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CN113185615A - 靶向bcma的嵌合抗原受体及其使用方法 - Google Patents

靶向bcma的嵌合抗原受体及其使用方法 Download PDF

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CN113185615A
CN113185615A CN202110529747.6A CN202110529747A CN113185615A CN 113185615 A CN113185615 A CN 113185615A CN 202110529747 A CN202110529747 A CN 202110529747A CN 113185615 A CN113185615 A CN 113185615A
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cdr1
cdr3
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CN202110529747.6A
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庄秋传
王平艳
王林
杨蕾
郝佳瑛
赵丹
何娴
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Legend Biotech Ireland Ltd
Original Assignee
Legend Biotech Ireland Ltd
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Abstract

本申请涉及靶向BCMA的嵌合抗原受体及其使用方法。本申请提供靶向BCMA的单域抗体，和包含一个或多个抗BCMA单域抗体的嵌合抗原受体(诸如单价CAR，和包括双表位CAR的多价CAR)。还提供了包含所述嵌合抗原受体的经工程化的免疫效应细胞(诸如T细胞)。还提供了治疗癌症的药物组合物、试剂盒和方法。

Description

靶向BCMA的嵌合抗原受体及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请为2017年8月10日提交的、发明名称为“靶向BCMA的嵌合抗原受体及其使用方法”、申请号为201780031233.X的中国发明专利申请的分案申请。
本申请要求2016年8月10日提交的国际专利申请No.PCT/CN2016/094408的优先权权益，该专利申请的内容以引用的方式整体并入本文。
在ASCII文本文件中提交序列表
以下在ASCII文本文件中提交的内容以引用的方式整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：761422000640SEQLISTING.txt，记录日期：2017年8月10日，大小：520KB)。
发明领域
本发明涉及靶向BCMA的单域抗体、嵌合抗原受体和经工程化的免疫效应细胞及其使用方法。
发明背景
随着肿瘤免疫疗法和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)免疫疗法目前是最有前途的肿瘤免疫疗法方法之一。一般而言，嵌合抗原受体(CAR)包含胞外抗原结合域、跨膜域和胞内信号传导域。胞外抗原结合域可包含靶向所鉴定的肿瘤抗原的单链可变片段(scFv)。可以使用基因转染技术在T细胞的表面上表达CAR。在结合至靶标肿瘤抗原后，CAR可活化T细胞，用以以抗原依赖性方式发起特异性抗肿瘤响应，而不受对靶标肿瘤抗原具有特异性的主要组织相容性复合体(MHC)的可用性的限制。
单域抗体(sdAb)由于具有单个单体抗体可变域而不同于传统的4链抗体。例如，骆驼科动物和鲨鱼产生天然缺乏轻链的sdAb，其被称为仅重链抗体(HcAb)。骆驼科动物仅重链抗体的每个臂中的抗原结合片段具有单个重链可变域(VHH)，所述重链可变域可在无需轻链的帮助下，对抗原具有高亲和力。骆驼科动物VHH被称为最小的功能性抗原结合片段，分子量为大约15kD。
多发性骨髓瘤(MM)是一种无法治愈的侵袭性血浆恶性肿瘤，其被归类为B细胞瘤，并且以不受控制的方法在骨髓中增殖，从而干扰血细胞的正常代谢产生并导致令人痛苦的骨病变(Garfall,A.L.等人,Discovery Med.2014,17,37)。多发性骨髓瘤在临床上可出现高钙血症、肾功能不全、贫血、骨病变、细菌感染、高粘血症和淀粉样变性(RobertZ.Orlowski,Cancer Cell.2013,24(3))。根据调查和统计，每年将有近86,000名患者被诊断为骨髓瘤，而每年有约63,000名患者死于疾病相关的并发症(Becker,2011)。由于人口老龄化，预计骨髓瘤的病例数将逐年增加。正如很多癌症一样，多发性骨髓瘤的起因仍不清楚，且未治愈。多发性骨髓瘤的一些治疗类似于其他癌症的疗法，诸如化学疗法或放射疗法、干细胞移植或骨髓移植、靶向疗法或生物疗法(George,2014)。已证实，基于抗体的细胞免疫疗法对血液恶性肿瘤(特别是B细胞非霍奇金氏(Non-Hodgkin)淋巴瘤)患者具有显著的临床有益效果。虽然目前的多发性骨髓瘤疗法通常会产生缓解，但是几乎所有患者最终都会复发。需要用于治疗多发性骨髓瘤的有效免疫治疗剂。
本发明中公开的LCAR-B38M是靶向二价BCMA的CAR-T，所述CAR-T在临床试验中在治疗难治性或复发性多发性骨髓瘤患者的安全性和功效方面已显示出临床优点。在早期临床试验中，35名患者中的33名(94％)在接受LCAR-B38M CAR-T细胞后具有多发性骨髓瘤的临床缓解。大多数患者只有轻微的副作用。主要发明人在2017年ASCO年会(2017ASCOAnnual Meeting)(文摘LBA3001)和新闻发布会中介绍了此研究，该新闻发布会吸引了广泛的媒体报道(http://www.ascopost.com/News/55713)。
总体而言，客观响应率为100％，并且33名患者(94％)在接受CAR T细胞的2个月内具有明显的骨髓瘤临床缓解(完全响应、非常好的部分响应或部分响应)。在跟踪该组超过4个月的时间后，在19名患者中，在功效方面，14名已达到严格完全响应标准，1名患者已达到部分响应，并且4名患者已实现非常好的部分缓解标准。
由于LCAR-B38M临床试验获得的出色功效和安全性特征显著优于ASCO中同时报道的少数其他BCMA CAR-T试验，因此这些工作在免疫疗法领域已被广泛认为是“革命性的突破”。值得注意的是，所有这些BCMA CAR设计是其中BCMA抗原结合域由单价ScFv抗体组成的常规CAR。
本文涉及的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容据此以引用的方式整体并入本文。
发明内容
本申请提供抗BCMA单域抗体(sdAb)、包含一个或多个抗BCMA sdAb(诸如VHH片段)的嵌合抗原受体(CAR)、经工程化的免疫效应细胞及其用于癌症免疫疗法的使用方法。
本申请的一个方面提供包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的CDR区的抗BCMAsdAb。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb包含以下中的任一者：(1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR3；(4)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR3；(5)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:43的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR3；(6)包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDR3；(7)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR3；(8)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的CDR3；(9)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3；(10)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的CDR3；(11)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的CDR3；(12)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR3；(13)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:89的氨基酸序列的CDR3；(14)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR3；(15)包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的CDR3；(16)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3；(17)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的CDR3；(18)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR3；(19)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR3；(20)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR3；(21)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR3；(22)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR3；(23)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的CDR3；(24)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:100的氨基酸序列的CDR3；(25)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:63的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR3；(26)包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR3；(27)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR3；(28)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR3；(29)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR3；(30)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR3；(31)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR3；(32)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR3；(33)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR3；(34)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR3；(35)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的CDR3；(36)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR3；(37)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3；或(38)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb包含VHH域，所述VHH域包含选自由SEQ ID NO:115-152组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了包含上述抗BCMA sdAb中的任一者的抗BCMA仅重链抗体(HCAB)或抗原结合蛋白。还提供了上述抗BCMA sdAb中的任一者特异性结合的BCMA表位，和与上述抗BCMA sdAb中的任一者竞争的抗BCMA抗体(诸如抗BCMA sdAb)。
在根据上述抗BCMA sdAb中的任一者的一些实施方案中，抗BCMA sdAb是骆驼科动物抗体。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb是人源化的。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb是VHH片段。
本申请的一个方面提供包含多肽的BCMA嵌合抗原受体，所述多肽包含：(a)包含抗BCMA sdAb(诸如上述抗BCMA sdAb中的任一者)的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域。在一些实施方案中，CAR是单特异性的。在一些实施方案中，CAR是单价的。在一些实施方案中，CAR是多价的(诸如二价的或三价的)。在一些实施方案中，CAR是多特异性的(诸如双特异性的)。在一些实施方案中，胞外抗原结合域包含至少两个抗BCMA sdAb(诸如上述抗BCMA sdAb中的任何一者或多者)。
本申请的一个方面提供包含多肽的多价嵌合抗原受体(CAR)，所述多肽包含：(a)包含第一BCMA结合部分和第二BCMA结合部分的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域。在一些实施方案中，第一BCMA结合部分和第二BCMA结合部分中的一者或多者是抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，第一BCMA结合部分是第一抗BCMA sdAb，并且第二BCMA结合部分是第二抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，第一BCMA结合部分是抗BCMA sdAb，并且第二BCMA结合部分来源于人抗体。在一些实施方案中，第一BCMA结合部分是抗BCMA sdAb，并且第二BCMA结合部分是BCMA的多肽配体。在一些实施方案中，第一BCMA结合部分和第二BCMA结合部分特异性结合至BCMA上的相同的表位。在一些实施方案中，第一BCMA结合部分和第二BCMA结合部分特异性结合至BCMA上的不同的表位。在一些实施方案中，第一BCMA结合部分和/或第二BCMA结合部分特异性结合至来源于选自SEQ ID NO:388-394的氨基酸序列的BCMA上的表位。在一些实施方案中，第一BCMA结合部分特异性结合至来源于SEQ IDNO:389和/或390的表位。在一些实施方案中，第二BCMA结合部分特异性结合至来源于SEQID NO:391和/或392的表位。
本申请的一个方面提供包含多肽的多价(诸如二价或三价)嵌合抗原受体，所述多肽包含：(a)包含第一抗BCMA sdAb(诸如上述抗BCMA sdAb中的任一者)和第二抗BCMA sdAb(诸如上述抗BCMA sdAb中的任一者)的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域。在一些实施方案中，第一抗BCMA sdAb和第二抗BCMA sdAb特异性结合至BCMA上的相同的表位。在一些实施方案中，第一抗BCMA sdAb和第二抗BCMA sdAb特异性结合至BCMA上的不同的表位。在一些实施方案中，第一抗BCMA sdAb和/或第二抗BCMA sdAb特异性结合至来源于选自SEQ ID NO:388-394的氨基酸序列的BCMA上的表位。在一些实施方案中，第一抗BCMA sdAb特异性结合至来源于SEQ ID NO:389和/或390的表位。在一些实施方案中，第二抗BCMA sdAb特异性结合至来源于SEQ ID NO:391和/或392的表位。
在根据上文提供的多价CAR中的任一者的一些实施方案中，第一BCMA结合部分(例如，第一抗BCMA sdAb)位于第二BCMA结合部分(例如，第二抗BCMA sdAb)的N-末端。在一些实施方案中，第一BCMA结合部分(例如，第一抗BCMA sdAb)位于第二BCMA结合部分(例如，第二抗BCMA sdAb)的C-末端。在一些实施方案中，第一BCMA结合部分(例如，第一抗BCMAsdAb)和第二BCMA结合部分(例如，第二抗BCMA sdAb)通过肽键直接彼此融合。在一些实施方案中，第一BCMA结合部分(例如，第一抗BCMA sdAb)和第二BCMA结合部分(例如，第二抗BCMA sdAb)通过肽接头彼此融合。在一些实施方案中，肽接头的长度不超过约50个(诸如不超过约35个、25个、20个、15个、10个或5个中的任一者)氨基酸。在一些实施方案中，肽接头包含选自SEQ ID NO:208-215的氨基酸序列。
在根据上述CAR(包括多价CAR)中的任一者的一些实施方案中，跨膜域来源于选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施方案中，跨膜域来源于CD8α或CD28。在一些实施方案中，跨膜域包含SEQ ID NO:193或194的氨基酸序列。
在根据上述CAR(包括多价CAR)中的任一者的一些实施方案中，胞内信号传导域包含免疫效应细胞(诸如T细胞)的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导域来源于CD3ζ。在一些实施方案中，主要胞内信号传导域包含SEQ ID NO:197或198的氨基酸序列。
在根据上述CAR(包括多价CAR)中的任一者的一些实施方案中，胞内信号传导域包含共刺激信号传导域。在一些实施方案中，共刺激信号传导域来源于选自由CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合组成的组的共刺激分子。在一些实施方案中，共刺激信号传导域包含CD28的胞质域和/或CD137的胞质域。在一些实施方案中，共刺激信号传导域包含SEQ ID NO:195和/或SEQ IDNO:196的氨基酸序列。
在根据上述CAR(包括多价CAR)中的任一者的一些实施方案中，CAR还包含位于胞外抗原结合域的C-末端和跨膜域的N-末端之间的铰链域。在一些实施方案中，铰链域来源于CD8α。在一些实施方案中，铰链域包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列。
在根据上述CAR(包括多价CAR)中的任一者的一些实施方案中，CAR还包含位于多肽的N-末端的信号肽。在一些实施方案中，信号肽来源于选自由CD8α、GM-CSF受体α和IgG1重链组成的组的分子。在一些实施方案中，信号肽来源于CD8α。在一些实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列。
本申请的一个方面提供表4和表5中列出的CAR。在一些实施方案中，CAR包含选自由SEQ ID NO:216-256和298-335组成的组的氨基酸序列。
本申请的一个方面提供包含选自由SEQ ID NO:115-152、216-256和298-335组成的组的氨基酸序列的多肽。
本申请的一个方面提供包含编码上述抗BCMA sdAb或CAR(包括多价CAR)中的任一者的核酸序列的经分离的核酸。在一些实施方案中，核酸序列选自由以下组成的组：SEQ IDNO:153-190、257-297和336-373。在一些实施方案中，经分离的核酸还包含编码第一CAR的第一核酸序列，其中编码第二CAR的第二核酸序列通过编码自切割肽(诸如T2A、P2A或F2A肽)的第三核酸序列可操作地连接至第一核酸序列。其中第三核酸序列为SEQ ID NO:385。在一些实施方案中，经分离的核酸是DNA分子。在一些实施方案中，经分离的核酸是RNA分子。
本申请的一个方面提供包含上述经分离的核酸中的任一者的载体。在一些实施方案中，载体是表达载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是非病毒载体。
本申请的一个方面提供经工程化的免疫效应细胞，其包含上文提供的CAR(包括多价CAR)中的任一者，或上述经分离的核酸中的任一者，或上述载体中的任一者的。在一些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞、NK细胞、外周血单核细胞(PBMC)、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。
本申请的一个方面提供包含上述经工程化的免疫效应细胞中的任一者和药学上可接受的载剂的药物组合物。还提供了治疗个体的癌症的方法，包括将有效量的上述药物组合物中的任一者施用于个体。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞是自体的。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞是同种异体的。在一些实施方案中，癌症是液体癌(liquid cancer)。在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。在一些实施方案中，癌症是实体癌，诸如胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，癌症是难治性或复发性多发性骨髓瘤。
本申请的一个方面提供包含上述抗BCMA sdAb中的任一者和药学上可接受的载剂的药物组合物。在一些实施方案中，提供了治疗个体的疾病(诸如癌症)的方法，包括将有效量的药物组合物施用于个体。
还提供了包括上述抗BCMA sdAb、CAR(包括多价CAR)、经工程化的免疫效应细胞、经分离的核酸或载体中的任一者的使用方法、试剂盒和制品。
附图说明
图1A至图1B示出了表达包含针对RPMI8226.Luc细胞(图1A)或U87MG.Luc细胞(图1B)的多种抗BCMA sdAb的示例性单特异性CAR的T细胞的体外细胞毒性测定的结果。
图2A至图2C示出了表达包含针对RPMI8226.Luc细胞(图2A)、K562.BCMA.Luc细胞(图2B)或K562.CD19.Luc细胞(图2C)的多种抗BCMA sdAb的示例性单特异性CAR的T细胞的体外细胞毒性测定的结果。
图3示出了表达包含针对K562.BCMA.Luc细胞的多种抗BCMA sdAb的示例性单特异性CAR的T细胞的体外IFNγ释放测定的结果。
图4A至图4C示出了表达针对RPMI8226.Luc细胞(图4A至图4B)或U87MG.Luc细胞(图4C)的示例性多价BCMA CAR的T细胞的体外细胞毒性测定的结果。
图5A至图5E示出了表达针对RPMI8226.Luc细胞(图5A)、K562.CD19.Luc细胞(图5B)、A549.Luc细胞(图5C)、U87MG.Luc细胞(图5D)或Raji.Luc细胞(图5E)的示例性二价BCMA CAR的T细胞的体外细胞毒性测定的结果。
图5F示出了表达针对K562.BCMA.Luc细胞和K562.CD38.Luc细胞的示例性二价BCMA CAR的T细胞的体外细胞毒性测定的结果。
图6A示出了在两种不同的效应细胞与靶标细胞比例下，表达针对K562.BCMA.Luc细胞的示例性二价BCMA CAR的T细胞的体外IFNγ释放测定的结果。
图6B示出了表达针对RPMI8226.Luc、A549.Luc、K562.CD38.Luc和Raji.Luc细胞的示例性二价BCMA CAR的T细胞的体外IFNγ释放测定的结果。
图7A至图7C示出了三种示例性VHH片段与K562.BCMA.Luc细胞和K562.CD38.Luc细胞(阴性对照)的结合。
图8A示出了BCMA的胞外域的晶体结构。图8B示出了BCMA表位肽。
图9A至图9B示出了VHH1和VHH2的表位作图测定的结果。
图10示出了使用CHO-BCMA细胞的竞争性结合测定的结果。
图11示出了表达针对RPMI8226.Luc细胞的LCAR-B38M的供体来源的T细胞的体外细胞毒性。
图12A示出了从针对RPMI8226.Luc细胞的选择供体制备的LCAR-B38M CAR-T细胞的体外细胞毒性。图12B至图12E示出了肿瘤异种移植小鼠模型中LCAR-B38M CAR-T细胞的体内抗肿瘤活性。图12B示出了LCAR-B38M CAR-T治疗的小鼠和未转导的T细胞(UnT)治疗的小鼠中的生物发光成像数据。图12C示出了CAR-T组和UnT组中小鼠的研究设计和生物发光图像。图12D示出了UnT治疗的小鼠的肝的图像。图12E示出了验证UnT治疗的小鼠的肝中的肿瘤的离体荧光素酶测定。
图13A至图13F示出了用LCAR-B38M CAR-T细胞治疗的两只猴的临床参数。在研究中监测的临床参数包括体温(图13A)、体重(图13B)、全血细胞计数(CBC，图13C和图13D)，以及血清化学和细胞因子水平(图13E和图13F)。
图14A至C示出了关于分别从相同的三名多发性骨髓瘤患者制备的LCAR-B38MCAR-T细胞和LCAR-B27S CAR-T细胞的体外细胞毒性测定。图14A示出了从多发性骨髓瘤患者A制备的LCAR-B38M CAR-T细胞和LCAR-B27S CAR-T细胞的体外细胞毒性结果。图14B示出了从多发性骨髓瘤患者B制备的LCAR-B38M CAR-T细胞和LCAR-B27S CAR-T细胞的体外细胞毒性结果。图14C示出了从多发性骨髓瘤患者C制备的LCAR-B38M CAR-T细胞和LCAR-B27SCAR-T细胞的体外细胞毒性结果。
图15A比较了基于VHH的CAR和常规的基于scFv的CAR的结构。左边的示意性结构示出了具有包含VHH域的胞外抗原结合域的示例性单特异性单价CAR。右边的示意性结构示出了具有包含scFv域的胞外抗原结合域的示例性单特异性单价CAR。
图15B比较了具有两个抗原结合位点的基于VHH的CAR和具有两个抗原结合位点的常规的基于scFv的CAR的结构。左边的示意性结构是具有包含两个VHH域的胞外抗原结合域的示例性CAR。两个VHH域可以是相同的或不同的。右边的示意性结构示出了具有包含两个scFv域的胞外抗原结合域的示例性CAR。两个scFv域可以是相同的或不同的。
图15C示出了示例性二价和双特异性基于VHH的CAR的示意性结构。左上图的示意性结构示出了具有包含两个相同的VHH域(每个VHH域特异性结合至抗原A的表位1)的胞外抗原结合域的示例性单表位、二价CAR。右上图的示意性结构示出了具有包含特异性结合至抗原A的表位1的第一VHH域和特异性结合至抗原A的表位2的第二VHH域的胞外抗原结合域的示例性双表位、二价CAR。抗原A的表位1和表位2在结构和/或序列上可以是不同的。左下图的示意性结构示出了具有包含特异性结合抗原A的第一VHH域和特异性结合抗原B的第二VHH域的胞外抗原结合域的示例性双特异性CAR。抗原A和抗原B是不同的抗原。
图15D示出了具有三个或更多个VHH域的示例性基于VHH的CAR的示意性结构。CAR可具有多个直接或通过肽接头彼此融合的VHH域。VHH域可以是相同的或不同的。不同的VHH域可以特异性结合至相同的抗原或不同的抗原上的不同表位。
图15E示出了共表达两个不同的基于VHH的CAR的示例性经工程化的免疫效应细胞。左图的示例性经工程化的免疫效应细胞共表达两个不同的单特异性、单价CAR。中图的示例性经工程化的免疫效应细胞共表达单特异性、单价CAR和双特异性或二价CAR。右图的示例性经工程化的免疫效应细胞共表达两个不同的双特异性或二价CAR。CAR可识别不同的抗原。
发明详述
本申请提供包含胞外抗原结合域的抗BCMA单域抗体(sdAb)和嵌合抗原受体(CAR)，所述胞外抗原结合域包含一个或多个BCMA结合部分(诸如抗BCMA sdAb)。还提供了包含特异性结合至单个抗原的至少两个结合部分(诸如sdAb)的多价CAR。在一些实施方案中，本申请提供包含至少两个抗BCMA sdAb的多价(诸如二价或三价)CAR。在一些实施方案中，至少两个抗BCMA sdAb是特异性结合至BCMA上的不同的表位的不同的抗BCMA sdAb。抗BCMA sdAb、CAR和表达本申请所述的CAR的经工程化的免疫细胞是用于癌症治疗的有用药剂。
值得注意的是，本申请已证实包含靶向不同的BCMA表位的两个抗BCMA sdAb的二价双表位CAR(例如，LCAR-B38M)在治疗人类患者的多发性骨髓瘤中的优异功效。在I/II期临床试验的期中分析中，100％具有复发性或难治性多发性骨髓瘤的患者对LCAR-B38MCAR-T治疗产生响应。94％的患者在接受CAR-T治疗的两个月内具有明显的骨髓瘤的临床缓解。达到严格完全响应(sCR)标准的患者在接受CAR-T治疗超过一年后仍然没有微量残留病。另外，患者能够非常好地耐受LCAR-B38M CAR-T治疗，因为大多数患者仅经历轻度和可控制的基于CAR-T细胞的疗法的常见副作用，即细胞因子释放综合征。无患者经历神经副作用。相比之下，包含单个抗BCMA sdAb的单价CAR的试验性临床研究在治疗的患者中显示出较低的客观响应率和完全缓解率，以及较高的复发率。在本申请之前，临床研究中的所有BCMA CAR在胞外抗原结合域中仅具有一个BCMA结合部分。本申请的多价BCMA CAR的改善的临床功效和安全性是出乎意料的。
因此，本申请的一个方面提供包含多肽的多价CAR，所述多肽包含：(a)包含特异性结合至BCMA的多个单域抗体(sdAb)的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域。
在另一个方面，提供了包含多肽的多价CAR，所述多肽包含：(a)胞外抗原结合域，其包含特异性结合至BCMA的第一表位的第一BCMA结合部分(诸如第一抗BCMA sdAb)和特异性结合至BCMA的第二表位的第二BCMA结合部分(诸如第二抗BCMA sdAb)；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一表位不同于第二表位。
还提供了包含本文所述的抗BCMA sdAb中的任何一者或多者的新型抗BCMA sdAb和CAR。
本文还描述了包含CAR的经工程化的免疫效应细胞(诸如T细胞)、药物组合物、试剂盒、制品以及使用经工程化的免疫效应细胞或sdAb来治疗癌症的方法。
I.定义
术语“抗体”包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长4链抗体或全长仅重链抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双体和单链分子)以及抗体片段(例如，Fab、F(ab')2和Fv)。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中可与抗体互换使用。本文设想的抗体包括单域抗体，诸如仅重链抗体。
基本4链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异源四聚体糖蛋白。IgM抗体由基本异源四聚体单元中的5个以及称为J链的另外的多肽组成，并且含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包含基本4链单元中的2个至5个，这些单元可以与J链一起聚合形成多价组装体。就IgG而言，4链单元通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键连接至H链，而两条H链根据H链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。每条H链和L链还具有规律间隔的链内二硫桥。每条H链在N-末端具有可变域(VH)，然后是用于每个α和γ链的三个恒定域(CH)和用于μ和ε同种型的四个CH域。每条L链在N-末端具有可变域(VL)，然后是另一个末端的恒定域。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定域(CH1)对齐。据信特定的氨基酸残基会在轻链和重链可变域之间形成界面。VH和VL配对在一起形成单个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见例如Basic and Clinical Immunology,第8版,Daniel P.Sties,Abba I.Terr和Tristram G.Parsolw(编),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994,第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的L链可根据其恒定域的氨基酸序列归为两种明显不同的类型(称为κ和λ)中的一种。可根据重链(CH)的恒定域的氨基酸序列，将免疫球蛋白归为不同的类别或同种型。免疫球蛋白有五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们分别具有称为α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和功能的相对较小差异，可将γ和α类进一步分为子类，例如人表达以下子类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“仅重链抗体”或“HCAb”是指包含重链，但缺乏4链抗体中通常存在的轻链的功能抗体。已知骆驼科动物(诸如骆驼、美洲驼或羊驼)产生HCAb。
术语“单域抗体”或“sdAb”是指具有三个互补决定区(CDR)的单个抗原结合多肽。sdAb单独能够结合至抗原，而不与对应的含CDR多肽配对。在一些情况下，单域抗体从骆驼科动物HCAb经工程化的，它们的重链可变域在本文中称为“VHH”。一些VHH也可以称为纳米体。骆驼科动物sdAb是最小的已知抗原结合抗体片段之一(参见例如Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-8(1993)；Greenberg等人,Nature 374:168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人,Nanomedicine(Lond),8:1013-26(2013))。基本VHH从N-末端至C-末端具有以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分别指框架区1至4，其中CDR1至CDR3是指互补决定区1至3。
“经分离的”抗体是已经从其产生环境的组分(例如，天然的或重组的)鉴定、分离和/或回收的抗体。优选地，经分离的多肽与其产生环境的所有其他组分无关。其产生环境的污染组分，诸如从重组转染细胞产生的污染组分，是通常会干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白溶质。在优选的实施方案中，多肽被纯化至：(1)如通过例如Lowry方法所测定，大于95重量％，并且在一些实施方案中，大于99重量％的抗体；(1)达到足以通过使用旋转杯测序仪获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)使用考马斯蓝或优选地银染色在非还原或还原条件下通过SDS-PAGE获得的同质性。因为抗体自然环境的至少一种组分将不存在，所以经分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，通常，将通过至少一个纯化步骤制备经分离的多肽或抗体。
抗体的“可变区”或“可变域”是指抗体的重链或轻链的氨基端域。重链和轻链的可变域可分别称为“VH”和“VL”。这些域通常是抗体中变化最大的部分(相对于其他相同类别的抗体)，并且含有抗原结合位点。骆驼科动物物种的仅重链抗体具有称为“VHH”的单个重链可变区。因此，VHH是特殊类型的VH。
术语“可变”是指下述事实，即在抗体间可变域的某些区段在序列上广泛不同。V域介导抗原结合，并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性不会均匀分布在整个可变域范围内。相反，在轻链和重链可变域中，其集中在三个称为高变区(HVR)的区段中。可变域的更加高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采用β-折叠构型，由三个HVR连接，这三个HVR形成连接β-折叠结构的环，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的HVR通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且与另一条链的HVR一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人,Sequencesof Immunological Interest,第五版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应子功能，诸如抗体参与到抗体依赖性细胞毒性中。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成该群体的各单独抗体，除了可以少量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)之外，其他方面是相同的。单克隆抗体具有高度特异性(针对单个抗原位点)。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们通过杂交瘤培养或重组合成，未被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群获得的抗体的特性，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生该抗体。例如，根据本申请使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括例如杂交瘤方法(例如，Kohler和Milstein.,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995)，Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,第2版,1988)；Hammerling等人,载于:Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA方法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))以及用于在具有人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的部分或全部的动物中产生人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
术语“裸抗体”是指未缀合至细胞毒性部分或放射性标记的抗体。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”可互换使用，是指与抗体片段相比，基本上完整形式的抗体。具体而言，全长4链抗体包括具有包括Fc区的重链和轻链的抗体。全长仅重链抗体包括重链(诸如VHH)和Fc区。恒定域可为天然序列恒定域(例如，人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可具有一种或多种效应子功能。
“抗体片段”包含完整抗体的部分，优选地完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体(参见美国专利No.5,641,870，实施例2；Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；单域抗体(诸如VHH)，以及从抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的称为“Fab”片段的抗原结合片段和残留的“Fc”片段(反映易于结晶的能力的名称)。Fab片段由整个L链以及H链的可变区域(VH)和一条重链的第一恒定域(CH1)组成。每个Fab片段就抗原结合而言是单价的，即具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生单个大F(ab')2片段，其大致对应于具有不同的抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段，并且仍能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在CH1域的羧基末端具有几个另外的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。本文中将其中恒定域的一个或多个半胱氨酸残基具有游离的硫醇基的Fab'称为Fab'-SH。F(ab')2抗体片段最初以Fab'片段对的形式产生，所述Fab'片段对在Fab'片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联物也是已知的。
Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区的序列确定，所述Fc区也由某些类型细胞上存在的Fc受体(FcR)识别。
“Fv”是包含完全抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价缔合的一个重链和一个轻链可变区域的二聚体组成。由这两个域的折叠产生六个高变环(各自来自H和L链的3个环)，这六个高变环贡献氨基酸残基用于抗原结合，并将抗原结合特异性赋予抗体。然而，即使单个可变域(或仅包含对抗原具有特异性的三个HVR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力小于完整的结合位点。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接至单个多肽链的VH和VL抗体域的抗体片段。优选地，sFv多肽还包含VH和VL域之间的多肽接头，该多肽接头使sFv形成用于抗原结合的所需结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun,载于The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
本文所述的抗体的“功能片段”包含完整抗体的部分，通常包括完整抗体的抗原结合或可变区，或者保留或具有修饰的FcR结合能力的抗体的Fc区。抗体片段的实例包括线性抗体、单链抗体分子以及从抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“双体”是指通过使用VH和VL域之间的短接头(约5-10个残基)构建sFv片段(参见前述段落)而制备的小抗体片段，使得V域的链间而非链内配对得以实现，从而产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双体是两个“交联”sFv片段的异源二聚体，其中两个抗体的VH和VL域存在于不同的多肽链上。双体在例如EP 404,097；WO93/11161；Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)中更详细地描述。
本文的单克隆抗体特别包括这样的“嵌合”抗体(免疫球蛋白)：其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的对应序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与来源于另一个物种或属于另一个抗体类别或子类的抗体以及此类抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物学活性即可(美国专利No.4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。本文关注的嵌合抗体包括
Figure BDA0003066909480000111
抗体，其中抗体的抗原结合区来源于例如使用所关注的抗原免疫猕猴而产生的抗体。如本文所用，“人源化抗体”用作“嵌合抗体”的子集。
非人(例如，骆驼科动物)抗体的“人源化”形式是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体是其中受体的HVR(下文定义)的残基被具有所需特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的HVR的残基替换的人免疫球蛋白(受体抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架(“FR”)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含受体抗体中或供体抗体中不存在的残基。可以进行这些修饰以进一步完善抗体性能，诸如结合亲和力。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变域的基本上全部，其中高变环的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白序列的那些高变环，FR区的全部或基本上全部为人免疫球蛋白序列的那些FR区，但是FR区可包括改善抗体性能(诸如结合亲和力、异构化、免疫原性等)的一个或多个单独FR残基取代。FR中的这些氨基酸取代数通常在H链中不超过6，并且在L链中，不超过3。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常人免疫球蛋白恒定区)的至少一部分。关于更多详情，参见例如Jones等人,Nature321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见例如Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；和美国专利No.6,982,321和7,087,409。
“人抗体”是具有对应于人产生的抗体的氨基酸序列和/或已使用本文公开的制备人抗体的任何技术来制备的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术(包括噬菌体展示文库)来产生。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)；Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)描述的方法也可用于制备人单克隆抗体。还可参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。人抗体可通过将抗原施用于转基因动物来制备，所述转基因动物已被修饰为响应于抗原激发而产生此类抗体，但其内源性基因座已失能，例如免疫化的xenomice(参见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584关于XENOMOUSETM技术的内容)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体还可参见例如Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”，在本文中使用时，是指在序列上是高变的和/或形成结构限定的环的抗体可变域的区域。一般而言，sdAb包含三个HVR(或CDR)：HVR1(或CDR1)、HVR2(或CDR2)和HVR3(或CDR3)。HVR3显示出在三种HVR中最具多样性，并且据信在赋予抗体精细特异性方面发挥了独特的作用。参见例如Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等人,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
术语“互补决定区”或“CDR”用于指Kabat系统定义的高变区。参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)
许多HVR描述正在使用中并且涵盖在本文中。Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性，并且是最常用的(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR和Chothia结构环之间的折衷方案，并且由OxfordMolecular的AbM抗体建模软件使用。“contact”HVR基于可用的复合物晶体结构分析。这些HVR中的每个的残基记录于下表1中。
表1.HVR描述。
Figure BDA0003066909480000121
HVR可包含以下“延伸HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)和VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。可变域残基根据Kabat等人(出处同上)的这些定义中的每个编号。
sdAb(诸如VHH)的氨基酸残基根据Kabat等人(“Sequence of proteins ofimmunological interest”,US Public Health Services,NIH Bethesda,Md.，公开号91)给出的VH域的一般编号来编号，如文章Riechmann和Muyldermans,J.Immunol.Methods,2000年6月23日；240(1-2):185-195中应用于骆驼科动物的VHH域。根据该编号，VHH的FR1包含位置1-30处的氨基酸残基，VHH的CDR1包含位置31-35处的氨基酸残基，VHH的FR2包含位置36-49处的氨基酸，VHH的CDR2包含位置50-65处的氨基酸残基，VHH的FR3包含位置66-94处的氨基酸残基，VHH的CDR3包含位置95-102处的氨基酸残基，VHH的FR4包含位置103-113处的氨基酸残基。在这方面，应该注意的是—如本领域熟知的VH域和VHH域—每个CDR中氨基酸残基的总数可以变化，并且可以不对应于Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即，根据Kabat编号的一个或多个位置在实际序列中可以不被占用，或实际序列可以含有比Kabat编号允许的数量更多的氨基酸残基)。
表述“Kabat中的可变域残基编号”或“Kabat中的氨基酸位置编号”及其变化是指Kabat等人(出处同上)中用于编码抗体的重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用该编号系统，实际线性氨基酸序列可以含有更少或另外的氨基酸，这些氨基酸对应于可变域的FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可包括H2的残基52之后的单个氨基酸插入物(根据Kabat的残基52a)和重链FR残基82之后的插入残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给定抗体而言可以通过在抗体序列同源区与“标准”Kabat编号序列的比对来确定残基的Kabat编号。
除非本文另外说明，否则免疫球蛋白重链中残基的编号是Kabat等人(出处同上)中的EU索引的编号。“Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
“框架”或“FR”残基是除了本文定义的HVR残基之外的那些可变域残基。
“人共有区框架”或“受体人框架”是代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常出现的氨基酸残基的框架。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变域序列的亚组。一般而言，序列的亚组是Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的亚组。实例包括：对于VL，亚组可以是Kabat等人(出处同上)所述的亚组κI、κII、κIII或κIV。另外，对于VH，亚组可以是Kabat等人所述的亚组I、亚组II或亚组III。或者，人共有区框架可来源于上述文献，其中特定残基，诸如当人框架残基根据其与供体框架的同源性，通过供体框架序列与一组多种人框架序列的比对来选择时。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有区框架的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列，或它可含有预先存在的氨基酸序列变化。在一些实施方案中，预先存在的氨基酸变化的数目为10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。
指定位置处，例如Fc区的“氨基酸修饰”是指指定残基的取代或缺失，或邻近指定残基的至少一个氨基酸残基的插入。“邻近”指定残基的插入意指在该指定残基的一个至两个残基内的插入。插入可以在指定残基的N-末端或C-末端。本文的优选氨基酸修饰是取代。
“亲和力成熟”抗体是在一个或多个HVR中具有一个或多个改变，从而与不具有一个或多个这些改变的亲代抗体相比，引起抗体对抗原的亲和力改善的抗体。在一些实施方案中，亲和力成熟抗体对靶标抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。亲和力成熟抗体通过本领域已知的程序产生。例如，Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通过VH域和VL域改组进行的亲和力成熟。HVR和/或框架残基的随机诱变如例如：Barbas等人,Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier等人,Gene 169:147-155(1995)；Yelton等人,J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等人,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；和Hawkins等人,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)所述。
如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”或“对......具有特异性”是指可测定的和可再现的相互作用，诸如靶标和抗原结合蛋白(诸如CAR或sdAb)之间的结合，在存在异质分子群(包括生物分子)的情况下，所述结合是靶标存在的决定性因素。例如，特异性结合靶标(可以是表位)的抗原结合蛋白(诸如CAR或sdAb)是与其他靶标的结合相比，与该靶标的结合具有更大的亲和力、亲合力、更容易和/或具有更长的持续时间的抗原结合蛋白(诸如CAR或sdAb)。在一些实施方案中，如例如通过放射性免疫测定法(RIA)所测定，抗原结合蛋白(诸如CAR或sdAb)与不相关靶标的结合程度比抗原结合蛋白(诸如CAR或sdAb)与靶标的结合小约10％。在一些实施方案中，特异性结合靶标的抗原结合蛋白(诸如CAR或sdAb)具有的解离常数(Kd)≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM或≦0.1nM。在一些实施方案中，抗原结合蛋白(诸如CAR或sdAb)特异性结合蛋白质上的表位，这些表位在不同物种的蛋白质中是保守的。在一些实施方案中，特异性结合可包括但不需要排他性结合。
术语“特异性”是指抗原结合蛋白(诸如CAR或sdAb)选择性识别抗原的特定表位。例如，天然抗体是单特异性的。如本文所用，术语“多特异性”表示，抗原结合蛋白(诸如CAR或sdAb)具有两个或更多个抗原结合位点，其中至少两个结合不同的抗原。如本文所用，“双特异性”表示，抗原结合蛋白(诸如CAR或sdAb)具有两种不同的抗原结合特异性。如本文所用，术语“单特异性”CAR表示具有一个或多个结合位点，其中每个结合相同的抗原的抗原结合蛋白(诸如CAR或sdAb)。
如本文所用，术语“价”表示抗原结合蛋白(诸如CAR或sdAb)中存在指定数量的结合位点。例如天然抗体或全长抗体具有两个结合位点，是二价的。因此，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”分别表示抗原结合蛋白(诸如CAR或sdAb)中存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。
“抗体效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)，并且随抗体同种型而变化的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞活化。“降低的或最小化的”抗体效应子功能意指从野生型或未修饰的抗体降低至少50％(或者60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)。抗体效应子功能的确定可易于由本领域的普通技术人员测定和测量。在优选的实施方案中，补体结合、补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性的抗体效应子功能受到影响。在一些实施方案中，通过消除糖基化的恒定区突变，例如“无效应子突变”来消除效应子功能。在一个方面，无效应子突变是CH2区中的N297A或DANA突变(D265A+N297A)。Shields等人,J.Biol.Chem.276(9):6591-6604(2001)。或者，导致效应子功能减少或消除的另外的突变包括：K322A和L234A/L235A(LALA)。或者，可通过产生技术来减少或消除效应子功能，诸如在不发生糖基化(例如，大肠埃希氏菌(E.coli.))或其中产生在促进效应子功能方面无效或效果较差的改变糖基化模式的宿主细胞中表达(例如，Shinkawa等人,J.Biol.Chem.278(5):3466-3473(2003)。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或ADCC是指其中结合到Fc受体(FcR)上的分泌Ig存在于某些细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上，以使这些细胞毒性效应细胞特异性结合携带抗原的靶标细胞，随后用细胞毒素杀死靶标细胞的细胞毒性形式。抗体为细胞毒性细胞提供“武装”，并且是通过该机制来杀死靶标细胞必须的。介导ADCC的主要细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的Fc表达汇总于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)的第464页上的表3中。为了评估所关注的分子的ADCC活性，可执行体外ADCC测定，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337所述。用于这些测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外，可在体内，例如在动物模型中评估所关注的分子的ADCC活性，诸如Clynes等人,PNAS USA 95:652-656(1998)所公开。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为从位置Cys226的氨基酸残基或从Pro230至其羧基末端的一段。可以例如在抗体的产生或纯化期间或通过重组工程改造编码抗体的重链的核酸来移除Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)。因此，完整抗体的组合物可包括全部K447残基均被移除的抗体群、无K447残基移除的抗体群以及具有和不具有K447残基的抗体混合物的抗体群。适用于本文所述的抗体的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“结合亲和力”通常是指分子的单个结合位点(例如，抗体或CAR)及其结合伴侣(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原，或CAR和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法(包括本文所述的那些方法)来测定。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并往往容易解离，而高亲和力抗体则通常更快地结合抗原并往往保持结合更长的时间。多种测定结合亲和力的方法是本领域已知的，它们中的任一种均可用于本申请的目的。用于测定结合亲和力的特定说明性和示例性实施方案如下所述。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物活性的抗体。在一些实施方案中，阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。
就肽、多肽或抗体序列而言，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”被定义为在比对序列和引入空位(如果需要的话)，以实现最大序列同一性百分比之后，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守取代的情况下，与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的候选序列中的氨基酸残基的百分比。为了测定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的多种方式实现，例如，使用公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域的技术人员可以确定用于测定比对的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
如本文所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指可用于将一种或多种抗原特异性移植到免疫效应细胞(诸如T细胞)的基因工程受体。一些CAR也称为“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”或“嵌合免疫受体”。在一些实施方案中，CAR包含对一种或多种抗原(诸如肿瘤抗原)具有特异性的胞外抗原结合域、跨膜域和T细胞和/或其他受体的胞内信号传导域。“CAR-T”是指表达CAR的T细胞。“BCMA CAR”是指具有对BCMA具有特异性的胞外结合域的CAR。“双表位CAR”是指具有对BCMA上的两个不同表位具有特异性的胞外结合域的CAR。
编码本文所述的CAR或sdAb的“经分离的”核酸分子是从至少一种污染核酸分子鉴定和分离的核酸分子，所述污染核酸分子通常与其产生的环境相关。优选地，经分离的核酸与产生环境相关的所有组分无关。编码本文的多肽和抗体的经分离的核酸分子的形式不同于其在自然界中存在的形式或背景。所以，经分离的核酸分子不同于编码本文的天然存在于细胞中的多肽和抗体的核酸。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
当一个核酸与另一个核酸序列处于功能关系时，则该核酸是“可操作地连接”的。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该DNA与该多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或该增强子与该序列可操作地连接；或者，如果核糖体结合位点被定位以便促进翻译，则该核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。一般而言，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是邻接的，并且就分泌前导序列而言，是邻接的且处于阅读框中。然而，增强子不必是邻接的。连接通过在适当限制性位点处的连接来实现。如果不存在这些位点，则根据常规实践使用合成寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所用，术语“载体”是指能够使与其连接的另一种核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及并入已经引入该载体的宿主细胞的基因组内的载体。某些载体能够引导与其可操作地连接的核酸的表达。本文将这些载体称为“表达载体”。
如本文所用，术语“自体”意指来源于相同个体的任何材料，随后该材料被重新引入该个体。
“同种异体”是指来源于相同物种的不同个体的移植物。
如本文所用，术语“转染”或“转化”或“转导”是指外源性核酸转入或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代受试者细胞及其子代。
如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且全部这些名称均包括子代。因此，词语“转染子”和“转染的细胞”包括原代受试者细胞以及由此来源的培养物，而不考虑转移次数。还应当理解，由于有意或无意突变，所有子代在DNA含量上可能不严格相同。包括与在初始转化的细胞中筛选的细胞具有相同功能或生物学活性的变体子代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已经引入外源性核酸的细胞，包括这些细胞的子代。宿主细胞包括“转化子”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞以及由此来源的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸含量上与亲代细胞可能不完全相同，但可能含有突变。本文包括与在初始转化的细胞中筛选或选择的细胞具有相同功能或生物学活性的突变子代。
如本文所用，“治疗”或“处理”是用于获得有益的或期望的结果(包括临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于以下一者或多者：缓解疾病产生的一种或多种症状，减少疾病的程度，稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)，预防或延迟疾病的传播(例如，转移)，预防或延迟疾病的复发，延迟或减缓疾病的进展，改善疾病状态，提供疾病的缓解(部分或全部)，减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量，延迟疾病的进展，提高生命的质量和/或延长存活期。“治疗”还涵盖减少癌症的病理后果。本申请的方法设想了治疗的这些方面中的任何一个或多个方面。
如本文所用，“个体”或“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施方案中，个体是人。
本文所用的术语“有效量”是指足以治疗指定病状、病症或疾病(诸如改善、缓和、减轻和/或延迟一种或多种其症状)的药剂(诸如sdAb、经工程化的免疫效应细胞或其药物组合物)的量。关于癌症，有效量包括足以引起肿瘤缩小和/或降低肿瘤的生长速率(诸如抑制肿瘤生长)或者预防或延迟其他不需要的细胞增殖的量。在一些实施方案中，有效量是足以延迟发展的量。在一些实施方案中，有效量是足以预防或延迟复发的量。有效量可以在一次或多次施用中施用。药物或组合物的有效量可以：(i)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤大小；(iii)抑制、阻碍、减缓至一定程度，优选地阻止癌细胞侵润到周围器官；(iv)抑制(即，减缓至一定程度，优选地阻止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)将癌症相关的一种或多种症状减轻至一定程度。
“辅助背景”是指其中个体具有癌症史，并且通常(但不一定)对治疗有响应的临床背景，其包括但不限于手术(例如，手术切除)、放射疗法和化学疗法。然而，由于这些个体的癌症史，它们被视为具有疾病发展的风险。在“辅助背景”中治疗或施用是指后续治疗模式。风险程度(例如，当辅助背景中的个体被视为“高风险”或“低风险”时)取决于若干因素，最通常的是首次治疗时的疾病程度。
“新辅助背景”是指其中方法在初期/确定性治疗之前进行的临床背景。
如本文所用，“延迟”癌症的发展意指推迟、妨碍、减缓、阻碍、稳定和/或推后疾病的发展。根据病史和/或待治疗的个体，该延迟可具有不同的时间长度。对于本领域的技术人员显而易见的是，充分或显著延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不患有疾病。“延迟”癌症的发展的方法是与未使用方法相比，在给定时间范围内减小疾病发展的概率和/或在给定时间范围内减少疾病的程度的方法。这些比较通常基于临床研究，使用统计学上显著数量的个体。癌症发展可使用标准方法，包括但不限于计算机轴向断层成像(CAT扫描)、磁性共振成像(MRI)、腹部超声、凝血测试、动脉造影或活组织检查来检测。发展也可以指最初不可检测的癌症进展，包括发生、复发和发作。
术语“药物制剂”是指处于诸如允许活性成分的生物学活性有效的形式，并且不含有对将施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。这些制剂是无菌的。“无菌”制剂是无菌的或不含所有活微生物及其孢子。
如本文所用，“载剂”包括在所采用的剂量和浓度下，对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。通常，生理学上可接受的载剂是水性pH缓冲溶液。生理学上可接受的载剂的实例包括缓冲剂，诸如磷酸、柠檬酸和其他酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文关注的“稀释剂”是药学上可接受的(对人施用是安全的和无毒的)并且用于制备液体制剂(诸如冻干后复原的制剂)的稀释剂。示例性稀释剂包括无菌水、抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏(Ringer)溶液或右旋糖溶液。在一个替代实施方案中，稀释剂可包括盐和/或缓冲剂的水溶液。
“防腐剂”是可加入本文的制剂以降低细菌活性的化合物。防腐剂的添加可以例如促进多用途(多剂量)制剂的产生。潜在的防腐剂的实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵(烷基苄基二甲基氯化铵的混合物，其中烷基基团是长链化合物)和苄索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳香醇(诸如苯酚、丁醇和苄醇)、对羟基苯甲酸烷基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚。本文中最优选的防腐剂是苄醇。
“稳定”制剂是其中的蛋白质在储存时实质上保留其物理和化学稳定性和完整性的制剂。用于测定蛋白质稳定性的多种分析技术在本领域中是可用的，并且在Peptide andProtein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee编,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中综述。可在选定的温度下测定稳定性一段选定的时间。对于快速筛选，制剂可保持在40℃下2周至1个月，在这段时间期间测定稳定性。当制剂在2-8℃下储存时，通常制剂在30℃或40℃下应能够稳定至少1个月和/或在2-8℃下稳定至少2年。当制剂在30℃下储存时，通常制剂在30℃下应能够稳定至少2年和/或在40℃下稳定至少6个月。例如，储存期间聚集的程度可用作蛋白质稳定性的指标。因此，“稳定”制剂可以是这样的制剂：其中小于约10％，优选地小于约5％的蛋白质以聚集体存在于制剂中。在其他实施方案中，可以确定在制剂的储存期间聚集体形成的任何增加。
“复原”制剂是通过将冻干蛋白质或抗体制剂溶解于稀释剂，以使蛋白质分散于其中来制备的制剂。复原制剂适于将所关注的蛋白质施用(例如皮下施用)于待治疗的患者，在本申请的一些实施方案中，可以是适于肠胃外或静脉内施用的制剂。
“等渗”制剂是具有与人血液实质上相等的渗透压的制剂。等渗制剂通常将具有约250至350mOsm的渗透压。术语“低渗”描述了具有低于人血液的渗透压的制剂。相应地，术语“高渗”用于描述具有高于人血液的渗透压的制剂。例如，等渗性可以使用蒸气压或冰冷型渗压计来测定。由于添加了盐和/或缓冲剂，本发明的制剂是高渗的。
应当理解，本文所述的本申请的实施方案包括“由实施方案组成”和/或“实质上实施方案组成”。
本文中提及“约”的值或参数包括(和描述)针对该值参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。
如本文所用，提及“不”的值或参数通常意指和描述“除了”该值或参数之外。例如，方法不用于治疗X型癌症意指该方法用于治疗除了X型之外的癌症类型。
本文所用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个”、“或”和“所述”包括复数个指代物。
II.抗BCMA单域抗体
本申请的一个方面提供特异性结合至BCMA(诸如人BCMA)的经分离的单域抗体(本文称为“抗BCMA sdAb”)。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb调节BCMA活性。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb是拮抗剂抗体。还提供了来源于本文所述的抗BCMA sdAb中的任一者的抗原结合片段，和包含本文所述的抗BCMA sdAb中的任一者的抗原结合蛋白。示例性抗BCMAsdAb列于下表2中。
表2.示例性抗BCMA sdAb。
Figure BDA0003066909480000191
Figure BDA0003066909480000201
Figure BDA0003066909480000211
Figure BDA0003066909480000221
B细胞成熟抗原(BCMA)，也称为CD269，是肿瘤坏死因子受体超家族成员，即TNFRSF17(Thompson等人,J.Exp.Medicine,192(1):129-135,2000)。人BCMA几乎排他性地在浆细胞和多发性骨髓瘤细胞中表达(参见例如Novak等人,Blood,103(2):689-694,2004；Neri等人,Clinical Cancer Research,73(19):5903-5909；Felix等人,Mol.Oncology,9(7):1348-58,2015)。BCMA可结合B细胞活化因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)(例如Mackay等人,2003和Kalled等人,Immunological Review,204:43-54,2005)。BCMA可以是针对多发性骨髓瘤的免疫治疗剂的合适肿瘤抗原靶标。高亲和力的抗体可阻断BCMA和其天然配体BAFF和APRIL之间的结合。抗BCMA sdAb可与使用CAR-T细胞的细胞免疫疗法组合使用，例如以增强针对肿瘤细胞的细胞毒性作用。
在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMAsdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMAsdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMAsdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMAsdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMAsdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb是骆驼科动物的。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb是人源化的。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb包含受体人框架，例如，人免疫球蛋白框架或人共有区框架。
在一些实施方案中，提供了包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个CDR的抗BCMA sdAb：(a)包含选自SEQ ID NO:1-38的氨基酸序列的CDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:39-76的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含选自SEQ ID NO:77-114的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗BCMAsdAb是骆驼科动物的。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb是人源化的。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb包含受体人框架，例如，人免疫球蛋白框架或人共有区框架。
在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)与选自SEQ ID NO:1-38的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一者的序列同一性的CDR1；(b)与选自SEQ ID NO:39-76的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一者的序列同一性的CDR2；和(c)与选自SEQ ID NO:77-114的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一者的序列同一性的CDR3。在一些实施方案中，具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者的同一性的CDR相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗BCMA sdAb保留了结合至BCMA的能力。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)与选自SEQ ID NO:1-38的氨基酸序列相比，具有约1个、2个、3个或4个中的任一者的氨基酸取代(例如，保守取代)、插入或缺失的CDR1；(b)与选自SEQ ID NO:39-76的氨基酸序列相比，具有约1个、2个、3个或4个中的任一者的氨基酸取代(例如，保守取代)、插入或缺失的CDR2；和(c)与选自SEQID NO:77-114的氨基酸序列相比，具有约1个、2个、3个或4个中的任一者的氨基酸取代(例如，保守取代)、插入或缺失的CDR3。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb是亲和力成熟的。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb是骆驼科动物的。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb是人源化的。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb包含受体人框架，例如，人免疫球蛋白框架或人共有区框架。
在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMAsdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQID NO:4的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQID NO:80的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMAsdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQID NO:14的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQID NO:90的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQID NO:57的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMAsdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQID NO:27的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQID NO:103的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ IDNO:106的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQID NO:73的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含三种CDR的抗BCMA sdAb，所述CDR包括：(a)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ IDNO:76的氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb是骆驼科动物的。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb是人源化的。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb包含受体人框架，例如，人免疫球蛋白框架或人共有区框架。
在一些实施方案中，抗BCMA sdAb(包括上述任何实施方案)(即，包含特定CDR1、CDR2和/或CDR3的抗BCMA sdAb)包含与选自SEQ ID NO:115-152的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一者的序列同一性的VHH域。在一些实施方案中，具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者的同一性的VHH序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗BCMA sdAb保留了结合至BCMA的能力。在一些实施方案中，在选自SEQ ID NO:115-152的氨基酸序列中总共1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即，FR中)。任选地，抗BCMA sdAb包含选自SEQ ID NO:115-152的氨基酸序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，提供了包含具有选自由SEQ ID NO:115-152组成的组的氨基酸序列的VHH域的经分离的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，提供了包含选自由SEQ IDNO:115-152组成的组的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，功能性表位可以通过组合丙氨酸扫描来作图。在该过程中，组合丙氨酸扫描策略可用于鉴定BCMA蛋白中与抗BCMA sdAb的相互作用所必需的氨基酸。在一些实施方案中，表位是具有构象的，并且结合至BCMA的抗BCMA sdAb的晶体结构可用于鉴定这些表位。在一些实施方案中，本申请提供来源于选自由SEQ ID NO:388-394组成的组的氨基酸序列的BCMA的表位。在一些实施方案中，本申请提供包含选自由SEQ ID NO:388-394组成的组的氨基酸序列的BCMA的表位。
