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Interessenerklärung der
Regierung
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Diese
Erfindung wurde mit staatlicher Unterstützung unter den NIH-Förderungsnr. EY10320 und EY11373
gemacht. Als solches besitzt die Regierung. der Vereinigten Staaten
gewisse Rechte an dieser Erfindung.
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Hintergrund der Erfindung
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Angiogenese
bezeichnet einen Prozess, durch den neue kapillare Blutgefäße aus vorhandenen
Mikrogefäßen gebildet
werden, was zur Entwicklung einer Blutzufuhr zu einem bestimmten
Gewebebereich führt [23,
25]. Sie ist eine der tiefgreifensten und grundlegendsten essentiellen
biologischen Prozesse, die man bei Organisationen bei Säugern antrifft.
Im gesunden, erwachsenen menschlichen Körper ist die Angiogenese eine
normale und wichtige Funktion, die bei einer Vielfalt physiologischer
Phänomene
einschließlich
chronischer Entzündung,
Embryonalentwicklung, Reproduktion und Wundheilung wichtig ist [22,
29]. Beispielsweise tritt die Angiogenese im weiblichen Reproduktionssystem
als Reaktion auf die Ovulation oder Schwangerschaft sowie im normalen
Haarzyklus auf [28]. Trotzdem tritt die Angiogenese, abgesehen von
Wundheilungs- und Entzündungsprozessen,
praktisch niemals physiologisch in erwachsenen Geweben auf, mit
Ausnahme in den Ovarien, im Endometrium und in der Plazenta [27].
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Wenn
sie jedoch fehlerhaft oder unkontrolliert ist, ist die Angiogenese
auch für
zahlreiche pathologische Prozesse zentral, einschließlich Anomalien
der Wundheilung bei Krankheiten wie Diabetes und Zwölffingerdarmgeschwüren; chronischer
inflammatorischer Störungen
wie rheumatoider Arthritis, Psoriasis und Peridontitis; dermatologischer
Erkrankungen wie Entartungen der Haut, Dekubitusgeschwüre, Hämangiome,
Karposi-Sarkom, Psoriasis, pyogener Granulome und Warzen; Augenerkrankungen
insbesondere diabetische Retinopathie; und Wachstum von festen Tumoren
sowohl gutartig als auch bösartig
[22, 23, 25, 26]. Die Folge von anormaler Angiogenese ist entweder übermäßiges oder
ungenügendes
Wachstum von Blutgefäßen. Geschwüre, Schlaganfälle und
Herzinfarkte können
beispielsweise auf das Fehlen von Angiogenese zurückzuführen sein,
die normalerweise für
die natürliche
Heilung erforderlich ist, während
die übermäßige Proliferation von
Blutgefäßen Arthritis,
Blindheit sowie Tumorwachstum und Tumorverbreitung begünstigen
kann [29].
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Der
angiogene Prozess ist – sowohl
zeitlich als auch räumlich – durch
eine Vielfalt endogener angiogener und angiostatischer Faktoren
streng reguliert. Er wird durch ein Gemisch von Wachstumsfaktoren
und proangiogenen Cytokinen angetrieben und durch eine Reihe von
Inhibitoren der Neovaskularisierung gemäßigt, die Schritte im angiogenen
Prozess stören
[22, 30]. Bei der Angiogenese werden kapillare Sprossungen als Reaktion
auf proangiogene Faktoren gebildet. Die Sprossungen, angetrieben
durch endotheliale Zellmigration und Proliferation, wachsen und
entwickeln sich dann und organisieren sich zu einer dendritischen
Struktur [24]. Angiogene und anti-angiogene Moleküle steuern
die Bildung neuer Gefäße über verschiedene
Mechanismen. Hypoxie und andere schlecht definierte Stimuli treiben
Tumor-, inflammatorische und Bindegewebezellen an, angiogene Moleküle wie den
vaskulären
endothelialen Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktor, transformierenden Wachstumsfaktor
beta und den von Thrombocyten stammenden Wachstumsfaktor zu erzeugen.
Natürliche
und synthetische Angiogenese-Inhibitoren wie Angiostatin, Thalidomid
und Thrombospondin können
die Angiogenese reprimieren [23]. Die meisten, wenn nicht alle der
Angiogenese-abhängigen
Krankheitsprozesse sind sowohl auf die unbegrenzte Produktion normaler
oder anormaler Formen von proangiogenen Mediatoren als auch auf
den relativen Mangel an die Angiogenese hemmenden Molekülen zurückzuführen [22].
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Prozesse,
die für
die neue Gefäßbildung
notwendig sind und die durch angiogene und anti-angiogene Moleküle gesteuert
werden, schließen
die Migration und Proliferation von Endothelzellen aus den Mikrogefäßen, die
kontrollierte Expression proteolytischer Enzyme, den Abbau und den
Wiederzusammenbau der extrazellulären Matrix und den morphogenen
Prozess der Endothelröhrenbildung
ein. In Tiermodellen können
einige Angiogenese-abhängige
Krankheiten über
Induktion oder Hemmung der Gefäßneubildung
gesteuert oder moduliert werden [23]. Die Manipulation der Gefäßneubildung,
insbesondere die therapeutische Induktion der Angiogenese, wäre wünschenswert,
da sie neue therapeutische Optionen zur Behandlung einer Vielzahl
von Angiogenese-abhängigen
Krankheiten oder Zuständen
einschließlich
Krebs, diabetischer Retinopathie, inflammatorischer Erkrankungen,
ischämischer
Herzerkrankungen, Myokardinfarkt, peripherer Gefäßerkrankungen und Wundheilung
darstellen.
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Onchozerkose
oder Flussblindheit tritt hauptsächlich
als Folge einer Entzündungsreaktion
des Wirts auf eine Infektion mit dem Fadenwurm („filarial")-Nematoden
Onchocera volvulus (O. volvulus) auf. Übertragen von den Bissen der
Schwarzfliege aus der Familie Simuliidae, die sich in schnell fließenden Gewässern fortpflanzt,
durchdringt der Parasit die Haut, subkutane Gewebe und andere Gewebe
und produziert fibröse
Knötchen.
Die Entzündungsreaktion
des Wirts auf die Infektion mit O. volvulus kann sich in chronischer
Hauterkrankung und Augenläsionen
manifestieren. In der Cornea erzeugt diese Reaktion beispielsweise
Neovaskularisierung – das
grundlegende Ereignis beim pathologischen Reaktionsprozess – gefolgt
von einer Trübung
der Cornea. Die Onchozerkose der Augen ist durch Läsionen des
vorderen Auges einschließlich
punktierter Keratitis, Deformation der Pupille und eines Einwachsens
des fibrovaskulären
Narbengewebes gekennzeichnet, was zur Blindheit führen kann.
Tatsächlich
ist Onchozerkose die zweithäufigste
Ursache der infektiösen
Blindheit weltweit. Von den 18 Millionen Menschen, von denen man
glaubt, dass sie mit Onchozerkose infiziert sind, sind etwa 270.000
blind und weitere 500.000 sind visuell beeinträchtigt [1–4, 31].
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Vom
Fadenwurm-Genomprojekt wurde kürzlich
eine Genbank mit exprimierten sequenzmarkierten Stellen von O. volvulus
entwickelt, und zahlreiche cDNAs wurden cloniert [5]. Aus dieser
Genbank wurden zahlreiche O. volvulus-Proteine, einschließlich Ov20
[32], OvPDI [11] und Ovzf [33], charakterisiert. Jedoch wurde die
Beziehung zwischen den O. volvulus-Proteinen und der Entzündungsreaktion
des Wirts bei der Onchozerkose der Augen – insbesondere bei der Induktion
der Neovaskularisierung der Cornea – bisher nicht vollständig beschrieben.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass bestimmte
Mitglieder der Ov-ASP-Proteinfamilie am pathologischen Prozess der
Neovaskularisierung der Cornea bei mit O. volvulus infizierten Tieren beteiligt
sind. Diese Entdeckung, die auf eine proangiogene Rolle für die Ov-ASP-Proteine hinweist,
hat Auswirkungen auf die Wundheilung und auf die Behandlung von
Krankheiten wie Ischämie,
wo die Verbesserung oder Förderung
der Angiogenese wünschenswert
ist. Außerdem
erlaubt diese Entdeckung die Durchmusterung nach anti-Ov-ASP-Faktoren,
die die angiogene Kapazität
von Ov-ASP hemmen oder herabsetzen. Dieser Befund hat Auswirkungen
auf die Behandlung der Onchozerkose der Augen.
