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CN110841067A - 用于降低的或增强的药效学作用的致耐受性合成纳米载体和治疗性大分子 - Google Patents

用于降低的或增强的药效学作用的致耐受性合成纳米载体和治疗性大分子 Download PDF

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CN110841067A
CN110841067A CN201911069542.3A CN201911069542A CN110841067A CN 110841067 A CN110841067 A CN 110841067A CN 201911069542 A CN201911069542 A CN 201911069542A CN 110841067 A CN110841067 A CN 110841067A
Authority
CN
China
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therapeutic
dose
therapeutic macromolecule
immunosuppressant
nanocarriers
Prior art date
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Pending
Application number
CN201911069542.3A
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English (en)
Inventor
罗伯托·A·马尔多纳多
岸本·隆·慧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cartesian Therapeutics Inc
Original Assignee
Selecta Biosciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Selecta Biosciences Inc filed Critical Selecta Biosciences Inc
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Abstract

本发明涉及用于降低的或增强的药效学作用的致耐受性合成纳米载体和治疗性大分子。公开了提供治疗性大分子特异性的药效学作用的组合物和方法。所述作用可由与免疫抑制剂剂量相组合的治疗性大分子的降低的剂量产生。所述作用还可用这样的组合物来增强。

Description

用于降低的或增强的药效学作用的致耐受性合成纳米载体和 治疗性大分子
本申请是申请日为2014年5月2日、申请号为“201480032251.6”、发明名称为“用于降低的或增强的药效学作用的致耐受性合成纳米载体和治疗性大分子”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/US2014/036687的中国国家阶段申请。
相关申请
本申请依据35U.S.C.§119要求于2013年5月3日提交的美国临时申请61/819517、于2013年9月24日提交的美国临时申请61/881851、于2013年9月24日提交的美国临时申请61/881913、于2013年9月24日提交的美国临时申请61/881921、于2013年11月21日提交的美国临时申请61/907177、于2014年3月5日提交的美国临时申请61/948313、以及于2014年3月5日提交的美国临时申请61/948384的权益，其每一个的全部内容均通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及与治疗性大分子伴随施用的免疫抑制剂剂量(在一些实施方案中，与合成纳米载体连接)及相关方法。该组合物和方法允许治疗性大分子特异性的高效药效学作用。因此，所提供的组合物和方法可用于甚至在治疗性大分子的降低的剂量下在对象中产生药效学响应。还可伴随地重复施用本文中提供的组合物和方法以产生期望的药效学作用和免疫学作用。
背景技术
治疗性治疗(例如蛋白质或酶替代治疗)通常导致针对具体治疗剂的不期望免疫应答。在这些情况下，免疫系统中的细胞将该治疗剂识别为外来的并试图将其中和或破坏，正如它们试图破坏感染性生物，例如细菌和病毒。此类不期望的免疫应答可中和治疗性治疗的效力或者引起针对该治疗剂的超敏反应。可通过使用免疫抑制药物来降低这些不期望应答。然而，常规的免疫抑制药物作用广泛，并且作用广泛的免疫抑制剂的使用与严重副作用的风险相关，所述副作用例如肿瘤、感染、肾毒性和代谢紊乱。因此，新的治疗将是有益的。
发明内容
在一个方面，提供了一种方法，其包括提供免疫抑制剂剂量，其中在一些实施方案中，所述免疫抑制剂剂量与合成纳米载体连接；以及将治疗性大分子的降低的药效学有效剂量与免疫抑制剂剂量伴随施用于对象。在一个实施方案中，所述伴随施用根据已被证明与当不与免疫抑制剂剂量伴随施用且各自存在抗治疗性大分子抗体应答时施用治疗性大分子相比，在与免疫抑制剂剂量伴随施用后以治疗性大分子的降低的药效学有效剂量产生药效学作用的方案进行。在所提供之任一种方法的另一个实施方案中，治疗性大分子的降低的药效学有效剂量低于(A)在抗治疗性大分子抗体应答存在下施用的、和(B)不与免疫抑制剂剂量伴随施用的治疗性大分子的药效学有效剂量。
在另一个方面，提供了一种方法，其包括提供免疫抑制剂剂量，其中在一些实施方案中，所述免疫抑制剂剂量与合成纳米载体连接；以及将治疗性大分子的药效学有效剂量与免疫抑制剂剂量伴随施用。在一个实施方案中，伴随施用根据已被证明与当不与免疫抑制剂剂量伴随施用且各自存在抗治疗性大分子抗体应答时施用治疗性大分子相比，在与免疫抑制剂剂量伴随施用后增强治疗性大分子的药效学作用的方案进行。
在另一个方面，提供了一种方法，其包括提供免疫抑制剂剂量，其中在一些实施方案中，所述免疫抑制剂剂量与合成纳米载体连接；将治疗性大分子的药效学有效剂量与免疫抑制剂剂量伴随施用；以及在伴随施用之后记录增强的药效学作用。
在另一个方面，提供了一种方法，其包括提供在一个或更多个对象中重复给药后产生或预期产生抗治疗性大分子抗体的治疗性大分子；以及提供免疫抑制剂剂量，其中所述免疫抑制剂剂量与合成纳米载体连接。在一些实施方案中，所述方法包括以相同或较低的剂量将治疗性大分子与所述免疫抑制剂剂量向对象伴随地重复给药。在一些实施方案中，伴随施用根据已被证明使得在给对象的两个或更多个治疗性大分子剂量期间维持所述治疗性大分子的药效学作用的方案进行。
在所提供之任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括确定所述方案。在所提供之任一种方法的另一个实施方案中，所述方法还包括确定药效学有效剂量，例如降低的或提高的药效学有效剂量。在所提供之任一种方法的另一个实施方案中，所述方法还包括在施用之前和/或之后在对象中评估药效学作用。在所提供之任一种方法的另一个实施方案中，重复伴随施用一次或更多次。在所提供之任一种方法的另一个实施方案中，所述施用通过静脉内、腹膜内或皮下施用进行。在所提供之任一种方法的另一个实施方案中，所述对象处于抗治疗性大分子抗体应答的风险之中。在所提供之任一种方法的另一个实施方案中，所述对象为其中预期发生抗治疗性大分子应答的对象。
在另一个方面，提供了一种组合物或药盒(kit)，其包含免疫抑制剂剂量，其中在一些实施方案中，所述免疫抑制剂与合成纳米载体连接；和治疗性大分子的降低的药效学有效剂量。
在另一个方面，提供了一种组合物或药盒，其包含与免疫抑制剂剂量相组合的用于本文中提供之任一种方法的治疗性大分子的降低的药效学有效剂量，其中在一些实施方案中，所述免疫抑制剂与合成纳米载体连接。
在所提供之任一种组合物或药盒的一个实施方案中，所述组合物或药盒用于本文中提供的任一种方法。在所提供之任一种组合物或药盒的一个实施方案中，所述组合物或药盒还包含可药用载体。
在所提供之任一种方法或组合物或药盒的一个实施方案中，所述治疗性大分子未与合成纳米载体连接。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述治疗性大分子与合成纳米载体连接。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述合成纳米载体不包含治疗性大分子APC可呈递抗原。
在所提供之任一种组合物或药盒的一个实施方案中，所述免疫抑制剂剂量和治疗性大分子分别包含在容器中。在所提供之任一种组合物或药盒的另一个实施方案中，所述免疫抑制剂剂量和治疗性大分子包含在独立容器中。在所提供之任一种组合物或药盒的另一个实施方案中，所述免疫抑制剂剂量和治疗性大分子包含在同一容器中。
在所提供之任一种方法或组合物或药盒的一个实施方案中，所述治疗性大分子的降低的药效学有效剂量比(A)在抗治疗性大分子抗体应答存在下施用的、和(B)不与免疫抑制剂剂量伴随施用的治疗性大分子的药效学有效剂量低至少30％。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述降低的药效学有效剂量降低至少40％。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述降低的药效学有效剂量降低至少50％。
在所提供之任一种方法或组合物或药盒的一个实施方案中，所述免疫抑制剂剂量包含：他汀类、mTOR抑制剂、TGF-β信号传导剂、皮质类固醇、线粒体功能的抑制剂、P38抑制剂、NF-κβ抑制剂、腺苷受体激动剂、前列腺素E2激动剂、磷酸二酯酶4抑制剂、HDAC抑制剂或蛋白酶体抑制剂。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，mTOR抑制剂是雷帕霉素。
在所提供之任一种方法或组合物或药盒的一个实施方案中，所述治疗性大分子包含治疗性蛋白质。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述治疗性大分子包含治疗性多核苷酸。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述治疗性蛋白质用于蛋白质替代或蛋白质补充治疗。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述治疗性蛋白质包含可输注或可注射的治疗性蛋白质、酶、酶辅因子、激素、血液因子或凝血因子、细胞因子、干扰素、生长因子、单克隆抗体、多克隆抗体或与庞皮病(Pompe’s disease)相关的蛋白质。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述可输注或可注射的治疗性蛋白质包含：托珠单抗(Tocilizumab)、α-1抗胰蛋白酶、Hematide、白蛋白干扰素α-2b(albinterferon alfa-2b)、Rhucin、替莫瑞林(tesamorelin)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、贝利木单抗(belimumab)、聚乙二醇化重组尿酸酶(pegloticase)、聚乙二醇化重组假丝酵母尿酸酶(pegsiticase)、他利苷酶α(taliglucerase alfa)、阿加糖酶α(agalsidase alfa)或葡糖脑苷脂酶α(velaglucerase alfa)。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述酶包含：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述酶包含用于溶酶体贮积症的酶替代治疗的酶。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述用于溶酶体贮积症的酶替代治疗的酶包含：伊米苷酶(imiglucerase)、a-半乳糖苷酶A(a-gal A)、阿加糖酶β(agalsidase beta)、酸性α-葡糖苷酶(acid α-glucosidase，GAA)、阿葡糖苷酶α(alglucosidase alfa)、LUMIZYME、MYOZYME、芳基硫酸酯酶B、拉罗尼酶(laronidase)、ALDURAZYME、艾杜硫酶(idursulfase)、ELAPRASE、芳基硫酸酯酶B或NAGLAZYME。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述酶包含KRYSTEXXA(聚乙二醇化重组尿酸酶)。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述单克隆抗体包含HUMIRA(阿达木单抗)。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述细胞因子包含：淋巴因子、白介素、趋化因子、1型细胞因子或2型细胞因子。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述血液因子或凝血因子包含：因子I、因子II、组织因子、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XII、因子XIII、冯·维勒布兰德因子(von Willebrand factor)、前激肽释放酶(prekallikrein)、高分子量激肽原、纤连蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂(protein Z-related protease inhibitor，ZPI)、纤溶酶原、α2-抗纤溶酶、组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI1)、纤溶酶原激活物抑制剂-2(plasminogenactivator inhibitor-2，PAI2)、癌促凝物质或阿法依伯汀(epoetin alfa)。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述血液因子或凝血因子是因子VIII。
在所提供之任一种方法或组合物或药盒的一个实施方案中，基于所有合成纳米载体的平均值，与合成纳米载体连接的免疫抑制剂的载量为0.1％至50％。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述载量为0.1％至20％。
在所提供之任一种方法或组合物或药盒的一个实施方案中，所述合成纳米载体包含脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、金属纳米颗粒、基于表面活性剂的乳剂(surfactant-based emulsion)、树状聚体(dendrimer)、巴基球(buckyball)、纳米线(nanowire)、病毒样颗粒或者肽或蛋白质颗粒。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述合成纳米载体包含脂质纳米颗粒。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述合成纳米载体包含脂质体。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述合成纳米载体包含金属纳米颗粒。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述金属纳米颗粒包含金纳米颗粒。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述合成纳米载体包含聚合物纳米颗粒。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述聚合物纳米颗粒包含聚合物，其为非甲氧基封端的普朗尼克(pluronic)聚合物。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述聚合物纳米颗粒包含聚酯、与聚醚连接的聚酯、聚氨基酸、聚碳酸酯、聚缩醛、聚缩酮、多糖、聚乙基
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唑啉或聚乙烯亚胺。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述聚酯包含：聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物或聚己内酯。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述聚合物纳米颗粒包含聚酯和与聚醚连接的聚酯。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述聚醚包含聚乙二醇或聚丙二醇。
在所提供之任一种方法或组合物或药盒的一个实施方案中，使用合成纳米载体的动态光散射获得的颗粒大小分布的平均值为大于100nm的直径。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述直径大于150nm。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述直径大于200nm。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述直径大于250nm。在所提供之任一种方法或组合物或药盒的另一个实施方案中，所述直径大于300nm。
在所提供之任一种方法或组合物或药盒的一个实施方案中，所述合成纳米载体的纵横比(aspect ratio)大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10。
在另一个方面，提供了制备本文中提供的任一种组合物或药盒的方法。在一个实施方案中，所述制备方法包括产生治疗性大分子的剂量或剂型和产生免疫抑制剂的剂量或剂型。在一些实施方案中，治疗性大分子的剂量或剂型为治疗性大分子的降低的药效学有效剂量。在所提供之任一种制备方法的另一个实施方案中，产生免疫抑制剂的剂量或剂型的步骤包括使免疫抑制剂与合成纳米载体连接。在所提供之任一种制备方法的另一个实施方案中，所述方法还包括将免疫抑制剂的剂量或剂型与治疗性大分子的剂量或剂型在药盒中组合。
在另一个方面，提供了本文中提供的任一种组合物或药盒用于制备用于在对象中降低抗治疗性大分子抗体应答的药物的用途。在一个实施方案中，所述组合物或药盒包含免疫抑制剂和治疗性大分子，其中可以以治疗性大分子的降低的药效学有效剂量提供治疗性大分子。在本文中提供的任一种用途的另一个实施方案中，免疫抑制剂与合成纳米载体连接。在本文中提供的任一种用途的另一个实施方案中，所述用途用于实现本文中提供的任一种方法。
在另一个方面，本文中提供的任一种组合物或药盒可用于本文中提供的任一种方法。在一个实施方案中，所述组合物或药盒包含治疗性大分子的一种或更多种剂量或剂型和/或免疫抑制剂的一种或更多种剂量或剂型。在一个实施方案中，治疗性大分子的剂量为降低的药效学有效剂量。在另一个实施方案中，免疫抑制剂与合成纳米载体连接。
在另一个方面，提供了制备意图用于降低抗治疗性大分子抗体应答的药物的方法。在一个实施方案中，所述药物包含免疫抑制剂和/或治疗性大分子，其中治疗性大分子可以在降低的药效学有效剂量下。在本文中提供的任一种制备方法的另一个实施方案中，免疫抑制剂与合成纳米载体连接。
附图说明
图1示出了在本文中提供的伴随施用下循环抗原特异性抗体产生的水平。
图2示出了在本文中提供的伴随施用下循环抗原特异性抗体产生的水平。
图3提供了在本文中提供的伴随施用下的抗OVA抗体效价。
图4提供了在本文中提供的伴随施用下的抗KLH抗体效价。
图5示出了在最后的纳米载体和FVIII给药后1个月针对FVIII的抗体回忆应答。
图6A和6B示出了血友病A小鼠中纳米载体和FVIII给药的效力。
图7A和7B示出了在用有或无与雷帕霉素连接之纳米载体的HUMIRA/阿达木单抗处理的小鼠中针对HUMIRA的免疫应答。
图8示出了在用有或无与雷帕霉素连接之纳米载体的钥孔林普贝血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)处理的小鼠中的抗KLH抗体效价。
图9示出了在用有或无与雷帕霉素连接之纳米载体的卵清蛋白(ovalbumin，OVA)处理的小鼠中的抗OVA抗体效价。
图10示出了在用有或无与雷帕霉素连接之纳米载体的KRYSTEXXA处理的小鼠中的抗KRYSTEXXA抗体效价。
图11示出了在存在或不存在与雷帕霉素连接之纳米载体的情况下，用OVA和KLH处理的小鼠中的抗体效价。
图12A和12B示出了在用有或无与雷帕霉素连接之纳米载体的KLH处理的小鼠中针对KLH的免疫应答。
图13A和13B示出了在用有或无与雷帕霉素连接之纳米载体的HUMIRA/阿达木单抗处理的小鼠中针对HUMIRA/阿达木单抗的免疫应答。
图14提供了用于实施本文中提供的方法的一个示例性方案。
图15示出了关于用HUMIRA治疗的实施本文中提供的方法的有益效果。
图16提供了用于实施本文中提供的方法的一个示例性方案。
图17示出了关于用HUMIRA治疗的实施本文中提供的方法的有益效果。
图18证明了作为与合成纳米载体连接的两种不同免疫抑制剂的结果，抗蛋白质抗体应答降低。
图19示出了关于用HUMIRA治疗的实施本文中提供的方法的另一个示例性方案和有益效果。
具体实施方式
在对本发明进行详细描述之前，应当理解，本发明不限于具体举例说明的材料或工艺参数，因为其当然可以变化。还应理解的是，本文中使用的术语仅是为了描述本发明的一些具体实施方案，并非旨在对描述本发明的替代术语的用途进行限制。
出于所有目的，本文中引用的所有出版物、专利和专利申请(无论上文或下文)均在此通过引用整体并入。
除非所述内容另有明确指出，否则本说明书及所附权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。例如，提及的“聚合物”包括两种或更多种此类分子的混合物或不同分子量的单一聚合物种类的混合物，提及的“合成纳米载体”包括两种或更多种此类合成纳米载体的混合物或多种这样的合成纳米载体，提及的“RNA分子”包括两种或更多种此类RNA分子的混合物或多种这样的RNA分子，提及的“免疫抑制剂”包括两种或更多种此类材料的混合物或多种这样的免疫抑制剂分子等。
本文中使用的术语“包含/包括”或其变化形式应理解为指包括引用的任何整体(例如特点、要素、特征、特性、方法/处理步骤或限制)或整体(例如特点、要素、特征、特性、方法/处理步骤或限制)的组，但不排除任何其他整体或整体的组。因此，本文中使用的术语“包含/包括”是包括性的并且不排除另外的未引用整体或方法/处理步骤。
