizaciones de la presente invención.

Una enfermedad o trastorno médico se considera que es una lesión nerviosa si la supervivencia o la función de las células nerviosas y/o de sus procesos axonales está comprometida. Dicha lesión nerviosa tiene lugar como resultado de las condiciones que incluyen: (a) lesión física, que causa la degeneración de los procesos axonales y/o de los cuerpos celulares nerviosos a proximidad del sitio de la lesión; (b) isquemia, por ejemplo un accidejte cerebro-vascular; (c) exposición a neurotoxinas, por ejemplo el cáncer y los agentes quimioterapéuticos como el cisplatino y la didesoxicitidina (ddC), respectivamente; (d) las enfermedades metabólicas crónicas, como la diabetes o la disfunción renal; y (e) enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson, Alzheimer y esclerosis lateral amiotrófica (ALS), que causan la degeneración de poblaciones neuronales específicas. Las condiciones que implican la lesión nerviosa incluyen la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica, el accidente cerebro-vascular, la polineuropatía diabética, la neuropatía tóxica y la lesión física del sistema nervioso como la causada por la lesión física del cerebro y la espina dorsal, o roturas o cortes en el brazo y en la mano u otras partes del cuerpo, incluyendo el cese del flujo sanguíneo a partes del sistema nervioso temporal o permanentemente, como en el caso del accidente cerebro-vascular.

El gen del GDNFR\alpha se expresa en las células del músculo y las neuronas asociadas. Según ello, la presente invención proporciona los procedimientos para el tratamiento de los trastornos de células musculares que expresan el GDNFR, comprendiendo dichos procedimientos la administración a un paciente que necesite de dicho tratamiento con los compuestos de la invención. Los trastornos de células musculares que pueden beneficiarse de dicho tratamiento incluyen, pero no se limitan a las distrofias musculares progresivas: Duchenne, Becker, Emery-Dreifuss, Landozy-Dejerine, escápulo-humeral, las de cinturas de tipo LGMD, Von Graefe-Fuchs, óculofaringeas, miotónicas y congénitas. Además, dichas moléculas pueden utilizarse en el tratamiento de las miopatías congénitas (core central, nemalina, centronuclear y desproporción congénita del tipo de fibra) y adquiridas (tóxicas, inflamación).

En otra realización de la presente invención, los pacientes que sufren de un exceso de GDNFR, hipersensibilidad al GDNF, exceso de GDNF, etc., se pueden tratar administrándoles una cantidad efectiva de RNA anti-sentido o de oligodesorribonucleótidos anti-sentido correspondientes con la región del gen codificante para el GDNFR, con lo que se disminuye la expresión del GDNFR.

Los compuestos y los procedimientos de la presente invención pueden utilizarse en condiciones asociadas con una disminución de células hematopoyéticas. Ejemplos de estas enfermedades incluyen: la anemia (incluyendo la anemia macrocítica y aplásica); la trombocitopenia; la hipoplasia; la coagulación intravascular diseminada (DIC); la mielodisplasia; la trombocitopenia inmune (autoinmune) púrpura (ITP); y la ITP inducido por VIH. Adicionalmente, las moléculas de GDNF y GDNFR\alpha pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades trombocíticas mieloproliferativas, así como la trombocitosis derivada de condiciones inflamatorias y en la deficiencia de hierro. El GDNF y el GDNFR\alpha, que conducen a un incremento en la proliferación de células hematopoyéticas, puede también utilizarse para incrementar la repoblación de linajes de células sanguíneas maduras en las células que han sufrido quimio- o radio-terapia o en la terapia del transplante de médula ósea. En general, se espera que las moléculas de GDNF y GDNFR\alpha conduzcan a un incremento de la proliferación y/o diferenciación (pero especialmente la proliferación) de las células hematopoyéticas. Las realizaciones preferidas proporcionan el tratamiento para aumentar la hematopoyesis que tiene lugar en el bazo.

Otras aplicaciones terapéuticas potenciales para el GDNF y el GDNFR\alpha, y sus genes, incluyen el tratamiento para promover el crecimiento, la supervivencia y la reparación de las células del riñón o del hígado, incluyendo el tratamiento de las enfermedades y trastornos del riñón. Por ejemplo, la insuficiencia renal aguda hace referencia a una interrupción abrupta de la función renal normal. Esta condición clínica grave puede dar como resultado una gran variedad de mecanismos que incluyen el paro circulatorio (choque), bloqueo vascular, glomerulonefritis y obstrucción del flujo urinario. La insuficiencia renal aguda se presenta frecuentemente como una complicación de la cirugía abdominal o vascular. También, los neonatos con un peso bajo al nacimiento y riesgo elevado, que en la actualidad sobreviven a los problemas de pulmón y corazón gracias a los continuos avances en la asistencia prenatal, pueden morir de las complicaciones de la insuficiencia renal causada por la infección o la toxicidad al fármaco. De especial importancia clínica son los casos de insuficiencia renal asociada con el trauma, la sepsis, las complicaciones post-operativas, o la medicación, en particular los anticuerpos. Los compuestos de la presente invención hallan una utilización en las etiologías relacionadas, directa o indirectamente, con la disfunción del sistema nervioso entérico o el sistema renal. Las condiciones específicas que afectan la GI incluyen, pero no se limitan a la acalasia esofágica, el espasmo esofágico, la esclerodermia (relacionada con la atrofia muscular de la porción del músculo liso del esófago, la debilidad de contracción de los dos tercios inferiores del cuerpo esofágico y la incompetencia del esfínter esofágico inferior, pero también causada por el tratamiento con agentes inmunosupresores), los trastornos como la úlcera duodenal, el síndrome de Zollinger-Ellinson (hipersecreción de ácido causada por factores que incluyen los factores genéticos, el tabaco e influencias nerviosas), la hipersecreción de ácido gástrico, el trastorno de mal absorción, por ejemplo en la diabetes (e hipoparatiroidismo, hipertiroidismo e insuficiencia renal) donde la atonía gástrica, las náuseas, los vómitos, etc., están por lo menos relacionados parcialmente con la disfunción del sistema nervioso simpático/parasimpático. Trastornos adicionales incluyen trastornos de la movilidad intestinal, incluyendo: diverticulosis/diverticulitis; enfermedad de Hirschprung (una enfermedad congénita causada por la ausencia de células ganglionales (plexos de Meissner y Auerbach) en un pequeño segmento del colon distal, generalmente cerca del ano, que se presenta habitualmente en los niños, no siendo diagnosticada hasta la adolescencia o una edad adulta temprana en algunos casos menos severos; megacolon de otros tipos (Hirschprung es un tipo de megacolon); obstrucción pseudo-intestinal aguda o crónica, que es una dismotilidad severa debida a las anomalías de la inervación simpática de las capas del músculo del intestino, o puede ser el resultado secundario de una esclerodermia, diabetes, amiloidosis, otras enfermedades neurológicas, fármacos, o sepsis; y, el estreñimiento crónico, que es un problema grave en los pacientes con retraso mental o trastornos neurológicos, en donde un factor contribuyente es una motilidad gástrica alterada. Condiciones adicionales incluyen pero no se limitan a: disfunción de médula espinal, debido a una interrupción obvia del sistema nervioso entérico; el síndrome de Guillain Barre; la esclerosis múltiple; la pandisautonomia (disfunción del sistema nervioso autónomo); el Parkinson (frecuentemente asociado con motilidad gastrointestinal alterada); la atrofia multi-sistémica (síndrome de Shy Drager), en donde una motilidad del intestino alterada es un característica del síndrome; y, la Porfiria y la amiloidosis que son enfermedades difusas que se manifiestan mediante una neuropatía y a menudo se acompañan de trastornos de la motilidad de GI.

La necrosis o la lesión de los tejidos que expresan el GDNFR\alpha o el GDNF tratables con las composiciones y procedimientos que aquí se proporcionan, incluye la necrosis debida a la infección microbiológica o viral, como por ejemplo la hepatitis vírica, la tuberculosis, la fiebre tiroidea, la tularemia, la brucelosis, la fiebre amarilla y similar, o la necrosis debida a la lesión isquémica derivada de un choque, fallo cardíaco y similar, o de necrosis debida a una reacción aguda o crónica a fármacos y sustancias tóxicas como los quimioterápicos, el cloroformo, el tetracloruro de carbono, el envenenamiento por fósforo, y similar. Tal como se describe aquí, las composiciones y procedimientos de la invención son útiles para el tratamiento de las enfermedades renales al proporcionar un aumento del crecimiento celular tanto de las células renales, como de las células epiteliales renales y las neuronas inervadoras del riñón. Los compuestos y los procedimientos de la presente invención se proporcionan para la reparación de la lesión renal. Sin limitarse a ninguna teoría, se cree que ello puede lograrse, bien directa o indirectamente, estimulando las células del riñón, incluyendo las neuronas inervadoras, para crecer y dividirse. Según ello, se proporciona un procedimiento para la regeneración del tejido renal que incluye las etapas de: preparación de un agonista de GDNFR (p.ej., el GDNFR\alpha soluble formando un complejo con el GDNF) tal como se describe aquí, opcionalmente en combinación con un vehículo aceptable farmacológicamente, o con un factor de crecimiento adicional o una citoquina; y el contacto del tejido renal con la composición, de la cual se administra una cantidad terapéutica. Las inyecciones o los implantes localizados son un procedimiento de liberación preferido. Alternativamente, se pueden extraer los riñones dañados, tratar ex vivo, y reinsertarlos en el huésped después de haberlos reparado.

Los agonistas del GDNFR, incluyendo el GDNF, se pueden administrar durante la hemodiálisis. La hemodiálisis se define como la extracción temporal de la sangre de un paciente con el propósito de extraer o separar las toxinas de ésta y devolverla limpia al mismo paciente. La hemodiálisis está indicada en pacientes renales en los que existe una insuficiencia o una lesión renal, es decir, en casos donde la sangre no se está limpiando adecuada o suficientemente (en particular para eliminar el agua) por los riñones. En el caso de insuficiencia o fallo renal crónico, la hemodiálisis ha de llevarse a cabo de forma repetitiva. Por ejemplo, en la enfermedad renal terminal, cuando ya no es posible el trasplante de riñones o está contraindicado, el paciente deberá dializarse unas 100 a 150 veces por año.

La invención también es de utilidad en los trastornos o condiciones que puedan degenerar en una lesión renal. La invención es útil en algunas terapias inmunosupresoras, donde existen efectos secundarios a la lesión renal, por ejemplo, en la terapia de IDDM en humanos mediante procedimientos diseñados para suprimir la respuesta autoinmune. La terapia que utiliza la ciclosporina A en la diabetes puede provocar lesión renal. La diabetes puede ser el resultado de lesiones tardías características de los vasos sanguíneos de los riñones. Otros ejemplos incluyen las enfermedades renales causadas inmunológica- o no inmunológicamente, como por ejemplo, la glomerulonefritis, la insuficiencia renal aguda, el rechazo del trasplante y la lesión renal causada por sustancias nefríticas, trasplantes renales y lesión tóxica de los riñones. Además, la presente invención es útil en el trasplante de órganos, incluyendo el transporte de órganos para el almacenamiento de cualquier órgano extraído de un donante y asegurar así la protección del órgano durante la duración del trasplante, minimizando cualquier problema que pueda tener lugar hasta la operación de trasplante y asegurar la conservación de dicho organismo en buenas condiciones. El órgano es uno que contiene células que tienen el GDNFR o que presentan una capacidad de respuesta al GDNF. En una realización preferida específica, el órgano es el riñón. La utilización o la intervención con un agonista del GDNFR, incluyendo el GDNF, promete tener éxito en relación con el mantenimiento de la función renal.

Tal como se discutió anteriormente, un objetivo de la presente invención es proporcionar los procedimientos para el tratamiento de mamíferos con disfunciones de los músculos gastrointestinales, o con trastornos de los músculos lisos de cualquier parte del cuerpo. El músculo gastrointestinal está organizado y regulado de forma muy diferente a cualquier otro músculo. Tanto el músculo esquelético como el liso en el tracto gastrointestinal están bajo el control del sistema nervioso entérico que es una red extremadamente compleja de nervios y músculos, que residen en la pared gastrointestinal y orquestra todo el proceso digestivo incluyendo la motilidad, la secreción y la absorción. Los nervios entéricos también están organizados en redes interconectadas denominadas plexos. De éstos, el plexo mientérico, situado entre las capas musculares circular y longitudinal, es el modulador principal de la motilidad gastrointestinal. Recibe impulsos del sistema nervioso central (por las vías vagal y simpática) así como también de las vías reflejas locales. Sus respuestas consisten tanto en señales inhibidoras como en excitantes para el músculo adyacente. La actividad muscular reguladora de la vía neural final en el tracto gastrointestinal está representada, en consecuencia, por las neuronas del plexo mientérico. Un concepto útil, y simplista, es visualizar el tono muscular neto en el tracto gastrointestinal que resulta del equilibrio entre los efectos opuestos de dos sistemas neuronales en el plexo mientérico: uno causante de la contracción muscular (principalmente por la acetilcolina) y el otro causante de la relajación. Ambos tipos de neuronas, sin embargo, se activan por la acetilcolina en el plexo mientérico. El papel de la acetilcolina en la regulación del tono muscular gastrointestinal es en consecuencia complejo. La acetilcolina liberada directamente por los nervios inductores cerca del músculo causa contracción; sin embargo, en el plexo, puede resultar en la inhibición o excitación. Al contrario que el músculo esquelético, ello se realiza fuera del tracto gastrointestinal, que está directamente inervado por los nervios que emanan del sistema nervioso central. La interacción entre el nervio y el músculo en el músculo esquelético fuera del tracto gastrointestinal es mucho más simple; los nervios liberan la acetilcolina que causa la contracción del músculo. Por último, el plexo mientérico es probablemente el más importante pero no el determinante único del tono muscular en el tracto gastrointestinal, de hecho, el tono basal del músculo liso puede visualizarse como resultado de la suma de muchos factores distintos incluyendo el tono intrínseco (biogénico) y las hormonas circulantes, además de la actividad nerviosa. Tal como se indica en los ejemplos, el GDNFR se halla en los músculos GI y en las neuronas inervantes. En consecuencia, la presente invención proporciona composiciones, procedimientos y dispositivos para el tratamiento de los trastornos gastrointestinales incluyendo la acalasia, otros trastornos del esfínter esofágico inferior, la disfunción del esfínter de Oddi, el síndrome del intestino irritable y otros trastornos tal como se discute en la presente invención.

Por ejemplo, se proporciona un procedimiento para tratar el síndrome del intestino irritable (SII), que es otro trastorno motor que consiste en alteraciones de la función intestinal, dolor abdominal y ausencia de patología detectable. El SII se reconoce por sus síntomas, que están influenciados de forma marcada por factores psicológicos y situaciones de estrés. El ISS es uno de los trastornos gastrointestinales más frecuentes. Entre el 20% y el 50% de los pacientes referidos a clínicas gastrointestinales padecen de ISS. Los síntomas aparecen en aproximadamente el 14% de personas aparentemente sanas. Es un síndrome compuesto de varias condiciones con manifestaciones similares. Los síntomas principales del SII (alteraciones de la función intestinal, dolor abdominal e hinchazón) son manifestaciones de motilidad aumentada en el intestino e hipersecreción gástrica ácida. La actividad del GI se modula neuronalmente por el sistema nervioso central (SNC) mediante inervación simpática y parasimpático y por el sistema nervioso entérico (SNE) que reside en el propio tracto GI y que expresa el GDNFR.

En otro aspecto se proporciona la administración de GDNFR\alpha a un mamífero que tiene niveles disminuidos de GDNFR\alpha endógeno o un gen GDNFR\alpha defectuoso, preferentemente en la situación en la que dichos niveles disminuidos conducen a un trastorno patológico, o cuando existe una ausencia de activación de GDNFR\alpha y Ret. En estas realizaciones, cuando se ha de administrar el GDNFR\alpha de tamaño completo al paciente, se contempla que el gen que codifica para el receptor se pueda administrar al paciente mediante la tecnología de la terapia génica.

En las aplicaciones de terapia génica, los genes se introducen en las células con el fin de lograr una síntesis in vivo de un producto genético eficaz terapéuticamente, por ejemplo, para el reemplazamiento de un gen defectuoso. La "terapia génica" incluye tanto la terapia génica convencional, en donde se logra un efecto duradero mediante un único tratamiento, como la administración de agentes terapéuticos génicos, que implica la administración única o repetida de un DNA o mRNA eficaz terapéuticamente. Los RNAs o DNAs antisentido pueden utilizarse como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. Se ha demostrado que los oligonucleótidos antisentido cortos pueden importarse en las células en donde actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares causadas por la incorporación restringida a través de la membrana celular. (Zamecnik y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:4143-4146 (1986)). Los oligonucleótidos pueden modificarse para aumentar su incorporación, p.ej., sustituyendo sus grupos fosfodiéster cargados negativamente por grupos no cargados.

Existen diversas técnicas disponibles para la introducción de ácidos nucleicos en las células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere in vitro a las células en cultivo, o in vivo en las células del huésped deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia in vitro de ácido nucleico en las células de mamífero incluyen la utilización de liposomas, la electroporación, la microinyección, la fusión celular, el DEAE-dextrano, el método de precipitación con fosfato cálcico, etc. Las técnicas de transferencia de genes in vivo preferidas incluyen la transfección con vectores virales (típicamente retrovirus) y la transfección mediada por liposomas-proteínas de la cubierta viral (Dzau y col., Trenes in Biotechnology, 11:205-210 (1993)). En algunas situaciones, es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que lo dirija a las células diana, como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie de la célula diana, un ligando para un receptor en la célula diana, etc. Si se utilizan liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de membrana de superficie celular asociada con la endocitosis puede utilizarse para dirigir y/o facilitar la incorporación, p.ej., las proteínas de la cápside o fragmentos de lo mismo para un tipo celular determinado, los anticuerpos para las proteínas que llevan a cabo la internalización durante el ciclo y las proteínas que dirigen la localización intracelular e incrementan la vida media intracelular. La técnica de la endocitosis mediada por receptor se describe, por ejemplo, por Wu y col., J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987); y Wagner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3410-3414 (1990). Para una revisión sobre el estado actual de los protocolos de marcado de genes y de terapia génica ver Anderson y col., Science, 256:808-813 (1992).

La presente invención también proporciona antagonistas de la activación de GDNFR\alpha (p.ej., el ácido nucleico antisentido de GDNFR\alpha, los anticuerpos neutralizantes). La administración del antagonista de GDFNR\alpha a un mamífero con niveles aumentados o excesivos de activación de GDNFR\alpha endógena, preferentemente en la situación en donde niveles aumentados de GDNFRE\alpha o activación de Ret conducen a un trastorno patológico.

En una realización, las moléculas de antagonistas de GDNFR\alpha se pueden utilizar para unir el ligando endógeno en el cuerpo, causando en consecuencia que el GDNFR\alpha insensibilizado se transforme y sea capaz de responder al ligando GDNF, especialmente cuando los niveles del ligando de GDNF en el suero exceden los niveles fisiológicos. También, puede ser beneficioso unir el ligando de GDNF endógeno que activa las respuestas celulares no deseadas (como la proliferación de las células tumorales que expresan el GDNFR).