在一些实施方案中，本申请提供与本文所述的抗BCMA sdAb中的任一者竞争结合至BCMA的抗体。在一些实施方案中，本发明提供与本文提供的抗BCMA sdAb竞争至BCMA上的表位的结合的抗体。在一些实施方案中，提供结合至与包含选自由SEQ ID NO:115-152组成的组的氨基酸序列的抗BCMA sdAb相同的表位的抗体。在一些实施方案中，提供与包含选自由SEQ ID NO:115-152组成的组的氨基酸序列的多肽抗BCMA sdAb竞争BCMA的特异性结合的抗体。
在一些实施方案中，竞争测定法可用于鉴定与本文所述的抗BCMA sdAb竞争结合至BCMA的单克隆抗体。竞争测定法可用于确定两种抗体通过识别相同的或空间上重叠的表位来结合相同的表位，还是一种抗体竞争性抑制另一种抗体与抗原的结合。在某些实施方案中，这种竞争性抗体结合至与本文所述的抗体所结合的相同表位(例如，来源于选自由SEQ ID NO:388-394组成的组的氨基酸序列的BCMA表位)。示例性竞争测定法包括但不限于常规测定法，诸如Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,第14章(ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)提供的那些测定法。用于对抗体所结合的表位进行作图的详细示例性方法提供于Morris(1996)“Epitope MappingProtocols”,载于Methods in Molecular Biology,第66卷(Humana Press,Totowa,N.J.)中。在一些实施方案中，如果每种抗体阻断另一种的结合50％或更多，则认为两种抗体结合至相同的表位。在一些实施方案中，与本文所述的抗BCMA sdAb竞争的抗体是骆驼科动物、嵌合、人源化或人抗体。在一些实施方案中，本申请提供与本文所述的骆驼科动物、嵌合、人源化或人抗BCMA sdAb竞争的抗体。
在一些实施方案中，提供了包含上述抗BCMA sdAb中的任一者的抗BCMA抗体或抗原结合蛋白。在一些实施方案中，抗BCMA抗体是单克隆抗体，包括骆驼科动物、嵌合、人源化或人抗体。在一些实施方案中，抗BCMA抗体是抗体片段，例如VHH片段。在一些实施方案中，抗BCMA抗体是包含任何抗体类别或同种型(诸如IgG1或IgG4)的Fc区的全长仅重链抗体。在一些实施方案中，Fc区具有降低的或最小化的效应子功能。
在一些实施方案中，根据上述实施方案中的任一种的抗BCMA抗体(诸如抗BCMAsdAb)或抗原结合蛋白可单独地或组合地包括下文“抗体的特征”第1-7部分所述的任何特征。
在一些实施方案中，提供了编码上述抗BCMA抗体(诸如抗BCMA sdAb)中的任一者的经分离的核酸。在一些实施方案中，提供了编码抗BCMA sdAb的经分离的核酸，其中所述核酸包含与选自由SEQ ID NO:153-190组成的组的核酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一者的序列同一性的序列。在一些实施方案中，提供了包含选自由SEQ ID NO:153-190组成的组的核酸序列的经分离的核酸。在一些实施方案中，提供了包含这种核酸的载体(例如，表达载体)。在一些实施方案中，提供了包含这种核酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了制备抗BCMA抗体的方法，其中所述方法包括在适合于表达抗BCMA抗体的条件下培养上文提供的包含编码抗BCMA抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗BCMA抗体。
抗体的特征
1.抗体亲和力
在一些实施方案中，本文提供的抗BCMA抗体具有的解离常数(Kd)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在一些实施方案中，通过使用以下测定所述的所关注的抗体及其抗原的Fab形式或VHH片段进行的放射性标记的抗原结合测定(RIA)来测量Kd。例如，通过以下方法来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力：在存在滴定系列的未标记的抗原的情况下使用最小浓度的(125I)-标记的抗原来平衡Fab，然后捕获与抗Fab抗体涂覆的平板结合的抗原(参见例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。
在一些实施方案中，在25℃下使用
Figure BDA0003066909480000291
-2000或
Figure BDA0003066909480000292
-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)使用～10个响应单位(RU)的固定化抗原CM5芯片通过表面等离子共振测定法来测量Kd。简而言之，根据供应商的说明使用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH4.8(约0.2μM)稀释至5μg/ml，然后以5μl/分钟的流速注射，以实现大约10个响应单位(RU)的偶联蛋白。在注射抗原之后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将两倍连续稀释的所关注的抗体的Fab或VHH(0.78nM至500nM)溶于PBS与0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂(PBST)一起在25℃下大约25μl/min的流速下注射。使用简单一对一Langmuir结合模型(
Figure BDA0003066909480000293
评估软件3.2版)通过同时拟合缔合和解离传感图来计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以koff/kon比例计算。参见例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离子共振测定法测得的结合速率超过106M-1s-1，则结合速率可通过使用荧光猝灭技术来确定，所述荧光猝灭技术在存在浓度逐渐增加的抗原的情况下，测量25℃下20nM溶于PBS的针对抗原的抗体(Fab形式)pH7.2的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm通带)，所述抗原的浓度由分光仪(诸如配备停流的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCO TM分光光度计(ThermoSpectronic))使用搅拌比色杯来测量。
2.抗体片段
在一些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段、VHH以及以下所述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün,载于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还可参见WO 93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基并具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利No.5,869,046。
双体是可为二价的或双特异性的具有两个抗原结合位点的抗体片段。参见例如EP404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三体和四体还在Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中有所描述。
如本文所述，抗体片段可通过多种技术，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化，以及通过重组宿主细胞(例如大肠埃希氏菌或噬菌体)的产生来制备。
3.嵌合和人源化抗体
在一些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体如例如美国专利No.4,816,567；和Morrison等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)所述。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于骆驼科动物物种(诸如美洲驼)的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体为“类别转换”抗体，其中类别或子类已从亲代抗体的类别或子类而改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在一些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人抗体被人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲代非人抗体的特异性和亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR例如CDR(或其部分)来源于非人抗体，并且FR(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基来源于其中的抗体)的对应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且例如在Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等人,Methods36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“导向选择”方法)中进一步描述。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如，Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993))；来源于特定亚组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列的框架区(参见例如，Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和来源于筛选FR文库的框架区(参见例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
在一些实施方案中，sdAb被修饰，诸如人源化，而不减少域对抗原的天然亲和力，同时不降低其对异源物种的免疫原性。例如，可以确定美洲驼抗体的抗体可变域(VHH)的氨基酸残基，并且例如框架区中的一个或多个骆驼科动物氨基酸被人共有序列中存在的人对应部分替换，且多肽未丧失其典型特征，即人源化不会显著影响所得的多肽的抗原结合能力。骆驼科动物sdAb的人源化要求在单条多肽链中引入和诱变有限量的氨基酸。这与scFv、Fab'、(Fab')2和IgG的人源化形成对比，scFv、Fab'、(Fab')2和IgG的人源化要求在两条链即轻链和重链中引入氨基酸变化以及两条链的组装体的保存。
包含VHH域的单域抗体可以人源化为具有人样序列。在一些实施方案中，本文所用的VHH域的FR区包含与人VH框架区具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多中的任一者的氨基酸序列同源性。一种示例性类别的人源化VHH域的特征在于，根据Kabat编号，VHH在位置45处携带选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺组成的组的氨基酸(例如，L45)，并且在位置103处携带色氨酸。因此，属于该类别的多肽显示出与人VH框架区的高氨基酸序列同源性，并且所述多肽可以直接施用于人，而不期望由此产生不需要的免疫响应，并且没有进一步人源化的负担。
另一种示例性类别的人源化骆驼科动物sdAb在WO 03/035694中有所描述并且含有通常存在于人来源或来自其他物种的常规抗体的疏水性FR2残基，但补偿了位置103上取代双链抗体的VH中存在的保守色氨酸残基的带电精氨酸残基的亲水性丧失。因此，属于这两种类别的肽显示出与人VH框架区的高氨基酸序列同源性，并且所述肽可以直接施用于人，而不期望由此产生不需要的免疫响应，并且没有进一步人源化的负担。
4.人抗体
在一些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的多种技术生产人抗体。人抗体通常在van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中有所描述。能够产生全人sdAb的转基因小鼠或大鼠是本领域已知的，参见例如，US20090307787A1、美国专利No.8,754,287、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794。
可以通过将免疫原施用于已被改性为响应于抗原激发而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物来制备人抗体。此类动物通常含有全部或一部分的人免疫球蛋白基因座，该基因座替换内源性免疫球蛋白基因座或存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利No.6,075,181和6,150,584；描述
Figure BDA0003066909480000314
技术的美国专利No.5,770,429；描述K-M
Figure BDA0003066909480000316
技术的美国专利No.7,041,870和描述
Figure BDA0003066909480000315
技术美国专利申请公开No.US 2007/0061900。由此类动物产生的完整抗体的人可变区还可以例如通过与不同的人恒定区组合而进一步修饰。
也可以通过基于杂交瘤的方法来制备人抗体。已描述用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。(参见例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体还在Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中有所描述。另外的方法包括例如美国专利No.7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)还在Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中有所描述。
也可通过分离选自人来源的噬菌体展示文库的Fv克隆可变域序列来产生人抗体。然后此类可变域序列可与所需的人恒定域组合。从抗体文库选择人抗体的技术如下所述。
用于获得针对特定抗原或靶标的VHH序列的一种技术涉及适当地免疫能够表达重链抗体的转基因哺乳动物(即，以产生免疫响应和/或针对所述抗原或靶标的重链抗体)，从含有所述VHH序列(编码所述VHH序列的核酸序列)的所述转基因哺乳动物获得合适的生物样品(诸如血液样品、血清样品或B细胞的样品)，然后从所述样品开始，使用本身已知的任何合适技术(诸如本文所述的任何方法或杂交瘤技术)产生针对所述抗原或靶标的VHH序列。例如，出于此目的，可使用表达重链抗体的小鼠以及在WO 02/085945、WO 04/049794和WO06/008548以及Janssens等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006年10月10日；103(41):15130-5中有所描述的另外的方法和技术。例如，这种表达重链抗体的小鼠可以表达具有任何合适的(单个)可变域，诸如来自天然来源的(单个)可变域(例如人(单个)可变域、骆驼科动物(单个)可变域或鲨鱼(单个)可变域)以及例如合成或半合成(单个)可变域的重链抗体。
5.文库来源的抗体
可以通过筛选具有所需的一种或多种活性的抗体的组合文库来分离本申请的抗体。例如，多种用于产生噬菌体展示文库和在此类文库中筛选具有所需结合特性的抗体的方法是本领域已知的。此类方法例如在Hoogenboom等人，载于Methods in MolecularBiology178:1-37(O’Brien等人编,Human Press,Totowa,NJ,2001)中综述，并且例如在McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury，载于Methods in MolecularBiology 248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)中进一步描述。用于构建sdAb文库的方法已有所描述，例如参见美国专利NO.7371849。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因库通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆，并且在噬菌体文库中随机重组，然后可对其筛选抗原结合噬菌体，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。免疫来源的文库为免疫原提供了高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如从人)克隆未暴露的库，从而在无需任何免疫的情况下，得到针对多种非自体抗原和自体抗原的单来源抗体，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，还可以通过克隆来自干细胞的未重排的V基因区段，并且使用含有编码高度可变CDR3区并实现体外重排的随机序列的PCR引物来合成制备未暴露的文库，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括例如：美国专利No.5,750,373和美国专利公开No.2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被视为本文的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在一些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是具有对至少两个不同位点的结合特异性的抗体。在一些实施方案中，一种结合特异性针对选自由CD19、CD20、BCMA和CD38组成的组的抗原，并且另一种则针对任何其他抗原。在一些实施方案中，双特异性抗体可结合至选自由CD19、CD20、BCMA和CD38组成的组的抗原的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于表达选自由CD19、CD20、BCMA和CD38组成的组的抗原的细胞。
双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段。用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于：具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))、WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))和“钮入孔”工程化(参见例如美国专利No.5,731,168)。多特异性抗体也可通过以下方法制备：利用静电导向效应制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；使两个或更多个抗体或片段交联(参见例如美国专利No.4,676,980和Brennan等人,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如，Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如，Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；和制备三特异性抗体，如例如Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)所述；以及产生包含串联单域抗体的多肽(参见例如美国专利申请No.20110028695；和Conrath等人,J.Biol.Chem.,2001；276(10):7346-50)。本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的经工程化的抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如，US2006/0025576A1)。
7.抗体变体
在一些实施方案中，设想了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码抗体的核酸序列或通过肽合成来制备。这些修饰包括例如在抗体的氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任何组合，以获得最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特性，例如抗原结合。
a)取代、插入和缺失变体
在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代诱变的所关注位点包括HVR和FR。表3的“优选的取代”标题下示出了保守取代。表3的“示例性取代”标题提供了更多的实质性变化，并且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述。氨基酸取代可引入所关注的抗体，并筛选产物的所需活性，例如保持/改善抗原结合、减少免疫原性或改善ADCC或CDC。
表3.氨基酸取代
Figure BDA0003066909480000331
根据常见侧链性质，氨基酸可以分为以下组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的成员。
一种类型的取代变体涉及取代亲代抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，所得的被选为用于进一步研究的一种或多种变体相对于亲代抗体具有某些生物学性质的修改(例如，改善)(例如，亲和力增加、免疫原性减少)和/或基本上保持了亲代抗体的某些生物学性质。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，它可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(诸如本文所述的那些技术)方便地产生。简而言之，使一个或多个HVR残基突变，并且在噬菌体上展示变体抗体，并筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可在HVR中作出改变(例如，取代)，例如以改善抗体亲和力。这些改变可以在HVR“热点”，即在体细胞成熟过程期间经历高频突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)中进行，其中测试所得的变体VH或VL的结合亲和力。通过从次级文库构建和再选择进行的亲和力成熟例如在Hoogenboom等人，载于Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))中有所描述。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸引导的诱变)中的任一种将多样性引入为成熟所选择的可变基因中。然后产生次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR引导的方法，其中使几个HVR残基(例如，每次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴定参与抗原结合的HVR残基。特别地，通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在一些实施方案中，可以在一个或多个HVR中发生取代、插入或缺失，只要这些改变基本上不降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可以在HVR中作出不会基本上降低结合亲和力的保守改变(例如，本文提供的保守取代)。这些改变可以在HVR“热点”或CDR的外部。在上文提供的变体VHH序列的一些实施方案中，每个HVR是未改变的，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
用于鉴定可靶向诱变的抗体的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在该方法中，鉴定残基或靶标残基组(例如，带电的残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换该残基或靶标残基组，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始取代显示出功能灵敏性的氨基酸位置处引入另外的取代。或者或另外，使用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以靶向或消除这些接触残基和邻近残基作为取代的候选物。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的性质。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-末端或C-末端融合至延长抗体的血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT)或多肽。
b)糖基化变体
在一些实施方案中，改变本文提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列以产生或除去一个或多个糖基化位点来方便地实现抗体的糖基化位点的添加或缺失。
在抗体包含Fc区的情况中，可以改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的、双触角寡糖，所述寡糖通常通过N-键连接至Fc区的CH2域的Asn297。参见例如，Wright等人,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括多种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“茎”中连接至GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以本申请的抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的性质的抗体变体。
在一些实施方案中，提供了具有缺乏连接(直接或间接)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，这种抗体中的岩藻糖的量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。相对于通过MALDI-TOF质谱法所测定的连接至Asn297的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，岩藻糖的量通过计算糖链内Asn297处岩藻糖的平均量来确定，例如如WO 2008/077546所述。Asn297是指位于Fc区中约第297位(Fc区残基的EU编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体的微小序列变化，Asn297也可位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开No.US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷的”抗体变体的专利公开的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生脱岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等人,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请No.US 2003/0157108 A1,Presta,L；和WO 2004/056312 A1，Adams等人，特别是实施例11)和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8敲除的CHO细胞(参见例如，Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
抗体变体还具有等分寡糖，例如其中连接至抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc等分。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例例如在WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利No.6,602,684(Umana等人)；和US2005/0123546(Umana等人)中有所描述。还提供在连接至Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体例如在WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)中有所描述。
c)Fc区变体
在一些实施方案中，可以将一种或多种氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在一些实施方案中，本申请设想了具有一些但不是所有效应子功能的抗体变体，这使所述抗体变体成为以下应用的所需候选物：其中抗体的体内半衰期是重要的，但某些效应子功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可进行体外和/或体内细胞毒性测定，以证实CDC和/或ADCC活性的减少/耗竭。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞(即NK细胞)仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc(RI、Fc(RII和Fc(RIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464页的表3中。评估所关注的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例在美国专利No.5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中有所描述。或者，可以采用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox
Figure BDA0003066909480000361
非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。用于这些测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外，可以在体内例如在动物模型中评估所关注的分子的ADCC活性，诸如Clynes等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所公开。也可以进行C1q结合测定以证实抗体不能结合C1q，并因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如，Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域已知的方法执行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如，Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一处或多处的取代的那些抗体(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297被取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见例如，美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312和Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在一些实施方案中，抗体变体包含具有改善了ADCC的一个或多个氨基酸取代的Fc区，例如Fc区的位置298、333和/或334处(残基的EU编号)的取代。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，这些改变产生改变的(即，改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如美国专利No.6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)所述。
US2005/0014934A1(Hinton等人)描述了具有延长的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)(负责将母体的IgG转移至胎儿)的结合的抗体(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，所述取代改善了Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在Fc区残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一个或多个处具有取代的那些变体，例如Fc区残基434的取代(美国专利No.7,371,826)。
还可参见Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；和WO 94/29351关于Fc区变体的其他实例。
d)半胱氨酸工程化的的抗体变体
在一些实施方案中，可以期望产生半胱氨酸工程化的抗体，例如其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代的“硫代MAb”。在具体实施方案中，取代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，由此将反应性硫醇基团定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体缀合至其他部分(诸如药物部分或接头-药物部分)，以产生免疫缀合物，如本文所进一步描述。在一些实施方案中，以下残基中的任何一者或多者可以被半胱氨酸取代：重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化的抗体可以如例如美国专利No.7,521,541所述描述产生。
e)抗体衍生物
在一些实施方案中，本文提供的抗体可以进一步修饰为含有本领域已知的和易于获得的另外的非蛋白质部分。适合于抗体的衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于：聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二噁茂烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)以及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷(prolypropylene oxide)/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于聚乙二醇丙醛在水中的稳定性，其在制备中可具有优势。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链的或无支链的。连接至抗体的聚合物的数量可以变化，并且如果连接了超过一个聚合物，那么它们可以是相同的或不同的分子。一般而言，可根据以下考虑来确定用于衍生化的聚合物的数量和/或类型，包括但不限于待改善的抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将被用于确定条件下的疗法等。
在一些实施方案中，提供了可以通过暴露于辐射来选择性加热的抗体和非蛋白质部分的缀合物。在一些实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞无害，但将非蛋白质部分加热至抗体-非蛋白质部分附近的细胞被杀死的温度的波长。
制备方法
可以使用本领域已知的或本文所述的任何方法来制备本文所述的抗体(诸如sdAb)。
制备sdAb的方法已有所描述。参见例如，Els Pardon等人,Nature Protocol,2014；9(3):674。单域抗体(诸如VHH)可以使用本领域已知的方法获得，诸如通过免疫骆驼科动物物种(诸如骆驼或美洲驼)并从中获得杂交瘤，或通过使用本领域已知的分子生物学技术克隆sdAb的文库，并使用未选择文库的单个克隆的ELISA或通过使用噬菌体展示进行后续选择。
对于sdAb的重组产生，分离编码sdAb的核酸并将其插入可复制载体用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。编码sdAb的DNA易于使用常规程序分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合至编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。很多载体是可用的。载体的选择部分取决于要使用的宿主细胞。一般而言，优选的宿主细胞是原核生物或真核生物(通常是哺乳动物)来源的。
1.多克隆抗体
通常通过有关抗原和佐剂的多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射在动物中产生多克隆抗体。使用双功能剂或衍生剂例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N═C═NR(其中R和R1独立地为低级烷基基团)将有关抗原缀合至在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质(例如钥孔
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血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)可为有用的。可以使用的佐剂的实例包括弗氏(Freund)完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A、合成海藻糖二棒分枝菌酸酯)。免疫接种方案可由本领域的技术人员选择，而无需过多的实验。
通过将例如100μg或5μg或蛋白质或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂合并并在多个部位皮内注射该溶液来针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫动物。一个月后，在多个部位用1/5至1/10原始量的溶于弗氏完全佐剂的肽或缀合物皮下注射来加强免疫动物。七至十四天后，将动物放血并测定血清的抗体滴度。加强免疫动物直到滴度达到平稳期。缀合物也可以在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物来制备。另外，聚集剂(诸如明矾)适合于增强免疫响应。
2.单克隆抗体
单克隆抗体从一群基本上同质的抗体获得，所述基本上同质的抗体即构成该抗体群的各单独抗体，除了可以少量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)之外，其他方面是相同的。因此，修饰语“单克隆”表示不是离散抗体的混合物的抗体特征。
例如，单克隆抗体可以使用Kohler等人,Nature,256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(美国专利No.4,816,567)。
在杂交瘤方法中，如上文所述免疫小鼠或其他适当的宿主动物(诸如仓鼠)，以引发产生或能够产生特异性结合用于免疫接种的蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以体外免疫。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(Academic Press,1986)。
免疫剂通常包括抗原蛋白质或其融合变体。一般而言，如果需要人来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者如果需要非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞。Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press(1986),第59-103页。
永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，利用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将这样制备的杂交瘤细胞接种，并在优选地含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的物质的合适培养基中生长。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏酶，即次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基碟呤和胸苷(HAT培养基)，它们是阻止HGPRT缺陷细胞生长的物质。
优选的永生化骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的产生抗体的细胞来支持抗体的稳定高水平产生并且对培养基(诸如HAT培养基)是敏感的的那些细胞。其中，优选的是鼠科动物骨髓瘤细胞系，诸如来源于MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(得自Salk Institute CellDistribution Center,San Diego,Calif.USA)和SP-2细胞(及其衍生物，例如X63-Ag8-653)(得自American Type Culture Collection,Manassas,Va.USA)的那些细胞系。还描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
测定其中杂交瘤细胞生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的生成。优选地，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定。
可测定其中培养杂交瘤细胞的培养基中针对所需抗原的单克隆抗体的存在。优选地，单克隆抗体的结合亲和力和特异性可通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联测定法(ELISA)来测定。这些技术和测定法是本领域已知的，例如结合亲和力可以通过Munson等人,Anal.Biochem.,107:220(1980)的斯卡查德(Scatchard)分析来测定。
在鉴定产生所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，克隆可以通过有限稀释程序亚克隆并通过标准方法生长(Goding，出处同上)。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为肿瘤在哺乳动物中体内生长。
通过常规免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱，从培养基、腹水或血清适当地分离亚克隆分泌的单克隆抗体。
单克隆抗体也可以通过重组DNA方法，诸如美国专利No.4,816,567所述和上文描述的那些方法来制备。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规程序分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合至编码鼠科动物抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞作为这种DNA的优选来源。一旦分离DNA，即可将其置于表达载体中，然后将该表达载体转染进不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞，诸如大肠埃希氏菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在此类重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在编码抗体的DNA的细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等人,Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)和Pliickthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可以从使用McCafferty等人,Nature,348:552-554(1990)所述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离抗体。Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠科动物和人抗体。后续出版物描述了通过链改组(Marks等人,Bio/Technology,10:779-783(1992))以及将组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等人,Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993))来产生高亲和力(nM范围)人抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的适宜替代方案。
DNA也可以例如通过用人重链和轻链恒定域的编码序列取代同源鼠科动物序列(美国专利No.4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA,81:6851(1984))或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分共价连接至免疫球蛋白编码序列来修饰。通常此类非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定域，或它们取代抗体的一个抗原组合位点的可变域，以产生包含对抗原具有特异性的一个抗原组合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原组合位点的嵌合二价抗体。
本文所述的单克隆抗体可以是单价的，其制备是本领域熟知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和经修饰的重链的重组表达。通常在Fc区中的任何点截短重链以防止重链交联。或者，相关的半胱氨酸残基可以被另一种氨基酸残基取代或缺失，以防止交联。体外方法也适用于制备单价抗体。消化抗体以产生其片段(特别是Fab片段)可以使用本领域已知的常规技术实现。
嵌合或杂合抗体也可以使用合成蛋白质化学中的已知方法，包括涉及交联剂的那些方法体外制备。例如，免疫毒素可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建。用于此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和4-巯基丁酰亚氨酸甲酯。
3.在原核细胞中重组产生
a)载体构建
编码本申请的抗体的多核苷酸序列可以使用标准重组技术获得。所需的多核苷酸序列可以从产生抗体的细胞(诸如杂交瘤细胞)中分离和测序。或者，可以使用核苷酸合成仪或PCR技术来合成多核苷酸。一旦获得编码多肽的序列，即可将其插入能够在原核宿主中复制和表达异源多核苷酸的重组载体。本领域可用和已知的很多载体可用于本发明的目的。适当载体的选择将主要取决于待插入载体的核酸的大小和待用载体转化的特定宿主细胞。根据载体的功能(异源多核苷酸的扩增或表达，或它们二者)以及载体与其所在的特定宿主细胞的相容性，每个载体含有不同的组件。载体组件通常包括但不限于：复制起点、选择性标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入物和转录终止序列。
一般而言，含有来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体连同这些宿主一起使用。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，通常使用来源于大肠埃希氏菌物种的质粒即pBR322转化大肠埃希氏菌。pBR322含有编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，从而提供了鉴定转化细胞的简易手段。pBR322、其衍生物或其他微生物质粒或噬菌体也可以含有或修饰为含有可由微生物用于表达内源蛋白质的启动子。用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例在Carter等人，美国专利No.5,648,237中详细描述。
此外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可连同这些宿主一起用作转化载体。例如，噬菌体(诸如GEMTM-11)可用于制备重组载体，该重组载体可用于转化易感宿主细胞(诸如大肠埃希氏菌LE392)。
本申请的表达载体可包含编码每种多肽组件的两个或更多个启动子-顺反子对。启动子是位于顺反子上游(5')的调节其表达的非翻译调控序列。原核启动子通常分为两类，诱导型和组成型。诱导型启动子是响应于培养条件的变化，例如在存在或不存在营养物或温度变化的情况下，而引起受其控制的顺反子转录水平升高的启动子。
大量被多种潜在宿主细胞识别的启动子是熟知的。通过限制性酶消化从来源DNA移除启动子，并将经分离的启动子序列插入本申请的载体，可以将选择启动子可操作地连接至编码轻链或重链的顺反子DNA。天然启动子序列和许多异源启动子二者都可以用于引导靶基因的扩增和/或表达。在一些实施方案中，利用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达的靶基因的更高转录和更高收率。
适于与原核宿主一起使用的启动子包括PhoA启动子、半乳糖苷酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子(诸如tac或trc启动子)。然而，在细菌中发挥功能的其他启动子(诸如其他已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的核酸序列已经公开，从而使技术人员能够使用提供任何所需限制性位点的接头或衔接子可操作地将它们连接至编码靶标轻链和重链的顺反子(Siebenlist等人,(1980)Cell 20:269)。
在一个方面，重组载体内的每个顺反子包含引导所表达多肽的跨膜易位的分泌信号序列组件。一般而言，信号序列可以是载体的组件，或者可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。出于本发明的目的选择的信号序列应该是被宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和加工异源多肽本身的信号序列的原核宿主细胞，信号序列被选自由例如碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP组成的组的原核信号序列取代。在本申请的一些实施方案中，用于表达系统的两个顺反子的信号序列是STII信号序列或其变体。
在一些实施方案中，根据本申请的抗体产生可以在宿主细胞的胞质中发生，所以不需要每个顺反子内都存在分泌信号序列。在一些实施方案中，表达、折叠和组装多肽组件(诸如编码任选地融合至第二抗原结合部分的第一抗原结合部分的VH域的多肽，和编码任选地融合至第二抗原结合部分的第一抗原结合部分的VL域的多肽)以在细胞质内形成功能性抗体。某些宿主菌株(例如，大肠埃希氏菌trxB-株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而允许所表达蛋白质亚基的正确折叠和组装。Proba和Pluckthun,Gene,159:203(1995)。
本发明提供其中所表达多肽组件的定量比例可调节的表达系统，以使分泌和正确折叠的本申请的抗体的收率最大化。这种调节至少部分通过同时调节多肽组件的翻译强度来实现。用于调节翻译强度的一种技术在Simmons等人，美国专利No.5,840,523中有所公开。它利用顺反子内的翻译起始区域(TIR)的变体。对于给定TIR，可以产生一系列具有一定范围的翻译强度的氨基酸或核酸序列变体，从而提供了用于对特定链的所需表达水平调整该因子的简便手段。TIR变体可以通过产生密码子变化的常规诱变技术来产生，该密码子变化可以改变氨基酸序列，但核酸序列中的沉默变化是优选的。TIR中的改变可以包括例如Shine-Dalgarno序列的数量或间隔的改变，以及信号序列的改变。用于产生突变信号序列的一种方法是在不改变信号序列的氨基酸序列(即，变化是沉默的)的编码序列开始时产生“密码子库”。这可以通过改变每个密码子的第三核苷酸位置来实现；另外，一些氨基酸，诸如亮氨酸、丝氨酸和精氨酸具有可在产生库时增加复杂性的多个第一和第二位置。该诱变方法在Yansura等人,(1992)METHODS:A Companion to Methods in Enzymol.4:151-158中详细描述。
优选地，为其中每个顺反子产生一组具有一定范围的TIR强度的载体。该有限组提供了每条链的表达水平的比较，以及在多种TIR强度组合下所需蛋白质产物的收率。TIR强度可以通过定量报告基因的表达水平来确定，如Simmons等人，美国专利No.5,840,523中详细描述。根据翻译强度比较，选择所需的单个TIR，以在本申请的表达载体构建体中组合。
b)原核宿主细胞。
适用于表达本申请的抗体的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物。有用的细菌的实例包括埃希氏菌属(Escherichia)(例如，大肠埃希氏菌)、芽孢杆菌属(Bacilli)(例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)物种(例如，绿脓假单胞菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘质沙雷菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。在一些实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一些实施方案中，将大肠埃希氏菌细胞用作本发明的宿主。大肠埃希氏菌菌株的实例包括W3110株(Bachmann,Cellular and Molecular Biology,第2卷(Washington,D.C.:American Society for Microbiology,1987),第1190-1219页；ATCC保藏No.27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 AfhuA (AtonA)ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE)degP41 kanR的33D3株(美国专利No.5,639,635)。其他菌株及其衍生物，诸如大肠埃希氏菌294(ATCC 31,446)、大肠埃希氏菌B、大肠埃希氏菌1776(ATCC 31,537)和大肠埃希氏菌RV308(ATCC 31,608)也是合适的。这些实例是示例性的而非限制性的。用于构建具有确定基因型的任何上述细菌的衍生物的方法是本领域已知的，并且在例如Bass等人,Proteins,8:309-314(1990)中有所描述。通常有必要考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适当的细菌。例如，当使用熟知的质粒(诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410)提供复制子时，大肠埃希氏菌、沙雷菌属(Serratia)或沙门氏菌属(Salmonella)物种可以适当地用作宿主。
通常，宿主细胞应分泌最小量的蛋白水解酶，并且可以理想地将另外的蛋白酶抑制剂加入细胞培养物。
c)蛋白质产生
用上述表达载体转化宿主细胞，并在常规营养培养基中培养，该培养基适当改良，以用于诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因。转化意味着将DNA引入原核宿主，使得DNA可作为染色体外元件或通过染色体整合体复制。根据所用的宿主细胞，使用适合于此类细胞的标准技术进行转化。利用氯化钙的钙处理通常用于含有实质上细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法利用聚乙二醇/DMSO。所用的另一种技术是电穿孔。
用于产生本申请的抗体的原核细胞在本领域已知的培养基中生长，并且适合于所选的宿主细胞的培养。合适的培养基的实例包括luria肉汤(LB)加上必需营养补充剂。在一些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性地允许含有表达载体的原核细胞的生长。例如，将氨苄青霉素加入培养基，以使表达氨苄青霉素抗性基因的细胞生长。
除了碳、氮和无机磷酸盐来源之外的任何必需补充剂也可以以适当浓度包括在内，这些必需补充剂单独引入或作为与另一种补充剂或培养基(例如复合氮源)的混合物引入。任选地，培养基可以含有一种或多种选自由谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇组成的组的还原剂。
原核宿主细胞在合适的温度下培养。对于大肠埃希氏菌生长，例如，优选的温度范围为约20℃至约39℃、更优选地约25℃至约37℃、甚至更优选地约30℃。培养基的pH可以在约5至约9任何pH范围内，主要取决于宿主生物。对于大肠埃希氏菌，pH优选地为约6.8至约7.4，并且更优选地约7.0。
如果在本申请的表达载体中使用诱导型启动子，则在适于启动子活化的条件下诱导蛋白质表达。在本申请的一个方面，PhoA启动子用于控制多肽的转录。因此，转化的宿主细胞在磷酸盐限制培养基中培养以进行诱导。优选地，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基(参见例如，Simmons等人,J.Immunol.Methods(2002),263:133-147)。如本领域已知，根据所采用的载体构建体，可以使用多种其他诱导子。
本申请的表达抗体分泌至宿主细胞的周质并从周质回收。蛋白质回收通常涉及通常通过诸如渗透压休克、超声或裂解的手段来破坏微生物。一旦细胞被破坏，即可通过离心或过滤除去细胞碎片或全细胞。可以例如通过亲和树脂色谱法进一步纯化蛋白质。或者，可以将蛋白质转运到培养基中并在其中分离。可以从培养物中除去细胞，过滤和浓缩培养物上清液以进一步纯化所产生的蛋白质。所表达的多肽可以使用通常已知的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蛋白质印迹测定进一步分离和鉴定。
或者，蛋白质产生通过发酵过程大量进行。多种大规模分批发酵程序可用于产生重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选地约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧气和营养物，特别是葡萄糖(优选的碳/能源)。小规模发酵通常是指在体积容量不超过大约100升并且范围可为约1升至约100升的发酵罐中发酵。
在发酵过程期间，蛋白质表达的诱导通常在细胞在合适的条件下生长至所需密度，例如OD550为约180-220之后引发，在该阶段中细胞处于早期稳定期。如本领域已知和如上文所述，根据所采用的载体构建体，可以使用多种诱导子。在诱导之前可以使细胞生长一段较短的时间。虽然可以使用更长或更短的诱导时间，但是通常诱导细胞约12-50小时。
为了改善本申请的抗体的生产收率和质量，可以修改多种发酵条件。例如，为了改善分泌多肽的正确组装和折叠，可以使用过表达伴侣蛋白(诸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣蛋白活性的肽基脯氨酰顺反式异构酶))的另外载体共转化宿主原核细胞。已经证实伴侣蛋白有助于细菌宿主细胞中产生的异源蛋白的正确折叠和溶解。Chen等人,(1999)J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等人，美国专利No.6,083,715；Georgiou等人，美国专利No.6,027,888；Bothmann和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17106-17113；Arie等人,(2001)Mol.Microbiol.39:199-210。
为了使表达的异源蛋白(特别是对蛋白水解敏感的那些蛋白质)的蛋白水解最小化，可以将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可以修饰宿主细胞菌株以在编码已知细菌蛋白酶(诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合)的基因中实现一个或多个遗传突变。一些大肠埃希氏菌蛋白酶缺陷菌株是可用的，并且在例如Joly等人，(1998)，出处同上；Georgiou等人，美国专利No.5,264,365；Georgiou等人，美国专利No.5,508,192；Hara等人,Microbial Drug Resistance,2:63-72(1996)中有所描述。
蛋白水解酶缺陷的并且用过表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠埃希氏菌菌株可以用作编码本申请的抗体的表达系统中的宿主细胞。
d)蛋白质纯化
进一步纯化本文产生的抗体以获得基本上同质的用于进一步测定和使用的制剂。可采用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下程序是适当的纯化程序示例：在免疫亲和或离子交换柱上进行的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上或在阳离子交换树脂(诸如DEAE)上进行的色谱分析、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀以及使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
在一个方面，使用固定在固相上的蛋白A进行本申请的包含Fc区的抗体的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD细胞壁蛋白，它以高亲和力结合至抗体的Fc区。Lindmark等人,(1983)J.Immunol.Meth.62:1-13。蛋白A固定其上的固相为优选地包含玻璃或二氧化硅表面的柱，更优选地可控孔度玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中，柱已经涂覆试剂，诸如甘油，以试图防止污染物的非特异性粘附。然后洗涤固相以除去非特异性结合至固相的污染物。最后通过洗脱从固相回收所关注的抗体。
4.在真核细胞中重组产生
对于真核表达，载体组件通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因和增强子元件、启动子和转录终止序列。
a)信号序列组件
用于真核宿主的载体也可以是编码在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特异性切割位点的信号序列或其他多肽的插入物。所选的异源信号序列优选地为由宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)的序列。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列(例如单纯疱疹gD信号)是可用的。
这种前体区的DNA连接至编码本申请的抗体的DNA的阅读框内。
b)复制起点
一般而言，对于哺乳动物表达载体而言并不需要复制起点组件(通常仅使用SV40起点，因为其包含早期启动子)。
c)选择基因组件
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择性标记。典型的选择基因编码这样的蛋白质：其(a)赋予对抗生素或其他毒素，例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素的抗性，(b)补充营养缺陷，或(c)提供复合培养基中无法获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个实例利用药物来抑制宿主细胞的生长。那些用异源基因成功转化的细胞产生赋予耐药性的蛋白，因此在选择方案中存活。这种显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
用于哺乳动物细胞的合适选择性标记的另一个实例是能够鉴定处于摄取编码本申请的抗体的核酸的感受态细胞的那些选择性标记，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和金属硫蛋白-II(优选地灵长类动物金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等等。
例如，首先通过在含有氨甲喋呤(Mtx)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有转化子来鉴定DHFR选择基因转化的细胞。当采用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如，ATCC CRL-9096)。
或者，编码多肽、野生型DHFR蛋白和另一种选择性标记(诸如氨基糖苷3’-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是含有内源性DHFR的野生型宿主)可以通过使细胞在含有针对选择性标记诸如氨基糖苷类抗生素的选择剂(例如，卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中生长来选择。参见美国专利No.4,965,199。
d)启动子组件
表达和克隆载体通常含有由宿主生物识别并且可操作地连接至编码所需多肽序列的核酸的启动子。实际上，所有真核基因均具有位于转录起始的位点上游大约25个至30个碱基的富含AT的区域。在很多基因的转录起始位点上游70个至80个碱基处存在的另一个序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。大部分真核的3’末端是AATAAA序列，该序列可以是将多聚A尾加入编码序列的3’末端的信号。所有这些序列均可以插入真核表达载体。
适于与原核宿主一起使用的其他启动子包括phoA启动子、内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子(诸如tac启动子)。然而，其他已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将含有可操作地连接至编码抗体的DNA的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
例如通过启动子控制哺乳动物宿主细胞中从载体进行的多肽转录，该启动子获自病毒基因组(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒以及最优选地猿猴病毒40(SV40))、异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、热休克启动子，前提条件是这些启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子可以同样包含SV40病毒复制起点的SV40限制性片段的形式方便地获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子可以HindIII E限制性片段的形式方便地获得。使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统在美国专利No.4,419,446中有所公开。该系统的修改在美国专利No.4,601,978中有所描述。还可参见Reyes等人,Nature297:598-601(1982)关于人干扰素cDNA在单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下在小鼠细胞中表达。或者，可使用劳氏(Rous)肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
e)增强子元件组件
通常通过将增强子序列插入载体来增加高等真核生物对编码本申请的抗体的DNA的转录。目前已知很多增强子序列都来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎儿蛋白和胰岛素)。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括位于复制起点后侧的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点后侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子。还可参见Yaniv,Nature297:17-18(1982)关于活化真核启动子的增强元件。增强子可以剪接到载体的多肽编码序列的5'或3'位置，但优选地位于启动子的5'位点，
f)转录终止组件
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物的有核细胞)的表达载体还含有对转录终止和稳定mRNA而言必须的序列。此类序列通常可得自真核或病毒DNA或cDNA的5'(有时为3')非翻译区。这些区含有在编码多肽mRNA的非翻译部分中以多腺苷酸化片段转录的核苷酸区段。一种有用的转录终止组件是牛生长激素多腺苷酸化区。参见WO 94/11026和其中公开的表达载体。
g)宿主细胞的选择和转化
在本文的载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞包括本文所述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中繁殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(亚克隆为在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝瘤细胞系(HepG2)。
宿主细胞用上述用于抗体产生的表达或克隆载体转化，并在适当改良的用于诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。
h)培养宿主细胞
用于产生本申请的抗体的宿主细胞可以在多种培养基中培养。可商购获得的培养基(诸如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM)(Sigma))均适于培养宿主细胞。此外，Ham等人,Meth.Enz.58:44(1979)，Barnes等人,Anal.Biochem.102:255(1980)，美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985中描述的任何培养基均可用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任一种均可根据需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、氯化钙、氯化镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)，以及葡萄糖或等效能量来源。任何其他必需补充剂也可以本领域技术人员已知的适当浓度包括在内。培养条件(诸如温度、pH等等)是此前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员将是显而易见的。
i)蛋白质纯化
当使用重组技术时，抗体可以在细胞内，在周质空间中产生，或者直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，则作为第一步骤，例如通过离心或超滤除去的颗粒碎片，宿主细胞或裂解片段。Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了用于分离分泌到大肠埃希氏菌的周质空间的抗体的程序。简而言之，在存在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的情况下解冻细胞浆料约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。在抗体分泌到培养基的情况下，通常首先使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自此类表达系统的上清液。在前述任一步骤中均可包括蛋白酶抑制剂(诸如PMSF)以抑制蛋白水解，并且可包括抗生素以防止外来污染物生长。
从细胞制备的蛋白质组合物可以使用例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱纯化，其中亲和色谱是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化根据含有1、2或4条重链的人免疫球蛋白的抗体(Lindmark等人,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。对于所有小鼠同种型和人3，推荐蛋白G(Guss等人,EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体所连接的基质最常见的是琼脂糖，但其他基质也是可用的。机械稳定的基质(诸如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯基)苯)与琼脂糖相比，可实现更快的流速和更短的加工时间。在抗体包含CH3域的情况下，可使用Bakerbond ABXTMresin(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)进行纯化。根据待回收的抗体也可以使用其他蛋白质纯化技术(诸如在离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上进行的色谱、在肝素SEPHAROSETM上进行的色谱、在阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上进行的色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀)。
在任何一个或多个初步纯化步骤之后，包含所关注的抗体和污染物的混合物可以使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲剂进行低pH疏水相互作用色谱，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下进行。
免疫缀合物
在一些实施方案中，本申请还提供包含缀合至一种或多种细胞毒性剂，诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或它们的片段)或放射性同位素的本文所述的任何抗体(诸如sdAb)的免疫缀合物。
在一些实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合至一种或多种药物，包括但不限于美登素(参见美国专利No.5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0 425235B1)；奥瑞他汀，诸如单甲基奥瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利No.5,635,483和5,780,588和7,498,298)；海兔毒素；卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利No.5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人,Cancer Res.53:3336-3342(1993)；和Lode等人,Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类，诸如道诺霉素或阿霉素(参见Kratz等人,CurrentMed.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等人,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834(2000)；Dubowchik等人,Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002)；King等人,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；和美国专利No.6,630,579)；氨甲喋呤；长春地辛；紫杉烷，诸如多西他赛、紫杉醇、洛他赛、替司他赛和沃塔紫杉醇；单端孢霉烯；和CC1065。
在一些实施方案中，免疫缀合物包含缀合至酶促活性毒素或其片段的本文所述的抗体，所述毒素包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯。
在一些实施方案中，免疫缀合物包含缀合至放射性原子的本文所述的抗体，以形成放射性缀合物。多种放射性同位素均可用于产生放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁扫描研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
抗体和细胞毒性剂的缀合物可以使用多种双官能蛋白偶联剂制备，所述偶联剂诸如N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如己二亚胺二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯-2,6-二异氰酸酯)以及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可以如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)所述制备。碳-14标记的1-异硫氰酰苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合至抗体的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是有助于细胞毒性药物在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含有二硫键的接头(Chari等人,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
本文的免疫缀合物或ADC明确设想了但不限于使用交联试剂制备的这些缀合物，所述交联试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB，以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们可商购获得(例如，从Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
用于诊断和检测的方法和组合物
在一些实施方案中，本文提供的任何抗体(诸如sdAb)均可用于检测生物样品中BCMA的存在。本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品是血液、血清或其他生物来源的液体样品。在一些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。
在一些实施方案中，提供了用于诊断或检测方法的抗BCMA抗体(诸如本文所述的抗BCMA sdAb中的任一种)。在另一个方面，提供了检测生物样品中BCMA的存在的方法。在某些实施方案中，方法包括检测生物样品中BCMA蛋白的存在。在某些实施方案中，BCMA是人BCMA。在某些实施方案中，方法包括在允许抗BCMA抗体结合至BCMA的条件下使生物样品接触本文所述的抗BCMA抗体，以及检测抗BCMA抗体和BCMA之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一些实施方案中，抗BCMA抗体用于选择适合用抗BCMA抗体治疗的受试者，例如其中BCMA是用于选择患者的生物标记物。
在某些实施方案中，提供了标记的抗BCMA sdAb。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(诸如荧光标记、发色团标记、电子密度标记、化学发光标记和放射性标记)以及例如通过酶促反应或分子相互作用间接检测的部分，诸如酶或配体。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I；荧光团，诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰基、伞形酮；荧光素酶，例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利No.4,737,456)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶；糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶(诸如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶)组合的杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)；生物素/亲和素、自旋标记、噬菌体标记、稳定自由基等等。
III.嵌合抗原受体
本申请的一个方面提供包含胞外抗原结合域的嵌合抗原受体(CAR)，所述胞外抗原结合域包含一个或多个单域抗体(诸如VHH)。第II部分描述的抗BCMA sdAb中的任一者均可用于本文所述的CAR。CAR的示例性结构如图15A-15D所示。
在一些实施方案中，提供了包含多肽的靶向BCMA的CAR(本文也称为“BCMA CAR”)，所述多肽包含：(a)包含抗BCMA sdAb的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb是骆驼科动物、嵌合、人或人源化的。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含免疫效应细胞(诸如T细胞)的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导域来源于CD3ζ。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含共刺激信号传导域。在一些实施方案中，共刺激信号传导域来源于选自CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合的共刺激分子。在一些实施方案中，BCMA CAR还包含位于胞外抗原结合域的C-末端和跨膜域的N-末端之间的铰链域(诸如CD8α铰链域)。在一些实施方案中，BCMA CAR还包含位于多肽的N-末端的信号肽(诸如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，多肽从N-末端至C-末端包含：CD8α信号肽、胞外抗原结合域、CD8α铰链域、CD28跨膜域、来源于CD28的第一共刺激信号传导域、来源于CD137的第二共刺激信号传导域和来源于CD3ζ的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，多肽从N-末端至C-末端包含：CD8α信号肽、胞外抗原结合域、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、来源于CD137的共刺激信号传导域和来源于CD3ζ的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，BCMA CAR是单特异性的。在一些实施方案中，BCMA CAR是单价的。
