KR102502248B1 - 5-할로우라실-변형 마이크로rna 및 암 치료시 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하나 이상의 할로우라실 분자를 포함하는 핵산 조성물을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 마이크로RNA 뉴클레오타이드 서열 내 우라실의 5-할로우라실로의 대체가 상기 마이크로RNA의 암 진행 및 종양 형성을 억제하는 능력을 증가시킨다는 것을 밝힌다. 이와 같이, 본 발명은 그 핵산 서열 내에 5-할로우라실 분자가 혼입된 다양한 핵산 (예컨대, 마이크로RNA) 조성물 및 이를 이용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 변형된 핵산 조성물을 포함하는 약학 조성물 (예컨대, 제형) 및 대장암, 췌장암 및 폐암과 같은 암을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

5-할로우라실-변형 마이크로RNA 및 암 치료시 그 용도

관련 출원에 대한 상호 참조

[0001] 이 출원은 그 전체 내용이 여기에 참조로서 포함되는 2017년 2월 28일자 미국 가출원 제62/464,491호, 2016년 11월 15일자 미국 가출원 제62/422,298호 및 2016년 11월 1일자 미국 가출원 제62/415,740호로부터의 우선권을 주장한다.

정부 지원

[0002] 본 발명은 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 부여된 허가 번호 HL127522 및 CA197098하에 정부 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 권리를 갖는다.

서열 목록 참조 포함

[0003] 2017년 10월 30일에 작성되고 EFS-Web을 통해 미국 특허상표청에 제출된 7 KB의 R8859_PCT_SequenceListing.txt라는 이름의 ASCII 텍스트 파일의 서열 목록이 참조로서 여기에 포함된다.

본 발명의 분야

[0004] 본 발명은 일반적으로 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이고, 더욱 특히, 변형된 마이크로RNA가 단독으로 또는 5-플루오로우라실과 함께 암, 특히 직장, 폐 또는 췌장의 암을 치료하는데 사용되는 방법에 관한 것이다.

[0005] 마이크로RNA (miRNAs, miRs)는 그들의 표적 유전자의 발현을 음으로 (negatively) 조절함에 따라서 번역 중단, mRNA 절단 또는 그 조합을 야기하는, 세포나 생물에서 번역을 조절하는 고도로 보존된 비-암호화 소형 RNA 분자의 한 류이다. [Bartel DP. Cell. (2009) 136(2):215-33] 참조. 다중 전사물을 표적으로 함으로써, miRNA는 세포자멸사, 분화 및 세포 증식을 비롯한 다양한 범위의 생물학적 과정을 조절하고, 따라서 비정상적인 마이크로RNA 기능은 암을 유발할 수 있고 ([Ambros V. Nature. (2004) 431(7006):350-5] 참조), 이와 같이, 최근에 miRNA는 바이오마커, 종양 유전자 (oncogene) 또는 종양 억제 인자로 확인되었다. 예컨대, [Croce, CM, Nat Rev Genet. (2009) 10:704-714] 참조.

[0006] 대장암 (CRC)은 세 번째로 흔한 악성 종양이며 미국에서 두 번째로 흔한 암-관련 사망 원인이다. [Hegde SR, et al., Expert review of gastroenterology & hepatology. (2008) 2(1):135-49] 참조. 암을 치료하는데 사용되는 다수의 화학요법 제제가 있으나, 피리미딘 길항제들, 예컨대 플루오로피리미딘계 화학요법 제제 (예컨대, 5-플루오로우라실, S-1)는 대장암을 치료하기 위한 대표적 표준 (gold standard)이다. 피리미딘 길항제들은 피리미딘 (DNA 중에서 시토신 및 티민, RNA 중에서 시토신 및 우라실) 함유 뉴클레오타이드의 합성을 차단한다. 피리미딘 길항제는 내인성 뉴클레오타이드와 비교했을 때 유사한 구조를 가지기 때문에, 천연 피리미딘과 경쟁하여 복제 과정에 관련된 중요한 효소 활성을 억제함으로써 DNA 및/또는 RNA 합성을 방해하고 세포 분열을 억제하는 결과에 이른다.

[0007] 췌장암은 치료가 매우 어려운 치명적인 암이다. [Siegel, RL et al. CA Cancer J. Clin. (2015) 65: 5-29] 참조. 췌장암의 독특한 측면으로는 5년 생존율이 7% 미만으로 매우 낮음 (ld.), 뒤늦은 증상발현, 조기 전이, 화학 요법 및 방사선 치료에 대한 저조한 반응을 들 수 있다. [Maitra A and Hruban RH, Annu Rev. Pathol. (2008) 3:157-188] 참조. 현재까지 젬시타빈계 화학요법 (2',2'-디플루오로 2'-데옥시시티딘)이 췌장암 치료의 대표적 표준이지만, 약물 내성으로 인하여 치료적 개입 효과는 제한적이다. [Oettle, H et al. JAMA (2013) 310: 1473-1481].

[0008] 5-플루오로우라실 (즉, 5-FU, 또는 보다 구체적으로는, 5-플루오로-1H-피리미딘-2,4-디온)은 다수의 아쥬반트 화학요법 치료제, 예컨대 Carac® 크림, Efudex®, Fluoroplex® 및 Adrucil®에 사용되는 잘 알려진 피리미딘 길항제이다. 5-FU가 DNA 생합성의 필수 단계인 데옥시유리딘 모노포스페이트 (dUMP)의 데옥시티미딘 모노포스페이트로 (dTMP)의 메틸화를 촉매하는 중요한 효소 인 티미딜산 합성효소 (TYMS 또는 TS)를 표적으로 한다는 것은 잘 알려져 있다. [Danenberg P. V., Biochim. Biophys. Acta. (1977) 473(2):73-92]. 그러나, 5-FU계 치료법의 꾸준한 개선에도 불구하고, 5-FU계 화학요법에 대한 환자 반응률은 약제 내성의 발전으로 인하여 여전히 미온적이다. [Longley D. B, et al., Apoptosis, Cell Signaling, and Human Diseases, (2007) p. 263-78].

[0009] 그럼에도 불구하고, 현존하는 암 치료법들은 여전히 초기 단계에 있으며, 여전히 개선되거나 극복되기를 기다리고 있는 많은 장애물이 있다. 예를 들어, 5-FU가 다양한 암 치료에 상당히 효과적이지만, 5-FU는 실질적인 독성을 가지며 많은 부작용을 유발할 수 있음이 잘 알려져 있다. miRNA와 관련하여, 이 화합물은 투여시 효소적 분해를 일으킬 법한 것으로 알려져 있으며, 이는 불량한 안정성을 초래한다. 또한, 종양 세포는 5-FU 및 젬시타빈과 같은 일반적인 치료 제제에 내성을 개발함으로써 세포자멸사 경로를 회피하는 것으로 알려져 있다. [Gottesman M. M. et al., Nature Reviews Cancer, (2002) 2(1):48-58] 참조. 따라서, 암의 치료를 위해서는 보다 효과적이고, 안정적이며, 독성이 적은 약물들이 상당히 이익이 될 것이다.

발명의 요약

[0010] 본 발명은 5-할로우라실 염기를 포함하는 핵산 조성물 (즉, 마이크로RNA)가 항암 제제로서 탁월한 효능을 갖는다는 것을 입증한다. 더욱이, 본발명의 데이터는 세포를 본 발명의 변형 마이크로RNA 조성물과 접촉시키는 것이, 예컨대, 암 세포 증식을 감소시키고 화학요법 제제의 효능을 증가시킴으로써, 세포주기의 진행 및 종양 발생 감소를 조절함을 보여준다. 본 발명은 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 서열 내에 5-할로우라실 염기가 혼입되는 것이 암 치료제 단독 및/또는 본연의 마이크로RNA보다 항암 치료 제제로서 마이크로RNA 효능을 증가시킨다는 발견에 전제하고 있다.

[0011] 그러므로, 본 발명의 한 측면에 있어서, 5-할로우라실, 예컨대 5-플루오로우라실 (5-FU)로 대체된 우라실 염기 (U, U 염기)를 하나 이상 갖는 변형된 마이크로RNA 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 조성물이 기술된다. 특정 구체예에 있어서, 상기 변형된 마이크로RNA는 5-할로우라실로 대체된 하나 이상의 우라실 또는 정확히 하나의 우라실을 갖는다. 일부 구체예에 있어서, 상기 변형된 마이크로RNA 뉴클레오타이드 서열은 5-할로우라실로 대체된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상의 우라실 염기를 포함한다. 다른 구체예 있어서, 상기 변형된 mRNA의 모든 우라실 뉴클레오타이드 염기는 5-할로우라실로 대체되었다.

[0012] 몇 가지 구체예에 있어서, 상기 5-할로우라실은, 예컨대 5-플루오로우라실, 5-클로로우라실, 5-브로모우라실 또는 5-요오도우라실이다. 특정 구체예에 있어서, 상기 5-할로우라실은 5-플루오로우라실이다.

[0013] 특정 구체예에 있어서, 상기 변형된 마이크로RNA 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 5-할로우라실을 포함하는데, 이에 의하여 상기 5-할로우라실 각각은 동일하다. 다른 구체예에 있어서, 상기 변형된 마이크로RNA 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 5-할로우라실을 포함하는데, 이에 의하여 상기 5-할로우라실 각각은 상이하다. 다른 구체예에 있어서, 상기 변형된 마이크로RNA 뉴클레오타이드 서열은 2 이상의 5-할로우라실을 포함하는데, 이에 의하여 상기 변형된 마이크로RNA 뉴클레오타이드 서열은 상이한 5-할로우라실의 조합을 포함한다.

[0014] 본 발명의 한 가지 예시적 구체예에 있어서, 하나 이상의 우라실 뉴클레오타이드 염기를 5-할로우라실로 대체함으로써 변형된 miR-129 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 핵산 조성물이 제공된다. 보다 구체적으로, 상기 핵산 조성물은 적어도 하기 본연의 miR-129 뉴클레오타이드 서열:

CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC [SEQ ID NO. 1]

을 함유하고, 여기서 상기 도시된 핵산 서열 중의, 또는 상기 도시된 서열에 공유적으로 결합될 수 있는 우라실 염기들 중 적어도 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟 개 또는 모두는 5-할로우라실에 의하여 대체된다.

[0015] 본 발명의 특정 구체예에 있어서, 상기 변형된 마이크로RNA는,

CU^FU^FU^FU^FU^FGCGGU^FCU^FGGGCU^FU^FGC [SEQ ID NO. 4]로 이루어지는 핵산 서열을 갖고, 여기서 U^F는 할로우라실, 구체적으로 5-플루오로우라실이다.

[0016] 다른 구체예에 있어서, 본연의 miR-129 뉴클레오타이드 서열의 씨드 부분인 GUUUUUGC는 비변형으로 남아있는 반면에 (즉, 5-할로우라실을 포함하지 않음), 상기 변형된 miR-129 뉴클레오타이드 서열의 나머지부에 남아있는 우라실 뉴클레오타이드 염기들 중 하나 이상 (또는 전부)는 동일한 수의 5-할로우라실로 대체된다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 변형된 miR-129 마이크로RNA는,

CUUUUUGCGGU^FCU^FGGGCU^FU^FGC [SEQ ID NO. 5]로 이루어지는 핵산 서열을 갖고, 이에 의하여 U^F는 할로우라실, 구체적으로 5-플루오로우라실이다.

[0017] 몇 가지 구체예에 있어서, 상기 5-할로우라실은, 예컨대 5-플루오로우라실, 5-클로로우라실, 5-브로모우라실 또는 5-요오도우라실이다. 특정 구체예에 있어서, 상기 5-할로우라실은 5-플루오로우라실이다.

[0018] 본 발명의 다른 구체예에 있어서, 우라실 뉴클레오타이드 염기들 중 하나 이상을 5-할로우라실, 예컨대 5-플루오로우라실 (5-FU)로 대체함으로써 변형된 miR-15a 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 핵산 조성물이 제공된다. 구체적으로, 상기 핵산 조성물은 적어도 하기 본연의 miR-15a 뉴클레오타이드 서열:

UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG [SEQ ID NO. 2]을 함유하고, 여기서 상기 도시된 서열 중의, 또는 상기 도시된 서열에 공유적으로 결합될 수 있는 우라실 뉴클레오타이드 염기들 중 적어도 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 개 또는 모두는 5-할로우라실이다.

[0019] 본 발명의 특정 구체예에 있어서, 상기 변형된 miR-15a 마이크로RNA는,

U^FAGCAGCACAU^FAAU^FGGU^FU^FU^FGU^FG [SEQ ID NO. 6]로 이루어지는 핵산 서열을 갖고, 여기서 U^F는 할로우라실, 구체적으로 5-플루오로우라실이다.

[0020] 다른 구체예에 있어서, 상기 본연의 miR-15a 뉴클레오타이드 서열의 씨드 부분인 UAGCAGCA는 5-할로우라실로 변형되지 않고 남아있는 반면에, 상기 miR-15a 뉴클레오타이드 서열의 나머지부 (비-씨드 부분)에 남아있는 우라실 염기들 중 하나 이상 (또는 전부)는 5-할로우라실에 의하여 대체된다.

[0021] 특정 구체예에 있어서, 상기 변형된 miR-129 마이크로RNA는,

UAGCAGCACAU^FAAU^FGGU^FU^FU^FGU^FG [SEQ ID NO. 7]로 이루어지는 핵산 서열을 갖고, 여기서 U^F는 할로우라실, 구체적으로 5-플루오로우라실이다.

[0022] 또 다른 예시적인 구체예에 있어서, 본 발명은 변형된 miR-140 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에 있어서, 상기 본연의 miR-140 뉴클레오타이드 서열은 U 염기들 중 하나 이상을 5-할로우라실로 대체함으로써 변형되었다.

[0023] 한 구체예 세트에 있어서, 상기 본연의 miR-140 핵산 서열 내 U 염기들 중 정확히 하나는 5-할로우라실이다. 제2의 구체예 세트에 있어서, 상기 본연의 miR-140 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 2개 또는 2개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실로 대체된다. 다른 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-140 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 3개 또는 3개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 본연의 miR-140 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 4개 또는 4개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 일부 구체예에 있어서, 상기 miR-140 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 5개 또는 5개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 miR-140 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 6개 또는 6개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 특정 구체예에 있어서, 상기 miR-140 뉴클레오타이드 서열의 U 염기들 전부는, 본연의 부분에서이든 및/또는 부속된 부분에서이든지 간에, 5-할로우라실이다.

[0024] 하나의 예시적 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 변형된 마이크로RNA 핵산 조성물은,

CAGU^FGGUUUUACCCU^FAUGGU^FAG [SEQ ID NO. 9]의 핵산 서열을 갖고, 여기서 U^F는 할로우라실, 구체적으로 5-플루오로우라실이다.

[0025] 또 다른 예시적인 구체예에 있어서, 본 발명은 우라실 염기들 중 하나 이상을 5-할로우라실로 대체함으로써 변형된, 변형된 본연의 miR-192 또는 miR-215 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에 있어서, 상기 변형된 miR-192 뉴클레오타이드 서열은 U 염기들 중 하나 이상을 5-플루오로우라실로 대체함으로써 변형되었다.

[0026] 다른 구체예 세트에 있어서, 상기 변형된 miR-192 뉴클레오타이드 서열 내 U 염기들 중 정확히 하나는 5-할로우라실이다. 제2의 구체예 세트에 있어서, 상기 변형된 miR-192 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 2개 또는 2개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예 세트에 있어서, 상기 변형된 miR-192 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 3개 또는 3개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 변형된 miR-192 또는 miR-215 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 4개 또는 4개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 특정 구체예에 있어서, 상기 변형된 miR-192 또는 miR-215 서열의 U 염기들 전부는, 상기 핵산의 본연의 부분에서이든 및/또는 부속된 부분에서이든지 간에, 5-할로우라실이다.

[0027] 한 가지 예시적 구체예에 있어서, 본 발명의 핵산 조성물은,

CU^FGACCU^FAU^FGAAU^FU^FGACAGCC [SEQ ID NO. 11]의 변형된 miR-192 또는 변형된 miR-215 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 여기서 U^F는 할로우라실, 구체적으로 5-플루오로우라실이다.

[0028] 또 다른 예시적인 구체예에 있어서, 본 발명은 우라실을 5-할로우라실로 대체함으로써 변형된, 변형된 본연의 miR-502 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에 있어서, 상기 변형된 miR-502 뉴클레오타이드 서열은 U 염기들 중 하나 이상을 5-플루오로우라실로 대체함으로써 변형되었다.

[0029] 다른 세트의 구체 예에서, 상기 miR-502 뉴클레오타이드 서열 내 U 염기들 중 정확히 하나는 5-할로우라실이다. 제2의 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-502 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 2개 또는 2개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-502 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 3개 또는 3개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 miR-502 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 4개 또는 4개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 miR-502 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 5개 또는 5개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 miR-502 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 6개 또는 6개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 miR-502 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 7개 또는 7개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 특정 구체예에 있어서, 상기 miR-502 뉴클레오타이드 서열의 U 염기들 전부는, 본연의 부분에서이든 및/또는 부속된 부분에서이든지 간에, 5-할로우라실이다.

[0030] 한 가지 예시적 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 변형된 miR-502 핵산 조성물은,

AU^FCCU^FU^FGCUAU^FCU^FGGGU^FGCU^FA [SEQ ID NO. 13]의 변형된 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 여기서 U^F는 할로우라실, 구체적으로는 5-플루오로우라실이다.

[0031] 또 다른 예시적 구체예에 있어서, 본 발명은 5-할로우라실을 포함하는 변형된 miR-506 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에 있어서, 상기 변형된 miR-506 뉴클레오타이드 서열은 U 염기들 중 하나 이상을 5-할로우라실, 예컨대 5-플루오로우라실로 대체함으로써 변형되었다.

[0032] 또 다른 구체예 세트에 있어서, 본연의 miR-506 뉴클레오타이드 서열 내 U 염기들 중 정확히 하나는 5-할로우라실로 대체된다. 제2의 구체예 세트에 있어서, 상기 변형된 miR-506 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 2개 또는 2개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예 세트에 있어서, 상기 변형된 miR-506 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 3개 또는 3개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 변형된 miR-506 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 4개 또는 4개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 변형된 miR-506 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 5개 또는 5개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 변형된 miR-506 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 6개 또는 6개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 변형된 miR-506 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 7개 또는 7개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 특정 구체예에 있어서, 상기 변형된 miR-506 뉴클레오타이드 서열의 U 염기들 전부는, 본연의 부분에서이든 및/또는 부속된 부분에서이든지 간에, 5-할로우라실이다.