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Daher
stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Ov-ASP für die Herstellung
eines Medikaments zum Induzieren von Angiogenese in einem Gewebe
bereit, wobei das Gewebe mit einer Menge von Ov-ASP in Kontakt zu
bringen ist, die wirksam ist, um die Angiogenese zu induzieren,
und wobei das Gewebe mit Krankheiten oder Zuständen, ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus Kreislaufstörungen, angeborener Herzerkrankung,
Ischämie,
myokardialer Erkrankung, myokardialen ischämischen Störungen, perikardialer Erkrankung
und Gefäßstörungen in
Verbindung gebracht wird. Die vorliegende Erfindung stellt ferner
ein Verfahren zum Durchmustern nach einem Anti-Ov-ASP-Faktor bereit,
umfassend die Schritte: (a) Inkontaktbringen eines Faktors von Interesse
mit Ov-ASP; und (b) Bestimmen der Fähigkeit des Faktors, die blutgefäßbildende
Aktivität
von Ov-ASP zu hemmen. Die Erfindung ist so, wie in den Patentansprüchen definiert.
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Zusätzliche
Aufgaben der vorliegenden Erfindung sind im Hinblick auf die nachfolgende
Beschreibung offensichtlich.
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Kurze Beschreibung der Figuren
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1 stellt
einen Vergleich zwischen den Mitgliedern der Ov-ASP-Familie und
anderen Mitgliedern der Tpx- und CRISP-Proteinfamilien dar. Die
Sequenzen wurden unter Verwendung des MACAW-Programms ausgerichtet, wie
in Material und Methoden beschrieben. Die Grauschattierung hebt
Bereiche mit Ähnlichkeitswerten
mit hohem Mittelwert hervor, während
die schwarze Schattierung identische Aminosäuren hervorhebt. Kursiv gedrucktes
hebt vermeintliche, identifizierte Signalsequenzen hervor, wie in
Material und Methoden beschrieben. Sterne heben die im Text diskutierten
konservierten Cysteinreste hervor. Ov-ASP-1, Ov-ASP-2 und Ov-ASP-3
= Mitglieder der Ov-ASP-Familie;
Bm-Asp = Brugia malayi-ASP-Homolog (Hinterlegungsnummer AF042088);
Ac-ASP = sekretiertes Protein von A. caninum (Carboxyterminus =
192 Aminosäuren;
Hinterlegungsnummer Q16937); Vv-Ag5 = Vespula vulgarus-Antigen 5 (Hinterlegungsnummer
Q05110); und Hs-Tpx = Homo sapiens-Tpx-Protein (Hinterlegungsnummer P16562)
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2 zeigt
eine phylogenetische Analyse der Mitglieder der Ov-ASP-Familie. Die dargestellte
Phylogenie wurde konstruiert, wie in Material und Methoden beschrieben.
Diese Analyse erzeugte einen einzelnen Persimonien-Baum, wie hier dargestellt.
Die statistischen Werte für
diese Phylogenie waren wie folgt: Baumlänge = 759 (Bereich 678–1071);
Konsistenzindex = 0,893; und Konsistenzindex mit neu geändertem
Maßstab =
0,709. Die Zahlen geben die Bootstrap-Support-Werte für die Gruppen
distal zum markierten Knotenpunkt an. Die Taxa sind wie folgt: Ov-ASP-1,
Ov-ASP-2, Ov-ASP-3 = Mitglieder der Ov-ASP-Familie; Bm-ASP = Brugia malayi-ASP-Homolog
(Hinterlegungsnummer AF042088); Di-ASP = Dirofilaria immitis-ASP-Homolog
(Hinterlegungsnummer AF001100); Ce-ASP = Caenorhabditis elegans-ASP-Homolog
(Hinterlegungsnummer CAA92136); Ac-ASP = sekretiertes Protein von
A. caninum (Carboxyterminus = 192 Aminosäuren; Hinterlegungsnummer Q16937);
Na-ASP = Necator americanus-Homolog von ASP (Carboxyterminus = 192
Aminosäuren;
Hinterlegungsnummer AF07952); Vv-Ag5 = Vespula vulgarus-Antigen
5 (Hinterlegungsnummer Q05110); Vc-Ag5 = Vespa crabro-Antigen 5
(Hinterlegungsnummer P35781); Hs-Tpx = Homo sapiens-Tpx-Protein
(Hinterlegungsnummer P16562); Mm-TPX = Mus musculus-Tpx-Protein
(Hinterlegungsnummer P16563)
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3 stellt
eine genomische Southern-Blot-Analyse der Mitglieder der Ov-ASP-Familie bereit.
Eine genomische Southern-Blot-Analyse wurde mit O. volvulus durchgeführt, und
menschliche, mit Restriktionsenzymen gespaltene DNA wurde mit einer
gereinigten Insertion getestet, das den offenen Leserahmen von Ov-asp-2
mit der vollständigen
Länge codiert,
wie in Material und Methoden beschrieben. Spur 1 = genomische O.
volvulus-DNA, gespalten mit BamHI; Spur 2 = genomische O. volvulus-DNA,
gespalten mit HindIII; Spur 3 = menschliche genomische DNA, gespalten
mit BamHI; und Spur 4 = menschliche genomische DNA, gespalten mit
HindIII.
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4 stellt
stadiumspezifische PCR dar, wobei die Expressionsprofile der drei
O. volvulus-asp-Gene in verschiedenen Stadien des Lebenszyklus gezeigt
sind. Die Amplifizierungen erfolgten unter Verwendung genspezifischer
Primer auf cDNA-Genbänken,
die aus Microfilariae (mf), Larven im zweiten Stadium (L2), Larven
im dritten Stadium (L3), sich häutenden
Larven (mL3), Larven im vierten Stadium (L4) und erwachsenen Männchen und
Weibchen hergestellt wurden. Das O. volvulus-Gen, das Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydragenase
(Ov-gpd-1) codiert, wurde als interne Kontrolle eingeschlossen.
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5 zeigt eine durch Ov-ASP-2 hervorgerufene
angiogene Reaktion. Feld A: 30 μg
Ov-ASP-2/MBP wurden in das Corneastroma von BALB/c-Mäusen injiziert.
Das Wachstum der Blutgefäße wurde
bezogen auf die Länge
(Gefäßlänge) und
auf den umgebenden Bereich (Uhrzeitstunden) von der Injektionsstelle
aus zeitlich beobachtet, wie in Material und Methoden beschrieben.
Die Daten sind Mittelwerte +/– SA
von 5 Mäusen pro
Gruppe. Dieses Experiment wurde fünf mal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
Feld B: Mikroskopische Aufnahme der BALB/c-Maus, 7 Tage nach Injektion
von Ov-ASP-2/MBP. Der Stern gibt die Injektionsstelle an.
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6 zeigt
die von den Ov-ASP-2/MBP-Fusionsproteinen hervorgerufene Spezifität der angiogenen Reaktion.
BALB/c-Mäusen
wurde Ov-ASP-1/MBP, Ov-ASP-2/MBP,
Ov-PDI-/MBP oder MBP allein in das Corneastroma injiziert. Die dargestellten
Ergebnisse stammen von Tag 3 nach der Injektion und stellen den
Mittelwert +/– SA
von 5 Mäusen
pro Gruppe dar. Dieses Experiment wurde fünf mal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
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7 stellt
die Histologie der Maus-Cornea 7 Tage nach der Injektion von Ov-ASP-2/MBP
dar. Zahlreiche Blutgefäße liegen
in der Corneastroma vor (große
Pfeile), aber es sind nur gelegentlich mononucläre Zellen (kleine Pfeile) vorhanden.
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Die
mikroskopische Aufnahme ist für
5 Tiere pro Gruppe und 5 reproduzierte Experimente repräsentativ.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt Mittel zum Induzieren der Angiogenese
in einem Gewebe bereit, wobei das Gewebe mit einer Menge von Ov-ASP
in Kontakt gebracht wird, die wirksam ist, um die Angiogenese indem
Gewebe zu induzieren. Wie hier verwendet, wird der Begriff „Ov-ASP" verwendet, um Mitglieder
der Ov-ASP-Proteinfamilie und Analoga davon sowie Homologe aus anderen
Spezies, die die Angiogenese induzieren, zu bezeichnen. Mitglieder
der Ov-ASP-Proteinfamilie schließen Ov-ASP-1, Ov-ASP-2 und
Ov-ASP-3 ein. Analoga von Ov-ASP schließen beispielsweise eine funktionale
Variante des Wildtyp-Ov-ASP-Proteins, das biologische Ov-ASP-Aktivität besitzt,
sowie ein Fragment von Ov-ASP mit biologischer Ov-ASP-Aktivität ein. Wie
ferner hier verwendet, bezieht sich der Begriff „biologische Ov-ASP-Aktivität" auf Ov-ASP-Aktivität, die die
Angiogenese induziert.