在一些实施方案中，提供了包含多肽的BCMA CAR，所述多肽包含：(a)包含抗BCMAsdAb的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中抗BCMA sdAb包含以下中的任一者：(1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR3；(4)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:42的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR3；(5)包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR3；(6)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDR3；(7)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR3；(8)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的CDR3；(9)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3；(10)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的CDR3；(11)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的CDR3；(12)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:88的氨基酸序列的CDR3；(13)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:51的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的CDR3；(14)包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR3；(15)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的CDR3；(16)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3；(17)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的CDR3；(18)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR3；(19)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR3；(20)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR3；(21)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR3；(22)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR3；(23)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:99的氨基酸序列的CDR3；(24)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:62的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR3；(25)包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR3；(26)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR3；(27)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR3；(28)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR3；(29)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR3；(30)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR3；(31)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR3；(32)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR3；(33)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR3；(34)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR3；(35)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的CDR3；(36)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR3；(37)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3；或(38)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb是骆驼科动物、嵌合、人或人源化的。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb包含VHH域，所述VHH域包含选自由SEQ ID NO:115-152组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含免疫效应细胞(诸如T细胞)的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导域来源于CD3ζ。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含共刺激信号传导域。在一些实施方案中，共刺激信号传导域来源于选自由CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合组成的组的共刺激分子。在一些实施方案中，BCMA CAR还包含位于胞外抗原结合域的C-末端和跨膜域的N-末端之间的铰链域(诸如CD8α铰链域)。在一些实施方案中，BCMA CAR还包含位于多肽的N-末端的信号肽(诸如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，多肽从N-末端至C-末端包含：CD8α信号肽、胞外抗原结合域、CD8α铰链域、CD28跨膜域、来源于CD28的第一共刺激信号传导域、来源于CD137的第二共刺激信号传导域和来源于CD3ζ的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，多肽从N-末端至C-末端包含：CD8α信号肽、胞外抗原结合域、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、来源于CD137的共刺激信号传导域和来源于CD3ζ的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，BCMA CAR是单特异性的。在一些实施方案中，BCMA CAR是单价的。
在一些实施方案中，提供了包含与选自由SEQ ID NO:216-256和298-335的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％组成的组中的任一者的序列同一性的多肽的BCMA CAR。在一些实施方案中，提供了包含选自由SEQ ID NO:216-256和298-335组成的组的氨基酸序列的BCMACAR。还提供了包含选自由SEQ ID NO:216-256和298-335组成的组的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，提供了编码本文提供的BCMA CAR中的任一者的经分离的核酸。在一些实施方案中，提供了与选自由SEQ ID NO:257-297和336-373组成的组的核酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一者的序列同一性的经分离的核酸。在一些实施方案中，提供了包含选自由SEQ ID NO:257-297和336-373组成的组的核酸序列的经分离的核酸。在一些实施方案中，经分离的核酸是DNA。在一些实施方案中，经分离的核酸是RNA。在一些实施方案中，提供了包含编码上述BCMA CAR的核酸中的任一者的载体。在一些实施方案中，载体是表达载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体，诸如慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是非病毒载体。示例性单价BCMA CAR如下表4所示。
表4.示例性单价BCMA CAR。
Figure BDA0003066909480000511
Figure BDA0003066909480000521
Figure BDA0003066909480000531
多价嵌合抗原受体
本申请还提供具有两个或更多个(诸如约2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性结合至抗原(诸如BCMA)的结合部分的多价CAR。在一些实施方案中，结合部分中的一个或多个是抗原结合片段。在一些实施方案中，结合部分中的一个或多个包含单域抗体。在一些实施方案中，结合部分中的一个或多个来源于骆驼科动物抗体。在一些实施方案中，结合部分中的一个或多个来源于四链抗体。在一些实施方案中，结合部分中的一个或多个是scFv。在一些实施方案中，结合部分中的一个或多个来源于人抗体。在一些实施方案中，结合部分中的一个或多个是特异性结合至抗原的多肽配体或其他非抗体多肽。在一些实施方案中，多价CAR是单特异性的，即多价CAR靶向单个抗原，并且包含两个或更多个单个抗原的结合位点。在一些实施方案中，多价CAR是多特异性的，即多价CAR靶向超过一个抗原，并且多价CAR包含两个或更多个至少一个抗原的结合位点。对相同抗原具有特异性的结合部分可结合至抗原的相同表位(即，“单表位CAR”)或结合抗原的不同表位(即，“多表位CAR”，诸如双表位CAR或三表位CAR)。对相同抗原具有特异性的结合位点可包含相同的或不同的sdAb。
在一些实施方案中，本申请提供包含多肽的多价(诸如二价、三价或更高的化合价数)嵌合抗原受体，所述多肽包含：(a)包含多个(诸如至少约2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性结合至抗原(诸如肿瘤抗原)的结合部分的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域。在一些实施方案中，抗原选自由CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77组成的组。
在一些实施方案中，本申请提供包含多肽的多价(诸如二价、三价或更高的化合价数)嵌合抗原受体，所述多肽包含：(a)包含多个(诸如至少约2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性结合至抗原(诸如肿瘤抗原)的单域抗体(sdAb)的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域。在一些实施方案中，抗原选自由CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、MAGEA3和糖脂F77组成的组。
在一些实施方案中，本申请提供包含多肽的多价(诸如二价、三价或更高的化合价数)嵌合抗原受体，所述多肽包含：(a)包含特异性结合至抗原(诸如肿瘤抗原)的第一表位的第一结合部分的胞外抗原结合域，和特异性结合至抗原的第二表位的第二结合部分；(b)跨膜域；和c)胞内信号传导域，其中第一表位和第二表位是不同的。在一些实施方案中，抗原选自由CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77组成的组。在一些实施方案中，第一结合部分是sdAb，并且第二结合部分来源于人抗体(例如，scFv)。在一些实施方案中，第一结合部分是sdAb，并且第二结合部分是多肽配体。在一些实施方案中，第一表位与第二表位相同。在一些实施方案中，第一表位与第二表位不同。在一些实施方案中，多价CAR特异性结合至抗原上的两个不同表位。在一些实施方案中，多价CAR特异性结合至抗原上的三个或更多个不同表位。
在一些实施方案中，本申请提供包含多肽的多价(诸如二价、三价或更高的化合价数)嵌合抗原受体，所述多肽包含：(a)包含特异性结合至抗原(诸如肿瘤抗原)的第一表位的第一sdAb，和特异性结合至抗原的第二表位的第二sdAb的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一表位和第二表位是不同的。在一些实施方案中，抗原选自由CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77组成的组。
在一些实施方案中，结合部分，诸如sdAb(包括多个sdAb，或第一sdAb和/或第二sdAb)是骆驼科动物、嵌合、人或人源化的。在一些实施方案中，结合部分或sdAb通过肽键或肽接头彼此融合。在一些实施方案中，每个肽接头的长度不超过约50个(诸如不超过约35个、25个、20个、15个、10个或5个中的任一者)氨基酸。在一些实施方案中，跨膜域选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含免疫效应细胞(诸如T细胞)的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导域来源于CD3 。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含共刺激信号传导域。在一些实施方案中，共刺激信号传导域来源于选自由CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合组成的组的共刺激分子。在一些实施方案中，多价CAR还包含位于胞外抗原结合域的C-末端和跨膜域的N-末端之间的铰链域(诸如CD8铰链域)。在一些实施方案中，多价CAR还包含位于多肽的N-末端的信号肽(诸如CD8信号肽)。在一些实施方案中，多肽从N-末端至C-末端包含：CD8信号肽、胞外抗原结合域、CD8铰链域、CD8 跨膜域、来源于CD137的共刺激信号传导域和来源于CD3ξ的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，多价CAR是单特异性的。在一些实施方案中，多价CAR是多特异性的，诸如双特异性。
本文所述的多价CAR可特别适合于通过不同的抗原结合位点经由协同结合来靶向多聚体抗原，或适用于增强对抗原的结合亲和力或亲合力。本文所述的任何抗BCMA sdAb可用于本文所述的多价CAR的胞外抗原结合域。表5示出了示例性多价BCMA CAR、示例性序列、构建体及其载体的列表。
在一些实施方案中，提供了包含以下组件的多价CAR靶向性BCMA：(a)包含多个(诸如至少约2个、3个、4个或更多个中的任一者)BCMA结合部分(例如，抗BCMA sdAb)的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域。任何抗BCMAsdAb均可用于构建多价BCMACAR。在一些实施方案中，胞外抗原结合域特异性结合至BCMA的单个表位，并且这些CAR在本文中称为单表位多价BCMA CAR。
在一些实施方案中，提供了包含以下组件的多价BCMA CAR：(a)包含多个(诸如至少约2个、3个、4个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、包含SEQID NO:39的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供了包含以下组件的多价BCMA CAR(本文也称为“多表位多价CAR”)：(a)包含至少两个(诸如2个、3个、4个或更多个中的任一者)BCMA结合部分的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中至少两个BCMA结合部分特异性结合至BCMA上的至少两个不同表位。在一些实施方案中，胞外抗原结合域包含第一BCMA结合部分和第二BCMA结合部分。在一些实施方案中，第一BCMA结合部分是抗BCMA sdAb，并且第二BCMA结合部分来源于人抗体(例如，scFv)。在一些实施方案中，第一BCMA结合部分是sdAb，第二BCMA结合部分是BCMA多肽配体。在一些实施方案中，第一抗BCMA结合部分和/或第二BCMA结合部分特异性结合至来源于选自SEQ ID NO:388-394的氨基酸序列的BCMA上的表位。在一些实施方案中，第一BCMA结合部分特异性结合至来源于SEQ ID NO:389和/或390的表位。在一些实施方案中，第二BCMA结合部分特异性结合至来源于SEQ ID NO:391和/或392的表位。
在一些实施方案中，提供了包含以下组件的多价BCMA CAR：(a)包含第一抗BCMAsdAb和第二抗BCMA sdAb的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一抗BCMA sdAb和第二抗BCMA sdAb特异性结合至BCMA上的不同表位。任何抗BCMA sdAb均可用于构建多价BCMA CAR。在一些实施方案中，第一抗BCMA sdAb和/或第二抗BCMA sdAb特异性结合至来源于选自SEQ ID NO:388-394的氨基酸序列的BCMA上的表位。在一些实施方案中，第一抗BCMA sdAb特异性结合至来源于SEQ ID NO:389和/或390的表位。在一些实施方案中，第二抗BCMA sdAb特异性结合至来源于SEQ ID NO:391和/或392的表位。
在一些实施方案中，提供了包含以下组件的多价BCMA CAR：(a)包含第一抗BCMAsdAb和第二抗BCMA sdAb的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR3；并且其中第二抗BCMA sdAb包括包含SEQID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，第一抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的VHH域。在一些实施方案中，第二抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的VHH域。在一些实施方案中，第一抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的VHH域。在一些实施方案中，第二抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的VHH域。
在一些实施方案中，提供了包含以下组件的多价BCMA CAR：(a)包含第一抗BCMAsdAb和第二抗BCMA sdAb的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的CDR3；并且其中抗BCMA sdAb包括包含SEQID NO:11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，第一抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的VHH域。在一些实施方案中，第二抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的VHH域。
在一些实施方案中，提供了包含以下组件的多价BCMA CAR：(a)包含第一抗BCMAsdAb和第二抗BCMAsdAb的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR3；并且其中抗BCMA sdAb包括包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，第一抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的VHH域。在一些实施方案中，第二抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的VHH域。
在一些实施方案中，提供了包含以下组件的多价BCMA CAR：(a)包含第一抗BCMAsdAb和第二抗BCMA sdAb的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的CDR3；并且其中抗BCMA sdAb包括包含SEQID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，第一抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的VHH域。在一些实施方案中，第二抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的VHH域。
在一些实施方案中，提供了包含以下组件的多价BCMA CAR：(a)包含第一抗BCMAsdAb和第二抗BCMA sdAb的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR3；并且其中抗BCMA sdAb包括包含SEQID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，第一抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的VHH域。在一些实施方案中，第二抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VHH域。
在一些实施方案中，提供了包含以下组件的多价BCMA CAR：(a)包含第一抗BCMAsdAb和第二抗BCMA sdAb的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR3；并且其中抗BCMAsdAb包括包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，第一抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VHH域。在一些实施方案中，第二抗BCMA sdAb包括包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的VHH域。
在一些实施方案中，第一BCMA结合部分(例如，第一抗BCMA sdAb)位于第二BCMA结合部分(例如，第二抗BCMA sdAb)的N-末端。在一些实施方案中，第一BCMA结合部分(例如，第一抗BCMA sdAb)位于第二BCMA结合部分(例如，第二抗BCMA sdAb)的C-末端。在一些实施方案中，第一BCMA结合部分(例如，第一抗BCMA sdAb)和第二BCMA结合部分(例如，第二抗BCMA sdAb)通过肽键或肽接头彼此融合。在一些实施方案中，肽接头的长度不超过约50个(诸如不超过约35个、25个、20个、15个、10个或5个中的任一者)氨基酸。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含免疫效应细胞(诸如T细胞)的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导域来源于CD3ξ。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含共刺激信号传导域。在一些实施方案中，共刺激信号传导域来源于选自由CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合组成的组的共刺激分子。在一些实施方案中，多价BCMA CAR还包含位于胞外抗原结合域的C-末端和跨膜域的N-末端之间的铰链域(诸如CD8α铰链域)。在一些实施方案中，多价BCMA CAR还包含位于多肽的N-末端的信号肽(诸如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，多肽从N-末端至C-末端包含：CD8α信号肽、胞外抗原结合域、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、来源于CD137的共刺激信号传导域和来源于CD3ξ的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，多价BCMA CAR是双特异性的。在一些实施方案中，多价BCMA CAR是三价的。在一些实施方案中，多价BCMA CAR特异性结合至BCMA上的两个不同表位。在一些实施方案中，多价BCMA CAR特异性结合至BCMA上的三个或更多个不同表位。
在一些实施方案中，提供了包含与选自由SEQ ID NO:298-335组成的组的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一者的序列同一性的多肽的多价BCMA CAR。在一些实施方案中，提供了包含选自由SEQ ID NO:298-335组成的组的氨基酸序列的多价BCMA CAR。还提供了包含选自由SEQ ID NO:298-335组成的组的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，提供了编码本文提供的多价BCMA CAR中的任一者的经分离的核酸。在一些实施方案中，提供了与选自由SEQ ID NO:336-373组成的组的核酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一者的序列同一性的经分离的核酸。在一些实施方案中，提供了包含选自由SEQ ID NO:336-373组成的组的核酸序列的经分离的核酸。在一些实施方案中，经分离的核酸是DNA。在一些实施方案中，经分离的核酸是RNA。在一些实施方案中，提供了包含编码上述多价BCMA CAR的核酸中的任一者的载体。在一些实施方案中，载体是表达载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体，诸如慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是非病毒载体。示例性多价BCMA CAR如下表5所示。
表5.示例性多价BCMA CAR。
Figure BDA0003066909480000571
Figure BDA0003066909480000581
Figure BDA0003066909480000591
多特异性嵌合抗原受体
本申请还提供靶向两个或更多个(诸如约2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)不同抗原的多特异性嵌合抗原受体。在一些实施方案中，多特异性CAR具有针对每个抗原的一个抗原结合位点。在一些实施方案中，多特异性CAR具有针对至少一个抗原的超过两个结合位点。每个抗原结合位点可包含sdAb。例如，在一些实施方案中，多特异性CAR是包含含有两个不同的sdAb的胞外抗原结合域的双特异性CAR，每个sdAb均特异性结合至抗原。在一些实施方案中，多特异性CAR是包含含有三个不同的sdAb的胞外抗原结合域的三特异性CAR，每个sdAb均特异性结合至抗原。
在一些实施方案中，提供了包含多肽的多特异性(诸如双特异性)嵌合抗原受体(CAR)，所述多肽包含：(a)包含特异性结合至BCMA的第一单域抗体(sdAb)和特异性结合至第二抗原(诸如肿瘤抗原)的第二单域抗体(sdAb)的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一抗原与第二抗原不同。在一些实施方案中，第二抗原选自由CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77组成的组。在一些实施方案中，第一sdAb和/或第二sdAb是骆驼科动物、嵌合、人或人源化的。在一些实施方案中，第一sdAb和第二sdAb通过肽键或肽接头彼此融合。在一些实施方案中，肽接头的长度不超过约50个(诸如不超过约35个、25个、20个、15个、10个或5个中的任一者)氨基酸。在一些实施方案中，跨膜域选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含免疫效应细胞(诸如T细胞)的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导域来源于CD3。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含共刺激信号传导域。在一些实施方案中，共刺激信号传导域来源于选自由CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合组成的组的共刺激分子。在一些实施方案中，多特异性CAR还包含位于胞外抗原结合域的C-末端和跨膜域的N-末端之间的铰链域(诸如CD8α铰链域)。在一些实施方案中，多特异性CAR还包含位于多肽的N-末端的信号肽(诸如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，多肽从N-末端至C-末端包含：CD8α信号肽、胞外抗原结合域、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、来源于CD137的共刺激信号传导域和来源于CD3的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，多肽从N-末端至C-末端包含：CD8α信号肽、胞外抗原结合域、CD8α铰链域、CD28跨膜域、来源于CD28的共刺激信号传导域和来源于CD3的主要胞内信号传导域。
胞外抗原结合域
本文所述的CAR的胞外抗原结合域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)结合部分，诸如sdAb。在一些实施方案中，一个或多个结合部分是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，一个或多个结合部分来源于四链抗体。在一些实施方案中，一个或多个结合部分来源于骆驼科动物抗体。在一些实施方案中，一个或多个结合部分来源于人抗体。在一些实施方案中，一个或多个结合部分是结合抗原的非抗体结合蛋白，诸如多肽配体或经工程化的蛋白。结合部分可以通过肽键或通过肽接头直接彼此融合。
1.单域抗体
在一些实施方案中，CAR包含胞外抗原结合域，所述胞外抗原结合域包含一个或多个sdAb。sdAb可以具有相同的或不同的来源，具有相同的或不同的大小。示例性sdAb包括但不限于来自仅重链抗体的重链可变域(例如，VHH或VNAR)、天然缺乏轻链的结合分子、来源于常规4链抗体的单域(诸如VH或VL)、人源化仅重链抗体、由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人sdAb以及除来源于抗体之外的经工程化的域和单域支架。本领域已知的或本发明人开发的任何sdAb，包括本申请的第II部分所述的sdAb，均可用于构建本文所述的CAR。sdAb可以来源于任何物种，包括但不限于小鼠、大鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。本文设想的单域抗体还包括除骆驼科(Camelidae)和鲨鱼之外的物种的天然存在的sdAb分子。
在一些实施方案中，sdAb来源于天然存在的单域抗原结合分子，这种分子称为缺乏轻链的重链抗体(本文也称为“仅重链抗体”)。此类单域分子在例如WO 94/04678和Hamers-Casterman,C.等人(1993)Nature 363:446-448中有所公开。为清晰起见，来源于天然缺乏轻链的重链分子可变域在本文中称为VHH，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区别。这种VHH分子可以来源于骆驼科物种(例如，骆驼、美洲驼、骆马、单峰骆驼、羊驼和原驼)产生的抗体。除骆驼科之外的其他物种可以产生天然缺乏轻链的重链分子，并且这些VHH在本申请的范围内。
骆驼科动物的VHH分子比IgG分子小约10倍。它们是单一多肽，并且可以非常稳定，耐受极端的pH和温度条件。此外，它们可以耐受蛋白酶的作用，而常规4链抗体则不能。此外，VHH的体外表达产生高收率，正确折叠的功能性VHH。此外，通过使用抗体文库或通过除骆驼科动物之外的哺乳动物的免疫接种，骆驼科动物产生的抗体可以识别除体外产生的抗体所识别的那些之外的表位(参见，例如WO9749805)。因此，包含一个或多个VHH域的多特异性或多价CAR与靶标的相互作用可以比包含来源于常规4链抗体的抗原结合片段的多特异性或多价CAR更有效。由于已知VHH结合“非常规”表位，诸如腔或槽，包含这些VHH的CAR的亲和力可以比常规多特异性多肽更适用于治疗性处理。
在一些实施方案中，sdAb来源于软骨鱼中存在的免疫球蛋白的可变区。例如，sdAb可以来源于鲨鱼的血清中存在的免疫球蛋白同种型，这种同种型称为新型抗原受体(NAR)。产生来源于NAR的可变区的单域分子(“IgNAR”)的方法在WO 03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.14:2901-2909中有所描述。
在一些实施方案中，sdAb是重组、CDR移植、人源化、骆驼源化、去免疫和/或体外产生的(例如，通过噬菌体展示选择的)。在一些实施方案中，框架区的氨基酸序列可以通过框架区中特定氨基酸残基的“骆驼源化”来改变。骆驼源化是指常规4链抗体的(天然存在的)VH域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基被重链抗体的VHH域中的一个或多个对应位置处存在的一个或多个氨基酸残基替换或取代。这可以以本身已知的方式执行，这种方式对于技术人员来说是清楚的，例如根据本文的进一步描述。这些“骆驼源化”取代优选地插入如本文所定义的VH-VL界面处，和/或所谓的骆驼科标志残基处形成和/或存在的氨基酸位置(参见例如WO 94/04678，Davies和Riechmann FEBS Letters 339:285-290,1994；Davies和Riechmann Protein Engineering 9(6):531-537,1996；Riechmann J.Mol.Biol.259:957-969,1996；和Riechmann和Muyldermans J.Immunol.Meth.231:25-38,1999)。
在一些实施方案中，sdAb是表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人sdAb。参见例如US20090307787A1、美国专利No.8,754,287、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794。在一些实施方案中，sdAb是亲和力成熟的。
在一些实施方案中，针对特定抗原或靶标的天然存在的VHH域可以从骆驼科动物VHH序列的(未暴露或免疫)文库获得。这些方法可以涉及或可以不涉及使用一种或多种本身已知的筛选技术，使用所述抗原或靶标或它们的至少一个部分、片段、抗原决定簇或表位来筛选这种文库。这些文库和技术例如在WO 99/37681、WO 01/90190、WO 03/025020和WO03/035694中有所描述。或者，可以使用来源于(未暴露或免疫)VHH文库的改善的合成或半合成文库，诸如通过技术(诸如随机诱变和/或CDR改组)从(未暴露或免疫)VHH文库获得的VHH文库，如例如WO 00/43507所述。
在一些实施方案中，sdAb从常规四链抗体产生。参见例如，EP 0 368 684，Ward等人(Nature，1989年10月12日；341(6242):544-6)，Holt等人,Trends Biotechnol.,2003,21(11):484-490；WO 06/030220；和WO 06/003388。
2.抗原
本申请的CAR靶向的一种或多种抗原是细胞表面分子。可以选择结合部分(诸如sdAb)以识别用作与特殊疾病状态相关的靶标细胞上的细胞表面标记物的抗原。在一些实施方案中，抗原(诸如第一抗原和/或第二抗原)是肿瘤抗原。在一些实施方案中，多特异性CAR靶向两个或更多个肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原与B细胞恶性肿瘤相关。肿瘤表达可以作为免疫响应(特别是T细胞介导的免疫响应)的靶标抗原的许多蛋白质。CAR靶向的抗原可以是单个疾病细胞上的抗原或在不同细胞上表达的抗原，这些不同细胞的每个都有助于疾病。CAR靶向的抗原可以直接或间接参与疾病。
肿瘤抗原是可以引发免疫响应(特别是T细胞介导的免疫响应)的肿瘤细胞产生的蛋白质。本发明的靶向抗原的选择将取决于待治疗的特定类型的癌症。示例性肿瘤抗原包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠道羧基酯酶、突变型hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、HER2/neu、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一些实施方案中，肿瘤抗原包含恶性肿瘤相关的一个或多个抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达可以作为免疫攻击的靶标抗原的许多蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，诸如黑素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和gp100以及前列腺癌症中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其他靶标分子属于转化相关分子组(诸如癌基因HER2/Neu/ErbB-2)。另一组靶标抗原是癌胚抗原(诸如癌胚抗原(CEA))。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成个别肿瘤独特的真实肿瘤特异性免疫球蛋白抗原。B细胞分化抗原(诸如CD19、CD20和CD37)是B细胞淋巴瘤中靶标抗原的其他候选物。
在一些实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA是肿瘤细胞独特的，并且不出现在体内的其他细胞上。TAA相关抗原不是肿瘤细胞独特的，相反在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下，也在正常细胞上表达。肿瘤上抗原的表达可以在允许免疫系统对抗原产生响应的条件下发生。当免疫系统不成熟，不能产生响应时，TAA可以是胎儿发育期间正常细胞上表达的抗原，或它们可以是通常以极低水平存在于正常细胞上，但以极高水平在肿瘤细胞上表达的抗原。
TSA或TAA抗原的非限制性实例包括：分化抗原，诸如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原，诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；过表达胚胎抗原，诸如CEA；过表达癌基因和突变肿瘤抑制基因，诸如p53、Ras、HER2/neu；染色体易位产生的独特肿瘤抗原，诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，诸如爱泼斯坦-巴尔(Epstein Barr)病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大型基于蛋白质的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
在一些实施方案中，抗原(诸如第一抗原和/或第二抗原)选自由CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77组成的组。
3.肽接头
本文所述的多特异性或多价CAR中的多个结合部分(诸如sdAb)可以通过肽接头彼此融合。在一些实施方案中，结合部分(诸如sdAb)在不存在任何肽接头的情况下直接彼此融合。连接不同结合部分(诸如sdAb)的肽接头可以是相同的或不同的。CAR的不同域也可以通过肽接头彼此融合。
根据sdAb和/或多个域的结构和/或功能特征，CAR中的每个肽接头可以具有相同的或不同的长度和/或序列。可以独立地选择和优化每个肽接头。CAR所用的一个或多个肽接头的长度、柔性程度和/或其他性质可以对性质(包括但不限于对一个或多个特定抗原或表位的亲和力、特异性或亲合力)具有一些影响。例如，可以选择更长的肽接头，以确保两个邻近域不在空间上互相干扰。例如，在包含针对多聚体抗原的sdAb的本申请的多价或多特异性CAR中，肽接头的长度和柔性优选地使其允许多价CAR中的每个sdAb结合多聚体的每个亚基上的抗原决定簇。在一些实施方案中，短肽接头可以布置在CAR的跨膜域和胞内信号传导域之间。在一些实施方案中，肽接头包含柔性残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)，使得邻近域彼此相对自由移动。例如，甘氨酸-丝氨酸双联体可以是合适的肽接头。
肽接头可以具有任何合适的长度。在一些实施方案中，肽接头的长度为至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、75个、100个或更多中的任一者的氨基酸。在一些实施方案中，肽接头的长度不超过约100个、75个、50个、40个、35个、30个、25个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或更少中的任一者的氨基酸。在一些实施方案中，肽接头的长度为约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、或约1个氨基酸至约100个氨基酸中的任一者。
肽接头可以具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，来源于仅重链抗体的铰链区的序列均可用作接头。参见例如WO1996/34103。在一些实施方案中，肽接头是柔性接头。示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n和(GGGGS)n，其中n是最小为一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及本领域已知的其他柔性接头。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO:208)、(GGGGS)2(SEQ ID NO:209)、(GGGS)4(SEQ ID NO:210)、GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGS(SEQ ID NO:211)、GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:212)、(GGGGS)3(SEQ ID NO:213)、(GGGGS)4(SEQ ID NO:214)或(GGGGS)3(SEQID NO:215)。
跨膜域
本申请的CAR包含可以直接或间接融合至胞外抗原结合域的跨膜域。跨膜域可以来源于天然或合成来源。如本文所用，“跨膜域”是指在细胞膜(优选地真核细胞膜)中热力学稳定的任何蛋白质结构。适用于本文所述的CAR的跨膜域可以从天然存在的蛋白质获得。或者，它可以是合成的非天然存在的蛋白质区段，例如在细胞膜中热力学稳定的疏水性蛋白质区段。
根据跨膜域的三维结构对跨膜域分类。例如，跨膜域可以形成α螺旋、多于一个α螺旋的复合物、β-桶或能够淘选细胞的磷脂双层的任何其他稳定结构。此外，跨膜域也可以或者根据跨膜域拓扑结构(包括跨膜域跨越膜的次数和蛋白质的取向)分类。例如，单次跨膜蛋白跨越细胞膜一次，多次跨膜蛋白跨越细胞膜至少两次(例如2次、3次、4次、5次、6次、7次或更多次)。根据末端的拓扑结构和相对于细胞内侧和外侧的一个或多个跨膜区段，可以将膜蛋白定义为I型、II型或III型。I型膜蛋白具有单次跨膜区，并且其取向使得蛋白质的N-末端存在于细胞的脂双层的胞外侧，蛋白质的C-末端存在于胞质侧。II型膜蛋白也具有单次跨膜区，但其取向使得蛋白质的C-末端存在于细胞的脂双层的胞外侧，蛋白质的N-末端存在于胞质侧。III型膜蛋白具有多次跨膜区段，并且可以根据跨膜区段的数量以及N-末端和C-末端的位置进一步细分。
在一些实施方案中，本文所述的CAR的跨膜域来源于I型单次跨膜蛋白。在一些实施方案中，多次跨膜蛋白的跨膜域也可适用于本文所述的CAR。多次跨膜蛋白可以包含复合(至少2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个)α螺旋或β折叠结构。优选地，多次跨膜蛋白的N-末端和C-末端存在于脂双层的相对侧，例如蛋白质的N-末端存在于脂双层的胞质侧，蛋白质的C-末端存在于胞外侧。
在一些实施方案中，CAR的跨膜域包含选自以下的跨膜域：T细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDl la、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Ra、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C的α、β或ζ链的跨膜域。在一些实施方案中，跨膜域来源于选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。
在一些实施方案中，跨膜域来源于CD28。在一些实施方案中，跨膜域是包含SEQ IDNO:194的氨基酸序列的CD28的跨膜域。在一些实施方案中，CD28的跨膜域由SEQ ID NO:203的核酸序列编码。
在一些实施方案中，跨膜域来源于CD8α。在一些实施方案中，跨膜域是包含SEQ IDNO:193的氨基酸序列的CD8α的跨膜域。在一些实施方案中，CD8的跨膜域由SEQ ID NO:202的核酸序列编码。
用于本文所述的CAR的跨膜域也可以包含合成的非天然存在的蛋白质区段的至少一部分。在一些实施方案中，跨膜域是合成的非天然存在的α螺旋或β折叠。在一些实施方案中，蛋白质区段具有至少大约20个氨基酸，例如至少18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个氨基酸。合成跨膜域的实例是本领域已知的，例如在美国专利No.7,052,906B1和PCT公开No.WO2000/032776A2中有所公开，这些专利的相关公开内容以引用的方式并入本文。
跨膜域可包含位于跨膜域的C-末端侧的跨膜区和胞质区。跨膜域的胞质区可包含三个或更多个氨基酸，并且在一些实施方案中，有助于脂双层中跨膜域的取向。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜域的跨膜区中。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜域的胞质区中。在一些实施方案中，跨膜域的胞质区包含带正电的氨基酸。在一些实施方案中，跨膜域的胞质区包含氨基酸精氨酸、丝氨酸和赖氨酸。
在一些实施方案中，跨膜域的跨膜区包含疏水性氨基酸残基。在一些实施方案中，CAR的跨膜域包含人工疏水性序列。例如，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸三联体可以存在于跨膜域的C-末端。在一些实施方案中，跨膜区包含大部分疏水性氨基酸残基，诸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或缬氨酸。在一些实施方案中，跨膜区是疏水性的。在一些实施方案中，跨膜区包含聚亮氨酸-丙氨酸序列。蛋白质或蛋白质区段的亲水性或疏水性或亲水特征可以通过本领域已知的任何方法(例如Kyte和Doolittle亲水性分析)来评估。
胞内信号传导域
本申请的CAR包含胞内信号传导域。胞内信号传导域负责表达CAR的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能的活化。术语“效应子功能”是指细胞的特殊功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞质信号传导域”是指转导效应子功能信号并且引导细胞执行特殊功能的蛋白质部分。虽然通常可以利用整个胞质信号传导域，但是在很多情况下，使用整个链是不必要的。就使用胞内信号传导域的截短部分而言，只要其转导效应子功能信号，就可以使用这种截短部分代替完整链。因此，术语胞质信号传导域意味着包括足以转导效应子功能信号的胞质信号传导域的任何截短部。
在一些实施方案中，胞内信号传导域包含免疫效应细胞的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，CAR包含基本上由免疫效应细胞的主要胞内信号传导域构成的胞内信号传导域。“主要胞内信号传导域”是指作用于以刺激方式诱导免疫效应子功能的胞质信号传导序列。在一些实施方案中，主要胞内信号传导域含有信号传导基序，称为免疫受体酪氨酸活化基序或ITAM。如本文所用，“ITAM”是通常存在于很多免疫细胞中表达的信号传导分子尾部的保守蛋白质基序。基序可包含两个相隔6-8个氨基酸的氨基酸序列YxxL/I的重复序列，其中每个x独立地为任何氨基酸，得到保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。信号传导分子内的ITAM对于细胞内信号转导是重要的，在信号传导分子的活化之后，所述信号转导至少部分由ITAM中酪氨酸残基的磷酸化介导。ITAM也可以作为参与信号传导通路的其他蛋白质的停泊位点而发挥功能。示例性的含有ITAM的主要胞质信号传导序列包括来源于CD3ζ、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。
在一些实施方案中，主要胞内信号传导域来源于CD3ζ。在一些实施方案中，胞内信号传导域由CD3ζ的胞质信号传导域组成。在一些实施方案中，主要胞内信号传导域是野生型CD3ζ的胞质信号传导域。在一些实施方案中，野生型CD3ζ的主要胞内信号传导域包含SEQID NO:197的氨基酸序列。在一些实施方案中，主要胞内信号传导域是含有一个或多个突变(诸如Q65K)的CD3ζ的胞质信号传导域的功能突变体。在一些实施方案中，突变型CD3ζ的主要胞内信号传导域包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列。在一些实施方案中，主要胞内信号传导域由SEQ ID NO:206或207的核酸序列编码。
共刺激信号传导域
除抗原特异性信号的刺激之外，很多免疫效应细胞还需要共刺激来促进细胞增殖、分化和存活，以及活化细胞的效应子功能。在一些实施方案中，CAR包含至少一个共刺激信号传导域。如本文所用，术语“共刺激信号传导域”是指介导细胞内信号转导以诱导免疫响应(诸如效应子功能)的蛋白质的至少一部分。本文所述的嵌合受体的共刺激信号传导域可以是来自共刺激蛋白质的胞质信号传导域，该胞质信号传导域转导信号并调节由免疫细胞(诸如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)介导的响应。“共刺激信号传导域”可以是共刺激分子的胞质部分。术语“共刺激分子”是指免疫细胞(诸如T细胞)上的同源结合伴侣，该同源结合伴侣与共刺激配体特异性结合，从而由免疫细胞介导共刺激响应，诸如但不限于增殖和存活。
在一些实施方案中，胞内信号传导域包含单个共刺激信号传导域。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含两个或更多个(诸如约2个、3个、4个或更多个中的任一者)共刺激信号传导域。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含两个或更多个相同的共刺激信号传导域，例如两个拷贝的CD28的共刺激信号传导域。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含两个或更多个来自不同的共刺激蛋白质(诸如任何两个或更多个本文所述的共刺激蛋白质)的共刺激信号传导域。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含主要胞内信号传导域(诸如CD3ζ的胞质信号传导域)和一个或多个共刺激信号传导域。在一些实施方案中，一个或多个共刺激信号传导域和主要胞内信号传导域(诸如CD3ζ的胞质信号传导域)通过任选的肽接头彼此融合。主要胞内信号传导域和一个或多个共刺激信号传导域可以以任何合适的顺序排列。在一些实施方案中，一个或多个共刺激信号传导域位于跨膜域和主要胞内信号传导域(诸如CD3ζ的胞质信号传导域)之间。多个共刺激信号传导域可以提供附加或协同刺激效应。
宿主细胞(例如，免疫细胞)中共刺激信号传导域的活化可诱导细胞增加或减少细胞因子的产生和分泌、噬菌性质、增殖、分化、存活和/或细胞毒性。任何共刺激分子的共刺激信号传导域均可适用于本文所述的CAR。根据多种因素选择一种或多种类型的共刺激信号传导域：诸如其中可表达效应分子的免疫效应细胞类型(例如，T细胞、NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)以及所需的免疫效应子功能(例如，ADCC效应)。用于CAR的共刺激信号传导域的实例可以是共刺激蛋白质的胞质信号传导域，包括但不限于B7/CD28家族成员(例如，B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC和PDCD6)；TNF超家族成员(例如，4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α和TNF RII/TNFRSF1B)；SLAM家族成员(例如，2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6和SLAM/CD150)；以及任何其他共刺激分子，诸如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和NKG2C。
在一些实施方案中，一个或多个共刺激信号传导域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、CD3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合至CD83的配体组成的组。
在一些实施方案中，本申请的CAR中的胞内信号传导域包含来源于CD28的共刺激信号传导域。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含CD3ζ的胞质信号传导域和CD28的共刺激信号传导域。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含含有SEQ ID NO:195的氨基酸序列的CD28的共刺激信号传导域。在一些实施方案中，CD28的共刺激信号传导域由SEQ IDNO:204的核酸序列编码。
在一些实施方案中，本申请的CAR中的胞内信号传导域包含来源于CD137(即，4-1BB)的共刺激信号传导域。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含CD3ζ的胞质信号传导域和CD137的共刺激信号传导域。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含含有SEQ ID NO:196的氨基酸序列的CD137的共刺激信号传导域。在一些实施方案中，CD137的共刺激信号传导域由SEQ ID NO:205的核酸序列编码。
在一些实施方案中，本申请的CAR中的胞内信号传导域包含CD28的共刺激信号传导域和CD137的共刺激信号传导域。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含CD3ζ的胞质信号传导域、CD28的共刺激信号传导域和CD137的共刺激信号传导域。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含多肽，所述多肽从N-末端至C-末端包含：CD28的共刺激信号传导域、CD137的共刺激信号传导域和CD3ζ的胞质信号传导域。在一些实施方案中，CD28的共刺激信号传导域包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD137的共刺激信号传导域包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列。
本文所述的任何共刺激信号传导域的变体也在本公开的范围内，使得共刺激信号传导域能够调节免疫细胞的免疫响应。在一些实施方案中，与野生型对应物相比，共刺激信号传导域包含最多10个氨基酸残基变异(例如，1个、2个、3个、4个、5个或8个)。此类包含一个或多个氨基酸变异的共刺激信号传导域可以称为变体。相对于不包含突变的共刺激信号传导域，共刺激信号传导域的氨基酸残基的突变可引起信号转导的增加和免疫响应刺激的增强。相对于不包含突变的共刺激信号传导域，共刺激信号传导域的氨基酸残基的突变可引起信号转导的减少和免疫响应刺激的减少。
铰链区
本申请的CAR可包含位于胞外抗原结合域和跨膜域之间的铰链域。铰链域是通常在蛋白质的两个域之间存在的氨基酸区段，并且可以允许蛋白质的柔性和一个或两个域的彼此相对运动。相对于效应分子的跨膜域，可以使用提供胞外抗原结合域的这种柔性和运动的任何氨基酸序列。
铰链域可以含有约10个-100个氨基酸，例如约15-75个氨基酸、20个-50个氨基酸或30个-60个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，铰链域的长度可以为至少约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个或75个氨基酸中的任一者。
在一些实施方案中，铰链域是天然存在的蛋白质的铰链域。本领域已知包含铰链域的任何蛋白质的铰链域对于在本文描述的嵌合受体中的使用是相容的。在一些实施方案中，铰链域是天然存在的蛋白质的铰链域的至少一部分并赋予嵌合受体柔性。在一些实施方案中，铰链域来源于CD8α。在一些实施方案中，铰链域是CD8α的铰链域的一部分，例如含有CD8α的铰链域的至少15个(例如，20个、25个、30个、35个或40个)连续氨基酸的片段。在一些实施方案中，CD8α的铰链域包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD8α的铰链域由SEQ ID NO:201的核酸序列编码。
抗体(诸如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体)的铰链域也适用于本文所述的pH依赖性嵌合受体系统。在一些实施方案中，铰链域是连接抗体的恒定域CH1和CH2的铰链域。在一些实施方案中，铰链域是抗体的并且包含抗体的铰链域和抗体的一个或多个恒定区。在一些实施方案中，铰链域包含抗体的铰链域和抗体的CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链域包含抗体的铰链域和抗体的CH2和CH3恒定区。在一些实施方案中，抗体是IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区以及CH2和CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区及CH3恒定区。
非天然存在的肽也可用作本文所述的嵌合受体的铰链域。在一些实施方案中，Fc受体的胞外配体结合域的C末端与跨膜域的N末端之间的铰链域是肽接头，诸如(GxS)n接头，其中x和n可以独立地为3和12之间的整数，包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更大。
信号肽
本申请的CAR可以包含多肽的N-末端处的信号肽(也称为信号序列)。一般而言，信号肽是使多肽靶向细胞中的所需部位的肽序列。在一些实施方案中，信号肽使效应分子靶向细胞的分泌通路，并且将允许效应分子整合和锚定至脂双层。信号肽对于本领域技术人员将是显而易见的，包括适用于本文所述的CAR天然存在的蛋白质的信号序列或合成的非天然存在的信号序列。在一些实施方案中，信号肽来源于选自由CD8α、GM-CSF受体α和IgG1重链组成的组的分子。在一些实施方案中，信号肽来源于CD8α。在一些实施方案中，CD8α的信号肽包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD8α的信号肽由SEQ ID NO:199或200的核酸序列编码。
IV.经工程化的免疫效应细胞
本申请还提供了包含本文所述的CAR中的任一者的宿主细胞(诸如免疫效应细胞)。
因此，在一些实施方案中，提供了包含含有多肽的多价CAR的经工程化的免疫效应细胞(诸如T细胞)，所述多肽包含：(a)包含特异性结合至BCMA的第一表位的第一BCMA结合部分，和特异性结合至BCMA的第二表位的第二BCMA结合部分的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一表位和第二表位是不同的。
在一些实施方案中，提供了包含含有多肽的多价CAR的经工程化的免疫效应细胞(诸如T细胞)，所述多肽包含：(a)包含特异性结合至BCMA的第一表位的第一抗BCMA sdAb，和特异性结合至BCMA的第二表位的第二抗BCMA sdAb的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一表位和第二表位是不同的。在一些实施方案中，第一抗BCMAsdAb和/或第二抗BCMA sdAb是骆驼科动物、嵌合、人或人源化的。在一些实施方案中，第一抗BCMA和第二抗BCMA通过肽键或肽接头彼此融合。在一些实施方案中，肽接头的长度不超过约50个(诸如不超过约35个、25个、20个、15个、10个或5个中的任一者)氨基酸。在一些实施方案中，跨膜域选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含免疫效应细胞(诸如T细胞)的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导域来源于CD3ζ。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含共刺激信号传导域。在一些实施方案中，共刺激信号传导域来源于选自由CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合组成的组的共刺激分子。在一些实施方案中，多价CAR还包含位于胞外抗原结合域的C-末端和跨膜域的N-末端之间的铰链域(诸如CD8α铰链域)。在一些实施方案中，多价CAR还包含位于多肽的N-末端的信号肽(诸如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，多肽从N-末端至C-末端包含：CD8α信号肽、胞外抗原结合域、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、来源于CD137的共刺激信号传导域和来源于CD3ζ的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞是T细胞、NK细胞、外周血单核细胞(PBMC)、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞是自体的。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞是同种异体的。
在一些实施方案中，提供了包含含有多肽的BCMA CAR的经工程化的免疫效应细胞(诸如T细胞)，所述多肽包含：(a)包含抗BCMA sdAb的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中抗BCMA sdAb包含以下中的任一者：(1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR3；(4)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列的CDR3；(5)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR3；(6)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDR3；(7)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR3；(8)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的CDR3；(9)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3；(10)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的CDR3；(11)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的CDR3；(12)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:50的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR3；(13)包含SEQID NO:13的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:89的氨基酸序列的CDR3；(14)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR3；(15)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的CDR3；(16)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3；(17)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的CDR3；(18)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR3；(19)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR3；(20)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR3；(21)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR3；(22)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR3；(23)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的CDR3；(24)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:100的氨基酸序列的CDR3；(25)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:63的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR3；(26)包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR3；(27)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR3；(28)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR3；(29)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR3；(30)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR3；(31)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR3；(32)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR3；(33)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR3；(34)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR3；(35)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的CDR3；(36)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR3；(37)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3；或(38)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，胞外抗原结合域包含至少两个抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb是骆驼科动物、嵌合、人或人源化的。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb包含VHH域，所述VHH域包含选自由SEQ ID NO:115-152组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含免疫效应细胞(诸如T细胞)的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导域来源于CD3ζ。在一些实施方案中，胞内信号传导域包含共刺激信号传导域。在一些实施方案中，共刺激信号传导域来源于选自由CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合组成的组的共刺激分子。在一些实施方案中，BCMA CAR还包含位于胞外抗原结合域的C-末端和跨膜域的N-末端之间的铰链域(诸如CD8α铰链域)。在一些实施方案中，BCMA CAR还包含位于多肽的N-末端的信号肽(诸如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，多肽从N-末端至C-末端包含：CD8α信号肽、胞外抗原结合域、CD8α铰链域、CD28跨膜域、来源于CD28的第一共刺激信号传导域、来源于CD137的第二共刺激信号传导域和来源于CD3ζ的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，多肽从N-末端至C-末端包含：CD8α信号肽、胞外抗原结合域、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、来源于CD137的共刺激信号传导域和来源于CD3ζ的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，BCMA CAR包含选自由SEQ ID NO:216-256、298-335组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞是T细胞、NK细胞、外周血单核细胞(PBMC)、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞是自体的。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞是同种异体的。
还提供了包含(或表达)两种或更多种不同的CAR的经工程化的免疫效应细胞。本文所述的任何两个或更多个CAR可以组合表达。CAR可以靶向不同的抗原，从而提供协同或附加效应。由于CAR的胞外抗原结合域中的单域抗体仅具有单个抗原可变链(诸如重链)，此类表达CAR的细胞不具有可变链错配问题，如在共表达两个或更多个基于scFv的CAR的经工程化的免疫效应细胞所观察。共表达两个基于VHH的CAR的示例性经工程化的免疫效应细胞如图15E所示。本领域的技术人员将认识到，本文所述的根据其他sdAb或具有其他结构的CAR也可以在经工程化的免疫效应细胞中共表达。两个或更多个CAR可以在相同的载体或不同的载体上编码。
经工程化的免疫效应细胞也可以表达一种或多种治疗性蛋白质和/或免疫调节物，诸如免疫检查点抑制剂。参见例如国际专利申请NO.PCT/CN2016/073489和PCT/CN2016/087855，这两个专利申请以引用的方式整体并入本文。
载体
本申请提供用于克隆和表达本文所述的任一种CAR的载体。在一些实施方案中，载体适于在真核细胞(诸如哺乳动物细胞)中复制和整合。在一些实施方案中，载体是病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物。病毒载体技术是本领域熟知的，例如在Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中有所描述。
已经开发了许多基于病毒的系统用于向哺乳动物细胞进行基因转移。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将异源核酸插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并体外或离体递送至经工程化的哺乳动物细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。在一些实施方案中，使用自失活慢病毒载体。例如，携带免疫调节剂(诸如免疫检查点抑制剂)编码序列的自失活慢病毒载体和/或携带CAR的自失活慢病毒载体可以使用本领域已知的方案包装。所得的慢病毒载体可用于使用本领域已知的方法转导哺乳动物细胞(诸如原代人T细胞)。来源于逆转录病毒(诸如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合以及它们在子代细胞中的繁殖。慢病毒载体也具有低免疫原性，并且可以转导非增殖性细胞。
在一些实施方案中，载体是非病毒载体。在一些实施方案中，载体是转座子，诸如睡美人(Sleeping Beauty,SB)转座子系统，或PiggyBac转座子系统。在一些实施方案中，载体是基于聚合物的非病毒载体，包括例如聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)和聚乳酸(PLA)、聚(乙烯亚胺)(PEI)和树状聚合物。在一些实施方案中，载体是基于阳离子脂质的非病毒载体，诸如阳离子型脂质体、脂质纳米乳液和固体脂质纳米颗粒(SLN)。在一些实施方案中，载体是基于肽的基因非病毒载体，诸如聚-L-赖氨酸。适于基因组编辑的任何已知非病毒载体均可用于将编码CAR的核酸引入经工程化的免疫效应细胞。参见例如Yin H.等人,NatureRev.Genetics(2014)15:521-555；Aronovich EL等人,“The Sleeping Beauty transposonsystem:a non-viral vector for gene therapy.”Hum.Mol.Genet.(2011)R1:R14-20；和Zhao S.等人,“PiggyBac transposon vectors:the tools of the human geneediting.”Transl.Lung Cancer Res.(2016)5(1):120-125，这些文献以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，通过物理方法(包括但不限于电穿孔、声穿孔、光穿孔、磁转染、流体动力学穿孔)将编码CAR的核酸中的任何一者或多者引入经工程化的免疫效应细胞。
在一些实施方案中，载体包含本文所述的编码CAR的核酸中的任一者。可以使用本领域任何已知的分子克隆方法，包括例如使用限制性核酸内切酶位点和一个或多个选择性标记将核酸克隆至载体。在一些实施方案中，核酸可操作地连接至启动子。已经研究了将许多启动子用于哺乳动物细胞中的基因表达，并且本领域已知的任何启动子均可用于本发明。启动子可以大致分为组成型启动子或调节型启动子(诸如诱导型启动子)。
在一些实施方案中，编码CAR的核酸可操作地连接至组成型启动子。组成型启动子允许异源基因(也称为转基因)在宿主细胞中组成型表达。本文设想的示例性组成型启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、人延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)以及与CMV早期增强子组合的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)。这些组成型启动子对驱动转基因表达的效率已在大量研究中进行了广泛比较。例如，Michael C.Milone等人比较了CMV、hEF1α、UbiC和PGK驱动原代人T细胞中的CAR表达的效率，并得出以下结论：hEF1α启动子不仅诱导最高水平的转基因表达，而且还最佳地维持在CD4和CD8人T细胞中(Molecular Therapy,17(8):1453-1464(2009))。在一些实施方案中，编码CAR的核酸可操作地连接至hEF1α启动子。
在一些实施方案中，编码CAR的核酸可操作地连接至诱导型启动子。诱导型启动子属于调节型启动子类别。诱导型启动子可以由一种或多种条件，诸如物理条件、经工程化的免疫效应细胞的微环境、或经工程化的免疫效应细胞的生理状态、诱导物(即，诱导剂)或它们的组合诱导。在一些实施方案中，诱导条件不诱导经工程化的哺乳动物细胞中和/或接受药物组合物的受试者中内源性基因的表达。在一些实施方案中，诱导条件选自由以下组成的组：诱导物、辐射(诸如电离辐射、光)、温度(诸如热)、氧化还原状态、肿瘤环境和经工程化的哺乳动物细胞的活化状态。
在一些实施方案中，载体还含有选择性标记基因或报告基因，以从慢病毒载体转染的宿主细胞群选择表达CAR的细胞。选择性标记和报告基因二者都可以侧接适当的调控序列以允许在宿主细胞中表达。例如，载体可以含有转录和翻译终止子、起始序列以及用于调节核酸序列表达的启动子。
在一些实施方案中，载体包含多于一种编码CAR的核酸。在一些实施方案中，载体包含含有编码第一CAR的第一核酸序列和编码第二CAR的第二核酸序列的核酸，其中第一核酸通过编码自切割肽的第三核酸序列可操作地连接至第二核酸。在一些实施方案中，自切割肽选自由以下组成的组：T2A、P2A和F2A。在一些实施方案中，T2A肽具有SEQ ID NO:385的氨基酸序列。
免疫效应细胞
“免疫效应细胞”是可执行免疫效应子功能的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞表达至少FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的免疫效应细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
在一些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+、CD4-/CD8-或它们的组合。在一些实施方案中，T细胞在表达CAR和结合至靶标细胞(诸如CD20+或CD19+肿瘤细胞)时产生IL-2、TFN和/或TNF。在一些实施方案中，CD8+T细胞在表达CAR和结合至靶标细胞时裂解抗原特异性靶标细胞。
在一些实施方案中，免疫效应细胞是NK细胞。在其他实施方案中，免疫效应细胞可以是已建立的细胞系，例如NK-92细胞。
在一些实施方案中，免疫效应细胞从干细胞(诸如造血干细胞、多能干细胞、iPS或胚胎干细胞)分化。
通过将CAR引入免疫效应细胞(诸如T细胞)来制备经工程化的免疫效应细胞。在一些实施方案中，通过转染任一种经分离的核酸或任一种载体来将CAR引入免疫效应细胞，如第III部分所述。在一些实施方案中，通过将蛋白质插入细胞膜，同时使细胞通过微流控系统(诸如CELL
Figure BDA0003066909480000731
)来将CAR引入免疫效应细胞(参见例如美国专利申请公开No.20140287509)。
将载体或经分离的核酸引入哺乳动物细胞的方法是本领域已知的。所述载体可以通过物理、化学或生物方法转入免疫效应细胞。
用于将载体引入免疫效应细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等等。用于产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见例如，Sambrook等人,(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York。在一些实施方案中，通过电穿孔将载体引入细胞。
用于将载体引入免疫效应细胞的生物方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体已成为将基因插入哺乳动物，例如人细胞的最广泛使用的方法。
用于将载体引入免疫效应细胞的化学手段包括胶体分散体系，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒和基于脂质的体系(包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外递送媒介物的示例性胶体体系是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
在一些实施方案中，编码本文所述的任何CAR的RNA分子可以通过常规的方法(例如，体外转录)制备，然后通过已知的方法(诸如mRNA电穿孔)引入免疫效应细胞。参见例如，Rabinovich等人,Human Gene Therapy 17:1027-1035。
在一些实施方案中，转导的或转染的免疫效应细胞在引入载体或经分离的核酸之后离体繁殖。在一些实施方案中，培养转导的或转染的免疫效应细胞以繁殖约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的至少任一者。在一些实施方案中，进一步评估或筛选转导的或转染的免疫效应细胞以选择经工程化的哺乳动物细胞。
报告基因可用于鉴定潜在转染的细胞和用于评估调控序列的功能。一般而言，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或由受体生物体或组织表达，并且编码表达表现为某种容易检测到的性质(例如，酶活性)的多肽的基因。在DNA引入受体细胞之后，在合适的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,FEBSLetters479:79-82(2000))。合适的表达系统是熟知的并且可以使用已知技术制备或商购获得。
确认编码CAR的核酸存在于经工程化的免疫效应细胞中的其他方法包括，例如本领域技术人员熟知的分子生物学测定法，诸如DNA印迹和RNA印迹、RT-PCR和PCR；生物化学测定法，诸如例如通过免疫方法(诸如ELISA和蛋白质印迹)检测特定肽是否存在。
1.T细胞的来源
