CN112852873B - 一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法，属于动物传染病防治和生物技术领域。本发明基于BAC系统和同源重组一步克隆法拯救PDCoV CHN‑HN‑2014株重组病毒的反向遗传系统，将毒株的5个基因片段一步克隆至中间载体pBAC‑M‑PDCoV中，获得包含PDCoV CHN‑HN‑2014株全长cDNA的重组质粒pBAC‑CHN‑HN‑2014，转染细胞后拯救出重组病毒rCHN‑HN‑2014，从而建立了猪δ冠状病毒反向遗传操作平台，为深入研究PDCoV的感染和致病机制奠定了基础。同时，针对目前我国还没有可用的PDCoV疫苗的实际问题，本发明的PDCoV感染性克隆平台，还可以用于研制更加安全高效的新型PDCoV基因工程疫苗，该平台还可作为活病毒载体，用于多联疫苗的研制，因此本发明对于该病毒相关的研究具有重大价值。

Description

一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法

技术领域

本发明属于动物传染病防治和生物领域。具体涉及一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法。

背景技术

猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)属于冠状病毒科，δ冠状病毒属成员，有囊膜、基因组为单股正链RNA，是目前唯一一种成功分离的δ冠状病毒。Woo等人对香港地区2010-2011年采集自不同动物的样品进行冠状病毒检测时首次发现猪δ冠状病毒(Woo P.C.Y,Discovery of seven novel Mammalian and avian coronaviruses in thegenus deltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source ofalphacoronavirus and betacoronavirus and avian coronaviruses as the genesource of gammacoronavirus and deltacoronavirus.J.Virol.2012,86:3995-4008)。2014年初，PDCoV感染在美国首次爆发，并很快传至美国多个州，随后韩国、加拿大、中国、泰国、越南、老挝、日本等国家也相继报道检测到PDCoV(Wang L et al，Porcine coronavirusHKU15 detected in 9US states,2014.Emerg Infect Dis.2014,20(9):1594-1595；Saeng-Chuto K et al,Different Lineage of Porcine Deltacoronavirus inThailand,Vietnam and Lao PDR in 2015.Transbound Emerg Dis.2017,64(1):3-10)。到目前为止，国内外已有多个课题组分离到PDCoV，动物实验证实其对仔猪具有较强的致病性，能够导致仔猪出现呕吐、腹泻等典型的肠道疾病症状，剖检可见感染仔猪肠壁变薄、透明，盲肠、结肠扩张并伴有大量的黄色液体；组织病理学分析发现十二指肠、空肠、回肠绒毛严重萎缩(Ma Y M et al,Origin,evolution,and virulence of porcinedeltacoronaviruses in the United States.MBIO,2015,6(2):e00064；Dong et al,Isolation,genomic characterization,and pathogenicity of a Chinese porcinedeltacoronavirus strain CHN-HN-2014.Vet Microbiol.2016,196:98-106)。尽管与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)相比，PDCoV感染引起的死亡率较低，但其往往与PEDV、TGEV存在混合感染的现象，从而引起更严重的临床症状，威胁着养猪业的健康发展。作为近年来新发现的猪肠道冠状病毒，体外传代的PDCoV毒株数量相对于PEDV仍然较少，对PDCoV的感染和致病性的机制了解也不是十分清楚，也没有可用的疫苗和特异性抗病毒药物，因此，进一步加大流行病学调查、临床毒株的分离以及致病机制的研究具有重要价值。

病毒的反向遗传操作系统可通过对靶基因进行改造，包括突变、缺失或插入外源基因等操作实现病毒改造，研究病毒编码蛋白的功能，确定毒力基因，为新型疫苗以及活病毒载体疫苗的研发提供技术平台。目前构建正链RNA病毒反向遗传操作系统的方法主要有4种：1)靶向RNA重组技术构建病毒的反向遗传操作系统；2)利用细菌人工染色体(bacterialartificial chromosome,BAC)系统；3)利用体外cDNA连接的方法构建病毒的反向遗传操作系统；4)利用痘苗病毒作为载体构建病毒的感染性克隆(Almazán F,Coronavirus reversegenetic systems:infectious clones and replicons.Virus Res.2014,189:262-270；Masters PS,Coronavirus reverse genetics by targeted RNA recombination.CurrTop Microbiol Immunol.2005,287:133-159)。然而，PDCoV感染性克隆的构建主要采用体外cDNA连接的方法，该方法利用II型限制性内切酶将病毒的多个cDNA片段连接起来，再利用T7 RNA聚合酶体外转录获得全长RNA，电转至敏感细胞系，拯救出重组病毒。用该方法进行病毒拯救通常需要同时电转相应病毒的N基因转录本以提高其拯救效率，同时，T7 RNA聚合酶在工作时可能会产生突变，这在一定程度上影响了该方法的拯救效率。而BAC系统不涉及到体外连接和转录，且重组病毒的拯救效率高，加上成熟的CRISPR/Cas9技术，可高效的改造重组质粒，该系统具有更强的优势。另外，现有的基于BAC系统构建的反向遗传操作系统，构建策略大多采用了多步同源重组方法，周期相对较长。基于上述的PDCoV反向遗传操作系统构建的缺陷和不足，我们采用BAC系统和同源重组一步克隆方法，快速构建了PDCoV感染性克隆质粒，转染易感细胞拯救出重组病毒，为后续PDCoV的研究奠定良好的基础。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法。本发明针对猪δ冠状病毒CHN-HN-2014株(GenBank登录号：KT336560)(Dong N,Fang L,Yang H,Liu H,Du T,Fang P,Wang D,Chen H,Xiao S.Isolation,genomic characterization,andpathogenicity of a Chinese porcine deltacoronavirus strain CHN-HN-2014.VetMicrobiol.2016,196:98-106)，采用BAC系统和同源重组一步克隆方法，得到一种猪δ冠状病毒CHN-HN-2014株感染性克隆质粒pBAC-CHN-HN-2014以及重组病毒rCHN-HN-2014，为PDCoV的后续研究提供非常有价值的技术平台。

本发明的技术方案如下：

一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)提取猪δ冠状病毒RNA并反转录成cDNA；

(2)以上述cDNA为模板，设计引物分别进行PCR扩增，获得猪δ冠状病毒的5’端基因序列、3’端基因序列以及5个基因片段，其中，所述5个基因片段之间含有20bp的同源序列，此外，将15121位点C沉默突变成A，消除了一个ClaI内切酶序列，作为遗传标记；

(3)以pBAC-AJ1102质粒为模板，设计引物分别进行PCR扩增，获得CMV启动子和HDV-BGH基因序列；

(4)利用BAC系统，通过ApaLI和HindIII限制性内切酶和多步融合PCR方法将CMV启动子、5’端基因序列、3’端基因序列、27个腺嘌呤脱氧核苷酸(A)的poly(A)结构、丁型肝炎病毒(HDV)核酶自切割位点以及牛生长激素终止序列(BGH)克隆至低拷贝载体pBeloBAC11中获得中间载体pBAC-M-PDCoV；

