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DE69837390T2 - Rekombinanter schweine adenovirus vektor - Google Patents

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DE69837390T2
DE69837390T2 DE69837390T DE69837390T DE69837390T2 DE 69837390 T2 DE69837390 T2 DE 69837390T2 DE 69837390 T DE69837390 T DE 69837390T DE 69837390 T DE69837390 T DE 69837390T DE 69837390 T2 DE69837390 T2 DE 69837390T2
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DE
Germany
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recombinant
pav
vector
porcine
pigs
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Application number
DE69837390T
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Michael Anthony Thornbury JOHNSON
Jeffrey Michael Jan Juc HAMMOND
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Australian Pork Ltd
Original Assignee
Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Pig Research and Development Corp
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Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=3802849&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE69837390(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft Abgabevektoren für Antigen-produzierende Gene (heterologe Gensequenzen oder Fragmente davon), die verwendet werden, um Immunantworten in kommerziellen Schweinen, welche hinsichtlich einer Dezimierung aufgrund von Erkrankungen anfällig ist, zu erzeugen. Solche Vektoren sind besonders nützlich für die Herstellung von Impfstoffen, die leicht in einem großen Maßstab verabreicht werden können, um Schweine vor Krankheiten zu schützen. Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von geeigneten Abgabevektoren, Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen, welche auf den Vektoren basieren, Verabreichungsstrategien und ein Verfahren zum Schützen von Schweinen vor Krankheiten.
  • HINTERGRUND
  • Die Produktivität der Industrie der intensiven Schweinehaltung hängt von der Kontrolle von Infektionskrankheiten ab. Obwohl Erkrankungen teilweise durch gute Hygiene- und Quarantänemaßnahmen unter Kontrolle gehalten werden können, muss die Industrie nach wie vor auf Impfungen bauen, um Herden zu schützen. In einer kommerziellen Situation sind die Kosten pro Tier in Bezug auf Futterkosten und Kosten für die laufende Krankheitskontrolle hoch und dementsprechend müssen die Kosten für die Verhütung von Erkrankungen und die Kontrolle durch einen jeglichen neu vorgeschlagenen Impfstoff billig, wirksam und leicht abzugeben sein.
  • Herkömmlicherweise sind Impfstoffe, die aus lebenden Viruspartikeln bestehen, durch Viruspassage und Selektion von attenuierten Formen hergestellt worden. Alternativ wurden abgetötete Impfstoffe ausgehend von virulenten Viren hergestellt.
  • Die neueste Beschreibung der Verwendung von viralen Vektoren bei der Kontrolle von Erkrankungen bei Schweinen war die Deletionsmutante des Pseudorabiesvirus für die Kontrolle der Aujeszkyschen Krankheit. Die Verwendung eines Herpesvirus als Vektor hat den Vorteil, dass dieses in der Lage ist, eine humorale und zellvermittelte Antwort zu stimulieren, wodurch ein möglicher lebenslanger Schutz bereitgestellt wird. Ein anderer Vorteil ist die Fähigkeit, andere heterologe Sequenzen in diesen Vektor zu inserieren, welche ausgehend von einem geeig neten Promotor exprimiert werden, um Antigene für eine Exposition gegenüber dem Immunsystem der Tiere zu produzieren, wodurch diese vor zwei Krankheiten geschützt werden. Es gibt Nachteile bei diesem System. Erstens gibt es das Problem der Latenz. Herpesviren haben die Fähigkeit, sich für die Lebensdauer des Tiers in die Neuronen in Ganglien zu integrieren. Es erfordert nur einen geeigneten Stress bei dem Tier, um die Reaktivierung des Virus und in der Folge eine vollständige Erkrankung hervorzurufen. Es ist jetzt jedoch bekannt, dass die Deletion eines speziellen Gens, Glycoprotein E, das Virus attenuieren und eine Reaktivierung aus der Latenz verhindern wird. Dementsprechend wird dieser Deletionsvektor jetzt weithin als ein Ausrottungsvektor für die Aujeszkysche Krankheit verwendet und wird nachfolgend nicht als ein geeigneter Vektor für die Abgabe von anderen Antigenen zur Verfügung stehen.
  • Es ist dementsprechend das Ziel dieser Erfindung, ein Abgabevehikel für heterologe Sequenzen von genetischem Material bereitzustellen, das für eine Verabreichung in einem großen Maßstab besonders geeignet ist.
  • Insbesondere ist es das Ziel dieser Erfindung, Mittel für eine Erzeugung und/oder eine Optimierung von Antikörpern oder zellvermittelter Immunität bereitzustellen oder zu verstärken, um einen Schutz gegen eine Infektion mit üblichen Schweine-Krankheiten bereitzustellen. Es ist ein zusätzliches Ziel, ein Verfahren zur Herstellung eines geeigneten Mittels zur Erzeugung und/oder Optimierung von Antikörpern oder zellvermittelter Immunität bereitzustellen, um Schweine vor einer Infektion mit üblichen Schweine-Krankheiten zu schützen. Es ist ein weiteres Ziel, eine Schutzstrategie bereitzustellen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt in einer Ausführungsform ein rekombinantes Schweine-Adenovirus, das in der Lage ist, eine DNA von Interesse zu exprimieren, wobei die DNA von Interesse stabil in eine geeignete Stelle des Genoms des rekombinanten Schweine-Adenovirus integriert ist, bereit.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung einen rekombinanten Vektor, umfassend ein rekombinantes Schweine-Adenovirus, welcher stabil wenigstens eine heterologe Nukleotidsequenz beinhaltet, bereit. Die heterologe Nukleotidsequenz ist vorzugsweise zu einer Ex pression als ein antigenes Polypeptid in der Lage. Das durch wenigstens eine Nukleotidsequenz kodierte antigene Polypeptid ist bezogen auf den Wirtsvektor vorzugsweise fremd.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die heterologe Nukleotidsequenz zu einer Expression als ein die Immunantwort verstärkendes Molekül in der Lage.
  • Es soll sich auch verstehen, dass die heterologe Nukleotidsequenz ein antigenes Polypeptid und ein die Immunantwort verstärkendes Molekül kodieren und/oder exprimieren kann.
  • Der rekombinante Vektor kann ein lebendes rekombinantes Schweine-Adenovirus umfassen, in welchem die Strukturproteine des Virions gegenüber jenen in dem nativen Schweine-Adenovirus, ausgehend von welchem das rekombinante Schweine-Adenovirus hergestellt wird, unverändert sind.
  • Diese Erfindung beruht teilweise auf der Entdeckung, dass es in dem Schweine-Adenovirusgenom nicht-essentielle Regionen gibt, die nicht jenen, die zuvor bei anderen Adenoviren charakterisiert worden sind, entsprechen, was dieses Virus besonders geeignet für eine Abgabe von heterologen Sequenzen macht.
  • Diese Erfindung beruht auch auf der Entdeckung, dass das Schweine-Adenovirus eine länger andauernde Antwort in Schweinen erzeugt, was dieses als ein Impfstoffvehikel gut geeignet macht. Darüber hinaus ermöglicht die Existenz von verschiedenen Serotypen, die für den Respirationstrakt oder den Gastrointestinaltrakt spezifisch sind, die Auswahl eines Impfstoffvehikels, welches für ein Zielorgan und den erforderlichen Typ der Immunantwort geeignet ist.
  • Die Erfindung beruht auch auf der Entdeckung, dass Schweine-Adenovirus genomische DNA verpacken kann, die größer als die 105%-Regel für Säugetier-Adenoviren mit Genomen von mittlerer Größe ist und dass die resultierenden verpackten Virionen in vitro und in vivo stabil sind.
  • Adenoviren sind eine große und vielgestaltige Familie, die aus vielen Lebewesen, einschließlich des Menschen und anderer Säugetiere wie auch verschiedener Vögel, isoliert worden sind. Als ein Ergebnis sind Adenoviren in wenigstens zwei Gattungen, die Mastoadenoviridae und die Aviadenoviridae, unterteilt worden und unlängst ist eine dritte Gattung vorgeschlagen worden, die Atadenoviridae, die einige Rin der- und Vögel-Adenoviren (Eierverlustsyndrom) umfasst (Benkö und Harrach, Archives of Virology 143, 829–837, 1998).
