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ITMI20120275A1 - Oligonucleotidi per la modulazione dell'espressione genica e loro usi - Google Patents

Oligonucleotidi per la modulazione dell'espressione genica e loro usi Download PDF

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ITMI20120275A1
ITMI20120275A1 IT000275A ITMI20120275A ITMI20120275A1 IT MI20120275 A1 ITMI20120275 A1 IT MI20120275A1 IT 000275 A IT000275 A IT 000275A IT MI20120275 A ITMI20120275 A IT MI20120275A IT MI20120275 A1 ITMI20120275 A1 IT MI20120275A1
Authority
IT
Italy
Prior art keywords
seq
oligonucleotide
oligonucleotides
group
gene
Prior art date
Application number
IT000275A
Other languages
English (en)
Inventor
Luca Montemurro
Roberto Tonelli
Andrea Tortori
Leonardo Venturelli
Original Assignee
Biogenera Societa A Responsabilita Limitata
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Publication date
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Description

DESCRIZIONE
Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo
"OLIGONUCLEOTIDI PER LA MODULAZIONE DELL'ESPRESSIONE
GENICA E LORO USI"
La presente invenzione riguarda oligonucleotidi per la modulazione dell'espressione di un gene, in particolare per la modulazione di un gene responsabile di una patologia di origine genetica, tumorale oppure virale. Inoltre, la presente invenzione si riferisce all'uso di detti oligonucleotidi, eventualmente modificati chimicamente, per la terapia e/o la diagnosi di dette malattie.
Gli oligonucleotidi sono corte sequenze degli acidi nucleici naturali RNA o DNA oppure di acidi nucleici sintetici, ad esempio PNA ("Peptide Nucleic Acid"), LNA ("Locked Nucleic Acid") e morfolino.
Gli oligonucleotidi si sono dimostrati sperimentalmente molto efficaci nel modulare l'espressione di un gene sia a livello della trascrizione, sia a livello della traduzione. Per guesta capacità, gli oligonucleotidi rappresentano un valido mezzo per il trattamento di numerose patologie, in particolare per le malattie di origine genetica, tumorale o virale.
La modulazione dell'espressione di un gene può implicare la sua inibizione o la sua attivazione.
Per esempio, sono noti oligonucleotidi in grado di inibire la trascrizione di un gene mediante la formazione di un legame complementare con il filamento antisenso del gene (Hélà ̈ne C, Bioch Bioph Acta 1990, 1049 (2):99-125) oppure modificando lo stato della cromatina nelle regioni regolative del gene di interesse (Rossi JJ, Nat Chem Biol 2007, 3(3):136—7). Altri oligonucleotidi sono in grado di inibire la traduzione genica, per esempio, tramite il legame complementare con l'RNA messaggero (mRNA) bersaglio. Questo legame, nel caso di oligonucleotidi a singolo filamento, causa la degradazione enzimatica dell'mRNA da parte del complesso RNasi H. Nel caso in cui gli oligonucleotidi sono molecole di RNA "interference" (interferenti) a doppio filamento, il legame complementare degli oligonucleotidi con l'mRNA bersaglio causa la degradazione del messaggero da parte dell'enzima "slicer" del complesso RISC. In guesto ultimo caso, gli oligonucleotidi possono essere anche oligonucleotidi equivalenti ad un microRNA endogeno in grado di associarsi, per complementarietà imperfetta, alla regione 3'UTR (3' "untranslated region" - regione 3' non tradotta) dell'mRNA bersaglio causando il blocco della traduzione di quell'mRNA.
Gli oligonucleotidi possono anche indurre l'attivazione di un gene o l'aumento della trascrizione dello stesso, per esempio, tramite il legame complementare con il "long antisense non-coding RNA" (Morris KV, Epigenetics, 2009, 4(5): 296-301), oppure mediante l'inibizione dei microRNA complementari con un conseguente aumento della traduzione dell'mRNA bersaglio del microRNA.
Gli oligonucleotidi possono essere modificati chimicamente allo scopo di aumentare la loro efficacia in termini terapeutici e/o diagnostici. Per esempio, si può modificare un oligonucleotide allo scopo di migliorare la sua specificità e/o la forza con cui si appaia alla sequenza complementare, oppure si può modificare un oligonucleotide per renderlo meno sensibile alla degradazione enzimatica, per migliorarne il profilo farmacocinetico/farmacodinamico, oppure per agevolarne il passaggio attraverso le membrane cellulari .
Oltre agli oligonucleotidi di acidi nucleici naturali (cioà ̈ corte sequenze di DNA e/o RNA) esistono oligonucleotidi di acidi nucleici sintetici per esempio, gli acidi nucleici peptidici (PNA acronimo di Peptide Nucleic Acid) e i "locked nucleic acids" (LNA) che sono molto studiati e caratterizzati, soprattutto ai fini di modulare l'espressione di un gene mediante una strategia antigene (cioà ̈ atta a colpire direttamente il gene). Gli oligonucleotidi PNA e LNA, come tutti gli oligonucleotidi modificati, sono in generale chimicamente molto più stabili rispetto agli oligonucleotidi a DNA o ad RNA. La loro stabilità può essere ulteriormente migliorata sintetizzando degli oligonucleotidi chimera. Un oligonucleotide chimera à ̈, per esempio, una sequenza oligonucleotidica in cui sono inseriti sia monomeri classici (deossiribonucleotidi o ribonucleotidi), sia nucleobasi (monomeri) di sintesi, per esempio i monomeri degli LNA.
Gli LNA sono utilizzati con una strategia antisenso per silenziare i geni attraverso l'inibizione del trascritto del gene bersaglio (Braasch DA, Nucl Acids Res, 2002, 30 (23):5160-7). Alternativamente, gli oligonucleotidi LNA possono essere anche utilizzati nella strategia antigene come à ̈ stato fatto da Smith e collaboratori (Ge R, Faseb J, 2007, 1902-14) che hanno progettato la sequenza oligonucleotidica in maniera tale da consentire l'interazione su entrambi i filamenti dell'acido nucleico mediante un meccanismo "strand invasion", così da formare una struttura a "Z" (definiti oligonucleotidi "Zorro") .
I PNA sono oligonucleotidi enzimaticamente più stabili se confrontati con le altre strutture oligonucleosidiche . I PNA possono legarsi al DNA a doppio filamento (DNAds) tramite "strand invasion", oppure possono appaiarsi in maniera complementare ad una molecola di DNA a singolo filamento (DNAss), oppure possono legarsi a filamenti di RNA, dando luogo ad una struttura ibrida PNA/DNA o PNA/RNA a doppia elica termodinamicamente molto stabile rispetto alle strutture "homoduplex" (come il doppio filamento di DNA/DNA).
I PNA rappresentano un sistema molto vantaggioso di modulazione dell'espressione di un gene, soprattutto, mediante strategia antigene. Infatti, à ̈ stato dimostrato che i PNA presentano una elevata specificità per le sequenze bersaglio e, quindi, consentono di inibire l'espressione delle proteine in maniera efficiente.
Pertanto, i PNA costituiscono un promettente approccio terapeutico per il trattamento di malattie geniche o virali .
L'unico inconveniente dei PNA à ̈ rappresentato dal fatto che essi hanno una ridotta capacità di attraversamento delle membrane cellulari. Tuttavia, questa limitazione ha trovato soluzione nella coniugazione, degli oligonucleotidi in generale e dei PNA in particolare, con molecole in grado di rendere più efficace l'attraversamento delle membrane cellulari (carrier). Infatti, in generale gli oligonucleotidi, ed i PNA nello specifico, possono essere somministrati tramite l'utilizzo di carrier (o "tag") ad essi coniugati, come ad esempio sequenze peptidiche di lunghezza variabile da 1 a 30 amminoacidi.
Una particolare applicazione degli oligonucleotidi riguarda la modulazione dell'espressione dei geni che sono attivati o repressi nei tumori.
E' ben noto che i tumori sono causati dalla disregolazione di diversi geni. Solitamente il danno à ̈ a carico dei proto-oncogeni (o anche semplicemente oncogeni) come i geni MYC (tra cui MYC, MYCN, MYCLl), survivina (BIRC5), BCL2, PLK4, ALK e PKM2 che risultano attivati o sovraespressi nel tumore. Inoltre, in un tumore di solito risultano inattivati anche i geni antitumorali od oncosoppressori come la caspasi-8 e RASSF1.
In particolare, gli oncogeni della famiglia MYC sono coinvolti nello sviluppo di numerosi tumori umani e sono tra i geni maggiormente responsabili dell'insorgenza e della progressione neoplastica. L'amplificazione di questi geni e/o la loro sovraespressione à ̈ quasi sempre associata a tumori sia di tipo pediatrico (per esempio neuroblastoma, medulloblastoma e rabdomiosarcoma), sia di tipo adulto (come il tumore a piccole cellule del polmone, o il glioblastoma)(Pession A, Cur Cancer Drug Target, 2005, 5 (4):273-83). Infatti, essi agiscono tramite meccanismi fondamentali per lo sviluppo di un tumore quali l'induzione della proliferazione cellulare, la resistenza all'apoptosi, la formazione di metastasi e la resistenza ai farmaci chemioterapici.
Sono noti in letteratura molti oligonucleotidi ad effetto antitumorale.
Per esempio esistono oligonucleotidi diretti contro i geni MYC, MYCN, BCL2, BIRC5 per una strategia antisenso (EV Prochownik, Exp Rev Antic Ther 2004, 4(2):289-302; Felsher DW, Drug News Persp, 2003, 16(6):370-4; CF Bennet, Exp Opin Investig Drugs, 1999, 8(3):237-53) o oligonucleotidi diretti contro MYCN e MYC con un effetto antigene (LC Boffa, Oligonucleotides 2005, 15(2):85-93). Sono stati generati anche oligonucleotidi antisenso fosforotioati a base DNA allo scopo di inibire la traduzione del gene MYCN in cellule di neuroblastoma (Burkhart CA, JNCI, 2003, 95(18):1394-403) ed oligonucleotidi antisenso tramite "small interference RNA (siRNA)" per l'inibizione della traduzione del gene MYCN in cellule di neuroblastoma (Kang JH, Bioch Bioph Res Com, 2006, 351(1):192-197).
Tuttavia à ̈ ancora fortemente sentita la necessità di identificare ulteriori oligonucleotidi capaci di modulare l'espressione di un gene in maniera sempre più specifica e selettiva così da poter avere un potente effetto terapeutico e/o antitumorale.
Allo scopo di ottenere oligonucleotidi utilizzabili come mezzi terapeutici e/o diagnostici à ̈ necessario identificare le sequenze di un gene bersaglio, o di un RNA messaggero bersaglio e/o delle loro relative sequenze regolative che siano in grado di determinare un consistente effetto di modulazione specifica e selettiva dell'espressione del gene stesso sia in senso di trascrizione, sia in senso di traduzione.
Pertanto à ̈ anche sentita la necessità di delineare delle regole generali che governino il procedimento di identificazione, all'interno della sequenza di un gene, o della sequenza di un RNA messaggero o delle loro sequenze regolative, di sequenze di oligonucleotidi più promettenti ai fini della modulazione della trascrizione/traduzione del gene stesso.
