DE69830582T2

DE69830582T2 - Verwendung von lactoferrin in der behandlung von beschwerden, die von allergenen verursacht sind

Info

Publication number: DE69830582T2
Application number: DE69830582T
Authority: DE
Inventors: Ian Knutsford KIMBER; Marie Wilmslow CUMBERBATCH; J. Rebecca Macclesfield DEARMAN; M. Orla CONNEELY; Pauline Ward
Original assignee: Agennix Inc
Current assignee: Agennix Inc
Priority date: 1997-04-10
Filing date: 1998-04-10
Publication date: 2006-05-04
Anticipated expiration: 2018-04-11
Also published as: NZ500712A; IL132293A0; WO1998044940A1; ES2245028T3; DE69830582D1; EP0979099A1; AU747385C; AU747385B2; CA2285960A1; AU6964798A; JP2001519815A; US20030190303A1; EP0979099B1; CN1262625A; ATE297755T1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Arzneimittel und Verwendungen davon für die Behandlung einer Allergen-induzierten entzündlichen Erkrankung, die ausgewählt ist aus Asthma und Kontaktdermatitis.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Lactoferrin (LF) ist ein Eisen-bindendes Glycoprotein mit 80 Kilodalton (kD), das in hohen Konzentrationen in Milch und in niedrigeren Konzentrationen in anderen Sekreten und Körperflüssigkeiten gefunden wird. Es ist eines einer Anzahl von Eisen-bindenden Proteinen, bezeichnet als Transferrine, die in der Bindung und Abgabe von Eisen in Säugern involviert ist. Montreuil und Mullet, 1960, C. R. Acad. Sci. Paris 250: 1736–1737; Montreuil et al., 1960, Biochem. Biophys. Acta 45: 413–421; Johansson, 1960, Acta Chem. Scand. 14: 510–512, Blanc und Isliker, 1961, Bull. Soc. Chim. Biol. 43: 929–943; Masson und Heremans, 1967, Protides Biol. Fluids Proc. Colloq. 21: 115–124; Querinjenn et al., 1971, Eur. J. Biochem. 20: 420–425; Leger et al., 1977, Biol. Anim. Biochim. Biophys. 17: 737–747.
Lactoferrin wurde ursprünglich in Milch entdeckt, wo es Mengen von 7 Gramm/Liter im Kolostrum erreichen kann. Seit dem ist es jedoch in einer Reihe von anderen Körperflüssigkeiten, einschließlich Tränen, Speichel und Schleimhautsekreten und auch in den sekundären Granula von polymorphonucleären Leukocyten nachgewiesen worden. Biserte et al., 1963, Exp. Ann. Biochim. Med. 25: 85–120; Masson, 1970, in: La Lactoferrine, S. 93–165, Arscia, Brüssel. Daher wird das Protein vorwiegend durch Drüsenepithelzellen und Neutrophile, die mit sowohl lokaler als auch zentraler Immunabwehr assoziiert sind, exprimiert.
Von Lactoferrin wurde gezeigt, dass es wichtige Rollen in Wirtsabwehr-Mechanismen auf Grund seiner gut etablierten antimikrobiellen Aktivitäten spielt. Die antimikrobiellen Aktionen von Lactoferrin scheinen zu mindestens zum Teil die Konsequenz der Eisen-bindenden Eigenschaften von Lactoferrin durch Sequestrierung von Eisen zu sein, das für mikrobielles Wachstum nötig ist.
Es wurde gezeigt, dass Lactoferrin-Produktion durch Lipopolysaccharide (LPS) induziert wird, die Bestandteile von bakteriellen Zellwänden sind. Gutteberg et al., 1990, Scan. J. Clin. Lab. Invest. 50: 421–427. Es gibt immer mehr Hinweise, dass Lactoferrin zusätzlich zu antimikrobiellen Aktivitäten angeborene und anpassungsfähige Immunvorgänge, einschließlich Funktion von natürlichen Killerzellen, beeinflussen, am Verlauf von Entzündung und Komplementaktivierung teilnehmen und Cytokinproduktion beeinflussen kann. Lash et al., 1983, Blood 61: 885–888; Mansson et al., 1990, Ann. Rheum. Dis. 49: 594–597; Van Snick et al., 1974, J. Exp. Med. 140: 1068–1084. In Bezug auf die letzteren ist sowohl in vivo als auch in vitro gezeigt worden, dass Lactoferrin die Produktion von Tumornekrose-Faktor-α (TNF-α) systemisch beeinträchtigen kann (Machnicki et al., 1993, Int. J. Exp. Path. 74: 433–439), ein Cytokin, dass wichtige Rollen für Entzündung, Sepsis und endotoxämischen Schock spielt (Beutler et al., 1985, Science 229: 869–871; Tracey et al., 1987, Curr. Opinion Immunol. 1: 454–461; Waage et al., 1989, J. Exp. Med., 169: 333–338; Kunkel et al., 1989, Crit. Rev. Immunol. 9: 93–117).
In früheren Untersuchungen fokussierte sich die Aufmerksamkeit jedoch auf die Regulierung von TNF-α-Produktion, die durch LPS ausgelöst wird. Machnicki et al., 1993, Int. J. Exp. Path. 74: 433–439; Gutteberg et al., 1990, APMIS 98: 1027–1032; und Gutteberg et al., 1991, APMIS 99: 602–608. Da von Lactoferrin bekannt ist, dass es direkt an LPS bindet, war es unsicher, ob die beobachtete Reduktion von TNF-α der transkriptionalen oder posttranskriptionalen Regulierung der Cytokine selbst oder der Reduktion durch Lactoferrin in der Verfügbarkeit von LPS auf Grund von direkter Bindung und Inaktivierung des Endotoxins zugeschrieben werden kann. Ellison und Giehl, 1991, J. Clin. Invest. 88: 1080–1091; Appelmelk et al., 1994, Infect. Immunity 62: 2628–2632. Es hat keine frühere Darstellung der Allergen-induzierten Effekte von Lactoferrin gegeben. Daher sind jetzt Versuche durchgeführt worden, um die Fähigkeit von homologem rekombinantem Lactoferrin zu untersuchen, die Induktion von TNF-α-abhängigen biologischen Antworten zu beeinflussen, wo Stimulierung von TNF-α-Expression unabhängig von LPS ist.
Eine cDNA, die Lactoferrin codiert, und Verfahren zur rekombinanten Produktion desselben sind offenbart worden durch Conneely et al. in U.S. Patent Nos. 5,571,896, 5,571,697 und 5,57/1,691. Die Produktion von Lactoferrin als ein Fusionsprodukt ist offenbart worden in U.S. Serien-Nos. 08/453,703, 08/456,106, beide eingereicht am 30. Mai 1995, und 08/691,123, eingereicht am 1. August 1996. Darüber hinaus ist die Verwendung von Lactoferrin zur Modulation oder Neutralisation der Heparinaktivität offenbart worden in U.S. Serien-No. 08/391,986, eingereicht am 21. Februar 1995. Zusätzlich sind Lactoferrin-Mutanten und Varianten davon offenbart worden in U.S. Serien-No. 08/866,544, eingereicht am 30. Mai 1997. Die Offenbarungen aller vorangehenden Patente und Anmeldungen sind hierin durch Bezugnahme in ihrer Gänze eingeschlossen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Lactoferrin unterdrückt die Induktion von Allergen-abhängigen entzündlichen Antworten. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass Lactoferrin TNF-α-abhängige Antworten hemmen kann, die nicht durch ein Endotoxin, d.h. die Lipopolysaccharid (LPS)-Komponente der Bakterienzellwand, induziert werden. Lactoferrin ist ein Wirkstoff für die Behandlung einer Vielzahl von entzündlichen Erkrankungen, die die Konsequenz von lokalen Immunreaktionen sind, die durch allergene Agenzien ausgelöst wurden.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Zusammensetzungen, die lokale entzündliche Reaktionen unterdrücken. Die Zusammensetzungen umfassen ein Lactoferrin und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Diese Zusammensetzungen können alternativ oder zusätzlich funktionelle Analoge oder funktionelle Fragmente von Lactoferrin einschließen, die die erwünschten inhibitorischen Aktivitäten auf die lokal induzierte TNF-α-abhängige Entzündung zeigen.
In einem anderen Aspekt liefert die Erfindung Verfahren zum Behandeln von Erkrankungen, die durch eine lokale Immunreaktion in einem Säuger charakterisiert sind, durch Verabreichung einer effektiven Menge einer Zusammensetzung, umfassend ein Lactoferrin und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Zusammensetzungen, die für die Behandlung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können alternativ oder zusätzlich funktionelle Analoge oder funktionelle Fragmente von Lactoferrin einschließen, die inhibitorische Aktivität auf die lokal-induzierte TNF-α-abhängigen entzündlichen Reaktionen zeigen.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind nützlich zur Behandlung einer Vielzahl von Indikationen, die die Konsequenz von lokalen Immunreaktionen sind. Solche Indikationen schließen allergische Kontaktdermatitis ein.
Schließlich können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in einem anderen Aspekt für die Behandlung von Asthma angewendet werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A beschreibt eine Zellmigrations-Kaskade in der Haut, die in einer lokalen Immunreaktion und Entzündung resultiert.
