DE60010921T2

DE60010921T2 - Künstliche chromosomen, die die genetische information für die bildung von rekombinantem rna-virus enthalten

Info

Publication number: DE60010921T2
Application number: DE60010921T
Authority: DE
Inventors: Luis Enjuanes Sanchez
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 1999-12-03
Filing date: 2000-11-30
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2020-12-01
Also published as: ES2170622B1; DK1234024T4; JP2003515335A; HUP0203305A3; ES2170622A1; WO2001039797A3; TR200401186T4; NO20022419D0; PL206816B1; SI1234024T2; CN100402643C; AR027893A1; NZ518990A; EP1234024A2; KR20020060251A; JP4637432B2; RS50372B; AU785081B2; PL356390A1; SK7612002A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung einer DNA oder einer RNA, durch diese Verfahren erhältliche Nukleinsäuren und ihre Verwendung als Impfstoffe.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Fortschritte in der Technologie der DNA-Rekombination haben die Entwicklung von Gentransfer zwischen Organismen vorangebracht. Es werden zurzeit zahlreiche Bemühungen unternommen, um chemische, pharmazeutische und biologische Produkte von wirtschaftlichen und kommerziellen Interesse unter Verwendung von Gentransfertechniken zu produzieren.
Eines der Schlüsselelemente bei der genetischen Veränderung sowohl prokaryotischer als auch eukaryotischer Zellen ist die Entwicklung von Vektoren- und Vektor-Wirts-Systemen. Im Allgemeinen ist ein Vektor ein Nukleinsäuremolekül, das zur Replikation oder Expression in einer Wirtszelle befähigt ist. Ein Vektor-Wirts-System kann als eine Wirtszelle definiert werden, die einen Vektor trägt und es erlaubt, die in ihm enthaltene genetische Information zu replizieren und zu exprimieren.
Vektoren wurden aus Viren sowohl auf der Grundlage von DNA- als auch RNA-Genomen entwickelt. Von DNA-Viren, die sich in dem Kern der Wirtszelle replizieren, abgeleitete virale Vektoren haben den Nachteil, dass sie fähig sind, sich in das Genom der Zelle zu integrieren, so dass sie im Allgemeinen nicht sehr sicher sind. Im Gegensatz dazu sind virale Vekto ren, die aus RNA-Viren, die sich in dem Cytoplasma der Wirtszelle replizieren, sicherer als auf DNA-Viren basierende Vektoren, da die Replikation durch RNA außerhalb des Kerns erfolgt. Es ist daher sehr unwahrscheinlich, dass diese Vektoren sich in das Genom der Wirtszelle integrieren.
WO 99/43842 beschreibt die Verwendung künstlicher Chromosomen, insbesondere bakterieller künstlicher Chromosomen ("bacterial artificial chromosomes", BACs), in die virale DNA-Sequenzen von Herpes simplex zur Herstellung rekombinanter Viruspartikel sowohl in vivo als auch in vitro kloniert wurden.
cDNA-Klone wurden von einzelkettigen DNA-Viren mit positiver Polarität [ssRNA(+)] erhalten, z.B. Picornavirus (Racaniello & Baltimore, 1981); Bromovirus (Ahlquist et al., 1984); Alphavirus, eine Art, die den Sindbis-Virus einschließt; Semliki Forest Virus (SFV) und den Venezuelischen Pferde-Encephalitis-Virus (Venezuelan Equine Encephalitis, VEE) (Rice et al., 1987; Liljeström und Garrof, 1991; Frolov et al., 1996; Smerdou und Liljeström, 1999); Flavivirus und Pestivirus (Rice und Strauss, 1981; Lai et al., 1991; Rice et al., 1989); und Viren der Astroviridae-Familie (Geigenmuller et al., 1997). Genauso wurden Vektoren zur Expression heterologer Gene aus zu dem Genom von ssRNA(+)-Virus komplementären DNA-Klonen entwickelt, z.B. Alphavirus, einschließlich Sindbis-Virus, Semliki Forest Virus (SFV), und Venezuelischem Pferde-Encephalitis (VEE)-Virus (Frolov et al., 1996; Liljeström, 1994; Pushko et al., 1997). Alle von RNA-Viren ausgehenden Verfahren zur Herstellung rekombinanter Viren sind jedoch immer noch durch die Tatsache kompliziert, dass die meisten Viren Sequenzen umfassen, die toxisch für Bakterien sind. Die Herstellung einer cDNA mit viraler RNA und die Subklonierung der cDNA in Bakterien führt daher oft zur Deletion oder zum Re-Arrangement der DNA-Sequenzen in der bakteriellen Wirtszelle. Aus diesem Grund können die meisten der im Allgemeinen benutzten Subklonierungs- und Expressionsvektoren nicht für die Herstellung von großen DNA-Abschnitten benutzt werden, die von rekombinanten RNA-Viren abgeleitet sind. Es ist jedoch für eine Anzahl von Aspekten bei der Entwicklung von Pharmazeutika, besonders von Impfstoffen, notwendig, Vektoren zu erhalten, die lange fremde DNA-Sequenzen enthalten können.
Coronaviren sind ssRNA(+)-Viren, die das größte bekannte Genom aller RNA-Viren haben, wobei die Länge zwischen etwa 25 und 31 Kilobasen (kb) umfasst (Siddell, 1995; Lai & Cavanagh, 1997; Enjuanes et al., 1998). Bei der Infektion durch einen Coronavirus repliziert sich die genomische RNA (gRNA) und es wird ein Satz subgenomischer RNAs (sgRNA) positiver und negativer Polarität synthetisiert (Sethna et al., 1989; Sawicki und Sawicki, 1990; van der Most und Spaan, 1995). Die Synthese der sgRNAs ist ein RNA-abhängiger Vorgang, der in dem Cytoplasma der infizierten Zelle abläuft, seine genauen Mechanismen sind jedoch noch nicht exakt bekannt.
Es wurde bei einigen Coronaviren, wie dem Murinen Hepatitisvirus (MHV), infektiösen Bronchitisvirus (IBV), Bovinen Coronavirus (BCV) (Chang et al. 1994), und Porcinen Gastroenteritisvirus (TGEV) (Spanische Patentanmeldung P9600620; Méndez et al.; 1996; Izeta et al., 1999; Sánchez et al., 1999) die Herstellung von cDNAs beschrieben, die für unvollständige interferierende (Defective Interfering, DI) Genome kodieren (Deletionsmutanten, die für ihre Replikation und Transkription die Anwesenheit eines komplementierenden Virus benötigen). Die Herstellung eines cDNA-Klons, der für ein vollständiges Genom eines Coronavirus kodiert, ist jedoch wegen der großen Größe des Coronavirusgenoms und der toxischen Sequenzen in dem Coronavirusgenom nicht möglich gewesen.
Zusammenfassend sind, obwohl eine große Zahl viraler Vektoren für die Replikation und Expression heterologer Nukleinsäuren in Wirtszellen entwickelt wurde, die meisten bekannten Vektoren für die Expression heterologer Gene nicht gut für die Subklonierung von RNA-Viren geeignet. Weiterhin haben die so erhaltenen viralen Vektoren wegen des Mangels an Speziesspezifität und Beschränkungen des Zielorgans oder -gewebes und ihrer beschränkten Kapazität zur Klonierung Nachteile, welche die Möglichkeiten der Verwendung sowohl in der Grundlagenforschung als auch der angewendeten Forschung begrenzen.
Es besteht daher Bedarf nach Verfahren zur Entwicklung neuer Vektoren zur Expression heterologer Gene, welche die beschriebenen Probleme bewältigen. Insbesondere wäre es vorteilhaft, große Vektoren für die Expression heterologer Gene mit einem hohen Sicherheitsgrad und großer Klonierungskapazität zu haben, die so entworfen werden können, dass ihre Speziesspezifität und ihr Tropismus kontrolliert werden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die oben beschriebenen Probleme durch ein Verfahren zur Herstellung einer DNA gelöst, die Sequenzen umfasst, welche von der genomischen RNA (gRNA) eines Coronavirus abstammen, wobei die Sequenzen eine Homologie von mindestens 60 % zu der natürlichen Sequenz des Virus aufweisen und für eine RNA-abhängige RNA-Polymerase und mindestens ein Struktur- oder Nicht-Strukturprotein kodieren, wobei ein Fragment dieser DNA in der Lage ist, in RNA transkribiert und zu einem Virion zusammengesetzt zu werden, wobei das Verfahren Schritte umfasst, bei denen man ein interferierendes unvollständiges Genom eines Coronavirus unter die Expressionskontrolle eines Promotors in ein künstliches Bakterienchromosom („bacterial artificial chromosome", BAC) kloniert und die innerhalb des unvollständigen Genoms deletierten Sequenzen in das Genom re-inseriert.
Überraschenderweise haben die Erfinder herausgefunden, dass die bei den Verfahren aus dem Stand der Technik auftre tenden Probleme, größe, von viraler gRNA abstammende DNA-Sequenzen zu subklonieren und zu exprimieren, durch die Verwendung von BACs als Klonierungsvektoren bewältigt werden können. Die Verwendung von BACs hat den besonderen Vorteil, dass diese Vektoren in Bakterien in einer Zahl von ein oder zwei Kopien pro Zelle vorliegen, was die Toxizität deutlich beschränkt und die Möglichkeiten der Rekombination zwischen Plasmiden verringert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen infektiösen Klon zur Verfügung, welcher eine Kopie vollständiger Länge der zu der genomischen RNA (gRNA) eines Coronavirus komplementären DNA (cDNA) umfasst und mit einer die Transkription regulierenden Sequenz kloniert wurde.
In einem weiteren Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf einen rekombinanten viralen Vektor gerichtet, der einen infektiösen Klon umfasst, welcher eine Kopie vollständiger Länge der zu der genomischen RNA (gRNA) eines Coronavirus komplementären DNA (cDNA) umfasst und mit einer die Transkription regulierenden Sequenz kloniert wurde, welcher durch Insertion einer heterologen Nukleinsäure in den infektiösen Klon verändert wurde, wobei die Bedingungen eine Expression der heterologen Nukleinsäure ermöglichen.
Die Erfindung umfasst einen Impfstoff zum Schutz eines Tieres gegen eine Infektion, die durch ein infektiöses Agens verursacht wird, umfassend

(i) mindestens einen rekombinanten viralen Vektor, wie oben definiert, wobei der virale Vektor entweder mindestens ein Antigen, das zur Induktion einer Immunreaktion gegen das infektiöse Agens geeignet ist, oder einen Antikörper exprimiert, welcher Schutz gegen das infektiöse Agens verleiht, gegebenenfalls zusammen mit
(ii) einem pharmazeutisch verträglichen Trägermittel.

Dieser Impfstoff kann ein multivalenter Impfstoff zum Schutz gegen eine Infektion sein, welche durch mehr als ein infektiöses Agens verursacht wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die Konstruktion eines cDNA-Klons, der für eine infektiöse RNA von TGEV kodiert. 1A zeigt die genetische Struktur von TGEV, wobei die Namen der Gene durch Buchstaben und Zahlen angegeben sind (1a, 1b, S, 3a, 3b, E, M, N und 7). 1B zeigt die Strategie zur cDNA-Klonierung, die aus der Vervollständigung des DI-C-Genoms bestand. Die Deletionen Δ1, Δ2 und Δ3 sind angegeben, die vervollständigt wurden, um die ganze Länge der cDNA wieder herzustellen. Die sich unter der Struktur des DI-C-Genoms befindenden Zahlen geben die Nukleotide an, die jede Deletion in dem DI-C-Genom flankieren. 1C zeigt die vier cDNA-Fragmente, die konstruiert wurden, um die Deletion Δ1 zu vervollständigen, und die Position der wichtigsten Restriktionsstellen, die beim Zusammenfügen benutzt wurden. Die Insertion des Fragmentes Δ1 führte zu einer Zunahme der Toxizität der cDNA.