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Nach
der vorliegenden Erfindung kann das Inkontaktbringen des Gewebes
mit Ov-ASP durch Einführen
einer Ov-ASP codierenden Nucleinsäure auf eine Weise, die die
Expression des Ov-ASP-Proteins erlaubt, oder durch Einführen des
Ov-ASP-Proteins selbst erfolgen. Die vorliegende Erfindung kann
auch verwendet werden, um die Angiogenese in vivo oder in vitro
zu induzieren.
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Gewebe
kann mit Ov-ASP in Kontakt gebracht werden, indem eine Ov-ASP codierende
Nucleinsäure auf
eine Weise in das Gewebe eingeführt
wird, die die Expression von Ov-ASP erlaubt. Die Ov-ASP codierende
Nucleinsäure
kann genomische DNA oder cDNA sein. Die Nucleinsäure kann unter Verwendung von
im Fachgebiet bekannten, herkömmlichen
Verfahren, einschließlich
ohne Einschränkung
Elektroporation, DEAE-Dextrantransfektion, Calciumphosphattransfektion,
monokationischer Liposomenfusion, polykationischer Liposomenfusion,
Protoplastenfusion, Erzeugen eines elektrischen Felds in vivo, Bombardierung
mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen, Injektion mit rekombinanten
replikationsdefekten Viren, homologer Rekombination, Gentherapie,
viraler Vektoren oder Transfer nackter DNA oder einer Kombination
davon erfolgen. Dem Fachmann sollte bewusst sein, dass jedes der
vorstehenden DNA-Transfer-Verfahren kombiniert werden kann.
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Eine
Ov-ASP codierende Nucleinsäure
kann in ein Gewebe oder ein Individuum unter Verwendung von Gentherapie
eingeführt
werden, z.B. durch Einführung
eines rekombinanten Vektors, der eine Ov-ASP codierende Nucleinsäuresequenz
enthält.
Die Nucleinsäuresequenz
kann beispielsweise genomische DNA oder cDNA sein. Der rekombinante
Vektor, der eine Ov-ASP codierende Nucleinsäuresequenz enthält, kann
einem Individuum unter Verwendung zahlreicher, dem Fachmann bekannter
Verfahren verabreicht werden, einschließlich ohne Einschränkung Elektroporation,
DEAE-Dextrantransfektion,
Calciumphosphattransfektion, monokationischer Liposomenfusion, polykationischer
Liposomenfusion, Protoplastenfusion, Erzeugen eines elektrischen
Felds in vivo, Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen, Injektion
mit rekombinanten replikationsdefekten Viren, homologer Rekombination,
Gentherapie, viraler Vektoren oder Transfer nackter DNA oder einer
Kombination davon. Dem Fachmann sollte bewusst sein, dass jedes
der vorstehenden DNA-Transfer-Verfahren kombiniert werden kann.
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Der
rekombinante Vektor kann eine Nucleinsäure eines Virusgenoms umfassen
oder mindestens einem Teil davon entsprechen, wobei dieser Anteil
die Expression der Ov-ASP codierenden Nucleinsäuresequenz lenken kann, funktional
an die Virus-Nucleinsäure
gebunden ist und als funktionales Genprodukt in dem Gewebe oder
Individuum exprimiert werden kann. Rekombinante virale Vektoren,
die für
die Gentherapie geeignet sind, können
von einer Vielfalt viraler Nucleinsäuren stammen, die dem Fachmann
bekannt sind, einschließlich
ohne Einschränkung,
der Genome der Retroviren, des HSV, Adenovirus, Adeno-assoziierten
Virus, Semiliki-Forest-Virus, Cytomegalievirus, Vacciniavirus und
der DNA- und RNA-Viren.
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Die
rekombinanten Vektoren können
auch eine Nucleotidsequenz enthalten, die geeignete regulatorische
Elemente codiert, um die Expression des Vektorkonstrukts in einer
geeigneten Wirtszelle zu bewirken. Wie hier verwendet, bezeichnet „Expression" die Fähigkeit
des Vektors, die eingebaute DNA-Sequenz in mRNA zu transkribieren,
so dass die Synthese des Proteins, das von der eingebauten Nucleinsäure codiert wird,
erfolgen kann. Dem Fachmann ist bewusst, dass eine Vielfalt von
Enhancern und Promotoren zum Einsatz in den in der Erfindung verwendeten
Konstrukten geeignet ist und dass die Konstrukte die erforderlichen Start-,
Terminations- und Kontrollsequenzen für die richtige Transkription
und Prozessierung der Ov-ASP codierenden Nucleinsäuresequenz
enthalten, wenn das rekombinante Vektorkonstrukt in ein Individuum
eingeführt
wird. Vektoren, die zur Expression der Ov-ASP codierenden Nucleinsäuresequenz
geeignet sind, sind dem Fachmann gut bekannt.
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Geeignete
Promotoren schließen
ein, sind jedoch nicht begrenzt auf konstitutive Promotoren, gewebespezifische
Promotoren und induzierbare Promotoren. Die Expression der Ov-ASP
codierenden Nucleinsäuresequenz
kann von dem bestimmten Vektor, in den die Nucleinsäuresequenz
eingeführt
wurde, kontrolliert und beeinflusst werden. Einige eukaryontische
Vektoren wurden konstruiert, so dass sie in der Lage sind, eingebaute
Nucleinsäuren
innerhalb der Zielzelle in hohem Ausmaß zu exprimieren. Derartige
Vektoren nutzen einen der zahlreichen starken Promotoren, um das
hohe Expressionsniveau zu lenken. Eukaryontische Vektoren verwenden
Promotor-Enhancer-Sequenzen
viraler Gene, insbesondere diejenigen von Tumorviren. Eine besondere
erfindungsgemäße Ausführungsform
stellt die Regulierung der Expression der Ov-ASP codierenden Nucleinsäuresequenz
bereit, wobei induzierbare Promotoren verwendet werden. Nicht begrenzende
Beispiele für
induzierbare Promotoren schließen
ein, sind aber nicht begrenzt auf Methallothionein-Promotoren und
Maus-Mammatumor-Virus-Promotoren. Abhängig vom Vektor würde die
Expression der Ov-ASP codierenden Nucleinsäuresequenz im Gewebe eines
Individuums durch Zugabe einer spezifischen Verbindung zu einem
bestimmten Zeitpunkt im Wachstumszyklus der Zellen des Individuums
induziert werden. Weitere Beispiele für Promotoren und Enhancer,
die beim Einsatz in den rekombinierten Vektoren effektiv sind, schließen ein,
sind aber nicht begrenzt auf CMV (Cytomegalievirus), SV40 (Affen-Virus
40) HSV (Herpes-Simplex-Virus), EBV (Epstein-Barr-Virus), retrovirale,
adenovirale Promotoren und Enhancer und tumorzellspezifische Promotoren
und Enhancer.
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Für die Zwecke
des Gentransfers in ein Gewebe oder in ein Individuum kann ein rekombinanter
Vektor, der eine Ov-ASP codierende Nucleinsäure enthält, mit einer sterilen wässrigen
Lösung
kombiniert werden, die vorzugsweise mit dem Blut des Empfängers isotonisch
ist. Derartige Formulierungen können
durch Suspendieren des rekombinanten Vektors in Wasser hergestellt
werden, das physiologisch kompatible Substanzen wie Natriumchlorid,
Glycin und dergleichen enthält
und einen gepufferten pH-Wert aufweist, der mit physiologischen
Bedingungen kompatibel ist, um eine wässrige Lösung herzustellen, wobei eine
derartige Lösung
sterilisiert wird. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
wird der rekombinante Vektor bei der Herstellung zur Einführung in
ein Individuum mit 20–25%-iger
Saccharose in Salzlösung
kombiniert.
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Es
liegt in den Grenzen der vorliegenden Erfindung, dass die Ov-ASP
codierende Nucleinsäure
unter Verwendung herkömmlicher
Verfahren in geeignete Zellen in vitro eingeführt werden kann. Zellen, die
Ov-ASP exprimieren, können
dann in das Gewebe eines Individuums eingeführt werden, um Angiogenese
zu induzieren. Zur Verringerung der Abstoßung werden die Zellen vorzugsweise
aus dem Individuum entnommen, DNA-Verfahren unterzogen, um die Ov-ASP
codierende Nucleinsäure
einzubauen, und dann in das Individuum wieder eingeführt.
