DE60022499T2

DE60022499T2 - Neue therapeutische verwendung eines eine virale ansteckung modulierendes protein zur verhinderung von abstossung von fremdtransplantaten

Info

Publication number: DE60022499T2
Application number: DE60022499T
Authority: DE
Inventors: J. Girish KOTWAL; Futwan Al-Mohanna; Ranjit Parhar
Original assignee: King Faisal Specialist Hospital and Research Centre; University of Louisville Research Foundation ULRF
Current assignee: King Faisal Specialist Hospital And Research C SA
Priority date: 1999-05-25
Filing date: 2000-05-24
Publication date: 2006-11-30
Anticipated expiration: 2020-05-25
Also published as: EP1185283A1; WO2000071147A1; HK1045456B; CA2374681A1; CA2374681C; AU5158000A; HK1045456A1; EP1185283A4; ATE303816T1; EP1185283B1; DE60022499D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Blockieren einer Xenotransplantat-Abstoßung bei einem Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, durch Verabreichen eines viral kodierten Komplement-Kontrollproteins, das als Inflammations-Modulatorprotein (IMP) bezeichnet wird, an den Patienten. Die vorliegende Erfindung betrifft weiter pharmazeutische Zusammensetzungen zum Verhindern oder Behandeln einer Xenotransplantatabstoßung, umfassend das IMP-Protein als solches oder in Kombination mit anderen immunsuppressiven Wirkstoffen.
Die Erfindung sieht die Verwendungen des IMP-Proteins oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments zum Verhindern oder Behandeln einer Xenotransplantabstoßung bei einem Patienten vor, der eine solche Behandlung benötigt.
2. Beschreibung des zugehörigen Standes der Technik.
Die Transplantation von festen Organen ist in den letzten zwei Jahrzehnten immer erfolgreicher geworden. Diese Leistung hat zu einem Problem geführt: ein Engpass bei den Spenderorganen begrenzt die Zahl der Patienten, die behandelt werden können. Die meisten Unfälle und Krankheiten, die tödlich verlaufen, schädigen auch die Nieren, das Herz, die Lungen, die Leber und die Bauchspeicheldrüse, wodurch sie für eine Transplantation ungeeignet werden. Die Zahl der Spender sinkt weiter durch die Zurückhaltung von Verwandten, eine Spende zu ermöglichen, oder durch die Entdeckung von AIDS oder Hepatitis beim möglichen Spender. Daher übersteigt die Zahl der Patienten, die auf eine Organtransplantation warten, bei weitem die Zahl der verfügbaren Spenderorgane. In der Zwischenzeit hat sich wenig an der Bereitstellung durch Organspender geändert. Obwohl sich diese Zahl jedes Jahr etwas mit dem Anheben der Spenderaltersgrenze und dem steigenden Bewusstsein für die Organspende erhöht, scheint das Plateau, das für Herz- und Herz-Lungen-Transplantationen nach 1990 erreicht wurde, hauptsächlich mit der begrenzten Spenderverfügbarkeit in Bezug zu stehen. Deshalb sterben viele Patienten, während sie auf ein Transplantat warten, eine Zahl, die weiter steigt.
Die Transplantation von Organen von nicht menschlichen Arten (Xenotransplantation) würde den Engpass von Leichenorganen beheben. Wenn Schimpansen- oder Pavianorgane auf den Menschen transplantiert werden, kann eine Abstoßung erfolgreich mittels immunsuppressiver Therapie, die gegenwärtig für menschliche Allotransplantate verwendet wird, kontrolliert werden: Transplantate zwischen solch eng verwandten Arten werden konkordante Xenoplantate genannt. Allerdings ist die weit verbreitete Verwendung von nicht menschlichen Primatenorganen für die menschliche Transplantation nicht praktisch. Die notwendige Zahl von Organen steht nicht zur Verfügung, weil nicht-menschliche Primaten Einzelgeburten und lange Gestationszeiten haben. Es gibt auch einen ethischen Widerstand gegen die Verwendung von nicht menschlichen Primaten.
Die Transplantation von Organen von Arten, die dem Menschen nicht nahe stehen, wie beispielsweise Schweine, führt zu einer sofortigen fulminanten hyperakuten Abstoßung innerhalb von Minuten bis Stunden im Gegensatz zu einer zellvermittelten Allotransplantatabstoßung, die in sieben bis zehn Tagen stattfindet. Dies wird als diskordantes Transplantat bezeichnet. Dieser extrem schnelle Abstoßungsprozess wird durch die Ablagerung von vorgeformten natürlichen Antikörpern, die primär gegen das Gal-Kohlenhydratepitop auf dem vaskulären Spenderendothel gerichtet sind, eingeleitet, gefolgt von einer Aktivierung der Wirtskomplement- und Koagulationskaskaden, die zu einer interstitiellen Blutung, intravaskulären Koagulation und ischemischen Nekrose führen. Eine solche Abstoßung kann nicht in zufrieden stellender Weise mit den gegenwärtig zur Verfügung stehenden immunsuppressiven Medikamenten kontrolliert werden.
Das Komplementsystem
Das Komplementsystem beinhaltet ungefähr 30 Plasma- und Membranproteine, die in einer präzisen Sequenz arbeiten, um eindringende Mikroorganismen auszuschalten. Die Komplementaktivierung kann durch eine der drei Hauptwege erfolgen: klassisch, alternativ und Mannose bindendes Protein (MBP). Der klassische Weg C1, C4, C2 und C3 wird durch Antigen-IgG/IgM-Komplexe aktiviert als Ergebnis davon, dass der C1q-Abschnitt von C1 an den Fc-Teil von IgG/IgM bindet. Der C1s-Abschnitt von C1 bewirkt eine Spaltung von C4 zu einem kleinen C4a- und großen C4b-Molekül. C4b bindet an die Oberfläche von Mikroorganismen durch kovalente Bindungen und bindet an C2a nach Spaltung von C2s durch C1 s. Der C4b2a-Komplex wird als C3-Convertase von Enzymkomplexen des klassischen Wegs bezeichnet, der durch Umwandlung von C3a zu C3b C3 aktiviert. Die C3b-Moleküle binden kovalent an Oberflächen von Mikroorganismen, die Klumpen bilden, die an Komplementrezeptor tragende Phagozytenzellen binden können.
Die Bildung von C3b kann auch über den alternativen Weg erfolgen. Der alternative Weg, bestehend aus dem Faktor B, D, H und I und Properdin (P), wird bei Fehlen von Antikörpern spontan durch Mikroorganismen aktiviert. Es gibt immer mehr Beweise, dass ein Antikörper die Aktivierung des alternativen Wegs verstärkt. Der alternative Weg wird durch die Bildung eines Komplexes von Faktor B eingeleitet, einem einzelkettigen 93 kDa-Protein, und zwar homolog zu C2 entweder mit C3b (das während des klassischen Wegs gebildet wird) oder C3(H₂O) (das gebildet wird, wenn der interne Thioester mit Bindungen von zirkulierendem C3 eine langsame spontane Hydrolyse durchlebt). Der Faktor B wird durch den Faktor D (einer 25 kDa Serinprotease) für eine Proteolyse empfänglich. Der Faktor D spaltet den gebundenen Faktor B unter Freisetzung eines 33 kDa Fragments (Ba) und lässt ein 63 kDa-Fragment, Bb, zurück, das an C3b oder C3(H₂O) angelagert wird. Der sich ergebende Komplex C3b oder C3(H₂O)Bb ist die Convertase des alternativen Wegs, wobei das Bb-Fragment als Serinprotease fungiert, die in der Lage ist, weiter C3 zu C3b zu spalten. Die Bildung von C3b führt zur Aktivierung von C5 durch die Wirkung von C5-Convertase, um C5a und C5b zu bilden. Das C5b-Molekül leitet den terminalen Weg ein, der in der Bildung des Membran-attackierenden Komplexes (MAC) kulminiert. MAC bildet große Poren, die zur Zelllyse führen und kann bestimmte Arten von Mikroorganismen zerstören. C5a bewirkt die Bildung von chemischen Lockmitteln und führt zum Einströmen von phagozytischen Zellen und Plasmaproteinen in das Gebiet der Fremdkörper, die das Komplement aktivieren. Daher zielt das Komplementsystem auf Mikroorganismen oder geschädigte Wirtsgewebe, was zu einem Einströmen von phagozytischen Zellen, die eine Lyse bewirken, führt.
Die Komplementkaskade kann an mehreren Stellen durch das gereinigte bioaktive Vacciniavirus-Komplement-Kontrollprotein (VCP) blockiert sein, das bekanntermaßen C3 und C4 bindet (siehe Kotwal GJ, u.a. (1997) Experimental and Clinical Immunogenetics, Bd. 14 (1) 107; Zusammenfassung F25, 6th European Meeting on Complement in Human Disease, 12. bis 15 März 1997, Innsbruck, Österreich).
Howard J. u.a. hat berichtet, dass das Kuhpockenvirus (CPV) mehrere Proteine kodiert, die die Entzündungsreaktion beeinflussen können, und dass Modelle entwickelt wurden, um die Wirksamkeit von viralen Immunmodulatoren zum Lindern von Entzündungsreaktionen zu testen, die durch Mechanismen erzeugt werden, die eine Xenotransplantatabstoßung umfassten (Howard J. u.a. (1998), J Leukocyte Biology, Bd. 64 (1) 68-71).
Komplement-Kontrollproteinanaloge der wichtigen Orthopoxviren zeigen Sequenzähnlichkeiten. Nagetiere sind die natürlichen Vorratswirte für Kuhpockenviren (CPV): IMP ist das Homolog von VCP in CPV und reduziert die Mausmodellspezifische Schwellreaktion deutlich, wobei das Gewebe an der Infektionsstelle erhalten bleibt (viraler Lebensraum) (Howard J. u.a. (1998) oben).
IMP moduliert die Komplementaktivität und es verringert signifikant die Schwere der Entzündungsreaktion aufgrund von CPV im Vergleich zu rekombinantem CPV, dem IMP fehlt (CPV-IMP), einschließlich der langfristigen Entzündungsreaktion (Miller CG u.a. (1997), Virology (Academic Press, Orlando USA), Bd. 229, 126-133). IMP hat ein therapeutisches Potential zum Reduzieren des inflammatorischen Gewebeschadens bei bestimmten humanen Erkrankungen, z.B. zum Ver hindern einer Allotransplantationsabstoßung bei Verwendung in Kombination mit anderen immunsuppressiven Wirkstoffen (Kotwal GJ u.a. (oben)).
Hyperakute Abstoßung und Komplementaktivierung.
Es ist weithin bekannt, dass Menschen vorgeformte Antikörper haben, die als xenoreaktive natürliche Antikörper (XNA) bezeichnet werden. Diese Antikörper sollen während der frühen neonatalen Periode auftreten, die der Colibakterienkolonisation des Dickdarms folgt. Diese Antikörper reagieren mit der terminalen Gal-alpha-1,3-Gal-Komponente und kreuzreagieren mit Schweineorganen. Diese kreuzreagierenden Antikörper bilden einen Antigen-Antikörper-Komplex, der den klassischen Komplementweg aktiviert und eine hyperakute Abstoßung bewirkt. Um die hyperakute Xenotransplantatabstoßung zu überwinden sind mehrere Strategien entwickelt worden. Unter ihnen wird der lösliche, den Zerfall beschleunigende Faktor (DAF) als der effektivste angesehen. Der DAF wurde in normale Schweine injiziert, und es wurden transgene Schweine, die humanen DAF exprimierten, produziert. Transgener humaner DAF scheint erfolgreich den Komplement vermittelten Schaden der Endothelzelle zu hemmen und verhindert so eine Endothelaktivierung und einen anschließenden Myokardschaden. Dieser Befund führt zu dem Schluss, dass humaner DAF, weil eine hyperakute Abstoßung nicht auftritt, das Organ einer diskordanten Art (Schwein) wie das Organ einer konkordanten Art funktionieren lässt. Allerdings haben andere darauf hingewiesen, dass seine Wirksamkeit, obwohl sowohl DAF als auch der homologe Restriktionsfaktor (HRF20) dazu tendieren, die Komplementaktivierung bis zu einem gewissen Umfang zu verhindern, für die klinische Verwendung bei der Transplantation nicht ausreicht. Studien haben auch gezeigt, dass der alternative Komplementweg trotz des Vorhandenseins von Membran-DAF und MCP-Membran-Kofaktor-Protein (MCP) aktiviert werden kann. Ein anderes Problem bei der Verwendung von natürlichen humanen Komplementrezeptoren, wie DAF und MCP, besteht darin, dass diese Rezeptoren auch als Proteine dienen, die von Viren und anderen Mikroorganismen benutzt werden, um Eintritt in die diese Rezeptoren tragenden Zellen zu erhalten. Um das Komplement wirksam und sicher zu hemmen und eine hyperakute Abstoßung auszuschalten, werden dringend andere potentere komplementinhibitorische Proteine benötigt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Kurz gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Blockieren einer Xenotransplantatabstoßung bei einem Patienten, der eine solchen Behandlung benötigt, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge an einem Protein der Formel (I) an den Patienten:
[SEQ ID NO: 1]
Die Erfindung betrifft weiter eine pharmazeutische Formulierung zum Verhindern oder Behandeln einer Xenotransplantatabstoßung, die ein Protein der Formel (I) zusammen mit einem oder mehr pharmazeutischen annehmbaren Verdünnungsmitteln, Trägern oder Hilfsstoffen dafür umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Proteins zur Verfügung, umfassend die Aminosäuresequenz der Reste 20 bis 263 von SEQ ID NO: 1 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, und zwar zur Herstellung eines Medikaments zum Verhindern oder Behandeln einer Xenotransplantatabstoßung bei einem Patienten, der eine solche Behandlung benötigt. Die Erfindung stellt auch die Verwendung zur Verfügung, bei der die Aminosäuresequenz des Proteins aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 besteht.
Die Erfindung stellt weiter Verwendungen zur Verfügung, bei denen ein immunsuppressiver Wirkstoff dem Patienten gleichzeitig verabreicht wird, einschließlich, aber nicht ausschließlich, eine Verwendung, bei der das Medikament weiter den immunsuppressiven Wirkstoff enthält. Die Erfindung stellt auch Verwendungen zur Verfügung, bei denen der immunsuppressive Wirkstoff aus der Gruppe bestehend aus Azathiopren, Cyclosporin und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon ausgewählt wird. Ein Glucocorticoid kann dem Patienten bei solchen Verwendungen auch gleichzeitig verabreicht werden; das Medikament kann weiter das Glucocorticoid umfassen, bei dem es sich um Prednison handeln kann.
Die Erfindung stellt weiter jede der vorherigen Verwendungen zur Verfügung, bei denen das Medikament zusätzlich einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, einschließlich – aber nicht ausschließlich – einen wässrigen Träger, umfasst.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Die Elution von BSA (ungebundene Fraktion), Lysozym (2-2,5 M) und humanem Heparin bindet ein Protein aus einer Heparinsäule (2,5-3 M) (HITRAP Heparin).
2. Die Elution von IMP aus einer HITRAP Heparinsäule (102 M), 60 mg mit konzentriertem Medium von infizierten Zellen.
3. Weitere Reinigung von mit Heparin eluiertem IMP mittels Superdex 75 Säule, wodurch reines bioaktives IMP in Fraktion 4-6 gezeigt wird.
4. Aufnahme von mit Fluoreszein markiertem Lysozym durch Mastzellen.
5. Aufnahme von mit Fluoreszein markiertem IMP durch Mastzellen.
6. Aufnahme von mit Fluoreszein markiertem Lysozym durch eine Mischung aus Mastzellen und Endothelzellen.
7. Aufnahme von mit Fluoreszein markiertem VCP durch eine Mischung aus Mastzellen und Endothelzellen.
8. Analyse der Komplement hemmenden Aktivität der Fraktion, die in der 4 gezeigt ist. Die VCP, die bei 1,0 M und 2,0 M eluieren, sind bioaktiv.
9. Mast/Endothelzellen-Aufnahme von mit Fluoreszein markiertem VCP, Lysozym, MBP, IgG und BSA. Phasenkontrastbilder von Mast/Endothelzellen werden von dem Fluoreszenzbild desselben Felds für jedes markierte Protein begleitet.
10. Hemmung der Bindung eines anti-alpha-gal-Rhodamin-konjugierten Antikörpers an Schweineaorta-Endothelzellen (PAEC) in Gegenwart von alpha-gal oder IMP.
11. Durchflusszytometrie, die die Bindungshemmung (Abnahme der Fluoreszenzintensität) eines anti-alpha-gal-Antikörpers in Gegenwart von IMP zeigt.
12. Bewertung, ob die Bindung des Antikörpers an PAEC nur für die alpha-gal-Reste an der Oberfläche spezifisch ist oder dass die Stearinsäureverhinderung sich nicht spezifisch von nicht spezifischen Antikörpern unterscheidet. Diagramm A: humane Endothelzellen, die mit Kontrollantikörper behandelt werden; Diagramm B: humane Endothelzellen, die mit anti-humanem Leukozyten-Antigen-Antikörper, der mit Phycoerythrin konjugiert ist, behandelt werden; Diagramm C: humane Endothelzellen, die mit IMP, PAEC und anti-HLA I-Antikörper behandelt werden.
13. Hemmung des Abtötens von PAEC durch IMP in Gegenwart von Serum als solches, neutrophilen Leukozyten als solche, Serum zusammen mit neutrophilen Leukozyten, natürlichen Killer(NK)-Zellen als solche, NK + Serum oder NK + Serum + neutrophilen Leukozyten.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Blockieren einer Xenotransplantatabstoßung bei einem eine solchen Behandlung benötigenden Patienten durch Verabreichen eines viral kodierten, als Inflammations-Modulatorprotein (IMP) bezeichneten Komplementkontrollproteins an den Patienten. Dieses kleine Protein ist strukturell mit der Familie der humanen Komplementkontrollproteine verwandt, die DAF umfasst, und ist funktional dem löslichen Komplementrezeptor 1 (sCR1) ähnlich. Daher kann IMP ein Komplement in einer sehr frühen Stufe durch Binden an C3b und C4b dadurch blockieren, dass die C3-Convertasebildung entweder durch den klassischen oder alternativen Weg gehemmt und auch der Zerfall der C3-Convertase beschleunigt wird. Verglichen mit inhibitorischen Komplementchemikalien hat IMP mehrere klare Vorteile: 1) infolge des Evolutionsdrucks hält es die wichtigsten Domänen zurück; 2) anders als sCR1, das C3 an zwei zusätzlichen Stellen spaltet, wobei zellgebundene Fragmente zurückbleiben (was möglicherweise einen Schaden durch Immunzellen mit Rezeptoren für die Fragmente hervorruft), spaltet IMP C3 an der ersten Spaltstelle in Gegenwart von Faktor 1; und 3) das virale Protein ist klein und wird nicht als Fremdprotein erkannt, weil es strukturell sehr ähnlich zu seinen Homologen ist. Das IMP-Protein zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung hat die Aminosäuresequenz der Formel (I):
[SEQ ID NO: 1].
Die Aminosäureabkürzungen sind nachfolgend angegeben:
Der Fachmann erkennt, dass bestimmte Aminosäuren zu einer Umlagerung neigen. Zum Beispiel kann Asp sich zu Aspartamid und Isoasparagin umlagern, wie in I. Schbn u.a., Int. J. Peptide Protein Res. 14:485-94 (1979) und dort angegebenen Literaturhinweisen beschrieben. Diese Umlagerungsderivate sind vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst. Wenn nicht anders angegeben, befinden sich die Aminosäuren in der L-Konfiguration.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, wie sie hier offenbart und beansprucht ist, sind die folgenden Begriffe und Abkürzungen wie folgt definiert:

Basenpaar (bp) – bezieht sich auf eine DNA oder RNA. Die Abkürzungen A, C, G und T entsprechen den 5'-Monophosphatformen der Nukleotide (Desoxy)adenin, (Desoxy)cytidin, (Desoxy)guanin bzw. (Desoxy)thymin, wenn sie in DNA-Molekülen auftreten. Die Abkürzungen U, C, G und T entsprechen den 5'-Monophosphatformen der Nukleoside Uracil, Cytidin, Guanin bzw. Thymin, wenn sie in RNA-Molekülen auftreten. In doppelsträngiger DNA kann das Basenpaar auf eine Partnerschaft von A mit T oder C mit G hinweisen. Bei einem DNA/RNA-Heteroduplex kann das Basenpaar auf eine Partnerschaft von T mit U oder C mit G hinweisen.
Chelatbildendes Peptid – Eine Aminosäuresequenz, die in der Lage ist, mit einem mehrwertigen Metallion zu komplexieren.
DNA – Desoxyribonukleinsäure.
EDTA – eine Abkürzung für Ethylendiamintetraessigsäure.
ED50 – eine Abkürzung für einen halbmaximalen Wert.
FAB-MS – eine Abkürzung für eine schnelle Atombeschussmassenspektrometrie.
Immunreaktive(s) Protein(e) – ein Begriff, der dazu verwendet wird, Antikörper, Fragmente von Antikörpern, die Antigene von ähnlicher Natur wie das Stammantikörpermolekül binden können, von dem sie stammen, und Einzelketten-Polypeptid-Bindungsmoleküle, wie in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/US 87/02208, Internationale Veröffentlichung Nr. WO 88/01649 beschrieben, kollektiv zu beschreiben.
mRNA – Boten-RNA.
MWCO – eine Abkürzung für eine Molekulargewichtstrenngrenze.
Patient – ein Patient ist ein Tier, gewöhnlich ein Säugetier, vorzugsweise ein Mensch.
Plasmid – ein extrachromosomales selbstreplizierendes genetisches Element.
PMSF – die Abkürzung für Phenylmethylsulfonylfluorid.
Leserahmen – die Nukleotidsequenz, von der die Translation „Lesen" in Dreiergruppen durch die Translationsvorrichtung von tRNA, Ribosomen und zugehörigen Faktoren auftritt, wobei jeder Dreiergruppe eine bestimmte Aminosäure entspricht. Weil jede Dreiergruppe eindeutig und von derselben Länge ist, muss die kodierende Sequenz ein Mehrfaches von Drei sein. Eine Basenpaarinsertion oder -deletion (als Frameshift-Mutation bezeichnet) kann zu zwei unterschiedlichen Proteinen führen, die durch dasselbe DNA-Segment kodiert sind. Um sich dagegen zu versichern, müssen die Dreiergruppen-Kodons, die dem gewünschten Polypeptid entsprechen, in Mehrfachen von Drei vom Initiationskodon abgeglichen werden, d.h. der richtige "Leserahmen" muss erhalten bleiben. Beim Erzeugen von Fusionsproteinen, die ein chelatbildendes Peptid enthalten, muss der Leserahmen der DNA-Sequenz, die das strukturelle Protein kodiert, in der DNA-Sequenz erhalten sein, die für die chelatbildende Peptid kodiert.
Rekombinanter DNA-Klonierungsvektor – jeder autonom replizierende Wirkstoff einschließlich – aber nicht ausschließlich – Plasmide und Phasen, die ein DNA-Molekül umfassen, an das ein oder mehr zusätzliche DNA-Segmente angefügt werden können oder worden sind.
Rekombinanter DNA-Expressionsvektor – jeder rekombinante DNA-Klonierungsvektor, in den ein Promotor eingefügt wurde.
Replikon – eine DNA-Sequenz, die die autonome Replikation eines Plasmids oder anderen Vektors kontrolliert und ermöglicht.
RNA – Ribonukleinsäure.
RP-HPLC – eine Abkürzung für Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie.
Transkription – das Verfahren, durch welches Information, die in einer Nukleotidsequenz einer DNA enthalten ist, auf eine komplementäre RNA-Sequenz übertragen wird.
Translation – das Verfahren, durch welches die genetische Information von Boten-RNA dazu verwendet wird, um die Synthese einer Polypeptidkette zu spezifizieren und zu lenken.
Tris – eine Abkürzung für Tris-(hydroxymethyl)aminomethan.
Behandeln – beschreibt den Umgang und die Betreuung eines Patienten, um die Erkrankung, den Zustand oder die Funktionsstörung zu bekämpfen, und beinhaltet die Verabreichung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung, um das Entstehen der Symptome oder Komplikationen zu verhindern, die Symptome oder Komplikationen zu erleichtern oder die Erkrankung, den Zustand oder die Funktionsstörung auszuschalten. Die Behandlung einer Xenotransplantatabstoßung umfasst daher die Hemmung von Immunreaktionen auf das transplantierte Gewebe.
Vektor – ein Replikon, das zur Transformation von Zellen in Genmanipulation tragenden Polynukleotidsequenzen verwendet wird, die den geeigneten Proteinmolekülen entsprechen, die bei Kombination mit geeigneten Kontrollsequenzen bestimmte Eigenschaften auf die zu transformierende Wirtszelle übertragen. Plasmide, Viren und Bakteriophagen sind geeignete Vektoren, da sie eigenständige Replikons sind. Künstliche Vektoren werden durch Schneiden und Verbinden von DNA-Molekülen aus unterschiedlichen Quellen unter Verwendung von Restriktionsenzymen und Ligasen konstruiert. Vektoren umfassen rekombinante DNA-Klonierungsvektoren und rekombinante DNA-Expressionsvektoren.
X-gal – eine Abkürzung für 5-Brom-4-chlor-3-idolyl-beta-D-galactosid.