1B beschreibt eine Interaktion von Cytokinen, die durch Langerhans-Zellen und Keratinocyten in der Epidermis produziert werden, die eine lokale Immunantwort in der Haut auslösen.
2 beschreibt die Bindung von Lactoferrin an seine Rezeptoren auf TNF-α-produzierenden Keratinocyten in situ in neonataler Maushaut. Die zwei oberen Felder zeigen die Hell- und die Dunkelfeld-Bilder, die unter Verwendung von nur markiertem Lactoferrin erhalten wurden. Die zwei unteren Felder zeigen die Hell- und die Dunkelfeld-Bilder, wenn der Bindungsassay in der Anwesenheit von einem Übermaß an unmarkiertem Lactoferrin durchgeführt wurde.
3A beschreibt, dass die intradermale Verabreichung von Lactoferrin die Akkumulation von dendritischen Zellen in drainierenden Lymphknoten hemmt, die induziert wird durch Oxazolon, aber nicht jene, die durch Injektion von TNF-α stimuliert wird.
3B beschreibt, dass die intradermale Verabreichung von Lactoferrin sowohl die Oxazolon- als auch die IL-1β-induzierte Akkumulation von dendritischen Zellen in drainierenden Lymphknoten hemmt.
4 beschreibt den Einfluss von Lactoferrin auf TNF-α- und IL-1β-induzierte Migration von Langerhans-Zellen.
5 liefert Ergebnisse von zwei unabhängigen Versuchen (Felder A und B), die darauf hinweisen, dass die Behandlung mit Oxazolon eine Akkumulation von dendritischen Zellen in drainierenden Lymphknoten von Mäusen induzierte, die mit 0,02% BSA vorbehandelt wurden (siehe Säule 2, Felder A und B, gegen Säule 1, Kontrolle). Die örtliche Verabreichung von Maus-Lactoferrin resultiert in einer starken Hemmung der Akkumulation von dendritischen Zellen in den Lymphknoten als Antwort auf Oxazolon in beiden Versuchen (siehe Säule 3, Felder A und B). Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass örtlich verabreichtes Lactoferrin hoch wirksam ist in der Hemmung der Akkumulation dendritischer Zellen in Lymphknoten als Antwort auf ein Allergen und daher Allergen-induzierte Hautentzündung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Regulierung von Tumornekrose-Faktor-α (TNF-α)
Produktion durch Lactoferrin
Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Entdeckung, dass Lactoferrin und Analoge und Derivate davon, einschließlich verkürzter Moleküle, biologisch aktiver Fragmente und Mutanten, die Substitutionen und/oder Deletionen aufweisen, fähig sind zur Hemmung einer Vielzahl von Antworten, die die Produktion von TNF-α durch Endotoxin (LPS)-unabhängige Stoffwechsel benötigen.
Entzündliche Erkrankungen sind oft die Konsequenz von lokalen Immunreaktionen, die z.B. verursacht werden durch Aussetzen gegenüber Chemikalien, einschließlich exogen und endogen produzierter Chemikalien oder Allergenen, oder ausgelöst durch eine Autoimmunantwort. Solch eine entzündliche Reaktion wird durch Abfangen des Antigens durch immune „Langerhans"-Zellen verursacht, die in der Epidermis lokalisiert sind. Sobald das Antigen abgefangen ist, unterliegen die Lagerhans-Zellen einem Reifungs- oder Differenzierungs-Prozess, der ihnen erlaubt, sich von der Epidermis zu lösen und als reife dendritische Zellen (DCs) abwärts durch die Dermis der Haut zum lymphatischen System zu wandern. Sie können dann durch das lymphatische System zu den drainierenden Lymphknoten getragen werden, wo sie den T-Lymphocyten das verarbeitete Antigen auf deren Zelloberfläche präsentieren. Kimber und Cumberbatch, 1992, Toxicol. Appl. Pharmacol. 117: 137–146. Siehe 1A. Die aktivierten T-Zellen können durch Auslösen einer komplexen Immunreaktion antworten, die in der Invasion der Haut durch entzündliche weiße Blutzellen resultiert, um eine lokale entzündliche Antwort hervorzurufen.
Daher erfordern lokale Immunreaktionen z.B. cutane Immunität:

(1) das Erkennen und Abfangen eines Antigens durch Langerhans-Zellreifung und die Migration von dendritischen Zellen zu einem Lymphknoten;
(2) die Aktivierung von T-Zellen in den Lymphknoten durch ein Antigen, das dendritische Zellen präsentiert; und
(3) die nachfolgende Stimulierung der Rekrutierung von entzündlichen weißen Blutzellen in die Haut.

Jeder dieser Prozesse ist abhängig von einem oder mehreren Cytokinen, die dazu dienen, die Funktion der beteiligten Immunzellen zu regulieren.
Cytokine, die eine entzündliche Antwort auslösen, wie die cutane entzündliche Antwortkaskade, werden sowohl von Keratinocyten als auch Langerhans-Zellen der Epidermis produziert. Langerhans-Zellen sind in der Epidermis in enger Apposition zu Keratinocyten-Zellen lokalisiert, wie es aus 1B deutlich wird.
Die Induktion der Migration von Langerhans-Zellen durch chemische Allergene und die nachfolgende Akkumulation von dendritischen Zellen in drainierenden Lymphknoten ist abhängig von der lokalen Verfügbarkeit von TNF-α, einem Cytokin, das in der Epidermis durch Keratinocyten als Antwort auf eine Haut-Sensibilisierung oder andere Formen von Hauttrauma produziert wird. Cumberbatch und Kimber, 1992; Immunology 75: 257–263; Cumberbatch et al., 1994, Immunology 81: 395–401; Cumberbatch und Kimber, 1995, Immunology 84: 31–35. Die systemische Verabreichung eines neutralisierenden anti-TNF-α-Antikörpers hemmt fast völlig die Stimulierung der Migration von Langerhans-Zellen und die Akkumulation von dendritischen Zellen, die durch Chemikalien wie Oxazolon induziert wird. Cumberbatch und Kimber, 1995, supra. Die intradermale Verabreichung von homologem rekombinantem TNF-α ist alleine ausreichend, um die Migration von Langerhans-Zellen aus der Haut zu induzieren und um eine Steigerung in der Anzahl von dendritischen Zellen zu bewirken, die in drainierenden Lymphknoten gefunden werden. Cumberbatch und Kimber, 1992, supra; Cumberbatch et al., 1994, supra.
Die intradermale Verabreichung von Lactoferrin und funktionellen Analogen und funktionellen Fragmenten davon hemmt die Akkumulation von dendritischen Zellen in drainierenden Lymphknoten, die induziert ist durch Oxazolon, aber nicht jene, die stimuliert ist durch Injektion von TNF-α, wie gezeigt in 3A und Beispielen 2 und 3. Diese Daten sind im Einklang mit der negativen Regulierung durch Lactoferrin der Produktion von TNF-α durch Keratinocyten, von der bekannt ist, dass sie in Folge von Haut-Sensibilisierung stimuliert wird.
Es ist vor kurzem gezeigt worden, dass die Stimulierung der Migration von Langerhans-Zellen und Akkumulation von dendritischen Zellen auch abhängig ist von der lokalen Verfügbarkeit eines anderen epidermalen Cytokin, Interleukin-1β (IL-1β). Enk et al., 1993, J. Immunol. 150: 3698–3704. Dieses Cytokins wird konstitutiv in kleinen Mengen in Maus-Epidermis durch Langerhans-Zellen produziert, und seine Expression wird weiter als das Ergebnis von Haut-Sensibilisierung hinaufreguliert. Enk und Katz, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 1398; Enk und Katz, 1992, J. Invest. Dermatol. 99: S39–S41. Die systemische Verabreichung eines neutralisierenden anti-IL-1β-Antikörpers hemmt die Migration von Langerhans-Zellen und die Akkumulation von dendritischen Zellen. Enk et al., 1993, supra.
Es ist daher klar, dass eine effektive Migration von Langerhans-Zellen abhängig ist von der Verfügbarkeit von IL-1β und der de novo-Synthese von TNF-α durch Keratinocyten. Dies wird weiter bewiesen durch eine frühere Arbeit, die zeigt, dass die intradermale Verabreichung von IL-1β allein die Migration von Langerhans-Zellen induziert. Siehe 3B und Beispiele 2 und 3.
Lactoferrin inhibiert sowohl die Oxazolon-induzierte als auch die IL-1β-induzierte Akkumulation von dendritischen Zellen in drainierenden Lymphknoten. Daher beeinträchtigt Lactoferrin die IL-1β-induzierte Akkumulation von dendritischen Zellen, aber nicht jene, die induziert wird durch TNF-α (siehe 3A). Dies zeigt, dass der inhibitorische Effekt von Lactoferrin in der Cytokin-Kaskade, die die lokale Immunantwort auslöst, stromabwärts von IL-1β und stromaufwärts von TNF-α, liegt.