在本文中提供任一种组合物和方法的一些实施方案中，可用“基本由...组成”或“由...组成”来替代“包含/包括”。本文中使用的短语“基本由...组成”要求指定的整体或步骤以及不显著影响所要求保护之发明的特征或功能的那些。本文中使用的术语“由...组成”仅用于指所引用的整体(例如特点、要素、特征、特性、方法/处理步骤或限制)或整体(例如特点、要素、特征、特性、方法/处理步骤或限制)的组的存在。
A.引言
本文中提供的方法、组合物或药盒可用于在已发生针对治疗性大分子的抗体应答的对象中提高该治疗性大分子的药效学作用。因此，本文中提供的方法或组合物或药盒可用于提高治疗性大分子的药效学作用(其否则由于抗治疗性大分子抗体应答而减弱)。不受特定理论的限制，认为可使用所提供的方法、组合物或药盒来降低针对治疗性大分子的不期望体液免疫应答。在一些实施方案中，所述方法、组合物或药盒可用于使对象对治疗性大分子产生耐受性，降低当在不伴随施用所提供的免疫抑制剂剂量的情况下施用治疗性大分子时将否则产生的不期望免疫应答，所述剂量可重复地伴随施用。此类不期望免疫应答可导致对治疗性大分子的清除增强或对治疗性大分子之治疗活性的其他干扰。因此，作为不期望免疫应答降低的结果，用本文所提供的方法、组合物或药盒可增强治疗性大分子的药效学作用和/或可使用治疗性大分子的降低的剂量来实现相同作用水平。因此，作为不期望免疫应答降低的另一结果，可向对象施用治疗性大分子的重复给药。
已出乎意料且令人惊讶地发现，在抗治疗性大分子抗体应答存在下将免疫抑制剂(优选地，在一些实施方案中，当与合成纳米载体连接时)与治疗性大分子伴随施用可产生增强的药效学作用。例如，上述组合可有助于中和干扰治疗性大分子的期望治疗效果的抗治疗性大分子特异性抗体。在一些实施方案中，本文中提供的方法、组合物或药盒不仅降低针对治疗性大分子的不期望免疫应答，而且使得增强当单独施用治疗性大分子时否则减弱的治疗性大分子的期望治疗效果(作为针对该治疗性大分子的不期望免疫应答的结果)。因此，本文中提供的方法、组合物或药盒可使对象获得治疗性大分子的治疗益处而无需提高治疗性大分子的剂量，而当在无本文中提供之本发明的益处的情况下施用时，为了补偿针对治疗性大分子的不期望免疫应答一般将提高治疗性大分子的剂量。令人惊讶的是，本文中提供的方法、组合物或药盒甚至允许向对象施用降低的治疗性大分子剂量以实现相同的治疗益处。
由于可用所提供的方法、组合物或药盒来抵消在用治疗性大分子进行治疗性治疗期间产生的不期望免疫应答，本发明可用于实现增强的药效学作用或者用于在其中产生或预期产生针对治疗性大分子之不期望免疫应答的对象中使用降低的药效学有效剂量。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述对象可以是处于这样的不期望免疫应答的风险之中的对象。
现在，将在下文中对本发明进行更详细的描述。
B.定义
“施用”意指以在药理学上可用的方式向对象提供物质。在一些实施方案中，该术语旨在包括“引起施用”。“引起施用”意指直接或间接地引起、促使、鼓励、帮助、诱导或指导另一方施用物质。
在用于向对象施用之组合物或剂量的情况下，“有效量”指该组合物或剂量在对象中产生一种或更多种期望应答的量，所述期望应答例如产生致耐受性免疫应答(例如，治疗性大分子特异性B细胞之增殖、活化、诱导、存活、募集的降低或者治疗性大分子特异性抗体之产生的降低)。在一些实施方案中，有效量为药效学有效量。因此，在一些实施方案中，有效量为本文中提供的组合物或剂量(或本文中提供的多个组合物或剂量)之产生本文中提供的一种或更多种期望药效学作用、治疗效果和/或免疫应答的任意量。该量可用于体外或体内目的。对于体内目的，所述量可以是临床医生认为可对需要治疗性大分子施用和/或针对它的抗原特异性免疫耐受的对象具有临床益处的量。
有效量可涉及降低不期望免疫应答的水平，但是在一些实施方案中，其涉及完全阻止不期望的免疫应答。有效量还可涉及延迟不期望免疫应答的发生。有效量还可以是产生期望治疗终点或期望治疗结果的量。在另一些实施方案中，有效量可涉及增强期望应答(例如治疗终点或结果)的水平。优选地，有效量在对象中引起针对抗原(例如治疗性大分子)的致耐受性免疫应答。可通过常规方法来监测上述任一项的实现。
在所提供之任一种方法的一些实施方案中，有效量为其中期望应答在对象中持续至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月或更久的量。在所提供之任一种组合物或方法的另一些实施方案中，有效量为在至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月或更久内产生可测量的期望应答的量。
当然，有效量将取决于所治疗的具体对象；病症、疾病或紊乱的严重程度；个体患者的参数，包括年龄、身体状况、身材和体重；治疗的持续时间；同时治疗(如果有的话)的性质；具体的施用途径以及在健康从业者的知识和经验范围内的类似因素。这些因素是本领域普通技术人员所公知的并且可仅用常规实验就可解决。一般优选使用最大剂量，即根据合理医疗判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员将理解，患者可由于医学原因、心理原因或实际上任何其他原因而坚持使用较低剂量或可耐受剂量。
一般来说，本发明组合物中免疫抑制剂和/或治疗性大分子的剂量指免疫抑制剂和/或治疗性大分子的量。或者，可基于提供期望量的免疫抑制剂和/或治疗性大分子的合成纳米载体的数量来施用所述剂量。
“抗治疗性大分子抗体应答”或“抗治疗性大分子特异性抗体应答”为作为施用治疗性大分子之结果的抗治疗性大分子特异性抗体的产生或用于产生此类抗体的过程的诱导。在一些实施方案中，这样的应答抵消治疗性大分子的治疗作用。
“抗原”意指B细胞抗原或T细胞抗原。“抗原的类型”意指共有相同或基本相同的抗原性特征的分子。在一些实施方案中，抗原可以是蛋白质、多肽、肽、脂蛋白、糖脂、多核苷酸、多糖或者包含在细胞中或在细胞内表达。在一些实施方案中，例如当抗原未经充分定义或表征时，抗原可包含在细胞或组织制备物、细胞碎片、细胞外来体、条件化培养基等中。
“抗原特异性的”指由于该抗原或其一部分的存在而产生的任何免疫应答或产生特异性地识别或结合该抗原之分子的任何免疫应答。在一些实施方案中，当抗原包含治疗性大分子时，抗原特异性的可意指治疗性大分子特异性的。例如，当免疫应答是抗原特异性抗体产生(例如治疗性大分子特异性抗体产生)时，产生特异性地结合该抗原(例如治疗性大分子)的抗体。作为另一个实例，当免疫应答是抗原特异性B细胞或CD4+ T细胞增殖和/或活性时，增殖和/或活性由识别单独或在与MHC分子、B细胞等的复合物中的抗原或其一部分引起。
“评估药效学作用”指对体外或体内药效学作用的水平、存在或不存在、降低、提高等的任何测量或确定。可对从对象获得的一份或更多份样品进行这样的测量或确定。可以以本文中提供的或本领域中另外已知的任一种方法来进行这样的评估。
“处于风险之中”的对象为健康从业者认为具有患疾病、紊乱或病症的可能性的对象，或者为健康从业者认为具有经历本文中所提供的不期望抗治疗性大分子抗体应答的可能性并且将受益于本文中提供的组合物和方法的对象。在本文中提供的任一种方法、组合物或药盒的一个实施方案中，所述对象为处于具有针对治疗性大分子之抗治疗性大分子抗体应答的风险之中的对象。在本文中提供的任一种方法、组合物或药盒的另一个实施方案中，所述对象为预期具有针对治疗性大分子的抗治疗性大分子抗体应答的对象。
“连接”或“连接的”或者“偶联”或“偶联的”(等)意指使一个实体(例如一个部分)与另一个实体化学结合。在一些实施方案中，连接是共价的，意指连接发生在两个实体之间存在共价键的情况下。在一些非共价实施方案中，非共价连接由非共价相互作用介导，所述非共价相互作用包括但不限于：电荷相互作用、亲和性相互作用、金属配位、物理吸附、主体-客体相互作用、疏水性相互作用、TT堆积相互作用、氢键合相互作用、范德华相互作用、磁性相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用和/或其组合。在一些实施方案中，包封是连接的一种形式。
在一些实施方案中，治疗性大分子与免疫抑制剂彼此未连接，意指治疗性大分子和免疫抑制剂未经历特异性地意图使彼此化学缔合的过程。在一些实施方案中，治疗性大分子和/或免疫抑制剂未与合成纳米载体连接，意指治疗性大分子(和/或免疫抑制剂)和合成纳米载体未经历特异性地使彼此化学缔合的过程。
除非另有指出，否则本文中使用的术语“平均值”指算术平均值。
当应用于两种或更多种材料和/或药剂(在本文中也称为组分)时，“组合”旨在对其中两种或更多种材料/药剂相缔合的材料进行定义。可将组分单独标识，例如第一组分、第二组分、第三组分等。在该情况下的术语“组合的”和“组合”可作相应解释。
两种或更多种材料/药剂以组合相缔合可以是物理的或非物理的。物理缔合的组合材料/药剂的实例包括：
·包含混合的两种或更多种材料/药剂(例如在同一单位剂量内)的组合物(例如单一制剂)；
·包含其中两种或更多种材料/药剂经化学/物理化学连接(例如通过交联、分子聚集或与常见的载剂部分结合)的材料的组合物；
·包含其中两种或更多种材料/药剂经化学/物理化学共包装(例如，布置在脂囊泡、颗粒(例如微米颗粒或纳米颗粒)或乳剂微滴之上或之中)的材料的组合物；
·其中两种或更多种材料/药剂经共包装或共存在(例如作为一组单位剂量的一部分)的药盒、药物包装或患者包装；
经非物理缔合的组合材料/药剂的实例包括：
·包含两种或更多种材料/药剂中的至少一种的材料(例如非单一制剂)，附带有用于使该至少一种化合物/药剂临时缔合以形成这两种或更多种材料/药剂的物理缔合的说明书；
·包含两种或更多种材料/药剂中的至少一种的材料(例如非单一制剂)，附带有用于使用这两种或更多种材料/药剂进行联合治疗的说明书；
·包含两种或更多种材料/药剂中的至少一种的材料，附带有用于向已施用(或正在施用)该两种或更多种材料/药剂中的其他材料/药剂的患者群施用的说明书；
·以特异性地适合与两种或更多种材料/药剂中的其他材料/药剂组合使用的量或形式包含这两种或更多种材料/药剂中的至少一种的材料。
本文中使用的术语“联合治疗”旨在对治疗进行定义，其包括使用两种或更多种材料/药剂的组合(如下文所定义的)。因此，本申请中提及的材料/药剂的“联合治疗”、“组合”和“组合”使用可指作为同一总治疗方案的一部分施用的材料/药剂。因此，两种或更多种材料/药剂各自的剂量学可有所不同：每一种可在相同时间或不同时间施用。因此，应当理解，可依次(例如之前或之后)或同时(在同一药物制剂(即一起)中或者在不同药物制剂(即独立地)中)施用组合中的材料/药剂。在同一制剂中时，同时是作为单一制剂；而在不同药物制剂中时，同时为非单一的。两种或更多种材料/药剂各自在联合治疗中的剂量学在施用途径方面也可有所不同。
“伴随”意指将两种或更多种材料/药剂以时间上相关、优选时间上足够相关以提供对生理学或免疫学应答之调节的方式施用于对象，并且甚至更优选地将两种或更多种材料/药剂组合施用。在一些实施方案中，伴随施用可包括在指定时间内，优选在1个月内，更优选在1周内，仍更优选在1天内并且甚至更优选在1小时内施用两种或更多种材料/药剂。在一些实施方案中，可重复地伴随施用所述材料/药剂；即不止一次进行伴随施用，例如实施例中可提供的。
“确定”意指确知实际关系。确定可以以多种方式实现，包括但不限于进行实验或者作出预测。例如，可如下确定免疫抑制剂或治疗性大分子的剂量：以测试剂量开始并使用已知的缩放(scaling)技术(例如异速缩放或等速缩放)来确定施用剂量。这还可用于确定如本文中提供的方案。在另一个实施方案中，可通过在对象中测试多种剂量来确定所述剂量，即通过基于经验和指导数据进行直接试验。在一些实施方案中，“确定”包括“引起确定”。“引起确定”意指引起、促使、鼓励、帮助、诱导或指导实体确知实际关系或者与实体协同作用以使其确知实际关系；包括直接或间接地，或者明确或隐含地。
“剂型”意指在适合向对象施用的介质、载体、载剂或装置中的药理学和/或免疫学活性材料。本文中提供的任一种组合物或剂量均可以是剂型形式。
“剂量”指在给定时间内向对象施用的药理学和/或免疫学活性材料的具体量。
“包封”意指将至少一部分物质封装在合成纳米载体内。在一些实施方案中，将物质全部封装在合成纳米载体内。在另一些实施方案中，大部分或全部的经包封物质不暴露于合成载体外部的局部环境。在另一些实施方案中，不超过50％、40％、30％、20％、10％或5％(重量/重量)暴露于局部环境。包封与吸附不同，吸附将大部分或全部的物质置于合成载体的表面上并使物质暴露于合成纳米载体外部的局部环境。
“产生”意指自身直接或间接地引起作用例如发生生理学或免疫学应答(例如，致耐受性免疫应答)。
“鉴定对象”为这样的任何活动或活动集合，其允许临床医生将对象识别为可受益于本文中提供的方法、组合物或药盒的对象。优选地，经鉴定的对象为需要来自如本文中提供的治疗性大分子的治疗益处和其中已发生或预期发生抗治疗性大分子特异性抗体应答的对象。所述活动或活动集合可以本身直接采取或者间接采取。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括鉴定需要本文中提供的方法、组合物或药盒的对象。
“免疫抑制剂”意指这样的化合物，其导致APC具有免疫抑制作用或者T细胞或B细胞被抑制(例如，致耐受性作用)。免疫抑制作用一般指APC产生或表达降低、抑制或预防不期望的免疫应答或促进期望免疫应答(例如，调节性免疫应答)的细胞因子或其他因子。当APC在识别由该APC呈递之抗原的免疫细胞上获取免疫抑制功能(属于免疫抑制作用)时，认为该免疫抑制作用对所呈递的抗原具有特异性。不受任何特定理论的限制，认为：免疫抑制作用是免疫抑制剂被递送至APC的结果，优选在抗原存在下。在一个实施方案中，免疫抑制剂致使APC促进一个或更多个免疫效应细胞中的调节性表型。例如，调节性表型的特征可在于：抑制抗原特异性CD4+ T细胞或B细胞的产生、诱导、刺激或募集，抑制抗原特异性抗体的产生，Treg细胞(例如CD4+CD25高FoxP3+ Treg细胞)的产生、诱导、刺激或募集等。这可以是CD4+ T细胞或B细胞转化成调节性表型的结果。这也可以是其他免疫细胞(CD8+ T细胞、巨噬细胞和iNKT细胞)中诱导FoxP3的结果。在一个实施方案中，免疫抑制剂在其对抗原进行加工之后影响APC的应答。在另一个实施方案中，免疫抑制剂不干涉对抗原的加工。在另一个实施方案中，免疫抑制剂不是凋亡信号传导分子。在另一个实施方案中，免疫抑制剂不是磷脂。
免疫抑制剂包括但不限于：他汀类；mTOR抑制剂，例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物；TGF-β信号传导剂；TGF-β受体激动剂；组蛋白去乙酰化酶抑制剂，例如曲古抑菌素A；皮质类固醇；线粒体功能的抑制剂，例如鱼藤酮；P38抑制剂；NF-κβ抑制剂，例如6Bio、地塞米松、TCPA-1、IKK VII；腺苷受体激动剂；前列腺素E2激动剂(prostaglandin E2 agonist，PGE2)，例如米索前列醇；磷酸二酯酶抑制剂，例如磷酸二酯酶4抑制剂(phosphodiesterase4inhibitor，PDE4)，例如咯利普兰；蛋白酶体抑制剂；激酶抑制剂；G蛋白偶联受体激动剂；G蛋白偶联受体拮抗剂；糖皮质激素；类视黄醇；细胞因子抑制剂；细胞因子受体抑制剂；细胞因子受体激活剂；过氧化物酶体增殖物激活受体拮抗剂；过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂；组蛋白去乙酰化酶抑制剂；钙调神经磷酸酶抑制剂；磷酸酶抑制剂；PI3KB抑制剂，例如TGX-221；自噬抑制剂，例如3-甲基腺嘌呤；芳基烃受体抑制剂；蛋白酶体抑制剂I(proteasome inhibitor I，PSI)；以及氧化的ATP，例如P2X受体阻断剂。免疫抑制剂还包括：IDO、维生素D3、环孢素(例如环孢素A)、芳基烃受体抑制剂、白藜芦醇、硫唑嘌呤(azathiopurine，Aza)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine，6-MP)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine，6-TG)、FK506、萨菲菌素A(sanglifehrin A)、沙美特罗、吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil，MMF)、阿司匹林以及其他COX抑制剂、尼氟灭酸、雌三醇、甲氨喋呤和雷公藤内酯(triptolide)。在一些实施方案中，免疫抑制剂可包含本文中提供的药剂中的任一种。
免疫抑制剂可以是直接提供对APC的免疫抑制作用或者其可以是间接提供免疫抑制作用的化合物(即，在施用后以某种方式进行加工)。因此，免疫抑制剂包括本文中提供的任何化合物的前药形式。
在本文中提供之任一种方法、组合物或药盒的一些实施方案中，本文中提供的免疫抑制剂与合成纳米载体连接。在一些优选实施方案中，免疫抑制剂是除构成合成纳米载体之结构的材料之外的组分。例如，在一个实施方案中，当合成纳米载体由一种或更多种聚合物构成时，免疫抑制剂为除所述一种或更多种聚合物之外并与其连接的化合物。作为另一个实例，在一个实施方案中，当合成纳米载体由一种或更多种脂质构成时，免疫抑制剂仍为除所述一种或更多种脂质之外并与其连接。在一些实施方案中，例如当合成纳米载体的材料也引起免疫抑制作用时，免疫抑制剂为除合成纳米载体的材料之外存在的引起免疫抑制作用的组分。
其他示例性的免疫抑制剂包括但不限于：小分子药物、天然产物、抗体(例如针对CD20、CD3、CD4的抗体)、基于生物制品的药物、基于碳水化合物的药物、纳米颗粒、脂质体、RNAi、反义核酸、适配体、甲氨蝶呤、NSAID；芬戈莫德；那他珠单抗；阿仑单抗；抗-CD3；他克莫司(FK506)；细胞因子和生长因子，例如TGF-β和IL-10；等。另一些免疫抑制剂是本领域技术人员已知的并且本发明在此方面不受限制。
在本文中提供之任一种方法、组合物或药盒的一些实施方案中，免疫抑制剂是如纳米结晶形式的形式，由此免疫抑制剂的形式本身是颗粒或颗粒样。在一些实施方案中，这样的形式模拟病毒或其他外来病原体。很多药物是已被纳米化的并且本领域普通技术人员知晓用于产生这样的药物形式的合适方法。药物纳米晶体(例如纳米结晶雷帕霉素)是本领域普通技术人员已知的(Katteboinaa，等2009，International Journal of PharmTechResesarch；第1卷，第3期；第682-694页)。本文中使用的“药物纳米晶体”指不包含载体或基质材料的药物(例如，免疫抑制剂)的形式。在一些实施方案中，药物纳米晶体包含90％、95％、98％或99％或更多药物。用于产生药物纳米晶体的方法包括但不限于：研磨、高压均质化、沉淀、喷雾干燥、超临界溶液的迅速膨胀(rapid expansion of supercriticalsolution，RESS)、技术(Baxter Healthcare)和Nanocrystal TechnologyTM(Elan Corporation)。在一些实施方案中，表面活性剂或稳定剂可用于药物纳米晶体的空间或静电稳定性。在一些实施方案中，免疫抑制剂的纳米晶体或纳米结晶形式可用于提高免疫抑制剂(特别是不溶性或不稳定的免疫抑制剂)的溶解度、稳定性和/或生物利用度。在一些实施方案中，将降低的药效学有效剂量的治疗性大分子与纳米结晶形式的免疫抑制剂伴随施用产生降低的抗治疗性大分子抗体应答。
当与合成纳米载体连接时，“载量”为基于整个合成纳米载体中材料的总干配方重量之与合成纳米载体连接的免疫抑制剂和/或治疗性大分子的量(重量/重量)。一般来说，将这样的载量计算为整个合成纳米载体群的平均值。在一个实施方案中，基于所有合成纳米载体的平均值，所述载量为0.1％至99％。在另一个实施方案中，所述载量为0.1％至50％。在另一个实施方案中，免疫抑制剂/或治疗性大分子的载量为0.1％至20％。在另一个实施方案中，免疫抑制剂/或治疗性大分子的载量为0.1％至10％。在又一个实施方案中，免疫抑制剂/或治疗性大分子的载量为1％至10％。在又一个实施方案中，免疫抑制剂的载量为7％至20％。在又一个实施方案中，基于整个合成纳米载体群的平均值，免疫抑制剂/或治疗性大分子的载量为至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在又一个实施方案中，基于整个合成纳米载体群的平均值，免疫抑制剂/或治疗性大分子的载量为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在上述实施方案的一些实施方案中，基于整个合成纳米载体群的平均值，免疫抑制剂/或治疗性大分子的载量为不超过25％。在一些实施方案中，可如实施例中所述或者如本领域中另外已知的计算载量。
在一些实施方案中，当免疫抑制剂的形式本身是颗粒或颗粒样(例如纳米结晶免疫抑制剂)时，免疫抑制剂的载量为颗粒等中免疫抑制剂的量(重量/重量)。在这样的一些实施方案中，载量可接近97％、98％、99％或更多。
“合成纳米载体的最大尺寸”意指沿合成纳米载体之任意轴测量的该纳米载体的最大尺寸。“合成纳米载体的最小尺寸”意指沿合成纳米载体之任意轴测量的该合成纳米载体的最小尺寸。例如，对于球形合成纳米载体，合成纳米载体的最大尺寸和最小尺寸基本相同并且是其直径的尺寸。类似地，对于立方形合成纳米载体，合成纳米载体的最小尺寸是其高度、宽度或长度中的最小者，而合成纳米载体的最大尺寸是其高度、宽度或长度中的最大者。在一个实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数，该样品中至少75％，优选至少80％，更优选至少90％的合成纳米载体的最小尺寸等于或大于100nm。在一个实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数，该样品中至少75％，优选至少80％，更优选至少90％的合成纳米载体的最大尺寸等于或小于5μm。优选地，基于样品中合成纳米载体的总数，该样品中至少75％，优选至少80％，更优选至少90％的合成纳米载体的最小尺寸大于110nm，更优选大于120nm，更优选大于130nm，并且更优选还大于150nm。合成纳米载体的最大尺寸和最小尺寸的纵横比可根据实施方案而不同。例如，合成纳米载体的最大尺寸∶最小尺寸的纵横比可以是1∶1至1,000,000∶1，优选1∶1至100,000∶1，更优选1∶1至10,000∶1，更优选1∶1至1000∶1，仍更优选1∶1至100∶1并且还更优选1∶1至10∶1。优选地，基于样品中合成纳米载体的总数，该样品中至少75％，优选至少80％，更优选至少90％的合成纳米载体的最大尺寸等于或小于3μm，更优选等于或小于2μm，更优选等于或小于1μm，更优选等于或小于800nm，更优选等于或小于600nm，并且更优选还等于或小于500nm。在一些优选实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数，该样品中至少75％，优选至少80％，更优选至少90％的合成纳米载体的最小尺寸等于或大于100nm，更优选地等于或大于120nm，更优选等于或大于130nm，更优选等于或大于140nm，并且更优选还等于或大于150nm。在一些实施方案中，可如下获得合成纳米载体尺寸(例如，有效直径)的测量：使合成纳米载体混悬于液体介质(通常为水性介质)中并使用动态光散射(dynamic light scattering，DLS)(例如使用BrookhavenZetaPALS仪器)。例如，可将合成纳米载体的混悬液从水性缓冲液稀释到纯水中以获得约0.01mg/mL至0.1mg/mL的最终合成纳米载体混悬液浓度。可在用于DLS分析的合适比色皿内直接制备经稀释的混悬液或者可将经稀释的混悬液转移至用于DLS分析的合适比色皿。然后，可将比色皿放置在DLS中，允许平衡至受控温度，随后基于针对介质之黏度和样品之折射指数的合适输入，扫描足够的时间以获取稳定且可重现的分布。然后，报道有效直径或分布的平均值。确定高纵横比或非球形合成纳米载体的有效尺寸可需要放大技术(例如电子显微术)以获得更准确的测量。合成纳米载体的“尺寸”或“大小”或“直径”意指例如使用动态光散射获得的颗粒大小分布的平均值。