Le esigenze del settore appena descritte, sono risolte dalla presente invenzione che riguarda, secondo un primo aspetto, un oligonucleotide, per la modulazione dell'espressione di un gene, comprendente 6-30 nucleotidi (monomeri), preferibilmente 12-24 nucleotidi, detto oligonucleotide essendo caratterizzato da una sequenza comprendente almeno un gruppo di almeno due guanine consecutive. Si intende escluso dalla definizione appena indicata 1'oligonucleotide di sequenza SEQ ID NO: 1.
Nel caso degli acidi nucleici naturali (DNA e RNA), ogni monomero (nucleotide) à ̈ costituito da una base azotata, da uno zucchero e da un trifosfato. La base à ̈ scelta tra adenina, guanina, timina, citosina ed uracile (solo nell 'RNA). Lo zucchero à ̈ deossiribosio per il DNA e ribosio per l'RNA. I monomeri sono legati nel polimero da un legame fosfodiestereo.
Preferibilmente, l'oligonucleotide oggetto della presente invenzione comprende una sequenza comprendente almeno un gruppo di almeno tre guanine consecutive. Si intende escluso da questa definizione 1'oligonucleotide di sequenza SEQ ID NO: 1.
Più preferibilmente, 1'oligonucleotide oggetto della presente invenzione comprende una sequenza comprendente almeno un gruppo di almeno quattro guanine consecutive. Ancora più preferibilmente, 1'oligonucleotide oggetto della presente invenzione comprende una sequenza comprendente almeno un gruppo di almeno cinque guanine consecutive .
Particolarmente preferito ai fini della presente invenzione à ̈ 1'oligonucleotide comprendente una sequenza comprendente almeno un gruppo di almeno sei guanine consecutive.
In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, l'oligonucleotide comprende una sequenza comprendente almeno un gruppo costituito da due a sei guanine consecutive.
In ulteriori forme di realizzazione 1'almeno un gruppo di guanine comprende, preferibilmente, almeno due gruppi di almeno due guanine consecutive.
Alternativamente 1'almeno un gruppo di guanine comprende, preferibilmente, almeno un gruppo di almeno due guanine consecutive ed almeno un gruppo di almeno tre guanine consecutive.
In ulteriori forme di realizzazione 1'almeno un gruppo di guanine comprende, preferibilmente, almeno tre gruppi di almeno due guanine consecutive.
Alternativamente l' almeno un gruppo di guanine comprende, preferibilmente, almeno un gruppo di almeno due guanine consecutive ed almeno due gruppi di almeno tre guanine consecutive.
Alternativamente l' almeno un gruppo di guanine comprende, preferibilmente, almeno un gruppo di almeno tre guanine consecutive ed almeno due gruppi di almeno due guanine consecutive.
Alternativamente l'almeno un gruppo di guanine comprende, preferibilmente, almeno un gruppo di almeno due guanine consecutive, almeno un gruppo di almeno tre guanine consecutive e/o almeno un gruppo di sei guanine consecutive .
In generale, l'almeno un gruppo di almeno due guanine consecutive secondo la presente invenzione può essere localizzato nei pressi dell'estremità 5' dell' oligonucleotide, oppure nei pressi dell'estremità 3' dell'oligonucleotide oppure può essere localizzata al centro della sequenza dell'oligonucleotide .
In forme preferite di realizzazione della presente invenzione detto oligonucleotide à ̈ coniugato, preferibilmente alla sua estremità 3' e/o 5', con una sequenza carrier che à ̈, preferibilmente, una corta sequenza di amminoacidi.
Detta corta sequenza di amminoacidi (carrier) à ̈, preferibilmente, costituita da un numero di amminoacidi variabile da 1 a 30, preferibilmente da 1 a 10, ancora più preferibilmente da 1 a 7. Tali amminoacidi possono essere in forma L o D, preferibilmente in forma D.
I carrier preferiti ai fini della presente invenzione sono scelti nel gruppo consistente in: SEQ ID NO: 47 (PKKKRKV); SEQ ID NO: 48 (VKRKKKP); SEQ ID NO: 49 (KKKKKK); SEQ ID NO: 50 (PKRKRKV); SEQ ID NO: 51 (KRKRKRK); SEQ ID NO: 52 (KKKRKV); SEQ ID NO: 53 (PKKKRK); SEQ ID NO: 54 (KKKRK); SEQ ID NO: 55 (RRRR) e SEQ ID NO: 56 (PKKKRKVHHHHH).
II carrier particolarmente preferito ai fini della presente invenzione à ̈ il peptide SEQ ID NO: 47.
Nel contesto della presente invenzione per "carrier" si intende un peptide in grado di modificare favorevolmente il profilo farmacocinetico, farmacodinamico e/o la penetrazione cellulare e/o nucleare di un oligonucleotide .
Nel contesto della presente invenzione "modulare l'espressione dì un gene" vuole significare inibire o attivare (aumentare) l'espressione di un gene. Detta inibizione o attivazione (aumento) dell'espressione può avvenire a livello trascrizionale o a livello traduzionale.
L'inibizione o l'attivazione dell'espressione di un gene può avvenire a livello trascrizionale mediante oligonucleotidi che agiscono con un meccanismo antigene (o anti-gene) (diretta contro il gene, cioà ̈ strategia antigene), mentre l'inibizione dell'espressione di un gene può avvenire a livello traduzionale mediante l'uso di oligonucleotidi che agiscono attraverso un meccanismo antisenso (o anti-senso, cioà ̈ diretti contro il messaggero, ovvero strategia antisenso), mentre l'aumento dell'espressione a livello traduzionale può avvenire tramite inibizione dei microRNA che degradano l'RNA messaggero.
I parametri o le regole o i prerequisiti che un oligonucleotide deve possedere allo scopo di modulare l'espressione di un gene in maniera efficace, identificate dalla Richiedente e sopra riportati, sono validi per un qualsivoglia gene e quindi possono essere applicati, per esempio, allo scopo di identificare le sequenze di oligonucleotidi in grado di modulare l'espressione del/i gene/i responsabile/i di malattie di origine genetica e/o virale o dei geni coinvolti nell'insorgenza di patologie tumorali.
Gli oligonucleotidi così identificati possono essere utilizzati, preferibilmente come farmaci, in approcci terapeutici per il trattamento di specifiche malattie genetiche, virali o tumorali.
Alternativamente, gli oligonucleotidi possono essere utilizzati per uso diagnostico.
Infatti, costituisce un ulteriore oggetto della presente invenzione l'uso degli oligonucleotidi oggetto dell'invenzione, eventualmente modificati chimicamente, a scopo terapeutico e/o diagnostico.
Gli oligonucleotidi oggetto della presente invenzione sono corti oligonucleotidi di 6-30, preferibilmente 1224 residui (nucleotidi o monomeri). Gli oligonucleotidi possono essere costituiti a base di acidi nucleici naturali, per esempio DNA oppure RNA, o a base di acidi nucleici sintetici, per esempio PNA, LNA o morfolino. Alternativamente gli oligonucleotidi possono comprendere una combinazione di DNA, RNA e/o acidi nucleici sintetici, preferibilmente PNA o LNA (oligonucleotidi ibridi o chimerici).
Inoltre, gli oligonucleotidi possono essere a singolo o a doppio filamento.
In alcune forme di realizzazione della presente invenzione, gli oligonucleotidi possono essere chimicamente modificati, per esempio allo scopo di migliorarne l'efficacia terapeutica e/o diagnostica.
In forme preferite di realizzazione dell'invenzione, gli oligonucleotidi possono essere molecole di PNA con una struttura scheletro (backbone) in cui il carbonio in posizione alfa (Calfa(α)) à ̈ legato a sostituenti diversi dal consueto atomo di idrogeno della glieina. Per esempio, invece della catena laterale della glieina può essere utilizzato la catena laterale di un altro amminoacido, di origine naturale o sintetica, preferibilmente, scelto nel gruppo consistente in: arginina, lisina, istidina, leucina, isoleucina, tirosina, asparagina, serina, treonina, glutammina, vaiina, alanina, cisteina, metionina, fenilalanina, glutammato, aspartato, prolina, triptofano e ornitina. Detto amminoacido può essere della serie D o della serie L.
In altre forme preferite di realizzazione dell'invenzione, gli oligonucleotidi sono: molecole di RNA a singolo o a doppio filamento tra di loro complementari (le molecole di RNA a doppio filamento tra di loro complementari sono definite siRNA acronimo di "small interference RNA").
In alcune forme di realizzazione, detto "small interference RNA" comprende monomeri di RNA (ribonucleotidi) ed almeno un monomero modificato in posizione 2' del ribosio, preferibilmente un monomero 2'-O-Metossietil, 2'-O-metil, 2'-fluoro; oppure detto "small interference RNA" comprende monomeri di RNA (ribonucleotidi) ed almeno un monomero di un acido nucleico sintetico preferibilmente scelto tra: LNA, LNA-metilfosfonati , UNA (Unlocked Nucleic Acid), ENA (Ethilen Nucleic Acid), ANA (ArabinoseNucleic Acid) e F-ANA (Fluoro-Arabinoside Nucleic Acid).
In forme di realizzazione preferite, detto "small interference RNA" à ̈ disegnato in modo che, alle estremità del doppio filamento complementare, uno solo dei due filamenti ha almeno uno, preferibilmente due, monomeri di acidi nucleici naturali o sintetici che protrudono, cioà ̈ sono non appaiati. Preferibilmente detti monomeri
In ulteriori forme di realizzazione, acidi nucleici naturali o sintetici protrudenti sono scelti tra: un monomero 2'-O-Metossietil, 2'-O-metil, 2'-fluoro oppure un monomero di: LNA, LNA-metilfosfonati, UNA (Unlocked Nucleic Acid), ENA (Ethilen Nucleic Acid) , ANA (ArabinoseNucleic Acid) e F-ANA (Fluoro-Arabinoside Nucleic Acid).
In ulteriori forme di realizzazione, gli oligonucleotidi sono definiti ibridi o chimerici e sono, preferibilmente, a singolo o doppio filamento, comprendenti monomeri di RNA (ribonucleotidi) e monomeri di LNA (questo oligo si rappresenta come RNA/LNA).
Alternativamente, gli oligonucleotidi ibridi possono comprendere i monomeri di RNA (ribonucleotidi) ed almeno un monomero di RNA scelto tra: un monomero di 2'-O-Metossietil (MOE), un monomero di 2'-O-metil, un monomero 2'-fluoro; oppure gli oligonucleotidi ibridi possono comprendere monomeri di RNA (ribonucleotidi) ed almeno un monomero di un acido nucleico sintetico preferibilmente scelto tra: LNA, LNA-metilfosfonati, UNA (Unlocked Nucleic Acid), ENA (Ethilen Nucleic Acid), ANA (ArabinoseNucleic Acid) e F-ANA (Fluoro-Arabinoside Nucleic Acid).
In una ulteriore forma di realizzazione, gli oligonucleotidi a base di RNA a singolo o a doppio filamento possono comprendere ribonucleotidi classici (cioà ̈ non modificati chimicamente) e ribonucleotidi o deossiribonucleotidi modificati a livello del legame fosfodiesterico come ad esempio mediante legame fosforotioato, o DNG (deoxyribonucleic guanidine), RNG (ribonucleic guanidine), GNA (glycerol nucleic acid), G-PNA (gamma-PNA) PMO (Morpholino).