Darüber hinaus wird hierin gezeigt, dass Lactoferrin an Rezeptoren auf Keratinocyten bindet, was darauf hinweist, dass die Bindung von Lactoferrin an Keratinocyten die Produktion von TNF-α verhindert. Insbesondere zeigt 2 die Bindung von Lactoferrin an seine Rezeptoren auf TNF-α-produzierenden Keratinocyten in situ auf neonataler Maushaut. Die Bindung von Lactoferrin ist in der epidermalen Schicht und in den Schweißdrüsen, aber nicht in den normalen epidermalen Zellen konzentriert.
Die hierin offenbarten Versuchsergebnisse zeigen, dass der inhibitorische Effekt von Lactoferrin auf die Migration von Langerhans-Zellen und die Akkumulation von dendritischen Zellen eher auf Grund der negativen Regulierung von TNF-α-Produktion erfolgt als durch einen Einfluss auf einen anderen Aspekt der Funktion von Langerhans-Zellen. Daher ist Lactoferrin in der Lage, die de novo-Synthese von TNF-α durch die Bindung an Rezeptoren auf Keratinocyten zu hemmen.
Die Entwicklung einer Zwei-Lappen-Struktur hat Lactoferrin mit einzigartigen Eisenbindungs-Eigenschaften ausgestattet und trug zu anderen biologischen Funktionen des Moleküls bei. Basierend auf der Identifikation jener Domänen sind Sequenzen und Strukturen im Lactoferrin-Polypeptid, die zu den Eisenbindungs-Eigenschaften des Proteins beitragen, beschrieben in U.S. Serien-No. 08/866,544, eingereicht am 30. Mai 1997, die Offenbarung davon ist hierin durch Bezugnahme eingeschlossen. Diese Anmeldung liefert eine Richtlinie für die Gestaltung und Herstellung von neuen Lactoferrin-Varianten oder Teilen davon, die eine modifizierte Eisenbindungs-Kapazität aufweisen. Typischer Weise haben Lactoferrin-Varianten verbesserte Eigenschaften, einschließlich Lactoferrin-Varianten mit höherer Affinität für Eisen für verbesserte antimikrobielle Aktivitäten, Lactoferrin-Varianten mit niedrigerer Affinität für Eisen, die verbesserte Eisen-freigebende Eigenschaften aufweisen, oder Lactoferrin-Varianten, die modifizierte pH- oder Temperatur-Anforderungen oder Bereiche für die Bindung und/oder Freigabe von Eisen haben, sind aber nicht darauf beschränkt. In ähnlicher Weise liefern Lactoferrin-Varianten, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, typischer Weise eine verstärkte Hemmung von Interleukin-Aktivität, wie jene, die von IL-1β gezeigt wird. Zusätzlich ermöglicht die Erfindung die Gestaltung von Lactoferrin-Varianten, die sonstige verbesserte Charakteristika aufweisen, z.B. therapeutische Toleranz, Immunreaktivität oder biologische Halbwertszeit, während sie ihre biologische Aktivität beibehalten.
Die Lactoferrin-Varianten der Erfindung können vom Wildtyp-Lactoferrin einer Vielzahl von Säugerspezies abstammen, einschließlich aber nicht beschränkt auf menschliches, Maus-, Ratten-, bovines und porcines Lactoferrin. Das Wildtyp-Lactoferrin kann durch eine Vielzahl von Verfahren, die allgemein auf dem Fachgebiet bekannt sind, mutiert werden. Siehe unter anderen Stellen Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York; Kunkel et al., 1987, Meth. Enzymol. 154: 367–382; Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488–42.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Lactoferrin-Varianten der vorliegenden Erfindung mindestens eine Mutation in der Aminosäuresequenz. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfassen die Lactoferrin-Varianten der vorliegenden Erfindung eine verkürzte Aminosäuresequenz.
Die Nucleinsäuresequenzen, die Lactoferrin und Varianten davon gemäß der vorliegenden Erfindung codieren, können in einen Vektor, der geeignet ist zur Expression in einer eukaryontischen Zelle, in einer solchen Weise inseriert werden, die Expression der Lactoferrin-Variante erlaubt. Alternativ können Nucleinsäuresequenzen, die Teile der Lactoferrin-Varianten der Erfindung codieren, in Vektoren inseriert werden, die deren Expression in eukaryontischen Zellen erlauben.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird Lactoferrin in einem rekombinanten Expressionssystem produziert. Siehe z.B. Ward et al., 1992, Biotechnology 10: 784–789; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498–503. Zu diesem Zweck wird Nucleinsäure, die die erwünschte Form von Lactoferrin codiert (siehe z.B. U.S. Patent 5,571,691, durch Bezugnahme in seiner Gänze eingeschlossen), exprimierbar in einen zellulären Wirt inkorporiert, der dann unter Bedingungen gezüchtet wird, die geeignet sind zur Expression dieses bestimmten Peptids oder Proteins. Eine Vielzahl von Genexpressionssystemen ist zu diesem Zweck angepasst worden, welche typischer Weise die Expression des erwünschten Gens von Expressionskontrollen, die natürlicher Weise durch den gewählten Wirt verwendet werden steuern.
Da die Lactoferrin-Varianten der Erfindung typischer Weise wie natürlich vorkommendes Lactoferrin post-translationale Modifikationen wie Glycosylierung an einigen Aminosäureresten benötigen, müssen viele der Lactoferrin-Varianten oder Teile davon in einem eukaryontischen Wirt produziert werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Lactoferrin-Produkt durch ein Aspergillus-Expressionssystem produziert, wie beschrieben in Ward et al., 1992, Gene 122: 219–223; und U.S. Patent Nos. 5,571,896 und 5,571,697, die Offenbarungen davon sind hierin durch Bezugnahme in deren Gänze eingeschlossen.
Wenn unglycosylierte Formen von Lactoferrin-Varianten oder Teile davon produziert werden, kann deren Produktion jedoch praktisch in bakteriellen Wirten wie E. coli erzielt werden. Für eine solche Produktion kann eine Nucleinsäure, die die selektierte Lactoferrin-Variante oder den Teil davon codiert, nützlicher Weise unter eine Expressionskontrolle gesetzt werden, z.B. der lac-, trp- oder PL-Gene von E. coli.
Als eine Alternative zur Expression einer Nucleinsäure, die die Lactoferrin-Variante oder einem Teil davon per se codiert, kann der Wirt angepasst werden, um das Lactoferrin-Produkt als ein Fusionsprotein zu exprimieren, in dem das Lactoferrin-Produkt freisetzbar an ein Trägerprotein geknüpft ist, das die Isolierung und Stabilität des Expressionsprodukts ermöglicht.
In einer weiteren Alternative kann die Lactoferrin-Variante oder der Teil davon durch organische Synthese erzeugt werden. Insbesondere wo die Produktion eines Teils einer Lactoferrin-Variante z.B. eines Peptids von etwa zwanzig (20) bis etwa fünfzig (50) Aminosäuren Länge angestrebt wird, werden vorzugsweise die gut etablierten Verfahren von automatisierter Peptidsynthese angewendet, im Allgemeinen erscheinen Beschreibungen davon zum Beispiel in J. M. Stewart und J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Aufl., 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois; und in M. Bodanszky und A. Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York; Applied Biosystems 430A Benutzerhandbuch, 1987, ABI Inc., Foster City, California; und Solid Phase Peptide Synthesis. A practical Approach, von: E. Atherton & R. C. Sheppard, IRL Press, Oxford (1989). In diesen Techniken wird der Lactoferrin-Varianten-Teil von seinem C-terminalen, Harz-konjugierten Rest durch die sequenzielle Zugabe von geeignet geschützten Aminosäuren unter Verwendung von entweder den Fmox- oder tBox-Vorschriften verlängert.
Arzneimittel, die Lactoferrin enthalten
Lactoferrin und Lactoferrin-Produkte. Der Ausdruck „Lactoferrin" bezieht sich hierin insgesamt auf natürliche oder rekombinant produzierte Formen von Lactoferrin, im besonderen Säuger-Formen außer, wenn es anderweitig angegeben ist. Der Ausdruck „Lactoferrin-Produkte" wie hierin verwendet bezieht sich insgesamt auf Lactoferrin und funktionelle Analoge und funktionelle Fragmente davon, die nützlich sein können, um die Erfindung auszuführen. Insbesondere umfasst der Ausdruck zum Beispiel verkürztes Lactoferrin und Lactoferrin, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren substituiert oder deletiert worden sind. „Funktionelle Analoge und funktionelle Fragmente" von Lactoferrin beziehen sich auf Lactoferrin-Mutanten und Derivate, beziehungsweise Lactoferrin-abstammende Peptide, die die Eigenschaft aufweisen, die Produktion von TNF-α in einer Zelle zu hemmen. Im Allgemeinen sind das Lactoferrin, die funktionellen Lactoferrin-Analoge und funktionellen Fragmente davon, die durch die Erfindung umfasst werden, in der Lage, eine unpassende oder übertriebene lokale Immunreaktion, die die Produktion von TNF-α involviert, zu hemmen.
