DE69705643T2

DE69705643T2 - Anwendungen des nervenwachstumfaktors zur aufbewahrung, kultivierung oder behandlung von cornea

Info

Publication number: DE69705643T2
Application number: DE69705643T
Authority: DE
Inventors: Alessandro Lambiase
Original assignee: Anabasis SRL
Current assignee: Anabasis SRL
Priority date: 1997-04-24
Filing date: 1997-11-21
Publication date: 2002-05-29
Anticipated expiration: 2017-11-22
Also published as: US20030096413A1; US7429483B2; CA2287780C; IL132473A0; AU5135098A; AU734801B2; PT973872E; WO1998048002A1; ITRM970238A1; EA002986B1; US20020037584A1; IT1291892B1; ATE203054T1; JP3973697B2; ITRM970238A0; EP0973872B1; EP0973872A1; ES2162331T3; US6537808B2; CA2287780A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des Nervenwachstumsfaktors für die Aufbewahrung von Hornhäuten in Kultur, die in vitro Produktion von Hornhaut- und Bindehautgeweben und die Behandlung von Hornhaut- und Bindehauterkrankungen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung des als Neurotrophin bezeichneten Nervenwachstumsfaktörs (NGF) - bekannt für seine Fähigkeit, die Entwicklung, die Regeneration und die Aufrechterhaltung der biologischen Funktionen der Nervenzelle (Neurone) zu beeinflussen - für die Behandlung von Hornhaut- und Bindehautgeweben, damit deren Funktionalität in vitro erhalten bleibt und für die Therapie von Pathologien auf der Augenoberfläche.
Es ist bekannt, dass die Hornhauttransplantation die einzige therapeutische Methode für dystrophische, entzündliche oder abbauende Hornhauterkrankungen für den Fall darstellt, dass durch diese Erkrankungen irreversibel die Transparenz oder die normale Struktur der Hornhaut zerstört ist. Wenn sie einmal vom Kadaver isoliert sind, werden die Hornhäute bis zu dem Zeitpunkt "aufbewahrt", bis sie transplantiert werden, mittels Aufbewahrungsmethoden, bei denen Flüssigkeiten, die von Zellkulturmedien stammen, verwendet werden. Nach einer der am meisten bekannten Methode, die "Kurz-/Zwischenzeit-Aufbewahrung" genannt wird, wird die Hornhaut bei 4ºC in Kulturmedien, wie McCärey- Kaufman (MK)-Medium oder in verschiedenen im Handel erhältlichen Flüssigkeiten (wie beispielsweise Optisol-GS®) für einen maximalen Zeitraum von 7 Tagen gehalten. Eine längere Aufbewahrungszeit ist nach einer ähnlich üblichen Methode, die als "Organkultur" bezeichnet wird, möglich. Diese Methode basiert auf Techniken, die der Zellkultur ähnlich sind und ermöglicht die Aufbewahrung von entnommenen Hornhäuten bei Temperaturen zwischen 30 und 36ºC für mehr als einen Monat.
Keine der obigen Methoden erbrachte eine Verbesserung der biologischen Eigenschaften der Hornhautgewebe während der Aufbewahrung, wobei die besten Ergebnisse darin lagen, dass die Qualität dieser Gewebe während der Aufbewahrung unverändert blieb. Dieses macht eher die bereits schwierige Situation auf dem Gebiet der Hornhauttransplantation noch kritischer. Tatsächlich werden mehr als die Hälfte der Hornhäute nach der Entnahme verworfen, weil die mikroskopische Untersuchung diese als für die Transplantation ungeeignet qualifiziert.
Ein anderes Hauptproblem besteht darin, dass ein Bedarf besteht hinsichtlich verfügbarer Einzelhornhautzellpopulationen, wie endotheliale Zellen, epitheliale Zellen und Keratozyten, um diese für die Transplantation zu verwenden. Insbesondere in Situationen, in denen eine Zerstörung der Augenoberfläche aufgrund physikalischer oder chemischer Schädigungen beteiligt ist oder die aus Autoimmunerkrankungen begleitend mit Verwachsungen (wie Narbenpemphigus, Stevens-Johnson-Syndrom, etc.) oder aus Postinfektionspathologien resultieren, ist es von kritischer Wichtigkeit, epitheliale Hornhautzellen (einschließlich Stammzellen) zur Verfügung zu haben, die dann anstelle der zerstörten Augenoberfläche transplantiert werden können und/oder epitheliales Bindehautgewebe zur Verfügung zu haben, um damit die vernarbte und zusammengezogene Haut zu ersetzen.
Unter Berücksichtigung der pathologischen Situationen, die die morphologische und funktionale Einheit, die aus der Hornhaut (d. h. Epithelium, Stromakeratozyten und Endothelium) und der Bindehaut bestehen, beeinflussen können, ist festzustellen, dass es eine Vielzahl von Störungen gibt, die diesen Bereich beeinflussen und bisher schwierig zu therapieren waren oder überhaupt nicht erfolgreich zu behandeln waren. Diese Pathologien oder Situationen, die die normale Oberflächeneinheit stören können, umfassen alle Störungen der Tränenfilmfunktionen, angeborene oder erworbene Hornhaut-/ oder Bindehauterkrankungen, wie neurotrophische und neuroparalytische Keratitis (Hornhautentzündung) und/oder Konjunktivitis (Bindehautentzündung); posttraumatische, postinfektiöse, postoperative Keratitis und/oder Konjunktivitis; Keratitis und/oder Konjunktivitis aufgrund von Laserbehandlung und chemischen, physikalischen oder metallischen Verbrennungen; autoimmune, dystrophe, degenerative, postinflammatorische Keratitis. Diese Erkrankungen erscheinen mit Veränderungen des Hornhautepithels (spontan in primären neuroparalytischen Formen oder auf physikalischer, infektiöser, immuner oder toxischer Basis in den sekundären Formen), die in einen Ulcus enden können, der in den meisten Fällen zu einer Hornhautperforation, entweder spontan oder nach Mikrotraumen oder Superinfektionen, führen. Das klinische Bild dieser Erkrankung ist durch eine langsame und schwierige Genesung, durch Superinfektionen und oftmals durch Therapiemisserfolge charakterisiert. Das Endergebnis ist schließlich oftmals die Eintrübung der Hornhaut oder ihre spontane Perforation.
