[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CZ20021882A3 - Infekční klony - Google Patents

Infekční klony Download PDF

Info

Publication number
CZ20021882A3
CZ20021882A3 CZ20021882A CZ20021882A CZ20021882A3 CZ 20021882 A3 CZ20021882 A3 CZ 20021882A3 CZ 20021882 A CZ20021882 A CZ 20021882A CZ 20021882 A CZ20021882 A CZ 20021882A CZ 20021882 A3 CZ20021882 A3 CZ 20021882A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
dna
infectious
coronavirus
virus
rna
Prior art date
Application number
CZ20021882A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ302785B6 (cs
Inventor
Sanchez Luis Enjuanes
Original Assignee
Consejo Superior De Investigaciones Cientificas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8310818&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ20021882(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Consejo Superior De Investigaciones Cientificas filed Critical Consejo Superior De Investigaciones Cientificas
Publication of CZ20021882A3 publication Critical patent/CZ20021882A3/cs
Publication of CZ302785B6 publication Critical patent/CZ302785B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A61K39/225—Porcine transmissible gastroenteritis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/20043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/20062—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
    • C12N2800/204—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of bacterial origin, e.g. BAC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

···· ·· ·· ···· ·· ·· • · · ··· ···· • · · ····· ·· · • · · · · · · ···
·· ·· ·· ··· ·· MM
Infekční klony Oblast techniky
Tento vynález se vztahuje ke způsobům přípravy DNA nebo RNA, k nukleovým kyselinám, které lze těmito způsoby získat, k jejich použití jako vakcin a pro genovou terapii.
Dosavadní stav techniky
Rozvoj v technologii rekombinantní DNA vedl k pokroku ve vývoji přenosu genů mezi organismy. Současně bylo vyvinuto velké úsilí vyrobit chemické, farmaceutické a biologické produkty, ekonomicky i komerčně zajímavé, použitím způsobů genového přenosu.
Jedním z klíčových prvků při genetické manipulaci prokaryontních i eukaryontních buněk je vyvinutí vektorů a systémů vektor - hostitel. Vektor je obecně molekulou nukleové kyseliny, která je schopná replikace nebo exprese v hostitelské buňce. Systém hostitel - vektor může být definován jako hostitelská buňka, která obsahuje vektor a umožňuje replikaci a expresi genetického materiálu, obsaženého ve vektoru.
Vektory jsou vyvinuty z virů, s DNA i RNA genomy. Virové vektory odvozené od DNA virů, které se replikují v jádře hostitelské buňky, mají nevýhodu v tom, že jsou schopné se začlenit do genomu jmenované buňky, tudíž obecně nejsou příliš bezpečné. Virové vektory, odvozené od RNA virů, které se replikují v cytoplasmě hostitelské buňky, jsou naopak bezpečnější, než vektory, odvozené od DNA virů, protože jejich replikace probíhá prostřednictvím RNA mimo jádro. U těchto vektorů je tudíž velmi nepravděpodobné jejich začlenění do genomu hostitelské buňky.
Byly získány cDNA klony z jednořetězcových RNA virů s positivní polaritou [ssRNA(+)J, například, pikornavirus (Racaniello & Baltimore, 1981); bromovirus (Ahlquist et al., 1984); alfavirus, rod obsahující Sindbis virus; Semliki Forest virus (SFV) a virus venezuelské koňské encefalitidy (VEE) (Rice et al., 1987); Liljestrom and Garoff, 1991; Frolov et al., 1996; Smerdou and Liljestrom. 1999); flavivirus a pestivirus (Rice and Strauss, 1981; Lai et al., 1996; Rice et al., 1989) a viry čeledi Astroviridae (Geigenmueller et al., 1997). Podobně byly vyvinuty vektory pro expresi heterologních genů z klonů DNA, komplementárních ke genomu ···· ·· ·· ···· ·· ·· • · · · · · ···«
2··· · · · · · · · I • · · * · · ··· · ·
• · · · · · · · · I ·· ·· Μ ··· ·· ···· viru ssRNA(+), například, alfaviru, včetně Sindic viru, Semliki Forest viru (SFV) a viru venezuelské koňské encefalitidy (VEE) (Frolov et al, 1996; Liljestrom, 1994; Pushko et al., 1997). Všechny způsoby přípravy rekombinantních virů vycházející z RNA virů jsou však stále komplikovány skutečností, že většina těchto virů obsahuje sekvence, které jsou toxické pro bakterie. Příprava cDNA z virové RNA a subklonování této cDNA v bakteriích tudíž často vede k deleci nebo přeskupení sekvencí DNA v bakteriálním hostiteli. Z těchto důvodů nemůže být většina všeobecně používaných subklonovacích a expresních vektorů použita pro přípravu větších úseků DNA odvozených od rekombinantních RNA virů. Získání vektorů, které právě nesou dlouhé sekvence cizí DNA, je však potřeba v mnoha aspektech vývoje léčiv, hlavně vakcín.
Koronaviry jsou ssRNA(+) viry, které představují nejdelší známý genom RNA viru, s délkou kolísající mezi 25 až 31 kilobasemi (kb) (Sidell, 1955; Lai & Cavanagh, 1997; Enjuanes et al., 1998). V průběhu infekce koronavirem se genomová RNA (gRNA) replikuje a je synthetisována sada subgenomových RNA kyselin (sgRNA) s positivní i negativní polaritou (Sethna et al., 1989; Sawicki and Sawicki, 1990; van der Most & Spaan, 1995). Synthesa sgRNA je mechanismus závislý na RNA, který probíhá v cytoplasmě infikované buňky, i když jeho přesný mechanismus není stále ještě znám.
Bylo popsáno sestrojení cDNA, které kódují defektní interferující genomy (Dl) (deleční mutanty, které vyžadují přítomnost komplementujícího viru pro svou replikaci a transkripci) některých koronavirů, tak jako virus myší žloutenky (murine hepatitis virus (MHV)). Virus infekční bronchitidy (IBV), hovězí koronavirus (BCV) (Chang et al., 1994) a virus prasečí gastroenteritidy (TGEV) (španělská patentová přihláška P 9 600 620; Mendez et al., 1996; Izeta et al., 1999; Hanchez et al., 1999). Konstrukce klonu cDNA, který kóduje kompletní genom koronavirů, nebyla ještě možná, v důsledku velké délky a toxických sekvencí v rámci genomu koronavirů.
Souhrnem, i když byl isolován velký počet virových vektorů, určených pro replikaci a expresi heterologních nukleových kyselin v hostitelských buňkách, není většina známých vektorů pro expresi heterologních genů vhodná pro subklonování RNA virů. Dále, takto získané virové vektory mají omezení v důsledku nedostatku druhové specifity a omezení v cílových orgánech nebo tkáních a v jejich omezené kapacitě pro klonování, což omezuje možnosti jejich použití v základním i aplikovaném výzkumu. 3 ···· ·· ·· ♦♦·· ·· ·· • · · * · · ·*·· • · · ····· « « « ·· ··· · · · · · · ···· ·· · ··· Μ ·· #· ··· ·· ····
Existuje tedy potřeba způsobů, jak vyvinout nové vektory pro expresi heterologních genů, které překonávají shora uvedené problémy. Hlavně by bylo výhodné, kdybychom měli velké vektory pro expresi heterologních genů s vysokou úrovní bezpečnosti a klonovací kapacity, které lze sestrojit tak, že může být kontrolována jejich druhová specifita a tropismus.
Podstata vynálezu
Podle předkládaného vynálezu jsou shora uvedené problémy řešeny způsobem přípravy DNA, sestávající z kroků, kde (a) DNA obsahující úplnou délku kopie genomové RNA (gRNA) od RNA viru nebo (b) DNA obsahující jeden nebo více fragmentů gRNA od RNA viru, kde tyto fragmenty kódují RNA dependentní RNA polymerasu a nejméně jeden strukturní nebo nestrukturní protein nebo (c) DNA homologní z nejméně 60 % k sekvenci podle (a) nebo (b); je klonována do bakteriálního artificiálního chromosomu (BAC). Předkladatelé vynálezu překvapivě objevili, že problémy spojovaném předchozích způsobů řešení se subklonováním a expresí velkých sekvencí DNA, odvozených od virové gRNA, mohou být překonány použitím BAC jako klonovacího vektoru. Použití BAC mělo hlavně výhodu v tom, že tyto vektory jsou přítomné v bakteriích v jedné nebo dvou kopiích na buňku, což významně omezuje toxicitu a snižuje možnosti interplasmidové rekombinace.
Vynález dále poskytuje způsoby přípravy virové RNA nebo virionu, zahrnující kroky přípravy DNA podle jednoho ze shora uvedených způsobů, exprese DNA a isolace virové RNA nebo virionu. Jsou také zahrnuty způsoby přípravy léčiv, hlavně vakcín, obsahující kroky shora uvedených způsobů přípravy DNA. V souhlase s dalším aspektem předkládaný vynález poskytuje DNA obsahující sekvence odvozené od genomové RNA (gRNA) koronaviru, jehož sekvence jsou nejméně z 60 % homologní s přírodními sekvencemi koronaviru a kódují RNA dependentní RNA polymerasu a nejméně jeden strukturní nebo nestrukturní protein, přičemž fragment této DNA je schopen transkripce do RNA, která může být zapojena do virionu. Předkládaný vynález také zahrnuje způsoby preparace příslušných molekul DNA. Předkládaný vynález dále poskytuje vektory, přesněji uvedeno bakteriální artificiální chromosomy (BAC), obsahující příslušné nukleové kyseliny. V souhlase s dalším uspořádáním je předkládaný vynález zaměřen na hostitelské buňky a na infekční, zeslabené nebo inaktivované viry, obsahující molekuly DNA nebo RNA podle předkládaného vynálezu.
Tento vynález také poskytuje farmaceutické přípravky, jako mono nebo multivalentní vakcíny, zahrnující nukleové kyseliny, vektory, hostitelské buňky nebo viriony podle předkládaného vynálezu. Předkládaný vynález poskytuje způsoby výroby virionu nebo virové RNA, zahrnující kroky, ve kterých je DNA podle předkládaného vynálezu transkribována a jsou získány viriony nebo molekuly virové RNA, rovněž jako virové RNA, získatelné tímto způsobem.
Popis obrázků na výkresech
Obrázek 1 ukazuje sestrojení cDNA klonu, který kóduje infekční RNA od TGEV. Obrázek 1A ukazuje genetickou strukturu TGEV, se jmény genů vyznačenými písmeny a čísly (Ia, lb, S, 3 a, 3b, E, Μ, N a 7). Obrázek lb ukazuje cDNA klonovací strategii, která je konsistentní v kompletaci DI-C genomu. Jsou vyznačeny delece Δΐ, Δ2 a Δ3, které mají být kompletovány, aby vznikla úplná délka řetězce. Čísla umístěná pod strukturou genomu DI-C genomu označují nukleotidy, které obklopují každou deleci v DI-C genomu. Obrázek lc ukazuje čtyři fragmenty cDNA, sestrojené pro kompletaci delece Δ1 a umístění rozhodujících restrikčních míst v průběhu spojování. Inserce fragmentu Δ1 způsobila zvýšení toxicity cDNA.
Obrázek 2a ukazuje strukturu plasmidu pBeloBAC (Wang et al., 1997) použitého při klonování infekční cDNA od TGEV. Plasmid pBeloBAC byl poskytnut H. Shimuza a M. Simon (California Institute of Technology) a obsahuje 7507 párů basí (bp), které obsahují počátek replikace F faktoru od E. coli (oriS), genů nezbytných pro zachování jednotlivé kopie plasmidu na buňku (parA, parB, parC a repE) a genu resistence vůči chloramfenikolu (CM1). Jsou vyznačeny posice promotorů T7 a SP6 a jedinečná restrikční místa. CosN: místo cosN od lambda pro usnadnění sestrojení plasmidu pBAC; lac Z: gen β-galaktosidasy. Je také vyznačena sekvence loxP, použitá v průběhu tvorby plasmidu.
Obrázek 3 ukazuje strukturu základního plasmidu, použitého při konstrukci TGEV cDNA. Plasmid pBAC-TcDNAACIaI obsahuje všechny informace o TGEV RNA, s výjimkou jednoho fragmentu Clal-Clal o velikosti 5198 bp. Tato cDNA byla klonována s bezprostředně počátečním (IE) promotorem exprese cytomegaloviru (CMV) a sousedí na 3' konci s poly(A) sekvencí, tvořenou 24 zbytky A, ribozymem delta viru hepatitidy (HDV) a terminačními a polyadenylačními sekvencemi hovězího růstového hormonu (BGH). Plasmid pBAC-B+C+D5'obsahuje fragment Clal-Clal, potřebný pro ukončení pBAC-TcDNAFL, jakmile dosáhne cDNA úplné délky. Plasmid pBAC-TcDNAFL obsahuje plnou délku cDNA od TGEV. SAP: krabí alkalická fosfatasa.
Obrázek 4 ukazuje rozdíly mezi nukleotidovou sekvencí S genu klonu TGEV PUR46-MAD v (MAD) a Cl 1. Čísla označují polohy substituovaných nukleotidů, označovaných jako nukleotid jedna každého z genů A iniciačního kodonu. Písmena uvnitř závorek označují odpovídající nukleotid ve vyznačené posici. Písmena umístěná pod závorkou označují aminokyselinové (aa) substituce, kódované nukleotidy,které jsou kolem označené posice. Δ6 nt označuje deleci 6-nukleotidu. Šipka označuje posici terminačního kodonu u genu S.
Obrázek 5 ukazuje strategii použitou pro zachování infekčního TGEV z celkové délky TGEV cDNA. Plasmid pBAC-TcDNAFL byl přenesen do buněk ST (buňky prasečích varlat) a supernatant byl 48 hodin po transfekci použit pro infekci nových ST buněk. Virus byl množen dle vyznačeného času. V každé pasáži byly spojeny alikvoty supernatantu a buněčné monovrstvy pro titraci viru a nebo isolaci RNA pro RT-PCR analysu. vgRNA: virová RNA o celkové délce.
Obrázek 6 ukazuje cytopathický efekt (CPE) vyvolaný TGEV cDNA v transfektovaných ST buňkách. Nepřítomnost CPE v netransfektovaných (kontrolních) ST buňkách (obrázek 6A) a CPE pozorovaný v 14 a 20 hodinách po transfekci s pBAC-TcDNAFL v ST buňkách jsou uvedeny na obrázku 6B, případně 6C.
Obrázek 7 ukazuje vývoj titru viru ve spojení s pasáží. Je uveden graf, představující titr viru v supernatantu dvou sérií celulárních monovrstev (1 a 2) v různých pasážích po transfekci ··♦· ♦· ·· ···· ·* ·· • · * · t· t · * · ··· · · · · · · · · , ···**· ····· 0 ♦····· ···» ·· ·· ·· ··· ·· ····
s pABC-TcDNAFL . Mock 1 a Mock 2 označují netransfektované ST buňky. TcDNA 1 a 2 označují ST buňky, transfektované s pBAC-TcDNAFL
Obrázek 8 ukazuje výsledky analysy sekvence viru získaného po transfekci ST buněk s pBAC-TcDNAfl. Struktura genomu TGEVje označena na horní straně obrázku. Podobně jsou označeny rozdíly v sekvenci nukleotidů (genetické markéry) mezi virem získaným z plasmidu pBAC-TcDNAFL (TcDNA) a klony TGEV C8 a Cl 1. Posice rozdílů mezi nukleotidy jsou označeny čísly, umístěnými nad sloupečkem.Sekvence cDNA viru TcDNA a klonu Cl 1 jsou určeny sekvenováním fragmentů získaných RT-PCR (reversní transkripce a polymerasová řetězcová reakce). Sekvence klonu C8 je právě zaslána k publikaci (Penzes et al., 1999) a je zahrnuta na konci tohoto patentu. Restrikční diagramy jsou uvedeny na Clal a DralII, fragmentech získaných pomocí RT-PCR, které obsahují nukleotidy 18 997 a 20 990 od TcDNA a C8 virusů. Restrikční diagramy ukazují přítomnost nebo nepřítomnost míst Clal nebo DralII v cDNA u těchto virusů. Výsledek této analysy ukázal, že získaný TcDNA virus měl sekvenci S-genu, očekávanou u isolátu Cil. MWM: markéry molekulové hmotnosti.