Lactoferrin-Analoge oder Lactoferrin-abstammende Peptide können zur Identifizierung von funktionellen Analogen oder funktionellen Fragmenten durch zum Beispiel das Mausmodell, das hierin in Beispiel 2 beschrieben wird, getestet werden. Siehe auch Cumberbatch und Kimber, 1992, Immunology 75: 257–263. Kurz gesagt, involviert das Testen die Induktion einer lokalen Immunantwort durch Verabreichen eines Allergens z.B. Oxazolon auf die rasierte Haut von Mäusen. Eine Stunde später wird den Mäusen intradermal an der Oxazolon-behandelten Stelle etwa 0,002% bis etwa 0,5% Lactoferrin-Analog oder -Fragment, das getestet werden soll, in Salzlösung injiziert. Einer zweiten und einer dritten Gruppe von Tieren wird Lactoferrin beziehungsweise BSA im gleichen Konzentrationsbereich und im gleichen Puffer injiziert. Nach etwa 12 Stunden können die Tiere getötet, und die drainierenden Lymphknoten gewonnen werden. Der Vergleich der Zahlen von akkumulierten dendritischen Zellen, die wie in Cumberbatch und Kimber vorstehend beschrieben bestimmt werden können, wird die Wirksamkeit eines Lactoferrin-Analogs oder -Fragments und seine Nützlichkeit für die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung zeigen.
Im Allgemeinen kann jede Substitution, Addition oder Deletion von Lactoferrin, die nicht seine Rezeptor-vermittelten inhibitorischen Effekte auf die Produktion von TNF-α als Teil einer ungeeigneten oder übertriebenen Immunantwort zerstört, nützlicher Weise in dieser Erfindung angewendet werden. Fachleute können solche Substitutionen, Additionen und Deletionen ohne unzumutbare Versuche durchführen. In bevorzugten Ausführungsformen sind die funktionellen Lactoferrin-Analoge oder funktionellen Fragmente im Wesentlichen so effektiv wie natives menschliches Lactoferrin. In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen haben die funktionellen Lactoferrin-Analoge oder funktionellen Fragmente eine verstärkte TNF-α-herunterregulierende Aktivität im Vergleich zum nativen menschlichen Lactoferrin. Zum Beispiel können solche funktionellen Analoge oder funktionellen Fragmente eine verstärkte Serumstabilität, verstärkte Rezeptorbindung und verstärkte Signaltransduktions-Aktivität zeigen. Andere Modifikationen von Lactoferrin und funktionellen Lactoferrin-Analogen und funktionellen Fragmenten, die nützlicher Weise in dieser Erfindung angewendet werden können, sind jene, die das Molekül leichter bioverfügbar für Stellen der Entzündung macht. Zum Beispiel kann das funktionelle Lactoferrin-Analog oder funktionelle Fragment in Fällen, wo das Lactoferrin-Produkt örtlich verabreicht wird, verstärkte percutane Absorption zeigen.
Die besonderen Lactoferrin-Produkte gemäß der vorliegenden Erfindung können durch eine Vielzahl von Techniken, die zum Erzeugen von Proteinprodukten wohlbekannt sind, hergestellt werden. Jene Formen von Lactoferrin, die natürlich vorkommen, können natürlich durch Extraktion aus der natürlichen Quelle erhalten werden, z.B. Säuger-, am bevorzugtesten menschliche Milch unter Verwendung einer geeigneten Kombination von Proteinisolierungs-Techniken. Zum Beispiel wird, wie beschrieben in Cheron et al., 1977, C. R. Acad. Sci. Paris 284: 585–588, eine Lactoferrinisolierung durch sequenzielle Extraktion und Aufreinigung mit Sephadex G-25, G-50, G-75 und G-100 erreicht.
Als eine Alternative zur Extraktion können jene Formen von Lactoferrin, die nur L-Aminosäuren inkorporieren, wiederholbar und in kommerziellen Mengen durch Anwendung von rekombinanter DNA-Technologie produziert werden. Siehe z.B. Ward et al., 1992, Biotechnology 10: 784–789; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498–503. Zu diesem Zweck können Nucleinsäuren, die die erwünschte Form von Lactoferrin codieren (siehe z.B. U.S. Patent 5,571,691, durch Bezugnahme in seiner Gänze eingeschlossen), exprimierbar in einen zellulären Wirt inkorporiert werden, der dann unter Bendingungen gezüchtet wird, die geeignet sind für die Expression dieses bestimmten Peptids oder Proteins. Eine Vielzahl von Genexpressionssystemen ist zu diesem Zweck angepasst worden und lenkt typischer Weise die Expression des erwünschten Gens von Expressionskontrollen, die natürlicher Weise durch den gewählten Wirt verwendet werden.
Da Lactoferrin in seiner natürlichen Form post-translationale Modifikationen wie die Glycosylierung an einigen Aminosäureresten benötigt, müssen viele der Lactoferrine, funktionellen Analoge oder funktionellen Fragmente davon gemäß der vorliegenden Erfindung in einem eukaryontischen Wirt produziert werden. In bevorzugten Ausführungsformen kann das Lactoferrin-Produkt durch ein Aspergillus-Expressionssystem produziert werden, wie beschrieben von Ward et al., 1992, Gene 122: 219–223; und U.S. Patent Nos. 5,571,896 und 5,571,697, die hierin durch Bezugnahme in deren Gänze eingeschlossen sind.
Wenn unglycosylierte Formen, funktionelle Analoge oder funktionelle Fragmente von Lactoferrin verwendet werden, kann deren Produktion jedoch bequem in bakteriellen Wirten wie E. coli erreicht werden. Für eine solche Produktion kann eine Nucleinsäure, die das ausgewählte Lactoferrin, funktionelle Analog oder funktionelle Fragment davon codiert, unter eine Expressionskontrolle von z.B. den lac-, trp- oder PL-Genen von E. coli gesetzt werden.
Als eine Alternative zum Exprimieren einer Nucleinsäure, die das Lactoferrin, funktionelle Analog oder funktionelle Fragment davon per se codiert, kann ein Wirt angepasst werden, um das Lactoferrin-Produkt als ein Fusionsprotein zu exprimieren, in dem das Lactoferrin-Produkt freisetzbar mit einem Trägerprotein verknüpft ist, das die Isolierung und Stabilität des Expressionsprodukts erleichtert.
In einer weiteren Alternative kann das Lactoferrin-Produkt durch organische Synthese hergestellt werden. Im Speziellen, wo das Lactoferrin-Produkt ein funktionelles Fragment, z.B. ein Peptid von etwa zwanzig (20) bis etwa fünfzig (50) Aminosäuren Länge ist, werden die gut etablierten Techniken von automatisierter Peptidsynthese angewendet. Allgemeine Beschreibungen von beispielhaften Peptidsynthesen erscheinen zum Beispiel in J. M. Stewart und J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Aufl., 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois; und in M. Bodanszky und A. Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York; Applied Biosystems 430A Benutzerhandbuch, 1987, ABI Inc., Foster City, California; und Solid Phase Peptide Synthesis – A Practical Approach, von: E. Atherton & R. C. Sheppard, IRL Press, Oxford (1989). In diesen Techniken kann das Lactoferrin-Fragment von seinem C-terminalen, Harz-konjugierten Rest durch die sequenzielle Addition von geeignet geschützten Aminosäuren unter Verwendung von entweder den Fmoc- oder tBoc-Vorschriften verlängert werden.
In einem alternativen Ansatz können die funktionellen Lactoferrin-Fragmente, die für die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung nützlich sind, durch Peptidase-Verdau oder Hydrolyse eines aufgereinigten Lactoferrins oder Lactoferrin-Produkts erhalten werden. Natürlich können Lactoferrin-Fragmente auch durch rekombinante Expression in einem geeigneten Wirt wie vorstehen dargelegt produziert werden. Die Erfindung umfasst auch die Verwendung von chemisch modifizierten Lactoferrin-Produkten, einschließlich Methylierungen, Carboxylierungen, etc.
Pharmazeutische Präparate und Wege der Verabreichung. Zur therapeutischen Verwendung kann (können) das (die) Lactoferrin-Produkte) gemäß der vorliegenden Erfindung durch alle verfügbaren konventionellen Mittel zur Verwendung in Verbindung mit Pharmazeutika, entweder individuelle therapeutische Mittel oder in einer Kombination von therapeutischen Mitteln verabreicht werden. Jedes kann allein verabreicht werden, aber wird im Allgemeinen mit einem pharmazeutischen Träger, der auf das Basis des gewählten Verabreichungsegs und Standard-pharmazeutischer Praxis ausgewählt wurde, verabreicht werden. Die Arzneimittel der Erfindung können angepasst werden für orale, parenterale, örtliche oder rektale Verabreichung oder als ein Inhalat und können in Einheitsdosierungsform in einer Weise vorliegen, die pharmazeutischen Fachleuten wohlbekannt ist. Eine parenterale Verabreichung schließt subcutane, intravenöse, intraperitoneale oder intramusculäre Injektion ein, ist aber nicht darauf eingeschränkt.