Die obigen Erkrankungen werden im allgemeinen durch Bandagierung und Verwendung von Gleitmittelsubstanzen und Antibiotika, um Komplikationen zu verhindern, behandelt. Die Abdeckung der Hornhaut ist notwendig, wenn eine Perforation bevorsteht oder bereits eingetreten ist und sie erfüllt den einzigen Zweck, dass die anatomische Einheit des Augapfels erhalten bleibt, was auf Kosten der Sehfunktion geht. Die Hornhauttransplantation, sowohl durch lamellare Keratoplastik als auch durch penetrierende Keratoplastik, ist absolut kontraindiziert wegen des häufigen Auftretens von Rückfällen, auch auf dem Transplantat und wegen des Risikos von Superinfektionen. Auf der Basis von in vitro Studien ist ebenfalls die topische medizinische Behandlung mit Präparationen, die Fibronectin, Plasmin, Collagenaseinhibitoren, EGF (d. h. Epidermiswachstumsfaktor) und Autoserum enthalten, ebenfalls vorgeschlagen worden. Keines dieser Arzneimittel hat bisher die Lösung gebracht, noch war es in der Lage, Hornhautverletzungen zu heilen oder zu vermindern oder das Endergebnis von Pathologien zu verändern.
Insbesondere sind bei der Behandlung von Hornhautverbrennungen ganz gute Ergebnisse bei der Transplantation von randständigen Bindehäuten, die von dem gegenüberliegenden Auge entnommen wurden, erhalten worden. Wenn die Beeinträchtigung auf beiden Seiten vorliegt, muss eine Entnahme der Bindehäute durch nahe Verwandte erfolgen, und wenn dieses nicht möglich ist, muss von einem Kadaver entnommen werden. Allerdings erbringt diese Methode nicht in allen Fällen die Lösung. Bei Autotransplantaten kann die Erkrankung nach Jahren wieder auftreten, während bei Homotransplantaten eine Abstoßung oftmals vorkommt, und somit eine Immunsuppressions-Therapie absolut notwendig mit den ganzen bekannten Konsequenzen aufgrund von Nebenwirkungen wird.
Eine andere Art von Hornhaut/Bindehaut-Erkrankungen, deren Behandlung oftmals unbefriedigend ist, sind Herpesinfektionen. Nach dem Rückgang eines ersten pathologischen Auftretens kommt es oft bei Herpesinfektionen zu Rückfällen, die oftmals erfolglos verhindert und behandelt werden.
So stellen ebenfalls die Erkrankungen, die das Hornhautendothel beeinflussen, wie z. B. die primäre und sekundäre Dekompensation und Endothelitis, die durch einen Verlust der Anzahl und/oder Funktion der Endothelzellen charakterisiert sind, eine Gruppe von Beeinträchtigungen dar, für die es zur Zeit keine wirksame Behandlung gibt.
Es ist daher eine primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Lösung der oben beschriebenen Probleme zur Verfügung zu stellen - wobei diese Probleme insgesamt mit der Physiopathologie der morphologischen und funktionellen Einheit der Hornhaut und der Bindehaut in Verbindung stehen - anhand der Verwendung eines therapeutischen Mittels, mit dem es möglich ist, die richtige biologische Aktivität dieser Gewebe zu erhalten und wiederherzustellen.
Das Molekül, das als Nervenwachstumsfaktor (NGF) bekannt ist, ist der erste Bestandteil einer komplexen Familie von Neurotrophinen, und es ist wegen seiner trophischen, tropischen und differenzierenden Wirkung auf cholinergische Neuronen des Zentralnervensystems und auf das periphere symphatische System gut bekannt. NGF wird in verschiedenen Geweben in Säugern, einschließlich Menschen, produziert und er wird in den Blutstrom in höheren Mengen während des Wachstums und der Differenzierung des Nervensystems abgegeben. Biologische, biochemische und molekulare Studien, die in vitro mit Zellsystemen durchgeführt wurden, haben eine sehr hohe Homologie zwischen muriner NGF und menschlicher NGF zutage gebracht. Beim Menschen, wie auch in anderen tierischen Spezies, ist der NGF normalerweise in der Cerebrospinalflüssigkeit und im Blutstrom in Mengen von etwa 10 - 50 pg/ml vorhanden. Diese Konzentrationen erhöhen sich bei einigen entzündlichen Pathologien (Autoimmunerkrankungen, allergische Erkrankungen, etc.) oder vermindern sich bei anderen Pathologien (Diabetes).
Der NGF wurde 1951 von Prof. Rita Levi-Montalcini vom Zoology Institute of Washington University von St. Louis (siehe Levi- Montalcini R., Harvey Lect., 60 : 217, 1966) entdeckt und stellt einen großen Fortschritt bei der Untersuchung von Wachstums- und Differenzierungsmechanismen der Nervenzelle dar, weil er in der Lage ist, die Entwicklung und Aufrechterhaltung der biologischen Funktionen von Neuronen und ihre Regeneration zu beeinflussen. Für die Entdeckung dieses Moleküls, die Charakterisierung seiner biologischen Rolle im peripheren Nervensystem und im Zentralnervensystem hat Prof. R. Levi-Montalcini 1986 den Nobelpreis für Medizin und Physiologie erhalten.