(5)将5个基因片段按比例同源重组一步克隆至中间载体pBAC-M-PDCoV中获得重组质粒pBAC-CHN-HN-2014；

(6)将重组产物转化至DH10B化学感受态细胞中，利用PCR筛选阳性克隆，将测序正确的阳性克隆扩大培养后提取质粒。

所述5’端基因序列、3’端基因序列以及5个基因片段的序列分别为：

5’端基因序列：如SEQ ID NO:1所示；

3’端基因序列：如SEQ ID NO:2所示；

基因片段A：如SEQ ID NO:3所示；

基因片段B：如SEQ ID NO:4所示；

基因片段C：如SEQ ID NO:5所示；

基因片段D：如SEQ ID NO:6所示；

基因片段E：如SEQ ID NO:7所示。

所述用于PCR扩增5’端基因序列、3’端基因序列以及5个基因片段的引物分别为：

PDCoV-5’-F：SEQ ID NO:11

PDCoV-5’-R：SEQ ID NO:12

PDCoV-3’-F：SEQ ID NO:13

PDCoV-3’-R：SEQ ID NO:14

A-F：SEQ ID NO:15

A-R：SEQ ID NO:16

B-F：SEQ ID NO:17

B-R：SEQ ID NO:18

C-F：SEQ ID NO:19

C-R：SEQ ID NO:20

D-F：SEQ ID NO:21

D-R：SEQ ID NO:22

E-F：SEQ ID NO:23

E-R：SEQ ID NO:24。

所述CMV启动子的序列如SEQ ID NO:8所示，所述HDV-BGH基因的序列如SEQ IDNO:9所示。

所述用于PCR扩增CMV启动子、HDV-BGH基因的引物分别为：

CMV-F：SEQ ID NO:25

CMV-R：SEQ ID NO:26

HDV-F：SEQ ID NO:27

BGH-R：SEQ ID NO:28。

步骤(5)中，所述5个基因片段与中间载体pBAC-M-PDCoV的摩尔比为1:2:2:1:1:1。

更为具体的步骤如下：

(1)PDCoV CHN-HN-2014株RNA的提取与cDNA的制备；

(2)PDCoV CHN-HN-2014株相关基因的扩增和克隆：以上述cDNA为模板，利用引物对PDCoV-5’-F/R(SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12)，PDCoV-3’-F/R(SEQ ID NO:13，SEQ IDNO:14)，A-F/R(SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16)，B-F/R(SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18)，C-F/R(SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20)，D-F/R(SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22)，E-F/R(SEQ IDNO:23，SEQ ID NO:24)进行PCR扩增，获得相应的基因片段。其中，A(348-4538，4191bp)，B(4519-9652，5134bp)，C(9633-15132，5500bp)，D(15113-19455，4343bp)，E(19436-23403，3968bp)基因片段之间含有20bp的同源序列，此外，通过引物设计将15121位点C沉默突变成A，消除了一个ClaI内切酶序列(ATCGAT)，作为遗传标记，区分亲本病毒与重组病毒。以实验室构建的pBAC-AJ1102(PEDV AJ1102株cDNA克隆质粒，本实验室保存)为模板，CMV-F/R(SEQID NO:25，SEQ ID NO:26)和HDV-F/BGH-R(SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28)为引物对，分别进行PCR扩增，获得CMV启动子和HDV-BGH基因序列。将这些基因片段分别克隆至pJET1.2/blunt vector中进行测序分析，质粒分别命名为pJET1.2-CMV，pJET1.2-PDCoV-5’(1-375)，pJET1.2-PDCoV-3’(23365-25421bp)，pJET1.2-A，pJET1.2-B，pJET1.2-C，pJET1.2-D，pJET1.2-E，pJET1.2-HDV-BGH。

(3)中间载体(pBAC-M-PDCoV)的构建：利用BAC系统，通过ApaLI和HindIII限制性内切酶和多步融合PCR方法将CMV启动子，PDCoV CHN-HN-2014株5’端基因序列(1-375bp，3’端包含AvrII限制性内切酶)，PDCoV CHN-HN-2014株3’端基因序列(23365-25421bp，5’端包含包括BamHI限制性内切酶)，27个腺嘌呤脱氧核苷酸(A)的poly(A)结构，丁型肝炎病毒(HDV)核酶自切割位点以及牛生长激素终止序列(BGH)克隆至低拷贝载体pBeloBAC11中获得中间载体pBAC-M-PDCoV；

(4)PDCoV CHN-HN-2014株全长cDNA克隆质粒(pBAC-CHN-HN-2014)构建：以上述测序正确的pJET1.2-A，pJET1.2-B，pJET1.2-C，pJET1.2-D，pJET1.2-E质粒为模板，A-F/R(SEQID NO:15，SEQ ID NO:16)，B-F/R(SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18)，C-F/R(SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20)，D-F/R(SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22)，E-F/R(SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24)为引物对，PCR扩增5个基因片段，A(SEQ ID NO:3)，B(SEQ ID NO:4)，C(SEQ ID NO:5)，D(SEQ ID NO:6)，E(SEQ ID NO:7)，每个片段之间含有20bp的同源序列，其中，A片段的5’端和E片段的3’端分别与经AvrII和BamHI线性化的pBAC-M-PDCoV两端存在20bp的同源臂。然后，5个片段通过一定的比例同源重组一步克隆至pBAC-M-PDCoV中获得重组质粒pBAC-CHN-HN-2014。

(5)将重组产物转化至DH10B化学感受态细胞中，利用PCR筛选阳性克隆；

(6)将测序正确的阳性克隆扩大培养后提取质粒；

(7)将提取的质粒用Lipofectamine 3000转染至LLC-PK1细胞，转染4h后，换上含有10μg/mL胰酶的无血清DMEM培养基，逐日观察细胞病变。

本发明的有益效果是：

本发明提供一种基于BAC系统和同源重组一步克隆方法快速获得的PDCoV CHN-HN-2014株全长cDNA感染性克隆质粒以及重组病毒rCHN-HN-2014的方法，为深入研究PDCoV的遗传变异以及潜在的跨种传播机制、毒力基因、病毒感染与致病机制及疫苗开发等提供有力的技术平台。本发明还具有同源重组效率高，阳性菌落含量高，周期短等优点。

附图说明

图1：猪δ冠状病毒CHN-HN-2014株感染性克隆构建示意图。

图2：间接免疫荧光(IFA)鉴定拯救病毒rCHN-HN-2014的图片。附图说明：A图：正常未感染病毒的LLC-PK1细胞在倒置显微镜下的图片；B图：PDCoV野生型病毒CHN-HN-2014株感染的LLC-PK1细胞在倒置显微镜下的图片；C图：PDCoV拯救病毒rCHN-HN-2014株感染的LLC-PK1细胞在倒置显微镜下的图片。

图3：RT-PCR分析鉴定遗传标记的图片。

图4：DNA测序分析遗传标记的图片。

图5：PDCoV rCHN-HN-2014株与CHN-HN-2014株体外一步生长曲线比较。

图6：rCHN-HN-2014与CHN-HN-2014在LLC-PK1细胞上形成的空斑表型比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：

1.主要试验材料、载体、质粒、试剂与相关培养基或溶液的配方：

PDCoV CHN-HN-2014株：由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室病毒分室分离鉴定保存(Dong N,Fang L,Yang H,Liu H,Du T,Fang P,Wang D,Chen H,XiaoS.Isolation,genomic characterization,and pathogenicity of a Chinese porcinedeltacoronavirus strain CHN-HN-2014.Vet Microbiol.2016,196:98-106)。全基因组序列如GenBank登录号：KT336560所示。

pBAC-AJ1102为含PEDV AJ1102株全长cDNA的感染性克隆：为华中农业大学农业微生物学国家重点实验室病毒分室构建保存。

LLC-PK1细胞：购自American Type Culture Collection(ATCC)。

氯霉素(货号：BS049B)：购自Biosharp公司。

各种限制性内切酶：购自New England Biolabs公司。

DMEM培养基，T4 DNA ligase(货号：15224025)，Lipofectamine 3000(货号：L3000015),pJET1.2/blunt vector均购自美国Thermofisher Scientific公司。

FastPfu DNA Polymerase购自TransGen Biotech公司。TranscriptorReverse Transcriptase(货号：39083420)。

胎牛血清(FBS，货号：P30-3302)：购自美国PAN Biotech公司。

Cycle Pure Kit(货号：D6492-02)，Gel Extraction Kit(货号：D2500-02)：购自美国Omega Bio-tek公司。

Infusion Clone Kit(货号：639648)，Plasmid DNA purification Kit(货号：740410.50)：购自TAKARA公司。