In forme preferite di realizzazione dell'invenzione, gli oligonucleotidi sono delle sequenze chimeriche a singolo filamento comprendenti monomeri di DNA (deossiribonucleotidi) e monomeri di LNA.
Per una strategia antigene, che significa modulare l'espressione di un gene a livello di trascrizione, si possono impiegare preferibilmente:
• oligonucleotidi a base di PNA, eventualmente coniugati con un carrier (generalmente costituite da 1 a 30 residui) preferibilmente alle estremità 3' e/o 5'; oppure
· oligonucleotidi a base di PNA detto PNA comprendente almeno un carbonio-alfa (C-alfa) della struttura "backbone" con un sostituente diverso rispetto all'atomo di H della canonica glieina; oppure
· oligonucleotidi a singolo filamento comprendenti monomeri di RNA (i ribonucleotidi classici)ed eventualmente almeno un nucleotide (monomero) modificato (per esempio un monomero di RNA 2'-O-Metil, un monomero di RNA 2'-Fluoro), o almeno un monomero di un acido nucleico scelto tra: LNA, LNA-metilfosfonati, BNA, UNA, GNA, ANA, FANA, ENA, DNG e RNG, o un ribonucleotide modificato a livello del legame fosfodiesterico; oppure
• oligonucleotidi a base di RNA a doppio filamento complementari tra loro (siRNA); oppure
• oligonucleotidi chimerici a doppio filamento parzialmente complementari comprendenti monomeri di RNA (i ribonucleotidi classici) ed almeno un monomero di LNA; oppure
· oligonucleotidi chimerici a doppio filamento comprendenti monomeri di RNA (i ribonucleotidi classici) ed almeno un monomero di RNA 2'-O-(2-Metossietil); oppure
• oligonucleotidi chimerici a singolo filamento comprendenti monomeri di DNA (i deossiribonucleotidi classici) ed almeno un monomero di LNA; oppure
• oligonucleotidi comprendenti monomeri di DNA (i deossiribonucleotidi classici) ed almeno un monomero di RNA 2'-Fluoro o almeno un monomero di un acido nucleico scelto tra: LNA, LNA-metilfosfonati, BNA, UNA, GNA, ENA, ANA, FANA, DNG e RNG.
Per una strategia antisenso, che significa modulare l'espressione di un gene a livello di traduzione, si possono utilizzare preferibilmente:
• oligonucleotidi a doppio filamento tra di loro complementari comprendenti monomeri di RNA (i ribonucleotidi classici) (siRNA); oppure
· oligonucleotidi a singolo filamento comprendenti monomeri di RNA (i ribonucleotidi classici) ed almeno un monomero di RNA modificato a livello del ribosio e/o a livello del legame fosfodiesterico; oppure
· oligonucleotidi chimerici a singolo filamento comprendenti monomeri di DNA (i deossiribonucleotidi classici) ed almeno un monomero di DNA fosforotioato; oppure
• oligonucleotidi chimerici a doppio filamento comprendenti monomeri di RNA (i ribonucleotidi classici) ed almeno un monomero di RNA 2'-O-(2-Metossietil); oppure
• oligonucleotidi chimerici a doppio filamento comprendenti monomeri di RNA (i ribonucleotidi classici) ed almeno un monomero di RNA 2'-metilato; oppure
oligonucleotidi chimerici a doppio filamento comprendenti monomeri di RNA (i ribonucleotidi classici) ed almeno un monomero di RNA Fluorurato; oppure
oligonucleotidi chimerici a doppio filamento comprendenti monomeri di RNA (i ribonucleotidi classici)ed almeno un monomero di LNA; oppure oligonucleotidi chimerici a doppio filamento comprendenti monomeri di RNA (i ribonucleotidi classici) ed almeno un monomero di RNA arabinoside; oppure
oligonucleotidi chimerici a singolo filamento comprendenti monomeri di DNA (i deossiribonucleotidi classici)ed almeno un monomero di LNA; oppure
oligonucleotidi a singolo filamento comprendenti monomeri di morfolino; oppure
oligonucleotidi a base di PNA detto PNA comprendente almeno un carbonio-alfa (C-alfa) della struttura "backbone" con un sostituente diverso rispetto all'atomo di H della canonica glicina, preferibilmente il sostituente à ̈ la catena laterale dell'arginina o della lisina; oppure oligonucleotidi comprendenti monomeri di DNA (i deossiribonucleotidi classici)ed almeno un monomero di un acido nucleico scelto tra: PNA, LNA, LNA metilfosfonato, BNA, UNA, GNA, ENA, DNG e RNG.
Preferibilmente, gli oligonucleotidi oggetto della presente invenzione sono diretti contro un gene coinvolto nello sviluppo di una malattia di origine genetica e/o virale oppure di un tumore. Detto gene à ̈, preferibilmente, scelto nel gruppo consistente in: geni della famiglia MYC (preferibilmente MYC, MYCN, MYCL1), gene survivina (BIRC5), BCL2, PLK4, ALK, PKM2, caspasi-8 e RASSF1.
In particolare, gli oligonucleotidi della presente invenzione sono diretti contro i geni della famiglia MYC, preferibilmente contro MYCN.
Detti oligonucleotidi sono, preferibilmente scelti nel gruppo consistente in: SEQ ID NO: 2-15, SEQ ID NO: 24, 25, 31 e 32, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 26 e 57, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 27 e 58, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 28 e 59, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 29 e 60, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 30 e 61, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 33 e 62, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 34 e 63, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 35 e 64 e la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 36 e 65.
In alcune forme di realizzazione, detti oligonucleotidi sono oligonucleotidi a PNA, preferibilmente detti PNA sono diretti contro MYCN.
In forme preferite di realizzazione i PNA sono scelti nel gruppo consistente in: SEQ ID NO: 2-15.
Preferibilmente gli oligonucleotidi a PNA sono scelti nel gruppo consistente in: SEQ ID NO: 2-13, più preferibilmente SEQ ID NO: 2-8, ancora più preferibilmente SEQ ID NO: 2-6. L'oligonucleotide di PNA particolarmente preferito ai fini della presente invenzione à ̈ SEQ ID NO: 5.
Preferibilmente SEQ ID NO: 5 à ̈ coniugato all'estremità 5' o 3' con SEQ ID NO: 47. Più preferibilmente, SEQ ID NO: 47 à ̈ costituito da amminoacidi in forma D.
I PNA SEQ ID NO: 2-15 sono diretti, preferibilmente, contro MYCN e, più preferibilmente, modulano l'espressione di MYCN con una strategia antigene.
In una ulteriore forma di realizzazione, detti oligonucleotidi sono a doppio filamento e, preferibilmente, comprendono monomeri di RNA. Preferibilmente detti oligonucleotidi sono diretti contro MYCN.
Alternativamente, detti oligonucleotidi di RNA a doppio filamento sono scelti nel gruppo consistente in: la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 26 e 57, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 27 e 58, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 28 e 59, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 29 e 60 e la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 30 e 61.
Detti oligonucleotidi sono, preferibilmente, diretti contro MYCN. Più preferibilmente, modulano l'espressione del gene mediante una strategia antisenso. In ulteriori forme di realizzazione, detti oligonucleotidi sono oligonucleotidi chimerici DNA-LNA, preferibilmente detti oligonucleotidi sono diretti contro MYCN.
In forme preferite di realizzazione, detti oligonucleotidi chimera DNA-LNA sono scelti nel gruppo consistente in: SEQ ID NO: 24 e 25.
SEQ ID NO: 24 e 25 sono, preferibilmente, diretti contro il gene MYCN.
SEQ ID NO: 24 e 25, preferibilmente, modulano l'espressione del gene mediante una strategia antigene. In ulteriori forme di realizzazione, detti oligonucleotidi sono oligonucleotidi chimerici a singolo filamento comprendenti monomeri di DNA e/o almeno un monomero di DNA fosforotioato . Detti oligonucleotidi sono preferibilmente diretti contro MYCN.
Particolarmente preferiti ai fini della presente invenzione sono gli oligonucleotidi chimerici scelti nel gruppo consistente in: SEQ ID NO: 31 e 32. SEQ ID NO: 31 e 32 sono, preferibilmente diretti contro il gene MYCN. SEQ ID NO: 31 e 32, preferibilmente, modulano l'espressione di MYCN mediante una strategia antisenso. In ulteriori forme di realizzazione, detti oligonucleotidi sono oligonucleotidi chimerici a doppio filamento comprendenti monomeri di RNA ed almeno un nomonero preferibilmente di RNA 2' O (2-Metossietil) o 2'-metil.
Detti oligonucleotidi sono preferibilmente diretti contro MYCN.
Particolarmente preferito ai fini della presente invenzione à ̈ la coppia di oligonucleotidi complementari chimerici SEQ ID NO: 33 e 62. Detta coppia di oligonucleotidi modula l'espressione del gene, preferibilmente, mediante meccanismo antisenso.
In ulteriori forme di realizzazione, detti oligonucleotidi sono oligonucleotidi chimerici a doppio filamento comprendenti monomeri di RNA ed almeno un monomero preferibilmente di RNA 2 '-Fluorurato . Preferibilmente detti oligonucleotidi sono diretti contro MYCN.
Particolarmente preferito ai fini della presente invenzione à ̈ la coppia di oligonucleotidi complementari chimerici SEQ ID NO: 34 e 63. Detta coppia di oligonucleotidi modula l'espressione del gene, preferibilmente, mediante meccanismo antisenso.
In ulteriori forme di realizzazione, detti oligonucleotidi sono oligonucleotidi chimerici a doppio filamento comprendenti monomeri di RNA ed almeno un monomero di LNA.
Detti oligonucleotidi sono preferibilmente diretti contro MYCN.
Particolarmente preferito ai fini della presente invenzione à ̈ la coppia di oligonucleotidi complementari chimerici SEQ ID NO: 35 e 64. Detta coppia di oligonucleotidi modula l'espressione del gene, preferibilmente, mediante meccanismo antisenso.
In ulteriori forme di realizzazione, detti oligonucleotidi sono oligonucleotidi chimerici a doppio filamento, comprendenti monomeri di RNA ed almeno un monomero di RNA arabinoside.
Preferibilmente detti oligonucleotidi sono diretti contro MYCN.
Particolarmente preferito ai fini della presente invenzione à ̈ la coppia di oligonucleotidi complementari chimerici SEQ ID NO: 36 e 65. Detta coppia di oligonucleotidi modula l'espressione del gene, preferibilmente, mediante meccanismo antisenso.
Un ulteriore aspetto dell'invenzione riguarda l'uso degli oligonucleotidi sopra descritti a scopo terapeutico e/o diagnostico.
In particolare, gli oligonucleotidi possono essere utilizzati singolarmente o tra di loro combinati per il trattamento delle malattie di origine genetica e/o virale, in particolare, per il trattamento delle malattie genetiche causate da una sovraespressione di un gene o dalla sua inibizione, ovvero le malattie genetiche che richiedono la modulazione dell'espressione di un gene che à ̈ sovraespresso o inibito.