在T细胞的扩增和遗传修饰之前，从个体获得T细胞的来源。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在一些实施方案中，可以使用本领域可获得的很多T细胞系。在一些实施方案中，可以使用很多技术人员已知的技术(诸如FICOLLTM分离)从受试者收集的血液单位获得T细胞。在一些实施方案中，通过单采血液成分术从个体的循环血液获得细胞。单采血液成分产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施方案中，可以洗涤单采血液成分术所收集的细胞以除去血浆级分，并将细胞置于适当的缓冲剂或培养基中用于后续加工步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙，可以缺乏镁或可以缺乏很多(如果不是全部)二价阳离子。同样，出乎意料的是，在不存在钙的情况下，初始活化步骤引起放大活化。本领域的普通技术人员将易于理解，洗涤步骤可以通过本领域已知的方法实现，诸如使用半自动化“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、BaxterCytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)根据制造商的说明实现。在洗涤之后，可以使细胞重悬于多种生物相容性缓冲剂中，例如不含Ca2+、不含Mg2+的PBS、PlasmaLyte A或有或无缓冲剂的其他盐水溶液。或者，可以除去单采血液成分样品中不需要的组分并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，通过裂解红细胞和剔除单核细胞(例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析)来从外周血淋巴细胞分离T细胞。可以通过正向或负向选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，诸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一些实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28(即，3×28)缀合珠粒(诸如
Figure BDA0003066909480000741
M-450CD3/CD28 T)一起孵育一段足以进行所需T细胞的正向选择的时间来分离T细胞。在一些实施方案中，时间期为约30分钟。在另一个实施方案中，时间期的范围从30分钟至36小时或更长，以及其间的所有整数值。在另一个实施方案中，时间期为至少1、2、3、4、5或6小时。在一些实施方案中，时间期为10至24小时。在一些实施方案中，孵育时间期为24小时。对于从患有白血病的患者中分离T细胞，使用更长的孵育时间(诸如24小时)可以提高细胞收率。与其他细胞类型相比，在存在少量T细胞的任何情况下，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞，例如从肿瘤组织或从免疫受损个体分离肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。此外，使用更长的孵育时间可以提高CD8+T细胞的捕获效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞结合CD3/CD28珠粒的时间和/或通过增加或减小珠粒与T细胞之比(如本文进一步描述)，可在培养开始时或在该过程的其他时间点优先选择或不选择T细胞亚群。另外，通过增加或减小珠粒或其他表面上抗CD3和/或抗CD28抗体之比，可在培养开始时或其他所需时间点优先选择或不选择T细胞亚群。技术人员将认识到，也可以使用多轮选择。在一些实施方案中，执行选择程序并将“未选择的”细胞用于活化和扩增过程可为所期望的。“未选择的”细胞也可以进行更多轮选择。
通过负向选择富集T细胞群可以使用针对负选细胞独特的表面标记物的抗体组合来实现。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该方法使用针对负选细胞上存在的细胞表面标记物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过负向选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，富集或正向选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节T细胞可为所期望的。或者，在某些实施方案中，通过抗C25缀合珠粒或其他类似的选择方法剔除T调节细胞。
对于通过正向或负向选择分离所需的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，颗粒如珠粒)的浓度。在某些实施方案中，显著降低珠粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠粒的最大程度接触可为所期望的。例如，在一个实施方案中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施方案中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个实施方案中，使用7500、8000、8500、9000、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施方案中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以增加细胞收率、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能表达所关注的靶标抗原较弱的细胞，诸如CD28阴性T细胞，或来自存在很多肿瘤细胞的样品(即，白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群可具有治疗价值，并且获得此类细胞群将是所期望的。例如，使用高浓度细胞允许更有效地选择通常具有较弱的CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施方案中，使用较低浓度的细胞可为所期望的。通过大量稀释T细胞和表面(例如，颗粒如珠粒)的混合物，可以最小化颗粒和细胞之间的相互作用。这可以选择表达大量与颗粒结合的所需抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达更高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更有效地被捕获。在一些实施方案中，所用的细胞浓度为5×106个/ml。在一些实施方案中，所用的浓度可以为约1×105个/ml至1×106个/ml，以及其间的任何整数值。
在一些实施方案中，细胞可以在2-10℃下或在室温下在旋转器上以不同的速度孵育不同的时间长度。
也可在洗涤步骤之后冷冻用于刺激的T细胞。不希望受理论的束缚，冷冻和后续解冻步骤通过除去细胞群中的粒细胞和一定程度的单核细胞而提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮于冷冻溶液中。虽然很多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在这种情况下是有用的，但是一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％右旋糖酐40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％右旋糖酐40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或其他合适的含有例如Hespan和PlasmaLyte A的细胞冷冻培养基，然后将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储存槽的气相中。可以使用其他受控冷冻方法，并且在-20℃下或液氮中立即进行不受控冷冻。
在一些实施方案中，如本文所述使低温保存的细胞解冻并洗涤，允许在室温下静置一小时，然后进行活化。
本申请还设想了在可能需要本文所述的扩增细胞之前的时间期，从受试者收集血液样品或单采血液成分产物。因此，可以在所需的任何时间点收集待扩增的细胞来源，并分离和冷冻所需的细胞(诸如T细胞)，以便后续用于很多疾病或病症的T细胞治疗，所述疾病或病症将受益于T细胞治疗，诸如本文所述的那些。在一个实施方案中，血液样品或单采血液成分取自一般健康受试者。在某些实施方案中，血液样品或单采血液成分取自具有患上疾病风险但尚未患有疾病的一般健康受试者，并且分离和冷冻所关注的细胞以便后续使用。在某些实施方案中，T细胞可以在随后的时间里扩增、冷冻和使用。在某些实施方案中，在诊断本文所述的特定疾病后不久，但在任何治疗之前，从患者收集样品。在另一个实施方案中，在很多相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或单采血液成分中分离细胞，所述相关治疗方式包括但不限于用试剂诸如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化学疗法、放射疗法、免疫抑制剂(诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、霉酚酸和FK506)，抗体或其他免疫消融剂(诸如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228)和辐射进行治疗。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶(即钙调磷酸酶)(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人,Cell 66:807-815,1991；Henderson等人,Immun73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在另一个实施方案中，分离细胞并冷冻以便后续连同骨髓或干细胞移植、T细胞消融疗法(使用化学治疗剂诸如氟达拉滨)、外照射放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体(诸如OKT3或CAMPATH)一起(例如，之前、同时或之后)用于治疗患者。在另一个实施方案中，预先分离细胞并且可以冷冻以便后续在B细胞消融疗法(诸如与CD20反应的试剂，例如Rituxan)之后用于治疗。
在一些实施方案中，在治疗之后直接从患者获得T细胞。就这一点而言，已经观察到在某些癌症治疗后，特别是用损害免疫系统的药物治疗后，治疗后不久在患者从治疗中正常恢复期间，所获得的T细胞的质量对于其离体扩增能力而言可为最佳的或改善的。同样，在使用本文所述的方法进行离体操作之后，这些细胞可以处于增强移植和体内扩增的优选状态。因此，在本发明的范围中设想了在此恢复阶段期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在某些实施方案中，可以使用动员(例如，用GM-CSF动员)和调理方案在受试者中形成其中特别是在治疗后的确定时间窗口期间，有利于特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增的条件。示例性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其他细胞。
2.T细胞的活化和扩增
无论在使用本文所述的CAR进行T细胞的遗传修饰之前还是之后，通常均可使用例如美国专利No.6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041；和美国专利申请公开No.20060121005所述的方法活化和扩增T细胞。
一般而言，T细胞可通过接触表面来扩增，该表面附接有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。具体而言，可以如本文所述刺激T细胞群，诸如通过接触抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体，或通过接触与钙离子载体组合的蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)。对于T细胞表面上辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群可以在适于刺激T细胞增殖的条件下接触抗CD3抗体和抗CD28抗体。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3，XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)可用作本领域通常已知的其他方法(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。
在一些实施方案中，T细胞的主要刺激信号和共刺激信号可以由不同的方案提供。例如，提供每个信号的试剂可以处于溶液中或与表面结合。当试剂与表面结合时，可以与相同的表面(即，以“顺式”形式)或单独的表面(即，以“反式”形式)结合。或者，一种试剂可以与表面结合，而另一种试剂处于溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的试剂与细胞表面结合，而提供主要活化信号的试剂处于溶液中或与表面结合。在某些实施方案中，两种试剂都可以处于溶液中。在另一个实施方案中，所述试剂可以为可溶形式，然后与表面交联，诸如表达Fc受体或抗体的细胞或与所述试剂结合的其他结合剂。就这一点而言，参见例如美国专利申请公开No.20040101519和20060034810的设想为在本发明中用于活化和扩增T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)。
在一些实施方案中，T细胞与试剂涂覆的珠粒组合，随后分离珠粒和细胞，然后培养细胞。在一个替代实施方案中，在培养之前，试剂涂覆的珠粒和细胞不是单独的，而是一起培养的。在另一个实施方案中，首先通过施加力(诸如磁力)来浓缩珠粒和细胞，使得细胞表面标记物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
例如，细胞表面蛋白可以通过允许抗CD3和抗CD28连接的顺磁珠粒(3×28珠粒)接触T细胞来连接。在一个实施方案中，将细胞(例如，104至109个T细胞)和珠粒(例如，1:1比例的
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M-450 CD3/CD28 T顺磁珠粒)在缓冲剂，优选地PBS(无二价阳离子，诸如钙和镁)中组合。同样，本领域的普通技术人员可易于理解可以使用任何细胞浓度。例如，靶标细胞在样品中可以非常稀少，仅占样品的0.01％，或者整个样品(即100％)可以包含所关注的靶标细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的范围内。在某些实施方案中，显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大程度接触可为所期望的。例如，在一个实施方案中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施方案中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个实施方案中，使用7500、8000、8500、9000、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施方案中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以增加细胞收率、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能表达所关注的靶标抗原较弱的细胞，诸如CD28阴性T细胞。在某些实施方案中，此类细胞群可具有治疗价值，并且获得此类细胞群将是所期望的。例如，使用高浓度细胞允许更有效地选择通常具有较弱的CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施方案中，可以培养混合物几小时(约3小时)至约14天或其间任何以小时计的整数值。在另一个实施方案中，可以培养混合物21天。在本发明的一个实施方案中，珠粒和T细胞一起培养约八天。在另一个实施方案中，珠粒和T细胞一起培养2-3天。几个刺激周期也可以是所期望的，使得T细胞的培养时间可以为60天或更长。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(Lonza))，所述培养基可以含有增殖和生存必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂(诸如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇)。培养基可包括添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素的RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo15和X-Vivo 20、Optimizer，这些培养基是无血清的或补充有适量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或一定量足够T细胞生长和扩增的细胞因子。仅在实验培养物中，而不是在要输注给受试者的细胞培养物中包括抗生素(例如，青霉素和链霉素)。将靶标细胞维持在支持生长所需的条件下，例如适当的温度(例如，37℃)和大气(例如，空气加上5％CO2)。已经暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特性。例如，典型的血液或单采血液成分术的外周血单核细胞产物具有辅助T细胞群(TH,CD4+)，所述辅助T细胞群大于细胞毒性或抑制T细胞群(TC,CD8)。通过刺激CD3和CD28受体来离体扩增T细胞在约第8-9天之前产生主要由TH细胞组成的T细胞群，而在约第8-9天之后，T细胞群包含逐渐增加的TC细胞群。因此，根据治疗目的，用主要包含TH细胞的T细胞群输注受试者可为有利的。类似地，如果已分离TC细胞的抗原特异性子集，则使该子集扩增至更大的程度可为有益的。
此外，除了CD4和CD8标记物之外，其他表型标记物也显著不同，但在很大程度上，在细胞扩增过程中可再现。因此，这种可再现性使得能够针对特定目的定制活化T细胞产物。
V.药物组合物
本申请还提供药物组合物，所述药物组合物包含任一种抗BCMA单域抗体，或包含本文所述的任一种CAR(诸如BCMA CAR)的任一种经工程化的免疫效应细胞以及药学上可接受的载剂。药物组合物可以通过使具有所需纯度的sdAb或多种经工程化的免疫效应细胞与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合(Remington's PharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.编(1980))以冻干制剂或水溶液的形式制备。
可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对受体是无毒的，并且包括缓冲剂；抗氧化剂包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、偏亚硫酸氢钠；防腐剂；等渗剂；稳定剂；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；螯合剂，诸如EDTA和/或非离子型表面活性剂。
缓冲剂用于将pH控制在优化治疗效果的范围内，特别是稳定性是pH依赖性的情况下。缓冲剂优选地以约50mM至约250mM范围内的浓度存在。适用于本发明的缓冲剂包括有机酸和无机酸二者及其盐。例如，柠檬酸、磷酸盐、琥珀酸、酒石酸、富马酸、葡糖酸、草酸、乳酸、乙酸。另外，缓冲剂可包含组氨酸和三甲胺盐，诸如Tris。
添加防腐剂以延缓微生物生长，并且通常以0.2％-1.0％(w/v)的范围存在。适用于本发明的防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎卤铵(例如，苯扎氯铵、苯扎溴铵、苯扎碘铵)、苄索氯铵；硫柳汞、苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇、3-戊醇和间甲酚。
张力剂，有时称为“稳定剂”，张力剂的存在用于调节或维持组合物中液体的张力。当与大型带电生物分子(诸如蛋白质和抗体)一起使用时，它们通常称为“稳定剂”，因为它们可与氨基酸侧链的带电基团相互作用，从而减少分子间和分子内相互作用的可能性。考虑到其他成分的相对量，张力剂可以0.1重量％至25重量％、优选地1重量％至5重量％之间的任何量存在。优选的张力剂包括多元糖醇，优选地三元或更多元糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
另外的赋形剂包括可以作为以下一种或多种的试剂：(1)填充剂、(2)溶解度增强剂、(3)稳定剂和(4)防止变性或粘附到容器壁的试剂。此类赋形剂包括：多元糖醇(如上文所列举)；氨基酸，诸如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖蛋白(myoinisitose)、肌醇(myoinisitol)、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖)；二糖(例如，乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖，诸如棉子糖；和多糖，诸如糊精或右旋糖酐。
非离子型表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)的存在有助于使治疗剂增溶以及保护治疗性蛋白质不发生搅拌诱导的聚集，它还允许制剂暴露于剪切表面应力，而不导致活性治疗性蛋白质或抗体的变性。非离子型表面活性剂以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，优选地约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
合适的非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、
Figure BDA0003066909480000795
多元醇、
Figure BDA0003066909480000796
聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(
Figure BDA0003066909480000797
-20、
Figure BDA0003066909480000798
-80等)、聚桂醇400、硬脂酸聚烃氧40酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可使用的阴离子洗涤剂包括十二烷基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子型洗涤剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
为了使药物组合物可用于体内施用，它们必须是无菌的。可以通过无菌过滤膜过滤使药物组合物无菌。通常将本文的药物组合物置于具有无菌入口的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内注射溶液袋或小瓶。
给药途径根据已知的和可接受的方法进行，诸如以合适的方式长时间单次或多次推注或输注，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、病灶内或关节内途径注射或输注、局部给药、吸入或通过缓释或延释手段。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质为成型制品的形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
本文所述的药物组合物还可以含有待治疗的具体适应症所需的多于一种活性化合物或试剂，优选地具有不会不利地互相影响的互补活性的那些。或者或此外，组合物可包含细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂或生长抑制剂。此类分子以对于预期目的有效的量适当地联合存在。
活性成分也可以被包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(分别地，例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中或包埋在粗乳液中。这些技术在Remington's Pharmaceutical Sciences第18版中有所公开。
VI.治疗方法
本申请还涉及用于细胞免疫疗法的方法和组合物。在一些实施方案中，细胞免疫疗法用于治疗癌症，包括但不限于血液恶性肿瘤和实体肿瘤。本文所述的任何抗BCMAsdAb、CAR和经工程化的免疫效应细胞(诸如CAR-T细胞)均可用于治疗癌症的方法。本文所述的CAR可用于治疗具有抗原丧失逃逸突变的肿瘤，并用于降低对现有疗法的耐受性。在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物可用于治疗单域抗体或CAR特异性识别的抗原相关的其他疾病，包括例如自体免疫性疾病。
在一些实施方案中，提供了治疗个体(诸如人个体)的癌症(诸如多发性骨髓瘤，例如复发性或难治性多发性骨髓瘤)的方法，包括将有效量的药物组合物施用于个体，所述药物组合物包含：(1)包含含有多肽的多价CAR的经工程化的免疫效应细胞(诸如T细胞)，所述多肽包含：(a)包含特异性结合至BCMA的第一表位的第一BCMA结合部分和特异性结合至BCMA的第二表位的第二BCMA结合部分的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一表位和第二表位是不同的；以及(2)药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，提供了治疗个体(诸如人个体)的癌症(诸如多发性骨髓瘤，例如复发性或难治性多发性骨髓瘤)的方法，包括将有效量的药物组合物施用于个体，所述药物组合物包含：(1)包含含有多肽的多价CAR的经工程化的免疫效应细胞(诸如T细胞)，所述多肽包含：(a)包含特异性结合至BCMA的第一表位的第一抗BCMA sdAb和特异性结合至BCMA的第二表位的第二抗BCMAsdAb的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一表位和第二表位是不同的；以及(2)药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞是自体的。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞是同种异体的。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞是CAR-T细胞。在一些实施方案中，癌症是液体癌，诸如多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。在一些实施方案中，癌症是难治性或复发性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞以约105至约107个细胞/kg，诸如约3×105至约7×106个细胞/kg或约3×106个细胞/kg的剂量施用。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞通过静脉内注射施用。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞在约一周内以三次分开剂量施用。
在一些实施方案中，提供了治疗个体(诸如人个体)的癌症(诸如多发性骨髓瘤，例如复发性或难治性多发性骨髓瘤)的方法，包括将有效量的药物组合物施用于个体，所述药物组合物包含：(1)包含含有多肽的BCMA CAR的经工程化的免疫效应细胞(诸如T细胞)，所述多肽包含：(a)包含抗BCMA sdAb的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域；以及(2)药学上可接受的载剂，其中抗BCMA sdAb包含以下中的任一者：(1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR3；(4)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR3；(5)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR3；(6)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:82的氨基酸序列的CDR3；(7)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR3；(8)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的CDR3；(9)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3；(10)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的CDR3；(11)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的CDR3；(12)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR3；(13)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的CDR3；(14)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR3；(15)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:91的氨基酸序列的CDR3；(16)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3；(17)包含SEQ IDNO:17的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的CDR3；(18)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR3；(19)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR3；(20)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR3；(21)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR3；(22)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR3；(23)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的CDR3；(24)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR3；(25)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR3；(26)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:102的氨基酸序列的CDR3；(27)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:65的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR3；(28)包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR3；(29)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR3；(30)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR3；(31)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR3；(32)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR3；(33)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR3；(34)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR3；(35)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的CDR3；(36)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR3；(37)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3；或(38)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，胞外抗原结合域包含至少两个抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb是骆驼科动物、嵌合、人或人源化的。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb包含VHH域，所述VHH域包含选自SEQ ID NO:115-152的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA CAR包含选自SEQ ID NO:216-256和298-335的氨基酸序列。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞是自体的。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞是同种异体的。在一些实施方案中，癌症是液体癌，诸如多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。在一些实施方案中，癌症是难治性或复发性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞以约105至约107个细胞/kg，诸如约3×105至约7×106个细胞/kg或约3×106个细胞/kg的剂量施用。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞通过静脉内注射施用。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞在约一周内以三次分开剂量施用。
在一些实施方案中，提供了获得患有多发性骨髓瘤(例如，复发性或难治性多发性骨髓瘤)的个体的部分或完全临床缓解的方法，包括将有效量的药物组合物施用于个体，所述药物组合物包含：(1)包含含有多肽的多价CAR的经工程化的免疫效应细胞(诸如T细胞)，所述多肽包含：(a)包含特异性结合至BCMA的第一表位的第一BCMA结合部分(诸如第一抗BCMA sdAb)和特异性结合至BCMA的第二表位的第二BCMA结合部分(诸如第二抗BCMA sdAb)的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一表位和第二表位是不同的；以及(2)药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞是自体的。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞是同种异体的。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞是CAR-T细胞。在一些实施方案中，癌症是液体癌，诸如多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。在一些实施方案中，癌症是难治性或复发性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞以约105至约107个细胞/kg，诸如约3×105至约7×106个细胞/kg或约3×106个细胞/kg的剂量施用。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞通过静脉内注射施用。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞在约一周内以三次分开剂量施用。
在一些实施方案中，提供了治疗个体(诸如人个体)的癌症(诸如多发性骨髓瘤，例如复发性或难治性多发性骨髓瘤)的方法，包括将有效量的药物组合物施用于个体，所述药物组合物包含抗BCMA sdAb和药学上可接受的载剂，其中抗BCMA sdAb包含以下中的任一者：(1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:79的氨基酸序列的CDR3；(4)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR3；(5)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR3；(6)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDR3；(7)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR3；(8)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的CDR3；(9)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3；(10)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:86的氨基酸序列的CDR3；(11)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:49的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的CDR3；(12)包含SEQ IDNO:12的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR3；(13)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的CDR3；(14)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR3；(15)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的CDR3；(16)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3；(17)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的CDR3；(18)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR3；(19)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR3；(20)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR3；(21)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:97的氨基酸序列的CDR3；(22)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:60的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR3；(23)包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的CDR3；(24)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR3；(25)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR3；(26)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR3；(27)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR3；(28)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR3；(29)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR3；(30)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR3；(31)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR3；(32)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR3；(33)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR3；(34)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR3；(35)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的CDR3；(36)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR3；(37)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3；或(38)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb是骆驼科动物、嵌合、人或人源化的。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb包含选自由SEQ ID NO:115-152组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，癌症是液体癌，诸如多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。在一些实施方案中，癌症是难治性或复发性多发性骨髓瘤。
本文所述的方法适用于治疗多种癌症，包括实体癌和液体癌。这些方法适用于所有分期的癌症，包括早期、晚期和转移性癌症。本文所述的方法在辅助背景或新辅助背景中可用作第一疗法、第二疗法、第三疗法或与本领域已知的其他类型癌症疗法(诸如化学疗法、手术、放射疗法、基因疗法、免疫疗法、骨髓移植、干细胞移植、靶向疗法、冷冻疗法、超声疗法、光动力疗法、射频消融等等)的组合疗法。
在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，根据Durie-Salmon分期系统，癌症是I期、II期或III期和/或A期或B期多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，根据国际骨髓瘤工作组(International Myeloma Working Group,IMWG)公布的国际分期系统，癌症是I期、II期或III期多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是意义未明的单克隆γ-球蛋白病(MGUS)。在一些实施方案中，癌症是无症状性(冒烟型/无痛性)骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是症状性或活动性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是难治性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，个体对多发性骨髓瘤的先前治疗不产生响应。在一些实施方案中，个体在多发性骨髓瘤的先前治疗之后患有进行性疾病。在一些实施方案中，个体已接受至少约2次、3次、4次或更多次中的任一者的多发性骨髓瘤治疗。在一些实施方案中，癌症是复发性多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，个体患有活动性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，个体具有至少10％的克隆骨髓浆细胞。在一些实施方案中，个体患有活检证实的骨或髓外浆细胞瘤。在一些实施方案中，个体具有可归因于潜在的浆细胞增殖性疾病的终末器官损伤的证据。
在一些实施方案中，个体患有高钙血症，例如血清钙>0.25mmol/L(>1mg/dL)，高于正常值的上限，或>2.75mmol/L(>11mg/dL)。在一些实施方案中，个体患有肾功能衰竭，例如肌酸酐清除率<40mL/分钟或血清肌酸酐>177μmol/L(>2mg/dL)。在一些实施方案中，个体患有贫血，例如血红蛋白值>20g/L，低于正常值的下限，或血红蛋白值<100g/L。在一些实施方案中，个体在骨骼放射成像、CT或PET/CT时具有一处或多处骨病变，例如一处或多处溶骨性病变。在一些实施方案中，个体具有一个或多个以下恶性肿瘤的生物标记物(MDE)：(1)在骨髓检查时克隆浆细胞为60％或更多；(2)参与血清/不参与血清的游离轻链之比为100或更大，前提条件是参与轻链的绝对水平为至少100mg/L；以及(3)在MRI时多于一个局部病灶的大小为至少5mm或更大。
药物组合物的施用可以任何简便的方式，包括通过注射、吸入、输注、植入或移植来进行。组合物可以经动脉、皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌肉内、静脉内或腹膜内施用于患者。在一些实施方案中，全身施用药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物通过输注(诸如静脉内输注)施用于个体。用于免疫疗法的输注技术是本领域已知的(参见例如Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676(1988))。在一些实施方案中，药物组合物通过皮内或皮下注射施用于个体。在一些实施方案中，组合物通过静脉内注射施用。在一些实施方案中，组合物直接注射至肿瘤或淋巴结。在一些实施方案中，药物组合物局部施用于肿瘤的部位，诸如直接施用于肿瘤细胞，或施用于具有肿瘤细胞的组织。
根据设想的特定用途，本发明的药物组合物的剂量和所需药物浓度可以变化。适当的剂量或给药途径的确定完全在普通技术人员的技能范围内。动物实验提供了确定人类治疗的有效剂量的可靠指导。有效剂量的物种间推算可以根据Mordenti,J.和Chappell,W.“The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics”,载于Toxicokinetics andNew Drug Development,Yacobi等人编,Pergamon Press,New York 1989,第42-46页给出的原理进行。在本申请的范围内，不同的制剂将对不同的治疗和不同的病状有效，并且旨在治疗特定器官或组织的给药可能需要以不同于另一种器官或组织的方式递送。
在一些实施方案中，其中药物组合物包含本文所述的任一种sdAb，根据给药途径，药物组合物以约10ng/kg最多至约100mg/kg个体体重/天或更多，例如以约1mg/kg/天至10mg/kg/天的剂量施用。文献中提供了关于特定剂量和递送方法的指导；参见例如美国专利No.4,657,760、5,206,344或5,225,212。
在一些实施方案中，其中药物组合物包含本文所述的任一种经工程化的免疫细胞，药物组合物以至少约104、105、106、107、108或109个细胞/kg个体体重中的任一者的剂量施用。在一些实施方案中，药物组合物以约104至约105、约105至约106、约106至约107、约107至约108、约108至约109、约104至约109、约104至约106、约106至约108或约105至约107个细胞/kg个体体重中的任一者的剂量施用。在一些实施方案中，药物组合物以至少约1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107个细胞/kg或更多中的任一者的剂量施用。在一些实施方案中，药物组合物以约3×105至约7×106个细胞/kg或约3×106个细胞/kg的剂量施用。
在一些实施方案中，药物组合物单次施用。在一些实施方案中，药物组合物多次(诸如2次、3次、4次、5次、6次或更多次中的任一者)施用。在一些实施方案中，药物组合物每周一次、2周一次、3周一次、4周一次、每个月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次或每年一次施用。在一些实施方案中，施用之间的间隔为约1周至2周、2周至1个月、2周至2个月、1个月至2个月、1个月至3个月、3个月至6个月或6个月至一年中的任一者。针对特定患者的最佳剂量和治疗方案，可由医学领域的技术人员通过监测患者的体征并相应地调整治疗而容易地确定。
此外，剂量可以通过一次或多次单独给药或通过连续输注施用。在一些实施方案中，药物组合物以分开剂量，诸如约2次、3次、4次、5次或更多次剂量中的任一者施用。在一些实施方案中，分开剂量在约一周内施用。在一些实施方案中，剂量是等分的。在一些实施方案中，分开剂量为总剂量的约20％、约30％和约50％。在一些实施方案中，连续的分开剂量之间的间隔为约1天、2天、3天或更长。对于几天或更长时间的重复施用，根据情况，持续治疗直至出现对疾病症状的所需抑制。然而，可以使用其他的给药方案。通过常规技术和测定可易于监控这种治疗的进程。
在一些实施方案中，药物组合物的量能够有效地在个体中引起客观临床响应。在一些实施方案中，提供了在患有多发性骨髓瘤(例如，复发性或难治性多发性骨髓瘤)的个体中获得客观临床响应的方法，包括将有效量的药物组合物施用于个体，所述药物组合物包含：(1)包含含有多肽的多价CAR的经工程化的免疫效应细胞(诸如T细胞)，所述多肽包含：(a)包含特异性结合至BCMA的第一表位的第一BCMA结合部分(诸如第一抗BCMA sdAb)和特异性结合至BCMA的第二表位的第二BCMA结合部分(诸如第二抗BCMA sdAb)的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一表位和第二表位是不同的；以及(2)药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，在个体中获得严格临床响应(sCR)。
在一些实施方案中，药物组合物的量能够有效地在个体中引起疾病缓解(部分或完全)。在一些实施方案中，提供了在患有多发性骨髓瘤(例如，复发性或难治性多发性骨髓瘤)的个体中引起疾病缓解(部分或完全)的方法，包括将有效量的药物组合物施用于个体，所述药物组合物包含：(1)包含含有多肽的多价CAR的经工程化的免疫效应细胞(诸如T细胞)，所述多肽包含：(a)包含特异性结合至BCMA的第一表位的第一BCMA结合部分(诸如第一抗BCMA sdAb)和特异性结合至BCMA的第二表位的第二BCMA结合部分(诸如第二抗BCMAsdAb)的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一表位和第二表位是不同的；以及(2)药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，临床缓解在个体接受药物组合物之后不超过约6个月、5个月、4个月、3个月、2个月、1个月或更短中的任一者之后获得。
在一些实施方案中，药物组合物的量能够有效地预防个体中癌症的复发或疾病进展。在一些实施方案中，提供了预防患有多发性骨髓瘤(例如，复发性或难治性多发性骨髓瘤)的个体中的复发或疾病进展的方法，包括将有效量的药物组合物施用于个体，所述药物组合物包含：(1)包含含有多肽的多价CAR的经工程化的免疫效应细胞(诸如T细胞)，所述多肽包含：(a)包含特异性结合至BCMA的第一表位的第一BCMA结合部分(诸如第一抗BCMAsdAb)和特异性结合至BCMA的第二表位的第二BCMA结合部分(诸如第二抗BCMA sdAb)的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一表位和第二表位是不同的；以及(2)药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，预防复发或疾病进展至少约6个月、1年、2年、3年、4年、5年或更长。
在一些实施方案中，药物组合物的量能够有效地延长个体的存活期(诸如无疾病存活期)。在一些实施方案中，延长存活期至少约2、3、4、5、6、12或24个月。在一些实施方案中，提供了延长患有多发性骨髓瘤(例如，复发性或难治性多发性骨髓瘤)的个体的存活期的方法，包括：将有效量的药物组合物施用于个体，所述药物组合物包含：(1)包含含有多肽的多价CAR的经工程化的免疫效应细胞(诸如T细胞)，所述多肽包含：(a)包含特异性结合至BCMA的第一表位的第一BCMA结合部分(诸如第一抗BCMA sdAb)和特异性结合至BCMA的第二表位的第二BCMA结合部分(诸如第二抗BCMA sdAb)的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一表位和第二表位是不同的；以及(2)药学上可接受的载剂。
在一些实施方案中，药物组合物能够有效地改善个体的生命质量。在一些实施方案中，提供了改善患有多发性骨髓瘤(例如，复发性或难治性多发性骨髓瘤)的个体的生命质量的方法，包括将有效量的药物组合物施用于个体，所述药物组合物包含：(1)包含含有多肽的多价CAR的经工程化的免疫效应细胞(诸如T细胞)，所述多肽包含：(a)包含特异性结合至BCMA的第一表位的第一BCMA结合部分(诸如第一抗BCMA sdAb)和特异性结合至BCMA的第二表位的第二BCMA结合部分(诸如第二抗BCMA sdAb)的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一表位和第二表位是不同的；以及(2)药学上可接受的载剂。
在一些实施方案中，药物组合物的量能够有效地抑制实体或淋巴肿瘤生长或减小实体或淋巴肿瘤的大小。在一些实施方案中，实体或淋巴肿瘤的大小减小至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)。在一些实施方案中，提供了在个体中抑制实体或淋巴肿瘤的生长或减小实体或淋巴肿瘤的大小的方法。
在一些实施方案中，药物组合物的量能够有效地抑制个体中的肿瘤转移。在一些实施方案中，抑制至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)的转移。在一些实施方案中，提供了抑制患有多发性骨髓瘤(例如，复发性或难治性多发性骨髓瘤)的个体的肿瘤转移的方法，包括将有效量的药物组合物施用于个体，所述药物组合物包含：(1)包含含有多肽的多价CAR的经工程化的免疫效应细胞(诸如T细胞)，所述多肽包含：(a)包含特异性结合至BCMA的第一表位的第一BCMA结合部分(诸如第一抗BCMA sdAb)和特异性结合至BCMA的第二表位的第二BCMA结合部分(诸如第二抗BCMAsdAb)的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域，其中第一表位和第二表位是不同的；以及(2)药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，提供了抑制转移至淋巴结的方法。在一些实施方案中，提供了抑制转移至肺的方法。在一些实施方案中，提供了抑制转移至肝的方法。转移可以通过本领域的任何已知方法，诸如通过血液测试、骨扫描、x-射线扫描、CT扫描、PET扫描和活组织检查来评估。
VII.试剂盒和制品
还提供了包含本文所述的单域抗体、嵌合抗原受体或经工程化的免疫效应细胞中的任一者的试剂盒、单位剂量和制品。在一些实施方案中，提供含有本文所述的药物组合物中的任一者的试剂盒，该试剂盒优选地提供其使用说明。
本申请的试剂盒处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、广口瓶、软包装(例如，密封Mylar(聚酯薄膜)或塑料袋)等等。试剂盒可以任选地提供另外的组件，诸如缓冲剂和解释信息。因此，本申请还提供包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶、广口瓶、软包装等等的制品。
制品可包括容器以及容器上或与容器相关的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。一般而言，容器容纳能够有效治疗本文所述的疾病或病状(诸如癌症)的组合物，并且可以具有无菌入口(例如容器可以具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内注射溶液袋小瓶)。标签或包装说明书标示该组合物可用于治疗个体的特定病症。标签或包装说明书还包括将组合物施用于个体的说明。标签可标示复原和/或使用的指引。容纳药物组合物的容器可以是多次使用小瓶，其允许复原制剂的重复施用(例如2-6次施用)。包装说明书是指通常在治疗产品的商业包装中包括的说明，其含有关于使用这些治疗产品的适应症、用法、用量、施用、禁忌症和/或警告的信息。另外，制品还可以包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer's)液和葡萄糖溶液。其还可包括从商业和使用者观点来看所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
试剂盒或制品可包括以足以在药房(例如，医院药房和调剂药房)中储存和使用的量包装的多个单位剂量的药物组合物及使用说明。
以下实施例和示例性实施方案旨在作为本发明的纯粹示例，所以不应视为以任何方式限制本发明。以下实施例和示例性实施方案以说明方式而不是限制方式提供。
VIII.示例性实施方案
本发明提供以下实施方案：
实施方案1.一种包含以下中的任一者的抗BCMA单域抗体(sdAb)：(1)包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR3；(4)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR3；(5)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR3；(6)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDR3；(7)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:45的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR3；(8)包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的CDR3；(9)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3；(10)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的CDR3；(11)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的CDR3；(12)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR3；(13)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的CDR3；(14)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR3；(15)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的CDR3；(16)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3；(17)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:93的氨基酸序列的CDR3；(18)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR3；(19)包含SEQ IDNO:19的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR3；(20)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR3；(21)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR3；(22)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR3；(23)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的CDR3；(24)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR3；(25)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR3；(26)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR3；(27)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR3；(28)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR3；(29)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR3；(30)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR3；(31)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR3；(32)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR3；(33)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR3；(34)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR3；(35)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的CDR3；(36)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR3；(37)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3；或(38)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR3。
实施方案2.根据实施方案1所述的抗BCMA sdAb，其中所述抗BCMA sdAb包含选自由SEQ ID NO:115-152组成的组的氨基酸序列。
实施方案3.一种与根据实施方案1或实施方案2所述的抗BCMA sdAb竞争的抗BCMA抗体。
实施方案4.根据实施方案3所述的抗BCMA抗体，其中所述抗BCMA抗体是sdAb。
实施方案5.根据实施方案1、实施方案2和实施方案4中的任一项所述的抗BCMAsdAb，其中所述抗BCMA sdAb是骆驼科动物抗体。
实施方案6.根据实施方案1、实施方案2和实施方案4中的任一项所述的抗BCMAsdAb，其中所述抗BCMA sdAb是嵌合抗体。
实施方案7.根据实施方案1、实施方案2和实施方案4中的任一项所述的抗BCMAsdAb，其中所述抗BCMA sdAb是人源化的。
实施方案8.根据实施方案1至实施方案2和实施方案4至实施方案7中的任一项所述的抗BCMA sdAb，其中所述抗BCMA sdAb是VHH片段。
实施方案9.一种包含多肽的嵌合抗原受体(CAR)，所述多肽包含：(a)包含根据实施方案1至实施方案2和实施方案4至实施方案7中的任一项所述的抗BCMA sdAb的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域。
实施方案10.根据实施方案9所述的CAR，其中所述胞外抗原结合域包含至少两个抗BCMA sdAb。
实施方案11.一种包含多肽的多价嵌合抗原受体(CAR)，所述多肽包含：(a)包含至少两个BCMA结合部分的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域。
实施方案12.根据实施方案11所述的多价CAR，其中所述胞外抗原结合域包含第一BCMA结合部分和第二BCMA结合部分。
实施方案13.根据实施方案12所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分和所述第二BCMA结合部分中的一者或多者是sdAb。
实施方案14.根据实施方案12或实施方案13所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分是第一抗BCMA sdAb，所述第二BCMA结合部分是第二抗BCMA sdAb。
实施方案15.根据实施方案12或实施方案13所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分是抗BCMA sdAb，所述第二BCMA结合部分来源于人抗体。
实施方案16.根据实施方案12或实施方案13所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分是抗BCMA sdAb，所述第二BCMA结合部分是BCMA的多肽配体。
实施方案17.根据实施方案12至实施方案16中的任一项所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分和所述第二BCMA结合部分特异性结合至BCMA上的相同的表位。
实施方案18.根据实施方案12至实施方案16中的任一项所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分和所述第二BCMA结合部分特异性结合至BCMA上的不同的表位。
实施方案19.根据实施方案12至实施方案18中的任一项所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分和/或所述第二BCMA结合部分特异性结合来源于选自SEQ ID NO:388-394氨基酸序列的BCMA上的表位。
实施方案20.根据实施方案12至实施方案19中的任一项所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分和所述第二BCMA结合部分中的一者或多者是根据实施方案1所述的抗BCMA sdAb。
实施方案21.根据实施方案12至实施方案20中的任一项所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分位于所述第二BCMA结合部分的N-末端。
实施方案22.根据实施方案12至实施方案20中的任一项所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分位于所述第二BCMA结合部分的C-末端。
实施方案23.根据实施方案12至实施方案22中的任一项所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分和所述第二BCMA结合部分通过肽接头彼此融合。
实施方案24.根据实施方案23所述的多价CAR，其中所述肽接头的长度不超过约50个氨基酸。
实施方案25.根据实施方案24所述的多价CAR，其中所述肽接头包含选自由SEQ IDNO:208-215组成的组的氨基酸序列。
实施方案26.根据实施方案9至实施方案25中的任一项所述的CAR或多价CAR，其中所述跨膜域来源于选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。
实施方案27.根据实施方案26所述的CAR或多价CAR，其中所述跨膜域来源于CD8α或CD28。
实施方案28.根据实施方案27所述的CAR或多价CAR，其中所述跨膜域包含SEQ IDNO:193或194的氨基酸序列。
实施方案29.根据实施方案9至实施方案28中的任一项所述的CAR或多价CAR，其中所述胞内信号传导域包括免疫效应细胞的主要胞内信号传导域。
实施方案30.根据实施方案29所述的CAR或多价CAR，其中所述主要胞内信号传导域来源于CD3ζ。
实施方案31.根据实施方案30所述的CAR或多价CAR，其中所述主要胞内信号传导域包含SEQ ID NO:197或198的氨基酸序列。
实施方案32.根据实施方案9至实施方案31中的任一项所述的CAR或多价CAR，其中所述胞内信号传导域包括共刺激信号传导域。
实施方案33.根据实施方案32所述的CAR或多价CAR，其中所述共刺激信号传导域来源于选自由CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合组成的组的共刺激分子。
实施方案34.根据实施方案33所述的CAR或多价CAR，所述共刺激信号传导域包含CD28的胞质域和/或CD137的胞质域。
实施方案35.根据实施方案34所述的CAR或多价CAR，其中所述共刺激信号传导域包含SEQ ID NO:195和/或SEQ ID NO:196的氨基酸序列。
实施方案36.根据实施方案32至实施方案35中的任一项所述的CAR或多价CAR，其中所述胞内信号传导域包括至少两个共刺激信号传导域。
实施方案37.根据实施方案9至实施方案36中的任一项所述的CAR或多价CAR，还包含位于所述胞外抗原结合域的C-末端和所述跨膜域的N-末端之间的铰链域。
实施方案38.根据实施方案37所述的CAR或多价CAR，其中所述铰链域来源于CD8α。
实施方案39.根据实施方案38所述的CAR或多价CAR，其中所述铰链域包含SEQ IDNO:192的氨基酸序列。
实施方案40.根据实施方案9至实施方案39中的任一项所述的CAR或多价CAR，还包含位于所述多肽的N-末端的信号肽。
实施方案41.根据实施方案40所述的CAR或多价CAR，其中所述信号肽来源于CD8α。
实施方案42.根据实施方案41所述的CAR或多价CAR，其中所述信号肽包含SEQ IDNO:191的氨基酸序列。
实施方案43.一种嵌合抗原受体，其包含选自由SEQ ID NO:216-256和298-335组成的组的氨基酸序列。
实施方案44.一种包含编码根据实施方案11至实施方案43中的任一项所述的CAR或多价CAR的核酸序列的经分离的核酸。
实施方案45.根据权利要求44所述的经分离的核酸，包含选自由SEQ ID NO:257-297和336-373组成的组的核酸序列。
实施方案46.根据实施方案45所述的经分离的核酸，还包含编码第二CAR的第二核酸序列，其中编码所述CAR的所述核酸序列通过编码自切割肽的第三核酸序列可操作地连接至所述第二核酸序列。
实施方案47.根据实施方案46所述的经分离的核酸，所述自切割肽选自由T2A、P2A和F2A组成的组。
实施方案48.根据实施方案47所述的经分离的核酸，所述第三核酸序列是SEQ IDNO:385。
实施方案49.根据实施方案44至实施方案48中的任一项所述的经分离的核酸，所述经分离的核酸是RNA分子。
实施方案50.一种包含根据实施方案44至实施方案49中的任一项所述的经分离的核酸的载体。
实施方案51.根据实施方案50所述的载体，其中所述载体是表达载体。
实施方案52.根据实施方案50或实施方案51所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
实施方案53.根据实施方案52所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。
实施方案54.根据实施方案50或实施方案51所述的载体，其中所述载体是非病毒载体。
实施方案55.一种经工程化的免疫效应细胞，其包含根据实施方案9至实施方案43中的任一项所述的CAR或多价CAR，根据实施方案44至实施方案49中的任一项所述的经分离的核酸，或根据实施方案50至实施方案54中的任一项所述的载体。
实施方案56.根据实施方案55所述的经工程化的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞是T细胞、NK细胞、外周血单核细胞(PBMC)、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞。
实施方案57.根据实施方案56所述的经工程化的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞是T细胞。
实施方案58.一种药物组合物，其包含根据实施方案55至实施方案57中的任一项所述的经工程化的免疫效应细胞和药学上可接受的载剂。
实施方案59.一种治疗个体的癌症的方法，包括将有效量的根据实施方案58所述的药物组合物施用于所述个体。
实施方案60.根据实施方案59所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
实施方案61.根据实施方案60所述的方法，其中所述癌症是难治性或复发性多发性骨髓瘤。
实施方案62.根据实施方案59至实施方案61中的任一项所述的方法，其中所述经工程化的免疫效应细胞是自体的。
实施方案63.根据实施方案59至实施方案61中的任一项所述的方法，其中所述经工程化的免疫效应细胞是同种异体的。
实施方案64.根据实施方案59至实施方案63中的任一项所述的方法，其中所述个体是人。
实施方案65.根据实施方案59至实施方案64中的任一项所述的方法，其中所述药物组合物静脉内施用。
实施方案66.根据实施方案59至实施方案65中的任一项所述的方法，其中所述药物组合物以约1×105至约1×107个细胞/kg的剂量施用。
实施方案67.根据实施方案59至实施方案66中的任一项所述的方法，其中所述药物组合物以3次分开剂量在约一周内施用。
实施方案68.根据实施方案58所述的药物组合物用于治疗个体的癌症的用途。
实施方案69.根据实施方案58所述的药物组合物用于制备治疗个体的癌症的药物的用途。
实施方案70.一种药物组合物，其包含根据实施方案1至实施方案8中的任一项所述的抗BCMA sdAb。
实施方案71.一种治疗个体的疾病的方法，包括将有效量的根据实施方案70所述的药物组合物施用于所述个体。
实施方案72.根据实施方案71所述的方法，其中所述疾病是癌症。
实施例
以下讨论的实施例旨在作为本发明的纯粹示例，不应视为以任何方式限制本发明。这些实施例不旨在表示以下实验是全部或仅进行的实验。已经努力确保关于所使用的数字(例如，数量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另外说明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力是大气压或接近大气压。
实施例1.抗BCMA sdAb的制备
为了开发对BCMA具有高结合亲和力的sdAb，用重组BCMA抗原免疫美洲驼。然后构建噬菌体展示文库以鉴定VHH前导序列。随机挑取不同的克隆，并根据重链互补决定区3(CDR3)(可以在抗原结合中发挥主要作用的区域)分类。以下描述了示例性方案。其他制备sdAb的方案已有所描述。参见例如，Els Pardon等人,Nature Protocol,2014；9(3):674。
1.动物免疫接种和免疫响应测定法
1.1动物免疫接种
将包含具有C-末端Fc标签的重组人BCMA蛋白(ACRO Biosystems，产品目录No.:BC7-H5254)的免疫原与佐剂或PBS混合，并注射到美洲驼。由服务供应商(Cedarline)免疫动物七次，通常每次用200μg免疫原和CFA(完全弗氏佐剂)，间隔约1周至2周。在免疫接种之前阶段和第5次和第7次免疫接种之后收集外周血样品。在多轮免疫接种之后，评估美洲驼对靶标抗原的免疫反应以确认抗原特异性sdAb的滴度。通过梯度离心从约100ml外周血分离淋巴细胞。细胞补充有RNALATERTM并储存在-80℃下。通过离心抗凝血液样品获得血清并储存在-80℃下。
1.2IgG分级分离
根据GenScript标准操作程序进行IgG子类分级分离。使用蛋白G和蛋白A树脂从尾部采血血清对IgG子类进行分级分离。将1ml血清样品上样至1ml
Figure BDA0003066909480000931
蛋白G HP柱上，并用10ml磷酸盐缓冲剂(20mM,pH7.0)洗涤柱。用0.15M NaCl、0.58％乙酸(pH3.5)洗脱IgG3(MW 100,000Da)级分，并用1M Tris-HCl(pH9.0)中和洗脱液至pH7.4。随后，用0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7)洗脱IgG1(MW 170,000Da)级分，并用1M Tris-HCl(pH8.5)中和洗脱液至pH7.4。然后将
Figure BDA0003066909480000932
蛋白G HP柱的流出物上样至1ml
Figure BDA0003066909480000933
蛋白AHP柱上，并用20ml磷酸盐缓冲剂(20mM,pH7.0)洗涤柱。用0.15M NaCl、0.58％乙酸(pH4.5)洗脱IgG2(MW 100,000Da)级分，并用1M Tris-HCl(pH9.0)中和洗脱液至pH7.4。通过OD280测定纯化的IgG1、IgG2和IgG3抗体的浓度，并通过还原和非还原SDS-PAGE分析评估各自的纯度。
1.3免疫响应测定
通过ELISA评估美洲驼的免疫响应，其中测定了血清样品和经纯化的IgG与固定化的免疫原的结合。评估免疫接种之前、第5次免疫接种之后和尾部采血时收集的血清。在涂覆缓冲剂中以4μg/ml稀释抗原(即，重组人抗原蛋白)。用稀释的抗原在4℃下涂覆微量滴定板过夜。然后用洗涤缓冲剂洗涤板3次，接着在室温下封闭2小时。随后用洗涤缓冲剂洗涤板4次。将一系列稀释血清或IgG加入板并在室温下孵育1.5小时。然后用洗涤缓冲剂洗涤板4次。将HRP缀合的抗美洲驼IgG二抗加入板并在室温下孵育1小时。在洗涤之后，将TMB底物加入每个孔，孵育10分钟，然后用1M HCl终止。为了定量结合，使用MK3分光光度计测量每个孔的450nm下的吸光度。
2.VHH噬菌体展示文库构建
2.1RNA提取
根据制造商的方案，使用
Figure BDA0003066909480000941
试剂从经分离的淋巴细胞(来自1.1.1)提取总RNA。通过凝胶电泳评估总RNA的数量和质量，并通过测量OD260/280下的吸光度来定量。
2.2RT-PCR和VHH扩增
根据制造商的方案，使用PRIMESCRIPTTM第1链cDNA合成试剂盒，用寡(dT)20引物将总RNA逆转录为cDNA。设计六个正向和两个反向特异性简并引物以扩增VHH片段，这些引物具有两个引入的BglI限制性位点。如下文所述，根据GenScript标准操作程序扩增VHH片段。
使用两步聚合酶链式反应(PCR)扩增重链免疫球蛋白的可变区(即，VHH)。在第一PCR中，将100ng cDNA模板与引物CALL001(SEQ ID NO:374)和CALL002(SEQ ID NO:375)混合。通过琼脂糖凝胶电泳分析来自第一PCR反应的DNA产物。在凝胶纯化之后，将第一PCR的DNA产物用作第二PCR中的模板。使用引物BACK-1(SEQ ID NO:376)、BACK-2(SEQ ID NO:377)和PMCF(SEQ ID NO:378)执行第二PCR。将含有VHH PCR片段的经扩增的第二PCR产物进行凝胶纯化和酶消化，然后将其插入噬菌粒质粒。将具有VHH基因片段的重组质粒电转入大肠埃希氏菌细胞，以产生噬菌体展示VHH免疫文库。
PCR反应的程序为在94℃下进行初始变性步骤7min，然后是94℃1min、55℃1min和72℃1min，共30个循环；然后在72℃下进行最后延伸步骤7min。
2.3噬菌体文库构建
通过使用不同的引物对扩增来获得VHH PCR产物。然后用BglI消化PCR产物并进行凝胶纯化。将凝胶纯化的片段插入GenScript的内部噬菌粒载体。构建试验性文库以优化连接和转化条件。利用优化的连接和转化条件来开发噬菌粒文库。稀释一小部分转化细胞并在补充有100μg/ml氨苄青霉素的2×YT平板上划线。对菌落进行计数以计算文库大小。随机挑取阳性克隆并测序以评估文库的质量。将其余的转化细胞划线至补充有100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的YT平板上。从平板上刮下菌落的菌苔。将小等分细胞用于文库质粒分离。其余部分补充有甘油并储存在-80℃下作为原种。
3.噬菌体展示淘选
3.1生物淘选
使用GenScript开发的标准程序分别针对重组人BCMA蛋白和表达人BCMA的CHO细胞(即，由Legend Biotec内部制备的CHO-BCMA细胞)淘选所构建的VHH噬菌体文库。使文库原种生长至对数期，然后用M13KO7辅助噬菌体拯救文库并在摇床中25℃下扩增过夜。然后用PEG/NaCl沉淀噬菌体，重悬于PBS中并储存在-80℃下。对于固相淘选，用溶于PBS的重组人BCMA蛋白在4℃下涂覆微板孔过夜。对于液相淘选，用封闭缓冲剂在室温下封闭CHO-BCMA细胞1小时。在涂覆或封闭步骤期间，用封闭缓冲剂和Fc对照蛋白在微板孔中预孵育噬菌体颗粒。在预孵育之后，将噬菌体颗粒加入分别用BCMA蛋白或CHO-BCMA溶液涂覆的孔并孵育1小时。在孵育之后，通过用PBST冲洗孔或CHO-BCMA细胞六次并再用PBS洗涤两次来洗掉未结合的和非特异性结合的噬菌体。用100mM三乙胺(TEA)洗脱结合的噬菌体颗粒，并用1MTris-HCl(pH7.4)中和洗脱液。然后将一半洗脱液用于感染指数生长的大肠埃希氏菌TG1细胞(OD600＝0.4～0.6)，以用于输出滴定。
3.2噬菌体ELISA
进行噬菌体ELISA以鉴定靶标抗原特异性克隆。使单个输出噬菌体克隆在96孔深孔板中生长，并用M13KO7辅助噬菌体拯救过夜。为了鉴定结合至抗原蛋白的克隆，分别用重组人BCMA蛋白和Fc对照蛋白在涂覆缓冲剂中4℃下涂覆96孔ELISA微量滴定板过夜，然后用封闭缓冲剂封闭板。在封闭之后，将来自过夜细胞培养物的大约50μl/孔的噬菌体上清液加入板，在4℃下孵育1.5小时。洗涤板四次，并将HRP缀合的抗M13单克隆抗体加入板，在4℃下孵育45分钟。再洗涤板五次，并将底物溶液加入孔以进行显色。测量每个孔在450nm下的吸光度。
为了鉴定结合CHO-BCMA细胞的克隆，用封闭缓冲剂在室温下封闭CHO-BCMA细胞1小时。在封闭之后，将来自过夜细胞培养物的大约20μl/孔的噬菌体上清液加入细胞溶液，在室温下孵育1小时。在洗涤细胞4次之后，加入HRP缀合的抗M13单克隆抗体，在室温下孵育30分钟。洗涤细胞五次，然后加入底物溶液以进行显色。测量在450nm下的吸光度。在淘选之后，随机选择ELISA阳性噬菌体克隆，并使用质粒提取试剂盒从输出噬菌体制备DNA。对质粒中的抗BCMA VHH测序。
实施例2.示例性单价BCMA嵌合抗原受体的制备
化学合成编码从N-末端至C-末端包含：CD8α铰链域、CD28跨膜域、CD28胞质域、CD137胞质域和CD3ζ胞质域的CAR骨架多肽的核酸序列，并将该核酸序列克隆至预修饰的慢病毒载体下游，并可操作地连接至组成型hEF1α启动子。将所得的CAR骨架载体命名为“PLLV-hEF1α-8281373”。载体中的多克隆位点(MCS)允许包含Kozak序列(SEQ ID NO:379)(可操作地连接至编码CD8α信号肽的核酸序列，所述CD8α信号肽融合至VHH片段的N-末端)的核酸序列插入PLLV-hEF1α-8281373载体上游，并可操作地连接至CAR骨架序列。