[0033] 한 가지 예시적 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 miR-506 핵산 조성물은,

U^FAU^FU^FCAGGAAGGU^FGU^FU^FACU^FU^FAA [SEQ ID NO. 15]의 변형된 마이크로RNA 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 여기서 U^F는 할로우라실, 구체적으로는 5-플루오로우라실이다.

[0034] 일부 구체예에 있어서, 상기 5-할로우라실은, 예컨대 5-플루오로우라실, 5-클로로우라실, 5-브로모우라실, 또는 5-요오도우라실이다. 특정 구체예에 있어서, 상기 5-할로우라실은 5-플루오로우라실, 또는 그들의 조합이다.

[0035] 본 발명은 또한 본 발명에 기재된 변형된 마이크로RNA 조성물의 제형 또는 이들의 조합을 포함하는 제형에 관한 것이다. 특정 구체예에 있어서, 상기 제형은 전술한 핵산 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 제제를 포함할 수 있다.

[0036] 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 기재된 하나 이상의 핵산 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명 방법의 특정 구체예에 있어서, 상기 핵산 조성물은 변형된 miR-129, miR-15a, miR-192, miR-215, miR-140, miR-502 또는 miR-506 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 본연의 (비변형) 뉴클레오타이드 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 6 개 또는 그 이상의 우라실 뉴클레오타이드 염기들은 5-할로우라실로 대체되었다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 본 발명의 핵산 조성물을 암을 앓는 또는 암 소인을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는데, 이에 의하여 상기 핵산 조성물은 변형된 miR-129 또는 변형된 miR-15a 핵산이다. 본 발명의 특정 구체예에 있어서, 투여된 상기 변형된 마이크로RNA는,

CU^FU^FU^FU^FU^FGCGGU^FCU^FGGGCU^FU^FGC [SEQ ID NO. 4],

CUUUUUGCGGU^FCU^FGGGCU^FU^FGC [SEQ ID NO. 5],

U^FAGCAGCACAU^FAAU^FGGU^FU^FU^FGU^FG [SEQ ID NO.6],

UAGCAGCACAU^FAAU^FGGU^FU^FU^FGU^FG [SEQ ID NO. 7],

CAGU^FGGUUUUACCCU^FAUGGU^FAG [SEQ ID NO. 9],

CU^FGACCU^FAU^FGAAU^FU^FGACAGCC [SEQ ID NO. 11],

AU^FCCU^FU^FGCUAU^FCU^FGGGU^FGCU^FA [SEQ ID NO. 13], 및

U^FAU^FU^FCAGGAAGGU^FGU^FU^FACU^FU^FAA [SEQ ID NO. 15]로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는다.

[0037] 특정 구체예에 있어서, 상기 대상체는 포유류이다. 다른 구체 예에 있어서, 치료되는 대상체는 인간, 개, 말, 돼지, 마우스 또는 래트이다. 특정 구체예에 있어서, 상기 대상체는 암으로 진단되었거나 암 발생의 소인을 갖는 것으로 확인된 인간이다. 일부 구체예에 있어서, 상기 치료되는 암은, 예컨대 대장암, 위암, 식도암, 폐암, 난소암, 췌장암 또는 자궁암일 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 대장암, 췌장암 또는 유방암에 대한 대상체를 치료한다.

[0038] 본 발명에서 제공되는 데이터는 놀랍게도, 대장암, 췌장암 및 폐암을 비롯한 몇몇 상이한 암 모델에서 공지의 항암 제제, 예컨대 5-FU 단독과 비교할 때 본 발명에 기재되는 변형된 마이크로RNA의 증가된 효능을 보여준다. 예를 들어, 본 발명은 상기 기술된 변형된 핵산 조성물이 5-FU, miR-15a, miR-129, miR-140, miR-192, miR-215, miR-502 또는 miR-506 단독의 경우보다, 또는 5-FU와 대응하는 본연의 마이크로RNA들의 조합보다 암 진행 및 종양 형성을 억제하는데 실질적으로 더 강력하다는 예기치 않은 발견을 제공한다.

[0039] 이와 같이, 본 발명의 조성물 및 방법은 낮은 투여량을 허용하는 부가적인 이점을 제공하게 되는데, 이는 독성을 낮추고 부작용을 감소시키는 결과를 나타낸다. 상기 기술되는 핵산 조성물에 의하여 보여지는 또 다른 중요한 이점은 본 조성물이 할로우라실로 변형되지 않은 miR-140, miR-192, miR-215, miR-502 또는 miR-506 서열과 비교하여 대단히 향상된 효능을 갖는다는 것이다. 따라서, 적어도 상기 언급된 이점에 비추어, 본 발명에 개시된 핵산 조성물은 암 치료에 실질적인 진보를 나타낸다.

도면의 간단한 설명

[0040] 도 1a 내지 1h. 본 발명의 예시적인 변형된 마이크로RNA 뉴클레오타이드 서열의 화학적 표현. (a) SEQ ID NO: 4에 기재된 대로, 모든 U 염기들이 할로우라실 (즉, UF)로 대체된 miR-129 뉴클레오타이드 서열의 화학적 표현. (b) SEQ ID NO: 5에 기재된 대로, miR-129의 비-씨드 부분만이 할로우라실로 대체된 U 염기를 갖는 miR-129의 화학적 표현 (c) SEQ ID NO: 6에 기재된 대로, 모든 U 염기가 할로우라실로 대체된 miR-15a 뉴클레오타이드 서열의 화학적 표현, (d) SEQ ID NO: 7에 기재된 대로, miR-15a의 비-씨드 부분만이 할로우라실로 대체된 U 염기를 갖는 miR-15a의 화학적 표현. (e) SEQ ID NO: 9에 기재된 대로, 특정한 3 개 U 염기가 할로우라실로 대체된 miR-140 뉴클레오타이드 서열의 화학적 표현. (f) SEQ ID NO: 11에 기재된 대로, 특정한 5 개 U 염기가 할로우라실로 대체된 miR-192 뉴클레오타이드 서열의 화학적 표현. (g) SEQ ID NO: 13에 기재된 대로, 특정한 7 개 U 염기가 할로우라실로 대체된 miR-502 뉴클레오타이드 서열의 화학적 표현. (h) SEQ ID NO: 15에 기재된 대로, 모든 (즉, 8 개) U 염기가 할로우라실로 대체된 miR-506 뉴클레오타이드 서열의 화학적 표현.

[0041] 도 2a-c. 예시적인 변형 miR-129 핵산은 암 세포에 들어가서 표적 단백질 발현을 효과적으로 감소시킨다. (a) 대조군 miRNA 및 비변형 miR-129 핵산의 것과 비교한, 변형 miR-129 (모든 U 염기가 5-FU로 대체됨, 5-FU-miR-129)의 표적 (E2F3) 특이성 및 성능을 보여주는 그래프. (b) miR-129 모방체가 암 세포에 들어간다는 것을 보여주는 정량적 실시간 PCR 분석. (c) miR-129 모방체는 암 세포에 들어가서 5-FU 단독의 경우보다 크게 우수하게 TS-FdUMP를 분해한다.

[0042] 도 3. 비특이적 대조군 (음성 대조군,

) 및 이상 발현된 (ectopically expressed) 본연의 miR-129 (○)에 비하여, 모든 U 염기가 5-FU로 대체된 예시적인 변형된 miR-129 핵산 (모방체)(

)에 의하여 4 가지 상이한 대장암 세포주 (HCT116, RKO, SW480 및 SW620)에서 대장암 세포 증식이 억제됨을 보여주는 그래프.

[0043] 도 4. 5-FU 및 본 발명의 변형된 마이크로RNA 조성물과의 조합 요법은 암 세포 증식을 효과적으로 억제한다. 음성 대조군 (NC), 본연의 miR-129, 5-FU, 본 발명의 예시적인 변형된 miR-129 핵산 모방체 (5-FU-miR-129), 및 5-FU와 본 발명의 예시적인 miR-129 모방체의 조합 (5-FU-miR-129 + 5-FU)으로 치료된 암 세포에 대하여, 대장암 세포 증식의 도표적 비교.

[0044] 도 5a-b. 예시적인 마이크로RNA 모방체는 대장암 세포에서 세포자멸사를 유도하고 세포 주기 어레스트를 야기한다. (a) 세포 사멸을 FITC-아넥신 V 세포자멸사 분석으로 정량화하여, 몇 가지 상이한 대장암 세포주에서 본 발명의 변형된 miR-129 핵산 조성물이 음성 대조군, 또는 이상 발현된 본연의 miR-129보다 상당히 높은 수준으로 암 세포의 세포자멸사를 유도한다는 것을 보여주었다. (b) 유세포 분석을 수행하여 본 발명의 변형된 miR-129 핵산 조성물 (모방체-1)이 음성 대조군 또는 이상 발현된 본연의 miR-129보다 상당히 높은 수준으로 G1 세포 주기 어레스트를 증가시킨다는 것을 밝혔다.

[0045] 도 6. 본 발명의 변형된 마이크로RNA 핵산 조성물은 화학 요법 내성의 암 줄기 세포를 제거한다. HCT116 유래 대장암 줄기 세포를 본 발명의 예시적인 변형 된 miR-129 핵산 (○) 또는 5-FU (●)의 농도를 증가시키며 처리하였다. 결과는, 변형된 miR-129 핵산이 용량 의존적 방식으로 5-FU 내성 암 줄기 세포를 사멸시켰음을 보여준다.

[0046] 도 7. 예시적인 변형된 miR-129 핵산 조성물을 이용한 생체 내 (in vivo) 전신 치료는 독성 부작용 없이 대장암 전이를 억제한다. 대장암 전이 마우스 모델은 전이성 인간 대장암 세포의 꼬리 정맥 주사를 통해 확립되었다. 전이를 확립한 지 2 주 후, SEQ ID NO: 4에 기재된 바와 같은 변형된 miR-129 핵산 조성물 40 μg을 정맥 내 주사에 의하여 2 주간 격일로 1 회 주사의 처리 빈도로 전달하였다. 상기 예시적인 변형된 miR-129 핵산 (모방체)는 대장암 전이를 억제할 수 있었던 반면 (오른쪽 패널), 음성 대조군 miRNA (왼쪽 패널)는 효과가 없었다. 상기 변형된 miR-129 핵산으로 처리된 마우스는 어떠한 독성도 나타내지 않았다.

[0047] 도 8a-b. 예시적인 제2의 본 발명의 변형된 마이크로RNA의 항암 활성. (a) 비변형 miR-15a (miR-15a)와 변현된 miR-15a 핵산 조성물 (모방체-1)의 대장암 세포에서의 단백질 발현 조절 능력을 비교한 대표적인 웨스턴 블롯. SEQ ID NO: 6에 기재된 바와 같은 변형된 miR-15a (모방체-1)은 대장암 세포에서 miR-15a 표적 (YAP1, BMI-1, DCLK1 및 ECL2)을 조절하고 TS-FdUMP를 분해하는 능력을 보유한다. (b) 변형된 miR-15a (모방체-1)은 비변형 miR-15a (miR-15a)와 비교하여 3 가지 상이한 대장암 세포주 (HCT116, RKO, SW620)에서 대장암 세포 증식을 억제하는 능력이 강화됨을 보였다.

[0048] 도 9. 대조군 (음성), 비변형 miR-15a (miR-15a) 및 SEQ ID NO: 6에 기재된 바와 같은 예시적인 변형된 miR-15a 핵산 조성물 (모방체-1)에 대한 세포 주기 제어를 보여주는 그래프. 본연의 miR-15a를 이상 발현하는 세포 및 음성 대조군과 비교할 때, 변형된 miR-15a를 발현하는 대장암 세포에 의해 나타난 G1/S 비율의 증가에 의하여 보여지는 바와 같이, 변형된 miR-15a 핵산의 투여는 비변형된 miR-15a에 비해 세포 주기 어레스트를 유도하였다.

[0049] 도 10. 변형된 miR-15a 발현은 암 줄기 세포가 암 세포 콜로니 형성을 유도하는 능력을 감소시킨다. 대장암 줄기 세포에서, 비변형된 miR-15a (miR-15a)의 발현은 비특이적 대조군 마이크로RNA (음성)를 이용하여 제공되는 암 줄기 세포의 능력과 비교하였을 때 암세포 콜로니 형성을 억제하였다. 본 발명의 예시적인 변형된 miR-15a (5-FU-miR-15a)를 이용한 처리는 암 세포 콜로니 형성을 완전히 방지하였다.

[0050] 도 11. 변형된 miR-15a는 생체 내 효과적인 항암 제제이다. 대장암 전이 마우스 모델은 전이성 인간 대장암 세포의 꼬리 정맥 주사를 통하여 확립되었다. 전이를 확립한 지 2 주 후, SEQ ID NO : 6에 기재된 바와 같은 변형된 miR-15a 핵산 조성물 40 μg을 정맥 내 주사에 의해 2 주간 격일로 1 회 주사의 처리 빈도로 전달하였다. 예시적인 변형된 miR-15a 핵산 (모방체)는 대장암 전이를 억제할 수 있었던 반면, 음성 대조군 miRNA (음성)는 효과가 없었다. 변형된 miR-15a 핵산으로 처리된 마우스는 어떠한 독성도 나타내지 않았다.

[0051] 도 12a-d. 본 발명의 예시적인 변형된 miR-15a 및 miR-129 모방체들은, 비변형 miR-15a (miR-15a) 또는 비변형 miR-129 (miR-129) 또는 음성 대조군으로 처리된 세포들에 비하여 인간의 유방암 세포 (A549; c, d) 및 췌장암 세포 (Panc-1 (a); AsPC-1 (b)) 증식을 억제하는 강화된 능력을 나타낸다.

[0052] 도 13a-b. 본 발명의 예시적인 변형된 마이크로RNA는 인간 대장암 세포 증식을 억제하는 향상된 능력을 나타낸다. 추가적인 예시적 변형된 마이크로RNA를 HCT116 인간 대장암 세포에서 대장암 세포 증식을 억제하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. (a) SEQ ID NO: 9로 기재되는 예시적인 변형된 miR-140 모방체를 인간 대장암 세포에 투여하고, 음성 대조군 마이크로RNA와 비교하였을 때, 대장암 세포 증식 억제 능력이 증가함이 밝혀졌다. (b) SEQ ID NO: 11로 기재되는 예시적인 변형된 miR-192 모방체를 인간 대장암 세포에 투여하고, 음성 대조군 마이크로RNA와 비교하였을 때, 대장 암 세포 증식 억제 능력이 증가함이 밝혀졌다.

[0053] 도 14a-d. 본 발명의 예시적인 변형된 마이크로RNA는 인간 췌장암 및 유방암 세포 증식을 억제하는 향상된 능력을 나타낸다. 추가적인 예시적 변형된 마이크로RNA를, 암 세포 증식에 대한 그들의 영향을 조사함으로써 여러 가지 유형의 인간 암을 억제하는 그들의 능력에 대하여 시험하였다. SEQ ID NO: 13으로 기재되는 예시적인 변형된 miR-502 모방체를 인간 췌장암 세포 (PANC1, a) 및 인간 유방암 (A549, c)에 투여하고, 음성 대조군 마이크로RNA와 비교했을 때, 두 가지 유형의 암 세포 증식을 억제하는 능력이 증가함이 밝혀졌다. 또 다른 예시적인 변형된 마이크로RNA인, SEQ ID NO: 15로 기재되는 miR-506 모방체를 인간 췌장암 세포 (PANC1, b) 및 인간 유방암 (A549, d)에 투여하고, 음성 대조군 마이크로RNA와 비교했을 때, 두 가지 유형의 암 세포 증식을 억제하는 능력이 증가함이 밝혀졌다.

발명의 상세한 설명

[0054] 본 발명은 하나 이상의 할로우라실 분자를 포함하는 핵산 조성물을 제공한다. 어떠한 하나의 특정 이론에 구속됨이 없이, 놀랍게도, 본 발명은 마이크로RNA 올리고뉴클레오타이드 서열 내의 우라실 뉴클레오타이드를 5-할로우라실로 대체하는 것이 상기 마이크로RNA의 암, 발병, 진행 및 종양 형성을 억제하는 능력을 증가시킨다는 것을 밝혀냈다. 이와 같이, 본 발명은 그의 핵산 서열 내에 혼입 된 5-할로우라실 분자를 갖는 다양한 핵산 (예컨대, 마이크로RNA) 조성물 및 이를 이용하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 제형, 예컨대 변형된 핵산 조성물을 포함하는 약학적 조성물 및 그를 필요로 하는 대상체로의 상기의 약학적 조성물의 투여를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.

핵산 조성물

[0055] 용어 "마이크로RNA" 또는 "miRNA" 또는 "miR"은 메신저 RNA 분자 (mRNA), DNA 또는 단백질과의 상호 작용을 통하여 유전자의 발현을 조절할 수 있는 작은 비-코딩 리보오스 핵산 (RNA) 분자를 지칭하기 위하여 상호 교환적으로 사용된다. 통상적으로, 마이크로RNA는 약 19-25 뉴클레오타이드 (염기)의 핵산 서열로 이루어지고 포유류 세포에서 발견된다.

[0056] 용어 "변형된 마이크로RNA", "변형된 miRNA", "변형된 miR" 또는 "모방체"는 본연의 또는 내인성 마이크로RNA (미변형 마이크로RNA) 폴리뉴클레오타이드와는 상이한 마이크로RNA를 지칭하기 위하여 본 발명에서 상호 교환적으로 사용된다. 보다 구체적으로, 본 발명에서, 변형된 마이크로RNA는 비변경 또는 비변형 마이크로RNA 핵산 서열과 하나 이상의 염기가 상이하다. 본 발명의 일부 구체예에 있어서, 본 발명의 변형된 마이크로RNA는 5-할로우라실로 대체된 하나 이상의 우라실 (U) 뉴클레오타이드 염기를 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 변형된 마이크로RNA는 추가적인 뉴클레오타이드 (즉, 아데닌 (A), 시토신 (C), 우라실 (U) 및 구아닌 (G)) 및 5-할로우라실로 치환되는 하나 이상의 우라실 염기를 포함한다.