“非甲氧基封端的聚合物”意指至少一个末端以不同于甲氧基的部分结尾的聚合物。在一些实施方案中，所述聚合物具有至少两个以不同于甲氧基的部分结尾的末端。在另一些实施方案中，所述聚合物没有以甲氧基结尾的末端。“非甲氧基封端的普朗尼克聚合物”意指不同于两端都具有甲氧基的线性普朗尼克聚合物的聚合物。本文中提供的聚合物纳米颗粒可包含非甲氧基封端的聚合物或非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。
“可药用赋形剂”或“可药用载体”意指与药理学活性材料一起使用以配制组合物的药理学惰性材料。可药用赋形剂包括本领域中已知的多种材料，包括但不限于：糖类(例如葡萄糖、乳糖等)、防腐剂(例如抗微生物剂)、重构助剂(reconstitution aid)、着色剂、盐水(例如磷酸缓冲盐水)和缓冲剂。
“药效学响应”的“药效学作用”意指由施用治疗性大分子引起的任何生理学或免疫学应答。这样的应答可以是期望的应答，例如与治疗效果相关的应答。在一些实施方案中，已发现当在抗治疗性大分子抗体应答存在下施用时，本文中提供的方法、组合物或药盒产生增强的药效学作用，例如增强的治疗效果。在一些情况下，可使用与在抗治疗性大分子抗体应答存在下不与本文中提供的免疫抑制剂剂量伴随施用时施用的治疗性大分子剂量相同或低于它的治疗性大分子剂量获得增强的药效学作用。可通过标准方法来评价材料或/药剂是否是药效学上有效的。在一些实施方案中，将在抗治疗性大分子抗体应答存在下使用所提供的方法、组合物或药盒的药效学作用与不按此但仍在抗治疗性大分子抗体应答存在下施用治疗性大分子时的药效学作用进行比较。在一些实施方案中，当在抗治疗性大分子抗体应答存在下单独施用治疗性大分子时，比较针对药效学作用。一般来说，在于抗治疗性大分子抗体应答存在下施用时评估药效学作用，因为期望方法、组合物或药盒有效地克服这样的应答。因此，在正发生这样的应答时确定药效学作用。
“方案”意指向对象施用的模式并且包括针对对象之一种或更多种物质的任何给药方案。方案由要素(或变量)构成，因此方案包含一个或更多个要素。方案的所述要素可包括给药量、给药频率、施用途径、给药持续时间、给药速率、给药间隔、上述任一项的组合等。在一些实施方案中，这样的方案可用于向一个或更多个测试对象施用本发明的一种或更多种组合物。然后，可对这些测试对象中的免疫应答进行评估以确定该方案是否有效地产生期望的药效学作用或者期望的药效学作用水平。作为前述免疫应答的替代或除前述免疫应答之外，还可对任何其他治疗和/或免疫学效果进行评估。可先前在测试对象(例如非人对象)中证明过方案的一个或更多个要素，随后将其转化成人方案。例如，可使用已有技术例如异速缩放或其他缩放方法将在非人对象中证明的给药剂量缩放为人方案的要素。不管方案是否具有期望的效果，其均可使用本领域中提供的或本领域中另外已知的任何方法确定。例如，样品可获自已经根据特定方案向其施用本文中提供的组合物的对象以确定特定的免疫细胞、细胞因子、抗体等是否得以降低、产生、激活等。可用于检测免疫细胞的存在和/或数量的方法包括但不限于：流式细胞术法(例如，FACS)、ELISpot、增殖应答、细胞因子产生和免疫组织化学法。用于对免疫细胞标志物进行特异性染色的抗体及其他结合剂均是市售可得的。这样的药盒通常包含针对抗原的染色试剂，其允许从异质细胞群对期望的细胞群进行基于FACS的检测、分离和/或量化。在一些实施方案中，使用所述方案包含的一个或更多个要素或者全部或基本全部要素向另一对象施用本文中提供的多种组合物。在一些实施方案中，已证明所述方案导致针对治疗性大分子的抗体应答降低和/或产生提高的药效学作用。
“提供”意指个体进行的供给用于实施本发明的所需项目或项目组或方法的活动或活动集合。所述活动或活动集合可本身直接采取或者间接采取。
“提供对象”为这样的任何活动或活动集合，其引起临床医生与对象接触并向其施用本文中提供的组合物或者对其进行本文中提供的方法。优选地，所述对象是需要治疗性大分子施用和针对它的抗原特异性免疫耐受的对象。所述活动或活动集合可本身直接采取或者间接采取。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括提供对象。
“记录增强的药效学作用”意指以任何书写或电子形式记录治疗性大分子剂量在实际的、预期的或怀疑的抗治疗性大分子抗体应答存在下实现增强的药效学作用，或者在期待这样的记录发生时直接或间接导致这些活动。一般来说，在这些情况下，基于在本文中提供的伴随施用时获得的信息，已预期如果不与本文中提供的免疫抑制剂剂量一起施用(例如，单独施用)，治疗性大分子剂量在抗治疗性大分子抗体应答存在下不会实现增强的药效学作用。例如，在这些情况下，预期如果不与免疫抑制剂剂量一起施用治疗性大分子的有效性将被减弱，但是在本文中提供的伴随施用下却观察到增强的药效学作用。在一些情况下，记录发生在将免疫抑制剂剂量与治疗性大分子剂量组合施用于对象时或此后的某点。在这些实施方案中的一些中，与在抗治疗性大分子抗体应答存在下不与免疫抑制剂剂量一起施用时的治疗性大分子剂量相比，治疗性大分子剂量有所降低(或者不超过该剂量)。本文中使用的“手写形式”指在介质例如纸上的任何记录。本文中使用的“电子形式”指在电子介质上的任何记录。本文中提供的任一种方法还可包括记录根据本文中提供的方法接受治疗的对象中的治疗和/或免疫应答的步骤。
“降低的药效学有效剂量”指这样的降低的治疗性大分子量，与当不与免疫抑制剂剂量一起施用时(例如，当单独施用治疗性大分子时)的治疗性大分子量相比，当如本文中提供的与免疫抑制剂剂量伴随施用时其可实现类似的药效学作用。如本文中所使用的，类似的药效学作用为在以相同方式测量的另一水平的一个log内的作用水平。优选地，类似药效学作用的差异不超过5倍。仍更优选地，类似药效学作用的差异不超过2倍。
“对象”意指动物，包括温血哺乳动物，例如人和灵长类动物；禽类；驯养的家养或农场动物，例如猫、狗、绵羊、山羊、牛、马和猪；实验室动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠；鱼；爬行动物；动物园动物和野生动物；等。
“合成纳米载体”意指不存在于自然界中并且至少一个维度的尺寸小于或等于5微米的离散物体。白蛋白纳米颗粒一般作为合成纳米载体包括在内，然而在某些实施方案中，合成纳米载体不包括白蛋白纳米颗粒。在一些实施方案中，合成纳米载体不包含壳聚糖。在另一些实施方案中，合成纳米载体不是基于脂质的纳米颗粒。在另一些实施方案中，合成纳米载体不包含磷脂。
合成纳米载体可以是，但不限于以下中的一种或多种：基于脂质的纳米颗粒(在本文中也称为脂质纳米颗粒，即构成其结构的大部分材料为脂质的纳米颗粒)、聚合物纳米颗粒、金属纳米颗粒、基于表面活性剂的乳剂、树状聚体、巴基球、纳米线、病毒样颗粒(即，主要由非感染性或具有低感染性的病毒结构蛋白构成的颗粒)、基于肽或蛋白质的颗粒(在本文中也称为蛋白质颗粒，即，构成其结构的大部分材料是肽或蛋白质的颗粒)(例如白蛋白纳米颗粒)和/或使用纳米材料之组合开发的纳米颗粒(例如脂质-聚合物纳米颗粒)。合成纳米载体可以是多种不同的形状，包括但不限于：球形、立方形、棱锥形、长方形、圆柱形、环形等。根据本发明的合成纳米载体包括一个或更多个表面。可适用于实施本发明的示例性合成纳米载体包括：(1)Gref等的美国专利5,543,158中公开的生物可降解纳米颗粒，(2)Saltzman等的公开的美国专利申请20060002852中的聚合物纳米颗粒，(3)DeSimone等的公开的美国专利申请20090028910中以平版印刷方式构建的纳米颗粒，(4)von Andrian等的WO 2009/051837的公开内容，(5)Penades等的公开的美国专利申请2008/0145441中公开的纳米颗粒，(6)de los Rios等的公开的美国专利申请20090226525中公开的蛋白质纳米颗粒，(7)Sebbel等的公开的美国专利申请20060222652中公开的病毒样颗粒，(8)Bachmann等的公开的美国专利申请20060251677中公开的核酸连接的病毒样颗粒，(9)WO2010047839A1或WO2009106999A2中公开的病毒样颗粒，(10)P.Paolicelli等，“Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-likeParticles”Nanomedicine.5(6)：843-853(2010)中公开的经纳米沉淀的纳米颗粒，(11)美国公开2002/0086049中公开的凋亡细胞、凋亡体或者合成或半合成模拟物，或者(12)Look等，Nanogel-based delivery of mycophenolic acid ameliorates systemic lupuserythematosus in mice”J.Clinical Investigation 123(4)：1741-1749(2013)中的那些。在一些实施方案中，合成纳米载体的纵横比可以大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7，或大于1∶10。
最小尺寸等于或小于约100nm、优选等于或小于100nm之根据本发明的合成纳米载体不包含具有激活补体的羟基的表面，或者作为替代地包含基本由不是激活补体之羟基的部分组成的表面。在一个优选实施方案中，最小尺寸等于或小于约100nm、优选等于或小于100nm之根据本发明的合成纳米载体不包含显著激活补体的表面，或者作为替代地包含基本由不显著激活补体的部分组成的表面。在一个更优选的实施方案中，最小尺寸等于或小于约100nm、优选等于或小于100nm之根据本发明的合成纳米载体不包含激活补体的表面，或者作为替代地包含基本由不激活补体的部分组成的表面。在一些实施方案中，合成纳米载体不包括病毒样颗粒。在一些实施方案中，合成纳米载体的纵横比可以大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7，或大于1∶10。
“治疗性大分子”指可向对象施用并且具有治疗效果的任何蛋白质、碳水化合物、脂质或核酸。在一些实施方案中，向对象施用治疗性大分子可引起不期望的免疫应答，包括抗治疗性大分子特异性抗体的产生。如本文中所述的，将治疗性大分子与免疫抑制剂剂量伴随施用可增强该治疗性大分子的治疗有效性，例如通过降低针对它的不期望免疫应答。在一些实施方案中，治疗性大分子可以是治疗性多核苷酸或治疗性蛋白质。
“治疗性多核苷酸”意指可向对象施用并且具有治疗效果的任何多核苷酸或基于多核苷酸的治疗。这样的治疗包括基因沉默。这样的治疗的实例在本领域中是已知的并且包括但不限于：裸RNA(包括信使RNA、经修饰的信使RNA以及RNAi的形式)。本文中的其他部分还提供了其他治疗性多核苷酸的实例。治疗性多核苷酸可在细胞中产生、在细胞上产生或者由细胞产生，并且还可使用无细胞体外方法获得或者由完全体外合成方法获得。因此，对象包括需要前述任何治疗性多核苷酸进行治疗的任何对象。这样的对象包括将接受前述任何治疗性多核苷酸的那些。
“治疗性蛋白质”意指可向对象施用并且具有治疗效果的任何蛋白质或基于蛋白质的治疗。这样的治疗包括蛋白质替代或蛋白质补充治疗。这样的治疗还包括施用外源或外来蛋白质、抗体治疗和细胞治疗或基于细胞的治疗。治疗性蛋白质包括但不限于：酶、酶辅因子、激素、凝血因子、细胞因子、生长因子、单克隆抗体、抗体-药物缀合物和多克隆抗体。本文中的其他部分还提供了其他治疗性蛋白质的实例。治疗性蛋白质可在细胞中产生、在细胞上产生或者由细胞产生，并且可从这样的细胞获得或者以这样的细胞的形式施用。在一些实施方案中，治疗性蛋白质在哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、细菌细胞、植物细胞、转基因动物细胞、转基因植物细胞等中产生、在其上产生或者由其产生。治疗性蛋白质可在这样的细胞中重组产生。治疗性蛋白质可在经病毒转化的细胞中产生、在其上产生或者由其产生。因此，对象可包括需要前述任何治疗性蛋白质进行治疗的任何对象。这样的对象包括将接受前述任何治疗性蛋白质的那些。
“治疗性大分子APC可呈递抗原”意指与治疗性大分子相关的抗原(即，治疗性大分子或其可产生针对该治疗性大分子的免疫应答(例如，抗治疗性大分子特异性抗体的产生)的片段)。一般来说，治疗性大分子抗原呈递细胞(APC)可呈递抗原可被呈递为被免疫系统(例如，免疫系统中的细胞，例如通过抗原呈递细胞呈递的细胞，包括但不限于树突细胞、B细胞或巨噬细胞)识别。治疗性大分子APC可呈递抗原可被呈递为被例如T细胞识别。这样的抗原可通过呈递与I类或II类主要组织相容性复合物分子(major histocompatabilitycomplex molecule，MHC)结合之抗原的表位而被T细胞识别并触发T细胞中的免疫应答。治疗性大分子APC可呈递抗原一般包括蛋白质、多肽、肽、多核苷酸、脂蛋白或者包含在细胞中或者在细胞内表达、细胞上表达或由细胞表达。在一些实施方案中，治疗性大分子抗原与合成纳米载体连接，并且包含MHC I类限制性表位和/或MHC II类限制性表位和/或B细胞表位。优选地，用本文中提供的方法、组合物或药盒引起治疗性大分子特异性的一种或更多种致耐受性免疫应答。在一些实施方案中，合成纳米载体群不包含添加的治疗性大分子APC可呈递抗原，意指在合成纳米载体制备期间未有意地向其中添加显著量的治疗性大分子APC可呈递抗原。
“不期望的免疫应答”指这样的任何不期望免疫应答，其是由暴露于抗原引起的、促进或加重本文中提供疾病、紊乱或病症(或其症状)，或者其为本文中提供的疾病、紊乱或病症的症状。这样的免疫应答一般对对象的健康具有不良影响或者为对对象之健康的不良影响的症状。不期望的免疫应答包括抗原特异性抗体产生、抗原特异性B细胞增殖和/或活性或抗原特异性CD4+ T细胞增殖和/或活性。一般来说，这些不期望的免疫应答可以是治疗性大分子特异性的并且抵消施用所述治疗性大分子所期望的有益效果。因此，在一些实施方案中，不期望的免疫应答为抗治疗性大分子抗体应答。
C.组合物及相关方法
本文中提供了包含免疫抑制剂和治疗性大分子的组合物以及相关的方法或药盒。这样的方法、组合物或药盒可用于在抗治疗性大分子抗体应答存在下增强治疗性大分子的药效学作用，例如通过降低或抑制减弱治疗性大分子之治疗益处的治疗性大分子特异性的不期望免疫应答。这样的方法、组合物或药盒还可用于允许治疗性大分子的重复给药。因此，本文中提供的方法、组合物或药盒可用于实现或增强治疗性大分子的期望治疗效果。在一些实施方案中，可在降低的药效学有效剂量下实现或增强这样的治疗效果。所提供的方法、组合物或药盒可用于需要治疗性大分子的治疗益处的任何对象。
如上所述，发现在抗治疗性大分子抗体应答存在下将免疫抑制剂(优选地，在一些实施方案中，当与合成纳米载体连接时)与治疗性大分子伴随递送可产生增强的药效学作用，包括甚至在降低的治疗性大分子剂量下所述作用的增强。例如，所述方法、组合物或药盒可有助于中和干扰治疗性大分子的期望治疗效果的抗治疗性大分子特异性抗体。因此，本文中提供的方法、组合物或药盒可使得增强治疗性大分子之当不将治疗性大分子与免疫抑制剂剂量一起施用时(例如，当单独施用治疗性大分子时)否则减弱的期望治疗效果。因此，在一些实施方案中，本文中提供的方法、组合物或药盒允许对象获得治疗性大分子的治疗益处而无需提高治疗性大分子的剂量，而当在无本文中提供之本发明的益处的情况下施用时，为了补偿针对治疗性大分子的不期望免疫应答一般将提高治疗性大分子的剂量。令人惊讶的是，本文中提供的方法、组合物或药盒甚至允许向对象施用降低的治疗性大分子剂量就可在抗治疗性大分子抗体应答存在下获得相同或更佳的治疗益处。
多种免疫抑制剂可用于实施本发明，优选地，免疫抑制剂与合成纳米载体连接。根据本发明，可使用多种合成纳米载体。在一些实施方案中，合成纳米载体为球体或球状体。在一些实施方案中，合成纳米载体是平的或板状的。在一些实施方案中，合成纳米载体为立方体物或者是立方体的。在一些实施方案中，合成纳米载体为卵形或椭圆形。在一些实施方案中，合成纳米载体为圆柱体、圆锥体或棱锥体。
在一些实施方案中，期望使用在尺寸或形状方面相对均一的合成纳米载体群使得每个合成纳米载体具有类似的特性。例如，基于合成纳米载体的总数，至少80％、至少90％或至少95％的合成纳米载体的最大尺寸或最小尺寸可落入合成纳米载体之平均直径或平均尺寸的5％、10％或20％内。
合成纳米载体可以是实心的或中空的并且可包含一个或更多个层。在一些实施方案中，相对于其他层，每个层均具有独特的组成和独特的特性。仅为了给出一个实例，合成纳米载体可具有芯/壳结构，其中芯为一个层(例如聚合物芯)而壳为第二层(例如脂质双层或单层)。合成纳米载体可包含多个不同的层。
在一些实施方案中，合成纳米载体可任选地包含一种或更多种脂质。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含脂质体。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含脂质双层。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含脂质单层。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含胶束。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含由脂质层(例如，脂质双层、脂质单层等)包围的包含聚合物基质的芯。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含由脂质层(例如，脂质双层、脂质单层等)包围的非聚合物芯(例如，金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒、骨颗粒、病毒颗粒、蛋白质、核酸、碳水化合物等)。
在另一些实施方案中，合成纳米载体可包含金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒等。在一些实施方案中，非聚合物合成纳米载体是非聚合物组分的聚集体，例如金属原子(例如，金原子)的聚集体。
在一些实施方案中，合成纳米载体可任选地包含一种或更多种两亲性实体。在一些实施方案中，两亲性实体可促进产生稳定性提高、均匀性提高或黏度提高的合成纳米载体。在一些实施方案中，两亲性实体可与脂质膜(例如，脂质双层、脂质单层等)的内表面相缔合。本领域中已知的很多两亲性实体均适用于制备根据本发明的合成纳米载体。这样的两亲性实体包括但不限于：磷酸甘油酯；磷脂酰胆碱；二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)；二油烯基磷脂酰乙醇胺(DOPE)；二油烯氧基丙基三乙铵(DOTMA)；二油酰磷脂酰胆碱；胆固醇；胆固醇酯；二酰甘油；琥珀酸二酰甘油酯；二磷脂酰甘油(DPPG)；十六烷醇(hexanedecanol)；脂肪醇，例如聚乙二醇(PEG)；聚氧乙烯-9-月桂基醚；表面活性脂肪酸，例如棕榈酸或油酸；脂肪酸；脂肪酸单甘油酯；脂肪酸二甘油酯；脂肪酸酰胺；去水山梨糖醇三油酸酯(
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85)甘氨胆酸盐；去水山梨糖醇单月桂酸酯(
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20)；聚山梨醇酯20(
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20)；聚山梨醇酯60(
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60)；聚山梨醇酯65(
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65)；聚山梨醇酯80(
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80)；聚山梨醇酯85(85)；聚氧乙烯单硬脂酸酯；表面活性素；泊洛沙姆；去水山梨糖醇脂肪酸酯，例如去水山梨糖醇三油酸酯；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)；心磷脂；磷脂酸；脑苷脂；磷酸二鲸蜡酯；二棕榈酰磷脂酰甘油；硬脂酰胺；十二烷胺；十六烷胺；乙酰棕榈酸酯；蓖麻醇酸甘油酯；硬脂酸十六烷酯；肉豆蔻酸异丙酯；泰洛沙泊；聚(乙二醇)5000-磷脂酰乙醇胺；聚(乙二醇)400-单硬脂酸酯；磷脂；具有高表面活性剂特性的合成和/或天然洗涤剂；脱氧胆酸盐；环糊精；离液盐；离子配对剂；及其组合。两亲性实体组分可以是不同两亲性实体的混合物。本领域技术人员将认识到：这是具有表面活性剂活性之物质的示例性的非全面性列表。任何两亲性实体均可用于产生根据本发明使用的合成纳米载体。
在一些实施方案中，合成纳米载体可任选地包含一种或更多种碳水化合物。碳水化合物可以是天然的或合成的。碳水化合物可以是衍生化的天然碳水化合物。在某些实施方案中，碳水化合物包含单糖或二糖，包括但不限于：葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺和神经氨酸。在某些实施方案中，碳水化合物为多糖，包括但不限于：普鲁兰多糖、纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟基纤维素(HC)、甲基纤维素(MC)、葡聚糖、环葡聚糖、糖原、羟乙基淀粉、角叉菜胶、糖苷配糖基(glycon)、直链淀粉、壳聚糖、N，O-羧甲基壳聚糖、藻胶和藻酸、淀粉、甲壳质、菊粉、魔芋、葡甘露聚糖、石耳素(pustulan)、肝素、透明质酸、凝胶多糖(curdlan)和黄原胶。在一些实施方案中，合成纳米载体不包含(或者特别排除)碳水化合物，例如多糖。在某些实施方案中，碳水化合物可包含碳水化合物衍生物，例如糖醇，包括但不限于：甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇和乳糖醇。
