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JP2022553292A - 操作されたナチュラルキラー細胞、ならびに免疫療法およびオートファジー阻害技法においてそれを使用するための方法 - Google Patents

操作されたナチュラルキラー細胞、ならびに免疫療法およびオートファジー阻害技法においてそれを使用するための方法 Download PDF

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Abstract

がん、特に膠芽腫の治療のための、ポリヌクレオチド構築物、およびそのような構築物を発現する多機能性の操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が提供される。構築物は、標的細胞上の少なくとも１種のコグネートリガンドを標的にする第１の結合ドメイン、標的細胞のアデノシン産生細胞表面タンパク質または標的細胞のアデノシン中間体産生細胞表面タンパク質に特異的な第２の結合ドメイン、および切断可能なリンカー、ならびにがん関連抗原に特異的な第３の結合ドメインの融合体である。操作されたＮＫ細胞の薬学的組成物、ならびに単独でおよびオートファジー阻害剤に加えて、そのような薬学的組成物を使用して膠芽腫を治療する方法も提供される。

Description

優先権
本出願は、２０１９年１０月２１日に出願されたＭａｔｏｓｅｖｉｃらに対する米国仮特許出願第６２／９２３，６４４号に関連し、その優先権の利益を主張するものである。前述の出願の内容は、参照によりその全体として本明細書によって本開示に組み入れられる。
本開示は、概して、がん療法および治療の分野、より特に、複数の抗腫瘍機能を持ち、かつ療法に対するがん抵抗性、特に膠芽腫抵抗性の主要な推進因子に対処するように操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を利用する多機能性免疫療法に関する。
膠芽腫（ＧＢＭ）は、成人および子どもにおける、飛び抜けて最もよく見られかつ侵攻性の悪性タイプの原発性脳腫瘍であり、治療するのが最も困難なものの１つである。ＧＢＭ患者は、伝統的治療に応答不良である傾向があり、ＧＢＭは、あらゆる中枢神経系悪性腫瘍のうちで最悪の予後を有する。先進の診断様態、ならびに手術、化学療法、放射線技法、小分子阻害剤、および複数種の抗新生物薬の使用等の積極的な単一のおよび多面的な治療選択肢を用いてさえ、生存の割合は、過去数十年にわたってごく穏やかに向上しているだけであり、生存期間中央値はおよそ１年間である。実際のところ、これまでに調べられた従来の治療のうち、すべてが、第ＩＩＩ相臨床試験においてＧＢＭ患者全生存期間を向上させることに失敗しており、ＧＢＭに対する治療法は存在しない。この失敗の理由は多因子的である。
第一に、ＧＢＭは、もともと高度に浸潤性かつ侵襲性であり、ＧＢＭに対する療法は、脳におけるその生物学的位置、血液脳関門、および神経実質に起因して困難である。さらに、腫瘍内の種々の細胞ならびに腫瘍を取り囲む細胞の間での複雑な相互作用と合わせて、ＧＢＭの不均質性は、治療抵抗性および悪性腫瘍再燃の主因の１つとして指定されている。公知のＧＢＭサブタイプ（古典的、間葉性、神経系、および前神経系）のそれぞれは、個別のかつ可変的な細胞可塑性と関連した多様な遺伝的およびエピジェネティック的シグネチャーを呈する。
ＧＭＢ細胞の亜集団であるグリオーマ幹様細胞（glioma stem-like cell）（ＧＳＣ）も治療抵抗性の一因となる。ＧＳＣは、自己再生能、複能性、および腫瘍発生の誘導を示し得、グリオーマ発生、療法に対する抵抗性、および侵攻性再発を支持する推進力としてますます認識されている。これは、少なくとも一部には、従来の療法が特異的ＧＳＣ亜集団を排除し得なかったことに起因する。しかしながら、これらの細胞は、従来のＧＢＭモデル細胞株（Ｕ８７ＭＧを含む）によって再現が乏しく、それがＧＭＢの調査を妨げる。
ＧＢＭ進行は、細胞のエネルギーバランスの、高度に制御された異化調節因子であるオートファジーによっても促進される。通常の条件下で、細胞は、基底レベルのオートファジーを利用して、生物学的機能の維持、恒常性、細胞内容物の品質管理、ならびに古いタンパク質および損傷した細胞小器官の排除を支援する。しかしながら、がん細胞では、オートファジーは、がん細胞増殖および腫瘍成長を促進することによって腫瘍発生を促し得る。実際のところ、オートファジーは、ＧＢＭ代謝、低酸素における生存、進行、および療法に対する抵抗性を支持し得る。ＢＥＣＮ１遺伝子によってコードされるＢｅｃｌｉｎ－１は、オートファジーの促進において中心的役割を有する。
付加的に、ＧＢＭは、抗原回避に参加し得るまたは免疫抑制を推進し得る、複数の免疫チェックポイントを発現する。これらのうちの１つは、抗炎症性アデノシンへのＡＴＰおよびＡＤＰの漸進的加水分解を媒介しかつＧＢＭにおいて上方調節される、複数種の細胞（浸潤免疫細胞および腫瘍細胞の両方を含む）上に発現される表面酵素であるエクト－５’－ヌクレオチダーゼ（ＣＤ７３）である。ＣＤ７３は、ＣＤ３９と共同して、アデノシン５’－三リン酸（ＡＴＰ）からの細胞外アデノシンの産生を誘導する。アデノシンは、今度は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上のアデノシン受容体に結合し、ＮＫ細胞活性の重大な免疫代謝調節異常をもたらす。このように、免疫系恒常性を維持するために非常に重要である、アデノシン作動性（adenosinergic）経路によって媒介される免疫抑制は、ＧＢＭにおいてハイジャックされる。
前述のものに加えて、ＧＢＭによる治療回避は、身体の先天性免疫系の重要なエフェクターを抑制する代謝的および機能的カスケードの両方を引き起こす、極度に免疫抑制性の低酸素腫瘍微小環境（ＴＭＥ）によっても促進される。不充分な血管新生（vascularzation）に起因して腫瘍のＴＭＥに見い出されるもの等、低酸素および虚血の病態生理学的病状は、ＡＴＰおよびアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）等のアデニンヌクレオチドの重大な代謝変化も推進する。通常の生理学的条件下で、ＡＴＰは細胞内区画に局在する；しかしながら、細胞外ＡＴＰ（ゆえに、アデノシン）のレベルは、低酸素、虚血、および悪性腫瘍の状況に応答して有意に上がり、腫瘍環境の特質を規定する。例えば、腫瘍内細胞外ＡＴＰ濃度は、同じ起源の細胞の正常組織におけるものよりも、最高１，０００倍高くあり得る。これらの条件は、ＮＫ細胞の調節異常、ゆえにＮＫ細胞抗腫瘍監視および免疫の抑制の一因となり、それは腫瘍の侵襲性を促進する。
先天性免疫の重要なエフェクターとして、ＮＫ細胞は固有であり、癌免疫監視において枢要な機能を果たす。感染細胞表面に提示される主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を単に検出するＴ細胞とは異なり、ＮＫ細胞機能は、活性化および阻害性受容体のバランスによって推進され、それを通じて、それらは病原体と相互作用し、がん細胞上のＭＨＣクラスＩ分子を認識する。ＮＫ細胞は、事前の感作なしで多様な異常細胞またはストレスを受けた細胞を排除し得、幹様細胞またはがん幹細胞を優先的に殺滅さえし得る。標的細胞との免疫シナプスを形成すると、ＮＫ細胞は、細胞溶解を誘導するサイトカインを放出する。しかしながら、ＧＢＭは、様々な戦術を採用して免疫抑制経路を遅延させ、変更し、または止めさえして、悪性細胞が危険なまたは外来のものとして認識されるのを阻止する。これらのメカニズムは、がんが免疫系によって排除されるのを阻止し、腫瘍成長の制御の失敗につながり、疾患が、非常に早期の段階から致死的状態に進行することを可能にする。
ＮＫ細胞応答のＧＢＭ誘導性機能阻害と並行して、標的抗原の下方調節または変異がＧＢＭにおいてよく観察され、免疫回避および治療に対する抵抗性の一因ともなる。二重抗原標的化のまたはプログラム可能な腫瘍感知のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含めた、従来の養子移入Ｔ細胞療法ストラテジーは、そのような回避に対抗することが前臨床的に評価されているが、ＧＢＭは、抗原逃避を超えるメカニズムを採用して標的化を避ける。抗原逃避は、細胞に基づく抗原特異的な単一療法の効能の減少をもたらし、差示的スプライシング、ミスセンス変異、または系統交代（lineage switch）を含めたメカニズムによって誘発される。実際のところ、ほとんどのＧＢＭ特異的なおよびＧＢＭ関連の抗原を用いたこれまでのすべての臨床研究において、抗原逃避変種の増生が観察されている。
新たなかつ有効なＧＢＭ治療選択肢の切迫した必要性がある。複数の複雑なメカニズムに対するＮＫ細胞機能喪失を再現することは、従来の療法に重大な課題を提示するだけではなく、一方でそれは、腫瘍組織内に特異的にＮＫ細胞のより大きな存在も要し、それにより、意味のある臨床応答が始まり得る。従来の方法は、これらのエリアにおいて成功していない。それゆえ、ＧＢＭ腫瘍標的化の増強、ＴＭＥへのＮＫ細胞動員の増加の能力があり、それを通じてＮＫ機能不全が救済され得る、有効なＧＢＭ治療選択肢のための商業的に実行可能でかつ安全な方法を開発する必要性が存在する。
本開示は、ＧＢＭにおける複数の免疫回避メカニズムを標的にする新規の免疫療法の開発を記載する。その組成物、システム、および方法は、２種以上のＧＢＭ抗原を一度に標的にし、一方でまたＣＤ７３活性を遮断する抗体を放出するように設計された遺伝子操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を初めて組み合わせる。少なくとも１つの実施形態において、本開示は、この細胞に基づく免疫療法と小分子オートファジー阻害剤、例えば、限定されることなくクロロキンとをさらに組み合わせる。この背景におけるオートファジー阻害剤の使用は、さらなるＧＢＭ阻害、ならびにＧＢＭにさらに浸潤しかつ全体的な療法有効性を増強するＮＫ細胞を引き付けるケモカインの分泌をもたらす。このように、本開示の組成物、システム、および方法は、免疫監視からのＧＢＭ逃避を制限し得、腫瘍へのＮＫ細胞の動員を促進し得、ゆえに持続的な抗ＧＢＭ応答をもたらす。
ポリヌクレオチド構築物が本明細書において提供される。少なくとも１つの実施形態において、そのような構築物は、少なくとも第２の結合ドメインまたはそのフラグメントをコードする第２の配列に作動可能に連結された、少なくとも第１の結合ドメインまたはそのフラグメントをコードする第１の配列を含む。第１の結合ドメインまたはそのフラグメントは、ＮＫ活性化受容体、または第１のがん関連抗原に特異的な第１のタンパク質を含み、第２の結合ドメインまたはそのフラグメントは、標的細胞のアデノシン産生細胞表面タンパク質または標的細胞のアデノシン中間体産生細胞表面タンパク質に特異的である。第１のドメインは、ヒンジドメイン（例えば、限定されることなく、リンカーまたはスペーサー）、１種もしくは複数の自己切断ペプチド（例えば、限定されることなく、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｔ２Ａ）、またはその両方を任意でさらにコードし得る。第２の結合ドメイン／フラグメントは、第１の結合ドメインに作動的に連結された切断可能なリンカーをさらに含む。ある特定の実施形態において、切断可能なリンカーは、標的細胞および／または腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に存在する１種または複数のプロテアーゼによって切断可能であるように構成される（限定されることなく、リソソームシステインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ（トリプシン等）、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、およびマトリックスメタロプロテアーゼを含む、そのようなプロテアーゼが当技術分野において広く知られておりかつ理解されている）。少なくとも１つの例示的な実施形態において、第２の結合ドメインは、ＣＤ７３、ＣＤ３９、またはＣＤ３８に特異的な抗体フラグメントを含み、任意で、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み得る。
構築物の例示的な実施形態は、少なくとも第３の結合ドメインまたはそのフラグメントをコードする第３の配列をさらに含む。そのような第３の結合ドメイン／フラグメントは、ＮＫ活性化受容体、または第２のがん関連抗原に特異的な第２のタンパク質を含む。例えば、第１の結合ドメインまたはそのフラグメントは、がん関連抗原に特異的な第１のタンパク質を含み得、第３の結合ドメインまたはそのフラグメントは、ＮＫ活性化受容体（例えば、限定されることなく、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ受容体（ＮＫＧ２Ｄ）、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４０、またはＤＮＡＭ－１）を含み得る。少なくとも１つの例示的な実施形態において、第１の配列は、配列番号７と少なくとも９０％同一である第１のアミノ酸をコードし、第３の配列は、配列番号６と少なくとも９０％同一である第２のアミノ酸をコードする。
本開示のがん関連抗原（それに対して、結合ドメインまたはフラグメントの１つまたは複数は特異的であり得る）は、限定されることなく、ジシアロガングリオシド（ｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、Ｈｅｒ２（ｐ１８５）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、Ｃ型レクチン様分子－１；ＥｐＣＡＭ、Ｇ２５０、プロテオグリカン、ＧＤ３、ＧＤ２、ＭＨＣ ＩＩ、ＴＡＧ－７２、ミルクムチンコアタンパク質、ルイスＡ抗原、チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ１）、ｃ－ｍｅｔ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲ変種ＩＩＩ、および／または癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のうちの１種または複数を含み得る。さらに、第１のがん関連抗原は、１つのタイプの抗原を含み得、一方で第２のがん関連抗原は、所望のとおり、同じまたは異なるタイプの抗原を含み得る。
少なくとも１つの例示的な実施形態において、第１および／または第３の結合ドメインまたはそのフラグメントは、ＮＫＧ２Ｄを含む細胞外リガンド結合ドメインを含み、それぞれの配列は、野生型ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄの発現と比較して、ＮＫＧ２Ｄの上方調節された発現をさらにコードする。付加的にまたは代替的に、第２の結合ドメインまたはそのフラグメントは、ｓｃＦｖと連結された抗ＣＤ７３、抗ＣＤ３９、または抗ＣＤ３８を含み得、第１および／または第３の結合ドメインまたはそのフラグメントは、ｓｃＦｖと連結された抗ＧＤ２を含み得る。
なおさらに、第１の配列は、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）において発現され得、第２の配列は、第２のＣＡＲにおいて発現される。さらに、標的細胞は、がん細胞、ＴＭＥにおける悪性細胞であり得、少なくとも１つの例示的な実施形態において、標的細胞は、膠芽腫細胞または膠芽腫ＴＭＥである。
少なくとも１つの例示的な実施形態において、第１および第３の配列の一方または両方は、活性化があると細胞傷害または細胞溶解活性を促進するための１種または複数のシグナル伝達ドメインを付加的にコードし得る。そこで、そのようなシグナル伝達ドメインは、それに作動的に連結された結合ドメインまたはそのフラグメントが標的細胞に結合すると活性化される。１種または複数のシグナル伝達ドメインは、免疫グロブリンγ－Ｆｃ領域受容体ＩＩＩ－Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）、分化抗原群（cluster of differentiation）２８（ＣＤ２８）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９または４－１ＢＢ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４またはＯＸ４０）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＡＰ１０）、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）、天然細胞傷害性受容体ＮＫｐ４６、天然細胞傷害性受容体ＮＫｐ４４、天然細胞傷害性受容体ＮＫｐ３０、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、分化抗原群２４４（ＣＤ２４４）、ＣＤ１３７、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）、およびＮＫＧ２Ｄ－ＤＡＰ１０受容体複合体からなる群から選択され得る。少なくとも１つの例示的な実施形態において、第１の配列によってコードされるシグナル伝達ドメインの１つまたは複数はＤＡＰ１０であり、第２の配列によってコードされるシグナル伝達ドメインの１つまたは複数はＣＤ３ζである。
操作された細胞または操作された細胞株も本明細書において提供される。少なくとも１つの実施形態において、本明細書に開示されるポリヌクレオチド構築物の任意の１種を発現する、操作された細胞または操作された細胞株が提供される。さらに、操作された細胞または操作された細胞株は、それによってコードされる第１の結合ドメインまたはそのフラグメントおよびシグナル伝達ドメインに作動的に連結されかつその間に配置されるヒンジドメインをさらにコードする第１の配列を含み得る。少なくとも１つの例示的な実施形態において、操作された細胞または細胞株は、配列番号８と少なくとも８０％、８５％、または９０％同一であるアミノ酸配列を発現する。
他の実施形態は、本開示の操作された細胞の集団を含む薬学的組成物を提供する。そのような実施形態において、１種または複数のシグナル伝達ドメインは、それに作動的に連結された結合ドメインまたはそのフラグメントが、例えば、限定されることなく、がんまたは膠芽腫腫瘍細胞等の標的細胞に結合すると活性化され得る。ここで、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、ならびに／または保存剤、充填剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、抗細菌剤、抗真菌剤、平滑剤、および分配剤（dispensing agent）等、任意の薬学的に許容される希釈剤、アジュバント、賦形剤、もしくはビヒクルを含み得る（投与の様態および剤形の性質に応じて）。
がんに罹患している対象を免疫療法治療を使用して治療するための方法も提供される。少なくとも１つの実施形態において、そのような方法は、少なくとも：ＮＫ活性化受容体、または第１のがん関連抗原に特異的な第１のタンパク質を含む第１の結合ドメインまたはそのフラグメント、ならびに第２の結合ドメインまたはそのフラグメント、および切断可能なリンカーをコードするポリヌクレオチド構築物であって、第２の結合ドメインは、標的細胞のアデノシン産生またはアデノシン中間体産生細胞表面タンパク質に特異的であり、切断可能なリンカーは、第１の結合ドメインに作動的に連結されている、ポリヌクレオチド構築物を発現する操作されたＮＫ細胞の集団を含む薬学的組成物の治療有効量を対象に投与するステップまたは投与しておくステップを含む。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド構築物は、ＮＫ活性化受容体、または第２のがん関連抗原に特異的な第２のタンパク質を含む第３の結合ドメインまたはそのフラグメントをさらにコードし得る。そこで、第１の結合ドメインまたはそのフラグメントは、がん関連抗原に特異的な第１のタンパク質を含み得、第３の結合ドメインまたはそのフラグメントは、ＮＫ活性化受容体および第３の結合ドメインまたはそのフラグメントを含む（または、逆もまた同様）。ポリヌクレオチド構築物は、活性化があると、操作されたＮＫ細胞の細胞傷害または細胞溶解活性を促進するように、第１および／または第３の結合ドメイン／フラグメントに作動的に連結された１種または複数のシグナル伝達ドメインを付加的にコードし得る。
治療有効量の薬学的組成物を投与する（または投与しておく）ステップは、静脈内に、腫瘍内に、非経口的に、または注入により実施され得る。付加的にまたは代替的に、治療有効量の薬学的組成物を対象に投与するまたは投与しておくステップは、養子細胞療法を実施するまたは実施しておくステップを含み得る。
そのような方法は、配列番号８と少なくとも８０％、８５％、または９０％同一であるアミノ酸配列を発現する操作されたＮＫ細胞の集団を採用し得る。
少なくとも１つの実施形態において、がんは膠芽腫であり得る。付加的にまたは代替的に、第１の結合ドメインまたはそのフラグメントは、ＧＤ２に特異的な第１のタンパク質を含み得、第３の結合ドメインまたはそのフラグメントは、ＮＫＧ２Ｄを含む細胞外リガンド結合ドメインを含み得、第３の結合ドメインまたはそのフラグメントは、ＣＤ７３、ＣＤ３９、またはＣＤ３８に特異的であり得る。
併用治療の他の方法も提供される。少なくとも１つの実施形態において、方法は、オートファジー阻害剤を含む付加的な治療的処置を対象に投与するステップまたは投与しておくステップをさらに含み得る。そのようなオートファジー阻害剤は、例えば、限定されることなく、治療有効量の小分子阻害剤および／またはオートファジー経路における遺伝子の遺伝的下方調節であり得る（例えば、ＢＥＣＮ１、ｐ６２、β－アクチン、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＬＣ３Ｂ、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＰＩ３Ｋ－ＩＩＩ、ＵＬＫ１、ＵＬＫ２、ＦＩＰ２００、および／またはＬＡＭＰ２等）。そのような小分子阻害剤の非限定的な例は、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スパウチン（spautin）－１、ＳＡＲ４０５、ベルテポルフィン（vertoprofin）、および現在公知のまたは後に発見される任意の他の薬学的オートファジー阻害剤または下方調節因子を含み得る。少なくとも１つの例示的な実施形態において、オートファジー阻害剤はクロロキンを含み、それは、任意で０．０１μＭ～２００μＭの濃度で投与され得る。
本明細書の方法が併用治療を含む場合、治療有効量の薬学的組成物を対象に投与する（または投与しておく）ステップは、静脈内に、腫瘍内に、非経口的に、または注入により実施され得、付加的な治療的処置を対象に投与するまたは投与しておくステップは、全身注射または注入により実施され得る。
膠芽腫を経験している対象を治療するためのキットも提供される。例えば、であり限定されることなく、そのようなキットは、治療有効量の本開示の薬学的組成物；および治療有効量のオートファジー阻害剤（小分子阻害剤等の薬学的阻害剤、または別様のものかどうかにかかわらず）、またはオートファジー経路の遺伝的下方調節を達成する組成物を含み得る。キットにおけるオートファジー阻害剤が小分子阻害剤を含む場合、少なくとも１つの実施形態において、阻害剤は、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スパウチン－１、ＳＡＲ４０５、およびベルテポルフィンからなる群から選択され得る。
開示される実施形態、ならびに本明細書に含有される他の特質、利点、および態様、ならびにそれらを実現することについては、本開示の様々な例示的な実施形態についての以下の詳細な説明を踏まえて明らかになるであろう。そのような詳細な説明は、添付の図面と併せられた場合によりよく理解されるであろう。
膠芽腫（ＧＢＭ）患者データにおける遺伝子発現、患者由来ＧＢＭにおけるＣＤ７３、ＧＤ２、およびＮＫＧ２ＤＬの表面発現についての相関解析から生じる図、ならびに多機能性のＮＫに基づくＧＢＭ免疫療法の設計を図解した図である；下位区分Ａは、１５６人のＧＢＭ患者からのデータを使用した、選択された遺伝子の正規化された発現（ＦＰＫＭ）の間の相関を示している（ピアソンの相関係数が、連続的な勾配色を用いて示されている）；下位区分Ｂは、ＮＫ遺伝子セット全体および個々の遺伝子の正規化された発現（ＦＰＫＭ）の間の相関を示している（相関は、正規化されたエンリッチメントスコア（ＮＥＳ）として表現されている）；下位区分Ｃは、同定された４種の遺伝子：ＮＴ５Ｅ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＭＩＣＡ、およびＭＩＣＢのうちの少なくとも１種の高発現を有するＧＢＭ患者の数を表すベン図を示している；下位区分Ｄは、下位区分Ｃにおいて同定された４種の遺伝子に基づく、ＧＢＭ腫瘍における遺伝子発現の患者分布を表す棒グラフを示している；下位区分Ｅは、フローサイトメトリーによって判定された、ＳＪ－ＧＢＭ２（小児性）、ＧＢＭ４３（原発性）、およびＧＢＭ１０（再発性）を含めた、種々のタイプの患者由来ＧＢＭ細胞上でのＣＤ７３、ＧＤ２、およびＮＫＧ２ＤＬの表面発現に関するデータを示している（結果は、対照と比べた変化倍率（ＦＣ）として報告されている；データは、平均±ＳＥＭとして示されている）；ならびに下位区分Ｆは、本開示の多機能性の腫瘍応答性の操作されたＮＫ細胞およびそれらの動作メカニズムについての少なくとも１つの実施形態を代表する概略的図解を示している（ＴＡＰは腫瘍関連プロテアーゼを表し；αＣＤ７３ ｓｃＦｖは抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖを表し；αＧＤ２ ｓｃＦｖは抗ＧＤ２ ｓｃＦｖを表す）。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） ｐＮＫ細胞生存率および活性化マーカー発現に対するアデノシンの効果に関する図式的データである；下位区分Ａは、１０００μＭのアデノシンを用いた２４時間の処理後の、ｐＮＫ細胞の細胞生存率（％）に関する図式的データを示している；および下位区分Ｂは、１０００μＭのアデノシンを用いた２４時間の処理後の、ｐＮＫ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現に関する図式的データを示している（データは、平均±ＳＥＭとして示されている）。 本開示のある特定の構築物の構造のインシリコモデリングを示す図である；下位区分Ａは、ＧＳスペーサーおよび切断可能なペプチドリンカー（矢印によって識別される）を介して一緒に連結された、直列の抗ＧＤ２および抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖ細胞外ドメインの分子モデルを示しており、モデルは、ＲａｐｔｏｒＸを使用してベクター配列に基づいて得られた；ならびに下位区分Ｂは、細胞外ｓｃＦｖドメインとＧＤ２（破線の丸によって示される）とのドッキングを示しており、ドッキングは、ＰａｔｃｈＤｏｃｋを使用して実施され、下位区分Ａに示される細胞外領域全体および矢印によって示される切断可能なペプチドのモデルを使用してＦｉｒｅＤｏｃｋにおいて洗練された（画像は、Ｃｈｉｍｅｒａにおいて作出された）。 本開示の少なくとも１つの実施形態に従った多機能性構築物の少なくとも１つの実施形態の概略的表示である。 本開示の多機能性の遺伝子操作されたＮＫ細胞の作出に関する図式的データである；下位区分Ａは、ＮＫＧ２Ｄリガンド（ＮＫＧ２ＤＬ）を標的にする、本開示に従ったＮＫＧ２Ｄ．ＤＡＰ１０．ＣＤ３ζ－ＣＡＲ構築物（構築物１Ｂ）に対する導入遺伝子の概略的表示を示している；ならびに下位区分Ｂは、構築物１Ｂの構造の概略的表示を示している；下位区分Ｃは、トランスフェクションの４８時間後の、本開示に従った構築物１Ｂを発現するように操作されたＮＫ細胞（ＮＫＧ２Ｄ．ＣＡＲ－ＮＫ９２）または操作されていない対照（ＮＫ９２）の細胞生存率（％）に関する図式的データを示している；下位区分Ｄは、下位区分Ｃのトランスフェクトされた細胞上での、フローサイトメトリーによって判定されたＮＫＧ２Ｄ発現を示している；下位区分Ｅは、４時間にわたる５のＥ／Ｔ比での、ＧＢＭ４３細胞に対する下位区分Ｃの細胞（ＮＫＧ２Ｄ．ＣＡＲ－ＮＫ９２）およびトランスフェクトされていないＮＫ－９２細胞（ＮＫ９２）のインビトロ細胞傷害に関するデータを示している；下位区分Ｆは、ＧＤ２を標的にする、本開示に従った抗ＧＤ２．ＣＤ２８．ＣＤ３ζ－ＣＡＲ構築物（構築物１Ａ）を表す導入遺伝子構造の概略的表示を示している；ならびに下位区分Ｇは、構築物１Ａ（抗ＧＤ２．ＣＤ２８．ＣＤ３ζ－ＣＡＲ）の構造の概略的表示を示している；下位区分Ｈは、トランスフェクションの４８時間後の、構築物１Ａ（ＧＤ２．ＣＤ２８．ＣＤ３ζ－ＣＡＲ）を発現するように操作されたＮＫ－９２細胞または操作されていない対照（ＮＫ９２）の細胞生存率（％）を示している；下位区分Ｉは、下位区分Ｈのトランスフェクトされた細胞上での、フローサイトメトリーによって判定された抗ＧＤ２ ｓｃＦｖ発現を示している；下位区分Ｊは、４時間にわたる５のＥ／Ｔ比での、ＧＢＭ４３細胞に対する下位区分Ｈの細胞（抗ＧＤ２．