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Die
Ov-ASP codierende Nucleinsäure
oder die Ov-ASP codierende Nucleinsäure, die in einem Vektor enthalten
ist, wird in das Gewebe eines Individuums in einer Menge eingeführt, die
wirksam ist, um Angiogenese in dem Gewebe zu induzieren. Die genaue
Dosierung hängt
jedoch von derartigen Faktoren wie dem Zweck der Verabreichung,
der Art der Verabreichung und der Wirksamkeit der Zusammensetzung
sowie den individuellen pharmakokinetischen Parametern des Individuums
ab. Derartige Therapien können
so häufig
wie notwendig und für
den als notwendig bestimmten Zeitraum vom Fachmann verabreicht werden.
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In
der vorliegenden Erfindung kann das Gewebe auch mit Ov-ASP in Kontakt
gebracht werden, indem in das Gewebe ein Ov-ASP-Protein eingeführt wird.
Das Ov-ASP-Protein kann synthetisch oder rekombinant produziert
werden oder kann aus nativen Zellen isoliert werden; jedoch wird
es vorzugsweise rekombinant produziert, wobei cDNA, die Ov-ASP (Ov-asp-1:
GenBank-Hinterlegungsnummer
AF02586; Ov-asp-2: GenBank-Hinterlegungsnummer H39490 und Ov-asp-3:
GenBank-Hinterlegungsnummer AA917267) codiert, wobei herkömmliche
Verfahren verwendet werden. Wie hier verwendet, besitzen die Ov-ASP-1-,
Ov-ASP-2- und Ov-ASP-3-Proteine die in 1 dargelegten
Aminosäuresequenzen.
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Das
Ov-ASP-1-Protein kann in das Gewebe eines Individuums durch bekannte
Verfahren in vivo eingeführt
werden, die zum Einführen
der Proteine verwendet werden, einschließlich beispielsweise Injektion, Transfusion
oder topischer Anwendung. Die Injektion oder Transfusion von Ov-ASP
kann beispielsweise intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös oder subkutan
durchgeführt
werden. Wenn das Gewebe in einem Individuum auf einen bestimmten
Teil des Körpers
des Individuums örtlich
begrenzt ist, kann es wünschenswert
sein, das Protein in das Gewebe durch ortsgerichtete Injektion in
ein spezifisches Organ oder durch einige andere Mittel (z.B. durch
Einführen
von Ov-ASP in das Blut oder eine andere Körperflüssigkeit) direkt einzuführen. Die
Menge des zu verwendenden Ov-ASP-Proteins ist eine Menge, die wirksam
ist, um die Angiogenese zu induzieren, und kann leicht vom Fachmann
bestimmt werden.
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Die
Fähigkeit
von Ov-ASP, die Neovaskularisierung zu induzieren, macht Ov-ASP
besonders nützlich für die Behandlung
von Individuen, die an Krankheiten oder Zuständen leiden, die einer Angiogenese
bedürfen.
Das Individuum ist vorzugsweise ein Säuger (z.B. Menschen, Haustiere
und Tiere für
die kommerzielle Nutzung) und am meisten bevorzugt ein Mensch. Man
glaubt, dass durch die Induzierung der Angiogenese Ov-ASP nützlich für die Behandlung
von Krankheiten oder Zuständen
ist, bei denen die Verbesserung oder Förderung der Angiogenese wünschenswert
ist. Man glaubt ferner, dass Ov-ASP entweder allein oder in Kombination
mit Therapeutika (z.B. Chemotherapeutika oder antiviralen Agenzien)
oder angiogenen Faktoren (z.B. Agenzien, die Angiogenese induzieren,
verstärken
oder fördern)
wirksam wäre,
die bei der Behandlung dieser Krankheiten oder Zustände verwendet
werden.
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Nicht
begrenzende Beispiele für
Gewebe, in die Ov-ASP zur Induzierung der Angiogenese eingeführt werden
kann, schließen
Herz-, cerebrovaskuläres, Endothel-,
Epithel-, fibröses,
Muskel-, transplantiertes, vaskuläres, vesikuläres und
verletzte Gewebe ein. Transplantierte Gewebe sind beispielsweise
Herz, Leber, Lunge, Niere und Augengewebe. Die Gewebe, in die Ov-ASP
eingeführt
werden kann, um Angiogenese zu induzieren, schließen ferner
diejenigen ein, die mit Krankheiten oder Zuständen assoziiert sind, bei denen
die Induzierung oder Förderung
der Angiogenese wünschenswert
wäre, einschließlich ohne
Einschränkung
von Kreislaufstörungen,
angeborener Herzerkrankung, Ischämie,
myokardialer Erkrankung, myokardialen ischämischen Störungen, Organtransplantation,
perikardialer Erkrankung, Hauttransplantationen und Gefäßstörungen.
Beispiele für
Ischämie
schließen
ohne Einschränkung
cerebrovaskuläre
Ischämie,
myokardiale Ischämie und
venookklusive Erkrankung ein. Ein Beispiel für myokardiale Ischämie ist
die koronare Arterienerkrankung.
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass Ov-ASP die
Angiogenese induziert. Daher kann Ov-ASP verwendet werden, um verschiedene,
mit der Angiogenese assoziierte biologische Prozesse zu beschleunigen
oder zu verbessern. Beispielsweise kann Ov-ASP verabreicht werden,
um die Wundheilung und Organtransplantation einschließlich der
Transplantation künstlicher
Organe zu verbessern. Daher werden ein Verfahren zur Verbesserung
der Wundheilung in einem Individuum durch Verabreichung von Ov-ASP
und ein Verfahren zur Verbesserung der Organtransplantation in einem
Individuum durch Verabreichung von Ov-ASP beschrieben. Außerdem kann
Ov-ASP verwendet werden, um die Beschichtung von Gefäßtransplantaten
mit Endothelzellen zu beschleunigen, um ein Transplantatversagen
aufgrund von Reokkulsion zu verhindern. Es kann auch verabreicht
werden, um Hauttransplantationen zu verbessern. Daher werden auch
ein Verfahren zur Beschleunigung der Bedeckung von Gefäßtransplantaten
mit Endothelzellen in einem Individuum durch Verabreichung von Ov-ASP
und ein Verfahren zur Verbesserung von Hauttransplantationen in
einem Individuum durch Verabreichung von Ov-ASP beschrieben. Ov-ASP
in Form einer Nucleinsäure,
eines rekombinanten Vektors, der die Ov-ASP codierende Nucleinsäure enthält, oder
eines Proteins kann nach den vorstehend beschriebenen, verschiedenen Einführungsverfahren
und in den vorstehend beschriebenen, verschiedenen Mengen verabreicht
werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Durchmusterung
nach einem anti-Ov-ASP-Faktor bereit. Ein „anti-Ov-ASP-Faktor" ist ein natürliches
oder synthetisches Agens, das Ov-ASP antagonisiert, indem die biologische
Ov-ASP-Aktivität
(d.h. die angiogene Ov-ASP-Aktivität) erniedrigt oder gehemmt
wird. Es liegt auch in den Grenzen der vorliegenden Erfindung, dass
ein anti-Ov-ASP-Faktor ein natürliches
oder synthetisches Agens ist, das andere angiogene Faktoren (z.B.
Agenzien, die Angiogenese induzieren, verbessern oder fördern),
einschließlich
Analoga oder Homologa von Ov-ASP, antagonisiert, indem ihre angiogene
Aktivität
erniedrigt oder gehemmt wird. Der anti-Ov-ASP-Faktor kann in Form
eines Antikörpers,
eines Fab-Fragments, eines F(ab')2-Fragments, eines Peptids, eines Polypeptids,
eines Proteins und von allen Kombinationen davon vorliegen. Ein
Fab-Fragment ist ein univalentes, antigenbindendes Fragment eines Antikörpers, das
durch Papainverdau hergestellt wird. Ein F(ab')2-Fragment
ist ein divalentes, antigenbindendes Fragment eines Antikörpers, das
durch Pepsinverdau hergestellt wird. Beispielweise kann der anti-Ov-ASP-Faktor
ein Antikörper
sein, der mit Ov-ASP reagiert. Alternativ kann der anti-Ov-ASP-Faktor
ein Enzym sein, das mit Ov-ASP
reagiert. Wie hier verwendet, bedeutet „reaktiv", dass der anti-Ov-ASP-Faktor Affinität für Ov-ASP
besitzt, daran bindet oder dagegen gerichtet ist.
