CN106822184A - 多靶点联合的car‑t细胞制剂与制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及CAR‑T细胞制剂与制备方法，由以下步骤构成：i.采用基因工程技术设计多个肿瘤抗原的组合，所述的肿瘤抗原的组合包括a.CD19；以及b.CD20、CD138、CD123中的一种或两种，ii.将肿瘤抗原的组合插入到载体序列的4513和4514位置之间构成CAR，载体序列的碱基序列如SEQIDNO.1所示；iii.将CAR进行病毒包装；iv.将CAR通过病毒转染T细胞；v.通过培养基进行培养；vi.将制备的CAR‑T细胞与人血白蛋白、生理盐水混合，其中CAR‑T细胞浓度为0.5～1×10⁶个/毫升，CAR阳性率在25％以上，活率在95％以上。本发明同现有技术相比，通过建立多种不同肿瘤抗原组合的CAR‑T细胞以及多靶点识别，能提高对肿瘤细胞的识别能力，确保T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。

Description

多靶点联合的CAR-T细胞制剂与制备方法

[技术领域]

本发明涉及CAR-T细胞制剂与制备方法。

[背景技术]

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)T细胞治疗(CAR-T)技术是近年来迅速发展起来的一种肿瘤过继免疫治疗的新手段。CAR是人工构建的融合基因编码的跨膜分子，由胞外区、胞内区和跨膜区三部分构成。胞外区负责肿瘤抗原的识别，胞内区负责信号的转导，跨膜区连接胞外区和胞内区。通过将识别肿瘤相关抗原的抗体的单链可变区(single-chain variable fragment，scFv)和胞内信号域在体外进行基因重组，生成重组质粒，采用病毒包装后再转染至患者T细胞，使患者的T细胞表达肿瘤抗原受体，转染后经过纯化和大量扩增后的T细胞，即为CART细胞。CAR能够赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力。目标肿瘤抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性都是关键的决定因素。目前，尽管识别CD19靶点的CART可以成功治愈B淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤，但仍然存在治疗失败的病例，根本原因是对于有的B淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤患者，CD19作为靶点的特异性不强，使CAR-T细胞不能正确识别肿瘤细胞。因此，开发多种肿瘤抗原组合的CAR，根据患者外周血中的肿瘤抗原的表达情况选择CAR，制备的CAR-T细胞，通过多靶点识别，能提高对肿瘤细胞的识别能力，确保T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。

[发明内容]

本发明提高T细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤效率。

为了实现上述目的，提供一种多靶点联合的CAR-T细胞制剂及其制备方法，由以下步骤构成：

i.采用基因工程技术设计多个肿瘤抗原的组合，所述的肿瘤抗原的组合包括a.CD19；以及b.CD20、CD138、CD123中的一种或两种，

ii.将肿瘤抗原的组合插入到载体序列的4513和4514位置之间构成CAR，载体序列的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

iii.将CAR进行病毒包装；

iv.将CAR通过病毒转染T细胞；

v.通过培养基进行培养；

vi.将制备的CAR-T细胞与人血白蛋白、生理盐水混合，其中CAR-T细胞浓度为0.5～1×10⁶个/毫升，CAR阳性率在25％以上，活率在95％以上。

包括两种不同的CD19，所述的CD19来自人源和/或鼠源。

包括两种不同的CD123序列。

所述的肿瘤抗原组合为CD19-CD20、CD19-CD138、CD19-CD123、CD19-CD20-CD138、CD19-CD20-CD123、CD19-CD138-CD123。

本发明同现有技术相比，通过建立多种不同肿瘤抗原组合的CAR-T细胞以及多靶点识别，能提高对肿瘤细胞的识别能力，确保T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。

[具体实施方式]

以下，结合实施例对于本发明做进一步说明，应当理解实施例仅用于解释说明而不用于限定发明的保护范围。

本实施例中的CAR-T细胞制剂的制备通过以下步骤实现：

a.采用基因工程技术设计多个肿瘤抗原的组合，这些抗原涉及CD19、CD20、CD138、CD123，抗原组合的方式是CD19加上另外一个抗原组合和CD19加上另外二个抗原组合，即CD19-CD20,CD19-CD138,CD19-CD123，CD19-CD20-CD138，CD19-CD20-CD123，CD19-CD138-CD123，这是根据患者外周血中的肿瘤抗原的表达而选择的，CD19、CD20、CD138、CD123的基因对于本领域的技术人员是清楚的，如