DH10B化学感受态细胞：购自上海超研生物技术有限公司。

pBeloBAC11载体(货号：P1028)购自上海禾午生物科技有限公司。

LB培养基的配制：称取5g蛋白胨，2.5g酵母提取物，5g NaCl于1L的锥形瓶中，加ddH₂O定容至500mL，121℃高压灭菌20min。

2.猪δ冠状病毒CHN-HN-2014株感染性克隆质粒构建

2.1PDCoV CHN-HN-2014株RNA的提取与cDNA的制备

利用TRIzol试剂提取PDCoV CHN-HN-2014株的基因组RNA。以提取的RNA为模板，利用Transcriptor First strand cDNA synthesis Kit进行反转录获得cDNA，反转录条件如下：1μ1oligo(dT)18或片段特异性下游引物，12μL提取的RNA，补加ddH₂O至总体积为13μL，混匀后65℃孵育10min，冰上孵育5min后，加入4μL 5×RT reaction buffer，2μL dNTP混合物，0.5μLRNase inhibitor，0.5μL Transcriptor Reverse Transcriptase，总体积为20μL，55℃孵育30min，85℃孵育10min，即获得cDNA，用于后续实验。

2.2PDCoV CHN-HN-2014株相关基因的扩增和克隆

以PDCoV CHN-HN-2014株cDNA为模板，利用引物对PDCoV-5’-F/R(SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12)，PDCoV-3’-F/R(SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14)，A-F/R(SEQ ID NO:15，SEQID NO:16)，B-F/R(SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18)，C-F/R(SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20)，D-F/R(SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22)，E-F/R(SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24)分别进行PCR扩增，获得相应的基因片段。其中，A(SEQ ID NO:3)，B(SEQ ID NO:4)，C(SEQ ID NO:5)，D(SEQ ID NO:6)，E(SEQ ID NO:7)基因片段之间含有20bp的同源序列，此外，通过引物设计将15121位点C人为沉默突变成A，消除了一个ClaI内切酶序列(ATCGAT→ATAGAT)，作为遗传标记。PCR反应体系如下：10μL 5×PCR reaction buffer，4μL dNTP混合物，10μM上下游引物，cDNA模板2μL，

FastPfu DNA Polymerase 1μL，加ddH₂O至总体积为50μL。反应条件如下：95℃2min；95℃20s；95℃20s，58℃20s，72℃2min；34个循环后，72℃延伸5min。反应结束后，将扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，按照说明书用Gel Extraction Kit进行回收，回收产物即为病毒相关的基因片段。

以实验室构建的pBAC-AJ1102(PEDV AJ1102株cDNA克隆质粒)为模板，CMV-F/R(SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26)和HDV-F/BGH-R(SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28)为引物对，分别进行PCR扩增，获得CMV启动子和HDV-BGH基因序列。

将上述所获得的基因片段分别克隆至pJET1.2/blunt vector(Thermoscientific)中，进行测序分析，保证序列的真实性,片段克隆反应体系如下：5μL 2×Reaction buffer，PCR产物4μL，0.5μL pJET1.2/blunt vector以及0.5μL T4 DNA ligase，总体积为10μL，25℃30min，然后转化DH5α感受态，挑取阳性克隆送武汉擎科生物技术有限公司测序，并提取阳性质粒，分别命名为pJET1.2-CMV，pJET1.2-PDCoV-5’(1-375)，pJET1.2-PDCoV-3’(23365-25421bp)，pJET1.2-A，pJET1.2-B，pJET1.2-C，pJET1.2-D，pJET1.2-E，pJET1.2-HDV-BGH。

2.3中间载体pBAC-M-PDCoV的构建：

2.3.1中间片段(M-PDCoV)的扩增：将上述CMV-F/R(SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26)引物对扩增获得的CMV基因片段与PDCoV-5’-F/R(SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12)引物对扩增获得的PDCoV CHN-HN-2014株PDCoV 5’端(1-375bp)基因片段通过重叠延伸PCR方法得到融合片段1。重叠延伸PCR体系：10μL 5×PCR reaction buffer，4μL dNTP混合物，10μM上下游引物(CMV-F/PDCoV-5’-R)，2μL DNA模板(等摩尔量的CMV和PDCoV-5’)，

FastPfu DNA Polymerase 1μL，加ddH₂O至总体积为50μL。反应条件如下：95℃2min；95℃20s；95℃20s，58℃20s，72℃2min；34个循环后，72℃延伸5min。反应结束后，将扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，按照说明书用Gel Extraction Kit进行回收，回收产物即为融合片段1。

将PDCoV-3’-F/R(SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14)引物对扩增获得的PDCoV CHN-HN-2014株3’端(23365-25421bp)基因片段与HDV-F/BGH-R(SEQ ID NO:27，SEQ IDNO:28)引物对扩增获得的HDV-BGH基因片段通过重叠延伸PCR方法得到融合片段2；最后将融合片段1和2通过重叠延伸PCR方法得到中间片段M-PDCoV(SEQ ID NO:10)，中间片段两端分别含有ApaLI和HindIII限制性内切酶序列。

2.3.2中间片段M-PDCoV克隆至pBeloBAC11载体：将pBeloBAC11载体和中间片段M-PDCoV分别经过ApaLI和HindIII双酶切处理2h，经1％琼脂糖凝胶电泳后，按照说明书用GelExtraction Kit进行回收。利用T4 DNA ligase进行连接，连接反应体系为：M-PDCoV200ng，线性化的pBeloBAC11载体200ng，1μLT4 DNA ligase，1μL 10×Ligase buffer，总体积为10μL，22℃5h，然后转化DH10B感受态，挑取阳性克隆，提取质粒，将获得的质粒命名为pBAC-M-PDCoV。

2.4pBAC-M-PDCoV的酶切与回收：用NEB公司的AvrII和BamHI对pBAC-M-PDCoV进行双酶切，酶切反应体系和条件如下：2.5μg pBAC-M-PDCoV，AvrII和BamHI各2μL，3μL10×reaction buffer，补加ddH₂O至总体积为30μL，混匀后，37℃孵育2h。按照说明书用CyclePure Kit进行回收。其中，AvrII和BamHI线性化的pBAC-M-PDCoV两端分别与A片段的5’端和E片段的3’端存在20bp的同源臂。

2.5线性化的pBAC-M-PDCoV与5个片段进行同源重组一步克隆：

2.5.1以上述测序正确的pJET1.2-A，pJET1.2-B，pJET1.2-C，pJET1.2-D，pJET1.2-E质粒为模板，利用A-F/R，B-F/R，C-F/R，D-F/R，E-F/R为引物对进行PCR扩增获得相应的片段。反应体系如下：10μL 5×PCR reaction buffer，4μL dNTP混合物，10μM上下游引物，cDNA模板2μL，

FastPfu DNA Polymerase 1μL，加ddH₂O至总体积为50μL。反应条件如下：95℃2min；95℃20s；95℃20s，58℃20s，72℃2min；34个循环后，72℃延伸5min。反应结束后，将扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，按照说明书用Gel Extraction Kit进行回收，回收产物用于后续同源重组实验。

2.5.2利用In-Fusion PCR Cloning Kits构建Infusion反应体系：将不同比例的5个基因片段(A,B,C,D,E)以及(4)步骤中线性化的pBAC-M-PDCoV载体(F片段)混匀，再加入4μL5×In-Fusion Enzyme Premix，总体积为20μL，50℃30min，然后冰上孵育2min，取5μL转化DH10B感受态，进行阳性克隆筛选。我们尝试了不同摩尔量比例的片段(A,B,C,D,E,F)进行重组，发现最常用的比例(1:1:1:1:1:1)进行同源重组，产生的阳性菌落非常少，大约只有2％；为此，我们进一步调整比例，包括(1:1:1:1:1:2)、(1:1:1:1:2:1)、(1:1:1:2:1:1)、(1:1:2:1:1:1)、(1:2:1:1:1:1)、(2:1:1:1:1:1)，发现增加B片段或C片段的比例，均明显提高菌落的阳性率，大约分别达到30％和36％；同时增加B和C的比例(1:2:2:1:1:1)，发现菌落的阳性率能达到65％，说明B片段和C片段的比例增加有利于提高一步同源重组的效率；我们进一步尝试在此基础上，增加其他片段的比例，发现阳性菌落的比率不仅没有提高，反而有所降低。此外，在比例(1:2:2:1:1:1)的基础上再同时提高B片段和C片段的比例(1:4:4:1:1:1)，菌落的阳性率没有再次提高，反而有所下降，这可能是PDCoV基因片段独有的性质，这在先前的研究中并没有报道。