Die Behandlung mit dem Wirkstoff kann zu jeder Zeit nachdem die zu behandelnde Indikation diagnostiziert wurde beginnen, z.B. Psoriasis, Kontaktdermatitis, UV-induzierte Entzündung, Säuglings-Windelausschlag, Asthma, Arthritis und dergleichen. Vorzugsweise wird die Behandlung als eine prophylaktische oder in frühen Stadien der Erkrankungen eingeleitet, um massive Entzündung von vornherein zu verhindern. Typischer Weise wird die Behandlung fortgesetzt, bis die Entzündung geheilt ist. In Fällen von chronischen Krankheiten wie Psoriasis, Asthma oder Arthritis oder in Fällen von kontinuierlichem Ausgesetztsein gegenüber einem Allergen kann die Behandlung über die Heilung der Symptome hinaus fortgesetzt werden müssen. Da Lactoferrin ein natürlich vorkommendes nicht-toxisches Protein ist, werden Nebenwirkungen nicht einmal in Fällen einer Langzeit-Behandlung erwartet.
Die verabreichte Dosis wird natürlich variieren, abhängig von bekannten Faktoren wie (1) den pharmakodynamischen Charakteristika des bestimmten Lactoferrin-Produkts und von Art und Weg der Verabreichung, (2) dem Alter, Gesundheitszustand, der Größe und dem Gewicht des Empfängers, (3) der Natur und dem Ausmaß der Symptome, (4) der Art von gleichzeitiger Behandlung(en), (5) der Häufigkeit der Behandlungen) und (6) dem erwünschten Effekt. Eine tägliche Dosis des Wirkstoffs kann etwa 1 Milligramm bis etwa 1,2 Gramm pro Kilogramm Körpergewicht sein, wobei die bevorzugte Dosis 50 Milligramm bis etwa 500 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht ist. Wenn der Wirkstoff örtlich auf die Haut oder in einem Inhalat verabreicht wird, wird der Wirkstoff typischer Weise in 0,005% bis etwa 5% gemischt mit dem Träger verabreicht, vorzugsweise sind es etwa 0,05% bis etwa 0,5% gemischt mit dem Träger.
Dosierungsformen (Zusammensetzungen, die geeignet sind zur Verabreichung) enthalten von etwa 0,005% bis etwa 0,5% des Wirkstoffs pro Einheit. In diesen Arzneimitteln ist der Wirkstoff gewöhnlich in einer Menge von etwa 0,5–95 Gewichts-% vorhanden, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung.
Typischer Weise wird der Wirkstoff örtlich als Inhalat oder als Injektion in entzündete Gelenke oder Knorpel verabreicht. Alternativ können die Lactoferrin-Produkte jedoch oral in festen oder halbfesten Dosierungsformen wie Hart- oder Weichgelatinekapseln, Tabletten oder Pulver oder in flüssigen Dosierungsformen wie als Elixiere, Sirupe oder Suspensionen verabreicht werden. Er kann auch parenteral in sterilen Flüssig-Dosierungsformen verabreicht werden. Andere Dosierungsformen sind potenziell möglich, wie Pflaster oder Salbe oder transdermale Verabreichung.
Die Lactoferrin-Produkte der Erfindung können auch als eine Implantationsvorrichtung mit langsamer Freisetzung für verlängerte und aufrechterhaltende Verabreichung des Lactoferrin-Produkts formuliert werden. Beispiele solcher Präparate mit verzögerter Freisetzung schließen Komposite von biokompatiblen Polymeren ein, wie Poly(Milchsäure), Poly(Milch-co-Glycolsäure), Methylcellulose, Hyaluronsäure, Kollagen und dergleichen. Die Struktur, Selektion und Verwendung von degradierbaren Polymeren in Arzneistoff-Abgabevehikeln ist in einigen Veröffentlichungen besprochen worden, einschließlich A. Domb et al., Polymers for Advanced Technologies 3: 279–292 (1992). Eine zusätzliche Anleitung für die Selektion und Verwendung von Polymeren in pharmazeutischen Präparaten kann gefunden werden im Text von M. Chasin und R. Langer (Ed.), „Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems", Bd. 45 von „Drugs and the Pharmaceutical Sciences", M. Dekker, New York, 1990. Liposome können auch verwendet werden, um die verzögerte Freisetzung eines Lactoferrin-Produkts zu liefern. Details, wie liposomale Präparate von Arzneistoffen von Interesse verwendet und gemacht werden, können gefunden werden unter anderem in U.S. Pat. No. 4,944,948; U.S. Pat. No. 5,008,050; U.S. Pat. No. 4,921,706; U.S. Pat. No. 4,927,637; U.S. Pat. No. 4,452,747; U.S. Pat. No. 4,016,100; U.S. Pat. No. 4,311,712; U.S. Pat. No. 4,370,349; U.S. Pat. No. 4,372,949; U.S. Pat. No. 4,529,561; U.S. Pat. No. 5,009,956; U.S. Pat. No. 4,725,442; U.S. Pat. No. 4,737,323; U.S. Pat. No. 4,920,016. Präparate mit verzögerter Freisetzung sind von besonderem Interesse, wenn es wünschenswert ist, eine hohe lokale Konzentration eines Lactoferrin-Produkts zu liefern.
Gelatinekapseln oder Flüssigkeits-gefüllte, Weichgelatinekapseln können den Wirkstoff und pulverförmige oder flüssige Träger wie Lactose, Lecitin-Stärke, Cellulose-Derivate, Magnesiumstearat, Stearinsäure und dergleichen enthalten. Ähnliche Verdünner können verwendet werden, um gepresste Tabletten herzustellen. Sowohl Tabletten als auch Kapseln können als Produkte mit verzögerter Freisetzung hergestellt werden, um kontinuierliche Freisetzung der Medikation über einen Zeitraum von Stunden zu liefern. Gepresste Tabletten können Zucker-beschichtet oder Film-beschichtet sein, um jeglichen unangenehmen Geschmack zu maskieren und die Tablette vor der Atmosphäre zu schützen, oder enteral beschichtet sein für den selektiven Zerfall im gastrointestinalen Trakt. Flüssige Dosierungsformen für die orale Verabreichung können Farbstoffe und/oder Geschmacksstoffe enthalten, um die Akzeptanz durch den Patienten zu erhöhen.
Geeignete pharmazeutische Träger sind darüber hinaus beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Aufl., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990), einem Standard-Referenztext auf diesem Gebiet, der hierin durch Bezugnahme in seiner Gänze eingeschlossen ist.
In bevorzugten Ausführungsformen können Arzneimittel, die Lactoferrin-Produkte umfassen, örtlich zur Behandlung von allergischen Hauterkrankungen, als ein Inhalat zur Behandlung von entzündlichen Lungenerkrankungen wie Asthma, in der Form eines Nasensprays für Rhinitis und Sinusitis oder in der Form von Injektionen für die Behandlung von Arthritis verabreicht werden. Neben dem Lactoferrin-Produkt können diese Zusammensetzungen zusätzliche aktive Komponenten, einschließlich Hydrocortison, Retinsäure oder konventionelle Zusätze, die für derzeitige örtliche Therapien verwendet werden, umfassen, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Die bevorzugten pharmazeutischen Dosierungsformen für die Verabreichung der Lactoferrin-Produkte dieser Erfindung können wie folgt dargestellt werden:
Örtliches Präparat
In Fällen, wo die Behandlung von entzündlichen Hauterkrankungen erwünscht ist, wird der bevorzugte Weg der Verabreichung typischer Weise örtlich sein. Da Lactoferrin z.B. von Schweißdrüsen abgesondert wird (Masson et al., 1966, Clin. Chem. Axta 14: 735–739), kann von Lactoferrin-Produkten im Allgemeinen erwartet werden, dass sie durch die Poren der Haut eindringen, wenn sie örtlich verabreicht werden. Die Verfügbarkeit der aktiven Substanz an der Stelle ihrer Wirkung wird darüber hinaus dadurch vermindert sein, dass die Entzündung typischer Weise von einer Zerstörung der Oberfläche der Haut begleitet ist. Alternativ können Substanzen, die die Penetration durch die Haut verstärken, dem Präparat zugefügt werden.
Im Allgemeinen können die Lactoferrin-Produkte für die örtliche Anwendung als eine Lösung, ein Gel, eine Lotion, Salbe, Creme, Suspension, Paste, ein Einreibemittel, Pulver, eine Tinktur, ein Aerosol, transdermales Arzneistoff-Abgabesystem und dergleichen in einer pharmazeutisch verträglichen Form durch Verfahren, die in dem Fachgebiet wohlbekannt sind, formuliert werden. Aktuelle Verfahren zum Herstellen von örtlichen Präparaten sind bekannt oder offensichtlich für Fachpersonen und sind im Detail beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Aufl., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990); und Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6. Aufl., Williams & Wilkins (1995).
Um die percutane Absorption der Wirkstoffe zu verstärken, kann eine Anzahl von Agenzien zu örtlichen Präparaten zugefügt werden, einschließlich Dimethylsulfoxid, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, oberflächenaktive Substanzen, Azon, Alkohol, Aceton, Propylenglycol und Polyethylenglycol, aber nicht darauf eingeschränkt. Zusätzlich können auch physikalische Verfahren verwendet werden, um die transdermale Penetration zu verstärken, wie Iontophorese oder Sonophorese.