Gli oligonucleotidi oggetto dell'invenzione sono utilizzati per il trattamento terapeutico di una malattia genetica, preferibilmente, scelta nel gruppo consistente in: sindrome di Gorlin, sindrome di Down, sindrome di Feingold, sindrome di Hirschsprung, sindrome di Von Hippel Lindau, Ataxia Telangiectasia, sindrome di Li-Fraumeni, sindrome di Turcot, tumori familiari e malattia di Parkinson.
Ulteriormente, gli oligonucleotidi oggetto dell'invenzione sono utilizzati per il trattamento terapeutico di patologie tumorali in bambini o adulti. In particolare, i tumori a cui si fa riferimento sono causati, preferibilmente, dalla sovraespressione di un gene od oncogene scelto nel gruppo consistente in: MYC, MYCN, MYCLl, survivina (BIRC5), BCL2, PLK4, ALK e PKM2.
Alternativamente i tumori sono causati, preferibilmente, dall'inibizione (inattivazione) di un gene oncosoppressore o antitumorale, preferibilmente, scelto nel gruppo consistente in: caspasi-8 e RASSF1.
I tumori a cui si fa riferimento sono, preferibilmente, scelti nel gruppo consistente in: neuroblastoma, retinoblastoma, medulloblastoma, ependimoma, feocromocitoma, carcinoma embrionale, tumore delle cellule germinali, rabdomiosarcoma alveolare, rabdomiosarcoma embrionale, tumore di Wilms, sarcoma renale a cellule chiare, sarcoma sinoviale, epatoblastoma, leucemia linfoìde acuta, leucemia linfoide cronica, leucemia linfoblastica acuta, leucemia linioblastica cronica, linfoma di Burkitt, leucemia mieloide acuta, leucemia mieloide cronica, leucemia megacarioblastica acuta, leucemia linfoide cronica B, leucemia delle cellule T, linfomi, tumore a piccole cellule del polmone (microcitoma), adenocarcinoma polmonare, adenocarcinoma polmonare a cellule squamose, carcinoma polmonare primario tipico e atipico, tumore polmonare a grandi cellule, carcinoma polmonare neuroendocrino a grandi cellule, glioblastoma, epatocarcinoma, basalioma, tumore alle ovaie, tumore della mammella e cancro al colon.
Particolarmente preferiti ai fini della presente invenzione sono i tumori scelti nel gruppo consistente in: neuroblastoma, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, tumore di Wilms, medulloblastoma, tumore del polmone a piccole cellule e basalioma.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione una composizione comprendente almeno un oligonucleotide secondo la presente invenzione ed almeno un eccipiente farmacologicamente accettato. Preferibilmente, detto almeno un oligonucleotide à ̈ un PNA, preferibilmente scelto nel gruppo consistente in: SEQ ID NO: 2-15, preferibilmente SEQ ID NO: 2-13, più preferibilmente SEQ ID NO: 2-8, ancora più preferibilmente SEQ ID NO: 2-6.
1/ oligonucleotide particolarmente preferito à ̈ SEQ ID NO: 5. Preferibilmente SEQ ID NO: 5 à ̈ coniugato all'estremità 5' o 3' con SEQ ID NO: 47. Più preferibilmente, SEQ ID NO: 47 à ̈ costituito da amminoacidi in forma D.
Detto PNA à ̈, preferibilmente, coniugato alla sua estremità 3' e/o 5' con un carrier che à ̈, preferibilmente, scelto nel gruppo consistente in: SEQ ID NO: 47-56.
Forma un ulteriore oggetto della presente invenzione una combinazione comprendente almeno un oligonucleotide secondo la presente invenzione, incluso 1<1>oligonucleotide di SEQ ID NO: 1, almeno un composto, preferibilmente almeno un composto ad effetto farmacologico, più preferibilmente un agente chemioterapico ed, eventualmente, almeno un eccipiente farmacologicamente accettato.
In forme preferite di realizzazione detto almeno un composto à ̈ almeno un ulteriore oligonucleotide antigene e/o antisenso, o almeno un agente farmacologico, oppure almeno un composto di origine biologica, biotecnologica o derivante da sintesi chimiche o loro combinazioni.
Detto composto di origine biologica, biotecnologica o derivante da sintesi chimiche à ̈, preferibilmente, scelto nel gruppo consistente in: un anticorpo monoclonale, un agente chemioterapico, un agente immunomodulatore, un fattore di crescita, una citochina, un peptide un inibitore dell' angiogenesi, un inibitore della crescita tumorale, un ormone steroideo e/o un ormone non steroideo e vitamine.
Esempi di composti particolarmente preferiti ai fini della presente invenzione sono scelti nel gruppo consistente in: "nerve growth factor" (NGF), somatostatina, acido retinoico, actinomicina D, asparaginasi, bleomicina, busulfano capecitabina, carboplatino, ciclofosfamide, ciclosporina, cisplatino, citarabina, clorambucile, dacarbazina, daunorubicina, docetaxel, doxorubicina cloridrato, epirubicina cloridrato, etoposide, fludarabina fosfato, fluoro uracile, gemcitabina, idarubicina cloridrato, idrossiurea, ifofosfamide, irinotecan cloridrato, melfalan, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitoxantrone, nutlina, oxaliplatino, paclitaxel, procarbazina, raltitrexed, streptozocina, tegafururacile, temozolomide, tioguanina, tiotepa, topotecan, vinblastina, vincristina, vindesina e vinorelbina e loro combinazioni .
Più preferibilmente i composti sono scelti nel gruppo consistente in: carboplatino, cisplatino, etoposide, vincristina, ciclofosfamide e loro combinazioni.
La Richiedente ha trovato che la somministrazione di almeno un oligonucleotide secondo l'invenzione in concomitanza con almeno un composto, preferibilmente almeno un agente chemioterapico, come sopra descritto, consente di ridurre la concentrazione di detto composto da somministrare, garantendo parimenti un aumento dell'efficacia terapeutica ed una minore tossicità.
La Richiedente ha trovato che, in queste condizioni, la riduzione della concentrazione di detto composto dipende dalla particolare patologia, in particolare la concentrazione del composto chemioterapico dipende dal tipo di tumore.
Per alcuni tumori quali: neuroblastoma, retinoblastoma, medulloblastoma, tumore polmonare a piccole cellule, tumore di Wilms, rabdomiosarcoma alveolare e rabdomiosarcoma embrionale, la concentrazione dell'almeno un agente chemioterapico, somministrato in combinazione con almeno un oligonucleotide secondo la presente invenzione, può essere ridotta fino a 10 volte garantendo lo stesso effetto terapeutico di una dose normale di chemioterapico.
Particolarmente efficace come combinazione farmaceutica (in termini di effetto terapeutico migliorato) à ̈ la combinazione di almeno un PNA secondo la presente invenzione, preferibilmente almeno un PNA scelto nel gruppo consistente in: SEQ ID NO: 1-15, preferibilmente SEQ ID NO: 1-13, più preferibilmente SEQ ID NO: 1-8, più preferibilmente SEQ ID NO: 1-6, ancora più preferibilmente SEQ ID NO: 1 e/o 5 ed almeno un composto, preferibilmente un agente chemioterapico, più preferibilmente scelto nel gruppo consistente in: etoposide (VP16), carboplatino, cisplatino o vincristina, ciclofosfamide e loro combinazioni.
Particolarmente preferita ai fini della presente invenzione à ̈ la combinazione scelta tra: SEQ ID: NO 1 e carboblatino, o etoposide, o cisplatino o vincristina; o SEQ ID: NO 5 e carboblatino, o etoposide, o cisplatino o vincristina .
Detto PNA à ̈, preferibilmente, coniugato alla sua estremità 3' e/o 5' con un carrier che à ̈, preferibilmente, scelto nel gruppo consistente in: SEQ ID NO: 47-56.
L'effetto migliorativo à ̈, preferibilmente, riscontrabile sia quando la combinazione à ̈ somministrata contemporaneamente sia quando detto almeno un composto à ̈ somministrato in tempi successivi, preferibilmente ad intervalli, più preferibilmente intervalli regolari, di 3 ore, 6 ore, 12 ore, 24 ore, 48 ore o 72 ore.
In altre forme preferite di realizzazione, almeno un oligonucleotide oggetto dell'invenzione, incluso l'oligonucleotide di SEQ ID NO: 1, può essere somministrato coniugato o complessato, preferibilmente, con almeno una particella veicolante, almeno un polimero veicolante o almeno un oligonucleotide autoassemblante veicolante (noti anche come aptameri).
In ulteriori forme preferite di realizzazione, almeno un oligonucleotide oggetto dell'invenzione, incluso l'oligonucleotide di SEQ ID NO: 1, può essere coniugato o complessato e somministrato con almeno una micella liposomiche, almeno una micro-particella o almeno una nanoparticella tali da favorirne la permeazione dei tessuti bersaglio.
Detta particella, solitamente di forma sferica ed utilizzata come mezzo di "delivery" specifica, può essere formulata con molteplici e differenti composti chimici. Ad esempio detta particella può essere una formulazione o co-formulazione di composti polimerici come: chitosano, acido ialuronico, polietilenglicole (PEG), polietilenimina (PEI), acido polilattico (PLA), acido polilattico-co-glicolico (PLGA), idrossiapatite (HAP), acidi grassi poiinsaturi, acidi grassi saturi, lipidi cationici, HAP-PLA, HAP-PLA/PGA e loro derivati. In ulteriori forme preferite di realizzazione, almeno un oligonucleotide oggetto dell'invenzione può essere somministrato coniugato o complessato, preferibilmente, con almeno una particella del tipo descritto precedentemente coadiuvati anche dalla presenza nelle membrane polimeriche di almeno un ligando o almeno una porzione di ligando per un recettore specifico delle cellule bersaglio (come ad esempio il GD2, l'acido folico, il TRAIL, l'NGF), sia di origine chimica che biotecnologica, utile a favorire 1'internalizzazione di detto oligonucleotide oggetto dell'invenzione, nelle cellule bersaglio.
In ulteriori forme preferite di realizzazione, almeno un oligonucleotide oggetto dell'invenzione può essere coniugato con almeno un ligando o una porzione di ligando (come ad esempio il GD2 (ganglioside GD2), l'acido folico, il TRAIL (TNF-RELATED APOPTOSIS-INDUCING LIGAND), l'NGF (Nerve Growth Factor) specifico per un recettore delle cellule bersaglio.
In ulteriori forme preferite di realizzazione, almeno un oligonucleotide oggetto dell'invenzione, incluso 1'oligonucleotide di SEQ ID NO: 1, può essere somministrato, da solo o in combinazione, associato ad almeno una ulteriore applicazione medica allo scopo di potenziare la loro efficacia, preferibilmente anche tramite la facilitazione della permeazione delle cellule e/o dei tessuti bersaglio.
Detta applicazione medica à ̈, preferibilmente, scelta nel gruppo consistente in: ossigeno-terapia, magnetoterapia, termoterapia, elettrostimolazione, ultrasuoni, radioterapia, chemioterapia e fototerapia.
Esempio 1
Sintesi chimica degli oligonucleotidi.
La sintesi chimica degli oligonucleotidi à ̈ basata sull'utilizzo di nucleosidi di DNA fosforoammiditi modificati con un gruppo protettivo 4,4'-dimetossitritil (DMTr) sul 5'-OH e un β-cianoetil sul gruppo 3'-fosfato; si utilizzano anche gruppi protettivi per le ammine primarie (eterocicli delle nucleobasi) altrimenti troppo reattive.