ＣＤ２８．ＣＤ３ζ－ＣＡＲ－ＮＫ９２）および操作されていないＮＫ－９２対照のインビトロ細胞傷害に関するデータを示している；下位区分Ｋは、本開示に従った完全な多機能性構築物１を表す導入遺伝子の概略的表示を示しており、構築物１は、Ｐ２Ａによって分離された２つのＣＡＲを含み、第１のＣＡＲは、ＣＤ２８およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有してＧＤ２を標的にし、腫瘍関連プロテアーゼ切断可能なリンカーによって抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖに連結され、それは、局所的に放出されると、ＧＢＭからのアデノシンの産生を阻害しまたは代わりに遮断し、第２のＣＡＲ構築物は、ＮＫＧ２Ｄ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζを含み、ＮＫＧ２Ｄリガンドを標的にし、ＧＢＭ腫瘍応答性である；下位区分Ｌは、腫瘍応答性抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖ分泌二重特異性ＣＡＲ（構築物１）の概略的表示を示している；下位区分Ｍは、トランスフェクションの４８時間後の、全体の多機能性構築物１を発現するように操作されたＮＫ－９２細胞の細胞生存率（％）に関するデータを示している；下位区分Ｎは、トランスフェクションの４８時間後の、フローサイトメトリーによって判定されたＮＫＧ２Ｄ発現を示している；下位区分Ｏは、抗ＣＤ７３ ＳｃＦｖフラグメントを放出するｕＰＡでのタンパク質分解的切断後の、フローサイトメトリーによって判定されたＮＫ細胞上での抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖおよび抗ＧＤ２ ｓｃＦｖの発現を示している；下位区分Ｐは、単離された末梢血由来ＮＫ（ｐＮＫ）細胞（ＣＤ５６＋ＣＤ３－）の純度を示すフローサイトメトリーデータを含む；下位区分Ｑは、２ラウンドのレンチウイルス形質導入後の、全体の構築物を発現するように操作されたｐＮＫ細胞の細胞生存率（％）に関するデータを示している；下位区分Ｒは、２ラウンドのレンチウイルス形質導入後の、フローサイトメトリーによって判定された操作されたｐＮＫ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現を示している；下位区分Ｓは、２ラウンドのレンチウイルス形質導入後の、フローサイトメトリーによって判定されたｐＮＫ細胞上での抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖおよび抗ＧＤ２ ｓｃＦｖの発現に関する図式的データを示している；ならびに下位区分Ｔは、ＮＫ ＭＡＣＳ（登録商標）培地における形質導入されていないｐＮＫおよびＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ＮＫ細胞の増大倍率を代表するデータを描写している；（下位区分Ｐ～Ｔを通じて示されるデータは、代表的なドナーからの三つ組での単離されたｐＮＫ細胞に関するものである；図５におけるデータは、平均±ＳＥＭとして示されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０）。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 初代ＮＫ細胞に対する調査に関する図式的データを示す図である；下位区分Ａ～ＤおよびＥ～Ｈは、それぞれ２人の別個のドナーから単離されたｐＮＫ細胞に関するデータを示しており、特徴付けおよび発現測定は、実施例１に関連して記載されるように検討された（データは、平均±ＳＥＭとして示されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０）。 患者由来ＧＢＭに対する、本開示の少なくとも１つの実施形態に従った多機能性の遺伝子操作されたＮＫ細胞のインビトロエフェクター活性に関する図式的データである；下位区分Ａは、４時間にわたる表示されるＥ／Ｔ比での、ＧＢＭ４３細胞に対するＮＫ－９２（対照）およびＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ＮＫ９２細胞（構築物１を発現する）のインビトロ細胞傷害を示している；下位区分Ｂは、ＧＢＭ４３細胞との４時間の共培養（Ｅ／Ｔ比、５：１）後の、ＮＫ－９２およびＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ＮＫ９２細胞の脱顆粒［％ ＣＤ１０７および（ＭＦＩ）ＣＤ１０７］を代表する棒グラフを示している（ＮＫ細胞を、脱顆粒のマーカーとしての表面ＣＤ１０７ａ発現についてフローサイトメトリーによって解析した）；下位区分Ｃは、ＧＢＭ４３細胞との４時間の共培養（Ｅ／Ｔ比、５：１）後の、ＮＫ－９２およびＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ＮＫ９２細胞によるＩＦＮ－γ産生（％ ＩＦＮ－γ）を示している；下位区分Ｄは、４時間にわたる表示されるＥ／Ｔ比での、ＧＢＭ４３細胞に対するＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ＮＫ９２およびＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ＮＫ９２（ａＣＤ７３ ｓｃＦｖ切断後）細胞のインビトロ細胞傷害を示している；下位区分Ｅは、ｕＰＡ処理ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ＮＫ９２細胞からの放出後の切断されたａＣＤ７３ ｓｃＦｖとのインキュベーション後の、ＧＢＭ４３細胞のＣＤ７３活性を示している；下位区分Ｆ～Ｈは、４時間にわたる表示されるＥ／Ｔ比での、ＳＪ－ＧＢＭ２、ＧＢＭ４３、およびＧＢＭ１０細胞を含めた、種々のＧＢＭ細胞に対するｐＮＫおよびＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞のインビトロ細胞傷害を示している；下位区分Ｉは、ＧＢＭ４３細胞との４時間の共培養（Ｅ／Ｔ比、５：１）後の、ｐＮＫおよびＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞の脱顆粒（％ ＣＤ１０７）を示している（ＮＫ細胞を、脱顆粒のマーカーとしての表面ＣＤ１０７ａ発現についてフローサイトメトリーによって解析した）；下位区分Ｊは、ＧＢＭ４３細胞との４時間の共培養（Ｅ／Ｔ比、５：１）後の、ｐＮＫおよびＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞のＩＦＮ－γ産生（％ ＩＦＮ－γ）を示している；下位区分Ｋは、４時間にわたる表示されるＥ／Ｔ比での、ＧＢＭ４３細胞に対するｐＮＫおよびＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ（ａＣＤ７３ ｓｃＦｖ切断後）細胞のインビトロ細胞傷害を示している；下位区分Ｌは、ｕＰＡ処理ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ＮＫ細胞からの切断後の切断されたａＣＤ７３ ｓｃＦｖとのインキュベーション後の、ＧＢＭ４３細胞のＣＤ７３活性を示している；下位区分Ｍは、ＧＢＭ４３細胞との１２時間の共培養（Ｅ／Ｔ比、５：１）後の、ｐＮＫおよびＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞上でのＣＤ１６発現（ＭＦＩの％）の相対的減少を示している；下位区分Ｎは、ＧＢＭ４３細胞との１２時間の共培養（Ｅ／Ｔ比、５：１）後の、ｐＮＫおよびＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞上でのＮＫＧ２Ａ発現（ＭＦＩの％）の相対的増加を示している；ならびに下位区分ＯおよびＰは、４時間にわたる表示されるＥ／Ｔ比での、非悪性神経細胞株ｈＣＭＥＣ／Ｄ３およびＨＣＮ－２に対するｐＮＫおよびＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞のインビトロ細胞傷害を示している（下位区分Ｆ～Ｐを通じて示されるデータは、代表的なドナーからの少なくとも三つ組での単離されたｐＮＫ細胞に関するものである；データは、平均±ＳＥＭとして示されている；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 （上記の通り。） （上記の通り。） ＣＤ７３によるリン酸形成を検出するために採用された反応の概略図（下位区分Ａ）、および３０分間のインキュベーション後に６２０ｎｍにおけるＯＤ値を読み取った、９６ウェルプレートにおけるリン酸標準曲線（下位区分Ｂ）である。 ＧＢＭ４３細胞とｐＮＫまたはＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞（本開示の構築物１を発現するｐＮＫ細胞）との共培養のライブイメージング顕微鏡画像（ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３を使用して撮影された）であり、画像における小さな不規則な形をした円形の点はＮＫ細胞を表し、大きな紡錘状の細胞はＧＢＭ４３細胞を表す（スケールバー＝２００μｍ）。 ｈＣＭＥＣ／Ｄ３およびＨＣＮ－２細胞上でのＣＤ７３、ＧＤ２、およびＮＫＧ２ＤＬの表面発現に関するデータを示す図であり、正常脳細胞株上での３種のマーカーの発現レベルは、フローサイトメトリーによって判定され、対照と比べた変化倍率（ＦＣ）として報告されている；データは、平均±ＳＥＭとして示されている。 ＢＥＣＮ１遺伝子ノックダウンまたはＣＱでの薬理学的処理のいずれかによる、ＧＢＭ細胞におけるオートファジーの阻害に関する図式的データである；下位区分Ａは、ＢＥＣＮ１ ｓｈＲＮＡ（ｈ）レンチウイルス粒子をトランスフェクトされた、または５０μＭのＣＱで２４時間処理されたＧＢＭ４３細胞であって、その後、細胞を溶解し、ＢＥＣＮ１、ＬＣ３Ｂ、およびｐ６２の発現レベルをフローサイトメトリーにより解析した（β－アクチンをローディング対照として使用した）、ＧＢＭ４３細胞からのデータを示している；ならびに下位区分Ｂは、ＢＥＣＮ１（ＢＥＣＮ１／β－アクチン）、ＬＣ３Ｂ（ＬＣ３Ｂ／β－アクチン）、およびｐ６２（ｐ６２／β－アクチン）の相対的発現レベルの定量化を示している（留意すべきは、ベクリン（Beclin）１（ＢＥＣＮ１）、ＬＣ３－ＩＩ（ＬＣ３Ｂ）、およびｐ６２は、オートファジーの３種の主たるマーカーである）。 ＮＫ細胞機能およびホーミングに対する、ＧＢＭにおけるオートファジーを標的にすることの効果に関するデータを示す図である；下位区分Ａは、インビトロで様々な濃度のＣＱを用いた２４時間の処理後の、ＧＢＭ４３細胞の生存率を表す；下位区分Ｂは、Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して算出されたＩＣ５０に関する、対数［ＣＱ濃度（μＭ）］に対してプロットされた細胞生存率（％）を示している；下位区分ＣおよびＤは、ＢＥＣＮ１ ｓｈＲＮＡレンチウイルスをトランスフェクトされたＧＢＭ４３細胞（ＢＥＣＮ１－ ＧＢＭ４３）におけるまたはＣＱで処理された細胞における、ＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０ ｍＲＮＡの発現を示している（結果は、トランスフェクトされていない対照と比較した変化倍率（ＦＣ）として報告されている）；下位区分ＥおよびＦは、ＬＹ２９４００２、ＢＡＹ１１－７０８２、およびＳＰ６００１２５を含めた様々な阻害剤の存在または非存在下での、ＣＱを用いた２４時間の処理後の、ＧＢＭ４３細胞の上清におけるＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０についてのＥＬＩＳＡによる定量化を示している；下位区分Ｇは、ＢＢＢを横断するｐＮＫ細胞遊走に対するＣＣＬ５またはＣＸＣＬ１０の効果を評価するために使用された実験設定を表すインビトロでの実験的二重層ＢＢＢモデルの概略を示している；下位区分Ｈは、実験的ＢＢＢを通したｐＮＫ細胞の移行を示している；下位区分Ｉは、ＣＣＫ－８アッセイによって判定される、ＧＢＭ４３およびＢＥＣＮ１－ ＧＢＭ４３細胞のインビトロ生存率に関するデータを示している；下位区分Ｊは、腫瘍成長およびＮＫ細胞浸潤に対する、ＢＥＣＮ１ノックダウンによりオートファジーを標的にすることの効果を評価する実験設計の概略を示している（すなわち、ＧＢＭ４３細胞をＲａｇ１－／－マウスの右脇腹に注射し、ＢＥＣＮ１－ ＧＢＭ４３細胞を左脇腹に注射した）；下位区分Ｋは、表示される日にモニターされかつ記録された腫瘍成長からのデータを示している；下位区分Ｌは、それぞれ抗ＮＫｐ４６、抗ＣＣＬ５、および抗ＣＸＣＬ１０抗体を使用して、表示される腫瘍切片に対して実施されたＮＫ細胞（上の行）、ＣＣＬ５（真ん中の行）、またはＣＸＣＬ１０（下の行）の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色の画像を示している（バー＝５０μｍ；２００×倍率）；下位区分Ｍは、対照およびＢＥＣＮ１－腫瘍に浸潤するＮＫ細胞の定量化を示しており、細胞カウントは、４つの連続高倍率視野（ＨＰＦ）において２００×倍率で記録された；下位区分ＮおよびＯは、対照およびＢＥＣＮ１－腫瘍におけるＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０のＩＨＣスコアをグラフに描いている（注記：下位区分Ｈに示されるデータは、１人の代表的なドナーからの少なくとも三つ組での単離されたｐＮＫ細胞に関するものである）；データは、平均±ＳＥＭとして示されている；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 （上記の通り。） （上記の通り。） ＧＢＭに対するオートファジーの阻害に応答したケモカイン発現に関する図式的データであり、ＢＥＣＮ１－ ＧＢＭ４３またはＣＱ処理ＧＢＭ４３細胞におけるＣＣＬ２およびＣＸＣＬ１２ ｍＲＮＡの発現はＲＴ－ＰＣＲによって判定され、ＧＡＰＤＨが参照遺伝子（対照）として使用され、結果は、対照と比べたＦＣとして報告されている；データは、平均±ＳＥＭとして示されている；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 ＧＢＭ４３培養培地における種々のタイプのケモカインの濃度を調べるためのＥＬＩＳＡアレイの使用に関する図である；下位区分Ａは、全実験過程の概略図を示している；および下位区分Ｂは、調べられた各ケモカインの判定された濃度を示している。 下位区分Ａは、表示されるＧＢＭ４３（対照）皮下異種移植片腫瘍切片に対して実施されたマウス（Ｒａｇ１－／－）ＮＫ細胞の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を示す図である；および下位区分Ｂは、表示されるＢＥＣＮ１－ＧＢＭ４３皮下異種移植片腫瘍切片に対して実施されたマウス（Ｒａｇ１－／－）ＮＫ細胞のＩＨＣ染色を示す図であり、ＩＨＣ染色は、ＢＥＣＮ１－ ＧＢＭ４３皮下異種移植片腫瘍の腫瘍組織の末梢および内部領域の両方へのＮＫ細胞の浸潤の増強を示す。 オートファジーの標的化後の、ＮＫ細胞媒介性殺滅に対するＧＢＭ細胞の感作に関する図式的データである；下位区分Ａは、様々な濃度のＣＱを用いた２４時間の処理後の、ＧＢＭ４３細胞上でのＮＫＧ２ＤＬ発現（ＭＦＩおよび％）を示している；下位区分Ｂは、様々な濃度のＣＱを用いた２４時間の処理後の、ＧＢＭ４３細胞上でのＣＤ７３発現（ＭＦＩおよび％）を示している；下位区分Ｃは、様々な濃度のＣＱを用いた２４時間の処理後の、ＧＢＭ４３細胞のＣＤ７３活性を示している；下位区分Ｄは、様々な濃度のＣＱを用いた２４時間の処理後の、ＧＢＭ４３細胞上でのＧＤ２発現（ＭＦＩおよび％）を示している；下位区分Ｅは、様々な濃度のＣＱを用いた２４時間の処理後の、ＧＢＭ４３細胞に対するｐＮＫ細胞の殺滅活性を示している；下位区分Ｆは、５のＥ／Ｔ比での４時間の共インキュベーション後の、ＢＥＣＮ１－ ＧＢＭ４３細胞に対するＮＫ９２細胞およびｐＮＫ細胞の殺滅活性を示している；図１６におけるすべてのデータは、１人の代表的なドナーから少なくとも三つ組で示されている；データは、平均±ＳＥＭとして示されている；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 ＧＭＢ４３異種移植片モデルにおける、本開示の多機能性の操作されたＮＫ細胞の抗ＧＢＭ活性に関する図である；下位区分Ａは、インビボ処理プログラムを図解する概略図を示している；下位区分Ｂは、ＰＢＳ、ＣＱ、ｐＮＫ細胞、および本開示の構築物１を発現するＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞を含めた、個々の処理群の腫瘍成長に関する図式的データを示している（腫瘍サイズは、キャリパー測定によって判定された）；下位区分Ｃは、処理の開始後２８日目の剖検後の、各処理群におけるマウスの平均腫瘍重量に関する図式的データを示している；下位区分Ｄは、処理期間中の、各群におけるマウスの体重の変化をグラフに描いている；下位区分Ｅは、抗ＮＫｐ４６抗体およびプロテインＬを使用した、各処理群における表示される腫瘍切片に対して実施されたＮＫ細胞（明るい点）および切断された抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖ（矢印によって示される）の免疫蛍光（ＩＦ）染色の画像を示している（バー＝５０μｍ；２００×倍率）；下位区分Ｆは、種々の処理群における、抗ＣＤ７３抗体を使用した、表示される腫瘍切片に対して実施されたＣＤ７３のＩＨＣ染色を示している（バー＝１００μｍ；２００×倍率）；下位区分Ｇは、種々の処理群における、表示される腫瘍切片に対して実施されたＣＤ７３発現のＩＨＣスコアをグラフに描いている；下位区分ＨおよびＩは、それぞれ抗ＣＣＬ５および抗ＣＸＣＬ１０抗体を使用した、種々の処理群における、表示される腫瘍切片に対して実施されたＣＣＬ５（下位区分Ｈ）およびＣＸＣＬ１０（下位区分Ｉ）のＩＨＣ染色を示している（バー＝５０μｍ；２００×倍率）；下位区分Ｊは、種々の処理群における、表示される腫瘍切片に対して実施されたＣＣＬ５またはＣＸＣＬ１０のＩＨＣスコアを示している（注記：この調査において例示されるデータは、１人の代表的なドナーからの少なくとも三つ組での単離されたｐＮＫ細胞に関するものである；データは、平均±ＳＥＭとして示されている；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 （上記の通り。） ルシフェラーゼ発現ＧＢＭ４３（ＧＢＭ４３－Ｌｕｃ）細胞の作出に関するデータを示す図であり、ＧＢＭ４３細胞に、誘導性ｓｕＣＭＶプロモーターの下でホタルルシフェラーゼ３遺伝子を発現する商業的ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）レンチウイルス粒子をトランスフェクトし、形質導入後にピューロマイシン抵抗性の細胞を回収し、ルシフェラーゼ発現を、ＩＶＩＳスペクトルを使用した生物発光測定によって検出した；下位区分Ａは、ルシフェラーゼを発現するＧＢＭ４３－Ｌｕｃの能力を示す代表的な生物発光画像を示している（播種された細胞の関数としてのシグナル強度が示されている）；下位区分Ｂは、ＧＢＭ４３－Ｌｕｃ細胞数の関数としての蛍光強度を代表する図式的データを示している（全光束（total flux）（光子／秒）を、ＡＵＲＡソフトウェアを使用して定量化した）；下位区分Ｃは、ＧＢＭ４３－Ｌｕｃおよび親対照ＧＢＭ４３細胞の成長曲線を示している（データは、平均±ＳＥＭとして示されている）。 同所性ＧＢＭ４３異種移植片モデルにおける、オートファジーの阻害との組み合わせでのＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞のインビボ活性に関するデータを示す図である；下位区分Ａは、インビボ処理プログラムを図解した概略図を示している；下位区分ＢおよびＣは、生物発光イメージングを使用して経時的にモニターされた、各群の個々のマウスにおける腫瘍容積を示している；下位区分Ｄは、処理の開始後２８日目の剖検後の、各処理群におけるマウスの平均腫瘍サイズを描写した折れ線グラフを示している；下位区分Ｅは、処理期間中の、各群におけるマウスの体重の変化についての折れ線グラフを示している；下位区分Ｆは、それぞれ抗ＣＣＬ５および抗ＣＸＣＬ１０抗体を使用して、種々の処理群における表示される腫瘍切片に対して実施されたＣＣＬ５（左の２つのパネル）およびＣＸＣＬ１０（右の２つのパネル）のＩＨＣ染色の画像を示している（バー＝５０μｍ；２００×倍率）；下位区分Ｇは、抗ＮＫｐ４６抗体を使用して、表示される腫瘍切片に対して実施されたＮＫ細胞のＩＨＣ染色の画像を示している（バー＝５０μｍ；２００×倍率）；下位区分Ｈは、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫまたはＣＱ＋ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫで処理された頭蓋内腫瘍へのＮＫ細胞浸潤の定量化を描写した棒グラフを示している（ここでは、細胞カウントは、４つの連続高倍率視野（ＨＰＦ）において２００×倍率で記録された）；下位区分Ｉは、種々の処理群において、抗ＣＤ７３抗体を使用して、表示される腫瘍切片に対して実施されたＣＤ７３に対するＩＨＣ染色の画像を示している（バー＝５０μｍ；２００×倍率）；下位区分Ｊは、種々の処理群において、表示される腫瘍切片に対して実施されたＣＤ７３発現のＩＨＣスコアを描写した図式的データを示している；下位区分Ｋは、ＧＢＭ ＴＭＥにおける細胞外アデノシン産生を図解した概略図を示している；ならびに下位区分Ｌは、各処理群におけるマウスの局所的脳組織におけるアデノシン濃度を描写した図式的データを示している（注記：図１９に示されるデータは、少なくとも三つ組での単離されたｐＮＫ細胞に関するものである；データは、平均±ＳＥＭとして示されている；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。）
本開示は、様々な改変および代替的な形態の影響を受けやすいものの、その例示的な実施形態が、図面において例として示され、本明細書に詳細に記載される。
配列表の簡単な説明
配列番号１は、以下のとおり、プロテアーゼ感受性リンカーのアミノ酸配列である：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；
配列番号２は、以下のとおり、切断可能なペプチドフラグメントのアミノ酸配列である：ＬＳＧＲＳＤＮＨ；
配列番号３は、以下のとおり、「自己切断」Ｐ２Ａペプチドのアミノ酸配列である：ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；
配列番号４は、以下のとおり、プライマーの核酸配列である：ＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧ；
配列番号５は、以下のとおり、プライマーの核酸配列である：ＴＧＴＡＧＴＴＧＡＧＧＴＣＡＡＴＧＡＡＧＧＧ；ならびに、
配列番号６は、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ受容体（ＮＫＧ２Ｄ）を含む、本開示の抗原結合ドメインまたはそのフラグメントの少なくとも１つの実施形態の人工アミノ酸配列である（ｈＣＤ３ゼータ－ｈＮＫＧ２Ｄ－Ｐ２Ａ－ｈＤＡＰ１０／Ｆｌａｇ）：
Figure 2022553292000002
 配列番号７は、がん関連抗原ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）に特異的に結合し、ｓｃＦｖを含む、本開示の抗原結合ドメインまたはそのフラグメントの少なくとも１つの実施形態の人工アミノ酸配列である（抗ＧＤ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８Ｈ－ｈＣＤ２８－ｈＣＤ３ゼータ）：
Figure 2022553292000003
 配列番号８は、切断可能なリンカーを介してＣＤ７３に特異的な第２の結合ドメインまたはそのフラグメントに作動的に連結されたがん関連抗原ＧＤ２に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインまたはそのフラグメント（配列番号７）、およびＮＫＧ２Ｄを含む第３の抗原結合ドメインまたはそのフラグメント（配列番号６）を含む、本開示のＣＡＲ構築物の少なくとも１つの実施形態の人工アミノ酸配列である（抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖ－リンカー－切断可能なペプチド－リンカー－ＧＤ２．ＣＡＲ－ＮＫＧ２Ｄ．ＣＡＲ）：
Figure 2022553292000004
前述のものに加えて、上記の配列は、本明細書と一緒に提出されたファイルにおいてコードされるコンピューター可読形態で提供され、参照により本明細書に組み入れられる。コンピューター可読形態で記録された情報は、米国特許規則１．８２１（ｆ）に従って、上で提供される書面の配列表と同一である。
詳細な説明
本開示の原理についての理解を促進する目的のために、ここで、図面において例示される実施形態に言及がなされ、それを記載するために具体的な言葉が使用されるであろう。それにもかかわらず、これらの実施形態の説明によって、範囲の限定が意図されるわけではないことが理解されるであろう。それどころか、本開示は、添付の特許請求の範囲によって規定される本出願の精神および範囲の内に含まれ得る代替物、改変、および均等物を網羅することを意図される。前に記述されるように、本技術は、１つまたは複数の好ましい実施形態において例示され得かつ記載され得るものの、その組成物、システム、および方法は、多くの異なる構成、形態、材料、および付属物を含み得る。
以下の説明において、本開示についての徹底的な理解を提供するために、数多くの具体的な詳細が記載される。特定の例は、これらの具体的な詳細の一部またはすべてを用いずに実行され得、本開示は、特定の生物学的システムに限定されず、それは当然のことながら変動し得ることが理解されるべきである。
別様に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、関連する技術分野における当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは均等の任意の方法および材料が、本出願の主題の実践または試験において使用され得るものの、好ましい方法および材料が本明細書に記載される。付加的に、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用するとき、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、本内容上別様に明確に述べられない限り、複数形の指示対象を含む。さらに、別様に具体的に記されない限り、「約」という用語は、パーセンテージに関して値プラスまたはマイナス１０％、および単位値に関してプラスまたはマイナス１．０単位の域を含めた、値または域のある程度の変動性を可能にし得、例えば約１．０とは、０．９～１．１の値の域、または域の記される限度の域を指す。「実質的に」という用語は、同じように値または域のある程度の変動性、例えば記される値または域の記される限度の９０％以内、９５％以内、または９９％以内を可能にし得る。
「対象」または「患者」とは、該用語が本明細書において使用されるとき、哺乳類、好ましくはヒトであり、雄、雌、成人、および子どもを含む。
「核酸」とは、一本鎖または二本鎖形態のいずれかにあるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマー、ならびにその相補体を指す。該用語は、合成の、天然に存在する、および天然に存在しない、参照核酸と同様の結合特性を有する、ならびに参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される、公知のヌクレオチド類似体または改変された骨格残基もしくは連結を含有する核酸を包含する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマー、ポリペプチド、もしくはポリペプチドのフラグメント、ペプチド、または融合ポリペプチドを指すために、（別様に明示的に記されない限り）本明細書において互換可能に使用される。該用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、相当する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーに、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
本明細書において使用するとき、「アデノシン作動性」とは、アデノシンに対して働くことを意味する。