在一些实施方案中，合成纳米载体可包含一种或更多种聚合物。在一些实施方案中，合成纳米载体包含一种或更多种这样的聚合物，其为非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(重量/重量)聚合物为非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的所有聚合物均为非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在一些实施方案中，合成纳米载体包含一种或更多种这样的聚合物，其为非甲氧基封端的聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(重量/重量)聚合物为非甲氧基封端的聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的所有聚合物均为非甲氧基封端的聚合物。在一些实施方案中，合成纳米载体包含一种或更多种不含普朗尼克聚合物的聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(重量/重量)聚合物不包含普朗尼克聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的所有聚合物均不包含普朗尼克聚合物。在一些实施方案中，这样的聚合物可由包被层(例如，脂质体、脂质单层、胶束等)包围。在一些实施方案中，合成纳米载体中的多种组分可与聚合物连接。
可通过多种方法中的任一种来使免疫抑制剂和/或治疗性大分子与合成纳米载体连接。一般来说，连接可以是免疫抑制剂和/或治疗性大分子与合成纳米载体之间键合的结果。这种键合可导致免疫抑制剂和/或治疗性大分子与合成纳米载体的表面连接和/或包含(包封)在合成纳米载体中。然而，在一些实施方案中，由于合成纳米载体的结构的原因，免疫抑制剂和/或治疗性大分子被合成纳米载体包封而不是与合成纳米载体键合。在一些优选实施方案中，合成纳米载体包含本文中提供的聚合物，并且免疫抑制剂和/或治疗性大分子与聚合物连接。
当由于免疫抑制剂和/或治疗性大分子与合成纳米载体之间的键合而发生连接时，所述连接可经由偶联部分发生。偶联部分可以是免疫抑制剂和/或治疗性大分子通过它与合成纳米载体键合的任何部分。这样的部分包含共价键(例如酰胺键或酯键)以及使免疫抑制剂和/或治疗性大分子与合成纳米载体(共价或非共价)键合的独立分子。这样的分子包含接头或聚合物或其单元。例如，偶联部分可包含与免疫抑制剂和/或治疗性大分子静电结合的带电聚合物。作为另一个实例，偶联部分可包含与免疫抑制剂和/或治疗性大分子共价键合的聚合物或其单元。
在一些优选实施方案中，合成纳米载体包含本文中提供的聚合物。这些合成纳米载体可以是完全聚合物的或者其可以是聚合物与其他材料的混合物。
在一些实施方案中，合成纳米载体中的聚合物缔合以形成聚合物基质。在这些实施方案中的一些中，组分(例如免疫抑制剂或治疗性大分子)可与聚合物基质中的一种或更多种聚合物共价缔合。在一些实施方案中，共价缔合由接头介导。在一些实施方案中，组分可与聚合物基质中的一种或更多种聚合物非共价缔合。例如，在一些实施方案中，组分可包封在聚合物基质内、被聚合物基质包围和/或分散在聚合物基质中。作为替代或补充，组分与聚合物基质中的一种或更多种聚合物可通过疏水性相互作用、电荷相互作用、范德华力等缔合。多种聚合物以及用于由其形成聚合物基质的方法均是常规已知的。
聚合物可以是天然聚合物或非天然(合成)聚合物。聚合物可以是含有两个或更多个单体的均聚物或共聚物。就序列而言，共聚物可以是随机的、嵌段的，或者包含随机序列和嵌段序列的组合。通常来说，根据本发明的聚合物是有机聚合物。
在一些实施方案中，聚合物包含聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺或聚醚或其单元。在另一些实施方案中，聚合物包含聚(乙二醇)(PEG)、聚丙二醇、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物或聚己内酯或其单元。在一些实施方案中，优选地，聚合物是生物可降解的。因此，在这些实施方案中，优选地，如果聚合物包含聚醚(例如聚(乙二醇)、聚丙二醇或其单元)，则该聚合物包含聚醚和生物可降解聚合物的嵌段共聚物，使得该聚合物是生物可降解的。在另一些实施方案中，聚合物不仅包含聚醚或其单元，例如聚(乙二醇)或聚丙二醇或其单元。
适用于本发明中的聚合物的其他实例包括但不限于：聚乙烯、聚碳酸酯(例如聚(1，3-二
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烷-2酮))、聚酐(例如聚(癸二酐))、聚丙基富马酸酯、聚酰胺(例如聚己内酰胺)、聚缩醛、聚醚、聚酯(例如，聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯-乙交酯共聚物、聚己内酯、聚羟基酸(例如聚(β-羟基烷酸酯)))、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯以及聚胺、聚赖氨酸、聚赖氨酸-PEG共聚物和聚(乙烯亚胺)、聚(乙烯亚胺)-PEG共聚物。
在一些实施方案中，根据本发明的聚合物包括已由美国食品药品管理局(U.S.Food and Drug Administration，FDA)根据21C.F.R.§177.2600批准用于人的聚合物，包括但不限于：聚酯(例如，聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚己内酯、聚戊内酯、聚(1，3-二烷-2酮))；聚酐(例如，聚(癸二酐))；聚醚(例如，聚乙二醇)；聚氨酯；聚甲基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；和聚氰基丙烯酸酯。
在一些实施方案中，聚合物可以是亲水性的。例如，聚合物可包含阴离子基团(例如，磷酸根基团、硫酸根基团、羧酸根基团)；阳离子基团(例如，季胺基团)；或极性基团(例如，羟基、巯基、胺基)。在一些实施方案中，包含亲水性聚合物基质的合成纳米载体在合成纳米载体内产生亲水性环境。在一些实施方案中，聚合物可以是疏水性的。在一些实施方案中，包含疏水性聚合物基质的合成纳米载体在合成纳米载体内产生疏水性环境。对聚合物之亲水性或疏水性的选择可影响合成纳米载体中掺入(例如连接)的材料的性质。
在一些实施方案中，可用一个或更多个部分和/或官能团对聚合物进行修饰。根据本发明可使用多种部分或官能团。在一些实施方案中，可用聚乙二醇(PEG)、碳水化合物和/或由多糖衍生的无环聚缩醛对聚合物进行修饰(Papisov，2001，ACS Symposium Series，786：301)。某些实施方案可使用Gref等的美国专利No.5543158或Von Andrian等的WO公开WO2009/051837的一般性教导来进行。
在一些实施方案中，可用脂质或脂肪酸基团来对聚合物进行修饰。在一些实施方案中，脂肪酸基团可以是以下中的一种或更多种：丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸或二十四烷酸。在一些实施方案中，脂肪酸基团可以是以下中的一种或更多种：棕榈油酸、油酸、异油酸、亚油酸、α-亚油酸、γ-亚油酸、花生四烯酸、鳕油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸或芥酸。
在一些实施方案中，聚合物可以是聚酯，包含含有乳酸和乙醇酸单元的共聚物，例如聚乳酸-乙醇酸共聚物和聚丙交酯-乙交酯共聚物，在本文中将其统称为“PLGA”；以及含有乙醇酸单元的均聚物(在本文中称为“PGA”)和含有乳酸单元的均聚物，例如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D，L-乳酸、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯和聚-D，L-丙交酯(在本文中统称为“PLA”)。在一些实施方案中，示例性的聚酯包括例如：聚羟基酸；PEG共聚物及丙交酯和乙交酯的共聚物(例如，PLA-PEG共聚物、PGA-PEG共聚物、PLGA-PEG共聚物，及其衍生物。在一些实施方案中，聚酯包括例如：聚(己内酯)、聚(己内酯)-PEG共聚物、聚L-丙交酯-L-赖氨酸共聚物、聚(丝氨酸酯)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸]，及其衍生物。
在一些实施方案中，聚合物可以是PLGA。PLGA是乳酸和乙醇酸的生物相容性的生物可降解共聚物，并且多种PLGA形式通过乳酸∶乙醇酸之比来表征。乳酸可以是L-乳酸、D-乳酸或D，L-乳酸。可通过改变乳酸∶乙醇酸之比来调节PLGA的降解速率。在一些实施方案中，根据本发明使用的PLGA的特征在于：乳酸∶乙醇酸比例为约85∶15、约75∶25、约60∶40、约50∶50、约40∶60、约25∶75或约15∶85。
在一些实施方案中，聚合物可以是一种或更多种丙烯酸类聚合物。在某些实施方案中，丙烯酸类聚合物包括例如：丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酐)、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基烷酯共聚物、甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物、聚氰基丙烯酸酯以及包含前述聚合物中一种或更多种的组合。丙烯酸类聚合物可包括丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的具有低含量季铵基团的完全聚合的共聚物。
在一些实施方案中，聚合物可以是阳离子聚合物。一般来说，阳离子聚合物能够缩合和/或保护核酸的带负电链。含胺聚合物例如聚(赖氨酸)(Zauner等，1998，Adv.DrugDel.Rev.，30：97；和Kabanov等，1995，Bioconjugate Chem.，6：7)、聚(乙烯亚胺)(PEI；Boussif等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1995，92：7297)和聚(酰胺胺)树状聚体(Kukowska-Latallo等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，93：4897；Tang等，1996，Bioconjugate Chem.，7：703；和Haensler等，1993，Bioconjugate Chem.，4：372)在生理pH下带正电并且与核酸形成离子对。在一些实施方案中，合成纳米载体可不包含(或者可排除)阳离子聚合物。
在一些实施方案中，聚合物可以是携带阳离子侧链的可降解聚酯(Putnam等，1999，Macromolecules，32：3658；Barrera等，1993，J.Am.Chem.Soc.，115：11010；Kwon等，1989，Macromolecules，22：3250；Lim等，1999，J.Am.Chem.Soc.，121：5633；和Zhou等，1990，Macromolecules，23：3399)。这些聚酯的实例包括聚L-丙交酯-L-赖氨酸共聚物(Barrera等，1993，J.Am.Chem.Soc.，115：11010)、聚(丝氨酸酯)(Zhou等，1990，Macromolecules，23：3399)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)(Putnam等，1999，Macromolecules，32：3658；和Lim等，1999，J.Am.Chem.Soc.，121：5633)和聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)(Putnam等，1999，Macromolecules，32：3658；和Lim等，1999，J.Am.Chem.Soc.，121：5633)。
这些和其他聚合物的特性及其制备方法在本领域中是公知的(参见，例如，美国专利6,123,727；5,804,178；5,770,417；5,736,372；5,716,404；6,095,148；5,837,752；5,902,599；5,696,175；5,514,378；5,512,600；5,399,665；5,019,379；5,010,167；4,806,621；4,638,045；和4,946,929；Wang等，2001，J.Am.Chem.Soc.，123：9480；Lim等.，2001，J.Am.Chem.Soc.，123：2460；Langer，2000，Acc.Chem.Res.，33：94；Langer，1999，J.Control.Release，62：7；和Uhrich等，1999，Chem.Rev.，99：3181)。更一般地，用于合成某些合适聚合物的多种方法在以下中进行了描述：Concise Encyclopedia of PolymerScience and Polymeric Amines and Ammonium Salts，由Goethals编辑，PergamonPress，1980；Principles of Polymerization，Odian，John Wiley&Sons，第四版，2004；Contemporary Polymer Chemistry，Allcock等，Prentice-Hall，1981；Deming等，1997，Nature，390：386；以及美国专利6,506,577、6,632,922、6,686,446和6,818,732。
在一些实施方案中，聚合物可以是直链聚合物或支链聚合物。在一些实施方案中，聚合物可以是树状聚体。在一些实施方案中，聚合物可彼此基本交联。在一些实施方案中，聚合物可基本无交联。在一些实施方案中，可根据本发明在不经历交联步骤的情况下使用聚合物。还应当理解的是，合成纳米载体可包含前述及其他聚合物的嵌段共聚物、接枝共聚物、共混物、混合物和/或加合物。本领域技术人员将认识到，本文中所列举的聚合物代表可根据本发明使用之聚合物的示例性的非全面性列表。
在一些实施方案中，合成纳米载体不包含聚合物组分。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒等。在一些实施方案中，非聚合物合成纳米载体为非聚合物组分的聚集体，例如金属原子(例如，金原子)的聚集体。
根据本发明的组合物可包含与可药用赋形剂(例如防腐剂、缓冲剂、盐水和磷酸缓冲盐水)组合的组分。所述组合物可使用常规的药物制备和配合技术制成以实现可用的剂型。在一个实施方案中，将组合物(例如包含合成纳米载体的那些)与防腐剂一起混悬于无菌盐水溶液中以用于注射。
在一些实施方案中，当制备合成纳米载体作为载体时，用于使组分与合成纳米载体连接方法是可用的。如果组分是小分子，有利地可在组装合成纳米载体之前使该组分与聚合物连接。在一些实施方案中，还有利的是，可制备具有表面基团的合成纳米载体，其可用于通过使用这些表面基团来使组分与合成纳米载体连接，而非使组分与聚合物连接并然后在构建合成纳米载体中使用该聚合物缀合物。
在某些实施方案中，连接可以是共价接头。在一些实施方案中，根据本发明的组分可与外表面经由1，2，3-三唑接头共价连接，所述接头通过纳米载体之表面上的叠氮基与含有炔基之组分的1，3-偶极环加成反应形成或者通过纳米载体之表面上的炔与含有叠氮基之组分的1，3-偶极环加成反应形成。优选在Cu(I)催化剂以及合适Cu(I)配体和还原剂存在下进行这样的环加成反应以将Cu(II)化合物还原成催化活性的Cu(I)化合物。还可将这种Cu(I)催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)称为点击反应。
另外，共价连接可包含共价接头，其包括酰胺接头、二硫接头、硫醚接头、腙接头、酰肼接头、亚胺或肟接头、脲或硫脲接头、脒接头、胺接头和磺酰胺接头。
酰胺接头通过一种组分上的胺与第二组分(例如纳米载体)的羧酸基团之间的酰胺键形成。接头中的酰胺键可使用经适当保护的氨基酸和活化羧酸(例如N-羟基琥珀酰亚胺活化的酯)利用任何常规的酰胺键形成反应形成。
二硫接头通过在形式为例如R1-S-S-R2的两个硫原子之间形成二硫(S-S)键构成。二硫键可通过使含有巯基/硫醇基(-SH)的组分与聚合物或纳米载体上的另一个活化巯基进行巯基交换形成，或者通过使含有巯基/硫醇基的纳米载体与含有活化巯基的组分进行巯基交换形成。
三唑接头，特别是其中R1和R2可以是任何化学实体之
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形式的1，2，3-三唑，通过与第一组分(例如纳米载体)连接之叠氮化物和与第二组分(例如免疫抑制剂或治疗性大分子)连接之末端炔的1，3-偶极环加成反应形成。在存在或无催化剂，优选Cu(I)催化剂的情况下进行1，3-偶极环加成反应，其通过1，2，3-三唑功能将两种组分连接。Sharpless等，Angew.Chem.Int.第41(14)版，2596，(2002)和Meldal，等，Chem.Rev.，2008，108(8)，2952-3015对这一化学进行了详细描述，并且通常将其称为“点击”反应或CuAAC。
在一些实施方案中，制备聚合物链末端包含叠氮化合物或炔基团的聚合物。然后，使用这种聚合物以使得多个炔或叠氮化物基团位于合成纳米载体之表面的方式制备合成纳米载体。或者，可通过另一途径制备合成纳米载体并随后用炔或叠氮化物进行官能化。在炔(如果聚合物包含叠氮化物)基团或叠氮化物(如果聚合物包含炔)基团存在下制备该组分。然后，在催化剂存在或不存在下使该组分与纳米载体经由1，3-偶极环加成反应而反应，所述催化剂使该组分与颗粒通过1，4-二取代的1，2，3-三唑接头连接。
硫醚接头通过以例如R1-S-R2的形式形成硫-碳(硫醚)键构成。硫醚可通过一种组分上的巯基/硫醇基(-SH)与第二组分上的烷基化基团(例如卤化物或环氧化物)的烷基化形成。硫醚接头还可通过将一种组分上的巯基/硫醇基Michael加成到含有马来酰亚胺基团或乙烯砜基团作为Michael接受体之第二组分上的缺电子烯基团形成。在另一种方式中，硫醚接头可通过一种组分上的巯基/硫醇基与第二组分上的烯基团的自由基巯基-烯反应制备。
腙接头通过使一种组分上的酰肼基团与第二组分上的醛/酮基团反应形成。
酰肼接头通过使一种组分上的肼基团与第二组分上的羧酸基团反应形成。这样的反应一般使用与其中羧酸经活化试剂激活的酰胺键形成类似的化学来进行。
亚胺接头或肟接头通过使一种组分上的胺或N-烷氧基胺(或氨基氧基)基团与第二组分上的醛或酮基团反应形成。
脲或硫脲接头通过使一种组分上的胺基团与第二组分上的异腈酸酯或硫代异腈酸酯基团反应制备。
脒接头通过使一种组分上的胺基团与第二组分上的亚氨酸酯基团反应制备。
胺接头通过一种组分上的胺基团与第二组分上的烷基化基团(例如卤化物、环氧化物或磺酸酯基团)的烷基化反应形成。或者，胺接头还可通过使一种组分上的胺基团与第二组分上的醛或酮基团在合适还原剂(例如氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠)存在下进行还原胺化形成。
磺酰胺接头通过使一种组分上的胺基团与第二组分上的磺酰卤(例如磺酰氯)基团反应形成。
砜接头通过将亲核体Michael加成到乙烯砜形成。乙烯砜或亲核体可以在纳米载体的表面上或者与组分连接。
组分与纳米载体缀合还可通过非共价缀合方法缀合。例如，带负电的治疗性大分子或免疫抑制剂可与带正电的纳米载体通过静电吸附缀合。含有金属配体的组分可与含有金属复合物的纳米载体经由金属-配体复合物缀合。
在一些实施方案中，可在组装合成纳米载体之前使组分与聚合物(例如聚乳酸-乙二醇嵌段共聚物)连接，或者合成纳米载体可形成为在其表面上具有反应性或可活化基团。在后一种情况下，组分可使用与通过合成纳米载体之表面呈现的连接化学相容的基团制备。在另一些实施方案中，可使用合适的接头使肽组分与VLP或脂质体连接。接头为能够将两个分子连接在一起的化合物或试剂。在一个实施方案中，接头可以是Hermanson 2008中所述的同双功能试剂或异双功能试剂。例如，可在EDC存在下用同双功能接头己二酸二酰肼(adipic dihydrazide，ADH)处理表面上包含羧基的VLP或脂质体合成纳米载体以形成具有ADH接头的相应合成纳米载体。然后，使所得ADH连接的合成纳米载体经由该纳米载体上ADH接头的另一端与含有酸基团的肽组分缀合以产生相应的VLP或脂质体肽缀合物。
有关可用缀合方法的详细描述，参见Hermanson G T“BioconjugateTechniques”，第2版，由Academic Press出版，Inc.2008。除共价连接之外，组分可与预先形成的合成纳米载体通过吸附连接或者其可在形成合成纳米载体期间通过包封连接。
本文中提供的任何免疫抑制剂均可用于所提供的方法或组合物，并且在一些实施方案中，可与合成纳米载体连接。免疫抑制剂包括但不限于：他汀类；mTOR抑制剂，例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物；TGF-β信号传导剂；TGF-β受体激动剂；组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂；皮质类固醇；线粒体功能的抑制剂，例如鱼藤酮；P38抑制剂；NF-κβ抑制剂；腺苷受体激动剂；前列腺素E2激动剂；磷酸二酯酶抑制剂，例如磷酸二酯酶4抑制剂；蛋白酶体抑制剂；激酶抑制剂；G蛋白偶联受体激动剂；G蛋白偶联受体拮抗剂；糖皮质激素；类视黄醇；细胞因子抑制剂；细胞因子受体抑制剂；细胞因子受体激活剂；过氧化物酶体增殖物激活受体拮抗剂；过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂；组蛋白去乙酰化酶抑制剂；钙调神经磷酸酶抑制剂；磷酸酶抑制剂和氧化的ATP。免疫抑制剂还包括IDO、维生素D3、环孢素A、芳基烃受体抑制剂、白藜芦醇、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、阿司匹林、尼氟灭酸、雌三醇、雷公藤内酯、白介素(例如，IL-1、IL-10)、环孢素A、靶向细胞因子或细胞因子受体的siRNA等。
他汀类的实例包括：阿托伐他汀西立伐他汀、氟伐他汀(
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XL)、洛伐他汀
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美伐他汀
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匹伐他汀
Figure BDA0002259400510000356
瑞舒伐他汀
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瑞舒伐他汀和辛伐他汀