Obrázek 9 ukazuje výsledky RT-PCR analysy získaného viru. Virová RNA byla exprimována za kontroly CMV promotoru, rozpoznaného celulámí polymerasou pol II. V zásadě by tato RNA v průběhu jejího transportu do cytoplasmy podlehla rozštěpení. Aby byl prostudován tento případ, byla určena místa v RNA s vysokou pravděpodobností štěpení, použitím programu pro predikci štěpných míst v sekvencích lidské DNA (Version 2.1.5.94, Department of Cell Biology, Baylor College of Medicine) (Solovyev et al., 1994). Potenciální štěpná místa s maximem pravděpodobnosti štěpení, měla donorové místo při nt7243 a dárcovské při nt 7570 (obrázek 9A). Pro zjištění, zda tato oblast podléhá štěpení. Byl připraven RT-PCR sousední fragment při nt 7078 a nt 7802 (obrázek 9B) z RNA z pasáže 0 a 2 z netransfektovaných kultur (kontroly) nebo z buněk transfektovaných s TcDNA s fragmentem Clal s obrácenou orientací (TcDNAFL('AClaI)RS) nebo se správnou orientací (TcDNAFL) a výsledné produkty z RT-PCR byly analysovány na agarosovém gelu. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 9C (pasáž 0) a 9D (pasáž 2).
Obrázek 11 ukazuje expresi GUS v jiných transkripčně-regulačních sekvencích (TRSs), které se liší v sousedních sekvencích 5' intergenní (IG) sekvence. Minigenom M39 byl klonován za kontroly promotoru CMV. Do tohoto minigenomu byla insertována násobná klonovací sekvence (PL1, 5'-CCTAGGATTTAAATCCTAAGG-3' ;SEQ ID NO:2) a transkripční ···· tf ·# ··«« #* ·· • · * * · # ···· _ ····*··· · * ♦ 7 ♦····· «···· ····»· «··· ·♦ «9 ·· 999 99 9999 jednotka, tvořená vybranými transkripčně-regulačními sekvencemi (TRS), jinou násobnou klonovací sekvencí (PL2, 5' - GCGGCCGCGCCGGCGABBCCTGTCGAC-3'; SEQ ID NO:2 nebo PL3, 5'-GTCGAC-3'; SEQ ID NO:3), sekvencemi se strukturou Kozákovy (Kz) oblasti, genem (GUS) β-glukuronidasy a jiným násobným klonovacím místem (PL4, 5' -GCTAGCCCAGGCGCGCGATACC-3'; SEQ ID NO:5). Tyto sekvence1 sousedily na 3'-konci se 3'sekvencí minigenomu M39, ribozymemHDV a terminačními apolyadenylačními sekvencemi BGH. TRS měla různý počet (0, až 3, až 8 a až 88) nukleotidů na 5' konci sekvence IG (CUAAAC) a pocházela z N, S nebo M genů, jak je vyznačeno. ST buňky byly transfektovány s různými plasmidy, byly infikovány s komplementárními viry (PUR46-MAD) a supernatanty byly 6násobně pasážovány. Aktivita GUS v infikovaných buňkách byla určena pomocí způsobu, popsaného Izetou (Izeta et al., 1999). Výsledky, získané porovnáním GUS aktivity s počtem pasáží, jsou uvedeny na obrázku 1 lb.
Obrázek 12 ukazuje expresi GUS za různých TRS, které se liší v sousední 3'oblasti sekvence IG (viz obrázek 11A). Použitím transkripční jednotky se sousední 3' oblastí odpovídající -88 nt genu N TGEV a IG sekvenci (CUAAAC) byla modifikována 3' sousední sekvence.
Sekvence odpovídaly sekvencím od jiných TGEV genů (S, 3a, 3b, E, Μ, N a 7), jak je uvedeno v tabulce 12A. Ve dvou případech byly 3' - sekvence nahrazeny jinými, které obsahovaly restrikční místo (Sáli) a optimalizovanou Kozákovu sekvenci (Kz) nebo sekvenci identickou se sekvencí, která následuje první sekvenci IG, lokalizovanou za začátkem virového genomu. Aktivita GUS v infikovaných buňkách byla určena pomocí způsobu popsaného shora (Izeta et al., 1999). CL12 označuje sekvenci o 12 nukleotidech, identickou se sekvencí 3 'konce začáteční sekvence TEGV genomu (viz sekvenci viru uvedenou na konci). Výsledky získané s ohledem na expresi GUS ve vztahu k počtu pasáží jsou uvedeny na obrázku 12B.
Obrázek 13 ukazuje vliv místa inserce expresního modulu v minigenomu nad hladinami GUS exprese. GUS transkripční jednotka, obsahující-88 ntN genu sousedícího 5' konce sekvence IG (CUAAAC) a Kz sekvence sousedící s 3' koncem (viz obrázek 12A), byla inserována do čtyřech restrikčních míst v minigenomu M39 (obrázek 13A), aby bylo určeno, jestli všechna tato čtyři místa jsou stejně přístupná pro expresi heterologního genu. ST buňky byly transfektovány těmito plasmidy a infikovány komplementárním virem (PUR46-MAD). GUS 1 1 Je třeba poznamenat, že CTAAAC a CUAAC mají stejný význam ve vztahu k tomuto patentu. První označuje sekvenci DNA a druhý sekvenci odpovídající RNA. 8 ··«· · · • · » · • · · «· ·*·· ·· Μ • ♦ · * · · • ··* · I · • · · · · * • · · I · # ·* ··· ·· ···· aktivita byla v infikovaných buňkách stanovena při pasáži 0 (PO) podle způsobu popsaného shora (Izeta et al., 1999). Získané výsledky jsou uvedeny na obrázku 13B. V souhlasu s předkládaným vynálezem jsou poskytnuty způsoby přípravy DNA, obsahující kroky, v nichž je (a) DNA obsahující kopii celé délky genomové RNA (gRNA) od RNA viru nebo (b) DNA obsahující jeden nebo více fragmentů gRNA od RNA viru, které kódují RNA dependentní RNA polymerasu a nejméně jeden strukturní nebo nestrukturní protein nebo (c) DNA homologní z nejméně 60 % se sekvencemi podle (a) nebo (b) klonována do bakteriálního artificiálního chromosomu (BAC). V souhlase s předkládaným přihláškou vynálezu je „bakteriální artificiální chromosom“ DNA sekvencí, obsahující sekvenci F faktoru. Plasmidy obsahující tyto sekvence, tak zvané F plasmidy, jsou schopné stabilního udržování heterologních sekvencí delších než 300 Kb v nízkém počtu kopií (jedna nebo dvě kopie na buňku). Případné BAC jsou v oboru známy (Shizuya et al., 1992). V souhlase s předkládaným vynálezem je DNA, klonovaná do BAC, homologní nejméně z 60 %, výhodně z 70 %, výhodněji z 85% nebo 95 % s přírodní sekvencí z RNA viru. Sekvenční homologie je výhodně určena použitím Clustal Computer program, dostupného v European Bioinformatics Institute (EBI).
Podle způsobu předkládaného vynálezu může DNA, klonovaná v BAC, dále obsahovat sekvence, kódující několik nebo všechny s výjimkou jednoho strukturálního nebo nestrukturálního proteinu viru.
Ve výhodném uspořádání předkládaného vynálezu DNA klonovaná v BAC obsahuje dále sekvence kódující jeden nebo několik heterologních genů. Podle předkládaného vynálezu je gen označen jako „heterologní gen“, jestliže není odvozen od viru, který byl použit jako zdroj genů kódujících RNA polymerasu dependentní na RNA a strukturální nebo nestrukturální protein. “Heterologní gen“ označuje tudíž také geny, odvozené od jiného typu viru a t··· ·♦ ·· ···♦ «· ·· • · · ··· · » · · • · · · ♦ ·♦· « · · Λ ······ ····· y ···#·· ···· ·· ·· ·· ··« ·· ··*· exprimované ve vektoru, který obsahuje sekvence odvozené od jiného typu viru. Libovolný žádoucí heterologní gen může být inserován do nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu. Inserce genů, kódujících jeden nebo několik peptidů nebo proteinů, které jsou imunitním systémem savců rozpoznávány jako antigen infekčního činidla, jsou obzvláště výhodné. Případně může být způsob podle předkládaného vynálezu proveden použitím heterologních genů, kódujících nejméně jednu molekulu, interferující s replikací infekčního činidla nebo protilátku, poskytující ochranu proti infekčnímu činidlu. Heterologní sekvence mohou obsahovat sekvence, kódující modulátor imunity, cytokin, zesilovač imunity a/nebo protizánětlivou sloučeninu.
Způsob předkládaného vynálezu může být proveden použitím DNA, klonované v BAC, která má libovolnou velikost. Jsou však známy specifické výhody známých způsobů přípravy subklonované DNA z virů, při použití velkých sekvencí. DNA, klonovaná v BAC, může tedy obsahovat délku nejméně 5 kb, přičemž velikosti DNA nejméně 15, 25 nebo 30 kb jsou specificky výhodné.
Podle specificky výhodného provedení předkládaného vynálezu jsou poskytnuty způsoby, kdy BAC obsahuje sekvenci, kontrolující transkripci cDNA, klonované v BAC. Toto může umožnit transkripci virové RNA a tedy usnadnit expresi viru. Pro tento účel může být použita jakákoliv sekvence, kontrolující transkripci viru známá v oboru, včetně sekvencí, řídících expresi genů, odvozených od DNA nebo RNA genomů. Použití IE promotoru cytomegaloviru (CMV) je výhodné. DNA klonovaná v BAC může také sousedit na 3' konci s poly(A) řetězcem. Nukleová kyselina může obsahovat terminační a nebo polyadenylační sekvence hovězího růstového hormonu (BGH). Kromě toho nebo případně, mohou nukleové kyseliny obsahovat sekvence kódující ribozym, například ribozym δ viru hepatitidy (HDV).
Dalších výhod lze dosáhnout, jestliže nejméně jeden z genů viru byl modifikován substitucí, delecí nebo přidáním nukleotidů. Například, gen kontrolující tropismus viru, může být modifikován tak, aby byl získán virus se změněným tropismem. Jiným způsobem může být gen, kontrolující tropismus viru, substituován případným genem jiného viru. Modifikace je výhodně provedena v S, M a nebo N genech viru. 10 10 ·· »«·*. • * · * » · » · • · · ♦ • · ♦
• · «· • · • ·
Ve výhodném uspořádání předkládaného vynálezu je poskytnut způsob , kdy DNA, klonovaná v BAC, je schopná transkripce do RNA, která je může být zabudována do virionu. Tímto virionem může být infekční, zeslabený, replikačně defektní nebo inaktivovaný virus.
Libovolný RNA virus může být použit ve způsobech podle tohoto vynálezu. Tímto virem může být například pikornavirus, flavivirus, togavirus, koronavirus, toroviry, arteriviry, kalcivirus, rhabdovirus, paramixovirus, filovirus, bornavirus, orthomyxovirus, bunyavirus, arenavirus nebo reovirus. Použití virů, které přirozeně mají plus vláknový genom, je výhodné.
Kromě toho poskytuje předkládaný vynález způsoby přípravy virové RNA nebo virionu, obsahující kroky, při nichž je DNA připravena v souhlase s některým ze shora popsaných způsobů, je exprimována ve vhodné hostitelské buňce a virová RNA nebo virion jsou isolovány z hostitelské buňky. Lze použít libovolný způsob isolace virů z hostitelské buňky, který je znám v oboru. Jsou také popsány způsoby přípravy virové RNA nebo virionu, kde je DNA podle předkládaného vynálezu transkribována nebo translatována použitím chemických, biologických činidel a nebo buněčných extraktů a RNA nebo virion jsou následně isolovány. V určitých uspořádáních může být virus následně inaktivován nebo usmrcen.
Vynález také poskytuje způsoby přípravy farmaceutických prostředků obsahujících kroky, kde jsou DNA, virová RNA nebo virion připraveny podle shora uvedených způsobů a následně smíseny s farmaceuticky přijatelným adjuvanciem a/nebo nosičem. Je znám velký počet nosičů a adjuvancií a plnidel a může být použit v souladu s předkládaným vynálezem. Léčivo je výhodně vakcínou pro ochranu člověka před infekční chorobou. Léčivo může být výhodně použito pro genovou terapii. Předkládaný vynález dále poskytuje poprvé DNA, obsahující sekvence, odvozené od genomové RNA (gRNA) koronaviru, které mají homologii nejméně 60 % s přirozenou sekvencí koronaviru a kódují RNA polymerasu závislou na RNA a nejméně jeden strukturní nebo nestrukturní protein, přičemž fragment této DNA je schopný transkripce do RNA, která může být začleněna do virionu.
Podle předkládaného vynálezu je termín „sekvence odvozená od koronaviru“ použit pro označení sekvence nukleové kyseliny, která je nejméně z 60 %, výhodně nejméně z 75 % a výhodněji nejméně z 85 až 95 % homologní s přirozenou sekvencí koronaviru. Sekvenční • f«· • 9*· ** • * * % « • * * · • • 1 • • • • • • • · ♦ • • • · • • • · ♦ · • • • • • • ·· ·· • · »·» ·· • *9 · homologie může být určena pomocí Clustal Computer programu, dostupného v European Bioinformatics Institute (EBI).
Termín „koronavirus“ je použit v souladu s předkládaným vynálezem pro označení skupiny virů, které mají jednoduchou lineární molekulu, s positivním smyslem vlákna, ssRNA 25 až 33 kb. Tyto viry obvykle obsahují 7 až 10 strukturních genů, tj., genů, které kódují proteiny určující strukturu viru. Tyto geny jsou typicky uspořádány ve virovém genomu v pořadí 5' replikasa - (hemaglutinin esterasa) - vlákno-obálka-membrána - nukleoprotein - 3'. Kromě toho může virový genom obsahovat mnoho nestrukturálních genů, které kódují svazkovou sadu molekul RNA se společným 3' koncem a jsou rozsáhle neesenciální.
Termín „schopný transkripce do RNA, která může být začleněna do virionu“, je používán pro označení DNA sekvence, která, je-li jednou zavedena do vhodné hostitelské buňky, bude transkribována do RNA a bude tvořit viriony. Tyto viriony jsou výhodně infekční viry, ale mohou být inaktivovány, zeslabeny nebo mohou být replikačně defektní, obsahující zmíněnou RNA. Všechny informace pro expresi virionu jsou výhodně kódovány sekvencí DNA podle předkládaného vynálezu.
Nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou dále obsahovat sekvenci kódující jeden nebo několik heterologních genů, o které se zajímáme. Podle předkládaného vynálezu je gen charakterisován jako „heterologní gen“, jestliže není odvozen od koronaviru, který byl použit jako zdroj pro geny kódující RNA polymerasu závislou na RNA a strukturní nebo nestrukturní protein. „Heterologní gen“ tedy také označuje geny, odvozené od jednoho typu koronaviru a exprimované ve vektoru, obsahujícím sekvence odvozené od jiného typu koronaviru. Do nukleových kyselin podle vynálezu může být vložen libovolný požadovaný heterologní gen. Inserce genů, kódujících peptidy nebo proteiny, které jsou imunitním systémem savce rozpoznány jako antigen infekčního činidla, jsou zvláště výhodné.
Heterologní gen může tedy kódovat nejméně jeden antigen, vhodný pro indukci imunitní odpovědi proti infekčnímu činidlu, nejméně jednu molekulu interferující s replikací infekčního činidla nebo protilátku, poskytující ochranu proti infekčnímu činidlu. Jiným způsobem nebo navíc, může heterologní gen kódovat imunitní modulátor, cytokin, zesilovač imunity nebo protizánětlivou sloučeninu. 12 um ** ·»*· • ft #· • • t • • • • • • t • % • • # ·*» • • • • • • · • • ♦ · • • • * • • • » • • • • ·· ·· ·· ·«·
Fragment DNA podle předkládaného vynálezu, který je transkribován do RNA, má výhodnou velikost nejméně 25 kb. Hlavně výhodné jsou fragmenty o velikosti 30 kb. V souhlasu s výhodným uspořádáním předkládaného vynálezu obsahuje DNA dále sekvence odvozené od koronaviru, kódující několik nebo všechny s výjimkou jednoho ze strukturních nebo nestrukturních proteinů koronaviru. V jiném případě může DNA podle předkládaného vynálezu dále obsahovat sekvence, které kódují všechny strukturní nebo nestruktumí proteiny koronaviru.