[0057] 본 발명의 한 가지 측면에 있어서, 5-할로우라실, 예컨대 5-플루오로 우라실 (5-FU)로 대체된 하나 이상의 우라실 염기 (U, U 염기)를 갖는 변형된 마이크로RNA 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 조성물이 기술된다. 본 발명에서 더 논의되는 바와 같이, 본 발명의 핵산 조성물은 적어도 암, 특히 대장암, 췌장암 및 유방암의 치료에 유용하다.

[0058] 일부 구체예에 있어서, 상기 핵산 조성물은 5-위치에서 할로겐 원자와 유사한 효과를 제공하는 그룹을 이용하여 하나 이상의 우라실 뉴클레오염기를 유도체화함으로써 변형된 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부 구체예에 있어서, 상기 유사한 효과를 제공하는 그룹은 중량 또는 공간적 차원에 있어서 할로겐 원자와 유사한 규모를 갖는데, 예컨대 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 이하의, 또는 80 g/mol 이하의 분자량이다. 특정 구체예에 있어서, 할로겐 원자와 유사한 효과를 제공하는 그룹은, 예컨대 메틸기, 트리할로메틸기 (예컨대, 트리플루오로메틸기), 슈도할라이드 (예컨대, 트리플루오로메탄술포네이트, 시아노 또는 시아네이트) 또는 중수소 (D) 원자일 수 있다. 할로겐 원자와 유사한 효과를 제공하는 그룹은 마이크로RNA 뉴클레오타이드 서열에서 5-할로우라실 염기의 부재하에 또는 그에 더하여 존재할 수 있다.

[0059] 또한, 다른 구체예에 있어서, 할로겐 원자와 유사한 효과를 제공하는 그룹은 마이크로RNA 뉴클레오타이드 서열의 본연의 (또는 씨드) 부분 및/또는 부속 부분에 위치할 수 있는데, 이는 이 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 쉽게 동정될 것이다. 일부 구체예에 있어서, 할로겐 원자와 유사한 효과를 제공하는 상기 유형의 그룹들 중 하나 이상 (또는 모두)는 변형된 miRNA 뉴클레오타이드 서열로부터 배제된다. 이러한 모든 대안적인 그룹들이 배제되는 경우, 하나 이상의 할로겐 원자들만이 상기 마이크로RNA 뉴클레오타이드 서열 중의 하나 이상의 우라실 그룹의 5-위치에서 치환체로서 존재한다.

[0060] 특정 구체예에 있어서, 상기 변형된 마이크로RNA는 5-할로우라실로 대체된, 하나 이상의 또는 정확히 하나의 우라실을 갖는다.

[0061] 일부 구체예에 있어서, 상기 변형된 마이크로RNA 뉴클레오타이드 서열은 5-할로우라실로 대체된, 3, 4, 5, 6, 7, 8 개 또는 그 이상의 우라실 염기를 포함한다.

[0062] 다른 구체예에 있어서, 변형된 mRNA의 모든 우라실 뉴클레오타이드 염기는 5-할로우라실로 대체되었다.

[0063] 일부 구체예에 있어서, 5-할로우라실은, 예컨대 5- 플루오로우라실, 5-클로로우라실, 5-브로모우라실 또는 5-요오도우라실이다. 특정 구체예에 있어서, 상기 5-할로우라실은 5-플루오로우라실이다.

[0064] 본 발명에서 사용되는 용어 "miR-129"는 "마이크로RNA-129" 또는 "miRNA-129"와 동의어를 의미하고, 하기 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 말하며:

CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC [SEQ ID NO. 1],

여기서 C = 시토신, U = 우라실 및 G = 구아닌 염기인 것으로 이해된다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 달리 명시하지 않는 한 본 발명에서 비변형 (즉, "본연의") miR-129 서열을 말한다. miR-129는 또한, 이 분야에서, 수탁 번호 MI0000252 및 MIMAT0000242의, hsa-miR-129 또는 hsa-miR-129-5p로 불리울 수 있다. MiR-129는 잘 알려져 있으며, 상세히 연구되었다. 예컨대, [J. Wu et al., Cell Cycle, (2010) 9:9, 1809-1818] 참조. 이 분야에 잘 알려진 바와 같이, 상기 miR-129 서열은 "miR-129 모방체"를 생성하도록 변형될 수 있는데, 이는 본연의 서열로부터 변형된 서열을 갖지만 본연의 miR-129의 알려진 기능 또는 활성을 보유한다. 달리 언급하지 않는 한, 이러한 모든 변형된 miR-129 조성물은 본 발명에서 사용되는 용어 "miR-129 모방체"의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

[0065] 대상 핵산 서열의 특정 변형된 miR-129 핵산 서열 (모방체)는 상기 miR-129 본연의 서열, 예컨대 CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC-UU [SEQ ID NO. 3]의 말단에 공유적으로 부속되는 2 개의 U 염기 (즉, 2 개의 U-함유 뉴클레오타이드)를 함유한다. 상기 서열에서, 2 개의 말단 U 염기는 상기 본연의 miR-129 서열을 21 개의 뉴클레오타이드 염기에서 23 개의 뉴클레오타이드 염기로 연속 또는 연장시킨다. 일반적으로, 상기 miR-129 모방체는 상기 miR-129 본연의 서열에 공유적으로 부속되는 1, 2, 3, 4 또는 5 개 이하의 추가적인 염기 (즉, 추가적인 뉴클레오타이드로서)를 함유하며, 상기 추가적인 염기는 C, U, G로부터, 그리고 C로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 상기 추가적인 염기는 독점적으로 U일 수 있다. 통상적으로, 상기 miR-129는 단일 가닥 형태로 이용되지만, 이중 가닥 버전 또한 본 발명에서 고려된다.

[0066] 한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 그 우라실 뉴클레오염기 (즉, U 염기) 중 하나 이상을 5-할로우라실로 대체함으로써 변형된 miR-129 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것으로, 즉 여기서 상기 miR-129 서열 내 U 염기들 중 하나 이상은, 그 본연의 부분에서든 및/또는 부속 부분에서든 5-할로우라실이다. 상기 5-할로우라실은, 예컨대 5-플루오로우라실, 5-클로로우라실, 5-브로모우라실 또는 5-요오도우라실일 수 있다.

[0067] 제1의 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-129 서열 내 U 염기들 중 정확히 하나는 5-할로우라실이다. 제2의 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-129 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 2개 또는 2개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 제3의 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-129 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 3개 또는 3개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 제4의 구체예에 있어서, 상기 miR-129 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 4개 또는 4개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 제5의 구체예에 있어서, 상기 miR-129 뉴클레오타이드 서열 내 정확히 5개 또는 5개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 제6의 구체예에 있어서, 상기 miR-129 뉴클레오타이드 서열의 U 염기들 전부는, 본연의 부분에서이든 및/또는 부속된 부분에서이든지 간에, 5-할로우라실이다.

[0068] 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 핵산 조성물은 SEQ ID NO. 4로 기재되는 CU^FU^FU^FU^FU^FGCGGU^FCU^FGGGCU^FU^FGC의 변형된 마이크로RNA 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 여기서 U^F는 할로우라실, 구체적으로 5-플루오로우라실이다.

[0069] 상기 miR-129 서열에서 5-할로우라실로 대체된 U 염기들은, 상기 제시된, 상기 miR-129 서열의 비변형 부분에 위치할 수 있거나, 또는 miR-129 모방체의 경우에는, 또한 상기 제시된 바와 같이, 본연의 miR-129에 공유적으로 부속되는 하나 이상의 U 염기들에 위치할 수도 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 본연의 miR-129 뉴클레오타이드 서열의 씨드 부분인 GUUUUUGC는 5-할로우라실로 변형되지 않은 채로 남아있는 반면, 상기 miR-129 뉴클레오타이드 서열의 나머지부에 남아있는 U 염기들 중 하나 이상 (또는 전부)는 동등한 수의 5-할로우라실로 대체된다.

[0070] 예컨대, 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 핵산 조성물은 SEQ ID NO. 5로 기재되는 CUUUUUGCGGU^FCU^FGGGCU^FU^FGC의 변형된 마이크로RNA 뉴클레오타이드 서열을 갖는데, 이에 의하여 U^F는 할로우라실, 구체적으로 5-플루오로우라실이다.

[0071] 다른 구체예에 있어서, 상기 핵산 조성물은 5-위치에서 우라실 (U) 뉴클레오염기 중 하나 이상을 할로겐 원자 유사한 효과를 제공하는 그룹으로 유도체화함으로써 변형된, miR-129 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부 구체예에 있어서, 상기 유사한 효과를 제공하는 그룹은 중량 또는 공간적 차원에 있어서 할로겐 원자와 유사한 규모를 갖는데, 예컨대 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 이하의, 또는 80 g/mol 이하의 분자량이다. 할로겐 원자와 유사한 효과를 제공하는 상기 그룹은, 예컨대 메틸기, 트리할로메틸기 (예컨대, 트리플루오로메틸기), 슈도할라이드 (예컨대, 트리플루오로메탄술포네이트, 시아노 또는 시아네이트) 또는 중수소 (D) 원자일 수 있다. 할로겐 원자와 유사한 효과를 제공하는 상기 그룹은 상기 miR-129 뉴클레오타이드 서열에서 5-할로우라실 염기의 부재하에 또는 그에 더하여 존재할 수 있다. 더하여, 할로겐 원자와 유사한 효과를 제공하는 상기 그룹은 상기 miR-129 뉴클레오타이드 서열의 본연의 (또는 씨드) 부분 및/또는 부속 부분에 위치할 수 있다. 일부 구체예에 있어서, 할로겐 원자와 유사한 효과를 제공하는 상기 유형의 그룹들 중 하나 이상 (또는 모두)는 상기 miR-129 뉴클레오타이드 서열로부터 배제된다. 이러한 모든 대안의 그룹이 배제되는 경우, 하나 이상의 할로겐 원자만이 상기 miR-129 뉴클레오타이드 서열 내 하나 이상의 우라실 그룹들의 5-위치에 치환체로서 존재한다.

[0072] 또 다른 예시적인 구체예에 있어서, 본 발명은 변형된 miR-15a 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에 있어서, 상기 miR-15a 뉴클레오타이드 서열은 U 염기들 중 하나 이상을 5-할로우라실로 대체함으로써 변형되었다.

[0073] 본 발명에서 사용되는 용어 "miR-15a"는 "마이크로RNA-15a" 또는 "miRNA-15a"와 동의어를 의미하고, 하기 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 말하며:

UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG [SEQ ID NO. 2],

여기서 A = 아데닌, C = 시토신, U = 우라실 및 G = 구아닌 염기인 것으로 이해된다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 달리 명시하지 않는 한 본 발명에서 비변형 (즉, "본연의") miR-15a 서열을 말한다. miR-15a는 또한, 이 분야에서, 수탁 번호 MI0000069의, hsa-miR-15a 또는 hsa-miR-15a-5p로 불리울 수 있다. MiR-15a는 잘 알려져 있으며, 상세히 연구되었다. 예컨대, [Xie T,　et al. Clin Transl Oncol. (2015) 17(7):504-10]; 및 [Acunzo M, and Croce CM, Clin . Chem. (2016) 62(4):655-6] 참조. miR-129 모방체에 대하여 전술한 바와 같이, miR-15a 모방체를 생성하는 방법은 이 기술 분야의 숙련된 기술자에게 공지된 것이다. 달리 언급하지 않는 한, 이러한 모든 변형된 miR-15a 형태는 본 발명에서, 본 발명에서 사용되는 용어 "miR-15a 모방체"의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

[0074] 일반적으로, 변형된 miR-15a (즉, miR-15a 모방체)는 상기 miR-15a 본연의 서열에 공유적으로 부속되는 1, 2, 3, 4 또는 5 개 이하의 추가적인 염기를 함유하며, 상기 추가적인 염기는 C, U, G로부터, 그리고 C로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 상기 추가적인 염기는 독점적으로 U일 수 있다. 통상적으로, 상기 miR-15a는 단일 가닥 형태로 이용되지만, 이중 가닥 버전 또한 본 발명에서 고려된다.

[0075] 일부 구체예에 있어서, 상기 miR-15a 서열 내 U 염기들 중 하나 이상은, 그 본연의 부분에서든 및/또는 부속 부분에서든 5-할로우라실이다. 상기 5-할로우라실은, 예컨대 5-플루오로우라실, 5-클로로우라실, 5-브로모우라실 또는 5-요오도우라실일 수 있다.

[0076] 제1의 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-15a 서열 내 U 염기들 중 정확히 하나는 5-할로우라실이다. 제2의 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-15a 서열 내 정확히 2개 또는 2개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 또 다른 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-15a 올리고뉴클레오타이드 서열 내 정확히 3개 또는 3개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 miR-15a 서열 내 정확히 4개 또는 4개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 일부 구체예에 있어서, 상기 miR-15a 서열 내 정확히 5개 또는 5개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 miR-15a 서열 내 정확히 6개 또는 6개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 특정 구체예에 있어서, 상기 miR-15a 서열의 U 염기들 전부는, 본연의 부분에서이든 및/또는 부속된 부분에서이든지 간에, 5-할로우라실이다.

[0077] 한 가지 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 핵산 조성물은 U^FAGCAGCACAU^FAAU^FGGU^FU^FU^FGU^FG [SEQ ID NO. 6]의 변형된 마이크로RNA 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 여기서 U^F는 할로우라실, 구체적으로 5-플루오로우라실이다.

[0078] 상기 miR-15a 서열에서 5-할로우라실로 대체된 U 염기들은, 상기 제시된, 상기 miR-15a 서열의 비변형 부분에 위치할 수 있거나, 또는 miR-15a 모방체의 경우에는, 또한 상기 제시된 바와 같이, 본연의 miR-15a에 공유적으로 부속되는 하나 이상의 U 염기들에 위치할 수도 있다.

[0079] 다른 구체예에 있어서, 상기 본연의 miR-15a 뉴클레오타이드 서열의 씨드 부분인 UAGCAGCA는 5-할로우라실로 변형되지 않은 채로 남아있는 반면, 상기 miR-15a 뉴클레오타이드 서열의 나머지부 (비-씨드 부분)에 남아있는 U 염기들 중 하나 이상 (또는 전부)는 5-할로우라실로 대체된다.

[0080] 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 핵산 조성물은 UAGCAGCACAU^FAAU^FGGU^FU^FU^FGU^FG [SEQ ID NO. 7]의 변형된 miR-15a 뉴클레오타이드 서열을 갖는데, 여기서 U^F는 할로우라실, 구체적으로 5-플루오로우라실이다.

[0081] 특정 구체예에 있어서, 상기 핵산 조성물은 5-위치에서 우라실 (U) 뉴클레오염기 중 하나 이상을 할로겐 원자 유사한 효과를 제공하는 그룹으로 유도체화함으로써 변형된, miR-15a 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부 구체예에 있어서, 상기 유사한 효과를 제공하는 그룹은 중량 또는 공간적 차원에 있어서 할로겐 원자와 유사한 규모를 갖는데, 예컨대 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 이하의, 또는 80 g/mol 이하의 분자량이다. 할로겐 원자와 유사한 효과를 제공하는 상기 그룹은, 예컨대 메틸기, 트리할로메틸기 (예컨대, 트리플루오로메틸기), 슈도할라이드 (예컨대, 트리플루오로메탄술포네이트, 시아노 또는 시아네이트) 또는 중수소 (D) 원자일 수 있다. 할로겐 원자와 유사한 효과를 제공하는 상기 그룹은 상기 miR-15a 뉴클레오타이드 서열에서 5-할로우라실 염기의 부재하에 또는 그에 더하여 존재할 수 있다. 더하여, 할로겐 원자와 유사한 효과를 제공하는 상기 그룹은 상기 miR-15a 뉴클레오타이드 서열의 본연의 (또는 씨드) 부분 및/또는 부속 부분에 위치할 수 있다.

[0082] 일부 구체예에 있어서, 할로겐 원자와 유사한 효과를 제공하는 상기 유형의 그룹들 중 하나 이상 (또는 모두)는 상기 miR-15a 뉴클레오타이드 서열로부터 배제된다. 이러한 모든 대안의 그룹이 배제되는 경우, 하나 이상의 할로겐 원자만이 상기 miR-15a 뉴클레오타이드 서열 내 하나 이상의 우라실 그룹들의 5-위치에 치환체로서 존재한다.

[0083] 또 다른 예시적인 구체예에 있어서, 본 발명은 변형된 miR-140 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에 있어서, 상기 miR-140 뉴클레오타이드 서열은 U 염기들 중 하나 이상을 5-할로우라실로 대체함으로써 변형되었다.

[0084] 본 발명에서 사용되는 용어 "miR-140"는 "마이크로RNA-140" 또는 "miRNA-140"와 동의어를 의미하고, 하기 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 말하며:

CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG [SEQ ID NO. 8],

여기서 A = 아데닌, C = 시토신, U = 우라실 및 G = 구아닌 염기인 것으로 이해된다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 달리 명시하지 않는 한 본 발명에서 비변형 (즉, "본연의") miR-140 서열을 말한다. miR-140은 또한, 수탁 번호 NT_010498로, 또는 miRBase 수탁 번호 MI0000456로 불리울 수 있다. MiR-140은 잘 알려져 있으며, 상세히 연구되었다. 예컨대, [Zhai, H. et al., Oncotarget. (2015) 6: 19735-46] 참조. 예시적인 모방체 miR-129 및 miR-15a에 대하여 전술한 바와 같이, miR-140 모방체를 생성하는 방법은 이 기술 분야의 숙련된 기술자에게 공지된 것이다. 달리 언급하지 않는 한, 이러한 모든 변형된 miR-140 형태는 본 발명에서, 본 발명에서 사용되는 용어 "miR-140 모방체"의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

[0085] 일반적으로, 변형된 miR-140 핵산 (즉, miR-140 모방체)는 상기 miR-140 본연의 서열에 공유적으로 부속되는 1, 2, 3, 4 또는 5 개 이하의 추가적인 염기를 함유하며, 상기 추가적인 염기는 C, U, G로부터, 그리고 C로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 상기 추가적인 염기는 독점적으로 U일 수 있다. 통상적으로, 상기 miR-140 모방체는 단일 가닥 형태로 이용되지만, 이중 가닥 버전 또한 본 발명에서 고려된다.