Figure BDA00022594005100003510
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mTOR抑制剂的实例包括：雷帕霉素及其类似物(例如，CCL-779、RAD001、AP23573、C20-甲基烯丙基雷帕霉素(C20-Marap)、C16-(S)-丁基磺酰氨基雷帕霉素(C16-Bsrap)、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素(C16-iRap)(Bayle等Chemistry&Biology 2006，13：99-107))、AZD8055、BEZ235(NVP-BEZ235)、大黄根酸(大黄酚)、地磷莫司(deforolimus，MK-8669)、依维莫司(RAD0001)、KU-0063794、PI-103、PP242、坦罗莫司和WYE-354(可获自Selleck，Houston，TX，USA)。
TGF-β信号传导剂的实例包括TGF-β配体(例如，活化素A、GDF1、GDF11、骨形态生成蛋白、nodal、TGF-β)及其受体(例如，ACVR1B、ACVR1C、ACVR2A、ACVR2B、BMPR2、BMPR1A、BMPR1B、TGFβRI、TGFβRII)、R-SMADS/co-SMADS(例如，SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5、SMAD8)和配体抑制剂(例如，卵泡抑素、头蛋白(noggin)、脊索蛋白(chordin)、DAN、lefty、LTBP1、THBS1、Decorin)。
线粒体功能的抑制剂的实例包括苍术苷(二钾盐)、米醇菌酸(三铵盐)、羰基氰化物间氯苯腙、羧基苍术苷(例如，来自欧苍术(Atractylis gummifera))、CGP-37157、(-)-鱼藤素(例如，来自绢毛萌豆(Mundulea sericea))、F16、己糖激酶II VDAC结合结构域肽、寡霉素、鱼藤酮、Ru360、SFK1和缬氨霉素(例如，来自极暗黄链霉菌(Streptomycesfulvissimus)(EMD4Biosciences，USA)。
P38抑制剂的实例包括SB-203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑)、SB-239063(反式-1-(4羟基环己基)-4-(氟苯基)-5-(2-甲氧基-嘧啶-4-基)咪唑)、SB-220025(5-(2氨基-4-嘧啶基)-4-(4-氟苯基)-1-(4-哌啶基)咪唑))和ARRY-797。
NF(例如，NK-κβ)抑制剂的实例包括IFRD1、2-(1，8-萘啶-2-基)苯酚、5-氨基水杨酸、BAY 11-7082、BAY 11-7085、CAPE(咖啡酸苯乙酯)、马来酸二乙酯、IKK-2抑制剂IV、IMD0354、乳胞素、MG-132[Z-Leu-Leu-Leu-CHO]、NFκB激活抑制剂III、NF-κB激活抑制剂II、JSH-23、小白菊内酯、氧化苯胂(PAO)、PPM-18、吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐、QNZ、RO 106-9920、楝酰胺、楝酰胺AL、楝酰胺C、楝酰胺I、楝酰胺J、洛克米兰醇(rocaglaol)、(R)-MG-132、水杨酸钠、雷公藤内酯(PG490)和蟛蜞菊内酯(wedelolactone)。
腺苷受体激动剂的实例包括CGS-21680和ATL-146e。
前列腺素E2激动剂的实例包括E-Prostanoid 2和E-Prostanoid 4。
磷酸二酯酶抑制剂(非选择性和选择性抑制剂)的实例包括咖啡因、氨茶碱、IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、副黄嘌呤、己酮可可碱、可可碱、茶碱、甲基化黄嘌呤、长春西汀、EHNA(赤型-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤)、阿那格雷、依诺昔酮(PERFANTM)、米立农、左西孟旦、日中花碱(mesembrine)、异丁司特、吡拉米司特、木犀草素、屈他维林、罗氟司特(DAXASTM、DALIRESPTM)、西地那非
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他达拉非
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伐地那非
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乌地那非、阿伐那非、淫羊藿苷(icariin)、4-甲基哌嗪和吡唑并嘧啶-7-1。
蛋白酶体抑制剂的实例包括：硼替佐米、双硫仑、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯和salinosporamide A。
激酶抑制剂的实例包括贝伐单抗、BIBW 2992、西妥昔单抗伊马替尼曲妥珠单抗
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吉非替尼
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雷珠单抗哌加他尼、索拉非尼、达沙替尼、舒尼替尼、埃罗替尼、尼洛替尼、拉帕替尼、帕尼单抗、凡德他尼、E7080、帕唑帕尼(pazopanib)和木利替尼(mubritinib)。
糖皮质激素的实例包括氢化可的松(皮质醇)、醋酸可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松、倍他米松、曲安西龙、倍氯米松、醋酸氟氢可的松、醋酸脱氧皮质酮(DOCA)和醛固酮。
类视黄醇的实例包括视黄醇、视黄醛、维A酸(视黄酸、RETIN-
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)、异维A酸阿利维A酸
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依曲替酯(TEGISONTM)、及其代谢物阿维A他扎罗汀贝沙罗汀
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和阿达帕林
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细胞因子抑制剂的实例包括IL1ra、IL1受体拮抗剂、IGFBP、TNF-BF、尿调节素、α-2-巨球蛋白、环孢素A、喷他眯和己酮可可豆碱
Figure BDA00022594005100003718
过氧化物酶体增殖物激活受体拮抗剂的实例包括GW9662、PPARγ拮抗剂III、G335和T0070907(EMD4Biosciences，USA)。
过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂的实例包括吡格列酮、环格列酮、氯贝丁酯、GW1929、GW7647、L-165，041、LY 171883、PPARγ激活剂、Fmoc-Leu、曲格列酮和WY-14643(EMD4Biosciences，USA)。
组蛋白去乙酰化酶抑制剂的实例包括异羟肟酸(或氧肟酸盐)例如曲古抑菌素A、环四肽(例如trapoxin B)和缩酚酸肽、苯甲酰胺、亲电性酮、脂族酸化合物(例如苯丁酸和丙戊酸)、异羟肟酸(例如伏立诺他(SAHA)、贝利司他(PXD101)、LAQ824和帕比司他(LBH589))、苯甲酰胺例如恩替诺特(MS-275)、CI994和mocetinostat(MGCD0103)、烟酰胺、NAD的衍生物、二氢香豆素类、萘并吡喃酮类、以及2-羟基萘醛。
钙调神经磷酸酶抑制剂的实例包括环孢素、吡美莫司、伏环孢素(voclosporin)和他克莫司。
磷酸酶抑制剂的实例包括BN82002盐酸盐、CP-91149、花萼海绵诱癌素A(calyculin A)、斑蝥酸、斑蝥素、氯氰菊酯、乙基-3，4-迪磷他汀、福司曲星钠盐、MAZ51、甲基-3，4-迪磷他汀、NSC 95397、去甲斑蝥素、来自凹形原甲藻(prorocentrum concavum)的冈田酸铵盐、冈田酸、冈田酸钾盐、冈田酸钠盐、氧化苯胂、多种磷酸酶抑制剂混合物、蛋白质磷酸酶1C、蛋白质磷酸酶2A抑制剂蛋白、蛋白质磷酸酶2A1、蛋白质磷酸酶2A2和正钒酸钠。
在所提供之任一种方法、组合物或药盒的一些实施方案中，本文中所述的治疗性大分子也与合成纳米载体连接。在另一些实施方案中，治疗性大分子未与任何合成纳米载体连接。在这些情况中任一种的一些实施方案中，治疗性大分子可以以治疗性大分子自身的形式递送或者以其片段或衍生物的形式递送。
治疗性大分子可包括治疗性蛋白质或治疗性多核苷酸。治疗性蛋白质包括但不限于：可输注的治疗性蛋白质、酶、酶辅因子、激素、凝血因子、细胞因子和干扰素、生长因子、单克隆抗体和多克隆抗体(例如作为替代治疗施用于对象)以及与庞皮病相关的蛋白质(例如，酸性葡糖苷酶α，rhGAA)(例如，Myozyme和Lumizyme(Genzyme))。治疗性蛋白质还包括参与凝血级联的蛋白质。治疗性蛋白质包括但不限于：因子VIII、因子VII、因子IX、因子V、冯·维勒布兰德因子、von Heldebrant因子、组织纤溶酶原激活物、胰岛素、生长激素、红细胞生成素α、VEGF、血小板生成素、溶菌酶、抗凝血酶等。治疗性蛋白质还包括脂肪素(adipokine)，例如瘦素和脂联素。治疗性蛋白质的其他实例如下文及本文中的其他部分所述。
用于患有溶酶体贮积症之对象的酶替代治疗中的治疗性蛋白质的实例包括但不限于：用于治疗戈谢病(Gaucher’s disease)的伊米苷酶(例如，CEREZYMETM)，用于治疗法布里病(Fabry disease)的a-半乳糖苷酶A(a-gal A)(例如，阿加糖酶β、FABRYZYMETM)，用于治疗庞皮病的酸性α-葡糖苷酶GAA(例如，酸葡糖苷酶α、LUMIZYMETM、MYOZYMETM)，用于治疗黏多醣贮积症(Mucopolysaccharidose)的芳基硫酸酯酶B(例如，拉罗尼酶、ALDURAZYMETM、艾杜硫酶、ELAPRASETM、芳基硫酸酯酶B、NAGLAZYMETM)，聚乙二醇化重组尿酸酶(KRYSTEXXA)和聚乙二醇化重组假丝酵母尿酸酶。
酶的实例包括：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、糖苷酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、蛋白酶、核酸酶、胶原酶、透明质酸酶、肝素酶、类肝素酶、细胞溶素(lysin)和连接酶。
治疗性蛋白质还可包括分离自或来源于细菌、真菌或病毒来源的任何酶、毒素或其他蛋白质或肽。
激素的实例包括：褪黑激素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺)、血清素、甲状腺素(或四碘甲腺原氨酸)(甲状腺激素)、三碘甲腺原氨酸(甲状腺激素)、肾上腺素(或肾上腺激素)、去甲肾上腺素(或去甲肾上腺激素)、多巴胺(或催乳素抑制激素)、抗米勒管激素(或米勒管抑制因子或激素)、脂连蛋白、促肾上腺皮质激素(或促皮质素)、血管紧张素原和血管紧张素、抗利尿激素(或加压素、精氨酸加压素)、心房钠尿肽(或心钠素)、降钙素、胆囊收缩素、促皮质素释放激素、红细胞生成素、促卵泡激素、胃泌素、生长素释放肽、胰高血糖素、胰高血糖素样肽(GLP-1)、GIP、促性腺素释放激素、生长激素释放激素、人绒毛膜促性腺素、人胎盘催乳素、生长激素、抑制素、胰岛素、胰岛素样生长因子(或生长调节素)、瘦素、黄体化激素、黑素细胞刺激激素、食欲素、催产素、甲状旁腺激素、催乳素、松弛素、分泌素、生长激素抑制素、血小板生成素、甲状腺刺激激素(或促甲状腺素)、促甲状腺素释放激素、皮质醇、醛固酮、睾酮、去氢表雄酮、雄烯二酮、二氢睾酮、雌二醇、雌酮、雌三醇、黄体酮、骨化三醇(1，25-二羟基维生素D3)、骨化二醇(25-羟基维生素D3)、前列腺素类、白三烯类、前列环素、血栓烷类、催乳素释放激素、促脂解素、脑钠尿肽、神经肽Y、组胺、内皮素、胰多肽、肾素和脑啡肽。
血液因子或凝血因子的实例包括：因子I(纤维蛋白原)、因子II(凝血酶原)、组织因子、因子V(前加速素，不稳定因子)、因子VII(稳定因子、前转化素)、因子VIII(抗血友病球蛋白)、因子IX(克雷司马斯因子(Christmas factor)或血浆促凝血酶原激酶组分)、因子X(斯图尔特因子(Stuart-Prower factor))、因子Xa、因子XI、因子XII(哈格曼因子(Hageman factor))、因子XIII(纤维蛋白稳定因子)、冯·维勒布兰德因子、前激肽释放酶(弗莱彻因子(Fletcher factor))、高分子量激肽原(HMWK)(菲兹杰拉尔德因子(Fitzgerald factor))、纤连蛋白、纤维蛋白、凝血酶、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂(ZPI)、纤溶酶原、α2-抗纤溶酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI1)、纤溶酶原激活物抑制剂-2(PAI2)、癌促凝物质或阿法依伯汀(Epogen，Procrit)。
细胞因子的实例包括淋巴因子、白介素以及趋化因子、1型细胞因子(例如IFN-γ、TGF-β)和2型细胞因子(例如IL-4、IL-10和IL-13)。
生长因子的实例包括肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌运动因子、骨形态生成蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)、脑源性神经营养因子(Brain-derivedneurotrophic factor，BDNF)、表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)、红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor，FGF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、生长分化因子-9(Growth differentiation factor-9，GDF9)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growthfactor，HGF)、肝癌源性生长因子(Hepatoma-derived growth factor，HDGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor，IGF)、促移行因子、肌生长抑制素(GDF-8)、神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)及其他神经营养因子、血小板源性生长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(Transforming growth factor alpha，TGF-α)、转化生长因子β(Transforming growthfactor beta，TGF-β)、肿瘤坏死因子α(Tumour_necrosis_factor-alpha，TNF-α)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、Wnt信号传导途径、胎盘生长因子(placental growth factor，P1GF)、(胎牛促生长素，Foetal Bovine Somatotrophin)(FBS)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6和IL-7。
单克隆抗体的实例包括：阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿达木单抗、阿德木单抗、阿非莫单抗、阿夫土珠单抗(Afutuzumab)、培化阿珠单抗、ALD、阿仑单抗、阿妥莫单抗喷替酸盐、麻安莫单抗、安芦珠单抗、抗胸腺细胞珠蛋白、阿泊珠单抗、阿西莫单抗、阿塞珠单抗、Atlizumab(托珠单抗)、阿托木单抗、Bapineuzumab、巴利昔单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、贝利木单抗、Benralizumab、柏替木单抗、贝索单抗、贝伐单抗、比西单抗、莫比伐珠单抗、Blinatumomab、Brentuximab vedotin、Briakinumab、卡那单抗、莫坎妥珠单抗、卡罗单抗喷地肽、卡妥索单抗、西利珠单抗、赛妥珠单抗、西妥昔单抗、泊西他珠单抗、Cixutumumab、克立昔单抗、Clivatuzumab tetraxetan、Conatumumab、Dacetuzumab、达珠单抗、Daratumumab、狄迪诺塞麦、地莫单抗、阿托度单抗、Dorlixizumab、依美昔单抗、依库珠单抗、埃巴单抗、依决可单抗、依法利珠单抗、依芬古单抗、埃罗妥珠单抗、艾西莫单抗、培戈赖莫单抗、西依匹莫单抗、依帕珠单抗、Erlizumab、厄妥索单抗、Etaracizumab、艾韦单抗、Fanolesomab、法拉莫单抗、Farletuzumab、非维珠单抗、非扎奴单抗、Figitumumab、芳妥珠单抗、Foravirumab、Fresolimumab、Galiximab、Gantenerumab、加维莫单抗、吉妥单抗、GC1008、Girentuximab、Glembatumumab vedotin、戈利木单抗、Gomiliximab、Ibalizumab、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、英西单抗、英夫利昔单抗、Intetumumab、伊诺莫单抗、奥英妥珠单抗、依匹木单抗、Iratumumab、凯利昔单抗、拉贝珠单抗、Lebrikizumab、来马索单抗、乐地单抗、来沙木单抗、利韦单抗、林妥珠单抗、Lorvotuzumab mertansine、Lucatumumab、鲁昔单抗、马帕木单抗、马司莫单抗、马妥珠单抗、美泊利单抗、美替木单抗、Milatuzumab、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、莫罗木单抗、Motavizumab、鼠单克隆抗体-CD3、他那可单抗、Naptumomabestafenatox、那他珠单抗、奈巴库单抗、Necitumumab、奈瑞莫单抗、尼妥珠单抗、巯诺莫单抗、Ocrelizumab、奥度莫单抗、奥法木单抗、Olaratumab、奥马珠单抗、莫奥珠单抗、奥戈伏单抗、Otelixizumab、Pagibaximab、帕利珠单抗、帕尼单抗、Panobacumab、帕考珠单抗、Pemtumomab、帕妥珠单抗、Pexelizumab、平妥莫单抗、普立昔单抗、Pritumumab、雷韦单抗、雷莫芦单抗、雷珠单抗、Raxibacumab、瑞加韦单抗、瑞利珠单抗、Rilotumumab、利妥昔单抗、Robatumumab、Rontalizumab、罗维珠单抗、鲁利单抗、沙妥莫单抗喷地肽、司韦单抗、西罗珠单抗、西法木单抗、Siltuximab、西利珠单抗、Solanezumab、Sonepcizumab、Sontuzumab、Stamulumab、硫索单抗、Tacatuzumab tetraxetan、他度珠单抗、Talizumab、尼珠单抗、帕他普莫单抗、替非珠单抗、阿替莫单抗、Tenatumomab、替奈昔单抗、Teplizumab、Ticilimumab(替西木单抗)、替加珠单抗、托珠单抗(atlizumab)、托利珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、替西木单抗、Tucotuzumab celmoleukin、妥韦单抗、乌珠单抗、Ustekinumab、伐利昔单抗、维多珠单抗、维妥珠单抗、维帕莫单抗、Visilizumab、伏洛昔单抗、伏妥莫单抗、Zalutumumab、扎木单抗、齐拉木单抗和阿佐莫单抗。单克隆抗体还包括抗-TNF-α抗体。
输注治疗或可注射的治疗性蛋白质的实例包括例如：托珠单抗(Roche/
Figure BDA0002259400510000421
α-1抗胰蛋白酶(Kamada/AAT)、
Figure BDA0002259400510000422
(Affymax和Takeda，合成肽)、白蛋白干扰素α-2b(albinterferon alfa-2b)(Novartis/ZalbinTM)、(Pharming Group，C1抑制剂替代治疗)、替莫瑞林(Theratechnologies/Egrifta，合成生长激素释放因子)、奥瑞珠单抗(Genentech、Roche和Biogen)、贝利木单抗(GlaxoSmithKline/
Figure BDA0002259400510000424
)、聚乙二醇化重组尿酸酶(pegloticase)(Savient Pharmaceuticals/KrystexxaTM)、聚乙二醇化重组假丝酵母尿酸酶、他利苷酶α(Protalix/Uplyso)、阿加糖酶α(Shire/
Figure BDA0002259400510000425
)、葡糖脑苷脂酶α(Shire)和钥孔林普贝血蓝蛋白(KLH)。
另外的治疗性蛋白质包括例如：工程化蛋白质，例如Fc融合蛋白、双特异性抗体、多特异性抗体、纳米体、抗原结合蛋白、抗体片段和蛋白质缀合物，例如抗体药物缀合物。
治疗性多核苷酸包括但不限于：核酸适配体例如哌加他尼(Macugen，一种聚乙二醇化抗VEGF适配体)、反义治疗性多核苷酸例如反义多核苷酸或反义寡核苷酸(例如，抗病毒药福米韦生，或米泊美生，靶向载脂蛋白B的信使RNA以降低胆固醇水平的反义治疗剂)；小干扰RNA(siRNA)(例如，dicer底物siRNA分子(DsiRNA)，其为以极高效力介导RNAi的25-30个碱基对的不对称双链RNA)；或经修饰的信使RNA(mmRNA)例如Fougerolles等的美国专利申请2013/0115272和Schrum等的公开的美国专利申请2012/0251618中所公开的那些。
可根据本发明的一些方面使用的其他治疗性大分子对本领域技术人员是显而易见的，并且本发明在此方面不受限制。
在一些实施方案中，组分(例如治疗性大分子或免疫抑制剂)可以是经分离的。“经分离的”指组分与其天然环境分离并且以足够量存在以允许其鉴定或使用。这意味着，例如，组分可(i)通过表达克隆选择性地产生或者(ii)通过色谱或电泳进行纯化。经分离的组分可以但不需要是基本纯的。由于可将经分离的组分与可药用赋形剂一起混合在药物制剂中，所述组分可仅占制剂的小重量百分比。组分仍是经分离的，只要其已与在活系统中与其相关的物质分离，即与其他脂质或蛋白质分离。本文中提供的任一种组分均可以是经分离的并且以经分离形式包含在组合物中或者用于方法中。