  • Schweine-Adenoviren sind weit verbreitete infektiöse Agentien von Schweinen und bis heute sind vier unterschiedliche Serotypen anerkannt worden (Adair und McFerran, 1976) und es gibt Beweise für wenigstens einen weiteren (Derbyshire et al., 1975). Von den vier gefundenen Serotypen wurden drei (Serotypen 1 bis 3) aus dem Gastrointestinaltrakt isoliert, während der vierte aus dem Atemwegssystem gewonnen wurde. Die Schweine-Adenoviren werden als ein gering pathogenes weit verbreitetes Agens angesehen und obwohl Isolierungen im Allgemeinen aus erkrankten Tieren erfolgten, war es überaus wahrscheinlich, dass das Adenovirus nur als eine Sekundärinfektion vorhanden war. Sie sind aus Schweinen mit Diarrhöe und Atemwegsinfektionen isoliert worden, es wurde aber angenommen, dass wenigstens die gastrointestinalen Adenovirus-Infektionen üblicherweise symptomlos verlaufen (Sanford und Hoover, 1983). Schweine-Adenoviren werden durch Ingestion oder Inhalation verbreitet und eine experimentelle Infektion über orale, intranasale und intratracheale Inokulationen hat zu der Aufnahme des Virus geführt. Experimentelle Pathogenitätsuntersuchungen haben gezeigt, dass die primären Infektionsorte der untere Dünndarm, wahrscheinlich die Mandeln sind (Sharpe und Jessett, 1967; Shadduck et al., 1968). Bei der Serotyp 4-Infektion scheint sich bei experimentellen Infektionen eine Virämie zu entwickeln. Dies kann jedoch bei den gastrointestinalen Serotypen eine weniger häufige Manifestation sein (Shadduck et al., 1968). Eine Ausscheidung in den Faeces ist die häufigste Ursache für eine Verbreitung von PAV, welche mehrere Wochen nach einer Infektion vorhanden ist. Unter experimentellen Bedingungen tritt auch eine Ausscheidung in den Nasensekreten auf. Es ist vermutet worden, dass die Rolle von PAV bei Pneumonie entweder jene eines eine Anfälligkeit bewirkenden Faktors oder eines Synergisten ist (Kasza et al., 1969; Schiefer et al., 1974), aber eine experimentelle Pneumonie mit dem Serotyp 4 erforderte kein zweites Agens, um eine Erkrankung hervorzurufen (Smith et al., 1973).
  • Die Schweine-Adenoviren müssen noch detailliert untersucht werden und es ist wenig bekannt über ihre Rolle bei Erkrankungen oder wie häufig sie sind. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass sie in Herden keinerlei signifikante Erkrankung hervorrufen und kein Interesse der Industrie aufgrund von Produktionsverlusten auf sich gezogen haben. Es ist wahrscheinlich, dass die Anzahl von Serotypen von Schweine-Adenoviren viel größer als vier ist und dass es wahrscheinlich in der Hauptzahl der Schweineherden als ein normaler Kommensale vorhanden ist.
  • Arbeiten, die an Schweine-Adenovirus in Hinblick auf dessen Morphologie und Molekularbiologie vorgenommen worden sind, haben einige Ähnlichkeiten zu anderen untersuchten Mastadenoviren gezeigt. Dessen Morphologie ist jene von anderen untersuchten Adenoviren mit einem ikosaederförmigen Kapsid, welches einen Kern mit einem doppelsträngigen DNA-Genom enthält. Es sind sehr wenige Arbeiten über die Charakterisierung des PAV-Genoms veröffentlicht worden (Benkö et al., 1990, Kleiboeker et al., 1993, Reddy et al., 1993, Kleiboeker, 1994). Die Größe des PAV-Genoms (ungefähr 34,8 kb) ist geringfügig kleiner als jene von humanen Adenoviren (ungefähr 35,9 kb). Eine Untersuchung unter Verwendung einer Hybridisierung mit DNA-Sonden aus dem vollständigen Genom von humanem Adenovirus Typ 2 hat gezeigt, dass es zwischen dem Schweine- und dem humanen Adenovirus eine beachtenswerte DNA-Homologie gibt (Benkö et al., 1990). Ein neuerer Bericht über das Serotyp 4-PAV zeigte, dass dessen genomische Ausstattung ebenfalls ähnlich zu jener der humanen Adenoviren in dem Bereich der L4- und E3-Regionen (einschließlich der Gene 33K und pVIII) war, obwohl die Sequenzhomologie nicht so stark war, wie man vielleicht erwartet hätte (Kleiboeker, 1994).
  • Wenn man geeignete PAV für die Entwicklung als lebende Vektoren, um Impfstoffe an Schweine abzugeben, auswählt, ist es wichtig, die natürliche Prävalenz von Serotypen zu berücksichtigen. Jene Serotypen, die man nicht üblicherweise überall antrifft, haben offensichtliche Vorteile gegenüber jenen, denen Schweine häufig ausgesetzt sind und gegen jene sie möglicherweise Immunität entwickelt haben.
  • Eine weitere Erwägung betrifft die Fähigkeit des Vektors, in dem Schwein aktiv zu bleiben nach dem Zeitraum, in welchem mütterliche Antikörper im Kolostrum Schweine ummittelbar nach der Geburt schützen.
  • Andere wichtige Erwägungen bei der Auswahl von potentiellen PAV-Vektoren sind Pathogenität und Immunogenität. Lebende Vektorviren sollten vorzugsweise hochgradig infektiös, aber nicht-pathogen (oder zumindest attenuiert) sein, so dass sie selbst die Zielspezies nicht nachteilig beeinflussen.
  • Die bevorzugten Kandidaten für Impfstoffvektoren sind nicht-pathogene Isolate von Serotyp 4 (respiratorisch) und Serotyp 3 (gastrointestinal). Serotyp 3 ist als der Serotyp der Wahl ausgewählt worden aufgrund seiner hervorragenden Vermehrungsfähigkeiten in kontinuierlichen Schweinenieren-Zelllinien. Es ist gut möglich, dass die Isolierung von anderen Serotypen, die wahrscheinlich erscheint, diese Auswahl verändern kann. Es ist bemerkenswert, dass die virulenteren Stämme eine stärkere Antikörperantwort hervorrufen.
  • Heterologe Nukleotidsequenzen, die in nicht-essentielle Regionen des Virusgenoms eingebaut werden können und die möglicherweise die antigenen Determinanten von infektiösen Organismen, gegen welche die Erzeugung von Antikörpern oder zellvermittelter Immunität wünschenswert ist, kodieren, können jene sein, die antigene Determinanten von Darminfektionen, die durch gastrointestinale Viren hervorgerufen werden, beispielsweise Rotavirus- oder Parvovirus-Infektionen, oder Atemwegsviren, beispielsweise Parainfluenzavirus, oder jenes der Japanischen Enzephalitits, exprimieren.
  • Heterologe Nukleotidsequenzen, die eingebaut werden können, umfassen die antigenen Determinanten der Mittel von:
    • – Schweine-Parvovirus
    • – Mycoplasma hyopneumonia
    • – Schweine-Parainfluenzavirus
    • – Übertragbare Gastroenteritis (Schweine-Coronavirus)
    • – Schweine-Rotavirus
    • – Hog Cholera-Virus (klassische Schweinepest)
    • – Schweinedysenterie
    • – Afrikanisches Schweinepestvirus
    • – Pseudorabiesvirus (Aujeszkysche Krankheit), insbesondere das Glycoprotein D des Pseudorabiesvirus
    • – Schweine-spezifisches respiratorisches und reproduktives Syndrom-Virus (PRRSV; Porcine respiratory and reproductive Syndrome virus)
    • – Heterologe Nukleotidsequenzen, die für einen Einbau in die Vektoren der Erfindung mehr bevorzugt sind, sind jene, die antigene Determinanten von Schweine-Parvovirus, Schweine-Rotavirus, Schweine-Coronavirus und des klassischen Schweinepestvi rus exprimieren.
  • Es wird auch ins Auge gefasst, dass die eingebauten heterologen Sequenzen die Immunantwort verstärkende Moleküle, wie Zytokine oder Wachstumsförderer, beispielsweise porzines Interleukin 4, gamma-Interferon (γIFN), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF), FLT-3-Ligand und Interleukin 3 (IL-3), sein können.
  • Die Art der durch Kandidaten-Vektoren stimulierten Immunantwort kann die Auswahl von heterologen Nukleotidsequenzen für eine Insertion in diese beeinflussen. Die PAV-Serotypen 1, 2 und 3, die von Natur aus über den Darm infizieren, können lokale mukosale Immunität induzieren und sind dementsprechend besser geeignet für Infektionen der Darmabschnitte (z.B. klassisches Schweinepestvirus). Der PAV-Serotyp 4, der von Natur aus über das Atemwegssystem infiziert, kann besser geeignet sein für Infektionen der Atemwege (z.B. Schweine-Parainfluenzavirus) und kann auch gute lokale Immunität induzieren.