Podle dalšího uspořádání, mohou nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu obsahovat sekvenci, kontrolující transkripci sekvence odvozené od gRNA koronaviru. Libovolná sekvence, kontrolující transkripci, známá v oboru, může být pro tyto účely použita, včetně sekvencí řídících expresi genů, odvozených od DNA nebo RNA genomů. Použití bezprostředně počátečního (IE) promotoru od cytomegaloviru (CMV) je výhodné.
Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může také sousedit na 3' konci s poly(A) sekvencí. Nukleová kyselina může obsahovat terminační a/nebo polyadenylační sekvence hovězího růstového hormonu (BGH). Kromě toho nebo také, mohou nukleové kyseliny obsahovat sekvence kódující ribozym, například ribozym δ viru hepatitidy (HDV).
Nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou také obsahovat sekvence, odvozené od libovolného koronaviru, například, odvozené od isolátu viru prasečí přenosné gastroenteritidy (TGEV), viru myší hepatitidy (MHV), viru infekční bronchitidy (IBV), hovězího koronaviru (BoCV), psího koronaviru (CcoV), liščího koronaviru (FcoV) nebo lidského koronaviru. Podle výhodného uspořádání je nukleová kyselina odvozena od viru přenosné gastroenteritidy.
Podle dalšího uspořádání předkládaného vynálezu jsou molekuly DNA podle předkládaného vynálezu částí plasmidu, výhodně částí bakteriálního artificiálního chromosomu (BAC). Předkládaný vynález dále uvádí hostitelské buňky, obsahující případné nukleové kyseliny nebo vektory. Hostitelské buňky mohou být eukaryontní nebo prokaryontní. Předkládaný vynález také poskytuje viriony, obsahující nukleovou kyselinu podle předkládaného vynálezu. 13 • · · · · · ««·· ·· • · • · «» · · · · • · · • · · · · Případné viriony mohou být, například isolovány z buněčných kultur, transfektovaných nebo infikovaných nukleovými kyselinami podle předkládaného vynálezu.
Podle dalšího provedení poskytuje předkládaný vynález způsoby výroby virionu nebo virové RNA, zahrnující kroky, v nichž je DNA podle tohoto vynálezu introdukována do hostitelské buňky, hostitelské buňky, obsahující tuto DNA, jsou kultivovány za podmínek umožňujících jejich expresi a virion nebo virová RNA jsou získány. Kromě toho, jsou poskytnuty způsoby výroby virionu nebo virové RNA, přičemž je DNA podle předkládaného vynálezu smísena in vitro s chemikáliemi, biologickými činidly a nebo buněčnými extrakty, za podmínek, umožňujících expresi této DNA a získání virionu nebo virové RNA. Předkládaný vynález také obsahuje viriony a virové RNA, které lze získat některým ze shora uvedených způsobů. Výhodné jsou viriony a RNA, které nesou heterologní geny. Takto získané viry mohou být ve formě infekčních, oslabených, replikačně defektních nebo inaktivovaných virů.
Tento virus může obsahovat také modifikované geny, například modifikované S, N nebo M geny. Ve specifickém uspořádání předkládaného vynálezu modifikace genů S, N nebo M, vede k zeslabenému viru nebo k viru se změněným tropismem.
Podle dalšího provedení poskytuje vynález farmaceutický přípravek, obsahující nukleové kyseliny nebo viriony podle předkládaného vynálezu. Podle výhodného provedení je tento přípravek vakcínou, schopnou ochrany živočicha proti nemocem, zapříčiněným infekčním agens. Vakcína může, například, obsahovat sekvence nejméně jednoho antigenu, schopného indukovat imunitní odpověď proti infekčnímu činidlu nebo protilátku, poskytující ochranu proti tomuto infekčnímu činidlu. Vakcína může obsahovat DNA, exprimující nejméně jednu molekulu interferující s replikací infekčního činidla. Vakcína může také obsahovat vektor, exprimující nejméně jeden antigen, schopný indukovat systémovou imunitní odpověď a/nebo imunitní odpověď v mukosních membránách proti různým infekčním činidlům, které se množí v respiračních nebo intestinálních mukosních membránách nebo jiných tkáních. Vakcína může také být multivalentní vakcínou, schopnou ochrany proti infekci, zaviněné více než jedním infekčním agens, která obsahuje více než jednu nukleovou kyselinu podle předkládaného vynálezu, přičemž každá z nich exprimuje antigen, schopný indukovat imunitní odpověď proti každému z uvedených infekčních agens nebo protilátky, které poskytují ochranu proti každému z uvedených infekčních činidel nebo jiných molekul, které interferují s replikací libovolného infekčního činidla. 14 14
• I · · · · ♦ ♦ ♦ • · · · · ·· ·· ♦ ♦ · ♦ · ♦ ·· ·
Vakcíny podle předloženého vynálezu mohou dále obsahovat libovolný farmaceuticky přijatelný nosič nebo plnivo, známé v současném stavu oboru. Předkládaný vynález dále poskytuje způsoby přípravy DNA podle předkládaného vynálezu, které zahrnují kroky, v nichž je interferující defektní genom, odvozený od koronaviru, klonován za exprese promotoru v BAC vektoru a delece v defektním genomu jsou opět reinserovány. Tento způsob může obsahovat kroky, v nichž jsou ve virovém genomu identifikovány toxické sekvence ještě dříve, než je provedena reinserce do zbývající genomové DNA. Je výhodné, když toxické sekvence ve virovém genomu jsou posledními sekvencemi, které jsou reinserovány před kompletováním genomu. Podle předkládaného vynálezu je tento způsob vhodný k získání infekčních klonů koronavirů, které jsou stabilní v bakteriích po nejméně 80 generací a poskytují tedy účinný klonovací vektor. Předkládaný vynález poskytuje vývoj infekčních klonů cDNA, odvozených od koronaviru (Almazan et al., 2000), rovněž jako vektorů, konstruovaných z těchto infekčních klonů, které také obsahují sekvence heterologní nukleové kyseliny, vložené do těchto klonů. Infekční klony a vektory, poskytované tímto vynálezem, mají mnoho použití v jak základním, tak i v aplikovaném výzkumu, rovněž jako vysokou klonovací kapacitu a mohou být upraveny tak, že jejich druhová specifita a tropismus mohou být snadno kontrolovány.
Tento patent popisuje vývoj způsobu, který umožnil, poprvé v historii koronaviru, získat klon s úplnou délkou infekční cDNA, který kóduje genom koronaviru (Almazan et al., 2000).
Byl vyvinut nový vektor nebo systém exprese heterologních nukleových kyselin, založený na koronaviru, vytvořený z klonu infekční cDNA, která kóduje genomovou RNA (gRNA) koronaviru. V hlavním uspořádání tohoto vynálezu je koronavirus virem prasečí přenosné gastroenteritidy (TGEV).
Nový systém exprese může být použit v základním nebo v aplikovaném výzkumu, například, pro získání požadovaných produktů (proteinů, enzymů, protilátek, apod.), jako vakcinační vektor nebo v genové terapii u člověka i u živočichů. Infekční koronavirus, získaný z infekčního klonu cDNA, může být manipulován konvenčními způsoby genetického inženýrství, takže mohou být do genomu koronaviru zaváděny nové geny, které mohou být exprimovány tkáňově i druhově specifickým způsobem, pro indukci imunitní odpovědi nebo pro genovou terapii. Kromě toho může být exprese optimalisována výběrem nových transkripčně regulačních sekvencí (TRS), které umožňují zvyšovat hladiny exprese více než stonásobně.
Vektory, odvozené od koronaviru, hlavně TGEV, mají některé výhody v indukci imunity v mukosních membránách, s ohledem na jiné systémy exprese, které se v nich nereplikují: (i) TGEV infikuje intestinální a respirační membrány (Enjuakes a Van der Zeijst, 1995), které jsou nejlepšími místy pro indukci sekreční imunity; (ii) jeho tropismus může být kontrolován modifikací S genu (Balesteros et al., 1997); (iii) existuji nepathogenní kmeny pro vývoj expresních systémů, které závisí na komplementárním viru (Sánchez et al., 1992) a (iv) koronaviry jsou cytoplasmatické RNA viry, které se replikují, aniž by prošly stadiem intermediární DNA (Lai a Cavanagh, 1997), což činí jejich integraci do celulárního chromosomu prakticky nemožnou.
Způsob, který umožnil získání infekčního koronaviru z cDNA, která kóduje gRNA koronaviru, zahrnuje následující kroky: (i) expresi RNA koronaviru za podmínek kontroly vhodným promotorem; (ii) klonování genomu koronaviru v bakteriálním artificiálním chromosomu (BAC) (iii) identifikaci sekvencí cDNA koronaviru, které jsou přímo nebo nepřímo toxické pro bakterie; (iv) identifikaci přesného počtu spojení komponent cDNA, které kódují infekční RNA koronaviru (promotory, transkripčně - terminační sekvence, polyadenylační sekvence, ribozymy, apod.) a (v) identifikaci skupiny výrobních způsobů (podmínek pro růst BAC, modifikace způsobů purifikace BAC DNA, způsoby transformace, apod.), které v kombinaci umožňují účinné uchování infekčního koronaviru z cDNA.
Promotor hraje důležitou úlohu při zvyšování exprese virové RNA v jádře, kde je synthetisována, aby byla později transportována do cytoplasmy.
Použití BAC je jedním z klíčových bodů způsobu vynálezu. Pokud je známo, je klonování eukaryontních sekvencí v bakteriálních plasmidech často nemožné v důsledku toxicity těchto exogenních sekvencí pro bakterie. V těchto případech bakterie obvykle eliminují toxicitu modifikováním introdukovaných sekvencí. Ve způsobu použitém v tomto případu, byla pro odstranění možné toxicity těchto virových sekvencí provedena nezbytná klonování pro získání úplné cDNA z koronaviru v BAC. Tyto plasmidy zřejmě obsahují pouze jednu kopii nebo maximálně dvě kopie na buňku, což významně omezuje jejich toxicitu a snižuje možnosti interplasmidové rekombinace.
Identifikací sekvencí cDNA koronaviru, toxických vůči bakteriím, lze konstruovat cDNA, která kóduje úplný genom koronaviru, s výjimkou toxických sekvencí, které jsou přidány v posledním kroku konstrukce úplného genomu, což je, těsně před transfekcí do eukaryontních buněk, zamezením jejich modifikace bakteriemi. Předmět předkládaného vynálezu tudíž zahrnuje klon infekční dvojřetězcové DNA, která kóduje gRNA koronaviru, rovněž jako způsob jeho získání.
Další předmět vynálezu zahrnuje sadu rekombinantních virových vektorů, která obsahuje infekční klon a sekvence heterologních nukleových kyselin, inserované do tohoto infekčního klonu.
Dalším předmětem tohoto vynálezu je způsob výroby rekombinantního koronaviru, který obsahuje introdukci infekčního klonu do hostitelské buňky, kultivaci transformované buňky za podmínek, které umožňují replikaci infekčního klonu a výrobu rekombinantního koronaviru a získání rekombinantního koronaviru z kultury.
Jiný předmět vynálezu zahrnuje způsob výroby modifikovaného rekombinantního koronaviru, obsahující introdukci rekombinantního virového vektoru do hostitelské buňky, kultivaci za podmínek, umožňujících replikaci virového vektoru a výrobu modifikovaného rekombinantního koronaviru a získání modifikovaného rekombinantního vektoru z kultury. Dalším předmětem tohoto vynálezu je způsob výroby požadovaných produktů, zahrnující kultivaci hostitelské buňky, která obsahuje rekombinantní virový vektor, za podmínek, umožňujících expresi sekvence heterologní DNA.
Buňky, obsahující dříve zmíněné infekční klony nebo rekombinantní virový vektor, představují další předmět předkládaného vynálezu.
Jiný předmět tohoto vynálezu obsahuje sadu vakcín, které chrání živočichy proti infekcím, způsobeným infekčními činidly. Tyto vakcíny obsahují infekční vektory, které exprimují nejméně jeden antigen vhodný pro indukci imunitní odpovědi proti všem infekčním činidlům nebo nejméně jedné protilátky, která poskytuje ochranu proti tomuto infekčnímu činidlu, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem. Tyto vakcíny mohou být mono nebo multivalentní, v závislosti na tom, jestli vektory exprimují jeden nebo více antigenů, schopných indukovat imunitní odpověď k jednomu nebo více infekčním činidlům nebo, případně jednu nebo více protilátek, které poskytují ochranu proti jednomu nebo více infekčním činidlům.
Jiný předmět vynálezu poskytuje způsob imunisace živočichů, který zahrnuje podání uvedené vakcíny.
Vynález poskytuje klon cDNA, který kóduje infekční RNA koronaviru, nadále infekční klon podle tohoto vynálezu, který obsahuje: (1) kopii DNA (cDNA), komplementární k infekční genomové RNA (gRNA) koronaviru nebo samotné virové RNA a (2) expresní modul pro přídavný gen, který obsahuje optimalisované transkripčně - promoční sekvence. V hlavním uspořádání tohoto vynálezu je koronavirus isolátem TGEV, hlavně PUR46-MAD isolátem (Sánchez et al., 1990), modifikovaným nahrazením S genu tohoto viru S genem isolátu TGEV klonu Cl 1 nebo S genem psího nebo lidského koronaviru.
Transkripčně - promoční sekvence nebo promotor jsou sekvencí RNA, umístěnou na 5' konci každé poslíčkové (messenger, dále jen mRNA) koronaviru, ke které se váže virová RNA polymerasa při počátku transkripce mRNA. V konorétním a výhodném uspořádání je virový genom exprimován z cDNA pomocí IE promotoru CMV, v důsledku vysoké hladiny exprese, získané použitím tohoto promotoru (Dubensky et al., 1996) a předchozích výsledků získaných v naší laboratoři, které indikovaly, že velké defektní genomy (9,7 kb a 15 kb), odvozené od TGEV koronaviru, exprimovaly RNA, které nepodléhaly štěpení v průběhu jejich transportu z jádra, kde jsou synthetisovány, do cytoplasmy.
Infekční klon podle tohoto vynálezu také obsahuje transkripčně - terminační sekvenci a polyadenylační signál, jako jsou ty, které přicházejí od BGH genu. Tyto terminační sekvence musí být umístěny na 3' konci poly(A) části. V jednom určitém uspořádání infekční klon podle tohoto vynálezu obsahuje poly(A) řetězec složený z 24 zbytků A a terminační a polyadenylační sekvence BGH, oddělené od poly(A) řetězce sekvencí HDV ribozymu.
Plasmid, do kterého byla inserována infekční virová cDNA, je molekulou DNA, která má replikační počátek, a která je tudíž potenciálně schopná replikace ve vhodné buňce. Použitý plasmid je replikonem, odpovídajícím za udržování a zesilování infekčního klonu podle tohoto vynálezu v odpovídající hostitelské buňce, jako je bakterie, například, Escherichia coli. Replikon obecně obsahuje gen resistence vůči antibiotikům, který umožňuje selekci buněk, nesoucích tento gen (například cat). V příkladu 1 je popsána konstrukce infekčního klonu TGEV za kontroly IE promotoru z CMV. Konec 3' cDNA se zdá být sousedním k sekvenci 24 nt poly(A), HDV ribozymu a transkripčně terminační sekvenci BGH.