D.制备和使用所述组合物的方法及相关方法
本发明的一些方面涉及确定用于本文中提供的伴随施用的方法的方案。可如下确定方案：改变施用治疗性大分子和免疫抑制剂的频率、剂量及其他方面并随后基于这些变化评估药效学作用。各种施用均发生在抗治疗性大分子抗体应答存在下。用于实施本发明的一个优选方案诱导期望的药效学作用但诱导很少至无抗治疗性大分子抗体应答。
在本发明的一些方面，治疗性大分子的期望药效学作用包括刺激或抑制特定应答。在一些实施方案中，药效学作用涉及，但不限于：细胞因子、趋化因子、信号传导分子或其他分子的产生或降解；诱导特定细胞类型的增殖或死亡；特定细胞类型的成熟或定位；与酶、结构蛋白、载体蛋白或受体蛋白的相互作用；调节酶、结构蛋白或受体蛋白的活性，等。在一些实施方案中，药效学作用为降低细胞因子例如炎症相关的细胞因子(例如TNF、IL-1)的产生。在一些实施方案中，药效学作用为降低细胞因子的活性。在一些实施方案中，药效学作用为降低不期望分子的产生。在一些实施方案中，药效学作用为提高不期望分子(例如尿酸晶体)的降解。在一些实施方案中，药效学作用为酶的活性。
可通过标准方法来评估治疗性大分子的药效学作用。在本发明的一些方面，药效学作用为炎症的降低。可通过以下示例性方法来评估炎症的水平，所述方法不限于对炎性症状(例如发红或肿胀)进行评分；对关节炎症状(例如运动性、疼痛或关节损坏)进行评分；对过敏反应症状(例如肿胀、血压、气短)进行评分；通过组织学、免疫组织化学、流式细胞术检测和/或量化细胞浸润；通过ELISA测量蛋白质或炎症相关细胞因子(TNF、IL-1)的浓度，通过转录分析评估基因或炎症相关基因的表达；测量炎症相关细胞因子的活性，等。
在本发明的一些方面，药效学作用为不期望分子的降低或降解。在一些实施方案中，可通过但不限于借助例如ELISA的方法量化组织或血液样品中的不期望分子来评估药效学作用。在一些实施方案中，可通过借助例如ELISA的方法量化由不期望分子的降解所产生的分子来评估药效学作用。在本发明的一些方面，药效学作用为先前不存在或不充分存在的酶的活性。在这样的一些实施方案中，可通过检测具有该酶活性之产物的存在或浓度来评估酶的活性。
在本发明的一些方面，施用降低的治疗性大分子剂量以产生药效学作用。出于此目的的降低的治疗性大分子剂量包括在免疫抑制剂剂量的伴随施用下在抗治疗性大分子抗体应答存在下实现药效学作用的任意治疗性大分子剂量，其低于在抗治疗性大分子抗体应答存在下当不与免疫抑制剂剂量伴随施用时用治疗性大分子实现类似的药效学作用所需的剂量。可如下确定降低的剂量：在抗治疗性大分子抗体应答存在下以某一剂量施用治疗性大分子并伴随施用免疫抑制剂剂量，并且评估药效学作用。然后，可将药效学作用与通过在抗治疗性大分子抗体应答存在下在无伴随施用免疫抑制剂剂量下施用治疗性大分子获得的药效学作用进行比较。通过这样的比较确定之实现类似药效学作用的较低剂量即为降低的剂量。
如前所述，免疫抑制剂可与合成纳米载体连接。可使用本领域中已知的多种方法来制备合成纳米载体。例如，可通过以下方法及本领域普通技术人员公知的其他方法来形成合成纳米载体：例如，纳米沉淀、使用流体通道的流动聚焦、喷雾干燥、单乳化溶剂蒸发和双乳化溶剂蒸发、溶剂萃取、相分离、研磨、微乳化法、微制造、纳米制造、牺牲层、简单凝聚和复合凝聚。作为替代或补充，用于单分散半导体纳米材料、电导性纳米材料、磁性纳米材料、有机纳米材料及其他纳米材料的水性溶剂和有机溶剂合成已有描述(Pellegrino等，2005，Small，1：48；Murray等，2000，Ann.Rev.Mat.Sci.，30：545；和Trindade等，2001，Chem.Mat.，13：3843)。另外的方法已在以下文献中进行了描述(参见，例如，Doubrow，编辑，“Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy，”CRC Press，BocaRaton，1992；Mathiowitz等，1987，J.Control.Release，5：13；Mathiowitz等，1987，Reactive Polymers，6：275；和Mathiowitz等，1988，J.Appl.Polymer Sci.，35：755；美国专利5578325和6007845；P.Paolicelli等，“Surface-modified PLGA-based Nanoparticlesthat can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles”Nanomedicine.5(6)：843-853(2010))。
如果期望的话，可使用多种方法将多种材料包封在合成纳米载体内，所述方法包括但不限于C.Astete等，“Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles”J.Biomater.Sci.Polymer Edn，第17卷，第3期，第247-289页(2006)；K.Avgoustakis“Pegylated Poly(Lactide)and Poly(Lactide-Co-Glycolide)Nanoparticles：Preparation，Properties and Possible Applications in Drug Delivery”CurrentDrug Delivery 1：321-333(2004)；C.Reis等，“Nanoencapsulation I.Methods forpreparation of drug-loaded polymeric nanoparticles”Nanomedicine 2：8-21(2006)；P.Paolicelli等，“Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that canEfficiently Associate and Deliver Virus-like Particles”Nanomedicine.5(6)：843-853(2010)。也可使用适合将材料包封在合成纳米载体内的其他方法，包括但不限于于2003年10月14日授权的Unger的美国专利6,632,671中公开的方法。
在某些实施方案中，通过纳米沉淀法或喷雾干燥来制备合成纳米载体。可对用于制备合成纳米载体的条件进行改变以产生具有期望尺寸或特性(例如，疏水性、亲水性、外部形态、“黏性”、形状等)的颗粒。制备合成纳米载体的方法及所使用的条件(例如，溶剂、温度、浓度、空气流速等)可取决于待与合成纳米载体连接的材料和/或聚合物基质的组成。
如果通过上述任一种方法制备的合成纳米载体的尺寸范围在期望范围之外，则可例如使用筛对此类合成纳米载体进行尺寸选择。
合成纳米载体的成分(即，组分)(例如抗原、免疫抑制剂等)可与整个合成纳米载体例如通过一个或更多个共价键连接，或者可借助一个或更多个接头连接。官能化合成纳米载体的另外方法可修改自Saltzman等的公开的美国专利申请2006/0002852、DeSimone等的公开的美国专利申请2009/0028910或Murthy等的公开的国际专利申请WO/2008/127532A1。
作为替代或补充，合成纳米载体与组分可直接地或间接地经由非共价相互作用连接。在一些非共价实施方案中，非共价连接由非共价相互作用介导，所述非共价相互作用包括但不限于：电荷相互作用、亲和性相互作用、金属配位、物理吸附、主体-客体相互作用、疏水性相互作用、TT堆积相互作用、氢键合相互作用、范德华相互作用、磁性相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用和/或其组合。这样的偶联可布置成在合成纳米载体的外表面或内表面上。在一些实施方案中，包封和/或吸附是连接的形式。在一些实施方案中，可将合成纳米载体与治疗性大分子或其他组成通过混合在同一载剂或递送系统中而组合。
本文中提供的组合物可包含无机或有机缓冲剂(例如，磷酸、碳酸、醋酸或柠檬酸的钠盐或钾盐)和pH调节剂(例如，盐酸、氢氧化钠或氢氧化钾、柠檬酸或醋酸的盐、氨基酸及其盐)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、α-生育酚)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚氧乙烯9-10壬基苯酚、去氧胆酸钠)、溶液剂和/或冷冻/冻干稳定剂(例如，蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖)、渗透调节剂(例如，盐或糖)、抗菌剂(例如，苯甲酸、苯酚、庆大霉素)、消泡剂(例如，聚二甲基硅氧烷)、防腐剂(例如，硫柳汞、2-苯氧基乙醇、EDTA)、聚合物稳定剂和黏度调节剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆488、羧甲基纤维素)和潜溶剂(例如甘油、聚乙二醇、乙醇)。
根据本发明的组合物可包含可药用赋形剂。所述组合物可使用常规的药物制备和配合技术制成以实现可用的剂型。适用于实施本发明的技术可见于Handbook ofIndustrial Mixing：Science and Practice，由Edward L.Paul，Victor A.Atiemo-Obeng和Suzanne M.Kresta编辑，2004 JohnWiley&Sons，Inc.；和Pharmaceutics：The Scienceof Dosage Form Design，第2版.由M.E.Auten编辑，2001，Churchill Livingstone中。在一个实施方案中，将组合物与防腐剂一起混悬于无菌盐水溶液中以用于注射。
应当理解，本发明的组合物可以以任何合适的方式制备，并且本发明不以任何方式局限于可使用本文中所述的方法制备的组合物。对合适制备方法的选择可需要注意所缔合的具体部分的特性。
在一些实施方案中，组合物是在无菌条件下制备的，或者是经最终灭菌的。这可确保，所得组合物是无菌的和非感染性的，从而当与非无菌组合物相比时，安全性提高。这提供了有价值的安全措施，尤其是当接受组合物的对象具有免疫缺陷、患有感染和/或易受感染时。在一些实施方案中，可将组合物冷冻干燥并悬浮储存或者作为冻干粉末储存，这取决于不丧失活性的长期配制策略。
根据本发明的施用可通过多种途径，包括但不限于：皮下、静脉内、腹膜内、肌内、经粘膜、经皮、经皮肤或皮内途径。在一个优选实施方案中，施用经由皮下施用途径。可使用常规方法将本文中提及的组合物配制和制备成用于施用，优选用于伴随施用。
可以以有效量(例如本文中其他部分所述的有效量)施用本发明的组合物。根据本发明，剂型的剂量可包含不同量的免疫抑制剂和/或治疗性大分子。本发明剂型中存在的免疫抑制剂和/或治疗性大分子的量可根据以下方面而不同：治疗性大分子和/或免疫抑制剂的性质、需达到的治疗益处以及其他这样的参数。在一些实施方案中，可进行剂量范围研究以建立剂型中存在之免疫抑制剂和/或治疗性大分子的最佳治疗量。在一些实施方案中，免疫抑制剂和/或治疗性大分子以在施用于对象后有效产生期望的药效学作用和/或针对所述治疗性大分子的降低免疫应答的量存在于剂型中。可利用在对象中进行常规的剂量范围研究和技术来确定有效产生期望结果的免疫抑制剂和/或治疗性大分子的量。本发明的剂型可以以多种频率施用。在一个优选实施方案中，本文中提供的组合物的至少一次施用就足以产生药理学上相关的响应。在一些更优选的实施方案中，利用至少两次施用或至少三次施用以确保药理学上相关的响应。在一些实施方案中，利用重复施用以确保药理学上相关的响应。
本公开内容的另一个方面涉及药盒。在一些实施方案中，所述药盒包含治疗性大分子的一个药效学有效剂量或多于一个剂量，例如降低的药效学有效剂量。在这样的一些实施方案中，所述药盒还可包含一个免疫抑制剂剂量或多于一个免疫抑制剂剂量。免疫抑制剂剂量和药效学有效剂量可包含在药盒中的独立容器中或者包含在药盒中的同一容器中。在一些实施方案中，所述容器为小瓶或安瓿。在一些实施方案中，治疗性大分子的药效学有效剂量和/或免疫抑制剂剂量包含在与容器分开的溶液中，使得可随后将治疗性大分子的药效学有效剂量和/或免疫抑制剂剂量添加至容器。在一些实施方案中，治疗性大分子的药效学有效剂量和/或免疫抑制剂剂量以冻干形式各自存在于独立容器中或同一容器中，使得它们可随后重构。在一些实施方案中，所述药盒还包含用于重构、混合、施用等的说明书。在一些实施方案中，所述说明书包含对本文中所述的方法的说明。说明书可以是任何合适的形式，例如，作为印刷插入物或标签。在一些实施方案中，所述药盒还包含一个或更多个注射器。
实施例
实施例1：用包含免疫抑制剂和APC可呈递抗原的合成纳米载体体内评价免疫应答
材料
卵清蛋白肽323-339(OVA323-339)，即已知为卵清蛋白蛋白质的T细胞和B细胞表位的一种17氨基酸肽，购自Bachem Americas Inc.(3132Kashiwa Street，Torrance CA90505；Part#4065609)。雷帕霉素购自TSZ CHEM(185 Wilson Street，Framingham，MA01702；产品目录#R1017)。丙交酯∶乙交酯比例为3∶1并且特性黏度为0.75dL/g的PLGA购自SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码7525 DLG 7A)。聚乙烯醇(85％至89％水解的)购自EMD Chemicals(产品号1.41350.1001)。
用于制备包含雷帕霉素和卵清蛋白(323-339)的合成纳米载体的方法
如下制备溶液：
溶液1：稀盐酸水溶液中的20mg/mL OVA323-339。该溶液通过在室温下将卵清蛋白肽溶解于0.13M盐酸溶液中制备。
溶液2：二氯甲烷中的100mg/mL PLGA。该溶液通过将PLGA溶解于纯二氯甲烷中制备。
溶液3：二氯甲烷中的100mg/mL PLA-PEG。该溶液通过将PLA-PEG溶解于纯二氯甲烷中制备。
溶液4：二氯甲烷中的50mg/mL雷帕霉素。该溶液通过将雷帕霉素溶解于纯二氯甲烷中制备。
溶液5：100mM pH 8磷酸盐缓冲液中的50mg/mL聚乙烯醇。
首先制备初级的油包水型乳剂。如下制备W1/O1：将溶液1(0.2mL)、溶液2(0.75mL)、溶液3(0.25mL)和溶液4(0.2mL)合并在小压力管中并使用Branson DigitalSonifier 250以50％振幅进行超声处理40秒。然后，如下制备次级乳剂(W1/O1/W2)：将溶液5(3.0mL)与初级W1/O1乳剂组合，涡旋10秒并使用Branson Digital Sonifier 250以30％振幅进行超声处理60秒。
将W1/O1/W2乳剂添加至含有70mM pH 8磷酸盐缓冲溶液(30mL)的烧杯并在室温下搅拌2小时以使二氯甲烷蒸发并形成合成纳米载体。将一部分的合成纳米载体经如下洗涤：将合成纳米载体混悬液转移至离心管并在75,600×g和4℃下离心35分钟，除去上清液并将沉淀物重悬于磷酸缓冲盐水中。重复洗涤操作并将沉淀物重悬于磷酸缓冲盐水中以获得约10mg/mL的最终合成纳米载体分散体。
通过HPLC分析确定合成纳米载体中肽和雷帕霉素的量。通过重量法确定总干合成纳米载体质量/mL混悬液。
用于包含雷帕霉素的合成纳米载体的方法
首先制备初级油包水型乳剂。如下制备W1/O1：将0.13M盐酸溶液(0.2mL)、溶液2(0.75mL)、溶液3(0.25mL)和溶液4(0.2mL)合并在小压力管中并使用Branson DigitalSonifier 250以50％振幅进行超声处理40秒。然后，如下制备次级乳剂(W1/O1/W2)：将溶液5(3.0mL)与初级W1/O1乳剂组合，涡旋10秒并使用Branson Digital Sonifier 250以30％振幅进行超声处理60秒。
将W1/O1/W2乳剂添加至含有70mM pH 8磷酸盐缓冲溶液(30mL)的烧杯并在室温下搅拌2小时以使二氯甲烷蒸发并形成合成纳米载体。将一部分的合成纳米载体经如下洗涤：将合成纳米载体混悬液转移至离心管并在21,000×g和4℃下离心1小时，除去上清液并将沉淀物重悬于磷酸缓冲盐水中。重复洗涤操作并将沉淀物重悬于磷酸缓冲盐水中以获得约10mg/mL的最终合成纳米载体分散体。
通过HPLC分析确定合成纳米载体中雷帕霉素的量。通过重量法确定总干合成纳米载体质量/mL混悬液。
用于测量雷帕霉素载量的方法
收集约3mg的合成纳米载体并离心以使上清液与合成纳米载体沉淀物分离。向沉淀物添加乙腈，将样品超声处理并离心以除去任何不溶性材料。将上清液和沉淀物注射在RP-HPLC上并在278nm下读取吸光度。使用见于沉淀物中的μg计算捕获的％(载量)，并使用上清液和沉淀物中的μg计算回收的总μg。
用于测量卵清蛋白(323-339)载量的方法
收集约3mg的合成纳米载体并离心以使上清液与合成纳米载体沉淀物分离。向沉淀物添加三氟乙醇并对样品进行超声处理以使聚合物溶解，添加0.2％三氟乙酸，将样品进行超声处理并离心以除去任何不溶性材料。将上清液和沉淀物注射在RP-HPLC上并在215nm下读取吸光度。使用见于沉淀物中的μg计算捕获的％(载量)，使用上清液和沉淀物中的μg计算回收的总μg。
免疫
本实验的目的是为了通过测量抗原特异性免疫球蛋白来评估经包封的免疫抑制剂对正发生的抗体应答的影响。使一组动物保持未免疫作为对照。使用鸡卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)和CpG通过在足垫内进行3次注射(d0、d14和d28)来对两组动物进行免疫，之后评估抗体效价。对于免疫，使动物在两后肢内皮下接受20μl/肢的OVA+CpG(12.5μg OVA+10μg CpG)。在相同天施用的处理包括静脉内(200μl)或皮下(20μl)施用。以使得在处理组中注射相同量OVA323-339的方式对纳米载体进行稀释。
IgG的测量
对IgG抗体的水平进行测量。使用PBS中的封闭剂酪蛋白(Thermo Fisher，目录#37528)作为稀释剂。使用PBS中的0.05％Tween-20作为洗涤缓冲液，其通过将10ml Tween-20(Sigma，目录#P9416-100mL)添加至2升10x PBS贮存液(PBS：
Figure BDA0002259400510000501
10X PBS液体浓缩物，4L，EMD Chemicals，目录#6505)和18升去离子水制备。
使用贮存液浓度为5mg/ml的OVA蛋白质作为包被材料。使用5μg/ml的1∶1000稀释度作为工作浓度。用100μl经稀释OVA/孔包被测定板的每个孔，将板用密封膜(VWR目录#60941-120)密封并在4℃下孵育过夜。使用Costar 9017 96孔平底板作为测定板(Costar9017)。
使用低结合聚丙烯96孔板或管作为在转移至测定板之前在其中制备样品的制备板(set-up plate)。制备板不含任何抗原，因此在制备样品期间血清抗体不与该板结合。如果使用经抗原包被的板来制备样品，使用制备板进行样品制备以最小化在制备或用移液管吸移样品期间可发生的结合。在于制备板中制备样品之前，将孔用稀释剂覆盖以封闭任何非特异性结合，将板密封并在4℃下孵育过夜。
将测定板用洗涤缓冲液洗涤三次，并在最后一次洗涤之后完全吸出孔中的洗涤缓冲液。在洗涤之后，向测定板的每个孔添加300μl稀释剂以封闭非特异性结合并将板在室温下孵育至少2小时。以合适的起始稀释度在制备板中制备血清样品。有时也使用稀释剂在1.5ml管中制备起始稀释度并随后将其转移至制备板。在可用时，基于先前的数据来确定合适的起始稀释度。当先前的数据不可用时，最低起始稀释度为1∶40。一旦被稀释，将200μl起始稀释度的血清样品从管转移至制备板中的合适孔。
一种示例性制备板的布局描述如下：列2和3包含稀释至0.25μg/mL(1∶4000稀释度)的抗卵清蛋白单克隆IgG2b同种型(AbCam，ab17291)标准物。列3至11包含血清样品(适当稀释度)。列1和12不用于样品或标准物以避免由于边缘效应而引起的任何测量偏差。作为替代，列1和12包含200μl稀释剂。使用经1∶40稀释的正常小鼠血清作为阴性对照。使用由0.5mg/mL贮存液(BD Bioscience)经1∶500稀释的抗小鼠IgG2a作为同种型对照。
一旦在制备板中制备完所有的样品，将板密封并储存在4℃下，直至测定板的封闭完成。将测定板用洗涤缓冲液洗涤三次，并在最后一次洗涤之后完全吸出洗涤缓冲液。在洗涤之后，向测定板的B至H排中的所有孔中添加100μL稀释剂。使用12-道移液器将样品从制备板转移至测定板。在转移之前通过将150μl经稀释的血清用移液管上下吸移3次来混合样品。在混合之后，将每份样品中的150μl从制备板转移并添加至各测定板的A排。
一旦将起始稀释度的每份样品从制备板转移至测定板的A排，如下在测定板上用移液管吸移连续稀释液：使用12-道移液器从A排取出每份血清样品中的50μl并将其与之前添加至B排每孔中的100μl稀释剂混合。在整个板中向下重复该步骤。在用移液管吸移最后一排的稀释物之后，从最后一排的孔中取出50μl流体并弃掉以在测定板的每个孔中产生100μl的终体积。一旦在测定板中制备完样品稀释物，将板在室温下孵育至少2小时。
在孵育之后，将板用洗涤缓冲液洗涤三次。在稀释剂中以1∶1500(0.33μg/mL)稀释检测抗体(山羊抗小鼠抗-IgG、HRP缀合的、AbCam ab98717)并向每个孔添加100μl经稀释的抗体。将板在室温下孵育1小时并随后用洗涤缓冲液洗涤三次，其中每个洗涤步骤包括至少30秒的浸泡时间。
在洗涤之后，向孔中添加检测底物。在临添加至测定板之前，将等份的底物A和底物B(BD Biosciences TMB Substrate Reagent Set，目录#555214)合并，向每个孔添加100μl的经混合底物溶液并在暗处孵育10分钟。10分钟后，通过向每个孔添加50μl终止溶液(2NH2SO4)使反应终止。在添加终止溶液之后，立即通过450nm下的板读数与570nm下的板读数相减评估孔的光密度(OD)。使用Molecular Device软件SoftMax Pro v5.4进行数据分析。以稀释度为x轴(log刻度)并以OD值为y轴(线性刻度)制作四参数逻辑曲线拟合图(four-parameter logistic curve-fit graph)，并确定每份样品的半最大值(EC50)。调整布局顶部的板模板以反映每份样品的稀释度(1/列)。
结果
结果证明了使用与抗原的组合的免疫抑制剂剂量能够降低抗原特异性抗体应答，免疫抑制剂和抗原两者均与纳米载体连接。图1示出了当静脉内施用时，在包含肽抗原和免疫抑制剂的纳米载体下循环中抗原特异性抗体产生的降低。进行2个独立实验，每个实验中使用5只动物。图2示出了当皮下施用时，在包含肽抗原和免疫抑制剂的纳米载体下循环中抗原特异性抗体产生的降低。进行3个独立实验，每个实验中使用5只动物。使用常规的单因素ANOVA检验的事后Bonferroni检验计算p值(＊＝p＜0.05、＊＊＝p＜0.01和＊＊＊＝p＜0.001)。