Las composiciones farmacéuticas de GDNFR\alpha soluble pueden además incluir un GDNF u otro agonista de unión a GDNFR\alpha. Dichas composiciones duales, p.ej., que contienen un complejo GDNFR/GDNFR\alpha, pueden ser beneficiosas si son terapéuticamente útiles para prolongar la vida media del GDNF, proporcionar una reserva de liberación lenta para el GDNF, activar el GDNFR\alpha endógeno o el Ret y/o suplir la falta de GDNFR\alpha en una célula diana que exprese el Ret, transformando la célula para que sea capaz de responder al GDNF.

Las formulaciones terapéuticas del GDNFR\alpha, GDNF, o el agonista de lo mismo, se preparan para el almacenamiento mezclando el GDNFR\alpha, GDNF, o el agonista de lo mismo, con un grado de pureza deseado con, opcionalmente, vehículos aceptables fisiológicamente, excipientes o estabilizantes (Remington Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Osol, A., Ed., (1980)), en la forma de una pasta liofilizada o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes, o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones como el fosfato, el citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes como el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como la albúmina sérica, la gelatina, o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; aminoácidos como la glicina, la glutamina, la esparraguina, o la lisina; los monosacáridos, los disacáridos y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, la manosa, o las dextrinas; los agentes quelantes como el EDTA; los alcoholes de azúcar como el manitol o el sorbitol; iones formadores de sales como el sodio; y/o tensoactivos no-iónicos como el Tween, Pluronics o el polietilén glicol (PEG).

El GDNFR\alpha, el GDNF o el agonista de lo mismo, también pueden incluirse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente), en sistemas de liberación del fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microsferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nano-cápsulas), o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington Pharmaceutical Sciences, supra.

El GDNFR\alpha, el GDNF, o el agonista de lo mismo, a utilizar para la administración in vivo han de ser estériles. Ello se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de o después de la liofilización y reconstitución. El GDNFR\alpha, GDNF, o el agonista de lo mismo, se almacenarán generalmente en forma liofilizada o en solución.

Las composiciones terapéuticas del GDNFR\alpha, GDNF, o el agonista de lo mismo, se colocan en general en un recipiente con un acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica.

La ruta de administración del GDNFR\alpha, GDNF, o del agonista de lo mismo estará de acuerdo con los procedimientos conocidos, p.ej., las rutas expuestas anteriormente para indicaciones específicas, así como las rutas generales de inyección o infusión por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, o intralesional, o sistemas de liberación sostenida tal como se indica más adelante. El GDNFR\alpha, GDNF o agonista de lo mismo, se administran de forma continua mediante infusión o inyección de bolo. En general, cuando la enfermedad lo permita, se debería formular y dosificar el GDNFR\alpha, GDNF, o el agonista de lo mismo, para su liberación específica de sitio. La administración puede ser continua o periódica. La administración puede lograrse mediante una bomba implantable constante o programable, o mediante inyecciones periódicas.

Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la proteína, estando dichas matrices en la forma de artículos moldeados, p.ej., láminas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen los poliésteres, los hidrogeles (p.ej., poli(2-hidroxietil-metacrilato) tal como se describe por Langer y col., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982) o poli(vinilalcohol)), los poliláctidos (patente americana U.S., 3.773.919, patente europea EP 58.481), los copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato (Sidman y col., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), el acetato de etilén-vinilo no degradable (Langer y col., supra), los copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico degradables como el Lupron Depot^{TM} (microesferas inyectables compuestas del copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolido) y el ácido poli-D-(-)3-hidroxibutírico (patente europea EP 133.988).

Mientras que los polímeros como el etilén-vinil acetato y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante 100 días, algunos hidrogeles liberan las proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando las proteínas se encapsulan en el cuerpo durante un largo tiempo, pueden desnaturalizarse o formar agregados como resultado de su exposición a la humedad a 37ºC, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y de cambios posibles en la inmunogenicidad. Las estrategias racionales pueden ser de utilidad para la estabilización de proteínas dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través de un intercambio tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse modificando los residuos sulfidrilos, liofilizándolos a partir de soluciones acídicas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices poliméricas específicas.

Las composiciones de liberación sostenida del GDNFR\alpha, GDNF, o del agonista de lo mismo, también incluyen el GDNFR\alpha, GDNF, o el agonista de lo mismo atrapado en liposomas. Los liposomas que contienen el GDNFR\alpha, GDNF o el agonista de lo mismo, se preparan mediante procedimientos conocidos per se: patente DE 3.218.121; Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82:3688-3692 (1985); Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980); patentes europeas EP 52.322, EP 36.576, EP 88.046, EP 143.949, EP 142.641; patente japonesa 83-118008; patentes americanas U.S. 4.485045 y 4.544.545; y la patente europea EP 102.324. Generalmente, los liposomas son de tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 Angstroms) en donde el contenido lipídico es superior a aproximadamente 30 moles % de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada a la terapia adecuada.

Cuando el GDNFR\alpha, GDNF, o el agonista de los mismo se aplica tópicamente, se combina adecuadamente con otros ingredientes como los vehículos y/o adyuvantes. No existen limitaciones en la naturaleza de estos otros ingredientes, excepto que deben ser fisiológicamente aceptables y eficaces para su administración deseada y no pueden degradar la actividad de los ingredientes activos de la composición. Ejemplos de vehículos adecuados incluyen ungüentos, cremas, geles, o suspensiones con o sin colágeno purificado. Las composiciones también pueden impregnarse en parches transdérmicos, emplastes y vendajes, preferentemente en la forma líquida o semi-líquida.

Para la obtención de una formulación en gel, el GDNFR\alpha, GDNF o el agonista de lo mismo formulado en una composición líquida, se puede mezclar con una cantidad de efectiva de polisacárido soluble en agua, o polímero sintético como el PEG para formar un gel de viscosidad adecuada para aplicar tópicamente. El polisacárido que puede utilizarse incluye, por ejemplo, los derivados de la celulosa como los derivados de la celulosa esterificada, incluyendo las alquil celulosas, las hidroxialquil celulosas y las alquilhidroxialquil celulosas, por ejemplo, la metilcelulosa, la hidroxietil celulosa, la carboximetil celulosa, la hidroxipropil metilcelulosa y la hidroxipropil celulosa; el almidón y el almidón fraccionado; el agar, el ácido algínico y los alginatos; la goma arábica; la agarosa; los carragenanos; los dextranos; las dextrinas; los fructanos; la inulina; los mananos; los xilanos; los arabinanos; los quitosanos; los glicógenos; los glucanos; y los biopolímeros sintéticos; así como las gomas como la goma xantano; la goma guar; la goma de semilla de algarrobo; la goma arábica; la goma de adragante; la goma Baraya; y derivados y mezclas de lo mismo. El agente gelificante preferido en la presente invención ha de ser inerte en los sistemas biológicos, no tóxico, sencillo de preparar y no demasiado líquido ni demasiado viscoso, y no deberá desestabilizar el GDNFR\alpha, ni el GDNF, ni el agonista de lo mismo, que se hallarán en su interior.

Preferentemente, el polisacárido es un derivado de la celulosa esterificada, más preferentemente uno bien definido, purificado y citado en la USP, p.ej, la metilcelulosa y derivados de la hidroxialquil celulosa, como la hidroxipropil metilcelulosa. El más preferido aquí es la metilcelulosa.

El polietilén glicol de utilidad para la gelificación es generalmente una mezcla de PEGs de bajo y alto peso molecular para obtener la viscosidad adecuada. Por ejemplo, una mezcla de un PEG de peso molecular de 400-600 con uno de un peso molecular de 1500 sería eficaz para este propósito si se mezclan en la proporción adecuada para obtener una pasta.

El término "soluble en agua" tal como se aplica a los polisacáridos y PEGs significa que incluye soluciones y dispersiones coloidales. En general, la solubilidad de los derivados de celulosa se determina por los grados de sustitución de grupos de éter. Los derivados estabilizantes de utilidad aquí deberían tener una cantidad suficiente de cada uno de los grupos éter por unidad de glucosa anhidra en la cadena de celulosa para convertir los derivados en solubles en agua. Un nivel de sustitución de éter de por lo menos 0,35 grupos de éter por unidad de glucosa anhidra es generalmente suficiente. Adicionalmente, los derivados de la celulosa pueden estar en la forma de sales de metales alcalinos, por ejemplo, sales de Li, Na, K o Cs.

La metilcelulosa se utiliza en el gel y preferentemente comprende aproximadamente del 2-5%, más preferentemente aproximadamente el 3% del gel y el GDNFR\alpha, GDNF, o el agonista de lo mismo, están presentes en una cantidad de aproximadamente 300-1000 mg por mol de gel.

Los dispositivos de membrana implantables y semipermeables son de utilidad como medios de liberación de fármacos en ciertas circunstancias. Por ejemplo, se pueden encapsular las células que secretan el GDNFR, el GDNF, o el agonista de lo mismo, o las quimeras, y dichos dispositivos se pueden implantar en un paciente, por ejemplo, en el cerebro de pacientes que padecen de la enfermedad de Parkinson. Ver, la patente americana U.S. 4.892.538 de Aebischer y col., la patente americana U.S. 5.011.472 de Aebischer y col.; la patente americana U.S. 5.106.627 de Aebischer y col.; la patente internacional WO 91/10425; la patente internacional WO 91/10470; Winn y col., Exper. Neurology, 113:322-329 (1991); Aebischer y col., Exper. Neurology, 111:269-275 (1991); y Tresco y col., ASAIO, 38:17-23 (1992). Según ello, también se incluye un procedimiento para prevenir o tratar la lesión de un nervio o la lesión a otras células que expresan el GDNFR o el GDNF, p.ej., el riñón, tal como se muestra en la presente invención, que comprende la implantación de células que secretan el GDNFR\alpha, el GDNF, o el antagonista, según se requiera para cada condición en particular, en el cuerpo de pacientes que lo necesiten. Por último, la presente invención incluye un dispositivo de implantación, para prevenir o tratar la lesión nerviosa o la lesión en otras células tal como se muestra aquí, que contiene una membrana semipermeable y una célula que secreta el GDNFR, el GDNF, o el agonista de lo mismo, (o el antagonista según sea necesario para cada condición en particular) encapsulado dentro de la membrana, siendo dicha membrana permeable al GDNFR, el GDNF, o agonista de lo mismo, e impermeable a los factores perjudiciales para las células del paciente. Las propias células del paciente, transformadas para producir el GDNF o el GDNFR ex vivo, podrían implantarse directamente en el paciente, opcionalmente sin encapsularse. La metodología para la encapsulación de membranas de células vivas es familiar para los expertos en la materia, y la preparación de las células encapsuladas y su implantación en pacientes puede lograrse fácilmente tal como se conoce en la materia. La presente invención incluye, en consecuencia, un procedimiento para la prevención o el tratamiento de la lesión celular, preferentemente la lesión nerviosa, mediante la implantación de células en el cuerpo de un paciente que lo requiera. Las células habrán sido seleccionadas por su capacidad natural de generar el GDNFR\alpha, el GDNF, o el agonista de lo mismo, o habrán sido diseñadas para secretar el GDNFR\alpha, el GDNF, o el agonista de lo mismo. Preferentemente, el GDNFR\alpha secretado es el GDNFR\alpha maduro, humano y soluble cuando el paciente es el hombre. El GDNF maduro humano (patente internacional WO 93/06116) es la forma preferida de GDNF. Los implantes son preferentemente no-inmunogénicos y/o previenen que las células implantada inmunógenicas sean reconocidas por el sistema inmune. Para la liberación en el SNC, una localización preferida para el implante es el líquido cefalorraquídeo de la médula espinal.

Una cantidad eficaz de GDNFR\alpha, GDNF, o del agonista de lo mismo, para utilizar terapéuticamente dependerá por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, de la vía de administración y de la condición del paciente. Según ello, será necesario para los terapeutas calibrar la dosificación y modificar la vía de administración, según sea necesario para obtener el efecto terapéutico óptimo. En general, el médico administrará el GDNFR\alpha, el GDNF, o el agonista de lo mismo, hasta alcanzar una dosificación que logre el efecto deseado. Una dosificación diaria típica para el tratamiento sistémico puede ser de aproximadamente 1 \mug/Kg hasta 10 mg/Kg o más, preferentemente de 1 \mug/Kg a 2 mg/Kg, y más preferentemente de 1 \mug/Kg a 1 mg/Kg, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Como una proposición general alternativa, el GDNFR\alpha, GDNF, o el agonista de lo mismo, se formula y libera al sitio o tejido diana a una dosificación capaz de establecer en el tejido un nivel de GDNFR\alpha, GDNF, o agonista de lo mismo, superior a aproximadamente 0,1 ng/cc hasta una dosis máxima que sea eficaz pero no excesivamente tóxica. Esta concentración intratisular debería mantenerse, si es posible, mediante infusión continua, liberación sostenida, aplicación tópica, implante de células que expresen el GDNFR\alpha (o el GDNF o el agonista de lo mismo), o inyecciones a frecuencias determinadas empíricamente. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante ensayos convencionales de la enfermedad a tratar. Cuando se administra el GDNFR\alpha formando un complejo, o junto con el GDNF, es válida una proporción 100:1 de GDNFR\alpha respecto al dímero de GDNF. Preferentemente, la proporción de 10:1 a 1:10, más preferentemente 1:1, e incluso más preferentemente 2:1, la cual puede reflejar la proporción de unión natural del GDNFR\alpha con el GDNF.

El ácido nucleico de GDNFR\alpha es de utilidad para la preparación del polipéptido GDNFR\alpha mediante técnicas recombinantes aquí ejemplificadas, que pueden utilizarse para la producción de anticuerpos anti-GDNFR\alpha que tienen diversas utilidades descritas más adelante.

El GDNFR\alpha (polipéptido o ácido nucleico) se puede utilizar para incrementar la capacidad de respuesta al GDNF (y así incrementar la supervivencia y modular las vías cadena abajo mediadas por Ret) de las células in vitro. Dichas células deben contener o deben modificarse para contener el Ret de superficie celular. Estas células cultivadas ex vivo pueden exponerse simultáneamente a otros factores neurotróficos conocidos o citoquinas, como los descritos aquí.

En otro aspecto de la invención, el GDNFR\alpha puede utilizarse para la purificación por afinidad de ligandos que se unen al GDNFR\alpha, bien los que suceden de forma natural o los ligandos sintéticos. El GDNF es un ligando preferido para la purificación. En resumen, esta técnica implica: (a) el contacto de una fuente de ligando de GDNF con un GDNFR\alpha inmovilizado en condiciones en las que el ligando GDNF a purificar se adsorbe selectivamente en el receptor inmovilizado; (b) el lavado del GDNFR\alpha inmovilizado y su soporte para eliminar el material no adsorbido; y (c) la elución de moléculas de ligando GDNF del GDNFR\alpha inmovilizado, en donde han sido adsorbidas con un tampón de elución. En una realización preferida en particular de purificación por afinidad, el GDNFR\alpha está unido covalentemente a una matriz o resina inerte y porosa (p.ej., agarosa reaccionada con el bromuro de cianógeno). Se prefiere en especial una inmunoadhesina de GDNFR\alpha inmovilizada en una columna de proteína A. A continuación se hace pasar una solución que contiene el ligando de GDNF a través de este material cromatográfico. El ligando GDNF se adsorbe a la columna y se libera a continuación cambiando las condiciones de elución (p.ej., cambiando el pH o la fuerza iónica). Los ligandos nuevos se pueden detectar controlando el desplazamiento de un ligando de GDNFR\alpha conocido y marcado, como por ejemplo el GDNF biotinilado o marcado con I^{125}.

El GDNFR\alpha se puede utilizar para el rastreo competitivo de agonistas o antagonistas potenciales para la unión al GDNFR\alpha. Dichos agonistas o antagonistas pueden constituir terapéuticos potenciales para el tratamiento de las condiciones caracterizadas por la activación insuficiente o excesiva del GDNFR\alpha, respectivamente.

La técnica preferida para la identificación de moléculas que se unen al GDNFR\alpha utiliza un receptor quimérico (p.ej., el GDNFR\alpha marcado epitópicamente o la inmunoadhesina-GDNFR\alpha) unido a una fase sólida, como por ejemplo una placa de ensayo. Se puede cuantificar la unión de las moléculas candidatas, que están opcionalmente marcadas (p.ej., marcadas isotópicamente), con el receptor inmovilizado. Alternativamente, se puede cuantificar la competición por la unión de un ligando de GDNFR\alpha marcado, como el GDNF-^{125}. Para el rastreo de los antagonistas, el GDNFR\alpha se puede exponer al ligando GDNF seguido por el antagonista putativo, o el ligando GDNF y el antagonista se pueden añadir al GDNFR\alpha simultáneamente y se puede evaluar la capacidad del antagonista para bloquear la activación del receptor.

La presente invención también proporciona los sistemas de ensayo para la detección de la actividad de GDNF, que comprenden las células que expresan niveles elevados de GDNFR\alpha y son por lo tanto extremadamente sensibles incluso a concentraciones bajas de moléculas GDNF o similares a GDNF. La presente invención proporciona los sistemas de ensayo en los que se pueden detectar las actividades del GDNF o las actividades similares a la actividad de GDNF resultantes de la exposición a un compuesto peptídico o no peptídico, mediante la cuantificación de la respuesta fisiológica al GDNF en una célula o línea celular capaz de responder al GDNF, expresando dichas células moléculas de GDNFR\alpha de la invención. Una respuesta fisiológica puede comprender cualquiera de los efectos biológicos del GDNF, incluyendo pero sin limitarse a, los descritos aquí, así como la activación transcripcional de algunas secuencias de ácido nucleico (p.ej., el promotor/elementos intensificadores así como los genes estructurales), el procesamiento relacionado con el GDNF, la traducción o la fosforilación, la inducción de procesos secundarios en respuesta a los procesos inducidos directa o indirectamente por el GDNF, incluyendo los efectos mediados por Ret y los cambios morfológicos, como la aparición de neuritas, o la capacidad para mantener la supervivencia de las células, por ejemplo, las células nodales o del ganglio de raíz dorsal, las motoneuronas, las neuronas dopaminérgicas, las neuronas sensoriales, las células de Purkinje, o las neuronas del hipocampo.

En una realización de la invención, la interacción funcional entre el GDNF y el GDNFR\alpha se puede observar detectando un aumento en la producción de la proteína Ret autofosforilada, o alternativamente, los homólogos ERK-1 o ERK-2 fosforilados (ver Kotzbauer y col., supra).

La presente invención proporciona el desarrollo de nuevos sistemas de ensayo que pueden utilizarse en el rastreo de los compuestos para la actividad de GDNF- o del compuesto similar a GDNF. Las células diana que se unen con el GDNF pueden producirse mediante transfección con el ácido nucleico que codifica para el GDNFR\alpha, o pueden identificarse y segregarse mediante, por ejemplo, la selección de células activada por fluorescencia, la sedimentación de rosetas, o por dilución limitante. Una vez que se han producido o identificado las líneas de células diana, puede ser deseable seleccionar las células que sean excepcionalmente sensibles al GDNF. Dichas células diana pueden portar un número mayor de moléculas de GDNFR\alpha; las células diana que contienen una relativa abundancia de GDNFR\alpha se pueden identificar seleccionando las células diana que se unan a niveles elevados de GDNF, por ejemplo, marcando las que expresan niveles elevados con el GDNF etiquetado con fluoróforos seguido por la detección con inmunofluorescencia y la tría de células. Alternativamente, las células que son excepcionalmente sensibles al GDNF pueden presentar una fuerte respuesta biológica a la unión al GDNF, como un aumento agudo de los efectos mediados por Ret o en los productos génicos inmediatamente tempranos como el c-fos o c-jun. Al desarrollar sistemas de ensayo utilizando células diana que son extremadamente sensibles al GDNF, la presente invención proporciona los procedimientos de rastreo de la actividad del GDNF o GDNF-similar, capaces de detectar niveles bajos de actividad GDNF.