La sintesi chimica di oligonucleotidi a DNA avviene in direzione 3'-5'. Viene utilizzata una resina CPG (acronimo di Controlled Pore Glass, vetro a porosità controllata) o un supporto polistirenico, funzionalizzati con la prima base nucleotidica. La sintesi comincia con una fase di deprotezione del gruppo 5'-dimetossitritil tramite una soluzione di acido tricloroacetico (TCA) al 3% in diclorometano (DCM). Successivamente si procede con l'attivazione, tramite etiltiotetrazolo (ETT) o benziltiotetrazolo (BTT) 0,3M, della fosforoammidite corrispondente alla seconda base da inserire in sequenza per poi accoppiarla con il 5'OH precedentemente deprotetto, formando così un legame fosfitodiesferico.
La fase successiva à ̈ quella di "capping", la quale consente di acetilare i gruppi 5'OH che non hanno reagito. Il capping viene effettuato tramite 2 soluzioni, una contenente tetraidrofurano (THF)/lutidina/anidride acetica (8:1:1) e l'altra contenente una soluzione al 10% di metilimidazolo in THF. Il legame trivalente instabile dei triesteri fosfiti viene stabilizzato tramite iodio in una soluzione THF/piridina che li ossida a fosfodiesteri pentavalenti .
Dopo l'ossidazione, il ciclo viene ripetuto partendo con detritilazione della seconda unità introdotta e così via. Si ripete guesto ciclo per il numero di volte necessarie a seconda di quante basi si vogliono inserire in sequenza. Infine, il gruppo 5'-DMTr finale viene rimosso tramite un trattamento con un acido a temperatura ambiente.
In base ai gruppi protettori presenti sulle basi (dipende dalla chimica delle basi scelte, PTO, 2'OMe, ecc.) si può lasciare a 55°C per 16 ore con idrossido d'ammonio o a 55°C per 35 minuti con una soluzione idrossido d'ammonio/metilammina (AMA) al fine di deproteggere i fosfori tramite β-eliminazione dei gruppi cianoetil e rimuovere i gruppi protettori sugli eterocicli delle nucleobasi.
Alternativamente il gruppo 5'-DMTr può essere mantenuto per tutta la fase di analisi (HPLC, MS) e di cromatografia preparativa per purificare meglio il prodotto finale dai sottoprodotti ed infine essere rimosso tramite trattamento con acido acetico.
La sintesi chimica di oligonucleotidi di RNA differisce da quella di oligonucleotidi di DNA per via del gruppo 2'OH presente sul ribosio, quindi per la presenza di un gruppo protettore aggiuntivo per ogni fosforoamidite. Di conseguenza la sintesi di oligonucleotidi di RNA ha bisogno di un tempo di coupling più lungo e di ulteriori passaggi per la deprotezione di tale gruppo.
Lo stesso protocollo sopra riportato à ̈ utilizzato per la sintesi di oligonucleotidi con monomeri chimicamente modificate, quali fosforotioati (PTO), 2'O-Metil (2'OMe), 2'Fluoro (2'-F), acido nucleico arabinoside (ANA), "locked nucleic acid" (LNA).
I dettagli delle specifiche tecniche di ogni base modificata sono quelle fornite dalla ditta di acquisto delle molecole monomeriche (Link Technologies Ltd.).
I morfolino sono stati acquistati dalla ditta produttrice (Gene Tools, LLC).
La sintesi di oligonucleotidi di PNA Ã ̈ stata realizzata su scala 10 micromolare, ed ha previsto una fase di purificazione e caratterizzazione.
La sintesi della molecola à ̈ stata effettuata in fase solida, utilizzando una resina Rink Amide-Chemmatrix® e lo strumento di sintesi automatica Syro (multisyntech). II primo monomero della sintesi viene legato manualmente alla resina. Ogni ciclo della sintesi automatica à ̈ suddiviso in tre fasi. La prima fase à ̈ la deprotezione, realizzata utilizzando una soluzione di piperidina al 20% in DMF (dimetilformammide).
La seconda fase à ̈ la reazione di coupling tra il monomero entrante e la catena in crescita. Questa reazione viene realizzata aggiungendo 0,22M di monomero (FMOC-PNA-G (Bhoc)-OH, FMOC-PNA-A (Bhoc)-OH, FMOC-PNA-C(Bhoc)-OH, FMOC-PNA-T-OH) in NMP (N-metilpirrolidone) e 0,32M di attivante in DMF (in questo caso l'HATU) in ambiente basico con una soluzione di 2,6-lutidina e DIPEA (N,N-diisopropildietilammina) all'8% in DMF. La reazione di coupling viene ripetuta, in doppio, all'attacco del primo e secondo monomero sulla resina precaricata, nel passaggio dalla catena peptidica a quella a PNA e sull'ultimo monomero.
La terza fase à ̈ la reazione di "capping" che serve per bloccare, mediante acetilazione, i siti che non hanno reagito durante il "coupling". La reazione à ̈ realizzata utilizzando una soluzione contenente 2,6-lutidina 6% e anidride acetica 5% in DMF. A sintesi ultimata si procede con l'allontanamento della molecola dal supporto solido .
Questa reazione à ̈ ottenuta con una soluzione di TFA (acido trifluoroacetico) e meta-cresolo in rapporti 5:1. La molecola così ottenuta viene raccolta mediante precipitazione in dietiletere.
Una volta recuperata in acqua, à ̈ purificata in HPLC. La colonna utilizzata per la purificazione à ̈ una C18 300A 5u Jupiter (© Phenomenex, Ine.). La purificazione à ̈ realizzata utilizzando un gradiente lineare dal 100% A (acqua 95%; acetronitrile 5% ; 0,1% TFA)- 0% B (acqua 60%; acetonitrile 40%; 0,1% TFA) al 60% A-40% B in 30 minuti. Il gradiente completo utilizzato à ̈ 0-5 minuti 0% B; 5-35 minuti 40% B; 35-37100% B; 37-42100% B; 42-44 0%B.
Il prodotto purificato viene infine analizzato mediante spettroscopia di massa ESI (© Waters).
Oligonucleotidi antigene per il blocco della trascrizione genica.
Allo scopo di dimostrare che gli oligonucleotidi dell'invenzione, selezionati e progettati secondo i parametri descritti nella presente invenzione, funzionano nel blocco selettivo della trascrizione di un gene, sono stati progettati e sintetizzati gli oligonucleotidi a base di PNA diretti contro il gene MYCN riportati in Tabella 1.
TABELLA 1
H Ή EH
H c m d) t) i 0 0
HE
s
o a
Ά o
•H
N IH
H Q •H ■H
H CU <3 8 0 o
a dp M dp <#> H dP MH cWo dp H Pi (3⁄4
SEQ ID 42 70 100 100
ATGCCGGGCATGATCT 56.3
NO: 1
SEQ ID 75 32 100 100
GGGTGGATGCGGGGGG 81.3
NO: 2
SEQ ID 68 41 100 100
GATGCGGGGGGCTCCT 75
NO: 3
SEQ ID 65 48 100 100
GTCGGCGGGAGGTAAG 68.8
NO: 4
SEQ ID 62 53 100 100
GCTGGGTGGATGCGGG 75
NO: 5
SEQ ID 60 54 100 100
TGGACGCGCTGGGTGG 75
NO: 6
SEQ ID 58 57 100 100
CGCGCTGGGTGGATGC 75
NO: 7
SEQ ID 54 59 100 100
GTCTGGACGCGCTGGG 75
NO: 8
SEQ ID 51 64 100 100
CCCTGCAGTCGGCGGG 81.3
NO: 9
SEQ ID 51 65 100 100
CGGCCGCGGGCCGCCA 93.8
NO: 10
SEQ ID 48 68 100 100
GGGAACTGTGTTGGAG 56.3
NO: 11
SEQ ID 47 69 100 100
TGTCTGGACGCGCTGG 68.8
NO: 12
SEQ ID 48 66 100 100
ACGCTCAGGGACCACG 68 .8
NO: 13
SEQ ID 40 70 100 100
CCCGGACGAAGATGAC 62.5
NO: 14
SEQ ID 37 77 100 100
ACTGTGTTGGAGCCGA 56.3
NO: 15
SEQ ID 14 90 100 100
CCTGTCGTAGACAGCT 56.3
NO: 16
SEQ ID 10 98 100 100
TGTGACAGTCATCTGT 56.3
NO: 17
SEQ ID 10 98 100 100
GTGACAGTCATCTGTC 50
NO: 18
SEQ ID 5 100 100 100
GACAGTCATCTGTCTG 50
NO: 19
SEQ ID 5 100 100 100
CGTCGATTTCTTCCTC 50
NO: 20
SEQ ID 1 100 100 100
CTCGAGTTTGACTCGC 56.3
NO: 21
SEQ ID 2 100 100 100
GCGCCTCCCCTGATTT 62.5
NO: 22
SEQ ID 2 100 100 100
ATATCCCCCGAGCTTC 56.3
NO: 23
I ΡΠA sono stati testati sia come oligonucleotidi
singoli, sia coniugati con carrier alle estremità 3'
e/o 5' allo scopo di favorire la permeazione delle
membrane cellulari. In particolare, gli oligonucleotidi
sono stati coniugati al carbossi terminale al 3' con la
sequenza amminoacidica SEQ ID NO: 43, cioà ̈ prolina-
lisina-lisina-lisina-arginina-lisina-valina .
L'oligonucleotide SEQ ID NO: 1 Ã ̈ la sequenza oggetto del brevetto EP 1618195 e rappresenta una sequenza controllo e la sequenza di confronto.
Gli oligonucleotidi SEQ ID NO: 2-15 contengono un gruppo di due guanine consecutive (SEQ ID NO: 14, 15), oppure un gruppo di tre guanine consecutive (SEQ ID NO: 13), oppure due gruppi di due guanine consecutive (SEQ ID NO: 12), oppure un gruppo di due guanine ed un gruppo di tre guanine consecutive (SEQ ID NO: 11, 10, 9, 8 e 7), oppure due gruppi di due guanine consecutive ed un gruppo di tre guanine consecutive (SEQ ID NO: 6 e 4), oppure un gruppo di due guanine consecutive e due gruppi di tre guanine consecutive (SEQ ID NO: 5), oppure un gruppo di sei guanine consecutive (SEQ ID NO: 3), oppure un gruppo di sei guanine consecutive, un gruppo di tre guanine consecutive ed un gruppo di due guanine consecutive (SEQ ID NO: 2).
I gruppi di guanine consecutive sono riportati nella Tabella 1 con una sottolineatura.
Gli oligonucleotidi SEQ ID NO: 16-23 non hanno gruppi di guanine consecutive, essendo controlli negativi.
Inoltre allo scopo di modulare selettivamente la trascrizione di un gene sono stati progettati e sintetizzati anche gli oligonucleotidi SEQ ID NO: 24-25 riportati nelle Tabelle 2.
Tabella 2
SEQ ID NO: 24 DNA-LNA 25-1 ATGCCGGGCATGATCT
SEQ ID NO: 25 DNA-LNA 25-2 ATGCCGGGCATGATCT
In particolare, sono stati progettati e sintetizzati gli oligonucleotidi chimerici a singolo filamento, comprendenti monomeri di DNA e monomeri di LNA (SEQ ID NO: 24 e 25).