这些结果证明：当在一般地产生显著抗卵清蛋白抗体应答的条件下施用时，使用相同量的卵清蛋白蛋白质可获得增强的作用。此外，如结果所提示的，已可在降低的药效学有效剂量下获得这种药效学作用。最后，结果的重现支持建立证明当与免疫抑制剂剂量伴随施用后在治疗性大分子的降低的药效学有效剂量下产生药效学作用的方案。
实施例2：在包含免疫抑制剂和治疗性蛋白质的合成纳米载体的伴随施用之后评 价免疫应答
材料
雷帕霉素购自TSZ CHEM(185Wilson Street，Framingham，MA 01702；产品目录#R1017)。具有76％丙交酯和24％乙交酯含量并且特性黏度为0.69dL/g的PLGA购自SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211.产品代码7525 DLG 7A.)。PEG嵌段为约5,000Da并且PLA嵌段为约40,000Da的PLA-PEG嵌段共聚物购自SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码100DL mPEG 50005CE)。聚乙烯醇(85％至89％水解的)购自EMD Chemicals(产品号1.41350.1001)。
用于制备合成纳米载体的方法
如下制备溶液：
溶液1：二氯甲烷中的75mg/mL PLGA和25mg/mL PLA-PEG。该溶液通过将PLGA和PLA-PEG溶解于纯二氯甲烷中制备。
溶液2：二氯甲烷中的100mg/mL雷帕霉素。该溶液通过将雷帕霉素溶解于纯二氯甲烷中制备。
溶液3：100mM pH 8磷酸盐缓冲液中的50mg/mL聚乙烯醇。
使用水包油型乳剂制备纳米载体。如下制备O/W乳剂：将溶液1(1mL)、溶液2(0.1mL)和溶液3(3mL)合并在小压力管中并使用Branson Digital Sonifier 250以30％振幅进行超声处理60秒。将O/W乳剂添加至含有70mM pH 8磷酸盐缓冲溶液(30mL)的烧杯并在室温下搅拌2小时以使二氯甲烷蒸发并形成纳米载体。将一部分的纳米载体经如下洗涤：将纳米载体混悬液转移至离心管并在75,000×g和4℃下离心35分钟，除去上清液并将沉淀物重悬于磷酸缓冲盐水中。重复洗涤操作并将沉淀物重悬于磷酸缓冲盐水中以获得约10mg/mL的最终纳米载体分散体。
通过动态光散射确定纳米载体的尺寸。通过HPLC分析确定纳米载体中的雷帕霉素量。通过重量法确定总干纳米载体质量/mL混悬液。
针对卵清蛋白的应答
对C57BL/6年龄匹配(5周至6周)的雌性小鼠(5只/组，3组：原初对照、未经处理的对照和用具有雷帕霉素的合成纳米载体进行处理)静脉内注射25μg使用高剪切以形成聚集体从而提高其免疫原性诱导的鸡卵清蛋白(aggOVA)。在引发和加强免疫应答的这些静脉内注射(在第0、14和28天施用)之后，腹膜内进行25μg卵清蛋白的后续加强(i.p.，第42和57天)并在左后肢内皮下进行12.5μgpOVA攻击(s.c.d62)，之后是使用与CpG组合的相同aggOVA的攻击(s.c.，第90、105和135天)。图3示出了此免疫方案的结果。在第25和40天，使用ELISA(一般如实施例1中所述的技术)在这些动物中可检测到显著的抗OVA抗体(Ab)应答。观察到，后续的aggOVA注射维持这些效价或者甚至加强该应答。相比之下，当仅在d0、14和28之与抗原的前三次接触期间使用与aggOVA静脉内伴随施用的合成纳米载体(计算剂量以提供100μg的雷帕霉素)处理小鼠时，甚至在4次包含aggOVA之免疫原性混合物注射后的随后60天内仍不能检测到IgG应答。参见图3。仅在aggOVA/KLH和CpG(极其具有免疫原性的组合)的3次s.c.注射(s.c.第90、105和135天)后，可在经处理的动物中检测到非常温和的抗aggOVA IgG应答。
针对第二抗原钥孔林普贝血蓝蛋白的应答
也向上述同一小鼠注射0.05μg第二Ag钥孔林普贝血蓝蛋白(KLH)，其中KLH与aggOVA混合并根据aggOVA的上述方案施用。使用与实施例1中所述的抗OVA IgG效价方法类似的方法确定抗KLHIgG抗体效价。
图4中的结果表明，不同于aggOVA，KLH在的与Ag接触的第一阶段(d0-40)无免疫原性。然而，在于CpG s.c.存在下进行3次KLH免疫(s.c.，第90、105和135天)后，在未经合成纳米载体处理的动物中KLH具有免疫原性。在这些对照小鼠中可观察到强抗KLH应答，而在该方案开始时接受3次具有与抗原组合的免疫抑制剂的合成纳米载体处理的小鼠甚至在KLH/CpG攻击后仍没有可检测的应答。
这些结果证明，当在一般产生显著抗体应答的条件下施用时，使用本文中提供的组合物和方法可获得增强的作用。此外，结果支持建立了证明产生药效学作用的方案。
实施例3：用于制备与雷帕霉素连接的纳米载体的方法
材料
雷帕霉素购自TSZ CHEM(185Wilson Street，Framingham，MA 01702；产品代码R1017)。丙交酯∶乙交酯比例为3∶1并且特性黏度为0.75dL/g的PLGA购自SurModicsPharmaceuticals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码7525 DLG7A)。甲基醚封端的PEG嵌段为约5,000Da并且整体特性黏度为0.5DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物购自Lakeshore Biochemicals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码100DL mPEG 50005CE)。
Figure BDA0002259400510000551
聚乙烯醇4-88，USP(85％至89％水解的，黏度为3.4mPa·s至4.6mPa·s)购自EMD Chemicals Inc.(480 South Democrat RoadGibbstown，NJ 08027.产品代码1.41350)。
方法
如下制备溶液：
溶液1：二氯甲烷中的75mg/mL PLGA、25mg/mL PLA-PEG-OMe和12.5mg/mL雷帕霉素。该溶液通过将PLGA、PLA-PEG-OMe和雷帕霉素溶解于纯二氯甲烷中制备。
溶液2：100mM pH8磷酸盐缓冲液中的50mg/mL聚乙烯醇。
使用水包油型(O/W)乳剂制备纳米载体。如下制备O/W乳剂：将溶液1(1.0mL)和溶液2(3.0mL)合并在小压力管中并使用Branson Digital Sonifier 250以30％振幅进行超声处理60秒。将O/W乳剂添加至含有70mM pH 8磷酸盐缓冲溶液的烧杯并在室温下搅拌2小时以使二氯甲烷蒸发并形成纳米载体。将一部分的纳米载体经如下洗涤：将纳米载体混悬液转移至离心管并在75,600×g和4℃下离心50分钟，除去上清液并将沉淀物重悬于磷酸缓冲盐水中。重复洗涤操作并将沉淀物重悬于磷酸缓冲盐水中以获得约10mg/mL的最终合成纳米载体分散体。
通过动态光散射确定纳米载体的尺寸并示于表1中。通过HPLC分析确定纳米载体中雷帕霉素的量(表1)。通过重量法确定总干纳米载体质量/mL混悬液。
与雷帕霉素连接的纳米载体的有效直径和雷帕霉素含量
Figure BDA0002259400510000552
Figure BDA0002259400510000561
材料
雷帕霉素购自TSZ CHEM(185 Wilson Street，Framingham，MA 01702；产品代码R1017)。丙交酯∶乙交酯比例为1∶1并且特性黏度为0.24dL/g的PLGA购自SurModicsPharmaceuticals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码5050 DLG2.5A)。甲基醚封端的PEG嵌段为约5,000Da并且整体特性黏度为0.5DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物购自Lakeshore Biochemicals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码100DL mPEG 50005CE)。
Figure BDA0002259400510000562
聚乙烯醇4-88，USP(85％至89％水解的，黏度为3.4mPa·s至4.6mPa·s)购自EMD Chemicals Inc.(480 South Democrat RoadGibbstown，NJ 08027.产品代码1.41350)。
方法
如下制备溶液：
溶液1：二氯甲烷中的75mg/mL PLGA、25mg/mL PLA-PEG-OMe和12.5mg/mL的雷帕霉素。该溶液通过将PLGA、PLA-PEG-OMe和雷帕霉素溶解于纯二氯甲烷中制备。
溶液2：100mM pH 8磷酸盐缓冲液中的50mg/mL聚乙烯醇。
溶液3：70mM磷酸盐缓冲液，pH 8。
如下制备水包油型乳剂：将溶液1(1.0mL)和溶液2(3.0mL)混合在小压力管中并使用Branson Digital Sonifier 250以30％振幅进行超声处理60秒。将乳剂添加至含有溶液3(30mL)的50mL敞口烧杯并在室温下搅拌2小时以使二氯甲烷蒸发并混悬形成纳米载体。然后，将一部分的混悬纳米载体经如下洗涤：将纳米载体混悬液转移至离心管并在75,600rcf旋转40分钟，除去上清液并将沉淀物重悬于磷酸缓冲盐水中。重复该洗涤操作并随后将沉淀物重悬于PBS 1X中以获得基于聚合物的标称浓度为10mg/mL的纳米载体混悬液。将混悬液冷冻储存在-20℃下直至使用。
通过动态光散射确定纳米载体的尺寸。通过HPLC分析确定纳米载体中的雷帕霉素量。通过重量法确定总干纳米载体质量/mL混悬液。
与雷帕霉素连接的纳米载体的有效直径和雷帕霉素含量
Figure BDA0002259400510000571
材料
雷帕霉素购自TSZ CHEM(185 Wilson Street，Framingham，MA01702；产品代码R1017)。丙交酯∶乙交酯比例为1∶1并且特性黏度为0.24dL/g的PLGA购自SurModicsPharmaceuticals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码5050 DLG2.5A)。甲基醚封端的PEG嵌段为约5,000Da并且整体特性黏度为0.5DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物购自Lakeshore Biochemicals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码100DL mPEG 50005CE)。F8II.1723肽购自AnaSpec(34801 Campus Drive，Fremont，CA 94555)。
Figure BDA0002259400510000572
聚乙烯醇4-88，USP(85％至89％水解的，黏度为3.4mPa·s至4.6mPa·s)购自EMD Chemicals Inc.(480South Democrat Road Gibbstown，NJ 08027.产品代码1.41350)。
方法
如下制备溶液：
溶液1：二氯甲烷中的75mg/mL PLGA、25mg/mL PLA-PEG-OMe和12.5mg/mL雷帕霉素。该溶液通过将PLGA、PLA-PEG-OMe和雷帕霉素溶解于纯二氯甲烷中制备。
溶液2：50mM pH 11.5磷酸盐缓冲液中的10mg/mL F8II.1723(ERLWDYGMSSSPHVL)和100mg/mL蔗糖。该溶液通过将蔗糖溶解于50mM pH 11.5磷酸盐缓冲液中并随后添加作为干粉的F8II.1723肽制备。
溶液3：100mM pH 8磷酸盐缓冲液中的50mg/mL聚乙烯醇。
溶液4：70mM pH 8磷酸盐缓冲液。
首先如下制备初级(W1/O)乳剂：将溶液1(1.0mL)和溶液2(0.2mL)混合在小玻璃压力管中并使用Branson Digital Sonifier 250以50％振幅进行超声处理40秒。
然后，如下形成次级(W1/O1/W2)乳剂：向初级W1/O1乳剂添加溶液3(3.0mL)，涡旋以产生粗分散体，然后使用Branson Digital Sonifier250以30％振幅进行超声处理60秒。
将次级乳剂添加至含有溶液4(30mL)的50mL敞口烧杯并在室温下搅拌2小时以使二氯甲烷蒸发并混悬形成纳米载体。然后将一部分的混悬的纳米载体经如下洗涤：将纳米载体混悬液转移至离心管并在75,600rcf下旋转35分钟，除去上清液并将沉淀物重悬于磷酸缓冲盐水中。重复洗涤操作并将沉淀物重悬于PBS 1X中以获得基于聚合物的标称浓度为10mg/mL的纳米载体混悬液。将混悬液冷冻储存在-20℃下直至使用。
通过动态光散射确定纳米载体的尺寸。通过HPLC分析确定纳米载体中的雷帕霉素量。使用基于荧光胺的测定确定纳米载体中F8II.1723的量。通过重量法确定总干纳米载体质量/mL混悬液。
与雷帕霉素连接的纳米载体的有效直径和雷帕霉素含量
Figure BDA0002259400510000581
材料
雷帕霉素购自TSZ CHEM(185 Wilson Street，Framingham，MA 01702；产品代码R1017)。丙交酯∶乙交酯比例为1∶1并且特性黏度为0.24dL/g的PLGA购自SurModicsPharmaceuticals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码5050 DLG2.5A)。甲基醚封端的PEG嵌段为约5,000Da并且整体特性黏度为0.5DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物购自Lakeshore Biochemicals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码100DL mPEG 5000 5CE)。F8II.75肽购自AnaSpec(34801 Campus Drive，Fremont，CA 94555)。
Figure BDA0002259400510000591
聚乙烯醇4-88，USP(85％至89％水解的，黏度为3.4mPa·s至4.6mPa·s)购自EMD Chemicals Inc.(480 South Democrat Road Gibbstown.NJ 08027.产品代码1.41350)。
方法
如下制备溶液：
溶液1：二氯甲烷中的75mg/mL PLGA、25mg/mL PLA-PEG-OMe和12.5mg/mL雷帕霉素。该溶液通过将PLGA、PLA-PEG-OMe和雷帕霉素溶解于纯二氯甲烷中制备。
溶液2：50mM pH 2磷酸盐缓冲液中的10mg/mL F8II.75(VHLFNIAKPRPPWMG)和100mg/mL蔗糖。该溶液通过将蔗糖溶解于50mM pH 2磷酸盐缓冲液中并随后添加作为干粉的F8II.75肽制备。
溶液3：100mM pH 8磷酸盐缓冲液中的50mg/mL聚乙烯醇。
溶液4：70mM pH 8磷酸盐缓冲液。
首先如下形成初级(W1/O)乳剂：将溶液1(1.0mL)和溶液2(0.2mL)混合在小玻璃压力管中并使用Branson Digital Sonifier 250以50％振幅进行超声处理40秒。
然后，如下形成次级(W1/O1/W2)乳剂：向初级W1/O1乳剂添加溶液3(3.0mL)，涡旋以产生粗分散体并使用Branson Digital Sonifier 250以30％振幅进行超声处理60秒。
将次级乳剂添加至含有溶液4(30mL)的50mL敞口烧杯并在室温下搅拌2小时以使二氯甲烷蒸发并混悬形成纳米载体。然后将一部分的混悬纳米载体经如下洗涤：将纳米载体混悬液转移至离心管并在75,600rcf下旋转35分钟，除去上清液并将沉淀物重悬于磷酸缓冲盐水中。重复该洗涤操作并随后将沉淀物重悬于PBS 1X中以获得基于聚合物的标称浓度为10mg/mL的纳米载体混悬液。将混悬液冷冻储存在-20℃下直至使用。
通过动态光散射确定纳米载体的尺寸。通过HPLC分析确定纳米载体中的雷帕霉素量。使用基于荧光胺的测定确定纳米载体中F8II.75的量。通过重量法确定总干纳米载体质量/mL混悬液。
与雷帕霉素连接的纳米载体的有效直径和雷帕霉素含量
材料
雷帕霉素购自TSZ CHEM(185Wilson Street，Framingham，MA 01702；产品代码R1017)。丙交酯∶乙交酯比例为1∶1并且特性黏度为0.24dL/g的PLGA购自SurModicsPharmaceuticals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码5050 DLG2.5A)。甲基醚封端的PEG嵌段为约5,000Da并且整体特性黏度为0.5DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物购自Lakeshore Biochemicals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码100DL mPEG 5000 5CE)。F8II.2210肽购自AnaSpec(34801 Campus Drive，Fremont，CA 94555)。聚乙烯醇4-88，USP(85％至89％水解的，黏度为3.4mPa·s至4.6mPa·s)购自EMD Chemicals Inc.(480 South Democrat RoadGibbstown，NJ 08027.产品代码1.41350)。
方法
如下制备溶液：
溶液1：二氯甲烷中的75mg/mL PLGA、25mg/mL PLA-PEG-OMe和12.5mg/mL雷帕霉素。该溶液通过将PLGA、PLA-PEG-OMe和雷帕霉素溶解于纯二氯甲烷中制备。
溶液2：50mM pH 2磷酸盐缓冲液中的10mg/mL F8II.2210(TASSYFTNMFATWSPSKAR)和100mg/mL蔗糖。该溶液通过将蔗糖溶解于50mM pH 2磷酸盐缓冲液中并随后添加作为干粉的F8II.2210肽制备。
溶液3：100mM pH 8磷酸盐缓冲液中的50mg/mL聚乙烯醇。
溶液4：70mM pH 8磷酸盐缓冲液。
首先如下制备初级(W1/O)乳剂：将溶液1(1.0mL)和溶液2(0.2mL)混合在小玻璃压力管中并使用Branson Digital Sonifier 250以50％振幅进行超声处理40秒。
然后，如下形成次级(W1/O1/W2)乳剂：向初级乳剂添加将溶液3(3.0mL)，涡旋以产生粗分散体并使用Branson Digital Sonifier 250以30％振幅进行超声处理60秒。
将次级乳剂添加至含有溶液4(30mL)的50mL敞口烧杯并在室温下搅拌2小时以使二氯甲烷蒸发并混悬形成纳米载体。然后将一部分的混悬纳米载体经如下洗涤：将纳米载体混悬液转移至离心管并在75,600rcf下旋转35分钟，除去上清液并将沉淀物重悬于磷酸缓冲盐水中。重复该洗涤操作并随后将沉淀物重悬于PBS 1X中以获得基于聚合物的标称浓度为10mg/mL的纳米载体混悬液。将混悬液冷冻储存在-20℃下直至使用。
通过动态光散射确定纳米载体的尺寸。通过HPLC分析确定纳米载体中的雷帕霉素量。使用基于荧光胺的测定确定纳米载体中F8II.2210的量。通过重量法确定总干纳米载体质量/mL混悬液。
与雷帕霉素连接的纳米载体的有效直径和雷帕霉素含量
Figure BDA0002259400510000611
材料
丙交酯∶乙交酯比例为1∶1并且特性黏度为0.24dL/g的PLGA购自SurModicsPharmaceuticals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码5050 DLG2.5A)。甲基醚封端的PEG嵌段为约5,000Da并且整体特性黏度为0.5DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物购自Lakeshore Biochemicals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码100DL mPEG 5000 5CE)。
Figure BDA0002259400510000621
聚乙烯醇4-88，USP(85％至89％水解的，黏度为3.4mPa·s至4.6mPa·s)购自EMD Chemicals Inc.(480South Democrat RoadGibbstown，NJ 08027.产品代码1.41350)。
方法
如下制备溶液：
溶液1：二氯甲烷中的75mg/mL PLGA和25mg/mL PLA-PEG-OMe。该溶液通过将PLGA和PLA-PEG-OMe溶解于纯二氯甲烷中制备。
溶液2：100mM pH 8磷酸盐缓冲液中的50mg/mL聚乙烯醇。
溶液3：70mM磷酸盐缓冲液，pH 8。
如下制备水包油型乳剂：将溶液1(1.0mL)和溶液2(3.0mL)混合在小玻璃压力管中并使用Branson Digital Sonifier 250以30％振幅进行超声处理60秒。将乳剂添加至含有溶液3(30mL)的50mL敞口烧杯并在室温下搅拌2小时以使二氯甲烷蒸发并混悬形成纳米载体。然后将一部分的混悬纳米载体经如下洗涤：将纳米载体混悬液转移至离心管并在75,600rcf下旋转40分钟，除去上清液并将沉淀物重悬于磷酸缓冲盐水中。重复该洗涤操作并随后将沉淀物重悬于PBS 1X中以获得基于聚合物的标称浓度为10mg/mL的纳米载体混悬液。将混悬液冷冻储存在-20℃下直至使用。
通过动态光散射确定纳米载体的尺寸。通过重量法确定总干纳米载体质量/mL混悬液。
纳米载体ID 有效直径(nm)
8 183
实施例4：评价针对FVIII的免疫应答
使血友病A小鼠(E16小鼠)(第0天，n＝8)每周接受以下的伴随静脉内(i.v.)注射：凝血蛋白质(因子VIII(FVIII))和与雷帕霉素连接的合成纳米载体(纳米载体ID 4)，或者空纳米载体(NP)(纳米载体ID 8)和FVIII或者IVIG(静脉内免疫球蛋白)和FVIII，持续连续5周。为了在最后的FVIII和与雷帕霉素连接之纳米载体的剂量后1个月评价针对FVIII的抗体回忆应答，使用显色FVIII活性测定药盒(Coatest SP4 FVIII)通过毕提斯达测定(Bethesda assay)确定抑制剂效价，如5中所示。