En particular, utilizando técnicas del DNA recombinantes, la presente invención proporciona las células diana de GDNF que están diseñadas para ser altamente sensibles al GDNF. Por ejemplo, el gen del receptor de GDNF se puede insertar en las células que sean naturalmente sensibles al GDNF para que se exprese el gen GDNFR recombinante a niveles elevados y las células diana diseñadas resultantes expresen un número elevado de GDNFRs en su superficie celular. Alternativamente, o adicionalmente, las células diana pueden diseñarse para comprender un gen recombinante que se exprese a niveles elevados en respuesta a la unión de receptor/GDNF. Un tal gen recombinante puede estar asociado preferentemente con un producto fácilmente detectable. Por ejemplo, y sin ánimo de limitación, las regiones control de la transcripción (es decir, las regiones promotor/intensificador) de un gen inmediato temprano pueden utilizarse para controlar la expresión de un gen reportero en una construcción que puede introducirse en las células diana. La construcción del gen inmediato temprano/gen reportero, cuando se expresa a niveles elevados en las células diana gracias a un promotor/intensificador fuerte o a un número elevado de copias, puede utilizarse para producir una respuesta amplificada para la unión a GDNFR. Por ejemplo, y sin ánimo de limitación, un promotor sensible a GDNF puede utilizarse para controlar la expresión de genes reporteros detectables incluyendo la \beta-galactosidasa, la hormona de crecimiento, la cloramfenicol acetil-transferasa, la neomicina fosfotransferasa, la luciferasa, o la \beta-glucuronidasa. La detección de los productos de estos genes reporteros, bien conocidos por los expertos en la materia, puede servir como indicador sensible para la actividad del GDNF o GDNF-similar de los compuestos farmacéuticos.

Las construcciones de los genes codificantes para GDNF o GDNFR\alpha discutidas aquí (p.ej., ECD soluble) pueden insertarse en las células diana utilizando un procedimiento conocido en la materia, incluyendo pero sin limitarse a la transfección, la electroporación, los procedimientos del fosfato cálcico/dextrán DEAE y el disparo de células. Las construcciones y las células diana diseñadas se pueden utilizar para la producción de animales transgénicos que porten las construcciones anteriormente mencionadas como los transgenes, de los que se pueden seleccionar las células diana que expresan el GDNF- o el GDNFR\alpha utilizando los procedimientos aquí comentados.

Los ácidos nucleicos que codifican para el GDNFR, preferentemente de especies no-humanas, como la proteína murina o la de rata, pueden utilizarse para generar animales transgénicos o animales "knock out" que, a su vez, son útiles en el desarrollo y rastreo de reactivos de utilidad terapéutica. Un animal transgénico (p.ej., un ratón) es un animal que tiene células animales que contienen un transgén, que se ha introducido en el animal o un ancestro del animal en un estadio prenatal, p.ej., en el embrión. Un transgén es un DNA que se ha integrado en el genoma de una célula de la que se desarrolla un animal transgénico. En una realización, el cDNA humano y/o de rata que codifica para el GDNFR\alpha, o para una secuencia adecuada de lo mismo, se puede utilizar para clonar el DNA genómico que codifica para el GDNFR de acuerdo con las técnicas establecidas. Y las secuencias genómicas se pueden utilizar para generar los animales transgénicos que contengan las células que expresan el DNA que codifica para el GDNFR. Los procedimientos para la generación de animales transgénicos, en particular animales como el ratón, se han vuelto convencionales en la materia y se describen, por ejemplo, en las patentes americanas U.S. 4.736.866 y 4.870.009. En general, se pueden dirigir células determinadas para que incorporen el transgén GDNFR con intensificadores específicos de tejido, lo que dará como resultado el efecto deseado de tratamiento. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén, que codifica para el GDNFR, introducido en la línea germinal del animal en un estadio embrionario, se pueden utilizar para examinar el efecto de la expresión incrementada del DNA que codifica para el GDNFR. Dichos animales se pueden utilizar como animales de test para los reactivos que confieren protección de, por ejemplo, las enfermedades relacionadas con el GDNF. De acuerdo con esta faceta de la invención, tras tratar a un animal con el reactivo, una incidencia disminuida de la enfermedad en comparación con los animales no tratados y que también llevan el gen, indicaría una indicación terapéutica potencial para la enfermedad.

Los ratones transgénicos que portan minigenes son los actualmente preferidos. En primer lugar, se crea una construcción que expresa la enzima y se selecciona basándose en la expresión de un cultivo de células, tal como se describió en los Ejemplos. A continuación, se construye un minigén capaz de expresar la enzima de fusión utilizando técnicas conocidas. En particular, los huéspedes preferidos son aquellos que contienen construcciones de minigenes con un elemento regulador de la transcripción que sea específico del tejido para la expresión.

Se generan ratones transgénicos que expresen el minigén de GDNFR utilizando técnicas conocidas, que implican, por ejemplo, la extracción del óvulo fertilizado, la microinyección de la construcción del DNA en el pronúcleo masculino y la reinserción del óvulo en el útero de madres de acogida pseudopreñadas y manipuladas hormonalmente. Alternativamente, las quimeras se realizan utilizando técnicas conocidas de, por ejemplo, células madre embrionales (Rossant y col., Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. 339:207-215 (1993)) o células germinales primordiales (Vick y col., Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. 251:179-182 (1993)) de las especies huésped. La inserción del transgén puede evaluarse mediante transferencia de Southern del DNA preparado a partir de las colas de los ratones de la descendencia. Dichos ratones transgénicos se retro-cruzan para generar homocigotos.

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En la actualidad, está bien establecido que los transgenes se expresan de forma más eficiente si contienen intrones en el extremo 5', y si éstos son intrones naturales (Brinster y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:836 (1988); Yokode y col., Science 250:1273 (1990)).

Los ratones transgénicos que expresan el minigén del GDNFR se crean utilizando procedimientos bien establecidos para la creación de ratones transgénicos. Los ratones transgénicos se construyen utilizando ahora procedimientos estándares (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:836 (1988); Yokoda y col., Science 250:1273 (1990); Rubin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:434 (1991); Rubin y col., Nature 353:265 (1991)). Los huevos fertilizados de los apareamientos programados se recogen del oviducto mediante un lavado suave con PBS y se microinyectan con hasta 100 nanolitros de una solución de DNA, liberando aproximadamente 10^{4} moléculas de DNA en el pronúcleo masculino. Los huevos inyectados con éxito se re-implantan en las madres de adopción pseudopreñadas mediante transferencia por el oviducto. Menos del 5% de los huevos microinyectados producen descendencia transgénica y sólo aproximadamente 1/3 de éstos expresan activamente el transgén: este número está presumiblemente influenciado por el sitio por donde entra el transgén en el genoma.

La descendencia transgénica se identifica demostrando la incorporación del transgén microinyectado en sus genomas, preferentemente preparando DNA de secciones pequeñas de la cola y analizándolo mediante transferencia de Southern por la presencia del transgén ("transferencias de colas"). Una sonda preferida es un segmento de una construcción de un minigén que únicamente está presente en el transgén y no en el genoma del ratón. Alternativamente, la sustitución de una secuencia natural de codones en el transgén con una secuencia distinta que todavía codifique para el mismo péptido proporciona una única región identificable en el análisis de DNA y de RNA. Los ratones "fundadores" transgénicos identificados de esta manera se cruzan con ratones normales para producir heterocigotos, que se retro-cruzan para generar una línea de ratones transgénicos. A continuación, se examinan las transferencias de colas de los ratones de cada generación hasta que la cepa se ha establecido y es homocigota. Cada ratón fundador creado con éxito y su cepa varía de las otras cepas en la localización y el número de copias de los transgenes insertados en el genoma del ratón, y por ello presentan niveles ampliamente variados de expresión del transgén. Los animales seleccionados de cada línea establecida se sacrifican a los 2 meses de edad y la expresión del transgén se analiza mediante transferencia de Northern del RNA procedente del hígado, músculo, grasa, riñón, cerebro, pulmón, corazón, bazo, gónadas, glándulas adrenales e intestinos.

Alternativamente, se pueden utilizar los homólogos no humanos del GDNFR para construir un animal "Knock out" de GDNFR, es decir, con un gen defectuoso o alterado que codifique para el GDNFR, como resultado de una recombinación homóloga entre el gen GDNFR endógeno y un DNA de GDNFR genómico alterado introducido en una célula embrional del animal. Por ejemplo, el cDNA del GDNFR murino se puede utilizar para clonar el DNA del GDNFR genómico de acuerdo con las técnicas establecidas. Una porción de DNA del GDNFR genómico (p.ej., como un exón que codifique para, por ejemplo, un dominio extracelular) se puede delecionar o reemplazar por otro gen, como un gen que codifique para un marcador seleccionable y que puede utilizarse para controlar la integración. Generalmente, se incluyen diversas kilobases de DNA flanqueante inalterado (tanto en el extremo 5' como 3') en el vector (ver p.ej., Thomas y Capecchi, Cell 51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homóloga). El vector se introduce en una línea de células madres embrionales (p.ej., mediante electroporación) y se seleccionan las células en las que el DNA introducido se ha recombinado homólogamente (ver p.ej., LI y col., Cell, 69:915 (1992)). Las células seleccionadas se inyectan en un blastocisto de un animal (p.ej., un ratón) para formar quimeras de agregación (ver p.ej., Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach,E. J. Robertson, ed., (IRL, Oxford, 1987), pág. 113-152). Un embrión quimera puede implantarse en un animal de adopción, hembra pseudopreñada adecuada y llevar a término el embrión para crear un animal "knock out". La progenie que lleva el DNA recombinante homólogo en sus células germinales se puede identificar mediante técnicas estándares y utilizar para procrear animales en los que las células contengan el DNA recombinado homólogo. Los animales Knock out se pueden caracterizar por su capacidad para aceptar injertos, rechazar tumores y defenderse contra las enfermedades infecciosas, con lo que se pueden utilizar estudios de inmunología básica.

Además de los procedimientos anteriores, que pueden utilizarse para preparar moléculas de DNA recombinantes y de animales huésped transformados de acuerdo con la práctica de la presente invención, se pueden utilizar otras técnicas y modificaciones conocidas de lo mismo para llevar a cabo la práctica de la invención. Por ejemplo, la patente americana U.S. 4.736.866 describe los vectores y procedimientos para la producción de un animal transgénico eucariota no humano, cuyas células germinales y somáticas contienen una secuencia génica introducida en el animal, o un ancestro del animal, en un estadio embrional. La patente americana U.S. 5.087.571 describe un procedimiento para proporcionar un cultivo de células que comprende: (1) proporcionar un mamífero transgénico no humano, conteniendo todas sus células germinales y somáticas una secuencia génica recombinante introducida en un estadio embrional; y (2) cultivar una o más de dichas células somáticas. La patente americana U.S. 5.175.385 describe los vectores y los procedimientos para la producción de un ratón transgénico cuyas células somáticas y germinales contienen y expresan un gen a niveles suficientes para proporcionar el fenotipo deseado en el ratón, habiendo sido introducido el gen en el mencionado ratón o un ancestro en un estadio embrionario, preferentemente mediante microinyección. Un promotor constitutivo parcialmente, el promotor de la metalotioneina, se utilizó para conducir la expresión génica heteróloga. La patente americana U.S. 5.175.384 describe un procedimiento de introducción de un transgén en un embrión mediante infección del embrión con un retrovirus que contenga el transgén. La patente americana U.S. 5.175.383 describe construcciones de DNA que contienen un gen, homólogo a la célula huésped, unido operativamente a un promotor heterólogo e inducible eficaz para la expresión de gen en los tejidos urogenitales de un ratón, habiendo sido introducido el transgén en el ratón en un estadio embrional para producir un ratón transgénico. Aún cuando se introduzca un gen homólogo, el gen se puede integrar en un cromosoma del ratón en un sitio distinto de la localización de la secuencia codificante endógena. El promotor de MMTV viral se ha descrito como un promotor inducible adecuado. La patente americana U.S. 5.162.215, describe los procedimientos y los vectores para la transferencia de genes en especies aviares, incluyendo especies de explotación ganadera como el pollo, el pavo, la codorniz o el pato, utilizando células madre pluripotentes de embriones para producir animales transgénicos. La patente americana U.S. 5.082.779 describe promotores de expresión específica de la hipófisis para utilizar en la producción de animales transgénicos capaces de expresar un gen de forma tejido-específica. La patente americana U.S. 5.075.229 describe los vectores y procedimientos para producir animales transgénicos, quiméricos, cuyas células hematopoyéticas del hígado contienen y expresan un gen funcional conducido por un promotor específico de hígado, inyectando en la cavidad peritoneal de un feto huésped los vectores descritos de modo que el vector se integre en el genoma de las células hepáticas hematopoyéticas.

Aunque algunas de las patentes y publicaciones anteriormente mencionadas están dirigidas a la producción o la utilización de un producto o material génico en particular que no se hallan dentro del ámbito de la presente invención, los procedimientos descritos aquí pueden modificarse fácilmente para la práctica de la invención descrita en esta especificación por los expertos en materia de fermentación e ingeniería genética.

Los sistemas de ensayo de la presente invención permiten el rastreo eficaz de compuestos farmacéuticos para utilizar en el tratamiento de las enfermedades asociadas al GDNF. Por ejemplo, y sin ánimo de limitación, puede ser deseable rastrear un agente farmacéutico para la actividad de GDNF y la eficacia terapéutica en la degeneración renal o cerebelar. En una realización de la invención, las células sensibles al GDNF pueden identificarse, aislarse y cultivarse luego en micropocillos de placas de cultivo de multipocillos. El medio de cultivo con el agente test añadido, o el GDNF añadido en múltiples diluciones puede añadirse a los pocillos junto con controles adecuados. Las células se pueden examinar a continuación por su mejora de la supervivencia, la aparición de neuritas y otros factores, y se puede determinar la actividad del agente test y del GDNF, así como sus actividades relativas. Por ejemplo, se pueden identificar los compuestos similares al GDNF, que al igual que el GDNF pueden prevenir la muerte celular de motoneuronas en respuesta a una agresión tóxica o axotómica, por ejemplo, podrían utilizarse las motoneuronas sensibles al GDNF, o las neuronas entéricas en sistemas de ensayo para identificar los compuestos de utilidad para el tratamiento de motoneuronas o de enfermedades del sistema nervioso entérico. Si se halla que una enfermedad particular está asociada con una respuesta defectuosa al GDNF en un tejido determinado, un tratamiento racional de la enfermedad sería proporcionar al paciente GDNF exógeno. Sin embargo, puede ser deseable desarrollar moléculas que tengan una vida media mayor que la del GDNF endógeno, o que actúen como agonistas del GDNF, o que se dirijan a un tejido en particular. Según ello, los procedimientos de la invención pueden utilizarse para producir sistemas de rastreo eficientes y sensibles útiles para identificar moléculas con las propiedades deseadas. Los sistemas de ensayos similares podrían utilizarse para identificar los antagonistas del GDNF.

Además, la presente invención proporciona sistemas de modelos experimentales para el estudio del papel fisiológico del GDNF y su receptor. Dichos sistemas incluyen modelos animales, como (i) animales expuestos a los péptidos del GDNFR\alpha que compiten con el receptor celular por la unión al GDNF y producen en consecuencia una condición mermada en GDNF, (ii)animales inmunizados con el GDNFR; (iii) animales transgénicos que expresan niveles elevados de GDNFR y en consecuencia son hipersensibles a GDNF; y (iv) animales derivados de la utilización de la tecnología de células madres embrionales, en los que los genes GDNFR endógenos se han delecionado del genoma.

La presente invención también proporciona sistemas de modelos experimentales para el estudio del papel fisiológico del GDNF y su receptor. En estos sistemas de modelos, la proteína GDFNR, el fragmento peptídico, o un derivado de lo mismo, pueden suministrarse al sistema o producirse en el propio sistema. Dichos sistemas modelos podrían utilizarse para estudiar los efectos del exceso de GDNF o de carencia de GDNF. Los sistemas de modelos experimentales pueden utilizarse para estudiar los efectos de una respuesta aumentada o disminuida para GDNF en cultivos de células o de tejidos, en todo l animal, en particular en células o tejidos determinados dentro de un animal o en sistemas de cultivo de tejidos, o durante intervalos de tiempo determinados (incluyendo la embriogénesis) en realizaciones en las que la expresión del GDNFR esté controlada por un promotor inducible o regulado durante el desarrollo. En una realización particular de la invención, se puede utilizar el promotor de CMV para controlar la expresión del GDNFR\alpha en animales transgénicos. Los animales transgénicos, tal como se discutió anteriormente, se producen mediante cualquier procedimiento conocido en la materia, incluyendo, pero sin limitarse a la microinyección, la fusión celular, la transfección y la electroporación.

La presente invención también proporciona los sistemas modelo para la enfermedad autoinmune, en los que una respuesta autoinmune está dirigida hacia el GDNFR\alpha. Dichos modelos comprenden animales que han sido inmunizados con cantidades inmunogénicas de GDNFR y se han generado para producir anticuerpos anti-GDNFR y/o inmunidad celular. Para producir un sistema de dicho modelo, puede ser deseable administrar el GDNFR junto con un adyuvante inmune.

Por ejemplo, y sin ánimo de limitación, un sistema de modelo experimental puede crearse para ser utilizado en el estudio de los efectos de un exceso de actividad de GDNF. En dicho sistema, la respuesta al GDNF puede incrementarse diseñando un número aumentado de GDNFR en las células del sistema modelo en relación con las células que no tienen tal diseño. Estas células podrían también expresar el Ret u otra molécula de señalización capaz de interaccionar con el GDNFR\alpha y de mediar la señal de GDNF. Puede ser preferible proporcionar un número aumentado selectivamente de GDNFRs en las células que normalmente expresan los GDNFRs. Las células se pueden diseñar para producir números aumentados de GDNFR mediante infección con un virus que porte un gen GDNFR de la invención. Alternativamente, el gen del GDNFR puede proporcionarse a las células mediante transfección. Si el sistema modelo es un animal, se puede introducir un gen GDNFR recombinante en las células del animal mediante infección con un virus que porte el gen del GDNFR o por otros medios ya discutidos. Por ejemplo, se puede crear un animal transgénico que porte el gen del GDNFR como un transgén. Con el fin de asegurar la expresión del GDNFR, el gen del GDNFR debería colocarse bajo el control de una secuencia promotora adecuada. Puede ser deseable poner el gen de GDNFR bajo control de un promotor constitutivo y/o específico de tejido. Al incrementar el número de GDNFR celulares, la respuesta al GDNF endógeno puede aumentar. Si el sistema modelo contiene pocos o ningún GDNF, el GDNF puede añadirse al sistema. También puede ser deseable añadir GDNF adicional al sistema modelo con el fin de evaluar los efectos del exceso de actividad de GDNF. La sobreexpresión del GDNF (o GDNF secretado) puede ser el procedimiento preferido para estudiar los efectos de niveles elevados de GDNF en células que ya expresen el GDNFR. Sería más preferible expresar el GNDFR en todas las células (expresión general) y determinar que células están dotadas de sensibilidad funcional al GDNF, permitiendo así la identificación potencial de un segundo componente del receptor, si lo hubiera.