本明細書において使用される「抗体フラグメント」とは、無傷抗体の一部分、好ましくは無傷抗体の抗原結合領域または可変領域を意味する。抗体フラグメントの例には、例えば単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ナノボディ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｄＡｂが含まれる。構造にかかわらず、本明細書において使用される抗体フラグメントは、全長抗体によって認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗体フラグメントには、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント等、可変領域からなる単離されたフラグメント、または軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続されている組み換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）が含まれる。しばしば「ｓｃＦｖ」と略される「単鎖抗体」は、相互作用して抗原結合部位を形成するＶＨおよびＶＬドメインの両方を含むポリペプチド鎖からなる。ＶＨおよびＶＬドメインは、通常、１～２５個のアミノ酸残基のペプチドによって連結される。抗体フラグメントには、ダイアボディ、トリアボディ、および単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）も含まれる。本開示において、抗体および抗体の様々な特性に言及がなされるものの、それとは反対のことが明示的に記述されない限り、本開示は、機能的抗体フラグメントにも適用される。
「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ、またキメラＴ細胞受容体としても知られる）とは、宿主Ｔ細胞またはＮＫ細胞において発現されるように、ならびに特異的標的抗原（例えば、ＣＤ３９／ＣＤ７９）およびその抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するように設計された合成構築物である。ＣＡＲは、典型的に、ＣＤ３－ζ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、Ｌｃｋ、および／またはＩＣＯＳのエンドドメインを含めた、ＣＤ３－ζまたはＣＤ２８膜貫通ドメインおよび選択的Ｔ細胞活性化部分等の付加的な構成要素も含む融合タンパク質に組み入れられた、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）またはＦａｂフラグメント等の抗体フラグメントを含む。そのような要素の様々な組み合わせも使用され得る。したがって、ＣＡＲは、細胞質尾部に存在する免疫受容体活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を利用するもの等、共刺激性ドメインを介して活性化シグナルを変換するようにも設計され得る。抗原結合部分を利用した遺伝子構築物は、それらが、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）非依存的形式で標的細胞表面の天然抗原に結合し、それゆえ患者または特異的ＨＬＡがマッチしたドナーから回収される必要がないという点で、「普遍的」であるという付加的な利点を与える。
本開示の実施形態に従ったＣＡＲは、当技術分野において公知の任意の手段によって産生され得るが、とはいえ好ましくは、それは、組み換えＤＮＡ技法を使用して産生される。ＣＡＲのいくつかの領域をコードする核酸配列が、分子クローニングの標準的技法（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー援用ライゲーション、酵母および細菌由来のｓｃＦｖライブラリー、部位指定変異導入等）によって調製され得、完全なコード配列に集められ得る。結果として生じるコード領域は、発現ベクターに挿入され得、適切な発現宿主同種または自家ＮＫ細胞を形質転換するために使用され得る。言い換えれば、形質導入またはトランスフェクションを実施して、ＣＡＲ発現構築物をＮＫ細胞に導入し得、次いでそれを使用して、対象における免疫応答を誘導し得る。付加的にまたは代替的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術等を採用して、特定の遺伝子をノックダウンもし得る。がん免疫療法のためのＮＫ細胞の遺伝子操作のための技法は、当技術分野において一般的に知られている。
さらに、上で記述されるように、ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、疾患関連抗原（ＴＡＡ）にまたは標的可能な構築物上のハプテンに結合する、ｓｃＦｖまたはＦａｂ等の標的化分子を含有し得る。これは、Ｔ細胞とは異なり、ＮＫ細胞が、殺滅されるべき細胞を標的にするための抗原特異性を欠くという問題を避ける。細胞標的化ｓｃＦｖまたはＦａｂは、膜貫通ドメインを介して１種または複数の細胞内シグナル伝達ドメインに連結して、リンパ球活性化をもたらし得る。ＣＡＲ－ＮＫ細胞とともに使用されるシグナル伝達ドメインには、例えばＣＤ３－ζ、ＣＤ２８等が含まれ得る。本開示のＣＡＲ構築物には、当技術分野において公知の任意のそのような構築物が含まれ得る。多種多様なＣＡＲ構築物が報告されており、市販されている。
関心対象の標的「に結合する」、本開示の「抗原結合ドメインもしくはそのフラグメント」または「結合ドメインもしくはそのフラグメント」とは、タンパク質、結合ドメイン、または操作された細胞が、タンパク質、または抗原を発現する細胞もしくは組織を標的にすることにおいて診断剤および／または治療剤として有用であるような、十分なアフィニティーで抗原／標的に結合するものである。標的分子へのタンパク質、結合ドメイン、および／または操作された細胞の結合に関して、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「への特異的結合」または「に特異的に結合する」または「に特異的で」あるという用語は、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、標的と類似している対照分子との競合による判定によって測定され得る。少なくとも１つの実施形態において、「特異的に結合する」とは、その指定されるアデノシン産生酵素標的受容体（例えば、ＣＤ７３またはＣＤ３９）への抗原結合ドメインの結合を指し、他の指定される非標的受容体への結合を指さない。
核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係性に置かれる場合、「作動的に連結され」ている。例えば、プレ配列または分泌リーダーに対するＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動的に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、それが翻訳を促すように配置される場合、コード配列に作動的に連結されている。一般的に、「作動的に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が隣接しており、リーダーの場合には、隣接しておりかつリーディング相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、必ずしも隣接している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって遂行され得る。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の実践に従って使用され得る。
ポリペプチド配列への言及に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列同一性最大パーセントを達成するように配列をアラインし、必要であればギャップを導入し、いかなる保存的置換も配列同一性の部分として見なさない後に、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを判定する目的のためのアラインメントは、例えば公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当技術分野における技能の範囲内にある様々なやり方で達成され得る。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたる最大アライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含めて、配列をアラインするための適当なパラメーターを決定し得る。
「下方調節」または「下方調節された」は、互換可能に使用され得、確立されたレベル（例えば、健常コホートまたは関心対象の対象のもの）と比較した、遺伝子、核酸、代謝産物、転写産物、酵素、タンパク質、またはポリペプチド等のマーカーのレベルの減少を指す。「上方調節」または「上方調節された」または「過剰発現した」も、互換可能に使用され得、確立されたレベル（例えば、健常対照または関心対象の対象のもの）と比較した、遺伝子、核酸、代謝産物、転写産物、タンパク質、酵素、またはポリペプチド等のマーカーのレベルの増加を指す。例えば、本出願における関連で、ＣＤ７３は、健常対照と比較して、固形腫瘍または他のがんを経験している患者において過剰発現され得る。付加的にまたは代替的に、ＮＫ Ｔ細胞は、操作されたＴ細胞のＮＫＧ２Ｄの発現を上方調節するように操作され得る。
「マーカー」または「バイオマーカー」とは、該用語が本明細書において使用されるとき、活発な疾患状態を経験している対象における発現のレベルが、対象のもの、または健常対象から採取されたサンプルのものとは有意に異なる場合に、差示的に発現されると記載され得る。差示的に発現されるマーカーは、正常なもしくは対照のサンプルまたは対象のベースラインの発現レベル（すなわち、下方調節された）と比較して、過剰発現され得るまたは低発現され得る。生物学的サンプルにおけるマーカーの増加もしくは減少、または定量化は、遺伝子産物または転写産物の存在および／または相対的存在量を測定するための当技術分野において公知のいくつかの方法のいずれかによって判定され得る。マーカーのレベルは、絶対値として、またはベースラインレベルと比べて、およびカットオフ指標と比較した対象のマーカーのレベルとして判定され得る。代替的に、１種または複数のマーカーの相対的存在量は、臨床的に正常な対象であり得る対照と比べて判定され得る。
本明細書において使用される「治療」または「療法」という用語（ならびに、「治療する」、「治療すること」、および「治療的」等、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変更しようとする試みにおける治癒的および／または予防的介入を含む。より特に、治癒的治療とは、特定の障害の、症状の軽減、改善、および／または排除、低下、および／または安定化（例えば、より進んだ段階に進行できないこと）、ならびに症状の進行の遅延のうちのいずれかを指す。予防的治療とは、以下のもの：特定の障害の、発病を食い止めること、発症の危険性を低下させること、発生率を低下させること、発病を遅延させること、発症を低下させること、および症状の発病までの時間を増加させることのうちのいずれかを指す。治療の望ましい効果には、疾患の出現または再発を阻止すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の低減、転移を阻止すること、疾患進行の速度を減少させること、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後の向上が含まれるが、それらに限定されるわけではない。一部の実施形態において、本開示の組成物を使用して、疾患および／もしくは腫瘍の発症を遅延させる、または疾患および／もしくは腫瘍成長の進行を遅らせる（またはさらに食い止める）。
本明細書において使用するとき、「抗腫瘍有効量」という用語は、がん細胞もしくは腫瘍成長を低下させるための、または対象における腫瘍容積もしくは腫瘍細胞の数を減少させるための、構築物発現ＮＫ細胞の有効量を指す。「抗腫瘍有効量」とは、平均余命を増加させるための、または腫瘍もしくはがんと関連した生理学的効果を軽減するための、操作されたＮＫ細胞または操作されたＮＫ細胞株の有効量も指し得る。
本明細書において使用するとき、「治療有効用量」、「治療有効量」、および「有効量」という語句は、（別様に具体的に記されない限り）１回または治療サイクルの経過にわたって投与された場合に、対象の健康状態、幸福、または死亡率に影響を及ぼす、本開示のポリペプチドおよび／または操作された細胞の分量を意味する（例えば、限定されることなく、がん性病状と関連した効果の低減または阻止）。本明細書に記載される疾患、病状、または障害（限定されることなく、固形状態腫瘍等のがん性病状を含む）を治療するための、対象に投与されるべきポリペプチド、操作された細胞、または他の化合物の適当な投薬量または量は、治療されている病状のタイプおよび重症度、疾患病理がどのくらい進んでいるか、組成物の製剤化、患者応答、処方医師または医療提供者の判断、１種または複数の構築物が投与されているかどうか、投与の経路、ならびに治療されている患者または対象の特徴（全般的健康状態、年齢、性別、体重、および薬物への耐性等）を含めたいくつかの因子に従って変動するであろう。ゆえに、所与の単位剤形に含まれる操作された細胞の絶対量は、広く変動し得、対象の年齢、重量、および身体的条件、ならびに投与の方法等の因子に依存する。
治療有効量とは、治療剤の任意の毒性のまたは有毒な効果を、治療上有益な効果が上回るものでもある。少なくとも１つの実施形態において、抗腫瘍有効量は治療有効用量であり得る。
がん、がん性腫瘍、または他の疾患もしくは障害を治療するための、本明細書に記載される操作された細胞に関する投与される投薬量は、当業者によって実践される投薬量およびスケジュールレジメンに従う。典型的に、１０９個細胞／患者を超える用量が、養子細胞移入療法を受けている患者に投与される。有効量または用量を決定することは、とりわけ本明細書において提供される詳細な開示を踏まえて、当業者の能力の十分に範囲内にある。
「薬学的組成物」という用語は、本明細書に記載される操作された細胞または操作されたＮＫ細胞株の１種または複数、ならびに保存剤、充填剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、抗細菌剤、抗真菌剤、平滑剤、および分配剤等、薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを含む少なくとも１種の構成要素（投与の様態および剤形の性質に応じて）を含む組成物を意味する。
「薬学的に許容される」という用語およびその文法的変形は、それらが組成物、担体、希釈剤、試薬等を指すとき、互換可能に使用され、合理的な有益性／危険性の比に見合うように、材料が、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、および／または吐き気、目まい、急性胃蠕動（gastric upset）等の望ましくない身体的効果なく、哺乳類へのまたはその上への投与ができることを表す。言い換えれば、それは、生物学的にまたは別様に望ましくなくない材料であり、すなわち、材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こすことなく、またはそれが含有される薬学的組成物の他の構成要素のいずれかとも重大に有害な様式で相互作用することなく、本開示の構築物を発現するように改変されたＮＫ細胞（および／または幹細胞もしくはｉＰＳＣ）とともに個体に投与され得る。
「単離された」という用語は、材料が、その元の環境、例えばそれが天然に存在している場合には天然環境から取り出されることを意味する。例えば、生きた生物内に存在している天然に存在するＮＫ細胞は単離されていないが、天然のシステムにおける共存している材料の一部またはすべてから分離された同じＮＫ細胞は単離されている。
限定されることなく、手術、放射線、および化学療法を含む、膠芽腫（ＧＢＭ）に対する従来の治療は、ＧＢＭに特徴的な重度の免疫抑制に大きく起因して効果がないと証明されている。ＧＢＭは、様々な分子的、遺伝子的、およびエピジェネティック的特徴を有する細胞が、従来の治療を回避するその能力の一因となる、その腫瘍内不均質性に起因して治療するのが特に難しい腫瘍である。さらに、ＧＢＭは、単一抗原を標的にする単一療法に抵抗する抗原逃避変種によって特徴付けられる。
単一抗原に基づく療法の限界は、腫瘍増生変種を通じて、臨床研究において認識されている。これまで、単一ＧＢＭ抗原であるＥＧＲＦ、ＥＧＲＦｖＩＩＩ、またはＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２を標的にするＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株の使用に限定されており、全応答率は失望するほどに低くかつ一貫性がない。これらの結果は、ＧＢＭに対する単一抗原標的化ＣＡＲ－Ｔ療法の臨床的ハードルを映し出しているようである。
標的選択のストリンジェントな要件は、標的化ストラテジーに制約を加える。多標的化ＣＡＲで操作された細胞を用いた組み合わせ抗原標的化は、ＧＢＭにおける抗原逃避に対処するいくらかの能力を示しているものの、主として低酸素ＧＢＭ ＴＭＥによって引き起こされる乏しい免疫細胞浸潤および免疫代謝リプログラミングが、永続的応答を妨害している。さらに、驚きではないが、抗原逃避変種の増生が、これまでほとんどのＧＢＭ関連抗原に関して臨床的に記録されており、免疫回避および治療に対する抵抗性をもたらす。持続不能な応答は、第ＩＩＩ相試験においてＣＡＲ－Ｔ療法を用いて治療されたＧＢＭ患者の全生存期間（ＯＳ）の向上の欠如をもたらしている。
二重抗原標的化のまたはプログラム可能な腫瘍感知のＣＡＲは、養子Ｔ細胞療法の背景においてのみ、ＧＢＭ治療に対して前臨床的に評価されているものの、ＧＢＭは、そのような手法が対処しない免疫監視を避ける抗原逃避を超えるメカニズムを採用する。したがって、二重抗原プログラミング単独では、臨床的に有効な治療に十分でない。実際のところ、ＧＢＭによる治療回避は、ＮＫ細胞エフェクター機能にとって好ましくないニッチを提供する、極度に免疫抑制性の低酸素ＴＭＥによって付加的に促進される。さらに、多くの腫瘍（例えば、ＧＢＭのような）の極めて低酸素の性質は、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドラーゼ－１（ＣＤ３９）、エクト－５’－ヌクレオチダーゼ（ＣＤ７３）、および他のアデノシン作動性シグナル伝達変種（例えば、ＣＤ３８等）の活性も促進して、免疫抑制性の代謝産物アデノシンを産生し、それは、ＮＫ細胞活性の重大なプリン作動性シグナル伝達媒介性欠損につながる。
加えて、ＧＢＭ細胞は、オートファジーを利用して、それらの成長、進行、および療法に対する抵抗性を促進する。最後に、ＧＢＭ細胞のサブセットであるグリオーマ幹様細胞（ＧＳＣ）も治療抵抗性の一因となり、Ｕ８７ＭＧを含めた従来のＧＢＭモデル細胞株によって再現が乏しい。この複雑性は、協調してまたは相乗的に作用して意味のある臨床応答を始動させ得る、様々な治療的ストラテジーの必要性をもたらす。
本開示の発明概念は、概して、１種または複数のがん特異的抗原を標的にするだけでなく、少なくとも１つの実施形態では、オートファジーを阻害もし、それによりＧＢＭが治療的処置に対して感作される、多機能性の操作されたＮＫ細胞による、がん、特にＧＢＭの治療のための方法、組成物、および操作されたペプチドに関する。さらに、本開示のある特定の実施形態は、アデノシン作動性シグナル伝達を直接阻害する。したがって、本開示の組成物、システム、および方法は、本明細書に記載される新規の操作されたＮＫ細胞を使用して、例えば抗原逃避、免疫代謝抑制、および／または乏しい腫瘍内ＮＫ細胞存在を含めた、ＧＢＭ進行の複数の臨床的に関連する経路を同時に標的にする、ＧＢＭに対する最初の多機能性の操作されたＮＫ細胞に基づく療法である。本開示のデータは、特にＧＢＭに関するものの、本明細書の発明概念は、がん関連抗原およびアデノシンまたはアデノシン中間体を発現する任意のがんに関係することが当業者によって理解されるであろう。
少なくとも１つの例示的な実施形態において、例えば、少なくとも二機能性の構築物（例えば、ＣＡＲ）、すなわち、がん関連抗原（例えば、限定されることなく、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２））に特異的なタンパク質をコードするための少なくとも第１の構築物、およびＮＫ活性化受容体（例えば、限定されることなく、強力な活性化ＮＫ細胞受容体ナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ））にコグネートリガンドを標的化するための少なくとも第２の構築物を含む単一ＮＫ細胞構築物が提供される。ＮＫ細胞において発現した場合、これら２つの結合ドメインは、膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインを含み得る、ＮＫ細胞の１種または複数の刺激性または共刺激性ドメイン（すなわち、シグナル伝達ドメイン）と共役され得る。そのような構築物の１種または複数は、所望のとおり単一ＮＫ細胞において発現され得る。この背景における少なくとも２種の異なるＣＡＲの使用は、従来の治療に関して見られるがん細胞の抗原逃避を避ける。
さらに、構築物の少なくとも１種は、切断可能なリンカーを介して構築物と作動的に連結された、例えば、限定されることなく、１種または複数のＣＤ７３、ＣＤ３９、またはＣＤ３８遮断抗体フラグメントを含めることを通じて、免疫抑制性プリン作動性／アデノシン作動性シグナル伝達を損なうようにさらに操作され得る。例えば、少なくとも１つの実施形態において、第１のＣＡＲは、切断可能なリンカーを介して抗ＣＤ７３ｓｃＦｖと共役され得る。このように、操業において、抗体および／またはフラグメントは、ＣＡＲに基づくシグナル伝達および／または活性化から完全に独立して放出される。次いで、放出された抗体／フラグメントは、がん細胞のアデノシン産生細胞表面タンパク質またはアデノシン中間体産生細胞表面タンパク質の活性を阻害するように機能し、それによって細胞外アデノシンの局所濃度は減少し、それが今度は、免疫抑制性プリン作動性シグナル伝達を損なう。少なくとも１つの例示的な実施形態において、リンカーの放出は腫瘍感受性であり、ゆえに、ＴＭＥにおいて上方調節されるプロテアーゼの活性によって切断可能である。これは、ＴＭＥにおけるアデノシン遮断抗体フラグメントの局所的放出をもたらし、ゆえに全身毒性を避ける。
なおさらに、特にＧＢＭによって引き起こされる腫瘍床へのＮＫ細胞の不十分なホーミングに対処するために、および免疫細胞治療に対してがん細胞を感作するために、本開示の実施形態は、少なくとも１種の付加的な治療的処置の投与によりオートファジーも損ない得かつ／または無効にし得る。少なくとも１つの実施形態において、付加的な治療的処置は、クロロキン（ＣＱ）等の１種または複数の薬理学的オートファジー阻害剤を患者に投与することを含む。付加的にまたは代替的に、少なくとも１種の付加的な治療的処置は、遺伝子ノックダウン患者由来ＧＢＭ細胞を作出することを通じて、オートファジー経路と関連した患者の１種または複数の遺伝子を標的にすることを含む。とりわけ、本開示の操作されたＮＫ細胞と併せて使用される場合、付加的な治療的処置は、ＧＢＭ環境の強力な再組織化を達成し得、ゆえに、ＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０ケモカイン軸の関与を通じて、ＮＫ細胞浸潤を実質的に増強し得る。
関連する細胞経路およびメカニズムの簡単な説明が、本明細書の発明概念の理解を支援するために提供され、その後に、本明細書において提供される本構築物、組成物、および新規の方法の詳細な説明が続くであろう。
アデノシン
固形腫瘍の病因の一因となるのは、低酸素固形腫瘍コアにおける嫌気的解糖の結果であるアデノシンの濃度の上昇である。固形腫瘍において、ＡＴＰは、細胞外空間において豊富に放出され、そこでその濃度は、健常組織においてよりも１０００倍を上回って高い濃度であるリットルあたり数百マイクロモルに達し得る。この現象は、主に、腫瘍コアにおける細胞死に、ならびにＡＴＰの活発なエクスポートを刺激する代謝的または低酸素ストレスおよび炎症促進性シグナルに起因する。ＴＭＥにおいて、細胞外ＡＴＰは、先天性免疫細胞の動員および抗腫瘍活性のプライミングに関わる危険シグナルとして作用する；しかしながら、それと同時に、細胞外ＡＴＰは、少なくともＣＤ３９およびＣＤ７３ならびにＣＤ３８の協調した酵素活性を介して、免疫抑制性アデノシンに分解される。結果として、様々な固形腫瘍において、細胞外アデノシンの蓄積、それに続く腫瘍反応性ＮＫ細胞上のアデノシン受容体の関与は、腫瘍成長を推進する高度に免疫抑制性のメカニズムである。
ＣＤ３９およびＣＤ７３は、固定された細胞表面タンパク質であり、細胞外空間に面して触媒部位を呈するエクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドラーゼである。ＣＤ３８およびＣＤ１５７も、それらがＡＤＰリボシルシクラーゼからなることを除いて、細胞外触媒ドメインを有する表面分子である代替経路である。ＧＢＭ等の固形腫瘍によるおよびＴＭＥにおけるこれらの外酵素の発現は、細胞外アデノシンの産生をもたらす。
ＣＤ３８およびＣＤ１５７は、ＮＡＤａｓｅ／ＡＤＰＲシクラーゼ酵素の同じファミリーの一部である。ＣＤ３８は、触媒部位を持する比較的大きな細胞外ドメインによって特徴付けられる表面糖タンパク質である。一方、ＣＤ１５７は、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーを介して膜に付着している。両分子の細胞外ドメインは、保存された肝要な残基を含有する。それらは両方とも、プリン作動性受容体にも影響を及ぼすニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を代謝し、寛容に向けて免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞）を生成する絶大な効果を有するアデノシン生成に集中する。実際のところ、細胞外ＮＡＤ＋は、ＣＤ３８およびＣＤ１５７を含めた、エクトヌクレオチダーゼの統合ネットワークによって分解され得、それは、シグナル伝達をモジュレートしかつ免疫調節回路を活性化する中間体を生成する。細胞外アデノシンは、ＣＤ３８の協調的作用を通じてＮＡＤ＋から生成され得、それは、ＡＤＰリボース（ＡＤＰＲ）およびＰＣ－１（エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１）を生成し、それはＡＭＰを生成する。ＣＤ３８と同様に、ＣＤ１５７は、ＮＡＤ＋とともにインキュベートされた場合、ｃＡＤＰＲおよびその後ＡＤＰＲを生成する。
ヒト末梢血において、ＣＤ３９およびＣＤ７３の両方とも、典型的に、非悪性血液細胞内のＮＫ細胞の約２～５％で発現される。そのため、ＣＤ３９およびＣＤ７３の両方の発現は、健常個体における循環ヒトＮＫ細胞には事実上不在である。しかしながら、ヒト腫瘍および浸潤免疫細胞によるＣＤ３９の有意な発現が広く記載されており、それは、エフェクター抗腫瘍免疫および炎症促進性サイトカインへの曝露に対して阻害的役割を有するアデノシンの生成、酸化ストレス、ならびに低酸素と関連している。同じように、ＣＤ７３の発現は、多くのタイプのがん細胞上で構成的に高いレベルでとどまる。高いＣＤ７３発現は、好ましくない臨床転帰と相関することが示されており、それは、アデノシンの免疫抑制的役割と整合している。ＣＤ３８、ＣＤ７３、および／またはＣＤ１５７の発現は、とりわけ低酸素であるＴＭＥにおいても上方調節され得る。
したがって、ＣＤ３９およびＣＤ７３は、多くの固形腫瘍細胞上で、特にＧＢＭで過剰発現され、細胞外ＡＭＰの脱リン酸化後のアデノシンシグナル伝達の上方調節を通じて、がん進行の促進に関わる。本明細書に記載されるように、アデノシン作動性シグナル伝達は、ケモカイン受容体の不均一な脱感作および炎症促進性サイトカインの低下に起因して、ＮＫ細胞の輸送および活性に干渉し、細胞傷害性ＮＫ顆粒のエキソサイトーシスを阻害する。これは、腫瘍発症を支持する血管新生促進性ニッチを創出する。
アデノシン誘導性免疫抑制は、ＣＤ７３またはその変種の抗体媒介性遮断によって軽減され得る；しかしながら、これは、単独では、低酸素腫瘍ニッチへのＮＫ細胞の動員に依存する。従来の努力は、ＮＫに基づく免疫療法と併せたアデノシン作動性シグナル伝達を標的にしていない。
ＮＫ活性
先天性免疫系の特化したエフェクターであるＮＫ細胞は、病原体由来のまたはストレス誘導性の自己抗原に直接結合し得る、生殖細胞系列によりコードされる活性化受容体の発現に起因して、がん細胞に迅速に応答し得る。ＮＫ細胞の活性は、活性化受容体および阻害性受容体のレパートリーからのシグナルのバランスによって制御される。活性化受容体には、限定されることなく、天然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ならびにＬＦＡ－１、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、およびＣＤ１３７（４１ＢＢ）等の共刺激性受容体が含まれる。これらの活性化細胞表面受容体は、細胞溶解プログラム、ならびに２Ｂ４、４１ＢＢ等の細胞質内ＩＴＡＭを介しておよび／または他の膜貫通シグナル伝達アダプターを介して、サイトカインおよびケモカイン分泌を誘発する能力を有する。本明細書において使用するとき、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、別様に指定されない限り、刺激性および共刺激性ドメインを意味しかつ含む。