Verschiedene experimentelle Studien, sowohl in vitro als auch in vivo, haben gezeigt, dass der NGF bei der Verhinderung neuronaler Verletzungen chirurgischer, chemischer, mechanischer und ischämischer Natur physiopathologisch wichtig ist, so dass er der ideale Kandidat für die Verwendung in der Therapie von verschiedenen Erkrankungen des zentralen und peripheren Nervensystems (Hefti F., J. Neurobiol., 25: 1418, 1994; J. Fricker Lancet 349: 480, 1997) darstellt. So haben bereits seit einigen Jahren in der Tat klinische Versuche mit Patienten begonnen, die an der Parkinson-Krankheit und der Alzheimer-Krankheit leiden. Diese Versuche werden durch intrazerebrale Verabreichung von murinem NGF durchgeführt (siehe z. B. Olson L. et al., J. Neural Trans.: ParkinsorCs Desease and Dementia Section, 4: 79, 1992). Die Ergebnisse dieser Studien bestätigten die Beobachtungen, die an Tiermodellen gemacht wurden und zeigten damit gleichzeitig, dass es keine Nebenwirkungen bei der Verabreichung von murinem NGF gibt. Dieses Merkmal ist jetzt erst kürzlich im Hinblick auf menschlichen rekombinanten NGF bestätigt worden (Petty, B. G. et al., Annals of Neurology, 36: 244-246, 1994).
Seit seiner Entdeckung sind die Studien mit NGF, d. h. die Charakterisierung seiner biologischen, biochemischen, molekularen, vorklinischen und klinischen Effekte, fast ausschließlich mit NGF durchgeführt worden, das aus den Unterkieferdrüsen erwachsener Nagetiere isoliert worden ist; daher betreffen die meisten Daten, die bisher erhältlich waren, murinen NGF. Die biologischen Eigenschaften desselben sind bereits insbesondere in einer Arbeit beschrieben worden, die bis auf 1968 zurückgeht (Levi-Montalcini R. und Angeletti P. U., Physiolocical Reviews, 48: 534, 1968).
Der in den Speicheldrüsen von Mäusen enthaltene NGF ist ein 140 kD-Molekülkomplex mit einem Sedimentationskoeffizienten 7S, der aus drei Untereinheiten, α, β, eγ, besteht, wobei die zweite die wirklich aktive Form darstellt. Diese Untereinheit, die βNGF genannt wird, mit den Sedimentationskoeffizienten 2,5 S, wird in der Regel nach drei Methoden extrahiert und gereinigt, die sich nicht sehr stark voneinander unterscheiden (Bocchini V., Angeletti P. U. Biochemistry, 64: 787-793, 1969; Varoh S. et al., Methods in Neurochemistry, 203-229, 1972; Mobley W. C. et al., Molecular Brain Research, 387: 53-62, 1986).
Der mit diesen Methoden erhaltene βNGF ist wiederum ein Dimer von etwa 13.000 Dalton, das aus zwei identischen Ketten mit 118 Aminosäuren besteht. Jede Einzelkette ist mit drei Disulphid- Brücken stabilisiert, während nichtkovalente Bindungen für die Bildung der Dimerstruktur sorgen. Dieses Molekül, das sehr stabil ist, kann sich in fast jedem Lösungsmittel, sowohl wässrig als auch ölig, lösen, während es seine biochemischen Merkmale und seine biologische Aktivität unverändert hält. Weitere Informationen hinsichtlich der Struktur und der physikalischen und biologischen Eigenschaften des Moleküls können in Greene, L. A. and Shooter, E. M., Ann. Rev. Neurosci. 3: 353, 1980 nachgelesen werden.
Erst kürzlich ist die Struktur des βNGF weiter durch eine kristallographische Analyse aufgeklärt worden. Dabei wurde die Gegenwart von drei antiparallelen Paaren von Strängen, mit einer sekundären Struktur des β-Typs, nachgewiesen, die bei der Bildung einer planaren Oberfläche kooperieren, wobei entlang dieser die zwei Ketten assoziieren, um das aktive Dimer zu bilden. Auf diesen Ketten des βNGF ist die Gegenwart von vier Schleifenbereichen zutage getreten, die viele variable Aminosäuren enthalten. An diese variablen Aminosäuren ist sehr wahrscheinlich die Erkennungsspezifität durch den Rezeptor gebunden.
Die biologische Wirkung des NGF wird durch zwei Rezeptoren vermittelt, die sich auf der Oberfläche der jeweiligen Zielzellen befinden. Es gibt verschiedene Antikörper, die die biologische Wirkung von NGF selektiv inhibieren. Die Existenz dieser Antikörper ermöglicht somit die genaue Charakterisierung und Modulation der NGF-Aktivität, sowohl in Zellsystemen als auch in vivo.
In den letzten Jahren ist es möglich geworden, humanen NGF mit gentechnischen Techniken zu synthetisieren (Iwane, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 171: 116, 1990), und kleine Mengen von humanem NGF gibt es bereits auf dem Markt. Allerdings haben direkte Experimente gezeigt, dass die biologische Aktivität von humanem NGF ziemlich niedrig im Vergleich zur biologischen Aktivität von murinem NGF ist. Des Weiteren muss berücksichtigt werden, dass fast alle bisher verfügbaren Daten hinsichtlich der Wirkung auf den Menschen, sowohl in vitro als auch in vivo, mit murinem NGF erhalten wurden, und es sind keine nachteiligen Wirkungen nachgewiesen worden, die mit dem murinen Ursprung des Produkts in Verbindung gebracht werden können.