2.6连接产物的转化：取5μL步骤(2.5.2)的连接产物缓慢加入100μL DH10B化学感受态细胞中，轻轻混匀后，在冰水浴中静置30min。42℃热激60s后，立即放置冰水浴中2min，加600μL LB培养基，37℃180rpm复苏1h。复苏完成后于5000rpm离心5min，弃掉500μL LB培养基，用剩余的LB培养基重悬感受态细胞，涂布于含有25μg/mL氯霉素的LB固体平板。10min后将平板倒置于37℃培养箱中继续培养15h。

2.7阳性克隆的筛选：挑取多个菌落于含有1mL LB的细菌瓶中，37℃，225rpm培养8h后，利用引物Clone-F和Clone-R，PCR扩增含遗传标记的基因序列进行鉴定。PCR条件如下：2×Taq Master Mix 12.5μL，上下游引物各10μM，1μL菌液，补加ddH₂O至总体积为25μL。反应条件如下：95℃预变性3min；95℃30s，58℃30s，72℃1min；25个循环后，72℃延伸5min。反应结束后，取8μL用1％琼脂糖凝胶进行电泳以鉴定阳性克隆，将鉴定为阳性克隆的菌夜送武汉擎科生物技术有限公司测序，阳性克隆质粒命名为pBAC-CHN-HN-2014。

2.8pBAC-CHN-HN-2014质粒的提取：将步骤(2.7)鉴定为阳性的菌落扩大培养后，按照说明书用Plasmid DNA purification Kit大量提取质粒pBAC-CHN-HN-2014。最后一步用100μL ddH₂O洗脱，-20℃保存备用。

2.9重组病毒rCHN-HN-2014的拯救：按照说明书用Lipofectamine 3000将3μg重组质粒pBAC-CHN-HN-2014转染至80％融合度的LLC-PK1细胞。转染4h后，将培养基换成含有10μg/mL胰酶的无血清DMEM，继续培养，至细胞80％以上病变时，收获细胞培养物，于-70℃冻融2次，2000rpm离心5min，取上清再接种LLC-PK1细胞进行传代培养。

结果：cDNA克隆pBAC-CHN-HN-2014转染LLC-PK1细胞后48h，细胞出现明显的病变，主要表现为细胞变圆，聚集，脱落，与野生型PDCoV CHN-HN-2014株所致细胞病变一致，说明病毒拯救成功，将其命名为rCHN-HN-2014。间接免疫荧光实验表明重组病毒和野生型病毒感染的细胞都可观察到特异性绿色荧光，对照细胞没有特异性荧光(图2)，进一步提取病毒RNA对其遗传标记(SEQ ID NO:29)进行鉴定，野生型病毒来源的RT-PCR产物被ClaI酶切成两条带(364bp和716bp)，而重组病毒来源的RT-PCR产物不能被切割(图3)，这些结果进一步通过DNA测序得到证实，15121位点C突变成A，导致重组病毒来源的RT-PCR产物中ClaI酶切位点消除(图4)。这些结果证实病毒拯救成功。将获得的重组病毒在LLC-PK1细胞上连续传5代，也能稳定地观察到细胞病变，RT-PCR分析证实遗传标记的稳定存在，说明重组病毒rCHN-HN-2014具有稳定的增殖能力。同时，进一步对重组病毒和亲本病毒的体外生物学特性进行分析，发现rCHN-HN-2014与亲本病毒具有类似的生长曲线(图5)以及空斑大小和形态(图6)。

其中，用于扩增得到1080bp含遗传标记的基因片段的引物为：

上游引物Clone-F：5’-CCAAGTTGGTGATTACATTC-3’

下游引物Clone-R：5’-GCTGAGTCAGTGGTCACGCA-3’。

本发明提供一种基于BAC系统和同源重组一步克隆方法快速获得的PDCoV CHN-HN-2014株全长cDNA感染性克隆质粒以及重组病毒rCHN-HN-2014的方法。为深入研究PDCoV的遗传变异以及潜在的跨种传播机制、毒力基因、病毒感染与致病机制及疫苗开发等提供有力的技术平台。

序列表说明：

SEQ ID NO:1：PDCoV CHN-HN-2014株5’端基因序列。

SEQ ID NO:2：PDCoV CHN-HN-2014株3’端基因序列。

SEQ ID NO:3：A片段基因序列。

SEQ ID NO:4：B片段基因序列。

SEQ ID NO:5：C片段基因序列。

SEQ ID NO:6：D片段基因序列。

SEQ ID NO:7：E片段基因序列。

SEQ ID NO:8：CMV启动子基因序列。

SEQ ID NO:9：HDV-BGH基因序列。

SEQ ID NO:10：中间片段M-PDCoV基因序列，包括：CMV启动子、PDCoV CHN-HN-2014株5’端基因序列，PDCoV CHN-HN-2014株3’端基因序列，27个A的poly(A)结构，HDV和BGH基因序列。

SEQ ID NO:11：扩增5’端基因的上游引物(PDCoV-5’-F)序列。

SEQ ID NO:12：扩增5’端基因的下游引物(PDCoV-5’-R)序列。

SEQ ID NO:13：扩增3’端基因的上游引物(PDCoV-3’-F)序列。

SEQ ID NO:14：扩增3’端基因的下游引物(PDCoV-3’-R)序列。

SEQ ID NO:15：扩增A片段基因的上游引物(A-F)序列。

SEQ ID NO:16：扩增A片段基因的下游引物(A-R)序列。

SEQ ID NO:17：扩增B片段基因的上游引物(B-F)序列。

SEQ ID NO:18：扩增B片段基因的下游引物(B-R)序列。

SEQ ID NO:19：扩增C片段基因的上游引物(C-F)序列。

SEQ ID NO:20：扩增C片段基因的下游引物(C-R)序列。

SEQ ID NO:21：扩增D片段基因的上游引物(D-F)序列。

SEQ ID NO:22：扩增D片段基因的下游引物(D-R)序列。

SEQ ID NO:23：扩增E片段基因的上游引物(E-F)序列。

SEQ ID NO:24：扩增E片段基因的下游引物(E-R)序列。

SEQ ID NO:25：扩增CMV启动子的上游引物(CMV-F)序列。

SEQ ID NO:26：扩增CMV启动子的下游引物(CMV-R)序列。

SEQ ID NO:27：扩增HDV-BGH基因的上游引物(HDV-F)序列。

SEQ ID NO:28：扩增HDV-BGH基因的下游引物(BGH-R)序列。

SEQ ID NO:29：含遗传标记的基因序列。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 375

<212> DNA

<213> 猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus)

<400> 1

acatggggac taaagataaa aattatagca ttagtctata attttatctc cctagcttcg 60

ctagttctct accgacacca atccaggtgc gtctgccacc aagttggcta ccctttctag 120

gggcgctttt gcgcttgctc accattagat tacctggaaa ccagccattc aggttggagt 180

ttccccaggc acttttgcgt gggcattagc ggcttgtggt ttttgcacaa aatctaagct 240

acttaccgtt cctctgacca ttcaccactt ctatagacag cactgactac cgtagggttc 300

aagtcacacc ggtctgcacc gcccgtcagc ggacacatta cccagcatag cactccttgc 360

accgagccta ggtag 375

<210> 2

<211> 2057

<212> DNA

<213> 猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus)