Se puede crear un sistema modelo experimental que pueda ser utilizado para estudiar los efectos de una actividad reducida de GDNF. Este sistema permite la identificación de procesos o neuronas que requieran el GDNF, y que pueden representar dianas terapéuticas potenciales. En dicho sistema, la respuesta al GDNF puede reducirse proporcionando GDNFRs recombinantes que no están asociados con una superficie celular o que se han diseñado para ser ineficaces para la transducción de una respuesta al GDNF. Por ejemplo, la proteína GDNFR, el péptido, o el derivado pueden suministrarse al sistema para que el receptor suministrado pueda competir con el GDNFR endógeno por la unión al GDNF, reduciendo así la respuesta al GDNF. Por ejemplo, la proteína GDNFR, péptido, o derivado puede suministrarse al sistema para que el receptor pueda competir con el GDNFR endógeno por la unión al GDNF, disminuyendo así la respuesta al GDNF. El GDNFR puede ser un receptor aislado que se añade al sistema o se produce por el sistema. Por ejemplo, una proteína GDNFR que carezca del dominio transmembrana puede producirse por las células dentro del sistema, como un GDNFR sin anclaje que pueda ser secretado por la célula productora. Alternativamente, la proteína GDNFR, el péptido o el derivado puede añadirse a un espacio extracelular dentro del sistema. En las realizaciones adicionales de la invención, un gen GDNFR recombinante puede utilizarse para inactivar o "poner fuera de servicio (knock out)" el gen endógeno mediante recombinación homóloga y crear así una célula, tejido o animal deficiente en GDNFR. Por ejemplo, y sin ánimo de limitación, puede diseñarse un gen GDNFR recombinante para contener una mutación insercional, por ejemplo el gen neo, que inactive el GDNFR. Dicha construcción, bajo el control de un promotor adecuado, puede introducirse en una célula, como por ejemplo una célula madre embrional, mediante una técnica como la transfección, la transducción, la inyección, etc. Las células que contengan la construcción pueden entonces seleccionarse por su resistencia a G418. Las células que carezcan de un gen GDNFR intacto pueden a continuación identificarse, por ejemplo mediante transferencia de Southern o transferencia de Northern o mediante el ensayo de expresión. Las células que carezcan de un gen GDNFR intacto podrían fusionarse a las células embrionales tempranas para generar animales transgénicos deficientes en GDNFR. Una comparación de un tal animal con uno que no exprese el GDNF endógeno pondría en evidencia que o bien ambos fenotipos concuerdan completamente o no, lo que implicaría la presencia de factores similares al GDNF o receptores adicionales. Un animal de estas características podría utilizarse para definir las poblaciones celulares específicas, p.ej., las poblaciones neuronales, o cualquier otro proceso in vivo, normalmente dependiente de GDNF o de su receptor. Así, se puede esperar que estas poblaciones o procesos hayan logrado su efecto si el animal no expresa el GDNFR y en consecuencia no responde al GDNF. Alternativamente, una proteína GDNFR recombinante, péptido, o derivado que compita con el receptor endógeno de GDNF puede expresarse en la superficie de las células dentro del sistema, pero puede ser diseñada para que falle en la transducción de una respuesta a la unión a GDNF. Las proteínas GDNFR recombinantes, péptidos, o derivados descritos anteriormente pueden unirse al GDNF con una afinidad similar o distinta a la afinidad del GDNFR endógeno por el GDNF. Para disminuir más eficazmente la respuesta a GDNF, la proteína GDNFR, péptido, o derivado puede unirse al GDNF con una mayor afinidad que la presentada por el receptor nativo. Si la proteína GDNFR, péptido, o derivado se produce dentro del sistema modelo, el ácido nucleico que codifica para la proteína GDNFR, péptido, o derivado puede suministrarse al sistema mediante infección, transducción, transfección, etc., o como un transgén. Tal como se discutió anteriormente, el gen GDNFR puede colocarse bajo control de un promotor adecuado, que puede ser, por ejemplo, un promotor específico de tejido o un promotor inducible, o un promotor regulado durante el desarrollo. En una realización específica de la invención, el gen endógeno GDNFR de una célula puede reemplazarse por un gen GDNFR mutante mediante recombinación homóloga. En otra realización de la invención, la expresión del GDNFR puede reducirse proporcionando células que expresen el GDNFR con una cantidad de RNA o DNA de GDNFR antisentido eficaz para reducir la expresión de la proteína GDNFR.

Los polipéptidos GDNFR\alpha son también útiles como marcadores de peso molecular. Para utilizar un polipéptido GDNFR como un marcador de peso molecular, se realizará una separación de proteínas mediante cromatografía de filtración en gel o SDS-PAGE, por ejemplo, para la proteína cuyo peso molecular se desea determinar en la forma corriente. El GDNFR, preferentemente un GDNFR soluble, y otro marcador de peso molecular se utilizarán como estándares para proporcionar un intervalo de pesos moleculares. Por ejemplo, la fosforilasa b (PM= 97.400), la albúmina sérica bovina (PM = 68.000), la ovalbúmina (PM=46.000), el inhibidor de la tripsina (PM=20.100) y la lisozima (PM= 14.400) pueden utilizarse como marcadores de PM. Los otros marcadores de peso molecular mencionados aquí pueden conseguirse comercialmente de Amersham Corporation, Arlington Heights, IL. Los marcadores de peso molecular se marcarán generalmente para facilitar la detección de lo mismo. Por ejemplo, los marcadores pueden biotinilarse y después de la separación pueden incubarse con estreptavidina-peroxidasa de rábano para poder ser detectados mediante detección lumínica. Los polipéptidos de la invención también hallarán una utilización como aditivos alimentarios para animales. Los ácidos nucleicos de la invención son útiles en la preparación de estos polipéptidos.

El GDNFR\alpha purificado y el ácido nucleico que lo codifica, puede también se vendidos como reactivos para estudiar los mecanismos del GDNFR\alpha y de sus ligandos, para estudiar el papel del GDNFR\alpha y del ligando GDNF en el crecimiento y desarrollo normales, así como el crecimiento y desarrollo anormal, p.ej., en procesos malignos. Las sondas GDNFR se pueden utilizar para identificar las células y los tejidos que son sensibles al GDNF en estados normales o de enfermedad. Por ejemplo, un paciente que padece de un trastorno relacionado con el GDNF puede presentar una anomalía en la expresión del GDNFR. La presente invención proporciona los procedimientos para la identificación de células que son sensibles al GNDF, mediante la detección de la expresión del GDNFR en cada una de las células. La expresión del GDNFR puede ser puesta en evidencia mediante transcripción del mRNA del GDNFR o la producción de la proteína GDNFR. La expresión del GDNFR puede detectarse utilizando sondas que identifiquen el ácido nucleico del GDNFR o proteína. Para detectar la expresión del GDNFR, se puede utilizar una variedad de sonda que sea un ácido nucleico, que se utilizará para detectar el RNA que codifica el GDNFR mediante cualquier procedimiento conocido en la materia, incluyendo, pero sin limitarse a ello, la hibridación in situ, el análisis de la transferencia de Northern, o las técnicas de PCR. Otra variedad de sonda que puede utilizarse es el GDNF etiquetado, tal como se discutido anteriormente.

De acuerdo con la invención, el GDNF etiquetado puede incubarse con las células en condiciones que podrían promover la unión o la adhesión del GDNF al GDNFR en, o sobre dichas células. En algunos casos, esto se puede lograr en condiciones de cultivo estándares. Por ejemplo, en una realización de la invención, las células se pueden incubar durante aproximadamente 30 minutos en presencia de GDNF etiquetado. Si la etiqueta es una molécula de anticuerpo, puede ser preferible permitir que el GDNF se una a las células en primer lugar y luego lavar éstas para eliminar el ligando no unido, seguido por la adición de un marcador anticuerpo anti-GDNF. En otra realización de la invención, el GDNF etiquetado en la superficie de las células sensibles al GDNF, denominadas de aquí en adelante células diana, puede detectarse mediante ensayos roseta en los que las células indicadoras capaces de unirse a la etiqueta se incuban con las células portadoras de GDNF-etiquetado, de modo que las células se adhieren al GDNF-etiquetado en las células diana y las células indicadoras unidas forman grupos similares a rosetas alrededor de las células portadoras del GDNF-etiquetado. Estas rosetas pueden visualizarse mediante técnicas microscópicas estándares sobre las células plaqueadas, o, alternativamente, pueden permitir la separación de las células formadoras de roseta y de las no formadoras mediante centrifugación por densidad. En una realización específica preferida de la invención, las células diana son las células neuronales. En una realización alternativa de la invención, el GDNF-etiquetado sobre la superficie de células diana puede detectarse utilizando técnicas inmunofluorescentes, en donde una molécula reacciona directa o indirectamente con la etiqueta, preferentemente un anticuerpo, y produce luz fluorescente. La fluorescencia puede observarse bajo el microscopio o utilizarse para cribar las células que portan el GDNF-etiquetado mediante técnicas de selección de células activadas por fluorescencia. La presente invención también proporciona los procedimientos para la detección de otras formas de etiquetas, como las etiquetas cromogénicas y las etiquetas catalíticas. Un anticuerpo anti-GDNFR también puede utilizarse como una sonda. Los procedimientos de detección para cualquier etiqueta determinada dependerán de las condiciones necesarias para la producción de una señal a partir de la etiqueta, pero debería ser fácilmente comprendido por un experto en la materia.

Las variantes de GDNFR\alpha son útiles como estándares o controles en los ensayos para el GDNFR\alpha, por ejemplo ELISA, RIA o RRA, siempre que sean reconocidos por el sistema analítico utilizado, p.ej., un anticuerpo anti-GDNFR\alpha.

Los anticuerpos policlonales se generan normalmente en animales mediante inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Ya que el epitopo preferido está en el ECD del GDNFR\alpha, es deseable utilizar GDNFR\alpha ECD o una molécula que comprenda el ECD (p.ej., las inmunoadhesinas-GDNFR\alpha), como el antígeno para la generación de anticuerpos monoclonales o policlonales. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteína que sea inmunogénica en las especies a inmunizar, p.ej., la hemocianina de la lapa, la albúmina sérica, la tiroglobulina bovina, o el inhibidor de la tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo, el éster de maleimidobenzoilo sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), la N-hidroxisuccinimida (a través de residuos lisina), el glutaraldehido, el anhídrido succínico, SOCl_{2}, o R^{1}N=C=NR, en donde R y R^{1} son distintos grupos alquilos.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, los conjugados inmunogénicos o los derivados mediante combinación de 1 mg o 1 \mug del péptido o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes más tarde, se administra un refuerzo a los animales de 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido, o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De 7 a 14 días después, los animales se sangran y se analiza el suero para titular el anticuerpo. Los animales se inyectan con un refuerzo hasta que se alcanza un título de anticuerpos en la meseta de producción de anticuerpos. Preferentemente, el animal se estimula con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína distinta y/o a través de un reactivo de unión distinto. Los conjugados también pueden realizarse en cultivos de células recombinantes como proteínas de fusión. Para incrementar la respuesta inmune, también son adecuados los agentes agregantes como el alumbre.

Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una población de anticuerpos esencialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por la posibilidad de ocurrencia de mutaciones naturales que pueden presentarse en cantidades menores. Así, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como no procedente de una mezcla de anticuerpos discretos.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden generarse utilizando el procedimiento del hibridoma descrito en primer lugar por Kohler y col., Nature, 256:495 (1975), o mediante procedimientos del DNA recombinante (Cabilly y col., supra).

En el procedimiento del hibridoma, un ratón u otro animal huésped adecuado, como el hámster, se inmuniza tal como se describió anteriormente para generar linfocitos, que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. A continuación, los linfocitos se fusionan con las células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, como el polietilén glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academia Press, 1986)).

Las células del hibridoma así preparadas se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado, que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parental no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parental carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá la hipoxantina, la aminopterina y la timidina (medio HAT), evitando dichas sustancias el crecimiento de las células deficientes en HPRGT.

Las células de mieloma preferidas son las que se fusionan de forma eficiente, soportan la producción de anticuerpo a nivel elevado y estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio como el HAT. Entre éstas, las líneas de células de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murino, las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles por el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y las células SP-2 disponibles por el American Type Culture Collection,Rockville, Maryland USA. Las líneas de células de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Application, pág. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

El medio cultivo en el que las células crecen se analiza para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producida por células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmuoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis de Scatchard de Munson y col., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después de identificar las células de hibridomas que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante y crecer mediante procedimientos estándares (Goding, supra). Los medios de cultivo para este propósito incluyen, por ejemplo, el medio D-MEM o el RPMI-1640. Además, las células de hibridomas pueden crecerse in vivo como tumores de ascitas en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico, o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales como por ejemplo, la Sepharose-proteína A, la cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

La capacidad de los MAbs para bloquear la unión del GDNF a su receptor puede evaluarse mediante ELISA y un bioensayo con reactivos disponibles (rhGDNFr-IgG; una línea celular de CHO transfectada de forma estable que expresa el GDNFR\alpha). Las actividades neutralizantes se pueden también evaluar mediante ensayo(s) de la supervivencia neuronal.

Los MAbs específicos de GDNFR pueden desarrollarse tal como se discutió anteriormente utilizando por ejemplo, la inmuoadhesina de receptor y la línea celular transfectada para iniciar los protocolos de inmunización y generar los MAbs específicos de GDNFR para utilizar como agonistas o antagonistas potenciales, así como para inmunoquímica, inmunohistoquímica y el desarrollo de ensayos. Los MAbs generados de la fusión de los animales inmunizados pueden rastrearse por sus actividades agonistas o antagonistas mediante bioensayo (p.ej., ensayos de supervivencia neuronal, transducción/fosforilación de señal, ensayos de supervivencia de células del riñón), así como por ELISA y FACS (bloqueo funcional de la unión de GDNF-GDNFR). Las técnicas adecuadas se proporcionan en, por ejemplo, Lucas y col., J. Immunol. 145:1415-1422 (1990); Hoogenraad y col., J. Immunol. Methods 6:317-320 (1983); Moks y col., Eur. J. Biochem. 85:1205-1210 (1986); Laemmli, Nature (London) 227:680-685 (1970); y Towbin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354 (1979).

El DNA que codifica para los anticuerpos se aísla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (p.ej., utilizando sondas oligonucleotídicas capaces de unirse específicamente a los genes que codifican para las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos). Las células de hibridomas sirven como fuente de dicho DNA. Una vez aislado, el DNA se puede colocar en los vectores de expresión, que se transfectan a las células huésped, como por ejemplo las células de E. coli, las células COS de mono, las células de ovario de hámster chino (CHO), o las células de mieloma que de otro modo no producirían proteínas inmunoglobulinas, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias del DNA que codifica para el anticuerpo incluyen Skerra y col., Cur. Opinión in Immunol., 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immuno. Revs., 130:151-188 (1992).

En una realización posterior, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de librerías de fagos de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty y col., Nature, 348:552-554 (1990). Claxon y col., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando librerías de fagos. Las publicaciones subsiguientes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango de nM) mediante barajamiento de cadenas (Mark y col., BiolTechnology, 10:779-783 (1992)), así como la infección combinatorial y la recombinación in vivo como una estrategia para la construcción de librerías de fagos muy grandes (Waterhouse y col., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Así, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El DNA también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de cadenas pesadas y ligeras humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas (Cabilly y col., supra; Morrison, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o mediante la unión covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulínico.

En general, dichos polipéptidos no inmunoglobulínicos se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación con el antígeno de un anticuerpo, para crear un anticuerpo quimérico bivalente que comprenda una sitio de combinación antigénica con especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación antigénica con especificidad por un antígeno distinto.

Los anticuerpos quiméricos o híbridos también pueden prepararse in vitro utilizando procedimientos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que implican agentes de unión. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir utilizando una reacción de intercambio de disulfuros o mediante formación de un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen el iminotiolato y el metil-4-mercaptobutirimidato.

Los procedimientos para anticuerpos humanizantes no humanos son bien conocidos en la materia. En general, un anticuerpo humanizado contiene uno o más residuos aminoacídicos introducidos en él procedentes de una fuente no-humana. Estos residuos aminoacídicos no-humanos son a menudo referidos como residuos de "importación", que son típicamente tomados de un dominio variable de "importación". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las secuencias CDR o CDRs de roedores por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Según ello, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Cabilly y col., supra), en donde esencialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente procedente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son anticuerpos típicamente humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de sitios análogos de anticuerpos de roedores.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a utilizar en la generación de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el procedimiento denominado del "mejor ajuste", se rastrea una librería entera de secuencias de dominios variables humanos conocidos, utilizando la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor. La secuencia humana más cercana a la del roedor se acepta como la región de entramado (FR) humano para el anticuerpo humanizado (Sims y col., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia y col., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro procedimiento utiliza una región marco determinada derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma región marco puede utilizarse para varios anticuerpos humanizados distintos (Carter y col., Proc., Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta y col., J. Imanol., 151:2623 (1993)).

Es además importante que los anticuerpos se humanicen reteniendo una afinidad elevada por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr dicho objetivo, de acuerdo con un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulinas tridimensionales están generalmente disponibles y son familiares a los expertos en la materia. Están disponibles los programas informáticos que ilustran y exponen las estructuras conformacionales tridimensionales probables de las secuencias de inmunoglobulinas candidatas. La inspección de estas estructuras permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia candidata de inmunoglobulina, es decir, el análisis de residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta forma, los residuos FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias consenso y de importación, a fin de obtener la característica deseada del anticuerpo, como por ejemplo la afinidad por el antígeno(s) diana. En general, los residuos CDR están directa y más esencialmente implicados en influenciar la unión al antígeno.

Alternativamente, ahora es posible producir animales transgénicos (p.ej., ratones) capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (J_{H}) en ratones quiméricos y en ratones mutantes de línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la serie de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal resulta en la producción de anticuerpos humanos frente al desafío antigénico. Ver, p.ej., Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits y col., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y col., Year in Immuno., 7:33 (1993). Los anticuerpos humanos pueden también producirse en librerías de expresión de fagos (Hoogenboom y col., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)).

Los anticuerpos biespecíficos (BsAbs) son anticuerpos que tienen especificidades de unión para por lo menos dos antígenos distintos. Los BsAbs se pueden utilizar como agentes dirigidos a tumores o para análisis por la imagen, y pueden utilizarse para dirigir enzimas o toxinas contra una célula que posea el GDNFR\alpha. Dichos anticuerpos pueden derivarse de anticuerpos de tamaño completo o de fragmentos de anticuerpos (p.ej., anticuerpos biespecíficos F(ab')2). De acuerdo con la presente invención, el BsAb puede poseer un brazo que se una al GDNFR\alpha y otro brazo que se una a una citoquina u otro receptor de citoquinas (o una subunidad de lo mismo), como los receptores para el TPO, EPO, G-CSF, IL-4, IL-7, GH, PRL; las subunidades \alpha y \beta de los receptores de IL-3, GM-CSF, IL-5, IL-6, LIF, OSM y de CNTF; o las subunidades \alpha, \beta o \gamma del complejo receptor de IL-2. Por ejemplo, el BsAB puede unirse al GDNFR\alpha y al gp130.

Los procedimientos para los anticuerpos biespecíficos son conocidos en la materia. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de tamaño completo se basa en la coexpresión de dos pares de cadenas pesadas y ligeras de dos inmunoglobulinas, en donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein y col., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la diversidad aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas, estos hibridomas (quadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos distintos, de los que sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que generalmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, es a veces engorrosa y los rendimientos de producto son bajos. En la patente internacional WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993 y en Traunecker y col., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) se describen procedimientos similares.