CD19可选择两个序列，一条为鼠源的(CD19-1，如SEQID NO.2所示)，一条为人源的(CD19-2，如SEQ ID NO.3所示)，因此，CD19的选择可以是上述两个中的任意一个；

CD20的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

CD123有两个序列，标记为CD123-1(如SEQ ID NO.5所示)，CD123-2(如SEQ IDNO.6所示)，CD123的选择可以是上述两个中的任意一个。

CD20的碱基序列如SEQ ID NO.7所示。

b.载体的序列为CARVec，如SEQ ID NO.1所示，将上面a.组合的序列插入到载体序列的4513和4514位置之间；

c.将CAR进行病毒包装；

d.将CAR通过病毒转染T细胞；

e.通过培养基进行培养；

f.将制备的CAR-T细胞与人血白蛋白、生理盐水混合，其中CAR-T细胞浓度为0.5～1×10⁶个/毫升，CAR阳性率在25％以上，活率在95％以上。

<110>梁爱斌，刘劼，孙毅，张文君，汪俊帮，李萍，唐晓晨，陈彩琴，朱益辉

<120>多靶点联合的CAR-T细胞制剂与制备方法

<160>7

<210>1

<211>7145

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>载体序列，在位置4513和4514之间插入抗原序列

<400>1

caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac 60

attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa 120

aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat 180

tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc 240

agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga 300

gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg 360

cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc 420

agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag 480

taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc 540

tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg 600

taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg 660

acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac 720

ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac 780

cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg 840

agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg 900

tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg 960

agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac 1020

tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg 1080

ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 1140

tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 1200

aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 1260

tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 1320

agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 1380

taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 1440

caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 1500

agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 1560

aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 1620

gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 1680

tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 1740

gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 1800

ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 1860

ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 1920

aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 1980

aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 2040

atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta 2100

tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt 2160

acgccaagcg cgcaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat 2220

gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc 2280

cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg 2340

tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgga 2400

ggcgtggcct gggcgggact ggggagtggc gagccctcag atcctgcata taagcagctg 2460

ctttttgcct gtactgggtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc 2520

taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg 2580

tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg 2640

tggaaaatct ctagcagtgg cgcccgaaca gggacctgaa agcgaaaggg aaaccagagc 2700

tctctcgacg caggactcgg cttgctgaag cgcgcacggc aagaggcgag gggcggcgac 2760

tggtgagtac gccaaaaatt ttgactagcg gaggctagaa ggagagagat gggtgcgaga 2820

gcgtcagtat taagcggggg agaattagat cgcgatggga aaaaattcgg ttaaggccag 2880

ggggaaagaa aaaatataaa ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag ctagaacgat 2940

tcgcagttaa tcctggcctg ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata ctgggacagc 3000

tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat acagtagcaa 3060

ccctctattg tgtgcatcaa aggatagaga taaaagacac caaggaagct ttagacaaga 3120

tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagacca ccgcacagca agcggccgct gatcttcaga 3180

cctggaggag gagatatgag ggacaattgg agaagtgaat tatataaata taaagtagta 3240

aaaattgaac cattaggagt agcacccacc aaggcaaaga gaagagtggt gcagagagaa 3300

aaaagagcag tgggaatagg agctttgttc cttgggttct tgggagcagc aggaagcact 3360

atgggcgcag cctcaatgac gctgacggta caggccagac aattattgtc tggtatagtg 3420

cagcagcaga acaatttgct gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca 3480

gtctggggca tcaagcagct ccaggcaaga atcctggctg tggaaagata cctaaaggat 3540

caacagctcc tggggatttg gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac tgctgtgcct 3600