为了使用PLLV-hEF1α-8281373骨架构建具有单个VHH域的单特异性CAR，将编码VHH域的核酸序列可操作地连接至编码CD8α信号肽的核酸序列的3’。化学合成融合核酸序列，并通过本领域已知的分子克隆技术通过EcoRI(SEQ ID NO:380:5’-GAATTC-3’)和SpeI(SEQID NO:381:5’-ACTAGT-3’)限制性位点克隆至PLLV-hEF1α-8281373CAR骨架。表4列出了构建为表达示例性单特异性、单价抗BCMA CAR的载体。
为了便于进一步插入另外的序列，诸如编码第二VHH的核苷酸，当设计单特异性CAR构建体时，将限制性位点(包括HpaI(SEQ ID NO:382:5’-GTTAAC-3’)、MluI(SEQ ID NO:383:5’-ACGCGT-3’)、NsiI(SEQ ID NO:384:5’-ATGCAT-3’)位点)包括在CD8α信号肽核酸序列和VHH核酸序列之间。
将慢病毒包装质粒混合物(包含pCMV-ΔR-8.74和pMD2.G(Addgene#12259))与具有VHH片段的载体PLLV-hEF1α-8281373(与聚醚酰亚胺(PEI)呈预优化的比例)预混合，然后适当混合并在室温下孵育5分钟。然后将转染混合物逐滴加入HEK293细胞并轻轻混合。其后，将细胞在37℃和5％CO2细胞孵育箱中孵育过夜。在4℃下500g离心10min后收集上清液。
通过0.45μm PES滤膜过滤含有病毒的上清液，然后超离心以进行慢病毒浓缩。在超离心之后，小心弃去上清液，并用预冷的DPBS小心冲洗病毒沉淀。将病毒适当等分，然后立即储存在-80℃下。基于GenScript开发的HTRF试剂盒，通过p24测定病毒滴度。
PBMC制备
通过单采血液成分术从健康供体收集白细胞，并将R10培养基中的细胞浓度调整至5×106个细胞/ml。然后将白细胞与0.9％NaCl溶液以1:1(v/v)的比例混合。将3mllymphoprep培养基加入15ml离心管，并使6ml稀释的淋巴细胞混合物在lymphoprep培养基的上部缓慢分层。将淋巴细胞混合物以800g在20℃下不中断离心30分钟。然后用200μl移液管收集淋巴细胞血沉棕黄层。用0.9％NaCl或R10稀释所收集的级分至少6倍，以降低溶液的密度。然后在20℃下以250g离心所收集的级分10分钟。将上清液全部吸出，并将10ml R10加入细胞沉淀，以使细胞沉淀重悬。在20℃下以250g进一步离心混合物10分钟。再次吸出上清液。将2ml 37℃预热的含有100IU/ml IL-2的R10加入细胞沉淀，并轻轻重悬细胞沉淀。在台盼蓝染色后测定细胞数，并将该PBMC样品准备用于后续实验。
T细胞纯化
根据以下所述的制造商的方案，使用Miltenyi Pan T细胞分离试剂盒(目录号130-096-535)从PBMC纯化人T细胞。首先测定细胞数，并以300g离心细胞悬浮液10分钟。然后将上清液全部吸出，并将细胞沉淀重悬于缓冲剂中，每107个总细胞40μl缓冲剂。每107个总细胞加入10μl Pan T细胞生物素-抗体混合物，充分混合并在冰箱中(2～8℃)孵育约5分钟。然后，每107个细胞加入30μl缓冲剂。每107个细胞加入20μl Pan T细胞微珠粒混合物。充分混合细胞悬浮液混合物，并在冰箱中(2～8℃)再孵育10分钟。磁力分离最少需要500μl。对于磁力分离，将LS柱置于合适的MACS分离器的磁场中。通过用3ml缓冲剂冲洗来准备柱。然后将细胞悬浮液施加至柱上，并收集含有未标记的细胞的流出物，该流出物代表富集的T细胞级分。通过用3ml缓冲剂洗涤柱并收集通过的未标记的细胞来收集另外的T细胞。这些未标记的细胞再次代表富集的T细胞，并将它们与前一步骤的流出物合并。然后离心合并的富集T细胞并重悬于R10+100IU/ml IL-2中。
随后根据制造商的方案用人T细胞活化/扩增试剂盒(Miltenyi#130-091-441)预活化所制备的T细胞48-96小时，其中抗CD3/CD28 MACSiBead颗粒以1:2的珠粒-与-细胞比例加入。
体外细胞毒性测定
在存在7μg/ml聚凝胺的情况下用慢病毒原种转导预活化的T细胞，并在32℃下以1200g离心1.5小时。然后将转导的细胞转入细胞培养孵育箱，以在合适的条件下进行转基因表达。
在转导后第3天或第7天，收集转导的T细胞，并以20:1的效应细胞(CAR-T)与靶标细胞之比与肿瘤细胞一起共孵育20小时。靶标细胞是人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226.Luc、重组表达BCMA的人细胞系K562.BCMA.Luc细胞、重组表达CD19的K562.CD19.Luc细胞系、或人胶质母细胞瘤细胞系U87MG.Luc细胞。所有细胞系均被内部工程化为表达萤火虫荧光素酶。为了测定CAR-T对肿瘤细胞的细胞毒性，根据制造商的方案制备ONE-GLOTM发光荧光素酶测定试剂(Promega#E6110)，并将其加入共培养的细胞，以检测孔中的剩余荧光素酶活性。由于荧光素酶仅在靶标细胞中表达，孔中的剩余荧光素酶活性与孔中活靶标细胞的数量直接相关。在不存在效应细胞的情况下通过将培养基加入靶标细胞来获得最大荧光素酶活性。通过在引发细胞毒性测定时以1％的终浓度加入Triton X-100来测定最小荧光素酶活性。通过下式计算特异性细胞毒性：特异性细胞毒性％＝100％×(1-(RLU样品-RLU最小)/(RLU最大-RLU最小))。
选择示例性单价CAR靶向性BCMA(CD269)并在细胞毒性测定中进行测试。如图1A所示，在测试的第一组单价BCMA CAR中，所选的克隆表现出针对多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226.Luc细胞的不同水平的细胞毒性，其中超过60％的基于单价VHH的CAR-T显示出针对RPMI8226.Luc细胞的>50％细胞毒性。选择基于克隆269A37346、269A37348、269A37353和269A37355的CAR-T用于进一步测试。具体而言，基于克隆269A37346、269A37348、267A37353和269A37355的CAR-T表现出针对多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226.Luc细胞的强效细胞毒性，与未转导的对照T细胞(UnT)相比，CAR-T处理杀死的RPMI8226.Luc细胞增加超过20％-30％。然而，对于人胶质母细胞瘤细胞系U87MG.Luc细胞，这种细胞毒性增加不发生(参见图1B)。与UnT对照相比，未通过这些基于单价VHH的CAR-T细胞检测到针对U87MG.Luc的显著细胞毒性作用。上述观察结果表明，这些克隆中的一些可能具有靶标特异性，并且对BCMA阳性细胞有效。
评估第二组示例性单价BCMA CAR的体外细胞毒性。GSS005，即包含抗BMCA scFv的CAR，作为阳性对照。GSI026，即包含抗EGFRvIII scFv的CAR，作为阴性对照。如图2A-2B所示，所选的克隆表现出针对多发性骨髓瘤细胞RPMI8226.Luc和过表达BCMA的稳定细胞系K562.BCMA.Luc的不同水平的细胞毒性。所有克隆均未显示出针对BCMA阴性细胞系K562.CD19.Luc的强效细胞毒性(图2C)。根据细胞毒性数据，在这些克隆中，基于269B005S、269B028S、269B030S、269B054S、269B060S、269B069S、269B093S、269B094S、269B104S、269B109S、269B110S和269B129S的CAR-T最强效。
IFNγ释放
另外，收集体外共培养测定的上清液，以评估CAR诱导的细胞因子释放，例如干扰素γ(即，IFN)释放。如图3所示，表达所选的单价BCMA CAR的T细胞在与表达BCMA的靶标细胞K562.BCMA.Luc.共培养后释放高水平的IFNγ。在共培养中，非特异性CAR-T(诸如GSI026)或未转导的T细胞(UnT)不诱导IFNγ的释放。细胞因子释放数据与体外细胞毒性数据一致。
实施例3.示例性多价BCMA嵌合抗原受体的制备
基于多价VHH的CAR可以通过将编码多个拷贝的VHH或多个不同的通过肽接头彼此融合的VHH的核酸序列克隆至CAR信号域骨架载体来构建。示例性多价BCMA CAR构建体如表5所示。这些构建体通过以下步骤制备：使2-3个抗BCMA VHH通过甘氨酸-丝氨酸肽接头融合，然后与Kozak-CD8α信号肽核酸序列组合直接合成该融合序列，并通过EcoRI和SpeI限制性位点克隆至PLLV-hEF1α-81373CAR骨架中。单价BCMA CAR构建体也克隆至相同的PLLV-hEF1α-81373CAR骨架中以作为对照(例如，表4的GSI5011、GSI5019和GSI5020)。
包装携带CAR基因的慢病毒载体，并且如实施例2所述的方案滴定。使用实施例2所述的方案，从志愿者的外周血制备人PBMC，以用于使用Miltenyi人Pan T细胞分离试剂盒进一步分离原代人T细胞。如实施例2所述，使用Miltenyi抗CD3/CD28微珠粒预活化和扩增经纯化的T细胞。然后在存在7μg/ml聚凝胺的情况下，通过在32℃下以1200g离心1.5小时，用慢病毒原种转导预活化的T细胞。然后将转导的细胞转入细胞培养孵育箱，以在合适的条件下进行转基因表达。
体外细胞毒性测定
在转导后第3天，收集转导的T细胞并与肿瘤细胞一起共孵育。为了测定CAR-T对肿瘤细胞的细胞毒性，将ONE-GLOTM发光荧光素酶测定试剂加入共培养的细胞，并如实施例2所述测量每个CAR-T的特异性细胞毒性。
在第一实验中，将表达单价BCMA CAR(GSI5011)、二价BCMA CAR(GSI5014)和三价BCMA CAR(GSI5015)的T细胞以20:1的效应细胞与靶标细胞之比与RPMI8226.Luc细胞一起共培养20小时。全部三个CAR构建体均包含克隆269A37346的抗BCMA VHH域。如图4A所示，与未转导的对照T细胞(UnT)裂解RPMI8226.Luc细胞的特异性百分比0.05％±2.33％相比，表达GSI5011的CAR-T细胞裂解RPMI8226.Luc细胞的特异性百分比为63.25±2.64％，表达GSI5014的CAR-T细胞裂解RPMI8226.Luc细胞的特异性百分比为61.04±2.75％，并且表达GSI5015的CAR-T细胞裂解RPMI8226.Luc细胞的特异性百分比为59.57±2.64％。所测试的具有不同抗原结合形式的BCMA CAR具有针对BCMA阳性细胞的强效抗肿瘤活性。
在第二实验中，测试具有两个不同BCMA结合部分269A37353和269A37917的示例性二价BCMA CAR(GSI5021-GSI5026)。将表达每个二价BCMA CAR的经工程化的T细胞以20:1的效应细胞与靶标细胞之比与RPMI8226.Luc细胞一起共培养20小时。还测试单价BCMA CAR，即GSI5019和GSI5020，以用于比较。如图4B所示，分别与未转导的对照T细胞(UnT)裂解RPMI8226.Luc细胞的特异性百分比13.49％±1.75％相比，表达GSI5019的CAR-T细胞裂解RPMI8226.Luc细胞的特异性百分比为88.21±1.29％，表达GSI5020的CAR-T细胞裂解RPMI8226.Luc细胞的特异性百分比为93.84±1.13％，表达GSI5021的CAR-T细胞裂解RPMI8226.Luc细胞的特异性百分比为71.45±1.79％，表达GSI5022的CAR-T细胞裂解RPMI8226.Luc细胞的特异性百分比为99.80±0.45％，表达GSI5023的CAR-T细胞裂解RPMI8226.Luc细胞的特异性百分比为97.46±0.50％，表达GSI5024的CAR-T细胞裂解RPMI8226.Luc细胞的特异性百分比为81.29±1.27％，表达GSI5025的CAR-T细胞裂解RPMI8226.Luc细胞的特异性百分比为93.50±0.47％，表达GSI5026的CAR-T细胞裂解RPMI8226.Luc细胞的特异性百分比为87.83±0.23％。另外，如图4C所示，与未转导的对照T细胞(UnT)裂解BCMA阴性细胞系U87MG.Luc的特异性百分比12.49％±3.79％相比，表达GSI5019的CAR-T细胞裂解BCMA阴性细胞系U87MG.Luc的特异性百分比为2.84±7.41％，表达GSI5020的CAR-T细胞裂解BCMA阴性细胞系U87MG.Luc的特异性百分比为15.50±2.24％，表达GSI5021的CAR-T细胞裂解BCMA阴性细胞系U87MG.Luc的特异性百分比为6.74±3.37％，表达GSI5022的CAR-T细胞裂解BCMA阴性细胞系U87MG.Luc的特异性百分比为8.03±2.36％，表达GSI5023的CAR-T细胞裂解BCMA阴性细胞系U87MG.Luc的特异性百分比为9.00±1.88％，表达GSI5024的CAR-T细胞裂解BCMA阴性细胞系U87MG.Luc的特异性百分比为17.03±2.27％，表达GSI5025的CAR-T细胞裂解BCMA阴性细胞系U87MG.Luc的特异性百分比为16.81±1.98％，表达GSI5026的CAR-T细胞裂解BCMA阴性细胞系U87MG.Luc的特异性百分比为-11.55±5.43％。数据表明，具有不同的抗原结合形式的二价CAR具有针对BCMA阳性细胞的强效抗肿瘤活性，但没有针对BCMA阴性细胞的抗肿瘤活性。
在第三实验中，构建具有两个不同BCMA结合部分的示例性二价BCMA CAR(即，BCAR001-BCAR008)，并且从由R/R MM患者供体#13获得的原代T细胞制备表达二价BCMA CAR的经工程化的CAR-T细胞。将表达内部开发的萤火虫荧光素酶的细胞系(包括RPMI8226(人多发性骨髓瘤细胞系)、A549(人肺癌细胞系)、U87-MG(人胶质母细胞瘤细胞系)和Raji(人伯基特(Burkitt)淋巴瘤细胞系))用作靶标细胞，并与每组转导T细胞一起(效应细胞:靶标细胞之比为20:1或5:1)在37℃/5％CO2细胞孵育箱中共培养20小时。在共培养完成后，使用ONE-GLOTM发光荧光素酶测定试剂盒(Promega)测定剩余的荧光素酶活性(相对光单位，RLU)，以评估每种CAR-T的细胞毒性。如图5A-5E所示，二价BCMA CAR-T具有针对RPMI8226.Luc、K562.BCMA.Luc和Raji.Luc细胞的剂量依赖性细胞毒性，但针对BCMA阴性A549.Luc和U87-MG.Luc细胞的细胞毒性很小。图5F中的数据证实，二价BCMA CAR-T细胞针对肿瘤细胞的细胞毒性是BCMA特异性的，因为CAR-T细胞没有针对为CD38+/BCMA-的K562.C38.Luc细胞的细胞毒性。与UnT处理的靶标细胞相比，BCAR001-BCAR008 CAR-T细胞处理的K562.BCMA.Luc仅显示出有限的残留荧光素酶活性(即，活细胞)(与UnT的100±3.95％相比，BCAR001-BCAR008分别为2.88±0.45％、12.84±1.67％、2.22±0.56％、1.77±0.14％、2.59±0.28％、6.58±1.19％、2.47±0.20％、6.61±1.47％，平均值±标准误差)。这些结果证实了二价BCMA CAR-T细胞针对K562.BCMA.Luc细胞的强效细胞毒性。与UnT处理的靶标细胞相比，BCAR001-BCAR008 CAR-T细胞不具有针对K562.CD38.Luc细胞的显著细胞毒性，因为未检测到荧光素酶活性显著降低(与UnT的100±6.58％相比，BCAR001-BCAR008分别为111.82±5.11％、111.72±3.43％、104.74±0.24％、95.04±2.70％、93.93±7.23％、97.72±1.86％、111.90±2.01％、108.33±4.05％，平均值±标准误差)。这些数据表明，二价BCMA CAR-T的细胞毒性是BCMA依赖性的。
IFNγ释放
另外，收集来自体外共培养测定的上清液，以评估CAR诱导的细胞因子释放(例如，干扰素γ，IFNγ释放)。如图6A-6B所示，共培养测定中的IFNγ释放是CAR依赖性和BCMA特异性的，这与体外细胞毒性数据(表6)一致。
表6.在共培养测定中二价BCMA CAR-T引起的IFNγ释放
Figure BDA0003066909480000991
Figure BDA0003066909480001001
整合CAR基因的拷贝数
每个转导的T细胞组的整合CAR基因的拷贝数通过半定量PCR(q-PCR)测定法来确定。简而言之，用Gentra Puregene细胞试剂盒(Qiagen)制备每组CAR-T的基因组DNA。通过Nanodrop测定基因组DNA的浓度，并处理10ng基因组DNA样品，以使用SYBR Green RealtimePCR主混合物+(SYBR Green Realtime PCR Master mix plus，Toyobo)在ABI#7300q-PCR仪器上使用CAR特异性引物(正向引物137P2F，SEQ ID NO:398:5’-GTCCTTCTCCTGTCACTGGTTAT-3’；和反向引物137P2R，SEQ ID NO:399:5’-TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCA-3’)进行标准化q-PCR测定。根据使用含有靶标序列的质粒建立的标准曲线计算每个整合CAR基因的相对拷贝数。
如表7所示，在每种CAR-T制剂中，将高拷贝数CAR载体整合进T细胞的基因组中。
表7.基因组整合拷贝数。
具有构建体的CAR-T细胞 拷贝/ng gDNA
GSI5019 35091.6
GSI5020 27627.2
GSI5021 24926.8
GSI5022 26393.6
GSI5023 32376.3
GSI5024 39319.8
GSI5025 22269.3
GSI5026 34790.4
UnT 26.6
实施例4.LCAR-B38M中两个VHH域的表位作图和差异表位结合
对四个抗BCMA VHH域的表位进行作图。构建具有特异性结合至BCMA的不同表位的两个不同抗BCMA VHH域的示例性二价BCMA CAR。将包含VHH1和VHH2的二价/双表位CAR命名为LCAR-B38M CAR，它是表5中列出的一种多价BCMA CAR。
表面等离子共振(SPR)测定
将四种示例性抗BCMA VHH序列中的每种克隆至含有人IgG1 Fc片段(hIgG1Fc)序列的载体中，以促进BCMA VHH-hIgG1Fc的重组表达。获得重组蛋白并纯化以用于SPR测定。
使用
Figure BDA0003066909480001003
2000分析系统(GE Healthcare)通过SPR测定每种VHH-hIgG1Fc对BCMA的亲和力。简而言之，使用4μg/ml VHH-hIgG1Fc将每种VHH-hIgG1Fc蛋白共价偶联至CM5传感器芯片。在运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％Tween-20，pH7.4)中连续稀释重组BCMA-His蛋白(ACRO Biosystems,目录号BCA-H522y)，并以10μl/min的流速注射，然后进行解离。使用
Figure BDA0003066909480001004
2000评估软件3.0版测定缔合和解离速率常数(Langmuir结合、局部拟合、1:1结合模型)。四种VHH-hIgG1Fc的结合亲和力如表8所示。
表8.VHH-hIgG1Fc与人BCMA-His蛋白的结合亲和力。
Figure BDA0003066909480001002
Figure BDA0003066909480001011
重组VHH-His蛋白与靶标细胞的结合
通过将抗BCMA VHH序列融合至人白蛋白信号肽序列(N’-MKWVTFISLLFLFSSAYS-C’；SEQ ID NO:386)的N末端，和6×His标签(N’-GSGHHHHHH-C’；SEQ ID NO:387)的C末端来构建重组抗BCMA VHH-His蛋白。进一步优化密码子以在哺乳动物宿主细胞中进行最佳表达。然后通过5’-XbaI和3’-HindIII限制性位点将所获得的核苷酸序列克隆至哺乳动物表达载体pTT5中，以提供质粒pTT5-LAB001(对于VHH1)、pTT5-LAB002(对于VHH2)和pTT5-LAB003(对于VHH1×VHH2)。
为了获得重组BCMA VHH蛋白，用质粒瞬时转染HEK293T细胞。简而言之，在转染之前一天将5×106个HEK293T细胞接种于10cm细胞培养皿中。第二天，使用LIPOFECTAMINETM2000试剂(Thermofisher Scientific,目录号：11668-019)根据制造商的手册用每种质粒转染细胞。在转染后四天，收集上清液，并使用HRP抗His标签(Biolegend,目录号:652504)通过ELSIA检测抗体的表达水平。LAB001、LAB002和LAB003的表达水平分别为109.31ng/ml、152.48ng/ml和396.62ng/ml。
使用基于细胞的测定法来测定LAB001、LAB002和LAB003抗BCMA VHH-His蛋白的结合亲和力。简而言之，用1×105个靶标细胞(K562.BCMA.Luc或K562.CD38.Luc细胞，它们分别是内部开发的稳定表达BCMA或CD39的细胞系)在4℃下孵育连续稀释的抗BCMA VHH-His蛋白2小时。其后，以300g离心细胞10min，并弃去上清液。用DPBS重悬细胞沉淀。洗涤细胞沉淀，离心，并再次弃去上清液2次。随后用含有检测抗体(THETM His标签抗体[FITC]，GenScript Cat:A01620)的缓冲剂重悬细胞沉淀45min，在4℃下放置2小时。其后，以300g离心细胞10min，并弃去上清液。洗涤细胞沉淀，离心，并再次弃去上清液2次。使用ATTUNETM下一代流式细胞仪测定LAB001、LAB002和LAB003与K562.BCMA.Luc或K562.CD38.Luc细胞的结合亲和力。通过GraphPad PRISMTM 6.0版使用“一个位点-具有坡度斜率的特异性结合(Onesite-Specific binding with Hill slope)”拟合数据。
如图7A-7C所示，LAB001、LAB002和LAB003以剂量依赖性方式特异性结合至K562.BCMA.Luc细胞。结合亲和力分别为0.079nM、0.035nM和0.0047nM。所有抗体均未显示出与BCMA阴性细胞系K562.CD38.Luc.的显著结合。此外，LAB003(VHH1×VHH2)显示的结合亲和力(0.0047nM)显著大于LAB001(VHH1)或LAB002(VHH2)。
表位结合
BCMA(NP_001183,UniProt#Q02223)是长度为184个氨基酸的跨膜蛋白。人BCMA由胞外域(ECD，氨基残基数1-54)、跨膜域(TM，氨基残基数55-77)和胞质域(CD，氨基残基数78-184)组成。此外，序列分析表明，BCMA在N末端无可识别的信号肽(Laabi Y等人(1992)EMBO J 11:3897–3904；Laabi Y等人(1994)Nucleic Acids Res 22:1147–1154；Gras M P(1995)Int Immunol 7:1093–1106；Hong-Bing Shu和Holly Johnson(2000):Proc.Natl.Acad.Sci.USA,10.1073)。
另外如在线数据库UniProt(www.uniprot.org/uniprot/Q02223)所示，3个二硫键(Cys-Cys)位于BCMA的ECD，它们处于位置
Figure BDA0003066909480001012
和
Figure BDA0003066909480001013
(表9)。BCMA ECD的二级结构从N-末端至C-末端由β链(aa12-15)、转角(aa16-19)、β链(aa20-23)、螺旋(aa24-27)、β链(aa30-32)、螺旋(aa35–37)、转角(aa38-40)和转角(aa42-44)组成。BCMA ECD的结构如图8A所示，它从PDB数据库www.ebi.ac.uk/pdbe/entry/pdb/2kn1/的结构复制。
表9.人BCMA的蛋白质序列。
Figure BDA0003066909480001021
如图8B和表10所示设计BCMA表位肽(269EP001-269EP007)，化学合成并在N-末端生物素化。使用ELISA测定VHH1-hIgG1Fc或VHH2-hIgG1Fc的结合亲和力。简而言之，将上述肽在4℃下以1μM涂覆于MAXISORPTM ELISA板上过夜。第二天，用PBST(添加0.5％TWEEN-20)洗涤板两次，然后用0.5％BSA在室温下封闭板1h。然后用PBST洗涤板两次，然后一式三份加入10nM连续稀释的VHH1-hIgG1Fc或VHH2-hIgG1Fc，然后在4℃下孵育2h。然后用冷PBST洗涤板3次，其后将山羊抗美洲驼HRP(1:1500,Bethyl Lab#A160)加入每个孔，并在室温下再孵育1h。然后用PBST洗涤板4次，将TMB底物加入每个孔，并在室温下孵育10-30min。然后在
Figure BDA0003066909480001022
10M微孔板读取仪上读取板在450nm下的吸光度。
表10.BCMA表位肽序列。
表位 位置 氨基酸残基序列 长度
269EP001 1-10 MLQMAGQCSQ(SEQ ID NO:388) 10
269EP002 8-21 CSQNEYFDSLLHAC(SEQ ID NO:389) 14
269EP003 11-23 NEYFDSLLHACIP(SEQ ID NO:390) 13
269EP004 20-30 ACIPCQLRCSS(SEQ ID NO:391) 11
269EP005 24-42 CQLRCSSNTPPLTCQRYCN(SEQ ID NO:392) 19
269EP006 36-43 LTCQRYCNAS(SEQ ID NO:393) 10
269EP007 43-54 ASVTNSVKGTNA(SEQ ID NO:394) 12
如图9A所示，VHH1显示出与269EP005肽的结合最强，然后是与269EP004肽的结合。然而，与269EP005和269EP004相比，VHH1与269EP003和269EP006的结合相对较弱。VHH1倾向于结合位于269EP005肽的表位(即，BCMA ECD的氨基酸24-36)，其含有螺旋(aa24-27)、β链(aa30-32)和螺旋(aa35–37)的二级结构。
如图9B所示，VHH2显示出与269EP002肽的结合最强，然后是与269EP003肽的结合。然而，与269EP002和269EP003相比，VHH1与269EP001和269EP004的结合相对较弱。虽然BCMAECD的第一β链(aa12-15)和β链(aa20-23)主要位于269EP002(aa8-21)和269EP003(aa11-23)涵盖的序列，但是VHH2倾向于结合至位于前两个β链的表位。
竞争性结合测定
通过基于细胞的竞争性结合测定来进一步验证VHH1和VHH2的差异表位结合。将过表达人BCMA的稳定CHO细胞系(“CHO-BCMA”)用于测定。
简而言之，用12.5ng/ml LAB001(在C末端含有6×His标签)一式两份在4℃下预孵育0.5×106个CHO-BCMA细胞0.5h。然后将连续稀释的VHH2-hIgG1Fc重组抗体加入板的每个孔，并在4℃下再孵育1h。在孵育之后，用500μl DPBS洗涤细胞，并以300g离心10min。用含有抗His标签-FITC的DPBS(1:200,GenScript Cat:A16020)重悬细胞沉淀，然后用500μl DPBS洗涤细胞，并以300g离心10min。用DPBS重悬细胞沉淀，然后在ATTUNETM下一代流式细胞仪上进行FACS分析。作为测定对照，根据上述并列的相同程序，在不存在LAB001的情况下用CHO-BCMA细胞直接孵育连续稀释的VHH2-hIgG1Fc。将山羊抗人IgG(Fc特异性)-FITC抗体(SigmaAldrich Cat:F9512)用于检测VHH2-hIgG1Fc与CHO-BCMA细胞的结合。如图10所示，VHH2-hIgG1Fc单独以剂量依赖性方式结合至CHO-BCMA。然而，VHH2-hIgG1Fc不能与VHH1-His竞争结合至CHO-BCMA细胞，这表明BCMA上具有VHH1和VHH2的不同结合位点。
实施例5.LCAR-B38M CAR-T在肿瘤异种移植小鼠中的体内功效
评估LCAR-B38M CAR-T细胞在具有多发性骨髓瘤肿瘤异种移植物的NCG小鼠模型(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/NjuCrl)中的体内抗肿瘤功效。LCAR-B38M CAR是具有两个靶向不同BCMA表位的抗BCMA VHH域的二价BCMA CAR。
在NOD/Nju小鼠中通过Prkdc和Il2rg基因座的连续CRISPR/Cas9编辑产生NCG小鼠模型，得到NOD/Nju的同类系小鼠。NOD/Nju小鼠携带Sirpa(SIRPα)基因的突变，该突变允许外源造血干细胞的移植。Prkdc敲除产生缺乏适当的T细胞和B细胞形成的SCID样表型。Il2rg基因的敲除进一步加剧了SCID样表型，同时还使NK细胞产生减少。因此，NCG小鼠是比通常使用的免疫缺陷小鼠品系(包括SCID和裸鼠)的免疫受损程度更高的“三重免疫缺陷”小鼠品系。
Prkdc和Il2rg是影响T细胞、B细胞、NK细胞以及在较小程度上树突细胞的成熟和形成的SCID(严重复合型免疫缺乏症)基因家族的一部分。Prkdc编码DNA依赖性蛋白激酶的催化亚基，该亚基是在成熟T和B细胞中增加抗体多样性的必要过程(即V(D)J重组)必需的。Il2rg编码IL-2和多种IL受体(IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21)中存在的常见γ亚基，该亚基是诱导不成熟淋巴细胞(例如，T、B和NK细胞)和其他白细胞的成熟的细胞因子介导的信号传导必需的。
使用来自多种供体的T细胞制备LCAR-B38M CAR-T细胞，以筛选产生具有体外杀死RPMI8226.Luc细胞的最高功效的CAR-T的T细胞来源(图11)。根据图11的结果，使用被选为用于体内动物测定的供体的T细胞制备LCAR-B38M CAR-T细胞。图12A示出了这批LCAR-B38MCAR-T细胞的剂量依赖性体外细胞毒性。为了产生肿瘤异种移植物，用RPMI8226.Luc细胞静脉内注射NCG小鼠。在14天后，用LCAR-B38M CAR-T细胞或未转导的T细胞处理肿瘤移植的小鼠，然后进行体内生物发光成像(BLI)。
如图12B-12C所示，LCAR-B38M CAR-T细胞能够有效地根除NCG小鼠中的移植RPMI8226.Luc肿瘤细胞并拯救小鼠，而对照(UnT)组中的大多数小鼠在4周内死亡。有趣的是，在尸检期间，在UnT组所有小鼠的肝中观察到很多转移性肿瘤。通过评估肿瘤样品的离体荧光素酶活性进一步验证了该观察结果(图12D-12E)。相比之下，LCAR-B38M CAR-T处理的小鼠的肝中不具有转移性肿瘤。总之，体内研究证实了LCAR-B38M CAR-T细胞在根除NCG小鼠的多发性骨髓瘤细胞(例如，RPMI8226.Luc)中的效力。
实施例6.LCAR-B38M CAR-T处理对非人灵长类动物的安全性研究
评估食蟹猴模型中LCAR-B38M CAR-T细胞的体内安全性。从两只猴(NHP#120117和NHP#120545，均为雄性，约4kg)的外周血样品获得PBMC，并通过密度梯度离心制备。使用非人灵长类动物Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi#130-091-993)根据制造商的手册从PBMC分离食蟹猴T细胞。使用非人灵长类动物T细胞活化/扩增试剂盒(Miltenyi#130-092-919)、人IL-2和自体猴血清预活化所制备的猴T细胞3天。其后，用LCAR-B38M慢病毒转导预活化的T细胞，然后再扩增10天。
在自体CAR-T细胞输注之前3天，用环磷酰胺以22mg/kg体重的剂量通过静脉内输注预处理猴。在自体输注当天，在37℃水浴中通过温和涡旋解冻细胞，并立即在5分钟内静脉内输注至动物。用5×106/kg CAR-T细胞输注猴NHP#120117，并用4×107/kg CAR-T细胞输注猴NHP#120545。
在T细胞施用之后监测猴的发热、呼吸窘迫、食欲变化、腹泻和体重下降。在施用之前和之后，获得血液样品并检查CBC、血清化学和细胞因子水平。如图13A-13F所示，CAR-T细胞在猴中无显著毒性。
实施例7.LCAR-B38M CAR-T在难治性/复发性多发性骨髓瘤人类患者中的临床研究
进行单臂、开放标签、多中心、1/2期临床研究，以确定LCAR-B38M CAR-T细胞在治疗诊断为难治性或复发性多发性骨髓瘤(“r/r MM”)的人类患者中的安全性和功效。临床试验的信息可见于www.clinicaltrials.gov，标识符为NCT03090659。
在该研究中，用来源于患者的自体T细胞的LCAR-B38M CAR-T细胞治疗难治性/复发性多发性骨髓瘤患者。将0.5×106-5×106个细胞/kg体重的总剂量通过静脉内注射以三个分开剂量(分别为20％、30％和50％)在一周的时间内(例如，在第0天、第2天和第6天)施用于每名患者。在研究的第1-30天期间，监测患者的不良事件，并获得患者样品以用于实验室评估。在CAR-T施用之后随访所有患者至少36个月。
研究的主要结果测量了在LCAR-B38M CAR-T细胞注射后1-30天内通过通用不良事件术语标准(Common Terminology Criteria for Adverse Events，CTCAE)v4.0评估的治疗相关不良事件的发生。次要结果评估了CAR-T诱导的抗骨髓瘤响应，例如通过在LCAR-B38M CAR-T细胞的施用之前和之后测定血清中的异常免疫球蛋白水平，和患者骨髓中多发性骨髓瘤细胞的数量。研究的功效目标包括病理性完全响应比例、3年无疾病存活率、3年无进展存活率。
满足以下条件的18-75岁患者具有参加本研究的资格：(1)患者预先确诊为如最新IMWG标准定义的活动性多发性骨髓瘤；(2)通过流式细胞术或免疫组织化学检测到来自骨髓或浆细胞瘤的恶性浆细胞上的明确BCMA表达；以及(3)患者患有已经接受至少3种预先治疗方案(包括硼替佐米)而定义的或者由临床医生鉴定的难治性多发性骨髓瘤；或患者患有如Oncology:Multiple Myeloma(2016V2)中的NCCN临床实践指南所定义的复发性多发性骨髓瘤。
以下患者被排除在研究之外：(1)可能怀孕或怀孕或哺乳的妇女；(2)患有任何活动性和不受控制的感染：乙型肝炎、丙型肝炎、HIV或其他致命性病毒和细菌感染的患者；(3)在所需的白细胞除去术或调理化学治疗方案开始之前2周内，已经接受大于5mg/天强的松或等效剂量的另一种皮质类固醇的全身皮质类固醇类固醇疗法的患者不允许；(4)患有任何不受控制的间发性疾病或严重不受控制的医学病状的患者；(5)具有CNS转移或症状性CNS受累(包括颅神经病变或肿块病灶和脊髓压迫)的患者；(6)具有同种异体干细胞移植史，其在参加的6个月内患有活动性急性或慢性移植物抗宿主病(GVHD)或需要GVHD的免疫抑制药物；或(7)患有活动性自体免疫性皮肤病(诸如牛皮癣)或其他活动性自体免疫性疾病(诸如类风湿性关节炎)的患者。
在2017年5月的期中分析中，35名患有复发性或抗治疗性(难治性)多发性骨髓瘤的患者接受LCAR-B38M CAR-T治疗。早在CAR-T细胞的初始注射之后10天就出现了治疗功效的最初体征。总体而言，客观响应率为100％，并且35名患者中的33名(94％)在接受CAR-T细胞的两个月内具有明显的骨髓瘤的临床缓解(完全响应或非常好的部分响应)。
到分析时，随访19名患者超过四个月，即国际骨髓瘤工作组(InternationalMyeloma Working Group，IMWG)共有标准进行完全功效评估的预定时间。一名患者功效的达到部分响应，四名患者实现非常好的部分缓解标准(VgPR)。所有未达到严格完全响应(Stringent Complete Response，“sCR”)标准的患者均复发。五名随访超过一年(12-14个月)的患者仍处于sCR状态，并且无微量残留病(即，在骨髓中检测不到癌细胞)。
细胞因子释放综合征(“CRS”)是CAR T细胞疗法的常见和潜在危险的副作用。35名患者中只有85％经历短暂的CRS。CRS症状包括发热、低血压、呼吸困难和多器官问题。在大多数患者中，CRS症状是轻度和可控制的。仅两名患者经历严重CRS(3级)，但在接受托珠单抗(通常在CAR-T细胞疗法的临床试验中用于控制CRS的炎症减少治疗)后恢复。所有患者均未经历CAR T细胞疗法的另一种常见和严重并发症，即神经副作用。
期中临床试验数据证实，LCAR-B38M CAR-T治疗对患有难治性/复发性多发性骨髓瘤的患者具有强大功效和安全性。
在试验性临床研究中，用表达单价BCMA CAR的自体T细胞(即，LCAR-B27S CAR-T细胞)治疗3名患者。LCAR-B27S CAR(表4中列出的一个单价BCMA CAR)具有含有识别BCMA分子的单个表位的单个VHH片段的抗原结合域。该VHH域与双表位/二价LCAR-B38M CAR的第二VHH域相同。
在体外细胞毒性测定中，分别从三名多发性骨髓瘤患者制备LCAR-B27S CAR-T细胞，另外分别从相同的三名多发性骨髓瘤患者制备LCAR-B38M CAR-T细胞作为对照。将两种CAR-T细胞以20:1和5:1的效应细胞与靶标细胞之比(E/T之比)与RPMI8226.Luc细胞共培养20小时。如图14A所示，使用来自患者A的T细胞制备CAR-T细胞。当E/T之比为20:1时，如通过RPMI8226.Luc细胞中的剩余荧光素酶活性所评估的剩余活细胞的百分比，对于LCAR-B38M，为3.97±0.75％，并且对于LCAR-B27S，为3.17±0.57％。然而，当E/T之比为5:1时，与LCAR-B27S相比，LCAR-B38M显示出更高的杀死RPMI8226.Luc细胞的效力(对于LCAR-B38M，剩余活细胞的百分比为33.37±0.75％，对于LCAR-B27S，为68.60±1.60％)。如图14B所示，使用来自患者B的T细胞制备CAR-T细胞。当E/T之比为20:1时，如通过RPMI8226.Luc细胞中的剩余荧光素酶活性所评估的剩余活细胞的百分比，对于LCAR-B38M，为4.45±0.57％，并且对于LCAR-B27S，为9.32±1.16％。然而，当E/T之比为5:1时，与LCAR-B27S相比，LCAR-B38M也显示出更高的杀死RPMI8226.Luc细胞的效力(对于LCAR-B38M，剩余活细胞的百分比为40.92±3.00％，对于LCAR-B27S，为84.05±1.56％)。如图14C所示，使用来自患者C的T细胞制备CAR-T细胞。当E/T之比为20:1时，如通过RPMI8226.Luc细胞中的剩余荧光素酶活性所评估的剩余活细胞的百分比，对于LCAR-B38M，为2.56±0.88％，并且对于LCAR-B27S，为10.12±1.83％。然而，当E/T之比为5:1时，与LCAR-B27S相比，LCAR-B38M也显示出更高的杀死RPMI8226.Luc细胞的效力(对于LCAR-B38M，剩余活细胞的百分比为29.99±3.13％，对于LCAR-B27S，为100.93±9.25％)。
在试验性临床研究中，用LCAR-B27S CAR-T细胞治疗3名患者，其中所有预调理、注射和随访方案均与二价LCAR-B38M CAR的临床研究的那些相同。将总剂量为3×106个细胞/kg(患者A)、5×106个细胞/kg(患者B)和7×106个细胞/kg(患者C)体重的自体LCAR-B27S修饰的CAR-T细胞分别通过静脉内注射以三个分开剂量(分别为20％、30％和50％)在一周的时间内(例如，在第0天、第2天和第6天)施用于每个患者。在研究的第1-30天期间，监测患者的不良事件，并获得患者样品以用于实验室评估。在CAR-T施用之后随访所有患者至少36个月。
三名患者中的2名患者达到非常好的部分响应(VgPR)，但两名患者在CAR-T输注后6个月内复发。第三名患者未显示出任何临床响应。因此，IRB终止了LCAR-B27S的试验性研究，无另外的患者参加研究。
该试验性单价BCMA CAR研究(LCAR-B27S)和二价BCMA CAR研究(LCAR-B38M CAR-T)的客观响应率、完全缓解率和复发率如下表11所示。与单价BCMA CAR-T相比，二价BCMACAR-T具有优异的临床功效。
表11：单价和二价/双表位BCMA CAR-T疗法的比较临床数据
Figure BDA0003066909480001061
序列表
<110> 南京传奇生物科技有限公司 (NANJING LEGEND BIOTECH CO.,Ltd)
<120> 靶向BCMA的嵌合抗原受体及其使用方法
<130> 761422000640
<160> 399
<170> FastSEQ for Windows 4.0版
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Thr Tyr Gly Met Ala
1 5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Thr Phe Thr Met Gly
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Ile Asn Ala Met Gly
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Ser Ile Val Met Gly
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Arg Ala Val Ile Val
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Ser Asp Val Met Gly
1 5
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
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<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
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Gly
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<223> 合成构建体
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Gly
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<223> 合成构建体
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Gly
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<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 88
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 90
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Asp Arg Lys Ser Val Met Ser Ile Arg Pro Asp Tyr
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Arg Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ser Lys Ala Ser Met Asn Tyr Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met
65 70 75 80
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85 90 95
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Met Gly
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Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile
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Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Gly Ile Phe Val Ile Asn
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50 55 60
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Ile
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Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Gly Ala Ile Met Trp Asn Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Gln Asp Ser Val
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Thr Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Arg Ala
20 25 30
Val Ile Val Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val
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Ser Phe Ile Lys Pro Ser Asp Gly Thr Ile Tyr Tyr Ile Asp Ser Leu
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65 70 75 80
Leu Gln Met Lys Ser Leu Glu Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gln Ser Thr Tyr Thr Val Asn Ser Asp
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Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Gly Ala Ile Met Trp Asn Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Gln Asp Ser Val
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Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser Lys Asn
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Thr Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gly Phe Val
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<400> 124
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu His Thr Phe Ser Ser His
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Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ser Val
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Ala Val Ile Gly Trp Arg Asp Ile Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<223> 合成构建体
<400> 125
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
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Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ser Thr Tyr
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Phe Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Ala Gly Ile Ala Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 126
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Pro Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ser Thr Val Ser Ile Asn
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Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Val Ser Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Val Thr Arg Asp Gly Arg Lys Ser Cys Gly Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys Gly
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Ala Asp Gly Trp Gly Ala Thr Thr Leu Asp Tyr Thr Tyr Gly Met Asp
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 127
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gly Phe Val Ala Ser Ile
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Thr Trp Asp Gly Arg Ser Ala Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg
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Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Val Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp
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100 105 110
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115
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 128
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Glu Ala Pro Gly Ser Gly Asn Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Arg Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Arg Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Gly Pro Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Val His Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
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Ala Glu Arg Leu Asp Gly Ser Gly Tyr Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 129
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser Lys Asn
20 25 30
Thr Val Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gly Phe Val
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Thr Ser Ile Thr Cys Asp Gly Arg Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 130
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Ile
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Gly Ala Ile Met Trp Asn Asp Gly Leu Thr Tyr Leu Gln Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Val
65 70 75 80
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100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 131
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 131
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile
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Ser Leu Ser Pro Thr Leu Ala Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg
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65 70 75 80
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100 105 110
Thr Val Ser Ser
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<210> 132
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 132
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser Lys Asn
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Thr Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gly Phe Val
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Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<210> 133
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 133
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ile Asn
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Thr Met Asp Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Ala Ala Ile Ser Leu Ser Pro Thr Leu Ala Tyr Tyr Ala Glu Ser Val
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100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<210> 134
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 134
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser Lys Asn
20 25 30
Thr Val Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gly Phe Val
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Thr Ser Ile Thr Cys Asp Gly Arg Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val
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Gly Thr His Val Thr Val Ser Ser
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 135
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Glu Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 136
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
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100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<210> 137
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 137
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Met Gly
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Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Asp Ile
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50 55 60
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Arg Lys
85 90 95
Ser Val Met Ser Ile Arg Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 138
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 138
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Val Ala
20 25 30
Ala Ile Ser Leu Ser Pro Thr Leu Ala Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys
35 40 45
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Val Leu
50 55 60
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala
65 70 75 80
Ala Asp Arg Lys Ser Val Met Ser Ile Arg Pro Asp Tyr Trp Gly Gln
85 90 95
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 139
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Glu Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser Lys Asn
20 25 30
Thr Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gly Phe Val
35 40 45
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50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 140
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Met Gly
20 25 30
Trp Phe His Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile
35 40 45
Ser Leu Ser Pro Thr Leu Ala Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
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65 70 75 80
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser
85 90 95
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100 105 110
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<223> 合成构建体
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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<223> 合成构建体
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Ile
20 25 30
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100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<211> 118
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 143
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Trp Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Met Gly
20 25 30
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100 105 110
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 144
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Met Gly
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115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 145
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Met Gly
20 25 30
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 146
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1 5 10 15
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Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg
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100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
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<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 147
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ser Val Ala Val Ile
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Gly Trp Arg Asp Ile Asn Ala Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
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65 70 75 80
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg
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100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 148
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu His Thr Phe Ser Asn His
20 25 30
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65 70 75 80
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100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 149
Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Thr Ser Ser Asn Tyr
20 25 30
Ile Leu Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Phe Val
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 150
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile
35 40 45
Ser Leu Ser Pro Thr Leu Ala Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 151
Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile
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Ser Leu Ser Pro Thr Leu Ala Tyr Tyr Ala Glu Pro Val Lys Gly Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 152
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Ala Ala Asp Arg Lys Ser Val Met Ser Ile Arg Pro Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
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<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 153
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctgggggttc tctgaggctc 60
tcctgtgaag cctctggatt cactttggat tattatgcca taggctggtt ccgccaggcc 120
ccagggaagg agcgcgaggg ggtcatatgt attagtagaa gtgatggtag cacatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa aacggtgtat 240
ctgcaaatga tcagcctgaa acctgaggac acggccgctt attactgtgc agcaggggcc 300
gattgttcgg ggtacctacg agattatgag ttccgggggc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 154
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 154
caggtaaagc tggaggagtc tgggggacga ttggtgcagc caaggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag gctctggacg cactttcagt acctatggta tggcctggtt ccgccaggct 120
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gtgtttctgc aaatgaacaa cctgaagcct gaggacacgg ccgtttatta ctgtgcagcg 300
ggcactggat gctcaacata tgggtgtttt gacgcccaga taatagacta ctggggcaaa 360
gggaccctgg tcaccgtctc ctca 384
<210> 155
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 155
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcacc atggggtggt tccgtcaggc tccagggaag 120
gagcgtgagt ttgtagcagc tattagtttg agtcctactt tagcatatta tgcagagtcc 180
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aacagcctga aacctgagga cacggccctt tattactgtg cagcagaccg gaaatcagta 300
atgtctattc ggcccgacta ctggggccag gggacccagg tcaccgtctc ctca 354
<210> 156
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 156
gccgtgcagc tggtggattc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgtag cctctggagg tatcttcgtc atcaatgcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccaggaaagc agcgcgagtt ggtcgcatct attcgtggac taggcagaac aaactatgac 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaacaacac ggtgtatctg 240
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ctacttggtg gggttaatag ggactactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 157
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 157
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg gaccttcagt agcattgtca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt tgtaggagcg attatgtgga atgatggtat tacatacttg 180
caagactccg tgaagggccg atttaccatc ttcagagaca atgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acttgaggat acggccgttt attactgtgc agcatccaag 300
ggtagatact cggaatatga gtactggggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctca 357
<210> 158
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 158
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtgcagg ctggggggtc tctgacagtc 60
tcctgtacag cctctggatt cactttcgac cgtgctgtca tagtctggtt ccgccaggcc 120
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ctgcaaatga aaagtctgga atcggaggac tcggccgttt attactgtgc ggcctcgcct 300
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<210> 159
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 159
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagga atggtgcagg ctggggactc tctgagacta 60
tcctgtgtgc agtctactta caccgtcaat agcgatgtca tgggctggtt ccgccaggct 120
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caagactccg tgaagggccg atttaccatc ttcagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acttgaggat acggccgttt attactgtgc agcatccaag 300
ggtagatact cggaatatga gtactggggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctca 357
<210> 160
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 160
gcggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctggggactc tctgagactc 60
tcctgtacag cctctggtgc aaccttgact aacgatcaca tggcatggtt ccgccaggct 120
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<210> 161
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 161
caggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggagg caccttaagt aaaaataccg tggcttggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgggtt tgtagcgtct attacctggg atggtcgtac gacatactat 180
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ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggat acggccgttt atgtctgtgc agacttaggg 300
aaatggcctg cgggcccggc ggactactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
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<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 162
caggtaaagc tggaggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctgggcggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgaaca caccttcagt agccatgtca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtc tgttgcagtt attggctgga gagatattag cacaagctat 180
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<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 163
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ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagga attgcatgga gtggtggtag cacggcgtat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa atctgaggac acggccgttt attactgtgc cagcaggggg 300
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<210> 164
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 164
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tcctgtacag cctctggaag cacagtcagc atcaatgtca tggcctggta ccgccaggtt 120
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<211> 354
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 165
gcggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcacc atggggtggt tccgtcaggc tccagggaag 120
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gtgaagggcc gattcaccat cagccgagac aacgccaaga acacggtggt tttgcaaatg 240
aacagcctga aacctgagga cacggccctt tattactgtg cagcagaccg gaaatcagta 300
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<211> 366
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 166
caggtacagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagc ctggggggtc tctaagactc 60
gcatgtgaag cgcctggaag cggcaatagt atcaatgcca tgggctggta ccggcagact 120
ccggggaagc ggcgcgagtt ggtcgcaact attactcggg gtggtagcac gaactatgga 180
ccctccgtga agggccgatt cacgatcacc agagacaatg tcaagaatac ggtgcatctg 240
cagatgaaca gcctgaaacc tgacgacacg gccgtctatt attgcaatgc ggagaggctg 300
gacggctcgg ggtacggata tgagtatgat tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 167
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 167
caggtaaagc tggaggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggagg caccttaagt aagaataccg tggcttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgggtt tgtaacgtct attacctgtg atggtcgtac gacatactat 180
gcgaactccg taaacggccg attccccatc aaccgaaaca acgccgagaa tttggtggtt 240
ttgcaaatga acagcctgaa acctgacgac acggcccttt attactgtgc agcataccgg 300
aagtcaataa tgtctattca gcccgactac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 168
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 168
gatgtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg gaccttcagt agcattgtca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt tgtaggagcg attatgtgga atgatggtct gacatacttg 180
caagggtccg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca acgccaagaa cacggtggtt 240
ttgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggcccttt attactgtgc agcagaccgg 300
aaatcagtaa tgtctattcg gcccgactac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 169
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 169
caggtacagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcacc atggggtggt tccgtcaggc tccagggaag 120
gagcgtgagt ttgtagcagc tattagtttg agtcctactt tagcatatta tgcagagtcc 180
gtgaagggcc gattcaccat cagccgagac aacgccaaga acacggtggt tttgcaaatg 240
aacagcctga aacctgagga cacggccgtt tactactgtg cagcacgtcg gatcgacgca 300
gctgactttg attcctgggg gcaggggacc caggtcaccg tctcctca 348
<210> 170
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 170
caggtacagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggagg caccttaagt aaaaataccg tggcttggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgggtt tgtagcgtct attacctggg atggtcgtac gacatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacagtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggat acggccgttt atgtctgtgc agacttaggg 300
aaatggcctg cgggcccggc ggactactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 171
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 171
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgacactc 60
tcctgtgcag cctctggaag catcgacagt atcaatacca tggactggtt ccgtcaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attagtttga gtcccacttt agcatattat 180
gcagagtccg tgaagggccg attcaccatc agccgagaca acgccaagaa cacggtggtt 240
ttgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggcccttt attactgtgc agcagaccgg 300
aaatcagtaa tgtctattcg gcccgactac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 172
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 172
gatgtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggagg caccttaagt aagaataccg tggcttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgggtt tgtaacgtct attacctgtg atggtcgtac gacatactat 180
gcgaactccg tgaagggccg attccccatc tccagagaca acgccgagaa cacagtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggat acggccggtt atgtctgtgc agacttaggg 300
aagtggcctg cgggttcggc ggactactgg ggccagggga cccacgtcac cgtctcctcc 360
<210> 173
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 173
caggtaaagc tggaggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtacag cctcggaatt cacattcagt gactactgga tgcattgggt ccgtcaggct 120
ccggggaagg ggctcgagtg ggtcgcatct atagatacta gtggacagac cacatactat 180
gcagactccc tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagag cacgttgtat 240
ctgcaaatga acagtctgaa atctgaagac acgggcgtgt atttctgtgc aaaacgatat 300
aggggtggta cctggtatgg catggccaac tggggcaaag ggacccaggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 174
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 174
caggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttaagt agtaatacca tggcttggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcgtct actacctgga atggtcgtag cacatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgatgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggat acggccgttt atgtctgtgc agacttaggg 300
aaatggcctg cgggcccggc ggactactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 175
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 175
caggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcacc atggggtggt tccgtcaggc tccagggaag 120
cagcgcgaat tggtcgcaga tattagtggt ggtcgcacaa actatgcaga ttccgtgaag 180
ggacgattca ccatctccag agacaacgcc aagaacacgg tatatctgca aatgaacagc 240
ctgaaacctg aggacacggc cgtttattac tgtgcagcag accggaaatc agtaatgtct 300
attcggcccg actactgggg ccaggggacc caggtcaccg tctcctca 348
<210> 176
<211> 312
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 176
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggcctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcacc gtggcagcta ttagtttgag tcctacttta 120
gcatattatg cagagtccgt gaagggccga ttcaccatca gccgagacaa cgccaagaac 180
acggtggttt tgcaaatgaa cagcctgaaa cctgaggaca cggcccttta ttactgtgca 240
gcagaccgga aatcagtaat gtctattcgg cccgactact ggggccaggg gacccaggtc 300
accgtctcct ca 312
<210> 177
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 177
gatgtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggagcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggagg caccttaagt aaaaataccg tggcttggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgggtt tgtagcgtct attacctggg atggtcgtac gacatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacagtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggat acggccgttt attactgtgc gtcgacggca 300
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gtcaccgtct cctca 375
<210> 178
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 178
gcggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcacc atggggtggt tccatcaggc tccagggaag 120
gagcgtgagt ttgtagcagc tattagtttg agtcctactt tagcatatta tgcagagtcc 180
gtgaagggcc gattcaccat cagccgagac aacgccaaga acacggtggt tttgcaaatg 240
aacagcctga aacctgagga cacggccctt tattactgtg cagcatccaa ggatagatat 300
tcggaatatg agtactgggg ccaggggacc caggtcaccg tctcctca 348
<210> 179
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 179
caggtaaagc tggaggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcacc atggggtggt tccgtcaggc tccagggaag 120
gagcgtgagt ttgtagcagc tattagtttg agtcctactt tagcatatta tgcagagtcc 180
gtgaagggcc gattcaccat cagccgagac aacgccaaga acacggtggt tttgcaaatg 240
aacagcctga aacctgagga cacggccctt tattactgtg caaaaaaaaa cggggggcct 300
gtggactact ggggcaaagg gacccaggtc accgtctcct ca 342
<210> 180
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 180
gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg gaccttcagt agcattgtca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt tgtaggagcg attatgtgga atgatggtat tacatacttg 180
caagactccg tgaagggccg atttaccatc ttcagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acttgaggat acggccgttt attactgtgc agcatccaag 300
ggtagatact cggaatatga gtactggggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctca 357
<210> 181
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 181
caggtaaagc tggaggaatc tgggggaaga ttggtgcagg ctgggggctc tctgaaactc 60
tcctgggcag cctctggacg caccttcacc atggggtggt tccgtcaggc tccagggaag 120
gaacgtgagt ttgtaacagc tattaatttg agtcctactt taacatatta tgcagaatcc 180
gtgaagggcc gattccccat cagccgaaac aacgcccaga acacggtggt tttgcaaatg 240
aacagcctga aacctgagga cacggccctt tattactgtg cagcagaacg gaaatcagta 300
atggctattc cgcccgacta ctggggccag gggacccagg tcaccgtctc ctca 354
<210> 182
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 182
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcacc atgggggggt tccgtcgggt tcctcgggat 120
gagcgggagt ttgtagcatc tattactttg attcctactt ttccttatta tgcatattcc 180
gtgaagggcc gattcgccct cttccgagac aaccccaaca acaccgtgat tttgctgatg 240
atcagcctga aacctgagga cccggacctt tattactgtg cttcataccg gaaataccta 300
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<210> 183
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 183
caggtaaagc tggaggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcacc atggggtggt tccgtcaggc tccagggaag 120
gagcgtgagt ttgtagcagc tattagtttg agtcctactt tagcatatta tgcagagtcc 180
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aacagcctga aacctgagga cacggccgtc tatttctgtg cagcaaatcg gaactcccaa 300
cgggtaattg cggcactgtc ctggattggc atgaactact ggggcgaatg gacccaggtc 360
accgtctcct cc 372
<210> 184
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 184
caggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcacc atggggtggt tccgtcaggc tccagggaag 120
gagcgtgagt ttgtagcagc tattagtttg agtcctactt tagcatatta tgcagagtcc 180
gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac aacgccaaga agacgctgta tctgcgaatg 240
aatagcctga aacctgagga cacggccgtt tactactgtg cagcacgtcg gatcgacgca 300
gctgactttg attcctgggg gcaggggacc caggtcaccg tctcctca 348
<210> 185
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 185
caggtaaagc tggaggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcacc atggggtggt tccgtcgggc tccagggaag 120
gagcgtgagt ctgttgcagt tattggctgg agagatatta acgcaagcta tgcagactcc 180
gtgaagggcc gattcgccat ctccagagac aacgccaaga agacgctgta tctgcagatg 240
aatagcctga aacctgagga cacggccgtt tactactgtg cagcacgtcg gatcgacgca 300
actgactttg attcctgggg gcaggggacc caggtcaccg tctcctca 348
<210> 186
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 186
caggtaaagc tggaggagtc tgggggagga ttggtgcaga ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgaaca caccttcagt aaccatgtca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtc tgttgcagtt attggctgga gagatattag cacaagctat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa gacgctgtat 240
ctgcaaatga atagcctgaa acctgaggac acggccgttt actactgtgc agcacgtcgg 300
atcgacgcag ctgactttga ttcccggggg caggggaccc aggtcaccgt ctcctca 357
<210> 187
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 187
gccgtgcagc tggtggattc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagaatt 60
tcctgtgcag tctctggacg cacctccagt aactatatat tggcctggtt ccgtcaggct 120
ccaggaaaag agcgtgactt tgtagcacat attagccgga gtggtggtaa gtccggctat 180
ggagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccgagaa cacggtcagg 240
gtgtatctgc aaatgaacag tctgaaacct ggggacacgg ccgtctatta ctgtaatcgc 300
cccctctggt acggaagtcc cacgttgatt gactactggg gccaggggac ccaggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 188
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 188
gcggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcacc atggggtggt tccgtcaggc tccagggaag 120
gagcgtgagt ttgtagcagc tattagtttg agtcctactt tagcatatta tgcagagtcc 180
gtgaagggcc gattcaccat cagccgagac aacgccaaga acacggtggt tttgcaaatg 240
aacagcctga aacctgagga cacggccctt tattactgtg cagcagaccg gaaatcagta 300
atgtctattc ggcccgacta ctggggccag gggacccagg tcaccgtctc ctca 354
<210> 189
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 189
gcggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcacc atggggtggt tccgtcaggc tccagggaag 120
gagcgtgagt ttgtagcagc tattagtttg agtcctactt tagcatatta tgcagagtcc 180
gtgaagggcc gattcaccat cagccgagac aacgccaaga acacggtggt tttgcaaatg 240
aacagcctga aacctgagga cacggccctt tattactgtg cagcagaccg gaaatcagta 300
atgtctattc ggcccgacta ctggggccag gggacccagg tcaccgtctc ctca 354
<210> 190
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 190
gatgtgcagc tggtggagtc tgggggagga tcggtgcaga ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtacag cctctggacg caccctcaat aactttgtca tgggctggtt ccgtcaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attagtttga gtcctacttt agcatattat 180
gtagagtccg tgaagggccg attcaccatc agccgagaca acgccaagaa cacggtggtt 240
ttgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggcccttt attactgtgc agcagaccgg 300
aaatcagtaa tgtctattcg gcccgactac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 191
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 191
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 192
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 192
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 193
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 193
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 194
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 194
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 195
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 195
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 196
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 196
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 197
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 197
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 198
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 198
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 199
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 199
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 200
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 200
atggctctgc ccgtcactgc tctgctgctg cccctggctc tgctgctgca cgccgcaaga 60
ccc 63
<210> 201
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 201
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 202
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 202
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 203
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 203
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 204
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 204
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 205
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 206
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 206
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
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<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 207
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 209
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 210
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 210
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 211
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 211
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 212
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 212
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser
<210> 213
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 213
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 214
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 215
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
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<211> 420
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 216
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Val Asn Arg Thr Arg Arg Met His Gln Val Gln
20 25 30
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
35 40 45
Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly
50 55 60
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ile Cys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
85 90 95
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met
100 105 110
Ile Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly
115 120 125
Ala Asp Cys Ser Gly Tyr Leu Arg Asp Tyr Glu Phe Arg Gly Gln Gly
130 135 140
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
145 150 155 160
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
165 170 175
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
180 185 190
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
195 200 205
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
210 215 220
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
225 230 235 240
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
245 250 255
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys
260 265 270
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
275 280 285
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
290 295 300
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
305 310 315 320
Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
325 330 335
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
340 345 350
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
355 360 365
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
370 375 380
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
385 390 395 400
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
405 410 415
Leu Pro Pro Arg
420
<210> 217
<211> 426
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 217
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Val Asn Arg Thr Arg Arg Met His Gln Val Lys
20 25 30
Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Arg Gly Ser Leu Arg
35 40 45
Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr Gly Met Ala
50 55 60
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ser Lys
65 70 75 80
Ala Ser Met Asn Tyr Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
85 90 95
Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Phe Leu
100 105 110
Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
115 120 125
Ala Gly Thr Gly Cys Ser Thr Tyr Gly Cys Phe Asp Ala Gln Ile Ile
130 135 140
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr
145 150 155 160
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
165 170 175
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
180 185 190
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu
195 200 205
Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
210 215 220
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His
225 230 235 240
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
245 250 255
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
260 265 270
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
275 280 285
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
290 295 300
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
305 310 315 320
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
325 330 335
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
340 345 350
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
355 360 365
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
370 375 380
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
385 390 395 400
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
405 410 415
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
420 425
<210> 218
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 218
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Val Asn Arg Thr Arg Arg Met His Glu Val Gln
20 25 30
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg
35 40 45
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Met Gly Trp Phe Arg
50 55 60
Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Leu Ser
65 70 75 80
Pro Thr Leu Ala Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
85 90 95
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Val Leu Gln Met Asn Ser Leu
100 105 110
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Arg Lys Ser
115 120 125
Val Met Ser Ile Arg Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
130 135 140
Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
165 170 175
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
180 185 190
Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
195 200 205
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys
210 215 220
Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg
225 230 235 240
Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp
245 250 255
Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
260 265 270
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
275 280 285
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
290 295 300
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
305 310 315 320
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
325 330 335
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
340 345 350
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
355 360 365
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
370 375 380
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
385 390 395 400
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
405 410 415
<210> 219
<211> 418
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 219
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Val Asn Arg Thr Arg Arg Met His Ala Val Gln
20 25 30
Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
35 40 45
Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Gly Ile Phe Val Ile Asn Ala Met Gly
50 55 60
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ser Ile
65 70 75 80
Arg Gly Leu Gly Arg Thr Asn Tyr Asp Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
85 90 95
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn
100 105 110
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Val Tyr Val
115 120 125
Thr Leu Leu Gly Gly Val Asn Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
130 135 140
Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
145 150 155 160
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
165 170 175
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
180 185 190
Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
195 200 205
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
210 215 220
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
225 230 235 240
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
245 250 255
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
260 265 270
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
275 280 285
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
290 295 300
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys
305 310 315 320
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
325 330 335
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
340 345 350
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
355 360 365
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
370 375 380
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
385 390 395 400
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
405 410 415
Pro Arg
<210> 220
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 220
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Val Asn Arg Thr Arg Arg Met His Glu Val Gln
20 25 30
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg
35 40 45
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Ile Val Met Gly
50 55 60
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Gly Ala Ile
65 70 75 80
Met Trp Asn Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Gln Asp Ser Val Lys Gly Arg
85 90 95
Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
100 105 110
Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser
115 120 125
Lys Gly Arg Tyr Ser Glu Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
130 135 140
Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
145 150 155 160
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
165 170 175
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
180 185 190
Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
195 200 205
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
210 215 220
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
225 230 235 240
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
245 250 255
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
260 265 270
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
275 280 285
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
290 295 300
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
305 310 315 320
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
325 330 335
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
340 345 350
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
355 360 365
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
370 375 380
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
385 390 395 400
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
405 410 415
Arg
<210> 221
<211> 426
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 221
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Val Asn Arg Thr Arg Arg Met His Glu Val Gln
20 25 30
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Thr
35 40 45
Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Arg Ala Val Ile Val
50 55 60
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val Ser Phe Ile
65 70 75 80
Lys Pro Ser Asp Gly Thr Ile Tyr Tyr Ile Asp Ser Leu Lys Gly Arg
85 90 95
Phe Thr Ile Ser Ser Asp Ile Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
100 105 110
Lys Ser Leu Glu Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser
115 120 125
Pro Glu Asp Trp Tyr Thr Asp Trp Ile Asp Trp Ser Ile Tyr Arg Trp
130 135 140
Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr
145 150 155 160
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
165 170 175
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
180 185 190
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu
195 200 205
Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
210 215 220
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His
225 230 235 240
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
245 250 255
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
260 265 270
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
275 280 285
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
290 295 300
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
305 310 315 320
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
325 330 335
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
340 345 350
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
355 360 365
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
370 375 380
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
385 390 395 400
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
405 410 415
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
420 425
<210> 222
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 222
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Val Asn Arg Thr Arg Arg Met His Glu Val Gln
20 25 30
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Ala Gly Asp Ser Leu Arg
35 40 45
Leu Ser Cys Val Gln Ser Thr Tyr Thr Val Asn Ser Asp Val Met Gly
50 55 60
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Gly Ala Ile
65 70 75 80
Met Trp Asn Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Gln Asp Ser Val Lys Gly Arg
85 90 95
Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
100 105 110
Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser
115 120 125
Lys Gly Arg Tyr Ser Glu Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
130 135 140
Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
145 150 155 160
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
165 170 175
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
180 185 190
Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
195 200 205
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
210 215 220
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
225 230 235 240
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
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Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
260 265 270
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
275 280 285
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
290 295 300
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
305 310 315 320
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
325 330 335
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
340 345 350
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
355 360 365
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
370 375 380
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
385 390 395 400
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
405 410 415
Arg
<210> 223
<211> 418
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 223
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Val Asn Arg Thr Arg Arg Met His Ala Val Gln
20 25 30
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp Ser Leu Arg
35 40 45
Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ala Thr Leu Thr Asn Asp His Met Ala
50 55 60
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile
65 70 75 80
Asp Trp Ser Gly Arg Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Glu Gly Arg
85 90 95
Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Glu Met
100 105 110
Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Val Leu
115 120 125
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130 135 140
Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
145 150 155 160
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
165 170 175
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
180 185 190
Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
195 200 205
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
210 215 220
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
225 230 235 240
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
245 250 255
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
260 265 270
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
275 280 285
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
290 295 300
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys
305 310 315 320
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
325 330 335
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
340 345 350
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
355 360 365
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
370 375 380
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
385 390 395 400
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
405 410 415
Pro Arg
<210> 224
<211> 418
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 224
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1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Val Asn Arg Thr Arg Arg Met His Gln Val Gln
20 25 30
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Thr Trp Asp Gly Arg Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
85 90 95
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
100 105 110
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115 120 125
Gly Lys Trp Pro Ala Gly Pro Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
130 135 140
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145 150 155 160
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
165 170 175
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
180 185 190
Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
195 200 205
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210 215 220
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
225 230 235 240
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
245 250 255
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260 265 270
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
275 280 285
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
290 295 300
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys
305 310 315 320
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
325 330 335
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
340 345 350
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
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Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
370 375 380
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
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405 410 415
Pro Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 225
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1 5 10 15
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100 105 110
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115 120 125
Arg Ile Asp Ala Ala Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
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Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
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Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
180 185 190
Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
195 200 205
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210 215 220
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
225 230 235 240
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
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275 280 285
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Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
305 310 315 320
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
325 330 335
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
340 345 350
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
355 360 365
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
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405 410 415
Arg
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<211> 417
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 226
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1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Val Asn Arg Thr Arg Arg Met His Ala Val Gln
20 25 30
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp Ser Leu Arg
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65 70 75 80
Ala Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
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100 105 110
Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg
115 120 125
Gly Ile Glu Val Glu Glu Phe Gly Ala Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
130 135 140
Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
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Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
165 170 175
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
180 185 190
Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
195 200 205
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210 215 220
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275 280 285
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Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
305 310 315 320
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
325 330 335
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
340 345 350
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355 360 365
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
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Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
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405 410 415
Arg
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 227
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1 5 10 15
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20 25 30
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180 185 190
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195 200 205
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Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
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Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
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<210> 228
<211> 373
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 228
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1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Val Asn Arg Thr Arg Arg Met His Gln Val Lys
20 25 30
Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Arg Ser Leu Arg
35 40 45
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu His Thr Phe Ser Ser His Val Met Gly
50 55 60
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ser Val Ala Val Ile
65 70 75 80
Gly Trp Arg Asp Ile Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
85 90 95
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met
100 105 110
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg
115 120 125
Arg Ile Asp Ala Ala Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
130 135 140
Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
145 150 155 160
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
165 170 175
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
180 185 190
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
195 200 205
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
210 215 220
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Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
245 250 255
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
260 265 270
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
275 280 285
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
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305 310 315 320
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
325 330 335
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
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Ala Leu Pro Pro Arg
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<210> 229
<211> 372
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 229
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1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Val Asn Arg Thr Arg Arg Met His Glu Val Gln
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65 70 75 80
Pro Thr Leu Ala Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
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Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
180 185 190
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
195 200 205
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
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Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
225 230 235 240
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
245 250 255
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
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370
<210> 230
<211> 372
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 230
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Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
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Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
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275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
340 345 350
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355 360 365
Leu Pro Pro Arg
370
<210> 231
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 231
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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100 105 110
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115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr
130 135 140
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145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
195 200 205
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
210 215 220
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
225 230 235 240
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
245 250 255
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
260 265 270
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
275 280 285