Le basi di DNA all'interno della sequenza di oligonucleotide sono segnate come basi marcate in grassetto, mentre i monomeri di LNA sono sottolineate. Ciascuna molecola di oligonucleotide chimerico à ̈ stata progettata e sintetizzata inserendo i monomeri di LNA intervallati da 1, 2 o 3 basi di DNA al fine di evitare una celere degradazione da parte delle nucleasi endogene, come riportato da letteratura. (Koch T, Biochem J 2001, 354 (Pt 3):481—4; Koji Nagahama, Bioorg Med Chem Lett, 2009, 19(10):2707-9).
Oligonucleotidi Antisenso per il blocco della traduzione genica .
Allo scopo di dimostrare che gli oligonucleotidi dell'invenzione, selezionati e progettati secondo i parametri descritti nella presente invenzione, funzionano nel blocco selettivo della traduzione del gene bersaglio, sono stati progettati, sintetizzati ed analizzati sperimentalmente in vitro gli oligonucleotidi SEQ ID NO: 26-36 antisenso riportati nella Tabella 3 e diretti contro il gene MYCN.
Tabella 3
SEQ ID SEQUENZA SEQUENZA SENSO NO ANTISENSO SEQ ID siMYCN SEQ ID UUCCUCUUCAUCAUCU UGAAGAUGAUGAAGAGGAA NO: 26 (795) NO: 57 OCA
SEQ ID siMYCN SEQ ID CAUCUUCCUCUUCAUC GAUGAUGAAGAGGAAGAUG NO: 27 (799) NO: 58 AUC
SEQ ID siMYCN SEQ ID UUCAUCUUCCUCUUCA UGAUGAAGAGGAAGAUGAA NO: 28 (801) NO: 59 UCA
SEQ ID siMYCN GAGGAAGAUGAAGAGGAAG SEQ ID CUUCCUCUUCAUCUUC NO: 29 (808) NO: 60 CUC SEQ ID siMYCN SEQ ID UUCUUCCUCUUCAUCU GGAAGAUGAAGAGGAAGAA NO: 30 (810) NO: 61 UCC
MYCN-SEQ ID CGTGGAGCAGCTCGGC PTO (1)
NO: 31 AT
as
SEQ ID MYCN-NO: 32 PTO CAGGGTGTCCTCTCCG
(763) GA
as
SEQ ID siRNA- SEQ ID GAGGAAGAUGAAGAGGAAGT CUUCCUCUUCAUCUUC NO: 33 2'-OMe- NO: 62
T CUCTT
RNA 808
SEQ ID siRNA- SEQ ID CAGGAAGAUGAAGAGGAAGU GUUCCUCUUCAUCUUC NO: 34 2'F-RNA NO: 63
U CUCUU
808
SEQ ID siRNA- GAGGAAGAUGAAGAGGAAGT SEQ ID CUUCCUCUUCAUCUUC NO: 35 LNA 808 T NO: 64 CUCTT
SEQ ID siRNA- CAGGAAGAUGAAGAGGAAGA SEQ ID GUUCCUCUUCAUCUUC NO: 36 ANA 808 A NO: 65 CUCAA
Sono stati realizzati degli oligonucleotidi a doppio filamento complementari a base di RNA (small interference RNA (siRNA) (SEQ ID NO: 26-30) per modulare selettivamente la traduzione del gene bersaglio MYCN. Inoltre, sono stati realizzati gli oligonucleotidi a base di DNA SEQ ID NO: 31 e 32 in cui il legame fosfodiesterico à ̈ stato modificato in fosforotioato.
Inoltre, sono stati realizzati oligonucleotidi chimerici a doppio filamento: a base di monomeri di RNA e monomeri 2'0-Metil (SEQ ID NO: 33); a base di monomeri di RNA e monomeri 2'-Fluorurati (SEQ ID NO: 34); a base di monomeri di RNA e di monomeri di LNA (SEQ ID NO: 35) e a base di monomeri di RNA e monomeri di RNA arabinoside (SEQ ID NO: 36). Nelle sequenze degli oligonucleotidi SEQ ID NO: 33-36 i monomeri 2'O-Metil, 2'-Fluorurati, di LNA, di arabinoside (ANA) sono riportati in grassetto, mentre ciascun gruppo di almeno due guanine consecutive à ̈ sottolineato.
Essendo gli siRNA degli oligonucleotidi a doppio filamento, la chimera à ̈ stata progettata e sintetizzata in maniera tale da lasciare due monomeri 2'O-Me, o due monomeri 2'-Fluoro, o due monomeri di LNA, o due monomeri di RNA arabinoside, sia in 3' che in 5', spaiate rispetto al filamento complementare ed evitare così una rapida degradazione da parte degli enzimi cellulari .
Trattamenti con Oligonucleotidi - QT-PCR
Al fine di valutare la capacità di modulare l'espressione dei geni bersaglio da parte degli oligonucleotidi oggetto della presente invenzione à ̈ stata analizzata la loro capacità di ridurre la quantità di RNA messaggero tramite la tecnica di Reai Time PCR. A tale scopo sono state utilizzate piastre contenenti 24 pozzetti, in cui sono state seminate 5.0x10<4>cellule con 0.3 ml di terreno OPTI-MEM (GIBCO BRL) 4%di FBS e 2mM L-glutammina (esperimenti in triplicato) per ogni pozzetto .
Le cellule sono state incubate per 24 ore a 37°C, in un atmosfera contenente CO2al 5% per permettere l'aderenza alla base dei pozzetti.
Ogni oligonucleotide analizzato, tranne gli oligonucleotidi a PNA, Ã ̈ stato preventivamente incubato con 2Î1⁄4l di Lipofectamine 2000 (Invitrogen), con 0.3 mL di terreno OPTI-MEM (GIBCO BRL) privo di siero.
Per ciascun pozzetto gli oligonucleotidi sono stati analizzati alle seguenti concentrazioni finali:
• gli oligonucleotidi antisenso siRNA e siRNA gapmer (cioà ̈ gli oligonucleotidi contenenti all'estremità 3' o 5' uno o più monomeri di acidi nucleici chimicamente modificati, mentre nella porzione centrale hanno monomeri di acidi nucleici non modificati o modificati a livello del legame fosfodiesterico come legame fosforotioato) sono stati utilizzati a 200nM;
• gli oligonucleotidi antisenso contenenti monomeri di DNA fosforotioati, gli oligonucleotidi antigene ad RNA (agRNA) e gli oligonucleotidi contenenti monomeri di DNA e monomeri di LNA sono stati utilizzati a 10 Î1⁄4Îœ;
• gli oligonucleotidi morfolino sono stati utilizzati ad una concentrazione pari a ΙÎ1⁄4Îœ, e
• gli oligonucleotidi a PNA sono stati somministrati alla concentrazione di 1 Î1⁄4Îœ.
Le cellule sono state trattate con gli oligonucleotidi aggiungendo il 4% di FBS dopo 6 ore dalla somministrazione degli stessi. In seguito à ̈ stato estratto e purificato l'RNA totale da ogni pozzetto a 24 ore tramite il RNeasy Mini Kit (QIAGEN).
I saggi sono state eseguiti su 8 linee cellulari ottenute da 5 differenti tumori umani che sono correlati alla espressione di MYCN e cioà ̈:
• come modello di neuroblastoma sono state utilizzate le linee cellulari Kelly, IMR-32 (dove il gene MYCN à ̈ amplificato e superespresso) e SKNBE2c e LANl (dove il gene MYCN à ̈ amplificato e superespresso e il gene p53 à ̈ mutato);
• come modello di rabdomiosarcoma à ̈ stata utilizzata la linea cellulare RH30 dove il gene MYCN à ̈ amplificato e superespresso,;
• come modello di tumore di Wilms à ̈ stata utilizzata la linea cellulare WÃŒT49 dove il gene MYCN à ̈ amplificato e superespresso;
• come modello di retìnoblastoma à ̈ stata utilizzata la linea cellulare Y79 dove il gene MYCN à ̈ amplificato e superespresso; e
• come modello di tumore a piccole cellule del polmone à ̈ stata utilizzata la linea cellulare H69 dove il gene MYCN à ̈ amplificato e superespresso. Come controllo sono state utilizzate le stesse linee cellulari sopra elencate trattate con acqua sterile invece degli oligonucleotidi.
Ogni campione di RNA Ã ̈ stato quantificato (in duplicato) utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies).
Il primo filamento di cDNA Ã ̈ stato prodotto utilizzando il cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (Roche). Per la reazione di sintesi del cDNA Ã ̈ stato utilizzato 1 Î1⁄4g totale di RNA. Per la PCR real-time sono stati utilizzati 10 ng di cDNA in un volume finale di 20 Î1⁄4l utilizzando la SYBR Green Master Mix 2X (Applied Biosystems) (sono stati condotti in triplicato 3 esperimenti identici). Le sequenze e le concentrazioni dei primer utilizzati per realizzare la Reai Time PCR sono riportate in Tabella 4. Come controlli positivi sono stati utilizzati due geni housekeeping: il gene GAPDH e la beta actina (ACTB).
Le condizioni della reazione della QT-PCR sono: 10 min a 95°C, 20 sec at 95°C, e 30 sec a 60°C, per 50 cicli.
Tabella 4
Primer Sequenza Concentrazione SEQ ID NO MYCN senso CGACCACAAGGCCCTCAGT 300 nM SEQ ID NO: 37 MYCN SEQ ID NO: 38
TGACCACGTCGATTTCTTCCT 300 nM
antisenso
ACTB senso GAGCACAGAGCCTCGCCTTTG 300 nM SEQ ID NO: 39 ACTB SEQ ID NO: 40
ACCATCACGCCCTGGTGCCTG 300 nM
antisenso
GAPDH senso CCAATATGATTCCACCCATGGC 300 nM SEQ ID NO: 41 GAPDH SEQ ID NO: 42
CTTGATTTTGGAGGGATCTCGC 300 nM
antisenso
Trattamenti_ con_ oligonucleotidi_ -_ Saggio_ di proliferazione cellulare.
Al fine di valutare la capacità di modulazione genica da parte degli oligonucleotidi oggetto della presente invenzione à ̈ stata valutato l'effetto della loro somministrazione sulla vitalità cellulare.
A tale scopo 5x10<3>cellule per pozzetto sono state seminate in piastre da coltura cellulare da 96 pozzetti (esperimenti condotti in triplicato) con 100 Î1⁄4l di terreno OPTI-MEM (GIBCO BRL) contenente il 4% di FBS e 2mM di L-glutammina.
Gli oligonucleotidi a PNA sono stati somministrati a differenti concentrazioni (1Î1⁄4Îœ-2,5Î1⁄4Îœ-5Î1⁄4Îœ-10Î1⁄4Îœ) per poter osservare una relazione dose-effetto.
Per quanto riguarda tutti gli altri oligonucleotidi, le concentrazioni di somministrazione sono quelle riportate nel paragrafo Trattamenti con Oligonucleotidi - QT-PCR.
La vitalità delle cellule trattate à ̈ stata valutata a 48, 72, 96 e 168 ore dal trattamento.