tggaatgcta gttggagtaa taaatctctg gaacagattt ggaatcacac gacctggatg 3660

gagtgggaca gagaaattaa caattacaca agcttaatac actccttaat tgaagaatcg 3720

caaaaccagc aagaaaagaa tgaacaagaa ttattggaat tagataaatg ggcaagtttg 3780

tggaattggt ttaacataac aaattggctg tggtatataa aattattcat aatgatagta 3840

ggaggcttgg taggtttaag aatagttttt gctgtacttt ctatagtgaa tagagttagg 3900

cagggatatt caccattatc gtttcagacc cacctcccaa ccccgagggg acccgacagg 3960

cccgaaggaa tagaagaaga aggtggagag agagacagag acagatccat tcgattagtg 4020

aacggatctc gacggtatcg gttaactttt aaaagaaaag gggggattgg ggggtacagt 4080

gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac aaactaaaga attacaaaaa 4140

caaattacaa aaattcaaaa ttttatcgat cacgagacta gcctcgagaa gcttgatcga 4200

tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg 4260

gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag 4320

tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc 4380

agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtgtcgtg 4440

acgcggatcc atggcgctgc cggtgaccgc gctgctgctg ccgctggcgc tgctgctgca 4500

tgcggcgcgt ccg 4513

accacca ccccggcgcc gcgtccgccg accccggcgc cgaccattgc 4560

gagccagccg ctgagcctgc gtccggaagc gtgccgtccg gcggcgggcg gcgcggtgca 4620

tacccgtggc ctggattttg cgtgcgatat ttatatttgg gcgccgctgg cgggcacctg 4680

cggcgtgctg ctgctgagcc tggtgattac cctgtattgc aaacgtggcc gtaaaaaact 4740

gctgtatatt tttaaacagc cgtttatgcg tccggtgcag accacccagg aagaagatgg 4800

ctgcagctgc cgttttccgg aagaagaaga aggcggctgc gaactgcgtg tgaaatttag 4860

ccgtagcgcg gatgcgccgg cgtatcagca gggccagaac cagctgtata acgaactgaa 4920

cctgggccgt cgtgaagaat atgatgtgct ggataaacgt cgtggccgtg atccggaaat 4980

gggcggcaaa ccgcgtcgta aaaacccgca ggaaggcctg tataacgaac tgcagaaaga 5040

taaaatggcg gaagcgtata gcgaaattgg catgaaaggc gaacgtcgtc gtggcaaagg 5100

ccatgatggc ctgtatcagg gcctgagcac cgcgaccaaa gatacctatg atgcgctgca 5160

tatgcaggcg ctgccgccgc gttaagtcga cctcgaggga attccgataa tcaacctctg 5220

gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta 5280

tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt 5340

ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc 5400

aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt 5460

gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg 5520

gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac 5580

aattccgtgg tgttgtcggg gaagctgacg tcctttccat ggctgctcgc ctgtgttgcc 5640

acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac 5700

cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct 5760

cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcatc gggaattcga gctcggtacc 5820

tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg 5880

gggactggaa gggctaattc actcccaacg aagacaagat ctgctttttg cttgtactgg 5940

gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact 6000

gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg 6060

tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag 6120

tagtagttca tgtcatctta ttattcagta tttataactt gcaaagaaat gaatatcaga 6180

gagtgagagg aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 6240

aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 6300

caatgtatct tatcatgtct ggctctagct atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc 6360

cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg 6420

gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcgtc 6480

gagacgtacc caattcgccc tatagtgagt cgtattacgc gcgctcactg gccgtcgttt 6540

tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc 6600

cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt 6660

tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcgacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg 6720

gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt 6780

tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc 6840

gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg 6900

attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga 6960

cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc 7020

ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa 7080

aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa 7140

tttcc 7145

<210>2

<211>726

<212>DNA

<213>鼠源的CD19

<400>2

gatattcaga tgacccagac caccagcagc ctgagcgcga gcctgggcga tcgtgtgacc 60

attagctgcc gtgcgagcca ggatattagc aaatatctga actggtatca gcagaaaccg 120

gatggcaccg tgaaactgct gatttatcat accagccgtc tgcatagcgg cgtgccgagc 180

cgttttagcg gcagcggcag cggcaccgat tatagcctga ccattagcaa cctggaacag 240

gaagatattg cgacctattt ttgccagcag ggcaacaccc tgccgtatac ctttggcggc 300

ggcaccaaac tggaaattac cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 360

ggcagcgaag tgaaactgca ggaaagcggc ccgggcctgg tggcgccgag ccagagcctg 420

agcgtgacct gcaccgtgag cggcgtgagc ctgccggatt atggcgtgag ctggattcgt 480

cagccgccgc gtaaaggcct ggaatggctg ggcgtgattt ggggcagcga aaccacctat 540

tataacagcg cgctgaaaag ccgtctgacc attattaaag ataacagcaa aagccaggtg 600

tttctgaaaa tgaacagcct gcagaccgat gataccgcga tttattattg cgcgaaacat 660

tattattatg gcggcagcta tgcgatggat tattggggcc agggcaccag cgtgaccgtg 720

agcagc 726

<210>3

<211>750

<212>DNA

<213>人源的CD19

<400>3

gaactggtgc tgacccagag cccggcgagc ctggcggtga gcctgggcca gcgtgcgacc 60

attagctgca aagcgagcca gagcgtggat tatgatggcg atagctatct gaactggtat 120

cagcagattc cgggccagcc gccgaaactg ctgatttatg atgcgagcaa cctggtgagc 180

ggcattccgc cgcgttttag cggcagcggc agcggcaccg attttaccct gaacattcat 240

ccggtggaaa aagtggatgc ggcgacctat cattgccagc agagcaccga agatccgtgg 300

acctttggcg gcggcaccaa actggaaatt aaacgtcgta gcggcggcgg cggcagcggc 360

ggcggcggca gcggcggcgg cggcagccag gtgcagctgc tggaaagcgg cgcggaactg 420

gtgcgtccgg gcagcagcgt gaaaattagc tgcaaagcga gcggctatgc gtttagcagc 480

tattggatga actgggtgaa acagcgtccg ggccagggcc tggaatggat tggccagatt 540

tggccgggcg atggcgatac caactataac ggcaaattta aaggcaaagc gaccctgacc 600

gcggatgaaa gcagcagcac cgcgtatatg cagctgagca gcctgcgtag cgaagatagc 660

gcggtgtata gctgcgcgcg tcgtgaaacc accaccgtgg gccgttatta ttatgcgatg 720

gattattggg gccagggcac caccgtgacc 750

<210>4

<211>666

<212>DNA

<213> CD20

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gatattcagc tgacccagag cccggcgatt ctgagcgcga gcccgggcga aaaagtgacc 60

atgacctgcc gtgcgagcag cagcctgagc tttatgcatt ggtatcagca gaaaccgggc 120

agcagcccga aaccgtggat ttatgcgacc agcaacctgg cgagcggcgt gccggcgcgt 180

tttagcggca gcggcagcgg caccagctat agcctgacca ttagcaccgt ggaagcggaa 240

gatgcggcga gctatttttg ccatcagtgg agcagcaacc cgctgacctt tggcgcgggc 300

accaaactgg aaattagcag cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcgatgtg 360

atgggcgtgg atagcggcgg cggcctggtg cagccgggcg gcagccgtaa actgagctgc 420

gcggcgccgg gctttacctt tagcagcttt ggcatgcatt gggtgcgtca ggcgccggaa 480

aaaggcctgg aatgggtggc gtatattagc agcccgagca gcaccctgca ttatgcggat 540

cgtgtgaaag gccgttttac cattagccgt gataacccga aaaacaccct gtttctgcag 600

atgaaactgc cgagcctgtg ctatggcctg ctgggcccgc gtgatcatgt gcatcgtctg 660

ctgaaa 666

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<211>732

<212>DNA

<213> CD123-1

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cagattcagc tggtgcagag cggcccggaa ctgaaaaaac cgggcgaaac cgtgaaaatt 60