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
290 295 300
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
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355 360
<210> 232
<211> 368
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 232
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
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Gly Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Val Lys
85 90 95
Asn Thr Val His Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Arg Leu Asp Gly Ser Gly Tyr Gly Tyr
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Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr
130 135 140
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
145 150 155 160
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
165 170 175
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
180 185 190
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
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Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
210 215 220
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
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Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
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Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
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Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
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Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<220>
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65 70 75 80
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100 105 110
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Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
165 170 175
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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275 280 285
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Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
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145 150 155 160
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
165 170 175
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180 185 190
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
195 200 205
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
210 215 220
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
225 230 235 240
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
245 250 255
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
260 265 270
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
275 280 285
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
290 295 300
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
305 310 315 320
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
325 330 335
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
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Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 242
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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145 150 155 160
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
165 170 175
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
180 185 190
Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
195 200 205
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
210 215 220
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
225 230 235 240
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
245 250 255
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
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Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
275 280 285
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
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Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
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Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 243
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Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
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130 135 140
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145 150 155 160
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
165 170 175
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
180 185 190
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
195 200 205
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
210 215 220
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
225 230 235 240
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
245 250 255
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
260 265 270
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
275 280 285
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
290 295 300
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
305 310 315 320
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
325 330 335
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
340 345 350
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Pro Pro Arg
370
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<211> 362
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 244
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1 5 10 15
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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260 265 270
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275 280 285
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Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
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195 200 205
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195 200 205
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<223> 合成构建体
<400> 247
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<220>
<223> 合成构建体
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<210> 252
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 252
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
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225 230 235 240
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
245 250 255
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
260 265 270
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
275 280 285
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
290 295 300
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
305 310 315 320
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
325 330 335
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
340 345 350
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360 365
<210> 253
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 253
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg
35 40 45
Thr Ser Ser Asn Tyr Ile Leu Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Glu Arg Asp Phe Val Ala His Ile Ser Arg Ser Gly Gly Lys Ser Gly
65 70 75 80
Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Glu Asn Thr Val Arg Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Gly
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Arg Pro Leu Trp Tyr Gly Ser Pro
115 120 125
Thr Leu Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
145 150 155 160
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
165 170 175
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
180 185 190
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
195 200 205
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
210 215 220
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
225 230 235 240
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
245 250 255
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
260 265 270
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
275 280 285
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
290 295 300
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
305 310 315 320
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
325 330 335
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
340 345 350
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
355 360 365
Arg
<210> 254
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 254
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg
35 40 45
Thr Phe Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
50 55 60
Phe Val Ala Ala Ile Ser Leu Ser Pro Thr Leu Ala Tyr Tyr Ala Glu
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
85 90 95
Val Val Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Ala Asp Arg Lys Ser Val Met Ser Ile Arg Pro Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
195 200 205
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
210 215 220
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
225 230 235 240
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
245 250 255
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
260 265 270
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
275 280 285
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
290 295 300
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
325 330 335
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
340 345 350
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 255
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 255
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg
35 40 45
Thr Phe Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
50 55 60
Phe Val Ala Ala Ile Ser Leu Ser Pro Thr Leu Ala Tyr Tyr Ala Glu
65 70 75 80
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
85 90 95
Val Val Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Ala Asp Arg Lys Ser Val Met Ser Ile Arg Pro Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
195 200 205
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
210 215 220
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
225 230 235 240
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
245 250 255
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
260 265 270
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
275 280 285
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
290 295 300
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
325 330 335
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
340 345 350
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 256
<211> 367
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 256
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg
35 40 45
Thr Leu Asn Asn Phe Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Leu Ser Pro Thr Leu Ala Tyr
65 70 75 80
Tyr Val Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Asn Thr Val Val Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Arg Lys Ser Val Met Ser Ile Arg
115 120 125
Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser
130 135 140
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
145 150 155 160
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
165 170 175
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
180 185 190
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
195 200 205
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
245 250 255
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
260 265 270
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
275 280 285
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
290 295 300
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
305 310 315 320
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
325 330 335
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
340 345 350
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360 365
<210> 257
<211> 1263
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 257
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggttaacc gcacgcgtcg catgcatcag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg 120
gtgcagcctg ggggttctct gaggctctcc tgtgaagcct ctggattcac tttggattat 180
tatgccatag gctggttccg ccaggcccca gggaaggagc gcgagggggt catatgtatt 240
agtagaagtg atggtagcac atactatgca gactccgtga agggccgatt caccatctcc 300
agagacaacg ccaagaaaac ggtgtatctg caaatgatca gcctgaaacc tgaggacacg 360
gccgcttatt actgtgcagc aggggccgat tgttcggggt acctacgaga ttatgagttc 420
cgggggcagg ggacccaggt caccgtctcc tcaactagta ccacgacgcc agcgccgcga 480
ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 540
cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatttttgg 600
gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct tgctatagct tgctagtaac agtggccttt 660
attattttct gggtgaggag taagaggagc aggctcctgc acagtgacta catgaacatg 720
actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag cattaccagc cctatgcccc accacgcgac 780
ttcgcagcct atcgctccaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 840
tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 900
gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 960
tacaagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 1020
gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 1080
aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 1140
gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1200
ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1260
tga 1263
<210> 258
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 258
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggttaacc gcacgcgtcg catgcatcag gtaaagctgg aggagtctgg gggacgattg 120
gtgcagccaa ggggctctct gagactctcc tgtgcaggct ctggacgcac tttcagtacc 180
tatggtatgg cctggttccg ccaggctcca gggaaggagc gtgagttcgt agcgtctaaa 240
gcatcgatga attacagcgg tagaacatac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc 300
atcgccagag acaacgccaa gaacatggtg tttctgcaaa tgaacaacct gaagcctgag 360
gacacggccg tttattactg tgcagcgggc actggatgct caacatatgg gtgttttgac 420
gcccagataa tagactactg gggcaaaggg accctggtca ccgtctcctc aactagtacc 480
acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 540
ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 600
ttcgcctgtg atttttgggt gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg 660
ctagtaacag tggcctttat tattttctgg gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac 720
agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc 780
tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat cgctccaaac ggggcagaaa gaaactcctg 840
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 900
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 960
agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1020
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1080
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1140
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1200
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1260
caggccctgc cccctcgctg a 1281
<210> 259
<211> 1251
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 259
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggttaacc gcacgcgtcg catgcatgag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg 120
gtgcaggctg gggggtctct gagactctcc tgtgcagcct ctggacgcac cttcaccatg 180
gggtggttcc gtcaggctcc agggaaggag cgtgagtttg tagcagctat tagtttgagt 240
cctactttag catattatgc agagtccgtg aagggccgat tcaccatcag ccgagacaac 300
gccaagaaca cggtggtttt gcaaatgaac agcctgaaac ctgaggacac ggccctttat 360
tactgtgcag cagaccggaa atcagtaatg tctattcggc ccgactactg gggccagggg 420
acccaggtca ccgtctcctc aactagtacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 480
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 540
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atttttgggt gctggtggtg 600
gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat tattttctgg 660
gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc 720
cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat 780
cgctccaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 840
gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 900
ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc 960
cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1020
aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1080
ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1140
aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1200
accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgctg a 1251
<210> 260
<211> 1257
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 260
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggttaacc gcacgcgtcg catgcatgcc gtgcagctgg tggattctgg gggaggcttg 120
gtgcagcctg gggggtctct gagactctcc tgtgtagcct ctggaggtat cttcgtcatc 180
aatgccatgg gctggtaccg ccaggctcca ggaaagcagc gcgagttggt cgcatctatt 240
cgtggactag gcagaacaaa ctatgacgac tccgtgaagg gccgattcac catctccaga 300
gacaacgcca acaacacggt gtatctgcag atgaacagcc tggaacctga ggacacggcc 360
gtctactact gtacagtcta cgttacacta cttggtgggg ttaataggga ctactggggc 420
caggggaccc aggtcaccgt ctcctcaact agtaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 480
acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 540
gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgattt ttgggtgctg 600
gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt 660
ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc 720
cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca 780
gcctatcgct ccaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 840
agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa 900
gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtacaag 960
cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1020
ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 1080
caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1140
gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1200
acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgctga 1257
<210> 261
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 261
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggttaacc gcacgcgtcg catgcatgag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggattg 120
gtgcaggctg ggggctctct gagactctcc tgtgcagcct ctggacggac cttcagtagc 180
attgtcatgg gctggttccg ccaggctcca gggaaggagc gtgagtttgt aggagcgatt 240
atgtggaatg atggtattac atacttgcaa gactccgtga agggccgatt taccatcttc 300
agagacaatg ccaagaacac ggtgtatctg caaatgaaca gcctgaaact tgaggatacg 360
gccgtttatt actgtgcagc atccaagggt agatactcgg aatatgagta ctggggccag 420
gggacccagg tcaccgtctc ctcaactagt accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 480
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 540
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatttttg ggtgctggtg 600
gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc 660
tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg cacagtgact acatgaacat gactccccgc 720
cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc 780
tatcgctcca aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 840
ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 900
ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtacaagcag 960
ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1020
gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1080
gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1140
atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1200
gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctga 1254
<210> 262
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 262
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggttaacc gcacgcgtcg catgcatgag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg 120
gtgcaggctg gggggtctct gacagtctcc tgtacagcct ctggattcac tttcgaccgt 180
gctgtcatag tctggttccg ccaggccccc gggaagggcc gtgagggggt ctcatttatt 240
aaacctagtg atggcaccat atactacatt gactccctga agggccgatt cacgatctcc 300
agtgacatcg ccaagaatac ggtatatctg caaatgaaaa gtctggaatc ggaggactcg 360
gccgtttatt actgtgcggc ctcgcctgag gactggtaca cggattggat cgactggagt 420
atatatcggt ggcagcactg gggccagggg acccaggtca ctgtctcctc aactagtacc 480
acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 540
ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 600
ttcgcctgtg atttttgggt gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg 660
ctagtaacag tggcctttat tattttctgg gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac 720
agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc 780
tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat cgctccaaac ggggcagaaa gaaactcctg 840
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 900
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 960
agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1020
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1080
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1140
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1200
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1260
caggccctgc cccctcgctg a 1281
<210> 263
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 263
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggttaacc gcacgcgtcg catgcatgag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggaatg 120
gtgcaggctg gggactctct gagactatcc tgtgtgcagt ctacttacac cgtcaatagc 180
gatgtcatgg gctggttccg ccaggctcca gggaaggagc gtgagtttgt aggagcgatt 240
atgtggaatg atggtattac atacttgcaa gactccgtga agggccgatt taccatcttc 300
agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg caaatgaaca gcctgaaact tgaggatacg 360
gccgtttatt actgtgcagc atccaagggt agatactcgg aatatgagta ctggggccag 420
gggacccagg tcaccgtctc ctcaactagt accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 480
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 540
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatttttg ggtgctggtg 600
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gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctga 1254
<210> 264
<211> 1257
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 264
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggttaacc gcacgcgtcg catgcatgcg gtgcagctgg tggagtctgg gggaggattg 120
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acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgctga 1257
<210> 265
<211> 1257
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 265
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggttaacc gcacgcgtcg catgcatcag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggattg 120
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acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgctga 1257
<210> 266
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 266
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggttaacc gcacgcgtcg catgcatcag gtaaagctgg aggagtctgg gggaggcttg 120
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cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc 780
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<210> 267
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 267
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<210> 268
<211> 1131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 268
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<210> 269
<211> 1122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 269
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggttaacc gcacgcgtcg catgcatcag gtaaagctgg aggagtctgg gggaggcttg 120
gtgcaggctg ggcggtctct gagactctcc tgtgcagcct ctgaacacac cttcagtagc 180
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acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aa 1122
<210> 270
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 270
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggttaacc gcacgcgtcg catgcatgag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg 120
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tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 900
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 960
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1020
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1080
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 1119
<210> 271
<211> 1113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 271
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
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<210> 272
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 272
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctgcggtgc agctggtgga gtctggggga ggattggtgc aggctggggg ctctctgaga 120
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atgaacagcc tgaaacctga ggacacggcc ctttattact gtgcagcaga ccggaaatca 360
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ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 540
ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 600
ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aaacggggca gaaagaaact cctgtatata 660
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ctgccccctc gctaa 1095
<210> 273
<211> 1107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 273
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
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ctcgcatgtg aagcgcctgg aagcggcaat agtatcaatg ccatgggctg gtaccggcag 180
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gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 540
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tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaaacgggg cagaaagaaa 660
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cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 1107
<210> 274
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 274
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
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<210> 275
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
<400> 275
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<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
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<212> DNA
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<223> 合成构建体
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atgaacagcc tgaaacctga ggacacggcc ctttattact gtgcaaaaaa aaacgggggg 360
cctgtggact actggggcaa agggacccag gtcaccgtct cctcaactag taccacgacg 420
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taa 1083
<210> 287
<211> 1098
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 287
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
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gccctgcccc ctcgctaa 1098
<210> 288
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 288
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctcaggtaa agctggagga atctggggga agattggtgc aggctggggg ctctctgaaa 120
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<210> 289
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 289
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<210> 290
<211> 1113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 290
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<210> 291
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 291
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<210> 292
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 292
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cctcgctaa 1089
<210> 293
<211> 1098
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 293
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctcaggtaa agctggagga gtctggggga ggattggtgc agactggggg ctctctgaga 120
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gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 840
cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 900
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ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1080
gccctgcccc ctcgctaa 1098
<210> 294
<211> 1110
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 294
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctgccgtgc agctggtgga ttctggggga ggattggtgc aggctggggg ctctctgaga 120
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<210> 295
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 295
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
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atgaacagcc tgaaacctga ggacacggcc ctttattact gtgcagcaga ccggaaatca 360
gtaatgtcta ttcggcccga ctactggggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctcaact 420
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ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 540
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ctgccccctc gctaa 1095
<210> 296
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 296
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctgcggtgc agctggtgga gtctggggga ggattggtgc aggctggggg ctctctgaga 120
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atgaacagcc tgaaacctga ggacacggcc ctttattact gtgcagcaga ccggaaatca 360
gtaatgtcta ttcggcccga ctactggggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctcaact 420
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ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 540
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ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aaacggggca gaaagaaact cctgtatata 660
ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc 720
cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactgagag tgaagttcag caggagcgca 780
gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 840
agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 900
ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 960
gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 1020
ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 1080
ctgccccctc gctaa 1095
<210> 297
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 297
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctgatgtgc agctggtgga gtctggggga ggatcggtgc agactggggg ctctctgaga 120
ctctcctgta cagcctctgg acgcaccctc aataactttg tcatgggctg gttccgtcag 180
gctccaggga aggagcgtga gtttgtagca gctattagtt tgagtcctac tttagcatat 240
tatgtagagt ccgtgaaggg ccgattcacc atcagccgag acaacgccaa gaacacggtg 300
gttttgcaaa tgaacagcct gaaacctgag gacacggccc tttattactg tgcagcagac 360
cggaaatcag taatgtctat tcggcccgac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 420
tcctcaacta gtaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 480
tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 540
acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 600
ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc 660
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 720
tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 780
aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 840
ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 900
gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 960
aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1020
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1080
atgcaggccc tgccccctcg ctaa 1104
<210> 298
<211> 495
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 298
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Glu Arg Glu Gly Val Ile Cys Ile Ser Arg Ser Asp Gly Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Ile Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Ala Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Ala Asp Cys Ser Gly Tyr Leu Arg
115 120 125
Asp Tyr Glu Phe Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
145 150 155 160
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr
165 170 175
Leu Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
180 185 190
Arg Glu Gly Val Ile Cys Ile Ser Arg Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr
195 200 205
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
210 215 220
Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Ile Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Ala Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Ala Asp Cys Ser Gly Tyr Leu Arg Asp
245 250 255
Tyr Glu Phe Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser
260 265 270
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
275 280 285
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
290 295 300
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
305 310 315 320
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
325 330 335
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
340 345 350
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
355 360 365
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
370 375 380
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
385 390 395 400
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
405 410 415
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
420 425 430
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
435 440 445
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
450 455 460
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
465 470 475 480
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490 495
<210> 299
<211> 622
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 299
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1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
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Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
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100 105 110
Ala Ala Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Ala Asp Cys Ser Gly Tyr Leu Arg
115 120 125
Asp Tyr Glu Phe Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
145 150 155 160
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr
165 170 175
Leu Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Ile Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Ala Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Ala Asp Cys Ser Gly Tyr Leu Arg Asp
245 250 255
Tyr Glu Phe Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
275 280 285
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Leu
290 295 300
Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
305 310 315 320
Glu Gly Val Ile Cys Ile Ser Arg Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala
325 330 335
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys
340 345 350
Thr Val Tyr Leu Gln Met Ile Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ala
355 360 365
Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Ala Asp Cys Ser Gly Tyr Leu Arg Asp Tyr
370 375 380
Glu Phe Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr
385 390 395 400
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
405 410 415
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420 425 430
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
435 440 445
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
450 455 460
Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
465 470 475 480
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Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 300
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1 5 10 15
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50 55 60
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65 70 75 80
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130 135 140
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Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Met
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435 440 445
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485
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 301
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Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
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450 455 460
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 302
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1 5 10 15
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Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
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100 105 110
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115 120 125
Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
165 170 175
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg
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325 330 335
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
340 345 350
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
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Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
405 410 415
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
420 425 430
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
435 440 445
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
450 455 460
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
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Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
485 490 495
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500 505
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<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 303
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1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg
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Thr Phe Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
50 55 60
Phe Val Ala Ala Ile Ser Leu Ser Pro Thr Leu Ala Tyr Tyr Ala Glu
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
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Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
145 150 155 160
Val Gln Ala Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu His
165 170 175
Thr Phe Ser Ser His Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
180 185 190
Glu Arg Glu Ser Val Ala Val Ile Gly Trp Arg Asp Ile Ser Thr Ser
195 200 205
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
210 215 220
Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
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Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Arg Ile Asp Ala Ala Asp Phe Asp