<400> 2

cttgcaggga ttatggatcc aatgggtaca tggaggtgca ttcccatcga ccacatggct 60

ccaattctca caccagtcgt taagcatggc aagctcaagc tacatgggca agagctggcc 120

aatggcatat cagtcagaaa tccgccacag gatatggtga tagtgtcacc aagtgacacc 180

tttcactaca cttttaagaa acctgtggaa tcaaacaacg atccagaatt cgctgttctg 240

atataccagg gtgaccgcgc ttcaaacgct ggacttcaca ccataaccac ttcaaaggcc 300

ggtgacgctc gcctgtataa gtatatgtaa tgtgcaactg ccacctgcag ctgcgagatt 360

tatatagatt gtgcaataag cggcacatca gaagagagga tgttcctgag cttattgacc 420

ctctcgttaa aactcgctgt tttgcttaca gtctcgtggt tcttgctaat gctaatccaa 480

ttgcatttag catactacct cggaaacttc ttatcaatgg tgagccttta ctgcttgaat 540

atggtagcat atatggtaaa gactttatca ttcgaccatc gctccaagtc attcttgaag 600

atgaattaaa ttaaagtttt gacaccaatc tatcatggct gcaccagtag tccctactac 660

tgacgcgtct tggtttcagg tgctcaaagc tcaaaacaaa aaagccattc atcctcagtt 720

tcgtggcaat ggagttccgc ttaactccgc catcaaaccc gttgaaaatc atggctactg 780

gctgcgttac accagacaaa agccaggtgg tactccgatt cctccatcct atgcctttta 840

ttatactggc acaggtccca gaggaaatct taagtatggt gaactccctc ctaatgatac 900

cccagcaacc actcgtgtta cttgggttaa gggttcggga gctgacactt ctattaagcc 960

tcatgttgcc aaacgcaacc ccaacaatcc taaacatcag ctgctacctc tccgattccc 1020

aaccggagat ggcccagctc aaggtttcag agttgacccc ttcaacgcta gaggaagacc 1080

tcaggagcgt ggaggtggcc caagatctca atctgttaac tccagaggca caggcaatca 1140

gcctaggaaa cgcgaccaat ctgcacccgc tgcggtacgt cgtaagaccc aacatcaagc 1200

tcccaagcgg actttaccta agggtaaaac catttctcag gtatttggca accggtctcg 1260

tactggtgcc aatgtcggct ctgcagacac tgagaagacg ggtatggctg atcctcgcat 1320

catggctcta gccagacatg tgcctggtgt tcaggaaatg cttttcgctg gtcacctcga 1380

gagcaacttt caggcggggg caattaccct taccttctct tactcaatca cagtcaagga 1440

gggttctcct gactatgaga gacttaagga tgcgctcaac acggtcgtta accagaccta 1500

tgagccaccc accaaaccaa ctaaggacaa gaagcctgac aaacaagacc agtctgctaa 1560

atccaaacag cagaagaaac ctaaaaaggt aactctgcca gcagacaaac aggattggga 1620

gtgggatgat gcttttgaga taaagcagga atcagcagcg tagacatcaa tctatgtctg 1680

ttaaacccac ccaactccac tcaaatatct ctttggttcc agagagtcgt agtgtatagc 1740

cagagagcca gtcagagggc gctatcatgc aaactagggc tggctactct agcacagaat 1800

cacatcccga taatcaacag tgctagaagg ttgattatac catttaatat gccgaggcca 1860

cgcggagtac gatcgagggt acagcataat ctcaactttt gttgagccac aattttaatc 1920

ctaattggag aaggccaaag gactgtacta cttctgtagg tgtagcagtc gcccagtggg 1980

aaagcgccaa ctaggttaca attgtggtgg ggacaaatta ggggaaatta aattggctta 2040

taggggggat ggagcaa 2057

<210> 3

<211> 4191

<212> DNA

<213> 猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus)