Způsob získání infekčního klonu podle tohoto vynálezu zahrnuje konstrukci úplné délky cDNA od gRNA koronaviru a připojení transkripčně regulačních prvků. DNA, která kóduje infekční gRNA koronaviru, byla získána z Dl genomu, odvozeného od koronaviru, který byl klonován jako cDNA, za kontroly vhodného promotoru v BAC, za účelem zvýšení stability cDNA. Poté byly identifikovány bakteriotoxické sekvence, které byly kvůli eliminaci této toxicity odejmuty a inserovány na konci konstrukce kompletního genomu, těsně před transfekcí do eukaryontních buněk. Potomstvo viru může být rekonstituováno pomocí transfekce plasmidu BAC, který obsahuje genom koronaviru v eukaryontních buňkách, ve kterých probíhá replikace viru.
Transkripčně regulační prvky jsou spojeny pomocí konvenčních způsobů (Maniatis et al., 1989).
Infekční klon podle tohoto vynálezu může být manipulován konvenčními způsoby genetického inženýrství tak, že je inserována nejméně jedna sekvence heterologní nukleové kyseliny, která kóduje určenou aktivitu, za kontroly promotoru, který je přítomen v infekčním klonu a regulačních sekvencí, obsažených ve výsledném expresním vektoru.
Infekční klon podle tohoto vynálezu představuje mnoho aplikací; například, může být použit jak v základním výzkumu, například, pro studium mechanismu replikace a transkripce koronavirů, tak v aplikovaném výzkumu, například, ve vývoji účinného systému exprese požadovaných produktů (proteinů, enzymů, protilátek, apod.).
Vhodné buňky mohou být transformovány infekčním cDNA klonem podle tohoto vynálezu a mohou být získány viriony, obsahující kompletní genom koronavirů. Vynález tedy poskytuje způsob výroby rekombinantních koronavirů, který obsahuje zavedení infekční cDNA podle tohoto vynálezu do hostitelské buňky, kultivaci této buňky za podmínek, umožňujících expresi a replikaci infekčního klonu a získání virionů, získaných z rekombinantního koronavirů, které obsahují infekční genom koronavirů. Tento infekční klon podle tohoto vynálezu může být introdukován do hostitelské buňky různými způsoby, například transfekcí hostitelské buňky RNA, transkribovanou in vitro z infekčního klonu podle tohoto vynálezu nebo infekcí hostitelské buňky infekčním klonem cDNA podle tohoto vynálezu. Tyto hostitelské buňky, které obsahují infekční klon podle vynálezu, jsou přídavným předmětem předkládaného vynálezu.
Vynález také poskytuje sadu rekombinantních virových vektorů, odvozených od infekčního klonu podle tohoto vynálezu, dále jenom virových vektorů podle tohoto vynálezu. Virové vektory podle tohoto vynálezu zahrnují klon infekční cDNA podle tohoto vynálezu, modifikovaný tak, aby obsahoval heterologní nukleovou kyselinu, inserovanou do tohoto infekčního klonu za podmínek, které umožňují, aby tato heterologní nukleová kyselina byla exprimována.
Termín „nukleová kyselina", jak je používán v tomto popisu, označuje geny a nebo jejich fragmenty, rovněž jako libovolné molekuly DNA nebo RNA.
Ve smyslu použití v tomto popisu, je termín „heterologní" použit pro nukleovou kyselinu, která má sekvenci nukleové kyseliny, která není normálně přítomná ve vektoru, použitém pro introdukci heterologní nukleové kyseliny do hostitelské buňky.
Heterologní nukleová kyselina, která může obsahovat virový vektor podle tohoto vynálezu, může být genem nebo fragmentem, který kóduje protein, peptid, epitop nebo libovolný požadovaný produkt genu (jako protilátky, enzymy, apod.). Heterologní nukleová kyselina 20 20 • · » · ···« *· • ♦ • ♦ může být inserována do infekčního klonu podle tohoto vynálezu v libovolné vhodné oblasti cDNA, například, po ORF 1b nebo mezi geny N a 7, následovně po iniciačním kodonu (AUG) nebo ve čtecím rámci s tímto genem nebo, případně, v zóně odpovídající jiným rámcům otevřeným pro čtení (ORF). Při konstrukci virového vektoru podle předkládaného vynálezu je zásadou, že inserce heterologní nukleové kyseliny neinterferuje s libovolnou základní funkcí viru.
Virový vektor podle tohoto vynálezu může exprimovat jednu nebo více aktivit. Ve druhém případě bude virový vektor obsahovat tolik sekvencí heterologní nukleové kyseliny, kolik aktivit má exprimovat, předešlých jedním nebo několika promotory nebo promotorem a různými ribosomovými rozpoznávacími místy (IRES, intemal ribosome entry site) nebo různými promotory a jedním ribosomovým rozpoznávacím místem.
Vynález tedy poskytuje způsob výroby požadovaného produktu, který zahrnuje kultivaci hostitelské buňky, obsahující virový vektor podle tohoto vynálezu, za podmínek, které umožňují, aby byla exprimována heterologní nukleová kyselina a byl získán požadovaný produkt. Hostitelská buňka, obsahující virový vektor, představuje další předmět předkládaného vynálezu.
Virový vektor podle tohoto vynálezu může být uspořádán tak, že jeho druhová specifita a tropismus mohou být snadno kontrolovány. V důsledku těchto charakteristik je velmi zajímavou aplikací virových vektorů podle tohoto vynálezu genová terapie, protože vektor požadovaného genu nebo vakcinový vektor indukují imunitní odpovědi proti různým pathogenům.
Vynález dále poskytuje vakcíny, schopné ochrany živočichů proti infekci, způsobené infekčním činidlem, které obsahují (i) nejméně jeden virový vektor podle vynálezu, který exprimuje nejméně jeden antigen vhodný pro indukci imunitní odpovědi proti uvedenému infekčnímu činidlu, výhodně spolu s (ii) farmaceuticky přijatelným nosičem.
Ve smyslu používaném v tomto popisu, může být „indukování ochrany“ chápáno jako imunitní odpověď organismu příjemce (živočich, který má být imunisován) indukovaná virovým vektorem podle vynálezu, vhodným mechanismem, jako je ten, který je indukován substancemi, které zesilují buněčnou odpověď (interleukiny, interferony, apod.), buněčné nekrosní faktory a obdobné substance, které chrání živočicha před infekcemi způsobenými infekčními činidly.
Pod termínem „živočich" jsou chápáni všichni živočiši všech druhů, hlavně savci, včetně člověka.
Termín „infekční činidlo" je použit ve smyslu tohoto popisu jako libovolné virové, bakteriální, houbové, parasitické nebo jiné infekční činidlo, které může infikovat živočicha a způsobit pathologický děj. V jednom určitém provedení je tímto vynálezem poskytnuta vakcína, která obsahuje nejméně jeden virový vektor podle tohoto vynálezu, který exprimuje nejméně jeden antigen, schopný indukovat systémovou imunitní odpověď a nebo imunitní odpověď v mukósní membráně proti různým infekčním činidlům, které se množí v respiračních nebo intestinálních mukósních membránách. Vektory podle tohoto vynálezu jsou zcela vhodné pro indukci imunity v mukósních membránách, rovněž jako laktogenní imunity, která je specielně zajímavá v ochraně novorozenců proti infekcím intestinálního traktu. V jiném provedení je tímto vynálezem poskytnuta vakcína, obsahující nejméně jeden virový vektor podle tohoto vynálezu, který exprimuje nejméně jeden gen, kódující lehký a těžký řetězec protilátky libovolného isotypu (například, IgGi, IgA, atd.), která chrání proti infekčnímu činidlu.
Druhová specifita může být kontrolována tak, že virový vektor může exprimovat S protein obálky koronaviru, který infikuje požadovaný druh (člověk, pes, kočka, prase apod.), vhodný pro rozeznání buněčnými receptory odpovídajícího druhu.
Vakcíny, poskytované tímto vynálezem, mohou být monovalentní nebo multivalentní, v závislosti na tom, jestli virové vektory exprimují jeden nebo více antigenů, schopných indukovat imunitní odpověď vůči jednomu nebo více infekčním činidlům nebo jednu nebo více protilátek, které poskytují ochranu proti jednomu nebo více infekčním činidlům. V konkrétním uspořádání tohoto vynálezu jsou poskytnuty monovalentní vakcíny schopné ochránit člověka, prasata, psy a kočky proti různým infekcím lidským, prasečím, psím a 22 #«+· ** • t • · • · · · «« ·· ·# ·· • · · # * ··· # · · * · « · · • · · · • ·» ·« ···· ·#*· kočičím a současně je kontrolován tropismus expresí S glykoproteinu koronaviru s požadovanou druhovou specifitou.
Monovalentní vakcíny proti prasečím infekčním činidlům mohou obsahovat vektor, který exprimuje antigen, vybraný ze skupiny zahrnující v podstatě antigeny následujících prasečích pathogenů: Acíinobacilluspleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Haemophilusparasuis, prasečí parvovirus, Leptospira, Escherichia coli, Erysipelotrix rhusiopathiae, Pasteurella mulíocisa, Bordelella bronchiseptica, Closíridium sp., Serpulim hydiosenteriae, mycoplasma hyopneumoniae, virus prasečího epidemického průjmu (PEDV), prasečí respirační koronavirus, rotavirus nebo proti pathogenům, které způsobují prasečí respirační a reprodukční syndromy, Aujeszkyho chorobu (pseudorabies), prasečí chřipku nebo přenosnou gastroenteritidu a etiologická agens atrofické rhinitidy a proliferativní ileitidy. Monovalentní vakcíny proti psím infekčním činidlům mohou obsahovat expresní vektor, který exprimuje antigen, vybraný ze skupiny, v podstatě zahrnující antigeny následujících psích patogenů: psí herpes viry, typy 1 a 2 psího adenoviru, typy 1 a 2 psího parvovira, psí reovirus, psí rotavirus, psí koronavirus, psí virus parainfluenza, psí chřipkový virus, virus psinky, virus vztekliny, retrovirus a psí kalicivirus. .
Monovalentní vakcíny proti kočičím infekčním činidlům mohou obsahovat expresní vektor, který exprimuje antigen vybraný ze skupiny, v podstatě zahrnující antigeny následujících kočičích pathogenů: kočičí kalicivirus, virus kočičí imunodeficience, kočičí herpes virus, virus kočičí panleukopenie, kočičí reovirus, kočičí rotavirus, kočičí koronavirus, virus kočičí infekční peritonitidy, virus vztekliny, kočičí Chlamydiapsiítaci a virus kočičí leukemie.
Vektory mohou exprimovat protilátku, která poskytuje ochranu proti infekčnímu Činidlu, například, prasečímu, psímu nebo kočičímu infekčnímu činidlu, které jsou uvedeny shora. V jednom uspořádání vektor exprimuje rekombinantní monoklonální protilátku, identifikovanou jako 6A.C3, která neutralisuje TGEV, exprimovanou isotypy IgGi nebo IgA, ve kterých je konstantní část imunoglobulinu prasečího původu nebo neutralisováním protilátek pro lidské a prasečí rotaviry.
Jako rozpouštědlo může být použit fysiologický roztok nebo jiné podobné solné roztoky. Tyto vakcíny mohou také podobně obsahovat adjuvans, obvykle používaná ve vodných roztocích nebo hydroxid hlinitý, QuilA, suspense gelů hydroxidu hlinitého a jim podobné a olejové vakcíny, založené na minerálních olejích, glyceridech, derivátech mastných kyselin a jejich směsí.
Vakcíny podle předkládaného vynálezu mohou také obsahovat substance zvyšující buněčnou odpověď (cell response potentiating (CRP)), což jsou látky, které zvyšují subpopulace T -lymfocytů (Thi a TI12), jako interleukin - 1 (IL-1), EL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, gamma IFN (gamma interferon), buněčný nekrosní faktor a podobné substance, které by mohly teoreticky provokovat buněčnou imunitu u očkovaných živočichů. Tyto CPR substance by mohly být použity v očkovacích přípravcích s vodnými nebo olejovými adjuvancii. Jiné typy adjuvancií, které modulují a imunostimulují buněčnou odpověď, mohou být také použity, jako MDP (muramyldipeptid). ISCOM (Imunostimulant Complex) nebo liposomy.
Vynález poskytuje multivalentní vakcíny, schopné prevence a ochrany živočichů před infekcemi, způsobenými různými infekčními Činidly. Tyto multivalentní vakcíny mohou být připraveny z virových vektorů podle tohoto vynálezu, do kterých byly ve stejném rekombinantním vektoru inserovány různé sekvence, kódující odpovídající antigeny nebo konstrukcí nezávislých rekombinantních vektorů, které by mohly být později smíseny pro společnou inokulaci. Tyto multivalentní vakcíny tedy obsahují virový vektor, který obsahuje více než jednu sekvenci heterologních nukleových kyselin, které kódují více než jeden antigen nebo, případně, různé virové vektory, z nichž každý exprimuje nejméně jeden různý antigen.
Analogicky lze připravit multivalentní vakcíny, které obsahují multivalentní vektory, použitím sekvencí, které kódují protilátky, ochraňující proti infekčním činidlům, místo sekvencí, kódujících antigeny. V dalším uspořádání tohoto vynálezu jsou poskytnuty vakcíny, schopné imunisace lidí, prasat, psů a koček proti různým prasečím, psím a kočičím infekčním činidlům. Pro tyto účely musí virové vektory, obsažené ve vakcíně, exprimovat různé antigeny od lidských, prasečích, psích nebo kočičích, shora zmíněných nebo jiných pathogenů.
Vakcíny podle tohoto vynálezu mohou být v kapalné nebo lyofilisované formě a mohou být připraveny suspendováním rekombinantních systémů v excipientu. Jsou-li tyto systémy v lyofilisované formě, potom sám excipiens může být rekonstituční substancí. 24 ··♦ · *« • *
Jiným způsobem lze vakcíny poskytované tímto vynálezem použít v kombinaci s jinými konvenčními vakcínami, přičemž buď tvoří jejich část nebo jako rozpouštědlo nebo lyofilisovaná frakce, která má být rozpuštěna v jiných konvenčních nebo rekombinantních vakcínách.
Vakcíny poskytnuté tímto vynálezem mohou být podány živočichům orálně, nasálně, subkutánně, intradermálně, intraperitoneálně, intramuskulárně nebo aerosolem.
Tento vynález také poskytuje způsob pro imunisaci živočichů, hlavně prasat, psů a koček, proti jednomu nebo proti více různým infekčním činidlům současně, což zahrnuje orální, nasální, subkutánní, intradermální, intraperitoneální, intramuskulární nebo aerosolové podání (nebo jejich kombinaci) vakcíny, která obsahuje imunologicky dostatečné množství rekombinantního systému, poskytovaného tímto vynálezem.
Kromě toho, poskytuje tento vynález také způsob ochrany novorozených živočichů proti infekčním činidlům, které infikují novorozené živočichy, zahrnující orální, nasální, subkutánní, intradermální, intraperitoneální, intramuskulární nebo aerosolové podání (nebo jejich kombinaci) vakcíny, poskytované tímto vynálezem, matkám, před nebo v průběhu těhotenství nebo novorozencům. Příklady provedení vynálezu
Vynález je znázorněn následujícími příklady, které popisují detailně získám infekčních klonů a konstrukci virových vektorů podle tohoto vynálezu. Tyto příklady nelze chápat jako limitující rozsah a záměr tohoto vynálezu, ale pouze jako ilustraci. V těchto příkladech je popsána transformace a růst bakterií, purifikace DNA, sekvenční analysa a způsob vyhodnocení stability plasmidů, podle způsobů, popsaných níže.