SEQ ID NO: 1 betrifft die Sequenz, die im Sequenzprotokoll angegeben ist und steht für ein Komplement hemmendes Protein der Formel (I):
[SEQ ID NO: 1].
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Blockieren einer Xenotransplantatabstoßung zur Verfügung, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel (I) in einer Dosis zwischen etwa 1 und 1000 μg/kg an einen Patienten, der eine solche Behandlung benötigt. Eine bevorzugte Dosis beträgt etwa 10 bis 100 μg/kg aktive Verbindung. Eine typische tägliche Dosis für einen erwachsenen Menschen beträgt etwa 0,5 bis 100 mg. Bei der Durchführung dieses Verfahrens können Verbindungen der Formel (I) in einer einzelnen Tagesdosis oder in mehreren Dosen pro Tag verabreicht werden. Der Behandlungsplan kann die Verabreichung über ausgedehnte Zeiträume erfordern. Die Menge pro verabreichte Dosis oder die verabreichte Gesamtmenge werden vom Arzt bestimmt und hängen von solchen Faktoren wie der Natur und Schwere der Erkrankung, dem Alter und Allgemeinzustand des Patienten und der Verträglichkeit der Verbindung durch den Patienten ab.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter pharmazeutische Formulierungen zur Verfügung, die Verbindungen der Formel (I) umfassen. Die Proteine, vorzugsweise in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes, können für die parenterale Verabreichung zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung einer Xe noimplantatabstoßung formuliert werden. Zum Beispiel können Verbindungen der Formel (I) mit herkömmlichen pharmazeutischen Trägern und Hilfsstoffen gemischt werden. Die Zusammensetzungen, die beanspruchte Proteine umfassen, enthalten etwa 0,1 bis 90 Gew.-% aktives Protein, vorzugsweise in löslicher Form. und allgemeiner etwa 10 bis 30 %. Weiterhin können die vorliegenden Proteine als solche oder in Kombination mit anderen die Abstoßung verhindernden Wirkstoffen oder immunsuppressiven Wirkstoffen verabreicht werden, insbesondere solchen, die als nützlich zur Hemmung oder Behandlung einer Alloimplantatabstoßung ermittelt wurden. Bevorzugte Wirkstoffe zur Verwendung in Kombination mit dem Protein der vorliegenden Erfindung zum Verhindern oder Behandeln einer Xenoimplantatabstoßung umfassen Azathioprin, Glucocorticoide (wie beispielsweise Prednison) und Cyclosporin.
Für die intravenöse (i.v.) Verwendung wird das Protein in üblicherweise verwendeten intravenösen Fluid(en) verabreicht und mittels Infusion gegeben. Es können solche Fluide, wie beispielsweise physiologische Kochsalzlösung, Ringer-Lösung oder 5 % Dextroselösung, verwendet werden.
Für intramuskuläre Präparate kann eine sterile Formulierung, vorzugsweise eine geeignete lösliche Salzform eines Proteins der Formel (I), zum Beispiel das Chlorhydratsalz, gelöst und in einem pharmazeutischen Verdünnungsmittel, wie beispielsweise pyrogenfreiem Wasser (destilliert), physiologische Kochsalzlösung oder 5 % Glucoselösung, verabreicht werden. Eine geeignete unlösliche Form der Verbindung kann hergestellt und als Suspension in einer wässrigen Base oder einer pharmazeutisch annehmbaren Ölbase, z.B. einem Ester einer langkettigen Fettsäure, wie beispielsweise Ethyloleat, verabreicht werden.
Die Proteine zur Verwendung in der vorliegend beanspruchten Erfindung können durch Aufbau der DNA, die für das beanspruchte Protein kodiert, und danach durch Exprimieren der DNA in einer rekombinanten Zellkultur hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von Austauschmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA mit bekannter Sequenz sind bekannt, zum Beispiel M13-Primermutagenese. Die Mutationen, die in der DNA, die für das Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, hergestellt werden könnten, dürfen die Sequenz nicht außerhalb des Leserahmens stellen und erzeugen vorzugsweise keine komplementären Regionen, die einen sekundären mRNA-Aufbau erzeugen könnten. Siehe DeBoer u.a., EP 75,444A (1983).
Das Protein der vorliegenden Erfindung kann entweder durch rekombinante DNA-Technik oder bekannte chemische Verfahren erzeugt werden, wie beispielsweise Lösungs- oder Festphasen-Peptidsynthese oder Halbsynthese in Lösung, die mit Proteinfragmenten beginnen, die durch herkömmliche Lösungsverfahren gekoppelt sind.
A. Festphase
Die Synthese des Proteins der vorliegenden Erfindung kann durch Festphasen-Peptidsynthese oder durch rekombinante Verfahren ablaufen. Die Prinzipien der chemischen Festphasen-Synthese von Polypeptiden sind auf dem Fachgebiet bekannt und können in allgemeinen Texten in diesem Bereich, wie beispielsweise Dugas, H. und Penney, C., Bioorganic Chemistry, Springer-Verlag, New York, Seite 54-92 (1981), gefunden werden. Zum Beispiel können Peptide durch eine Festphasenmethode unter Verwendung eines PE-Applied Biosystems 430A Peptidsynthetisierers (im Handel erhältlich von Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien) und Synthesezyklen, die von Applied Biosystems bereitgestellt werden, synthetisiert werden. Boc-Aminosäuren und andere Reagenzien sind im Handel von PE-Applied Biosystems und anderen Chemielieferfirmen erhältlich. Sequenzielle Boc-Chemie unter Verwendung von Protokollen im Hinblick auf die Doppelkopplung (double couple protocols) werden auf die anfänglichen p-Methylbenzhydrylaminharze zur Herstellung von C-terminalen Carboxamiden angewandt. Für die Herstellung von C-terminalen Säuren wird das entsprechende PAM-Harz verwendet. Arginin, Asparagin, Glutamin, Histidin und Methionin werden unter Verwendung von vorgeformten Hydroxybenzotriazolestern verbunden. Der folgende Seitenkettenschutz kann verwendet werden:

Arg: Tosyl Met: Sulfoxid

Asp: Cyclohexyl oder Benzyl Ser: Benzyl

Cys: 4-Methylbenzyl Thr: Benzyl

Glu: Cyclohexyl Trp: Formyl

His: Benzyloxymethyl Tyr: 4-Bromcarbobenzoxy

Lys: 2-Chlorbenzyloxycarbonyl
Boc-Entschützung kann mit Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid bewerkstelligt werden. Das Entfernen von Formyl aus Trp wird durch Behandeln des Peptidylharzes mit 20 % Piperidin in Dimethylformamid 60 Minuten lang unter variierenden Bedingungen (VC) erreicht. Met(O) kann durch Behandeln von Peptidylharz mit TFA/Dimethylsulfid/conHC1 (95/5/1) bei 25°C 60 Minuten lang reduziert werden. Im Anschluss an die obigen Vorbehandlungen können die Peptide weiter entschützt und von dem Harz mit wasserfreiem Wasserstofffluorid, enthaltend ein Gemisch aus 10 % m-Cresol oder m-Cresol/10 % p-Thiocresol oder m-Cresol/p-Thiocresol/Dimethylsulfid, abgespalten werden. Die Spaltung der Seitenkettenschutzgruppe(n) und des Peptids aus dem Harz wird bei Null Grad Celsius oder darunter, vorzugsweise bei –20°C, 30 Minuten lang, gefolgt von 30 Minuten bei 0°C, durchgeführt. Nach dem Entfernen des HF wird das Peptid/Harz mit Ether gewaschen. Das Peptid wird mit Eisessigsäure extrahiert und lyophilisiert. Die Reinigung wird durch eine Umkehrphasen-C18-Chromatographie(Vydac)-Säule in 0,1 % TFA mit einem Gradienten von steigender Acetonitril-Konzentration erreicht.
Der Fachmann erkennt, dass die Festphasensynthese auch mittels der FMOC-Strategie und einem TFA/Fänger-Abspaltungsgemisch erreicht werden könnte.
B. Rekombinante Synthese
Das Protein der vorliegenden Erfindung kann auch durch rekombinante Verfahren erzeugt werden. Rekombinante Verfahren werden bevorzugt, wenn eine hohe Ausbeute gewünscht ist. Die grundlegenden Schritte bei der rekombinanten Herstellung von Protein umfassen:

a) Aufbau einer synthetischen oder halbsynthetischen (oder Isolation aus natürlichen Quellen) DNA, die für das Protein der vorliegenden Erfindung kodiert,
b) Integration der kodierenden Sequenz in einen Expressionsvektor in einer solchen Weise, die für die Expression des Proteins entweder allein oder als Fusionsprotein geeignet ist,
c) Transformation einer geeigneten eukaryotischen oder prokaryotischen Wirtszelle mit dem Expressionsvektor und
d) Wiedergewinnung und Reinigung des rekombinant erzeugten Proteins.