<400> 3

tagcactcct tgcaccgagc ctaggtagga taaaaccccc taccgggtga ctcttaaggc 60

ctttcctcca cgggatagct actagtcact aggtgtaagt gatctgatct gggcgtattg 120

tgttgcgcaa gtgtgatacc cataggagcg tggaatccta ttctgcggct cagtgcctga 180

tatagctgtg aaatggccaa gaacaagtcc aagcgcgacg ctatcgcgtt gcctgaaaat 240

gtaccaccac ctctgcaact tttcattcac gttgcagctg ctgaagaggg tcaccctaag 300

gttactactt accttggcaa ctataacctc tatgccacca aggctccgcc tggcgtgcag 360

gttcttagtg ctaaaacctc tcttactgac tttgagaatg tctttggagc ccaacccacc 420

ttgcgatcaa ttcgtaatct ggtttgtgag gctcgctcgg ctgaatggac aacttccaag 480

aatgcttttg cactcaaagc cactcaactt gactactctg atgccgtttt gagggcaatg 540

attcgtttct gccctccaaa ggtgtccaca ctcgctgcct ttgctctttt tggcagattg 600

gttaaaattg aggacaagga acttgctgag ttagctcgtg acactgccct tgagttggcg 660

tacacggcta aaattggtac atctcttgct gacacgagat ctgtctcact tattcataag 720

gacgcttatc taactctcag taatgaggtt gttggcgtaa cttttactgc cgcacttatg 780

gcaaaggcta ccactgttaa tggagcaatg caatactcaa acttttacct ctaccctcgt 840

gccactatta aggtgaccga tggtaaggtt gaagcaattg caaccaagcc tctttctgct 900

gctactaaag gcaagcaaat cacagaggat gtcaaccttc tccctgacta tcagcagctg 960

cttgttgatc aagtgactgg cactgaggtt aaggttggag ctttaaccta tgttaagacc 1020

actgattcac caccccttta ctttcccaaa gtcaagggtg gtgttattgg tattgcactt 1080

aagcagcagg gcactgcggc taagaagctc aatgtagtct tccatgctca acctgatgat 1140

gttctgctag ccttcataca acttcagcaa ttcttgaacc gtacttcgga ttcaagtgtt 1200

gaaattactg gttgccagag ttatgaagta tctccaactg tgactgtcaa aattggcccg 1260

tctaaacctg gggatgtcat cgtggctact gatgaggaat accttaaatg ctttgaaacc 1320

cctgaggtag gtaggctcta taaggttttc caaactcaat cttgggctat cattgagcgt 1380

tccttctcca gtttgaagat ccgcgtgtcc aaagctttat cagcatttat aagttttctg 1440

caaaaccttg cagataactt tactgcaata agtggtgttg tcactgcact cattcgtgaa 1500

ctccaggatc ttaccctgga tgtggcgaca cgtatcacta acatacaatt tgtttaccgt 1560

gccggtaagc ttattgtcga cactacaagt gtcatagcta aacttttcca gccattctgt 1620

gattttatat cacctttcct tcggaaagtt gctggttttg caatttacac tgttggtaat 1680

cgcatgctta tgtttaccag caccggcacc tttcttctta caagggcaac tactaagata 1740

ctcaataagg caaagtacat ctttgatgtg gagcctgagt acccagtaga tgtaacaaca 1800

tccaaagttg tagtacatga agcactccag caaaccgaca ctaagcctac tagagctcta 1860

gaggctgttg atgtcgttgt tggtaatact gtactgcaaa tggctactga tggcactgcg 1920

ttctacccat cggatggtac gcacgcctct cttccaggat tcaaagcagg ctcggatgag 1980

ctttttataa gcttcaactg cgacctcttt gatgatgaga ctaatgctca aatcaacgaa 2040

acactcgctg catatgagct taaccaacta gtggctccag gtgattctac accgcgtcaa 2100

attgcgacgt tggttgtcga tacacttgta gatgctataa cagaccactt tccggagaaa 2160

accattgatc tacctgaaga ctatcaagtc ttttctgacc atgatgatct cccactcgca 2220

caataccaca tccctgatca cctgagcctg tatattcagg ctatggaagg tgaagatgat 2280

agtggtgatg aaatatgtat tgaggacgat gattacgact gtcctcaagc cgacgaagac 2340

acagaaggag taattcccca acagtgggaa cttcctgatg ttgataaatt tttactcaag 2400

atccaggaac ggaagaccag cagcgacgaa gtacttagcg tcgacgtcta tcctaaacca 2460

gagccagtcg gcaatgttgg gattgacgac agcgcgtcgg aaaagaagcc aaatggggac 2520

tcagtaccgg atcctgaggt ccatccaaca ctagagagtg tggatgttga acgaccaacc 2580

gaaacagcaa accaggctgt tgaagacaaa ccttctgata ccacctttgt ggttgatgag 2640

gaacaattac aagaatcaac accagaacat gaactccgct cctatgaggg ggagtttgat 2700

tctgatgatg aaattattat tcctatagta ccagtaacac ctgcggattt aaaaccacag 2760

actattacta taaaggagta ctttaagtct gaaaaacttg agactattaa cgaaggatcc 2820

acagagtcag ttacacaatc tgacgattcg tttgacgagt catttgttga tgctgagtct 2880

gatgatccac aagatcctgc tgtatatgat gatacaacaa ttataacgga cagtactgat 2940

gtaggcgatg agcctgagac aactctagct accatcgtta acacacctct gacactcgat 3000

aataacttgc cacctgaagc cattaaacaa cccagcccga ctaaggttga gttagttgtt 3060

ggcgaattgg caagtattaa atttgacaat tctgtcctag tcaaccctgc taatgcgcaa 3120

ttaacaaatg gcggtggagc tgcccgtgca attgcaaagt tagctggtcc aaaataccaa 3180

gagtactgta atagtgtggc tcctatctca ggaccgctta ccacggactc ttttgatgcc 3240

aagaaacttg gtgtagcctg catcttgcat gtagtgccac ccaaaggttc tgaccctaat 3300

gtacaagaac tcctgtatca agcttacaag agtatcctta ctgaaccagc acactatgtt 3360

atacctatac taggtgctgg tatctttgga tgcaacccag tccactctct ggatgcgttc 3420

aggaaagcat gtccaagtga cataggtcgt gtcacccttg tcactatgaa caaaaaccat 3480

ttgcaggtgt gggatgctct caataggacc attgtacgca ccactactga ctatgatcaa 3540

gttaccacca aggcccttac accccaggga gtgttagaag ccaatctctt tgatggtgag 3600

gactttgttc aagaaccaaa acccggtcaa atttaccttg aggttactga agaagttcag 3660

aaccaagcca aggaacttga ccttaacctt cagcaatact gcgtctacct gaagacttgc 3720

caccataaat gggttgtgag tcgtacgaac gggttgatgc atctaaaaca aaaagataac 3780

aattgttttg ttagtgcagg tgtaaacttg tttcaaaaca ctgcttatca atttagacct 3840

gctattgatg ctctctatag ggagtatctc aatggtaatc caaacagatt tgttgcttgg 3900

atctacgcat ccactaaccg tcgtgttggt gagatgggtt gtccacagca agttatttct 3960

ttgctcgtta gtaactctga cgcagcattt tcagcaacta cagcctgttg taacacctac 4020

tttaaccaca caggtgttat ttcagtagct cgtgaatatg acccaataca accaaaggtc 4080

tactgcatga agtgcgatgt gtggactccc tttacacccc agagtggaaa aggtgcagtt 4140

gcaattggta cttctgcaga tgaacctacc ggtcctgcca ttaaatttgc c 4191

<210> 4

<211> 5134

<212> DNA

<213> 猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus)