Transformace bakterií Všechny plasmidy byly elektroporovány v kmeni E. coli DH10B (Gibco BRL), lehce modifikovanými popsanými způsoby (Shizuya et al., 1992). Pro každou transformaci byly smíšeny 2 μΐ ligační směsi a 50 μΐ kompetentních bakterií v 0,2 cm miskách(BioRad) a elektroporovány pří 200 Ω, 2,5 kV a 25 pF. Poté byl ke každé transformaci přidán 1 ml SOC (Maniatis et al., 1989), buňky byly inkubovány při 37 °C po 45 minut a rekombinované 25 25 #·♦· t* • · »· *·#· ·♦ ·· • · · ♦ * · · · • « · · ♦·· # · * • « ♦ · · · · · · * ·« ·« ♦·· ·· ···· kolonie byly detekovány na deskách v LB SOC mediu (Maniatis et al., 1989) s 12,5 pg/ml chloramfenikolu. Růstové podmínky bakterií
Bakterie obsahující originální plasmidy, ve kterých byl klonován neúplný genom TGEV, byly pěstovány při 37 °C a vykazovaly normální růstové kinetiky. Na druhé straně, BAC, které obsahovaly kompletní cDNA, byly pěstovány při 30 °C, aby byla co možná nejvíce minimalisována nestabilita. V důsledku toho byla redukována velikost kolonií a pro dosažení normální velikosti kolonií byly nezbytné inkubační periody až 24 hodin.
Purifikace DNA
Byl použit způsob, popsaný Woo (Woo et al., 1994), s malými modifikacemi. Z jednotlivé kolonie byly inokulovány 41 LB s chloramfenikolem (12,5 pg/ml). Po inkubační periodě 18 hodin při 30 °C byly bakterie odděleny centrifugací při 6000 g a plasmid byl purifikován použitím Qiagen Plasmid Maxipreparations kit, podle návodu výrobce. Způsobem dle tohoto doporučení bylo zjištěno, že získaný plasmid DNA byl znečištěn bakteriální DNA. Pro odstranění tohoto znečištění byla plasmidová DNA čištěna centrifugací při 55 000 g po 16 hodin v gradientu CsCl. Získaný výtěžek byl mezi 15 až 30 μ/l, v závislosti na velikosti plasmidu.
Sekvenční analysa DNA byla sekvenována na automatickém sekvenátoru (373 DNA Sequencer, Applied Biosystems) použitím dideoxynukleotidů, značených fluorochromy a polymerasou citlivou na teplotu (Perkin Elmer). Činidla byla získána nákupem kitu (ABIPRISM Dye Terminátor Cycle Sequencing Ready Reaction Kit) od společnosti Applied Biosystems. Termocykler, použitý pro provedení sekvenačních reakcí byl „GeneAmpPCR Systém 9600“ (Perkin Elmer). Spojení sekvencí a jejich srovnání s dohodnutou sekvencí TGEV bylo provedeno použitím SeqMan II and Align (DNASTAR) programů. Ve vztahu k dohodnuté sekvenci nebyly detekovány žádné rozdíly.
Stabilita plasmidů Z počátečních glycerolátů byly bakterie, které obsahovaly rekombinantní pBeloBACl 1 plasmidy, pěstovány v 20 ml LB s chloramfenikolem (12,5 pg/ml po 16 hodin při 30 °C a 37 °C. Tento materiál byl považován za pasáž 0. Bakterie byly zředěny 106násobně a pěstovány 26 999 9 ·· I I f • · · • 9 9 • · f 9 ·· t« 99 « 4 9 9 99 99 « 9 9 • 9 9 • * ··· • · • 9 • 9 9 · 9 • 9 • 9 9 9 ·· 9« · 9 9 9 9 9 1 při 30 °C a 37 °C po 16 hodin. Následné pasáže byly realisovány v průběhu osmi následujících dní (každá pasáž představuje přibližně 20 generací). Plasmidová DNA byla purifikována pomocí Miniprep v pasážích 0 až 8 (160 generací) a analysována restrikčními endonukleasami. Dva plasmidy, které obsahovaly část genomu TGEV, byly vysoce stabilní, zatímco plasmid, který obsahoval úplný genom TGEV, vykazoval jistou nestabilitu po 40 generacích (v tomto bodu přibližně 80 % DNA vykazovalo správné restrikční vzorce). Příklad 1
Konstrukce rekombinantního vektoru, založeného na klonu infekční cDNA, odvozené od TGEV 1.1 Tvorba infekční cDNA z TGEV
Za účelem získání cDNA, která kódovala kompletní TGEV genom, jsme původně začínali s cDNA, která kódovala defektní DI-C genom (Méndez et al., 1996).Tato cDNA, která byla asi třetinou délky TGEV genomu, byla klonována v plasmidu s malým počtem kopií pACNRl 180 (Ruggli et al., 1996) a byla určena její sekvence. CDNA, která kódovala defektní genom, byla účinně uchována (replikována a uložena) s pomocí komplementárního viru (Méndez et al, 1996; Izeta et al., 1999).
Genom DI-C představuje tři delece (Δ1, Δ2 a Δ3) o přibližně 10, 1 a 8 kilobasích (kb), v ORF la, lb a mezi geny S a 7 (viz obrázek 1).
Způsob, použitý pro doplnění sekvence cDNA, která by kódovala infekční genom TGEV, zahrnoval inkorporaci, krok za krokem, sekvencí deletovaných v genomu DI-C a analysu bakteriotoxicity nově vzniklých konstrukcí. Tento aspekt je velmi důležitý, protože je dobře doloženo v odborné literatuře, že rekombinantní plasmidy, obsahující cDNA z RNA virů, obecně špatně rostly a byly nestabilní (Boyer a Haenni, 1994; Rice et al., 1989, Mandl et al., 1997).
První delecí, která měla být kompletována, byla delece Δ2, dlouhá 1 kb, z ORF lb, poskytující stabilní rekombinantní plasmid. Sekvence, která postrádala ORF la, byla introdukována klonováním cDNA fragmentů A, B, C a D (obrázek 1) (Almazan et al., 2000), takovým způsobem, že všechny potřebné informace pro gen replikasy byly úplné. Získaný rekombinantní plasmid byl v bakteriích nestabilní a tvořil nové plasmidy, které měly inkorporovány adice a delece ve fragmentu A (Almazan et al., 2000). Bylo zajímavé, že eliminace 5198 bp Clal-Clal restrikčního fragmentu, která zaujímala oblast genomu mezi nukleotidy 4417 a 9615 (Penzes et al., 1999), poskytla relativně stabilní plasmid v kmenu E. 27 ··* · • · ·· • « • t
coli DH10B. Později byla sekvence delece Δ3 přidána klonováním všech genetických informací pro strukturální a nestrukturální proteiny na 3' konci genomu TGEV (obrázek 1). Z důvodů zvýšení stability TGEV cDNA, bylo rozhodnuto, že bude subklonována v BAC, použitím plasmidu pBeloBACl 1 (Kim et al., 1992) (viz obrázek 2). Plasmid pBeloBACl 1 byl velkorysým darem H. Shizuya a M. Simona (California Institute of Technology). Tento plasmid, 7,507 bp veliký, zahrnoval replikační počátek F faktoru od parB, parC E. coli) (oriS) a geny nezbytné pro zachování jedné kopie plasmidu na buňku (parA a repE). Plasmid také představoval gen resistence vůči chloramfenikolu (cat), jako selekční markér. cDNA byla klonována za kontroly IE promotoru z CMV, v důsledku vysoké hladiny exprese, získané použitím tohoto promotoru (Dubensky et al., 1996) a předchozích výsledků, získaných v naší laboratoři, naznačujících, že velké (9,7 kb a 15 kb) defektní genomy, odvozené od TGEV, exprimovaly RNA, která nepodléhala štěpení v průběhu transportu z jádra, kde byla synthetisována, do cytoplasmy (Izeta et al., 1999); Penzes et al., 1999; Almazan et al., 2000). Vytvořená TGEV cDNA (pBAC-TcDNA-AClal) obsahovala informaci pro geny replikasy, s výjimkou deletovaného 5198 bp Clal fragmentu a všech informací o strukturálních a nestrukturálních genech. Konec 3' u cDNA sousedil s 24 nt poly(A) sekvencí, HDV ribozymem a transkripčně terminační sekvencí BGH (Izeta et al., 1999). Na druhé straně byl fragment Clal, nezbytný pro tvorbu kompletního genomu TGEV, klonován v BAC, za tvorby plasmidu pB AC-B+C+D5', který obsahoval oblast TGEV genomu mezi 4310 a 9758 (viz obrázek 3). Oba plasmidy byly pěstovány na kmeni E. coli DH10B a sekvenovány v jejich celistvosti. Získaná sekvence byla identická se souhlasnou sekvencí isolátu PUR46-MAD TGEV, uvedenou na konci tohoto dokumentu (SEQ Π) NO:l), s výjimkou dvou náhrad na posicích nukleotidů 6752 (A => G, tichá) a 18 997 (T => G, tichá) a změn v S genu u PUR46-MAD, které byly nahrazeny D genem isolátu Cl 1 (tyto změny jsou uvedeny na obrázku 4). Z důvodů tvorby cDNA, která kóduje virulentní TGEV, byl S gen isolátu PUR46-MAD, který se replikuje na vysoké hladině v respiračním traktu (>106 PFU/g tkáně) a v nízké hladině v intestinálním traktu (<103 PFU/ml, kompletně nahrazen S genem klonu TGEV 11, dále označovaným jako Cil, který se replikuje se zvýšenými titry jak v respiračním traktu (<106 PFU/ml), tak v intestinálním traktu (<106 PFU/ml) (Sánchez et al., 1999). S gen Cl 1 zahrnuje 14 nukleotidů, které se liší od S genu isolátuPUR46-MAD a 6 nt insercí na 5' konci S genu (viz obrázek 4) (Sánchez et al., 1999). Předchozí výsledky v naší laboratoři (Sánchez et al., 1999) ukázaly, že mutanty vytvořené směrovanými rekombinacemi, v nichž byl S gen PUR46-MAD isolátu TGEV nahrazen S genem intestinálního isolátu Cil, získal intestinální 28 »··· ·· » i * » · « ♦ · · • « « · + ♦ »· • V 9»fr« « » ě ··· ·· » * · ♦ ·» ···« tropismus a zvýšenou virulenci, na rozdíl od přirozeného isolátu PUR46-MAD TGEV, který se replikuje velmi málo nebo vůbec v intestinálním traktu infikovaných prasat. cDNA byla konstruována z isolátu PUR46-MAD od TGEV s S genem z intestinálního isolátu Cil, pomocí klonování 5198 bp fragmentu Clal-Clal, získaného z plasmidu pBAC-B+C+D5', v plasmidu pBAC-TcDNA'AClal, aby vznikl plasmid pBAC—TcDNAFL, který obsahuje cDNA, kódující kompletní genom TGEV (obrázek 3).
Stabilita plasmidu, použitých pro konstrukci klonu infekční cDNA (pBAC-TcDNA"ÁClaI a pBAC—ClaIFL), v bakteriích, rovněž jako plasmidu, který obsahuje kompletní cDNA (pBAC-TcDNAfl), byla analysována po kultivaci v E. coli po 160 generací. Stabilita byla analysována pomocí digesce purifikovaných cDNA s restrikčními endonukleasami. Nebyly detekovány žádné delece ani žádné inserce, i když nelze vyloučit přítomnost malých změn v plasmidu pBAC-TcDNA'ACIaI a plasmidu pBAC-B+C+D5', které nebylo možno detekovat použitým způsobem analysy. V případě plasmidu pBAC-TcDNA, který obsahuje kompletní genom TGEV, byla po 40 generacích detekována určitá nestabilita (v tomto bodu asi 80 % přítomné DNA odpovídalo správnému restrikčnímu obrazci). Tato lehká nestabilita, však nemůže představovat překážku v udržení infekčního viru, protože 20 generací (41 kultury) bakteriálního růstu je dostatečných pro vznik takového množství plasmidové DNA, které stačí pro udržení viru. 1.2 Obnova infekčního TGEV z cDNA, která kóduje kompletní genom ST buňky byly transfektovány s plasmidem pBAC-TcDNAFL. Po 48 hodinách po transfekci byl supematant kultury spojen a pasážován ónásobně do ST buněk (viz obrázek 5). Počínaje pasáží 2, ve 14.hodině po transfekci, se stal cytopathický efekt zřetelným, s dalším vývojem, 20 hodin po transfekci, prakticky všechny buňky tvořily jedno vrstvu (viz obrázek 6). Na druhé straně, se titr obnoveného viru rychle zvyšoval s pasážemi, dosahuje hodnot řádu 108 PFU/ml v pasáži 3 (viz obrázek 7). Tento experiment byl pětkrát opakován a ve všech případech byly získány podobné titry, zatímco v případě netransfektovaných buněk nebo v případě buněk transfektovaných podobným plasmidem, kde byl fragment Clal-Clal nalezen v obrácené orientaci, nebyl virus nikdy získán. Z důvodů eliminace možnosti, že získaný virus byl produktem kontaminace, byla sekvence na posicích 6752 a 18 997 určena pomocí sekvenování cDNA fragmentů, zesílených RT-PCR, použitím genomové RNA z obnoveného viru jako templátu. Analysa sekvence určila, že nukleotidy v posicích 6752 a 18 997 byly ty, které jsou v cDNA. Obnovený virus dále obsahoval restrikční místo DralII v posici 20 990, v sekvenci cDNA pro S gen, jak bylo 29 Μ«· Μ • * • · ♦ 9 • ♦ · ♦ # ·#
očekáváno pro S gen od Cl 1 (obrázek 8). Přítomnost těchto tří genetických markérů potvrdila, že isolovaný virus pocházel z cDNA. Při podrobnější charakterisaci vytvořeného viru byla provedena komparativní analysa pomocí imunofluorescence infikovaných buněk s virem (TcDNA), získaným po transfekci s plasmidem pBAC-TcDNAFL nebo buňkami, infikovanými isolátem PUR46-MAD od TGEV. Pro tyto účely byly použity specifické polyklonální a monoklonální protilátky, které rozpoznávají buď, jak Cil isolát, tak PUR46-MAD isolát nebo pouze druhý jmenovaný (obrázek 10). Získané výsledky potvrzují antigenicitu, očekávanou pro nový virus TcDNA. Polyklonální protilátka, specifická pro TGEV, očekávaná specifická protilátka S proteinu (ID.B12 a 6A.C3), rovněž jako specifické monoklonální protilátky od Μ (3B.B3) a N (3B.D8) proteinů, rozpoznaly TcDNA i PUR46-MAD. Získané výsledky naznačují, že vytvořený virus zahrnuje M a N proteiny od isolátu PUR46-MAD a S protein od isolátu Cl 1, protože byl konstruován v původní cDNA. 1.3 Infekčnost in vivo a virulence
Pro účely analysy infekčnosti in vivo viru TcDNA, byla inokulována skupina pěti narozených selat virem, klonovaným z pasáže 6 a byla analysována mortalita. Těchto pět inokulovaných selat uhynulo 3 až 4 dny po inokulaci, což značí, že že virus TcDNA byl virulentní. Naopak, dvě selata, inokulovaná pouze rozpouštědlem viru a chovaná za stejných podmínek, nevykázala žádné změny. 1.4 Optimalisace hladin exprese modifikováním transkripčně regulačních sekvencí Synthesa RNA v koronaviru probíhá prostřednictvím procesu závislého na RNA, ve kterém jsou mRNA transkribovány z templátů s negativní polaritou. U TGEV je, zdá se, konservovaná sekvence, CUAAAC, která je umístěna právě před většinou genů. Tyto sekvence představují signály pro transkripci subgenomových mRNA. U koronaviru je mezi šesti až osmi typy mRNA s různou délkou, v závislosti na typu koronaviru a na hostiteli. Ten nejdelší odpovídá genomové RNA, která naopak slouží jako mRNA pro ORF la a lb. Zbytek mRNA odpovídá subgenomové mRNA. Tyto mRNA jsou nazvány mRNA 1 až 7, v pořadí klesající velikosti. Na druhé straně některé mRNA, které byly objeveny až po sadě původně popsaných mRNA, byly nazvány jmény odpovídajících mRNA, pomlčka a číslo, např., mRNA 2-1. Tyto mRNA představují koterminální struktury ve vztahu ke struktuře genomové RNA. S výjimkou té nejmenší mRNA, je zbytek strukturálně polycistronický, zatímco obecně pouze ORF, orientovaný nejblíže ku 5' konci, je translatován. 99 30 ·Μ· • 9 • 9 • 9 • 9 9 99 9# 9 * 9 99 9*9» * 9 9 9 9 #·9 % 9 « ·9 Λ · 9 99 9*9 • 9 9 9 « 9 9 9 9 9 9 ÍV* · 9 9 9 999 Účinnost exprese markerového genu (GUS) byla studována použitím různých sekvencí, sousedících s 5' termináíní částí minimální intergenní sekvence (IG) CUAAAC (obrázek 11), různých sekvencí sousedících s 3' termináíní oblastí IG sekvence (obrázek 12) a různých insertních míst (obrázek 13). Získané výsledky naznačují, že optimální exprese bylo dosaženo s TRS, sestávající z: (i) -88 nt sousední dohodnuté sekvence pro N gen TGEV; (ii) IG sekvence a (iii) 3' sousední sekvence IG sekvence S genu. V souhlase s výsledky, získanými dále ve vztahu k místu inserce u heterologního genu, byly pozorovány nejvyšší hladiny exprese, když heterologní gen byl umístěn na 3' konci genomu. TRS, tak jak je zde popsána, umožňuje, aby byl GUS exprimován v hladinách mezi 2 a 8 pg na 106 buněk. 1.5 Tkáňová specifita expresního systému