2.a. Genkonstruktion
Synthetische Gene, deren Transkription und Translation in vitro oder in vivo zur Herstellung des Proteins führen, können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren konstruiert werden. Aufgrund der natürlichen Degeneration des genetischen Kodes erkennt der Fachmann, dass eine ziemlich große und doch bestimmte Anzahl von DNA-Sequenzen konstruiert werden kann, die die beanspruchten Proteine kodieren. In der bevorzugten Durchführung der Erfindung wird eine Synthese durch rekombinante DNA-Technik erreicht.
Die Methode der Konstruktion von synthetischen Genen ist auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel Brown u.a. (1979) Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., Bd. 68, Seite 109-151. Die DNA-Sequenz, die dem syntethischen beanspruchten Proteingen entspricht, kann unter Verwendung einer herkömmlichen DNA-Synthetisiervorrichtung, wie beispielsweise dem Applied Biosystems Modell 380A oder 380B DNA-Synthetisierer erzeugt werden (im Handel erhältlich von Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404).
Es kann für einige Anwendungen wünschenswert sein, die kodierende Sequenz des beanspruchten Proteins so zu modifizieren, dass eine geeignete, für Protease sensible Spaltstelle z.B. zwischen dem Signalpeptid und dem Strukturprotein, eingeführt wird, was das kontrollierte Ausschneiden des Signalpeptids aus dem Fusionsproteinkonstrukt erleichtert.
Das Gen, das für das beanspruchte Protein kodiert, kann auch mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) erzeugt werden. Die Matrize kann eine cDNA-Bibliothek (im Handel erhältlich von CLONETECH oder STRATAGENE) oder mRNA sein, die aus dem menschlichen adipösen Gewebe isoliert wurde. Solche Verfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt, Maniatis u.a., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989).
2.b. Direkte Expression oder Fusionsprotein
Das beanspruchte Protein kann entweder durch direkte Expression oder als Fusionsprotein, das das beanspruchte Protein umfasst, und anschließende enzymatische oder chemische Spaltung hergestellt werden. Es ist eine Auswahl von Peptidasen (z.B. Trypsin), die ein Polypeptid an bestimmten Stellen spalten oder die Peptide von den Amino- oder Carboxytermini (z.B. Diaminopeptidase) der Peptidkette verdauen, bekannt. Weiterhin spalten bestimmte Chemikalien (z.B. Cyanogenbromid) eine Polypeptidkette an bestimmten Stellen. Der Fachmann ist sich der Modifikationen bewusst, die für die Aminosäuresequenz (und synthetische oder halbsynthetische kodierende Sequenz, wenn rekombinante Mittel verwendet werden) benötigt werden, um ortsspezifische interne Spaltstellen einzuführen. Siehe z.B. Carter P., Site Specific Proteolysis of Fusion Proteins, Kap. 13 in Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large Scale Processes, American Chemical Soc., Washington, D.C. (1990).
2.c. Vektorkonstruktion
Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, die die gewünschten Kodierungs- und Kontrollsequenzen enthalten, verwenden Standardligationsverfahren. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, konfektioniert und erneut in der Form ligiert, die zur Bildung der erforderlichen Plasmide gewünscht ist.
Um die Translation des gewünschten Proteins zu bewirken, setzt man die manipulierte synthetische DNA-Sequenz in eines aus einer Unmenge von geeigneten rekombinanten DNA-Expressionsvektoren durch die Verwendung von geeigneten Restriktionsendonukleasen ein. Das beanspruchte Protein ist ein relativ großes Protein. Eine synthetische kodierende Sequenz wird so aufgebaut, dass sie Restriktionsendonukleasespaltstellen an beiden Enden des Transkripts besitzt, um die Isolation von und Integration in diese Expression und Amplifikation und Expressionsplasmide zu erleichtern. Die isolierte cDNA-Kodierungssequenz kann ohne weiteres durch die Verwendung von synthetischen Linkern modifiziert werden, um die Einarbeitung dieser Sequenz in die gewünschten Klonierungsvektoren durch Verfahren zu erleichtern, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Die bestimmten verwendeten Endonukleasen werden durch die Restriktionsendonuklasespaltmuster des zu verwendenden Stammexpressionsvektors diktiert. Die Wahl der Restriktionsstellen erfolgt derart, dass die kodierende Sequenz mit Kontrollsequenzen günstig ausgerichtet wird, um eine passende Lesung im Rahmen und eine Expression des beanspruchten Proteins zu erzielen.
Im Allgemeinen werden Plasmidvektoren, die Promotoren und Kontrollsequenzen enthalten, die von Arten stammen, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor trägt gewöhnlich eine Replikationsstelle sowie Markersequenzen, die in der Lage sind, eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen vorzusehen. Zum Beispiel wird E. coli typischerweise mittels BR322 transformiert, einem Plasmid das von einer E.coli-Art stammt (Bolivar u.a., Gene 2: 95 (1977)). Das Plasmid pBR322 enthält Gene für eine Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und sieht so einfache Mittel vor, um transformierte Zellen zu identifizieren. Das pBR322-Plasmid oder ein anderes mikrobielles Plasmid muss auch Promotoren und andere Kontrollelemente, die üblicherweise in der rekombinanten DNA-Technik verwendet werden, enthalten oder so modifiziert werden, dass er sie enthält.
Die gewünschte kodierende Sequenz wird in einen Expressionsvektor in der richtigen Orientierung so eingesetzt, dass sie von einem Promotor und einer Ribosombindungsstelle transkribiert wird, die beide funktionsfähig in der Wirtszelle sein sollten, in der das Protein exprimiert wird. Ein Beispiel für einen solchen Expressionsvektor ist ein Plasmid, das in Belagaje u.a., US-Patent Nr. 5,304,493 beschrieben ist, dessen Lehren hier durch Bezugnahme aufgenommen werden.
Das Gen, das für das A-C-B-Proinsulin kodiert, das im US-Patent Nr. 5,304,493 beschrieben ist, kann aus dem Plasmid pRB182 mit den Restriktionsenzymen Ndel und BamHI entfernt werden. Die für das Protein der vorliegenden Erfindung kodierenden Gene können in den Plasmidaufbau auf einer Ndel/BamHI-Restriktionsfragmentkassette eingesetzt werden.
2.d. Prokaryotische Expression
Im Allgemeinen werden Prokaryoten zur Klonierung von DNA-Sequenzen zum Aufbau der in der Erfindung nützlichen Vektoren verwendet.
Zum Beispiel ist der E. coli K12 Stamm 294 (ATCC Nr. 31446) besonders nützlich. Andere Mikrobenstämme, die verwendet werden können, umfassen E. coli B und E. coli X1776 (ATCC Nr. 31537). Diese Beispiele sind veranschaulichend nicht aber einschränkend.
Prokaryoten werden auch zur Expression verwendet. Es können die zuvor erwähnten Stämme sowie E. coli W3110 (prototroph, ATCC Nr. 27325), Bazillen wie beispielsweise Bacillus subtilis und andere Enterobakteriaceae, wie beispielsweise Salmonella tymphimurium oder Serratia marcescans und verschiedene Pseudomonas-Arten verwendet werden. Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase (Vektor pGX2907 [ATCC 39344] enthält das Replikon und β-Lacatamasegen) und Lactosepromotorsysteme (Chang u.a., Nature, 275:615 (1978); und Goeddel u.a., Nature 281:544 (1979)), alkalische Phosphatase, das Tryptophan(trp)-Promotorsystem (Vektor pATH1 [ATCC 37695] ist so ausgebildet, dass die Expression eines offenen Leserahmens als trpE-Fusionsprotein unter der Kontrolle des trp-Promotors erleichtert wird) und Hybridpromotoren, wie beispielsweise den tac-Promotor (isolierbar aus dem Plasmid pDR540 ATCC 37282). Allerdings ermöglichen andere funktionelle bakterielle Promotoren, deren Nukleotidsequenzen allgemein bekannt sind, es dem Fachmann, sie zu DNA zu ligieren, die das Protein mittels Linkern oder Adaptoren kodiert, um jede erforderliche Restriktionsstelle zu liefern. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno-Sequenz, die funktionsfähig mit der das Protein kodierenden DNA kodierenden Protein verbunden ist.
2.e. Eukaryotische Expression
Das Protein kann rekombinant in eukaryotischen Expressionssystemen erzeugt werden. Bevorzugte Promotoren, die die Transkription in Säugetierwirtszellen kontrollieren, können aus verschiedenen Quellen erhalten werden, zum Beispiel den Genomen von Viren, wie beispielsweise: Polyoma, Simian-Virus-40 (SV40), Adenovirus, Retoviren, Hepatitis B-Virus und besonders bevorzugt Cytomegalovirus oder von heterologen Säugetierpromotoren, z.B. β-Aktinpromotor. Die early und late Promotoren des SV40-Virus werden in geeigneter Weise als SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den SV40-Virus-Replikationsursprung enthält. Fiers u.a., Nature, 273:112 (1978). Das gesamte SV40-Genom kann aus dem Plasmid pBRSV, ATCC 45019, erhalten werden. Der immediate early Promotor des humanen Cytomegalovirus kann aus dem Plasmid pCMBP (ATCC 77177) erhalten werden. Natürlich sind Promotoren aus der Wirtszelle oder verwandte Arten hier auch nützlich.
Die Transkription einer DNA, die für das beanspruchte Protein kodiert, durch höhere Eukaryoten ist durch Einsetzen einer Enhancersequenz in den Vektor erhöht. Enhancer sind cis-aktive DNA-Elemente, gewöhnlich etwa 10-300 bp, die auf einen Promotor wirken, um seine Transkription zu erhöhen. Enhancer sind relativ unabhängig von der Ausrichtung und Position und wurden 5' (Laimins, L. u.a., PNAS 78:993 (1981) und 3' (Lusky, M.L. u.a., Mol. Cell Bio. 3:1108 (1983)) zur Transkriptionseinheit in einem Intron (Banerji, J.L. u.a., Cell 33:729 (1983)) sowie in der kodierenden Sequenz selbst (Osborne, T.F. u.a., Mol. Cell Bio. 4:1293 (1984)) gefunden. Viele Enhancer-Sequenzen von Säugetiergenen sind jetzt bekannt (Globin, RSV, SV40, EMC, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin) bekannt. Typischerweise wird allerdings ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40 late Enhancer, den Cytomegalovirus early Promotorenhancer, den Polyomaenhancer auf der late Seite des Replikationsursprung und Adenovirusenhancer.
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilze, Insekt, Pflanze, Tier, Mensch oder nukleierte Zellen von anderen mehrzelligen Organismen) verwendet werden, enthaften auch Sequenzen, die für die Beendung der Transkription notwendig sind, was eine mRNA-Expression beeinflussen kann. Diese Regionen werden als poyladenylierte Segmente in dem nicht translatierten Abschnitt der das Protein kodierenden mRNA transkribiert. Die nicht translatierten 3'-Regionen umfassen auch die Transkriptionsterminierungsstellen.
Expressionsvektoren können ein Selektionsgen enthalten, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Beispiele für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind Dihydrofolatreduktase (DHFR, das von dem Ba/II/HindIII-Restriktionsfragment von pJOD-10 [ATCC 68815] stammen kann), Thymidinkinase (Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase ist auf dem BamHI-Fragment vom vP-5-Klon [ATCC 2028] enthalten) oder Neomycin (G418)-Resistenzgene (erhältlich von pNN414- künstlicher Hefechromosomvektor [ATCC 37682]). Wenn solche selektierbaren Marker erfolgreich in eine Säugetierwirtszelle übertragen werden, kann die transfizierte Säugetierwirtszelle überleben, wenn sie unter selektiven Druck gesetzt wird. Es gibt zwei weithin verwendete ausgeprägte Kategorien für selektive Systeme. Die erste Kategorie beruht auf einem Zellmetabolismus und die Verwendung einer Mutantenzelllinie, der die Fähigkeit fehlt, ohne ein ergänztes Medium zu wachsen. Zwei Beispiel sind: CHO DHFR^–-Zellen (ATCC CRL-9096) und Maus-LTK^–-Zellen (L-M(TK-) ATCC CCL-2.3). Diesen Zellen fehlt die Fähigkeit, ohne die Zugabe von solchen Nährstoffen, wie Thymidin oder Hypoxanthin, zu wachsen. Weil diesen Zellen bestimmte Gene fehlen, die für einen vollständigen Nukleotidsyntheseweg notwendig sind, können sie nicht überleben, wenn nicht die fehlenden Nukleotide in einem ergänzten Medium zur Verfügung gestellt werden. Eine Alternative zum Ergänzen des Mediums ist es, ein intaktes DHFR- oder TK-Gen in die Zellen einzuführen, denen die jeweiligen Gene fehlen, um so ihre Wachstumsanforderungen zu ändern. Einzelne Zellen, die nicht mit dem DHFR- oder TK-Gen transformiert wurden, können in nicht ergänzten Medien nicht überleben.
Die zweite Kategorie ist die dominante Selektion, die ein Selektionsschema betrifft, das in jedem Zelltyp verwendet wird und nicht die Verwendung einer Mutan tenzelllinie erfordert. Diese Schemen verwenden typischerweise ein Medikament, um das Wachstum einer Wirtszelle anzuhalten. Diese Zellen, die ein neues Gen haben, exprimieren ein Protein, das die Medikamentenresistenz überträgt, und überleben die Selektion. Beispiele für eine solche dominante Selektion verwenden die Medikamente Neomycin, Southern P. und Berg. P., J. Molec. Appl. Genet. 1:327 (1982), Mycophenolsäure, Mulligan, R.C. und Berg, P., Science 209:1422 (1980) oder Hygromycin, Sugden, B. u.a., Mol. Cell Biol. 5:410-413 (1985). Die drei oben angegebenen Beispiele verwenden bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle, um die Resistenz gegenüber dem geeigneten Medikament G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu übertragen.
Ein bevorzugter Vektor für die eukaryotische Expression ist pRc/CMV (im Handel erhältlich von Invitrogen Corporation, 3985 Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA 92121). Um zutreffende Sequenzen in konstruierten Plasmiden zu bestätigen, werden die Ligationsgemische dazu verwendet, E. coli K12-Stamm DH5a (ATCC 31446) und erfolgreiche Transformanten, die gegebenenfalls durch Antibiotikaresistenz ausgewählt werden, zu transformieren. Plasmide von den Transformanten werden hergestellt und durch Restriktion und/oder Sequenz mittels des Verfahrens von Messing u.a., Nucleic Acids Res. 9:309 (1981) analysiert.
Wirtszellen können mit den Expressionsvektoren dieser Erfindung transformiert und in herkömmlichen Nährstoffmedien kultiviert werden, die wie zum Induzieren von Promotoren geeignet modifiziert sind, indem Transformanten ausgewählt oder Gene amplifiziert werden. Die Kulturbedingungen, wie beispielsweise die Temperatur, der pH-Wert und dergleichen, sind die zuvor mit der Wirtszelle, die für die Expression ausgewählt wurde, verwendeten und sind dem Durchschnittsfachmann ersichtlich. Die Verfahren zum Transformieren von Zellen mit den zuvor erwähnten Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt und können in solchen allgemeinen Literaturstellen wie Maniatis u.a., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989) oder Current Protocls in Molecular Biology (1989) und Ergänzungen gefunden werden.
Bevorzugte geeignete Wirtszellen zum Exprimieren der Vektoren, die die beanspruchten Proteine kodieren, in höheren Eukaryoten umfassen: die afrikanische grüne Meerkatzen Nierenlinien-Zelllinie, die durch SV 40 transformiert ist (COS-7, ATCC CRL-1651); transformierte humane primäre embryonale Nierenzelllinie 293 (Graham, F.L. u.a., J. Gen Virol. 36:59-72 (1977), Virology 77:319-329, Virology 86:10-21); Babyhamsternierenzellen (BHK-21(C-13), ATCC CCL-10, Virology 16:147 (1962)), chinesische Hamster Eierstockzellen CHO-DHFR- (ATCC CRL-9096), Maus-Sertoli-Zellen (TM4, ATCC CRL-1715, Biol. Reprod. 23:243-250) (1980)), afrikanische grüne Meerkatzen Nierenzellen (VERO 76, ATCC CRL-1587); humane Cervikalepithoeloid-Karzinomazellen (HeLa, ATCC CCL-2), Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL-34); buffalo rat liver-Zellen (BRL 3A, ATCC CRL-1442), humane diploide Lungenzellen (WI-38, ATCC CCL-75); humane hepatozelluläre Karzinomazellen (Hep G2, ATCC HB-8065); und Maus-Brusttumorzellen (MMT 060562, ATCC CCL51).
2.f. Hefeexpression
Zusätzlich zu Prokaryoten, können auch eukaryotische Mikroben, wie beispielsweise Hefekulturen, verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae oder übliche Bäckerhefe ist der am häufigsten verwendete eukaryotische Mikroorganismus, obwohl eine Anzahl von anderen Stämmen allgemein verfügbar sind. Zur Expression in Saccharomyces wird zum Beispiel das Plasmid YRp7 (ATCC-40053, Stinchcomb u.a., Nature 282:39 (1979); Kingsman u.a., Gene 7:141 (1979); Tschemper u.a., Gene 10:57 (1980)) üblicherweise verwendet. Dieses Plasmid enthält bereits das trp-Gen, das einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm von Hefe vorsieht, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, zum Beispiel ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 (1977)).
Geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (gefunden auf dem Plasmid pAP12BD ATCC 53231 und beschrieben im US-Patent Nr. 4,935,350, 19. Juni 1990) oder andere glycolytische Enzyme, wie beispielsweise Enolase (gefunden auf dem Plasmid pAC1 ATCC 39532), Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase (abgeleitet vom Plasmid pHcGAPC1 ATCC 57090, 57091), Zymomonas mobilis (US- Patent Nr. 5,000,000, ausgegeben am 19. März 1991), Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomaserase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren sind, die den zusätzlichen Vorteil der Transkription haben, die durch Wachstumsbedingungen kontrolliert wird, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Säurephosphatase, abbauende Enzyme, die mit dem Stickstoffstoffwechsel in Verbindung stehen, Metallothionein (enthalten auf dem Plasmidvektor pCL28XhoLHBPV ATCC 39475, US-Patent Nr. 4,840,896), Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für die Verwendung von Maltose- und Galactose (GALI gefunden auf dem Plasmid pRY121 ATCC 37658) verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in der Hefeexpression werden weiter in R. Hitzeman u.a., europäische Patentanmeldung N. 73 657 A beschrieben. Hefe-Enhancer, wie beispielsweise UAS-Gal aus Saccharomyces cerevisiae (gefunden in Verbindung mit dem CYC1-Promotor auf dem Plasmid YEpsec-hllbeta ATCC 67024) werden auch günstigerweise mit Hefepromotoren verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein DNA-Molekül, das das Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, wie nachfolgend gezeigt.
(SEQ ID NO: 2). Dieses DNA-Molekül ist homolog zur im US-Patent 5,157,110 offenbarten Sequenz, dessen Inhalt hier durch Bezug aufgenommen wird.
Die folgenden Beispiele werden vorgelegt, um die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung vollständiger zu veranschaulichen. Sie sind keineswegs dahingehend auszulegen, dass sie den breiten Umfang der Erfindung einschränken.
BEISPIEL 1: Klonieren von DANN kodierendem IMP in einem Hefeexpressionsvektor.
Das Ziel dieses Vorhabens ist es, die Expression von großen Mengen von authentisch gefalteten, stabilen und funktionellen IMP mittels des Pichia-Hefeexpressionssystems (Invitrogen) zu erzielen und das Protein zur Homogenität zu reinigen. Die Gründe für das Auswählen des Pichiaexpressionssystems gegenüber anderen eukaryotischen Expressionssystemen sind die hohen Expressionsniveaus, die Einfachheit, das leichte Klonieren und die Kultur, die eukaryotische Kotranslationsmodifikation (IMP ist nicht glykosyliert aber erfordert die Spaltung der Signalsequenz und Sekretion, die durch dieses System leicht erreicht werden kann) und das authentische Falten (IMP hat mindestens 6 Disulfidbindungen und ein bakterielles Systems ist für die Falten eines solchen als Protein nicht ideal).