<400> 4

gtcctgccat taaatttgcc gcagctcact gctggtacac taatggcaag aaaacagtta 60

atggctatga cactaaagct aatgttgtag ctacttatca taggtttgac gtgcctaagc 120

ctcaacttgt cgaggacgtg gttgcgctgc ctactaaaaa tgactttgaa gttctcaatg 180

ttgaagaact gccacaggat agtgtgctcc atttggaccc acctcctgta caggccttac 240

aacctaaggc taaccaacac attgagattt tagaaaaccc agattatctg gacattttgg 300

atctttggat tcgtaaaccc aaattcatcc tcgtaaagtc gtggagtgtt ttgggtagag 360

cactatgtaa ggcaggtaaa gttgtctttg tcagtgcttc gcttttgacc cgtttctaca 420

attaccttgt agagattggt gctcttgact caacaataag gttgtcagtc gatcttacct 480

gtaaatttgt tagaacggta ctcccatcgt ctaacactgt acacaaaact tgtcttggtc 540

tgtattattc agcccagaca ctttttgttt ctttagcacc attccttatg ttaccagctg 600

tagttagtct gcttaattca ggctatacaa ttggcacata tttgtatgca aaaactggct 660

ggccttgtaa ttacaatgcc acgcaacacc ttgattataa ttcttactgt gcaggtgact 720

tggtttgtca agcctgtttt gacggtcaag actccctaca tttgtatccg catttacgtg 780

ttaatcagca gcctcttcag accactgact acactgttta tgcgctttca ctaatactac 840

tattagctaa catgactctt gtcatgggta cgctaatagt tactttcttt gtgaacttct 900

atggtgtgca aataccattt tatggtacac ttctgataga ttatcagtcc gcgctgatga 960

tgactttctc agtgtactac ttttataagg taatgaagtt tttccgccat ctcacacatg 1020

gatgtaaaat tccaacgtgt atggtatgtg ctaaacttcg taccccacct actataacag 1080

ttgagactgt cgttcaaggc aggaaatacc catctgttat tgaaacaaat ggcgggttta 1140

caatttgtaa agaacacaac ttctattgca aagactgctc tctacaaaca cccggcactt 1200

tcatcccgac agaagctatt gagtcgctct cacgagctac caggcttagt gtcaaaccaa 1260

cagcaccagc attcttactt gctagagatg ttgagtgcca aactgatgtt gtcgttgctc 1320

gcgcaatgca taaccaaaat gcgcatgtgt gcatttcaaa atactctgat atccgtaccg 1380

ttgaccaact acttaagcct actccactgt tttcatacac tcccgatgtt atcatcgcgg 1440

cagactttga caacagaggt agtcttaaga cagctaaaga attagctgtg gttttgtcaa 1500

tggaccttaa acgtactata attatcattg atcaggctta ttctagaccc attgataatt 1560

atcaggaagt tgcttctcgt attgagaagt attacccagt tgcaaagatt acacccacag 1620

gtgacatctt tacagacatt aagcaagcga ccaatggcca agctagtgac tctgctatta 1680

atgcagctgt tctggctgtc cagcgcggtc ttgattttac aatcgacaac cctaacaata 1740

tattaccaca ttacgccttt gacttttcaa cccttaatgc agaagaccag tctaccattt 1800

tggagagtgg ttgtgctaaa ggcaatctca agggcactaa tgttggtgtt gttctttcag 1860

ctagccttgt tacacgtctt agtcagcagg ctatatgtgt gattgctaat gctgcttcac 1920

gtaatggtgt aacatgcgct gttactccat ctacacttgt tatgcgtggg aatattgcaa 1980

cacagccctt gactcgcatc aaagctggtg cacctcccat gcgtcaaaaa attttatgtg 2040

ttatcctggc acttgctatt gtgtactttg ctgctatggc ttttggcttt tttgcaagtc 2100

aaattacgct taatacagtg cctacgatta aatctgatat ccgcgcctct accttctacg 2160

ttgttagaga tggagtcttg gatactgttc gctcaaatga caagtgcttt gcaaataagt 2220

ttttggcatt tgatagcttc attcaagcac cttacactaa ttcacctgac tgtccagtcg 2280

ttgtgggagt tgttgaagta acgacgcact ctattcctgg aattccagca ggtgtcattc 2340

atagagacgg tctcatactt aacatttatg aacagtctct ttatgaaatc catcagcgtc 2400

agtctatggt tagggatgcg ttgtcactca agacagcaaa tctctttaac ctaggcaagc 2460

gtgttgtagt aggatacact caacatgaag ttgttgtggg tacctcctat tttaattctc 2520

ctgcactttt taacgcaaag tgcaccttct tacagtacca ggacactaga caactctatt 2580

gctatgatac tgttcctact gaacataagc tttactctga tgtgcttccg cacgtcgagt 2640

ataaggctat tgacattaat ggtgatcttg ttcctttcaa gataccggag cagataatgt 2700

tctatccaca tattgtgcgc tatactagca attcctattg ccgtatgggg cattgtttta 2760

atactaaccc tggtatttgc atttcattta cggacgaatt tccgtatagt gaaaatgtta 2820

aacccggtgt atactgtgct gatacctctt tgcagttgtt ttcaaacctc gttttgggca 2880

ctgtatctgg tattcacatc tttacatcaa cagctgcatt gcttggatct actattgtga 2940

tcatactatg cgttgttgct gttcttgcag ttcagcgatt cttcaaggag tacacaactt 3000

ttgttatgta cacttgtggt cttgctcttg tcaacattgt gggcattgca cttatataca 3060

agtgccttgt cttcgcgatc ttctattatg caatctacct ttactttgtc cttactttcc 3120

cctcctttaa gaggaatgtg gcattgtttt acttcgctgt agtgatcgtg ccgcacgtga 3180

gtaacatgca attgcttgcg ctcattgtgt gtagcattat ctactttctc tacacctatg 3240

ttcatactgt agctaagaca gctgggaaat tctcttcctt cttagacgca gctaaagcta 3300

cttttgtcat tgacaatgaa aagtacgtgt tgcttaaaga cctcgctggt gctgaatttg 3360

accagtatct ggcctcttac aacaagtaca aatatttttc tggtactgct tctgataagg 3420

attatgataa ggtctgtatg gcatttcttg ccaaggcttt gtcatctttt cgtgaaggag 3480

gcggttcaca gttgtacaca ccacctaaat ttgcagttgt tcagagtctt aagaccaagc 3540

tgcaagcagg tatcaaaatc ctcctgcacc cttcaggtgt agttgagcga tgtatggtct 3600

cagttgtcta caatggatct gcattgaatg gcatctggct taagaatgtt gtctactgcc 3660

cacgccatgt aattggaaaa ttccgtggtg accagtggac tcacatggtc tcaattgctg 3720

attgccgcga ctttatagtc aagtgtccaa tacagggtat tcagctaaat gtccaatcag 3780

ttaagatggt aggagctctc ctccagttaa ctgttcatac caacaacaca gccactccag 3840

actataagtt tgaaaggctc caaccaggat catcgatgac aattgcttgt gcttatgatg 3900

gcattgtacg gcatgtctat cacgtggtcc tccaacttaa taatcttatt tatgcaagct 3960

tccttaacgg agcttgtggt agtgtgggtt acactcttaa gggtaaaaca ctctacttac 4020

attacatgca ccacattgag tttaacaaca aaactcatag tggtacagat cttgaaggta 4080

acttctatgg cccctatgtg gatgaggaag ttattcagca acaaacagca ttccagtatt 4140

acactgataa tgttgttgct caattatatg cacacttact gactgttgat gctagaccaa 4200

aatggctggc acaatctcag ataagtatcg aggattttaa ctcatgggct gctaacaatt 4260

cctttgctaa cttcccatgt gaacaaacta atatgtccta cattatggga ctctcgcaaa 4320

ctgctcgagt ccctgtagaa cgtatcctca ataccattat acagctaacc accaatagag 4380

atggtgcttg tattatggga tcttatgatt tcgagtgtga ttggacgcca gagatggtat 4440

acaatcaggc tccaatttca ttgcagtcag gagtagttaa gaaaacttgt acgtggttct 4500

tccacttctt gtttatggct attaccatgc tactcgctgc catgcatgtt ttccctgtac 4560

acctgtaccc aatagtactg ccatgcttca ttgtcgtggc attcctgttg actttaacca 4620

ttaaacacac tgttgtgttt accactacat atttgcttcc gtcacttttg atgatggttg 4680

taaatgctaa cactttttgg ataccgaaca catttctgcg cacctgctac gaaactatat 4740

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ttattctgct ttggctgctc caacccttca ccctagtggt gaccatttgg accgcagttg 3780

acagatcatc taagaaggac gcagttttca ttgtgtccat aatttttgcc gtactgacct 3840

tcatatcctg ggccaagtac tggtatgact caattcgttt attaatgaaa accagatctg 3900

catgggcact ctcacctgag agtagactcc ttgcagggat tatggatcca atgggtacat 3960

ggaggtgc 3968

<210> 8

<211> 635

<212> DNA

<213> 猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus)

<400> 8

ggcgtgcact tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt 60

agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg 120

ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 180

gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 240

ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 300

atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 360

catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg 420

gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 480

gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc 540

attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt 600

agtgaaccgt acatggggac taaagataaa aatta 635

<210> 9

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

atagggggga tggagcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaagggtcgg catggcatct 60