2 zeigt die Struktur des pBeloBAC Plasmides (Wang et al., 1997), das für die Klonierung der infektiösen cDNA von TGEV benutzt wurde. Das pBeloBAC Plasmid wurde von H. Shizuya und M. Simon (California Institute of Technology) zur Verfügung gestellt und beinhaltet 7,507 Basenpaare (bp), die den Replikationsursprung des F-Faktors von E. coli enthalten (OriS), die Gene, die dazu notwendig sind, eine einzige Kopie des Plasmids pro Zelle zu erhalten (parA, parB, parC und repE), und das Chloramphenicol-Resistenzgen (CM^r). Die Positionen der T7- und SP6-Promotoren und die einzigartigen Restriktionsstellen sind angegeben. CosN: die Stelle cosN von Lambda, um die Konstruktion des pBAC Plasmids zu erleichtern; lac Z: β-Galaktosidasegen. Auch die Sequenz loxP, die während der Herstellung des Plasmids benutzt wurde, ist angegeben.
3 zeigt die Struktur des grundlegenden Plasmids, das für die Konstruktion der TGEV cDNA verwendet wurde. Das pBAC-TcDNA^ΔClaI Plasmid enthält die ganze Information der TGEVRNA, außer eines ClaI-ClaI Fragmentes von 5,198 bp. Die cDNA wurde unter den unmittelbar frühen (Immediately Early, IE) Expressionspromotor des Cytomegalovirus (CMN) kloniert und wird an dem 3'-Ende von einem poly(A)-Schwanz mit 24 A-Resten, dem Ribozym des Hepatitis Delta Virus (HDV) und den Terminations- und Polyadenylierungssequenzen des bovinen Wachstumshormons (BGH) flankiert. Das pBAC–B+C+D5' Plasmid enthält das ClaI-ClaI-Fragment, das notwendig ist, um pBAC-TcDNA^ΔClaI zur ganzen cDNA-Länge zu vervollständigen. Das pBAC-TcDNA^FL Plasmid enthält die cDNA von TGEV in vollständiger Länge. SAP: Krabbenalkalische Phosphatase (shrimp alkaline phosphatase).
4 zeigt die Unterschiede zwischen den Nukleotidsequenzen des S-Gens der Klone von TGEV PUR46-MAD (MAD) und Cll. Die Zahlen geben die Positionen der substituierten Nukleotide an, wobei als Nukleotid 1 jedes Gens das A des Initiationskodons betrachtet wird. Die Buchstaben innerhalb der Balken geben das entsprechende Nukleotid in der angegebenen Position an. Die Buchstaben unter den Balken geben die Aminosäure (As)-Substitutionen an, die durch die Nukleotide an der angegebenen Position kodiert werden. Δ6 nt gibt eine 6-Nukleotid-Deletion an. Der Pfeil gibt die Position des Terminationskodons des S-Gens an.
5 zeigt die Strategie, die befolgt wurde, um den infektiösen TGEV aus der TGEV-cDNA voller Länge zu erhalten. ST-Zellen (Schweinehodenzellen) wurden mit pBAC-TcDNA^FL-Plasmid transfiziert, und 48 Stunden nach der Transfektion wurde der Überstand benutzt, um neue ST-Zellen zu infizieren. Der Virus wurde zu den angegebenen Zeiten übertragen. Bei jeder Passage wurden Aliquots des Überstands und der einschichtigen Zellen jeweils für, die Virustitration und die Isolation der RNA für RT-PCR-Analyse gesammelt. vgRNA: virale RNA vollständiger Länge.
6 zeigt den durch TGEV-cDNA in den transfizierten ST-Zellen hervorgerufenen cytopathischen Effekt (CPE). Die Abwesenheit von CPE in nicht-transfizierten (Kontroll-) ST-Zellen (6A) und 14 und 20 Stunden nach Transfektion mit pBAC-TcDNA^PL in ST-Zellen beobachtete CPE sind gezeigt (6B bzw. 6C).
7 zeigt die Entwicklung des viralen Titers während der Passagen. Es wird ein Graph gezeigt, der die viralen Titer in dem Überstand von zwei Reihen einschichtiger Zellen (1 und 2) bei verschiedenen Passagen nach der Transfektion mit pBACTcDNA^FL darstellt. Mock 1 und 2 beziehen sich auf nicht transfizierte ST-Zellen. TcDNA 1 und 2 beziehen sich auf mit pBAC-TcDNA^FL transfizierte Zellen.
8 zeigt die Ergebnisse der Analyse der Sequenz des Virus, der nach der Transfektion der ST-Zellen mit pBAC-TcDNA^FL erhalten wurde. Die Struktur des TGEV-Genoms ist oben in der Figur angegeben. Genauso sind die Unterschiede in der Nukleotidsequenz (genetische Marker) zwischen dem mit dem pBAC-TcDNA^FL (TcDNA) Plasmid erhaltenen Virus und den TGEV-Klonen C8 und C11 angegeben. Die Positionen der Unterschiede zwischen den Nukleotiden sind durch die über dem Balken befindlichen Zahlen angegeben. Die cDNA-Sequenzen des TcDNA-Virus und des Klons C11 wurden durch Sequenzierung der Fragmente bestimmt, die durch RT-PCR (Reverse Transkription und Polymerasekettenreaktion) erhalten wurden. Die Sequenz des Klons C8 wird zur Veröffentlichung eingeschickt (Penzes et al., 1999) und ist am Ende dieses Patents angegeben. Das Restriktionsmuster der mit ClaI und DraIII durch RT-PCR erhaltenen Fragmente, welche die Nukleotide 18,997 und 20,990 der TcDNA und C8-Viren einschlie ßen, ist gezeigt. Die Restriktionsmuster zeigen die Anwesenheit oder Abwesenheit von ClaI- und DraIII-Schnittstellen in der cDNA dieser Viren. Das Ergebnis dieser Analyse gab an, dass der erhaltene TcDNA-Virus die für das Isolat C11 erwartete S-Gensequenz hat. MWM: Molekulargewichtsmarker.
9 zeigt die Ergebnisse der RT-PCR-Analyse des zurückgewonnenen Virus. Die virale RNA wurde unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimiert, der von der zellulären Polymerase Pol II erkannt wird. Im Prinzip könnte diese RNA während ihres Transports in das Cytoplasma einem Spleißen unterworfen sein. Um zu untersuchen, ob dies der Fall war, wurden die Stellen der RNA mit einer hohen Wahrscheinlichkeit für Spleißen mit einem Programm für die Vorhersage von Spleiß-Stellen in Sequenzen humaner DNA bestimmt (Version 2.1.5.94, Abteilung für Zellbiologie, Baylor College of Medicine) (Solovyev et al., 1994). Die potentielle Spleißstelle mit der höchsten Wahrscheinlichkeit des Schneidens hatte eine Donorstelle an nt 7,243 und eine Rezeptorstelle bei nt 7.570 (9A). Um zu untersuchen, ob diese Domäne einem Spleißen unterworfen war, wurde ein durch nt 7,078 und nt 7,802 (9B) flankiertes RT-PCR-Fragment aus Passagen 0 und 2 von nicht transfizierten Kulturen (Kontrolle) oder aus ST-Zellen, die mit TcDNA mit dem ClaI-Fragment in reverser Orientierung (TcDNA^{FL(–ClaI)RS)} oder in der richtigen Orientierung (TcDNA^FL) transfiziert waren, hergestellt, und die Produkte der RT-PCR wurden in Agarosegelen analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den 9C (Passage 0) und 9D (Passage 2) gezeigt.
10 zeigt die Ergebnisse der Immunfluoreszenzanalyse des Virus, der in Kulturen von ST-Zellen hergestellt wurde, die mit TcDNA transfiziert wurden. Die Färbung für die Immunfluoreszenz wurde mit Antikörpern durchgeführt, die spezifisch für das TGEV PUR46-MAD-Isolat und für den nach Transfektion mit dem pBAC-TcDNA^FL-Plasmid erhaltenen Virus sind. Dafür wurden TGEV-spezifische monoklonale Antikörper benutzt, die an beide Isolate oder nur an PUR46-MAD binden (Sánchez et al., 1990). Das Ergebnis bestätigte, dass der TcDNA-Virus die erwartete Antigenizität besaß. Das spezifische polyklonale Antiserum für TGEV band an beide Viren, aber nicht an die nicht infizierte Kultur, und nur die erwarteten monoklonalen Antikörper, die für die S-(ID.B12 und 6A.C3), M-(3B.B3) und N-(3B.B8) Proteine spezifisch sind, banden an den TcDNA Virus (Sánchez et al., 1999).
11 zeigt die Expression von GUS unter verschiedenen Transkriptions-regulatorischen Sequenzen (TRS) mit verschiedenen flankierenden Regionen 5' der Sequenz zwischen den Genen ("intergenic sequence", IG). Das Minigenom M39 wurde unter die Kontrolle des CMV-Promotors kloniert. In dieses Minigenom eingefügt waren eine multiple Klonierungssequenz (PL1, 5'-CCTAGGATTTAAATCCTAAGG-3'; SEQ ID NO:2) und die Transkriptionseinheit, die durch die ausgewählten Transkriptionsregulierenden Sequenzen (TRS), eine weitere multiple Klonierungssequenz (PL2, 5'-GCGGCCGC GCCGGCGAGGCCTGTCGAC-3'; SEQ ID NO:3; oder PL3, 5'-GTCGAC-3'; SEQ ID NO:4), Sequenzen mit der Struktur einer Kozak (Kz)-Domäne, das β-Glucuronidase (GUS)-Gen und eine weitere multiple Klonierungsstelle (PL4, 5'-GCTAGCCCAGGCGCGCGGTACC-3'; SEQ ID NO:5) gebildet wird. Diese Sequenzen waren an dem 3'-Ende durch die 3'-Sequenz des Minigenoms M39, das HDV-Ribozym und die Terminations- und Polyadenylierungssequenzen von BGH flankiert. Die TRS wiesen eine unterschiedliche Zahl (0, –3, –8 und –88) von Nukleotiden an dem 5'-Ende der IG-Sequenz (CUAAAC) auf, und stammten, wie angegeben, von den N-, S- oder M-Genen. ST-Zellen wurden mit den verschiedenen Plasmiden transfiziert, mit dem komplementierenden Virus (PUR46-MAD) infiziert und die Überstände wurden sechsmal passagiert. Die GUS-Aktivität in den infizierten Zel len wurde mit dem von Izeta (Izeta et al., 1999) beschriebenen Protokoll bestimmt. Die durch die Beziehung der GUS-Aktivität auf die Zahl der Passagen erhaltenen Ergebnisse sind in 11B gesammelt.
12 zeigt die Expression von GUS unter verschiedenen TRS, die sich in der 3'-flankierenden Region der IG-Sequenz unterscheiden (siehe 11A). Unter Verwendung der Transkriptionseinheit, deren 5'-flankierende Region den –88 nt des N-Gens von TGEV sowie der IG-Sequenz (CUAAAC) entspricht, wurden die 3'-flankierenden Sequenzen verändert. Diese Sequenzen entsprechen denen der verschiedenen TGEV-Gene (S, 3a, 3b, E, M, N und 7), wie in 12A angegeben. In zwei Fällen wurden 3'-Sequenzen durch andere ersetzt, die eine Restriktionsstelle (SalI) und eine optimierte Kozak-Sequenz (Kz) enthielten, oder durch eine mit der auf die erste IG-Sequenz nach der „Leader"-Sequenz des viralen Genoms folgenden Sequenz identischen Sequenz. Die GUS-Aktivität in den infizierten Zellen wurde mit dem oben beschriebenen Protokoll bestimmt (Izeta et al., 1999). CL12 weist auf eine mit dem 3'-Ende der „Leader"-Sequenz des TGEV-Genoms identische Sequenz von 12 Nukleotiden hin (siehe die am Ende angegebene Virussequenz). Die durch den Bezug der Expression von GUS auf die Zahl der Passagen erhaltenen Ergebnisse sind in 12B gesammelt.