Die DNA, die das IMP-Protein kodiert, wurde mittels Primer amplifiziert, die von den Enden des offenen Leserahmens von genomischer DNA für das Kuhpocken-Virus stammen, und wurde mit dem Restriktionsenzym Hinc II verdaut. Das Fragment wurde dann von dem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt wie oben beschrieben gereinigt und die Enden wurden durch PCR mittels modifizierter Oligonukleotidprimer mutagenisiert, um die Restriktionsenzyme einzuführen. Diese modifizierte DNA von IMP, der die Region fehlt, die die Signalsequenz mit den geeigneten Restriktionsenzymen kodiert, wurde in die Mehrfachklonierungsstellen des Expressionsvektors pPIC9 eingeführt, der eine Signalsequenz mit dem Insert-ORF fusioniert. Darüber hinaus trägt dieser Vektor ein Ampicillinresistenzgen, CoLE1 und F1-Replikationsursprünge.
Das rekombinante Plasmid wurde dann ausgewählt, durch Restriktionsanalyse charakterisiert, in E. coli amplifiziert, um Pichia pastoris zu transformieren, auf Einbau durchsucht und sequenziert. Das durch das rekombinante Plasmid mit der passenden Sequenz getragene Insert wurde dann gereinigt. Der Vektor, der die 5' und 3' AOX1(Alkoholdehydrogenase)-Sequenzen trägt, welche auf die Integration in das Pichia-Wirtsgenom abzielen, führt zu einem Austausch des natürlichen AOX1-Gens durch das IMP-Gen. Auf der Suche nach wesentlichen Be standteilen wurde der HIS4-defiziente Stamm in Gegenwart von histidinfreiem Medium verwendet. Zellen, bei denen eine Rekombination auftrat, wuchsen, während Zellen, die kein Histidin erzeugten, nicht überlebten. Bei der Such nach Integration an den richtigen Stellen wurden Kolonien von der HIS-freien Platte auf eine Minus-HIS-Platte, Plus-Glycerinplatte und eine Minus-HIS,Plus-Methanol-Platte gegeben. Kolonien, die ein schwerfälliges Wachstum auf Methanol zeigen, besitzen nicht länger das AOX1-Gen und haben einen HIS+,Methanol^–-Phänotyp. Die ausgewählten Kolonien wurden dann 2 Tage lang in Medien wachsen gelassen, die Glycerin als einzige Kohlenstoffquelle enthielten. Die Zellen wurden 2 Tage später geerntet und zur Induktion der Expression verwendet. Die geernteten Zellen wurden erneut in Methanol enthaltenden Medien suspendiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden die Post-Induktionsproben der geklärten Kulturmedien zur Analyse angesetzt. Dies erfolgte auf einem 10-20 % Gradientengel und es wurde mittels eines Silberfärbeverfahrens mit bekannten Mengen an Gamma-Globulin gefärbt, das neben dem exprimierten VCP mitlief. Die erhaltenen Ergebnisse bestätigen, dass das Protein mit richtiger Größe sekretiert wird und zur Verwendung auf geeignete Weise gereinigt wurde.
BEISPIEL 2: Isozymartige Heparinbindungsaktivität von VCP
VCP hat eine isozymartige Heparinbindungsaktivität, die die Aufnahme durch Mastzellen ermöglicht, was dann zu einer verzögerten Freisetzung an der Infektionsstelle führen könnte. Eine Analyse der VCP-Sequenz legt eine mögliche molekulare Grundlage für die Heparinbindungsaktivität nahe. Dies umfasst eine positive Gesamtladung des Proteins (PI von 8,8) und das Vorhandensein von mutmaßlichen Heparinbindungsstellen (Lys X Lys) (worin X jede Aminosäure ist).
Das Medium aus mit dem Vacciniavirus-WR-Stamm infizierten RK-13-Zellen wurde geerntet, konzentriert und auf die DEAE-Biogelsäule gegeben. Die DEAE-Fraktionen, die VCP enthielten, wurden gepoolt und auf einer HITRAP-Heparinsäule gereinigt. Die gebundenen Proteine wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und mit erhöhten Natriumchloridkonzentrationen im Bereich von 100 mM bis 2,0 M eluiert. Die Fraktionen wurden dann auf einem Gradientenpolyacrylamidgel getrennt und dann silber gefärbt. Gereinigtes BSA (69 kDa), Lysozym (14,4 kDa) und Heparinbindungsprotein (HBP) (36 kDa) wurden in PBS gemischt und in ähnlicher Weise auf einer Heparinsäule getrennt, um die Salzkonzentrationen zu bestimmen, bei denen sie eluieren, und so die ungefähre Heparinbindungsaktivität von VCP zu bestimmen. Es wurde ein Hämolyseassay zur Bestimmung der Bioaktivität von VCP enthaltenden Fraktionen durchgeführt.
100 μg gereinigtes VCP und Lysozym wurden in 10 μl 50 ml Bicarbonatpuffer, pH 8,5, gelöst. Dann wurde mit 0,5-1,0 μl Fluorescein in DMSO gemischt und 2 Stunden auf Eis inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurden 2 ml PBS zugesetzt und die Lösung wurde auf 100 μl auf einem Amicon-Mikrokonzentrierer konzentriert und bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
Humane Mastzellen (NMC-1) wurden in RPMI-Medium mit 10 % Serum kultiviert. HMC-1 wurde entweder mit 20 μl mit Fluorescein markiertem VCP oder Lysozym gemischt. Nach 1-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen gewaschen und in 10 μl glycerierter Kochsalzlösung auf einem Objektträger platziert suspendiert und ein Deckgläschen wurde auf den Tropfen gelegt und unter dem UV-Licht-Mikroskop beobachtet.
Die Ergebnisse der Analyse der Fraktionen, die von den beiden getrennten Heparinsäulen eluieren, welche in den 1-3 gezeigt sind, legen nahe, dass das BAS nicht bindet und daher mit der Waschlösung eluiert. Im oberen Teil der 1 bis 3 betrifft 1,0 M den Molekulargewichtsmarker. BSA enthält unser gereinigtes BSA, Lys enthält gereinigtes Lysozym. Die HPB-Spur enthält reines HBP. U ist die ungebundene Fraktion und der Rest der Spuren sind Waschlösungen, bei denen mit steigendem NaCl gewaschen wird. Lysozym eluiert bei 2,0 M und 2,5 M. VCP andererseits (das Bodengel) eluiert bei 2,0 M, während das Heparinbindungsprotein bei etwa 3,0 M eluiert. Das VCP, das bei 1,0 und 2,0 M eluiert, hemmte 80 % der Hämolyse von sensibiliserten roten Zellen vom Schaf in Gegenwart von humanem Serum, was anzeigt, dass die Fraktionen, die die sichtbaren VCP-Bande enthalten, bioaktiv waren. Wir schlossen aus diesen Daten, dass VCP eine lysozymartige Heparinbindungsaktivität hat.
Um zu bestimmen, ob VCP die lysozymartige Fähigkeit hatte, durch Mastzellgranulate aufgenommen zu werden, wurden Fluoreszein markiertes VCP und Lysozym mit HMC-1 gemischt. Wie aus den 4 bis 7 ersichtlich ist, wurden sowohl Lysozym als auch VCP aufgenommen, und die Zellen waren fluoreszent. BSA, das als negative Kontrolle verwendet wurde, hatte keine Fluoreszenz. Diese Daten legen nahe, dass VCP an der Infektionsstelle durch das Mastzellengranulat aufgenommen werden konnte und über einen langen Zeitraum freigesetzt wurde, so dass sich eine verzögerte Hemmung der Komplementaktivität im Gewebe zu ergab.
Um weiter die Fähigkeit von VCP zu bestimmen, hat die Analyse der Komplementhemmungsaktivität der in der 1 veranschaulichten Fraktion gezeigt, dass die Aktivität hauptsächlich in der Fraktion 1M und 2M (8) beobachtet wird.
Um die molekulare Basis der Heparinbindungsaktivität der Proteine zu bestimmen, analysierten wir die mutmaßlichen Bindungsstellen für Lysozym, VCP und das Heparinbindungsprotein. Wir schlossen, dass die Heparinbindung der fundamentalen Gesamteigenschaft dieser Proteine zugeschrieben werden kann. Das Vorhandensein von basischen Aminosäuren in nächster Nähe an mehreren Stellen in den Proteinen kann auch zur Heparinbindung beitragen. Beim Vergleich von VCP und HBP scheint eine LysXLys-Stelle in jedem Protein vorhanden zu sein (X ist eine Aminosäure).
Um weiter die Fähigkeit von VCP zu bestimmen, von Mastzellen und Endothelzellen in einer Mischkultur aufgenommen zu werden, wurden Fluoreszein markiertes VCP, Lysozym, HBP, IgG und BSA mit HMC-1 und HUVEC gemischt. Lysozym und HBP waren als positive Kontrollen aufgrund ihrer Fähigkeit, Heparin zu binden und von Mastzellen aufgenommen zu werden, enthalten. BSA und IgG waren aufgrund ihrer schwachen Heparinbindungseigenschaften als negative Kontrollen enthalten. Die 9 zeigt das Phasenkontrastbild und das entsprechende Fluoreszenzbild für jede Protein/Zell-Mischung. VCP wurde von den Mast/Endothelzellen aufgenommen und zeigte eine Fluoreszenzintensität, die ähnlich der von Lysozym und HBP war. Umgekehrt waren die Fluoreszenzinten sitäten von IgG und BSA signifikant niedriger, was nahe legt, dass sie kein Heparin banden und nicht von den Mast-/Endothelzellen so wirksam wie VCP, Lysozym oder HPB aufgenommen wurden. Diese Daten legen nahe, dass VCP an der Infektionsstelle von Mastzellgranulat aufgenommen werden konnte, das anschließend von Endothelzellen aufgenommen und über die Zeit freigesetzt werden konnte, was zu einer verzögerten Hemmung der Komplementaktivität im Gewebe führte.
Chemokine sind kleine Chemolockstoff-Cytokine, die für die Rekrutierung von Leukozyten an Entzündungsstellen kritisch sind. Chemokine treten über ihren Aminoterminus mit Rezeptoren, die auf Leukozyten angeordnet sind, in Wechselwirkung, während ihr Carboxyterminus an Glycosamine, wie beispielsweise Heparin, das auf den Endothelzelloberflächen angeordnet ist, bindet.
Durch die Heparinbindung sind Chemokine in der Lage, Gradienten entlang den Endothelwänden einzurichten und die Leukozytenlokalisation und Migration in Gewebe zu dirigieren. Daher haben die Erfinder die Fähigkeit von VCP getestet, an Heparin auf Endothelzellen zu binden und die Migration von Monocyten in Gegenwart und bei Fehlen von Chemokin MIP-1α zu hemmen. Die Tabelle 1 zeigt die Anzahl von Endothelzellen mit angelagerten Monozyten unter allen getesteten Bedingungen.
Tabelle 1. Prozentuale Verringerung einer Monozytenanlagerung an Endothelzellen in Gegenwart von VCP
Jede Anzahl in der Spalte „# angelagerte Monozyten" in der Tabelle 1 stellt den Durchschnitt von 3 Proben dar, mit Ausnahme der 4x, 8x und 16x VCP-Proben, die in nur einmal durchgeführt wurden. Die Spalte „% Abfall" in der Tabelle 1 betrifft den Abfall in Bezug auf die reine MIP-1α-Kontrolle für jede jeweilige Probengruppe. Das Einschließen von VCP führte zu signifikant niedrigeren Niveaus an Monocytenmigration, wobei der dramatischste Abfall (87,9 %) auftrat, wenn 2x VCP mit 2X MIP-1α enthalten war. VCP scheint an Heparin auf Endothelzellen zu binden, die Anlagerung von Chemokinen zu blockieren und daher die Leukozytenlokalisation zu verhindern.
Ein lyophilisiertes Präparat mit VCP von einer natürlichen Infektion konnte das durch Humanserum induzierte und NK-Zellen induzierte Abtöten von Schweineaortaendothelzellen blockieren, so dass nachgewiesen werden konnte, dass IMP das Komplement vermittelte Abtöten einer Schweineaortoaendothelzellsuspension in Gegenwart von humanem Serum blockieren kann. Dies zeigt klar das Potential von IMP beim Konservieren von Xenotransplantaten (10). VCP und IMP sind funktional identisch und daher praktisch austauschbar.
BEISPIEL 3: Überexpression und Reinigung von großen Mengen an IMP in einem geeigneten System.
Diese Untersuchung verwendet das Hefe-Pichia-System, um ein authentisches Produkt in großen Mengen zur Verfügung zu stellen und die Entzündung in einem viral induzierten Entzündungsmodell zu regulieren. Das Standardverfahren zur Reinigung und Analyse von komplementinhibitorischer VCP-Aktivitiät von einer natürlichen Infektion wird kurz wie folgt beschrieben: RK-13-Zellen (ATCC CCL 37, American Type Culture Collection, Rockville, MD) werden zur Konfluenz in 40 150 cm³ Zellkulturkolben mit Eagles Minimal Essential Medium (MEM), enthaltend 10 % fötales Rinderserum (FBS), in einem CO₂-Inkubator, der bei 37°C gehalten wird, wachsen gelassen. Die Zellen werden mit dem Vaccinia-Virus-Stamm WR (ATCC VR-119) in 2,5 ml MEM, enthaltend 2 FBS, 2 Stunden lang bei einer Vielzahl von Infektionen von 30 pfu (Plaque bildende Einheiten)/Zelle infiziert. Die Zellmonoschicht wird ausgiebig mit serumfreiem Medium gewaschen, um das Inokulum und restliche Serumproteine zu entfernen. Die gewaschenen Zellen werden in einen Kolben mit 10 ml serumfreiem MEM oder opti-MEM gegeben, dann bei 37°C 24 Stunden lang inkubiert. Das Medium wird geerntet und 10 Minuten bei 4°C durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit geklärt (2500 UpM in einem H6000A-Rotor (DuPont Sorvall, Newtown, CT) in einer Sorvall RC-3B Zentrifuge (DuPont Sorvall)). Das gepoolte Medium wird dann zehnfach mittels einer 500 ml Rührzelle bei N₂-Druck (75 psi) mit einer gewaschenen YM10-Membran (Amicon, Beverly, MA) konzentriert. Das Konzentrat wird auf 50 ml mit einem Puffer verdünnt, der 30 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8,6, enthält und erneut konzentriert. Dieser Schritt hilft beim Entsalzen der Proteine und balanciert sie in dem Säulenbindungspuffer aus. Das Konzentrat wird auf eine DEAE Biogel-Säule (Bio-Rad Laboratories, Diagnostic Group, Hercules, CA) gegeben, mit dem obigen Puffer ausbalanciert und dann mit einem Stufengradienten von 0,03 bis 0,3 M NaCl eluiert. Zwei-Milliliter-Fraktionen werden einzeln in Centricon-10-Konzentrierer (Amicon) gegeben, zehnfach konzentriert und bei –90°C gelagert. Die Fraktionen werden mittels SDS-PAGE überwacht. Diejenigen, die VCP enthalten, werden auf eine Sephadex G-100-Säule gegeben (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ), mit 141 mM NaCl, 0,15 mM CaCl₂, 0,5 mM MgCl₂, 1,8 mM Natriumbarbital und 3,1 mM Barbitursäure ausbalanciert, pH 7,3 bis 7,4.
Die Fraktionen werden erneut mittels SDS-PAGE analysiert, entweder durch Färben mit Silberfärbung und durch Western Transfer oder durch Mischen von radiomarkierten Proteinen mit nicht markierten Proteinen und Überwachen der Radioaktivität durch Aussetzen des trockenen Gels einem Röntgenfilm. Die Komplementhemmungsaktivität des Proteins wird durch Standardverfahren und die folgenden, im Handel verfügbaren Materialien gemessen: sensibilisierte rote Blutzellen von Schafen (Diamedix, Miami, FL), in 150 μl Volumen, abgegeben in die Löcher einer 96er-Mikroplatte (Nunc, Inc., Naperville, IL). Es wird eine Blindprobe durch Zugabe von 50 μl Verdünnungsmittel (Gelatinveronalpuffer, Sigma, St. Louis, MO) zum ersten Loch hergestellt. Ein Bezugsstandard wird durch Zugabe von 5 μl eines mit 1:20 verdünnten Standardserums (Diamedix) und 45 μl Verdünnungsmittel erstellt. Die Proben (15 μl) aus gereinigtem Material, 5 μl eines mit 1:20 verdünnten Standardserums und 30 μl Verdünnungsmittel werden dem Testloch zugesetzt. Der Inhalt des Lochs wird gemischt und die Platte 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Proben werden aus den Löchern genommen und in Mikrofugenröhrchen zentrifugiert. Die Überstände werden auf eine Mikroplatte mit flachem Boden übertragen. Das Adsorptionsvermögen wird bei 415 nm gemessen. Die prozentuale Hemmung der Hämolyse wird durch Abziehen der prozentualen Hämolyse von 100 berechnet.
Der rekombinante Hefe-Pichia pastoris-Vektor, der IMP exprimiert, ist bereits isoliert worden, und das IMP wird aus dem Überstand durch ein Verfahren gereinigt, das mit dem Reinigungsverfahren, das für das natürliche Infektionssystem verwendet wird, identisch ist.
BEISPIEL 4: Die Wirkung von IMP auf die Komplementhemmung
Diese Untersuchung ist so ausgelegt, dass sie die Ergebnisse von In-vitro-Experimenten in vivo bestätigt, was anzeigt, dass IMP wirksam die Komplementaktivierung hemmt.
1. Experimenteller Aufbau.
a) Hemmung einer Entzündungsreaktion.
Die In-vivo-Injektion von IMP in die Bindegewebe-Luftsäcke (air pouches) von Mäusen, enthaltend rekombinantes CPV-IMP in BALB/c, C5-defiziente und abgestimmte C5-suffiziente/C3-defiziente und C3-suffiziente Mäusen. Das Bindegewebe und umgebende Gewebe werden auf bestimmte Zelländerungen hin untersucht.
Zwei sensible in vivo-Assays sind entwickelt worden, um den Umfang und die Natur der Entzündungsreaktion zu messen. Einer von beiden ist ein Fußballen-Injektionsverfahren, das das Injizieren von 10⁶ Viruspartikeln der rekombinanten und Wildtyp-Viren in den rechten Fußballen von einzelnen Mäusen und dann das Überwachen der SSR für bis zu zwei Wochen umfasst. Im Allgemeinen erfolgt die Spitzenreaktion um den 10. Tag herum und es gibt eine etwa 200 % größere SSR in dem Mutanten, dem IMP fehlt, als bei der Wildtyp-Virusinjektion. Mindestens 24 BALB/c-Mäuse pro jede der vier Gruppen (96 Mäuse) sind erforderlich, um statistisch signifikante Ergebnisse zu erhalten. Die 24 Mäuse werden wie folgt verwendet: sechs für die Fußballen-Messung; sechs für die Luftsack-Experimente, um das Einströmen von Zellen anschließend an die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung zu quantifizieren; vier für die Messung der Myeloperoxidase (Anzeichen für neutrophilen Influx) direkt vom Bindegewebe mit einem sensiblen in der Firma entwickelten Mikroplattenassay; und jeweils vier werden für die Messung von CD4+- oder CD8+-Zellen mittels Immunhistochemie verwendet. Frühere Erfahrungen haben gezeigt, dass die SD der Fußballen-SSR sehr gering (~ 0,25 mm) und das Modell stark reproduzierbar ist. Bei dem anderen Verfahren wird altersmäßig angepassten Mäusen subkutan auf dem Dorsum 1 cm³ Luft mittels einer 27er Nadel injiziert. Anschließend folgt eine Injektion von 10⁶ pfu mit Gradient gereinigtem CPV oder CPV-IMP mit und ohne geeignete Mengen an IMP oder PBS in einem 100 μl Volumen PBS direkt in den Luftsack mittels einer 25er Nadel. Nach 10 Tagen werden die Mäuse durch Ausbluten geopfert. Luftsack-Bindegewebe wird dann schnell entfernt und auf einen Objektträger gelegt, mit 99 % Methanol fixiert und dann mit May-Grunwald-Giemsa zur Differenzierung und Quantifizierung gefärbt. Das Gewebe benachbart dem Bindegewebssack wird auch entnommen und dann werden Längsschnitte angefertigt und mit Hematoxylin und Eosin gefärbt, um den Umfang und die Art der Gewebeinfiltrati on zu untersuchen. Diese In-vivo-Verfahren ermöglichen die Quantifizierung durch Auszählen entzündeter Zellen/cm².
B) C3-Bindungsassay.
Maussplenozyten (3 × 10⁵, hergestellt gemäß dem in der nächsten Untersuchung beschriebenen Verfahren) werden 10 Minuten lang bei 37°C in Gegenwart von gepooltem normalem humanem Serum (NHS; 0-12,5 %) in MT-PBS inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EDTA auf 10 mM beendet und durch Zentrifugation gesammelt (250 × g, 5 Minuten, 4°C). Um die C3-Ablagerung festzustellen, werden Zellen (30 Minuten auf Eis) mit FITC-konjugierten Kaninchen anti-humanen C3c-Fab-Fragmenten (Boehringer) bei einer Verdünnung von 1:50 in MT-PBS mit 2 % HI-FCS und 10 % Mausserum inkubiert und durch Durchflusszytometrie analysiert.
In der Untersuchungsgruppe wird IMP der Inkubationslösung zugesetzt. Die Kontrollgruppe umfasst Splenozyten, die mit anti-C3c-Antikörper (kein Serum) inkubiert sind, um eine Kontrolle auf nicht spezifische Antikörperablagerung durchzuführen. Die Quantifizierung der C3-Ablagerung wird mittels Durchflusszytometrie durchgeführt; die Ergebnisse werden als mittlere Kanalfluoreszenz (MCF) von Dreifachproben ausgedrückt.
C) Untersuchte Tiergruppen.
Zur Hemmung der Entzündungsreaktion werden vier Mäusegruppen untersucht, von denen jede 24 Mäuse umfasst.