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Wie
hier verwendet, kann der Antikörper
polyclonal oder monoclonal sein und kann durch dem Fachmann gut
bekannte Verfahren produziert werden. Polyclonale Antikörper können beispielsweise
durch Immunisierung einer Maus, eines Kaninchens oder einer Ratte
mit gereinigtem Ov-ASP produziert werden. Monoclonale Antikörper können dann
durch Entfernen der Milz aus der immunisierten Maus und Fusionieren
der Milzzellen mit Myelomzellen produziert werden, so dass ein Hybridom
erzeugt wird, das, wenn es in Kultur gezüchtet wird, einen monoclonalen
Antikörper
produziert. Der Antikörper
der vorliegenden Erfindung schließt auch einen humanisierten
Antikörper
ein, der nach den im Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt
wird.
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Ein
anti-Ov-ASP-Faktor kann unter Verwendung von in-vitro-Tests durchmustert
werden. Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ein anti- Ov-ASP-Faktor durchmustert
werden, indem ein Faktor von Interesse mit Ov-ASP in Kontakt gebracht wird und dann
die Fähigkeit
des Faktors beurteilt wird, die angiogene Aktivität von Ov-ASP
zu hemmen. Beispielsweise kann ein Cornea-Test verwendet werden,
um nach einem anti-Ov-ASP-Faktor zu durchmustern. Ein Agens von
Interesse kann mit Cornea-Gewebe oder Zellen in Kontakt gebracht
werden, die Ov-ASP enthalten, dann können das Cornea-Gewebe oder die Zellen
beurteilt werden, um zu bestimmen, ob das Agens von Interesse die
Angiogenese oder Neovaskularisierung im Cornea-Gewebe oder in den
Zellen verringert oder hemmt. Außerdem kann beim Einsatz eines ähnlichen
Verfahrens, ein in-vitro-Test unter Verwendung von menschlichen
Gefäßendothelzellen
oder menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) genutzt
werden, um nach einem anti-Ov-ASP-Faktor zu durchmustern. Ein anti-Ov-ASP-Faktor,
der durch das vorstehend beschriebene Durchmusterungsverfahren identifiziert wird,
wird ebenfalls von der vorstehenden Erfindung bereitgestellt.
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Die
vorliegende Anmeldung beschreibt Mittel zur Hemmung der Angiogenese
in einem Individuum. Die Anmeldung beschreibt die Verabreichung
einer Menge eines anti-Ov-ASP-Faktors an ein Individuum, die wirksam
ist, um die Angiogenese in dem Individuum zu hemmen. Die zur Hemmung
der Angiogenese erforderliche anti-Ov-ASP-Faktor-Menge kann vom
Fachmann leicht bestimmt werden. Das vorliegende Verfahren zur Hemmung
der Angiogenese in einem Individuum wäre nützlich zur Behandlung eines
Individuums mit einer Krankheit oder einem Zustand, bei der/dem
die Hemmung der Angiogenese wünschenswert
wäre, einschließlich ohne
Einschränkung
Arthritis, Erkrankung der Cornea, diabetischer Retinopathie, pyogener
Granulome, hypertropher Narben, Entzündung, Karposi-Sarkom, Leberzirrhose,
benigner Neoplasie (z.B. Hämangiome), maligner
Neoplasie (z.B. Hautkrebs, Entartungen der Haut und andere Entartungen),
Onchozerkose, Psoriasis, Wachstum fester Tumore, metastierender
Ausbreitung fester Tumore und Warzen. Der anti-Ov-ASP-Faktor kann
in einer Menge verabreicht werden, die wirksam ist, um die Angiogenese
in dem Individuum zu hemmen. Diese Menge kann vom Fachmann leicht
bestimmt werden.
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Es
wird auch ein Arzneimittel erwähnt,
das einen anti-Ov-ASP-Faktor und einen pharmazeutisch verträglichen
Träger
umfasst. Der pharmazeutisch verträgliche Träger muss in dem Sinne „verträglich" sein, dass er mit
den anderen Bestandteilen der Zusammensetzung kompatibel ist und
nicht für
dessen Empfänger schädlich ist.
Beispiele für
pharmazeutisch verträglichen
Trägern
schließen
unter anderem Carboxymethylcellulose, kristalline Cellulose, Glycerin,
Gummi arabicum, Lactose, Magnesiumstearat, Methylcellulose, Pulver, Salzlösung, Natriumalginat,
Saccharose, Stärke,
Talkum und Wasser ein. Formulierungen des Arzneimittels können in
geeigneter Weise in einer Einheitsdosierung vorgelegt werden. Die
Formulierungen können
durch im pharmazeutischen Fachgebiet gut bekannte Verfahren hergestellt
werden. Der Wirkstoff kann beispielsweise mit einem Träger oder
Verdünnungsmittel
wie einer Suspension oder Lösung
in Verbindung gebracht werden. Fakultativ können auch ein oder mehrere
Zusatzstoffe (z.B. Puffer, Geschmacksstoffe, grenzflächenaktive Agenzien
und dergleichen) zugegeben werden. Die Wahl des Trägers hängt vom
Verabreichungsweg ab. Das Arzneimittel wäre nützlich zur Verabreichung des
anti-Ov-ASP-Faktors an ein Individuum, um eine Krankheit oder einen
Zustand zu behandeln, bei der/dem die Hemmung der Angiogenese wünschenswert
wäre, einschließlich ohne
Einschränkung
benigner Neoplasie, maligner Neoplasie und Onchozerkose. Wo das
Arzneimittel einem Individuum verabreicht werden soll, um die Angiogenese
zu hemmen, wird der anti-Ov-ASP-Faktor
in einer Menge bereitgestellt, die wirksam ist, um die Angiogenese
in dem Individuum zu hemmen. Diese Menge kann vom Fachmann leicht
bestimmt werden.
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Die
vorliegende Erfindung wird im folgenden Abschnitt Experimentelle
Details beschrieben, der dargelegt wird, um das Verständnis für die Erfindung
zu unterstützen,
und er sollte nicht dahingehend ausgelegt werden, dass er in irgendeiner
Weise den Umfang der Erfindung, wie in den sich daran anschließenden Patentansprüchen definiert,
einschränkt.
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Experimentelle Details
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I. Einführung
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Die
Onchozerkose der Augen (Flussblindheit) tritt hauptsächlich als
Folge einer Entzündungsreaktion des
Wirts auf tote oder absterbende Onchocera volvulus (O. volvulus)-Würmer im
Auge auf. In der Cornea manifestiert sich diese Reaktion zuerst
in der Entwicklung neuer Blutgefäße (Neovaskularisierung)
und später
in der Trübung
der Cornea. Tiermodelle haben gezeigt, dass die Entwicklung der
O. volvulus-vermittelten Entzündung
der Cornea (Keratitis) auf die zeitliche Rekrutierung von Neutrophilen
und Eosinophilen zur Cornea über
das Netzwerk neuer Blutgefäße zurückzuführen ist.
Der Entzündungsprozess
hängt von
der Entwicklung einer systemischen Reaktion vom T-Helfer-Typ 2 (Th2)-Typ
auf die Parasiten-Antigene ab [1–4]. Jedoch versteht man derzeit
sehr wenig von den Mechanismen, durch die der Parasit die Neovaskularisierung
der Cornea – das
grundlegende Ereignis im pathologischen Prozess – induzieren kann.
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Das
Fadenwurm-Genomprojekt begann kürzlich
mit der Entwicklung einer Genbank mit exprimierten sequenzmarkierten
Stellen (ESTs) aus O. volvulus [5]. Eine der am reichlichsten vorhandenen
cDNAs, die in infektiösen
Larven identifiziert wurde, codiert ein Protein, das einen signifikanten
Grad an Ähnlichkeit
mit dem Vespidae-Gift-Antigen 5 [6] und dem sekretierten Hauptprotein
von infektiösen
Ancylostoma caninum (A. caninum)-Larven aufweist [7]. Dieses Protein
wurde als Ov-asp-1 (für
Aktivierungsassoziiertes Sekretiertes Protein von O. volvulus) bezeichnet.
Die Vespidae-Gifte (Bienen- und Hornissengifte) sind wichtige Allergene
für Menschen.
Ferner weist das Vespidae-Gift-Antigen 5 Ähnlichkeiten mit den hodenspezifischen
Protein (Tpx)-/cysteinreichen sekretierten Protein (CRISP)-Proteinfamilien auf
[8]. Diese Proteinfamilien schließen ein Hauptautoantigen des
Säugerspermaacrosoms
ein, und man findet sie in vielen anderen Wirbeltiergeweben [8,
9].