Mnoho pathogenů vstupuje do hostitelské buňky přes mukósní membrány. Aby bylo zabráněno tomuto typu infekce, je důležité vyvinout systémy exprese, které umožňují indukci vysokých hladin sekreční imunity. Toho lze v zásadě dosáhnout podáním antigenů do lymfatických uzlin, spojených s respiračním a intestinálním traktem. Aby bylo dosaženo tohoto cíle a obecně byla nasměrována exprese genu do požadované tkáně, byly studovány molekulární základy tropismu TGEV. Tyto studie ukázaly, že tkáňová specifita TGEV může být modifikována konstrukcí rekombinantních virů, obsahujících S gen koronaviru s požadovaným tropismem (Ballesteros et al., 1997; Sánchez et al., 1999). Tato informace umožňuje konstruovat systémy exprese, založené na genomech cDNA koronaviru s respiračním nebo intestinálním tropismem. 1.6 Exprese virového antigenů, kódovaného ORF5 od PRRSV, použitím infekční cDNA Pro účely optimalisace hladin exprese heterologních genů, byly provedeny konstrukce z vektoru ze vzájemně výměnných modulů, obklopujících klonované sekvence, které usnadňují výměnu TRS a heterologních genů ve vektoru. Tato konstrukce, která obsahuje ORF 5 od PRRSV (Porcine respirátory and reproductive syndrome virus) obklopenou na 5' konci minimální IGS dohodnutou sekvencí (CUAAAC), předcházející - 88 nt sousedící s genem kapsidy virového jádra (N) a na 3' konci restrikčním místem Sáli (GTCGAC) a sekvencí, analogickou sekvenci, popsané Kozákem (AC)GACC, poskytla optimální expresi (asi 10 pg/106 buněk). V zásadě byly tyto hladiny exprese heterologního genu více než dostatečné pro indukci imunitní odpovědi. Heterologní gen byl inserován do posice předběžně okupované genem 3a a 3b viru, které jsou postradatelné. 31 31
mm ··»* • · • ··· • · • · t· ··· • · • p · · · • · · ·
1.7 Indukce imunitní odpovědi u prasat na antigen, exprimovaný virovým vektorem, odvozeným od cDNA
Za použití stejného typu virového vektoru, odvozeného od cDNA a TRS popsaných shora, byl na vysoké hladině (20 pg proteinu na milion buněk v prasečích varlatech, ST, buněk) exprimován gen, kódující zeleně fluoreskující protein (GFP). Expresní hladiny byly stabilní po více než 20 pasáží v buněčných kulturách. Skupina prasat byla dále imunisována vektorem živého viru, který byl podán orálně, intranasálně a intragastricky a byla detekována masivní humorální imunitní odpověď proti virovému vektoru i proti GFP. Bylo zajímavé, že nebyl pozorován sekundární efekt u inokulovaných živočichů po podání tří dávek virového vektoru. 1.8 Konstrukce bezpečného vektoru, který exprimuje cizí gen, bez vzniku infekčního viru Při konstrukci vektoru pro humánní léčbu, je bezpečnost prioritou. Pro dosažení tohoto cíle byly do vektoru zabudovány tři typy pojistek. Dvě z nich jsou založeny na deleci dvou virových komponent, uložených na různých místech v genomu, zásadních pro replikaci viru. Tyto komponenty existují v poloze trans při agregované buněčné Unii. Tato buňka (Baby Hamster Kidney, BHK) exprimuje chybějící TGEV geny, kódující základní strukturální proteiny viru (obálku a membránové proteiny). Třetí bezpečnostní pojistkou je změna polohy signálu k agregaci virového genomu takovým způsobem, že je zabráněno získání infekčního viru rekombinací, což vede ke vytvoření sebevražedného vektoru, který efektivně exprimuje heterologní geny, ale který je neschopen množení i do nejbližší sousední buňky. S uspořádáním nového vektoru pro použití v humánní medicíně, nevyrábíme nový virus, který by se mohl množit v lidském druhu, protože tento vektor nemůže být přenášen z buňky do buňky v člověku. Vektor je založen na replikaci defektního viru. Může být pouze pěstován v továrně na vakcíny, použitím agregovaných buněk, komplementujících delece viru. Tyto bezpečnostní pojistky představují nový způsob inženýringu koronavirů. Rekombinantní virus s novým tropismem bude replikačně kompetentní přinejmenším v buňkách kočky, protože tyto buňky replikují lidské, prasečí, psí a kočičí koronaviry.
Uložení mikroorganismů
Bakterie odvozená od Escherichia coli, nesoucí plasmid s infekčním klonem podle tohoto vynálezu, identifikovaná jako Escherichia coli pBAC-TcDNAFL, byla uložena ve Španělské sbírce typových kultur (CECT), Burjassot (Valencia), 24. listopadu 1999, pod registračním číslem CECT 5265. 32 32 • · · · · · • · Μ ··· • · « * ·· · · · · · · • · · · · · • · · · · · ·· ·· ·· ·»·
Použitá literatura
Ahlquist, P., R. French, M. Janda, and L. S. Loesch-Fries.(1984). Multicomponent RNA planťvírus infection derived from cloned viral cDNA. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 81 : 7066-7070.
Almazan, F., J. M. González, Z. Penzes, A. Izeta, E. Calvo, J.Plana-Duran, and L. Enjuanes. (2000). Engineering the largestRNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 97 : 5516-5521.
Ballesteros, M. L., C. M. Sanchez, and L. Enjuanes. (1997). Two amino acid changes at the N-terminus of transmissible gastroenteritis coronavirus spike protein result in the loss of enteric tropism. Virology. 227 : 378-388.
Baron, M. D., and T. Barrett. (1997). Rescue of rinderpest virus from cloned cDNA. J. Virol. 71 : 1265-1271.
Boyer, J. C., A. L. and Haenni. (1994). Infectious transcripts and cDNA dones of RNA viruses. Virology. 198 : 415-426.
Chang, R. Y., M. A. Hofinann, P. B. Sethna, and D. A. Brian.(1994). A cis-acting function for the coronavirus leader in defective interfering RNA replication. J. Virol. 68 : 8223-8231.
Collins, P. L., M G. Hill, E. Camargo, H. Grosfeld, R. M. Chanock, and B. R. Murphy. (1995). Production of infectious human respirátory syncytial virus from cloned dCNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5'proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development. Proč. Nati. Acad. Sci.USA. 92 : 11563-11567.
Davis, N. L., L. V. Willis, J. F. Smith, and R. E. Johnston. (1989).In vitro synthesis of infectious Venezuelan equine encephalitis virus RNA from a cDNA cloně : analysis of a viable deletion mutant. Virology. 171 : 189-204.
Dubensky, J., T. W., D. A. Driver, J. M. Polo-, B. A. Belli, E. M.Latham, C. E. Ibanez, S. Chada, D. Brumm, T. A. Banks, S. J. Mento, D. J. Jolly, and S. M. W. Chang. (1996). Sindbis virus DNA-based expression vectors : utility for in vitro and in vivo gene transfer. J. Virol. 70 : 508-519.
Durbin, A. P., S. L. Halí, J. W. Siew, S. S. Whitehead, P. L. Collins, and B. R. Murphy. (1997). Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology. 235 : 323-332.
Enjuanes, L., S. G. Siddell, and W. J. Spaan. 1998. Coronaviruses and Arteriviruses. Plenům Press, New York.
Enjuanes, L., and B. A. M. Van der Zeijst. 1995. Molecular basis of transmissible gastroenteritis coronavirus epidemiology. In The Coronaviridae. S. G. Siddell, editor. Plenům Press, New York.337-376.
Frolov, I., T. A. Hoffinan, B. M. Prágai, S. A. Dryga, Η. V. Huang,S. Schlesinger, and C. M. Rice. (1996). Alphavirus-based expression vectors : Strategies and applications. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 93 : 11371-11377.
Garcin, D., T. Pelet, P. Calain, L. Roux, J. Curran, and D.Kolakofsky. (1995). A highly recombinogenic systém for the recovery of infectious sendai paramyxovirus from cDNA : generation of a novel. EMBO J. 14 : 6087-6094.
Geigenmuller, U., N. H. Ginzton, and S. M. Matsui. (1997). Construction of a genome-length cDNA cloně for human astrovirus serotype 1 and synthesis of infectious RNA transcripts. J. Virol. 71 : 1713-1717.
Izeta, A., C. Smerdou, S. Alonso, Z. Penzes, A. Mendez, J. Plana-Duran, and L. Enjuanes. (1999). Replication and packaging of transmissible gastroenteritis coronavirus-derived synthetic minigenomes. J. Virol. 73 : 1535-1545.
Kim, U.-J., H. Shizuya, P. de Jong, B. W. Birren, and Μ. I. Simon.(1992). Stable propagation of cosmid-sized human DNA inserts in an F-factor based vector. Nucleic Acids Res. 20 : 34 34 • ·
Ι· · · · · · · · · • « · · · · * • ···· · · * • · · · · · · 1083-1085.
Lai, C.-J., B. Zhao, H. Hoři, and M. Bray. (1991). Infectious RNA transcribed from stably cloned full-length cDNA of dengue type 4 virus. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 88 : 5139-5143.
Lai, Μ. M. C., and D. Cavanagh. (1997). The molecular biology of coronaviruses. Adv. Virus Res. 48 : 1-100,
Lai, Μ. M. C., C.-L. Liao, Y.-J. Lin, and X. Zhang. (1994). Coronavirus : how a large RNA viral genome is replicated and transcribed. Infect. Agents Dis. 3 : 98-105.
Liljestrom, P. (1994). Alphavirus expression Systems. Curr.Opin. Biotech. 5 : 495-500.
Liljestrom, P., and H. Garofř. (1991). A new generation of animal cell expression vectors based on the Semliki Forest virus replicon. BiolTechnology. 9 : 1356-1361.
Luytjes, W., M. Krystal, M. Enami, J. D. Parvin, and P. Palese.(1989). Amplification, expression, and packaging of a foreign gene by influenza virus. Cell. 59 : 1107-1113.
Mandl, C. W., M. Ecker, H. Holzmann, C. Kunz, F. X. Heinz. (1997). Infectious cDNA dones of tick-borne encephalitis virus European subtype prototypic strain Neudoerfl and high virulence strain Hypr. J. Gen. Virol. 78 : 1049-1057.
Maniatis, T., E. F. Fritsh, and J. Sambrook, (1989). Molecular cloning : a laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press. New York
Mendez, A., C. Smerdou, A. Izeta, F. Gebauer, and L. Enjuanes.(1996). Molecular characterization of transmissible gastroente ritis coronavirus defective interfering genomes : packaging and heterogeneity. Virology. 217 : 495-507.
Penzes, Z., A. Izeta, C. Smerdou, A. Mendez, M. L. Ballesteros, and L. Enjuanes. (1999). Complete nucleotide sequence of transmissible gastroenteritis coronavirus strain PUR46-MAD. Submitted for publication. 35 % ··· «· ·· ··♦· ·· ··· ··· ·· « · · · · · · · · * 6·
Pushko, Ρ., Μ. Parker, G. V. Ludwing, N. L. Davis, R. E. Johnston, and J. F. Smith. (1997). Replication-helper Systems from attenuated Venezuelan equine encephalitis virus : expression of heterologous genes in vitro and immunization against heterologous pathogens in vivo. Virology. 239 : 389-401.
Racaniello, V. R., and D. Baltimore. (1981). Cloned poliovirus cDNA is infectious in mammalian cells. Science, 214 : 916-919.
Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, C. Dotsch, G. Christiansen, and M. A. Billeter. (1995). Rescue of measles viruses form cloned DNA. EMBO J. 14 : 5773-5784.
Rice, C. M., A. Grakoui, R. Galler, and T. J. Chambers. (1989). Transcription of infectious yellow fever RNA from fall-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biologist. 1 : 285-296.
Rice, C. M., R. Levis, J. H. Strauss, and Η. V. Huang. (1987). Production of infectious RNA transcripts from Sindbis virus cDNA dones : Mapping of lethal mutations, rescue of a temperaturesensitive markér, and in vitro mutagenesis to generate defined mutants. J. Virol. 61 : 3809-3819.
Rice, C. M., and J. H. Strauss. (1981). Synthesis, cleavage, and sequence analysis of DNA complementary to the 26S messenger RNA of Sindbis virus. J. Mol. Biol. 150 : 315-340.
Ruggli, N., J. D. Tratschin, C. Mittelholzer, M. A. Hofmann. (1996). Nucleotide sequence of classical swine fever virus strain Alfort/187 and transciption of infectious RNA from stably cloned ťull-length cDNA. J. Virol. 70 : 3479-3487. Sánchez, C. M., G. Jimenez, M. D. Laviada, I. Correa, C. Sune, M. J. Bullido, F. Gebauer, C. Smerdou, P. Callebaut, J. M. Escribano, and L. Enjuanes. (1990). Antigenic homology among coronaviruses related to transmissible gastroenteritis virus. Virology. 174 : 410-417 36 I · • · · · • ··· • « • « » · · » Sánchez, C. M, F. Gebauer, C. Sune, A. Mendez, J. Dopazo, and L.Enjuanes. (1992). Genetic evolution and tropism of transmissible gastroenteritis coronaviruses. Virology. 190 : 92-105. Sánchez, C. M., A. Izeta, J. M. Sanchez-Morgado, S. Alonso, I. Sóla, M. Balasch, J. Plana-Durán, and L. Enjuanes. (1999). Targeted recombination demonstrates that the spike gene of transmissible gastroenteritis coronavirus is a determinant of its enteric tropism and virulence. J. Virol. 73 : 7607-7618.
Sawicki, S. G., and D. L. Sawicki. (1990). Coronavirus transcription : subgenomic mouše hepatitis virus replicative intermediates ťunction in RNA synthesis. J. Virol. 64 : 1050-1056.
Schnell, M. J., T. Mebatsion, and K.-K. Conzelmann. (1994). Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13 : 4195-4203.
Sethna, P. B., S.-L. Hung, and D. A. Brian. (1989). Coronavirus subgenomic minus-strand RNAs and the potential for mRNA replicons. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 86 : 5626-5630.
Shizuya, Η., B. Birren, U.-J. Kim, V. Mancino, T. Slepak, Y. Tachiiri, and M. Simon. (1992). Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragmente of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 89 : 8794-8797.
Siddell, S. G. 1995. The Coronaviridae. Plenům Press, New York. 418 pp.
Smerdou, C., and P. Liljestrom. (1999). Non-viral amplification systems for gene transfer: vectors based on alphaviruses. Curr. Opin. Mol. Therap. 1 : 244—251.
Taniguchi, M., and F. A. P. Miller. (1978). Specific suppressive factors produced by hybridomas derived from the fusion of enriched suppressor T cells and A T lymphoma cell line. J. Exp. Med. 148 : 373-382. van der Most, R. G., and W. J. M. Spaan. 1995. Coronavirus replication, transcription, and RNA recombination. In The Coronaviridae. S. G. Siddell, editor. Plenům Press, New York. 11-31. ···· ·< ** ···· ·· ·· I « I * « · ««*« Φ · · #···· * · 9
Wang, Κ., C. Boysen, H. Shizuya, Μ. I. Simon, and L. Hood.(1997). Complete nucleotide sequence of two generations of a bacterial artificial chromosome cloning vector. BioTechniques.23 : 992-994.
Woo, S.-S., J. Jiang, B. S. Gill, A. H. Paterson, and R. A. Wing.(1994). Construction and characterization of a bacterial artificial chromosome library of Sorghum bicolor. Nucleic Acids Res.22 : 4922-4931.
Zhang, X., C. L. Liao, and Μ. M. C. Lai. (1994). Coronavirus leader RNA regulates and initiates subgenomic mRNA transcription both in trans and in cis. J. Virol. 68 : 4738-4746.