  • Die DNA von Interesse, die heterologe Gene, welche antigene Determinanten oder die Immunantwort verstärkende Moleküle kodieren, umfassen kann, kann in wenigstens einer nicht-essentiellen Region des Virusgenoms lokalisiert sein.
  • Nicht-essentielle Regionen des Virusgenoms, die für die Zwecke des Ersetzens durch oder der Insertion von heterologe(n) Nukleotidsequenzen geeignet sein können, können nicht-kodierende Regionen am rechten terminalen Ende des Genoms bei den Kartierungseinheiten 97 bis 99,5 sein. Bevorzugte nicht-kodierende Regionen umfassen die frühe Region (E3) des PAV-Genoms bei den Kartierungseinheiten 81–84.
  • Die heterologen Gensequenzen können mit einem Promotor und einer Leadersequenz assoziiert sein, damit die Nukleotidsequenz in situ so effizient wie möglich exprimiert werden kann. Die heterologe Gensequenz ist vorzugsweise mit dem Major late-Promotor und der Spleiß-Leadersequenz des Schweine-Adenovirus assoziiert. Der Major late-Promotor der Säugetier-Adenoviren befindet sich nahe den Kartierungseinheiten 16–17 auf der genetischen Karte der Adenoviren und enthält ein klassisches TATA-Sequenzmotiv (Johnson, D. C., Ghosh-Chondhury, G., Smiley, J. R., Fallis, L. und Graham, F. L. (1988), Abundant expression of herpes simplex virus glycoprotein gB using an adenovirus vector. Virology 164, 1–14).
  • Die Spleiß-Leadersequenz des betrachteten Schweine-Adenovirus-Serotyps ist eine dreiteilige (tripartite) Sequenz, die an das 5'-Ende der mRNA aller späten Gene gespleißt ist.
  • Die heterologe Gensequenz kann auch mit einer Polyadenylierungssequenz assoziiert sein.
  • Statt dem Major late-Promotor des Schweine-Adenovirus kann ein jeglicher anderer geeigneter eukaryotischer Promotor verwendet werden. Es können beispielsweise jene des SV40-Virus, Zytomegalievirus (CMV) oder humanen Adenovirus verwendet werden.
  • Es können auch andere Prozessierungs- und Polyadenylierungssignale als jene von Schweine-Adenoviren in Betracht gezogen werden, beispielsweise jene von SV40.
  • Unter einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein rekombinanter Impfstoff für das Erzeugen und/oder Optimieren von Antikörpern oder zellvermittelter Immunität bereitgestellt, um einen Schutz gegen eine Infektion mit einem infektiösen Organismus bei Schweinen bereitzustellen oder zu verstärken, wobei der Impfstoff wenigstens einen rekombinanten Schweine-Adenovirus-Vektor, welcher wenigstens eine heterologe Nukleotidsequenz beinhaltet, formuliert mit geeigneten Trägern und Hilfsstoffen umfasst. Die Nukleotidsequenz ist vorzugsweise zu einer Expression als ein antigenes Polypeptid oder als ein die Immunantwort verstärkendes Molekül in der Lage. Mehr bevorzugt kann die heterologe Nukleotidsequenz ein antigenes Polypeptid und ein die Immunantwort verstärkendes Molekül kodieren und/oder exprimieren.
  • Das durch die wenigstens eine Nukleotidsequenz kodierte antigene Polypeptid ist bezogen auf den Wirtsvektor vorzugsweise fremd. Wenigstens eine Nukleotidsequenz kann mit einer Promotor/Leadersequenz und einer polyA-Sequenz assoziiert sein.
  • Der rekombinante Impfstoff kann einen lebenden rekombinanten Schweine-Adenovirusvektor enthalten, in welchem die Strukturproteine des Virions gegenüber jenen in dem nativen Schweine-Adenovirus, ausgehend von welchem das rekombinante Schweine-Adenovirus hergestellt wird, unverändert sind.
  • Bevorzugte Vektor-Kandidaten für eine Verwendung in dem rekombinanten Impfstoff sind PAV-Isolate der Serotypen 3 und 4. Eine Verwendung von anderen Serotypen ist abhängig von der in der Herde vorliegenden Immunität und deren Umwelt möglich.
  • Der Impfstoff kann gegen Atemwegs- und Darminfektionen, die durch verschiedene Agentien hervorgerufen werden, gerichtet sein. Um den Impfstoff gegen einen speziellen infektiösen Organismus zu richten, können heterologe Gensequenzen, welche die antigenen Determinanten von jenen infektiösen Organismen kodieren, in nicht-essentielle Regionen des Genoms des Schweine-Adenovirus, welches der Vektor umfasst, eingebaut werden. Wenn der Impfstoff verwendet werden soll, um einen Schutz gegen eine Erkrankung zu optimieren, können geeignete heterologe Nukleotidsequenzen jene von die Immunantwort verstärkenden Molekülen, wie von Zytokinen oder Wachstumsförderern, sein.
  • Der Impfstoff kann andere Bestandteile, wie Stabilisatoren, Hilfsstoffe, andere pharmazeutisch verträgliche Verbindungen oder ein jegliches anderes Antigen oder einen Teil davon, umfassen. Der Impfstoff kann in Form eines lyophilisierten Präparats oder als Suspension vorliegen, die allesamt auf dem Gebiet der Impfstoffherstellung üblich sind.
  • Ein geeigneter Träger für einen solchen Impfstoff kann isotonische gepufferte Kochsalzlösung sein.
  • Unter einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs für die Erzeugung und/oder Optimierung von Antikörpern oder zellvermittelter Immunität, um einen Schutz gegen einen infektiösen Organismus in einem Schwein zu induzieren oder zu verstärken, bereitgestellt, welches umfasst, einen rekombinanten Schweine-Adenovirusvektor zu konstruieren, welcher stabil wenigstens eine heterologe Nukleotidsequenz beinhaltet, und den rekombinanten Schweine-Adenovirusvektor in einer Form, die für eine Verabreichung geeignet ist, bereitzustellen. Die Nukleotidsequenz ist vorzugsweise zu einer Expression als ein antigenes Polypeptid in der Lage, obwohl es auch ein die Immunantwort verstärkendes Molekül sein kann. Die Nukleotidsequenz kann mehr bevorzugt ein antigenes Polypeptid und ein die Immunantwort verstärkendes Molekül kodieren und/oder exprimieren. Die Nukleotidsequenz ist geeigneterweise bezogen auf den Wirtsvektor fremd.
  • Sogar noch mehr bevorzugt ist die Nukleotidsequenz mit Promotor/Leader- und polyA-Sequenzen assoziiert.
  • Die Verabreichungsform kann jene einer enterischen beschichteten Dosierungseinheit, eines Inokulums für eine intraperitoneale, intramuskuläre oder subkutane Verabreichung, eines Aerosolsprays, durch o rale oder intranasale Anwendung sein. Eine Verabreichung im Trinkwasser oder in Futterpellets ist auch möglich.
  • Unter einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Schweine-Adenovirus-Impfvektors bereitgestellt, welches umfasst, in ein Schweine-Adenovirus wenigstens eine heterologe Nukleotidsequenz zu inserieren. Die heterologe Nukleotidsequenz ist vorzugsweise zu einer Expression als ein antigenes Polypeptid in der Lage, obwohl es auch ein die Immunantwort verstärkendes Molekül sein kann. Die Nukleotidsequenz kann mehr bevorzugt ein antigenes Polypeptid und ein die Immunantwort verstärkendes Molekül kodieren und/oder exprimieren.
  • Das antigene Polypeptid, das durch die wenigstens eine Nukleotidsequenz kodiert wird, ist geeigneterweise bezogen auf den Wirtsvektor fremd.
  • Noch mehr bevorzugt ist die heterologe Nukleotidsequenz mit Promotor/Leader- und polyA-Sequenzen assoziiert.
  • In einem Verfahren zur Konstruktion eines geeigneten Vektors könnte die nicht-essentielle Region, die verändert werden soll, damit sie fremde DNA beinhalten kann, über homologe Rekombination konstruiert werden. Durch diese Methode wird die nicht-essentielle Region kloniert und fremde DNA wird zusammen mit Promotor-, Leader- und Polyadenylierungssequenzen vorzugsweise durch homologe Rekombination zwischen flankierende Sequenzen inseriert. Durch diese Methode ist auch eine Deletion von Abschnitten der nicht-essentiellen Region möglich, um zusätzlichen Platz für größere DNA-Inserts, die außerhalb der normalen Verpackungsgrenzen des Virus liegen, zu erzeugen.
  • Durch diese Methode kann eine DNA-Expressionskassette, welche einen geeigneten PAV-Promotor mit einer fremden Gensequenz wie auch Leadersequenzen und Polyadenylierungserkennungssequenzen enthält, konstruiert werden, wobei die die Kassette flankierenden einmalig vorkommenden Restriktionsenzymstellen eine leichte Insertion in das PAV-Genom erlauben.