De acuerdo con una aproximación distinta y más preferida, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a las secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente se realiza con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos la bisagra, las regiones CH2 y CH3. Es preferible tener la primera región constante de cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión de cadenas ligeras, presente en por lo menos una de las fusiones. Los DNAs que codifican para las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulinas y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se co-transfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en las realizaciones, cuando proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas utilizadas en la construcción proporcionan rendimientos óptimos. Sin embargo, cuando la expresión de por lo menos dos cadenas polipeptídicas en iguales proporciones resulta en rendimientos altos, o cuando las proporciones no tienen una significación particular, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un mismo vector de expresión.

En una realización preferida de esta aproximación, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadenas pesadas-ligeras de inmunoglobulina híbrida (que proporcionan una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se ha hallado que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de inmunoglobulina no deseadas, al igual que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una vía fácil de separación. Esta aproximación se describe en la patente internacional WO 94/04690 publicada el 3 de marzo de 1994. Para otros detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, ver, por ejemplo, Suresh y col., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Los anticuerpos biespecíficos incluyen los anticuerpos unidos por enlace cruzado o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a la avidina y el otro a la biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto para, por ejemplo, dirigir a las células del sistema inmune contra células no deseadas (patente americana U.S., 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (patente internacional WO 91/00360, patente internacional WO 92/200373 y patente europea EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden realizarse utilizando cualquiera de los procedimientos de unión adecuados. Los agentes de unión adecuados son bien conocidos en la materia y se describen en la patente americana U.S. 4.676.980, junto con varias de las técnicas de unión.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos de los fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la literatura. Las siguientes técnicas también pueden utilizarse para la producción de fragmentos de anticuerpos bivalentes que no son necesariamente biespecíficos. De acuerdo con estas técnicas, los fragmentos de Fab'-SH se pueden recuperar de E. coli, y a continuación acoplarse químicamente a anticuerpos bivalentes. Shalaby y col., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula F'(a')_{2} de un BsAB completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó de forma separada de E. coli y se sometió al acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el BsAb. El BsAb así formado fue capaz de unirse a las células que sobreespresaban el receptor HER2 y a las células T humanas normales, así como provocar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumores de mama humanos. Ver también, Int. J. Cancers, (Suppl.) 7:45-50 (1992).

Se han descrito diversas técnicas para la realización y el aislamiento de fragmentos de anticuerpos bivalentes directamente del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, los heterodímeros bivalentes se han producido utilizando cremalleras de leucina. Kostelny y col., J. Immunol., 148(5) 1547-1553 (1992). Los péptidos de la cremallera de leucina de las proteína Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos distintos mediante fusión génica. Los homodímeros se redujeron a la región bisagra para formar monómeros y a continuación se re-oxidaron para formar los heterodímeros del anticuerpo. La tecnología de los "diacuerpos" descrita por Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) proporcionó un mecanismo alternativo para generar los fragmentos de BsAb. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un engarce que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Según ello, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, con lo que se forman dos sitios de unión antigénica. También se ha publicado otra estrategia para generar fragmentos de BsAb utilizando dímeros de cadena sencilla Fv(sFv). Ver Gruber y col., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Los agonistas de GDNFR\alpha (incluyendo el GDNF y el complejo GDNF/GDNFR\alpha) y los anticuerpos de agonistas de GDNFR\alpha de la presente invención se pueden utilizar para incrementar la hematopoyesis del bazo, permitiendo cierta repoblación de las líneas celulares sanguíneas en pacientes que siguen quimio- o radio-terapia y transplante. En general, los agonistas o los anticuerpos actuarán para incrementar la proliferación y/o la diferenciación (pero especialmente la proliferación) de las células hematopoyéticas en el bazo. Sin limitarse a ninguna teoría, los agonistas de GDNFR pueden actuar directamente como un factor de crecimiento, supervivencia o diferenciación para las células hematopoyéticas en el bazo y/o pueden actuar indirectamente sobre el entorno estromal (posiblemente por las neuronas implicadas en la inervación esplénica) para producir otro factor responsable del mantenimiento de los linajes hematopoyéticos. En cualquiera de los sucesos, tal como se muestra aquí el agonista de GDNFR, incluyendo el GDNF, presentan un beneficio terapéutico en facilitar el injerto esplénico de los trasplantes de médula ósea después de la irradiación o la quimioterapia o durante la estimulación de la hematopoyesis extramedular en el bazo (que es normal en roedores, pero no se observa habitualmente en el hombre) en aquellas condiciones donde exista una demanda aumentada de producción de células sanguíneas debido a una anemia (eritrocitos de la sangre), infección crónica (neutrófilos), deficiencia de médula ósea (en todos los linajes) y una deficiencia inmune (linfocitos). Los agonistas pueden ser útiles de modo similar para tratar las enfermedades caracterizadas por una disminución de células sanguíneas. Ejemplos de estas enfermedades incluyen: la anemia (incluyendo la anemia macrocítica y aplásica); la trombocitopenia; la hipoplasia; la trombocitopenia inmune (autoinmune) púrpura (ITP); y la ITP inducida por VIH. También, se pueden utilizar los agonistas para tratar un paciente que padezca una hemorragia.

Las aplicaciones terapéuticas para los anticuerpos neutralizantes de GDNF o GDNFR\alpha incluyen el tratamiento de trastornos metabólicos y de tumores celulares en sitios de expresión de GDNFR\alpha, especialmente de aquellos tumores caracterizados por la sobreexpresión de GDNFR\alpha.

Para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos GDNF o GDNFR\alpha de la invención se administran a una mamífero, preferentemente un humano, en una forma de dosificación aceptable fisiológicamente, incluyendo los que se pueden administrar a un humano intravenosamente como un bolo o mediante infusión continua durante un período de tiempo por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, infraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o por inhalación. Los anticuerpos también son adecuados para administrarse mediante vías intratumorales, peritumorales, intralesionales o perilesionales o a la linfa, para producir efectos terapéuticos locales al igual que sistémicos.

Dichas formas de dosificación abarcan vehículos aceptables fisiológicamente que son intrínsecamente no tóxicos y no terapéuticos. Ejemplos de dichos vehículos incluyen intercambios iónicos, aluminio, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, como la seroalbúmina humana, sustancias tamponantes como los fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas de glicérido potásico de ácidos grasos de vegetales saturados, agua, sales, o electrolitos como el sulfato de protamina, el fosfato hidrógeno sódico, el fosfato hidrógeno potásico, el cloruro de sodio, las sales de zinc, el sílice coloidal, el trisilicato de magnesio, la polivinil pirrolidona, las sustancias basadas en celulosa y el PEG. Los vehículos para formas tópicas o basadas en gel de anticuerpos de GDNF, o GDNFR\alpha incluyen los polisacáridos como la carboximetilcelulosa sódica o la metilcelulosa, la polivinilpirrolidona, los poliacrilatos, los polímeros de bloques de polioxi-etilén-polioxipropileno, el PEG y la lana y los alcoholes de lanolina. Para todas las administraciones, las formas de depósito convencionales se utilizan de forma adecuada, por ejemplo, las microcápsulas, las nano-cápsulas, los liposomas, los emplastes, las formas de inhalación, los aerosoles nasales, las tabletas sublinguales y las preparaciones de liberación prolongada. El anticuerpo se formulará típicamente en dichos vehículos a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a 100 mg/ml.

Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos que contienen el anticuerpo de GDNF o GDNFR\alpha. Dichas matrices se hallan en la forma de artículos moldeados, p.ej., láminas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, el poli(2-hidroxietil-metacrilato) tal como se describió por Langer col., supra y Langer, supra, o el poli(vinilalcohol), los poliláctidos (patente americana U.S. 3.773.919), los copolímeros del ácido L-glutámico y del \gamma-etil-L-glutamato (Sidman y col., supra), etilén-vinil acetato no degradable (Langer y col., supra), los copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables como el Lupron Depot^{TM} (las microesferas compuestas del copolímero ácido láctico-ácido glicólico y el acetato de leuprolide) y el ácido poli-D-(-)3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros como el acetato de etilén-vinil y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante unos 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo cortos. Cuando los anticuerpos se encapsulan, éstos permanecen durante largo tiempo en el cuerpo, se pueden desnaturalizar o agregar debido a la exposición a la humedad a 37ºC, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y a posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden elaborar estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se demuestra que es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse modificando los residuos sulfidrilo, liofilizándolos de las soluciones acídicas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices de polímeros específicos.

Las composiciones de anticuerpos de GDNF o GDNFR\alpha de liberación sostenida también incluyen los anticuerpos incorporados en liposomas. Estos se preparan mediante procedimientos conocidos en la materia, tal como se describe en Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77:4030 (1980); y las patentes americanas U.S. 4.485.045 y 4.544.545. Habitualmente, los liposomas son pequeños (aproximadamente de 200-800 Angstroms), de tipo unilamelar en donde el contenido lipídico es mayor que aproximadamente 30 moles % de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para una terapia de anticuerpos óptima. Los liposomas con un tiempo de circulación aumentado se describen en la patente americana U.S. 5.013.556.

Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada del anticuerpo GDNF o GDNFR\alpha dependerá del tipo de enfermedad a tratar, tal como se definió anteriormente, de la gravedad y el rumbo de la enfermedad, de si los anticuerpos se administran con propósitos preventivos o terapéuticos, antes de la terapia, del historial clínico del paciente y respuesta al anticuerpo y del criterio médico. El anticuerpo se administra de forma adecuada al paciente en una sola vez o durante una serie de tratamientos.

Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, una dosis inicial de administración al paciente es de aproximadamente 1 \mug/Kg a 15 mg/Kg de anticuerpo de GDNF- o GDNFR\alpha, mediante, por ejemplo, una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica puede hallarse en el intervalo de aproximadamente 1 \mug/Kg a 100 mg/Kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para las administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se mantiene hasta suprimir los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas convencionales y ensayos.

Para valorar los efectos de los compuestos y el procedimiento de la invención, están disponibles modelos animales. Por ejemplo, para valorar los efectos de tratar riñones lesionados con composiciones que afectan el crecimiento (Toback, 1977; Toback y col., 1977), una inyección intravenosa de 1,0 a 1,1 mg de mercurio por Kg de peso corporal como HgCl_{2} se proporciona para las ratas para inducir un síndrome reversible de insuficiencia renal aguda nonoligúrico. Al cabo de un día, hay incrementos marcados en el suero de la concentración de nitrógeno de urea (SUN), excreción urinaria de sodio y proteínas y necrosis de las células del túbulo proximal. Al segundo día, los incrementos en fosfolípidos, síntesis de DNA y RNA y del índice mitótico son indicativos de que la regeneración celular se lleva a cabo. Al tercer día, el SUN alcanza un máximo y las células epiteliales escamosas aparecen en la membrana basal tubular. En el quinto día, el SUN retorna a sus niveles normales, se alcanza la tasa máxima de síntesis de fosfolípidos y los túmulos se repueblan con más células maduras. Los efectos de la infusión de una composición de factores de crecimiento autocrino sobre la estructura renal se compara con ratas y animales perfundieron con el vehículo sólo durante el curso del síndrome de necrosis tubular aguda inducida por cloruro mercúrico, tal como se discutió anteriormente.

Los anticuerpos de la invención son también de utilidad como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los anticuerpos contra el GNDFR\alpha se inmovilizaron en un soporte sólido, como la resina de Sephadex o papel de filtro, utilizando procedimientos bien conocidos en la materia. El anticuerpo inmovilizado se contacta a continuación con una muestra que contiene el GNDFR\alpha a purificar, y luego se lava el soporte con un solvente adecuado que eliminará esencialmente todo el material en la muestra excepto el GDNFR\alpha unido al anticuerpo inmovilizado. Por último, el soporte se lava con otro solvente adecuado, como el tampón de glicina, pH 5,0, que liberará el GNDFR\alpha del anticuerpo.

Los anticuerpos GDNFR\alpha pueden también utilizarse en los ensayos diagnósticos para GDNFR\alpha, p.ej., la detección de su expresión en células, tejidos, o suero específicos. Para aplicaciones diagnósticas, los anticuerpos característicos se marcarán con una porción detectable. La porción detectable puede ser cualquiera capaz de producir, bien directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un radioisótopo, como el H^{3}, C^{14}, P^{32}, o I^{125}; un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, como por ejemplo el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, o la luciferina; los marcajes isotópicos radioactivos, como por ejemplo, H^{3}, C^{14}, P^{32}, o I^{125}; o una enzima como la fosfatasa alcalina, la beta-galactosidasa, o la peroxidasa de rábano.

Puede utilizarse cualquier procedimiento conocido en la materia para conjugar separadamente la variante del polipéptido con la porción detectable, incluyendo aquellos procedimientos descritos por Hunter y col., Nature, 144:945 (1962); David y col., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain y col., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. And Cytochem., 30:407 (1982).

Los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse en cualquiera de los procedimientos de ensayo conocidos, como los ensayos de unión competitiva, los ensayos de sándwich directo e indirecto y los ensayos de inmunoprecipitación, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pág. 147-158 (CRC Press Inc., 1987).

Los ensayos de unión competitiva se apoyan en la capacidad de un estándar marcado para competir con el analito de la muestra test por la unión con una cantidad limitada de anticuerpo. Por ejemplo, la cantidad de GDNFR\alpha en la muestra test es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se une, los anticuerpos se insolubilizan generalmente antes o después de la competición, a fin de poder separar adecuadamente el estándar y el analito unidos a los anticuerpos del estándar y analito no unidos.

Los ensayos de sándwich implican la utilización de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a un epitopo inmunogénico distinto, o epitopo de la proteína a detectar. En un ensayo sándwich, el analito de la muestra test se une por un primer anticuerpo inmovilizado en un soporte sólido y a continuación un segundo anticuerpo se une al analito, formando así un complejo insoluble de tres partes. Ver, p.ej., la patente americana U.S. 4.376.110. El segundo anticuerpo puede estar marcado con una porción detectable (sándwich directo) o puede cuantificarse utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina marcado con una porción detectable (ensayo sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo sándwich es un ensayo ELISA, en donde la porción detectable es una enzima. Los ejemplos siguientes de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención se ofrecen con propósitos ilustrativos únicamente, y sin intención de limitar el ámbito de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Clonaje de GDNFR\alpha

El tejido del cerebro medio ventral de embriones de rata E14, que contenían neuronas dopaminérgicas sensibles al GDNF, se utilizó para generar una librería de cDNA en un vector de expresión basado en citomegalovirus (Colmes y col., Science, 253:1278-1280 (1991)). Se transfectaron 1500 clones de cDNA en células COS7 y se detectó la expresión de proteínas GDNFR putativas mediante la unión de GDNF yodinado a las células después de una autorradiografía, o mediante tinción del GDNF frío unido con anticuerpos anti-GDNF (Gearing y col., EMBO J., 8:3667-3676 (1989)). Se rastrearon 330 grupos de cDNA. Se identificó un único grupo positivo. Este grupo se subdividió repetidamente en grupos más pequeños y se rastreó cada grupo hasta aislar un único clon de cDNA.

El cDNA (secuencia de ácido nucleico que se muestra en la Figuras 1A-1E) se halló que codificaba para una nueva proteína rica en cisteínas de 468 aminoácidos (denominada "GDNFR\alpha" de tamaño completo), que contiene un péptido señal en su extremo amino-terminal y un fragmento de 23 aminoácidos hidrofóbicos en su extremo carboxi-terminal (ver la Figura 2). Los sitios de glicosilación potenciales están indicados (Figura 2). La secuencia hidrofóbica carboxi-terminal está precedida por un grupo de aminoácidos pequeños (Ala-Ser-Ser), que definen un sitio de corte/unión para la proteína unida a GPI (Micanovic y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:157-161 (1990); Moran y col., J. Biol. Chem., 266:1250-1257 (1991)). Las 30 cisteínas están colocadas de forma que se asemejan al espaciado de cisteínas en la familia de receptores de citoquinas (Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6934-6938 (1990)). El dominio extracelular ("ECD") está flanqueado por el péptido señal y el sito de adhesión GPI.

Además del cDNA aislado mediante clonaje de expresión, se aislaron otros 9 cDNAs de librerías de rata (4) y ratón (5) utilizando el cDNA de GDNFR\alpha como sonda; de éstos, 8 contenían un marco abierto de lectura idéntico al GDNFR\alpha, mientras que un cDNA de rata codificaba para un marco abierto de lectura más corto de 158 aminoácidos, que podía representar una forma aberrante o una forma secretada de esta proteína.

Un clon independiente de cDNA, designado clon 26, que incluye un orf-GDNFR de tamaño completo, se aisló de una librería de cDNA de ratón utilizando un cDNA de GDNFR\alpha como una sonda. La secuencia del extremo 5' del clon(es) de GDNFR\alpha de ratón se proporciona con el codón de inicio de traducción metionina subrayada:

1

Y la secuencia codificante el extremo C-terminal de la secuencia del GDNFR\alpha de ratón se proporciona con el codón serina del extremo C-terminal subrayada:

2

3

Las secuencias son altamente homólogas a las de las Figuras 1A-1E en ambos niveles, aminoacídico y de ácido nucleico.

Otras secuencias hallan una utilización en la presente invención, en particular como sondas para identificar secuencias GDNFR adicionales, incluyendo variantes humanas, que incluyen o comprenden la secuencia derivada de EST humana designada ye83h05.r1 o los fragmentos de lo mismo,

4

y la secuencia derivada de EST humana designada yl70a10.r1 o fragmentos de lo mismo:

5

También son de interés los fragmentos de secuencia derivados de las dos secuencias anteriores y los ácidos nucleicos que los comprenden, o las proteínas que comprenden las secuencia aminoacídica codificada por estos fragmentos, por ejemplo:

6

Ejemplo 2 El GDNFR\alpha se une al GNDF

Para caracterizar la interacción entre el GDNF y el GDNFR\alpha, se realizaron experimentos de unión por enlace cruzado y por competición con células de ovario de hámster Chino que expresaban de forma estable el GDNFR\alpha. Para los experimentos de unión por enlace cruzado, las células de ovario de hámster Chino que expresaban de forma estable el GDNFR\alpha, o una proteína irrelevante, se incubaron durante 1 h a 37ºC en presencia o ausencia de PIPLC (2 \mug/ml) y se resuspendieron a una densidad de 1-2x 10^{6}/ml con medio L15 en hielo, incubándose a 4ºC durante 2 h. Se añadió formaldehído a una concentración final del 4% a temperatura ambiente durante 30 min. Las células se lavaron tres veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato. A continuación, las células se lisaron en tampón de muestra (Tris-HCL 80 mM, pH 6,8, glicerol al 10% (v/v), SDS al 1% (p/v), Bromophenol Blue al 0,025% y se cargaron en geles de SDS-poliacrilamida. Tres proteínas de aproximadamente 85 KD, 180 KD y 200 KD se detectaron como unidas al GDNF I^{125} en las células que expresan el GDNFR\alpha (Figura 3). Estas proteínas estaban ausentes cuando la reacción de unión por enlace cruzado tuvo lugar en presencia de un exceso de GDNF no marcado, o cuando el GDNF-I^{125} se unió a las células que expresaban una proteína de superficie celular irrelevante (Figura 3). La banda proteica de 80-85 KD representa probablemente un complejo formado por el GDNFR\alpha de 58 KD y el monómero de GDNF de 15 KD, mientras que las bandas de alto peso molecular pueden representar la interacción entre el GDNF-I^{125}, el GDNFR\alpha y moléculas de señalización putativas, como el Ret (ver más adelante) o la dimerización del complejo GDNF-I^{125}/GDNFR\alpha. La unión por enlace cruzado del GDNF-I^{125} disminuyó virtualmente después del tratamiento con fosfolipasa C específica de fosfoinositido (PIPLC), una enzima que corta específicamente la unión GPI (Figura 3), lo que soporta la idea de que el GDNFR\alpha es una proteína de unión a GDNF, unida a GPI con alta afinidad.