ccacctcctc gcggtccgac ctgggcatcc gaaggaggac gcacgtccac tcggatggct 120

aagggagagc cactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc 180

cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg 240

catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca 300

agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggaag 360

cttctc 366

<210> 10

<211> 3390

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

ggcgtgcact tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt 60

agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg 120

ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 180

gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 240

ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 300

atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 360

catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg 420

gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 480

gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc 540

attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt 600

agtgaaccgt acatggggac taaagataaa aattatagca ttagtctata attttatctc 660

cctagcttcg ctagttctct accgacacca atccaggtgc gtctgccacc aagttggcta 720

ccctttctag gggcgctttt gcgcttgctc accattagat tacctggaaa ccagccattc 780

aggttggagt ttccccaggc acttttgcgt gggcattagc ggcttgtggt ttttgcacaa 840

aatctaagct acttaccgtt cctctgacca ttcaccactt ctatagacag cactgactac 900

cgtagggttc aagtcacacc ggtctgcacc gcccgtcagc ggacacatta cccagcatag 960

cactccttgc accgagccta ggtagcttgc agggattatg gatccaatgg gtacatggag 1020

gtgcattccc atcgaccaca tggctccaat tctcacacca gtcgttaagc atggcaagct 1080

caagctacat gggcaagagc tggccaatgg catatcagtc agaaatccgc cacaggatat 1140

ggtgatagtg tcaccaagtg acacctttca ctacactttt aagaaacctg tggaatcaaa 1200

caacgatcca gaattcgctg ttctgatata ccagggtgac cgcgcttcaa acgctggact 1260

tcacaccata accacttcaa aggccggtga cgctcgcctg tataagtata tgtaatgtgc 1320

aactgccacc tgcagctgcg agatttatat agattgtgca ataagcggca catcagaaga 1380

gaggatgttc ctgagcttat tgaccctctc gttaaaactc gctgttttgc ttacagtctc 1440

gtggttcttg ctaatgctaa tccaattgca tttagcatac tacctcggaa acttcttatc 1500

aatggtgagc ctttactgct tgaatatggt agcatatatg gtaaagactt tatcattcga 1560

ccatcgctcc aagtcattct tgaagatgaa ttaaattaaa gttttgacac caatctatca 1620

tggctgcacc agtagtccct actactgacg cgtcttggtt tcaggtgctc aaagctcaaa 1680

acaaaaaagc cattcatcct cagtttcgtg gcaatggagt tccgcttaac tccgccatca 1740

aacccgttga aaatcatggc tactggctgc gttacaccag acaaaagcca ggtggtactc 1800

cgattcctcc atcctatgcc ttttattata ctggcacagg tcccagagga aatcttaagt 1860

atggtgaact ccctcctaat gataccccag caaccactcg tgttacttgg gttaagggtt 1920

cgggagctga cacttctatt aagcctcatg ttgccaaacg caaccccaac aatcctaaac 1980

atcagctgct acctctccga ttcccaaccg gagatggccc agctcaaggt ttcagagttg 2040

accccttcaa cgctagagga agacctcagg agcgtggagg tggcccaaga tctcaatctg 2100

ttaactccag aggcacaggc aatcagccta ggaaacgcga ccaatctgca cccgctgcgg 2160

tacgtcgtaa gacccaacat caagctccca agcggacttt acctaagggt aaaaccattt 2220

ctcaggtatt tggcaaccgg tctcgtactg gtgccaatgt cggctctgca gacactgaga 2280

agacgggtat ggctgatcct cgcatcatgg ctctagccag acatgtgcct ggtgttcagg 2340

aaatgctttt cgctggtcac ctcgagagca actttcaggc gggggcaatt acccttacct 2400

tctcttactc aatcacagtc aaggagggtt ctcctgacta tgagagactt aaggatgcgc 2460

tcaacacggt cgttaaccag acctatgagc cacccaccaa accaactaag gacaagaagc 2520

ctgacaaaca agaccagtct gctaaatcca aacagcagaa gaaacctaaa aaggtaactc 2580

tgccagcaga caaacaggat tgggagtggg atgatgcttt tgagataaag caggaatcag 2640

cagcgtagac atcaatctat gtctgttaaa cccacccaac tccactcaaa tatctctttg 2700

gttccagaga gtcgtagtgt atagccagag agccagtcag agggcgctat catgcaaact 2760

agggctggct actctagcac agaatcacat cccgataatc aacagtgcta gaaggttgat 2820

tataccattt aatatgccga ggccacgcgg agtacgatcg agggtacagc ataatctcaa 2880

cttttgttga gccacaattt taatcctaat tggagaaggc caaaggactg tactacttct 2940

gtaggtgtag cagtcgccca gtgggaaagc gccaactagg ttacaattgt ggtggggaca 3000

aattagggga aattaaattg gcttataggg gggatggagc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060

aaaaaaaggg tcggcatggc atctccacct cctcgcggtc cgacctgggc atccgaagga 3120

ggacgcacgt ccactcggat ggctaaggga gagccactgt gccttctagt tgccagccat 3180

ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc 3240

tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg 3300

ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg 3360

gggatgcggt gggctctatg gaagcttctc 3390

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

acatggggac taaagataaa aattatagca ttagtct 37

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

ctacctaggc tcggtgcaag g 21

<210> 13

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

cttgcaccga gcctaggtag cttgcaggga ttatggatcc aatgggtaca tg 52

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

ttgctccatc ccccctataa gccaatttaa tttcccc 37

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

tagcactcct tgcaccgagc ctaggtagga taaaaccccc tac 43

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

ggcaaattta atggcaggac 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

gtcctgccat taaatttgcc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

gttgtgaatc gatttgcaag 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

cttgcaaatc gattcacaac 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

cagagtgcat ctattgctgc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

gcagcaatag atgcactctg 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

actgctggaa ttcctcgtgg 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

ccacgaggaa ttccagcagt 20

<210> 24

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

gcacctccat gtacccattg gatccataat ccctgcaagg ag 42

<210> 25

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

ggcgtgcact tgacattgat tattgactag ttat 34

<210> 26

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

taatttttat ctttagtccc catgtacggt tcactaaacg agctctgctt atatagacc 59

<210> 27

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

atagggggga tggagcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaagggtcgg catggcatc 59

<210> 28

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

gagaagcttc catagagccc accgcatccc cagc 34

<210> 29

<211> 1080

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 29

ccaagttggt gattacattc ttgctaaaac agatggcagt gacacttata cttacagagg 60

aacatctacc tacaaactcc aaacaggtga tgttctagtc ttaatggcac atgttgttac 120

accgctctca gcaccccctg tgctaacgca gacaacatat gtcagaaaat cacttttacc 180

cgactctgtt ggtgcgtctt attatgtgca acattttaag tcatataatg agatagctat 240

gcagagggtt acaacagtat taggtccgcc aggcacaggt aagtcaacct ttgctattgg 300

tttggctaag tactttccta gtgcacgtat ttgctacact gcgtcttcgc atgcagcaat 360

agatgcactc tgtgaaaaag ctttcaagac aatacctgta ggccaatgca gtcgtatcgt 420

acccacacgt acaactgttg agtgctttca ggagtttgtc gtaaataaca caactgcaca 480

gtatatcttc tcgactatca atgccttacc tgacattaag tgtgacattg tagttgtaga 540

tgaggtttct atgttgacca attatgagct ttcctctgtg aatgctcgtt tggtttacaa 600

tcacattgtg tatgttggtg atccttatca gttaccttca cctagaacta tgcttacgtc 660

tggccagctt tcgccagctg actataacgt agttactgat ataatggtac atgcaggagc 720

ggacgttatg ctcgacatgt gctacagatg cccacgtgaa atcgttgaga cagtgtctaa 780

acttgtctac gataacaaac taaaagcggc gaaaccgaac tcaagacagt gttacaagac 840

cattgtgaac tttggtcctg gagacgttgc tcatgaggga caatctgcct acaacgaagc 900

acagttgcgt ttcgcactcg catttagaca acaaaagcgg tgggataacg tgactttcat 960

atctccatat aatgctatga atgtgaaagc atccttagca ggtttctcta ctcagaccgt 1020

tgactcttct caaggttctg agtatgatta tgttatcttt tgcgtgacca ctgactcagc 1080

Claims (4)

1.一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）提取猪δ冠状病毒RNA并反转录成cDNA；

（2）以上述cDNA为模板，设计引物分别进行PCR扩增，获得猪δ冠状病毒的5’端基因序列、3’端基因序列以及5个基因片段，其中，所述5个基因片段之间含有20bp的同源序列，此外，将15121位点C沉默突变成A，消除了一个ClaI内切酶序列，作为遗传标记；

（3）以pBAC-AJ1102质粒为模板，设计引物分别进行PCR扩增，获得CMV启动子和HDV-BGH基因序列；

（4）利用BAC系统，通过ApaLI和HindIII限制性内切酶和多步融合PCR方法将CMV启动子、5’端基因序列、3’端基因序列、27个腺嘌呤脱氧核苷酸的poly(A)结构、丁型肝炎病毒核酶自切割位点以及牛生长激素终止序列克隆至低拷贝载体pBeloBAC11中获得中间载体pBAC-M-PDCoV；

（5）将5个基因片段按比例同源重组一步克隆至中间载体pBAC-M-PDCoV中获得重组质粒pBAC-CHN-HN-2014，所述5个基因片段与中间载体pBAC-M-PDCoV的摩尔比为1:2:2:1:1:1；

（6）将重组产物转化至DH10B化学感受态细胞中，利用PCR筛选阳性克隆，将测序正确的阳性克隆扩大培养后提取质粒，

所述5’端基因序列、3’端基因序列以及5个基因片段的序列分别为：5’端基因序列：SEQID NO: 1；3’端基因序列：SEQ ID NO: 2；基因片段A：SEQ ID NO: 3；基因片段B：SEQ IDNO: 4；基因片段C：SEQ ID NO: 5；基因片段D：SEQ ID NO: 6；基因片段E：SEQ ID NO: 7；

所述CMV启动子的序列如SEQ ID NO: 8所示，所述HDV-BGH基因的序列如SEQ ID NO: 9所示。

2.如权利要求1所述猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法，其特征在于：所述猪δ冠状病毒为CHN-HN-2014株。

3.如权利要求1所述猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法，其特征在于，用于PCR扩增5’端基因序列、3’端基因序列以及5个基因片段的引物分别为：

PDCoV-5’- F：SEQ ID NO:11；PDCoV-5’- R：SEQ ID NO:12；PDCoV-3’- F：SEQ ID NO:13；PDCoV-3’- R：SEQ ID NO: 14；A- F：SEQ ID NO:15；A- R：SEQ ID NO:16；B- F：SEQ IDNO:17；B- R：SEQ ID NO:18；C- F：SEQ ID NO:19；C- R：SEQ ID NO:20；D- F：SEQ ID NO:21；D- R：SEQ ID NO:22；E- F：SEQ ID NO:23；E- R：SEQ ID NO:24。

4.如权利要求1所述猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法，其特征在于：用于PCR扩增CMV启动子、HDV-BGH基因的引物分别为：

CMV- F：SEQ ID NO:25；CMV- R：SEQ ID NO:26；HDV- F：SEQ ID NO:27；BGH- R：SEQ IDNO:28。

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