逆に、阻害性ＮＫ細胞受容体は、コグネートＭＨＣクラスＩタンパク質を主に認識し、健常細胞に対する自己寛容を提供する。形質転換またはウイルス感染の後にしばしば観察される、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現の不在または低下を有する細胞は、十分な阻害性シグナルを誘発することができず、ＮＫ細胞攻撃の影響を受けやすくなる。
活性化ＮＫ細胞受容体に対するリガンドの上方調節された発現は、ＮＫ細胞攻撃に対して細胞を感受性の状態にし得る。そのような活性化受容体は、Ｃ型レクチン様受容体ＮＫＧ２ｄである。ＮＫＧ２ｄ受容体は、ＮＫ細胞、ならびにＮＫＴ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、およびγδＴ細胞等の多くのＴ細胞において発現される。しかしながら、Ｔ細胞において、ＮＫＧ２Ｄは、通常、共刺激性受容体としてのみ作用し、細胞傷害を直接媒介せず、それはＮＫ細胞とは異なる。
ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現（腫瘍細胞においてしばしば発現される）は、一般的に、免疫攻撃のために細胞に印付けし、ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合することによってＮＫ細胞を活性化する「危険シグナル」と見なされる。実際のところ、ヒト細胞を用いたエクスビボ調査、およびマウスにおけるインビボ腫瘍モデルは、腫瘍細胞上でのＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が、ＮＫ細胞攻撃に対する影響の受けやすさの増加をもたらすことを実証した。免疫系が適正に機能している場合、ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄのライゲーションは、ＮＫ細胞活性化を促進しかつ適応免疫応答に影響する働きをする；しかしながら、ＮＫＧ２Ｄ受容体／ＮＫＧ２Ｄリガンドの作用を阻害して免疫逃避を可能にする様々なメカニズム（とりわけＧＢＭに関して）がある。
本明細書において論じられるように、アデノシンシグナル伝達は、ＮＫ細胞上での受容体発現の下方調節をもたらす（例えば、限定されることなく、アデノシンは、サイトカインによりプライムされたヒトＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄを下方調節することが確証されている）。細胞外アデノシン濃度に加えて、ＮＫ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ受容体の発現は、細胞活性因子の変化およびＴＭＥの物理化学的特質（例えば、低酸素等）を含めた、多様な他の因子によって調節され得る。ＴＭＥは、腫瘍関連線維芽細胞、腫瘍関連マクロファージ、Ｔｒｅｇ、免疫調節酵素（例えば、アルギナーゼおよびシクロオキシゲナーゼ－２）、および免疫抑制因子（例えば、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、およびプログラム死リガンド１）を含めた、多様な細胞および分子から構成される。腫瘍細胞（ＧＭＢ細胞等）および免疫抑制細胞は、ＴＭＥにおいて、ポドカリキシン（podocalyxin）様タンパク質１（ＰＣＬＰ１）、アクチビン－ａ、インドールアミン－ピロール２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＰＧＥ２、ＴＧＦ－β、およびマクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）を発現してまたは分泌して、ＮＫＧ２Ｄの下方調節を媒介する。
さらに、低酸素は、免疫抑制分子の分泌を直接的または間接的に誘導し得るＴＭＥの重要な特質であり、それにより、ＮＫ細胞は、ＩＬ－２および他のサイトカインを通じてＮＫＧ２Ｄ発現を上方調節する能力を喪失する。低酸素条件下で、腫瘍細胞は、多様なケモカインを分泌して、サイトカインを分泌する免疫抑制細胞を動員し得、それによってＮＫＧ２Ｄ発現を下方調節する。
構築物および関連する方法
本開示の発明的構築物、操作されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株、組成物、ならびに方法は、がん抗原および／またはＮＫ活性化受容体の少なくとも１種またはその組み合わせを独自に標的にし、がん／腫瘍細胞のアデノシン産生細胞表面タンパク質またはアデノシン中間体産生細胞表面タンパク質の活性を遮断することによって、免疫抑制性プリン作動性シグナル伝達を損なう放出可能な可溶性抗体フラグメントをさらに提供する。複数種のがん抗原および／または活性化受容体が採用される場合、これは、抗原逃避に対する腫瘍の能力を限定する。さらに、アデノシンを遮断する可溶性抗体フラグメントが空間的に制御される少なくとも１つの実施形態において、それは、ＴＭＥ内にある場合にのみ放出して、その持続的でかつ非毒性の放出を可能にする。したがって、これは、他の従来の療法において見られる全身毒性の問題点を避ける。
本開示の新規の手法は、操作されたＮＫ細胞の特異性とアデノシン産生酵素の遮断（例えば、抗ＣＤ７３）によって誘導される免疫関与とを独自に組み合わせる。なおさらに、下で付加的に詳細に記載されるように、そのような治療は、１種または複数のオートファジー阻害剤の投与と組み合わされて、腫瘍をさらに感作し得、治療効能をさらに促進し得る。したがって、本開示の構築物、操作されたＮＫ細胞、薬学的組成物、および結果として生じる療法は、毒性を避けながら、ＧＢＭ進行の複数の臨床的に認識されるメカニズムを同時に標的にし得る併用免疫療法様態をもたらす。
ここで図４に言及すると、合成遺伝子構築物１００の少なくとも１つの例示的な実施形態が提供される。遺伝子構築物１００は、それを発現する（生物工学および他の公知の様態により達成される）ＮＫ細胞およびＮＫ細胞株が、天然ＮＫ細胞の表面で通常では発現されない少なくとも１種のドメインおよび／または受容体を発現するように操作される。腫瘍／ＧＢＭ細胞等の標的細胞上のリガンドへの、これらの改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株の結合は、天然ＮＫ細胞に存在しない新たなドメインを通じたものである。少なくとも１つの実施形態において、構築物１００は、１種または複数のＣＡＲ構築物を含み得る。少なくとも１つの例示的な実施形態において、構築物１００は、第１のＣＡＲ構築物および第２のＣＡＲ構築物を含む。
おそらくその最も簡素な形態において、遺伝子構築物１００は、少なくとも第２の結合ドメインまたはそのフラグメントおよび切断可能なリンカー１０４をコードする第２の配列に作動的に連結された、少なくとも第１の結合ドメインまたはそのフラグメント１０２をコードする第１の配列を含む、第１の構築物を含む。第１の結合ドメインまたはそのフラグメント１０２は、ＮＫ活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ；配列番号６）またはがん関連抗原に特異的なタンパク質（例えば、ＧＤ２；配列番号７等）を含み得る。図５、下位区分ＦおよびＧは、第１の配列によってコードされる第１の結合ドメインまたはそのフラグメント１０２の少なくとも１つの実施形態を概略で図解している。
少なくとも１つの例示的な実施形態において、第１の構築物は、標的細胞のアデノシンまたはアデノシン中間体産生細胞表面タンパク質に特異的である第２の結合ドメインまたはそのフラグメント１０４もコードするようにさらに操作される。例えば、そのようなアデノシンまたはアデノシン中間体産生細胞表面タンパク質は、アデノシンまたはその中間体を産生する標的細胞のＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ３８、または任意の他の細胞表面タンパク質を含み得る。少なくとも１つの例示的な実施形態において、アデノシンまたはアデノシン中間体産生細胞表面タンパク質はＣＤ７３を含み、第２の結合ドメインまたはそのフラグメント１０４は、抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖ等の抗ＣＤ７３フラグメントを含む（図５、下位区分Ｋを参照されたい）。
顕著には、第２の結合ドメインまたはそのフラグメント１０４は、切断可能なリンカーをさらに含む。そのような切断可能なリンカーは、当技術分野において公知の任意のそのようなリンカーを含み得、少なくとも１つの例示的な実施形態では、ＴＭＥ内に存在する１種または複数のプロテアーゼによって切断可能であるリンカーを含む。上で詳細に記載されるように、がん細胞は、ＣＤ７３および他の表面タンパク質を通じてアデノシンを産生する。第２の結合ドメイン１０４は、そのようなアデノシンまたはアデノシン中間体産生腫瘍細胞表面タンパク質に特異的であり得ることから、そのリンカーがＴＭＥにおいて切断された場合、結果として生じる可溶性抗体フラグメントは、操作されたＮＫ細胞から放出され、アデノシン（またはアデノシン中間体）産生腫瘍細胞表面タンパク質に結合することが可能となる。
遺伝子構築物１００は、図５、下位区分ＫおよびＬに示される第２の構築物をさらに含み得る。第１の構築物と同様に、第２の構築物は、ＮＫ活性化受容体、またはがん関連抗原に特異的なタンパク質を含む、少なくとも１つの結合ドメイン（またはそのフラグメント）をコードする第２の配列を含み得る。図５、下位区分ＡおよびＢは、第２の配列によってコードされる第３の結合ドメインまたはそのフラグメントの少なくとも１つの実施形態を概略で図解している。
第１および第３の配列の一方または両方（適用可能な場合）は、ＮＫ細胞のシグナル伝達ドメインをコードし得、それによりそれらは、活性化があると、操作された細胞または細胞株の細胞傷害および／または細胞溶解活性を促進し得る（例えば、限定されることなく、図５、下位区分ＡおよびＦにおけるＣＤζ、ならびに図５、下位区分ＡにおけるＤＡＰ１０を参照されたい）。第１および第３の結合ドメイン１０２、１０６は、所望のとおり、相補性（complimentary）決定領域、可変領域、および／またはその抗原結合フラグメントを含み得る。所望の結果を達成するために要され得るように、様々なリンカー、スペーサー、ｓｃＦｖ、ヒンジ、および／またはタンパク質複合体が、第１および第２の配列の一方または両方によって付加的にコードされ得ることが同じように解されるであろう。
第１の配列および第３の配列は、それぞれ活性化受容体１０２およびがん関連抗原に特異的なタンパク質１０６を含むものとして図５に表されているものの、第１および第３の配列は、両方ともがん関連抗原に対するタンパク質をコードし得る、または両方ともＮＫ細胞活性化受容体をコードし得る（すなわち、必ずしも各タイプの一方である必要はない）。さらに、第２の結合ドメインまたはそのフラグメント１０４をコードする第２の配列は、第１のドメイン１０２のＮＫ細胞活性化受容体に作動可能に連結され得る。第１および第３の配列が、両方とも抗原または受容体１０２、１０６をコードする場合、例示的な実施形態において、それらは、２種の異なるがん特異的抗原または２種の異なるＮＫ細胞活性化受容体をコードし得る；しかしながら、しばしば望ましいものの、これは要されるわけではない。
図５、下位区分ＫおよびＬは、第１、第２、および第３の結合ドメイン（またはそのフラグメント）１０２、１０４、１０６を含む、本開示の遺伝子構築物の少なくとも１つの例示的な実施形態の概略を図解している。そこでは、非限定的な例として、第１の結合ドメイン１０２は、ＣＤ８αヒンジおよび２種のシグナル伝達ドメイン（ＣＤ２８およびＣＤ３ζ）に作動可能に連結された抗ＧＤ２ ｓｃＦｖフラグメントを含み（集合的に、ＧＤ２－ＣＡＲ；配列番号７）、第２の結合ドメイン１０４は、切断可能なリンカー（配列番号１）を介して第１の結合ドメイン１０２に連結された抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖフラグメントを含み、第３の結合ドメイン１０６は、ＮＫＧ２Ｄ、２種のシグナル伝達ドメイン（ＤＡＰ１０およびＣＤ３ζ）、および少なくとも１種のＰ２Ａ自己切断ペプチドを含み（ＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ；配列番号６）、ＧＤ２－ＣＡＲは、自己切断Ｐ２Ａペプチドの１つ（配列番号４）を通じてＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲと結び付いている。少なくとも１つの例示的な実施形態において、構築物１００は、配列番号８と少なくとも８０％、８５％、または９０％の配列同一性をコードする。
標的細胞は、がん関連抗原、ＮＫＧ２Ｄ、もしくはＮＫ活性化受容体とコグネートな他のリガンド、および／または細胞表面タンパク質を通じたアデノシンもしくはその中間体を産生する任意の細胞、例えば、限定されることなく、がん細胞または代わりにＴＭＥ内の悪性の細胞を含み得る。ＧＤ２、およびＮＫＧ２Ｄに対するリガンドは、特に、ヒトＧＢＭ上で広く発現され、そのため、非限定的な例として本開示において言及される。しかしながら、限定されることなく、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、Ｈｅｒ２（ｐ１８５）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、Ｃ型レクチン様分子－１；ＥｐＣＡＭ、Ｇ２５０、プロテオグリカン、ＧＤ３、ＧＤ２、ＭＨＣ ＩＩ、ＴＡＧ－７２、ミルクムチンコアタンパク質、ルイスＡ抗原、チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ１）、ｃ－ｍｅｔ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲ変種ＩＩＩ、および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）等、他のがん関連抗原が本開示の構築物においてコードされ得、ある特定の抗原は、ある特定のタイプのがんと特に関連し得る。
同様に、ＮＫＧ２Ｄは、代表的なＮＫ細胞活性化受容体として図５に示されているものの、限定されることなく、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４０、ＤＮＡＭ－１等を含む、所望の標的細胞上に提示されるコグネートリガンドを有する任意のＮＫ活性化受容体が、構築物１００においてコードされ得る。ある特定の実施形態において、構築物および結果として生じるＮＫ細胞は、例えば、関心対象のがんにおいて主に発現される抗原またはコグネートリガンドに特異的なタンパク質をコードする第１の配列１０２および／または第３の配列１０６を含むことによって、特定のがんタイプに対して特異的に操作され得る。
付加的に、ＮＫ活性化受容体をコードする構築物１００のある特定の実施形態は、当技術分野において公知の技法を使用して、上方調節された発現のために付加的に操作され得る。例えば、少なくとも１つの例示的な実施形態において、結合ドメインまたはそのフラグメントをコードする配列の１つまたは複数は、野生型ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄの発現（すなわち、それが天然に存在するＮＫ細胞の典型的形態でのそのような受容体の発現）と比較して、ＮＫＧ２Ｄの上方調節された発現をコードするように操作される。そのような操作された上方調節された発現は、それが、利用可能な局所的ＮＫＧ２Ｄを増加させることから、操作されたＮＫ細胞を採用して、ＧＢＭおよび低酸素ＴＭＥを有する他の腫瘍を治療する場合に特に有用である。
がん関連抗原、およびＮＫ活性化受容体のコグネートリガンドの多くは、がん細胞（特にＧＢＭ）およびＴＭＥにおいて上方調節されることから、構築物１００における結合ドメインまたはそのフラグメント１０２、１０６の１つまたは複数におけるそのような抗原に特異的なタンパク質を含めることは、結果として生じる操作されたＮＫ細胞が、がんおよび他のそのような細胞を直接標的にしかつ認識することを可能にする。この目標に向けて、本構築物１００は、特異性を増強し、腫瘍、がん、および他の悪性細胞の直接的な標的化および関与を安全に可能にする。
結合ドメイン１０２、１０４、１０６は、約１０～約２５個のアミノ酸のより短いリンカーペプチドを用いて接続された、免疫グロブリンの重（ＶＨ）および軽（ＶＬ）鎖の可変領域間の融合タンパク質である、１種または複数の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列またはナノボディ等の他の抗体フラグメントをさらに含み得る。ｓｃＦｖまたは他の抗体フラグメントの特異的構成は、結果として生じるペプチドの所望の特性（例えば、柔軟性のためのグリシン、ならびに可溶性のためのセリンまたはトレオニンに富む）に基づいて選択され得る。当技術分野において公知であるように、ｓｃＦｖまたは別の抗体フラグメントは、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とを接続させ得る、または逆もまた同様である。該タンパク質は、定常領域の除去およびｓｃＦｖまたは他の抗体フラグメントの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。
したがって、少なくとも１つの実施形態において、第２の結合領域またはドメイン１０４、および第１の結合領域またはドメイン１０２はそれぞれ、特定のマウス、もしくはヒト、もしくはヒト化モノクローナル抗体に由来する、または他の公知の供給源および公知の方法論に従ったｓｃＦｖフラグメントを含む。フラグメントは、抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合ドメインでもあり得る。より具体的な実施形態において、フラグメントは、ヒトＮＫ細胞における発現のためにヒトコドン使用法に対して最適化されている配列によってコードされる抗原特異的ｓｃＦｖ（例えば、αＣＤ７３ ｓｃＦｖまたはαＧＤ２ ｓｃＦｖ）である。少なくとも１つの例示的な実施形態において、第１の配列は、配列番号７と少なくとも８０％、８５％、または９０％の配列同一性を有し、それがＣＤ７３ ｓｃＦｖをコードする結合ドメインまたはそのフラグメント１０２は、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、または９０％の配列同一性を有する。
構築物１００によってコードされ得る１種または複数のシグナル伝達ドメインに戻って言及すると、第１および／または第３の結合領域またはドメイン１０２、１０６は、それに作動的に連結され得（直接的に、または下で記載されるヒンジ領域を介して）、実際に、第１の結合ドメインそれ自体が、シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＤＡＰ１０）を含み得る。１種または複数のシグナル伝達ドメインは、例えば、結び付いた結合ドメインまたはそのフラグメントが標的細胞に結合すると、ＮＫ細胞の細胞溶解および細胞傷害プログラムを誘発し得るＮＫ活性化因子受容体または受容体複合体を含み得る。例えば、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、もしくはＤＡＰ１０シグナル分子、または当技術分野において公知の任意の他のシグナル伝達ドメインを含み得る。ある特定の実施形態において、シグナル伝達ドメインは、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＬＦＡ－１、ＣＤ２４４、ＣＤ１３７、またはＮＫＧ２Ｄ－ＤＡＰ１０受容体複合体を含み得る。さらに、シグナル伝達ドメインは、限定されることなく、ＤＡＰ１２、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、およびＤＡＰ１０のうちの１種または複数を含む、付加的な他の共刺激性ドメインも含み得る。
適用において、標的細胞との、構築物１００の少なくとも第１の、および任意で第３の結合ドメイン１０２、１０６の関与は、操作されたＮＫ細胞のシグナル伝達ドメインを通じてシグナル伝達を促進し、ＣＤ３ζアダプター鎖上のＩＴＡＭモチーフの活性化、ならびに固形腫瘍および他のアデノシン産生またはアデノシン中間体産生標的に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害をもたらす。したがって、操作されたＮＫ細胞がＧＤ２産生および／またはＮＫＧ２Ｄリガンド産生表面細胞タンパク質（例えば、固形腫瘍上の）を直接標的にしかつ結合した場合、シグナルは、シグナル伝達ドメインを介して操作されたＮＫ細胞に送られて、それが結合している標的（がん）細胞の細胞溶解および／または細胞傷害メカニズムを誘発する。
任意で、構築物１００は、例えば、限定されることなく、第３の結合ドメイン１０６のαＧＤ２ ｓｃＦｖとシグナル伝達ドメインＣＤ２８およびＣＤ３ζとの間の位置で、結合ドメイン１０２、１０６内に配置されるヒンジドメイン（「ＣＤ８αヒンジ」とラベルされた、図５を参照されたい）を付加的に含み得る。ヒンジドメインは、リンカーまたはスペーサーをコードする１種または複数の配列を含みかつ構築物に含まれて、例えば第１／第３の結合ドメイン１０２、１０６と膜および／または細胞表面との間に十分な距離を提供し得る。付加的にまたは代替的に、所望の三次構造を促し得、かつ／または改変されたＮＫ細胞の抗原結合もしくはエフェクター機能に悪影響を及ぼし得る考え得る立体障害を軽減するようにヒンジドメインを含め（かつ／または構成し）得る。このように、ヒンジドメインは、ヒト細胞における最適な発現のために使用され得かつ／または操作され得る。
付加的にまたは代替的に、付加的な細胞内シグナル伝達ドメインを構築物１００に付加して、殺滅刺激を増強し得る（すなわち、結果として生じる操作されたＮＫ細胞のＮＫ媒介性細胞傷害をさらに強化する）。例えば、図５の下位区分Ｌに示されるように、ヒトＣＤ３ζ細胞内ドメインは、第１および第３の結合ドメイン１０２、１０６の両方と作動的に連結され得る。他の細胞質ドメインも、所望の場合には、相加または相乗効果のために一緒に融合されたそのような細胞質ドメインの１つまたは複数とともに、所望のとおり採用され得る。
操業において、結合ドメイン１０２、１０４、１０６は、関心対象の細胞を標的にし、結合ドメイン１０２、１０６が標的化された細胞に結合した場合、操作されたＮＫ細胞は、シグナル伝達ドメインを介してシグナルを送って、標的細胞の細胞溶解および／または細胞傷害を誘発する。さらに、結合ドメインまたはそのフラグメントの少なくとも１つが、上方調節された活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）を含む場合、これは、ＮＫ細胞の抗腫瘍応答を増強し、細胞外アデノシンの局所濃度だけでなく、ＮＫ細胞活性化の免疫抑制も低下させる。これは、第２の結合ドメイン１０４の放出によってさらに強化される。前に記載されるように、第２の結合ドメイン１０４はＴＭＥにある場合、その中のプロテアーゼは、第２のドメイン／フラグメント１０４を第１のドメイン１０２につなぐリンカーが切断されるようにし、それによってＴＭＥ内にフラグメントを放出して、標的細胞における局所的なアデノシンまたはアデノシン中間体活性遮断を開始する。特に、ＮＫＧ２Ｄ活性の増加と局所的ＣＤ７３標的遮断との組み合わせは、ＧＢＭおよび他のがんにおける制御されかつ局所的な応答性を達成することにおいて非常に有効である。
したがって、構築物１００は、ＧＢＭおよび他のがん進行を促進する経路の複雑なネットワークに対する多方向からの攻撃を可能にする。単一構築物に２種以上（例示的な実施形態では、３種）の標的を組み入れると、そのうちの１種は放出可能であり、本開示の操作されたＮＫ細胞が、抗がん免疫応答を活性化しかつ増強するだけでなく、抗原逃避等のＧＢＭの回避戦術を抑制することを可能にする。
これらの発明的技法は、従来の手法と比べて独自に有利である。第一に、同種幹細胞およびＮＫ細胞は、移植片対宿主疾患を引き起こさず、それらの幅広い、すぐに使える使用を実現可能にする。成熟ＮＫ細胞は、比較的限定された寿命を有し、有効な抗腫瘍活性を可能にし、一方で、オンターゲット／オフ腫瘍効果等の長期にわたる有害事象の可能性を低下させる。さらに、本構築物の発現は、それが局所的に放出されるため、ＣＤ７３および同様の抗体に関して典型的に見られる全身毒性を阻止し、低酸素等の抑制性ＴＭＥメカニズムによって誘導される活性化受容体の下方調節も救済する。
実施形態に従った構築物は、従来の技法を使用して調製され得る。大部分は天然配列が採用され得るため、天然遺伝子が単離され得、様々な構成要素の適正な接合を可能にするように必要に応じて操作され得る。例えば、遺伝子の非所望の部分の欠失をもたらす適当なプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を採用することによって、核酸配列が単離され得る。代替的に、クローニングされた遺伝子の制限消化を使用して、キメラ構築物を作出し得る。いずれの場合にも、平滑末端であるまたは相補的重なり合いを有する制限部位を提供するように、配列が選択され得る。
本明細書の構築物を調製するための様々な操作はインビトロで行われ得、特定の実施形態において、構築物は、標準的な形質転換またはトランスフェクション法を使用して、適当な宿主におけるクローニングおよび発現のためにベクターに導入される。ゆえに、各操作の後、ＤＮＡ配列の接合により結果として生じた構築物はクローニングされ、ベクターは単離され、配列をスクリーニングして、配列が所望の導入遺伝子および発現制御配列をコードすることを確実にする。配列は、所望のとおり、制限解析、シーケンシング等によってスクリーニングされ得る。
本明細書において提示される実施形態のベクターは、当技術分野において公知である真核生物プロモーターをさらに採用し得る。また、ベクターは、他の理由がない場合、インビトロでのそれらの操作を容易にするために、選択可能なマーカーを含有し得る。他の実施形態において、導入遺伝子は、ＤＮＡ鋳型からインビトロで転写されたｍＲＮＡから発現し得る。
実施形態に従って採用される例示的な核酸構築物（ポリヌクレオチド）において、プロモーターは、実施形態の導入遺伝子をコードする核酸配列に作動的に連結され、すなわちそれらは、単剤（single-agent）構築物をコードするＤＮＡからのメッセンジャーＲＮＡの転写を促進するように配置される。プロモーターは、ゲノム起源のものであり得るまたは合成で作出され得る。代替的に、いくつかの周知のウイルスプロモーターも適切である。
ＮＫ細胞またはＮＫ細胞株における本開示の構築物の発現のために、導入遺伝子をコードする核酸配列の天然に存在するまたは内因性の転写開始領域を使用して、標的宿主における所望の発現を生じさせ得る。代替的に、構成的または誘導性発現を可能にする外因性転写開始領域が使用され得、発現は、標的宿主、所望される発現のレベル、標的宿主の性質等に応じて制御され得る。
同じように、一部の場合には、導入遺伝子によってコードされる対象となる構築物を細胞表面に向かわせる、ヒトタンパク質発現に特異的な、Ｎ末端に付加されるリーダーおよび／またはシグナル配列が使用され得る。
本開示の構築物のＤＮＡ配列を組み入れた、単離された核酸セグメントおよび発現カセットも提供される。当業者であれば、そのような構築物を、ウイルス形質導入、ｍＲＮＡまたはＤＮＡエレクトロポレーション、ならびに他のウイルスおよび非ウイルス形質導入、ならびにトランスフェクション技法を含めた公知の遺伝子改変技法とともに採用して、本明細書に記載される構築物を発現する操作されたＮＫ細胞および／または操作されたＮＫ細胞株を達成し得ることを解するであろう。
本開示の操作されたＮＫ細胞を作製するおよび／または増大させる方法も提供される。少なくとも１つの実施形態において、本明細書において提供される構築物をコードするポリヌクレオチドは、適切なベクターまたはベクターフリーのいずれかで、従来のトランスフェクションおよび／または形質導入法を使用して、対象自身の細胞に（または、異なるドナー対象由来の細胞に）導入され得る。エレクトロポレーションによってまたは別様にＮＫ細胞に安定に形質導入するまたはトランスフェクトする方法は、当技術分野において公知である。さらなる態様において、本構築物を、トランスポゾンに基づくシステムを使用して細胞に導入して、細胞のゲノムＤＮＡ、非ウイルスベクター、またはウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター）への構築物の組み込みを媒介し得る。さらに、少なくとも１つの実施形態において、ＣＡＲは、ＮＫ細胞による取り込み、ゆえにＮＫ細胞における構築物由来の融合タンパク質の発現を促すように改変され得る。