13 zeigt die Auswirkung des Ortes der Insertion des Expressionsmoduls in das Minigenom auf den Grad der GUS-Expression. Die GUS-Transkriptionseinheit, die –88 nt des N-Gens, die das 5'-Ende der IG-Sequenz (CUAAAC) flankieren und die Kz-Sequenzen, die das 3'-Ende flankieren, enthält (siehe 12A), wurde in vier einzelne Restriktionsstellen in dem Minigenom M39 (13A) eingeführt, um zu bestimmen, ob alle diese Schnittstellen die Expression des heterologen Gens gleichermaßen erlauben. ST-Zellen wurden mit diesen Plasmiden transfiziert und mit dem komplementierenden Virus (PUR46-MAD) infiziert. Die GUS-Aktivität in dem infizierten Zellen wurde bei Passage 0 (P0) nach dem oben beschriebenen Protokoll bestimmt (Izeta et al., 1999). Die erhaltenen Ergebnisse sind in 13B gesammelt.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Anmeldung ist ein „bakterielles künstliches Chromosom" eine DNA-Sequenz, welche die Sequenz des F-Faktors umfasst. Dieses Sequenzen enthaltende Plasmide, sogenannte F-Plasmide, sind dazu in der Lage, heterologe Sequenzen mit einer Länge von mehr als 300 kb in einer geringen Kopienzahl (ein oder zwei Kopien pro Zelle) stabil zu erhalten. Entsprechende BACs sind im Stand der Technik bekannt (Shizuya et al., 1992).
Gemäß der vorliegenden Erfindung hat die in das BAC klonierte DNA eine Homologie von mindestens 60 %, bevorzugt 75 % und am meisten bevorzugt 85 oder 95 % zu einer natürlichen Sequenz eines RNA-Virus. Die Sequenzhomologie wird bevorzugt mit dem Clustal-Computerprogramm bestimmt, das vom Europäischen Bioinformatik-Institut (EBI) erhältlich ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Bezeichnung „von einem Coronavirus abstammende Sequenz" benutzt, um eine Nukleinsäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 60 %, bevorzugt 75 % und am meisten bevorzugt 85 oder 95 % zu der natürlichen Sequenz eines Coronavirus zu bezeichnen. Sequenzhomologie kann mit dem Clustal-Computerprogramm bestimmt werden, das vom Europäischen Bioinformatik-Institut (EBI) erhältlich ist.
Der Ausdruck „Coronavirus" wird gemäß der vorliegenden Erfindung benutzt, um eine Gruppe von Viren zu bezeichnen, die ein einziges Molekül linearer, positiver ssRNA von 25 bis 33 kb aufweisen. Diese Viren enthalten normalerweise 7 bis 10 Strukturgene, d.h. Gene, die für Proteine kodieren, welche die virale Struktur bestimmen. Diese Gene sind normalerweise in dem viralen Genom in der Reihenfolge 5'-Replikase-(Hämagglutinin-Esterase)-Spike-Hülle-Membran-Nukleoprotein -3' angeordnet. Zusätzlich kann das virale Genom eine Anzahl von Nicht-Strukturgenen umfassen, die einen verschachtelten Satz von mRNAs mit einem gemeinsamen 3'-Ende kodieren und größtenteils nicht essentiell sind.
Der Ausdruck „in der Lage sein, in RNA transkribiert und zu einem Virion zusammengesetzt werden zu können" wird benutzt, um eine DNA-Sequenz zu bezeichnen, welche – einmal in eine passende Wirtszelle eingeführt – in RNA transkribiert werden wird und Virionen generieren wird. Die Virionen sind bevorzugt infektiöse Viren, können aber auch inaktivierte, attenuierte oder in ihrer Replikation defekte Viren sein, welche diese RNA umfassen. Bevorzugt wird die ganze, für die Expression des Virions notwendige Information von der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz kodiert.
Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können weiterhin eine Sequenz umfassen, die für ein oder mehrere ausgewählte heterologe Gene kodiert. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Gen als „heterologes Gen" bezeichnet, wenn es nicht von dem Coronavirus abstammt, welcher als Quelle für welche die RNA-abhängige RNA-Polymerase und die strukturellen oder nicht-strukturellen Proteine kodierenden Gene benutzt wurde. Ein „heterologes Gen" bezieht sich also auf Gene, die von einem Typ eines Coronavirus abstammen und in einem Vektor exprimiert werden, der Sequenzen umfasst, die von einem anderen Typ des Coronavirus abstammen. Jegliches ausgewählte heterologe Gen kann in die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung eingefügt werden. Die Insertion von für Peptide oder Proteine kodierenden Genen, die durch das Immunsystem eines Säugetiers als Antigen eines infektiösen Agens erkannt werden, ist besonders bevorzugt. Das heterologe Gen kann somit für mindestens ein Antigen, das geeignet ist, eine Immunantwort gegen ein infektiöses Agens zu induzieren, für mindestens ein Molekül, das die Replikation eines infektiösen Agens stört oder für einen Antikörper, der Schutz gegen ein infektiöses Agens gewährt, kodieren. Alternativ oder zusätzlich kann das heterologe Gen einen Immunmodulator, ein Cytokin, einen Verstärker der Immunantwort oder einen anti-inflammatorischen Stoff kodieren.
Das erfindungsgemäße DNA-Fragment, das in RNA transkribiert wird, hat vorzugsweise eine Größe von mindestens 25 kb. Fragmente mit einer Größe von mindestens 30 kb sind besonders bevorzugt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die DNA weiterhin Sequenzen, die von einem Coronavirus abstammen und für mehrere oder alle strukturellen oder nicht-strukturellen Proteine eines Coronavirus bis auf eins kodieren. Alternativ umfasst die erfindungsgemäße DNA weiterhin Sequenzen, die für alle strukturellen oder nicht-strukturellen Proteine eines Coronavirus kodieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfassen die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung eine Sequenz, welche die Transkription einer Sequenz kontrolliert, die von einer Coronavirus gRNA abstammt. Jede im Stand der Technik bekannte Sequenz, die Transkription kontrolliert, kann für diesen Zweck benutzt werden, einschließlich Sequenzen, welche die Expression von Genen, die aus DNA- oder RNA-Genomen stammen, veranlassen. Die Verwendung des unmittelbar frühen (Immediately Early, IE) Promotors des Cytomegalovirus (CMV) ist bevorzugt.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann an dem 3'-Ende auch durch einen poly(A)-Schwanz flankiert werden. Die Nukleinsäure kann Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenzen des bovinen Wachstumshormons (BGH) umfassen. Zusätzlich oder alter nativ können die Nukleinsäuren für ein Ribozym kodierende Sequenzen umfassen, z.B. das Ribozym des Hepatitis δ Virus (HDV).
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können von irgendeinem Coronavirus stammende Sequenzen umfassen, z.B. von einem Isolat des Porcinen Transmissiblen Gastoenteritisvirus (TGEV), Murinen Hepatitisvirus (MHV), infektiösen Bronchitisvirus (IBV), Bovinen Coronavirus (BoCV), Caninen Coronavirus (CcoV), Felinen Coronavirus (FcoV) oder Humanen Coronavirus. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform stammt die Nukleinsäure von einem Transmissiblen Gastroenteritisvirus.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen DNA, die Schritte umfassen, bei denen man ein interferierendes unvollständiges Genom eines Coronavirus unter die Expressionskontrolle eines Promotors in einen BAC-Vektor kloniert und die innerhalb des unvollständigen Genoms deletierten Sequenzen re-inseriert. Das Verfahren kann weiter Schritte umfassen, bei denen toxische Sequenzen innerhalb des viralen Genoms vor Re-Insertion die restliche genomische DNA identifiziert werden. Bevorzugt sind die toxischen Sequenzen innerhalb des viralen Genoms die letzten Sequenzen, welche bei der Vervollständigung des Genoms reinseriert werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist dieses Verfahren geeignet, um infektiöse Klone des Coronavirus zu erhalten, die in Bakterien für mindestens 80 Generationen stabil sind und damit einen sehr effizienten Klonierungsvektor bereitstellen.
Die vorliegende Erfindung stellt die Entwicklung infektiöser Klonen aus von Coronavirus abstammender cDNA bereit (Almazan et al., 2000), genau wie Vektoren, die mit diesen infektiösen Klonen hergestellt wurden, die auch heterologe Nukleinsäuresequenzen einschließen, die in diese Klone eingefügt sind. Die infektiösen Klone und durch diese Erfindung bereitgestellten Vektoren haben vielfältige Anwendungen sowohl in der Grundlagenforschung als auch der angewandten Forschung, sowie eine hohe Klonierungskapazität, und sie können so entworfen werden, dass ihre Speziesspezifizität und ihr Tropismus leicht kontrolliert werden können.
Dieses Patent beschreibt die Entwicklung eines Verfahrens, dass es das erste Mal in der Geschichte des Coronavirus möglich macht, einen infektiösen cDNA-Klon vollständiger Länge, der für das Genom eines Coronavirus kodiert, zu erhalten (Al-mazan et al., 2000).
Es wurde ein neuer Vektor oder ein Expressionssystem für heterologe Nukleinsäuren entwickelt, basierend auf einem für die genomische RNA (gRNA) eines Coronavirus kodierenden infektiösen cDNA-Klon. In einer besonderen Ausführungsform dieser Erfindung ist der Coronavirus der Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus (TGEV).
Das neue Expressionssystem kann in der Grundlagenforschung oder angewandten Forschung verwendet werden, z.B., um ausgewählte Produkte (Proteine, Enzyme, Antikörper, etc.) zu erhalten, als Impfvektor, oder für die Gentherapie sowohl bei Menschen als auch Tieren. Der aus dem infektiösen cDNA-Klon erhaltene infektiöse Coronavirus kann durch konventionelle Gentechnik verändert werden, so dass neue Gene in das Genoms des Coronavirus eingefügt werden können, und diese Gene können gewebe- und speziesspezifisch exprimiert werden, um eine Immunantwort zu initiieren oder Gentherapie durchzuführen. Zusätzlich wurde die Expression durch die Auswahl neuer transkriptionsregulatorischer Sequenzen (TRS) optimiert, die es möglich machen, die Stärke der Expression mehr als 100fach zu steigern.
Die von Coronavirus, besonders TGEV, abstammenden Vektoren haben mehrere Vorteile für die Induktion von Immunität in Schleimhäuten, im Vergleich zu anderen Expressionssystemen, die dort nicht replizieren: (i) TGEV infiziert intestinale und respiratorische Schleimhäute (Enjuanes und Van der Zeijst, 1995), also die besten Orte für die Induktion sekretorischer Immunität; (ii) sein Tropismus kann durch Veränderung des S (Spike)-Gens kontrolliert werden (Ballesteros et al., 1997); (iii) es gibt für die Entwicklung von Expressionssystemen nicht-pathogene Stämme, die von komplementierenden Viren abhängen (Sánchez et al., 1992); und (iv) Coronaviren sind cytoplasmische RNA-Viren, die sich replizieren, ohne ein intermediäres DNA-Stadium durchzumachen (Lai und Cavanagh, 1997), was ihre Integration in das zelluläre Chromosom praktisch unmöglich macht.