Claims (73)

  1. 38 1. ···· • · • · • · • I ·· PATENTOVÉ NÁROKY ·· · · * · ·« ·« • * · * * * * • » ··« · · I • · ♦ · · · · • % · · · · • · «·· · · Mil Způsob přípravy DNA, vyznačující se tím, že se
    (a) DNA obsahující úplnou délku kopie genomové RNA (gRNA) z RNA viru nebo (b) DNA obsahující jeden nebo více fragmentů gRNA z RNA viru, kde tyto fragmenty kódují RNA polymerasu závislou na RNA a nejméně jeden strukturní nebo nestrukturní protein nebo (c) DNA homologní z nejméně 60 % se sekvencemi podle (a) nebo (b) klonuje v bakteriálním artificiálním chromosomu (BAC).
  2. 2. Způsob podle nároku 1, v y z n a čuj í c í se tím, že DNA klonovaná v BAC obsahuje navíc sekvence, kódující několik nebo všechny, s výjimkou jednoho, strukturní nebo nestrukturní proteiny viru.
  3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, v y z n a čuj í c í se tím, že DNA klonovaná v BAC obsahuje navíc sekvence, kódující jeden nebo několik heterologních genů.
  4. 4. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že heterologní gen kóduje nejméně jeden antigen, vhodný pro indukci imunitní odpovědi proti infekčnímu činidlu, nejméně jednu molekulu, interferující s replikací infekčního činidla, protilátku, poskytující ochranu proti infekčnímu činidlu, modulátor imunity, cytokin, zesilovač imunity nebo protizánětlivou sloučeninu.
  5. 5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že DNA klonovaná v BAC má velikost nejméně 5 kb.
  6. 6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž 5, vyznačující se tím, že DNA klonovaná v BAC má velikost nejméně 15 kb.
  7. 7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že DNA klonovaná v BAC má velikost nejméně 25 kb. 39 ♦ · 9··* ► · · I · ··· ·· «·
  8. 8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že BAC zahrnuje sekvenci, kontrolující transkripci DNA, klonované v BAC.
  9. 9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž 8, vyznačující se tím, že jeden z genů viru je modifikován substitucí, delecí nebo adicí nukleotidů.
  10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že se modifikuje gen, kontrolující tropismus.
  11. 11. Způsob podle kteréhokoliv z nároků lažlO, vyznačující se tím, že gen kontrolující tropismus viru je nahrazen odpovídajícím genem jiného viru.
  12. 12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž 11, vyznačující se tím, že DNA klonovaná v BAC je schopna transkripce do RNA, přičemž tato RNA může být spojena s virionem.
  13. 13. Způsob podle nároku 12, v y z n a č u j í c í se tím, ž e virionem je infekční, zeslabený, replikačně defektní nebo inaktivovaný virus.
  14. 14. Způsob podle kteréhokoliv z nároků lažl3,vyznačující se tím, že virus má přirozeně kladné znaménko vlákna genomu.
  15. 15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků lažl4, vyznačující se tím, že virem je pikornavirus, flavivirus, togavirus, koronavirus, torovirus, arteiivirus, kalcivirus, rhabdovirus, paramixovirus, filovirus, bornavirus, orthomyxovirus, bunyavirus, arenavirus nebo reovirus.
  16. 16. Způsob přípravy virové RNA, vyznačující se tím, že se připraví DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, tato DNA se exprimuje ve vhodné hostitelské buňce nebo se tato DNA smísí s chemikáliemi, biologickými činidly a/nebo buněčnými extrakty, za podmínek, které umožňují transkripci DNA, a isoluje se virová RNA.
  17. 17. Způsob přípravy virionu, vyznačující se tím, že se připraví DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, tato DNA se exprimuje ve vhodné hostitelské buňce nebo se
    9 « · · 9 9 9 9 ·· ·· » « 9*9 · t ♦ » •9 9*999 9 ♦ * • «·· 9 · · · · ♦ 99 9· 999 9« «999 tato DNA smísí s chemikáliemi, biologickými činidly a/nebo buněčnými extrakty, za podmínek, umožňujících transkripci a translaci DNA, a virion se isoluje.
  18. 18. Způsob podle nároku 17, v y z n a čuj í c i se tím, ž e virion se následně inaktivuje nebo usmrtí.
  19. 19. Způsob přípravy farmaceutického přípravku, vyznačující se tím, že se připraví DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, připraví se virová RNA podle nároku 16 nebo se připraví virion podle nároku 17 nebo 18 a následně se smísí s farmaceuticky přijatelným adjuvantem nebo nosičem.
  20. 20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že tímto farmaceutickým přípravkem je vakcína pro ochranu lidí nebo živočichů proti infekční chorobě.
  21. 21. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že tento farmaceutický přípravek se použije pro genovou terapii lidí nebo živočichů.
  22. 22. DNA obsahující sekvence, odvozené od genomové RNA (gRNA) koronaviru, když tyto sekvence jsou nejméně z 60 % homologní s přirozenými sekvencemi tohoto viru a kódují RNA polymerasu, závislou na RNA, a nejméně jeden strukturní nebo nestruktumí protein, přičemž fragment zmíněné DNA je schopný transkripce do RNA, přičemž tato RNA může být spojena s virionem.
  23. 23. DNA podle nároku 22, která navíc obsahuje sekvenci, kódující heterologní gen.
  24. 24. DNA podle nároku 23, kde heterologní gen kóduje nejméně jeden antigen, vhodný pro indukci imunitní odpovědi proti infekčnímu činidlu, nejméně jednu molekulu, interferující s replikací infekčního činidla, protilátku, poskytující ochranu proti infekčnímu činidlu, modulátor imunity, cytokin, zesilovač imunity nebo protizánětlivou sloučeninu.
  25. 25. DNA podle nároku 22 nebo 24, kde uvedený fragment má velikost nejméně 25 kb. 41 • · · · ♦ ♦
  26. 26. DNA podle kteréhokoliv z nároků 22 až 25, která obsahuje navíc sekvence, odvozené od koronaviru, které kódují některé nebo všechny strukturní nebo nestrukturní proteiny viru, s výjimkou jednoho.
  27. 27. DNA podle kteréhokoliv z nároků 22 až 26, která navíc obsahuje sekvence, odvozené od koronaviru, které kódují všechny strukturní nebo nestrukturní proteiny koronaviru.
  28. 28. DNA podle kteréhokoliv z nároků 22 až 27, která navíc obsahuje sekvenci, která kontroluje transkripci virové gRNA.
  29. 29. DNA podle kteréhokoliv z nároků 22 až 28, kde sekvencí kontrolující transkripci virové gRNA je bezprostředně počáteční (IE) promotor cytomegaloviru (CMV).
  30. 30. DNA podle kteréhokoliv z nároků 22 až 29, kde sekvence sousedí na 3' konci s řetězcem poly(A), ribozymem δ viru hepatitidy (HDV) a terminační a polyadenylační sekvencí hovězího růstového hormonu (BGH).
  31. 31. DNA podle kteréhokoliv z nároků 22 až 30, kde jsou tyto virové sekvence odvozeny od isolátu viru přenosné prasečí gastroenteritidy (TGEV), viru myší hepatitidy (MHV), viru infekční bronchitidy QBV), hovězího koronaviru (BoCV), psího koronaviru (CCoV), kočičího viru (FCoV), lidského koronaviru (HcoV), torovirů nebo arterivirů.
  32. 32. DNA podle kteréhokoliv z nároků 22 až 31, kde virionem je infekční, neinfekční nebo replikačně deficientní virus.
  33. 33. DNA podle kteréhokoliv z nároků 22 až 32, kde sekvence strukturního nebo nestrukturního genu, odvozená od koronaviru, byla modifikována substitucí, delecí nebo adicí jednoho nebo několika nukleotidů přirozené genové sekvence.
  34. 34. DNA podle kteréhokoliv z nároků 22 až 33, kde byly modifikovány sekvence genů S, N nebo M.
  35. 35. DNA podle kteréhokoliv z nároků 22 až 34, kde byla sekvence S genu, odvozeného od koronaviru, modifikována tak, aby vznikl zeslabený virus. 42 «· ♦· * » ♦ ** • t t · ♦ · • · « · * »·· • · I * · • · · · · ··#
  36. 36. DNA podle kteréhokoliv z nároků 22 až 35, kde byla sekvence genu S, odvozeného od koronaviru, modifikována tak, aby byl získán virion s tropismem odlišným od tropismu koronaviru.
  37. 37. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 22 až 36.
  38. 38. Vektor podle nároku 37, kde tímto vektorem je plasmid nebo bakteriální artificiální chromosom (BAC).
  39. 39. Hostitelská buňka, obsahující nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 22 až 38. 40. E. coli, uchovaná pod číslem CECT 5265 ve Španělské sbírce typových kultur.
  40. 41. Způsob výroby rekombinantního virionu nebo rekombinantní virové RNA, vyznačující se tím, že se DNA podle kteréhokoliv z nároků 22 až 38 introdukuje do hostitelské buňky, hostitelské buňky, obsahující tuto DNA, se kultivují za podmínek, které umožňují její expresi, a získá se rekombinantní virion nebo virová RNA.
  41. 42. Způsob výroby rekombinantního virionu nebo rekombinantní virové RNA, vyznačující se tím, že se DNA podle kteréhokoliv z nároků 22 až 38 smísí s chemikáliemi, biologickými činidly a/nebo buněčnými extrakty, za podmínek, umožňujících transkripci DNA, a získá se rekombinantní virion nebo virová RNA.
  42. 43. Způsob podle nároku 41 nebo 42, v y z n a č uj í c í se tím, že se použije DNA podle kteréhokoliv z nároků 23 až 38.
  43. 44. Virion, připravitelný způsobem podle kteréhokoliv z nároků 41 až 43.
  44. 45. Virion podle nároku 44, kde tímto virionem je infekční, zeslabený, replikačně defektivní nebo inaktivní virus.
  45. 46. Virion podle nároku 44 nebo 45, který obsahuje modifikovaný S, M nebo N gen.
  46. 47. Virion podle nároku 46, kde modifikace S genu vede ke zeslabenému viru.
  47. 48. Virion podle nároku 46, kde modifikace S genu vede k virionu se změněným tropismem.
  48. 49. Virová RNA, připravitelná způsobem podle nároku 41 až 43.
  49. 50. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 22 až 38, hostitelskou buňku podle nároku 39 nebo 40, virion podle kteréhokoliv z nároků 41 až 48 nebo virovou RNA podle nároku 49.
  50. 51. Vakcína schopná ochránit živočicha nebo člověka proti chorobám, způsobeným infekčním činidlem, vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 22 až 38, hostitelskou buňku podle nároku 39 nebo 40, virion podle kteréhokoliv z nároků 41 až 48 nebo virovou RNA podle nároku 49.
  51. 52. Vakcína podle nároku 51,vyznačující se tím, že nukleová kyselina obsahuje sekvence, kódující nejméně jeden antigen, vhodný pro indukci imunitní odpovědi proti infekčnímu činidlu, nejméně jeden gen, interferující s replikací infekčního činidla, nebo protilátku, poskytující ochranu proti uvedenému infekčnímu činidlu.
  52. 53. Vakcína podle nároku 51 nebo 52, vyznačující se tím, že uvedený virionový vektor exprimuje nejméně jednu molekulu, interferující s replikací, antigen, schopný indukce systémové imunitní odpovědi a/nebo imunitní odpovědi v mukósních membránách proti různým infekčním činidlům, které se množí v respiračních nebo intestinálních mukósních membránách nebo v jiných tkáních.
  53. 54. Multivalentní vakcína, schopná ochránit živočicha nebo člověka proti infekci, způsobené více než jedním infekčním činidlem, vyznačující se tím, že obsahuje více než jednu nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 22 až 38, hostitelskou buňku podle nároku 39 nebo 40, virion podle kteréhokoliv z nároků 41 až 48 nebo virovou RNA podle nároku 49, z nichž každý exprimuje antigen, vhodný pro indukci imunitní odpovědi proti každému z uvedených infekčních činidel, interferující molekulu nebo protilátku, poskytující ochranu proti každému z uvedených infekčních činidel.
  54. 55. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 51 až 54, vyznačující se tím, že navíc obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
  55. 56. Způsob přípravy DNA podle kteréhokoliv z nároků 22 až 38, vyznačující se tím, že se interferující defektní genom, odvozený od koronaviru, klonuje za exprese promotoru v BAC vektoru, a že se reinserují deletované sekvence v rámci defektního genomu.
  56. 57. Způsob přípravy DNA podle nároku 56, v y z n a č u j í c í se tím, že se ve virovém genomu identifikují toxické sekvence před reinsercí do DNA.
  57. 58. Způsob přípravy DNA podle nároku 56 nebo 57, vyznačující se tím, že se při kompletaci genomu toxické sekvence ve virovém genomu použijí jako poslední sekvence.
  58. 59. Infekční klon, odvozený od koronaviru, obsahující úplnou délku kopie DNA, komplementární (cDNA) ke genomové RNA (gRNA) koronaviru, klonovanou za transkripčně regulační sekvence.
  59. 60. Infekční klon podle nároku 59, kde je jmenovaný koronavirus představován isolátem viru přenosné gastroenteritidy prasat (TGEV).
  60. 61. Infekční klon podle nároku 59 nebo 60, kde uvedený promotor je bezprostředně . počátečním (IE) promotorem exprese cytomegaloviru (CMV).
  61. 62. Infekční klon podle kteréhokoliv z nároků 59 až 61, kde uvedená úplná délka cDNA sousedí na 3' konci s poly(A) řetězcem, ribozymem delta viru hepatitidy (HDV) a terminačními a polyadenylačními sekvencemi hovězího růstového hormonu (BGH).
  62. 63. Infekční klon podle kteréhokoliv z nároků 59 až 62, kde uvedená infekční cDNA je klonována v bakteriálním artificiálním chromosomu (BAC).
  63. 64. Způsob získání infekčního klonu podle kteréhokoliv z nároků 59 až 63, 45 ·· ·· • ♦ · ♦ • · * • * vyznačující se tím, že se sestrojí úplná délka cDNA z gRNA koronaviru a připojí se transkripčně - regulační prvky.
  64. 65. Způsob podle nároku 64, vyznačující se tím, že se provede konstrukce úplné délky cDNA z gRNA koronaviru tak, že se: (i) klonuje interferující defektní genom, odvozený od jmenovaného koronaviru, s promotorem exprese v BAC; (ii) kompletují delece interferujícího defektního genomu a regenerují deletované sekvence s ohledem na infekční gRNA; (iii) identifikují sekvence toxické pro bakterie, ve kterých mají být klonovány, odstraní toxické sekvence a inserují uvedené toxické sekvence těsně před provedením transfekce v eukaryontních buňkách, aby se získal klon cDNA, odpovídající gRNA koronaviru.
  65. 66. Rekombinantní virový vektor, který obsahuje infekční klon podle kteréhokoliv z nároků 59 až 63 nebo připravitelný způsobem podle kteréhokoli z nároků 58 nebo 59, modifikovaný tak, aby obsahoval heterologní nukleovou kyselinu, inserovanou do infekčního klonu, za podmínek, které umožňují expresi této heterologní nukleové kyseliny.
  66. 67. Vektor podle nároku 60, kde heterologní nukíeová kyselina je vybrána mezi genem a fragmentem genu, který kóduje požadovaný produkt genu.
  67. 68. Způsob výroby požadovaného produktu, vyznačující se tím, že se kultivuje hostitelská buňka, která obsahuje virový vektor podle kteréhokoli z nároků 60 nebo 61, za podmínek umožňujících expresi heterologní nukleové kyseliny a získání požadovaného produktu.
  68. 69. Způsob výroby modifikovaného rekombinantního koronaviru, obsahujícího heterologní nukleovou kyselinu v sekvenci cDNA, odpovídající genomu koronaviru, vyznačující setím, že se do hostitelské buňky zavede virový vektor podle kteréhokoli z nároků 60 nebo 61, tato buňka, obsahující jmenovaný virový vektor, se kultivuje za podmínek, které umožňují expresi a replikaci virového vektoru a získají se viriony z modifikovaného rekombinantního koronaviru.
  69. 70. Vakcína, schopná ochránit živočicha proti infekci, způsobené infekčním činidlem, vyznačující se tím, že obsahuje (i) nejméně jeden virový vektor podle nároku 70 nebo 61, který exprimuje nejméně jeden antigen, vhodný pro indukci imunitní odpovědi proti infekčnímu činidlu, nebo protilátku, která poskytuje ochranu proti infekčnímu činidlu, výhodně společně s (ii) s farmaceuticky přijatelným excipientem.
  70. 71. Vakcína podle nároku 64, vyznačující se tím, že virový vektor exprimuje nejméně jeden antigen, schopný indukce systémové imunitní odpovědi a/nebo imunitní odpovědi v mukósních membránách, proti různým infekčním činidlům, které se množí v respiračních nebo intestinálních mukósních membránách.
  71. 72. Multivalentní vakcína, schopná ochrany živočicha proti infekci způsobené více než jedním infekčním činidlem, vyznačující se tím, že obsahuje (i) virový vektor podle nároku 60 nebo 61, který exprimuje antigen, vhodný pro indukci imunitní odpovědi proti uvedeným infekčním činidlům, nebo protilátky, které poskytují ochranu proti infekčním činidlům, výhodně společně s (ii) farmaceuticky přijatelným excipientem.
  72. 73. Multivalentní vakcína, schopná ochrany živočicha proti infekci, způsobené více než jedním infekčním činidlem, vyznačující se tím, že obsahuje (i) více než jeden virový vektor podle nároku 60 nebo 61, z nichž každý exprimuje antigen vhodný pro indukci imunitní odpovědi proti každému ze zmíněných infekčních činidel, nebo protilátky, které poskytují ochranu proti každému ze zmíněných infekčních činidel, výhodně společně s (ii) farmaceuticky přijatelným excipientem.
  73. 74. Způsob výroby rekombinantního koronaviru, vyznačující setím, že se do hostitelské buňky zavede infekční klon podle kteréhokoliv z nároků 59 až 63 nebo připravitelný podle nároku 64 nebo 65, hostitelská buňka, která obsahuje tento infekční klon, se kultivuje za podmínek, které umožňují expresi infekčního klonu, replikaci infekčního klonu a získají se viriony z rekombinantních koronavirů, obsahujících kompletní genom koronaviru.
CZ20021882A 1999-12-03 2000-11-30 Zpusob prípravy DNA odvozené od koronaviru, príslušné infekcní klony, vektory a vakcíny CZ302785B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES009902673A ES2170622B1 (es) 1999-12-03 1999-12-03 Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20021882A3 true CZ20021882A3 (cs) 2002-11-13
CZ302785B6 CZ302785B6 (cs) 2011-11-09