Studien, die seit dem Anfang der Neunziger mit Tiermodellen durchgeführt werden, haben eine mögliche Beteiligung von NGF bei Augenpathologien nahegelegt. Allerdings betreffen diese Studien fast ausschließlich die Verwendung von NGF bei Netzhauterkrankungen, d. h. auf dem Nervengeweben, während sich nichts in der Literatur über die Wirkung dieses Neurotrophins auf der Augenoberfläche (d. h. Netzhaut und Bindehaut) findet, noch gibt es irgendwelche wissenschaftlichen Arbeiten, die die Verwendung von NGF für die Behandlung von Erkrankungen vorschlagen, die die Hornhaut und/oder die Bindehaut beeinträchtigen. Insbesondere sind einige Studien mit Tieren durchgeführt worden, um die Wirkung der topischen Verabreichung von NGF bei der Behandlung von Netzhautpathologien festzustellen, z. B. der Behandlung von akuter Netzhautischämie (Siliprandi R. et al., Inv.. Ophthalmol. Vis. Sci., 34: 3232, 1993) bei der Transektion des Sehnervs (Carmignoto G. et al., J. Neurosci., 9:; 1263, 1989) und bei der Behandlung von Renititis pigmentosa (Lambiase A. e Aloe L., Graefe's Arch. Clin. Exp. Ophthalmol.; 234 : 596- S100, 1996). Die Ergebnisse zeigten, dass die topische Verabreichung den Tod von Netzhautganglionzellen und Photorezeptoren während der obigen Pathologien verhindern oder zumindest verzögern kann. Keine dieser Studien brachte Nebenwirkungen bei Tieren zutage.
Andererseits haben verschiedene Autoren, mit Blick auf Erkrankungen von Netzhautgeweben, die in der vorliegenden Erfindung von Interesse sind, für diese Indikationen die mögliche Verwendung des Epidermiswachstumsfaktors (EGF) zu berücksichtigt, wobei angenommen wurde, dass Veränderungen des Hornhautepithels den pathogenen Schlüssel für die Entwicklung anderer Hornhautbeeinträchtigungen, wie Ulcera und Keratitis, darstellen.
Der EGF ist ein Polypeptid mit 53 Aminosäuren, der in den frühen Sechzigern (Cohen S., J. Biol. Chem., 237: 1555-1562; 1962) entdeckt und charakerisiert wurde und ein Molekulargewicht von etwa 6.000 Dalton aufweist. Dieses Molekül wird von der Speicheldrüse der erwachsenen Maus produziert, es ist allerdings auch in geringen Mengen in menschlichen Geweben vorhanden. Der EGF übt eine gutcharakterisierte trophische, proliferative und differenzierende Wirkung auf Endothelzellen aus, die von verschiedenen tierischen und menschlichen Geweben erhalten werden, und seine in vitro Wirkung auf Hornhautepithel-Zellkulturen als auch seine Fähigkeit, die Proliferation und Differenzierung dieser Zellen zu induzieren, sind in einigen experimentellen Arbeiten beschrieben worden.
Allerdings ergaben die klinischen Studien mit Hornhauterkrankungen, die auf der Basis der obigen experimentellen Daten durchgeführt wurden, widersprüchliche Ergebnisse und zeigten im Allgemeinen eine wesentliche Unwirksamkeit von EGF bei dieser Art von menschlichen Erkrankungen (Kandrakis A. S. et al., Am. J. Ophthalmol., 98: 411, 1984). Diese Unwirksamkeit ist wahrscheinlich einer anderen Expression des EGF-Rezeptors in vitro und in vivo oder, eher wahrscheinlicher, der Tatsache zuzuschreiben, dass die Epithelveränderungen bei Hornhauterkrankungen nur ein Epiphänomen der Hornhauterkrankungen selbst repräsentieren.
Die EP-A-0 312 208 (Ethicon) beschreibt Gelpräparate für die Anwendung bei der Behandlung von Epithelläsionen und Epithelpathologien im Allgemeinen, wobei Läsionen und Pathologien der Augenoberfläche eingeschlossen sind. Diese Präparate enthalten einen aktiven Bestandteil, der willkürlich unter verschiedenen Molekülen ausgewählt werden kann, deren Name den Ausdruck "Wachstumsfaktor" enthält. Obwohl die Beschreibung ausschließlich EGF als bevorzugten aktiven Bestandteil betrifft und obwohl die Aktivitätsdaten (in vitro) und Formulierungsbeispiele nur für den EGF angegeben werden, werden andere Wachstumsfaktoren ebenso erwähnt, wie FGF (Fibroblastenwachstumsfaktor), PDGF (von Blutplättchen hergleiteter Wachstumsfaktor), α-TGF (Umwandlungswachstumsfaktor) oder der NGF selbst. Diese Wachstumsfaktoren werden wahrscheinlich als Familie von Molekülen dargestellt, die die gleichen Merkmale und die gleiche biologische Aktivität wie der EGF aufweisen. Tatsächlich weiß der Fachmann aufgrund seines aktuellen Wissens, dass diese Wachstumsfaktoren verschiedene spezifische Angriffsziele haben und dass sie oftmals entgegengesetzte Wirkungen ausüben, so dass diese Wachstumsfaktoren nicht als biologisch äquivalent zueinander betrachtet werden können. Daneben beschreibt das obige Dokument, sofern die Augenheilkunde insbesondere betroffen ist, diese Wachstumsfaktoren als ausschließlich aktiv auf dem Hornhautepithel, so dass die vorgeschlagene Indikation hinsichtlich einer Indikation als reepithelisierende Faktoren, die in der Praxis nur bei traumatischen Beeinträchtigungen von Nutzen sind, reduziert wird.
Andererseits haben die Studien, die zu der vorliegenden Erfindung geführt haben, am Konzept der Hornhaut als morphologische und funktionale Einheit festgehalten, worin die Einzelschichten (d. h. Epithel, Stroma und Endothel) alle eine Funktion einer gleichgestellten Wichtigkeit bei der Erhaltung der Gewebeeinheit und der Wiederherstellungsmechanismen durchführen. Von diesem Standpunkt aus wird eine Schlüsselrolle durch die trophische Unterstützung gespielt, die durch die sensorische Hornhautinnervation gegeben ist und deren Schädigung eine Schädigung der gesamten morphologischen und funktionalen Einheit hervorruft.