Das Verfahren, das es möglich gemacht hat, einen infektiösen Coronavirus von einer cDNA zu erhalten, die für die gRNA eines Coronavirus kodiert, umfasst die folgenden Strategien:

(i) Expression der RNA des Coronavirus unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors;
(ii) Klonierung des Genoms des Coronavirus in bakterielle künstliche Chromosomen (BACs);
(iii) Identifizierung der cDNA-Sequenzen des Coronavirus, die direkt oder indirekt toxisch auf Bakterien wirken;
(iv) Identifizierung der genauen Reihenfolge, in der die Komponenten der cDNA, die für eine infektiöse RNA des Coronavirus kodieren, zusammengefügt sein müssen (Promotoren, Transkriptionsterminationssequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Ribozyme, etc.); und
(v) Identifizierung einer Gruppe von Technologien und Verfahren (Bedingungen für das Wachstum von BACs, Veränderungen des Reinigungsverfahrens von BAC-DNA, Transformationstechniken, etc.), die es zusammen erlauben, einen infektiösen Coronavirus aus einer cDNA zu erhalten.

Der Promotor spielt eine wichtige Rolle bei der Verstärkung der Expression viraler RNA in dem Kern, wo sie synthetisiert wird, um später in das Cytoplasma transportiert zu werden.
Die Verwendung von BACs stellt einen der Kernpunkte des erfindungsgemäßen Verfahrens dar. Bekanntermaßen ist die Klonierung eukaryotischer Sequenzen in bakterielle Plasmide wegen der Toxizität der exogenen Sequenzen für Bakterien oft unmöglich. In diesen Fällen eliminieren die Bakterien die Toxizität normalerweise, indem sie die eingeführten Sequenzen verändern. Um dennoch die mögliche Toxizität dieser viralen Sequenzen zu vermeiden, wurden in der in diesem Fall benutzten Strategie die notwendigen Klonierungen, um die vollständige cDNA des Coronavirus zu erhalten, in BACs ausgeführt. Diese Plasmide treten in nur einer oder maximal zwei Kopien pro Zelle auf, was ihre Toxizität deutlich beschränkt und die Möglichkeiten der Rekombination zwischen Plasmiden reduziert.
Durch die Identifizierung der bakteriotoxischen cDNA-Sequenzen des Coronavirus kann die Herstellung der cDNA abgeschlossen werden, die das vollständige Genom eines Coronavirus kodiert, mit der Ausnahme der toxischen Sequenzen, die in dem letzten Schritt der Herstellung des vollständigen Genoms hinzugefügt werden, also direkt vor der Transfektion in eukaryotische Zellen, was eine Veränderung durch die Bakterien vermeidet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein infektiöser, doppelsträngiger cDNA-Klon, der für die gRNA eines Coronavirus kodiert, sowie das Verfahren, um diesen zu erhalten.
Weiterhin ist ein Satz von rekombinanten viralen Vektoren, die den infektiösen Klon und in diesen infektiösen Klon eingefügte Sequenzen heterologer Nukleinsäuren umfassen, Gegenstand dieser Erfindung.
Gegenstand dieser Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Coronavirus, welches die Einführung des infektiösen Klons in eine Wirtszelle, die Kultur der transformierten Zelle unter Bedingungen, welche die Replikation des infektiösen Klons und Herstellung des rekombinanten Coronavirus erlauben, und die Gewinnung des rekombinantem Coronavirus aus der Kultur umfasst.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung besteht aus einem Verfahren zur Herstellung eines veränderten rekombinanten Coronavirus, welches die Einführung des rekombinanten viralen Vektors in eine Wirtszelle, das Kultivieren unter Bedingungen, welche die Replikation des viralen Vektors und die Herstellung des veränderten rekombinanten Coronavirus erlauben, und die Gewinnung von veränderten rekombinanten Coronavirus aus der Kultur umfasst. Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung besteht aus einem Verfahren zur Herstellung eines ausgewählten Produkts, welches das Kultivieren einer Wirtszelle, die den rekombinanten viralen Vektor enthält, unter Bedingungen, welche die Expression der Sequenz heterologer DNA erlauben, umfasst.
Zellen, welche die bereits erwähnten infektiösen Klone oder rekombinanten viralen Vektoren enthalten, stellen einen anderen Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung besteht aus einem Satz von Impfstoffen, die Tiere gegen Infektionen schützen, die von infektiösen Agenzien hervorgerufen werden. Diese Impfstoffe umfassen infektiöse Vektoren, die mindestens ein Antigen, das für die Induktion einer Immunantwort gegen jedes der infektiösen Agenzien geeignet ist, oder mindestens einen Antikörper, der gegen das infektiöse Agens schützt, exprimieren, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägermittel. Die Impfstoffe können mono- oder multivalent sein, abhängig davon, ob die Vektoren ein oder mehrere Antigene exprimieren, die in der Lage sind, eine Immunantwort gegen ein oder mehrere infektiöse Agenzien zu induzieren, oder alternativ ein oder mehrere Antikörper, die gegen ein oder mehrere infektiöse Agenzien schützen.
Ein anderer durch diese Erfindung bereitgestellter Gegenstand umfasst ein Verfahren zur Immunisierung von Tieren, das in der Administration des Impfstoffes besteht.
Die Erfindung stellt einen cDNA-Klon bereit, der für die infektiöse RNA eines Coronavirus kodiert, der nachfolgend als der erfindungsgemäße infektiöse Klon bezeichnet wird, welcher umfasst: (1) eine Kopie der zu der infektiösen genomischen RNA (gRNA) eines Coronavirus komplementären DNA (CDNA) oder die virale RNA selbst; und (2) ein Expressionsmodul für ein zusätzliches Gen, welches optimierte transkriptionsfördernde Sequenzen einschließt.
In einer besonderen Ausführungsform dieser Erfindung ist der Coronavirus ein TGEV-Isolat, insbesondere das PUR46-MAD-Isolat (Sánchez et al., 1990), durch Austausch des S-Gens dieses Virus durch des S-Gen des Klon C11-TGEV-Isolats oder das S-Gen eines Caninen oder humanen Coronavirus verändert.
Die transkriptionsfördernde Sequenz, oder der Promotor, ist eine RNA-Sequenz, die sich an dem 5'-terminalen Ende jeder Messenger-RNA (mRNA) des Coronavirus befindet, welche von der viralen RNA-Polymerase gebunden werden, um die Transkription der Messenger-RNA (mRNA) einzuleiten. In einer besonderen und bevorzugten Ausführungsform wird wegen des hohen Expressionsgrades, der durch Benutzung dieses Promotors erhalten wird (Dubensky et al., 1996), und wegen vorheriger, in unserem Labor erhaltener Ergebnisse, die darauf hinwiesen, dass große unvollständige Genome (9,7 kb und 15 kb), die von TGEV Coronavirus abstammten, RNA exprimierten, die während ihres Transports aus dem Kern, wo sie synthetisiert wurden, in das Cytoplasma keinem Spleißen unterworfen waren, das virale Genom unter Verwendung des IE-Promotor von CMV von einer cDNA exprimiert.
Der infektiöse erfindungsgemäße Klon enthält auch eine Transkriptionsterminationssequenz und ein Polyadenylierungssignal, wie das des BGH-Gens. Diese Terminationssequenzen müssen an dem 3'-Ende des poly(A)-Schwanzes platziert werden. In einer besonderen Ausführungsform enthält der infektiöse erfindungsgemäße Klon einen poly(A)-Schwanz von 24 A-Resten und die Terminations- und Polyadenylierungssequenzen von BGH, die durch die Sequenz des HDV-Ribozyms von dem poly(A)-Schwanz getrennt sind.
Das Plasmid, in das die infektiöse cDNA des Virus eingefügt worden ist, ist ein DNA-Molekül, das einen Replikationsursprung besitzt und daher potentiell dazu in der Lage ist, sich in einer geeigneten Zelle zu replizieren. Das verwendete Plasmid ist ein Replikationskonstrukt, das dazu geeignet ist, den infektiösen erfindungsgemäßen Klon in einer geeigneten Wirtszelle, wie einem Bakterium, z.B. Escherichia coli, zu erhalten und zu amplifizieren. Das Replikationskonstrukt trägt normalerweise ein Antibiotika-Resistenzgen, das die Selektion von Zellen, die es tragen, erlaubt (z.B., cat).
In Beispiel 1 wird die Herstellung eines infektiösen Klons von TGEV unter der Kontrolle des IE-Promotors von CMV beschrieben. Das 3'-Ende der cDNA wird von einer 24 nt poly(A)-Sequenz, dem HDV-Ribozym und der Transkriptionsterminationssequenz von BGH flankiert.
Das Verfahren, um den infektiösen erfindungsgemäßen Klon zu erhalten, umfasst die Konstruktion der cDNA vollständiger Länge aus der gRNA eines Coronavirus und das Zusammenfügen mit den transkriptionsregulierenden Elementen.
Die für die infektiöse gRNA eines Coronavirus kodierende cDNA wurde aus einem DI-Genom erhalten, das von einem Corona virus abstammt, der als cDNA unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors in ein BAC kloniert wurde, um die Stabilität der cDNA zu erhöhen. Die bakteriotoxischen Sequenzen wurden sodann identifiziert, und, um diese Toxizität zu beseitigen, wurden die toxischen Sequenzen entfernt und am Ende der Herstellung des vollständigen Genoms, direkt vor der Transfektion in eukaryotische Zellen, eingefügt. Virale Nachfahren können wieder hergestellt werden, indem eukaryotische Zellen, welche die virale Replikation unterstützen, mit dem das Coronavirus-Genom enthaltenden BAC-Plasmid transfiziert werden.
Die transkriptionsregulierenden Elemente werden mit konventionellen Techniken hinzugefügt (Maniatis et al., 1989).
Der infektiöse erfindungsgemäße Klon kann mit konventioneller Gentechnik verändert werden, um mindestens eine heterologe Nukleinsäuresequenz, die für eine bestimmte Aktivität kodiert, unter der Kontrolle des in dem infektiösen Klon vorliegenden Promotors und der regulierenden Sequenzen, die in dem sich ergebenden Expressionsvektor enthalten sind, einzufügen.
Der infektiöse erfindungsgemäße Klon kann vielfältig verwendet werden, z.B. kann er sowohl in der Grundlagenforschung benutzt werden, z.B. um den Mechanismus der Replikation und Transkription von Coronaviren zu untersuchen, als auch in der angewandten Forschung, z.B. bei der Entwicklung von effizienten Systemen zur Expression von ausgewählten Produkten (Proteinen, Enzymen, Antikörpern, etc.).
Geeignete Zellen können mit dem infektiösen erfindungsgemäßen cDNA-Klon transformiert werden, und die erhaltenen Virionen, die das vollständige Genom des Coronavirus enthalten, können zurückgewonnen werden. Daher stellt die Erfindung darüber hinaus ein Verfahren bereit, um einen rekombinanten Coronavirus herzustellen, das umfasst, dass man eine infektiöse erfindungsgemäße cDNA in eine Wirtszelle einführt, diese Zelle unter Bedingungen kultiviert, welche die Expression und Repli kation des infektiösen Klons und die Gewinnung der erhaltenen Virionen des rekombinanten Coronavirus erlauben, die das infektiöse Genom des Coronavirus enthalten. Der infektiöse erfindungsgemäße Klon kann in die Wirtszelle auf verschiedene Arten eingeführt werden, z.B. durch Transfektion der geeigneten Zelle mit einer in vitro von einem infektiösen erfindungsgemäßen Klon transkribierten RNA, oder durch Infektion der Wirtszelle mit dem infektiösen erfindungsgemäßen cDNA-Klon. Die Wirtszellen, die den infektiösen erfindungsgemäßen Klon enthalten, stellen einen zusätzlichen Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar.