agctgcaaag cgagcggcta tatttttacc aactatggca tgaactgggt gaaacaggcg 120

ccgggcaaaa gctttaaatg gatgggctgg attaacacct ataccggcga aagcacctat 180

agcgcggatt ttaaaggccg ttttgcgttt agcctggaaa ccagcgcgag caccgcgtat 240

ctgcatatta acgatctgaa aaacgaagat accgcgacct atttttgcgc gcgtagcggc 300

ggctatgatc cgatggatta ttggggccag ggcaccagcg tgaccgtgag cagcggcggc 360

ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg atattgtgct gacccagagc 420

ccggcgagcc tggcggtgag cctgggccag cgtgcgacca ttagctgccg tgcgagcgaa 480

agcgtggata actatggcaa cacctttatg cattggtatc agcagaaacc gggccagccg 540

ccgaaactgc tgatttatcg tgcgagcaac ctggaaagcg gcattccggc gcgttttagc 600

ggcagcggca gccgtaccga ttttaccctg accattaacc cggtggaagc ggatgatgtg 660

gcgacctatt attgccagca gagcaacgaa gatccgccga cctttggcgc gggcaccaaa 720

ctggaactga aa 732

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<212>DNA

<213> CD123-2

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caggtgcagc tgcagcagcc gggcgcggaa ctggtgcgtc cgggcgcgag cgtgaaactg 60

agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc agctattgga tgaactgggt gaaacagcgt 120

ccggatcagg gcctggaatg gattggccgt attgatccgt atgatagcga aacccattat 180

aaccagaaat ttaaagataa agcgattctg accgtggata aaagcagcag caccgcgtat 240

atgcagctga gcagcctgac cagcgaagat agcgcggtgt attattgcgc gcgtggcaac 300

tgggatgatt attggggcca gggcaccacc ctgaccgtga gcagcggcgg cggcggcagc 360

ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc gatgtgcaga ttacccagag cccgagctat 420