  • Unter einem anderen Aspekt der Erfindung werden Strategien für eine Verabreichung der Impfstoffe der Erfindung bereitgestellt.
  • Im Rahmen einer Strategie können ein heterologes Antigen und ein die Immunantwort verstärkendes Molekül, wie ein Zytokin, in dem gleichen rekombinanten Konstrukt exprimiert und als ein einziger Impfstoff abgegeben werden.
  • Im Rahmen einer Strategie gemäß der Erfindung können auf PAV-Vektoren basierende Impfstoffe als „Cocktails", welche 2 oder mehrere Virusvektoren, welche unterschiedliche fremde Gene oder die Immunantwort verstärkende Moleküle tragen, umfassen, verabreicht werden.
  • Bei einer bevorzugten Impfstrategie der Erfindung, der „Cocktail"- oder simultanen Strategie, wird ein Impfstoff verwendet, der sowohl auf dem PAV-Serotyp 3 als auch Serotyp 4 basiert.
  • In einer anderen bevorzugten Strategie wird ein rekombinantes Serotyp 3-Basis-Schweine-Adenovirus konstruiert, bei welchem das Fasergen aus dem Serotyp 4 jenes des Serotyps 3 ersetzt oder die Faser aus dem Serotyp 4 zusätzlich in den Impfstoff kloniert worden ist, um die Zielgerichtetheit der Erfindung sowohl auf eine Abgabe an den Darm als auch an die Atemwege zu verbreitern.
  • In einer alternativen Strategie gemäß der Erfindung können auf PAV-Vektoren basierende Impfstoffe nacheinander verabreicht werden, um entweder Auffrischimpfungs (Booster-)-Impfstoffe oder neue Impfstoffe zu irgendeinem Zeitpunkt nach einer anfänglichen PAV-Impfung zu verabreichen. Die verwendeten Impfstoffe basieren vorzugsweise auf heterologen PAV-Isolaten.
  • In einer bevorzugten Version der „aufeinanderfolgenden" Strategie werden Impfstoffe, welche auf hinsichtlich des Serotyps nicht verwandten Isolaten basieren, ausgewählt, um einen maximalen Schutz gegen eine Infektion zu erzielen. In einem Beispiel einer solchen Strategie wird ein auf dem PAV-Serotyp 3 basierender Impfstoff nach oder vor einer Impfung mit einem auf dem PAV-Serotyp 4 basierenden Impfstoff verabreicht.
  • Schweine werden in geeigneter Weise mit erfindungsgemäßen Vektorimpfstoffen in einem jeglichen Alter inokuliert. Ferkel können im Alter von 1 Tag geimpft werden, Zuchttiere können regelmäßig bis zu dem Zeitpunkt des Gebärens und danach geimpft werden.
  • Gemäß entweder der aufeinanderfolgenden Strategie oder der Cocktail-Strategie werden Schweine vorzugsweise geimpft, während sie noch nicht vollständig immunkompetent sind. Mehr geeignet können Tage alte Schweine für einen Schutz gegen eine Reinfektion nach einem Zeitraum von 4 Wochen nach einer anfänglichen Impfung geimpft werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Verwendung der Vektoren für die Herstellung eines Arzneimittels für das Erzeugen einer Immunantwort in einem Schwein bereitgestellt, indem an das Schwein eine wirksame Menge eines rekombinanten Impfstoffs gemäß der Erfindung verabreicht wird. Eine wirksame Menge ist eine Menge, welche ausreicht, um eine Immunantwort auszulösen, vorzugsweise wenigstens 104 TCID50 pro Dosis.
  • Der Impfstoff der Erfindung kann selbstverständlich mit Impfstoffen gegen andere Viren oder Organismen, wie Parvovirus oder Aujeszkysche Krankheit, zu dem Zeitpunkt von dessen Verabreichung kombiniert werden.
  • Unter einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform der Erfindung erfolgt eine Verabreichung durch orale Abgabe oder intranasal. Verfahren zur Konstruktion und zum Testen von rekombinanten Vektoren und Impfstoffen gemäß dieser Erfindung werden den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt sein. Standard-Vorgehensweisen für Endonukleaseverdau, Ligation und Elektrophorese wurden gemäß den Anweisungen der Hersteller oder Lieferanten ausgeführt. Standardtechniken werden nicht detailliert beschrieben und sind für Fachleute auf diesem Gebiet selbstverständlich.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 veranschaulicht die DNA-Restriktionsendonukleasekarte des vollständigen PAV-Serotyp 3-Genoms.
  • 2 veranschaulicht die Sequenzcharakterisierung und Klonierung des Major late-Promotors und der Spleiß-Leadersequenzen des PAV-Serotyps 3.
  • 3 veranschaulicht die Sequenzen des Major late-Promotors, der strangaufwärts gelegenen Enhancer-Sequenz und der Spleiß-Leadersequenzen 1, 2 und 3.
  • 4 veranschaulicht die terminalen 720 Basen des rechten Endes des Genoms.
  • 5 veranschaulicht die Promotorregion von E3 und den überlappenden L4-Bereich.
  • 6 veranschaulicht ein bevorzugtes Verfahren zur Konstruktion eines PAV-Vektors.
  • 7 repräsentiert Temperaturdaten von mit einem auf PAV basierenden Impfstoff immunisierten Schweinen nach Provokation mit dem CSFV-Antigen.
  • 8 repräsentiert graphisch die durch ELISA detektierten anti-PAV-Antikörperkonzentrationen in Schweinen vor und nach einer Impfung mit einem auf PAV basierenden Impfstoff.
  • 9 veranschaulicht graphisch die Entwicklung von neutralisierenden Antikörpern in mit einem auf PAV basierenden Impfstoff geimpften Schweinen vor und nach einer Provokation mit dem CSFV-Antigen.
  • 10 veranschaulicht graphisch die mittleren Leukozyten (WBC)-zahlen von Schweinen, die mit einem rekombinanten PAV-Impfstoff, welcher G-CSF vom Schwein exprimiert, geimpft worden sind.
  • 11 veranschaulicht graphisch die prozentuale Veränderung der Leukozyten (WBC)-zahlen nach Impfung mit einem rekombinanten PAV-Impfstoff, welcher G-CSF vom Schwein exprimiert.
  • 12 repräsentiert graphisch die prozentuale Veränderung der Monozytenzellpopulationen nach Impfung mit rekombinantem PAV-G-CSF.
  • 13 repräsentiert graphisch die prozentuale Veränderung der Lymphozytenzellpopulationen nach Impfung mit rekombinantem PAV-G-CSF.
  • 14 repräsentiert graphisch die Veränderung der Stimulation von T-Zellen nach Impfung mit rekombinantem PAV-G-CSF.
  • 15a, b und c veranschaulichen graphisch ein Verfahren zur Konstruktion eines PAV-E3-Vektors.
  • BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Jetzt werden Aspekte von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung basierend auf den PAV-Isolaten des Serotyps 3 und Serotyps 4 beschrieben. Obwohl diese beiden Isolate aufgrund ihrer Infektionsorte im Schwein ausgewählt worden sind, versteht es sich, dass andere Isolate von Schweine-Adenovirus für die Konstruktion von Impfstoffvektoren besser geeignet sein können, vorausgesetzt, dass die hier zuvor beschriebenen Auswahlkriterien erfüllt werden.
  • Allgemein werden PAV als von geringer Pathogenität mit geringfügigen Auswirkungen im Freiland angesehen. Die pathogene Signifikanz von PAV wird in der Übersicht von Derbyshire, 1989, dargestellt. Der erste Bericht über die Isolierung von PAV stammte von einem 12 Tage alten Schwein mit Diarrhöe (Haig et al., 1964). Zwei Jahre später wurde erstmals über PAV vom Typ 4 berichtet, welches aus dem Gehirn eines unter einer Enzephalitis unbekannter Ursache leidenden Schweins isoliert worden war (Kasza, 1966). Spätere Berichte haben PAV hauptsächlich mit Diarrhöe im Freiland in Verbindung gebracht, obwohl diese normalerweise schwach verläuft. PAV kann auch regelmäßig aus gesunden Tieren ohne Anzeichen einer Erkrankung isoliert werden und es ist recht wahrscheinlich, dass dessen Isolierung aus erkrankten Tieren mehr eine Koinzidenz von dessen Prävalenz als ein Indikator für Pathogenität ist. Jedoch ist über eine Verbindung zwischen dem Serotyp 4 und Atemwegserkrankungen berichtet worden (Watt, 1978) und diese ist durch eine experimentelle Infektion bestätigt worden (Edington et al., 1972). Experimentelle Infektionen mit gastrointestinalen Serotypen des Virus (z.B. Serotyp 3) konnten Diarrhöe hervorrufen, aber die erzeugten pathologischen Veränderungen waren nicht klinisch signifikant.