Die Erfindung stellt auch einen Satz rekombinanter viraler Vektoren bereit, die von einem infektiösen erfindungsgemäßen Klon abstammen, in der Folge die viralen erfindungsgemäße Vektoren. Die viralen erfindungsgemäßen Vektoren umfassen einen infektiösen erfindungsgemäßen cDNA-Klon, der so verändert wurde, dass er eine in den infektiösen Klon eingefügte heterologe Nukleinsäure enthält, unter Bedingungen, welche die Expression der heterologen Nukleinsäure erlauben.
Der Begriff „Nukleinsäure", wie in dieser Beschreibung verwendet, schließt Gene oder Genfragmente, genauso wie im Allgemeinen jedes DNA- oder RNA-Molekül, ein.
Der auf eine Nukleinsäure angewendete Begriff „heterolog" bezieht sich, in dem in dieser Beschreibung verwendeten Sinn, auf eine Nukleinsäuresequenz, die üblicherweise nicht in dem Vektor vorliegt, der zum Einbringen der heterologen Nukleinsäure in eine Wirtszelle benutzt wird.
Die heterologe Nukleinsäure, die in dem viralen erfindungsgemäßen Vektor enthalten ist, kann ein Gen oder Fragment davon sein, das für ein Protein, ein Peptid, ein Epitop oder ein beliebiges ausgewähltes Genprodukt (so wie Antikörper, Enzyme, etc.) kodiert. Die heterologe Nukleinsäure kann in den infektiösen erfindungsgemäßen Klon mit Hilfe von konventionel ler Gentechnik in jede geeignete Region der cDNA eingefügt werden, z.B. nach ORF 1b oder zwischen den Genen N und 7 nach dem Initiationskodon (AUG) und im Leseraster mit diesem Gen; oder, alternativ, in den anderen ORFs entsprechenden Gebieten. Bei der Konstruktion des viralen erfindungsgemäßen Vektors ist es essentiell, dass die Insertion der heterologen Nukleinsäure keine der grundlegenden viralen Funktionen stört.
Der virale erfindungsgemäße Vektor kann ein oder mehrere Aktivitäten exprimieren. In dem letzteren Fall schließt der Vektor so viele Sequenzen heterologer Nukleinsäuren ein, wie Aktivitäten exprimiert werden, wobei ein oder mehrere Promotoren vorangestellt sind, oder ein Promotor und mehrere Chromosomenerkennungsstellen (IRES, internal ribosome entry sites), oder mehrere Promotoren und eine Ribosomenerkennungsstelle.
Damit stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines ausgewählten Produktes bereit, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle, die einen viralen erfindungsgemäßen Vektor enthält, unter Bedingungen, welche die Expression der heterologen Nukleinsäure und die Gewinnung des ausgewählten Produktes erlauben. Die Wirtszellen, die den viralen erfindungsgemäßen Vektor enthalten, stellen einen zusätzlichen Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar.
Der virale erfindungsgemäße Vektor kann so entworfen sein, dass seine Speziesspezifität und sein Tropismus leicht kontrolliert werden können. Wegen dieser Eigenschaften ist eine sehr interessante Anwendung der viralen erfindungsgemäßen Vektoren ihre Nutzung in der Gentherapie als Vektor eines ausgewählten Genes, oder als Impfvektor, um Immunantworten gegen verschiedene Pathogene zu induzieren.
Die Erfindung stellt weiterhin Impfstoffe bereit, die in der Lage sind, ein Tier gegen durch infektiöse Agenzien ausgelöste Infektionen zu schützen, umfassend (i) mindestens einen viralen erfindungsgemäßen Vektor, der mindestens ein für die Induktion einer Immunantwort gegen das infektiöse Agens geeig- netes Antigen oder einen Antikörper, der Schutz gegen das infektiöse Agens verleiht, exprimiert, gegebenenfalls gemeinsam mit (ii) einem pharmazeutisch verträglichen Trägermittel.
In dem in dieser Beschreibung verwendeten Sinn sollte „die Induktion von Schutz" als eine Immunantwort des Akzeptor-Organismus (des zu immunisierenden Tieres) verstanden werden, die durch den viralen erfindungsgemäßen Vektor durch geeignete Mechanismen induziert wird, wie solche, die durch Substanzen induziert werden, die zelluläre Antworten verstärken (Interleukine, Interferone, etc.), zelluläre Nekrosefaktoren und ähnliche Substanzen, die das Tier vor durch infektiöse Agenzien ausgelösten Infektionen schützen.
In dem Begriff „Tier" sind alle Tiere jeglicher Spezies eingeschlossen, bevorzugt Säugetiere, einschließlich des Menschen.
Der Begriff „infektiöses Agens" in dem in dieser Beschreibung verwendeten Sinn schließt jegliches virale, bakterielle, fungale, parasitäre oder anderes infektiöses Agens ein, das ein Tier infizieren und in ihm eine Schädigung hervorrufen kann.
In einer besonderen Ausführungsform umfasst der durch diese Erfindung bereitgestellte Impfstoff mindestens einen viralen erfindungsgemäßen Vektor, der mindestens ein Antigen exprimiert, das in der Lage ist, eine systemische Immunantwort und/oder eine Immunantwort in den Schleimhäuten gegen verschiedene infektiöse Agenzien zu induzieren, die sich in Schleimhäuten des respiratorischen oder Intestinaltrakts vermehren. Die erfindungsgemäßen Vektoren sind dazu geeignet, Immunität in Schleimhäuten und laktogene Immunität auszulösen, was von besonderem Interesse ist, um Neugeborene gegen Infektionen des Intestinaltrakts zu schützen.
In einer anderen Ausführungsform umfasst der durch diese Erfindung bereitgestellte Impfstoff mindestens einen erfindungsgemäßen viralen Vektor, der mindestens ein Gen exprimiert, das für die leichten und schweren Ketten eines Antikörpers beliebigen Isotyps kodiert (z.B. IgG₁, IgA, etc.), der gegen ein infektiöses Agens schützt.
Speziesspezifität kann kontrolliert werden, da der virale Vektor das S-Protein der Hülle eines Coronavirus exprimieren kann, das die gewünschte Spezies infiziert (Mensch, Hund, Katze, Schwein, etc.), wobei es dafür geeignet ist, durch die zellulären Rezeptoren der entsprechenden Spezies erkannt zu werden.
Die durch diese Erfindung bereitgestellten Impfstoffe können monovalent oder multivalent sein, abhängig davon, ob die viralen erfindungsgemäßen Vektoren ein oder mehrere Antigene, die in der Lage sind, eine Immunantwort gegen ein oder mehrere infektiöse Agenzien zu induzieren, oder eine oder mehrere Antikörper, die Schutz gegen ein oder mehrere infektiöse Agenzien verleihen, exprimieren.
In einer besonderen Ausführungsform dieser Erfindung werden monovalente Impfstoffe bereitgestellt, die in der Lage sind, Menschen, Schweine, Hunde und Katzen gegen verschiedene für Menschen, Schweine, Hunde und Katzen infektiöse Agenzien zu schützen, wobei der Tropismus durch Expression des S-Glykoproteins von Coronavirus mit der gewünschten Speziesspezifität kontrolliert wird.
Die monovalenten Vakzine gegen für Schweine infektiöse Agenzien können einen Vektor enthalten, der ein Antigen exprimiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die im wesentlichen aus Antigenen der folgenden Schweine-Pathogene besteht: Actinobacillus pleuropneumoniae, Actibacillus suis, Haemophilus parasius, Porciner Parvovirus, Leptospira, Escherichia coli, Erysipelotrix rhusiophatiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Serpulina hydiosenteriae, Mycoplasma hyopneumoniae, Porciner Epidemischer Durchfallsvirus (porcine epidemic diarrhea virus, PEDV), Porciner Respiratorischer Coronavirus, Rotavirus, oder gegen die Pathogene, die Porcines respiratorisches und reproduktives Syndrom verursachen, Aujeszky-Krankheit (Pseudowut), Schweinegrippe oder Transmissible Gastoenteritis, und das ätiologische Agens von Atrophischer Rhinitis und Proliferativer Ileitis. Die monovalenten Impfstoffe gegen für Hunde infektiöse Agenzien können einen Expressionsvektor enthalten, der ein Antigen ausgewählt aus der Gruppe, die im Wesentlichen aus Antigenen der folgenden caninen Pathogene besteht, exprimieren: Caniner Herpesvirus, Caniner Adenovirus Typ 1 und 2, Caniner Parvovirus Typ 1 und 2, Caniner Reovirus, Caniner Rotavirus, Caniner Coronavirus, Caniner Parainfluenzavirus, Caniner Influenzavirus, Staupevirus, Tollwutvirus, Retrovirus, und Caniner Calicivirus.
Die monovalenten Vakzine gegen für Katzen infektiöse Agenzien können einen Expressionsvektor enthalten, der ein Antigen aus der Gruppe exprimiert, die im Wesentlichen aus Antigenen der folgenden Katzen-Pathogene besteht: Katzen Calicivirus, Feliner Immunschwächevirus, Feline Herpesviren, Feliner Panleukopeniavirus, Feliner Reovirus, Feliner Rotavirus, Feliner Coronavirus, Feliner Infektiöse Peritonitis-Virus, Tollwutvirus, feline Clamydia psittaci und Feliner Leukämievirus.
Die Vektoren können einen Antikörper exprimieren, der Schutz gegen ein infektiöses Agens verleiht, z.B. ein für Schweine, Hunde oder Katzen infektiöses Agens wie die oben beschriebenen. In einer besonderen Ausführungsform exprimiert der Vektor den rekombinanten monoklonalen Antikörper, der als 6A.C3 identifiziert ist, der TGEV neutralisiert und mit den Isotypen IgG₁ oder IgA exprimiert wird, in denen der konstante Teil des Immunoglobulins von porcinem Ursprung ist, oder neutralisierende Antikörper gegen humane oder porcine Rotaviren.
Als Trägermittel kann ein Verdünnungsmittel wie physiologische Salzlösung oder andere ähnliche Salzlösungen benutzt werden. Diese Impfstoffe können auch ein Adjuvans enthalten, das normalerweise bei der Formulierung entweder von wässrigen Impfstoffen verwendet wird, z.B. Aluminiumhydroxid, QuilA, Suspensionen von Alumgelen und Ähnliches, oder von ölartigen Impfstoffen, die auf Mineralöl, Glyceriden, Fettsäurederivaten und ihren Mischungen basieren.
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können auch die Zellantwort verstärkende ("cell-response-potentiating", CRP) Substanzen enthalten, das sind Substanzen, die Unterpopulationen von Helfer T-Zellen (Th₁ und Th₂) verstärken, z.B. Interleukin-1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, gamma-IFN (gamma-Interferon), zellulärer Nekrosefaktor und ähnliche Substanzen, die theoretisch zelluläre Immunität in geimpften Tieren hervorrufen können. Diese CRP-Substanzen können in Impfstoffformulierungen mit wässrigen oder öligen Adjuvanzien verwendet werden. Eine andere Art von Adjuvanzien, welche die zelluläre Antworten modulieren und stimulieren können, kann auch verwendet werden, z.B. MDP (Muramyldipeptid), ISCOM (Immunostimulant Complex), oder Liposomen.
Die Erfindung stellt multivalente Impfstoffe bereit, die in der Lage sind, Infektionen durch verschiedene infektiöse Agenzien zu verhindern und Tiere vor ihnen zu schützen. Diese multivalenten Impfstoffe können mit viralen erfindungsgemäßen Vektoren hergestellt werden, in die verschiedene Sequenzen, die für entsprechende Antigene kodieren, in den gleichen rekombinanten Vektor eingefügt wurden, oder durch die Herstellung unabhängiger rekombinanter Vektoren, die später für gemeinsame Inokulation gemischt werden. Daher umfassen diese multivalenten Impfstoffe einen viralen Vektor, der mehr als eine heterologe Nukleinsäuresequenz enthält, die für mehr als ein Antigen kodieren oder alternativ verschiedene virale Vek toren, von denen jeder mindestens ein unterschiedliches Antigen exprimiert.