Im Hinblick auf die Tatsache, dass im Stand der Technik kein Hinweis auf eine Wirkung des NGF (d. h. einer der vielen Mediatoren, die durch die Nervenenden in anderen Bereichen des Körpers freigesetzt werden) auf die Augenoberfläche existierte, hat sich die Frage anfangs gestellt, ob dieses Neurotrophin eine trophisch-reparierende Wirkung auf das Hornhautgewebe von neuroectodermischer embryonaler Herkunft spielen kann, da verschiedene Angriffsziele dieses Neurotrophins eine ähnliche embryogenetische Herkunft zeigen. Demzufolge sind die Hornhaut und die Bindehaut hinsichtlich der Gegenwart von NGF und des NGF- Hochaffinitätsrezeptors (TrkA-Tyrosinkinase A) unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (TrkA-Antikörper; Santa Cruz, USA) mit immunhistochemischen Techniken (Bhattachryya A. et al., J. Neurosci. 17: 7007, 1997) analysiert worden. Tatsächlich ist die Gegenwart eines spezifischen Rezeptors ein Schlüsselerfordernis für die Aktivität des untersuchten Moleküls.
Es ist demzufolge festgestellt worden, dass alle Hornhautzellen (d. h. Epithelzellen, Endothelialzellen und Keratozyten) TrkA exprimieren und dass gleichzeitig die somatosensorische Innervation der Hornhaut in der Lage ist, NGF freizusetzen. Diese Entdeckung erlaubt die Hypothese, dass einerseits der NGF, der wahrscheinlich von den Nervenenden freigesetzt wird, eine physiopathologische Rolle in allen Hornhautreparaturmechanismen (sowohl an der Oberfläche als auch in tieferen Bereichen) spielt und dass andererseits verschiedene oberflächliche Hornhauterkrankungen, die mit einer primären Schädigung der Innervation (wie neurotrophische oder dystrophische Keratitis und Wiederauftreten von Herpesinfektionen) oder mit sekundären Schädigungen der Innervation (wie chemische oder physikalische Verbrennungen und Postinfektionen, Autoimmunerkrankungen, postoperative Läsionen oder Läsionen, die durch eine Laserbehandlung entstehen) begleitet sind, als fundamentale ätiologische Stufe für das Fehlen der NGF-Freisetzung anerkannt werden.
Die gleiche Feststellung erlaubt die Hypothese, dass der NGF für die Aufrechterhaltung des gesamten Hornhautgewebes in Kultur wesentlich ist, d. h. immer dann, wenn der Hornhaut als Ganzes, als morphologische und funktionale Einheit aus Epithel, Stroma und Endothel oder einige Zellen davon, die trophische Unterstützung, die durch die Freisetzung von NGF durch die Hornhautnervenenden zur Verfügung gestellt wird, fehlt.
Da außerdem die Wirkungen, die nach der Verabreichung von exogenem NGF beobachtet worden sind, bei Konzentrationen, die nahe am physiologischen Wert sind, auftreten, kann die Hypothese aufgestellt werden, dass ein möglicher physiopathogener Mechanismus bei den hier betrachteten Hornhautbeeinträchtigungen aus einer Verminderung der lokalen Gehalte des NGF unterhalb der Schwelle, bei der die Hornhaut- und/oder Bindehautintegrität sichergestellt ist, besteht.
Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung, nach einem ersten Aspekt, die Verwendung des Nervenwachstumsfaktors für die Aufbewahrung von Hornhäuten in Kultur und für die Aufbewahrung und in vitro Produktion von Hornhaut- und Bindehautgeweben und von einzelnen Hornhaut- oder Bindehautzellpopulationen zur Verfügung.
Bevorzugt wird der NGF in ein Kulturmedium der Art gegeben, dass er für die Aufbewahrung von Hornhäuten oder für die in vitro Kultur von Hornhaut- oder Bindehautzellen oder -geweben geeignet ist, in Mengen, die zwischen 100 pg/ml und 200 ng/ml, gegebenenfalls zusammen mit anderen Nährstoffen und anderen biologisch aktiven Mitteln. Der zu verwendende NGF soll von muriner oder menschlicher Herkunft, wobei rekombinanter NGF eingeschlossen ist, sein, und er kann in lyophilisierter Form, in Lösung gelöst, in einem Kulturmedium oder in jedem anderen verfügbaren Lösungsmittel verwendet werden, um so eine Endkonzentration zu erreichen, die dem oben spezifizierten Bereich entspricht.
Geeignete Methoden der Extraktion und Reinigung von NGF werden in der oben erwähnten Literatur beschrieben. Für die experimentelle Arbeit der, vorliegenden Erfindung ist die Bocchini- und Angeletti-Technik (oben zitiert) angewendet worden, die nun nachfolgend beschrieben wird. Die Unterkieferdrüsen von erwachsenen männlichen Mäusen werden unter Sterilbedingungen explantiert und die Gewebe werden homogenisiert, zentrifugiert und dialysiert; dann wird die Suspension durch Cellulosesäulen in Reihe gelassen, um so durch Adsorption den NGF abzutrennen. Der NGF wird dann aus der Säule mit einem Puffer, der 0,4 M Natriumchlorid enthält, eluiert. Die auf diese Weise erhaltenen Proben werden mit einem Spektrometer bei einer Wellenlänge von 280 nm analysiert, um die NGF-haltigen Fraktionen zu identifizieren. Die letztgenannten werden dialysiert, und der in dieser Weise erhaltene NGF wird unter Sterilbedingungen lyophilisiert und in einem Kühlschrank bei -20ºC aufbewahrt.