  • Das Genom des ausgewählten PAV-Serotyps 3 wurde durch herkömmliche Methoden charakterisiert. Die DNA-Restriktionsendonukleasekarten des vollständigen Genoms sind in 1 veranschaulicht. Die Genome sind von links nach rechts orientiert. Konventionsgemäß werden Adenovirus-Genome normalerweise so orientiert, dass die terminale Region, ausgehend von welcher keine späten mRNA-Transkripte synthetisiert werden, sich am linken Ende befindet. Die Enzyme, die verwendet wurden, um die Karte zu erzeugen, sind am Rand von jeder Karte angegeben.
  • CHARAKTERISIERUNG DES MAJOR LATE-PROMOTORS (MLP) UND VON SPLEISSLEADERSEQUENZEN (LS) DES PAV-SEROTYPS 3
  • Identifizierung und Klonierung des PAV-MLP
  • Durch Verwendung von Restriktionsenzym- und genetischen Karten des Genoms des PAV-Serotyps 3 wurde eine Region lokalisiert, die die MLP- und Leadersequenzen enthielt (1). Die in dieser Region identifizierten Fragmente wurden in Plasmidvektoren kloniert und sequenziert.
  • Es wurde identifiziert, dass die MLP-Promotorsequenz eine klassische TATA-Sequenz, die einzige in der sequenzierten Region, wie auch strangaufwärts gelegene Faktoren enthielt und dies wurde nachfolgend durch die Lokalisierung der Leadersequenz und der Transkriptionsstartstelle bestätigt.
  • Die 2 und 3 veranschaulichen die Sequenzcharakterisierung des Major late-Promotors und der Spleiß-Leadersequenzen des PAV-Serotyps 3.
  • Um die Struktur und Sequenz der an späte mRNA gespleißten Leadersequenz zu bestimmen, wurden Schweinenierenzellen mit PAV infiziert und man ließ die Infektion bis spät im Infektionszyklus fortschreiten (üblicherweise 20–24 h p.i.). Zu diesem Zeitpunkt wurde Gesamt-RNA aus den infizierten Zellen unter Verwendung des „RNAgents total RNA purification kit" (Promega) gereinigt. Die isolierte RNA wurde mit Isopropanol ausgefällt und in 200 μl-Aliquots bei –70°C aufbewahrt, bis sie benötigt wurde. Poly A-(mRNA) wurde aus Gesamt-RNA durch die Verwendung des „Poly AT tract System" (Promega, USA) isoliert. Die isolierte mRNA wurde für die cDNA-Herstellung verwendet.
  • Für die cDNA-Herstellung wurden Oligonukleotide zu dem komplementären Strang des Hexon-Gens und des Penton-Base-Gens, die beide MLP-Transkripte sind, hergestellt. Es wurde ein weiteres Oligonukleotid hergestellt, das die vorgeschlagene Cap-Stelle des Major late-Transkripts 24 Basen strangabwärts von der TATA-Box überspannte. Dieses Oligonukleotid wurde in Verbindung mit jenem, das bei der cDNA-Herstellung verwendet wurde, in einer Taq-Polymerase-Kettenreaktion verwendet. Die ausgehend von positiven Klonen hergestellte resultierende DNA wurde mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, um die Größe des inserierten Fragments zu bestimmen. Unter Verwendung einer Modifikation der Kettenabbruchtechnik (Sanger, F., Nicklen, S. und Gulson, A. R., 1977, DNA sequencing with chain terminating inhibitors. PNAS USA 74: 5463–5467) wurde eine DNA-Sequenzierung von diesen inserierten Fragmenten ausgeführt, um eine Taq-DNA-Polymerase-Verlängerung (Promega, USA) zu ermöglichen.
  • Um die Cap-Stelle der Leadersequenz zu bestätigen, wurde frische cDNA hergestellt und dieses Mal ein Schwanz von dGTP-Resten daran angefügt. Kurz zusammengefasst, wurde cDNA mit 1 mM dGTP und ungefähr 15 Einheiten terminale Desoxynukleotidyltransferase (Promega) in 2 mM CaCl2-Puffer bei 37°C 60 min inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erwärmen für 10 min auf 70°C gestoppt. Die DNA wurde dann mittels Ethanol ausgefällt und in einem für eine Verwendung in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) geeigneten Volumen resuspendiert. Eine PCR wurde ausgeführt, wie früher beschrieben, unter Verwendung eines poly(dC)-Oligonukleotids mit einer XbaI-Stelle am 5'-Ende. Resultierende Fragmente wurden mit T4-DNA-Polymerase bei 37°C für 30 min in Gegenwart eines Überschusses von Nukleotiden mit stumpfen Enden versehen und in die SmaI-Stelle des pUC18-Vektors kloniert. DNA-Präparation und -Sequenzierung wurden an Klonen, von denen durch Hybridisierung gezeigt worden war, dass sie positiv waren, ausgeführt, wie zuvor beschrieben.
  • 3 veranschaulicht die separaten Sequenzen des Major late-Promotors, der strangaufwärts gelegenen Enhancersequenz und der Spleiß-Leadersequenzen 1, 2 und 3, wie ausgehend von cDNA-Untersuchungen bestimmt. 2 veranschaulicht die DNA-Sequenz der vollständigen Promotor-Kassette, in welcher die Komponenten miteinander verknüpft sind.
  • CHARAKTERISIERUNG VON NICHT-ESSENTIELLEN REGIONEN DES VIRUSGENOMS
  • Das rechte Ende wurde durch Klonierung und vollständige Sequenzierung des PAV Serotyp 3-ApaI-Fragments J von ungefähr 1,8 kb identifiziert. Die invertierte Sequenzwiederholung (ITR) ist durch Vergleich der RHE-Sequenz mit jener des linken Endes bestimmt worden. Die ITR ist 144 Basen lang und repräsentiert den Startpunkt, wo hinein potentielle Insertionen vorgenommen werden können. 4 zeigt die Sequenz der 720 terminalen Basen. Restriktionsendonukleasestellen von Interesse für eine Insertion von fremder DNA sind in der terminalen Sequenz angegeben. Es ist eine mutmaßliche TATA-Stelle für den E4-Promotor angezeigt, welche das am weitesten links liegende Ende für die mögliche Insertionsstelle darstellt. Anfängliche Insertionen werden in die SmaI- oder EcoRI-Stelle erfolgen.
  • Die E3-Region des Genoms, die ebenfalls ein nicht-essentieller Bereich ist, ist lokalisiert und kloniert worden. Die Promotorregion von E3 ist identifiziert und der überlappende L4-Bereich ist sequenziert worden (5). Die Region von E3 nach dem Polyadenylierungssignal von L4 ist auch eine mögliche Stelle für eine Insertion und kann auch für eine Deletion verwendet werden, um mehr Platz für die Insertion von größeren Kassetten zu erzeugen.
  • KONSTRUKTION EINES PAV-VEKTORS
  • 6 veranschaulicht ein bevorzugtes Verfahren zur Konstruktion eines PAV-Vektors. Das am rechten Ende gelegene ApaI-Fragment J des PAV-Serotyps 3 wird kloniert und eine einmalig vorkommende SmaI-Restriktionsendonukleasestelle 230 bp von den invertierten Sequenzwiederholungen entfernt wurde als Insertionsstelle verwendet.
  • Die Major late-Promotor-Expressionskassette, welche das E2 (gp55)-Gen des klassischen Schweinepestvirus (Hog Cholera-Virus) enthält, wurde in die SmaI-Stelle des RHE-Fragments kloniert.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur homologen Rekombination war das Schneiden von genomischer PAV 3-DNA mit HpaI, einer im Genom einmalig vorkommenden Stelle, und Einführen dieser DNA durch Transfektion mittels einem mit ApaI geschnittenen Expressionskassettenplasmid, welches gp55 enthält.
  • Mit der DNA-Mischung wurden bevorzugt primäre Schweinenierenzellen durch Calciumchlorid-Standardpräzipitationstechniken transfiziert. Das bevorzugte Transfektionsverfahren erzeugt rekombinantes Virus durch homologe Rekombination zwischen genomischem PAV 3 und Plasmid (6).
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • KONSTRUKTION EINES PAV-VEKTORS
  • Die folgenden Beispiele zeigen die Konstruktion von repräsentativen Schweine-Adenoviren dieser Erfindung. Die rekombinanten Viren wurden mittels primärer Schweinenierenzellen vermehrt und titriert.