[0086] 일부 구체예에 있어서, 상기 miR-140 서열 내 U 염기들 중 하나 이상은, 그 본연의 부분에서든 및/또는 부속 부분에서든 5-할로우라실이다. 상기 5-할로우라실은, 예컨대 5-플루오로우라실, 5-클로로우라실, 5-브로모우라실 또는 5-요오도우라실일 수 있다.

[0087] 제1의 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-140 모방체 서열 내 U 염기들 중 정확히 하나는 5-할로우라실이다. 제2의 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-140 서열 내 정확히 2개 또는 2개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 또 다른 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-140 올리고뉴클레오타이드 서열 내 정확히 3개 또는 3개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 miR-140 서열 내 정확히 4개 또는 4개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 일부 구체예에 있어서, 상기 miR-140 모방체 서열 내 정확히 5개 또는 5개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 miR-140 모방체 서열 내 정확히 6개 또는 6개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 특정 구체예에 있어서, 상기 miR-140 서열의 U 염기들 전부는, 본연의 부분에서이든 및/또는 부속된 부분에서이든지 간에, 5-할로우라실이다.

[0088] 한 가지 예시적인 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 핵산 조성물은 CAGU^FGGUUUUACCCU^FAUGGU^FAG [SEQ ID NO. 9]의 변형된 miR-140 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 여기서 U^F는 할로우라실, 구체적으로 5-플루오로우라실이다.

[0089] 상기 miR-140 모방체 서열에서 5-할로우라실로 대체된 U 염기들은, 상기 제시된, 상기 miR-140 서열의 비변형 부분에 위치할 수 있거나, 또는 상기 제시된 바와 같이, 본연의 miR-140 서열에 공유적으로 부속되는 하나 이상의 U 염기들에 위치할 수도 있다.

[0090] 다른 구체예에 있어서, 상기 본연의 miR-140 뉴클레오타이드 서열의 씨드 부분은 5-할로우라실로 변형되지 않은 채로 남아있는 반면, 상기 miR-140 뉴클레오타이드 서열의 나머지부 (비-씨드 부분)에 남아있는 U 염기들 중 하나 이상 (또는 전부)는 5-할로우라실로 대체된다.

[0091] 또 다른 예시적인 구체예에 있어서, 본 발명은 변형된 miR-192 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에 있어서, 상기 miR-192 뉴클레오타이드 서열은 U 염기들 중 하나 이상을 5-할로우라실로 대체함으로써 변형되었다.

[0092] 본 발명에서 사용되는 용어 "miR-192"는 "마이크로RNA-192", "miRNA-192", "마이크로RNA-215", "miR215" 또는 "miRNA-215"와 동의어를 의미하고, 하기 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 말하며:

CUGACCUAUGAAUUGACAGCC [SEQ ID NO. 10],

여기서 A = 아데닌, C = 시토신, U = 우라실 및 G = 구아닌 염기인 것으로 이해된다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 달리 명시하지 않는 한 본 발명에서 비변형 (즉, "본연의") miR-192 서열을 말한다. miR-192는 또한, hsa-mir-192, has-mir-215로서, 또는 miRBase 수탁 번호 MI0000234, 또는 MIMAT0000222로 불리울 수 있다. MiR-192는 잘 알려져 있으며, 상세히 연구되었다. 예컨대, [Song, B. et al., Clin. Cancer Res. (2008), 14: 8080-8086], 및 [Song, B. et al., Mol. Cancer. (2010), 9:96 pp. 1476-4598] 참조. 예시적인 모방체 miR-129, miR-140 및 miR-15a에 대하여 전술한 바와 같이, miR-192 모방체를 생성하는 방법은 이 기술 분야의 숙련된 기술자에게 공지된 것이다. 달리 언급하지 않는 한, 이러한 모든 변형된 miR-192 핵산 형태는 본 발명에서, 본 발명에서 사용되는 용어 "miR-192 모방체"의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

[0093] 일반적으로, 변형된 miR-192 (즉, miR-192 모방체)는 상기 miR-192 본연의 서열에 공유적으로 부속되는 1, 2, 3, 4 또는 5 개 이하의 추가적인 염기를 함유하며, 상기 추가적인 염기는 C, U, G로부터, 그리고 C로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 상기 추가적인 염기는 독점적으로 U일 수 있다. 통상적으로, 상기 miR-192 모방체는 단일 가닥 형태로 이용되지만, 이중 가닥 버전 또한 본 발명에서 고려된다.

[0094] 일부 구체예에 있어서, 상기 miR-192 또는 miR-215 서열 내 U 염기들 중 하나 이상은, 그 본연의 부분에서든 및/또는 부속 부분에서든 5-할로우라실이다. 상기 5-할로우라실은, 예컨대 5-플루오로우라실, 5-클로로우라실, 5-브로모우라실 또는 5-요오도우라실일 수 있다.

[0095] 또 다른 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-192 모방체 서열 내 U 염기들 중 정확히 하나는 5-할로우라실이다. 제2의 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-192 서열 내 정확히 2개 또는 2개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 또 다른 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-192 올리고뉴클레오타이드 서열 내 정확히 3개 또는 3개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 miR-192 서열 내 정확히 4개 또는 4개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 특정 구체예에 있어서, 상기 miR-192 서열의 U 염기들 전부는, 본연의 부분에서이든 및/또는 부속된 부분에서이든지 간에, 5-할로우라실이다.

[0096] 한 가지 예시적인 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 핵산 조성물은 CU^FGACCU^FAU^FGAAU^FU^FGACAGCC [SEQ ID NO. 11]의 변형된 miR-192 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 여기서 U^F는 할로우라실, 구체적으로 5-플루오로우라실이다.

[0097] 상기 miR-192 모방체 서열에서 5-할로우라실로 대체된 U 염기들은, 상기 제시된, 상기 miR-192 서열의 비변형 부분에 위치할 수 있거나, 또는 상기 제시된 바와 같이, 본연의 miR-192 서열에 공유적으로 부속되는 하나 이상의 U 염기들에 위치할 수도 있다.

[0098] 다른 구체예에 있어서, 상기 본연의 miR-192 뉴클레오타이드 서열의 씨드 부분은 5-할로우라실로 변형되지 않은 채로 남아있는 반면, 상기 miR-192 뉴클레오타이드 서열의 나머지부 (비-씨드 부분)에 남아있는 U 염기들 중 하나 이상 (또는 전부)는 5-할로우라실 또는 그들의 조합으로 대체된다.

[0099] 또 다른 예시적인 구체예에 있어서, 본 발명은 변형된 miR-502 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에 있어서, 상기 miR-502 뉴클레오타이드 서열은 U 염기들 중 하나 이상을 5-할로우라실로 대체함으로써 변형되었다.

[00100] 본 발명에서 사용되는 용어 "miR-502"는 "마이크로RNA-502" 또는 "miRNA-502"와 동의어를 의미하고, 하기 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 말하며:

AUCCUUGCUAUCUGGGUGCUA [SEQ ID NO. 12],

여기서 A = 아데닌, C = 시토신, U = 우라실 및 G = 구아닌 염기인 것으로 이해된다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 달리 명시하지 않는 한 본 발명에서 비변형 (즉, "본연의") miR-502 서열을 말한다. miR-502는 또한, hsa-mir-502로서, 또는 miRBase 수탁 번호 MI0003186, 또는 MIMAT0002873로 불리울 수 있다. MiR-502는 잘 알려져 있으며, 상세히 연구되었다. 예컨대, [Zhai, H, et al., Oncogene. (2013), 32:12 pp. 1570-1579] 참조. 예시적인 모방체 miR-129, miR-140, miR-192 및 miR-15a에 대하여 전술한 바와 같이, miR-502 모방체를 생성하는 방법은 이 기술 분야의 숙련된 기술자에게 공지된 것이다. 달리 언급하지 않는 한, 이러한 모든 변형된 miR-502 핵산 형태는 본 발명에서, 본 발명에서 사용되는 용어 "miR-502 모방체"의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

[00101] 일반적으로, 변형된 miR-502 (즉, miR-502 모방체)는 상기 miR-502 본연의 서열에 공유적으로 부속되는 1, 2, 3, 4 또는 5 개 이하의 추가적인 염기를 함유하며, 상기 추가적인 염기는 C, U, G로부터, 그리고 C로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 상기 추가적인 염기는 독점적으로 U일 수 있다. 통상적으로, 상기 miR-502 모방체는 단일 가닥 형태로 이용되지만, 이중 가닥 버전 또한 본 발명에서 고려된다.

[00102] 일부 구체예에 있어서, 상기 miR-502 서열 내 U 염기들 중 하나 이상은, 그 본연의 부분에서든 및/또는 부속 부분에서든 5-할로우라실이다. 상기 5-할로우라실은, 예컨대 5-플루오로우라실, 5-클로로우라실, 5-브로모우라실 또는 5-요오도우라실일 수 있다.

[00103] 또 다른 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-502 모방체 서열 내 U 염기들 중 정확히 하나는 5-할로우라실이다. 제2의 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-502 서열 내 정확히 2개 또는 2개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 또 다른 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-502 올리고뉴클레오타이드 서열 내 정확히 3개 또는 3개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 miR-502 서열 내 정확히 4개 또는 4개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 miR-502 서열 내 정확히 5개 또는 5개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 miR-502 서열 내 정확히 6개 또는 6개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 miR-502 서열 내 정확히 7개 또는 7개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 특정 구체예에 있어서, 상기 miR-502 서열의 U 염기들 전부는, 본연의 부분에서이든 및/또는 부속된 부분에서이든지 간에, 5-할로우라실이다.

[00104] 한 가지 예시적인 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 핵산 조성물은 AU^FCCU^FU^FGCUAU^FCU^FGGGU^FGCU^FA [SEQ ID NO. 13]의 변형된 miR-502 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 여기서 U^F는 할로우라실, 구체적으로 5-플루오로우라실이다.

[00105] 상기 miR-502 모방체 서열에서 5-할로우라실에 의하여 대체된 U 염기들은, 상기 제시된, 상기 miR-502 서열의 비변형 부분에 위치할 수 있거나, 또는 상기 제시된 바와 같이, 본연의 miR-502 서열에 공유적으로 부속되는 하나 이상의 U 염기들에 위치할 수도 있다.

[00106] 다른 구체예에 있어서, 상기 본연의 miR-502 뉴클레오타이드 서열의 씨드 부분은 5-할로우라실로 변형되지 않은 채로 남아있는 반면, 상기 miR-502 뉴클레오타이드 서열의 나머지부 (비-씨드 부분)에 남아있는 U 염기들 중 하나 이상 (또는 전부)는 5-할로우라실 또는 그들의 조합에 의하여 대체된다.

[00107] 또 다른 예시적인 구체예에 있어서, 본 발명은 변형된 miR-506 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에 있어서, 상기 miR-506 뉴클레오타이드 서열은 U 염기들 중 하나 이상을 5-할로우라실로 대체함으로써 변형되었다.

[00108] 본 발명에서 사용되는 용어 "miR-506"은 "마이크로RNA-506" 또는 "miRNA-506"과 동의어를 의미하고, 하기 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 말하며:

UAUUCAGGAAGGUGUUACUUAA [SEQ ID NO. 14],

여기서 A = 아데닌, C = 시토신, U = 우라실 및 G = 구아닌 염기인 것으로 이해된다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 달리 명시하지 않는 한 본 발명에서 비변형 (즉, "본연의") miR-506 서열을 말한다. miR-506은 또한, hsa-mir-506으로서, 또는 miRBase 수탁 번호 MI0003193, 또는 MIMAT0022701로 불리울 수 있다. MiR-506은 잘 알려져 있으며, 상세히 연구되었다. 예컨대, [Li, J, et al., Oncotarget. (2016), 7:38 pp. 62778-62788], 및 [Li, J. et al., Oncogene. (2016) 35 pp. 5501-5514] 참조. 예시적인 모방체 miR-129, miR-140, miR-502, miR-192 및 miR-15a에 대하여 전술한 바와 같이, miR-506 모방체를 생성하는 방법은 이 기술 분야의 숙련된 기술자에게 공지된 것이다. 달리 언급하지 않는 한, 이러한 모든 변형된 miR-506 핵산 형태는 본 발명에서, 본 발명에서 사용되는 용어 "miR-506 모방체"의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

[00109] 일반적으로, 변형된 miR-506 (즉, miR-506 모방체)는 상기 miR-506 본연의 서열에 공유적으로 부속되는 1, 2, 3, 4 또는 5 개 이하의 추가적인 염기를 함유하며, 상기 추가적인 염기는 C, U, G로부터, 그리고 C로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 상기 추가적인 염기는 독점적으로 U일 수 있다. 통상적으로, 상기 miR-506 모방체는 단일 가닥 형태로 이용되지만, 이중 가닥 버전 또한 본 발명에서 고려된다.

[00110] 일부 구체예에 있어서, 상기 miR-506 서열 내 U 염기들 중 하나 이상은, 그 본연의 부분에서든 및/또는 부속 부분에서든 5-할로우라실이다. 상기 5-할로우라실은, 예컨대 5-플루오로우라실, 5-클로로우라실, 5-브로모우라실 또는 5-요오도우라실일 수 있다.

[00111] 또 다른 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-506 모방체 서열 내 U 염기들 중 정확히 하나는 5-할로우라실이다. 제2의 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-506 서열 내 정확히 2개 또는 2개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 또 다른 구체예 세트에 있어서, 상기 miR-506 올리고뉴클레오타이드 서열 내 정확히 3개 또는 3개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 miR-506 서열 내 정확히 4개 또는 4개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 miR-506 서열 내 정확히 5개 또는 5개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 miR-506 서열 내 정확히 6개 또는 6개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 miR-506 서열 내 정확히 7개 또는 7개 이상의 U 염기들은 5-할로우라실이다. 특정 구체예에 있어서, 상기 miR-506 서열의 U 염기들 전부는, 본연의 부분에서이든 및/또는 부속된 부분에서이든지 간에, 5-할로우라실이다.

[00112] 한 가지 예시적인 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 핵산 조성물은 U^FAU^FU^FCAGGAAGGU^FGU^FU^FACU^FU^FAA [SEQ ID NO. 15]의 변형된 miR-506 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 여기서 U^F는 할로우라실, 구체적으로 5-플루오로우라실이다.

[00113] 상기 miR-506 모방체 서열에서 5-할로우라실로 대체된 U 염기들은, 상기 제시된, 상기 miR-506 서열의 비변형 부분에 위치할 수 있거나, 또는 상기 제시된 바와 같이, 본연의 miR-506 서열에 공유적으로 부속되는 하나 이상의 U 염기들에 위치할 수도 있다.

[00114] 다른 구체예에 있어서, 상기 본연의 miR-506 뉴클레오타이드 서열의 씨드 부분은 5-할로우라실로 변형되지 않은 채로 남아있는 반면, 상기 miR-506 뉴클레오타이드 서열의 나머지부 (비-씨드 부분)에 남아있는 U 염기들 중 하나 이상 (또는 전부)는 5-할로우라실 또는 그들의 조합으로 대체된다.

[00115] 본 발명에 기재된 변형된 마이크로RNA 핵산 조성물은 핵산을 합성하는 임의의 공지된 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 상기 핵산 조성물은 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성, 예컨대 포스포르아미다이트 화학을 이용하는 임의의 잘 알려진 공정에 의해 제조된다. 변형된 miR 서열 (예컨대, miR-15a 서열, miR-140 서열, miR-192 서열, miR-502 서열, miR-506 서열 또는 miR-129 서열)에 하나 이상의 5-할로우라실 염기를 도입하기 위하여, 5-할로우라실 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트는, 천연 염기 (예컨대, A, U, G 및 C)를 함유하는 뉴클레오사이드의 포스포르아미다이트 유도체와 함께, 전구체 염기로서 포함되어 상기 핵산 서열에 포함될 수 있다.

[00116] 일부 구체예에 있어서, 본 발명의 핵산 조성물은 생합성적으로, 예컨대 플라스미드, PCR 단편 또는 합성 DNA 주형으로부터의 시험관 내 (in vitro) RNA 전사를 이용하거나, 또는 재조합 (생체 내) RNA 발현 방법을 이용함으로써 제조될 수 있다. 예컨대, [C. M. Dunham et al., Nature Methods, (2007) 4(7), pp. 547-548] 참조. 상기 마이크로RNA 서열 (예컨대, miR-15a 서열, miR-140 서열, miR-192 서열, miR-502 서열, miR-506 서열 또는 miR-129 서열)은, 이 기술 분야에서 잘 알려진 기술들에 의하여, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 탄화수소 또는 표적화 제제, 특히 엽산과 같은 암 세포 표적화 제제를 이용하여 관능화됨으로써 화학적으로 더 변형될 수 있다. 이러한 그룹들을 포함하기 위하여, 원하는 관능기를 부착시키는데 이용될 수 있는 반응성 그룹 (예컨대, 아미노, 알데하이드, 티올 또는 카복실레이트 그룹)이 먼저 상기 올리고뉴클레오타이드 서열에 포함될 수 있다. 그러한 반응성 또는 관능성 그룹은 제조되는 (as-produced) 핵산 서열 상에 혼입될 수 있지만, 반응성 또는 관능성 그룹은, 반응성 그룹을 함유하는 비(非)-뉴클레오사이드 포스포르아미다이트 또는 반응성 전구체 그룹이 포함되는 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성을 이용함으로써 보다 용이하게 포함될 수 있다.