天然ＮＫ細胞の供給源は、同種および自家供給源の両方を含み得る。一部の場合には、ＮＫ細胞は、幹細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化し得る。例えば、本明細書に記載される構築物は、幹細胞またはｉＰＳＣにおいて発現され得、それは次いで、関連する技術分野における当業者に公知の方法を使用して、ＮＫ細胞に分化し得る。ゆえに、本明細書の実施形態に従って操作するための細胞は、臍帯血、末梢血、ヒト胚性幹細胞、またはｉＰＳＣから単離され得る。
他の実施形態において、ＮＫ細胞は、ヒト末梢血単核細胞または臍帯血に由来するＮＫ細胞等の初代ヒトＮＫ（ｐＮＫ）細胞である。少なくとも１つの例示的な実施形態において、操作されたＮＫ細胞は、当技術分野において公知の方法に従って、再発性および原発性患者由来細胞から産生され得る。代替的に、本開示の構築物を発現する操作されたＮＫ細胞および／または操作されたＮＫ細胞株を、標準化された細胞集団から産生して、臨床的規模に成長し得る均質なＮＫ細胞集団を提供し得る。
本明細書に記載される構築物を発現するように改変されたＮＫ細胞、幹細胞、ｐＮＫ細胞、またはｉＰＳＣは、ＮＫ細胞障害の標的であり得る細胞によって少なくとも部分的に特徴付けられる病状（例えば、アデノシンを過剰発現する疾患状態）を有する対象への送達のための「担体」とともに、薬学的組成物に製剤化され得る。本明細書において使用するとき、「担体」には、任意の溶媒、分散媒、希釈剤、抗細菌薬、コーティング、ビヒクル、および／または抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド等が含まれる。そのような媒体および／または作用物質の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または作用物質が活性成分と不適合である限りを除いて、本明細書の薬学的組成物におけるその使用が企図される。補足的な活性成分も、組成物に組み入れられ得る。
さらに、本開示の薬学的組成物（例えば、本明細書の構築物を発現する操作された細胞を含む）は、単独で、またはがんおよび／もしくは固形腫瘍がんを治療するのに有用な他の十分に確証された作用物質との組み合わせで使用され得る。少なくとも１つの例示的な実施形態において、本開示の１種または複数の薬学的組成物は、１種または複数のオートファジー阻害剤と併せて、単一の患者に投与され得る。
下の実施例において詳細に論じられるように、本開示の新規の多機能性の操作されたＮＫ細胞のホーミングは、オートファジー阻害剤と併せて投与された場合に有意に増強されたことが新たに見つけ出されている。オートファジー阻害は、ＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０勾配の上方調節と並行して重大なＮＫ細胞走化性を誘発し、一方でそれと同時に腫瘍促進性ＣＣＬ２およびＣＸＣＬ１２の量を減少させる。言い換えれば、これらケモカインの放出は、操作されたＮＫ細胞をがんＴＭＥに引き付け、疾患と闘うためにそれらが必要とされる場所にそれらを効率的に連れていく。
さらに、オートファジーを無効にすることにより、ＮＫエフェクター機能の増強に有益に寄与する抗ＧＢＭ免疫学的応答の洗練されかつ複雑な再組織化も明らかになった。ＧＢＭ療法にオートファジー阻害剤を付加することの臨床的効能は、一般的なＦＤＡ承認のオートファジー阻害剤であるクロロキン（ＣＱ）の慢性投与を用いた、前向きの無作為化比較対照試験（prospective controlled randomized trial）において実証された。結果は、抗新生物療法に対するＧＢＭの有意に増強された応答を実証し、外因性作用物質に対してがん細胞を感作し、そのような治療が臨床的に安全でかつ忍容性良好であることを示す。
したがって、少なくとも１つの例示的な実施形態において、オートファジー過程の薬理学的欠損は、本開示の構築物を発現する操作された細胞を含む組成物（または活性成分）の投与と併せた、それと連続して、またはその前もしくは後の、オートファジー阻害剤を含む治療的処置の投与を通じて達成され得る。そのようなオートファジー阻害剤は、例えば小分子阻害剤の投与を含めた、対象におけるオートファジーを阻害し得るまたは低下させ得る任意の療法を含み得る。少なくとも１つの実施形態において、小分子阻害剤は、ＣＱ、ヒドロキシクロロキン、スパウチン－１、ＳＡＲ４０５、ベルテポルフィン、またはオートファジーを阻害するもしくは遮断するために患者への投与に適切である現在公知のもしくは後に開発される任意の他の小分子阻害剤を含み得る。付加的にまたは代替的に、オートファジーは、オートファジーと関連した１種または複数の遺伝子の下方調節を通じて、例えば遺伝子ノックダウン技法を通じて、遺伝子的に阻害され得る。少なくとも１つの例示的な実施形態において、該遺伝子は、以下の遺伝子ＢＥＣＮ１、ｐ６２、β－アクチン、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＬＣ３Ｂ、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＰＩ３Ｋ－ＩＩＩ、ＵＬＫ１、ＵＬＫ２、ＦＩＰ２００、およびＬＡＭＰ２、またはオートファジー経路と関連した（かつ、下方調節を介してまたは別様に阻害し得る）任意の他の遺伝子のうちの１種または複数を含み得る。
組成物それ自体が活性成分の組み合わせを含む、あるいはそれは、単独でまたは他の作用物質もしくは療法との組み合わせで送達されるかどうかにかかわらず、本明細書の薬学的組成物は、哺乳類の、好ましくはヒトの身体における様々な経路を介しておよび様々な部位に送達されて、特定の効果を達成し得る。当業者であれば、１つを上回る経路が投与に使用され得るものの、特定の経路は、他の経路よりも即時のかつ／または有効な反応を提供し得ることを認識するであろう。例えば、腫瘍内送達が、固形腫瘍癌の治療に使用され得る（かつ、オフターゲット効果を最小限に抑えるという観点から有利であり得る）。局所または全身送達は、薬学的組成物を体腔に投与すること、注入、または非経口的導入によって遂行され得る。本開示の組成物が、オートファジー阻害等の付加的な治療的処置に加えて投与される場合、オートファジー阻害は、全身注射もしくは注入を介して、または医療提供者によって別様に所望されるとおりに実施され得る。
薬学的組成物は、投与の好ましい経路に適応した多様な形態で製剤化され得る。したがって、組成物は、限定されることなく、非経口的（例えば、皮内、皮下、静脈内、経皮的、筋肉内、腹腔内等）または局部的（例えば、気管内、肺内等）を含む、公知の経路を介して投与され得る。組成物は、持続放出または遅延放出によっても投与され得る。
製剤は、単位剤形で好都合に提示され得、薬学の技術分野において周知の方法によって調製され得る。薬学的に許容される担体を用いて組成物を調製する方法は、本開示の構築物を発現するように改変されたＮＫ細胞（および／または幹細胞もしくはｉＰＳＣ）を、１種または複数の補助的成分を構成する担体と結び付けるステップを含む。一般的に、製剤は、操作された細胞を、例えば液体担体と均一にかつ／または密接に結び付けることによって調製され得る。
本明細書の構築物を発現するように改変されたＮＫ細胞（および／または幹細胞もしくはｉＰＳＣ）を含む薬学的組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、スプレー、エアロゾル、または任意の形態の混合物を含むがそれらに限定されない、任意の適切な形態で提供され得る。組成物は、任意の薬学的に許容される賦形剤、担体、またはビヒクルを有する製剤の状態で送達され得る。対象に投与される本明細書の構築物を発現するように改変されたＮＫ細胞（および／または幹細胞もしくはｉＰＳＣ）の有効量は、本明細書において論じられる様々な投薬因子に応じて変動し得る。
一部の実施形態において、方法は、例えば約１０９個細胞／対象でのもしくはそれを上回る、または約１０５個細胞／ｋｇ～約１０１０個細胞／ｋｇの用量を提供する、本開示の構築物を発現するように改変された操作された細胞の治療上有効量を対象に投与するステップを含み得るが、とはいえ一部の実施形態において、方法は、これらの域から外れる用量における操作された細胞の量を投与することによって実施され得る。
一部の実施形態において、本明細書の構築物を発現するように改変された操作された細胞を含む薬学的組成物は、例えば週あたり単回用量から複数回用量投与され得るが、とはいえ一部の実施形態において、方法は、この域から外れる頻度で薬学的組成物を投与することによって実施され得る。
いずれにしても、投与される操作された細胞の量は、投与の経路を考慮に入れるべきであり、所望の治療的目的を達成するように、十分な数の操作された細胞が導入されるであろうようなものであるべきである。一般的に、薬学的組成物は、病状の症状または臨床兆候を治療するのに有効な量および投薬レジメンで対象に投与され、それは、（限定されることなく）（任意の程度まで）それを低下させること、その進行を限定すること、それを改善すること、またはそれを解消することを含み得る。
本開示の構築物、操作された細胞、およびＮＫ細胞株は、限定されることなく、治療される対象における、腫瘍または他の標的化された細胞のサイズを低下させる、あるいは腫瘍または他のがん性もしくは悪性細胞の成長または再成長を阻止することを通じて、アデノシン過剰発現がんまたは他の疾患状態を有する対象を治療することを含む、多くの適用において使用され得る。したがって、アデノシン過剰発現がんまたは関連する疾患状態を有する対象を治療するための方法の実施形態も提供される。
免疫療法治療を使用してがんに罹患している対象を治療する方法も提供される。そのような方法は、本明細書に記載される薬学的組成物の治療有効量を対象に投与する（または投与しておく）ステップを含み得る。例えば、薬学的組成物は、標的細胞上の少なくとも１種のコグネートリガンドを標的にする少なくとも第１の結合ドメインまたはそのフラグメント（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）、ＧＤ２に特異的である少なくとも第２の結合ドメインまたはそのフラグメント（例えば、抗ＧＤ２、および任意でｓｃＦｖ）、および標的細胞のアデノシン産生またはアデノシン中間体産生細胞表面タンパク質に特異的である少なくとも第３の結合ドメインまたはそのフラグメント（例えば、抗ＣＤ７３、および任意でｓｃＦｖ）をコードするポリヌクレオチド構築物を発現する操作されたＮＫ細胞（本明細書に記載される）の集団を含み得る。本明細書に記載されるように、結び付いた結合ドメインが標的細胞に結合することによる活性化があると、操作された細胞の細胞傷害または細胞溶解活性を促進することに関わる１種または複数のドメインを含むシグナル伝達ドメインもコードされ得る。標的細胞は、例えばがん細胞（例えば、ＧＢＭ）またはＴＭＥにおける悪性細胞を含み得る。
投与ステップは、限定されることなく、静脈内に、腫瘍内に（局所的に）、非経口的に、または注入による（全身的に）を含む、これまでに記載された投与技法のいずれかを使用して実施され得る。さらに、本開示の構築物のうちの１種または複数を発現するように改変された操作された細胞を含む本明細書の薬学的組成物は、膠芽腫等のアデノシン過剰発現がんを経験している対象を治療するためのキットに集められ得る。本開示の新規の薬学的組成物と併せて、そのようなキットは、対象へのそのような組成物の投与を簡素化しかつ／または容易にするために望ましい１種または複数のツールおよび／またはデバイスをさらに含み得る（例えば、バイアル、シリンジ、チューブ類等）ことが解されるであろう。
少なくとも１つの例示的な実施形態において、がんに罹患している対象を治療する方法は、本明細書に記載される１種または複数のオートファジー阻害剤を含む、対象への付加的な治療的処置を投与する（または投与しておく）ステップをさらに含み得る。例えば、そのようなオートファジー阻害剤は、治療有効量の小分子阻害剤および／またはオートファジー経路における遺伝子の遺伝的下方調節を含み得る。少なくとも１つの例示的な実施形態において、方法は、０．０１μＭ～２００μＭの濃度で対象にクロロキンを投与する（または投与しておく）ステップを含む。付加的な治療的処置の投与は、限定されることなく全身注射または注入によるものを含めて、必要に応じて実施され得る。
方法が少なくとも二重手法（すなわち、本開示の薬学的組成物、およびオートファジー阻害剤を含む付加的な治療的処置の投与）を含む場合、両治療様態を投与する手段は同じである必要はない、または同時にもしくは同じ投薬パターンにより生じる必要はない。例えば、薬学的組成物は、静脈内に、腫瘍内に、非経口的に、または注入により投与され得、付加的な治療的処置の投与は、全身注射または注入により実施される。そのため、治療のタイミングおよび投薬量は、具体的な患者および彼のまたは彼女の病状に合わせられ得る。
さらに、本明細書の多重治療手法を容易にするキットも提供され得る。少なくとも１つの例示的な実施形態において、キットは、本開示に従った治療有効量の薬学的組成物、および治療有効量のオートファジー阻害剤を含み得る。少なくとも１つの実施形態において、そのような治療構成要素は、キット内に別個に収納される。そのような治療組成物と併せて、キットは、対象へのそのような組成物の投与を簡素化しかつ／または容易にするために望ましい１種または複数のツールおよび／またはデバイスをさらに含み得る（例えば、バイアル、シリンジ、チューブ類等）ことが解されるであろう。
任意で、方法は、対象に対する薬学的組成物を調製するステップも含み得る。例えば、任意のステップは、サンプルを取り出すまたは取り出しておくことを含み得、そのようなサンプルは、幹細胞、血液細胞、またはｉＰＳＣを含む。そのような取り出された細胞は、その後、サンプルから単離され（すなわち、末梢採血を含むサンプルの場合には、１種または複数のＮＫ細胞が単離される）、必要とされるまたは所望される場合には増大される。サンプルは、対象から得られ得（例えば、自家がん免疫療法）、養子細胞療法は、それを用いて実施される。代替的に、サンプルは、対象とは別個のドナーから提供され得る（例えば、同種療法）。少なくとも１つの実施形態において、単離、遺伝子改変、および／または任意の増大ステップは、インビトロで実施される。
方法は、単離された細胞に、本開示の構築物を含有する発現ベクターを形質導入するまたはトランスフェクトすることを含む任意のステップも含み得る。その後、所望の構築物を発現する操作された細胞の集団が達成される。次いで、そのような操作された細胞の集団は、前に記載されるように対象に投与され得る。少なくとも１つの実施形態において、そのような投与は養子細胞療法を含む。
さらに、方法は、がん、固形腫瘍の治療に対して、および／または症状もしくはそのような療法と関連した副作用を改善するもしくは排除することに関して、現在公知のもしくは後に開発される付加的な療法の投与と組み合わせられ得る（または含み得る）ことが企図される。少なくとも１つの例示的な実施形態において、方法は、前に記載されるオートファジー阻害剤を含む付加的な治療的処置を対象に投与する（または投与しておく）付加的なステップを含み得る。
そのような方法の少なくとも１つの実施形態において、本開示の構築物は、対象の単離されたＮＫ細胞に導入され、その後、形質転換されたＮＫ細胞は対象に再導入され、それによって抗腫瘍および／または抗がん応答をもたらして、対象における病状を低下させるまたは排除する。使用され得る適切なＮＫ細胞は、上に書かれており、限定されることなく血液由来ＮＫ細胞を含む。本明細書に記載の非ＮＫ細胞さえも採用され得る。当業者に周知であるように、白血球除去療法等の様々な方法が、対象からこれらの細胞を単離するために容易に利用可能である。
本明細書の構築物、操作された細胞および細胞株、薬学的組成物、ならびに方法についての様々な実施形態がかなり詳細に記載されているものの、実施形態は、単に非限定的な例として与えられる。本明細書に記載される実施形態の多くの変形および改変は、本開示を踏まえて当業者に明らかであろう。それゆえ、本開示の範囲から逸脱することなく、様々な変化および改変がなされ得、均等物がその要素に代わって置換され得ることは当業者によって理解されるであろう。実際のところ、本開示は、包括的であるまたは限定的すぎることを意図されない。本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によっておよびそれらの均等物によって規定されるべきである。
さらに、代表的な実施形態を記載する際、本開示は、ステップの特定の配列として方法および／または過程を提示しているかもしれない。しかしながら、方法または過程が、本明細書に記載されるステップの特定の順序に依存しない限り、方法または過程は、記載されるステップの特定の配列に限定されるべきではない。当業者が解するであろうように、ステップの他の配列が可能であり得る。それゆえ、本明細書に開示されるステップの特定の順序は、特許請求の範囲に対する限定として解釈されるべきではない。加えて、方法および／または過程を対称とする請求項は、書かれた順序でのそれらのステップの実施に限定されるべきではなく、当業者であれば、配列が変動し得、なおも本開示の精神および範囲内にとどまり得ることを容易に解し得る。
それゆえ、本説明および添付の特許請求の範囲は、本開示に基づいて当業者に明らかなすべての改変および変化を包含するであろうことが意図される。
腫瘍発生促進性抗原および構築物設計考慮事項
本開示の抗原標的選択は、ＧＢＭ患者サンプルにおける腫瘍発生促進性抗原の組み合わせ存在に基づいた。ＧＢＭ病理の一因となる個別の役割を有するマーカーであるＧＤ２、ＮＫＧ２ＤＬ、およびＣＤ７３の遺伝子レベル転写発現は、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）患者コホートからのＧＢＭ ＲＮＡ－ｓｅｑ患者データセット（１５６人の患者）の９６％超（１５６人中１５１人）で個々に存在することが観察され、一方で二重組み合わせは、患者サンプルの６８％で検出された。小児性、成人原発性、および成人再発性の患者由来ＧＢＭ細胞は、この発現パターンをさらに裏付けた。
低量で存在する標的抗原に対する抗原認識の強度をモジュレートすることは、乏しい抗原密度の状況において活性化シグナルを増強し得るが、それは、正常細胞上に存在するそうした抗原に対するオフターゲット毒性も強める。直接的な抗原認識（例えば、ＣＡＲに基づく活性化による）と可溶性抗体フラグメントの持続的な空間的に制御された放出とを合わせる、抗原の組み合わせを標的にすることは、潜在的オフターゲット効果を抑え、これらの抗原が経時的にまたは個々の腫瘍において発現の変更を示す、患者における標的化組み合わせを提供する。したがって、本開示に従って、少なくとも１つの例示的な実施形態において、局所的にそれらの発現レベルに応答的に抗原の異種組み合わせを標的にし得、一方で健常細胞に危害を加えない三機能性構築物を発現するようにＮＫ細胞を操作した。これらの多機能装備のＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ヒト脳微小血管内皮細胞（ｈＣＭＥＣ／Ｄ３）およびヒト皮質神経細胞（ＨＣＮ－２）を含めた、脳における正常細胞に対して明白な毒性を示さなかった（下の実施例を参照されたい）。これは、少なくとも一部には、これらの細胞上での標的化されたマーカーの少なくとも１種の低い発現によって支援される。ＧＢＭ ＴＡＰによるＣＤ７３抗体フラグメントの誘発可能な放出は、ＣＡＲ発現に依存するがその活性化から独立している持続的応答である、局所的ＴＭＥにおける低濃度のＣＤ７３をもたらし、腫瘍認識の２つの関係するが独立したメカニズムを提供する。
いくつかの調査は、健常ドナーおよびＧＢＭ患者の両方からの血液由来ＮＫ細胞の間の有意な表現型類似性を実証している。しかしながら、ＧＢＭ腫瘍常在性ＮＫ細胞の表現型および機能は、著しく変更され、活性化受容体ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ２、および２Ｂ４の有意により低いレベルによって特徴付けられる。メカニズム的には、ＧＢＭ患者は、彼ら自身の免疫抑制性ＴＭＥを利用して、免疫監視からのＧＢＭ逃避を支持した浸潤性ＮＫ細胞機能、およびＮＫ媒介性細胞傷害を損なう。これらの免疫逃避メカニズムは、ＧＢＭの不均質性に根差し、ＧＢＭ進行を促進する経路の複雑なネットワークを表す。
ＮＫＧ２Ｄ－ＮＫＧ２ＤＬ相互作用は、抗がん免疫応答を活性化することにおいて枢要な役割を果たす。しかしながら、本明細書において前で論じられるように、ＮＫ細胞の表面でのＮＫＧ２Ｄ発現は、ＧＢＭ ＴＭＥにおける外酵素ＣＤ７３によって産生されるアデノシンの高い細胞外濃度に応答して有意に減少する。その背景において、本発明者らは、ＣＤ７３が、ＧＢＭに対する重大な予後バイオマーカーであり、ＧＢＭ患者生存期間の相関因子として使用され得ることを以前に確証している。これに加えて、本開示は、ＮＫＧ２Ｄに基づくＣＡＲを発現する発明的な操作されたＮＫ細胞の使用を通じてＮＫＧ２Ｄの上方調節を誘導し得る組成物、細胞、および方法を達成し、それは、ＣＤ７３遮断との組み合わせで抗腫瘍応答を増強することが以前に示されている。しかしながら、アデノシン作動性軸を介したＮＫ細胞の免疫抑制は、活性化受容体阻害を超え、ＮＫ細胞代謝および様々なエフェクター機能を包含する。ＣＤ７３の広い発現が理由で、この酵素の標的化された遮断を局在化することが、抗ＣＤ７３療法の全身投与にとって好ましい可能性がある。
制御されかつ局在化した応答性を達成するために、ＧＢＭ ＴＭＥにおける放出の誘発があると局所的ＣＤ７３活性を遮断し得る、腫瘍応答性の局所的に放出される抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖを有するように、ＮＫ細胞を操作した。本明細書において提示されるデータは、本開示の操作されたＮＫ細胞が、細胞外アデノシンの局所濃度を低下させるだけでなく、腫瘍特異的様式でＮＫ細胞活性化の免疫抑制も低下させることを支持する。抗ＣＤ７３の持続的な低濃度の放出は、邪魔されないＣＤ７３酵素活性の状況（すなわち、ＴＭＥ）であったなら喪失されるＮＫ細胞の代謝機能を持続させる。その点で、局所的ＣＤ７３遮断との組み合わせでのＣＡＲ媒介性シグナル伝達は、がん細胞に対する細胞傷害によってだけでなく、それらの損なわれた代謝活性によっても測定可能である抗腫瘍応答をもたらし、今度は、腫瘍におけるＮＫ細胞のより長期にわたる保持を持続させる。
抗原の一時的なモジュレーションは、治療に応答しても生じる。２つのＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質（ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ）および６つのＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ１～６）を含むＮＫＧ２ＤＬの発現は、化学療法（ＴＭＺ）または照射（ＩＲ）を用いた標準的治療の後に、ＧＢＭにおいて上方調節される。下の実施例において提供されるデータによって支持されるように、ＮＫＧ２ＤＬ発現は、オートファジー阻害剤によっても調節され得、それを用いた治療は、患者由来ＧＢＭ細胞上でのＮＫＧ２ＤＬの有意な増加（ＭＦＩおよび％レベルの両方とも）を誘導し得る。ＮＫＧ２ＤＬ発現は、ＧＢＭ細胞成熟度と逆相関することが以前に見い出され、幹様ＧＢＭ細胞は、これらのリガンドの発現の不均質であるがより実質的なパターンを発現した。オートファジー阻害剤によって誘導される変化は、ＮＫＧ２ＤＬ－Ｒ軸を介したエフェクター機能に対してＧＢＭを感作し、ＣＡＲを介したＮＫＧ２Ｄ発現の誘導によって減じられ得る現象を通じて、エフェクター細胞上のＮＫＧ２Ｄの間接的喪失を促進もする。さらに、オートファジー阻害剤によって誘導されるＧＢＭ ＴＭＥの再組織化は、ＧＤ２発現の減少を含み、それは、ＧＢＭ上のガングリオシドによって誘導される腫瘍浸潤細胞に課されたアポトーシス負荷を減じる。患者ＧＢＭ腫瘍におけるグリオーマ幹様細胞に起因した療法に対する抵抗性と関連した幹細胞様特性の一部を再現するために、原発性ＧＢＭを有する患者から調達された細胞を用いて作出された患者由来異種移植片を利用した。
抗原標的化は、持続的な抗ＧＢＭ応答を誘導するのに十分でない可能性がある。臨床データは、腫瘍内ＮＫ細胞存在が、患者転帰および生存期間と正に関連することを示している。しかしながら、ＮＫ細胞はＧＢＭに低量で存在する。ＧＢＭにおける多様な病態生理学的機能を調節することの中で、ケモカイン受容体／リガンド相互作用は、それらのシグナル伝達勾配と並行してＮＫ細胞輸送を推進して、ＧＢＭへのＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２指向性ＮＫ細胞ホーミングに対して実証された応答であるホーミングの向上をもたらし得る。しかしながら、ケモカイン依存的輸送のわずかな証拠は、頭蓋内ＧＢＭにおいて示されている。本開示は、オートファジーの薬理学的標的化後の、ＧＢＭにおけるＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０ケモカイン経路の有意な関連性を明らかにしている。メカニズム的には、ＧＢＭ細胞におけるオートファジーの阻害は、ＰＩ３Ｋ／ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化を介して、ケモカイン、特にＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０の上方調節を誘発することが判定された。これは、その後、重大な走化能をＮＫ細胞に付与し、処理マウスの脳における養子移入されたＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞の著明な検出をもたらした。これらケモカインの有意な上方調節が検出されたものの、ＮＫ細胞の腫瘍内輸送への他からの寄与は、今のところ決定的には除外され得ない。逆に、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）等の免疫抑制細胞の動員へのそれらの寄与的役割に関して両方とも認識されているＣＣＬ２およびＣＸＣＬ１２の発現は、オートファジー遮断に応答して有意に減少した。本明細書において提示される前臨床的インビボデータは、オートファジーのオートファジー阻害剤媒介性標的化が、抗原レベル発現、およびＧＢＭでのアポトーシス促進性経路の活性化をモジュレートすることによるそれらの殺滅への感作を伴い得るメカニズムを介して、ＮＫ細胞の抗ＧＢＭ活性を強めることをさらに実証する。これらのデータは、オートファジーの阻害およびＣＡＲに基づく抗原標的化によって誘導される新規の実用的な応答を指し示す。本明細書において提示されるデータは、オートファジー阻害剤の投与によって誘導される、ＧＢＭ ＴＭＥの複雑でかつ洗練された再組織化も強調する。ＧＢＭ病理に対するオートファジー阻害剤の２つに分かれた効果の交絡因子が臨床的に認識されている。アジュバントとして、ＣＱ（オートファジー阻害剤の代表的な例）は、二重盲検第ＩＩＩ相研究において、抗ＧＢＭ療法に対する臨床的応答を増強することが示された。データは、ＣＱがインビボで血液脳関門を横断し得たことを支持し、一方で前臨床研究は、５０ｍｇ／ｋｇの濃度が、同所性膠芽腫異種移植片に対する投与レジメンに適切であることを実証している。
しかしながら、腫瘍負荷のみを制御する限定された能力と共に、インビボでのＧＢＭの表現型シグネチャーおよびケモカインプロファイルに対するオートファジー阻害剤の複数の効果は、ＣＡＲに基づく養子移入免疫療法をそれにもかかわらず独自に増強し得る組み合わせレジメンにおける微妙な役割を指し示す。ＣＱ等の多くのオートファジー阻害剤の潜在的毒性は、療法投与レジメンに織り込まれるべきであることが理想的である。毒性の低い代謝産物ヒドロキシクロロキンの使用は、特にＣＱと関連した毒性を和らげる１つのストラテジーである。ここで、マウスをＣＱおよびＮＫ細胞の組み合わせで処理する場合、ＮＫ細胞は頭蓋内に注入され、一方でＣＱは全身投与された。重大なことには、処理群における観察可能なＣＱ依存的毒性は観察されなかった。
本開示および関連データは、多機能性の遺伝子操作されたヒトＮＫ（ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ）細胞の開発が、ＧＢＭ ＴＭＥの腫瘍不均質性および複数の免疫抑制特質を克服する協調的な手法によって支持される有効な抗ＧＢＭ活性をもたらし得ることを実証する。本開示は、オートファジーを標的にすることが、免疫モジュレーターとして機能して、ＧＢＭ腫瘍部位へのエフェクターＣＡＲ－ＮＫ細胞のホーミングを促進し、一方で、ＣＡＲに基づく標的化への感作に対してＧＢＭ ＴＭＥをリプログラミングすることも突き止めた。実際のところ、すべての処理マウスは、腫瘍成長の遅延または完全な停止のいずれかを経験し、オートファジー阻害剤とともにＣＡＲ－ＮＫ細胞の共投与があると最も有意な応答が得られた。ＧＢＭの免疫療法におけるヒトＣＡＲ－ＮＫ細胞の使用についての実証として、データは、ヒトＣＡＲ－ＮＫ療法が実行可能な選択肢である一方で、ある特定の実施形態において、最適な応答は、養子移入の投与レジメン（regiment）、投薬量、および頻度に依存し得ることを示している。
以下の実施例は、本開示のある特定の具体的な実施形態を例示するものであり、決して本発明の範囲を限定することを意図されるものではない。
マウス
雌の６～８週齢のＲａｇ１－／－マウスおよびＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスを、パデューがん研究センター（Purdue Center for Cancer Research）で維持した。本明細書に記載されるすべての動物実験は、パデュー大学動物実験委員会によって承認された。