Gruppe 1. C5-defiziente Mäuse
Gruppe 2. abgestimmte C5-suffiziente Mäuse
Gruppe 3. C3-defiziente Mäuse
Gruppe 4. abgestimmte C3-suffiziente Mäuse

2. Ergebnisse
Es wird erwartet, das IMP eine viel weniger ernste Komplementaktivierung und weniger Gewebeinfiltration bewirkt. Bei der Splenozytenuntersuchung wird weniger Komplementablagerung erwartet. Diese Untersuchung bildet die Grundlage für die Maus-Ratten-Herz-Xenotransplantation.
BEISPIEL 5. Maus-Ratten-Xeno-Herztransplantation
1. Gründe für die Studie
Diese Untersuchung dient dazu, die Komplementaktivität während der Maus-Ratten-Herz-Xenotransplantation zu testen. Eine gewöhnliche Maus-Ratten-Transplantation (konkordant) wird zum Vergleich mit der Maus-Ratten-Xenotransplantation verwendet, bei der die Empfängerratten durch Splenozyteninjektion sensibilisiert wurden.
2. Sensibilisierung der Ratten mittels Splenozyten von Mäusen.
A. Herstellung von Donor-Milzzellen.
Die Mäuse werden mit Natriumpentobarbital (50-55 mg/kg, i.p.) anästhetisiert. Der Bauch wird geöffnet und die Milz wird durch einen Mittellinienschnitt unter aseptischen Bedingungen entfernt. Die Milz wird auf eine sterile Petrischale mit 5 ml RPMI 1640 Medium (Sigma Chemical Co.) übertragen und mittels eines Gewebehomogenisierers zerkleinert und in RPMI-Medium suspendiert. Die Suspension wird durch einen sterilen Filter gegeben, um die Stromaelemente zu eliminieren. Das Filtrat wird dann bei 1100 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert, der Zellknopf wird in RPMI erneut suspendiert und die Splenozytensuspension wird auf einen Ficoll-Hypaque-Gradienten gegeben und bei 1600 UpM 15 Minuten lang zentrifugiert. Die roten Blutzellen werden mit NH₄Cl lysiert. Alle verbleibenden weißen Blutzellen werden mit RPMI 1640 Medium gewaschen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird mittels Trypan blau-Färbeausschluss bewertet. Wenn die Lebensfähigkeit über 90 % liegt, werden die Zellen für die Injektion verwendet.
B) Vorbehandlung von Implantatempfängern.
Den Empfängerratten wird 25 × 10⁶ Mäusesplenozyten jeweils in einem Volumen von 0,01 ml RPMI 1640 Medium injiziert. Dieses Volumen wird perkutan in den Thymus mit der Nadel unter dem Manubrium abgewinkelt injiziert.
3. Allgemeines Operationsverfahren

A) Zeit der Herztransplantation: 4 Wochen nach dem Empfangen der Maussplenozyteninjektion.
B) Instrumente und präoperative Maßnahmen. Im Betrieb befindliches Mikroskop: Carl-Zeiss Operationsmikroskop Nähte: II-0 Prolen mit einer 3 mm gekrümmten Rundkörpernadel.
C) Sowohl die Spender- als auch die Empfängeroperation werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
D) Penicillin (10.000 Einheiten) wird zur Zeit der Operation i.m. verabreicht.