Bei der Bewertung der Wirkungen der NGF-Zugabe zu verschiedenen Kulturmedien für die explantierten Hornhäute (bei 4ºC und bei 30-36ºC) ist eine allgemeine Verbesserung der biologischen Merkmale des Hornhautgewebes mit NGF-Mengen innerhalb eines Bereichs zwischen 100 pg/ml und 200 ng/ml erreicht worden. Die optimale Antwort ist mit einer Konzentration von etwa 100 ng/ml erreicht worden. Nach 7 Kulturtagen bestanden insbesondere die Verbesserungen in einem Anstieg der Endothelzellendichte (Anstieg von 10 auf 25%), einer Herabsetzung der Endothelzellenmortalität (Abwesenheit von Trypanblau positiven Endothelzellen), einer besseren Endothelmorphologie (d. h. quantitativ ein 3/3 Trophismus vs. einem 2/3 Trophismus in den Kontrollen ohne Zugabe von NGF), einer höheren Überlebensrate der Keratozyten und einem beträchtlich besseren Aussehen des Epithels. Zusätzlich haben sich einige Hornhäute vor der Kultur als nichtgeeignet für die Transplantation erwiesen, sie waren aber nach der Kultur für 7 Tage in Gegenwart von NGF geeignet.
Eine ähnliche experimentelle Bewertung der Wirkungen von NGF als Additiv im Kulturmedium von Hornhautzellen (d. h. Epithelzellen, Endothelzellen und Keratozyten) zeigte, dass die Zugabe von murinem NGF in Mengen im Bereich zwischen 100 pg/ml und 200 ng/ml (mit einer optimalen Antwort bei einer Konzentration Von etwa 100 ng/m²) die Proliferation und Differenzeriung der verschiedenen Zellpopulationen induziert, und darüber hinaus unterstützt er die Einpflanzung der Zellpopulationen auf einer Anzahl von Trägergeweben (wie Lamellen von Hornhautstroma, amniotische Membran, etc.). Des Weiteren begünstigt die Zugabe die Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Zelltypen in Zellcokulturen. Demzufolge kann die Erfindung ebenfalls beim Züchten bzw. Kultivieren von Hornhautzellliniengemischen angewendet werden, um eine künstliche Hornhaut für die Transplantation herzustellen.
Es hat sich außerdem gezeigt, dass in Bindehautepithelzellkulturen die Proliferation und Differenzierung erhöht werden. Des Weiteren erhöht sich die Anzahl von Becherzellen in der Kultur in Gegenwart von murinem NGF bei den gleichen, oben spezifizier ten Konzentrationen. Das in dieser Weise erhaltene Transplantat aus Epithelbindehautgewebe eignet sich besonders vorteilhaft für den Ersatz von Bindehaut bei Patienten, die an Kerato-Conjunktivissicca (Trockenaugensyndrom) primär und sekundär zu anderen Pathologien, leiden.
Nach einem anderen Aspekt der Erfindung wird daher ein Kulturmedium für die Aufbewahrung von Hornhäuten oder für die Aufbewahrung und in vitro Produktion von Hornhaut- und/oder Bindehautgeweben oder Einzelhornhaut- oder Bindehautzellpopulationen zur Verfügung gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine wirksame Menge NGF, bevorzugt zwischen 100 pg/ml und 200 ng/ml, insbesondere etwa 100 ng/ml enthält.
Wie vorstehend beschrieben wurde, wird nach einem weiteren Aspekt der Erfindung die Verwendung des Nervenwachstumsfaktors bei der Herstellung eines Medikaments für die Therapie und/oder die Prophylaxe von Hornhaut- und/oder Bindehauterkrankungen zur Verfügung gestellt.
Insbesondere ist die Erfindung für die Herstellung von medizinischen Produkten geeignet, die für die Behandlung und/oder Prophylaxe von angeborenen und/oder erworbenen Hornhaut- und/oder Bindehauterkrankungen geeignet sind und aus der folgenden Gruppe gewählt sind: neurotrophische und neuroparalytische Keratitis und/oder Konjunktivitis; Herpeskeratitis und/oder Herpesbindehautentzündung; posttraumatische, postinfektiöse, postoperative Keratitis und/oder Bindehautentzündung; Keratitis und/oder Bindehautentzündung aufgrund von Beeinträchtigung der Tränenfilmfunktionen, durch Laserbehandlung, durch chemische, physikalische oder metallische Verbrennungen, autoimmune, dystrophische, degenerative und postentzündliche Keratitis.
Bevorzugt enthält ein erfindungsgemäßes medizinisches Produkt für die topische Verabreichung, allein oder in Kombination mit, einem oder mehr anderen aktiven Bestandteilen, 10 bis 500 ug NGF pro ml, wobei die optimale Konzentration etwa 250 ug NGF pro ml ist. Dieses Produkt kann in Form einer ophtalmischen Lösung für Augentropfen oder in Form eines Gels, einer Salbe, einer Creme oder eines Pulvers vorliegen, oder es kann in eine lokale Bandage oder in eine medizinische Kontaktlinse gegeben werden.
Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das pharmazeutische Produkt, für dessen Herstellung das NGF vorgeschlagen ist, ein Medikament, das für die Therapie und/oder Prophylaxe von primären oder sekundären endothelialen ophthalmischen Pathologien indiziert ist. Für diesen Zweck enthalten die bevorzugten Zusammensetzungen (in diesem Fall ebenfalls wahlweise in Kombination mit anderen aktiven Bestandteilen) 1 bis 250 ug NGF pro ml, und die Verabreichung wird durch Eingeben in die Vorderkammer des Auges durchgeführt.
In vivo Studien bei Tieren im Hinblick auf die Behandlung von Erkrankungen des Hornhautendothels sind durchgeführt worden, indem in die Vorderkammer des Auges wässrige Lösungen, die NGF bei Konzentrationen im Bereich von 1 und 250 ug/ml enthielten, gegeben wurden. Insbesondere konnte bei Kaninchen mit einer endothelialen Schädigung durch eine Kryoprobe eine vollständige Wiederherstellung der Endothelialdichte nach 15 Tagen Behandlung mit NGF erreicht werden. Die Verabreichung von NGF bei Endothelialpathologien, sei es dystrophischer Natur oder erworben, mit dem Verlust der Endothelzellen und mit Verlust ihrer Funktionalität, hat gezeigt, dass die Endothelialfunktion vollständig hergestellt werden konnte.