Los experimentos de unión competitiva indican además que el GDNF se une específicamente y de forma reversible a las células que expresan el GDNFR\alpha. Para los análisis de unión en equilibrio, las células se procesaron como antes y se incubaron con GDNF-I^{125} 50 pM y varias concentraciones de GDNF frío. Se utilizó el programa IGOR para determinar la Kd. La unión por competición del GDNF-I^{125} a las células de ovario de hámster chino que expresan de forma estables el GDNFR\alpha demostraron que el GDNF se une específicamente y reversiblemente al GDNFR\alpha y que las dos proteínas interactúan con una Kd de aproximadamente 63 pM (Figura 4; inserción del análisis de Scatchard).

Tal como se predijo para la presencia de la secuencia consenso para la unión a GPI, el tratamiento con PIPLC de las células seleccionadas por citometría de flujo que expresaban el GDNFR\alpha, redujo la unión del GDNF (Figura 5). Para la selección por citometría de flujo, las células de ovario de hámster chino (CHO) que expresaban el GDNFR\alpha recombinante, o una proteína control no relacionada, bajo el control del promotor de SV40, se incubaron durante 1 h a 37ºC en presencia o ausencia de PIPLC (2 \mug/ml) (Kobe y col., Prot. Exp. Purification, 2:51-58 (1991)). El GDNF (100 ng/ml) y los anticuerpos monoclonales anti-GDNF (60/c; 100 \mug/ml) se añadieron a continuación y se incubaron las células durante 30 min adicionales. Los anticuerpos monoclonales anti-IgG fluorescentes (Vector Inc.) se añadieron y las células se seleccionaron por citometría de flujo con un aparato adecuado. El equilibrio de unión del GDNF-I^{125} con las células que expresan el GDNFR\alpha se redujo en más del 90% después del tratamiento con PIPLC. Estos resultados indican que el GDNFR\alpha es una proteína de unión a GDNF de alta afinidad.

Ejemplo 3 Distribución tisular del GDNFR\alpha

La distribución tisular del mRNA del GDNFR\alpha se examinó utilizando transferencias de Northern, así como el análisis de hibridación in situ. Se realizó el análisis de transferencia de Northern de los transcritos de GDNFR\alpha en tejidos de rata adulta. Las transferencias de Northern se realizaron utilizando múltiples transferencias de tejidos (Clontech, Palo Alto, CA). Se utilizó como sonda toda la región codificante del GDNFR\alpha. Se detectó un transcrito de aproximadamente 3,7 Kb en el cerebro, hígado y riñón adultos en condiciones astringentes.

\newpage

Se realizaron hibridaciones in situ de la sonda de GDNFR\alpha con los tejidos embrionales de rata E14, incluyendo regiones de la sección medio sagital, del cerebro medio ventral, la médula espinal y del riñón. Para la hibridación in situ, los tejidos se fijaron mediante inmersión en formaldehído al 4%, se equilibraron en sacarosa al 20%, se obtuvieron secciones de 20 \mum y se procesaron tal como se describió anteriormente (Fonnum, J. Neurochem., 24:407-409 (1975)), utilizando toda la región codificante del GDNFR\alpha como una sonda. Además, se realizó la hibridación in situ de los embriones de rata E15.5. Los embriones se fijaron mediante inmersión durante toda la noche a 4ºC en paraformaldehido, luego se crioprotegieron durante toda la noche en sacarosa al 15%. Los cerebros y las médulas espinales de rata adulta se congelaron frescos. Los tejidos se seccionaron en fragmentos de 16 \mum y se procesaron para la hibridación in situ utilizando sondas de RNA marcadas con UTP-P32, tal como se describe en Henderson y col., Science 266:1062-1064 (1994). Las sondas sentido y antisentido se derivaron de la región N-terminal del GDNFR\alpha utilizando la T7 polimerasa. El análisis de la reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa inversa se realizó tal como se describe por Henderson y col., Science 266:1062-1064 (1994).

Los transcritos del GDNFR\alpha estuvieron presentes en regiones donde residen las neuronas sensibles al GDNF, incluyendo el cerebro medio ventral (neuronas dopaminérgicas), la médula espinal ventral (motoneuronas espinales) y en subpoblaciones de neuronas de ganglios de raíz dorsal (GRD) dependientes de GDNF. En el sistema nervioso de los embriones de rata E14, se halló mRNA del GDNFR\alpha en regiones como el cerebro medio ventral y la médula espinal ventral, donde residen las neuronas dopaminérgicas las motoneuronas sensibles al GNDF, así como en el puente, la médula oblonga, el plexo coroideo, el primordio de cerebelo, el diencéfalo y la retina. Los transcritos del GDNFR\alpha también se hallaron en los folículos pilosos, los músculos cutáneos, la lengua, el riñón, el esófago, el intestino medio, el estómago, los testículos, el tracto genital y el canal anal. Los transcritos de GDNFR\alpha se hallaron en la capa más externa del tectum del cerebro medio, el plexo coroidal, el primordio del cerebelo, el epitelio olfativo, los cojines de la barba, el tracto genital, el sino urogenital, los testículos, los discos invertebrales y la tráquea de ratas E15.5. En el sistema nervioso de una rata adulta, se detectó mRNA de GDNFR\alpha en los ganglios de la raíz dorsal, la retina, el septo lateral, la células piramidales y granulares en las capas interiores del córtex, núcleo geniculado, cerebro medio ventral, cerebelo superior, tálamo, puente y médula oblonga. Consistente con el hallazgo de que los riñones y el sistema nervioso entérico no lograron desarrollarse en ratones deficientes en GDNFR\alpha (ver Ejemplo de más adelante), niveles elevados de mRNA de GDNFR se hallaron en las neuronas en desarrollo y en los músculos lisos y estriados embrionales alrededor del sistema nervioso entérico en el esófago, el intestino y el estómago. En el adulto, los transcritos del GDNFR\alpha también se hallaron en la pars compacta de la sustancia nigra, la columna de células ventrolaterales de la médula espinal, la formación del hipocampo, las capas internas del córtex cerebral, el núcleo geniculado lateral, el colículo superior, el margen externo de células granulares del cerebelo, el septo lateral, el núcleo endopiriforme y el claustro. Los transcritos del GDNFR\alpha también se hallaron en tejidos no neuronales, incluyendo la hipófisis, el tracto urogenital y el primordio pancreático. Las motoneuronas expresan tanto el GDNFR\alpha como el c-ret. La tinción inmunohistoquímica con antisuero Ret demostró la presencia de Ret en una neurona en desarrollo. En el riñón, se expresan tanto el Ret como el FGDNFR\alpha en las neuronas en desarrollo adyacentes al GDNF. En el intestino, el GDNF y el GDNFR\alpha están presentes entre el músculo liso circular interno y el longitudinal externo adyacente y posiblemente entre el sistema nervioso entérico, mientras que el Ret está presente únicamente en el sistema nervioso entérico.

Ejemplo 4 El GDNFR\alpha media la respuesta al GDNF

Para determinar si la proteína GDNFR\alpha es un mediador fisiológico esencial de GDNF, se trataron neuronas primarias procedentes de embriones: neuronas sensoriales craniales y motoneuronas con PIPLC (fosfolipasa C específica de fosfoinositido (PIPLC) que corta específicamente las proteínas unidas a GPI (Shukla, Life Sci., 10.1323-1335 (1982); Rhee y col., Science, 244:546-550 (1989)), y se controló su supervivencia en presencia de GDNF u otros factores. Se aislaron neuronas de nódulos de embriones de pollo, de ganglios trigémicos y simpáticos (Buj-Bello y col., Neuron 15:821-828 (1995)), motoneuronas de rata E14 (Henderson y col., Science 266:1062-1064 (1994)) y neuronas dopaminérgicas de rata E14 (Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6934-6938 (1990)), se plaquearon y se crecieron en pocillos por triplicado. Se añadió PIPLC (2-4 \mug/ml) a las muestras indicadas 1-2 h antes, así como 12 y 24 h después de la adición de los factores de crecimiento indicados y se determinó el número de neuronas supervivientes 30 y 72 h después. Después del tratamiento con PIPLC, el número de neuronas sensoriales de nódulos y de ganglios trigémicos de embriones de pollo, o de neuronas simpáticas supervivientes en presencia de concentraciones saturantes de GDNF se redujo un 50-70%. No se observaron cambios en la respuesta de estas neuronas con el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) o con el factor de crecimiento nervioso (NGF) en presencia de PIPLC (Figura 6 y 9A). Asimismo, el tratamiento con PIPLC redujo el número de motoneuronas espinales E14 o de neuronas dopaminérgicas que sobrevivieron en presencia de GDNF en un 50-90%, sin afectar la supervivencia de estas neuronas en presencia de BDNF o TGF\beta3 (Figura 7 y 9A). En estos distintos sistemas, el PIPLC redujo los efectos de promoción de la supervivencia de GDNF a concentraciones de GDNF tan bajas como 10 pg/ml, lo que sugiere que la molécula del receptor unido a GPI es necesaria para la respuesta de alta afinidad a GDNF. Además, el PIPLC fue eficaz aún cuando el GDNF se aplicara a 1 \mug/ml (2x10^{8} veces por encima del EC_{50}) para neuronas sensoriales de nódulos (el EC50 para neuronas de nódulos de pollo es de 6,1 ng/ml; Buj-Bello y col., Neuron, 15:821-828 (1995)) y de 0,1 pg/ml para motoneuronas (Henderson y col., Science, 266:1062-1064 81994)). Estas altas concentraciones no invierten el efecto del tratamiento de PIPLC (Figuras 6,7 y 9A), excluyendo la posibilidad de que, después de su liberación de la membrana celular, la proteína unida a GPI se una a GDNF y se reduzca su concentración efectiva (Figura 9A).

Los oligonucleótidos antisentido contra el GDNFR\alpha se utilizaron para bloquear la expresión del GDNFR\alpha en las neuronas primarias procedentes de embriones: sensoriales craniales y motoras primarias. Se sintetizaron oligodesoxinucleótidos contra las regiones del GDNFR\alpha que se muestra en la Figura 1. Mientras que el GDNF promueve la supervivencia de estas neuronas en los cultivos control y en cultivos que contienen oligonucleótidos sentido, no se observó ninguna respuesta al GDNF en los cultivos que contienen oligonucleótidos sentido. En cambio, el efecto del BDNF de promover la supervivencia fue el mismo en los cultivos que contenían oligonucleótidos antisentido de GDNFR\alpha que en los cultivos control.

Se generó una proteína soluble GDNFR\alpha y se utilizó para restaurar la respuesta de GDNF en las neuronas motoras y sensoriales. Estudios previos demostraron que la adición de una forma soluble del receptor de CNTF unido a GPI (CNT-FR\alpha) condujo a la adquisición de una respuesta a CNTF (Davis y col., Science, 259:1736-1739 (1993); Panayotatos y col., Biochem., 33:581-5818 (1994)). En el caso presente, al igual que antes, el GDFN solo fue incapaz de prevenir la muerte de muchas motoneuronas tratadas con PIPLC, sin embargo, la adición de GDNFR\alpha soluble a 100 ng/ml restauró completamente los efectos de promoción de la supervivencia de GDNF en las neuronas primarias sensoriales y motoras tratadas con PIPLC (Figura 9B). Así, el GDNFR\alpha se expresa en las neuronas sensibles al GDNF y al igual que los receptores para CNTF (Davis y col., Science, 253:59-63 (1991); Ip y col., Neuron, 10:89-102 (1993)) y la endotoxina (LPS) (Lee y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:9930-9934 (1993)), se ancla a la membrana celular mediante unión a glicosilfosfatidil inositol ("GPI") (Low y col., Science, 239:268-275 (1988)).

La actividad de formar excrecencias de neuritas se determinó con células PC12. Las células PC12 de feocromocitoma de rata, que son dependientes de factores neurotróficos para la supervivencia en medio sin suero y expresan niveles bajos de Ret (resultados no mostrados) se crecieron sin suero en presencia de GDNF, GDNFR\alpha soluble o ambos y se examinaron 7 días después. El GDNFR\alpha soluble, se produjo como una proteína etiquetada con His en el extremo carboxi-terminal en las células renales embrionales humanas 293, se purificó con cromatografía con Ni-NTA, tal como se describe por Moran y col., (J. Biol. Chem., 266:1250-1257 (1991)). Las células PC12 se sembraron en placas de 35 mm recubiertas con poliomitina colágeno en medio RPMI suplementado con suero de caballo al 10% y suero fetal de ternera al 5%. Después de la adhesión, las células se cambiaron a medio sin suero y luego se expusieron a GDNF (100 ng/ml) y se indicó el GDNFR\alpha soluble (sR\alpha) tal como se indica en la Figura 9C. El número de células vivas con neuritas (células brillantes con el microscopio de contraste de fases) por campo microscópico se determinó al cabo de 7 días, tal como se describe por Micanovic y col., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:157-161, 1991). Únicamente con el GDNF o el GDNFR\alpha, sólo se observaron pocas células con neuritas (células brillantes con el contraste de fase). En cambio, cuando se expusieron células PC12 al GDNF o al GDNFR\alpha soluble, se observó un incremento en el número de células vivas con neuritas (Figura 9C). La combinación de GDNFR\alpha soluble (sR\alpha) y el GDNF indujo una respuesta de excrecencia de neuritas en las células PC12. El GDNFR\alpha soluble provocó la sensibilidad de las células PC12 al GDNF. En consecuencia, el GDNFR\alpha es un componente de la cascada de señalización del GDNF y tiene las propiedades esperadas de una subunidad de unión al ligando de un receptor de GDNF funcional.

Ejemplo 5 El GDNFR\alpha y el Ret forman un complejo GDNF-receptor

Ya que el GDNFR\alpha está anclado en la superficie externa de la célula, la transmisión de las señales del GDNF después de la unión al GDNFR\alpha debe implicar una proteína transmembrana adicional. Otros miembros de la superfamilia de la proteína TGF\beta, de la cual el GDNF es un miembro, que tienen una proteína de unión ligada a GPI tienen también un receptor serina treonina quinasa transmembrana (para revisión ver Massagué y col., J. Biol. Chem., 266:20767-20772 (1991); Cheifetz y col., J. Biol. Chem., 266:20767-20772 (1991)). La estructura del GDNFR\alpha indica que un complejo de receptor para el GDNF, al igual que los complejos de receptor para el CNTF (Davis y col., Science 260:1805-1809 (1993)) y para la endotoxina (LPS) (CD14; Lee y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:9930-9934 (1993)), estará compuesto de multi-subunidades, incluyendo un componente de unión al ligando (GDNFR\alpha descrito aquí) y una molécula de transducción de señal trans-membrana como el gp 130. El fenotipo de ratones sin el receptor huérfano tirosina quinasa c-ret (Schuchardt y col., Nature 367:380-383 (1994); recientemente confirmado por Durbec y col., Nature 381:789-793 (1996)) tiene una sorprendente similitud con el fenotipo de los ratones deficientes en GDNF generados en primer lugar y examinados aquí (ver más adelante). Además, la distribución tisular de Ret (Pachnis y col., Development 119:1005-1017 (1993); Avantaggiato y col., Cell Growth Dic. 5:305-311(1994); Tsuzuki y col., Oncogene 10:191-198 (1995); Davis y col., Science 259:1736-1739 (1993)) fue similar a la de GDNFR\alpha (resultados no mostrados). Para confirmar que el GDNF tiene un receptor transmembrana, denominado Ret, que forma un complejo con el GDNFR\alpha para señalizar o mediar una respuesta al GNDF, se determinó la interacción física del GDNFR\alpha y el Ret. Las líneas celulares de neuroblastoma humano SK-N-SH y la de neuroblastoma de ratón Neuro-2a, que expresan el c-ret endógeno, se expusieron al GDNF sólo o al GDNF en combinación con el GDNFR\alpha soluble durante 5 minutos y se determinó el nivel de fosforilación de tirosina de Ret. Para analizar la fosforilación de tirosina de Ret, las células se incubaron durante 1 h a 37ºC con o sin PIPLC y luego se expusieron a varias concentraciones de GDNF y GDNFR\alpha soluble durante 5-10 minutos a 37ºC. A continuación, las células se extrajeron de las placas con EDTA 2 mM en PBS y se lisaron con tampón frío (fosfato sódico 10 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM, NP40 al 1%, EDTA 5 mM, vanadato sódico 100 mM, PMSF 2 mM y 0,2 unidades de aprotinina) y se utilizaron para la inmunoprecipitación con antisueros generados contra el extremo carboxi-terminal de 19 aminoácidos de Ret, seguido por la unión a Proteína A-Sepharose. Las proteínas inmunoprecipitadas se liberaron hirviéndolas en tampón de muestra con SDS, se separaron en un gel de poliacrilamida-SDS al 8%, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y reaccionaron con un anticuerpo anti-fosfotirosina (Upstate Biotechnology, Inc.); la detección se realizó con un sistema de detección de transferencia de Western ECL (Amersham Life Science). Para aumentar el nivel de Ret, las células SK-N-SH se trataron con ácido retinoico 10 nM 12 h antes de la adición de GDNF.

El GDNF indujo una fosforilación modesta de Ret en estas dos líneas celulares (Figura 10A), pero no en las células NIH3T3 que expresan de forma estable el Ret humano (resultados no mostrados). La fosforilación de Ret se incrementó además cuando el GDNF se añadió junto con el GDNFR\alpha, pero no cuando el GDNFR\alpha se añadió solo (Figura 10A y los resultados no mostrados). Para determinar si la inducción de la fosforilación de la tirosina de Ret es dependiente de la presencia del GDNFR\alpha, las células Neuro-2a y las células SK-N-SH se trataron con PIPLC y se examinó la respuesta de Ret frente al GDNF. De acuerdo con el hallazgo de que la respuesta de supervivencia con el GDNF requiere la presencia del GDNFR\alpha, no se detectó ninguna inducción de la fosforilación de tirosina de Ret en estas células tratadas con PIPLC en presencia de GDFN solo. En cambio, la estimulación de la fosforilación de tirosina de la proteína Ret de 170 KD se observó rápidamente en las células Neuro-2a y SK-N-SH tratadas con PIPLC cuando se añadió el GDNF junto con un GDNFR\alpha soluble (Figura 10A y resultados no observados).