末梢血ＮＫ細胞の単離および細胞培養
血液サンプルを健常成人ドナーから得、ｐＮＫ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ＤｉｒｅｃｔヒトＮＫ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｎａｄａ）を使用して陰性選択によって全血から単離した。次いで、細胞を、メーカーの使用説明書に従ってＮＫ ＭＡＣＳ（登録商標）培地システム（１３０－１１４－４２９；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して培養しかつ増大させた。ＮＫ－９２細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から直接購入した）を、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、４００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２、および０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノールを補足されたＲＰＭＩ１６４０中で維持した。ＨＣＮ－２細胞（ＡＴＣＣから直接購入した）を、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足されたＤＭＥＭ中で維持した。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞（パデュー大学、Ｉｎｄｉａｎａ）を、５％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１．４μＭヒドロコルチゾン、５μｇ／ｍＬアスコルビン酸、１％化学的に規定された脂質濃縮液（chemically defined lipid concentrate）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを補足されたＥＢＭ－２中で成長させた。ＳＪ－ＧＢＭ２、ＧＢＭ４３、およびＧＢＭ１０細胞（Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｉｎｄｉａｎａ）を、１０％ ＦＢＳおよび１％ ＨＥＰＥＳを補足されたＤＭＥＭ中で成長させた。すべての細胞株を、加湿した５％ ＣＯ２環境において３７℃でインキュベートした。
化学試薬
クロロキン二リン酸塩（ＣＱ）（９８％）およびアデノシン５’－一リン酸ナトリウム塩水和物（ＡＭＰ）（９９％）を、ＡＣＲＯＳ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（商標）（Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から購入した。ヒドロコルチゾン（９８％）を、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から購入した。アスコルビン酸、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から購入した。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、アデノシン（９９％以上）、ＤＥＡＥ－エキストラン塩酸塩、およびグルコースを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入した。ブレフェルジンＡ溶液１０００×およびモネンシン溶液１０００×を、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。Ｄ－ルシフェリンカリウム塩（９９％超）を、Ｓｙｄ Ｌａｂｓ（Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から購入した。ＬＹ２９４００２、ＢＡＹ１１－７８２、およびＳＰ６００１２５を、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）から購入した。胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）から購入した。組み換えヒトインターロイキン－１２（ＩＬ－２）は、Ａｋｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ）から譲渡された。組み換えヒトインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）および線維芽細胞成長因子－塩基性（ｂＦＧＦ）を、ＧｏｌｄＢｉｏ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入した。組み換えヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）を、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から購入した。組み換えヒトＣＸＣＬ１０、組み換えヒトｕ－プラスミノーゲン活性化因子／ウロキナーゼ、ＣＦ（ｕＰＡ）、および組み換えヒトＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３１４ Ｆｃキメラを、Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）から購入した。ビオチン－プロテインＬを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から購入した。ＢｓｉＷＩを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から購入した。ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液１００×（ＰＳ）、２－メルカプトエタノール（５０ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１Ｍ）、化学的に規定された脂質濃縮液、トリパンブルー溶液、およびトリプシン－ＥＤＴＡを、Ｇｉｂｃｏ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から購入した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ 血清低減培地（Reduced Serum Media）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。ＥＢＭ－２を、Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ ＡＧ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。ヒトＡＢ血清を、Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。コラーゲンＩ、ラット尾部を、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）から購入した。ＲＩＰＡ溶解バッファーシステム（ｓｃ－２４９４８）を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘａｓ）から購入した。
プラスミド構築およびレンチウイルス（Lentvirus）産生
下の（１）（２）（３）および（４）は、特注でクローニングされ、ｖｅｃｔｏｒｂｕｉｌｄｅｒ．ｃｏｍによって産生された。（５）をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘａｓ）から購入した。（６）をＧｅｎＴａｒｇｅｔ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。
（１）ｐＴ７［ｍＲＮＡ］－ＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ：このプラスミドにおいて、ヒトＮＫＧ２Ｄ特異的ＣＡＲ（ＮＫＧ２Ｄ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ；下で構築物１Ｂとして識別される）を、Ｔ７プロモーターの制御下で発現させた。ＮＫＧ２Ｄ配列は、以前の仕事に由来した。
（２）ｐＴ７［ｍＲＮＡ］－ＧＤ２－ＣＡＲ：このプラスミドにおいて、ヒトＧＤ２特異的ＣＡＲ（抗ＧＤ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ｈＣＤ２８－ＣＤ３ζ；下で構築物１Ａとして識別される）を、Ｔ７プロモーターの制御下で発現させた。抗ＧＤ２ ｓｃＦｖ配列は、以前の仕事に由来した。
（３）ｐＴ７［ｍＲＮＡ］－ＣＤ７３－ＣＡＲ：このプラスミドにおいて、ヒトＣＤ７３特異的な切断可能な抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖ、ヒトＧＤ２特異的ＣＡＲ（ＧＤ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ｈＣＤ２８－ＣＤ３ζ；構築物１Ａ）およびヒトＮＫＧ２Ｄ特異的ＣＡＲ（ＮＫＧ２Ｄ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ；構築物１Ｂ）を含む構築物全体を、Ｔ７プロモーターの制御下で発現させた。ここで、抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖフラグメントを、配列番号１を含むリンカー、切断可能なペプチドフラグメント（配列番号２）、および短いスペーサー（ＧＳＳＧＴ）を通じて、ＧＤ２－ＣＡＲと共役させた。ＧＤ２－ＣＡＲを、「自己切断」Ｐ２Ａペプチド（配列番号４）を通じて、ＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲと結び付けた。抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖ配列は、以前の仕事に由来した。
（４）ｐＬＶ［Ｅｘｐ］－Ｐｕｒｏ－ＥＦ１Ａ＞｛ＣＤ７３－ＣＡＲ｝：（３）に記載される構築物全体（構築物１）をコードするレンチウイルスベクターを、ＥＦ１アルファプロモーターの制御下で発現させた。
（５）ベクリン１（ＢＥＣＮ１）ｓｈＲＮＡ（ｈ）レンチウイルス粒子（ｓｃ－２９７９７－Ｖ）：ＢＥＣＮ１遺伝子ノックダウンＢＥＣＮ１－ＧＢＭ４３細胞を、メーカーのプロトコールに従って、レンチウイルス形質導入によって作出した。
（６）ＣＭＶ－ルシフェラーゼ（ホタル）、（Ｐｕｒｏ）レンチウイルス粒子（ＬＶＰ３２５）：ホタルルシフェラーゼ標識ＧＢＭ４３：ＧＢＭ４３（Ｌｕｃ）細胞を、メーカーのプロトコールに従って、ルシフェラーゼを持つレンチウイルスベクターを用いたレンチウイルス形質導入によって作出した。
材料
表１は、本明細書に記載される実験において使用された抗体および染色剤を列挙しており、本開示に記載されるアッセイキットおよびプライマーは下に列挙される。
Figure 2022553292000005
以下のアッセイキットを、本明細書に記載される実施例において使用した：
（１）ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－ｍＲＮＡトランスフェクションキット（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；
（２）ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ＤｉｒｅｃｔヒトＮＫ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）；
（３）ヒトＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ） Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ－ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標）Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎｄ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；
（４）ヒトＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０） Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ－ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標）Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎｄ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；
（５）Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎリン酸アッセイキット（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；
（６）アデノシンアッセイキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；
（７）ｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；
（８）ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキット（テーリングあり）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）；
（９）ＥＺ－１０スピンカラムＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎキット（Ｂｉｏ Ｂａｓｉｃ Ｉｎｃ．、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）；
（１０）ｑＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ｑＲＴ－ＰＣＲキット、低ＲＯＸ（商標）（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）；
（１１）固定／透過処理溶液キット（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；
（１２）７－ＡＡＤ／ＣＦＳＥ細胞媒介性細胞傷害アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）
以下のＲＴ－ＰＣＲプライマーを、本明細書に記載される実施例において使用した：ヒトＣＣＬ５ ｑＰＣＲプライマーペア（ＨＰ１００７８４）、ヒトＣＸＣＬ１０ ｑＰＣＲペア（ＨＰ１００６９０）、ヒトＣＣＬ２ ｑＰＣＲプライマーペア（ＨＰ１０４８５４）、ヒトＣＸＣＬ９ ｑＰＣＲプライマーペア（ＨＰ１００７７３）、およびヒトＣＸＣＬ１２ ｑＰＣＲプライマーペア（ＨＰ１００１９２）を、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＵＳ Ｉｎｃ．（Ｃｈｅｓｔｅｒｂｒｏｏｋ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から得た。ＧＡＰＤＨを内因性対照として使用した。そのプライマーであるプライマー１（配列番号４）およびプライマー２（配列番号５）を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）から得た。ＲＴ－ＰＣＲアッセイにおいて使用されたプライマーのすべてを、メーカーの使用説明書に従って使用した。
統計解析
データは、本明細書において平均±ＳＥＭとして提示されている。すべての調査に関する統計解析を、Ｅｘｃｅｌ ２００７ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ ２００７）を使用して実施し、２つの正規分布した試験群間の比較を、両側スチューデントｔ検定を使用して実施した。３つ以上の群の解析に関しては、一元配置ＡＮＯＶＡ解析を使用して比較を実施した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であると見なした。
[実施例１]
多機能性の応答性のＣＡＲに基づく構築物を用いて操作されたＮＫ細胞は、ヒトＧＢＭに広く存在する複数の抗原を標的にし得る
ＮＫ細胞に相当する遺伝子、ならびにＧＢＭにおける様々な腫瘍発生促進性または抗腫瘍発生リガンドおよび標的をコードする一連の機能的遺伝子の発現プロファイルの間の任意の相関を同定するために、遺伝子セット採点法を使用して、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｄａｔａ Ｃｏｍｍｏｎｓを通じてＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）からのＧＢＭ ＲＮＡ－ｓｅｑ患者データセット（１５６人の患者）を検討し、ある特定の機能的遺伝子の発現とＮＫ細胞存在との間の関係性を同定した。そのような機能的遺伝子には、限定されることなく、ＮＫ細胞シグネチャー遺伝子セット（例えば、ＮＣＲ１、ＮＣＲ３、ＫＬＲＢ１、ＣＤ１６０、およびＰＲＦ１を含む）、ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３をコードする）、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１（ＧＤ２を産生する酵素をコードする）、ＭＩＣＡ／Ｂ（ＮＫＧ２Ｄに対する共通のリガンドをコードする）、ならびにＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０（２種の名を冠したケモカインをコードする）が含まれた。
選択された遺伝子の正規化された発現（ＦＰＫＭ）の間の線形相関を、ｃｏｒｒｐｌｏｔ Ｒパッケージを使用して判定した。ＧＢＭ患者（Ｎ＝１５６）を、高および低発現に対するカットオフとしてそれぞれ上位四分位点および下位四分位点を使用して、それぞれ個々の遺伝子（Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、およびＮＴ５Ｅ）の発現に基づいて高／低群に分類した。高発現群が関心対象であり、４種の遺伝子のうちの少なくとも１種の高発現を有する患者の数を使用して、ベン図を作った（図１、下位区分Ｃを参照されたい）。
ＮＴ５ＥおよびＢ４ＧＡＬＮＴ１それぞれは、ＧＢＭにおけるＮＫシグネチャーセットを表した個々の遺伝子との負の相関を有し、これらの遺伝子によってコードされる抗原が、ＧＢＭにおいてＮＫ細胞機能および増殖を抑制するように作用することを示唆した。代替的に、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＣＬ５、およびＣＸＣＬ１０をコードする、ＮＫＧ２Ｄリガンドを含めた、ＮＫエフェクター応答を推進することが公知である遺伝子は、個々のＮＫシグネチャー遺伝子との正の相関を示した（ｒ＜０）（図１、下位区分Ａを参照されたい）。
５０％上位および下位四分位点に基づく高／低群へのＧＢＭ患者の分類（ＴＣＧＡ ＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用した）は、これらの知見をさらに支持し、１５６人の患者中１５１人が、４種の標的化された遺伝子ＮＴ５Ｅ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＭＩＣＡ、またはＭＩＣＢのうちの少なくとも１種を過剰発現することを同定した。特異的遺伝子の高発現を有するＧＢＭ患者のデータを使用した、ＮＫシグネチャー遺伝子セットに対するエンリッチメント解析は、ＮＴ５ＥおよびＢ４ＧＡＬＮＴ１遺伝子に対して発現の負の相関（ＮＥＳ＜１）、ならびにＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ、ＣＸＣＬ１０、およびＣＣＬ５遺伝子に対して正の相関発現（ＮＥＳ＞１）を示した（図１、下位区分Ｂ、および表２を参照されたい）。
Figure 2022553292000006
患者数の間の遺伝子発現の関連を示したベン図は、複数の遺伝子組み合わせを発現する患者の相当数および予想されるより低い数を示す（図１Ｃ～１Ｄを参照されたい）。
２種の腫瘍発生促進性マーカーＧＤ２およびＣＤ７３は、患者由来の原発成人性（ＧＢＭ４３）、小児性（ＳＪ－ＧＢＭ２）、および再発成人性（ＧＢＭ１０）脳腫瘍細胞を含めた、種々のタイプのＧＢＭ上で広くかつ不均一に発現される（図１、下位区分Ｅを参照されたい）。これらの中で、外酵素ＣＤ７３は、負の予後因子であることが以前に実証された。
逆に、強力な活性化ＮＫ細胞受容体ＮＫＧ２Ｄに対するコグネートリガンドもＧＢＭに高度に存在するが、とはいえＮＫＧ２Ｄは、ＴＭＥにおいてしばしば下方調節される。このことを検証するために、ｐＮＫ細胞を、５００μＬ培地中にて５×１０５個細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。次いで、アデノシンを１０００μＭの最終濃度で添加した。２４時間後、細胞を回収し、それらの生存率（％）をＣＣＫ－８アッセイにより判定した（図２の下位区分Ａ）。ＮＫＧ２Ｄ発現（％およびＭＦＩ）をフローサイトメトリーによって判定した（図２の下位区分Ｂ）。図２に示されるように、アデノシンの存在は、細胞生存率に対して明確な負の影響を有し、ＮＫＧ２Ｄの発現を同様に減少させた。これらの知見は、操作を通じて、ＮＫ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現を増加させる必要性があることを支持する。
これらのＧＢＭ抗原の応答性でかつ組み合わせの標的化を達成するために、２シストロン性ベクターを、まず、２種の個々のＣＡＲを同時に発現するように操作し、ＧＤ２．ＣＤ２８．ＣＤ３ζ ＣＡＲ（構築物１Ａ）およびＮＫＧ２Ｄ．ＤＡＰ１０．ＣＤ３ζ ＣＡＲ（構築物１Ｂ）の両方を発現するＮＫ細胞を産出した。次いで、構築物１Ａを、抗ＣＤ７３ｓｃＦｖとともに、切断可能な腫瘍感受性リンカーの後に縦列でさらに操作して、ＣＤ７３－ＧＤ２．ＣＤ２８．ＣＤ３ζ－ＣＡＲ（構築物１）を作出し（図３～４を参照されたい）、ＣＡＲ活性化から独立した、ＧＢＭ ＴＭＥにおけるＣＤ７３遮断抗体フラグメントの局在的放出のために構成された構築物をもたらした。
次いで、構築物１Ｂ（図５、下位区分Ａ）、切断可能な抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖを組み入れた構築物１Ａ（ＣＤ７３－ＧＤ２．ＣＤ２８．ＣＤ３ζ－ＣＡＲ）（図５、下位区分Ｆ）、および全体の構築物を持つ多機能性ＣＡＲ（構築物１；図５、下位区分Ｋ）を含めた、各要素の別個の型を作出することによって、多機能性構築物１の個々の遺伝子構成要素の機能性を評価した。
各ＣＡＲをＮＫ－９２細胞に別個に発現させ、相当するＣＡＲ構造の発現を検証した（図５、下位区分Ｂ、Ｇ、およびＬ）。より具体的には、プラスミド（１）、（２）、および（３）（上で言及された）に個々に由来するｍＲＮＡを、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキット（テーリングあり）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）により合成した。すべてのｍＲＮＡ産物を、ＥＺ－１０スピンカラムＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎキット（Ｂｉｏ Ｂａｓｉｃ Ｉｎｃ．、Ｍａｒｋｈａｍ、Ｃａｎａｄａ）により濃縮しかつ精製した。その後、それらの濃度を、Ｑｕｂｉｔ ４蛍光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して測定した。
種々のＣＡＲ構築物の発現を有する操作されたＮＫ－９２細胞を作出するために、メーカーの推奨プロトコールに従って、ＮＫ－９２細胞に、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－ｍＲＮＡトランスフェクションキット（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）によりｍＲＮＡをトランスフェクトした。簡潔には、ＮＫ－９２細胞を１２ウェルプレートに播いた（１ｍＬ完全成長培地中５×１０５個細胞／ウェル）。ｍＲＮＡ（１μｇ）を、滅菌ポリスチレンチューブ中Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（１００μＬ）に添加し、ウェルを混合した。その後、ｍＲＮＡ Ｂｏｏｓｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（３μＬ）およびＴｒａｎｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（３μＬ）を添加し、逐次的に混合した。チューブを室温で５分間インキュベートし、複合体を細胞に液滴で添加した。トランスフェクションの後、細胞を３７℃および５％ ＣＯ２で４８時間インキュベートし、次いでＣＡＲ構造発現判定のために回収した。
ＮＫＧ２Ｄ発現（構築物１Ｂおよび／または構築物１の発現）のレベルによりトランスフェクション効率を測定するために、細胞をＡＰＣコンジュゲートＮＫＧ２Ｄ抗体で染色し、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６ Ｐｌｕｓ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を使用してフローサイトメトリーによって解析した。
ＧＤ２．ＣＡＲ発現（構築物１Ａおよび／または構築物１の発現）の検出に関しては、細胞を、ビオチン－プロテインＬおよびＡＰＣ－ストレプトアビジンで逐次的に染色し、ＧＤ２．ＣＡＲ発現のレベルをフローサイトメトリーによって解析した。全体のＣＡＲ構築物（構築物１）を発現するＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ＮＫ－９２細胞に関しては、細胞を様々な濃度のｕＰＡとともにインキュベートして、細胞表面およびＣＡＲ構築物の残部からの抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖの除去を誘発することによって、抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖの発現を判定した。この後、細胞をビオチン－プロテインＬおよびＡＰＣ－ストレプトアビジンで染色した。次いで、残りの構築物の発現をフローサイトメトリーによって解析した。トランスフェクション後の細胞生存率を、ＣＣＫ－８アッセイ解析（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）によって測定した。
図５、下位区分Ｃ、Ｈ、およびＭに示されるように、すべての場合に、ＣＡＲ発現ＮＫ細胞は高い生存率（９５％超）を保持した。それと同時に、ＮＫ細胞上での堅牢な構築物１Ｂ発現を達成し（約４４％）（図５、下位区分Ｄを参照されたい）、構築物１Ｂを発現する細胞は、トランスフェクトされていない細胞と比較して、ＧＢＭ４３細胞のより高い細胞傷害活性を示した（図５、下位区分Ｅ）。構築物１Ａに関して同様の発現を達成し（約４２％）（図５、下位区分Ｉを参照されたい）、患者由来ＧＢＭ標的細胞に対する相応により高い細胞傷害を有した（図５、下位区分Ｊを参照されたい）。このデータは、構築物１Ａが、ＧＤ２発現ＧＢＭ細胞を有効に認識し得かつ排除し得ることを裏付ける。
完全な多機能性配列（構築物１）を発現するように操作した場合、ＮＫ－９２細胞は、ＮＫＧ２Ｄ発現（図５、下位区分Ｎ）、抗ＧＤ２ ｓｃＦｖ発現、および抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖ発現（図５、下位区分Ｏ）の有意な増加を示した。
ＮＫ－９２細胞と比較して、健常ドナーの末梢血に由来する初代ＮＫ（ｐＮＫ）細胞は、一般的に、患者由来ＧＢＭ標的細胞に対するより高い溶解活性を有する。患者由来ＧＢＭ４３細胞が、複数のドナーから回収されかつその後構築物１を発現するように操作されたｐＮＫ細胞によって殺滅され得ることを検証するために、ｐＮＫ細胞を健常成人ドナーから単離し（図５、下位区分Ｐ、および図６）、全体の多機能性構築物１（ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ）を発現するように、ＤＥＡＥ－デキストランの存在下でレンチウイルス形質導入によって操作した。