  • 1. Konstruktion von PAV-gp55
  • Eine Expressionskassette, bestehend aus dem Major late-Promotor des Schweine-Adenovirus, dem klassischen Schweinepestvirus (CSFV)-Gens (gp55) und polyA von SV40, wurde in die SmaI-Stelle am rechten Ende (MU 97–99,5) des Schweine-Adenovirus-Serotyps 3 inseriert und verwendet, um in primären Schweinenierenzellen ein rekombinantes PAV3 zu erzeugen. Die Größe der Expressionskassette betrug 2,38 Kilobasenpaare. Es erfolgte keine Deletion des genomischen PAV 3. Es ist gezeigt worden, dass Säugetier-Adenoviren mit mittleren Genomen (~36 kb) bis zu 105 der Wildtyp-Genomlänge aufnehmen können und Genome, die größer als diese Größe sind, sind entweder nicht verpackbar oder extrem instabil, wobei sie häufig DNA-Umlagerungen durchlaufen (Betts, Prevec und Graham, Journal of Virology 67, 5911–5921 (1993), Packaging capacity and stability of human adenovirus type 5 vectors; Park and Graham, Journal of Virology, 71, 3293–3298, (1997), A helper dependent system for adenovirus vector production helps define a lower limit for efficient DNA packaging). Bei dieser Erfindung betrug die PAV-Genomlänge 34,8 kb, in welche ohne jegliche andere Deletion eine Expressionskassette von 2,38 kb inseriert wurde. Die resultierende Länge der genomischen DNA des rekombinanten Schweine-Adenovirus dieser Erfindung betrug 106,8% und überschritt folglich die mutmaßliche Maximalgrenze für die Konstruktion einer stabilen Rekombinante. Das rekombinante Virus wurde dreimal mittels Plaques gereinigt und in primären Schweinenierenzellen stabil passagiert. Es wurde durch Southern-Blot-Hybridi sierung gezeigt, dass die Rekombinante gp55 enthielt. Die Expression von gp55 wurde gezeigt, indem eine auf Glas-Deckgläschen kultivierte primäre PK-Zelllinie mit dem rekombinanten Schweine-Adenovirus infiziert wurde. Nach 24 h zeigte eine Immunfluoreszenzanfärbung (IF) infizierte Zellen, welche gp55 exprimierten.
  • 2. Konstruktion von rekombinantem PAV-G-CSF
  • Eine Expressionskassette, welche den Major late-Promotor des Schweine-Adenovirus, das den Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF) des Schweins kodierende Gen und polyA von SV40 umfasst, wurde in die SmaI-Stelle am rechten Ende (MU 97–99,5) des Schweine-Adenovirus-Serotyps 3 inseriert und verwendet, um in primären Schweinenierenzellen ein rekombinantes PAV 3 zu erzeugen. Die Größe der Expressionskassette betrug 1,28 Kilobasenpaare. Es erfolgte keine Deletion des genomischen PAV 3. Das rekombinante Virus wurde zweimal mittels Plaques gereinigt und in primären Schweinenierenzellen stabil passagiert. Es wurde durch Southern-Blot-Hybridisierung und Polymerasekettenreaktion (PCR) gezeigt, dass die Rekombinante G-CSF enthielt. Die Expression von G-CSF wurde gezeigt, indem primäre Nierenzellen mit dem rekombinanten PAV-G-CSF infiziert wurden. Gewebekulturüberstände von den infizierten primären Nierenzellen wurden dann einer Elektrophorese in SDS-PAGE-Gelen unterworfen und auf Filter transferiert. Infizierte Zellen, welche G-CSF exprimieren, wurden in einem Western-Blot unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antiserums gegen Schweine-G-CSF, exprimiert durch gereinigte rekombinante E. coli, detektiert.
  • 3. Konstruktion von rekombinantem PAV-gp55T/GM-CSF
  • Eine Expressionskassette, bestehend aus dem Major late-Promotor des Schweine-Adenovirus, einer verkürzten Form des klassischen Schweinepestvirus-Gens gp55 fusioniert im Raster an das Gen, welches entweder die vollständige Länge oder die reife Form des Schweine-Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (GM-CSF) kodiert, und polyA von SV40, wurde in die SmaI-Stelle am rechten Ende (MU 97–99,5) des Schweine-Adenovirus-Serotyps 3 inseriert und verwendet, um in primären Schweinenierenzellen ein rekombinantes PAV 3 zu erzeugen. Die Größe der Expressionskassette betrug 2,1 Kilobasenpaare. Es erfolgte keine Deletion des genomischen PAV 3. Das rekombinante Vi rus wurde zweimal mittels Plaques gereinigt und es wurde durch PCR gezeigt, dass es gp55 und GM-CSF enthielt.
  • 4. Konstruktion von rekombinantem PAV-gp55/E3
  • Der Insertionsvektor pJJ408, welcher das am rechten Ende gelegene ApaI-Fragment J des PAV-Serotyp 3-Genoms (ungefähr 1,8 kb) enthielt, wurde vergrößert, so dass er das vollständige BglII B-Fragment, umfassend 7,2 kb des rechten Endes von PAV3, enthielt (15a und b). Dieses Fragment enthält sowohl die zuvor beschriebene am rechten Ende gelegene Insertionsstelle als auch die E3-Region. Die am rechten Ende gelegene Insertionsstelle wurde gentechnologisch modifiziert, so dass sie die PAV3-MLP/TPL-Sequenzen, gefolgt von einer Mehrfachklonierungsstelle und der polyA-Sequenz von SV40, enthielt.
  • Eine E3-Insertionsstelle wurde konstruiert, indem ein 622 bp-SnaBI/BsrGI-Fragment innerhalb der E3-Region des PAV-Serotyps 3 herausgeschnitten wurde. Die MLP/TPL-gp55-PolyA-Expressionskassette wurde in die SnaBI/BsrGI-Stelle inseriert (15b und d). Dieses Plasmid wurde in Transfektionen verwendet, um ein rekombinantes PAV3, welches die MLP/TPL-gp55-poly A-Kassette inseriert in die teilweise deletierte E3-Region enthielt, herzustellen (15c).
  • Wildtyp-PAV3-DNA wurde mit dem Restriktionsenzym SnaBI verdaut, wodurch zwei Fragmente von 28,712 kbp und 5,382 kbp erhalten wurden. Das große links gelegene Fragment, welches die Überlappungsregion des rechten Endes und des linken Endes des PAV3-Genoms umfasst, wurde mittels eines Gels gereinigt. Mit diesem Fragment zusammen mit mit dem KpnI-Restriktionsenzym geschnittener E3/rhe-Insertionsvektor-DNA wurden primäre PK-Zellen in 3 cm-Petrischalen transfiziert, um zu ermöglichen, dass eine homologe Rekombination zwischen dem PAV3 und der Insertionsvektor-DNA auftritt. Bei Verwendung dieses Verfahrens wird nur rekombinantes Virus gewonnen.
  • Zellen wurden 5 Tage bei 37°C gehalten und dann zweimal eingefroren und aufgetaut. Lysat wurde in frische primäre PK-Zellen passagiert und hinsichtlich der Entwicklung von Plaques beobachtet. Das rekombinante Virus wurde mittels Plaques gereinigt und es wurde durch PCR gezeigt, dass es gp55 enthielt.
  • IMPFSTRATEGIE
  • 1. Impfung mit PAV-gp55
  • In diesem Experiment wurden 5–6 Wochen alte Ferkel verwendet, um immunkompetente Schweine zu repräsentieren. Eine Gruppe der Ferkel (Nr. 2, 6 und 7) wurde mit subkutan in einer Dosis von 1 × 107 pfu (Plaque-bildende Einheiten) pro Ferkel verabreichtem rekombinantem PAV-gp55 geimpft. Eine Kontrollgruppe von Ferkeln (Nr. 3, 8, 11, 12, 13 und 14) war ungeimpft. Es wurden in der geimpften Ferkelgruppe keine klinischen Anzeichen beobachtet (kein Temperaturanstieg) (Tabelle 1).
  • Figure 00200001
  • Fünf Wochen nach der Impfung mit dem rekombinanten PAV-gp55 wurden beide Gruppen von Schweinen einer Provokation mit einer letalen Dosis (1 × 103,5 TCiD50) von virulentem Hog-Cholera-Virus (klassisches Schweinepestvirus), welche subkutan verabreicht wurde, unterzogen.
  • Die Temperaturen der Schweine wurden überwacht und die Ergebnisse in Tabelle 2 tabellarisch aufgelistet und in 7 graphisch dargestellt.