Die Arzneimittel können direkt auf die Haut angewendet werden. Alternativ können sie durch verschiedene transdermale Arzneistoff-Abgabesysteme wie Pflaster abgegeben werden.
Präparate für Inhalate
Insbesondere für die Behandlung von entzündlichen Lungenerkrankungen wie Asthma und Bronchitis werden Zusammensetzungen, die das Lactoferrin-Produkt umfassen, typischer Weise als ein Inhalat verabreicht.
Im Allgemeinen kann das Lactoferrin-Produkt unter Verwendung eines konventionellen Inhalators verabreicht werden. Das Lactoferrin-Produkt kann alleine verabreicht werden, oder es kann zusammen mit anderen Inhalationsaerosolen verabreicht werden, einschließlich beta-adrenergische Agonisten, z.B. Albuterol-Inhalationsaerosole, Salmeterol-Xinafoat-Inhalationsaerosole, Terbutalinsulfat-Inhalationsaerosole; adrenocorticale Steroide z.B. Beclomethason-Diproprionat-Inhalationsaerosole; Antiasthmatika, Antiallergika oder Mastzellen-Stabilisatoren z.B. Cromolynnatrium-Inhalationsaerosole; antiinflammatorische Aerosole z.B. Triamcinolonacetonid-örtliches Aerosol; anticholinergische Mittel z.B. Ipratropiumbromid-Inhalationsaerosole; oder sympathomimetische Substanzen, z.B. Isoetharinmesylat-Inhalationsaerosole und Metaproterenolsulfat-Inhalationsaerosol, aber nicht darauf eingeschränkt. Zur weiteren Information werden zusätzliche Lehren auf diesem Gebiet in Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, von Ansel et al., Williams & Wilkins, PA (1995) bereitgestellt.
Präparate für Sprays
Insbesondere für die Behandlung von Rhinitis, Sinusitis und Sonnenbrand werden Zusammensetzungen, die das Lactoferrin-Produkt umfassen, typischer Weise als ein Spray verabreicht.
Im Allgemeinen kann das Lactoferrin-Produkt unter Verwendung einer konventionellen Spray-Vorrichtung wie jenen, die kommerziell erhältlich sind, verabreicht werden. Das Lactoferrin-Produkt kann alleine verabreicht werden, oder es kann zusammen mit anderen Substanzen verabreicht werden, einschließlich Antihistaminika, sympathomimetische Agenzien und Antibiotika, aber nicht darauf eingeschränkt. Darüber hinaus kann das Lactoferrin-Produkt in medizinischen Sprays wie Natriumchlorid-Nasenlösung (Salinex-Lösung (Muro)) oder Xylometazolin-hydrochlorid-Nasenlösung (Sine-Off (SmithKline Beecham)) oder funktionell analogen Sprays verabreicht werden. Zur weiteren Information sind zusätzliche Lehren auf diesem Gebiet in Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, vorstehend, enthalten.
Präparate für Injektionen
Insbesondere für die Behandlung von Arthritis und Cellulitis können die Zusammensetzungen, die ein Lactoferrin-Produkt umfassen, durch Injektion z.B. lokal in das erkrankte Gelenk oder den Knorpel oder systemisch verabreicht werden.
Im Allgemeinen sind Wasser, Öl, Salzlösung, wässrige Dextrose (Glucose), Polysorbat und verwandte Zuckerlösungen und Glycole wie Propylenglycol oder Polyethylenglycole geeignete Träger für parenterale Lösungen. Lösungen oder Emulsionen für parenterale Verabreichung enthalten vorzugsweise etwa 5–15% Polysorbat 80 oder Lecithin, geeignete Stabilisierungsmittel und wenn nötig Puffersubstanzen. Antioxidationsmittel wie Natriumbisulfit, Natriumsulfit oder Ascorbinsäure, aber nicht darauf eingeschränkt, entweder allein oder kombiniert sind geeignete Stabilisierungsmittel. Citronensäure und seine Salze und Natrium-EDTA werden auch verwendet. Zusätzlich können parenterale Lösungen Konservierungsmittel, einschließlich Benzalkoniumchlorid, Methyl- oder Propylparaben und Chlorbutanol, aber nicht darauf eingeschränkt, enthalten.
Weitere geeignete pharmazeutische Träger für parenterale Verabreichung sind beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, vorstehend.
Indikationen
Wie vorstehend diskutiert, spielt TNF-α wichtige Rollen in der Pathogenese und/oder Progression einer Vielzahl von akuten und chronischen entzündlichen Erkrankungsprozessen. Als eine Konsequenz hat es beträchtliches Interesse an der Gestaltung von synthetischen Inhibitoren der TNF-α-Produktion gegeben, die therapeutisch verwendet werden können. Die hier aufgeführten Beweise legen nahe, dass Lactoferrin-Produkte ein Mittel zur Regulierung der TNF-α-Produktion liefern. Die potenziellen therapeutischen Anwendungen von Lactoferrin, die von diesen Daten abgeleitet sind, sind viele und schließen die Behandlung der folgend diskutierten entzündlichen Erkrankungen in einem Säuger, insbesondere einem Menschen, der sie benötigt, ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Kontaktdermatitis
Kontaktdermatitis ist eine ekzematöse Dermatitis, die durch Ausgesetztsein gegen Substanzen in der Umwelt verursacht wird. Jene Substanzen wirken als Reizstoffe oder Allergene und können akute, subakute oder chronische ekzematöse Entzündung bewirken. Reizende Kontaktdermatitis, d.h. Reizung der Haut, ist die häufigste Form von Kontaktdermatitis. Milde Reizstoffe können Trockenheit, Sprödheit und Erythem verursachen, wenn das Ausgesetztsein kontinuierlich ist. Zum Beispiel kann kontinuierliches Ausgesetztsein gegenüber Feuchtigkeit in Bereichen wie der Hand, dem Windelbereich, z.B. Säuglings-Windelausschlag oder die Haut rund um eine Colostomie irgendwann eine ekzematöse Entzündung bewirken. Starke Chemikalien können eine unmittelbare Reaktion produzieren. Siehe T. P. Habif, in: Clinical Dermatology, Mosby, Missouri (1996) und The Textbook of Medicine, Ed.: J. B. Wyngaarden und L. H. Smith, W., W. B. Saundres Company, Philadelphia (1985).
Allergische Kontaktdermatitis ist im Gegensatz zur reizenden Kontaktdermatitis eine verzögerte Hypersensibilisierungsreaktion, die eine begrenzte Anzahl von Individuen nach einmaligem oder mehrmaligem Ausgesetztsein gegenüber einer Substanz, die antigene Aktivität auf das bestimmte Individuum zeigt, betrifft.
Von sowohl reizender als auch allergischer Kontaktdermatitis wird angenommen, dass sie durch eine lokale Immunkaskade ausgelöst wird, die eine de novo-Expression von TNF-α in Keratinocyten, wie vorstehend erklärt, beinhaltet.
Derzeitige Behandlungsverfahren und deren Nachteile. Akute Kontaktdermatitis wird derzeit mit kalten feuchten Verbänden behandelt, begleitet von der Verabreichung von Steroiden z.B. Hydrocortison, Prednisolon, Methylprednisolon und in schweren Fällen fluorierten Corticosteroiden, die hochwirksame anti-inflammatorische Mittel in sehr niedrigen Konzentrationen sind. Weniger wirksam als die fluorierten Steroide, werden Hydrocortison, Prednisolon und Methylprednisolon für weniger schwere Fälle verwendet. Abhängig von der Schwere der Entzündung werden die Steroide örtlich oder systemisch angewendet.
Viele negative Effekte sind jedoch für Steroide, besonders im Fall der hochwirksamen fluorierten Steroide berichtet worden. Zum Beispiel können eine epidermale und eine dermale Atrophie ein ausgeprägter negativer Effekt sein, und eine erniedrigte Kollagensynthese und eine reduzierte Stroma-Unterstützung für Blutgefäße können zu Telangiectasie, Purpura und Striae führen. Eine periorale Dermatitis ist auch mit den fluorierten Steroiden berichtet worden, sowie die Verschlimmerung von Gesichtserythem, was das Ausmaß der Verwendung dieser Verbindungen für das Gesicht absolut einschränkt. Darüber hinaus rechtfertigt ein möglicher erhöhter intraoculärer Druck ein strenges Verbot der langfristigen Anwendung von jeglichen örtlichen Steroiden nahe dem Auge.
Die Tatsache von systemischer Absorption von örtlichen Steroiden bietet eine zusätzliche Gefahr. Eine Erniedrigung des Plasma-Cortisolwerts wird nur in 20 Prozent des Körpers unter Occlusion beobachtet. Das Risiko eines Rückschlags nach dem Absetzen von Steroiden in jenen Hauterkrankungen, die durch das Phänomen charakterisiert sind, kann nicht übersehen werden.
Insgesamt ist die Notwendigkeit für Behandlungsverfahren mit niedriger Toxizität für Kontaktdermatitis offensichtlich.