Analog können multivalente Impfstoffe hergestellt werden, die multivalente Vektoren umfassen, indem Sequenzen verwendet werden, die für gegen infektiöse Agenzien schützende Antikörper kodieren, anstelle der Sequenzen, die das Antigen kodieren.
In einer besonderen Ausführungsform dieser Erfindung werden Impfstoffe bereitgestellt, die in der Lage sind, Menschen, Schweine, Hunde und Katzen gegen jeweils verschiedene für Schweine, Hunde und Katzen infektiöse Agenzien, zu immunisieren. Dafür müssen die in dem Impfstoff enthaltenen viralen Vektoren verschiedene Antigene der oben erwähnten oder anderen Menschen-, Schweine-, Hunde- und Katzenpathogene enthalten.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können in flüssiger oder lyophilisierter Form vorliegen und können hergestellt werden, indem die rekombinanten Systeme in dem Trägermittel suspendiert werden. Wenn diese Systeme in lyophilisierter Form sind, kann das Trägermittel selbst die rekonstituierende Substanz sein.
Alternativ können die durch diese Erfindung bereitgestellten Impfstoffe in Kombination mit anderen konventionellen Impfstoffen benutzt werden, indem sie entweder einen Teil von ihnen darstellen, oder als Verdünnungsmittel oder als lyophilisierte Fraktion, um mit anderen konventionellen oder rekombinanten Impfstoffen verdünnt zu werden.
Die von dieser Erfindung bereitgestellten Impfstoffe können dem Tier oral, nasal, subkutan, intradermal, intraperitoneal, intramuskulär oder durch Aerosol verabreicht werden.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Immunisierung von Tieren, insbesondere Schweinen, Hunden und Katzen, gegen ein oder verschiedene infektiöse Agenzien gleichzeitig, bereit, das die orale, nasale, subkutane, intradermale, intraperitoneale, intramuskuläre oder aerosolische Verabereichung (oder Kombination davon) eines Impfstoffs umfasst, der eine immunologische effektive Menge eines durch diese Erfindung bereitgestellten rekombinanten Systems enthält.
Zusätzlich stellt die Erfindung auch ein Verfahren bereit, um neugeborene Tiere gegen infektiöse Agenzien, welche diese Tiere infizieren, zu schützen, das darin besteht, dass man einen der durch diese Erfindung bereitgestellten Impfstoffe vor oder während der Gestationsperiode an Mütter oder ihre Nachkommen oral, nasal, subkutan, intradermal, intraperitoneal, intramuskulär oder als Aerosol verabreicht.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, welche im Detail die Gewinnung der infektiösen erfindungsgemäßen Klone und die Konstruktion der viralen erfindungsgemäßen Vektoren beschreiben. Diese Beispielen sollten nicht so betrachtet werden, dass sie den Umfang der Erfindung beschränken, sondern dass sie diese veranschaulichen. In dem Beispiel wurde die Transformation und das Wachstum von Bakterien, DNA-Aufreinigung, Sequenzanalyse und der Test, um die Stabilität der Plasmide abzuschätzen, gemäß den unten beschriebenen Methoden ausgeführt.
Transformation der Bakterien
Alle Plasmide wurden durch Elektroporation in den E. coli DH10B Stamm (Gibco BRL) eingebracht, wobei bereits beschriebene Protokolle leicht verändert wurden (Shizuya et al., 1992). Für jede Transformation wurden 2 μL Ligation und 50 μL kompetenter Bakterien in 0,2 cm Gefäßen (BioRad) gemischt und bei 200 Ω, 2,5 kV und 25 μF elektroporiert. Dann wurde bei jeder Transformation 1 mL SOC-Medium hinzugefügt (Maniatis et al., 1989), die Zellen bei 37 °C für 45 Minuten inkubiert und schließlich wurden die rekombinanten Kolonien auf Platten von LB SOC Medium (Maniatis et al., 1989) mit 12,5 μg/mL Chloramphenicol detektiert.
Wachstumsbedingungen der Bakterien
Bakterien, welche die Originalplasmide enthalten, in die das unvollständige Genom von TGEV kloniert wurde (3), wurden bei 37 °C wachsen gelassen, wobei sie normale Wachstumskinetiken zeigten. Andererseits wurde das BAC, das die vollständige cDNA enthielt, bei 30 °C wachsen gelassen, um die Instabilität soweit wie möglich zu minimieren. Sogar so war die Größe der Kolonien reduziert, und Inkubationszeiten von bis zu 24 Stunden waren notwendig, um Kolonien normaler Größe zu erhalten.
Aufreinigung der DNA
Es wurde das von Woo (Woo et al., 1994) beschriebene Protokoll mit leichten Veränderungen befolgt. Von einer einzelnen Kolonie wurden 4 L LB mit Chloramphenicol (12,5 μg/mL) inokuliert. Nach einer Inkubationszeit von 18 h bei 30 °C wurden die Bakterien durch Zentrifugation bei 6.000 g gesammelt und das Plasmid wurde unter Benutzung des Qiagen Plasmid Maxipreparation-Kits nach den Empfehlungen des Herstellers aufgereinigt. Mit diesem Verfahren wurde beobachtet, dass die erhaltene Plasmid-DNA mit bakterieller DNA verunreinigt war. Um die verunreinigende bakterielle DNA zu eliminieren, wurde die Plasmid-DNA mit Hilfe von Zentrifugation bei 55.000 rpm für 16 h auf einem CsCl-Gradienten gereinigt. Die erhaltene Ausbeute lag zwischen 15 und 30 μg/L, abhängig von der Größe des Plasmids.
Sequenzanalyse
Die DNA wurde mit einem automatischen Sequenzierer (373 Sequencer, Applied Biosystems) sequenziert, wobei mit Fluoro chrom markierte Dideoxynukleotide und eine Temperaturresistente Polymerase (Perkin Elmer) verwendet wurden. Die Reagenzien wurden als Kit (ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit) von der Firma Applied Biosystems erhalten. Der für die Sequenzierungsreaktionen verwendete Thermocycler war „GeneAmpPCR System 9600" (Perkin Elmer).
Das Zusammenfügen der Sequenzen und der Vergleich mit der Consensussequenz von TGEV wurde jeweils mit den SegMan II und Align (DNASTAR) Programmen, ausgeführt. Es wurden keine Unterschiede in Bezug auf die Cosensussequenz festgestellt.
Stabilität der Plasmide
Von den Original-Glycerolstocks wurden die Bakterien, die rekombinante pBeloBACll Plasmide enthielten, in 20 mL LB mit Chloramphenocol (12,5 μg/ml) 16 h bei 30 °C und 37 °C wachsen gelassen. Dieses Material wurde als Passage 0 bezeichnet. Die Bakterien wurden 1 : 10⁶ verdünnt und bei 30 °C und 37 °C 16 h wachsen gelassen. Während acht aufeinanderfolgenden Tagen wurden serielle Passagen durchgeführt (jede Passage stellt ca. 20 Generationen dar). Die Plasmid-DNA wurde bei Passage 0 und 8 (160 Generationen) durch Miniprep auf gereinigt und mit Restriktionsendonukleasen analysiert. Die zwei Plasmide, die einen Teil des Genoms von TGEV enthielten, waren sehr stabil, während die Plasmide, die das vollständige Genom von TGEV enthielten, nach 40 Generationen eine gewisse Instabilität zeigten (zu diesem Zeitpunkt zeigten etwa 80 % der DNA das richtige Restriktionsmuster).
Beispiel 1
HERSTELLUNG EINES REKOMBINANTEN VEKTORS BASIEREND AUF EINEM VON TGEV ABSTAMMENDEN KLON INFEKTIÖSER cDNA
1.1 Herstellung einer infektiösen TGEV-cDNA
Um eine cDNA, die für ein vollständiges TGEV-Genom kodierte, zu erhalten; gingen wir ursprünglich von einer cDNA aus, die für das unvollständige DI-C-Genom kodierte (Mendez et al., 1996). Diese cDNA, mit einer ungefähren Länge von einem Drittel des TGEV-Genoms, wurde in das Plasmid geringer Kopienzahl pACNR1180 kloniert (Ruggli et al., 1996) und die Sequenz wurde bestimmt. Die für das unvollständige Genom kodierende cDNA wurde effizient mit der Hilfe eines komplementierenden Virus (Mendez et al., 1996; Izeta et al., 1999) gerettet (repliziert und verpackt).
Das DI-C-Genom weist drei Deletionen (Δ1, Δ2 und Δ3) von etwa 10, 1 und 8 Kilobasen (kb) auf, jeweils bei den ORFs 1a, 1b und zwischen den Genen S und 7 (siehe 1).
Die verfolgte Strategie, um die Sequenz der cDNA zu vervollständigen, die für ein infektiöses TGEV kodieren würde, war, Schritt für Schritt die in dem DI-C-Genom deletierten Sequenzen einzubauen, wobei die Bakteriotoxizität der neu hergestellten Konstruktionen analysiert werden musste. Dieser Aspekt ist sehr wichtig, da es in der wissenschaftlichen Literatur weithin dokumentiert ist, dass rekombinante Plasmide mit cDNAs von RNA-Viren im Allgemeinen schlecht wachsen und instabil sind (Boyer und Haenni, 1994; Rice et al., 1989; Mandl et al., 1997).
Die erste Deletion, die vervollständig wurde, war Deletion Δ2, 1 kb, von ORF 1b, was zu einem stabilen rekombinanten Plasmid führte. Die Sequenz, die in ORF 1a fehlte, wurde eingeführt, indem die cDNA-Fragmente A, B, C und D (1) (Almazan et al., 2000) so kloniert wurden, dass die gesamte für das Replikasegen benötigte Information vollständig sein sollte. Das erhaltene rekombinante Plasmid war in dem Bakterium instabil, was zu neuen Plasmiden führte, die Additionen und Deletionen in Fragment B aufwiesen (Almazan et al., 2000) . Interessanterweise führte die Elimination eines 5,198 by ClaI- ClaI-Restriktionsfragments, das die Region des Genoms zwischen Nukleotiden 4,417 und 9,615 umfasste (Penzes et al., 1999) zu einem in dem E. coli DH10B Stamm relativ stabilen Plasmid.
Später wurde die Sequenz von Deletion Δ3 hinzugefügt, indem die gesamte genetische Information für die strukturellen und nicht-strukturellen Proteine des 3'-Endes des TGEV-Genoms kloniert wurde (1).