  • Figure 00210001
  • Die Ergebnisse zeigen, dass am Tag 5 die Kontrollgruppe erhöhte Temperaturen aufwies (höher als 40,5°C) und klinische Anzeichen einer Erkrankung zeigten. Die geimpfte Gruppe zeigte keine klinischen Anzeichen einer Erkrankung. Schweine aus der Kontrollgruppe waren am Tag 9 tot oder wurden schmerzlos getötet. Die geimpfte Gruppe wurde am Tag 16 schmerzlos getötet. Post mortem zeigten alle Kontrollschweine eine schwere klinische Erkrankung, die geimpften Schweine zeigten keine klinischen Anzeichen einer Erkrankung.
  • Die Ergebnisse zeigen an, dass die subkutan mit dem rekombinanten PAV-gp55 geimpften Schweine eine Provokation mit dem klassischen Schweinepestvirus in einer letalen Dosis überlebten.
  • Von beiden Gruppen von Schweinen wurden Seren gesammelt und hinsichtlich des Vorhandenseins von Antikörpern gegen PAV durch ELISA getestet. Diese Tests zeigten das Vorhandensein von vorab existierenden Antikörpern gegen PAV vor der Impfung. Die Konzentration dieser Antikörper nahm nach einer Impfung mit dem rekombinanten PAV-gp55 zu, wobei zwischen Tag 28 und 36 nach der Impfung Spitzenwerte erzielt wurden. Diese Ergebnisse sind tabellarisch in 8 aufgelistet.
  • Seren wurden von der geimpften Gruppe von Schweinen vor und nach der Provokation mit CSFV gesammelt und auf das Vorhandensein von neutralisierenden Antikörpern gegen CSFV getestet. Seren wurden an den Tagen 0 und 28 nach der Impfung mit rekombinantem PAV-gp55 (vor der Provokation) und dann erneut am Tag 16 nach der Provokation (Tag 52 nach der Impfung) getestet. Die Ergebnisse in 9 zeigen keine neutralisierenden Antikörper bei Detektion am Tag 0, geringe Konzentrationen von neutralisierenden Antikörpern am Tag 28 und hohe Konzentrationen am Tag 52.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass das rekombinante PAV-gp55 Schweine vor einer letalen Provokation mit klassischem Schweinepestvirus in Gegenwart von vorab existierenden Antikörpern gegen PAV schützen kann.
  • 2. Impfung mit PAV-G-CSF
  • In diesem Experiment wurden 5–6 Wochen alte Ferkel verwendet, um immunkompetente Schweine zu repräsentieren. Eine Gruppe von Schweinen (n = 4) wurde mit subkutan in einer Dosis von 1 × 107 pfu pro Ferkel verabreichtem rekombinantem PAV-G-CSF geimpft. Eine zweite Gruppe (n = 4) wurde mit subkutan in einer Dosis von 1 × 107 pfu pro Ferkel verabreichtem PAV-Wildtyp (wt) geimpft. Eine Kontrollgruppe (n = 4) war un geimpft. Schweinen wurde in einem Zeitraum von 104 h nach der Impfung in 8-stündigen Zeitabständen Blut abgenommen. Es wurden für jede überwachte Gruppe große Blutbilder und die mittleren Leukozytenzahlen (WBC) bestimmt. Diese Ergebnisse sind in 10 graphisch dargestellt und die prozentuale Veränderung der mittleren Leukozytenzahlen ist in 11 graphisch dargestellt.
  • Schweine, die mit entweder PAV-wt oder PAV-G-CSF geimpft worden waren, zeigten klinische Anzeichen einer Erkrankung mit milder Diarrhöe 24–72 h nach der Impfung. Beide Gruppen von Schweinen hatten sich 80–96 h nach der Impfung wieder vollständig erholt. Kontrollschweine zeigten keine klinischen Anzeichen einer Erkrankung.
  • Vollblut-Screening-Ergebnisse zeigen, dass die mittleren Leukozytenzahlen für Kontrollschweine über die Dauer des Experiments zunahmen.
  • Mit PAV-wt gemipfte Schweine zeigen ebenfalls eine Zunahme der Leukozytenzahlen mit einer Verringerung der Leukozytenzahlen zwischen 48 und 80 h nach der Impfung und einer Erholung ab 80–96 h.
  • Mit dem rekombinanten PAV-G-CSF geimpfte Schweine zeigen eine signifikante Verringerung der Leukozytenzahlen über die Dauer des Experiments. Eine statistische Analyse dieser Ergebnisse ist tabellarisch in Tabelle 3 aufgeführt. Die Analyse zeigt, dass Unterschiede zwischen den mittleren Leukozytenzahlen (Kontrollen und PAV-G-CSF; PAV-wt und PAV-G-CSF) signifikant waren, was anzeigt, dass das rekombinante PAV-G-CSF die Verhältnisse von an der Immunität beteiligten Zellen veränderte. Tabelle 3. Ergebnisse von t-Tests zwischen den mittleren Leukozytenzahlen von Gruppen von Schweinen, die entweder mit PAV-Wildtyp (wt) oder einem rekombinanten PAV, welches G-CSF exprimiert (PAV-G-CSF), geimpft worden sind, oder von ungeimpften Kontrollen.
    Figure 00240001
    • a: Null-Hypothese; es gibt keinen Unterschied zwischen den mittleren Leukozytenzahlen.
    • b: p > 0,05, unzureichend, um die Null-Hypothesen beim 95%-Vertrauensniveau abzulehnen; Schlussfolgerung, dass es keinen Unterschied zwischen den mittleren Leukozytenkonzentrationen gibt.
    • c: p < 0,05, Null-Hypothese beim 95%-Vertrauensniveau abgelehnt; Schlussfolgerung, dass es einen Unterschied zwischen den mittleren Leukozytenkonzentrationen gibt.
    • d: 4 Schweinen in jeder Gruppe wurde in Zeitabständen von 8 h Blut abgenommen.
  • Es wurden für jede Gruppe auch die differenziellen Leukozytenzahlen bestimmt und überwacht. Die prozentuale Veränderung der mittleren Monozytenzellpopulationen ist graphisch in 12 dargestellt und die prozentuale Veränderung der mittleren Lymphozytenzellpopulationen ist graphisch in 13 dargestellt. 12 zeigt, dass die Monozytenzellpopulationen in Schweinen nach einer Impfung mit PAV-wt schnell zunahmen, aber durch Impfung mit dem rekombinanten PAV-G-CSF supprimiert wurden. Dieser Effekt war auf die Expression von G-CSF durch die Rekombinante zurückzuführen. Eine statistische Analyse dieser Ergebnisse ist tabellarisch in Tabelle 4 aufgeführt. Die Analyse zeigt, dass es von 32 bis 96 h nach der Impfung einen signifikanten Unterschied zwischen PAV-wt und PAV-G-CSF gab. 13 zeigt, dass es Verschiebungen in den Lymphozytenzellpopulationszahlen nach einer Impfung mit dem rekombinanten PAV-G-CSF gab. Ungeimpfte Kontrollen zeigen stabile Lymphozytenzellzahlen über die Dauer des Experiments, wohingegen Schweine, die mit PAV-wt geimpft worden sind, eine signifikante Zunahme der Lymphozytenzellpopulation als Reaktion auf eine Infektion zeigen. Mit dem rekombinanten PAV-G-CSF geimpfte Schweine zeigen eine Abnahme der Lymphozytenzellpopulation. Eine statistische Analyse dieser Ergebnisse ist tabellarisch in Tabelle 5 aufgeführt. Die Analyse zeigt, dass es zwischen 8 und 96 h nach der Impfung einen signifikanten Unterschied zwischen PAV-wt und dem rekombinanten PAV-G-CSF gab. Die unterschiedlichen Reaktionen bei der Lymphozytenzellproliferation nach einer Impfung mit rekombinantem PAV-G-CSF und PAV-wt waren auf die Expression von G-CSF durch die Rekombinante zurückzuführen. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Impfung mit rekombinantem PAV-G-CSF eine Verschiebung bei Subpopulationen von an der Immunität beteiligten Zellen erzeugt. Tabelle 4. Ergebnisse von t-Tests zwischen den mittleren Monozytenzellpopulationen nach einer Impfung von Schweinen mit entweder rekombinantem PAV-G-CSF oder Wildtyp-PAV (PAV wt) oder von ungeimpften Kontrollen.
    Figure 00250001
    • a: Null-Hypothese; es gibt keinen Unterschied zwischen den mittleren Monozytenzellzahlen.
    • b: p > 0,1, unzureichend, um die Null-Hypothesen beim 90%-Vertrauensniveau abzulehnen; Schlussfolgerung, dass es keinen Un terschied zwischen den mittleren Monozytenzellkonzentrationen gibt.