La vitalità cellulare à ̈ stata valutata tramite saggio di ATP-Lite (Luminescence ATP Detection Assay System, PerkinElmer) e sono riportati come il rapporto tra il segnale medio dei pozzetti trattati rispetto al valore medio dei pozzetti di controllo. Le cellule sono state processate seguendo le istruzioni del kit.
I saggi sono state eseguiti sulle stesse linee cellulari utilizzate per valutare i livelli del messaggero del gene MYCN ed elencate nel paragrafo Trattamenti con Oligonucleotidi - QT-PCR.
RISULTATI
Per quanto riguarda gli oligonucleotidi PNA, i risultati riguardanti la loro capacità di inibire la trascrizione del gene MYCN e la proliferazione delle cellule Kelly sono riportati nella Tabella 1. Nella Tabella 6 sono riportati i valori (in percentuale) delle cellule Kelly proliferanti alle diverse concentrazioni di PNA analizzate.
Tabella 5
SEQ ID Celi Prolif Celi Prolif Celi Prolif. Celi Prolif.
Sequenza
O (%) ΙÎ1⁄4Îœ 72h (%)2,5Î1⁄4Îœ 72h (%)5Î1⁄4Îœ 72h (%)ΙΟÎ1⁄4Îœ 72h SEQ ID
ATGCCGGGCATGATCT B9 66 50 24
O: 1
SEQ ID
GGGTGGATGCGGGGGG 74 32 12 2
O: 2
EQ ID
GATGCGGGGGGCTCCT 78 41 19 3
O: 3
SEQ ID
GTCGGCGGGAGGTAAG 78 48 21 3
NO: 4
SEQ ID
GCTGGGTGGATGCGGG 79 53 27 5
NO: 5
SEQ ID
TGGACGCGCTGGGTGG 82 59 35 13
NO: 6
SEQ ID
CGCGCTGGGTGGATGC 80 54 31 8
NO: 7
SEQ ID
GTCTGGACGCGCTGGG 80 57 32 11
NO: 8
SEQ ID
CCCTGCAGTCGGCGGG 86 64 42 20
NO: 9
SEQ ID
TGTCTGGACGCGCTGG 84 60 40 16
NO: 12
I risultati hanno dimostrato che l'effetto di inibizione sul tradotto proteico del gene bersaglio da parte di questi PNA Ã ̈ altamente selettivo e specifico. Inoltre, Ã ̈ stato osservato che l'arresto della crescita delle cellule tumorali utilizzate come modello (caratterizzate dall'amplificazione del gene MYCN) a seguito della somministrazione dei PNA antigene, Ã ̈ direttamente seguito da apoptosi.
In generale gli oligonucleotidi antigene a PNA SEQ ID: 2-SEQ ID NO: 13 (contenenti uno o più gruppi di G), hanno una maggiore efficacia antigene (vale a dire l'inibizione dell'mRNA di MYCN e della proliferazione di cellule tumorali con espressione di MYCN), rispetto ad oligonucleotidi a PNA privi dì gruppi di G (SEQ ID NO: 16-SEQ ID NO: 23).
In particolare, i risultati riportati nella Tabella 1 e nella Tabella 5 dimostrano che le sequenze SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 13 hanno più efficacia antigene rispetto alla SEQ ID NO: 1 oggetto del brevetto EP 1618195.
Le sequenze SEQ ID NO: 7-SEQ ID NO: 12 (contenenti due gruppi da due o tre G consecutive) mostrano maggiore efficacia antigene rispetto alle sequenze SEQ ID NO: 1, e SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO: 15 (contenenti un solo gruppo da due o tre G consecutive).
Le sequenze SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 6 (contenenti tre gruppi da due o tre G consecutive) mostrano maggiore efficacia antigene rispetto alle sequenze SEQ ID NO: 7-SEQ ID NO: 12 (contenenti due gruppi da due o tre G consecutive) .
La SEQ ID NO: 3, contenente un gruppo da sei G consecutive, mostra maggiore efficacia antigene rispetto alle sequenze SEQ ID NO: 1 ed alle sequenze SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 12 contenenti uno o due o tre gruppi di G (in cui ogni gruppo costituito da massimo due o tre G consecutive) .
La sequenza SEQ ID NO: 2, contenente tre gruppi di G consecutive, comprendenti oltre che due gruppi da due e tre G consecutive,anche un gruppo da sei G consecutive, mostra maggior efficacia antigene sia rispetto alla SEQ ID NO: 3, contenente un solo gruppo da sei G, sia rispetto alle sequenze SEQ ID NO: 1 ed alle sequenze SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 12 contenenti uno o due o tre gruppi di G (in cui ogni gruppo costituito da massimo due o tre G consecutive).
Inoltre, gli oligonucleotidi SEQ ID NO 1-23 sono stati somministrati in linee cellulari di tipo fibroblasto (NIH-3T3 e Phoenix) ed i risultati sono riportati nella Tabella 1 (ultime due colonne).
I risultati dimostrano chiaramente che gli oligonucleotidi analizzati non sono specificamente efficaci e non tossici su queste cellule (cioà ̈ su cellule che non esprimono il gene bersaglio che in questo caso à ̈ MYCN).
Infatti, non si sono osservate variazioni nella proliferazione cellulare in queste due linee di fibroblasti non tumorali, e questo risultato significa che gli oligonucleotidi a PNA agiscono tramite un effetto di inibizione specifico sull'espressione di MYCN, mentre non hanno effetto aspecifico e tossico in cellule che non esprimono MYCN.
Quindi si può dedurre che gli oligonucleotidi a PNA progettati sulla base dei parametri descritti nella presente invenzione agiscono specificamente ed in maniera efficace sul gene bersaglio e quindi sulle cellule che esprimono/sovraesprimono questo gene.
I PNA SEQ ID NO: 1-12 sono stati anche testati su diverse linee cellulari che sovraesprimono MYCN (Kelly, SKNBE2c, RH30, WÌT49, WERI-Rbl 1 e H69). I risultati sono riportati nella Tabella 6 e confermano la selettività e specificità dell'effetto di inibizione sul tradotto proteico del gene MYCN da parte dei PNA.
Tabella 6
O CM CN coÌ
O
§ § § 3⁄4O
§ § § § § § § § 0 Î ̃ P P D
H H H aH Q P
H H Q P H QH fi H ο α
Hi O
co Wl O Ol Ol O O Ol O O Wι o
co Wl
CO cwo WCO cWl
o cWl
o wco Hl Wl O COCOCO Hl
co
lly
48
RNA 75 68 65 62 60 58 54 51 51 50 50 elly %cell
66 32 41 48 53 54 57 59 60 64 64 65 rol.
KNBE2c%mRNA 41 75 68 60 59 62 60 62 58 41 40 40
KNBE2c%cell
72 52 53 59 64 57 58 56 64 70 71 71 rol.
H30
39 74 65 57 56 56 55 58 50 29 31 32 %RNA
H30
76 56 59 62 64 64 63 60 71 80 78 77 cell Prol.
iT49
62 78 75 73 69 68 70 72 66 60 60 62 mRNA
iT49
74 54 57 60 63 65 60 62 68 70 72 73 cell Prol.
ERI-Rb1
31 46 43 41 38 37 38 40 36 30 30 30 mRNA
ERI-Rbl
82 79 78 79 80 80 79 78 79 85 84 84 cell Prol.
69
40 58 55 55 54 55 55 56 50 41 41 40 RNA
69
77 61 63 66 68 69 67 66 70 79 78 78 cell Prol.
In maniera più dettagliata à ̈ stato analizzato
1' oligonucleotide PNA antìgene SEQ ID NO: 5.
In particolare, sono stati sintetizzati ed analizzati in vitro su cellule Kelly (che sovraesprimono MYCN) degli oligonucleotidi modificati in cui sono stati modificati i gruppi di guanine consecutivi presenti nella sequenza (i gruppi di guanine consecutive sono sottolineati, mentre i nucleotidi modificati sono in grassetto) in modo da interrompere la consecutività delle guanine.
I risultati (riassunti nella Tabella 7) hanno chiaramente dimostrato che la consecutività delle guanine à ̈ di fondamentale importanza ai fini dell'attività di modulazione dell'espressione del gene. Infatti, il PNA SEQ ID NO: 43, in cui sono stati mutati tutti i gruppi di guanine consecutivi del PNA SEQ ID NO: 5 provoca la perdita dell'attività inibitoria del PNA, mentre la mutazione di uno o due dei tre gruppi di guanine consecutive compromette notevolmente, ma non annulla completamente l'attività inibitoria della molecola .
Tabella 7
Inibizione (Kelly) Celi SEQ ID NO SEQUENZA
mRNA (%)(Kelly) Prolif. %
SEQ ID NO: 5 GCTGGGTGGATGCGGG 62 53
SEQ ID NO: 43 GCTGAGTCGATGCGTG 0 100
SEQ ID NO: 44 GCTGAGTGGATGCGTG 25 89
SEQ ID NO: 45 GCTGGGTCGATGCGGG 47 69
SEQ ID NO: 46 GTTGGGTGGATGTGGG 58 60
Gli oligonucleotidi chimerici comprendenti monomeri di DNA e monomeri di LNA aventi come bersaglio il gene MYCN sono stati testati in vitro su cellule di rabdomiosarcoma alveolare (RH30). I risultati sono riassunti nella Tabella 8 e dimostrano che questi oligonucleotidi hanno una intensa e specifica attività antigene.
Tabella 8
Inibizione Cell SEQ ID NO NOME SEQUENZA
mRNA (%) Prolif (%) SEQ ID NO: DNA-LNA 25- 23 75
ATGCCGGGCATGATCT
24 1
SEQ ID NO: DNA-LNA 25- 24 78
ATGCCGGGCATGATCT
25 2
Gli oligonucleotidi antisenso progettati e sintetizzati dalla Richiedente secondo i parametri descritti nella presente invenzione sono stati analizzati in vitro su cellule di rabdomiosarcoma (RH30). I risultati sono riassunti nella Tabella 9 e mostrano che gli oligonucleotidi sono in grado di inibire in maniera specifica ed efficace il trascritto di MYCN, inoltre essi sono anche in grado di inibire selettivamente la proliferazione delle cellule tumorali in maniera più efficace rispetto agli oligonucleotidi antisenso standard attualmente disponibili per il gene MYCN(Chung DH, Bioch Bioph Res Commun, 2006, 351(1):192-7.
In particolare, gli siRNA diretti contro l'mRNA di MYCN identificati dalla Richiedente e descritti in Tabella 11 esercitano una attività antisenso con inibizione dell'mRNA di MYCN che varia da un minimo del 70% ad un massimo del 85%.