Um die Stabilität der TGEV-cDNA schrittweise zu verbessern, wurde entschieden, dass sie unter Verwendung des pBeloBAC11-Plasmids in BAC subkloniert werden würde (Kim et al., 1992) (siehe 2). Das pBeloBAC11-Plasmid war ein größzügiges Geschenk von H. Shizuya und M. Simon (California Institute of Technology). Das Plasmid, mit einer Größe von 7,507 bp, enthält den Replikationsursprung des F-Faktors von parB, parC, E. coli (oriS) und die Gene, die dafür notwendig sind, eine einzelne Kopie des Plasmids pro Zelle zu erhalten (parA und repE). In dem Plasmid liegt auch ein Chloramphenicol-Resistenzgen (cat) als Selektionsmarker vor. Die cDNA wurde unter Kontrolle des IE-Promotors von CMV kloniert, wegen des hohen Expressionsgrades, der mit diesem Promotor erhalten wird (Dubensky et al., 1996), und wegen vorheriger in unserem Labor erhaltener Ergebnisse, die darauf hinweisen, dass große (9,7 kb und 15 kb) unvollständige Genome, die von TGEV-exprimierten RNAs abstammen, während des Transports aus dem Kern, wo sie synthetisiert werden, ins Cytoplasma keinem Spleißen unterworfen waren (Izeta et al., 1999; Penzes et al., 1999; Almazan et al., 2000). Die hergestellte TGEV-cDNA (pBAC-TcDNA-ΔClaI) enthielt die Information für die Gene der Replikase (mit der Ausnahme des deletierten 5,198 by ClaI-Fragments, und die gesamte Information der strukturellen und nicht-strukturellen Gene. Das 3'-Ende der cDNA wird flankiert von einer 24 nt poly(A)-Sequenz, dem HDV-Ribozym und der Transkriptionsterminationssequenz von BGH (Itzeta et al., 1999). Andererseits wurde das ClaI-Fragment, das für die Vervollstän digung des Genoms von TGEV notwendig ist, in BAC kloniert, wobei das Plasmid pBAC–B+C+D5' hergestellt wurde, welches die Region des TGEV-Genoms zwischen 4,310 und 9,758 enthält (siehe 3). Beide Plasmide wurden in dem E. coli DH10B-Stamm vervielfältigt und komplett sequenziert. Die erhaltene Sequenz war identisch mit der Consensussequenz des PUR46-Mad-Isolats von TGEV, die am Ende dieses Dokuments bereitgestellt wird (SEQ ID NO:1), mit der Ausnahme von zwei Austauschen in den Positionen der Nukleotide 6,752 (A = > G, stille Mutation) und 18,997 (T = > C, stille Mutation) und den Veränderungen in dem S-Gen von PUR46-MAD, das durch das D-Gen des Isolats C11 ersetzt wurde (diese Änderungen sind in 4 angegeben).
Weiterhin wurde, um eine cDNA herzustellen, die für ein virulentes TGEV kodieren würde, das S-Gen des PUR46-MAD-Isolats, welches sich auf hohem Niveau in dem respiratorischen Trakt (> 10⁶ PFU/g Gewebe) und auf geringem Niveau in dem Intestinaltrakt (< 10³ PFU/mL) repliziert, vollständig durch das S-Gen von TGEV Klon 11 ersetzt, in der Folge C11, welcher sich mit erhöhten Titern sowohl in dem respiratorischen Trakt (< 10⁶ PFU/mL) als auch im Intestinaltrakt (< 10⁶ PFU/mL) repliziert (Sánchez et al., 1999). Das S-Gen von C11 zeigt 14 Nukleotide, die sich von dem S-Gen des PUR46-MAD-Isolats unterscheiden, sowie eine 6 nt-Insertion am 5'-Ende des S-Gens (siehe 4) (Sánchez et al., 1999). Frühere Ergebnisse in unserem Labor (Sánchez et al., 1999) zeigten, dass durch gerichtete Rekombination hergestellte Mutanten, in denen das S-Gen des PUR46-MAD-Isolats von TGEV durch das S-Gen des C11 intestinalen Isolats ersetzt wurde, einen intestinalen Tropismus und verstärkte Virulent annahmen, anders als das natürliche PUR46-MAD-Isolat von TGEV, das sich im Intestinaltrakt infizierter Schweine nur wenig oder gar nicht repliziert.
Eine cDNA mit dem S-Gen des intestinalen Isolats C11 wurde aus dem PUR46-MAD-Isolat von TGEV hergestellt, indem das 5,198 by ClaI-ClaI-Fragment, das aus dem pBAC–B+C+D5'-Plasmid erhalten wurde, in das pBAC-TcDNA^ΔClaI-Plasmid kloniert wurde, um das pBAC-TcDNA^FL-Plasmid herzustellen, das die für das vollständige TGEV-Genom kodierende cDNA enthält (3).
Die Stabilität der für die Konstruktion des Klons infektiöser cDNA (pBAC-TcDNA-^ΔClaI und pBAC-ClaI^F) benutzten Plasmide, genau wie des Plasmids, das die vollständige cDNA enthält (pBAC-TcDNA^FL) in Bakterien wurde nach Wachstum in E. coli für 160 Generationen analysiert. Die Stabilität wurde durch Verdau der gereinigten DNA mit Restriktionsenzymen analysiert. Es wurden keine Deletionen oder Insertionen festgestellt, obwohl die Anwesenheit geringfügiger Änderungen, die durch die benutzte Analysetechnik nicht festgestellt werden können, in dem Fall des pBAC-TcDNA^ΔClaI-Plasmids und des pBAC–B+C+D5'-Plasmids nicht ausgeschlossen werden kann. In dem Fall des pBAC-TcDNA-Plasmids, welches das vollständige Genom von TGEV enthält, wurde eine gewisse Instabilität nach 40 Generationen festgestellt (zu diesem Zeitpunkt zeigten etwa 80 % der DNA das richtige Restriktionsmuster). Diese leichte Instabilität ist jedoch kein Hindernis für die Gewinnung des infektiösen Virus, da 20 Generationen bakteriellen Wachstums (4 L Kultur) ausreichen, um eine Menge von Plasmid-DNA herzustellen, welche die Gewinnung des Virus erlaubt.
1.2 Gewinnung der infektiösem TGEV aus einer cDNA, die für das vollständige Genom kodiert
ST-Zellen wurden mit dem pBAC-TcDNA^FL-Plasmid transfiziert. 48 h nach Transfektion wurde der Überstand der Kultur gesammelt und sechmal in ST-Zellen passagiert (siehe 5). Ab Passage 2, 14 h nach Infektion, wurde der cytopathische Effekt deutlich, der sich später, 20 h nach Infektion, auf praktisch alle Zellen, welche die einzelne Zellschicht bildeten, ausdehnte (siehe 6). Andererseits erhöhte sich der Titer des erhaltenen Virus mit den Passagen schnell und erreichte bei Passage 3 Werte in der Größenordnung von 10⁸ PFU/mL (siehe 7) . Das Experiment wurde fünfmal wiederholt, und in allen Fällen wurde infektiöses Virus mit ähnlichen Titern zurückgewonnen, wobei im Falle von nicht transfizierten ST-Zellen oder ST-Zellen, die mit einem ähnlichen Plasmid, in denen das ClaI-ClaI-Fragment in der umgekehrten Orientierung vorlag, nie Virus gewonnen wurde.
Um die Möglichkeit auszuschließen, dass das erhaltene Virus das Ergebnis von Kontaminationen war, wurden die Sequenzen an Positionen 6,752 und 18,997 bestimmt, indem mit der genomischen RNA des erhaltenen Virus als Matrize mit RT-PCR amplifizierte CDNA-Fragmente sequenziert wurden. Die Analyse der Sequenz ergab, dass die Nukleotide in den Positionen 6,752 und 18,997 die in der cDNA vorliegenden Nukleotide waren. Weiterhin zeigte der gewonnene Virus in der cDNA-Sequenz des S-Gens eine Restriktionsschnittstelle DraIII an Position 20,990, wie es für das S-Gen von C11 erwartet wurde (8). Die Anwesenheit dieser drei genetischen Marker bestätigte, dass das isolierte Virus von der cDNA stammte.
Für eine gründlichere Kennzeichnung des hergestellten Virus wurde eine vergleichende Analyse durch Immunfluoreszenz von Zellen durchgeführt, die mit dem nach Transfektion mit dem pBAC-TcDNA^FL-Plasmid gewonnenen Virus (TcDNA) oder mit dem PUR46-MAD-Isolat von TGEV infiziert waren. Dafür wurden spezifische polyklonale und monoklonale Antikörper verwendet, die sowohl das Cll-Isolat als auch das PUR46-MAD-Isolat erkannten, oder nur das letztere (siehe 10). Die erhaltenen Ergebnisse bestätigten die für das neue TcDNA-Virus erwartete Antigenizität. Der für TGEV-spezifische polyklonale Antikörper, der monoklonale Antikörper gegen das S-Protein, für den Spezifität erwartet wurde (ID.B12 und 6A.C3), sowie der spezifische monoklonale Antikörper gegen die M-(3B.B3) und N-(3B.D8) Proteine erkannte sowohl TcDNA als auch PUR46-MAD. Die erhal tenen Daten wiesen darauf hin, dass der hergestellte Virus die M- und N-Proteine des PUR46-MAD-Isolates und das S-Protein des C11-Isolates aufwies, wie es in der ursprünglichen cDNA geplant war.
1.3 In vivo-Infektiösität und Virulenz
Um die in vivo-Infektiösität des TcDNA-Virus zu analysieren, wurde eine Gruppe von 5 neugeborenen Schweinen mit von Passage 6 kloniertem Virus inokuliert und die Mortalität wurde analysiert. Die fünf inokulierten Schweine starben 3 bis 4 Tage nach der Inokulation, was darauf hinwies, dass der TcDNA-Virus virulent war. Im Gegensatz dazu zeigten sich bei zwei Schweinen, die nur mit dem Verdünnungsmittel für den Virus inokuliert und unter den gleichen Bedingungen gehalten wurden, keine Änderungen.
1.4 Optimierung des Expressionsniveaus durch Veränderung der Transkriptions-regulierenden Sequenzen
RNA-Synthese in Coronaviren findet mit Hilfe eines RNA-abhängigen Vorgangs statt, in dem mRNA von Matrizes mit negativer Polarität transkribiert wird. Bei TGEV gibt es eine konservierte Consensussequenz, CUAAAC, die direkt vor den meisten Genen lokalisiert ist. Diese Sequenzen stellen Signale für die Transkription der subgenomischen mRNAs dar. Bei Coronavirus gibt es zwischen sechs und acht Arten von mRNAs mit unterschiedlichen Größen, abhängig von dem Typ des Coronavirus und dem Wirt. Die größte entspricht der genomischen RNA, welche wiederum als mRNA für die ORFs 1a und 1b dient. Der Rest der mRNAs entspricht subgenomischen mRNAs. Diese RNAs werden in abnehmender Reihenfolge der Größe als mRNA 1 bis 7 bezeichnet. Andererseits wurden einige mRNAs, die nach dem Satz der ur sprünglich beschriebenen mRNAs entdeckt wurden, mit dem Namen der entsprechenden mRNA, einem Bindestrich und einer Zahl bezeichnet, z.B. mRNA 2-1. Im Vergleich zur Struktur der genomische RNA zeigen die mRNAs eine gemeinsame terminale Struktur. Mit der Ausnahme der kleinsten mRNA ist der Rest strukturell polycistronisch, während im Allgemeinen nur der am weitesten 5' befindliche ORF translatiert wird.
Die Effizienz der Expression eines Markergenes (GUS) wurde unter Verwendung verschiedener Sequenzen, die das 5'-Ende der minimalen Sequenz zwischen den Genen (IG) CUAAAC (11) flankierten, verschiedener Sequenzen, die das 3'-Ende der IG-Sequenz flankierten (12), und verschiedener Insertions-Orte (13) untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse ( 11 bis 13) wiesen darauf hin, dass optimale Expression mit einem TRS erreicht wurden, der aus (i) der –88 nt flankierenden Consensussequenz für das N-Gen von TGEV; (ii) der IG-Sequenz; und (iii) der 3'-flankierenden Sequenz der IG-Sequenz des S-Gens besteht. weiterhin wurden, in Übereinstimmung mit den Ergebnissen in Bezug auf den Insertionspunkt des heterologen Gens, die größten Expressionsniveaus erreicht, wenn das heterologe Gen an dem 3'-Ende des Genoms lokalisiert war. Ein TRS mit dem beschriebenen Aufbau erlaubt eine Expressions von GUS auf einem Niveau zwischen 2 und 8 μg pro 10⁶ Zellen.