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260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
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Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
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Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
325 330 335
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
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Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
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Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
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435 440 445
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450 455 460
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<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 304
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
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Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
435 440 445
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485 490 495
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<210> 305
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 305
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
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35 40 45
Thr Phe Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
50 55 60
Phe Val Ala Ala Ile Ser Leu Ser Pro Thr Leu Ala Tyr Tyr Ala Glu
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
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195 200 205
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Leu Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
275 280 285
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290 295 300
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
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Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
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Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
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Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
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Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
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Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
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Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 307
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Glu
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Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 322
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 323
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<400> 324
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Glu Asn Leu Val Val Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
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<223> 合成构建体
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325 330 335
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
340 345 350
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
355 360 365
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
370 375 380
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
385 390 395 400
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
420 425 430
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
435 440 445
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
450 455 460
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
465 470 475 480
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
485 490 495
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 336
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 336
atggctctgc ccgtcactgc tctgctgctg cccctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctcaggtcc agctggtgga aagcggagga ggcctggtgc agccaggagg cagcctgagg 120
ctgtcctgcg aggcctctgg cttcaccctg gactactatg ccatcggctg gtttaggcag 180
gcacctggaa aggagaggga gggagtgatc tgtatctctc gcagcgacgg cagcacatac 240
tatgccgatt ccgtgaaggg ccggttcacc atcagcagag acaacgccaa gaagacagtg 300
tacctgcaga tgatctccct gaagcctgag gataccgcag catactattg cgcagcagga 360
gcagactgta gcggatacct gagggattat gagtttaggg gacagggaac ccaggtgaca 420
gtgagctccg gaggaggagg ctcccaggtg cagctggtgg agtctggagg cggcctggtg 480
cagcctggag gcagcctgag actgagctgt gaagcttccg gatttaccct ggactactat 540
gcaatcggat ggtttaggca ggcaccagga aaggagagag aaggcgtgat ctgtatctcc 600
agatctgacg gctctacata ctatgccgat agtgtcaaag gacggttcac catctctaga 660
gataatgcca agaagacagt ctatctgcag atgattagcc tgaagcccga ggacacagcc 720
gcctattact gcgcagcagg agcagattgt agtgggtatc tgagggacta tgagtttcgg 780
gggcagggga cacaggtgac agtgagttct actagtacca cgacgccagc gccgcgacca 840
ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 900
ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc 960
tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 1020
tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 1080
caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 1140
tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 1200
aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 1260
agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1320
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1380
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1440
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgctaa 1488
<210> 337
<211> 1869
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 337
atggctctgc ccgtcactgc tctgctgctg cctctggccc tgctgctgca cgccgcacgc 60
cctcaggtcc agctggtcga gtcaggagga ggcctggtgc agccaggagg ctccctgcgg 120
ctgtcttgcg aggccagcgg cttcaccctg gactactatg ccatcggctg gtttaggcag 180
gcacctggaa aggagaggga gggagtgatc tgtatctcca gatctgacgg ctccacatac 240
tatgccgatt ctgtgaaggg ccggttcacc atctctagag acaacgccaa gaagacagtg 300
tacctgcaga tgatcagcct gaagcccgag gataccgcag catactattg cgcagcagga 360
gcagactgtt ccggatacct gagggattat gagtttaggg gacagggaac ccaggtgaca 420
gtgagctccg gaggaggagg ctcccaggtg cagctggtgg agtctggagg cggcctggtg 480
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gcaatcggat ggtttaggca ggcaccagga aaggagagag aaggcgtgat ctgtatcagc 600
cgctccgacg gcagtaccta ctatgccgat tccgtcaaag gccggttcac catctccaga 660
gacaatgcca agaagacagt ctatctgcag atgatctctc tgaagcctga ggatacagcc 720
gcctattact gtgccgcagg agcagactgt agtggctatc tgagagatta tgagtttcgc 780
ggccagggca cccaggtgac agtgtctagc ggaggaggag gcagccaggt ccagctggtg 840
gaatccggcg gaggcctggt gcagcccggc ggctccctga gactgtcctg tgaagcctcc 900
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ggaagattta ccatctccag agataatgcc aagaagacag tgtatctgca gatgatttcc 1080
ctgaagcccg aggacactgc cgcctattac tgtgcagcag gagcagattg tagcgggtat 1140
ctgcgggatt atgaatttag aggacagggc actcaggtga cagtctcaag cactagtacc 1200
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ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 1320
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tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa 1440
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gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 1680
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cctcgctaa 1869
<210> 338
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 338
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctcaggtca aactggaaga atctggcgga ggcctggtgc aggcaggacg gagcctgcgc 120
ctgagctgcg cagcatccga gcacaccttc agctcccacg tgatgggctg gtttcggcag 180
gccccaggca aggagagaga gagcgtggcc gtgatcggct ggagggacat ctccacatct 240
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tatctgcaga tgaacagcct gaagcccgag gacaccgccg tgtactattg cgcagcaagg 360
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ggaggaggag gatctgaggt gcagctggtg gagagcggag gcggcctggt gcaggccgga 480
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tactatgccg agagcgtgaa gggcaggttt accatctccc gcgataacgc caagaataca 660
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<210> 339
<211> 1497
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 339
atggctctgc ctgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctcaggtca aactggaaga aagtggggga ggcctggtgc aggcaggacg gagcctgcgc 120
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gccccaggca aggagagaga gtccgtggcc gtgatcggct ggagggacat ctccacatct 240
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<210> 340
<211> 1527
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 340
atggctctgc ccgtcaccgc actgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgcaaga 60
ccacaggtca aactggaaga atcaggagga ggcctggtgc aggcaggacg gagcctgcgc 120
ctgagctgcg cagcatccga gcacaccttc agctcccacg tgatgggctg gtttcggcag 180
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tatctgcaga tgaacagcct gaagcccgag gacaccgccg tgtactattg cgcagcaagg 360
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tactatgccg agagcgtgaa gggcaggttt accatctccc gcgataacgc caagaataca 720
gtggtgttac aaatgaacag cctgaaacct gaggacacag ccctgtacta ttgtgccgcc 780
gatcggaaga gcgtgatgag cattagaccc gattattggg ggcaggggac acaggtgacc 840
gtgagcagca ctagtaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 900
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tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaaacgggg cagaaagaaa 1080
ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 1140
ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc 1200
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cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 1527
<210> 341
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 341
atggctctgc ctgtgaccgc actgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgcacga 60
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gtgcaggccg gacggtccct gagactgtct tgtgccgcca gcgagcacac cttctctagc 540
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ggatggaggg acatcagcac atcctacgcc gattctgtga agggccggtt caccatcagc 660
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cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 1080
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ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1320
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acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aa 1482
<210> 342
<211> 1497
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 342
atggccctgc ctgtcaccgc tctgctgctg cccctggccc tgctgctgca cgccgcacgc 60
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cacaccttct ctagccacgt gatgggatgg ttcaggcagg cacctggaaa ggagagggag 600
tctgtggccg tgatcggctg gagggacatc agcacatcct acgccgatag cgtgaagggc 660
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ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 900
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accctttact gcaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 1080
agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa 1140
gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 1200
cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1260
ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 1320
caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1380
gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1440
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<210> 343
<211> 1512
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 343
atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cccctggccc tgctgctgca cgccgcacga 60
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tctgtgaagg gcaggtttac catcagccgc gacaacgcca agaatacagt ggtgctgcag 300
atgaacagcc tgaagccaga ggacacagcc ctgtactatt gcgccgccga tcggaagtct 360
gtgatgagca tcagacccga ttactggggc cagggcaccc aggtgacagt gagctccgga 420
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gtgaagctgg aggagtccgg aggcggcctg gtgcaggccg gacggtccct gagactgtct 540
tgtgccgcca gcgagcacac cttctctagc cacgtgatgg gatggttcag gcaggcacct 600
ggaaaggaga gggagagcgt ggcagtgatc ggatggaggg acatcagcac atcctacgcc 660
gattccgtga agggccggtt caccatcagc cgggacaacg ccaagaagac actgtattta 720
caaatgaaca gcctgaagcc cgaggatacc gccgtgtact attgtgccgc ccggcggatt 780
gatgccgcag actttgatag ttggggacag gggactcagg tcaccgtcag cagcactagt 840
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 900
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 960
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 1020
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 1080
aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 1140
tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 1200
gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1260
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1320
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1380
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1440
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1500
ccccctcgct aa 1512
<210> 344
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 344
atggctctgc ccgtcaccgc actgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctcaggtca aactggaaga atctggcgga ggcctggtgc aggcaggcag gtccctgagg 120
ctgtcttgcg cagcaagcga gcacaccttt agctcccacg tgatgggatg gttcaggcag 180
gcaccaggca aggagagaga gtccgtggcc gtgatcggct ggagggacat ctccacatct 240
tacgccgatt ctgtgaaggg ccggtttacc atcagcagag acaacgccaa gaagacactg 300
tatctgcaga tgaatagcct gaagcctgag gacaccgccg tgtactattg cgcagcaagg 360
agaatcgatg cagcagactt cgattcctgg ggacagggaa cccaggtgac agtgtctagc 420
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ggaggaggag gatccggcgg aggaggctct gcggtgcagc tggtggagtc tgggggagga 480
ttggtgcagg ctggggactc tctgagactc acctgtacag cctctggacg cgccttcagt 540
acctatttca tggcctggtt ccgccaggct ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagga 600
attgcatgga gtggtggtag cacggcgtat gcagactccg tgaagggccg attcaccatc 660
tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat ctgcaaatga acagcctgaa atctgaggac 720
acggccgttt attactgtgc cagcaggggg attgaggtcg aagagtttgg tgcctggggc 780
caggggaccc aggtcaccgt ctcgtcgact agtaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 840
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gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 960
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aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1080
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cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1260
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gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gctaa 1485
<210> 354
<211> 1500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 354
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctgaggtgc agctggtgga gtctggggga ggaatggtgc aggctgggga ctctctgaga 120
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tatctgcaaa tgaacagcct gaaacttgag gatacggccg tttattactg tgcagcatcc 360
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ggaggaggag gatccggcgg aggaggctct ggcggcggcg gcagcgcggt gcagctggtg 480
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<210> 355
<211> 1515
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 355
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctgaggtgc agctggtgga gtctggggga ggaatggtgc aggctgggga ctctctgaga 120
ctatcctgtg tgcagtctac ttacaccgtc aatagcgatg tcatgggctg gttccgccag 180
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tatctgcaaa tgaacagcct gaaacttgag gatacggccg tttattactg tgcagcatcc 360
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ggaggaggag gatccggcgg aggaggctct ggcggcggcg gctccggcgg cggcggctcc 480
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acctgtacag cctctggacg cgccttcagt acctatttca tggcctggtt ccgccaggct 600
ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagga attgcatgga gtggtggtag cacggcgtat 660
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ctgccccctc gctaa 1515
<210> 356
<211> 1479
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 356
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctcaggtaa agctggagga gtctggggga ggattggtgc aggctggggg ctctctgaga 120
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gttttgcaaa tgaacagcct gaaacctgac gacacggccc tttattactg tgcagcatac 360
cggaagtcaa taatgtctat tcagcccgac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 420
tcctcaggag gaggaggatc tcaggtacag ctggtggagt ctgggggagg attggtgcag 480
gctgggggct ctctgagact ctcctgtgca gcctctggag gcaccttaag taaaaatacc 540
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<210> 357
<211> 1509
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 357
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
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<210> 358
<211> 1539
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 358
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
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tcctcaggag gaggaggatc tggaggagga ggaagcggag gaggaggaag cggcggcggc 480
ggctctggcg gcggcggcag ccaggtacag ctggtggagt ctgggggagg attggtgcag 540
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tatgtctgtg cagacttagg gaaatggcct gcgggcccgg cggactactg gggccagggg 840
acccaggtca ccgtctcctc aactagtacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 900
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ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 1080
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 1140
caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 1200
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tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1320
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1380
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<210> 359
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 359
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctcaggtaa agctggagga gtctggggga ggattggtgc aggctggggg ctctctgaga 120
ctctcctgtg cagcctctgg aggcacctta agtaagaata ccgtggcttg ggtccgccag 180
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tcctcaggag gaggaggatc cggcggagga ggctctcagg tacagctggt ggagtctggg 480
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ttaagtaaaa ataccgtggc ttggttccgc caggctccag ggaaggagcg tgggtttgta 600
gcgtctatta cctgggatgg tcgtacgaca tactatgcag actccgtgaa gggccgattc 660
accatctcca gagacaacgc caagaacaca gtgtatctgc aaatgaacag cctgaaacct 720
gaggatacgg ccgtttatgt ctgtgcagac ttagggaaat ggcctgcggg cccggcggac 780
tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc tcctcaacta gtaccacgac gccagcgccg 840
cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 900
tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc 960
tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 1020
ctttactgca aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 1080
ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1140
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ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1260
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<210> 360
<211> 1509
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 360
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctcaggtaa agctggagga gtctggggga ggattggtgc aggctggggg ctctctgaga 120
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tatgcgaact ccgtaaacgg ccgattcccc atcaaccgaa acaacgccga gaatttggtg 300
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cggaagtcaa taatgtctat tcagcccgac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 420
tcctcaggag gaggaggatc cggcggagga ggctctggcg gcggcggcag ccaggtacag 480
ctggtggagt ctgggggagg attggtgcag gctgggggct ctctgagact ctcctgtgca 540
gcctctggag gcaccttaag taaaaatacc gtggcttggt tccgccaggc tccagggaag 600
gagcgtgggt ttgtagcgtc tattacctgg gatggtcgta cgacatacta tgcagactcc 660
gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac aacgccaaga acacagtgta tctgcaaatg 720
aacagcctga aacctgagga tacggccgtt tatgtctgtg cagacttagg gaaatggcct 780
gcgggcccgg cggactactg gggccagggg acccaggtca ccgtctcctc aactagtacc 840
acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 900
ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 960
ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg 1020
tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa 1080
caaccattta tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt 1140
ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 1200
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gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 1320
aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 1380
tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 1440
cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1500
cctcgctaa 1509
<210> 361
<211> 1524
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 361
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctcaggtaa agctggagga gtctggggga ggattggtgc aggctggggg ctctctgaga 120
ctctcctgtg cagcctctgg aggcacctta agtaagaata ccgtggcttg ggtccgccag 180
gctccaggga aggagcgtgg gtttgtaacg tctattacct gtgatggtcg tacgacatac 240
tatgcgaact ccgtaaacgg ccgattcccc atcaaccgaa acaacgccga gaatttggtg 300
gttttgcaaa tgaacagcct gaaacctgac gacacggccc tttattactg tgcagcatac 360
cggaagtcaa taatgtctat tcagcccgac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 420
tcctcaggag gaggaggatc cggcggagga ggctctggcg gcggcggctc cggcggcggc 480
ggctcccagg tacagctggt ggagtctggg ggaggattgg tgcaggctgg gggctctctg 540
agactctcct gtgcagcctc tggaggcacc ttaagtaaaa ataccgtggc ttggttccgc 600
caggctccag ggaaggagcg tgggtttgta gcgtctatta cctgggatgg tcgtacgaca 660
tactatgcag actccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaacgc caagaacaca 720
gtgtatctgc aaatgaacag cctgaaacct gaggatacgg ccgtttatgt ctgtgcagac 780
ttagggaaat ggcctgcggg cccggcggac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 840
tcctcaacta gtaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 900
tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 960
acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 1020
ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc 1080
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1140
tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1200
aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1260
ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1320
gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1380
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cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1500
atgcaggccc tgccccctcg ctaa 1524
<210> 362
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 362
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctcaggtac agctggtgga gtctggggga ggattggtgc aggctggggg ctctctgaga 120
ctctcctgtg cagcctctgg aggcacctta agtaaaaata ccgtggcttg gttccgccag 180
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<212> DNA
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ggctggttcc gccaggctcc agggaaggag cgtgagtttg taggagcgat tatgtggaat 660
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<400> 371
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctgatgtgc agctggtgga gtctggggga ggattggtgc aggctggggg ctctctgaga 120
ctctcctgtg cagcctctgg aggcacctta agtaagaata ccgtggcttg ggtccgccag 180
gctccaggga aggagcgtgg gtttgtaacg tctattacct gtgatggtcg tacgacatac 240
tatgcgaact ccgtgaaggg ccgattcccc atctccagag acaacgccga gaacacagtg 300
tatctgcaaa tgaacagcct gaaacctgag gatacggccg gttatgtctg tgcagactta 360
gggaagtggc ctgcgggttc ggcggactac tggggccagg ggacccacgt caccgtctcc 420
tccggaggag gaggatccgg cggaggaggc tctgatgtgc agctggtgga gtctggggga 480
ggcttggtgc agcctggggg gtctctgaga ctctcctgtg cagcctctgg acggaccttc 540
agtagcattg tcatgggctg gttccgccag gctccaggga aggagcgtga gtttgtagga 600
gcgattatgt ggaatgatgg tattacatac ttgcaagact ccgtgaaggg ccgatttacc 660
atcttcagag acaacgccaa gaacacggtg tatctgcaaa tgaacagcct gaaacttgag 720
gatacggccg tttattactg tgcagcatcc aagggtagat actcggaata tgagtactgg 780
ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca actagtacca cgacgccagc gccgcgacca 840
ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 900
ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc 960
tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 1020
tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 1080
caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 1140
tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 1200
aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 1260
agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1320
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1380
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1440
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgctaa 1488
<210> 372
<211> 1503
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 372
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctgatgtgc agctggtgga gtctggggga ggattggtgc aggctggggg ctctctgaga 120
ctctcctgtg cagcctctgg aggcacctta agtaagaata ccgtggcttg ggtccgccag 180
gctccaggga aggagcgtgg gtttgtaacg tctattacct gtgatggtcg tacgacatac 240
tatgcgaact ccgtgaaggg ccgattcccc atctccagag acaacgccga gaacacagtg 300
tatctgcaaa tgaacagcct gaaacctgag gatacggccg gttatgtctg tgcagactta 360
gggaagtggc ctgcgggttc ggcggactac tggggccagg ggacccacgt caccgtctcc 420
tccggaggag gaggatccgg cggaggaggc tctggcggcg gcggcagcga tgtgcagctg 480
gtggagtctg ggggaggctt ggtgcagcct ggggggtctc tgagactctc ctgtgcagcc 540
tctggacgga ccttcagtag cattgtcatg ggctggttcc gccaggctcc agggaaggag 600
cgtgagtttg taggagcgat tatgtggaat gatggtatta catacttgca agactccgtg 660
aagggccgat ttaccatctt cagagacaac gccaagaaca cggtgtatct gcaaatgaac 720
agcctgaaac ttgaggatac ggccgtttat tactgtgcag catccaaggg tagatactcg 780
gaatatgagt actggggcca ggggacccag gtcaccgtct cctcaactag taccacgacg 840
ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc 900
ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc 960
tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg 1020
gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 1080
tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 1140
gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 1200
taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 1260
gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 1320
aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 1380
gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1440
ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1500
taa 1503
<210> 373
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 373
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60
cctgatgtgc agctggtgga gtctggggga ggattggtgc aggctggggg ctctctgaga 120
ctctcctgtg cagcctctgg aggcacctta agtaagaata ccgtggcttg ggtccgccag 180
gctccaggga aggagcgtgg gtttgtaacg tctattacct gtgatggtcg tacgacatac 240
tatgcgaact ccgtgaaggg ccgattcccc atctccagag acaacgccga gaacacagtg 300
tatctgcaaa tgaacagcct gaaacctgag gatacggccg gttatgtctg tgcagactta 360
gggaagtggc ctgcgggttc ggcggactac tggggccagg ggacccacgt caccgtctcc 420
tccggaggag gaggatccgg cggaggaggc tctggcggcg gcggctccgg cggcggcggc 480
tccgatgtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtgc agcctggggg gtctctgaga 540
ctctcctgtg cagcctctgg acggaccttc agtagcattg tcatgggctg gttccgccag 600
gctccaggga aggagcgtga gtttgtagga gcgattatgt ggaatgatgg tattacatac 660
ttgcaagact ccgtgaaggg ccgatttacc atcttcagag acaacgccaa gaacacggtg 720
tatctgcaaa tgaacagcct gaaacttgag gatacggccg tttattactg tgcagcatcc 780
aagggtagat actcggaata tgagtactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 840
actagtacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 900
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 960
gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 1020
cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 1080
atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1140
tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 1200
gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1260
cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1320
aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1380
gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1440
ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1500
gccctgcccc ctcgctaa 1518
<210> 374
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 374
gtcctggctg ctcttctaca agg 23
<210> 375
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 375
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 376
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 376
gatgtgcagc tgcaggagtc tggaggagg 29
<210> 377
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 377
gatgtgcagc tgcaggagtc tgggggagg 29
<210> 378
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 378
ctagtgcggc cgctgaggag acggtgacct gggt 34
<210> 379
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 379
gccgccacc 9
<210> 380
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 380
gaattc 6
<210> 381
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 381
actagt 6
<210> 382
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 382
gttaac 6
<210> 383
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 383
acgcgt 6
<210> 384
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 384
atgcat 6
<210> 385
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 385
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 386
<211> 18
<212> PRT
<213> 人
<400> 386
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser
<210> 387
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 387
Gly Ser Gly His His His His His His
1 5
<210> 388
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 388
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln
1 5 10
<210> 389
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 389
Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu His Ala Cys
1 5 10
<210> 390
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 390
Asn Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu His Ala Cys Ile Pro
1 5 10
<210> 391
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 391
Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser
1 5 10
<210> 392
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 392
Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg
1 5 10 15
Tyr Cys Asn
<210> 393
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 393
Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser
1 5 10
<210> 394
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 394
Ala Ser Val Thr Asn Ser Val Lys Gly Thr Asn Ala
1 5 10
<210> 395
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 395
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala
50
<210> 396
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 396
Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu Ile Ile Ser Leu Ala Val
1 5 10 15
Phe Val Leu Met Phe Leu Leu
20
<210> 397
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 397
Arg Lys Ile Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly
1 5 10 15
Ser Gly Leu Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr
20 25 30
Gly Asp Glu Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu
35 40 45
Cys Thr Cys Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp
50 55 60
His Cys Phe Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val
65 70 75 80
Thr Thr Lys Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser
85 90 95
Ala Thr Glu Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg
100 105
<210> 398
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 398
gtccttctcc tgtcactggt tat 23
<210> 399
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 399
tcttcttctt ctggaaatcg gca 23

Claims (43)

1.一种包含多肽的多价嵌合抗原受体(CAR)，所述多肽包含：
(a)包含至少两个BCMA结合部分的胞外抗原结合域；
(b)跨膜域；以及
(c)胞内信号传导域。
2.根据权利要求1所述的多价CAR，其中所述胞外抗原结合域包含第一抗BCMA结合部分和第二BCMA结合部分。
3.根据权利要求1或2所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分和所述第二BCMA结合部分中的一者或多者是抗BCMA sdAb。
4.根据权利要求2或3所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分是第一抗BCMA sdAb并且所述第二BCMA结合部分是第二抗BCMA sdAb。
5.根据权利要求2或3所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分是抗BCMA sdAb并且所述第二BCMA结合部分来源于人抗体。
6.根据权利要求2或3所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分是抗BCMA sdAb并且所述第二BCMA结合部分是BCMA的多肽配体。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分和所述第二BCMA结合部分特异性结合至BCMA上的相同的表位。
8.根据权利要求2-6中任一项所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分和所述第二BCMA结合部分特异性结合至BCMA上的不同的表位。
9.根据权利要求2-8中任一项所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分和/或所述第二BCMA结合部分特异性结合至来源于选自SEQ ID NO:388-394氨基酸序列的BCMA上的表位。
10.根据权利要求3-9中的任一项所述的多价CAR，其中所述抗BCMA sdAb包含以下中的任一者：
(1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR3；
(2)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3；
(3)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR3；
(4)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR3；
(5)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR3；
(6)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDR3；
(7)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR3；
(8)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的CDR3；
(9)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3；
(10)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的CDR3；
(11)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的CDR3；
(12)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR3；
(13)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的CDR3；
(14)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR3；
(15)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的CDR3；
(16)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3；
(17)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的CDR3；
(18)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR3；
(19)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR3；
(20)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR3；
(21)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR3；
(22)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR3；
(23)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的CDR3；
(24)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR3；
(25)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR3；
(26)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR3；
(27)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR3；
(28)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR3；
(29)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR3；
(30)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR3；
(31)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR3；
(32)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR3；
(33)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR3；
(34)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR3；
(35)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的CDR3；
(36)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR3；
(37)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3；或
(38)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR3。
11.根据权利要求2-10中任一项所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分位于所述第二BCMA结合部分的N-末端。
12.根据权利要求2-10中任一项所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分位于所述第二BCMA结合部分的C-末端。
13.根据权利要求2-12中任一项所述的多价CAR，其中所述第一BCMA结合部分和所述第二BCMA结合部分通过肽接头彼此融合。
14.根据权利要求13所述的多价CAR，其中所述肽接头的长度不超过约50个氨基酸。
15.一种包含以下中的任一者的抗BCMA单域抗体(sdAb)：
(1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR3；
(2)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3；
(3)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR3；
(4)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR3；
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(28)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR3；
(29)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR3；
(30)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR3；
(31)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR3；
(32)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR3；
(33)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR3；
(34)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR3；
(35)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的CDR3；
(36)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR3；
(37)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3；或
(38)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR3。
16.根据权利要求15所述的抗BCMA sdAb，其中所述抗BCMA sdAb包含选自由SEQ IDNO:115-152组成的组的氨基酸序列。
17.一种抗BCMA抗体，其与根据权利要求15或16所述的抗BCMA sdAb竞争。
18.根据权利要求17所述的抗BCMA抗体，其中所述抗BCMA抗体是sdAb。
19.根据权利要求15、16和18中任一项所述的抗BCMA sdAb，其中所述抗BCMA sdAb是骆驼科动物抗体。
20.根据权利要求15、16和18中任一项所述的抗BCMA sdAb，其中所述抗BCMA sdAb是嵌合抗体。
21.根据权利要求15-16和18-20中任一项所述的抗BCMA sdAb，其中所述抗BCMA sdAb是VHH片段。
22.一种包含多肽的嵌合抗原受体(CAR)，所述多肽包含：
(a)包含根据权利要求15-16和18-21中任一项所述的抗BCMA sdAb的胞外抗原结合域；
(b)跨膜域；以及
(c)胞内信号传导域。
23.根据权利要求22所述的CAR，其中所述胞外抗原结合域包含至少两个抗BCMA sdAb。
24.根据权利要求1-14和23-23中任一项所述的多价CAR或CAR，其中所述跨膜域来源于选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。
25.根据权利要求24所述的多价CAR或CAR，其中所述跨膜域来源于CD8α或CD28。
26.根据权利要求1-14和22-25中任一项所述的多价CAR或CAR，其中所述胞内信号传导域包含免疫效应细胞的主要胞内信号传导域。
27.根据权利要求26所述的多价CAR或CAR，其中所述主要胞内信号传导域来源于CD3ζ。
28.根据权利要求1-14和22-27中任一项所述的多价CAR或CAR，其中所述胞内信号传导域包含共刺激信号传导域。
29.根据权利要求28所述的多价CAR或CAR，其中所述共刺激信号传导域来源于选自由CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合组成的组的共刺激分子。
30.根据权利要求29所述的多价CAR或CAR，所述共刺激信号传导域包含CD28的胞质域和/或CD137的胞质域。
31.根据权利要求1-14和22-30中任一项所述的多价CAR或CAR，还包含位于所述胞外抗原结合域的C-末端和所述跨膜域的N-末端之间的铰链域。
32.根据权利要求31所述的多价CAR或CAR，其中所述铰链域来源于CD8α。
33.根据权利要求1-14和22-32中任一项所述的多价CAR或CAR，还包含位于所述多肽的N-末端的信号肽。
34.根据权利要求33所述的多价CAR或CAR，其中所述信号肽来源于CD8α。
35.一种包含选自由SEQ ID NO:216-256和298-335组成的组的氨基酸序列的嵌合抗原受体。
36.一种经分离的核酸，其包含编码根据权利要求1-14和22-35中任一项所述的CAR或多价CAR的核酸序列。
37.一种载体，其包含根据权利要求36所述的经分离的核酸。
38.一种经工程化的免疫效应细胞，其包含根据权利要求1-14和22-35中任一项所述的CAR或多价CAR，根据权利要求36所述的经分离的核酸，或根据权利要求37所述的载体。
39.根据权利要求38所述的经工程化的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞是T细胞。
40.一种药物组合物，其包含根据权利要求39所述的经工程化的免疫效应细胞，或根据权利要求1-7中的任一项所述的抗BCMA sdAb，和药学上可接受的载剂。
41.一种治疗个体的癌症的方法，包括将有效量的根据权利要求40所述的药物组合物施用于所述个体。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述癌症是难治性或复发性多发性骨髓瘤。
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