Family

ID=8310818

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20021882A CZ302785B6 (cs) 1999-12-03 2000-11-30 Zpusob prípravy DNA odvozené od koronaviru, príslušné infekcní klony, vektory a vakcíny

Country Status (27)

Country Link
US (4) US7445928B2 (cs)
EP (2) EP1437400A3 (cs)
JP (1) JP4637432B2 (cs)
KR (1) KR100755814B1 (cs)
CN (3) CN100402643C (cs)
AR (1) AR027893A1 (cs)
AT (1) ATE267246T1 (cs)
AU (2) AU785081B2 (cs)
BR (1) BR0016145A (cs)
CA (1) CA2393325A1 (cs)
CZ (1) CZ302785B6 (cs)
DE (1) DE60010921T3 (cs)
DK (1) DK1234024T4 (cs)
ES (2) ES2170622B1 (cs)
HU (1) HU228205B1 (cs)
IL (2) IL149859A0 (cs)
MX (1) MXPA02005525A (cs)
NO (1) NO331812B1 (cs)
NZ (1) NZ518990A (cs)
PL (1) PL206816B1 (cs)
PT (1) PT1234024E (cs)
RS (1) RS50372B (cs)
SI (1) SI1234024T2 (cs)
SK (1) SK7612002A3 (cs)
TR (1) TR200401186T4 (cs)
WO (1) WO2001039797A2 (cs)
ZA (1) ZA200203560B (cs)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2170622B1 (es) 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.
BR0209837A (pt) * 2001-05-17 2004-12-14 Univ Utrecht Partìcula semelhante a vìrus isolada ou recombimante capaz de replicação, composição, e, método para inibir ou bloquear uma infecção com um coronavìrus ou partìcula semelhante a coronavìrus
US7556957B2 (en) 2001-05-17 2009-07-07 Stichting Voor De Technische Wetenschappen Coronavirus-like particles comprising functionally deleted genomes
US7906311B2 (en) 2002-03-20 2011-03-15 Merial Limited Cotton rat lung cells for virus culture
US7371837B2 (en) * 2004-07-21 2008-05-13 The University Of Hong Kong Human virus causing respiratory tract infection and uses thereof
EP1619246A1 (en) * 2004-07-23 2006-01-25 Université de la Méditerranée, Aix-Marseille II RNA dependent RNA polymerases from coronavirus and their use in molecular biology and drug screening
EP1632247A1 (en) * 2004-09-03 2006-03-08 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding FMDV proteins capable of associating into a virus-like particle
AU2005279303B2 (en) 2004-09-03 2011-10-27 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle
CN101389214A (zh) 2004-10-22 2009-03-18 雷维维科公司 具有基因修饰免疫系统的有蹄类动物
EP1792996A1 (en) * 2005-12-01 2007-06-06 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
JP2007312649A (ja) * 2006-05-24 2007-12-06 Japan Health Science Foundation 再構築された感染性レトロウイルスゲノムクローンｄｎａ及びそれを含む微生物ならびにそれらの製造方法
DK2348827T3 (en) 2008-10-27 2015-07-20 Revivicor Inc IMMUNICIPLY COMPROMATED PETS
FR2947839A1 (fr) * 2009-07-09 2011-01-14 Centre Nat Rech Scient Nouveaux agents antibacteriens
WO2012117045A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Intervet International B.V. Infectious bronchitis virus (ibv) spike protein as subunit vaccine
GB201307528D0 (en) * 2013-04-26 2013-06-12 Univ Leuven Kath Bacterial artificial chromosomes
CN106459997A (zh) * 2014-05-16 2017-02-22 耶鲁大学 用于疫苗应用的高效价病毒样囊泡的进化
CA2948181A1 (en) * 2014-05-16 2015-11-19 Yale University Virus like vesicles (vlvs) based vaccines to prevent or treat chronic hepatitis b virus (hbv) infection
PL3198008T3 (pl) 2014-09-22 2020-03-31 Regents Of The University Of Minnesota Układ wykorzystujący odwrotną genetykę wirusa pichinde i sposoby zastosowania
GB201603374D0 (en) 2016-02-26 2016-04-13 Ucl Business Plc Packaging cell
CN107190022B (zh) * 2017-06-28 2020-10-30 浙江大学 一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法
US11254953B2 (en) * 2018-04-18 2022-02-22 Utah State University Compositions and methods for zika virus characterization and vaccine development
KR102119875B1 (ko) * 2019-03-19 2020-06-05 한국화학연구원 한국형 중동호흡기증후군 코로나바이러스 감염성 변이 유전자 및 이의 용도
CN110468113A (zh) * 2019-08-07 2019-11-19 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 重组修饰的猪传染性胃肠炎病毒强毒株及其应用
CN110656120A (zh) * 2019-10-16 2020-01-07 中国医学科学院医学生物学研究所 一种乙脑病毒sa14-14-2的克隆方法及应用
CN111662885A (zh) * 2020-06-22 2020-09-15 扬州大学 两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救与应用
CN112852873B (zh) * 2021-02-04 2023-03-24 华中农业大学 一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法
CN115094142B (zh) * 2022-07-19 2024-05-28 中国医学科学院肿瘤医院 用于诊断肺肠型腺癌的甲基化标志物

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5833975A (en) * 1989-03-08 1998-11-10 Virogenetics Corporation Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence
US5288641A (en) * 1984-06-04 1994-02-22 Arch Development Corporation Herpes Simplex virus as a vector
US5550289A (en) * 1985-01-07 1996-08-27 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(1,(1-1)-dialkyloxy)-and N-(1,(1-1)-dialkenyloxy alk-1-yl-N-N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) * 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5106733A (en) * 1987-06-25 1992-04-21 Immunex Corporation Bovine granulocyte-macrophage colony stimulating factor
WO1990009441A1 (en) 1989-02-01 1990-08-23 The General Hospital Corporation Herpes simplex virus type i expression vector
US5811103A (en) * 1989-03-19 1998-09-22 Akzo Nobel N.V. Hog cholera virus vaccine and diagnostic
US5703055A (en) * 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
CA2039921A1 (en) 1990-04-16 1991-10-17 Xandra O. Breakefield Transfer and expression of gene sequences into central nervous system cells using herpes simplex virus mutants with deletions in genes for viral replication
US5264618A (en) * 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
EP0575491B1 (en) * 1991-03-07 2003-08-13 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
ES2026827A6 (es) * 1991-03-26 1992-05-01 Ercros Sa Procedimiento para la produccion de una vacuna subunidad contra el parvovirus porcino.
US6033904A (en) * 1992-01-13 2000-03-07 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US5382425A (en) * 1992-01-13 1995-01-17 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US5658724A (en) * 1992-07-31 1997-08-19 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Herpes simplex virus strains deficient for the essential immediate early genes ICP4 and ICP27 and methods for their production, growth and use
AU681874B2 (en) * 1993-02-08 1997-09-11 Bayer Corporation Process for growing porcine reproductive and respiratory syndrome virus and its use in vaccines
CA2164088C (en) * 1993-06-07 2005-06-14 Gary J. Nabel Plasmids suitable for gene therapy
US20020146392A1 (en) 1993-06-24 2002-10-10 Frank L. Graham Helper dependent adenovirus vectors based on site-specific recombinases
WO1995003400A1 (en) * 1993-07-23 1995-02-02 Johns Hopkins University School Of Medicine Recombinationally targeted cloning in yeast artificial chromosomes
US6015686A (en) * 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
WO1995024929A2 (en) * 1994-03-15 1995-09-21 Brown University Research Foundation Polymeric gene delivery system
WO1995030018A2 (en) * 1994-04-29 1995-11-09 Immuno Aktiengesellschaft Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions
GB2289279B (en) * 1994-05-13 1998-09-16 Iberica Cyanamid Diagnostic kits and vaccines containing recombinant PRRSV proteins
US5585096A (en) * 1994-06-23 1996-12-17 Georgetown University Replication-competent herpes simplex virus mediates destruction of neoplastic cells
GB9415319D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Medical Res Council HSV viral vector
WO1996015779A1 (en) 1994-11-21 1996-05-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Unique associated kaposi's sarcoma virus sequences and uses thereof
US5719131A (en) * 1994-12-09 1998-02-17 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles containing dialkylamine lipophilic groups for intracellular delivery of therapeutic molecules
EP0811057B1 (en) 1995-02-21 2006-04-26 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Viral preparations, vectors, immunogens, and vaccines
US6043232A (en) * 1997-07-23 2000-03-28 Nitromed, Inc. Nitroso esters of beta-oxo-amides and aryl propionic acid derivatives of non-steroidal antiinflammatory drugs
US5820869A (en) * 1995-06-07 1998-10-13 American Home Products Corporation Recombinant raccoon pox viruses and their use as an effective vaccine against feline immunodeficiency virus infection
US6019980A (en) * 1995-06-07 2000-02-01 Connaught Laboratories Limited Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines
US5705385A (en) * 1995-06-07 1998-01-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5851826A (en) 1995-07-26 1998-12-22 Children's Medical Center Corporation Helper virus-free herpesvirus vector packaging system
US5795872A (en) * 1995-09-19 1998-08-18 Pharmadigm, Inc. DNA construct for immunization
US6133243A (en) 1996-02-22 2000-10-17 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Liposomal-viral DNA complexes for treating disease
ES2109189B1 (es) * 1996-03-14 1998-05-16 Iberica Cyanamid Vectores basados en genomas virales defectivos recombinantes y su empleo en la formulacion de vacunas.
FR2751224B1 (fr) * 1996-07-19 1998-11-20 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs
US5990091A (en) * 1997-03-12 1999-11-23 Virogenetics Corporation Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof
US6004777A (en) * 1997-03-12 1999-12-21 Virogenetics Corporation Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof
DE19733364A1 (de) * 1997-08-01 1999-02-04 Koszinowski Ulrich H Prof Verfahren zur Klonierung eines großen Virusgenoms
US7211379B2 (en) * 1997-10-03 2007-05-01 Merial Sas Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
UA78180C2 (uk) * 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти
US6391314B1 (en) * 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
US6517843B1 (en) * 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US6165493A (en) * 1997-10-22 2000-12-26 New York Blood Center, Inc. "Methods and compositions for decreasing the frequency of HIV, herpesvirus and sexually transmitted bacterial infections"
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
US20040062775A1 (en) * 1997-12-05 2004-04-01 Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD)
EP1037909B1 (en) * 1997-12-11 2007-06-13 University of Saskatchewan Postweaning multisystemic wasting syndrome virus from pigs
US6277621B1 (en) * 1998-02-26 2001-08-21 Medigene, Inc. Artificial chromosome constructs containing foreign nucleic acid sequences
EP1064024A4 (en) * 1998-03-13 2005-04-06 Univ Georgia Res Found VACCINES AGAINST CIRCOVIRUS INFECTIONS
US6497883B1 (en) * 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
ES2170622B1 (es) 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.
AU778110B2 (en) 1999-12-14 2004-11-18 Novartis Ag Bovine immunodeficiency virus (BIV) based vectors
WO2001090340A2 (en) * 2000-05-21 2001-11-29 University Of North Carolina At Chapel Hill Assembly of large viral genomes and chromosomes from subclones
DE10044648A1 (de) * 2000-09-08 2002-03-21 Aventis Behring Gmbh Verfahren zur Vermehrung oder zur Entfernung von Cirocoviren aus biologischem Material
HU228065B1 (en) * 2001-03-27 2012-09-28 Univ Saskatchewan Methods to culture circovirus

Also Published As

Publication number Publication date
ES2170622B1 (es) 2004-05-16
DK1234024T4 (da) 2010-10-11
JP2003515335A (ja) 2003-05-07
HUP0203305A3 (en) 2004-07-28
ES2170622A1 (es) 2002-08-01
WO2001039797A3 (en) 2002-01-24
TR200401186T4 (tr) 2004-07-21
NO20022419D0 (no) 2002-05-22
PL206816B1 (pl) 2010-09-30
SI1234024T2 (sl) 2010-10-29
CN100402643C (zh) 2008-07-16
AR027893A1 (es) 2003-04-16
NZ518990A (en) 2004-03-26
EP1234024A2 (en) 2002-08-28
KR20020060251A (ko) 2002-07-16
JP4637432B2 (ja) 2011-02-23
RS50372B (sr) 2009-11-10
AU785081B2 (en) 2006-09-14
PL356390A1 (en) 2004-06-28
SK7612002A3 (en) 2002-11-06
BR0016145A (pt) 2002-08-13
CN1872994A (zh) 2006-12-06
PT1234024E (pt) 2004-08-31
IL149859A (en) 2009-07-20
AU3005101A (en) 2001-06-12
EP1437400A3 (en) 2004-10-20
US20040086846A1 (en) 2004-05-06
CN1616670A (zh) 2005-05-18
YU37502A (sh) 2005-11-28
EP1234024B2 (en) 2010-06-16
CZ302785B6 (cs) 2011-11-09
ATE267246T1 (de) 2004-06-15
DK1234024T3 (da) 2004-09-13
WO2001039797A2 (en) 2001-06-07
US20030148325A1 (en) 2003-08-07
DE60010921T3 (de) 2011-01-05
DE60010921D1 (de) 2004-06-24
ZA200203560B (en) 2003-03-26
NO331812B1 (no) 2012-04-10
US7368557B2 (en) 2008-05-06
US7445928B2 (en) 2008-11-04
MXPA02005525A (es) 2004-09-10
DE60010921T2 (de) 2006-05-11
US20100167352A1 (en) 2010-07-01
EP1437400A2 (en) 2004-07-14
KR100755814B1 (ko) 2007-09-07
CN1402780A (zh) 2003-03-12
HUP0203305A2 (hu) 2003-01-28
CA2393325A1 (en) 2001-06-07
IL149859A0 (en) 2002-11-10
NO20022419L (no) 2002-07-30
SI1234024T1 (en) 2004-08-31
US20110142879A1 (en) 2011-06-16
ES2218276T3 (es) 2004-11-16
AU2006203327A1 (en) 2006-08-31
AU2006203327B2 (en) 2009-09-10
ES2218276T5 (es) 2010-10-07
HU228205B1 (en) 2013-01-28
EP1234024B1 (en) 2004-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2006203327B2 (en) Infectious clones
US7618802B2 (en) Compositions of coronaviruses with a recombination-resistant genome
EP1792996A1 (en) Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
NZ529691A (en) Coronaviruses and diagnosis, therapeutic use and vaccines derived thereof.
EP1741789A1 (en) Vectors based on recombinant defective viral genomes, and their use in the formulation of vaccines
EP1736539A1 (en) Attenuated SARS-CoV vaccines
US20060165723A1 (en) Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle
US7279327B2 (en) Methods for producing recombinant coronavirus
EP1650308A1 (en) Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle
EP4436596A1 (en) Coronavirus derived rna replicons and their use as vaccines
US20050152920A1 (en) Nucleic acid sequence comprising the rna packaging signal of a group 1 coronavirus and the applications thereof
ENJUANES SANCHEZ Patent 2393325 Summary

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20131130