Aunque el GDNF estimuló la fosforilación de tirosina de Ret, no se pudo detectar ninguna unión de alta afinidad de GDNF con Ret en las células Neuro-2a, que expresaban niveles elevados de una proteína Ret endógena o en células que expresaban la proteína Ret recombinante (Figura 10B y resultados no mostrados). Se determinó la interacción física entre el Ret y el GDNF, tal como se definió por la formulación de un complejo Ret/GDNF inmunoprecipitado, que podía estar mediado por el GDNFR\alpha. Las células 293 de riñón embrional humano se transfectaron transitoriamente con un vector de expresión que contenía el c-ret o una combinación de vectores de expresión para c-ret y GDNFR\alpha, se expusieron a GDNF y luego se lisaron con un detergente suave (Davis y col., Science 259.1736-1739 (1993)). Las proteínas que formaron complejos con el GDNF se inmunoprecipitaron con anticuerpos policlonales contra el GDNF y se analizaron en una transferencia de Western utilizando un anticuerpo policlonal contra Ret. En las células que expresaban sólo Ret, o el GDNFR\alpha solo, no se pudo detectar proteína Ret co-inmunoprecipitada. En cambio, el Ret se co-inmunoprecipitó rápidamente por los anticuerpos GDNF de células que expresan tanto el Ret como el GDNFR\alpha (Figura 10C). Para caracterizar el complejo entre el GDNFR\alpha y el Ret, se transfectaron células 293 transitoriamente con vectores de expresión para c-ret y con un GDNFR\alpha etiquetado con un epitopo y luego se analizaron por la presencia de complejos de proteínas GDNFR/Ret en presencia o ausencia de GDNF. Las células se estimularon con el GDNF, tal como se indicó, y luego se lisaron con detergente Brij 96 (Sigma), tal como se describe por Davis y col., (Science, 259.1736-1739 (1993)). Los complejos inmunes putativos se inmunoprecipitaron con un anticuerpo policlonal contra el GDNF (Figura 10C) o Ret (Figura 10 D), se transfirieron a un filtro de nitrocelulosa y luego se analizaron con el anticuerpo policlonal contra el Ret (Figura 10 C) o con el GDNFR\alpha etiquetado con epitopo (Figura 10D). En las células que expresaban el Ret solo o el GDNFR\alpha etiquetado con epitopo solo, no se pudieron detectar complejos de proteína a nivel significativo, tanto en presencia como en ausencia de GDNF (Figura 10D). En cambio, en las células que expresan ambos, el GDNFR\alpha etiquetado con epitopo y el Ret, los hallazgos fueron consistentes con la idea de que el GDNF, el GDNFR\alpha y el Ret pueden, en presencia de GDNF, formar un complejo en la superficie de la célula; de que el Ret es un componente de un receptor de GDNF funcional y de que el GDNFR\alpha es un intermediario necesario en la interacción entre el GDNF y el Ret.

Ejemplo 6

El gen de GDNF de ratón se interrumpió mediante recombinación homóloga en células madres embrionales ("ES") y se inyectó un clon etiquetado en los blastocistos para generar ratones mutantes de GDNF. En la construcción dirigida faltaban los aminoácidos 103-211 de la porción activa biológicamente y madura de GDNF (ver Figura 1), lo que produjo alelos interrumpidos. La construcción dirigida se creó de la manera siguiente. Un fragmento genómico de 3Kb SphI-EcoRI que codifica para los aminoácidos 52-102 del GDNF se fusionó en la misma fase de lectura con el gen lacZ. Un gen neo^{r} bajo el control del promotor PGK y un fragmento BglII-BamHI de 3,1 Kb desde el extremo 3' del gen GDNF se insertó inmediatamente cadena abajo del gen lacZ. Se obtuvieron fragmentos del gen GDNF de una librería lambda 129 murina. La construcción dirigida se electroporó en las células ES-D3. Y luego, se aislaron los clones resistentes a G418 (400 microgramos/ml). Los clones dirigidos ES se inyectaron en blastocistos BALB/c y un único clon se transmitió a la línea germinal. Mediante hibridación de Southern se determinó un suceso de recombinación homóloga en un único clon ES. Las transferencias de Southern se utilizaron para confirmar la interrupción. El análisis del genotipo de animales de tipo salvaje (+/+), heterocigotos (+/-) y mutantes homocigotos (-/-) se determinó mediante PCR. En el análisis, se observó una banda superior específica para el gen neo^{r} y una banda inferior específica para el gen GDNF de tipo salvaje.

Se examinaron los ratones mutantes. Mientras que el mRNA del GDNF se halló en el riñón, el intestino, el cerebro medio ventral y el músculo esquelético de ratones E15.5 normales, no se pudieron detectar transcritos de GDNF en la descendencia homocigota para el alelo mutante (GDNF-/-). Los ratones heterocigotos fueron de tamaño normal e indiferenciables de la descendencia de tipo salvaje (WT). En cambio, aunque los ratones GDNF-/- fueron capaces de amamantar y presentaron movimientos normales de extremidades y cuerpo, murieron al cabo de 1-1,5 días del nacimiento.

El GNDF se identificó en primer lugar mediante su capacidad para prevenir la muerte de neuronas dopaminérgicas embrionales en el cultivo (Lin y col., Science 260: 1130-1132 (1993)) y en modelos de lesiones in vivo (Beck y col., Nature 373:339-341 (1995); Kearns y col., Brain Res. 672:104-111 (1995); Tomas y col., Nature 373:335-339 (1995)) y se demostró consiguientemente que se expresaba en el estriatum embrional, una diana de inervación principal de neuronas dopaminérgicas (Schaar y col., Exp. Neurol. 124:368-371 (1993); Strömberg y col., Exp. Neurol. 124:401-412 (1993); Poulsen y col., Neuron 13:1245-1252 (1994)). Se examinó si el GDNF es un factor de supervivencia esencial para las neuronas dopaminérgicas (DA) durante el desarrollo normal. Se determinó el número de neuronas en los distintos ganglios en los ratones p1 WT y GDNF-/-. El tipo de neurona examinado incluyó las neuronas dopaminérgicas, el núcleo motor facial, motoras espinales, noradrenérgicas, trigémicas, nodulares, DRG, petrosal, vestibular y SCG. Los animales se procesaron y se realizaron contajes neuronales como en Jones y col., (Cell 76:989-999 (1994)) y se registró el número de ganglios. Después de la tinción con tirosina hidroxilasa (TH), se examinó el estriatum, cerebro medio ventral, sustancia nigra, locus coeruleus y las motonoeuronas en los ratones GDNF-/-, comparándose con los ratones P1 WT GDNF. La TH es la enzima limitante de la velocidad de síntesis de la dopamina. Se observó una reducción en la densidad de las fibras TH en el estriatum de ratones GDNF -/-. Los animales se anestesiaron y se fijaron mediante perfusión con paraformaldehido al 4% en fosfato 0,1 M, las secciones se tiñeron tal como se ha descrito (Jones y col., Cell 76:989-999 (1994)). Sorprendentemente, el número de neuronas dopaminérgicas tirosina hidroxilasa positivas (TH+) en el cerebro medio ventral y la densidad de las proyecciones dopaminérgicas en el estriatum fueron idénticas en los animales GDNF-/- y WT.

Ya que el desarrollo de las neuronas DA en los mamíferos es largo y se continua postnatalmente (Coyle y col., J. Neurochem. 27:673-678 (1976); Spectra y col., Comp. Neurol. 199:255-276 (1981)), se comparó el número de células TH+ en el cerebro medio de los ratones heterocigotos P42 GDNF+/-. Los resultados están representados en la Tabla 1.

TABLA 1

Número de neuronas en ganglios distintos en ratones P42WT y GDNF+/-
Tipo de neurona	Tipo salvaje	GDNF^{het}
	(N=(8)	(N=12)
Facial MN	1701 \pm55,8	1657\pm54,4
Dopaminérgica	118,04 \pm7,34	112,88\pm9,04
Noradrenérgica	1218,5 \pm91,24	1068\pm38,19

Leyenda de la tabla: El procesamiento de animales y el contaje del número de células inmunoreactivas TH en toda la región de la pars compacta de la sustancia nigra se realizó tal como se describió anteriormente (Saber y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8935-8939 (1995)9. Los contajes de células se representan como el número medio de células por sección y por animal. El contaje del número de células TH-IR en el locus coeruleus se realizó contando el número de perfiles de células TH-IR presentes en cada sección del cerebro posterior que contenía el locus coeruleus. Los números de células se representan como contajes acumulativos en cada lado del animal. Los contajes en el núcleo motor facial se realizaron a partir de secciones teñidas con violeta de cresilo por un observador independiente. El número total de perikarya neuronal teñida en todos los subnúcleos del núcleo motor facial se obtuvo contando en cada tercera sección por ambos lados del troncoencéfalo. El número de células se representa como el contaje total de células +/- SEM por animal. Toda la microscopía se realizó en campo claro a un aumento de x200. N representa el número de ganglios analizados.

Sorprendentemente, no se detectó ningún déficit en el número de neuronas dopaminérgicas (Tabla 1) o en la complejidad de las fibras TH+ en el estriatum en los ratones GDNF+/-. Estos resultados indican que el GDNF no es un factor de supervivencia necesario para las neuronas dopaminérgicas embrionales y no es un factor de supervivencia limitante para las neuronas dopaminérgicas en el adulto, tal como se sugirió previamente (Lin y col., Science 260:1130-1132 (1993); Beck y col., Nature 373:339-341 (1995); Kearns y col., Brain Res. 672:104-111 (1995); tomas y col., Nature 373:335-339 (1995)).

El GDNF es un factor neurotrófico potente para las motoneuronas espinales embrionales en cultivo y previene la muerte de motoneuronas faciales lesionadas in vivo (Henderson y col., Science 266:1062-1064 (1994); Yan y col., Nature 373:341-344 (1995); Oppenheim y col., Nature 373:344-346 (1995)). Se determinó si el GDNF, expresado en el músculo esquelético, es necesario para la supervivencia de motoneuronas durante la embriogénesis. Se detectaron déficits pequeños en la médula lumbar y el trigémico (<20%), pero no en los núcleos faciales de ratones P1 GDNF-/-. Además, no se observó ningún déficit en las motoneuronas faciales en los animales P42GDNF+/- (Tabla 1). Estos hallazgos presentan argumentos contra la posibilidad de que el GDNF sea un factor neurotrófico principal para las motoneuronas voluntarias durante el periodo de muerte celular normal (Henderson y col., Science 266:1062-1064 (1994); Yan y col., Nature 373:341-344 (1995); Oppenheim y col., Nature 373:344-346 (1995)).

El GDNF demostró recientemente que previene la muerte inducida químicamente de las neuronas noradrenérgicas en el locus coeruleus y promueve su fasciculación y propagación en todo el animal (Arenas y col., Neuron 15:1465-1473 (1995)). Estos hallazgos sugieren que el GDNF puede ser un factor neurotrófico natural y un agente terapéutico potencial para las neuronas noradrenérgicas que degeneran en las enfermedades de Alzheimer y Parkinson. Después de un examen, las neuronas del locus coeruleus, noradrenérgicas halladas fueron normales en tamaño y número, tanto en los ratones P1 GDNF-/- como en P42 GDNF+/- (Tabla 1). De igual manera, aunque el GDNF está regulado positivamente en el hipocampo, córtex y estriatum después de convulsiones epilépticas inducidas químicamente o mediante la inyección de neurotransmisores excitadores (Schmidt-kastner y col., Brain Res. Mol. 26:325-330 (1994); Humpel y col., Neuroscience 59:791-795 (1994)), no se identificaron grandes deficiencias en el cerebelo, cerebro anterior basal, la formación del hipocampo, el estriatum y el neocortex de ratones P1 GDNF-/-. Únicamente se observó un déficit en las motoneuronas de la médula (<20%) y ningún déficit en las neuronas noradrenérgicas o dopaminérgicas, en el día 1 post-natal (P1). Estos hallazgos sugieren que la presencia de GDNF en el CNS embrional y en las dianas de inervación puede reflejar, por lo menos en parte, su implicación en la diferenciación, la regulación de propagación axonal, la sinaptogénesis, la elección de neurotransmisores, la velocidad de conducción o la eficacia sináptica.

Consistente con la observación de que el GNDF promueve la supervivencia de neuronas simpáticas y sensoriales nodulares de embriones de pollo en cultivo (Buj-Bello y col., Neuron 15:821-828 (1995)), se detectó una reducción en el número de neuronas de ganglios cervicales superiores (<35%) y de nódulos (<40%), así como en las neuronas de ganglios de la raíz dorsal (<40%). En cambio, no se observó ningún déficit en el número de neuronas trigémicas o de ganglios vestibulares.

Se examinó el sistema nervioso entérico en los ratones WT y GDNF-/-. El intestino delgado de ratones WT y GDNF-/- se tiñó con H&E o con anticuerpos contra la periferina, proteína específica neuronal. Se examinaron ratones P1 y ratones E13.5. Las neuronas mientéricas (Myn) y submucosales (Sub) presente en los animales WT, estuvieron ausentes en los ratones GDNF-/-. Los animales se fijaron mediante perfusión con formalina tamponada neutra al 10%, se embebieron en parafina y se seccionaron a 5 \mum para el análisis al microscopio óptico. La tinción de anticuerpos se realizó como en Jones y col., (Cell 76:989-999 (1994)), utilizando anticuerpos anti-periferina (Chemicon Inc.) a una dilución 1:300. Los plexos mientéricos (Auberbach) y submucosal (Meissner) se examinaron para ver los déficits neuronales. Las neuronas del sistema nervioso entérico (ENS) pertenecientes a los 2 plexos fueron fácilmente visibles a lo largo del tracto gastrointestinal en los ratones E13.5, E15.5 y P1 WT y GDNF-/- mediante microscopía óptica, así como después de la tinción con un anticuerpo contra la periferina, marcador específico neuronal. En cambio, estas neuronas estuvieron completamente ausentes en la descendencia de GDNF-/- emparejada por la edad. Además, la pared del músculo del intestino fue más delgada en la descendencia GDNF-/- en relación con la WT o GDNF+/-. Aunque el ENS se origina en primer lugar en las células de la cresta neural de la región del cerebro posterior, no se observó un efecto significativo sobre las neuronas derivadas de la cresta neural. Estos hallazgos combinados sugieren que el GDNF es esencial para la supervivencia y/o el desarrollo de neuronas entéricas poco después de que penetren en el intestino embrional (Gershon y col., J. Neurobiolo. 2:199-214 (1993)). Y que la inervación inducida por el GDNF puede ser necesaria para el desarrollo y/o mantenimiento de músculos lisos en el intestino. La ausencia de ENS ya se había observado en los ratones carentes del receptor huérfano tirosina quinasa (Schuchardt y col., Nature 367:380-383 (1994)). Se ha publicado que el GDNF se expresa abundantemente en las capas de los músculos lisos del intestino durante la embriogénesis, así como la presencia de mRNA de GDNF en el mesénquima de riñón embrional (p.ej., Trupp y col., J.Cell Biol. 130:137-148 (1995)).

Se examinaron los riñones en los ratones WT, GDNF -/+ y GDNF-/-. Se obtuvieron fotomicrografías de baja resolución del abdomen en ratones P1 WT, P1 GDNF-/-, P1 GDNF+/- y P42 GDNF+/-. La posición de los riñones fue adyacente a la de las glándulas adrenales en los ratones WT; sin embargo, estuvieron ausentes en ratones GDNF-/- y el riñón izquierdo estuvo ausente en los ratones P1 y P30 GNF+/-. Se realizaron secciones sagitales y se tiñeron con H&E en los embriones de ratones E13.5 WT, E13.5 GDNF-/- y en ratones E11.5 WT y E11.5 GDNF-/-. El ovario (Ovr) se halló en el espacio normalmente ocupado por el riñón (Kid), justo caudal al tejido adrenal (Adr). Los ratones T, GDNF-/- y GDNF+/- se sacrificaron a la edad indicada, se perfundieron con formalina tamponada neutra al 10%, se embebieron en parafina y se realizaron secciones seriadas, que se tiñeron con H&E para el examen microscópico. El genotipo de GDNF para cada cría se determinó mediante análisis por PCR, el sexo se determinó mediante análisis al microscopio de las gónadas y se analizaron histológicamente de 2-3 animales de cada genotipo y para cada edad.

Catorce de 16 ratones GDNF-/- presentaron agenesia renal bilateral y uretral completa, con desarrollo parcial de uno de los dos riñones y uretra que se observó en dos embriones GDNF-/-. En los embriones heterocigotos, crías y adultos de ambos sexos, se observó una elevada incidencia de agenesia renal unilateral (7/26) o de hipoplasia (4/26) en relación con los ratones WT. El análisis de ratones GDNF-/- en estadios embrionales tempranos demostró la ausencia de riñones metanefríticos tan temprano como en E11.5. Otros derivados del mesodermo intermedio urogenital embrionario (adrenal y gónadas), las tejidos de vísceras abdominales y tejidos torácicos restantes fueron normales al microscopio óptico tanto en los ratones GDNF+/-, como en los GDNF-/-. Respecto a los órganos reproductores, el único cambio observado en los ratones GDNF-/- fue una inversión en la orientación del ovario en relación con las vísceras abdominales. Este cambio puede reflejar un aumento en el espacio disponible en la cavidad abdominal después de la agenesia renal, o las modificaciones en el mesotelio que sujetan el ovario a la pared del cuerpo.

Además, los ratones GDNF-/- expresaron una necrosis multifocal ligera en la pulpa roja esplénica, sitio de hematopoyesis activa. Se examinaron los bazos de ratones WT GDNF de 1 día (P1) y de ratones GDNF-Knock-out (KO) mutantes, así como los embriones KO de tipo salvaje en el día 16.5 (E16.5), E15.5, E13.5 y E12.5 de gestación. Todos estos exámenes se realizaron sobre secciones de 5 micras, embebidas en parafina y fijadas en formalina tamponada neutra al 10% (14 horas). Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina para la evaluación microscópica utilizando procedimientos estándares para la evaluación de cambios morfológicos en los tejidos. En todos los puntos temporales examinados, hubo producción de elementos hematopoyéticos (series celulares eritroide-célula roja y mieloide-célula blanca, incluyendo los neutrófilos, eosinófilos, los linfocitos y los macrófagos) en el hígado. Esto es un proceso normal durante el desarrollo, que todavía está presente en el nacimiento de los ratones y parece normal en los ratones de tipo salvaje como los KO. La producción similar de elementos eritroideos y mieloides también tiene lugar en la pulpa roja del bazo, desarrollándose alrededor de E13.5 y persistiendo durante toda la vida del ratón. Sin embargo, en los ratones E16.5 KO (1 animal) y los P1 KO (3 animales), se observaron múltiples focos dispersor de necrosis en la pulpa roja, frecuentemente adyacente a los vasos sanguíneos. (Los focos en el embrión E16.5 fueron menos dramáticos que los observados en los ratones P1). Estos focos se rodearon de células eritroides y mieloides en desarrollo, lo que indicaba que estos focos se originaron en islas hematopoyéticas en donde tiene lugar la proliferación celular. Estas área de necrosis frecuentemente, pero no siempre, fueron adyacentes a las venas del parénquima. Estas venas son los lugares en donde las células eritroides y mieloides maduras entran en la circulación periférica. No hubo evidencias de trombosis ni de infección que sugiriera otra etiología para estos focos necróticos. La ausencia de focos similares en cualquier otra edad de desarrollo en las camadas de tipo salvaje sugiere que no es debido a la infección o a la condición en la madre (un factor "ambiental", de entre los tipos de factores), pero sí está directamente relacionado con el genotipo KO. Estos focos no se observaron en los ratones KO E15.5 y E13.5, pero fue debido a que la hematopoyesis esplénica en estas edades gestacionales se acaba justo de iniciar. En E16.5, la hematopoyesis también se inicia en las cavidades de la médula ósea, el lugar principal de producción después del nacimiento. Focos necróticos similares en la médula ósea de ratones E16.5 o P1 KO o en el hígado de ratones KO no se observaron en ninguna de las edades gestacionales examinadas. La presencia de focos necróticos en las islas hematopoyéticas en la pulpa roja esplénica de ratones KO sugiere que el GDNF tiene un efecto sobre la hematopoyesis esplénica.