サイトカイン活性化ｐＮＫ細胞（ＮＫ－ＭＡＣＳ（登録商標）培地中での培養の１週間活性化された）を、デキストランの助けを借りて、２ラウンドのレンチウイルス形質導入にわたって、機能的ＣＡＲを発現するように操作した（ｐＬＶｐ［Ｅｘｐ］－Ｐｕｒｏ－ＥＦ１Ａ＞｛ＣＤ７３－ＣＡＲ｝）。簡潔には、ｐＮＫ細胞を２４ウェルプレートに播いた（１０％ ＦＢＳおよび５００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２を補足された０．５ｍＬ ＲＰＭＩ１６４０培地中５×１０５個細胞／ウェル）。レンチウイルス上清を１０感染多重度（ＭＯＩ）で添加し、その後、デキストラン水溶液を８μｇ／ｍＬの最終濃度に添加した。各プレートを１０００ｇで６０分間遠心分離し、５％ ＣＯ２を注入された３７℃インキュベーターにて一晩インキュベートした。トランスフェクションの後、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞を回収し、さらなる使用までＮＫ－ＭＡＣＳ（登録商標）培地の下で増大させた。次いで、すべての構築物の発現レベルを、上記のプロトコールに従ってフローサイトメトリーによって測定しかつ解析した。トランスフェクション後の細胞生存率を、トリパンブルー染色によって測定した。
２ラウンドの形質導入の後、ドナーＮＫ細胞の生存率の予想されるドナー特異的下降（図５、下位区分Ｏ、および図６）は、ＮＫＧ２Ｄ、抗ＧＤ２ ｓｃＦｖ、および抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖの有意に増加した発現を伴った（図５、下位区分ＲおよびＳ、ならびに図６）。さらに、構築物１を発現するＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞は、フィーダーの使用なしで商業的ＮＫ－ＭＡＣＳ（登録商標）培地中で２週間にわたって実質的に増大し得、一方で安定な遺伝子発現を保持した（図５、下位区分Ｔを参照されたい）。
集合的に、これらの結果は、組み合わせＧＢＭ標的としてのＣＤ７３、ＧＤ２、およびＮＫＧ２ＤＬの使用を立証し、ＮＫ細胞に基づくＧＢＭ免疫療法に対するそれらの使用を検討するための論理的根拠を提供する。
[実施例２]
多機能性の操作されたＮＫ細胞は、患者由来ＧＢＭ細胞を標的にし、一方で正常細胞に危害を加えない
殺滅効力を調べるために、殺滅アッセイを、ＮＫ－９２、ＮＫＧ２Ｄ．ＣＡＲ－ＮＫ９２（構築物１Ｂ）、ＧＤ２．ＣＡＲ－ＮＫ９２（構築物１Ａ）、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ＮＫ９２（構築物１）、ｐＮＫ、またはＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞のいずれかとともに利用し、これらの細胞を、種々の標的細胞（ＳＪ－ＧＢＭ２、ＧＢＭ４３、ＧＢＭ１０、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３、およびＨＣＮ－２）とともに様々なＥ：Ｔ比で４時間共培養した。殺滅活性に対する抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖ部分の効果を評価するために、構築物全体の発現を有するＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ＮＫ９２またはＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞のいずれかをｕＰＡとともにインキュベートして、表面からすべての抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖを除去した。その後、ＧＢＭ４３標的細胞に対するこれらの細胞の殺滅能を測定した。
脱顆粒を調べるために、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ＮＫ９２またはＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞のいずれかを、公知の技法に従って、ＡＰＣ－ＣＤ１０７ａ抗体およびモネンシンの存在下でＧＢＭ４３細胞とともに４時間共培養した（Ｅ：Ｔ＝５：１）。ＣＤ１０７ａ（％およびＭＦＩ）の検出をフローサイトメトリーによって行った。
ＩＦＮ－γ産生を調べるために、公知のプロトコールに従い、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ＮＫ９２またはＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞のいずれかを、ブレフェルジンＡの存在下でＧＢＭ４３細胞とともに４時間共培養した（Ｅ：Ｔ＝５：１）。次いで、細胞を回収し、洗浄し、固定し／透過処理し、その後ＡＰＣ－ＩＦＮ－γ抗体で染色し、フローサイトメトリーによって検出した。
ＣＤ７３活性、およびアデノシンを生成するその能力を調べるために、ＧＢＭ４３細胞を、完全ＤＭＥＭ中にて９６ウェルプレートにウェルあたり２×１０４個細胞で播種した。一晩のインキュベーション後、ＧＢＭ４３細胞を、６時間のインキュベーションの間のＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ＮＫ９２またはＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞のいずれかからのｕＰＡ（１００ｎＭ）媒介性切断後の抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖとともにインキュベートした。次いで、細胞培地を除去し、細胞をリン酸塩不含バッファー（ｄｄＨ２Ｏ中に希釈された１１７ｍＭ ＮａＣｌ、５．３ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＭｇＣｌ２、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）を用いて３回リンスした。リン酸塩不含バッファー中に希釈されたＡＭＰ（２５０μＭ最終）を添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。最後に、ＡＭＰ加水分解により生じるリン酸（Ｐｉ）濃度を、メーカーの使用説明書に従って、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎリン酸アッセイキットを使用して測定した。
ＧＢＭ細胞に応答した、ＮＫ細胞上でのＣＤ１６およびＮＫＧ２Ａ発現の変化（すなわち、ＮＫ細胞表現型変化）を調べるために、ＣＦＳＥ標識ＧＢＭ４３細胞を、まず、完全ＤＭＥＭ中にて２４ウェルプレートにウェルあたり４×１０４個細胞で播種した。一晩のインキュベーション後、ｐＮＫまたはＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞のいずれかを添加し４時間おいた（Ｅ：Ｔ＝５：１）。次いで、細胞を回収し、洗浄し、ＡＰＣ－ＣＤ１６またはＡＰＣ－ＮＫＧ２Ａ抗体のいずれかで染色し、発現をフローサイトメトリーによって測定した。
対照ＮＫ－９２細胞と比較して、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ＮＫ９２細胞（構築物１を発現する）は、様々なＥ／Ｔ比で、４時間後にＧＢＭ４３細胞の有意に向上した殺滅を示した（図７、下位区分Ａ）。さらに、ＧＢＭ４３細胞との共培養は、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ＮＫ９２細胞を刺激して、細胞表面ＣＤ１０７ａ発現によって測定される脱顆粒を誘導し（図７、下位区分Ｂ）、ＩＦＮ－γ分泌を上方調節した（図７、下位区分Ｃ）。
ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ＮＫ９２細胞をｕＰＡ（１００ｎＭ）で処理して、抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖを解放した後、殺滅されたＧＢＭ４３の数は減少した（図７、下位区分Ｄ）。付加的に、切断された抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖは、ＧＢＭ４３細胞による細胞外アデノシンの有意に減少した産生をもたらし（図７、下位区分Ｅ、および図８）、ＧＢＭに対するＣＤ７３の酵素的能力が損なわれたことを示した。付加的に、このデータは、抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖが、ＣＤ７３に対して機能的でかつ特異的であり、アデノシン蓄積を破棄し得ることを裏付ける。
付加的に、多機能性構築物１（ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ）を発現するように遺伝子操作されたヒト末梢血由来ＮＫ細胞は、対照の操作されていないＮＫ細胞のものよりも有意に高いレベルまで、ＳＪ－ＧＢＭ２（小児性）、ＧＢＭ４３（成人性）、およびＧＢＭ１０（再発性）細胞の効率的な殺滅を同様にもたらした（図６および図７、下位区分Ｆ～Ｈを参照されたい）。天然または操作されたＮＫ細胞によるＧＢＭ標的の殺滅についてのライブイメージングは、この過程の動力学的性質、および天然ヒトＮＫ細胞によるものと比較して、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞によるＧＢＭ細胞のより高い殺滅特異性を実証する（図９を参照されたい；ＧＢＭ細胞を、４×１０４個細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。一晩の培養後、ｐＮＫまたはＣＤ７３．ｍ．ＣＡＲ－ｐＮＫ細胞のいずれかを、５のＥ／Ｔ比に添加した。次いで、共培養物を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３を使用して撮像し、スキャンは４時間の間１０分ごとに実施された）。
ＧＢＭ細胞による刺激は、有意に増加したＮＫ細胞脱顆粒、およびＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞によるＩＦＮ－γの細胞内産生に寄与した（図７、下位区分ＩおよびＪ）。ｕＰＡ処理後の抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖを欠くＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ＮＫ細胞は、２．５および５のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で４時間の共培養の後に、標的ＧＢＭ４３細胞の有意に減少した細胞傷害能を呈した（図７、下位区分Ｋを参照されたい）。加えて、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞から切断された抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖを用いた処理の後、ＧＢＭ４３細胞は、活性ＣＤ７３の喪失に起因して、アデノシンを産生する有意に低下した能力を示した（図７、下位区分Ｌ）。
したがって、多機能性構築物の遺伝子発現による、ＮＫ細胞に与えられた抗腫瘍特異性は、ＧＢＭに応答した、操作されていないヒトＮＫ細胞に関して観察された変化と比較して、ＧＢＭ細胞との接触後のＣＤ１６の喪失に対する抵抗性の増強（図７、下位区分Ｍ）、ならびにＮＫＧ２Ａの上方調節の低下（図７、下位区分Ｎ）をもたらした。
最後に、非腫瘍組織上でのこれらの抗原の任意の潜在的発現の多特異的標的化に起因した任意の潜在的オフターゲット効果に対処するために、健常細胞を標的にするＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞の能力も、本明細書に記載されるプロトコールを使用して評価した。ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞は、正常細胞、具体的にはｈＣＭＥＣ／Ｄ３およびＨＣＮ－２細胞を含めた神経系統に属するものを優先的に殺滅しなかった。その代わりに、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞は、健常脳細胞に対する対照の操作されていないｐＮＫ細胞のものに匹敵するエフェクター活性を呈した（図７、下位区分ＯおよびＰを参照されたい）。
例えば阻害性リガンド発現の個別のパターンを含めた複数のメカニズムが、そのような細胞の標的化に関わり得るものの、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞によって誘導される低い細胞傷害率は、ＧＢＭ細胞と比較して、これらの細胞上の標的化されたリガンドに関する相対的により低い発現プロファイルに起因し得た（図１０を参照されたい）。まとめると、これらの観察結果は、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞の機能的優位性を示し、正常細胞への観察可能な毒性のない高度に特異的な抗ＧＢＭ免疫療法に対する有望な道を表す。
[実施例３]
ＧＢＭにおけるオートファジーの機能的標的化は、ＮＫ活性およびホーミング（Ｈｏｎｉｎｇ）を増強する
オートファジーは、がんの発症および進行につながりかつ推進する肝要な細胞生存メカニズムである。療法に対するＧＢＭ抵抗性を推進する、および免疫細胞治療に対するＧＢＭの感作を確立するその能力に手を加えるために、ＧＢＭにおけるオートファジーを遮断する効果を、２つの手法により検討した。一方の調査では、ノックダウン患者由来ＧＢＭ細胞（ＢＥＣＮ１－ＧＢＭ４３）の作出によるＢＥＣＮ１遺伝子の標的化を通じて、オートファジーを遺伝子的に遮断した。より具体的には、ＧＢＭ４３細胞を、前に記載されるように成長させた。レンチウイルスＢＥＣＮ１ ｓｈＲＮＡ粒子を、メーカーの使用説明書に従って使用して、ＢＥＣＮ１－ ＧＢＭ４３細胞を作出した。ＢＥＣＮ１－ ＧＢＭ４３のインビトロ成長挙動を、ＣＣＫ８アッセイ解析により検証した。
代替的に、一般的なＦＤＡ承認のオートファジー阻害剤であるクロロキン（ＣＱ）を用いた処理により、オートファジーを薬理学的に阻害した（図１１を参照されたい）。これらの標的化手法を、ＮＫ細胞浸潤およびエフェクター機能の両方に対して調べた。この手法に関しては、ＧＢＭ４３細胞を、種々の濃度のＣＱで処理した。ＣＱに応答したインビトロ細胞生存率を判定するために、ＧＢＭ４３細胞を、１×１０４個細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。一晩の培養後、細胞を、種々の濃度のＣＱで処理し、もう２４時間インキュベートした。次いで、細胞生存率を、ＣＣＫ－８アッセイ解析を用いて判定した。
細胞溶解物を、メーカーの使用説明書に従って、ＲＩＰＡ溶解バッファーシステムを使用して調製した。その後、サンプルをランし、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から提供されたａｕｔｏ－ｗｅｓｔｅｒｎサービスにより解析した。標的オートファジーマーカーには、ＢＥＣＮ１、ＬＣ３Ｂ、ｐ６２、およびβ－アクチンが含まれる（ベクリン１（ＢＥＣＮＩ）、ＬＣ３－ＩＩ（ＬＣ３Ｂ）、およびｐ６２は、オートファジーの３種の主たるマーカーである）。
重大なことには、すべての場合において、ＣＱの投与は、２４時間後にＧＢＭ４３細胞の生存率および増殖を用量依存的様式で損なった（ＩＣ５０＝６７．１０μＭ；図１２、下位区分ＡおよびＢを参照されたい）。
ケモカインとそれらのコグネート受容体との間の勾配は、より高い濃度を有する部位への細胞の指向性移動を開始させて、腫瘍への免疫細胞輸送を最終的に調節する。ＧＢＭへのＮＫ細胞のケモカイン媒介性輸送についての洞察が少ないことに刺激されて、腫瘍へのＮＫ細胞輸送と関連していることが公知のいくつかのケモカインの発現レベルに対する、ＧＢＭにおけるオートファジーを阻害することの影響を調査した。
ＲＮＡ抽出およびＲＴ－ＰＣＲ
総ＲＮＡを、ｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キットを使用して抽出し、濃度を、Ｑｕｂｉｔ ４蛍光光度計を用いて判定した。各サンプルからのＲＮＡ（８０ｎｇ）を、ＶｉｉＡ－７ ＲＴ－ＰＣＲシステムにおけるｑＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ｑＲＴ－ＰＣＲキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して逆転写した。ＧＡＰＤＨ遺伝子を内因性対照として使用した。関心対象の遺伝子の比較Ｃｔ値を、ＧＡＰＤＨのＣｔ値に対して正規化した。２－Δｃｔ法を使用して、遺伝子の相対的発現を判定し、一方で２－ΔΔｃｔ法を使用して、対照と比べた遺伝子発現の変化倍率を算出した。
ＢＥＣＮ１－ＧＢＭ４３およびＣＱ処理ＧＢＭ４３細胞の両方とも、それらのｍＲＮＡの有意な増加によって測定される、転写レベルにおけるＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０の実質的な上方調節をもたらした（図１２、下位区分ＣおよびＤ）。それと同時に、ケモカインＣＣＬ２およびＣＸＣＬ１２は、オートファジーの阻害があると、ＧＢＭ４３細胞上での転写レベルの減少を示した（図１３）。
ＥＬＩＳＡ測定
これらケモカインのタンパク質レベルの変化を評価するために、および根底にある分子メカニズムについてのより多くの洞察を得るために、ケモカイン濃度を、これらケモカインに対するシグナル伝達経路を推進する様々な薬理学的阻害剤の非存在および存在下で、ＣＱ処理ＧＢＭ４３細胞の馴化培地においてＥＬＩＳＡを使用して定量化した。これには、ＰＩ３Ｋ阻害剤のＬＹ２９４００２、ＮＦ－κＢ阻害剤のＢＡＹ１１－７０８２、およびＪＮＫ阻害剤のＳＰ６００１２５が含まれた。
より具体的には、分泌されたＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０を測定するために、ＧＢＭ４３細胞を、ＬＹ２９４００２、ＢＡＹ１１－７０８２、およびＳＰ６００１２５を含めた様々な小分子阻害剤の存在または非存在下で、５０μＭの最終濃度のＣＱで２４時間処理した。上清を回収し、ＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０のレベルを、メーカーの指示に従ってヒトＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ－ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標）Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔを使用して定量化した。ＧＢＭ４３細胞からの複数のケモカイン分泌のレベルを見るために、細胞培養上清も回収し、すべての選択された標的を、Ｅｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｌｇａｒｙ、Ｃａｎａｄａ）によって提供されるケモカインアレイを用いて判定した。
対照ＧＢＭ４３細胞の馴化培地は、ＣＣＬ２（１３２４．９５ｐｇ／ｍＬ）およびＣＸＣＬ１２（６９．２ｐｇ／ｍＬ）のそれらの発現と比較して、ＣＣＬ５（１２．５５ｐｇ／ｍＬ）およびＣＸＣＬ１０（２１．０３ｐｇ／ｍＬ）の両方の相対的に低いレベルを呈した（図１４、特にその下位区分Ｂを参照されたい）。しかしながら、ＣＱ処理ＧＢＭ４３細胞は、全体にわたって、未処理の対照細胞と比較して有意により高い量のＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０の両方を分泌した（図１２、下位区分４Ｅおよび４Ｆを参照されたい）。これらケモカインの産生の上昇は、ＬＹ２９４００２またはＢＡＹ１１－７０８２によって有意に阻害されたが、ＳＰ６００１２５によってはそうではなく、それは、ＧＢＭに対するオートファジーの阻害後のＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０の発現の増強と、ＰＩ３Ｋ／ＮＦ－κＢ経路の活性化との間のメカニズム的なつながりを示唆する。
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ＢＢＢ遊走アッセイ
ＮＫ細胞の遊走におけるＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０の関わりを判定するために、次いで、ＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０勾配に対する活性化ｐＮＫ細胞の遊走を、初代ヒトアストロサイトおよびｈＭＥＣ／Ｃ３ヒト脳微小血管内皮細胞の直接接触共培養によって設定されたインビトロＢＢＢモデルを使用して追尾した（図１２、下位区分Ｇ）。
インビトロ直接接触共培養血液脳関門（ＢＢＢ）モデルを、以前に記載されるように５３確立した。簡潔には、ヒトアストロサイトを、２μｇ／ｃｍ２のポリ－Ｌ－リジンでプレコートされた２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサート（細孔サイズ５μｍ）に４×１０４個細胞／ｃｍ２の密度で播種し、培地中で４８時間増殖／分化させた。次いで、培地を除去し、ＥＢＭ－２培地に懸濁されたｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を、１×１０５個細胞／ｃｍ２の密度で播種した。
共培養物を、付加的な７日間１日おきに培地交換を有してＥＢＭ－２中で成長させ、その後調査を行った。１００ｎｇ／ｍＬの組み換えＣＣＬ５またはＣＸＣＬ１０を含有する、１％ ＦＢＳを補足された６００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）プレートの下方チャンバーに入れた。１％ ＦＢＳを補足された１００μＬ ＲＰＭＩ１６４０培地中の活性化ｐＮＫ細胞（５×１０５個）を、上方チャンバーに入れた（５μｍの細孔サイズ）。３７℃および５％ ＣＯ２で６時間のインキュベーションの後、下方チャンバーに遊走したｐＮＫ細胞の数をフローサイトメトリーによって判定した。データは、総細胞インプットに基づく遊走のパーセンテージとして提示されている。
図１２、下位区分Ｈに示されるように、活性化ｐＮＫ細胞は、ＣＣＬ５（１００ｎｇ／ｍＬ）ならびにＣＸＣＬ１０（１００ｎｇ／ｍＬ）リガンド勾配に沿って遊走するそれらの能力を有意に増加させた。興味深いことには、ＢＥＣＮ１－ＧＢＭ４３細胞の生存率および増殖は、ＢＥＣＮ１ノックダウンによって影響を受けなかった（図１２、下位区分Ｉ）。
インビボ調査
ＧＢＭ腫瘍成長およびＮＫ細胞浸潤に対するＢＥＣＮ１ノックダウンの影響を、成熟ＢおよびＴリンパ球を持たないが、その代わりに成熟ＮＫ細胞区画を有するＲａｇ１－／－マウスにおいてインビボでさらに評価した（図１２、下位区分Ｊ）。
ＧＢＭ細胞（３×１０６個）を、Ｒａｇ１－／－マウスの両脇腹において皮下（ＳＣ）接種した（右脇腹においてＧＢＭ４３対照細胞、および左脇腹においてＢＥＣＮ１－ＧＢＭ４３細胞）。腫瘍成長をモニターし、腫瘍の長さ（Ｌ）、幅（Ｗ）、および高さ（Ｈ）を、デジタルキャリパーを使用して測定した。腫瘍容積（ｍｍ３）を、式：Ｖ＝０．５２×Ｌ×Ｗ×Ｈを使用して算出した。腫瘍成長を、マウスが所定の評価項目基準を満たすまでモニターした。その時点で、腫瘍組織を回収し、組織学的（ＩＨＣ）解析のために処理した。
ＮＳＧマウスに右脇腹において３×１０６個のＧＢＭ４３細胞を接種することによって、皮下ＧＢＭ異種移植片を確立した。１０日後、腫瘍が約８０ｍｍ３の容積に達した場合、マウスを５つの群（ｎ＝４／群）に無作為に割り振り、以下のプロトコールのうちの１つに従って処理した：（１）ＰＢＳのみ；（２）５×１０６個のｐＮＫ細胞単独の静脈内（ＩＶ）注射；（３）５×１０６個のＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞単独（構築物１）の静脈内（ＩＶ）注射；（４）ＣＱ（５０ｍｇ／ｋｇ）単独の腹腔内（ＩＰ）注射。ＮＫ細胞を、３週間週１回投与した。養子ＮＫ細胞療法（群２および３）を受けたマウスは、３～４日ごとにＩＰ注射によりＩＬ－１５（０．５μｇ／マウス）も受けた。腫瘍成長をキャリパー測定によって追跡し、腫瘍容積を、上で記載される式：Ｖ＝０．５２×Ｌ×Ｗ×Ｈを使用して算出した。マウスの体重を、処理の全体にわたって記録した。療法の終わりに、マウスを屠殺し、腫瘍を組織学的（ＩＨＣ／ＩＦ）解析のために回収した。
付加的に、同所性ＧＢＭ異種移植片を、前に記載されるＮＳＧマウスを使用して作出した。簡潔には、０日目に、ＧＢＭ４３（Ｌｕｃ）細胞（１×１０５個）を、デジタル化定位送達システムにより右前脳に定位的に埋め込んだ。埋め込みの９日後、マウスを４つの群（ｎ＝４／群）に無作為に割り振り、以下のプロトコールのうちの１つに従って処理した：（１）未処理（対照として）；（２）ＣＱ（５０ｍｇ／ｋｇ）単独の腹腔内（ＩＰ）注射；（３）２×１０６個のＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞（構築物１を発現する）単独の頭蓋内（ＩＣ）注射；（４）ＣＱ（ＩＰ）とＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞（ＩＣ）との組み合わせ。ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞の投与前に、ＣＱを週３回（１回／日）継続的に注射した。ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞を３週間週１回投与した。腫瘍容積を、Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ａｍｉ Ｏｐｔｉｃａｌイメージングシステムを使用してモニターしかつ記録した。マウスの体重も、処理期間中に記録した。処理の終わりに、マウスを屠殺し、各マウスからの全脳組織を、アデノシン測定およびＩＨＣ／ＩＦ解析のために回収した。
免疫組織化学（ＩＨＣ）および免疫蛍光（ＩＦ）染色は、パデュー大学獣医学部組織学研究所（Histology Research Laboratory at the Purdue University College of Veterinary Medicine）（Ｗｅｓｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｉｎｄｉａｎａ）で行われた。簡潔には、腫瘍を１０％中性緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、３～５μｍ切片に切削した。
ＢＥＣＮ１－ ＧＢＭ４３異種移植片に関しては、腫瘍におけるマウスＮＫ細胞を、マウスＮＫｐ４６／ＮＣＲ１抗体を使用した染色により検出した。腫瘍におけるＮＫ細胞の定量化に関しては、染色された細胞を、各スライドの５つの無作為に選択された腫瘍内の視野において２００×倍率でカウントした。
腫瘍におけるＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０発現を、それぞれヒトＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ抗体およびＣＸＣＬ１０抗体を使用した染色により検出した。染色を、ケモカイン免疫染色の強度（弱＝１、中程度＝２、および高＝３）、および陽性腫瘍細胞の密度（０％＝０、１～４０％＝１、４１～７５％＝２、７６％超＝３）に基づいて評価した。各サンプルの最終スコアに強度および密度を掛けた。
皮下ＧＢＭ４３異種移植片に関しては、ＮＫ細胞浸潤を、以下の染色：プロテインＬ（Ａｌｅｘａ ６４７、遠赤色）、ＮＫｐ４６（Ａｌｅｘａ ４８８、緑色）、およびＤＡＰＩ核対比染色を用いて実施されたＩＦ染色によって検討した。ＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０発現を、上で記載されるようにＩＨＣ染色によって評価した。腫瘍におけるＣＤ７３発現を、ヒトＣＤ７３抗体を使用した染色により検出した。
頭蓋内ＧＢＭ異種移植片に関しては、腫瘍におけるＮＫ細胞を、ヒトＮＫｐ４６／ＮＣＲ１抗体を使用した染色により検出した。腫瘍におけるＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０発現を、それぞれヒトＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ抗体およびＣＸＣＬ１０抗体を使用した染色により検出した。腫瘍におけるＣＤ７３発現を、ヒトＣＤ７３抗体を使用した染色により検出した。
ＢＥＣＮ１－ＧＢＭ４３細胞を移植されたマウスの左脇腹からの腫瘍は、対照ＧＢＭ４３細胞から生じたものよりも有意に遅い成長および小さなサイズを呈した（図１２、下位区分Ｋ）。ＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０に対する染色と並行して、摘出された腫瘍に対して免疫組織化学染色を実施して、マウスＮＫ細胞存在の測定としてＮＫｐ４６の発現を検出した。ＢＥＣＮ１を欠く腫瘍において、ＮＫｐ４６の有意により高い発現が検出され、対照腫瘍と比較してオートファジーを実施する能力を欠くＧＢＭへのＮＫ細胞のより深い浸潤を実証した（図１２、下位区分ＬおよびＭ）。加えて、ＢＥＣＮ１－腫瘍におけるＮＫ細胞は、腫瘍周辺および腫瘍内エリアの両方でより高い分布を示した（図１５を参照されたい）。さらに、ＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０の発現は、対照腫瘍における相対的に低いベースラインレベルから、ＢＥＣＮ１－腫瘍における有意により高いレベルまで上方調節された（図１２、下位区分Ｌ、Ｎ、およびＯ）。