4. Spenderoperation.
Es wird eine Anästhesie mit Natriumpentobarbital (55 mg/kg, i.p.) eingeleitet. Zwanzig Einheiten Heparin werden über die Penisvene injiziert. Die Brust wird durch eine mediane Sternotomie geöffnet. Unter dem Mikroskop (16 ×) wird die rechte obere Venenhöhle und die hintere Venenhöhle mit 6-0 Seidennaht nahe dem Atrium ligiert und distal zu den Ligaturen geteilt. Die aufsteigende Aorta und ein Segment der namenlosen Arterie werden immobilisiert. Die Aorta wird ligiert und nahe der namenlosen Arterie abgeschnitten, und eine 1 mm lange namenlose Arterie verbleibt an der Aorta für eine spätere Revaskularisierung. Die Hauptlungenarterie wird freigelegt und am Bifurkationspunkt abgetrennt (transacted). Die linke obere Venenhöhle und die Lungenvenen werden alle zusammen ligiert und distal geteilt. Das linke Atrium wird ligiert, um es zu verkleinern. Das Herz wird dann herausgeschnitten, durch 4°C Kardioplegie (Euro-Collins oder St. Thomas Lösung) künstlich durchblutet und für die Transplantation in die Kardioplegielösung (2-4°C) gegeben.
5. Zervikale heterotrope Translation.
Die Empfängerratte wird mit Natriumpentobarbital (55 mg/kg i.p.) anästhetisiert und in eine Rückenlage gebracht, wobei der Kopf zum Operateur hin zeigt. Der Kopf wird gestreckt und mit einem Stück Gummiband immobilisiert, das die oberen Schneidezähne des Tiers am Operationstisch (operating board) verankert. Nach der Rasur erfolgt ein vertikaler Schnitt von etwa 1,5 cm Länge im Hals vom Mittelpunkt des Kinns zum rechten mittleren Schlüsselbein. Unter dem Mikroskop (16 ×) wird die äußere Jugularvene vom Schlüsselbein zu ihrer ersten Hauptbifurkation beweglich gemacht. Alle kleinen Äste dieses Segments werden mit dem Feinspitzkauter geschnitten. Die Jugularvene wird proximal mit der feinen Klemme nahe dem Schlüsselbein abgeklemmt und dann distal am Bifurkationspunkt abgetrennt. Der Sternomastoidmuskel wird durchgeschnitten, um die rechte Halsschlagader freizulegen. Das Gefäß wird beweglich gemacht und proximal mit der feinen Klemme abgeklemmt, ligiert und distal durchgeschnitten.
Bei 25 × Vergrößerung wird das Spenderherz in den vorderen Hals des Empfängers mittels des Ende-an-Ende-Nahtverfahrens sowohl für Arterien- als auch Venenanastomosen transplantiert. Die namenlose Arterie des Spenderherzens und die rechte Halsschlagader des Empfängers werden anastomosiert, indem zuerst eine 11-0 Naht verwendet wird, und dann wird die Lungenarterie des Spenderherzens und die äußere Jugularvene des Empfängers mittels einer 11-0-Naht anastomosiert. Die Klemme an der Jugularvene wird nach dem Abschließen der Anastomosen zuerst freigegeben und dann wird die Klemme an der Karotidarterie entfernt. Das transplantierte Herz wird in eine geeignete Position gebracht, um ein Verdrehen der anastomosierten Gefäße zu verhindern, bevor der Hautschnitt geschlossen ist.
6. Perioperative und postoperative Messungen.
Das Empfängertier wird aufwachen gelassen und nach der Operation sorgfältig beobachtet. Das arterielle und venöse Blutgas, arteriell-venöse Sauerstoffunterschiede, Serummilchsäure, Serum-CPK und CPK-Isoenzyme werden überwacht.
A) Blutentnahme während der Operation.
Um die Komplementaktivierung während der hyperakuten Abstoßung zu untersuchen, werden 0,2-0,3 ml Blut von den Empfängerratten zu folgenden Zeiten gesammelt: 1) arterielles Blut bevor die Vaskularklemme freigegeben wird (vor der Abstoßung); 2) rechtes Ventrikelblut des Transplantats etwa 5 Minuten nach der Freigabe der Klemme (während der Abstoßung), und 3) arterielles Blut nach erfolgter Abstoßung (etwa 20 Minuten nachdem die Klemme freigegeben wird).
B) Blutentnahme nach der Operation.
Wenn die Tiere die akute Abstoßung überleben, werden Blutproben durch Schwanzblutung der Empfängerratten jeden zweiten Tag acht Tage lang und dann jeden 7. Tag gesammelt, bis das Spenderherz aufhört zu schlagen. Die Proben werden für spätere Tests bei –80°C gelagert.
C) Myokardbiopsien.
Herzbiopsien werden an der Grundlinie (direkt vor der Implantatreperfusion) und bei Beendigung der Studie genommen. Jede Probe wird histopathologisch und immunpathologisch untersucht.
D) Überleben des Herzxenotransplantats.
Das Überleben des transplantierten Herzens wird durch tägliche Palpation und EKG-Überwachung bestimmt. Die Abstoßung wird als abgeschlossen angesehen, wenn der Herzschlag aufhört.
E) Komplementaktivierung im Herzgewebe.
Wenn das Herz abgestoßen wird, wird die Ratte durch Injektion von Natriumpentobarbital getötet und das Herz wird für eine histopathologische oder immunhistochemische Analyse entnommen.
7. Histopathologische Untersuchungen.
Sobald der Herzschlag des Implantats aufhört, wird die Ratte durch eine Überdosis Natriumpentobarbital getötet, bevor das Herz entnommen wird. Die Herzen werden in 10 % Formalinlösung fixiert und Herzschnitte werden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Die Abstoßung wird wie folgt beurteilt: 0 = kein interstitielles Infiltrat; 1 = leichtes, diffuses interstitielle Extravasation von RBC; 2 = erhöhtes interstitielles Ödem mit mäßiger bis intensiver Extravasation von RBC, Infiltration von mononuklearen Zellen und fokaler Myocytennekrose; 3 = schweres Entzündungsinfiltrat mit ausgedehnter Myocytennekrose und Blutung. Diese Beurteilung stellt die schwerste histologische vorhandene Schädigung dar. Bei den langfristig Überlebenden wird besonderes Augenmerk auf die Zellinfiltration, Myokardfibrose und vaskuläre Verletzung gelegt.
8. Immunpathologische Messungen der Komplementaktivität.
A) Immunfluoreszenzstudien.
Proben von Biopsiegeweben werden gefärbt auf IgG, IgM, C3, C4, C5b-Neoantigen, MAC, Properdin, Fibrinogen, polymorphonukleare neutrophile Leukozyten und Blutplättchen, affinitätsisolierte, Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) Ziegen anti-humane Antikörper gegen IgG (γ-kettenspezifisch), IgM (μ-kettenspezifisch), C4, C3 und C5b werden von Organon-Teknika Corporation (Cappel Research Products, Durham, NC) erhalten. Properdin und Fibrinogen werden mittels FITC-konjugierten Kaninchen antihumanen Antikörpern (Atlantic, Stillwater, MN und Accurate, Westbury, NY) erfasst. MAC wird mittels Ziegen monoklonalen Antikörpern gegen Neoantigen von MAC erfasst. Monozyten und/oder Granulozyten werden mittels Maus anti-humanem CDIIb/CD18 (OKM₁) (Ortho, Raritan, NJ) erfasst und Blutplättchen werden mittels Maus anti-humanem CD9 (BA-2) festgestellt. Monoklonale Maus-Antikörper werden mittels affinitätsisolierten f(ab')₂, FITC-konjugierten Ziegen anti-Maus-IgG-Antikörpern und Kaninchen anti-Ziegen IgG-Antikörpern (Organon-Teknika Corporation) ermittelt. Monoklonale Ziegen-Antikörper und affinitätsgereinigte Antikörper, die gegen humanes Immunoglobulin gerichtet sind, und Komplement werden durch Reaktivität mit Paviangeweben und durch ELISA gegen Pavianserum standardisiert. Antikomplementreagenzien werden gegen Nierengewebe standardisiert, das von einem Pavian mit Immunablagerungen erhalten wurde.
B) Herstellung und Färben von Gewebeschnitten.
Gewebeproben aus Herzxenotransplantaten werden in vorgekühltem Isopentan und flüssigem Stickstoff schockgefroren (snapfrozen) und bei –70°c bis zur Verwendung gelagert. Die gefrorenen Gewebeschnitte (4 μm Dicke) werden geschnitten. Die Gewebeschnitte werden luftgetrocknet, mit Aceton fixiert und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) gewaschen. Die Gewebeschnitte werden dann 45 min mit einem affinitätsisolierten FITC-konjugierten markierten primären Antikörper oder mit nicht markierten monoklonalen oder polyklonalen Ziegen-Antikörpern inkubiert. Nicht markierte monoklonale Ziegen-Antikörper werden mit einer Doppelfluorchromantikörperschicht bestehend aus affinitätsisoliertem F(ab')₂ FITC-konjugiertem Ziegen anti-Maus-IgG (H und L) und affinitätsisoliertem, F(ab')₂- FITC-konjugiertem Kaninchen anti-Ziegen IgG (H und L) erfasst, wobei beide Reagenzien mit humanem Serum absorbiert wurden. Nach dem Färben werden die Gewebe mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in einer Lösung enthaltend p-Phenylendiamin und Glycerin eingerichtet. Die Hintergrundimmunfluoreszenz wird durch Weglassen der primären Antikörper bewertet. Antikörper gegen humanes Immunglobulin werden mit Schweineserum absorbiert. Das ganze Gewebe wird untersucht und mit einem Fluoreszenzmikroskop photographiert.
C) Messung von natürlichen Antikörperniveaus.
Die gesamten und xenoreaktiven IgM-Titer werden an der Grundlinie und nach der Xenotransplantation gemessen. Der Gesamt-IgM wird durch ELISA bestimmt. Die Bindung von xenoreaktivem IgM an kultivierte Schweineaorta-Endothelzellen (anti-PAEC-IgM) wird mittels ELISA bestimmt. Die anti-Gala (1,3) Gal IgM-Komponente von anti-PAEC-IgM wird durch Messen des Abfalls in der IgM-Bindung an kultivierte Schweinezellen nach der Behandlung mit 0,4 U ml^–1 einer Lösung von αI-3-Galactosidase (von der grünen Kaffeebohne) (Boehringer Mannheim, GMBH, Mannheim, Deutschland) vor dem ELISA bestimmt. Xenoreaktive IgM-Titer werden sowohl für anti-PAEC-IgM als auch anti-Gal (1,3) Gal-IgM gezeigt.
D) Komplementaktivitätsassays.
Die Komplementaktivität wird durch Messung von Pavianplasma C4 funktioneller Aktivität und durch totale hämolytische (CH50) Aktivität quantifiziert. Die Plasmaproben, die für die Komplementaktivitätsassays verwendet werden, werden in EDTA gesammelt und bei –70°C wie oben beschrieben gelagert. Während des Verarbeitens werden alle Proben auf Eis präpariert, um die Temperaturen unter 4°C zu halten. Die ganzen Komplementtitrationsassays werden mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren durchgeführt. Die Plasmaniveaus der vierten Komplementkomponente (C4) werden mittels einem einstufigen funktionalen Assay, der auf dem Fachgebiet bekannt ist, bestimmt.
9. Untersuchte Tiergruppen:
Etwa 100 BALB/c-Mäuse mit einem Gewicht von 20 bis 25 g werden als Herzspender verwendet und erwachsene Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 200 bis 300 g werden als Empfänger verwendet.
Die Tiere werden in zwei Gruppen eingeteilt:
Kontrollgruppe: nicht sensibilisierte Ratten werden als Empfänger verwendet.
Untersuchungsgruppe: Ratten, die mit Spendermaussplenozyten sensibilisiert wurden, werden als Empfänger verwendet.
10. Ergebnisse
Es wird erwartet, dass die Komplementaktivierung in beiden Gruppen auftritt, wobei eine Abstoßung nach der Transplantation erfolgt. Bei der Untersuchungsgruppe, bei der die Ratten sensibilisiert wurden, wird eine viel schnellere Abstoßung erfolgen, die als hyperakute Abstoßung bezeichnet wird. Die Komplementaktivierung in dieser Gruppe wird erwartungsgemäß viel schwerer als in der Kontrollgruppe sein.
BEISPIEL 6: Die Wirksamkeit von IMP auf eine Maus-Ratten-Herz-Xenotransplantation.
Diese Untersuchung wird die Wirksamkeit von IMP auf die Komplementaktivierung während der Maus-Ratten-Herzxenotransplantation testen. Die Untersuchung wird in drei Teile unterteilt: 1) die Wirksamkeit von IMP als solches auf die Maus-Ratten-Herztransplantation und die Dosisreaktion von IMP; 2) die Wirkung von IMP in Kombination mit Lektin: und 3) die Wirkung von IMP in Kombination mit regulärer Immunsuppression.
Mannose bindendes Lektin (MBL) ist ein C-Typ-Lektin, das in erster Linie mit der Wirtsabwehr gegen Pathogene befasst ist. Lektin kann einen natürlichen Antikör per davon abhalten, mit Gewebeoberflächen in Wechselwirkung zu treten und Komplement zu aktivieren. Bei Verwendung zusammen mit IMP kann die Wirkung der Komplementhemmung sehr stark gesteigert werden.
Wegen der obigen Kombinationen kann das xenotransplantierte Herz in der Lage sein, die hyperakute Abstoßung zu überleben und viel länger zu leben. Wir werden eine dreifache Immunsuppression zugeben, um die Überlebenszeit weiter zu verlängern und die zelluläre vermittelte Abstoßung zu untersuchen.
Beispiel 6A, Dosisreaktion von IMP
1. Experimenteller Aufbau
Der experimentelle Aufbau ist ähnlich dem in Beispiel 5 oben beschriebenen. Die Empfängerratten werden durch Maussplenozyteninjektion sensibilisiert.
2. Untersuchte Tiergruppen.
Vier Herztransplantatgruppen werden ausgeführt. Jede Gruppe umfasst 50 Transplantate.

Gruppe 1: Kontrollgruppe, Maus-Ratten-Herz-Xenotransplantation wird durchgeführt, aber es wird kein IMP verwendet.
Gruppe 2: Maus-Ratten-Herz-Xenotransplantation wird durchgeführt und IMP wird in einer Dosierung von 5 mg/kg/Tag gegeben.
Gruppe 3: IMP 15 mg/kg/Tag
Gruppe 4: IMP 25 mg/kg/Tag.

3. Ergebnisse:
Wir erwarten, dass IMP nicht die Wirtskomplementaktivierung hemmt und die xenotransplantierten Mausherzen länger als in der Gruppe ohne IMP überleben werden. Die wirksamste Dosierung von IMP wird gewählt.
Beispiel 6B. Die Wirkung von IMP in Kombination mit Lektin gegeben
1. Experimenteller Aufbau.
Der experimentelle Aufbau ist ähnlich dem in Beispiel 5 (oben) beschriebenen. Die Empfängerratten werden mittels Maussplenozyteninjektion sensibilisiert. Die Herzproben werden auf Komplementablagerung untersucht, wie im Beispiel 2 (oben) beschrieben.
2. Untersuchte Tiergruppen.
Drei Herztransplantatgruppen werden ausgeführt. Jede Gruppe hat 50 Transplantate.

Gruppe 1: Kontrollgruppe, eine Maus-Ratten-Herz-Xenotransplantation wird durchgeführt, aber es wird kein IMP verwendet.
Gruppe 2: Maus-Ratten-Herz-Xenotransplantation wird durchgeführt und IMP wird verwendet. Die beste in der Untersuchung 4A gefundene Dosierung wird verwendet
Gruppe 3: Maus-Ratten-Herze-Xenotransplantation plus IMP und Lektin (10 mg/kg/Tag)

2. Ergebnisse
Wir erwarten, dass die Zugabe von Lektin weiter die hyperakute Abstoßung reduzieren und die Überlebenszeit des Herzens verlängern wird. Die Komplementaktivierung sollte auch umfangreicher gehemmt werden.
Beispiel 6C. Die Wirkung von IMP in Kombination mit regulärer Immunsuppression
IMP kann die hyperakute Abstoßung reduzieren oder ausschalten. Allerdings ist der Abstoßungsvorgang, der bei der Xenotransplantation umfasst ist, nicht auf hyperakute Abstoßung beschränkt. Nach der ersten starken hyperakuten Abstoßung erfolgen humorale und zelluläre Abstoßungen. Diese Abstoßungen werden durch das Komplementsystem eingeleitet. Um ein Überleben von xenogenen Organtransplantaten zu erhöhen, ist eine reguläre Immunsuppression erforderlich. Diese Untersuchung ist so aufgebaut, dass die Möglichkeit des Verlängerns der Xenotransplantat-Überlebenszeit durch Kombination von IMP und regulärer immunsuppressiver Behandlung erforscht wird.
Wegen der Zusatzes der Immunsuppression ist es für das transplantierte Herz möglich, viel länger zu überleben. Es wird erwartet, dass in den ersten drei Monaten ein ähnlicher akuter Abstoßungsvorgang, wie er bei einer Alloherztransplantation zu sehen ist, auftritt. Diese Abstoßung ist zellvermittelt und ist ein entzündliches Infiltrat mit verschieden Schwerestufen. Die Lymphozytenaktivierung ist ein Standardansatz zur Bewertung der zellvermittelten Abstoßung. Das CD69-Antigen ist einer der frühesten Marker, die auf aktivierten T-, B- und natürlichen Killer(NK)-Lymphozyten anschließend an eine Stimulation durch Antigene exprimiert wird. Wir haben in unserem Labor einen schnellen T-Zell-Aktivierungsassay verwendet, der die Zelloberflächenexpression von CD69-Antigen mittels Multiparameter-Durchflusszytometrie misst. Dies ermöglicht es uns, die frühe Aktivierung von zellvermittelter Abstoßung festzustellen und zu überwachen.
1. Experimenteller Aufbau
A). Eine Herztransplantationsoperation wird wie im Beispiel 5 (oben) durchgeführt.
B). Dosierung von IMP.
Die Dosierung von IMP wird gemäß der wirksamsten Dosis, die im Beispiel 6A oben gezeigt ist gewählt.
C) Planmäßiges Immunsuppressionsprotokoll.