In einer Serie von Studien beim Menschen zur Untersuchung der Wirksamkeit der Behandlung mit NGF mit einer topischen Behandlung von Hornhaut- und/oder Bindehautbeeinträchtigungen, sind eine Anzahl von Pathologien auf der Basis einer primären oder sekundären Beteiligung des somato-sensorischen Hornhautnervplexus ausgewählt worden. Muriner NGF (2,55), der nach er oben beschriebenen Reinigung erhalten wurde, ist in diesen Studien untersucht worden. Der NGF wurde topisch bei einer Konzentration von etwa 250 mg/ml, verdünnt in einer ausgewogenen Salzlösung, verabreicht.
Die nachfolgend gezeigte Tabelle fasst die Ergebnisse zusammen, die aus einer Studie mit fünf Patienten, die an torpidem Hornhautulcus aufgrund neurodystophischer Keratitis (2 Augen) oder einer Keratoplastik (2 Augen) oder einer Verbrennung durch Alkalien (2 Augen) litten. Das Therapieschema bestand aus Einträufeln von 1 bis 2 Tropfen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in einer täglichen Frequenz wie folgt: Alle zwei Stunden für die ersten zwei Tage, sechsmal am Tag bis zum zweiten Tag nach der vollständigen Reepithelisierung der Hornhaut und zweimal am Tag für die folgenden 15 Tage.
Die topische Behandlung mit NGF wurde nach 15 Tagen Behandlung mit Autoserum, in Abwesenheit von Zeichen der Besserung des klinischen Bildes begonnen. Alle behandelten Patienten zeigten deutliche Zeichen der Wiederherstellung innerhalb von 2 Wochen vom Beginn der Behandlung mit NGF, und keiner von ihnen zeigte irgendwelche lokalen oder systemischen Nebenwirkungen während der Behandlung oder auch später. Nach dem Aussetzen sollte die Therapie sofort wieder in dem Fall begonnen werden, wenn die ersten Zeichen oder Symptome irgendeines Rückfalls der Epithelpathologie erscheinen.
Die betroffenen fünf Fälle werden nun nachfolgend im Einzelnen diskutiert, und die Hauptdaten sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
1. Fall: Eine 9 Jahre alte Patientin, die an angeborener Anophthalmie litt, zeigte im anderen Auge einen Hornhautulcus seit mehr als 20 Tagen. Der Ulcus, der mit Antibiotika und Steroiden behandelt wurde, zeigte keine Anzeichen der Heilung. Der Ulcus hatte einen Durchmesser von etwa 7 mm und nahm in der Tiefe mehr als 2/3 des Hornhautstromas ein. Die klinische Untersuchung zeigte eine Hornhaut-Gefühllosigkeit, worauf dann aufgrund dessen eine neurotrophische Keratitis diagnostiziert wurde. Nach 15 Tagen Behandlung mit. Autoserum, wobei eine fortschreitende Verschlechterung des klinischen Bildes erkannt wurde, wurde die topische Behandlung mit NGF begonnen.
Nach vier Tagen war der Hornhautulcus auf etwa 3,5 mm Durchmesser reduziert und nach 15 Tagen war die Hornhaut vollständig geheilt, und die Behandlung mit NGF wurde unterbrochen. Die Patientin zeigte ein zentrales Leukom mit einigen Neogefäßen, und es gab, wenn auch reduziert, eine Hornhaupt-Empfindlichkeit, die vollständig vor der Behandlung verschwunden war. Nach 8 Monaten in der Nachbehandlung zeigte die Patientin 5/10 der Sehfähigkeit und die Hornhaut-Empfindlichkeit war noch vorhanden.
2. Fall: Eine 26 Jahre alte Frau, die an Syndactilia litt und die kein VIII-Paar der Cranialnerven hatte, zeigte seit etwa 2 Monaten einen Hornhautulcus, der sich ständig vertiefte, bis er ein Ausmaß von 7 mm und eine Tiefe bis zur Descernet-Membran erreichte. Die klinische Untersuchung zeigte eine vollständige Hornhaut-Anästhesie.
Nach 2 Wochen Therapie mit NGF kamen deutliche Zeichen der Genesung auf, mit einer Reduktion der Ulcustiefe. Nach 6 Wochen Therapie war die Hornhaut voll reepithelisiert, während ein zentrales Leukom mit einigen Neogefäßen übrig blieb. Zusätzlich wurde etwas Hornhaut-Empfindlichkeit wieder hergestellt, allerdings vermindert.
3. Fall: Ein Mann im Alter von 25 Jahren, der eine Enukleation des linken Auges mit anschließendem Ausbruch eines Hornhautulcus nach der penetrierenden Keratoplastik hinter sich hatte, zeigte seit etwa einem Monat einen Hornhautulcus im rechten Auge im Hornhauttransplantat. Der Hornhautulcus hatte einen Durchmesser von 5 mm und seine Tiefe betrug ¹/&sub2; der Hornhautstroma. Eine Hornhaut-Anästhesie war ebenfalls zu verzeichnen.
Nach 2 Wochen Behandlung mit NGF war der Hornhautheilungsprozeß evident, mit einer Reduktion der Größe und der Tiefe des Ulcus. Nach 4 Wochen Behandlung mit NGF war der Ulcus vollständig geheilt und es verblieb ein zentrales Leukom mit einigen Neogefäßen. Eine beträchtliche Hornhaut-Hypästhesie war noch vorhanden.