    • c: p < 0,05, Null-Hypothese beim 95%-Vertrauensniveau abgelehnt; Schlussfolgerung, dass es einen Unterschied zwischen den mittleren Monozytenzellkonzentrationen gibt.
    • d: 4 Schweinen in jeder Gruppe wurde in Zeitabständen von 8 h Blut abgenommen.
    Tabelle 5. Ergebnisse von t-Tests zwischen den mittleren Lymphozytenzellpopulationen nach einer Impfung von Schweinen mit entweder rekombinantem PAV-G-CSF oder Wildtyp-PAV (PAV wt) oder von ungeimpften Kontrollen.
    Figure 00260001
    • a: Null-Hypothese; es gibt keinen Unterschied zwischen den mittleren Lymphozytenzellzahlen.
    • b: p > 0,05, unzureichend, um die Null-Hypothesen beim 95%-Vertrauensniveau abzulehnen; Schlussfolgerung, dass es keinen Unterschied zwischen den mittleren Lymphozytenzellkonzentrationen gibt.
    • c: p < 0,05, Null-Hypothese beim 95%-Vertrauensniveau abgelehnt; Schlussfolgerung, dass es einen Unterschied zwischen den mittleren Lymphozytenzellkonzentrationen gibt.
    • d: 4 Schweinen in jeder Gruppe wurde in Zeitabständen von 8 h Blut abgenommen.
  • 14 repräsentiert graphisch die Veränderungen bei der Proliferation von T-Zellen von jeder Gruppe nach einer Stimulation mit Concanavalin A (Con A). Diese Ergebnisse bestätigen, dass es eine signifikante Proliferation von T-Zellen nach einer Impfung mit PAV-wt am Tag 2 nach der Impfung gab, wohingegen eine Impfung mit dem rekombinanten PAV-G-CSF zu einer Suppression der T-Zellproliferation am Tag 3 führte.
  • Die Ergebnisse einer Impfung mit einem rekombinanten PAV, welches G-CSF aus dem Schwein exprimiert, zeigt, das G-CSF eine signifikante Wirkung auf die an Immunantworten beteiligten Zellen hat.
  • Es versteht sich, dass, obwohl dieses Dokument die Grenzen dieser Erfindung aufzeigt, alle Ausführungsformen, die in deren Umfang fallen, beispielsweise in Hinblick auf heterologe Gene, Insertionsstellen, Arten von Promotor und Serotyp, nicht notwendigerweise spezifisch exemplifiziert worden sind, obwohl beabsichtigt ist, dass sie unter den Schutzumfang, den diese Erfindung gewährt, fallen sollen.
  • 2
  • Gesamte Sequenz der PAV-Major late-Promotor-Kassette einschließlich der hinzugefügten Nukleotide 5' (strangaufwärts) des USF.
    Nukleotidbasenzahl: 76 A 143 C 187 G 96 T Gesamt 502 bp
    Figure 00270001
  • Der „Upstream Stimulatory Factor" (USF) und das TATA-Motiv sind fettgedruckt. Die vollständige Leadersequenz ist kursiv gedruckt, wobei die Cap-Stelle und die Spleißstellen zwischen den individuellen Leadersequenzen durch doppelte Unterstreichung bzw. einfache Unterstreichung angegeben werden.
  • 3
  • Individuelle Sequenzen der Promotor-Kassetten-Komponenten: I. Die in der langen Kassette enthaltene 5' (strangaufwärts gelegene) Sequenz.
    Figure 00280001
    II. Sequenz, welche den USF, das TATA-Motiv und die Sequenz zu der Cap-Stelle umfasst.
    Figure 00280002
    III. Erste Leadersequenz.
    Figure 00280003
    IV. Zweite Leadersequenz.
    Figure 00280004
    V. Dritte Leadersequenz.
    Figure 00280005
  • 4
  • Sequenz des rechten Endes des PAV-Genoms, wobei dieser Bereich eine vorgeschlagene Stelle für eine Insertion von Expressionskassetten ist.
    Nukleotidbasenzahl 183 A 255 C 306 G 204 T Gesamt 948 Basen
    Figure 00290001
  • Die invertierte Sequenzwiederholung (ITR) ist fettgedruckt gezeigt. Enzymstellen von Interesse sind unterstrichen mit dem darunter angegebenen Namen des Enzyms. Es ist auch die mutmaßliche TATA-Sequenz für die E4-Region gezeigt.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Figure 00320001

Claims (15)

  1. Rekombinanter Vektor, der ein rekombinantes Schweine-Adenovirus des Serotyps 3 (PAV3) umfasst, der eine heterologe Nukleotidsequenz stabil beinhaltet und in der Lage ist, diese zu exprimieren, wobei die heterologe Nukleotidsequenz in eine nicht-essentielle Region einer Stelle bei den Kartierungseinheiten 97–99,5 von PAV3 eingefügt ist.
  2. Vektor nach Anspruch 1, wobei das rekombinante Schweine-Adenovirus ein lebendes Schweine-Adenovirus umfasst, welches Virion-Strukturproteine aufweist, welche gegenüber jenen in einem nativen Schweine-Adenovirus, von welchem das rekombinante Schweine-Adenovirus abgeleitet ist, unverändert sind.
  3. Vektor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die heterologe Nukleotidsequenz ein antigenes Polypeptid und/oder ein die Immunantwort verstärkendes Molekül kodiert.
  4. Vektor nach Anspruch 3, wobei das antigene Polypeptid eine oder mehrere antigene Determinanten von infektiösen Agenzien, die bei Schweinen Darmerkrankungen hervorrufen, von infektiösen Agenzien, die bei Schweinen Atemwegserkrankungen hervorrufen, von Pseudorabiesvirus (Aujeszkysche Krankheit-Virus), von Glycoprotein D des Pseudorabiesvirus, von dem Schweine-spezifischen respiratorisches und reproduktives Syndrom-Virus (PRRSV; „porcine respiratory and reproductive syndrome virus"), von Hog Cholera-Virus (Schweinepestvirus), von Schweine-Parvovirus, von Schweine-Coronavirus, von Schweine-Rotavirus, von Schweine-Parainfluenzavirus oder von Mycoplasma hyopneumonia umfasst.
  5. Vektor nach Anspruch 3, wobei das die Immunantwort verstärkende Molekül FLT-3-Ligand; Interleukin 3 (IL-3); Interleukin 4 (IL-4) vom Schwein; gamma-Interferon (γIFN); Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) vom Schwein; oder Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF) vom Schwein ist.
  6. Vektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die heterologe Nukleotidsequenz mit dem Major late-Promotor und dreiteiligen (tripartiten) Leaderelementen assoziiert ist.
  7. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Schweine-Adenovirus-Vektors zur Verwendung als ein Impfstoff, umfassend a. Erhalten einer Schweine-Adenovirus-Serotyp 3-Sequenz; und b. Inserieren von wenigstens einer operativ mit einer effektiven Promotorsequenz verknüpften heterologen Nukleotidsequenz in die Sequenz an einer nicht-essentiellen Region einer Stelle bei den Kartierungseinheiten 97–99,5 von PAV3.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei vor der Insertion der heterologen Nukleotidsequenz eine Restriktionsenzymstelle in die Stelle inseriert wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, modifiziert durch die Merkmale eines jeglichen der Ansprüche 1 bis 6.
  10. Rekombinanter Impfstoff zum Erzeugen und/oder Optimieren von Antikörpern oder zellvermittelter Immunität, um einen Schutz gegen eine Infektion durch einen infektiösen Organismus in Schweinen bereitzustellen oder zu verstärken, wobei der Impfstoff wenigstens einen rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und einen geeigneten Träger und/oder Hilfsstoffe einschließt.
  11. Rekombinanter Impfstoff nach Anspruch 10, wobei die Träger und/oder Hilfsstoffe so ausgewählt werden, dass der Impfstoff in Form eines Aerosol-Sprays, einer enterischen (dünndarmlöslichen) beschichteten Dosierungsform oder eines Inokulums verabreichbar ist.
  12. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Impfstoffs nach Anspruch 10 oder 11, welches umfasst, wenigstens einen rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 mit geeigneten Trägern und/oder Hilfsstoffen zu vermischen.
  13. Verwendung eines rekombinanten Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung eines Impfstoffs für die Impfung von Schweinen gegen Erkrankung.
  14. Verwendung nach Anspruch 13, umfassend einen ersten Vektor und einen zweiten Vektor, die unterschiedliche heterologe Nukleotidsequenzen stabil darin eingefügt enthalten.
  15. Rekombinanter Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für eine Verwendung bei der Impfung von Schweinen gegen Erkrankung.
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