ＮＫ細胞腫瘍内浸潤の増加に加えて、様々な濃度のＣＱを用いた処理の２４時間後の、ＧＢＭ４３細胞上でのＮＫ２Ｇ２ＤＬ発現（ＭＦＩおよびパーセンテージ）を評価した。
ＧＢＭ４３細胞を、まずＣＱ（様々な濃度）で処理し、次いで回収し、９６ウェルに再播種した。一晩の培養後、ＮＫ細胞（ＢＥＣＮ１－ＧＢＭ４３に対して、ＮＫ９２対照細胞およびｐＮＫ細胞）を、５のＥ／Ｔ比で添加し、４時間共インキュベートした。
結果として生じたデータは、オートファジーのＣＱ媒介性阻害が、ＧＢＭ４３細胞上でのＮＫＧ２ＤＬ、ＣＤ７３、およびＧＤ２の発現に対して測定可能でかつ有意な効果を有することを支持する。具体的には、ＧＢＭ４３細胞上でのＮＫＧ２ＤＬ発現（％およびＭＦＩの両方）は、様々な濃度のＣＱを用いた２４時間の処理後に有意に増加した（図１６、下位区分Ａ）。他方で、ＣＤ７３の発現（ＭＦＩ）は、６．２５μＭの低い濃度でさえＣＱ処理後に減少した（対照の約７０％）（図１６、下位区分Ｂ）。
前述のものに加えて、腫瘍内アデノシン濃度も査定した。脳組織を処理後に回収し、冷却ＰＢＳでリンスし、ＰＢＳ中でホモジナイズした。その後、懸濁液を４℃で１０，０００ｇにて１０分間遠心分離し、上清を回収した。アデノシン濃度を、メーカーの指示に従ってアデノシンアッセイキットを使用して判定した。ＩＨＣ染色を、上で記載されるように実施した。
ＣＤ７３によって媒介されるヒトＧＢＭ細胞におけるアデノシンの産生も、ＣＱを用いた処理後に有意に低下した（図１６、下位区分Ｃ）。ＧＤ２の発現（ＭＦＩ）は、５０μＭの濃度またはそれより高い濃度のＣＱを用いた処理後に減少した。逆に、ＧＤ２の発現パーセンテージ（％）は、最高１００μＭのＣＱに応答して減少し、その後それは、対照細胞ものと（約５８％）比較して一定のままであった（約４６％）（図１６、下位区分Ｄ）。
ＮＫ細胞の細胞傷害能に対するオートファジーの阻害の影響をさらに検討するために、ＣＱ処理ＧＢＭ４３細胞またはＢＥＣＮ１－ ＧＢＭ４３細胞を、ｐＮＫ細胞とともに５のＥ／Ｔ比で４時間インキュベートした。結果は、ＣＱでの処理が、ヒトＮＫ細胞によるより優れた殺滅に対してＧＢＭ細胞を実際に感作したことを支持する（図１６、下位区分ＥおよびＦを参照されたい）。
まとめると、これらの調査から生じたデータは、オートファジーを標的にすることが、ＧＢＭ腫瘍床へのＮＫ細胞の浸潤を向上させ、より高いレベルのケモカインＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０によって支援されることを実証する。加えて、オートファジーを無効にすることは、ＮＫＧ２ＤＬ発現の増加等のＮＫ細胞機能性の増強を支持したそれらの表現型シグネチャーをリプログラミングすることによって、ＧＢＭ細胞に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害を強めもし得る。オートファジーを標的にすることによって誘導されるＧＢＭ ＴＭＥの複雑でかつ独自のリプログラミングは、これらのリプログラミングされた経路を活用するように操作されたＮＫ細胞を用いたＧＢＭ腫瘍の処理をさらに増感させ得る。
[実施例４]
多機能性の操作されたＮＫ細胞は、患者由来ＧＢＭ腫瘍をインビボで効率的に標的にする
多機能性の操作されたＮＫ細胞のインビボ抗腫瘍活性、ならびにＧＢＭに対する、オートファジーを標的にすることによって誘導される効果を評価するために、患者由来ＧＢＭ４３細胞をＮＳＧマウスに移植することによって、皮下異種移植片モデルを確立した。
処理スケジュールが、図１７、下位区分Ａに要約されている。簡潔には、３×１０６個のＧＢＭ４３細胞を、マウスの右脇腹に皮下に（ＳＣ）埋め込んだ（０日目）。１０日後（１０日目）、ＣＱ群におけるマウスに、５０ｍｇ／ｋｇのＣＱを３週間週１回腹腔内（ＩＰ）注射した。１日後（１１日目）、ｐＮＫおよびＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ群におけるマウスを、５×１０６個の養子移入されたｐＮＫまたはＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞で３週間週１回静脈内（ＩＶ）処理した。ＮＫ細胞の最初の注射の日から開始し、すべてのマウスは、３～４日ごとに１回０．５μｇのＩＬ－１５をＩＰで受けた。
ｐＮＫ細胞での処理は、ＰＢＳ対照群におけるマウスと比較して、腫瘍成長を有意に遅延させた（平均腫瘍容積：８１５．７５ｍｍ３対１４７５ｍｍ３、＊＊ｐ＜０．０１；平均腫瘍重量：１．１３ｇ対２．３１ｇ、＊＊ｐ＜０．０１；図１７、下位区分ＢおよびＣ）。ｐＮＫ細胞処理マウスとＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞処理マウスとの間で、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞は、より強力な抗腫瘍応答を媒介し、腫瘍成長速度の有意な低下を呈した（平均腫瘍容積：４０１．５ｍｍ３対８１５．７５ｍｍ３、＊＊ｐ＜０．０１；平均腫瘍重量：０．５９ｇ対１．１３ｇ、＊＊ｐ＜０．０１）。ＣＱ処理も、ＰＢＳ群と比較して、腫瘍成長の有意な阻害を示した（平均腫瘍容積：９５３．２５ｍｍ３対１４７５ｍｍ３、＊ｐ＜０．０５；平均腫瘍重量：１．１６ｇ対２．３１ｇ、＊＊ｐ＜０．０１；図１７、下位区分ＢおよびＣ）。処理期間全体にわたって、すべての群においてマウスの体重の有意な減少はなかった（図１７、下位区分Ｄ）。
次いで、ＧＢＭ異種移植片腫瘍へのＮＫ細胞浸潤をＩＦ染色によって検討した。図１７、下位区分Ｅに示されるように、ｐＮＫ細胞処理マウスからの腫瘍組織において、養子移入されたＮＫ細胞（明るい点）が観察された。比較して、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞処理マウスからの腫瘍において、より高いＮＫ細胞数が検出された。
付加的に、インビボでＣＤ７３＋腫瘍細胞に結合し得る局所的に切断された抗ＣＤ７３ ｓｃＦｖ（矢印およびより暗い点によって示される）が、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞処理マウスにおいて腫瘍細胞の近くに検出された。本明細書で報告されるインビトロデータおよび以前のインビボ調査は、リガンド切断を誘発する腫瘍内プロテアーゼ活性の必要性を実証した。その理由で、血中におけるその活性化は予想されず、結果として、循環におけるｓｃＦｖの検出可能な存在はないはずであった。それゆえ、ＩＦを使用して、ＣＤ７３ ｓｃＦｖの腫瘍特異的存在を検出した。
ＣＤ７３ ｓｃＦｖの存在は、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ染色とのみ共局在し、ＣＤ７３ ｓｃＦｖの切断に成功したことを示した。さらに、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ処理群における腫瘍上でのＣＤ７３の発現の有意な減少が、他の処理群と比較して観察された（図１７、下位区分ＦおよびＧ）。付加的に、ＣＱ処理マウスからの腫瘍組織は、ケモカインＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０の有意により高い存在を明らかにした（図１７、下位区分Ｈ～Ｊ）。これらの腫瘍は、より低いレベルのＣＤ７３発現も呈した（図１７、下位区分ＦおよびＧ）。
[実施例５]
同所性の患者由来ＧＢＭ異種移植片に対する、多機能性の遺伝子操作されたＮＫ細胞とＣＱとの組み合わせの活性
ＣＱとＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞（構築物１を発現する）との組み合わせによって達成される相乗効果をさらに解析するために、ＮＳＧマウスにおけるＧＢＭ４３異種移植片同所性モデルを確立した。まず、ＧＢＭ４３細胞を、ホタルルシフェラーゼを発現するように遺伝子操作して（ＧＢＭ４３－Ｌｕｃ）、インビボ生物発光イメージングによる腫瘍成長のモニタリングを可能にした（図１８を参照されたい）。より具体的には、細胞（１０００個）を、ピューロマイシンなしの通常（regular）成長培地中で４日間成長させた。経時的な細胞の総生存率を、ＣＣＫ－８アッセイを使用して測定し、対数尺度でプロットした。両細胞とも、同様の成長パターンおよび倍増時間を示した。
本明細書において使用されたインビボ処理プログラムを図解した概略図が、図１９、下位区分Ａに示されている。簡潔には、ＮＳＧマウスに、ＧＢＭ４３－Ｌｕｃ細胞（約８×１０４個）を同所的に埋め込み、埋め込みの１０日後に、３週間週１回のＣＱの腹腔内（ＩＰ）注射（日あたり５０ｍｇ／ｋｇ、継続的な３日間）および／またはＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞の頭蓋内（ＩＣ）注射（２×１０４個）で処理した。対照群におけるものと比較した場合、ＣＱ単独で処理されたマウスは、腫瘍成長に対する有意な効果を示さなかった（図１９、下位区分Ｂ～Ｄを参照されたい）。逆に、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞またはＣＱ＋ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞のいずれかで処理されたマウスは、生物発光イメージングによって判定される明白に低下した腫瘍成長を示した（図１９、下位区分Ｂを参照されたい）。ＣＱ＋ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞処理マウスに関して、最も強力な抗腫瘍応答が見られた。特に、ＣＱ＋ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞で処理されたマウスの半分での腫瘍は、処理期間中に有意な停止を示した。処理期間全体にわたって、すべての群におけるマウスの体重の有意な変化は見い出されなかった（図１９、下位区分Ｅ）。
皮下異種移植片調査と同様に、ＣＱ処理群におけるマウスの腫瘍組織は、ＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０を含めた、堅牢に上方調節されたケモカイン発現を呈し（図１９、下位区分Ｆ）、それは、ＮＫ細胞浸潤の増加に寄与し得、治療効能の向上につながり得る。図１９、下位区分ＧおよびＨに示されるように、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞単独を受けたマウスと比較して、ＣＱ＋ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞処理マウスのＧＢＭ腫瘍において、有意により高いＮＫ細胞浸潤が見い出された。対照またはＣＱ処理群と比較して、ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞およびＣＱ＋ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞処理群の両方におけるマウスの腫瘍は、ＣＤ７３発現の減少を呈し、後者の群は、ＣＤ７３発現の最も実質的な喪失を示した（図１９、下位区分ＩおよびＪ）。これは、処理マウスの腫瘍において検出された有意に減少したレベルの細胞外アデノシンと関連付けられた。具体的には、局所的脳組織におけるＣＤ７３媒介性アデノシン産生は、ＣＱ＋ＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞で処理されたマウスにおいて最も目立って減少した（図１９、下位区分ＫおよびＬ）。
総合すると、これらのインビボ異種移植片調査は、患者由来成人ＧＢＭに対するＣＤ７３．ｍＣＡＲ－ｐＮＫ細胞の強力でかつ特異的な活性を実証する。応答は、ＣＱとの共療法後のケモカイン分泌およびＧＢＭ上でのＣＤ７３発現の有意な変化の誘導と関連し、オートファジーを無効にすると誘導されるＧＢＭ ＴＭＥの再組織化を示した。
１００ 合成遺伝子構築物
１０２ 第１の結合ドメインまたはそのフラグメント
１０４ 第２の結合ドメインまたはそのフラグメント
１０６ 第３の結合ドメインまたはそのフラグメント

Claims (44)

  1. ナチュラルキラー（ＮＫ）活性化受容体、または第１のがん関連抗原に特異的な第１のタンパク質を含む少なくとも第１の結合ドメインまたはそのフラグメントをコードする第１の配列、ならびに
    少なくとも第２の結合ドメインまたはそのフラグメントおよび切断可能なリンカーをコードする第２の配列
    を含むヌクレオチド構築物であって、前記第２の結合ドメインは、標的細胞のアデノシン産生細胞表面タンパク質または標的細胞のアデノシン中間体産生細胞表面タンパク質に特異的であり、前記切断可能なリンカーは、前記第１の結合ドメインに作動的に連結されている、ヌクレオチド構築物。
  2. ＮＫ活性化受容体、または第２のがん関連抗原に特異的な第２のタンパク質を含む少なくとも第３の結合ドメインまたはそのフラグメントをコードする第３の配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
  3. 前記第１および第３の結合ドメインまたはそのフラグメントの一方は、がん関連抗原に特異的な第１のタンパク質を含み、前記第１および第３の結合ドメインまたはそのフラグメントの他方はＮＫ活性化受容体を含む、請求項２に記載のポリヌクレオチド構築物。
  4. 前記第２の結合ドメインは、ＣＤ７３、ＣＤ３９、またはＣＤ３８に特異的な抗体フラグメントを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
  5. 前記切断可能なリンカーは、前記標的細胞における１種または複数のプロテアーゼによって切断可能である、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
  6. 前記第１の配列は、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ受容体（ＮＫＧ２Ｄ）、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４０、またはＤＮＡＭ－１を含む細胞外リガンド結合ドメインを含むＮＫ活性化受容体をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
  7. 前記第１のがん関連抗原は、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、Ｈｅｒ２（ｐ１８５）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、Ｃ型レクチン様分子－１；ＥｐＣＡＭ、Ｇ２５０、プロテオグリカン、ＧＤ３、ＧＤ２、ＭＨＣ ＩＩ、ＴＡＧ－７２、ミルクムチンコアタンパク質、ルイスＡ抗原、チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ１）、ｃ－ｍｅｔ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲ変種ＩＩＩ、および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）からなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
  8. 前記第２のがん関連抗原は、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、Ｈｅｒ２（ｐ１８５）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、Ｃ型レクチン様分子－１；ＥｐＣＡＭ、Ｇ２５０、プロテオグリカン、ＧＤ３、ＧＤ２、ＭＨＣ ＩＩ、ＴＡＧ－７２、ミルクムチンコアタンパク質、ルイスＡ抗原、チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ１）、ｃ－ｍｅｔ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲ変種ＩＩＩ、および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）からなる群から選択され、前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質は同じではない、請求項７に記載のポリヌクレオチド構築物。
  9. 前記第１の結合ドメインまたはそのフラグメントは、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ受容体（ＮＫＧ２Ｄ）を含む細胞外リガンド結合ドメインを含み、前記第１の配列は、野生型ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄの発現と比較して、前記ＮＫＧ２Ｄの上方調節された発現をさらにコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
  10. 前記第２の結合ドメインまたはそのフラグメントは、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）と連結された抗ＣＤ７３、抗ＣＤ３９、または抗ＣＤ３８を含み、前記第３の結合ドメインまたはそのフラグメントは、ｓｃＦｖと連結された抗ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
  11. 前記第１の配列は、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）において発現され、前記第２の配列は、第２のＣＡＲにおいて発現される、請求項２に記載のポリヌクレオチド構築物。
  12. 前記第１および第３の配列の一方または両方は、活性化があると細胞傷害または細胞溶解活性を促進するための１種または複数のシグナル伝達ドメインをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド構築物。
  13. 前記１種または複数のシグナル伝達ドメインは、それに作動的に連結された前記結合ドメインまたはそのフラグメントが前記標的細胞に結合すると活性化される、請求項１２に記載のポリヌクレオチド構築物。
  14. 前記標的細胞は、がん細胞または腫瘍微小環境における悪性細胞である、請求項１から１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
  15. 前記がん細胞または悪性細胞は、膠芽腫細胞または膠芽腫腫瘍微小環境における悪性細胞である、請求項１４に記載のポリヌクレオチド構築物。
  16. １種または複数のシグナル伝達ドメインは、免疫グロブリンγ－Ｆｃ領域受容体ＩＩＩ－Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）、分化抗原群２８（ＣＤ２８）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９または４－１ＢＢ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４またはＯＸ４０）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＡＰ１０）、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）、天然細胞傷害性受容体ＮＫｐ４６、天然細胞傷害性受容体ＮＫｐ４４、天然細胞傷害性受容体ＮＫｐ３０、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、分化抗原群２４４（ＣＤ２４４）、ＣＤ１３７、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）、およびＮＫＧ２Ｄ－ＤＡＰ１０受容体複合体からなる群から選択される、請求項８から１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
  17. 前記第１の配列によってコードされる前記１種または複数のシグナル伝達ドメインはＤＡＰ１０であり、前記第２の配列によってコードされる前記１種または複数のシグナル伝達ドメインはＣＤ３ζである、請求項１４に記載のポリヌクレオチド構築物。
  18. 前記抗体フラグメントはｓｃＦｖをさらに含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド構築物。
  19. 前記第１の配列は、ヒンジドメイン、１種もしくは複数の自己切断ペプチド、またはその両方をさらにコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
  20. 前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、およびＴ２Ａからなる群から選択される、請求項１９に記載のポリヌクレオチド構築物。
  21. 前記ヒンジドメインは、リンカーまたはスペーサーを含む、請求項１９に記載のポリヌクレオチド構築物。
  22. 前記第１の配列は、配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有する第１のアミノ酸をコードし、前記第３の配列は、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有する第２のアミノ酸をコードする、請求項１７に記載のポリヌクレオチド構築物。
  23. 請求項１から２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物を発現する、操作された細胞または細胞株。
  24. 配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を発現する、請求項２３に記載の操作された細胞または細胞株。
  25. 前記第１の配列は、前記第１の配列によってコードされる前記第１の結合ドメインまたはそのフラグメントおよびシグナル伝達ドメインに作動的に連結されかつその間に配置されるヒンジドメインをさらにコードする、請求項２３に記載の操作された細胞または細胞株。
  26. 前記１種または複数のシグナル伝達ドメインは、それに作動的に連結された前記結合ドメインまたはそのフラグメントが前記標的細胞に結合すると活性化される、請求項２３に記載の操作された細胞の集団を含む薬学的組成物。
  27. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２６に記載の薬学的組成物。
  28. がんに罹患している対象を免疫療法治療を使用して治療する方法であって、少なくとも、
    ナチュラルキラー（ＮＫ）活性化受容体、または第１のがん関連抗原に特異的な第１のタンパク質を含む第１の結合ドメインまたはそのフラグメント；ならびに
    第２の結合ドメインまたはそのフラグメント、および切断可能なリンカー
    をコードするポリヌクレオチド構築物であって、前記第２の結合ドメインは、標的細胞のアデノシン産生またはアデノシン中間体産生細胞表面タンパク質に特異的であり、前記切断可能なリンカーは、前記第１の結合ドメインに作動的に連結されている、ポリヌクレオチド構築物を発現する操作されたＮＫ細胞の集団を含む薬学的組成物の治療有効量を対象に投与するステップまたは投与しておくステップを含む方法。
  29. 前記ポリヌクレオチド構築物は、ＮＫ活性化受容体、または第２のがん関連抗原に特異的な第２のタンパク質を含む第３の結合ドメインまたはそのフラグメントをさらにコードする、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記第１および第３の結合ドメインまたはそのフラグメントの一方は、がん関連抗原に特異的な第１のタンパク質を含み、前記第１および第３の結合ドメインまたはそのフラグメントの他方はＮＫ活性化受容体を含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 操作されたＮＫ細胞の前記集団は、配列番号８と少なくとも８０％、８５％、または９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を発現する、請求項２８から３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記ポリヌクレオチド構築物は、活性化があると、前記操作されたＮＫ細胞の細胞傷害または細胞溶解活性を促進するように、前記第１の結合ドメインに作動的に連結された１種または複数のシグナル伝達ドメインをさらにコードする、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記がんは膠芽腫であり、前記第１の結合ドメインまたはそのフラグメントは、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）に特異的な第１のタンパク質を含み、前記第３の結合ドメインまたはそのフラグメントは、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ受容体（ＮＫＧ２Ｄ）を含む細胞外リガンド結合ドメインを含み、前記第３の結合ドメインまたはそのフラグメントはＣＤ７３に特異的である、請求項３０に記載の方法。
  34. オートファジー阻害剤を含む付加的な治療的処置を前記対象に投与するステップまたは投与しておくステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
  35. 前記オートファジー阻害剤は、治療有効量の小分子阻害剤またはオートファジー経路における遺伝子の遺伝的下方調節を含む、請求項３４に記載の方法。
  36. オートファジー経路における前記遺伝子は、ＢＥＣＮ１、ｐ６２、β－アクチン、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＬＣ３Ｂ、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＰＩ３Ｋ－ＩＩＩ、ＵＬＫ１、ＵＬＫ２、ＦＩＰ２００、およびＬＡＭＰ２からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記オートファジー阻害剤は、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スパウチン－１、ＳＡＲ４０５、およびベルテポルフィンからなる群から選択される小分子阻害剤を含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記クロロキンは０．０１μＭ～２００μＭの濃度で投与される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記がんは膠芽腫である、請求項２８に記載の方法。
  40. 投与するまたは投与しておく前記ステップは、静脈内に、腫瘍内に、非経口的に、または注入により実施される、請求項２８に記載の方法。
  41. 治療有効量の薬学的組成物を対象に投与するまたは投与しておく前記ステップは、静脈内に、腫瘍内に、非経口的に、または注入により実施され、付加的な治療的処置を前記対象に投与するまたは投与しておく前記ステップは、全身注射または注入により実施される、請求項３４に記載の方法。
  42. 治療有効量の薬学的組成物を対象に投与するまたは投与しておく前記ステップは、養子細胞療法を実施するまたは実施しておくステップを含む、請求項２８に記載の方法。
  43. 膠芽腫を経験している対象を治療するためのキットであって、
    治療有効量の請求項２６に記載の薬学的組成物；および
    治療有効量のオートファジー阻害剤
    を含むキット。
  44. 前記オートファジー阻害剤は、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スパウチン－１、ＳＡＲ４０５、およびベルテポルフィンからなる群から選択される小分子阻害剤を含む、請求項４３に記載のキット。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1914242A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
ES2807182T3 (es) * 2014-11-21 2021-02-22 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos frente a CD73 y sus usos
CN105384825B (zh) * 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
EP3436070A4 (en) * 2016-03-29 2019-11-27 University of Southern California CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTORS TARGETING CANCER
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