1. Präoperative Dosierung: Cyclosporin A 15 mg/kg und Methylprednisolon 10 mg/kg, i.v.
2. Postoperative Dosierung: Cyclosporin A 15 mg/kg/Tag, Prednison 0,5 mg/kg/Tag und Azatzioprin 1,5 mg/kg/Tag, i.v.

2. Messung der Komplementaktivierung.
Diese Messung wird auf dieselbe Weise wie im Beispiel 4 (oben) durchgeführt.
3. Messung der Lymphozytenaktivierung/CD69-Membranexpression.
A) Probenherstellung und mitogene Stimuli.
Gesamtblut wird gesammelt und in Behälter mit Heparinnatrium gegeben. Das Blut von Versuchs- und Kontrolltieren wird gesammelt und in Heparin enthaltende Behälter gegeben. Für die Kontrollen werden verschiedene Konzentrationen an Kontrollmitogenlektinen (z.B. Kermesbeerenmitogen (PWM), 25 μg/ml Endkonzentration; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) und Antikörpern (z.B. CD2/CD2R, jeweils 10 μg/ml; Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) zu 500 μl Aliquots von Gesamtblut in 12 × 75 mm Polystyrolröhren zugesetzt. Andere zu umfassende Stimuli sind das Superantigenstaphylokokkenenterotoxin B (SEB; Sigma) und das spezifische Antigen Candida albicans (Greer Laboratories, Inc., Lenoir, NC) in Endkonzentrationen von 10 μg/ml bzw. 40 μg/ml. Optimale Konzentrationen der zu verwendenden Stimuli werden durch Titrationen mittels Tierspendern bestimmt. Die Proben werden 4 Stunden lang in einem 37°C heißen Wasserbad inkubiert. Ein PWM-spezifischer monomerer Zucker, N-Acetyl-a-D-glucosamin (Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI), wird zu den PWM-stimulierten Proben bei 3 % Endkonzentration zugesetzt und 5 mM EDAT wird zu allen Proben nach der Aktivierung gegeben.
B) Dreifarb-Immunfluoreszenzfärben.
Dreifarbimmunfluoreszenzfärben wird mit Modifikationen gegenüber zuvor veröffentlichten Verfahren durchgeführt. Kurz gesagt werden 50 μl Probenaliquots mit 10 μl einer titrierten Mischung aus drei monoklonalen Antikörper-Fluorchromkonjugaten 15 min lang bei Raumtemperatur im Dunkeln gefärbt. Für eine typische Analyse der T-Zellaktivierung umfasste die färbende Antikörperkombination CD3 (Leu 4), das mit Cyanin-5/Phycoerythrin (CY-5/PE) konjugiert war, CD4 (Leu 3a) oder CD8 (Leu 2a), das mit Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) konjugiert war, und CD69 (Leu 23), das mit Phycoerythrin (PE) konjugiert war. Die IgGl-Isotopen-Kontrollantikörperkonjugate sind enthalten, um die Hintergrundfluoreszenz einzurichten. Alle Antikörper, die in den in diesem Bericht vorgelegten Färbeprotokollen verwendet wurden, werden von Becton Di ckinson Immunocytometry Systems erhalten. Alle Antikörperfluorochromkonjugate werden mit einem Fluorochrom zu Protein Verhältnis von 1:1 hergestellt, mit der Ausnahme der FITC-Konjugate, die typischerweise bei 3-4:1 liegen. Die Proben werden vor der FACS-Analyse mit 400 μl 0,5 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 1 Stunde bei 20°C oder 16 Stunden bei 4°C fixiert (delysiert).
C). Durchflusszytometrieanalyse.
Gesamtblutproben werden mittels einer Dreifarbanalyse unter Verwendung eines FACScan Durchflusszytometers (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) analysiert. Die Daten werden mit der LYSYS 11 Software mittels Fluoreszenzauslösung im FL3-Kanal (CY5/PE) ermittelt, um die Lymphozyten (typischerweise CD3⁺-Zellen) auszublenden. Die Daten werden als zweifarbige Punktdarstellungen (FL1 gegenüber FL2) gezeigt, um den Anteil an aktivierten Lymphozyten-Teilmengen, die CD69 exprimierten, zu messen. Die Daten werden entweder mittels der LYSYS 11 Software auf einem Hewlett Packard 340 Computer oder der Attractors (Becton Dickinson) Cluster Analysis Software auf einem Apple Macintosh IICi Computer analysiert.
4. Untersuchte Tiergruppen.
Es werden zwei Gruppen untersucht und jede Gruppe hat 50 Versuchstiere. Den Ratten in der Kontrollgruppe wird nur eine IMP-Injektion gegeben. Die Dosis wird gemäß dem Beispiel 6A oben gewählt. Die Ratten in der Untersuchungsgruppe erhalten IMP plus normale Immunsuppression.
5. Erwartete Ergebnisse.
Wir erwarten, dass nach der Verwendung von IMP die Empfängertiere eine hyperakute Abstoßung überleben können und eine Komplementaktivierung viel weniger schwer sein wird. Mit einer normalen Immunsuppression wird die zellvermittelte Abstoßung weniger schwer sein. Die obige Kombination verlängert ein Überleben des Organs sehr.
BEISPIEL 7. Transplantation von Herzen aus transgenen Mäusen, die IMP exprimieren, auf sensibilisierte Ratten
1. Erzeugen von transgenen Mäusen, die IMP exprimieren.
Es werden Zuchtpaare transgener Mäuse, die entweder das IMP in seiner sekretorischen Form exprimieren oder die IMP als membranverankertes Protein im Herzgewebe exprimieren, erzeugt. Plasmide mit IMP voller Länge sind jetzt verfügbar. Allerdings wird ein neues rekombinantes Plasmid konstruiert, bei dem die Membranankerungsregion des Membranglycoproteins B5R von Vacciniavirus am 3'-Ende des IMP-Inserts gespleißt ist. Die Klonierung und Charakterisierung von genomischer Ziel-DNA einer isogenen Maus sowie der Aufbau und das Erzeugen des Zellvektors können mit vernünftiger Zuversicht mittels bekannter Verfahren erzielt werden. Das konstruierte Plasmid wird auf richtige Insertion und das membrangebundene IMP der erwarteten Größe sequenziert und analysiert. Es wird die Medikamentenauswahl durchgeführt und anschließend auf rekombinante Klone mittels Southern-Blot-Analyse und Blastozysteninjektion des rekombinanten Klons gescreent.
2. Transgene Milzzelle und Komplementaktivierung.
Diese Untersuchung testet, ob Milzzellen von transgenen Mäusen gegen Humankomplement geschützt werden können. Die Untersuchung wird auf dieselbe Weise wie im Beispiel 5 (oben) durchgeführt. Allerdings werden Splenozyten von transgenen Mäusen anstatt Splenozyten von normalen Mäusen verwendet. Die Messung der C3-Ablagerung ist dieselbe wie im Beispiel 5 (oben).
3. Herztransplantation von transgenen Mäusen auf sensibilisierte Ratten.
Das Verfahren für die zervikale Herztransplantation ist dieselbe wie im Beispiel 6 (oben). Das Spenderherz wird von transgenen Mäusen, die IMP exprimieren, erhalten.
4. Postoperative Messungen.
Die postoperativen Überwachungen der Herzfunktion sind dieselben wie im Beispiel 6 (oben). Die Labortests für Komplementaktivierung sind auch dieselben wie im Beispiel 6.
5. Untersuchte Tiergruppen.
Bei der transgenen Mäuseherztransplantation werden zwei Tiergruppen verwendet. Es gibt 50 Mäuse-Ratten-Transplantate in jeder Gruppe. Für Ratten in der Kontrollgruppe wird eine normale Maus als Herzspender verwendet. Für Ratten in der Untersuchungsgruppe 1 wird ein transgenes Mäuseherz für die Transplantation verwendet. Es wird keine extra Immunsuppression angewendet. Für Ratten in der Untersuchungsgruppe 2 wird ein transgenes Mäuseherz für die Transplantation verwendet und eine normale Immunsuppression (dieselbe wie im Beispiel 6C) wird postoperativ angewendet.
6. Ergebnisse
Wir erwarten, dass die Komplementaktivierung viel weniger schwer bei Ratten, die ein Herz von einer transgenen Maus empfangen, sein wird. Die kombinierte Verwendung der Immunsuppression wird das Überleben der Empfängermäuse weiter verlängern.
BEISPIEL 8: Die Fähigkeit von IMP, das Anhaften eines Antikörpers an Gewebeoberflächen zu blockieren
Die vorliegenden Erfinder haben entdeckt, dass IMP einen natürlichen humanen Antikörper oder anti-gal-Antikörper daran hindern kann, an Schweineendothelzellen zu binden (10 und 11). Die 10 veranschaulicht die Hemmung der Bindung von anti-alpha-gal-Rhodamin-konjugiertem Antikörper an Schweineaorta-Endothelzellen (PAEC) in Gegenwart von alpha-gal oder IMP. Das obere Bild zeigt rote Immunfluoreszenz aufgrund der alpha-gal-Antikörperbindung an die PAEC. Das mittlere Bild zeigt, dass alpha-gal um die Bindung an den Antikörper ringt und die Intensität der Fluoreszenz signifikant verringert ist. Das untere Bild zeigt auch die signifikante Verringerung der Fluoreszenz aufgrund der IMP-Bindung an das Heparin an der Zelloberfläche von PAEC und die stearische Verhinderung der Bindung des Rhodamin-konjugierten anti-alpha-gal-Antikörpers.
Die 11 veranschaulicht die Ergebnisse der Durchflusszytometrie, die die Hemmung der Bindung (Abnahme der Fluoreszenzintensität) des anti-alpha-gal-Antikörpers in Gegenwart von IMP zeigt, wie durch eine Verlagerung der Spitze zur niedrigeren Intensität hin bewiesen. Dies bestätigt das in der 10 gezeigte Ergebnis und das Fazit ist dasselbe.
Die vorliegenden Erfinder haben auch entdeckt, dass IMP die Bindung von Maus anti-HLA-Antikörper an humane umbilikale vaskuläre Endothelzellen (HuVEC) blockieren kann (12). Die Ergebnisse einer Bewertung, ob die Bindung von Antikörper an PAEC nur für die alpha-gal-Reste an der Oberfläche spezifisch ist, oder dass die stearische Verhinderung sich nicht spezifisch von nicht spezifischen Antikörpern unterscheidet, sind in der 12 gezeigt. Humane Endothelzellen wurden entweder mit Kontrollantikörperbehandlung (Bild A), anti-humanem Leukozyten-Antigen-Antikörper, konjugiert mit Phycoerythrin (Bild B), oder IMP zusammen mit den PAEC and dem anti-HLA I-Antikörper (Bild C) behandelt. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass die Fluoreszenz nach der Bereinigung für die nicht spezifische Fluoreszenz (Kontrollantikörper) in Gegenwart von IMP auf 25 % reduziert wurde. Diese Daten führen zu dem Schluss, dass IMP eine Antikörperbindung an die Endothelzellen nicht spezifisch blockiert.
Die vorliegenden Erfinder haben auch festgestellt, dass IMP das Abtöten von Schweineaorta-Endothelzellen durch humane neutrophile Leukozyten und natürliche Killerzellen allein oder in Gegenwart von Humanserum oder NK-Zellen, neutrophilen Leukozyten und Serum alle gleichzeitig blockieren kann (13). Es gab ein durchweg geringeres Abtöten von einer der Kombinationen in Gegenwart von IMP im Vergleich zu ohne IMP. Diese Daten führen zu dem Schluss, dass IMP das komplementvermittelte Abtöten sowie das Abtöten durch zytotoxische Zellen blockiert. Letztere Hemmung liegt möglicherweise an der IMP-Bindung an Heparin, das die Zell-Zell-Wechselwirkungen blockiert.
Obwohl die Erfindung hier durch Bezugnahmen auf verschiedene spezifische Materialien, Verfahren und Beispiele beschrieben und veranschaulicht ist, wird davon ausgegangen, dass die Erfindung nicht auf diese Materialien, Kombinationen von Material und Verfahren, die für diese Zwecke ausgesucht wurden, beschränkt ist. Zahlreiche Variationen solcher Details können impliziert werden und sind dem Fachmann bewusst.

Claims

Verwendung eines Proteins, umfassend die Aminosäuresequenz der Reste 20 bis 263 von SEQ ID NO: 1, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, zur Herstellung eines Medikaments zum Verhindern oder Behandeln einer Xenotransplantatabstoßung bei einem Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz des Proteins aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 besteht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei dem Patienten gleichzeitig ein immunsuppressiver Wirkstoff verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Medikament weiter den immunsuppressiven Wirkstoff umfasst.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, wobei der immunsuppressive Wirkstoff aus der Gruppe bestehend aus Azathiopren, Cyclosporin und pharmazeutisch annehmbare Salze davon ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei dem Patienten gleichzeitig ein Glucocorticoid verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Medikament weiter das Glucocorticoid umfasst.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Glucocorticoid Prednison ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Medikament zusätzlich einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Träger wässrig ist.