Verbesserte Behandlungsverfahren, die durch die vorliegende Erfindung geliefert werden. Die vorliegende Erfindung liefert neue Arzneimittel, umfassend ein Lactoferrin-Produkt, für die Behandlung von Kontaktdermatitis. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zusammensetzungen für eine örtliche Anwendung formuliert. Insbesondere kann das Lactoferrin-Produkt in der Form von Lotionen, Cremen, Salben und dergleichen in Konzentrationen von etwa 0,005% bis etwa 5%, in bevorzugten Ausführungsformen in Konzentrationen von etwa 0,01% bis etwa 0,5% Wirkstoff verabreicht werden. Typischer Weise wird die Zusammensetzung Zusätze umfassen, die konventionell für örtliche Verabreichung verwendet werden. Siehe vorstehend. In alternativen Ausführungsformen werden die Zusammensetzungen für intradermale Injektionen formuliert. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung interferieren direkt mit der Produktion von TNF-α durch Keratinocyten, und verhindern so eine übersteigerte lokale Immunantwort, die der eigentliche Grund der Reizung sowie allergische Kontaktdermatitis ist. Da von Lactoferrin bekannt ist, dass es ein nicht-toxisches Protein ist, werden die gelieferten Zusammensetzungen keine nachweisbaren Nebenwirkungen haben.
Entzündliche Lungenerkrankungen
Entzündliche Lungenerkrankungen wie allergisches Asthma und Bronchitis sind Erkrankungen, die durch verstärkte Reaktion der Trachea und Bronchien auf verschiedene Reize, d.h. Allergene, charakterisiert sind, die in einem weit verbreiteten Verengen der Luftwege resultieren. Zum Beispiel ist Asthma eine entzündliche Reaktion des Respirationssystems als Antwort auf externe Reize. In schweren Fällen kann Asthma den Tod durch Mangel an Sauerstoffzufuhr bewirken, und kann bis zu fünf Prozent der Bevölkerung in den Vereinigten Staaten betreffen. In über der Hälfte der Fälle wird Asthma zwischen dem Alter von zwei (2) und siebzehn (17) Jahren diagnostiziert, und in dieser Gruppe ist es die Hauptursache für Krankheit und Behinderung. Siehe The Textbook of Medicine, Ed.: J. B. Wyngaarden und L. H. Smith, W., W. B. Saundres Company, Philadelphia (1985).
Derzeitige Behandlungsverfahren und deren Nachteile. Derzeitige Behandlungsverfahren schließen die Verabreichung von sympathomimetischen Arzneistoffen, Methylxanthinen und Corticosteroiden ein. Sympathomimetische Arzneistoffe, einschließlich Epinephrin und Isoproterenol, haben einen beta-adrenergischen Effekt. Ihre Nützlichkeit ist durch deren Wirkungen auf das Herz eingeschränkt, darüber hinaus entwickelt sich Toleranz nach wiederholter Anwendung. Methylxanthine, von denen man glaubt, dass sie Relaxation der glatten Muskulatur durch deren Wirkung auf das cytoplasmatische Enzym Phosphodiesterase bewirken, verursachen in vielen Fällen Anorexie, Nausea, gastrointestinale Reizung und Reizbarkeit des zentralnervalen Systems. Corticosteroide sind sehr effektiv in der Behandlung von Asthma, sie haben jedoch schwere Nebenwirkungen wie vorstehend diskutiert. Es gibt daher eine Notwendigkeit für neue Zusammensetzungen und Verfahren für die Behandlung von Asthma, die effektiv sind, während sie eine niedrige Toxizität haben.
Verbesserte Zusammensetzungen, die durch die vorliegende Erfindung geliefert werden. Die vorliegende Erfindung liefert neue Zusammensetzungen, umfassend ein Lactoferrin-Produkt, und Verfahren für die Behandlung von Asthma. Typischer Weise werden die Zusammensetzungen als ein Inhalat verabreicht. Alternativ können die Zusammensetzungen, die das Lactoferrin-Produkt umfassen, systemisch durch Injektion oder in Form von Tabletten, Kapseln oder in Formen mit verzögerter Freisetzung verabreicht werden. Sogar in einer hohen Dosierung werden die Zusammensetzungen der Erfindung keine signifikanten Nebenwirkungen haben, da Lactoferrin ein natürliches, nicht-toxisches Protein ist.
Die untenstehenden Beispiele erklären die Erfindung in mehr Detail. Die folgenden Präparate und Beispiele sind angegeben, um Fachleuten zu ermöglichen, die vorliegende Erfindung deutlicher zu verstehen und anzuwenden.
BEISPIELE DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Beispiel 1
Bindung von Lactoferrin an Rezeptoren, die auf TNF-α-produzierenden Keratinocyten lokalisiert sind
Das folgende Beispiel ist ein in situ-Liganden-Bindungsassay, der die Bindung von ¹²⁵J-Lactoferrin an Keratinocyten in der epidermalen Schicht von neonataler Maushaut zeigt.
Versuchsablauf. Ungefähr 2 mm²-Proben von Rückenhaut von einer neugeborenen Wildtyp-Maus wurden erhalten und zweimal kurz mit PBS bei 37°C abgespült und in doppelter Ausführung bei 37°C in 0,5 ml PBS/0,1% Rinderserumalbumin inkubiert, enthaltend:

(A) 1,0 × 10⁸ ¹²⁵I-Lactoferrin; und
(B) 1,0 × 10⁸ ¹²⁵I-Lactoferrin plus 50-facher Überschuss an unmarkiertem Eisen-gesättigtem rekombinantem Lactoferrin.

Proben wurden sechs (6) Mal für je zehn (10) Minuten in kaltem PBS/0,1% Rinderserumalbumin gewaschen und in 4% Paraformaldehyd für drei (3) Stunden ohne Schütteln fixiert und dann zweimal für zehn (10) Minuten in kaltem PBS gespült. Die Proben wurden sofort eingefroren. Die Proben wurden verwendet, um 10 μm-Schnitte zu machen, und dann wurden die Schnitte unter Verwendung von steigenden Konzentrationen von Ethanol dehydriert. Die Schnitte wurden in NTB-2-Emulsion platziert und für sieben (7) und vierzehn (14) Tage bei 4°C exponiert. Nach der Entwicklung wurden die Schnitte mit Hämatoxylin gefärbt und mit Permount fixiert.
Bindung von Lactoferrin an Keratinocyten. Wie der in situ-Hybridisierungs-Versuch zeigt, akkumuliert Lactoferrin an der Membran von Keratinocyten. Siehe z.B. 2. Insbesondere zeigt 2 die Bindung von Lactoferrin an seine Rezeptoren auf TNF-α-produzierenden Keratinocyten in situ auf neonataler Maushaut. Die oberen zwei Felder zeigen die Hell- und die Dunkelfeld-Bilder, erhalten unter Verwendung von nur markiertem Lactoferrin (1,0 × 10⁸ ¹²⁵I-Lactoferrin). Die unteren zwei Felder zeigen die Hell- und die Dunkelfeld-Bilder, wenn der Bindungsassay in der Anwesenheit eines Überschusses (50-facher Überschuss) an unmarkiertem Lactoferrin ausgeführt wurde. Die Bindung von Lactoferrin ist konzentriert auf die epidermale Schicht in den Haarfollikeln, aber wird nicht in der normalen dermalen Schicht beobachtet. Diese Ergebnisse weisen auf die Bindung von Lactoferrin an seine Rezeptoren auf der Oberfläche von Keratinocyten in der Epidermis hin. Von Keratinocyten ist bekannt, dass sie TNF-α produzieren.
BEISPIEL 2
Einfluss von Lactoferrin auf DC-Akkumulation in drainierenden Lymphknoten
Das folgende Beispiel zeigt, dass Lactoferrin die Akkumulation von dendritischen Zellen in drainierenden Lymphknoten, die durch Oxazolon und IL-1β induziert wird, hemmt, während Lactoferrin die Akkumulation von dendritischen Zellen, die durch Verabreichung von TNF-α induziert wird, nicht beeinflusst.
Versuchsablauf. Gruppen von Mäusen (n = 10) erhielten 30 μl intradermale Injektionen in beide Ohrmuscheln von entweder 0,02% murinem Lactoferrin (LF) oder 0,02% Rinderserumalbumin (BSA), beide suspendiert in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,2). Zwei (2) Stunden später erhielten die Mäuse entweder eine zweite intradermale Injektion an der selben Stelle von 50 ng (30 μl) Cytokin, d.h. TNF-α oder IL-1β, suspendiert in 0,1% BSA/PBS, oder wurden örtlich auf dem Ohrrücken beider Ohren 25 μl 0,5% Oxazolon (Ox), aufgelöst in Aceton:Olivenöl (4:1), ausgesetzt. Kontrollmäuse waren unbehandelt. Drainierende (auriculäre) Lymphknoten wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Ausgesetztsein entfernt, abhängig von der Kinetik der induzierten DC-Akkumulation für jede Behandlung, d.h. vier (4) Stunden für TNF-α, siebzehn (17) Stunden für IL-1β, beziehungsweise 18 (18) Stunden für Oxazolon. In der Folge wurde die Anzahl von dendritischen Zellen pro Knoten wie vorher beschrieben beurteilt. Cumberbatch und Kimber, 1992, Immunology 75: 257–263.