변형된 핵산 제형

[00117] 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 기재되는 변형된 핵산 조성물의 제형에 관한 것이다. 예컨대, 본 발명의 핵산 조성물은 약학적 용도를 위하여 제제화될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 제형은 본 발명에 기재되는 핵산 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학적 조성물이다. 다른 구체 예에 있어서, 본 발명의 제제는 변형된 miR-129 핵산, 변형된 miR-15a 핵산, 변형된 miR-140 핵산, 변형된 miR-192 핵산, 변형된 miR-502, 변형된 miR-506 핵산 또는 이들의 조합 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 보다 구체적으로, 하기 뉴클레오타이드 서열로 기재된되는 변형된 마이크로RNA 핵산이 약학적 활용 및 이용을 위하여 제형화될 수 있다; CU^FU^FU^FU^FU^FGCGGU^FCU^FGGGCU^FU^FGC [SEQ ID NO. 4], CUUUUUGCGGU^FCU^FGGGCU^FU^FGC [SEQ ID NO. 5], U^FAGCAGCACAU^FAAU^FGGU^FU^FU^FGU^FG [SEQ ID NO.6], UAGCAGCACAU^FAAU^FGGU^FU^FU^FGU^FG [SEQ ID NO. 7], CAGU^FGGUUUUACCCU^FAUGGU^FAG [SEQ ID NO. 9], CU^FGACCU^FAU^FGAAU^FU^FGACAGCC [SEQ ID NO. 11], AU^FCCU^FU^FGCUAU^FCU^FGGGU^FGCU^FA [SEQ ID NO. 13], 및 U^FAU^FU^FCAGGAAGGU^FGU^FU^FACU^FU^FAA [SEQ ID NO. 15].

[00118] 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 본 발명에서 약학적으로 허용가능한 희석제, 비히클 또는 부형제와 동의어로 사용된다. 약학적 조성물의 유형 및 의도된 투여 방식에 따라, 상기 핵산 조성물은 상기 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되거나 현탁될 수 있다 (예컨대, 에멀젼으로서). 약학적으로 허용가능한 담체는 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 대상체의 조직과의 접촉에 사용하기에 적합한 액체 또는 고체 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여형일 수 있다. 담체는 그것이 제공되는 대상체에 유해하지 않다는 관점에서 "허용가능" 해야 하고 제형의 다른 성분들과 양립 가능해야 하는데, 즉 생물학적 또는 화학적 기능을 변경시키지 않는 것이다.

[00119] 약학적으로 허용가능한 담체로서 기능할 수 있는 물질들 중 일부, 비 제한적인 예는: 당류, 예컨대 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로오스 및 그 유도체, 예컨대 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; 젤라틴; 활석; 왁스; 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 아가 (agar); 완충 제제; 물; 등장성 염액; pH 완충 용액; 및 제약 제형에 사용되는 기타 비-독성 상용 물질을 들 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 또한 제조 보조제 (예컨대, 윤활제, 탈크 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트 또는 스테아린산), 용매 또는 캡슐화 물질을 포함할 수 있다. 원한다면, 특정 감미 제 및/또는 향미제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다. 다른 적합한 부형제는, 표준 약학 교재에서, 예컨대 ["Remington's Pharmaceutical Sciences", The Science and Practice of Pharmacy, 19^th Ed. Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1995)]에서 찾아볼 수 있다.

[00120] 일부 구체예에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체는 고형의 약학적 조성물의 부피를 증가시키고 약학적 투여형을 환자 및 보호자가 취급하기에 보다 용이하게 하는 희석제를 포함할 수 있다. 고형의 조성물용의 희석제는, 예컨대 미세결정 셀룰로오스 (예컨대, Avicel^®), 미분 셀룰로오스 (microfine cellulose), 락토오스, 전분, 전호화 전분 (pregelatinized starch), 칼슘 카보네이트, 칼슘 술페이트, 당류, 덱스트레이트, 덱스트린, 덱스트로오스, 이염기성 칼슘 포스페이트 이수화물, 삼염기성 칼슘 포스페이트, 고령토, 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 옥사이드, 말토덱스트린, 만니톨, 폴리메타크릴레이트 (예컨대, Eudragit^®), 포타슘 클로라이드, 분말 셀룰로오스, 소듐 클로라이드, 소르비톨 및 활석을 들 수 있다.

[00121] 본 발명의 핵산 조성물은, 이 기술 분야에 공지된 방법에 따라 조성물 및 투여형 내로 제형화될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 상기 제형화된 조성물은 고형 또는 액체형으로 투여하기 위해 특별히 제제화될 수 있는데, 하기 투여용으로 맞춰진 것들을 들 수 있다: (1) 경구 투여, 예컨대, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 혀에 도포하기 위한 페이스트, 수성 또는 비-수성 용액 또는 현탁액, 물약 (drench) 또는 시럽; (2) 비경구 투여, 예컨대 멸균 용액 또는 현탁액으로서 피하, 근육 내 또는 정맥 내 주사에 의한 비경구 투여; (3) 국소 적용, 예컨대 피부, 폐 또는 점막에 도포되는 크림, 연고 또는 스프레이로서 국소 적용; 또는 (4) 예컨대, 페서리, 크림 또는 발포체로서 질 내로 또는 직장 내로 투여; (5) 설하 또는 협측으로 (buccally) 투여; (6) 안구로 투여; (7) 경피적으로 투여; 또는 (8) 비강적으로 투여.

[00122] 일부 구체예에 있어서, 본 발명의 제형은 정제와 같은 투여형으로 압축된 고형의 약학적 제제를 포함하며, 그 기능이 압축 후에 활성 성분 및 다른 부형제를 함께 결합시키는 것을 돕는 것인 부형제를 포함할 수 있다. 고형 약학적 조성물을 위한 바인더로는 아카시아, 알긴산, 카보머 (예컨대, 카보폴), 카복시 메틸셀룰로오스 소듐, 덱스트린, 에틸 셀룰로오스, 젤라틴, 구아 검, 수소화 식물유, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스 (예컨대, Klucel^®), 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스 (예컨대, Methocel^®), 액체 글루코오스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 말토덱스트린, 메틸셀룰로오스, 폴리메타크릴레이트, 포비돈 (Kollidon^®, Plasdone^®), 전호화성 전분, 소듐 알기네이트 및 전분을 들 수 있다.

[00123] 대상체의 위장에서의 압축 고형 약학적 조성물의 용해 속도는 상기 조성물에 붕해제를 첨가함으로써 증가시킬 수 있다. 붕해제로는, 알긴산, 카복시메틸셀룰로오스 칼슘, 카복시메틸셀룰로오스 소듐 (예컨대, Ac-Di-Sol^®, Primellose^®), 콜로이드성 실리콘 다이옥사이드, 크로스카멜로오스 소듐, 크로스포비돈 (예컨대, Kollidon^®, Polyplasdone^®), 구아 검, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 메틸 셀룰로오스, 미세결정 셀룰로오스, 폴라크릴린 포타슘, 분말 셀룰로오스, 전호화성 전분, 소듐 알기네이트, 소듐 전분 글리콜레이트 (예컨대, Explotab^®) 및 전분을 들 수 있다.

[00124] 그러므로, 특정 구체예에 있어서, 활택제 (glidant)는 비-압축 고형 제제의 유동성을 향상시키고 투여의 정확성을 향상시키기 위하여 제형에 첨가될 수 있다. 활택제로서 기능할 수 있는 부형제는 콜로이드성 실리콘 다이옥사이드, 마그네슘 트리실리케이트, 분말 셀룰로오스, 전분, 활석 및 삼염기성 칼슘 포스페이트를 들 수 있다.

[00125] 정제와 같은 투여형이 분말 조성물의 압축에 의하여 제조될 때, 상기 조성물은 펀치 및 염료로부터의 압력을 받게 된다. 일부 부형제 및 활성 성분은 상기 펀치 및 염료의 표면에 부착하는 경향이 있어, 이는 생성물에 피팅 (pitting)이나 기타 표면의 불균질을 유발할 수 있다. 윤활제는 상기 조성물에 첨가되어 접착을 감소시키고 염료로부터 생성물의 방출을 용이하게 할 수 있다. 윤활제로는 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 수소화 피마자유, 수소화 식물유, 광물유, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 벤조에이트, 소듐 라우릴 술페이트, 소듐 스테아릴 푸마레이트, 스테아린산, 활석 및 스테아린산 아연을 들 수 있다.

[00126] 정제화 또는 캡슐 충전용 제형화된 약학적 조성물은 습식 과립화에 의하여 제조될 수 있다. 습식 과립화에서, 분말 형태의 활성 성분 및 부형제의 일부 또는 전부는 배합된 후, 액체, 통상적으로 분말이 과립으로 응집되게 하는 물의 존재하에서 추가로 혼합된다. 과립은 스크리닝 및/또는 분쇄, 건조된 후 원하는 입자 크기로 스크리닝 및/또는 분쇄된다. 그 후, 상기 과립은 정제화 될 수 있거나, 또는 다른 부형제, 예컨대 활택제 및/또는 윤활제가 정제화 전에 첨가될 수 있다. 정제화 조성물은 통상적으로 건식 배합 (dry blending)에 의하여 제조될 수 있다. 예컨대, 활성 성분 및 부형제의 배합된 조성물은 슬러그 (slug) 또는 시트로 압축된 후 압축된 과립으로 분쇄될 수 있다. 압축된 과립은 이어서 정제로 압축될 수 있다.

[00127] 다른 구체예에 있어서, 건식 과립화에 대한 대안으로서, 배합된 조성물은, 직접 압축 기술을 사용하여 압축된 투여형으로 직접 압축될 수 있다. 직접 압축은 과립없이 보다 균일한 정제를 생산한다. 직접 압축 정제화에 특히 꽤 적합한 부형제는 미세결정 셀룰로오스, 분무 건조된 락토오스, 디칼슘 포스페이트 이수화물 및 콜로이드성 실리카를 들 수 있다. 직접 압축 정제화에 있어서, 이들 및 다른 부형제의 적절한 사용은 특히 직접 압축 정제화에 대한 제형 시도에 대한 경험 및 기술을 가진 당업자에게 공지되어 있다. 캡슐 충전은 정제화에 대하여 기술된 전술한 배합물 및 과립 중 임의의 것을 포함할 수 있으나; 이들은 최종 정제화 단계를 거치지 않는다.

[00128] 본 발명의 액체 약학적 조성물에서, 약제 및 임의의 다른 고체 부형제는 액체 담체, 예컨대 물, 주사용 증류수, 식물성유, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 글리세린에 용해되거나 현탁된다. 액체 약학 조성물은 상기 액체 담체에 용해되지 않는 활성 성분 또는 기타 부형제를 상기 조성물 전체를 통하여 균일하게 분산시키기 위한 유화제를 함유할 수 있다. 상기 액체 제형은 주사 가능한, 장의 (enteric) 또는 연화제 유형의 제형으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 액체 조성물에 유용할 수 있는 유화제로는, 예컨대 젤라틴, 계란 노른자, 카세인, 콜레스테롤, 아카시아, 트라가칸트, 진두발 (chondrus), 펙틴, 메틸 셀룰로오스, 카보머, 세토스테아릴 알코올 및 세틸 알코올을 들 수 있다.

[00129] 일부 구체예에 있어서, 본 발명의 액체 약학적 조성물은 또한 생성물의 구강감을 개선시키고 및/또는 위장관 내벽을 코팅하기 위한 점도 증진제를 함유할 수 있다. 이러한 제제는 아카시아, 알긴산 벤토나이트, 카보머, 카복시메틸셀룰로오스 칼슘 또는 소듐, 세토스테아릴 알코올, 메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 젤라틴 구아 검, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 말토덱스트린, 폴리비닐 알코올, 포비돈, 프로필렌 카보네이트, 프로필렌 글리콜 알기네이트, 소듐 알기네이트, 소듐 전분 글리콜레이트, 전분 트라가칸트 및 크산탄 검을 들 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 액체 조성물은 또한 완충제를 함유할 수 있는데, 예컨대 글루콘산, 젖산, 시트르산 또는 아세트산, 소듐 글루코네이트, 소듐 락테이트, 소듐 시트레이트 또는 소듐 아세테이트일 수 있다.

[00130] 감미제, 예컨대 소르비톨, 사카린, 소듐 사카린, 수크로오스, 아스파탐, 프럭토오스, 만니톨 및 전화당은 본 발명의 특정 제제에 첨가되어 맛을 개선시킬 수 있다. 향미제 및 향미 증진제는 투여형을 환자에게 보다 맛있게 느껴지도록 할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 약학적 생성물의 통상적인 향미제 및 향미 증진제는 말톨, 바닐린, 에틸 바닐린, 멘톨, 시트르산, 푸마르산, 에틸 말톨 및 타르타르산을 들 수 있다.

[00131] 보존제 및 킬레이팅 제제, 예컨대 알콜, 소듐 벤조에이트, 부틸화 하이드록시 톨루엔, 부틸화 하이드록시아니솔 및 에틸렌디아민 테트라아세트산은 섭취하기에 안전한 수준으로 첨가되어 저장 안정성을 개선시킬 수 있다. 고체 및 액체 조성물은 또한 그들의 외형을 개선시키고 및/또는 생성물 및 단위 투여량 수준에 대한 환자 식별을 용이하게 하기 위해 임의의 약학적으로 허용가능한 착색제를 사용하여 염색될 수 있다.

[00132] 본 발명의 투약 제형은 경질 또는 연질의 쉘 내에 상기 조성물, 예컨대 분말화된 또는 과립화된 본 발명의 고체 조성물을 함유하는 캡슐일 수 있다. 상기 쉘은 젤라틴으로 제조될 수 있으며, 임의로 가소제, 예컨대 글리세린 및 소르비톨, 및 불투명화 제제 또는 착색제를 함유할 수 있다.

암 치료 방법

[00133] 전술한 바와 같이, 본 발명의 변형된 마이크로RNA 핵산 조성물 및 그 제형은 본연의 마이크로RNA에 의하여 나타나는 활성 및/또는 공지의 암 요법 (화학 요법), 예컨대 5-FU와 비교할 때 예기치 않은 예외적인 항암 활성을 보여준다. 그러므로, 본 발명의 또 다른 측면은 포유류에 본 발명의 상기 변형된 마이크로RNA 핵산 조성물 또는 그 제형 중 하나 이상의 유효량을 투여함으로써 상기 포유류의 암 치료 방법을 제공한다.

[00134] 도 2a 및 도 8a에 도시된 바와 같이, 본 발명의 예시적인 변형된 마이크로RNA 핵산, 즉 변형된 miR-15a 및 변형된 MiR-129는 대상체의 암 세포에서 BCL2 발현 및 활성을 억제하는데, 이는 궁극적으로 암 페소 사멸을 증가시키는 이용 가능한 전-세포자멸사 단백질들의 양을 증가시키는 결과를 낳는다. miR-129는, 예컨대 BCL2를 직접적으로 표적하고, 다른 중요한 세포 사멸-관련 단백질들에 영향을 미침으로써 세포자멸사를 조절한다. 또한, 도 2a는, miR-129가, 세포 주기 진행을 조절하고 티미딜산 합성효소 (TS)의 단백질 수준의 발현 또는 활성을 감소시키는 전사 인자 단백질인 E2F3의 발현을 감소시키고, 따라서 그 활성을 감소시키는데, 이는 세포 증식을 증가시키고 화학요법 제제의 효능을 증가시키는 결과를 낳는다는 것을 보여준다.

[00135] 다른 예시적인 마이크로RNA, 예컨대 변형된 miR-506, miR-140, miR-192 및 miR-502는 또한 도 13a-b 및 14a-d에 나타난 바와 같이 암 세포 증식 및 암 세포의 세포자멸사를 조절한다.

[00136] 사실, 도 7 및 도 11은 본 발명의 2 가지 예시적인 변형된 마이크로RNA (예컨대, 변형된 miR-129 및 변형된 miR-15a)를 이용한 정맥 내 치료가 종양 성장 및 발달을 억제함으로써 대장암을 효과적으로 치료한다는 것을 보여준다.

[00137] 일반적으로, 본 발명의 암을 치료하는 방법은 본 발명의 핵산 조성물 (예컨대, 변형된 miR-129 핵산, 변형된 miR-15a 핵산, 변형된 miR-140 핵산, 변형된 miR-192 핵산, 변형된 miR-502, 변형된 miR-506 핵산 또는 이들의 조합 등의 변형된 마이크로 RNA)을 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 상기 핵산 조성물은 상기 핵산 조성물 및 담체를 포함하는 제형으로서 투여될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 핵산 조성물은 담체의 부재하에 (즉, 네이키드 (naked) 상태로) 투여될 수 있다.

[00138] 본 발명에서 사용되는 용어 "대상체"는 임의의 포유 동물을 말한다. 본 발명의 방법은 통상 인간에 관한 것이지만, 상기 포유 동물은 임의의 포유 동물일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 바 "그를 필요로 하는 대상체"라는 구문은 상기 대상체라는 용어에 포함되며, 특히 암이거나 또는 암성이나 전암성 질환의 위험 증가가 의학적으로 결정된, 치료를 필요로 하는 임의의 포유 동물 대상체를 말한다. 특정 구체예에 있어서, 상기 대상체는 인간 암 환자를 포함한다. 일부 구체예에 있어서, 상기 대상체는 대장암을 앓고 있거나 의학적으로 결정된 대장암에 걸릴 위험이 증가되어 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 대상체는 췌장암을 앓고 있거나 예컨대 만성 췌장염으로 진단된 것과 같이 의학적으로 결정된 췌장암에 걸릴 위험이 증가되어 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 대상체는 폐암을 앓고 있거나 의학적으로 결정된 폐암에 걸릴 위험이 증가되어 있다.

[00139] 용어 "치료" "치료하다" 및 "치료하는"은 "유효량을 투여하는 것"이라는 용어와 동의어이다. 이들 용어는 질환, 병적 상태 또는 암과 같은 장애를 치료, 개선, 안정화, 하나 이상의 증상을 감소시키거나 예방하기 위한 목적을 가지는 의학적 관리를 의미한다. 이들 용어는 상호 교환적으로 사용되며, 적극적 치료, 즉 질환, 병리학적 상태 또는 장애의 개선을 위하여 구체적으로 지시되는 치료를 포함하며, 또한 인과적 치료, 즉 관련 질환, 병리학적 상태 또는 장애의 원인을 제거하기 위하여 지시되는 치료를 포함한다. 또한, 치료는 완화 치료, 즉 관련 질환, 병리학적 상태 또는 장애의 치료하는 것 보다는 증상 완화를 위하여 설계되는 치료; 예방적 치료, 즉 관련 질환, 병리학적 상태 또는 장애의 발병을 최소화하거나 또는 부분적으로 또는 완전히 억제하는 것을 향하는 치료; 및 보조 치료, 즉 관련 질환, 병리학적 상태 또는 장애의 개선을 향하는 또 다른 특정 치료법을 보충하기 위해 이용되는 치료를 포함한다. 치료는, 질환, 병리학적 상태 또는 장애를 치료, 개선, 안정화 또는 예방하는 것을 목적으로 하지만, 실제로 치료, 개선, 안정화 또는 예방을 결과할 필요는 없다고 이해된다. 치료의 효과는 관련되는 질환, 병리학적 상태 또는 장애에 적합한 바 본 발명에 기술되는 바와 같이 그리고 이 기술 분야에 공지되는 바와 같이 측정되거나 평가될 수 있다. 그러한 측정 및 평가는 질적 및/또는 양적 관점에서 이루어질 수 있다. 따라서, 예컨대 질환, 병리학적 상태 또는 장애의 특성 또는 특징 및/또는 질환, 병리학적 상태 또는 장애의 증상은 임의의 효과까지 또는 임의의 양까지 감소될 수 있다.