4. Fall: Ein 56 Jahre alter Mann zeigte einen bilateralen Hornhautulcus aufgrund einer Verbrennung mit Alkalien. Das rechte Auge wurde, nach einem chirurgischen Eingriff durch penetrierende Keratoplastik, nach dem Ausbruch eines Ulcus enukleiert. Das linke Auge, nach der lamellaren Keratoplastik, entwickelte einen torpiden Ulcus mit einem Durchmesser von etwa 7 mm, der keine Anzeichen einer Heilung zeigte.
Nach 2 Wochen Behandlung mit NGF war der Beginn eines Wiederherstellungsprozesses evident, und dieser Prozess war nach 5 Wochen beendet.
5. Fall: ein 56 Jahre alter Mann zeigte einen bilateralen Hornhautulcus aufgrund einer Verbrennung mit Chlorwasserstoffsäure. Im rechten Auge war ein Ulcus mit einem Durchmesser von etwa 4 mm vorhanden, während im linken Auge der Ulcus größer war (mehr als 8 nun Durchmesser) und auch tiefer. Der Patient zeigte eine starke Hornhaupthypästhesie.
Nach 2 Wochen Behandlung mit NGF war das rechte Auge vollständig ausgeheilt, mit einem zentralen Restleukom, während der Ulcus im linken Auge hinsichtlich der Größe und der Tiefe reduziert war, obwohl eine Neogefäßeinsprossung vorhanden war. Nach 3 Wochen Behandlung waren beide Hornhäute vollständig reepithelisiert, es verblieb ein zentrales Leukom und die Hornhaut- Empfindlichkeit war vorhanden, wenn auch reduziert. Nach zwei Monaten in der Nachbehandlung waren beide Hornhäute reepithelisiert, und das Seevermögen des rechten Auges betrug 3/10, während das des linken Auges 1/10 betrug. Des Weiteren war in beiden Augen noch eine Hornhautempfindlichkeit vorhanden. TABELLE 1: In vivo Behandlung mit Nervenwachstumsfaktor
a) PK: Hornhauttransplantat durch penetrierende Keratoplastik
b) LK: Hornhauttransplantat durch Lamellarkeratoplastik
Die vorangegangenen Daten zeigen deutlich die Wirksamkeit der Verwendung von NGF nicht nur zum Aufbewahren und Produzieren in vitro von Hornhaut- und/oder Bindehautgewebe, als Ganzes oder in Teilen oder zum Aufbewahren und in vitro Produzieren von Einzelzelltypen, aus denen diese Gewebe bestehen, sondern ebenfalls für die Behandlung und Prävention humaner oder tierischer Erkrankungen, bei denen die morphologische und funktionelle Einheit der Hornhaut oder der Bindehaut beeinträchtigt ist, welche Erkrankungen bisher noch keine effektive Therapie erfahren haben.
Die vorliegende Erfindung ist mit speziellem Bezug auf einige ihrer spezifischen Ausführungsformen beschrieben worden, es sollte allerdings selbstverständlich sein, dass Modifikationen und Veränderungen vom Fachmann vorgenommen werden können, ohne dass der Umfang der Erfindung, wie er in den anliegenden Ansprüchen definiert ist, verlassen wird.

Claims

1. Verwendung des Nervenwachstumsfaktors (NGF) zur Aufbewahrung von Hornhäuten in Kultur und zur Aufbewahrung und Erzeugung in vitro von Hornhaut- und Bindegeweben und von einzelnen Hornhaut- und Bindehautzellenpopulationen.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin der NGF zu einem Kulturmedium zur Aufbewahrung von Hornhäuten oder zu einem Kulturmedium zur Aufbewahrung und Erzeugung von Hornhaut- und Bindehautzellen oder von Hornhaut- und Bindehautgeweben in einer Konzentration von 100 pg/ml bis 200 ng/ml hinzugefügt wird.

3. Verwendung nach Anspruch 2, worin die vorgenannte Konzentration etwa 100 ng/ml beträgt.

4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das vorgenannte Kulturmedium auch zusätzliche Nahrungsstoffe und/oder biologisch aktive Stoffe enthält.

5. Verwendung des Nervenwachstumsfaktors (NGF) bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Therapie und/oder Prophylaxe von Hornhaut- und/oder Bindehautkrankheiten.

6. Verwendung nach Anspruch 5, worin das vorgenannte Arzneimittel für die Behandlung und/oder Prophylaxe von angeborenen und/oder erworbenen Hornhaut- und/oder Bindehautkrankheiten induziert ist, die aus der Gruppe gewählt sind: neutrophische und neuroparalytische Hornhaut- und/oder Bindehautentzündung; herpetische Hornhaut- und/oder Bindehautentzündung; posttraumatische, postoperative, postinfektiöse Hornhaut- und/oder Bindehautentzündung; Hornhaut- und/oder Bindehautentzündung, die auf die Störung der Tränenfilmfunktion, auf die Laserbehandlung oder auf chemische, physikalische oder metallische Verbrennungen zurückzuführen sind; dystrophische, degenerative und postinflammatorische Hornhautentzündung.

7. Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, worin das vorgenannte Arzneimittel topisch verabreicht wird und 10 bis 500 ug/ml NGF enthält.

8. Verwendung nach Anspruch 7, worin das vorgenannte Arzneimittel etwa 250 ug/ml NGF enthält.

9. Verwendung nach Anspruch 5, worin das vorgenannte Arzneimittel für die Therapie und/oder Prophylaxe von primären und sekundären endothelischen ophthalmischen Pathologien indiziert ist.

10. Verwendung nach Anspruch 9, worin das vorgenannte Arzneimittel durch Eingabe in die vordere Augenkammer verabreicht wird und 1 bis 250 ug/ml NGF enthält.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 10, worin der NGF im vorgenannten Arzneimittel mit einem oder mehreren aktiven Bestandteilen kombiniert ist.

12. Verwendung und Kulturmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der vorgenannte NGF muriner oder menschlicher Herkunft ist oder ein menschlicher rekombinanter NGF ist.