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Da
die Ov-ASPs einer Komponente der Vespidae-Gifte ähneln und die Vespidae-Gifte
sowohl allergene als auch Entzündungsreaktionen
induzieren können
[10], wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese Proteine bei der
Entwicklung der Onchozerkose der Augen eine Rolle spielen könnten. In
der aktuellen Studie legen die Erfinder Daten vor, die zeigen, dass
zwei Ov-ASP-Proteine
eine angiogene Reaktion in naiven Maus-Corneas induzieren, so dass
nahe gelegt wird, dass diese Proteine eine direkte Rolle bei der
Pathogenese der Onchozerkose der Augen spielen könnten, möglicherweise indem sie die
Neovaskularisierung während
der Knötchenbildung
fördern.
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2. Material und Methoden
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A. Clonierung und Expression der Ov-asp-cDNAs
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Die
Erfinder isolierten früher
durch Immunscreening einer L3-cDNA-Expressionsgenbank (OvB93-RP, GenBank-Hinterlegungsnummer
AF020586) eine cDNA, die ein Mitglied der Ov-ASP-Proteinfamilie
codiert. Die isolierte cDNA wurde als Ov-asp-1 bezeichnet. Die vollständigen Nucleotidsequenzen
der beiden anderen Mitglieder der Ov-asp-Familie wurden als Teil
des O. volvulus-EST-Sequenzierprojekts
identifiziert und wurden als Ov-asp-2 (GenBank-Hinterlegungsnummer H39490) und Ov-asp-3
(GenBank-Hinterlegungsnummer AA917267) bezeichnet. Die hier genannten
Erfinder konstruierten drei Primersätze, die den vollständigen offenen
Leserahmen von jedem der Clone mit EcoRI-Schnittstellen an ihren 5'-Enden flankieren,
um die nachfolgende Clonierung zu erleichtern. Die Nucleotidsequenzen
der Primer waren wie folgt:
Ov-asp-1 exp-f: 5'-GGAATTCCATATGATACTTTTCATCATCTTC-3'
Ov-asp-1 exp-r:
5'-TCATTTTCTGCACAGTCCAGA3'
Ov-asp-2 exp-f:
5'-GGATTCCATATGATACTTTTTCTCATCTC-3'
Ov-asp-2 exp-r:
5'-CATAATAACTACTAAATATATACGT-3'
Ov-asp-3 exp-f
5'-GGAATTCCATATGATACTTTTCATCATCTTC-3'
Ov-asp-3 exp-r:
5'-TCATTTTTTGCACAATCCAGA-3'
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Die
Primerpaare wurden zur Amplifizierung der entsprechenden cDNAs aus
einer cDNA-Genbank von O. volvulus-Larven (SAW94WL-OvL3) verwendet.
Die Amplifizierungsreaktionen erfolgten in einem Gesamtvolumen von
200 μl in
einem Gemisch, enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 2 mM MgSO4, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)SO4, 0,1% Triton X100, 100 μg/ml Rinderserumalbumin, 200 μM dNTPs,
0,5 μM jedes
Primers, 5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Sigma Chemical, St. Louis,
MO) und 2,5 Einheiten Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene, LaJolla, KA).
Die Zyklusbedingungen bestanden aus einer Anfangsdenaturierung von
5 min bei 95°C, gefolgt
von 40 Zyklen, die jeweils aus 45 sec bei 95°C, 1 min bei 50°C und 1 min
bei 72°C
bestanden. Die Reaktion wurde mit einem abschließenden Schritt von 7 min bei
72°C beendet.
Die Reaktionsprodukte wurden in den TA-Clonierungsvektor (Invitrogen,
Carlsbad, KA) nach den Anweisungen des Herstellers cloniert. Einzelne
Clone, die die Polymerasekettenreaktions (PCR)-Produkte enthielten,
wurden isoliert, und ihre DNA-Sequenzen wurden bestimmt, um sicherzustellen,
dass der Amplifizierungsvorgang keine Mutationen einführte. Insertionen
von Clonen mit richtigen Sequenzen, die den drei Ov-ASP-Proteinen
entsprachen, wurden durch Verdau mit EcoRI herausgeschnitten und
in den pMALCRI-Expressionsvektor (New England Biolabs, Beverly, MA)
subcloniert. Die Produktion von rekombinanten, maltosebindendes
Protein (MBP)-Fusionsproteinen wurde in E. coli unter Verwendung
von 1 mM IPTG induziert. Die Fusionsproteine wurden durch Amylose-Affinitätschromatographie
gereinigt, wie früher
beschrieben [11]. Die Erträge
aus den Ov-ASP-1/MSP und Ov-ASP-2/MBP-Zubereitungen lagen im Bereich
von 1–2
mg Protein pro Liter, und das gereinigte Protein war zu 80–90% homogen,
wie durch SDS-PAGE beurteilt wurde (Daten nicht gezeigt). Induzierte
Kulturen, die Ov-ASP-3/MSP
exprimierten, produzierten kein stabiles Fusionsprotein.
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B. Genbank-Polymerasekettenreaktionen
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Um
das Expressionsmuster der drei Ov-asp-Transkripte zu untersuchen,
wurden genspezifische Primer zur Amplifizierung eines etwa 400 bp-Fragments
der 3'-Region von
jedem der cDNA-Clone konstruiert. Die Amplifizierungen erfolgten
auch unter Verwendung von Primern für eine cDNA, die das glycolytische
Enzym Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (Ov-gpd-1) codiert,
als interne Kontrolle. Die verwendeten genspezifischen Primer waren:
Ov-asp-1-f:
5'-AAAACTGCTGGTACGGA-3'
Ov-asp-1-r:
5'-CGAGAATTAAATGAAGAAAAGCG-3'
Ov-asp-2-f:
5'-GTTTACACCCAGCGGTCAGATAC-3'
Ov-asp-2-r:
5'-CCAAAAATTAAATGAAGAAATTCAATTTGC-3'
Ov-asp-3-f:
5'-CGCCTTAGGGTTACCAAAAGATG-3'
Ov-asp-3-r:
5'-CAAAAATTAAATGAAGTGAAACG-3'
Ov-gpd-1-f
: 5'-TGATCTCACTTGCCGACTGC-3'
Ov-gpd-1-r:
5'-AAGGTGTTGTCAGAAGGC-3'
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Die
PCR-Amplifizierungen erfolgten mit 10 μl-Aliquots von jeder amplifizierten
O. volvulus-cDNA-Genbank aus Microfilarien (mf) (SAW98MLW-OvMf),
Larven im zweiten Stadium (L2) (SAW98MLW-OvL2), Larven im dritten
Stadium (L3) (SAW94WL-OvL3), sich häutenden Larven im dritten Stadium
(mL3) (SL96MLW-OvmL3),
Larven im vierten Stadium (L4) [12], erwachsenen Männchen (SAW98MLW-OvAM)
und erwachsenen Weibchen [12] unter Verwendung der genspezifischen
Primerpaare. Nach einer 5-minütigen
Anfangsdenaturierung wurden 35 Amplifizierungszyklen unter Verwendung
von Taq-DNA-Polymerase (Promega, Madison, WI) unter den folgenden
Zyklusbedingungen durchgeführt:
1 min bei 95°C,
1 min bei 50°C
und 1 min bei 72°C.
Die PCR-Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert.
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C. Southern-Blots
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Die
Southern-Blots wurden aus mit BamHI und HindIII gespaltenen menschlichen
genomischen und genomischen O. volvulus-DNA-Proben hergestellt,
wie früher
beschrieben [11]. Der Blot wurde anschließend mit gereinigter Insertions-DNA
aus einem Clon, der den offenen Leserahmen von Ov-asp-2 codiert,
und dann mit einem gereinigten DNA-Fragment sondiert, das einen
Teil der O. volvulus-Prolyl-4-hydroxylase codiert. Der mit der Ov-asp-2-Insertion sondierte
Blot wurde bei Bedingungen moderater Stringenz gewaschen (0,4 × SSC, 1%
SDS bei 48°C),
während
der mit der O. volvulus-Prolyl-4-hydroxylase-Insertion
hybridisierte Blot bei hoher Stringenz (0,2 × SSC, 1% SDS bei 65°C) gewaschen
wurde.