[00140] 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 핵산 조성물은 암, 예컨대 대장암을 치료하는데 사용된다.

[00141] 본 발명에서 사용되는 바, 용어 "암"은 비조절 분열 및 비정상적 세포의 성장에 의하여 야기되는 임의의 질병을 포함하며, 예컨대 종양의 악성 및 전이성 성장을 포함한다. "암"이라는 용어는 또한 전암 상태, 또는 암성 또는 전암 상태의 위험이 높아진 것을 특징으로 하는 상태를 포함한다. 따라서, 본 발명에서 암의 치료는 또한, 암 예방 방법 또는 전암 상태가 암성 상태로 또는 완전히 비-암성 상태로 변환되는 것을 방지하는 방법을 포함하는 것으로 여겨진다. 암 또는 전암 (신생물 상태)은 내부 기관 및 피부를 포함하여 신체의 어느 부분에도 위치할 수 있다. 암세포 함유하는 가능한 신체 부위의 예로는 결장, 직장 (항문 포함), 위, 식도, 소화 기관, 폐, 췌장 및 간을 들 수 있다. 암 또는 신생물은 또한 하나 이상의 암종, 육종, 림프종, 아세포종 또는 기형종 (생식 세포 종양)의 존재를 포함할 수 있다. 일부 구체예에 있어서, 암은 또한 백혈병의 한 형태일 수 있다.

[00142] 특정 구체예에 있어서, 본 발명에 기술되는 핵산 조성물은 후술되는 바와 같이 임의의 단계에 있는 대장암 (즉, 결장암 또는 직장암), 췌장암 또는 폐암을 치료하는데 사용된다. 잘 알려진 바와 같이, 암은 림프절과 혈관을 통하여 종양을 둘러싼 정상적인 비암성의 조직을 침범함으로써, 및 종양이 대상자의 정맥, 모세혈관 및 동맥을 침범한 후에 혈액에 의하여 대상체에게 퍼진다. 암 세포가 원발성 종양으로부터 분리될 때 ("전이화"), 전이된 병변을 형성하는 유병 대상체를 통하여 이차 종양이 발생한다.

[00143] 예컨대, 대장암의 4 가지 단계가 있는데, 이는 일반적으로 전이 정도에 의해 특징지어진다. 단계 0 또는 상피내 암종 (carcinoma in situ)에서, 비정상적인 잠재적 암성 세포는 결장벽의 점막 (최내층)에서 발견된다. 단계 I에서 암성의 세포는 결장벽의 점막에서 형성되어 점막하층 (점막 아래의 조직층)으로 퍼지고 상기 결장벽의 근육층으로 퍼질 수 있다. 단계 II는 세 개의 하위 클래스로 구성된다: 암성 조직이 결장벽의 근육층을 통해 결장벽의 장막층 (최외층)으로 퍼지는 단계 IIA; 종양이 결장벽의 장막층을 통하여 퍼졌지만 근처의 기관으로 퍼지지 않은 단계 IIB; 및 암이 결장벽의 장막층을 통하여 퍼져 근처의 기관을 침범한 단계 IIC. 단계 III 또한 세 개의 하위 클래스로 나뉜다: 암이 결장벽의 점막을 통하여 점막하층 및 근육층으로 퍼졌으며 1-3 개의 근처 림프절 또는 그 림프절 근처의 조직으로 퍼지거나; 또는 암이 점막을 통하여 점막하층 및 4-6 개의 근처 림프절로 퍼진 단계 IIIA; 종양이 결장벽의 근육층을 통하여 장막층으로 퍼졌거나 장막층을 통하여 퍼졌지만 근처 기관으로 퍼지지 않고 암이 1-3 개의 근처 림프절 또는 상기 림프절 근처 조직으로 퍼지거나; 또는 근육층 또는 점막층 및 4-6 개의 근처 림프절로 퍼지거나; 점막을 통하여 점막하로 퍼지고 근육층으로 퍼져서 7 개 이상의 근처 림프절로 퍼진 단계 IIIB. 단계 IIIC 대장암에서, 종양은 결장벽의 장막층을 통하여 퍼지지만 근처 기관에는 퍼지지 않으며 암은 4-6 개의 근처 림프절로 퍼지거나; 암은 근육층을 통하여 장막층으로 퍼지거나 장막층을 통하여 퍼지지만 근처 기관으로는 퍼지지 않고 암은 7 개 이상의 근처 림프절로 퍼지거나; 또는 암은 장막층을 통하여 근처 기관으로 및 하나 이상의 근처 림프절로 또는 상기 림프절 근처의 조직으로 퍼진다. 마지막으로 단계 IV 대장암은 두 개의 하위 클래스로 나뉜다: 암이 결장벽을 통하여 퍼지고 근처 기관 및 결장 근처에 있지 않은 하나의 기간 또는 먼 림프절로 퍼진 단계 IVA; 및 암이 결장벽을 통하여 퍼지고 근처 기관으로 및 결장 근처에 있지 않은 하나 이상의 기관으로 또는 복벽의 내벽으로 퍼진 단계 IVB.

[00144] 종양 단계화의 또 다른 예로는 대장암에 대한 듀크 (Dukes) 분류 시스템을 들 수 있다. 여기에서, 단계는, 종양이 장 벽에 국한되는 단계 A; 종양이 장을 통한 침습을 나타내지만 림프절을 침범하지 않은 단계 B; 암성 세포 또는 조직이 대상체의 림프절 내에서 발견되는 단계 C; 및 종양이 대상체의 여러 기관에 광범위한 전이를 나타내는 단계 D로 정의된다.

[00145] Astler Coller 분류 시스템도 대안으로 사용될 수 있다. 여기에서, 단계 A 대장암은 장의 점막에만 존재하는 암으로 정의되고; B1 단계는 종양이 근육층 (muscularis propria)으로 확장되었으나 그를 통하여 침투하지는 않고 종양이 림프절로 전이되지 않은 것으로, 단계 B2 대장암은 근육층을 통하여 침투한 종양으로 정의되고 그 종양이 림프절로는 전이하지 않으며; 단계 C1은 근육층으로 확장되었지만 그를 통하여 침투하지는 않은 종양으로 특징지어지고 그 종양이 림프절로는 전이하지 않았고; 단계 C2 대장암은 종양이 림프절로 전이한 근육층을 통하여 침투한 종양으로서 분류되고; 단계 D는 개체 또는 대상체을 통하여 전이된 종양을 설명한다.

[00146] 일부 구체예에 있어서, 본 발명의 치료 방법은 더욱 특히 miR-129 발현, miR-15a 발현, miR-506 발현, miR-502, miR-140 또는 그의 조합의 수준 감소를 나타내는 암 대상체에 관한 것이다. 이 점에 있어서, miR-15a는 암에서 하향 조절된다는 것이 알려져 있다. 예컨대, [R I　Aqeilan, et al., Cell Death and Differentiation　(2010)　17,　pp. 215-220] 참조. 또한, 예컨대, 그 내용이 전체로서 참조로서 포함되는 미국 특허 출원 공개 공보 제2016/0090636호에 기재된 바와 같이 miR-129 발현 수준이 감소된 암성 세포는 5-플루오로우라실에 내성인 것으로 알려져 있다. 또한 췌장암 세포가 miR-506 수준 감소를 나타낸다는 것이 알려져 있다. 예컨대, [Li, J, et al. Oncogene. 35 pp. 5501-5514] 참조.

[00147] 또 다른 예시에 있어서, 본 발명의 마이크로RNA 모방체는 췌장암을 치료하는데 사용된다. 췌장암은 췌장 상피내 신생물 (paninreatic intraepithelial neoplasia, PanINs)이라고 불리는 전구체 병변에서 발생한다. 이러한 병변은 통상 외분비 췌장의 작은 덕트에 위치하며, 세포 이형성의 정도에 따라, 저 이형성 (low-grade dysplasia), 중간 이형성 또는 고도 이형성 병변으로 분류될 수 있다. 이러한 병변은 통상 CDKN2A, TP53 및 SMAD4의 특정 불활성화 돌연변이와 함께, KRAS 유전자에서 활성화 돌연변이의 존재를 보여준다. 총체적으로, 이들 유전적 돌연변이는 침윤 암의 형성으로 이어진다. 췌장암은 원발성 종양의 크기와 췌장 외부로 자라 주변 기관으로 자랐는지 여부; 종양이 근처의 림프절로 퍼졌는지 여부 및 그것이 신체의 다른 기관 (예를 들어, 간, 폐, 복부)으로 전이되었는지 여부에 기초하여 단계화된다. 그 후, 이 정보는 결합되고 이용되어 특정 단계, 즉 0, 1A, 1B, 2A, 2B, 3 및 4 단계를 제시한다. 단계 0의 경우 췌장 종양은 췌장 세포의 최상층에 국한되어 더 깊은 조직을 침범하지 않는다. 원발성 종양은 췌장 제자리 암종 (pancreatic carcinoma in situ)이나 췌장 상피내 신생물 III과 같이 췌장 외부로 전이되지 않는다. 단계 1A 췌장 종양은 통상 췌장에 국한되며 2 cm 크기 또는 그 이하이다. 또한, 단계 1A 췌장 종양은 인근 림프절 또는 먼 위치로 퍼지지 않는다. 췌장에 국한된 단계 1B 췌장 종양은 2 cm 크기보다 크다. 단계 1B 췌장 종양은 인근 림프절 또는 먼 위치로 퍼지지 않는다. 단계 2A 췌장 종양은 췌장 외부로 자라지만 주요 혈관이나 신경으로는 자라지 않는 종양을 나타내고, 그 암은 근처 림프절이나 먼 위치로 퍼지지 않는다. 단계 2B 췌장암을 나타내는 환자는 종양이 췌장에 국한되거나, 췌장 외부로 자라지만 주요 혈관이나 신경으로는 자라지 않고, 근처 림프절로 퍼진다. 단계 3 췌장암을 나타내는 대상체는 췌장 외부로 자라 주요 혈관이나 신경으로 성장하고, 먼 위치로 퍼진 종양을 나타낸다. 단계 4 췌장암은 먼 위치, 림프절 및 기관으로 전이된다.

[00148] 또 다른 예시에 있어서, 본 발명의 변형된 마이크로RNA 핵산 조성물은 폐암을 치료하는데 사용된다. 본 방법은 비소세포 폐암, 예컨대 편평 세포 암종, 선암종 및 대세포 암종의 치료를 포함한다. 폐암은 종종 폐의 기관지의 악성 종양에서 발생하여 림프절과 같은 다른 신체 부위로 퍼진다. 예컨대, 소세포 폐암의 경우, 암성 병변은 종종, 일단 폐에서 발견된 후, 두 번째 폐, 폐 (늑막) 주변액 또는 이웃 기관으로 퍼진다. 폐암은 원발성 종양의 크기 및 폐 외부로 자라 림프절로 자랐는지 및 신체의 다른 기관 (예 : 뼈, 간, 유방, 뇌)로 전이되었는지 여부에 기초하여 단계화된다. 그 후, 이 정보는 결합되고 이용되어 특정 단계, 즉 0, 1, 2, 3 및 4 단계를 제시한다. 단계 0, 즉 제자리 암종에 대하여, 암은 크기가 작고 더 깊은 폐 조직이나 폐 외부로 퍼지지 않는다. 단계 1 폐암은 하부 폐 조직에 존재하는 암성 세포를 보이지만, 림프절은 영향을 받지 않는다. 단계 2 폐암은, 암이 근처 림프절이나 흉부 벽으로 퍼졌음을 보여준다. 단계 3 폐암은 폐로부터 림프절까지 또는 심장, 기관 및 식도와 같은 근처 구조물과 기관까지 연속적으로 퍼졌는지에 의하여 분류된다. 단계 4 폐암은 신체 전반을 통하여 전이된 암을 나타내는데, 이는 간, 뼈 또는 뇌에 영향을 줄 수 있다.

[00149] 본 발명에 따른 핵산 조성물은 이 기술 분야에서 통상적으로 알려진 임의의 경로에 의하여 투여될 수 있다. 이는, 예컨대, (1) 경구 투여; (2) 비경구 투여, 예컨대, 피하, 근육 내 또는 정맥 내 주사; (3) 국소 투여; 또는 (4) 질 내 또는 직장 내 투여; (5) 설하 또는 협측 투여; (6) 안구 투여; (7) 경피 투여; (8) 비강 투여; 및 (9) 그를 필요로 하는 기관 또는 세포에 직접 투여를 들 수 있다.

[00150] 투여되는 본 발명의 핵산 조성물의 양 (투여량)은 몇 가지 인자들, 예컨대 암의 유형 및 단계, 예비 약물 또는 아쥬반트 약물의 존재 또는 부재, 및 대상체의 체중, 연령, 건강 상태 및 제제에 대한 내성을 비롯한 몇 가지 인자들에 의존한다. 이들 다양한 인자에 따라, 투여량은, 예컨대 약 2 mg/체중kg, 약 5 mg/체중kg, 약 10 mg/체중kg, 약 15 mg/체중kg, 약 20 mg/체중kg, 약 25 mg/체중kg, 약 30 mg/체중kg, 약 40 mg/체중kg, 약 50 mg/체중kg, 약 60 mg/체중kg, 약 70 mg/체중kg, 약 80 mg/체중kg, 약 90 mg/체중kg, 약 100 mg/체중kg, 약 125 mg/체중kg, 약 150 mg/체중kg, 약 175 mg/체중kg, 약 200 mg/체중kg, 약 250 mg/체중kg, 약 300 mg/체중kg, 약 350 mg/체중kg, 약 400 mg/체중kg, 약 500 mg/체중kg, 약 600 mg/체중kg, 약 700 mg/체중kg, 약 800 mg/체중kg, 약 900 mg/체중kg, 또는 약 1000 mg/체중kg일 수 있고, 여기서 용어 "약"은 일반적으로 표시된 값의 ± 10%, 5%, 2% 또는 1% 이내로 이해된다. 상기 투여량은 또한, 상기 값들 중 임의의 값에 의하여 제한되는 범위 내일 수 있다. 통상적인 실험을 이용하여, 그 모두가 이 기술 분야에 공지된 방법에 따라 빈번하게 그리고 쉽게 모니터링될 수 있는, 화합물의 암성 질환 또는 전암성 질환에 대한 효과, 또는 마이크로RNA (예컨대: miR-15a, miR-129, miR-140 , miR-192, miR-502, miR-506) 발현 수준 또는 활성에 대한 효과, 또는 BCL 2 수준이나 활성에 대한 효과, 또는 TS 수준 또는 활성에 대한 효과, 또는 E2F3 수준이나 질병 병리학에 대한 효과를 모니터링함으로써 각 환자에 대한 적절한 투여량 요법을 결정할 수 있다. 전술된 다양한 인자에 따라, 상기 예시적인 핵산 투여량들 중 임의의 것이 하루에 1 회, 2 회 또는 다회 투여될 수 있다.

[00151] 본 발명에서 기술되는 핵산 조성물 및 임의로, 본 발명의 방법과 함께 사용하기 위한 임의의 추가적인 화학요법 제제의 능력은 이 기술 분야에 잘 알려진 약리학 모델을 이용하여, 예컨대 세포 독성 분석, 세포자멸사 염색 분석, 이종이식 분석, 및 결합 분석을 이용하여 결정될 수 있다.

[00152] 본 발명에서 기술되는 핵산 조성물은 또한, 본 발명에 기재되는 핵산 조성물과 상이한 예비 약물 또는 아쥬반트 약물일 수 있는 하나 이상의 화학요법 제제와 함께 투여되거나 또는 투여되지 않을 수 있다.

[00153] 본 발명에서 사용되는 "화학요법" 또는 "화학요법 제제"의 어구는 암의 치료에 유용한 제제이다. 본 발명에 기술되는 방법과 결합되어 유용한 화학요법 제제는 BCL2, E2F3 또는 TS를 직접 또는 간접적으로 조절하는 임의의 제제를 포함한다. 화학요법 제제의 예로는: 항-대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 플루오로피리미딘계 피리미딘 길항제, 5-플루오로우라실 (5-FU) (Carac® cream, Efudex®, Fluoroplex®, Adrucil®) 및 S-1; 엽산길항제 (antifolate), 예컨대 폴리글루타메이트화 엽산길항제 화합물 (polyglutamatable antifolate compound); 랄티트렉시드 (Tomudex®), GW1843 및 페멕트렉시드 (Alimta®) 및 비-폴리글루타메이트화 엽산길항제 화합물; 놀라트렉시드 (Thymitaq®), 플레비트렉시드, BGC945; 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 및 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카무푸르, 시타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스유리딘을 들 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에 있어서, 화학요법 제제는 비정상적인 세포 증식 또는 세포자멸사에 관여하는 신호전달 경로에 관련된 유전자 또는 유전자 생성물, 예컨대 YAP1, BMI1, DCLK1, BCL2, 티미딜산 합성효소 또는 E2F3의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 화합물; 및 상기 화합물 중 어느 하나의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체이다.

[00154] 일부 구체예에 있어서, 화학요법 제제는 항암 약물, 또는 항암 약물용 조직 증감제 또는 기타 촉진제이다. 일부 구체예에 있어서, 공-약물은 또 다른 핵산, 또는 또 다른 miRNA, 예컨대 본 발명의 마이크로RNA 모방체, 젬시타빈 또는 유리 5-FU일 수 있다.