1.5 Gewebespezifität des Expressionssystems
Viele Pathogene dringen durch Schleimhäute in den Wirt ein. Um diese Art von Infektionen zu verhindern, ist es wichtig, Expressionssysteme zu entwickeln, welche die Induktion eines hohen Grads sekretorischer Immunität erlauben. Dies kann grundsätzlich durch die Verabreichung von Antigenen in den mit dem respiratorischen und Intestinaltrakt assoziierten Lymphknoten erreicht werden. Um dieses Ziel zu erreichen, und um im Allgemeinen die Expression eines Gens auf das ausgewählte Gewebe zu richten, wurden die molekularen Grundlagen des Tropismus von TGEV untersucht. Diese Untersuchungen haben gezeigt, dass die Gewebespezifität von TGEV durch die Konstruktion rekombinanter Viren verändert werden kann, die das S-Gen des Coronavirus mit dem erwünschten Tropismus enthalten (Ballesteros et al., 1997; Sánchez et al., 1999). Diese Information ermöglicht es, Expessionssysteme basierend auf cDNA-Genomen von Coronavirus zu konstruieren, die respiratorischen oder intestinalen Tropismus aufweisen.
1.6 Expression des durch ORF5 des PRRSV kodierten viralen Antigens mit infektiöser cDNA
Um das Niveau der Expression heterologer Gene zu optimieren, wurden aus einem Vektor mit austauschbaren Modulen, flankiert durch Klonierungssequenzen, die den Austausch von TRS und heterologen Genen innerhalb des Vektors erleichtern, Konstrukte hergestellt. Das Konstrukt, das ORF5 von PRRSV (Poricines respiratorisches und reproduktives Syndrom-Virus) enthielt, ergab eine optimale Expression (etwa 10 μg/10⁶ Zellen), wenn es am 5'-Ende flankiert war durch die minimale IGS Consensussequenz (CUAAAC) folgend auf die –88 nt, die das Gen für das virale Nukleocapsid (N) flankieren, und am 3'-Ende durch die Restriktionsstelle DalI (GTCGAC) und eine der Kozak-Sequenz analoge Sequenz (AC)GACC. Im Prinzip ist dieses Expressionsniveau des heterologen Gens mehr als ausreichend, um eine Immunantwort zu induzieren. Das heterologe Gen wurde an der vorher durch die verzichtbaren Gene 3a und 3b des Virus besetzten Position eingefügt.
1.6 Induktion einer Immunantwort in Schweinen gegen ein Antigen, das mit dem von der cDNA abstammenden Virusvektor exprimiert wurde
Unter Benutzung des gleichen Typs Virusvektor, der von der cDNA und den oben beschriebenen TRS abstammte, wurde das für grünes fluoreszierendes Protein (GFP) kodierende Gen auf hohem Niveau exprimiert (20 μg Protein pro Million Zellen in Schweinehoden-(ST-)Zellen). Das Expressionsniveau war für mehr als 20 Passagen in der Zellkultur stabil. Weiterhin wurden Schweine mit dem Lebendvirusvektor immunisiert, der auf oralem, intranasalen und intragastrischen Weg verabreicht wurde, und eine starke humorale Immunantwort wurde sowohl gegen den Virusvektor als auch das GFP detektiert. Interessanterweise wurden in den geimpften Tieren nach der Administration von drei Dosen des Virusvektor keine Nebenwirkungen beobachtet.
1.7 Konstruktion eines sicheren Virusvektors, der das fremde Gen exprimiert, ohne zu der Herstellung infektiösen Virus zu führen.
Für die Entwicklung von Vektoren für Menschen ist biologische Sicherheit eine Priorität. Um dieses Ziel zu erreichen, werden drei Arten von Sicherheitsmechanismen in den Vektor eingebaut. Zwei davon basieren auf der Deletion zweier Viruskomponenten, die sich an unterschiedlichen Positionen des Virusgenoms befinden und essentiell für die Replikation des Virus sind. Diese Komponenten werden in trans von einer Verpackungszelllinie bereitgestellt. Diese Zelle (Baby Hamster Kidney, BHK) exprimiert die fehlenden TGEV-Gene, die für essentielle strukturelle Proteine des Virus kodieren (die Hüllen(envelope) E und Membran- M Proteine). Der dritte Sicherheitsmechanismus ist die Re-Lokalisierung des Verpackungssignals des Virusgenoms, so dass die Wiederherstellung eines infektiösen Virus durch Rekombination verhindert wird, was zur Herstellung eines Selbstmordvektors führt, der die heterologen Gene effizient exprimiert, aber ungeeignet ist, um sich selbst zu der dichtesten Nachbarzelle fortzupflanzen.
Mit dem Entwurf des neuen Vektors für die Verwendung im Menschen stellen wir keinen neuen Virus her, der sich innerhalb der menschlichen Art fortpflanzen könnte, da dieser Vektor nicht im Menschen von Zelle zu Zelle übertragen werden kann. Der Vektor basiert auf einem replikationsdefizienten Virus. Er kann nur in der Impfstofffabrik gezüchtet werden, indem Verpackungszellen verwendet werden, welche die Deletionen des Virus komplementieren. Dieses Sicherheitsmechanismen stellen neue Verfahren bei der künstlichen Herstellung von Coronaviren dar. Der rekombinante Virus mit einem neuen Tropismus wird mindestens in felinen Zellen repliktionskompetent sein, da sich in diesen Zellen Humane, Porcine, Canine und Feline Coronaviren replizieren.
HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN:
Das von Escherichia coli abstammende Bakterium, welches das Plasmid mit dem infektiösen erfindungsgemäßen Klon trägt und als Escherichia coli pBAC-TcDNA^FL identifiziert ist, wurde bei der Spanish Collection of Type Cultures (CECT), Burfassot (Valencia), am 24. November 1999 unter der Registrationsnummer CECT 5265 hinterlegt.
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Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Herstellung einer DNA, die Sequenzen umfasst, welche von der genomischen RNA (gRNA) eines Coronavirus abstammen, wobei die Sequenzen eine Homologie von mindestens 60 % zu der natürlichen Sequenz des Virus aufweisen und für eine RNA-abhängige RNA-Polymerase und mindestens ein Struktur- oder Nicht-Strukturprotein kodieren, wobei ein Fragment dieser DNA in der Lage ist, in RNA transkribiert und zu einem Virion zusammengesetzt zu werden, wobei das Verfahren Schritte umfasst, bei denen man ein interferierendes unvollständiges Genom eines Coronavirus unter die Expressionskontrolle eines Promotors in ein künstliches Bakterienchromosom ("bacterial artificial chromosome", BAC) kloniert und die innerhalb des unvollständigen Genoms deletierten Sequenzen in das Genom re-inseriert.
Verfahren zur Herstellung einer DNA gemäß Anspruch 1, bei dem Sequenzen innerhalb des viralen Genoms vor Re-Insertion in die DNA identifiziert werden, welche für die Bakterien, in denen die Klonierung erfolgt, toxisch sind.
Verfahren zur Herstellung einer DNA gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem die toxischen Sequenzen innerhalb des viralen Genoms die letzten Sequenzen sind, welche bei der Vervollständigung des Genoms re-inseriert werden.
Verfahren zur Herstellung einer DNA gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem man einen infektiösen Klon erhält, der eine Kopie vollständiger Länge der komplementären DNA (cDNA) zu der genomischen RNA (gRNA) eines Coronavirus umfasst, welcher mit einer die Transkription regulierenden Sequenz kloniert wurde, wobei das Verfahren Schritte umfasst, bei denen man die cDNA vollständiger Länge aus der gRNA des Coronavirus erstellt und die Elemente, welche die Transkription regulieren, mit der cDNA vollständiger Länge verknüpft.
Verfahren zur Herstellung einer DNA gemäß Anspruch 4, bei dem die Herstellung der cDNA vollständiger Länge aus der gRNA eines Coronavirus Schritte umfasst, bei denen man: (i) ein von einem Coronavirus abstammendes, interferierendes unvollständiges Genom unter die Kontrolle eines Promotors für die Expression in einen BAC kloniert; (ii) die Deletionen in dem interferierenden unvollständigen Genom vervollständigt, indem man die deletierten Sequenzen der infektiösen gRNA regeneriert; (iii) die Sequenzen innerhalb des Coronavirus identifiziert, welche für die Bakterien, in denen es kloniert werden soll, toxisch sind, die toxischen Sequenzen entfernt und die toxischen Sequenzen unmittelbar vor der Transfektion in eukaryotische Zellen inseriert, um einen cDNA-Klon zu erhalten, welcher der gRNA eines Coronavirus entspricht.
Infektiöser Klon, welcher eine Kopie vollständiger Länge der zu der genomischen RNA (gRNA) komplementären DNA (cDNA) eines Coronavirus umfasst und mit einer die Transkription regulierenden Sequenz kloniert wurde.
Infektiöser Klon gemäß Anspruch 6, in dem das Coronavirus ein Isolat des Porcine Transmissible Gastroenteritis-Virus (TGEV) ist.
Infektiöser Klon gemäß Anspruch 6 oder 7, in dem der Promotor der Immediately Early (IE) Promotor für die Expression des Zytomegalovirus (CMV) ist.
Infektiöser Klon gemäß irgendeinem der Ansprüche 6 bis 8, in dem die cDNA vollständiger Länge an ihrem 3'-Ende durch ei nen poly(A)-Schwanz, dem Ribozym des Hepatitis Delta Virus (HDV) und den Terminations- und Polyadenylierungssequenzen des bovinen Wachstumshormons (BGH) flankiert ist.
Infektiöser Klon gemäß irgendeinem der Ansprüche 6 bis 9, in dem die infektiöse cDNA in ein künstliches Bakteriumchromosom kloniert ist (BAC).
Infektiöser Klon gemäß irgendeinem der Ansprüche 6 bis 10, indem die infektiöse cDNA aus dem künstlichen Bakteriumchromosom (BAC) eines E. coli erhältlich ist, welches unter der Zugriffsnummer CECT 5265 bei der Spanish Collection of Type Cultures hinterlegt wurde.
E. coli, das unter der Zugriffsnummer CECT 5265 bei der Spanish Collection of Type Cultures hinterlegt wurde.
Rekombinanter viraler Vektor, der einen infektiösen Klon gemäß Anspruch 6 umfasst, welcher durch Insertion einer heterologen Nukleinsäuresequenz in den infektiösen Klon verändert wurde, wobei die Bedingungen verwendet wurden, welche die Expression der heterologen Nukleinsäure ermöglichen.
Rekombinanter viraler Vektor gemäß Anspruch 13, in dem die heterologe Nukleinsäure aus einem Gen und einem Genfragment, welches für das ausgewählte Genprodukt kodiert, ausgewählt wird.
Impfstoff zum Schutz eines Tiers gegen eine Infektion, die durch ein infektiöses Agens verursacht wird, umfassend (i) mindestens einen rekombinanten viralen Vektor gemäß Anspruch 13, wobei der virale Vektor entweder mindestens ein Antigen, das zur Induktion einer Immunreaktion gegen das infektiöse Agens geeignet ist, oder einen Anti körper exprimiert, welcher Schutz gegen das infektiöse Agens verleiht, zusammen mit, gegebenenfalls, (ii) einem pharmazeutisch verträglichen Trägermittel.
Impfstoff gemäß Anspruch 15, in dem der virale Vektor mindestens ein Antigen exprimiert, das in der Lage ist, eine systemische Immunreaktion und/oder eine Immunreaktion in Schleimhäuten gegen verschiedene infektiöse Agenzien zu erzeugen, welche sich in respiratorischen oder intestinalen Schleimhäuten vermehren.
Impfstoff gemäß Anspruch 15 oder 16, wobei der Impfstoff ein multivalenter Impfstoff zum Schutz gegen eine Infektion ist, welche durch mehr als ein infektiöses Mittel verursacht wird.
Multivalenter Impfstoff gemäß Anspruch 17, welcher unabhängige rekombinante virale Vektoren zur Vermischung und gemeinsamen Inokulation umfasst, wobei jeder der rekombinanten viralen Vektoren mindestens ein verschiedenes Antigen oder einen verschiedenen Antikörper exprimieren.