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D. DNA-Sequenzanalyse
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Signalsequenzen
und vermeintliche Schnittstellen wurden unter Verwendung des Signale-Servers (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP)
identifiziert, wobei das von Heijne-Verfahren verwendet wurde [13]. Die
Peptidsequenzen wurden unter Verwendung des Gibbs-Sampler-Algorithmus
des MACAW-Programmpakets ausgerichtet [14]. Die phylogenetischen
Analysen erfolgten bei den ausgerichteten Sequenzen unter Verwendung
des Branch-and-Bound-Algorithmus, den man im PAUP-Programmpaket
findet [15]. Die phylogenetische Analyse war auf die Aminosäuren beschränkt, die
sich von Position 24 bis zum Ende des Proteins erstreckten, um die
vermeintlichen Signalsequenzen zu beseitigen. Lücken, die während des Ausrichtungsvorgangs
eingeführt
wurden, wurden nicht als Merkmalszustände betrachtet. Die statistische
Stützung
für die
Phylogenie erfolgte mit der Bootstrap-Reanalyse von 1000 replizierten
Datensätzen.
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E. Beurteilung der angiogenen Aktivität
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Die
neovaskuläre
Reaktion in den Corneas wurde durch Spaltlampenuntersuchung unter
Verwendung des von Kenyon et al. beschriebenen Verfahrens bestimmt
[16]. Kurz gesagt wurden Corneas von 4- bis 6-Wochen alten BALB/c-Mäusen, erhalten
von Jackson Laborstories (Bar Harbor, ME), 30 μg jedes rekombinanten Proteins
in 10 μl
steriler, endotoxinfreier Hanks gepufferter Salzlösung (Life
Technologies, Gaithersburg, MD) injiziert. Das Wachstum neuer Gefäße wurde
durch Messen der Gefäßlänge vom
Limbus bis zur Injektionsstelle unter Verwendung eines linearen
Gitternetzes und durch Abschätzen
der angrenzenden umgebenden Zone der Neovaskularisierung als „Zeitstunde" (30° des Bogens
= 1 Zeitstunde) gemessen.
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F. Histologie
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Die
Augen wurden entnommen, über
Nacht in 10% Formaldehyd fixiert, mit Standardverfahren bearbeitet
und in Paraffin eingebettet. Die Schnitte (5 μm) wurden mit Hämatoxylin
und Eosin gefärbt,
und die Anwesenheit von Blutgefäßen in der
Cornea wurde durch Lichtmikroskopie festgestellt.
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3. Ergebnisse
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Durch
Immunscreening einer O. volvulus-L3-cDNA-Genbank isolierten die
Erfinder zuvor cDNA, die ein Protein codiert, das der Familie der
Vespidae-Allergen-Antigene ähnelt. Die
O. volvulus-EST-Sequenzierinitiative hat auch zahlreiche unterschiedliche
Clone mit einem signifikanten Homologiegrad zum Vespidae-Gift Antigen
5-Protein [17], zu Mitgliedern der Tpx- und CRISP-Proteinfamilien und
zu einem sekretierten Hauptantigen von infektiösen Ancylostoma caninum-Larven
identifiziert [7].
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Diese
Sequenzen wurden in eine Proteinfamilie eingeordnet, die als Ov-ASP
(für Aktivierungsassoziierte.
Sekretierte Proteine von Onchocerca volvulus) bezeichnet werden.
Die cDNAs mit der vollständigen
Länge,
welche die drei Mitglieder der Ov-ASP-Familie codieren, wurden durch PCR-Amplifizierung
aus der aus infektiösen
O. volvulus-Larven hergestellten cDNA-Genbank isoliert, wie in Material
und Methoden beschrieben. Die von den drei Mitgliedern der Ov-ASP-Familie
abgeleiteten Aminosäuresequenzen
sind in 1 dargestellt. Alle drei Proteine
besitzen Merkmale, die den Mitgliedern der Tpx- und CRISP-Proteinfamilie ähneln. Die
Ov-ASPs sind zu 54–62%
miteinander identisch und enthalten 6 der 10 konservierten Cysteinreste,
die man bei den Wirbeltier-Mitgliedern der Tpx-Proteinfamilie findet. Alle drei Mitglieder
der Ov-ASP-Familie enthalten vermeintliche Signalsequenzen an ihren
aminoterminalen Enden. Zusätzlich
enthalten die drei Ov-ASPs die Sequenz HFTQ oder eine eng verwandte
Variante (NFTQ), die eine konservierte Variation der HYTQ-Sequenz
ist, die man bei den meisten Mitgliedern der CRISP-Familie findet
[7].
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Als
die phylogenetische Verwandtschaft der Ov-ASP-Proteine untersucht
wurde, bildeten Ov-ASP-3 und Ov-ASP-2 eine Made, die sich von derjenigen,
die von Ov-ASP-1 gebildet wurde, und den in anderen Fadenwurm-Parasiten
(B. malayi und D. immitis) identifizierten ASP-Homologa unterschied
(2). Ferner bildeten die Fadenwurm-ASPs eine Gruppe,
die sich von den ASP-Homologa anderer Organismen unterschied, einschließlich der
ASPs aus A. caninum und C. elegans. Diese Ergebnisse legten nahe,
dass die Fadenwurm-ASPs eine neue Unterfamilie der CRISP-Proteine
repräsentieren.
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Die
Entdeckung der drei unterschiedlichen O. volvulus-Clone, die Homologe
der Vespidae-Antigene codieren, legte nahe, dass die Ov-asp-Clone
Mitglieder einer Multigen-Familie sind. Um die Struktur dieser Familie
detaillierter zu untersuchen, wurde ein aus genomischer O. volvulus-DNA
hergestellter Southern-Blot
bei Bedingungen mit moderater Stringenz mit einer gereinigten Insertion
getestet, die den offenen Leserahmen von Ov-asp-2 codiert. Die Ov-asp-2-cDNA
hybridisierte mit sehr vielen DNA-Banden sowohl bei mit HindIII
als auch mit BamHI gespaltener O. volvulus-DNA in einem Bereich
von 3,5 bis 16 kbp (3). Dagegen wurde keine Hybridisierung
mit der menschlichen genomischen DNA nachgewiesen (3).
Als der Blot erneut mit einer Gensequenz sondiert wurde, von der
bekannt ist, dass sie als Einzelkopie im O. volvulus-Genom vorhanden
ist (die alpha-Untereinheit I der O. volvulus-Prolyl-4-hydroxylase),
wurden einzelne unterschiedliche Banden in beiden O. volvulus-Spuren
nachgewiesen, was bestätigte,
dass die Mehrfachbanden, die man sah, keine Artifakte waren, die
entweder durch Teilspaltung oder Abbau der genomischen DNA-Proben
produziert wurden, die zur Herstellung des Southern-Blots verwendet
wurden (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse legen nahe, wenn
man sie zusammennimmt, dass die Ov-asps eine Multigenfamilie innerhalb
des O. volvulus-Genoms umfassen.
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Um
etwas Einsicht in das Entwicklungsprofil der Expression der drei
Mitglieder der Ov-asp-Familie zu gewinnen, wurden nicht quantitative
stadiumspezifische PCR-Analysen unter Verwendung von Primern durchgeführt, die
für jedes
der drei Mitglieder der Ov-asp-Familie spezifisch sind; von verschiedenen
Lebensstadien des Parasiten stammende cDNA-Genbanken wurden als
Matrizen-DNA verwendet. Es wurde festgestellt, dass das Ov-asp-2-Transkript
in allen Stadien vorlag, während
das Ov-asp-3-Transkript L3-stadiumspezifisch und das Ov-asp-1-Transkript auf L2-,
L3-, mL3- und Erwachsenenstadien der Weibchen beschränkt war.
Eine Suche nach den 4.635 L3- und mL3-ESTs in der O. volvulus-EST-Datenbank (ab 1999)
unter Verwendung genspezifischer Abschnitte der drei Ov-asp-cDNAs zeigte,
dass das Ov-asp-3 L3-spezifisch ist, während das Ov-asp-1- und das Ov-asp-2-Transkript
beide im mL3-Stadium vorliegen und im L3-Stadium hoch reguliert sind
(Tabelle 1). Der Ov-asp-Gencluster umfasst bis zu 0,81% der L3/mL3-ESTs
in der aktuellen O. volvulus-EST-Datenbank. Ov-asp-1- und Ov-asp-2-Transkripte konnten
aus anderen Lebensstadien des Parasiten amplifiziert werden, aber
es wurden keine entsprechenden ESTs in den aktuellen EST-Datensätzen von
irgendeinem anderen Stadium (mf, 12, Männchen, Weibchen) identifiziert.