[00155] 특정 구체예에 있어서, 다른 핵산은 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), siRNA 또는 BCL2 3'UTR 부분에 상보적인 핵산이다.

[00156] 다른 구체예에 있어서, 화학요법은 하기 암 약물 중 어느 하나, 예컨대 메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파아미드, 시스-플라틴, 옥살리플라틴, 블레오마이신, 빈블라스틴, 젬시타빈, 빈크리스틴, 에피루비신, 폴린산, 파클리탁셀, 및 도시탁셀 중 하나 이상일 수 있다. 상기 화학요법 제제는 핵산 조성물로 치료를 시작하기 전, 도중 또는 후에 투여될 수 있다.

[00157] 일부 구체예에 있어서, 화학요법 제제는 공-약물이다.

[00158] E2F 전사 인자 3, E2F3 (RefSeq NG_029591.1, NM_001243076.2, NP_001230005.1)은 DNA에 결합하고 이펙터 단백질과 상호작용하는 전사 인자로서, 상기 이펙터 단백질은 세포주기 조절에 관여된 유전자의 발현을 조절하는 망막아세포종 단백질을 포함하지만 이에 국한되지는 아니한다. 따라서, E2F3의 발현을 억제하는 임의의 약물은 본 발명에서 공-약물로 간주될 수 있다.

[00159] B 세포 림프종 2 (BCL2), (RefSeq NG_009361.1, NM_000633, NP_000624), 예컨대 그의 이소형 α (NM_000633.2, NP_000624.2) 및 β (NM_000657.2, NP_000648.2)는 Bcl-2 유전자에 의하여 인코딩되는데, Bcl-2 유전자는 내재적 세포자멸사 경로를 통하여 미토콘드리아-조절 세포 사멸을 조절하는 조절 단백질들 중 BCL2 패밀리의 한 구성원이다. BCL2는 BAD 및 BAK 단백질을 결합함으로써 세포의 세포자멸사를 차단하는 미토콘드리아 외막 내재성 단백질이다. BCL2 억제제의 비제한적인 예로는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 Oblimersen (Genasense; Genta Inc.), BH3 모방 소분자 억제제, 예컨대 ABT-737 (Abbott Laboratories, Inc.), ABT-199 (Abbott Laboratories, Inc.), 및 Obatoclax (Cephalon Inc.)를 들 수 있다. BCL2의 발현을 억제하는 임의의 약물은 본 발명에서 공-약물로 간주될 수 있다.

[00160] 티미딜산 합성효소 (RefSeq : NG_028255.1, NM_001071.2, NP_001062.1)는 널리 존재하는 (ubiquitous) 효소이고, DNA를 구성하는 4 개의 염기 중 하나인 dTMP를 생성하기 위하여 필수적인 dUMP의 메틸화를 촉매한다. 이 반응은 ,메틸 그룹 주개 그리고 고유하게 환원제 양자 모두로서의 보조 인자로서 CH H4-엽산을 필요로 한다. CH H4- 엽산을 일정하게 요구함은, 티미딜산 합성효소 활성이 세포의 엽산 저장 공간을 보충을 책임지는 두 효소: 디하이드로폴레이트 리덕테이즈 및 세린 트랜스하이드록시메틸레이즈의 활성과 크게 관련되어 있음을 의미한다. 티미딜산 합성효소는 30-35 kDa 서브유닛의 동종이합체이다. 활성 부위는, 친핵성 시스테인 잔기를 통하여 효소에 공유적으로 결합된 dUMP를 이용하여, 엽산 공인자와 dUMP 기질 양자 모두와 동시에 결합한다. ([Carreras et al, Annu. Rev. Biochem., (1995) 64:721-762] 참조). 상기 티미딜산 합성효소 반응은, DNA 내로 포함을 위한 dCTP와 dTTP를 생성하는 피리미딘 생합성 경로의 중요한 부분이다. 이 반응은 DNA 복제와 세포 성장에 필요하다. 따라서, 티미딜산 합성효소 활성은 암 세포와 같이 빠르게 분열하는 모든 세포에서 요구된다. DNA 합성, 따라서 세포 복제와의 연관성으로 인하여, 티미딜산 합성효소는 수년간 항암제의 표적이 되어왔다. 티미딜산 합성효소 억제제의 비제한적인 예로는 엽산 및 dUMP 유사체, 예컨대 5-플루오로우라실 (5-FU)을 들 수 있다. 티미딜산 합성효소의 발현을 억제하는 임의의 약물은 본 발명에서 공-약물로 간주될 수 있다.

[00161] 원한다면, 본 발명에 기술되는 핵산 조성물의 투여는 하나 이상의 비약물 요법과 조합될 수 있는데, 예컨대 방사선 요법 및/또는 수술일 수 있다. 이 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, 수술 전에, 예컨대 종양을 줄이기 위하여 또는 암의 확산을 막기 위하여 방사선 조사 요법 및/또는 화학요법 제제 (이 경우, 본 발명에서 기술되는 핵산 조성물, 및 필요에 따라 임의의 추가적인 화학요법 제제)의 투여가 주어질 수 있다. 이 기술 분야에 또한 잘 알려져 있는 바와 같이, 방사선 조사 요법 및/또는 화학요법 제제의 투여는 임의의 나머지 암을 파괴하기 위하여 수술 후에 주어질 수 있다.

[00162] 하기 실시예는 예시의 목적으로, 그리고 본 발명의 특정한 구체적인 구체예를 기술하기 위하여 제시되었다. 그러나, 본 발명의 범위는 본 발명에 기재되는 실시예에 의하여 여하간에 제한되지 않는다.

실시예

실시예 1. 재료 및 방법

[00163] 변형된 miR-129: 5-FU 변형된 miR-129 분자를 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성 공정에 의해 합성하고 HPLC로 정제하였다. 두 가닥을 어닐링하여 성숙한 변형된 5-FU-miR-129를 제조하였다. 보다 구체적으로, "2'-ACE RNA 합성"이라 불리는 방법이 사용되었다. 2'-ACE RNA 합성은 2'-하이드록시 상의 산-불안정한 오르소에스테르 보호기 (2'-ACE)와 조합하여, 5'-하이드록실 그룹을 보호하기 위하여 실릴에테르가 사용되는 보호 그룹 양식에 기반한다. 이러한 보호 그룹의 조합은, 그 후, 표준 포스포르아미다이트 고상 합성 기술과 함께 이용된다. 예컨대, 이들 각각의 내용 전체가 명시적으로 본 발명에 포함되는 [S.A. Scaringe, F.E. Wincott, and M.H. Caruthers, J. Am. Chem . Soc ., 120 (45), 11820-11821 (1998)]; 국제 PCT 출원 WO/1996/041809; [M.D. Matteucci, M.H. Caruthers, J. Am. Chem . Soc ., 103, 3185-3191 (1981)]; [S.L. Beaucage, M.H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 22, 1859-1862 (1981)] 참조.

[00164] 우라실을 5-할로우라실로 대체하는 예시적인 변형된 miR-15a 핵산, 변형된 miR-140 핵산, 변형된 miR-192 핵산, 변형된 miR-502, 변형된 miR-506 핵산 또는 임의의 다른 변형된 마이크로RNA는 miR-129a와 동일한 방식으로 합성될 수 있다.

[00165] 현재 사용되는 보호되고 관능화 된 리보뉴클레오사이드 포스포르아미다이트의 몇 가지 예시적인 구조를 하기에 나타낸다.

[00166] 세포 배양. 인간 대장암 세포주 HCT116, RKO, SW480, SW620 및 정상 결장 세포주 CCD 841 CoN, 췌장암 세포주 ASPC-1, Panc-1 및 폐암 세포주 A549는 American Type Culture Collection (ATCC)로부터 구득되어 McCoy's 5A 배지 (HCT-116), DMEM (RKO, SW480, SW620) 및 MEM (CCD 841 CoN) (Thermo Fischer)에서 유지되었다. 배지는 10% 소 태아 혈청 (Thermo Fischer)으로 보충되었다.

[00167] 트랜스펙션을 위하여, 1×10⁵ 세포를 6-웰 플레이트에 도말하고 24 시간 후에, Oligofectamine (Thermo Fischer)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 각각 100 nM의 miR-15a 전구체, 비특이적 miRNA (Thermo Fischer) 또는 변형된 miR-15a 모방체 (Dharmacon)로 트랜스펙션시켰다. 무시약 트랜스펙션을 위하여, 세포를 웰당 (1x10⁵) 세포로 6 웰 플레이트에 도말하였다. 24 시간 후, 100 pmol miRNA (대조군, miR-15a, 모방체-1)을 Optimem (Thermo Fischer)에서 희석하고 플레이트에 첨가하였다. 24 시간 후에 배지를 교체하였다. 배지는 10% 소 태아 혈청 (Thermo Fischer)으로 보충되었다. 간단히, 세포를 초저부착 플라스크 (ultra-low attachment flask)에서 B27, 10 ng/mL bFGF 및 20 ng/mL EGF로 보충된 DMEM/F12 (Life Technologies) 내에서 배양하였다. 구상의 (spheroid) 세포는 약한 원심 분리, 단세포로의 해리 및 재도말을 통한 수집에 의해 유지되었다.

[00168] 웨스턴 면역블롯 분석: 트랜스펙션 48 시간 후, 단백질분해효소 저해제 (Sigma)를 함유한 RIPA 완충액에서 용해된 세포로부터 추출된 동량의 단백질 (15 μg)를 표준 방법을 이용하여 10%-12% 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아마이드 겔에서 분리하였다. 분석에 이용된 1차 항체는 토끼 항-YAP1 모노클로날 항체 (1:10000) (Cell Signaling Technologies), 항 DLCK1 (1:500) (Abcam), 항-BCL2 (1:500) (NeoMarkers), 항-BMI-1 (1:10000) (Cell Signaling Technologies), 마우스 항-인간 TS 항체 (1:500), 항-α-튜블린 (1:50000) (Santa Cruz Biotech Inc.), 항-GAPDH (1:100000) (Santa Cruz Biotech Inc.), 항-E2F3 (1:500) (Santa Cruz Biotech Inc.)였다. 2차 항체로서는, 마우스 또는 토끼에 대한 홀스래디쉬 퍼옥시데이즈-컨쥬게이티드 항체 (1:5000, Santa Cruz Biotech Inc.)가 사용되었다. SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fischer)를 사용하여 오토라디오그래피 필름으로 단백질 밴드를 시각화하였다. 웨스턴 블롯 밀도는 Image J 소프트웨어를 사용하여 정량화되었다.

[00169] 세포 증식 분석: 트랜스펙션 24 시간 후, 세포를 웰당 2000 개 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 파종하였다. 세포 증식 분석은 배양 배지에서 1 시간 동안 10 μl WST-1 (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)을 배양하고, 450 및 630 nm에서 흡광도를 판독함으로써 제1 일 내지 제5 일에 수행되었다. 세포 증식 속도는 630 nm에서의 흡광도로부터 450 nm에서의 흡광도를 뺀 값으로 계산하였다. 세포 증식 분석을 위한 실험은 적어도 3 회 수행되었다. O.D.는 450 nm에서의 흡광도로부터 630 nm에서의 흡광도를 뺀 값으로 계산하였다. 증식 실험은 3 번 수행되었다.

[00170] 암 세포 콜로니 형성 능력을 결정하기 위하여 비부착 증식 (Anchorage-independent proliferation)을 연구하였다. 암 세포를 트립신 처리하고 계수하여, 6-웰 플레이트에서 웰당 총 1×10⁵ 세포에 올리고펙타민을 이용하여 25 nM의 변형된 마이크로RNA 또는 본연의 miR 또는 음성 대조군 miRNA로 트랜스펙션하였고, 트랜스펙션 6 시간 후 세포를 다시 계수하였다. 35-mm 디쉬에서, 1 mL의 고화된 0.6% 아가 층 위에, 0.35% 아가 (Bacto Agar, Becton Dickinson) 중의 총 20,000 개의 세포를 깔았다. B27, 10 ng/mL bFGF 및 20 ng/mL EGF를 함유하는 성장 배지가 두 층 모두에 포함되었다. 배양 2 주 후, 직경 50 mm 이상의 콜로니를 계수하였다.

[00171] 세포 주기 분석: 트랜스펙션 24 시간 후, 세포를 수확하고, 0.02 mg/mL RNase H 및 0.05 mg/mL 프로피듐 요오다이드로 보충된 변형 Krishan 완충액에 0.5 내지 1 x 10⁶ 세포/mL로 재현탁시켰다. 염색된 세포를 유세포 분석기로 검출하고 결과를 Modfit LT™ 소프트웨어로 분석하였다. 세포 주기 분석을 위한 실험은 적어도 3 번 수행되었다.

[00172] 세포자멸사 분석. 초기 및 후기 세포자멸사를 구별하기 위하여 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC, fluorescein isothiocyanate)-Annexin 분석을 수행하였다 (Becton Dickinson). HCT116, RKO, SW480 및 SW620 세포를 웰당 (1×10⁵) 세포로 6 웰 플레이트에 도말하고, 24 시간 후, Oligofectamine을 사용하여 25 nM 변형된 miRNA로 세포를 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 48 시간 후, 세포를 수확하고 제조자의 프로토콜에 따라 프로피듐 요오다이드 및 항-아넥신-V 항체로 염색하고 (Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit, Invitrogen, CA, USA), 염색된 세포를 유세포 분석으로 검출하였다.

[00173] 5-FU 처리 및 세포 독성 분석: 트랜스펙션 24 시간 후, 암 세포를 100 μl 배지 내에서 웰당 2 x 10³ 세포로 96-웰 플레이트에 3 개 쌍으로 (in triplicates) 도말하였다. 24 시간 후, 2-μM 5-FU 단독, 50 nM 본연의 마이크로RNA, 50 nM 변형된 마이크로RNA (예컨대: 변형된 miR-129), 또는 2 mM 5-FU와 50 nM의 본 발명의 변형된 마이크로RNA인, 예컨대 변형된 miR-129의 조합을 포함하는 신선한 배지를 첨가하고, 세포를 추가로 72 시간 배양하였다. 세포 생존력은 WST-1 분석을 사용하여 측정하였다.

[00174] 렌티바이러스 생산: 간단히, 1.5 x 10⁶ 293T 세포를 10 mL DMEM + 10% FBS를 함유하는 10-cm 디쉬에 도말 하였다. 이틀 후, miR-129 또는 hsa-miR-15a를 발현하는 렌티 바이러스 플라스미드인 pEZX-MR03을 제조사의 프로토콜에 따라 Lenti-Pac HIV 발현 패키징 키트로 트랜스펙션시켰다. 48 시간 후, 바이러스를 수확하고 Lenti-Pac 렌티바이러스 농도 용액으로 농축시켰다. 그 후, Lenti-Pac™ HIV qRT-PCR 적정 키트를 사용하여 바이러스의 역가를 측정하였다 (대략 1011 개의 바이러스 입자/ml). 또한, 바이러스를 연속적으로 희석하여 (0.1 μL, 0.5 μL, 2 μL, 10 μL, 50 μL)을 5 x 10⁴ HCT116 CSC 형질도입에 사용하고 형질도입 효율을 결정하였다. 100% 양성 발현을 달성하기 위한 최저 농도 (2 μL)를 사용하여 생체 내 처리 실험용 마우스에 세포를 감염시켰다.

[00175] 핵산 발현의 실시간 qRT - PCR 분석. 암 세포에서 마이크로RNA의 발현 수준을 정량화하였다. 간단히, 대상 마이크로RNA 및 내부 대조군 RNU44 유전자에 특이적인 프라이머를 Ambion으로부터 구득하였다. cDNA 합성은, miRNA 특이적 프라이머를 이용하여 High Capacity cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems)에 의하여 수행되었다. 실시간 qRT-PCR은 TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems)에 의하여 miRNA 특이적 프라이머를 이용하여 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR 장비에서 수행되었다. 본 발명의 예시적인 miR의 발현 수준은 내부 대조군 RNU44에 기초한 △△CT 방법에 의하여 계산되었고, 대조군에 대하여 정규화되어 상대 정량으로 플롯 (plot)하였다.

[00176] 인간 암 줄기 세포 프로파일러: 본 발명의 예시적인 마이크로RNA 또는 음성 miRNA로 트랜스펙션된 암 세포로부터 TRIzol 시약 (Thermo Fischer)을 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 RNA를 추출하였다. RT2 First Strand Kit (Qiagen)을 사용하여 RNA를 제1 가닥 cDNA로 전사시켰다. 다음으로, 상기 cDNA를 RT2 SYBR Green Mastermix (Qiagen)와 혼합하고, 이 혼합물을 Human Cancer Stem Cells RT2 Profiler PCR Array (Qiagen)의 웰 내로 분주한다. Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR 장비를 qRT-PCR (Applied Biosystems)에 사용하였고, 상대적 발현 값을 △△CT 방법을 사용하여 결정하였다.

[00177] 마우스 피하 종양 이식 모델: 주사 2 일 전, HCT116 암 줄기 세포를, 6-웰 초저부착 플레이트에 5 x 10⁵/웰로 도말하였다. 20 μL의 바이러스 또는 100 pmole의 변형된 miR-129 또는 변형된 miR-15a를 사용하여 세포에 형질도입 또는 트랜스펙션시켰다. 48 시간 후, 세포를 수집하고 30% 매트리젤을 함유하는 DMEM/F12 녹아웃 배지에서 10⁶/ml로 재현탁시켰다. 10 주 내지 12 주령의 NOD/SCID 마우스 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, MA, USA)를 종양 이식에 이용하였다. 마우스를 이소플루레인 흡입으로 마취시켰다. 100 μL의 세포 현탁액을 허리 부분의 양쪽 면에 피하 주사하였다. 종양 크기는 캘리퍼 (caliper)를 사용하여 측정하였고, 종양 부피는 V = 길이 × 폭²/2의 공식을 사용하여 계산하였다.