Ergebnisse. Wie in TABELLE 1 und 3A dargestellt, induzierte die Behandlung mit Oxazolon die Akkumulation von dendritischen Zellen in drainierenden Lymphknoten (Säule 4, im Vergleich zu der Kontrollgruppe, dargestellt als Säule 1). Die intradermale Verabreichung von Lactoferrin an die Oxazolon-induzierten Tiere resultierte jedoch in einer Hemmung der Akkumulation von dendritischen Zellen in den drainierenden Lymphknoten um 75% (Oxazolon/Lactoferrin: 13 774 dendritische Zellen pro Knoten (über dem Basiswert), Oxazolon/+Lactoferrin: 3 394 dendritische Zellen pro Knoten (über dem Basiswert), siehe TABELLE 1), was auf eine Suppression einer lokalen Immunantwort in diesen Tieren durch Lactoferrin hinweist.
Wie weiter in TABELLE 1 und 3A dargestellt, induzierte die Verabreichung von TNF-α eine Akkumulation von dendritischen Zellen in drainierenden Lymphknoten (siehe 3A, Säule 2). Wie durch die Ergebnisse, die durch Säule 3 von 3A dargestellt werden, angezeigt, hat Lactoferrin keine Wirkung auf die TNF-α-induzierte lokale Immunantwort, d.h. die Verabreichung von TNF-α/-Lactoferrin resultierte in 4 753 dendritischen Zellen pro Knoten (über dem Basiswert), während die Verabreichung von TNF-α/+Lactoferrin in 4 802 dendritischen Zellen pro Knoten (über dem Basiswert) resultierte. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Lactoferrin stromaufwärts von TNF-α in der Immunantwortskaskade wirkt.
Wie in TABELLE 1 (B) dargestellt und wie in 3B weiter veranschaulicht, resultierte die intradermale Verabreichung von IL-1β in der Stimulierung der Migration von Langerhans-Zellen und Akkumulation von dendritischen Zellen in drainierenden Lymphknoten (3B, Säule 1). Die Verabreichung von Lactoferrin resultierte in einer Hemmung der Immunantwort. Wie in 3B, Säule 2 angedeutet, resultierte die intradermale Injektion von Lactoferrin in der Hemmung der Akkumulation von dendritischen Zellen um 56% (IL-1β/-Lactoferrin: 7 569 dendritische Zellen pro Knoten (über dem Basiswert), Oxazolon/+Lactoferrin: 3 342 dendritische Zellen pro Knoten (über dem Basiswert), siehe TABELLE I).
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass:

(1) die Akkumulation von dendritischen Zellen abhängig ist von Erhöhungen in IL-1β-Mengen und
(2) IL-1β stromaufwärts von TNF-α wirkt, da eine TNF-α-induzierte Immunantwort nicht durch Lactoferrin beeinträchtigt wird.

Daher stimuliert IL-1β die de novo-Synthese von TNF-α durch Keratinocyten. Darüber hinaus zeigen diese Daten, dass die inhibitorische Wirkung von Lactoferrin auf die Migration von Langerhans-Zellen und die Akkumulation von dendritischen Zellen eher auf Grund der negativen Regulierung von TNF-α-Produktion als durch einen Einfluss auf einen anderen Aspekt der Funktion von Langerhans-Zellen erfolgt. Daher ist Lactoferrin in der Lage, die de novo-Synthese von TNF-α zu hemmen.
TABELLE I EINFLUSS VON LACTOFERRIN AUF DIE DC-AKKUMULATION IN DRAINIERENDEN LYMPHKNOTEN
BEISPIEL 3
Einfluss von Lactoferrin auf TNF-α- und IL-1β-induzierte Migration von Langerhans-Zellen
Das folgende Beispiel zeigt, dass Lactoferrin die IL-1β-induzierte Migration von Langerhans-Zellen hemmt, während es die Migration von Langerhans-Zellen nicht beeinflusst, die durch TNF-α induziert ist.
Versuchsablauf. Gruppen von Mäusen (n = 3) erhielten 30 μl intradermale Injektionen in beide Ohrmuscheln von entweder 0,005% murinem Lactoferrin (LF) oder 0,005% Rinderserumalbumin (BSA), beides suspendiert in Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; pH 7,2). Zwei Stunden später erhielten die Mäuse eine zweite intradermale Injektion an der gleichen Stelle von 50 ng (30 μl) Cytokin, d.h. TNF-α beziehungsweise 1L-1β, suspendiert in 0,1% BSA/PBS. Kontrollmäuse waren unbehandelt. Die Ohren wurden 30 min nach TNF-α-Behandlung oder 17 Stunden nach IL-1β-Behandlung entfernt und epidermale Platten hergestellt wie vorher beschrieben. Cumberbatch et al., 1994, Immunology 81: 395–401. Die Häufigkeit von Langerhans-Zellen (LC) wurde durch indirekte Immunfluoreszenz gemessen. Die Ergebnisse sind als die Mittelwerte von Zellen/mm³ (± SE) ausgedrückt, die von der Untersuchung von 10 Feldern/Probe für jede von 4 Proben stammen. Die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen Versuchsgruppen wurde unter Verwendung des Student's t-Test berechnet. P < 0,005.
Ergebnisse. Wie in TABELLE II und 4 dargestellt, resultierte die intradermale Verabreichung von IL-1β in der Stimulierung der Migration von Langerhans-Zellen, die durch Lactoferrin gehemmt wurde. Die Verabreichung von TNF-α resultierte auch in der Migration von Langerhans-Zellen, die TNF-α-induzierte Migration wurde jedoch nicht durch Lactoferrin gehemmt.
Diese Ergebnisse bestätigen, dass IL-1β stromaufwärts von TNF-α in der lokalen Immunantwortskaskade wirkt, und dass Lactoferrin stromabwärts von IL-1β, aber stromaufwärts von TNF-α wirkt.
TABELLE II EINFLUSS VON LACTOFERRIN AUF TNF-α- UND IL-1β-INDUZIERTE MIGRATION VON LANGERHANS-ZELLEN.
BEISPIEL 4
Einfluss von Lactoferrin auf die Akkumulation von dendritischen Zellen in drainierenden Lymphknoten
Das folgende Beispiel zeigt, dass Lactoferrin, wenn es örtlich verabreicht wird, die Akkumulation von dendritischen Zellen in drainierenden Lymphknoten, die durch Oxazolon induziert wird, hemmt.
Versuchsablauf. Gruppen von Mäusen (n = 6) erhielten örtlich eine 0,02%-ige Lösung von Lactoferrin, gelöst in Lubriderm-Lotion, oder 0,02% Rinderserumalbumin (BSA), gelöst in ähnlicher Weise, auf den Rücken von beiden Ohren. Später wurden die Mäuse. örtlich an den selben Stellen 25 μl 0,5% Oxazolon (Ox), gelöst in Aceton:Olivenöl (4:1) ausgesetzt. Kontrollmäuse waren unbehandelt. Drainierende Lymphknoten wurden 18 Stunden nach dem Aussetzen entfernt, und die Anzahl von dendritischen Zellen pro Knoten wurde wie vorher beschrieben beurteilt. Cumberbatch et al., 1992, Immunology 75: 257–263.
Ergebnisse. Wie in 5 gezeigt, weisen die Ergebnisse von zwei unabhängigen Versuchen (Felder A und B) darauf hin, dass die Behandlung mit Oxazolon eine Akkumulation von dendritischen Zellen in drainierenden Lymphknoten von Mäusen induzierte, die mit 0,02% BSA vorbehandelt wurden (siehe Säule 2, Felder A und B, gegen Säule 1, Kontrolle). Die örtliche Verabreichung von Maus-Lactoferrin resultierte in einer starken Hemmung der Akkumulation von dendritischen Zellen in den Lymphknoten als Antwort auf Oxazolon in beiden Versuchen (siehe Säule 3, Felder A und B).
Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass örtlich verabreichtes Lactoferrin hoch wirksam ist in der Hemmung der Akkumulation von dendritischen Zellen in Lymphknoten als Antwort auf ein Allergen und daher Allergen-induzierte Hautentzündung.
5 zeigt den inhibitorischen Effekt von Lactoferrin auf Oxazolon-induzierte Akkumulation von dendritischen Zellen in drainierenden Lymphknoten, wenn Lactoferrin örtlich auf die Hautoberfläche verabreicht wird.

Claims

Verwendung eines Lactoferrinprodukts für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Allergen-induzierten entzündlichen Erkrankung in einem Säuger, wobei die Allergen-induzierte entzündliche Erkrankung Asthma ist.
Verwendung eines Lactoferrinprodukts für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Allergen-induzierten entzündlichen Erkrankung in einem Säuger, wobei die Allergen-induzierte entzündliche Erkrankung Kontaktdermatitis ist und wobei das Arzneimittel aus einem Lactoferrinprodukt und einem pharmazeutischen Träger besteht.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Lactoferrinprodukt ein natürlicherweise vorkommendes Lactoferrin ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Lactoferrinprodukt ein rekombinant erzeugtes Lactoferrin ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Lactoferrinprodukt ein biologisch aktives Fragment von Lactoferrin ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Lactoferrinprodukt als Inhalat verabreicht wird.