Wenn man die relativ kleinere Anzahl von ESTs in diesen Datensätzen berücksichtigt,
legen diese Ergebnisse nahe, dass die Ov-asp-1- und Ov-asp-2-Transkripte in diesen
Stadien wahrscheinlich herunterreguliert sind. Tabelle 1: Verteilung der drei Ov-asp-ESTs
in den O. volvulus-Larven-EST-Datensätzen
| | L3 | mL3 |
| Ov-asp-1 | 29 | 2 |
| Cv-asp-2 | 11 | 2 |
| Cv-asp-3 | 7 | 0 |
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Die
beiden klinischen Hauptmerkmale der Onchozerkose des vorderen Auges
sind die Trübung
der Cornea und die Neovaskularisierung [1]. Um zu bestimmen, ob
die Ov-ASPs in der Lage sind, eines dieser beiden Merkmale direkt
zu induzieren, wurden Ov-ASP-1- und Ov-ASP-2 in E. coli als lösliche Fusionsproteine mit
maltosebindendem Protein (MBP) exprimiert und bis zur Homogenität durch
Amylose-Affinitätschromatographie
gereinigt. 30 μg
jedes gereinigten Proteins wurden in die Corneas von naiven BALB/c-Mäusen injiziert, und
das Wachstum der Blutgefäße wurde
durch Spaltlampenuntersuchung überwacht.
Wie in 5 dargestellt, induzierte das
Ov-ASP-2/MBP-Konstrukt eine ausgeprägte angiogene Reaktion, wobei
die Gefäße von der
peripheren Cornea zur Injektionsstelle wuchsen. Die Gefäßlänge wurde
während
des Zeitraums von 7 Tagen aufrechterhalten, obwohl der Bereich der
Cornea, in dem die Gefäße vorlagen
(gemessen als Zeitstunden) nach 5 Tagen abnahm. Nach der Injektion
von 10 μg
Protein wurde eine ähnliche
Kinetik festgestellt (Daten nicht gezeigt).
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Um
die Spezifität
der angiogenen Reaktion zu bestimmen, wurden den Mäusen Ov-ASP-1/MBP, Ov-ASP-2/MBP,
MBP allein oder O. volvulus-Protein-Disulfidisomerase, fusioniert mit MBP
(Ov-PDI/MBP), injiziert [18]. Wie in 6 dargestellt,
entwickelte sich die Angiogenese in Tieren, denen Ov-ASP-1/MBP oder Ov-ASP-2/MBP
injiziert wurde, aber nicht in Tieren, denen MBP allein oder Ov-PDI/MBP
injiziert wurde. Dieses Ergebnis zeigt, dass die angiogene Reaktion
für die
Ov-ASP-Proteine spezifisch war.
-
Um
festzustellen, ob die durch die Ov-ASP-2/MBP-Proteine induzierte
angiogene Reaktion mit dem Vorliegen von inflammatorischen Wirtszellen
assoziiert war, wurden die Augen der Mäuse entnommen, denen Ov-ASP-2/MBP
oder die Kontrollproteine injiziert worden war, und dann in Formalin
fixiert. Die Paraffinschnitte (5 μm)
wurden nach der Färbung
mit Hämatoxylin
und Eosin untersucht. Corneas von mit Ov-ASP-2/MBP injizierten Tieren
besaßen
zahlreiche Blutgefäße, jedoch
relativ wenig inflammatorische Zellen (7). Im Gegensatz
zu dem Modell der O. volvulus-Keratitis, bei der es ein starkes
neutrophiles und eosinophiles Infiltrat gibt [1], waren die meisten
inflammatorischen Zellen Corneas, in die Ov-ASP-2/MBP injiziert
worden war, mononucleär. Ähnliche
Ergebnisse wurden nach der Injektion von Ov-ASP-1/MBP festgestellt, wobei keine Gefäße oder
inflammatorische Zellen in den Corneas der Tiere nachgewiesen wurden,
denen Ov-PDI/MBP oder MBP allein injiziert worden war (Daten nicht
gezeigt).
-
4. Diskussion
-
Eine
der am reichlichsten vorhanden Larven-cDNAs, die durch die EST-Analyse
identifiziert wurden, codiert ein Mitglied der Ov-ASP-Familie. Die
Identifizierung von drei Mitgliedern der Ov-ASP-Familie zusammen
mit den vorstehend dargestellten Daten der genomischen Southern-Blot-Analyse
legen nahe, dass die Ov-ASPs eine Multigenfamilie mit mehreren Mitgliedern
bilden. Ferner scheinen die drei Mitglieder der Ov-ASP-Familie,
die bisher charakterisiert wurden, verschiedene Entwicklungsprofile
zu zeigen, was nahelegt, dass diese Proteine verschiedene Funktionen
im Parasiten haben. Die biologische Funktion der Vespidae-Gift-Homologa
in Invertebraten und in A. caninum bleibt unklar. Jedoch ist das
A. caninum-Homologon ein sekretiertes Hauptprotein in aktivierten
infektiösen
Larven, was nahelegt, dass dieses Protein eine wichtige Rolle bei
der Etablierung der Infektion [7] spielt.
-
Abgesehen
von den Ov-ASP-Homologa hat keines der einzelnen rekombinanten,
bisher getesteten O. volvulus-Proteine irgendeine Reaktion in naiven
Tieren im etablierten Maus-Modell für Onchozerkose der Augen hervorgerufen
[18, 19]. Die durch Ov-ASP-1/MBP und Ov-ASP-2/MBP induzierte Reaktion
unterschied sich auch signifikant von derjenigen, die man bei mit
löslichen
nativen Parasitenantigenen subkutan immunisierten und intrastromal
provozierten Tieren sieht – ein
Verfahren, das eine schwere Trübung
der Cornea induziert [3, 18]. In immunisierten Tieren, die intracorneal
mit ganzen O. volvulus-Antigenen provoziert wurden, gab es eine
ausgeprägte.
Migration der Eosinophilen und Neutrophilen in die Cornea und schwere Ödeme. Dagegen
führte
die Injektion der naiven Tiere mit Ov-ASP-1/MBP oder Ov-ASP-2/MBP
zu einer minimalen inflammatorischen Reaktion. Diese Daten legen
nahe, dass die Ov-ASP-Proteine eine angiogene Reaktion direkt induzieren
können
und daher zur Neovaskularisierung der Cornea bei der Onchozerkose-Keratitis
beitragen können.
-
Die
Mechanismen, durch die die Mitglieder der Ov-ASP-Proteinfamilie
die Blutgefäßneubildung
in den Corneas der naiven Tiere stimulieren, müssen noch bestimmt werden.
Es ist jedoch möglich,
sich mindestens zwei Mechanismen vorzustellen, durch die dies stattfinden
kann: (1) die Ov-ASPs können
das Wachstum der vaskulären
Endothelzellen direkt stimulieren, um zu proliferieren und neue
Blutgefäße zu bilden;
(2) alternativ kann Angiogenese auf die Freisetzung von endothelialen
Zellwachstumsfaktoren zurückzuführen sein,
die durch Infiltrieren mononucleärer
Zellen produziert werden.
-
Obwohl
die Neovaskularisierung der Cornea für die Entwicklung der mit einer
O. volvulus-Infektion assoziierten Augensymptomatik wichtig ist,
kann die Angiogenese auch zur Erhaltung des Knötchens wesentlich sein, in
dem sich die Erwachsenenstadien befinden. Diese Knötchen sind
stark mit Gefäßen durchzogen
[20]; ihr Überleben
kann von der Produktion angiogener Proteine auf eine Weise abhängen, die
derjenigen ähnelt, die
für Tumoren
beschrieben wird [21]. Es kann sein, dass eine Funktion der Mitglieder
der Ov-ASP-Familie darin besteht, die Neovaskularisierung während der
Knötchenbildung
zu fördern,
so dass sie eine ausreichende Blutzufuhr zu den Erwachsenenparasiten
sicherstellt. Die potenzielle Bedeutung der Mitglieder der Ov-ASP-Proteinfamilie
beim Etablieren einer Infektion durch die infektiösen Larven
und bei der Unterstützung der
Entwicklung des Knötchens
durch den juvenilen, erwachsenen Parasiten legt nahe, dass diese
Proteine ein potenzielles Ziel für
einen immuntherapeutischen oder chemotherapeutischen Angriff gegen
eine O. volvulus-Infektion sein können.
-
Literatur
-
- 1. Hall und Pearlman, Pathogenesis of onchocercal
keratitis (river blindness). Clin. Micro. Rev., 12:445–53, 1999.
- 2. Pearlman et al, Interleukin 4 and T helper type 2 cells are
required for development of experimental onchocercal keratitis (river
blindness). J. Exp. Med., 182:931–40, 1995.
- 3. Pearlman, E., Experimental onchocercal keratitis. Parasitol.
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