Tabella 9
Inibizion Celi
SEQUENZA SEQUENZA
SEQ ID NO e mRNA Prolif
SENSO ANTISENSO
(%) (%) SEQ ID siMYCN UGAAGAUGAUGAA UUCCUCUUCAUCA 82 28
NO: 26 (795) GAGGAA UCUUCA
SEQ ID siMYCN GAUGAUGAAGAGG CAUCUUCCUCUUC 70 43
NO: 27 (799) AAGAUG AUCAUC
SEQ ID siMYCN UGAUGAAGAGGAA UUCAUCUUCCUCU 78 35
NO: 28 (801) GAUGAA UCAUCA
SEQ ID siMYCN GAGGAAGAUGAAG CUUCCUCUUCAUC 85 28
NO: 29 (808) AGGAAG UUCCUC
SEQ ID siMYCN GGAAGAUGAAGAG UUCUUCCUCUUCA 81 30
NO: 30 (810) GAAGAA ucuucc
MYCN- 34 73
SEQ ID CGTGGAGCAGCTC PTO (1)
NO: 31 GGCAT
as
SEQ ID MYCN- 45 65
NO: 32 PTO CAGGGTGTCCTCT
(763) CCGGA
as
SEQ ID siRNA- 13 85
GAGGAAGAUGAAG CUUCCUCUUCAUC
NO: 33 2'-OMe-
AGGAAGTT UUCCUCTT
RNA 808
SEQ ID siRNA- 59 52
CAGGAAGAUGAAG GUUCCUCUUCAUC
NO: 34 2'F-RNA
AGGAAGUU UUCCUCUU
808
SEQ ID siRNA- GAGGAAGAUGAAG CUUCCUCUUCAUC 34 68
NO: 35 LNA 808 AGGAAGTT UUCCUCTT
SEQ ID siRNA- CAGGAAGAUGAAG GUUCCUCUUCAUC 69 35
NO: 36 ANA 808 AGGAAGAA UUCCUCAA
Allo scopo di verificare se gli oligonucleotidi oggetto della presente invenzione fossero in grado di abbassare le concentrazioni di chemioterapici attualmente utilizzati nei protocolli terapeutici contro il cancro gli stessi sono stati somministrati in concomitanza con farmaci chemioterapici.
Sono stati effettuati degli studi di associazione tra PNA con farmaci chemioterapici (carboplatino, etoposide (VP16), cisplatino e vincristina) su differenti linee cellulari tumorali umane e murine di neuroblastoma (CAN, LAN 1, IMR-32, KCN, Kelly, NH02A, SKNBE2c).
La "schedule" terapeutica utilizzata nei trattamenti effettuati ha previsto il trattamento delle cellule con PNA e successivamente ad un tempo prestabilito (potevano essere 6 o 12 ore) Ã ̈ stato somministrato il chemioterapico.
I risultati dimostrano che l'associazione di questi composti con gli oligonucleotidi dell'invenzione determina, ad intervalli specifici di concentrazione, un effetto terapeutico maggiore rispetto al trattamento in singolo degli stessi composti.
In particolare, si osserva che il trattamento, sia esso contestuale e contemporaneo o ad intervalli differenti di tempo (3 ore, 6 ore, 12 ore, 24 ore, 48 ore , 72 ore, ecc. .) di una combinazione costituita dagli oligonucleotidi dell'invenzione con altri composti ad effetto farmacologico determina una maggiorazione dell'effetto terapeutico desiderato.
Quindi la combinazione di uno o più oligonucleotidi identificati dalla Richiedente con farmaci chemioterapici permette di ridurre la concentrazione di farmaco chemioterapico anche di 10 volte rispetto allo standard terapeutico attuale ottenendo il medesimo effetto.
In particolare, i risultati di questo studio dimostrano che SEQ ID NO: 1 ha un effetto sinergico, in termini di inibizione della proliferazione in cellule, quando viene somministrato in combinazione con vincristina, o etoposide, o carboplatino, o cisplatino, rispetto agli effetti ottenuti con trattamento in singolo dell'oligonucleotide o rispetto ai trattamenti in singolo dei chemioterapici citati.

Claims (1)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un oligonucleotide per la modulazione dell'espressione di un gene, comprendente 6-30 nucleotidi, preferibilmente 12-24 nucleotidi, detto oligonucleotide essendo caratterizzato da una sequenza comprendente almeno un gruppo di almeno due guanine consecutive, ad esclusione dell'oligonucleotide di sequenza SEQ ID NO: 1. 2. 1/oligonucleotide in accordo con la rivendicazione 1, in cui detto almeno un gruppo di almeno due guanine comprende: almeno un gruppo di almeno tre guanine consecutive; o almeno un gruppo di almeno quattro guanine consecutive; o almeno un gruppo di almeno cinque guanine consecutive; o almeno un gruppo di almeno sei guanine consecutive. 3. 1/ oligonucleotide in accordo con la rivendicazione 1 o 2, in cui detto oligonucleotide à ̈ coniugato con una sequenza carrier all'estremità 3' e/o all'estremità 5' di detto oligonucleotide, preferibilmente un carrier scelto nel gruppo consistente in: SEQ ID NO: 47-56. 4. L'oligonucleotide in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui detto oligonucleotide à ̈ almeno una molecola di acido nucleico naturale, preferibilmente DNA o RNA eventualmente modificata chimicamente, o di acido nucleico sintetico, preferibilmente PNA, LNA o morfolino eventualmente modificato chimicamente, oppure una combinazione di detto acido nucleico naturale e di detto acido nucleico sintetico. 5. L'oligonucleotide in accordo con la rivendicazione 4, in cui detto acido nucleico naturale o sintetico à ̈ a singolo o a doppio filamento. 6. L'oligonucleotide in accordo con la rivendicazione 4 o 5, in cui detta almeno una molecola di DNA comprende almeno un nucleotide di LNA, UNA, ENA, ANA, F-ANA, PNA o morf olino; oppure comprende un nucleotide di RNA 2ÎŒ -Metil, 2'O-Metossietil o 2'-fluoro. 7. L 'oligonucleotide in accordo con la rivendicazione 4 o 5, in cui detta almeno una molecola di RNA comprende almeno un nucleotide di RNA scelto tra: un nucleotide 2'0-Metil, un nucleotide 2'O-Metossietil, un nucleotide 2'-fluoro; oppure almeno un nucleotide di un acido nucleico scelto tra: LNA, UNA, ENA, ANA, F-ANA, PNA e morfolino . 8. L 'oligonucleotide in accordo con la rivendicazione 4, in cui detta almeno una molecola di DNA o detta almeno una molecola di RNA comprende almeno un nucleotide modificato a livello del legame fosfodiestereo come legame fosforotioato. 9. L 'oligonucleotide in accordo con la rivendicazione 4, in cui detto PNA ha una struttura scheletro modificata in cui il carbonio-alfa ha come sostituente la catena laterale dell'arginina o della lisina. 10. L'oligonucleotide secondo una gualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detto oligonucleotide à ̈ scelto tra: SEQ ID NO: 2-15, SEQ ID NO: 24, 25, 31 e 32, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 26 e 57, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 27 e 58, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 28 e 59, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 29 e 60, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 30 e 61, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 33 e 62, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 34 e 63, la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 35 e 64 e la coppia di oligonucleotidi complementari SEQ ID NO: 36 e 65. 11. L'oligonucleotide secondo la rivendicazione 10, in cui detto oligonucleotide à ̈ un PNA scelto nel gruppo consistente in: SEQ ID NO: 2-15, preferibilmente SEQ ID NO: 2-13, più preferibilmente SEQ ID NO: 2-8, ancora più preferibilmente SEQ ID NO: 2-6. 12. L'oligonucleotide secondo la rivendicazione 11, in cui detto PNA à ̈ SEQ ID NO: 5. 13. L' oligonucleotide in accordo con la rivendicazione 12, in cui SEQ ID NO: 5 à ̈ coniugata all'estremità 5' e/o 3' con SEQ ID NO: 47. 14. L'oligonucleotide in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 13, in cui detto oligonucleotide à ̈ diretto contro almeno un gene responsabile di una malattia di origine genetica o virale oppure contro almeno un gene tumorale. 15. L'oligonucleotide in accordo con la rivendicazione 14, caratterizzato dal fatto che detto gene à ̈ scelto nel gruppo consistente in: almeno un gene appartenente alla famiglia MYC, preferibilmente MYC, MYCN o MYCL1, BIRC5, BCL2, PLK4, ALK, PKM2, CASP8 e RASSF1. 16. Una composizione comprendente almeno un oligonucleotide in accordo con una qualsiasi delle rivendicazione dalla 1 alla 13 ed un almeno un eccipiente farmacologicamente accettabile. 17. Una composizione comprendente almeno un oligonucleotide in accordo con una qualsiasi delle rivendicazione dalla 1 alla 13, compreso SEQ ID NO: 1, in combinazione con un composto ad azione farmacologica scelto, preferibilmente, nel gruppo consistente in: NGF, somatostatina, acido retinoico, actinomicina D, asparaginasi, bleomicina, busulfano capecitabina, carboplatino, ciclofosfamide, ciclosporina, cisplatino, citarabina, clorambucile, dacarbazina, daunorubicina, docetaxel, doxorubicina cloridrato, epirubicina cloridrato, etoposide, fludarabina fosfato, fluoro uracile, gemcitabina, idarubicina cloridrato, idrossiurea, ifofosfamide, irinotecan cloridrato, melfalan, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitoxantrone, oxaliplatino, paclitaxel, procarbazina, raltitrexed, streptozocina, tegafur-uracile, temozolomide, tioguanina, tiotepa, topotecan, vinblastina, vincristina solfato, vindesina e vinorelbina . 18. La composizione in accordo con la rivendicazione 17, in cui detta combinazione à ̈ : SEQ ID: NO 1 e carboblatino, o etoposide, o cisplatino o vincristina; o SEQ ID: NO 5 e carboblatino, o etoposide, o cisplatino o vincristina . 19. Un oligonucleotide in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 13 od una composizione in accordo con la rivendicazione 16-18 per uso come medicamento o per uso diagnostico. 20. L'oligonucleotide o la composizione secondo la rivendicazione 19, per uso nel trattamento di una malattia di origine genetica e/o virale oppure per il trattamento di un tumore, detta malattia di origine genetica e/o virale e detto tumore essendo causati da una sovra-espressione e/o inibizione di un gene. 21. L'oligonucleotide o la composizione secondo la rivendicazione 19 o 20, in cui detta malattia genetica à ̈ scelta dal gruppo consistente in: sindrome di Gorlin, sindrome di Down, sindrome di Feingold, sindrome di Hirschsprung, sindrome di Von Hippel Lindau, ataxia telangiectasia, sindrome di Li-Fraumeni, sindrome di Turcot, tumori familiari e malattia di Parkinson; detto tumore à ̈ un tumore di adulto o pediatrico, preferibilmente scelto nel gruppo consistente in: neuroblastoma, retinoblastoma, medulloblastoma, ependimoma, feocromocitoma, carcinoma embrionale, tumore delle cellule germinali, rabdomiosarcoma alveolare, rabdomiosarcoma embrionale, tumore di Wilms, sarcoma renale a cellule chiare, sarcoma sinoviale, epatoblastoma, leucemia linfoide acuta, leucemia linfoide cronica, leucemia linioblastica acuta, leucemia linioblastica cronica, linfoma di Burkitt, leucemia mieloide acuta, leucemia mieloide cronica, leucemia megacarioblastica acuta, leucemia linfoide cronica B, leucemia delle cellule T , linfomi, tumore a piccole cellule del polmone , adenocarcinoma polmonare, adenocarcinoma polmonare a cellule squamose, carcinoma polmonare primario tipico e atipico, tumore polmonare a grandi cellule, carcinoma polmonare neuroendocrino a grandi cellule, glioblastoma, epatocarcinoma, basalioma, tumore alle ovaie, tumore della mammella e cancro al colon.
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