El desarrollo esencialmente normal de las gónadas en ratones GDNF-/- indica que el GDNF no es necesario para la organogénesis de riñones pro-nefríticos o mesonefríticos (estructuras transitorias que participan en la formación de ambos riñones definitivos y de las gónadas) (Saxen, Organogenesis of the Kidney (ed. P.W. Barlow, P.B. Green y C.C. White), vol 19, Cambridge University Press, Cambridge. UK (1987)). En su lugar, el GDFN parece ser esencial durante el período en el que las interacciones inductivas recíprocas entre el esbozo urétrico (una evaginación del mesonefro/conducto de Wolffian) y el mesénquima metanéfrico (mesodermo intermedio caudal) originan los conductos colectores (uretra) y el sistema de filtrado (el corpúsculo renal y los túmulos distales) del riñón permanente metanéfrico. Es interesante citar que el factor-7 morfogénico del hueso (BP-7), otro miembro de la familia de proteínas del TGF-\beta, ha demostrado ser esencial para el crecimiento y la supervivencia de la uretra y de los nefrones, pero no para su inducción (Dudley y col., Genes & Develop., 9:2795-2807 (1995)), lo que sugiere que múltiples miembros de la familia de la proteína TGF-\beta pueden regular aspectos distintos del desarrollo renal. Además, se observaron defectos en el desarrollo del riñón (así como de otros órganos) en los ratones carentes del receptor huérfano de tirosina quinasa RET (Schuchard y col., Nature 367:380-383 (1994)) y en los ratones carentes del factor de transcripción putativo, asociado al tumor de Wilms, WT-1 (Kreidberg y col., Cell 74:679-691 (1993)). Según ello, tal como se demostró anteriormente, el GDNF está implicado en la organogénesis del riñón (Patterson y Dressler, Curr. Opin. Genet. Dev. 4(5):696-702 (1994)) para controlar la diferenciación del crecimiento celular y los patrones de desarrollo en este órgano.

Se observaron varios ratones heterocigotos relativamente jóvenes (5-7 semanas) con aspecto desaliñado, poco pelo y pérdida de peso. Cuatro de los 8 presentaron una enfermedad renal severa en estadio terminal. El examen de los riñones demostró el aspecto microscópico de riñones de 1-2 años (la enfermedad renal en fase terminal se observa habitualmente en ratones adultos). Las lesiones parecieron ser principalmente de origen glomerular, caracterizado por glomérulos escleróticos y encogidos y por una matriz glomerular aumentada (glomerulonefritis membranosa). Un animal presentó una matriz mesangial acelular aumentada, sugestiva de amiloidosis glomerular, sin embargo tinciones especiales fueron negativas para amiloide. Este material fue PAS positivo, lo que indica que es probablemente matriz mesangial. Los cambios secundarios observados fueron la dilatación tubular y la proteinuria. En los animales terminales, los niveles de BUN y creatinina estaban aumentados, lo que ocurre generalmente muy tarde en la enfermedad, cuando se pierde >70% de la masa renal. Tal como se mostró con anterioridad, algunos heterocigotos GDNF tienen sólo 1 riñón; sin embargo, esta enfermedad renal severa se observó en animales que tenían de 1-2 riñones (y en ambos sexos). Estos resultados indican que la enfermedad presente en los heterocigotos GDNF es una glomerulonefritis membranosa.

Mediante rastreo de patología clínica, hematológica y análisis al microscopio electrónico, se analizaron 7 parejas de ratones emparejados por la edad GDNF de tipo salvaje y heterocigotos. Estos ratones tenían una edad de 21-23 semanas, y excepto por una ligera elevación del BUN (34 versus 25) en los heterocigotos, no hubo evidencias de enfermedad renal. Se realizaron análisis por microscopía electrónica con los heterocigotos con mayor BUN (44), pero fueron estructuralmente normales. Se observaron diversas áreas donde el pedículo epitelial estaba fusionado. Dado que estos animales eran más viejos que los examinados previamente en necropsia, probablemente no eran susceptibles de una enfermedad renal.

En resumen, el trabajo presentado aquí demuestra que el GDNF no es un factor neurotrófico esencial para las neuronas dopaminérgicas, motoras, o noradrenérgicas durante la embriogénesis, tal como se sugirió previamente. En su lugar, el GDNF parece ser esencial para la supervivencia o el desarrollo del sistema nervioso entérico y para la diferenciación del riñón metanéfrico y de la uretra procedentes del mesodermo intermedio caudal.

Ejemplo 7 Anticuerpos monoclonales anti-GDNF

Se hiperinmunizaron 5 ratones BALB/c (Charles River Laboratorios, Wilmington, DE) con rhGDNF purificado en adyuvante de RIBI (RIBI Immunochem Research, Inc., Hamilton, MO). Se fusionaron los esplenocitos de ratón que demostraron tener el mayor título de anticuerpo para inmovilizar el rhGDNF (Sierra BiioSource, Inc., Gilroy, CA) con las células de mieloma de ratón (SP2/0; American Type Cultura Collection, Rockville, MD). Al cabo de 10-14 días, los sobrenadantes se cosecharon y se seleccionaron para la producción de anticuerpos y especificidad de hGDNF mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Para la producción de MAb in vivo, se inyectaron en ratones Pristaneprimed catorce clones positivos que mostraron la mayor inmunoreactividad después de la segunda ronda de clonaje. Se recolectaron los fluidos de ascitas y se purificaron mediante cromatografía de afinidad (Pharmacia Fast Protein Liquid Chromatography [FPLC]; Pharmacia, Uppsala, Sweden) sobre proteína A staphylococal (Pharmacia). Las preparaciones de anticuerpo purificado se filtraron estérilmente (0,2 \mum de tamaño de poro; Nalgene, Rochester, NY) y se guardaron a 4ºC en solución salina tamponada de fosfato (PBS).

Las placas de microtitulación se recubrieron con 100 \mul/pocillo de rhGDNF o rhTGF-\beta1 (Genentech, Inc.; 1 \mug/ml) en tampón carbonato 0,05 M, pH 9,6, durante toda la noche a 4ºC. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado ELISA (PBS/Tween 20 al 0,05%) y se bloquearon durante por lo menos 1 h con PBS que contenía albúmina sérica bovina al 0,5% y Tween 20 al 0,05% (PBS/BSA/T20). Las placas se lavaron de nuevo tres veces con tampón de lavado y se añadieron 100 \mul de muestras y controles durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces y se incubaron durante 1-2 horas a temperatura ambiente con anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con HPR (Fc específica) (Sigma) diluido en PBS/BSA/T20. Las placas se lavaron a continuación y se incubaron con ortofenilén diamina en PBS (Sigma; una tableta de 0,5 mg por 12,5 ml de PBS; 100 \mul/pocillo) durante 10-20 minutos a temperatura ambiente. La reacción se paró con H_{2}SO_{4} 2,5 N. Las absorbancias resultantes (490 nm con un filtro de 405 nm) se registraron utilizando un lector de placas (UV Max, Molecular Devices, Palo Alto, CA).

Los puntos isoeléctricos de los MAbs purificados se determinaron utilizando el Phast-System (Pharmacia), según las instrucciones del fabricante.

El SDS-PAGE se puede utilizar para análisis de pureza e inmunotransferencia. Se realizó un SDS-PAGE unidimensional de acuerdo con el procedimiento de Laemmli, utilizando geles de Tris-glicina 4-20% (Novex, Encinitas,CA). El rhGDNF (1 \mug por carril) y 5 \mul de estándares de peso molecular biotinilados (Bio Rad) se añadieron a los carriles de geles adecuados y se realizó una electroforesis a 125 V (aproximadamente 32-35 mA) durante 1,5-2 h. Los geles se utilizaron para la inmunotransferencia. El rhGDNF se diluyó a 100 \mug/ml en tampón de muestra (SDS al 8%, glicerol al 40%, Tris-HCl 350 mM, Tris bases 273 mM, xilen cianol al 0,5% (p/v) y bromofenol blue al 0,5% (p/v)) en presencia y ausencia de un agente reductor (de \beta-mercaptoetanol al 5% (v/v)). Las muestras reducidas se calentaron a 90ºC durante 5 min.

Se realizaron análisis de inmunotransferencia. Después de la transferencia, las membranas se bloquearon con PBS/BSA/T20 durante por lo menos 1 h a temperatura ambiente y se incubaron con MAbs purificados por afinidad (diluidos a 1 \mug/ml en PBS/BSA/T20) durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación las membranas se lavaron con PBS/T20 al 0,05% y se añadieron los conjugados HRP adecuados (IgG de rata anti-ratón HRP [Boehringer Mannheim], 1:5000; o estreptavidina-HRP [Sigma, St.Louis, MO], 1:10.000; cada uno diluido con PBS/BSA/T20) durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron a continuación y se expusieron al sustrato luminol (Amersham Internacional, Amersham, UK) durante 1 min a temperatura ambiente con agitación y se expusieron a una película de rayos X (Eastman Kodak, Rochester, NY) durante aproximadamente 15-60 s.

Se hallaron 14 rhGDNF MAbs, de varios isotipos, capaces de unirse al rhGDNF inmovilizado y al rhGDNF en solución. Los MAbs no reaccionaron de forma cruzada con el rhTGF-\beta1, y se unieron tanto a la proteína GDNF reducida como a la no-reducida. Cinco de los MAbs fueron adecuados para los análisis de inmunohistoquímica. Los MAbs 1694, 1712, 1717, 1725 y 1731 son capaces de unirse a complejos GDNF de unión con su receptor putativo. Los otros MAbs se designaron 1693, 1695, 1696, 1709, 1710, 1711, 1713, 1714, 1715 y 1716. Las designaciones son las asignadas a los hibridomas productores de cada MAb. La especificidad epitópica de los MAbs puede determinarse mediante análisis de bloqueo cruzado.

En resumen, en la presente invención se proporciona un sistema único para el GDNF, en el que el GDNFR\alpha, una proteína nueva unida a GPI, es un componente de unión del ligando y el receptor tirosina quinasa Ret es un componente de señalización. El complejo del receptor de GDNF se parece en parte a los receptores del factor neurotrófico ciliar (Davis y col., Science 259:1736-1739 (1993)), la endotoxina bacteriana (Lee y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9930-9934 (1993); Pugin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2744-2748 (1993)) y los receptores del sistema inmune en los que las proteínas unidas a GPI sirven como componentes de unión a ligando y las tirosinas quinasas citoplasmáticas como componentes de señalización (Brown, Curr. Opin. Immunol. 5:349-354 (1993)). El GDNF puede representar una transición evolutiva dentro de la superfamilia de las proteínas que contienen bloques de cisteínas, desde los factores de crecimiento que utilizan los receptores de serina treonina quinasa (la rama del TGF\beta de esta superfamilia) a los factores de crecimiento que utilizan receptores de tirosina quinasa (el factor de crecimiento nervioso y el factor de crecimiento derivado de plaquetas de esta superfamilia; Mc. Donald y col., Cell 73:421-424 (1993). La identificación de células neuronales y no neuronales adicionales y de órganos dependientes de GDNF, y el descubrimiento del receptor y el sistema de receptor asociado para el GDNF, aquí mostrado, proporcionan los medios para la modulación y el control de la actividad y la supervivencia celular. Todo ello proporciona procedimientos específicos y adicionales de tratamiento disponible para la práctica médica.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE

Genentech, Inc.

Klein, Robert D.

Moore, Mark W.

Rosenthal, Arnon

Ryan, Anne M.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: UTILIZACIONES DEL GDNF Y DEL RECEPTOR DE GDNF

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 12

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(iv)

DIRECCIÓN POSTAL

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(A)

DIRECCIÓN: Genentech, Inc.

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(B)

CALLE: 460 Point San Bruno Blvd.

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(C)

CIUDAD: South San Francisco

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(D)

ESTADO: California

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(E)

PAÍS: USA

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 94080

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(v)

FORMATO INFORMÁTICO:

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(A)

TIPO MEDIO: 3,5 pulgadas, 1,44 Mb disco flexible

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

PROGRAMA: WinPatin (Genentech)

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(vi)

FECHA DE LA ACTUAL SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE SOLICITUD:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

FECHA PREVIA DE SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/615902

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(B)

FECHA DE SOLICITUD: 14 de marzo de 1996

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(vii)

FECHA PREVIA DE SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/618236

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(B)

FECHA DE SOLICITUD: 14 de marzo de 1996

\vskip0.666000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Torchia, PhD., Timothy E.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 36.700

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA DEL SUMARIO: P09956P1PCT

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: 415/225-8674

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(B)

TELEFÁX: 415/952-9881

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(C)

TELEX: 910/371-7168

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 2378 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:

7

8

9

10

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 468 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: Dominio extracelular

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(B)

LOCALIZACIÓN: 25

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(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRAS INFORMACIONES:

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: Extremo N-terminal de la proteína madura

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(B)

LOCALIZACIÓN: 25-427

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(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRAS INFORMACIONES:

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio de glicosilación potencial

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(B)

LOCALIZACIÓN: 349

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(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRAS INFORMACIONES:

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio de glicosilación potencial

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 408

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRAS INFORMACIONES:

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio de glicosilación potencial

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓ: 61

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(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRAS INFORMACIONES:

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:

11

12

13

\newpage

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gln Asn Leu Ser Asp Gly Lys}

\hskip-6mm\lower3.5mm\hbox{8}

\vskip1.000000\baselineskip

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gln Asn Ile Ser Asp Gly Lys}

\hskip-6mm\lower3.5mm\hbox{8}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gln Ser Leu Gly Thr Gln}

\hskip-5.8mm\lower3.5mm\hbox{7}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Ile Ser Ser His Leu Gly Gln}

\hskip-6mm\lower3.5mm\hbox{8}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr Pro}

\hskip-6mm\lower3.5mm\hbox{11}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 418 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº:8:

14

15

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 840 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº:9:

16

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 351 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº:10:

17

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 453 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº:11:

18

19

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 201 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº:12:

20

Claims (39)

1. Polipéptido GDNFR\alpha aislado que comprende un dominio extracelular de GDNFR\alpha, que tiene la secuencia aminoacídica según se indica entre los aminoácidos Asp25 y Gly427 de la SEC ID Nº:2.

2. Polipéptido GDNFR\alpha aislado que comprende el GDNFR\alpha maduro, que tiene la secuencia aminoacídica según se indica entre los aminoácidos Asp25 y Ser468 de la SEC ID Nº:2.

3. Polipéptido GDNFR\alpha aislado que es una variante alélica o un homólogo de mamífero del polipéptido de la reivindicación 1 ó de la reivindicación 2.

4. Polipéptido GDNFR\alpha aislado que se une específicamente al GDNF y que está codificado por una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar a 42ºC en formamida al 20% con una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 45 bases contiguas, las cuales codifican para una porción de GDNFR\alpha que tiene la secuencia de ácido nucleico indicada en la SEC ID Nº:1.

5. Polipéptido GDNFR\alpha aislado que se une específicamente al GDNF y que comprende un polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de por lo menos el 75% con el dominio extracelular de GDNFR\alpha que tiene la secuencia aminoacídica que se halla entre los aminoácidos Asp25 y Gly427 de la SEC ID Nº:2.

6. Polipéptido GDNFR\alpha de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se conjuga con, o se fusiona a, una molécula que aumenta su vida media sérica.

7. Polipéptido GDNFR\alpha de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 a 5, en donde dicho polipéptido es soluble.

8. Composición que comprende el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo fisiológicamente aceptable.

9. Polipéptido GDNFR\alpha quimérico que comprende un polipéptido GDNFR\alpha de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, fusionado con un polipéptido heterólogo.

10. Polipéptido GDNFR\alpha quimérico de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el polipéptido heterólogo es una secuencia de inmunoglobulina.

11. Polipéptido GDNFR\alpha quimérico de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el polipéptido heterólogo es una secuencia de etiqueta epitópica.

12. Procedimiento para la identificación de una molécula que se une al GDNFR\alpha que comprende la exposición del GDNFR\alpha de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 con la molécula sospechosa de unírsele y la determinación de la unión de la molécula con el GDNFR\alpha.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el GDNFR\alpha es el GDNFR\alpha soluble.

14. Procedimiento para la identificación de una molécula que activa el GDNFR\alpha que comprende la exposición del GDNFR\alpha de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 con una molécula sospechosa de ser capaz de activar el GDNFR\alpha y la medición de la activación del GDNFR\alpha.

15. Procedimiento para la purificación de una molécula que se une al GDNFR\alpha que comprende la adsorción de la molécula con el GDNFR\alpha de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, inmovilizado en una fase sólida y la recuperación de la molécula del GDNFR\alpha inmovilizado.

16. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el GDNFR\alpha es el GDNFR\alpha quimérico que comprende una fusión de una secuencia de un dominio extracelular de GDNFR\alpha con una secuencia de un dominio constante de inmunoglobulina.

17. Anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular del GDNFR\alpha, que tiene una secuencia aminoacídica que se halla entre los aminoácidos Asp25 y Gly427 de la SEC ID Nº:2.

18. Anticuerpo que se une específicamente al GDNFR\alpha maduro, que tiene la secuencia aminoacídica que se halla entre los aminoácidos Asp25 y Ser468 de la SEC ID Nº:2.

19. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, que es un anticuerpo monoclonal.

20. Composición que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 y un vehículo fisiológicamente aceptable.

21. Composición de acuerdo con la reivindicación 20, que además comprende una citoquina o un factor neurotrófico.

22. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, que es un anticuerpo agonista.

23. Anticuerpo agonista de GDNFR\alpha de acuerdo con la reivindicación 22 para utilizar como medicamento para la activación del GDNFR\alpha.

24. Procedimiento in vitro para modular una respuesta fisiológica de una célula al GDNF, que comprende el contacto de la célula con una cantidad de un GDNFR\alpha de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, efectiva para modular la respuesta de la célula frente al GDNF.

25. Procedimiento para la determinación de la presencia de GDNFR\alpha que comprende la exposición de una muestra de ensayo sospechosa de contener el GDNFR\alpha con el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18 y la determinación de la unión de dicho anticuerpo con la muestra de ensayo.

26. Molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para el GDNFR\alpha de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

27. Molécula de ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 26, que comprende además un promotor unido operativamente con la molécula de ácido nucleico.

28. Vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 26 ó reivindicación 27 unida operativamente a secuencias control reconocidas por una célula hospedadora transformada con el vector.

29. Célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 28.

30. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 18 nucleótidos contiguos de GDNFR\alpha, que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº:1.

31. Procedimiento de utilización de una molécula de ácido nucleico que codifica para el GDNFR\alpha para efectuar la producción del GDNFR\alpha, que comprende el cultivo de la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 28 en condiciones que permitan la expresión del GDNFR\alpha.

32. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 31, que comprende además la recuperación del GDNFR\alpha del cultivo de células hospedadoras.

33. Animal transgénico, no humano, que contiene células que expresan un transgén de ácido nucleico que codifica para el polipéptido.

34. Animal knocout, no humano que contiene células que tienen un gen GDNFR\alpha defectuoso.

35. Polipéptido GDNFR\alpha de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para utilizar en un procedimiento de tratamiento médico.

36. Utilización del GDNF o de un agonista de GDNF para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad renal, en combinación con el GDNFR\alpha de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

37. Utilización de acuerdo con la reivindicación 34, en donde la enfermedad renal está asociada con glomerulonefritis.

38. Utilización de un GDNF o de un agonista de GDNF para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno relacionado con el sistema nervioso entérico, en combinación con el GDNFR\alpha de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

39. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, en donde el GDNF es el GDNF humano.