[00178] 생체 내 miRNA 전달 실험을 위하여, 재조합 렌티바이러스로 부모 HCT116 세포를 감염시킴으로써 lenti-luc 리포터 유전자를 발현하는 대장암 세포를 생성하였다. 루시퍼라아제-발현 HCT116 세포 (마우스당 2.0x10⁶ 세포)를 0.1 mL의 PBS 용액에 현탁시키고 각 마우스의 꼬리 정맥을 통하여 주사하였다. 대장암 세포를 주입한 지 2 주 후에, 꼬리 정맥 주사를 통하여 마우스를 40 μg의 음성 대조군 또는 in vivo-jetPEI (Polyplus Transfection)로 패키징된 변형된 miR(s)로 처리하였다. 마우스를 2 주간 격일로 (8 회) 처리하였다. 처리 후, IVIS Spectrum In vivo Imaging System (IVIS) (PerkinElmer)을 사용하여 마우스를 스크리닝하였다.

[00179] RNA 단리: 마우스 이종 이식을 위하여, 절편 조직 각각을 탈파라핀화, 수화, 단백질분해효소 K로 소화시켰다. 이어서 TRIzol^® 시약을 사용하여 총 RNA를 단리하였다. 또한, 총 RNA를 TRIzol^®-계 접근법을 통하여 임상 표본으로부터 단리하였다.

[00180] 통계 분석. 모든 실험을 적어도 3 회 반복하였다. 모든 통계 분석은 SigmaPlot 소프트웨어로 수행되었다. 두 그룹 사이의 통계적 유의성은 스튜던트 t- 테스트 (임상 샘플에 대하여 페어드 t-test (paired t-test) 및 기타 모든 샘플에 대하여 언페어드 t-test (unpaired t-test))를 이용하여 결정되었다. 2 이상의 그룹을 비교하기 위하여, 일원 분산 분석 (one-way ANOVA)에 이어 Bonferroni-Dunn 테스트를 이용하였다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로 표현되었다. 통계적 유의성은 그림 범례에 설명되어 있거나 별표 (*)로 표시된다. * = P<0.05; ** = P<0.01; *** = P<0.001.

실시예 2: 본 발명의 변형된 마이크로RNA는 항암 활성을 갖는다.

[00181] 도 3, 8b, 12a-b, 13a-b 및 14a-d에 도시된 바와 같이, 변형된 miRNA (변형된 miR: 129, 15a, 192 (215), 140, 502 및 506)는 비변형된 miRNA 전구체보다 대장암, 췌장암, 및 폐암 세포 증식 억제에 더 효과적이다. 또한, 상기 변형된 miRNA는 트랜스펙션 시약 없이도 암 세포로 전달될 수 있다 (데이터는 미제공). 주목할만하게, 결과는, 몇 가지 상이한 대장암 세포주, 췌장암 세포주 및 폐암 세포주에 걸쳐 암 세포 증식이 대조군 마이크로RNA로 처리된 암 세포와 비교할 때 유의하게 억제된다는 것을 보여준다.

실시예 3: 변형된 miR -129 핵산은 항암 활성을 갖는다.

[00182] 다음 실험에서, 5-FU가 miR-129에 혼입되었다. 한 실험에서, 도 1a에 제공되는 구조에 나타낸 바와 같이, miR-129의 모든 U 염기가 5-FU로 대체되었고, 여기서 "U^F"는 5-플루오로우라실 또는 다른 5-할로우라실을 나타낸다. 또 다른 실험에서, miR-129의 시드 영역을 제외한 모든 U 염기가 도 1b에 제공되는 구조에 나타낸 바와 같이 5-FU로 대체되었다.

[00183] 표적 특이성 분석: 대장암 HCT-116 세포에서의 웨스턴 면역블롯 실험의 결과는 본 발명의 예시적인 변형된 miR-129 폴리뉴클레오타이드가 TS, BCL2 및 E2F3에 대한 그들의 표적 특이성을 보유할 수 있음을 입증한다. 그 결과를 도 2a 및 2b가 보여주는데, 이는, SEQ ID. NO: 4에 기재된 대로, 2 개의 분리된 오퍼레이터에 의하여 얻어지는 바 모든 U 염기가 5-FU로 대체된 변형된 miR-129 핵산에 대한 결과를 보여준다. 더욱 중요한 의미에서, 예시적인 miR-129 모방체는 TS, BCL2 및 E2F3의 발현 수준을 감소시키는데 있어서 비변형 (대조군) miR-129보다 더 강력한 것으로 밝혀졌다.

[00184] 본 발명의 변형된 마이크로RNA의 기능 강화. 대장암 세포 증식에 대한 예시적인 변형된 miR-129의 영향을 본연의 miR-129와 비교하였다. 결과는, 50 nM 농도에서 5-FU-miR-129가 HCT-116 종양 세포 성장을 완전히 억제할 수 있음을 보여준다. 또한, 도 3의 결과에 도시된 바와 같이, 5-FU-miR-129는 본연의 miR-129보다 훨씬 강력하며, 그에 의하여 현저히 더 높은 억제 효과를 제공한다. 이러한 억제는, 스크램블 대조군 miR이 세포 증식에 아무런 영향을 미치지 않기 때문에, 특이적인 것이다.

[00185] 다음으로, 세포 증식에 대한 변형된 miR-129 및 5-FU의 효능을 HCT-116 대장암 세포를 사용하여 비교하였다. 도 4에 제공된 결과에 의하여 도시되는 바와 같이, 50 nM (5-FU보다 40 배 미만)의 변형된 miR-129는 2 μM 5-FU보다 종양 세포 증식 억제에 예기치 않게 훨씬 더 강력하다.

[00186] 본 발명의 예시적인 변형된 마이크로RNA는 대장암 세포에서 세포자 멸사를 유도한다. miR-129의 중요한 표적인 BCL2를 이용하여, 본 발명의 변형된 miR의 세포자멸사에 대한 영향을 조사하였다. 구체적으로, 음성 대조군 miRNA, 본연의 miR-129 또는 SEQ ID NO: 4의 예시적인 miR-129 모방체로 트랜스펙션된 HCT116, RKO, SW480 및 SW620 대장암 세포에서의 세포자멸사 분석을 이용하여 세포 사멸을 정량화하였다. 결과는, 형광-활성화 세포 분류 (FACS)-기반 FITC-Annexin 분석을 통하여, miR-129 모방체가 모든 4 가지 대장암 세포주에서 본연의 miR-129 및 음성 대조군 miRNA와 비교하여 2 내지 30-배로 세포자멸사를 유도할 수 있다는 것을 보여준다 (도 5a).

[00187] miR -129 모방체는 G1/S 세포 주기 체크 포인트 조절을 촉발한다. 세포 주기 분석은 스크램블 대조군, miR-129 전구체 및 예시적인 miR-129 모방체로 처리된 HCT-116 세포에서 유세포 분석을 이용하여 수행되었다. 도 5b에 도시된 바와 같이, 세포 주기 분석은 miR-129 모방체가 G1 어레스트를 유도함으로써 대장암 세포 성장에 영향을 미치고, 그러한 영향은 본연의 miR-129보다 훨씬 더 (2 배 이상) 강력함이 밝혀졌다.

[00188] miR -129 모방체는 화학요법 내성 대장암 줄기 세포를 제거한다. 5-FU 내성 대장암 줄기 세포에 대한 본 발명의 특정한 예시적인 변형된 마이크로RNA (즉, miR-129 모방체)의 영향을 결정하기 위하여, HCT116 유래 대장암 줄기 세포를 다양한 농도의 모방체-1 또는 5-FU로 처리하였다. 도 6에 도시된 데이터는, 본 발명의 예시적인 마이크로RNA 모방체가 100 nM 농도에서 5-FU 내성 대장암 줄기 세포를 80% 이상까지 제거할 수 있는 반면, 5-FU의 치사량 100 μM에서 종양 줄기 세포 생존력에 최소한의 영향을 미친다는 것을 나타낸다.

[00189] 종합하면, 이들 결과는 본 발명의 예시적인 변형된 마이크로RNA 폴리뉴클레오타이드가 HCT116 대장암 줄기 세포의 세포 증식을 억제할 수 있음을 보여준다 (도 6). miR-129에 의한 이러한 억제 효과는, 증식이 제6 일에 25 nM miR-129로 거의 완전히 차단되었으므로 (도 6), 본연의 miR-129보다 훨씬 더 강력하였다. 우리는 또한 소프트 아가 분석을 이용하여, 비부착 세포 성장에 대한 변형된 miR-129를 이용한 세포 치료의 효과를 입증하였다. 변형된 miR-129는 대장암 줄기 세포를 치료하였고 본연의 miR-129 또는 대조군 miRNA로 처리된 세포들과 비교하여 눈에 띠는 구체를 형성하지 않았다 (도 10에서 볼 수 있는 것과 유사).

[00190] miR -129 모방체는 생체 내 대장암 전이를 억제한다. 대장암 전이 모델을 이용하여 miR-129 핵산 변형의 치료 효과를 평가하였다. 전이 확립 2 주 후, SEQ ID NO: 4의 miR-129 핵산 40 μg을 2 주간 격일 1 회 주사의 처리 빈도로 정맥 주사로 전달하였다.

[00191] 도 7에 도시된 결과는, 독성 부작용은 없지만, 변형된 마이크로RNA-129가 대장암 전이를 억제하는 반면, 음성 대조군 miRNA는 효과가 없음을 보여준다.

실시예 3. 변형된 miR -15a 및 이의 항암 활성.

[00192] 예시적인 변형된 miR -15a 조성물은 항암 활성을 갖는다. 도 1c 및 도 1d에 도시된 바와 같이, miR-15a 핵산 서열의 모든 우라실 염기가 5-할로우라실 (즉, 5-플루오로우라실)로 대체되거나 (도 1c) miR-15a 핵산 서열의 비-시드 영역의 우라실 염기만이 5-할로우라실 (즉, 5-플루오로우라실)로 대체된 (도 1d), 예시적인 변형된 miR-15a 모방체를 전술한 바와 같이 합성하였다.

[00193] 도 1c에 기재된 예시적인 변형된 miR-15a의 HCT-116 대장암 줄기 세포로의 트랜스펙션 3 일 후, 단백질을 수집하고, 웨스턴 블롯팅을 수행하여 본 발명의 변형된 miR-15a 핵산 조성물이 주요 miR-15a 표적을 조절하는 능력을 유지하는지를 확인하였다. 도 8a에 도시된 바와 같이, miR-15a 표적 YAP1, BMI1, DCLK1 및 BCL2는 비변형 miR-15a (본연-miR15a) 또는 변형된 miR-15a 조성물에 의한 트랜스펙션시 단백질 수준 감소를 나타내었고, 이는 5-할로우라실 변형이 miR-15a의 세포 내에서 그들의 표적을 조절하는 능력을 억제하지 않았음을 나타내었다.

[00194] 변형된 miR -15a는 시험관 내에서 증가 된 치료 효능을 갖는다. 본 발명의 변형된 miR-15a 조성물이 비변형된 miR-15a와 비교하여 대장암 세포주에서효능 증가를 나타내는지 결정하기 위하여, 도 1c에 기재된 바와 같이 HCT-116 대장암 세포를 음성 대조군 (비특이적 올리고뉴클레오타이드), 비변형 miR-15a 또는 예시적인 변형된 miR-15a 조성물로 트랜스펙션하였다.

[00195] 암 세포 증식을 평가하기 위해 WST-1 분석을 이용하였다. 도 8b에 도시된 바와 같이, 트랜스펙션 6 일 후, 비변형 miR-15a는 대조군에 비해 세포 증식을 53% 감소시켰다. 변형된 miR-15a의 경우, 세포 증식은 84% 감소했다. 종합하면, 실험 결과는 변형된 miR-15a가 비변형된 miR-15a에 비하여 암 세포 증식을 감소시키는데 보다 효과적임을 보여준다.

[00196] 변형된 miR-15a 핵산은 또한, 암 세포에서 세포 주기 진행을 억제하는 그들의 능력에 대하여 분석되었다. 도 9는 비변형된 miR-15a가 세포 주기 어레스트를 유도하고 G1/S 비율의 약 3 배 증가를 이끌어냄을 보여준다. 도 9는 또한, 본 발명의 예시적인 변형된 miR-15a 조성물이, 본래의 카운터파트와 비교할 때 세포 주기 진행을 중지시키는데 보다 효과적이었음을 보여준다. 예컨대, 대조군과 비교할 때 본 발명의 예시적인 변형된 miR-15a 핵산을 발현하는 세포에 의하여 G1/S 비율의 7 배 증가가 나타났다. 따라서, 변형된 miR-15a는 비변형 miR-15a보다 대장 암 세포에서 세포 주기 어레스트를 유도하는데 더 효과적이다.

[00197] Matrigel 매트릭스에서, 대장암 줄기 세포에 의한 콜로니 형성에 대하여, 예시적인 변형된 miR-15a 조성물의 효과를 또한 조사하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, 대조군 miRNA로 트랜스펙션된 세포에 의하여는 많은 콜로니가 형성되었지만 (도 10, 음성), 비변형 miR-15a로 트랜스펙션된 세포들에 의하여는 콜로니가 거의 생성되지 않았다 (도 10, miR-15a). 대조적으로, 변형된 miR-15a로 트랜스펙션된 세포의 경우, 어떠한 콜로니도 관찰되지 않았다 (도 10, 5-FU-miR-15a). 이들 결과는 본 발명의 예시적인 변형된 miR-15a 조성물이 실제로 암 생성 및 대장암 진행의 보다 강력한 억제제라는 것을 나타낸다.

[00198] 변형된 miR -15a는 암 발생 및 생체 내 진행을 억제한다. 결장 CSCs에서 miR-15a에 대한 우리의 이해를 더하기 위하여, 변형된 miR-15a 또는 음성 대조군 miRNA로 미리 트랜스펙션된 대장암 세포를 포함하는 마우스 이종 이식 모델을 확립하였다. 주사 8 주 후에 종양을 측정하고 수확하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 변형된 miR-15a 모방체를 발현하는 CSC로부터 확립된 종양의 종양 크기에 현저한 감소가 있었다 (> 25x) (n = 8).

[00199] 본 발명에 제시되는 데이터는, 다른 화학요법 제제를 사용하거나 사용하지 않고, 본연의 마이크로RNA 분자의 화학요법 기능을 향상시키기 위하여, 할로우라실 (예컨대, 5-FU)이 miRNA 핵산 서열에 혼입된 신규 변형의 실행 가능성을 뒷받침한다.

SEQUENCE LISTING <110> The Research Foundation for The State University of New York <120> 5-HALOURACIL-MODIFIED MICRORNAS AND THEIR USE IN THE TREATMENT OF CANCER <130> 34085 PCT <150> 62/464,491 <151> 2017-02-28 <150> 62/422,298 <151> 2016-11-15 <150> 62/415,740 <151> 2016-11-01 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cuuuuugcgg ucugggcuug c 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 uagcagcaca uaaugguuug ug 22 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified microRNA129 with additional uracils on the 3' end of the nucleic acid sequence <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> uracil nucleotides <400> 3 cuuuuugcgg ucugggcuug cuu 23 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an exemplary modified microRNA-129 nucleic acid with all uracils modified <220> <221> misc_feature <222> (2)..(6) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> halouracil nucleotides <400> 4 cuuuuugcgg ucugggcuug c 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an exemplary modified microRNA-129 nucleic acid with all uracils in non-seed modified <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> halouracil nucleotides <400> 5 cuuuuugcgg ucugggcuug c 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an exemplary modified microRNA-15a nucleic acid with all uracils modified <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (17)..(19) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> halouracil nucleotides <400> 6 uagcagcaca uaaugguuug ug 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an exemplary modified microRNA-15a nucleic acid with all uracils in the non-seed portion of the nucleic acid sequence modified <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (17)..(19) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> halouracil nucleotides <400> 7 uagcagcaca uaaugguuug ug 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cagugguuuu acccuauggu ag 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an exemplary modified microRNA-140 nucleic acid with certain uracils modified <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> halouracil nucleotides <400> 9 cagugguuuu acccuauggu ag 22 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 cugaccuaug aauugacagc c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an exemplary modified microRNA-192 nucleic acid with certain uracils modified <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> halouracil nucleotides <400> 11 cugaccuaug aauugacagc c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 auccuugcua ucugggugcu a 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an exemplary modified microRNA-502 nucleic acid with certain uracils modified <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> halouracil nucleotides <400> 13 auccuugcua ucugggugcu a 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 uauucaggaa gguguuacuu aa 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an exemplary modified microRNA-506 nucleic acid with certain uracils modified <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> halouracil nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> halouracil nucleotides <400> 15 uauucaggaa gguguuacuu aa 22

Claims (22)

1. 하나 이상의 우라실 핵산을 포함하는 변형된 마이크로RNA 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 조성물로서,
   상기 하나 이상의 우라실 핵산은 5-할로우라실이고,
   상기 변형된 마이크로RNA 뉴클레오타이드는,
   CU^FU^FU^FU^FU^FGCGGU^FCU^FGGGCU^FU^FGC [SEQ ID NO. 4], 및
   U^FAGCAGCACAU^FAAU^FGGU^FU^FU^FGU^FG [SEQ ID NO. 6]로 이루어지는 군으로부터 선택되는 마이크로RNA 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 U^F는 5-할로우라실인 것인 핵산 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 5-할로우라실은 5-플루오로우라실인 것인 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 내에서 상기 우라실 핵산 중 적어도 2 개는 5-할로우라실인 것인 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 내에서 상기 우라실 핵산 중 적어도 3 개는 5-할로우라실인 것인 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 내에서 상기 우라실 핵산 중 적어도 4 개는 5-할로우라실인 것인 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 내에서 상기 우라실 핵산 중 적어도 5 개는 5-할로우라실인 것인 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 내에서 상기 우라실 핵산 중 적어도 6 개는 5-할로우라실인 것인 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 내에서 모든 우라실 핵산은 5-할로우라실인 것인 조성물.
9. 대상체의 암을 예방 또는 치료하기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것인 약학적 조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 대상체는 암에 걸렸거나 암 발생 소인을 갖는다고 진단되었고, 상기 치료는 암의 진행의 억제인 것인 약학적 조성물.
11. 제10항에 있어서, 상기 대상체는 인간인 것인 약학적 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 대상체는 대장암, 췌장암 또는 폐암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암에 걸린 것인 약학적 조성물.
13. 제12항에 있어서, 상기 대상체는 대장암에 걸린 것인 약학적 조성물.
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제

Images