ctggcggcga gcccgggcga aaccattacc attaactgcc gtgcgagcaa aagcattagc 480

aaagatctgg cgtggtatca ggaaaaaccg ggcaaaacca acaaactgct gatttatagc 540

ggcagcaccc tgcagagcgg cattccgagc cgttttagcg gcagcggcag cggcaccgat 600

tttaccctga ccattagcag cctggaaccg gaagattttg cgatgtatta ttgccagcag 660

cataacaaat atccgtatac ctttggcggc ggcaccaaac tggaaattaa a 711

<210>7

<211>2031

<212>DNA

<213> CD138

<400>7

gatattcaga tgacccagag caccagcagc ctgagcgcga gcctgggcga tcgtgtgacc 60

attagctgca gcgcgagcca gggcattaac aactatctga actggtatca gcagaaaccg 120

gatggcaccg tggaactgct gatttattat accagcaccc tgcagagcgg cgtgccgagc 180

cgttttagcg gcagcggcag cggcaccgat tatagcctga ccattagcaa cctggaaccg 240

gaagatattg gcacctatta ttgccagcag tatagcaaac tgccgcgtac ctttggcggc 300

ggcaccaaac tggaaattct gcgtaccgtg gcggcgccga gcgtgtttat ttttccgccg 360

agcgatgaac agctgaaaag cggcaccgcg agcgtggtgt gcctgctgaa caacttttat 420

ccgcgtgaag cgaaagtgca gtggaaagtg gataacgcgc tgcagagcgg caacagccag 480

gaaagcgtga ccgaacagga tagcaaagat agcacctata gcctgagcag caccctgacc 540

ctgagcaaag cggattatga aaaacataaa gtgtatgcgt gcgaagtgac ccatcagggc 600

ctgagcagcc cggtgaccaa aagctttaac cgtggcgaat gcggcggcgg cggcagcggc 660

ggcggcggca gcggcggcgg cggcagccag gtgcagctgc agcagagcgg cagcgaactg 720

atgatgccgg gcgcgagcgt gaaaattagc tgcaaagcga ccggctatac ctttagcaac 780

tattggattg aatgggtgaa acagcgtccg ggccatggcc tggaatggat tggcgaaatt 840

ctgccgggca ccggccgtac catttataac gaaaaattta aaggcaaagc gacctttacc 900

gcggatatta gcagcaacac cgtgcagatg cagctgagca gcctgaccag cgaagatagc 960

gcggtgtatt attgcgcgcg tcgtgattat tatggcaact tttattatgc gatggattat 1020

tggggccagg gcaccagcgt gaccgtgagc agcgcgagca ccaaaggccc gagcgtgttt 1080

ccgctggcgc cgtgcagccg tagcaccagc gaaagcaccg cggcgctggg ctgcctggtg 1140

aaagattatt ttccggaacc ggtgaccgtg agctggaaca gcggcgcgct gaccagcggc 1200

gtgcatacct ttccggcggt gctgcagagc agcggcctgt atagcctgag cagcgtggtg 1260

accgtgccga gcagcagcct gggcaccaaa acctatacct gcaacgtgga tcataaaccg 1320

agcaacacca aagtggataa acgtgtggaa agcaaatatg gcccgccgtg cccgagctgc 1380

ccggcgccgg aatttctggg cggcccgagc gtgtttctgt ttccgccgaa accgaaagat 1440

accctgatga ttagccgtac cccggaagtg acctgcgtgg tggtggatgt gagccaggaa 1500

gatccggaag tgcagtttaa ctggtatgtg gatggcgtgg aagtgcataa cgcgaaaacc 1560

aaaccgcgtg aagaacagtt taacagcacc tatcgtgtgg tgagcgtgct gaccgtgctg 1620

catcaggatt ggctgaacgg caaagaatat aaatgcaaag tgagcaacaa aggcctgccg 1680

agcagcattg aaaaaaccat tagcaaagcg aaaggccagc cgcgtgaacc gcaggtgtat 1740

accctgccgc cgagccagga agaaatgacc aaaaaccagg tgagcctgac ctgcctggtg 1800

aaaggctttt atccgagcga tattgcggtg gaatgggaaa gcaacggcca gccggaaaac 1860

aactataaaa ccaccccgcc ggtgctggat agcgatggca gcttttttct gtatagccgt 1920

ctgaccgtgg ataaaagccg ttggcaggaa ggcaacgtgt ttagctgcag cgtgatgcat 1980

gaagcgctgc ataaccatta tacccagaaa agcctgagcc tgagcctggg caaa 2034

Claims (10)

1.一种多靶点联合的CAR-T细胞制剂的制备方法，其特征在于由以下步骤构成：

i.采用基因工程技术设计多个肿瘤抗原的组合，所述的肿瘤抗原的组合包括a.CD19；以及b.CD20、CD138、CD123中的一种或两种，

ii.将肿瘤抗原的组合插入到载体序列的4513和4514位置之间构成CAR，载体序列的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

iii.将CAR进行病毒包装；

iv.将CAR通过病毒转染T细胞；

v.通过培养基进行培养；

vi.将制备的CAR-T细胞与人血白蛋白、生理盐水混合，其中CAR-T细胞浓度为0.5～1×10⁶个/毫升，CAR阳性率在25％以上，活率在95％以上。

2.如权利要求1所述的CAR-T细胞制剂的制备方法，其特征在于包括两种不同的CD19，所述的CD19来自人源和/或鼠源。

3.如权利要求1所述的CAR-T细胞制剂的制备方法，其特征在于包括两种不同的CD123序列。

4.如权利要求1所述的CAR-T细胞制剂的制备方法，其特征在于所述的肿瘤抗原组合为CD19-CD20。

5.如权利要求1所述的CAR-T细胞制剂的制备方法，其特征在于所述的肿瘤抗原组合为CD19-CD138。

6.如权利要求1所述的CAR-T细胞制剂的制备方法，其特征在于所述的肿瘤抗原组合为CD19-CD123。

7.如权利要求1所述的CAR-T细胞制剂的制备方法，其特征在于所述的肿瘤抗原组合为CD19-CD20-CD138。

8.如权利要求1所述的CAR-T细胞制剂的制备方法，其特征在于所述的肿瘤抗原组合为CD19-CD20-CD123。

9.如权利要求1所述的CAR-T细胞制剂的制备方法，其特征在于所述的肿瘤抗原组合为CD19-CD138-CD123。

10.一种多靶点联合的CAR-T细胞制剂，由权利要求1～9任一所述的制备方法制备得到。