为了进一步评估由FVIII和与雷帕霉素连接之纳米载体的处理引起的持久耐受性，使血友病A小鼠(E16小鼠)(第0天，n＝8)每周接受以下的伴随静脉内注射：合成纳米载体和FVIII肽(将纳米载体ID 5、6和7混合以获得1∶1∶1的肽质量比并一起注射)，或者与雷帕霉素连接的合成纳米载体(纳米载体ID 4)和FVIII蛋白，或者空NP(纳米载体ID 8)和FVIH，或者IVIG(静脉内免疫球蛋白)和FVIII，持续5周，如图6A中示意性所示的。第57、81和125天，在不存在进一步处理的情况下用FVIII(i.v.或i.p.)攻击小鼠。通过ELISA确定抗FVIII抗体的水平。在选定时间点的结果示于图6B中。将每个时间点的数据表示为平均值±SEM。对于统计学分析，使用具有双尾分布的t-检验(student t-test)将纳米载体组(具有蛋白质或肽)与空纳米颗粒对照组进行比较。＊p＜0.05和＊＊p＜0.01，在具有蛋白质的纳米载体ID 4和空NP组之间；#p＜0.05和##p＜0.01，在纳米载体和肽(纳米载体ID 5、6和7)与空NP组之间。FVIII的所有注射均为1μg/注射。纳米载体ID 4的所有注射均为100μg/注射。
数据表明将与合成纳米载体连接之免疫抑制剂和FVIII或其肽一起施用可降低抗因子FVIII抗体应答。与未连接的因子FVIII蛋白以及也与合成纳米载体连接的因子FVIII肽组合使用免疫抑制剂合成纳米载体也是如此。数据还表明，这样的施用可使因子VIII的活性提高。这证明，当伴随施用与合成纳米载体连接的免疫抑制剂时降低针对蛋白质的不期望免疫应答并且提高效力。最后，结果支持建立了如本文中提供的方案。
实施例5：评价针对HUMIRA/阿达木单抗的应答
一周一次地，在前肢内向年龄匹配(5周至6周)的雌性对照C57BL/6皮下(s.c.)注射60μg HUMIRA，直至第29天(d0、7、14、22、29，在所有组和条件下)。使另一组接受类似的注射，但在开始第0天，将0.9mg与雷帕霉素连接的合成纳米载体(纳米载体ID 1、2或3)与HUMIRA的溶液混合。图7A中所示的结果示出了在第21天所有动物的血液中的抗体效价。对照动物发生针对HUMIRA的稳健抗体应答，而经处理的动物甚至在20天和在无处理情况下进行两次HUMIRA注射后保持完全阴性。在第29天，在一个后肢内使动物接受再一次攻击，而使另一后肢接受盐水以测试局部抗体介导的I型超敏反应。为此，在注射后1小时借助卡尺测量后肢的厚度。两个肢体间的厚度差异示于图7B中。与抗体结果类似，纳米载体处理消除了通过局部施用HUMIRA引起的炎性应答。
这些结果表明，将与合成纳米载体连接的免疫抑制剂与HUMIRA一起施用可降低不期望的抗HUMIRA抗体应答以及消除由在无免疫抑制剂纳米载体组合物下施用HUMIRA引起的不期望炎性反应。这证明，当伴随施用与合成纳米载体连接的免疫抑制剂时降低针对蛋白质的不期望免疫应答。最后，结果支持建立了如本文中提供的方案。
实施例6：评价针对钥孔林普贝血蓝蛋白(KLH)的应答
从第0天或第21天开始，一周一次地在尾静脉内向年龄匹配的(5周至6周)雌性C57BL/6静脉内(i.v.)注射200μg钥孔林普贝血蓝蛋白(KLH)，直至第34天(d0、7、14、21、28、34)。在第0天至第34天，使另一组接受类似的注射，但在第0、14和21天，将0.47mg与雷帕霉素连接的合成纳米载体(纳米载体ID 1、2或3)与KLH的溶液混合，之后在第21天至第34天每周进行单独KLH注射(d21、28、34)。图8中所示的结果示出了在指定时间点所有动物的血液中的KLH抗体效价。在使用相同量的KLH进行三次注射后(分别在第26天和第40天)，在第0天或第21天开始免疫的对照动物发生非常类似的应答(EC50＝3×103至5×103)。相比之下，在进行三次单独KLH的注射后，接受三次合成纳米载体注射的动物保持完全阴性。
数据表明，将与合成纳米载体连接的免疫抑制剂与KLH一起施用可降低抗KLH抗体应答，并且甚至在纳米载体处理之后施用KLH后仍可保持这样的降低。这证明，与合成纳米载体连接之免疫抑制剂的伴随施用降低针对蛋白质的不期望免疫应答。最后，结果支持建立了如本文中提供的方案。
实施例7：评价针对卵清蛋白的应答
在第-21天和第-13天，在尾静脉内对年龄匹配的(5周至6周)雌性C57BL/6静脉内注射1.2mg未连接纳米颗粒(NP[空])(纳米载体ID 8)、游离雷帕霉素(fRapa)(100μg)、22μg游离鸡卵清蛋白(fOVA)、fRapa与fOVA的组合、单独或与22μg fOVA组合之1.2mg与雷帕霉素连接的纳米载体(NP[Rapa]，100μg雷帕霉素内容物)(纳米载体ID 1、2或3)。在第0天，在后肢内，对所有动物皮下注射与2μg CpG混合的2.5μg颗粒OVA(pOVA)，之后在第7天和第14天注射2.5μg pOVA。在不存在任何处理的情况下(NP[空])，动物发生针对OVA的稳健免疫应答，这可通过抗OVA IgG抗体效价测量。图9中所示的第22天抗体效价证明在相同溶液(fOVA+NP[Rapa])中与OVA伴随施用之合成纳米载体的两个剂量甚至在1次OVA+CpG注射和2次单独OVA注射之后有效地预防针对OVA的抗体形成。
数据表明，将与合成纳米载体连接的免疫抑制剂与OVA一起施用可降低抗OVA抗体应答，并且甚至在将OVA与强佐剂组合施用后仍可保持这样的降低。这证明，与合成纳米载体连接之免疫抑制剂的伴随施用降低针对蛋白质的不期望免疫应答。最后，结果支持建立了如本文中提供的方案。
实施例8：评价针对KRYSTEXXA的应答
在第-21天和第-14天，在尾静脉内，向对照组年龄匹配的(5周至6周)雌性C57BL/6静脉内注射PBS，而向处理组注射0.9mg与雷帕霉素连接的纳米载体(纳米载体ID 1、2或3)和40μg KRYSTEXXA的组合。在第0天至第28天，在后肢内使所有动物每周接受与20μg CpGs.c.组合的100μg KRYSTEXXA的注射(d0、7、12、28)。对照动物发生针对KRYSTEXXA的免疫应答，这可通过抗KRYSTEXXA IgM抗体效价测量。图10中的结果表明，在同一溶液中用与KRYSTEXXA伴随施用之合成纳米载体处理动物有效地在长时间内预防针对KRYSTEXXA的抗体形成。经处理的动物甚至在无纳米载体的情况下进行5次KRYSTEXXA+CpG注射后未发生抗KRYSTEXXA应答。
数据表明，将与合成纳米载体连接的免疫抑制剂与KRYSTEXXA一起施用可降低抗KRYSTEXXA抗体应答，并且甚至在纳米载体处理之后将KRYSTEXXA与强佐剂组合施用后仍可保持这样的降低。这证明，与合成纳米载体连接之免疫抑制剂的伴随施用降低针对蛋白质的不期望免疫应答。最后，结果支持建立了如本文中提供的方案。
实施例9：评价针对卵清蛋白和KLH的应答
一周一次地，在尾静脉内向对照组年龄匹配的(5周至6周)雌性C57BL/6静脉内注射2.5μg颗粒卵清蛋白(pOVA)的免疫原性形式并在后肢内皮下注射2μg钥孔林普贝血蓝蛋白(KLH)，持续49天(d0、7、14、20、28、35、42、49)。以相同的途径和量使其他动物组接受pOVA和KLH，但在第0、7和14天与0.2mg连接有雷帕霉素的纳米载体(纳米载体ID 1、2或3)混合，之后在第20天至第42天进行pOVA注射(与之前相同的量)。对照动物发生针对OVA和KLH的稳健免疫应答，这可通过抗OVA或抗KLH IgG抗体效价测量。图11中所示的第54天抗体效价证明，在同一溶液中与pOVA伴随施用之合成纳米载体的3个剂量有效地在长时间内降低和预防针对OVA的抗体形成，而非KLH(注射在另一位置s.c.)。经处理的动物甚至在5次单独的pOVA注射后仍未发生抗OVA应答。
数据表明，将与合成纳米载体连接的免疫抑制剂与蛋白质伴随施用可降低抗蛋白质抗体应答，但这样的应答是对通过相同途径施用的蛋白质有特异性的。这证明，与合成纳米载体连接之免疫抑制剂的伴随施用降低针对蛋白质的不期望免疫应答。最后，结果支持建立了如本文中提供的方案。
实施例10：评价针对KLH的应答
一周一次地，在尾静脉内向年龄匹配(5周至6周)的雌性对照C57BL/6静脉内(i.v.)注射200μg钥孔林普贝血蓝蛋白(KLH)，持续63天(d0、7、14、21、28、35、42、49、56、63)。使另一组接受类似的注射但在第0、7、14和21天，将0.9mg与雷帕霉素连接的合成纳米载体(纳米载体ID 1、2或3)与KLH的溶液混合，之后在第28天至第63天进行6次KLH注射(相同量)。对照动物发生针对KLH的稳健应答，这可通过抗KLH IgG抗体效价以及由注射引起的过敏反应测量。图12A中的结果示出了在指定时间点所有动物的血液中的抗体效价，并且由注射抗原导致的过敏反应评分示于图12B中。与KLH伴随施用之合成纳米载体的4个剂量有效地在长时间内降低和预防抗体形成和过敏反应。事实上，经处理的动物甚至在4次单独KLH的注射后仍未发生抗KLH应答，在对照动物中，4次单独KLH的注射在很大程度上足以产生应答(第26天)。
这些结果表明，本文中提供的组合物当在一段时间内与蛋白质伴随施用时可在长时间内降低或预防抗体形成和过敏反应。由三个独立的观察者确定过敏反应评分，如下：0＝无症状，1＝嗜睡，2＝嗜睡和不能直立，3＝垂死。
这些结果表明，将与合成纳米载体连接的免疫抑制剂与KLH伴随施用可降低不期望的抗KLH抗体应答，以及消除由在无免疫抑制剂纳米载体组合物的情况下施用KLH所引起的不期望过敏反应。这证明，与合成纳米载体连接之免疫抑制剂的伴随施用降低针对蛋白质不期望免疫应答。最后，结果支持建立了如本文中提供的方案。
实施例11：评价关节炎动物中的抗HUMIRA免疫应答
过表达人肿瘤坏死因子α的转基因动物(transgenic animals overexpressinghuman tumor necrosis factor alpha，huTNFaTg)在出生后20周内发生进行性类风湿性关节炎。这一过程可通过使用全人抗人TNFα抗体HUMIRA/阿达木单抗来预防。然而，重复施用初始治疗剂量的HUMIRA(60μg)导致中和治疗益处的抗药物抗体(anti-drug antibody，ADA)形成。再者，只有非常高的剂量才可维持治疗益处和克服中和的免疫应答。例如，认为，在这样的小鼠模型的一个实例中产生炎症的最大抑制需要约200μg(Binder等，Arthritis&Rheumatism，第65卷(第3期)，2013年3月，第608-617页)。
对于前7次注射，在肩胛下区域内，向年龄匹配的huTNFaTg 5周龄雌性动物皮下注射盐水(PBS)或60μgHUMIRA(每周)，或者HUMIRA和0.87mg与雷帕霉素连接的纳米载体(纳米载体ID 1、2或3)的混合物(第0、7、14、21、28、35、42天，5周至12周龄)，之后进行3次单独HUMIRA的注射(相同量)(第49天至第63天，13周至15周龄)。图13A中的结果示出了在第21天所有动物的血液中的抗体效价。如所预期的，未接受HUMIRA的对照动物无抗HUMIRA效价；而在仅接受HUMIRA的对照中可观察到稳健的抗体应答。相比之下，经纳米载体处理的动物甚至在无处理的情况下进行三次HUMIRA注射后保持完全阴性。对这些动物之肢体的监测揭示了在对照动物中在10周龄就已显现的进行性疾病。经单独HUMIRA处理的动物显著阻断疾病进程，而向该方案添加纳米载体极大地阻断关节炎症状的出现。在此的评分为4个独立评分员的总分，如下：1)表示滑膜炎、关节积液和软组织肿胀，2)包括增殖性发炎滑液组织，其生长进入关节腔并破坏软骨，3)表示软骨的广泛损失、关节边缘的腐蚀和畸形，4)几乎为具有关节的纤维性或骨性硬化的疾病的末期，其结束其功能寿命。
这些结果表明，将与合成纳米载体连接的免疫抑制剂与HUMIRA施用可降低抗HUMIRA抗体应答。证明HUMIRA效力提高的进一步降低的关节炎评分也证明了伴随施用的益处。这证明，与合成纳米载体连接之免疫抑制剂的伴随施用不仅降低针对治疗性蛋白质的不期望免疫应答而且提高效力。这还证明，在本文中提供的本发明伴随施用下不需要较高剂量的治疗剂。此外，基于在相同HUMIRA剂量下关节炎评分的降低水平，与在无本文中提供之免疫抑制剂剂量的伴随施用下所需的HUMIRA量相比，还可使用降低的HUMIRA量，并且其可实现提高的效力。重点指出的是，本实施例中使用的HUMIRA量为60μg，与本领域中为了通过HUMIRA实现炎症的最大抑制而使用的约200μg量相比，这远远降低(Binder等，Arthritis&Rheumatism，第65卷(第3期)，2013年3月，第608-617页)。最后，结果支持建立了如本文中提供的方案。
实施例12：具有连接的布洛芬的介孔二氧化硅纳米颗粒(预示性的)
通过溶胶-凝胶法制备介孔SiO2纳米颗粒芯。将十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide，CTAB)(0.5g)溶解于去离子水(500mL)中，然后向CTAB溶液添加2M NaOH水溶液(3.5mL)。将溶液搅拌30分钟，然后向溶液添加四乙氧基硅烷(Tetraethoxysilane，TEOS)(2.5mL)。将所得凝胶在80℃的温度下搅拌3小时。通过过滤捕获形成的白色沉淀物，之后用去离子水洗涤并在室温下干燥。然后，将剩余的表面活性剂通过混悬于HCl的乙醇溶液中过夜来从颗粒中萃取。将颗粒用乙醇洗涤，离心并在超声处理下重分散。再重复该洗涤操作两次。
然后，使用(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷((3-aminopropyl)-triethoxysilane，APTMS)用氨基官能化SiO2纳米颗粒。为了实现这一点，将颗粒混悬于乙醇(30mL)中，并向混悬液添加APTMS(50μL)。使混悬液在室温下静置2小时，然后煮沸4小时，通过定期添加乙醇使体积保持不变。如下除去剩余的反应物：通过离心进行5个循环的洗涤并重分散于纯乙醇中。
在独立反应中，产生直径为1nm至4nm的金籽晶(gold seed)。首先，对该反应中使用的所有水进行去离子并随后从玻璃蒸馏。向100mL的圆底瓶添加水(45.5mL)。在搅拌的同时，添加0.2M NaOH水溶液(1.5mL)，之后添加四(羟甲基)氯化(tetrakis(hydroxymethyl)phosphoniumchloride，THPC)的1％水溶液(1.0mL)。在添加THPC溶液后2分钟，添加已陈化至少15分钟的氯金酸的10mg/mL水溶液(2mL)。通过用水透析纯化金籽晶。
为了形成芯-壳纳米载体，首先，将上述形成的氨基官能化SiO2纳米颗粒与金籽晶在室温下混合2小时。通过离心收集经金装饰的SiO2颗粒并将其与氯金酸和碳酸氢钾的水溶液混合以形成金壳。然后，通过离心并重分散于水中对颗粒进行洗涤。通过将颗粒混悬于布洛芬钠的溶液(1mg/L)中72小时装载布洛芬。然后，通过离心并重分散于水中从颗粒中洗去游离的布洛芬。
实施例13：包含环孢素A的脂质体(预示性的)
使用薄膜水合形成脂质体。将1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1，2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DPPC)(32μmol)、胆固醇(32μmol)和环孢素A(6.4μmol)溶解于纯氯仿(3mL)中。将该脂质溶液添加至50mL的圆底瓶，并在60℃的温度下在旋转蒸发器上使溶剂蒸发。然后，用氮气吹洗该瓶以除去剩余的溶剂。向该瓶添加磷酸缓冲盐水(2mL)和5个玻璃珠，通过在60℃下摇动1小时以形成混悬液来对脂质膜进行水合。将混悬液转移至小压力管并在60℃下超声处理4个30秒脉冲的循环，其中每个脉冲之间具有30秒延迟。然后，使混悬液在室温下静置2小时以允许完全水合。通过离心并随后重悬于新鲜的磷酸缓冲盐水中对脂质体进行洗涤。
实施例14：制备包含雷帕霉素的金纳米载体(AuNC)(预示性的)
制备HS-PEG-雷帕霉素：
将PEG酸二硫化物(1.0当量)、雷帕霉素(2.0当量至2.5当量)、DCC(2.5当量)和DMAP(3.0当量)在无水DMF中的溶液在室温下搅拌过夜。通过过滤除去不溶性二环己基脲并将滤液添加至异丙醇(IPA)以沉淀出PEG-二硫化物-二-雷帕霉素酯，用IPA洗涤并干燥。然后，用DMF中的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐处理聚合物以将PEG二硫化物还原成巯基PEG雷帕霉素酯(HS-PEG-雷帕霉素)。通过从IPA中沉淀出回收所得聚合物，如前所述进行干燥并通过H NMR和GPC分析。
金NC(AuNC)的形成：
在剧烈搅拌下，将500mL 1mM HAuCl4的水溶液在装备有冷凝器的1L圆底瓶中加热回流10分钟。然后，向搅拌中的溶液迅速添加50mL40mM柠檬酸三钠的溶液。将所得的深酒红色溶液在回流下保持25分钟至30分钟并撤出热量，将溶液冷却至室温。然后，通过0.8μm膜过滤器过滤溶液以得到AuNC溶液。使用可见光谱和透射电子显微术对AuNC进行表征。经柠檬酸盐包被的AuNC的直径为约20um，并且在520um下具有峰吸收。
具有HS-PEG-雷帕霉素的AuNC缀合物：
向1mL直径为20nm的经柠檬酸盐包被金纳米载体(1.16nM)添加150μl HS-PEG-雷帕霉素(10mM pH 9.0碳酸盐缓冲液中10μM)的溶液以产生巯基∶金为2500∶1的摩尔比。将混合物在氩气下在室温下搅拌1小时以使巯基与金纳米载体上的柠檬酸盐完全交换。然后，通过在12,000g下离心30分钟纯化表面上具有PEG-雷帕霉素的AuNC。将上清液倒出并随后用1x PBS缓冲液洗涤含有AuNC-S-PEG-雷帕霉素的沉淀物。然后，将经纯化的金-PEG-雷帕霉素纳米载体重悬于合适的缓冲液中以进行进一步的分析和生物测定。
实施例15.包含雷帕霉素和卵清蛋白的脂质体(预示性的)
通过薄膜水合形成脂质体。将1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)(32μmol)、胆固醇(32μmol)和雷帕霉素(6.4μmol)溶解于纯氯仿(3mL)中。将该脂质溶液添加至10mL玻璃管，在氮气流下除去溶剂并真空干燥6小时。通过用2.0ml包含过量卵清蛋白的25mM MOPS缓冲液pH8.5水合膜得到多层囊泡。使管涡旋直至脂质膜从管表面剥离。为了将多层囊泡分解成单层囊泡，应用了10个冷冻(液氮)和解冻(30℃水浴)的循环。然后，在25mMMOPS缓冲液pH 8.5中将样品稀释至1ml。通过使10倍的样品通过200nm孔聚碳酸酯过滤器挤出来均化所得脂质体的尺寸。然后将所得的脂质体用于进一步的分析和生物测定。
实施例16.在关节炎动物中，针对HUMIRA的致耐受性应答预防中和抗HUMIRA应答 的形成
材料
雷帕霉素购自TSZ CHEM(185 Wilson Street，Framingham，MA 01702；产品代码R1017)。丙交酯∶乙交酯比例为3∶1并且特性黏度为0.75dL/g的PLGA购自SurModicsPharmaceuticals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码7525 DLG7A)。甲基醚封端的PEG嵌段为约5,000Da并且整体特性黏度为0.5DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物购自Lakeshore Biochemicals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码100 DL mPEG 5000 5CE)。
Figure BDA0002259400510000711
聚乙烯醇4-88，USP(85％至89％水解的，黏度为3.4mPa·s至4.6mPa·s)购自EMD Chemicals Inc.(480 South Democrat RoadGibbstown，NJ 08027.产品代码1.41350)。
方法
如下制备溶液：
溶液1：二氯甲烷中的75mg/mL PLGA、25mg/mL PLA-PEG-OMe和12.5mg/mL雷帕霉素。该溶液通过将PLGA、PLA-PEG-OMe和雷帕霉素溶解于纯二氯甲烷中制备。溶液2：100mMpH 8磷酸盐缓冲液中的50mg/mL聚乙烯醇。
使用水包油型乳剂制备纳米载体。如下制备O/W乳剂：将溶液1(1.0mL)和溶液2(3.0mL)合并在小压力管中并使用Branson Digital Sonifier 250以30％振幅进行超声处理60秒。将O/W乳剂添加至含有70mM pH 8磷酸盐缓冲溶液的烧杯并在室温下搅拌2小时以使二氯甲烷蒸发并形成纳米载体。将一部分的纳米载体经如下洗涤：将纳米载体混悬液转移至离心管并在75,600×g和4℃下离心50分钟，除去上清液并将沉淀物重悬于磷酸缓冲盐水中。重复洗涤操作并将沉淀物重悬于磷酸缓冲盐水中以获得约10mg/mL的最终合成纳米载体分散体
通过动态光散射确定纳米载体的尺寸。通过HPLC分析确定纳米载体中雷帕霉素的量。通过重量法确定总干纳米载体质量/mL混悬液。
Figure BDA0002259400510000721
过表达人肿瘤坏死因子α的转基因动物(huTNFaTg)在出生后20周内发生进行性类风湿性关节炎。这一过程可通过使用全人抗人TNFα抗体阿达木单抗或HUMIRA来预防。然而，重复施用初始治疗剂量的HUMIRA(60μg)导致中和治疗益处的抗药物抗体形成(ADA)。
对于前7次注射(第0至42天，第5周至第11周龄)，在肩胛下区域内，向年龄匹配的huTNFaTg5周龄雌性动物皮下注射盐水(PBS)或60μg HUMIRA(每周)，或者HUMIRA与0.87mg致耐受性纳米颗粒的混合物，之后进行10次单独HUMIRA的周注射(相同量)(第49天至第107天，第12周至第20周龄)。该方案示于图14中。
图15(左图)中的结果示出了在不同时间点所有动物的血液中的抗体效价。如所预期的，经对照模拟物处理的动物无效价；而在仅接受HUMIRA的动物中可观察到稳健的抗HUMIRA抗体应答。在第5周至11周龄的致耐受性纳米颗粒处理甚至在无致耐受性处理的情况下进行10次HUMIRA注射(第12周至第20周)后导致完全抵抗发生抗HUMIRA效价。对这些动物之肢体的监测揭示了在10周龄就已显现的进行性疾病。单独HUMIRA显著阻断疾病进程，而向该方案添加致耐受性纳米载体极大地阻断关节炎症状的出现。在此的评分为4个独立评分员的平均总分，如下：1)表示滑膜炎、关节积液和软组织肿胀，2)包括增殖性发炎滑液组织，其生长进入关节腔并破坏软骨，3)表示软骨的广泛损失、关节边缘的腐蚀和畸形，4)几乎为具有关节的纤维性或骨性硬化的疾病的末期，其结束其功能寿命。
这些结果表明，本文中提供的组合物当在一段时间内与蛋白质伴随施用时可在长时间内降低或预防针对生物治疗剂的抗体形成，并由此提高其效力和治疗窗。这些结果还表明，将与合成纳米载体连接之免疫抑制剂与HUMIRA一起施用可降低不期望的抗HUMIRA抗体应答。证明HUMIRA效力提高的进一步降低的关节炎评分也证明了伴随施用的益处。这证明，与合成纳米载体连接之免疫抑制剂的伴随施用不仅降低针对治疗性蛋白质的不期望免疫应答而且提高效力。这还证明，在本文中提供的本发明伴随施用下不需要较高剂量的治疗剂。此外，基于在相同HUMIRA剂量下关节炎评分的降低水平，与在无本文中提供之免疫抑制剂剂量的伴随施用下所需的HUMIRA量相比，还可使用降低的HUMIRA量，并且其可实现提高的效力。重点指出的是，本实施例中使用的HUMIRA量为60μg，与本领域中为了通过HUMIRA实现炎症的最大抑制而使用的约200μg量相比，这远远降低(Binder等，Arthritis&Rheumatism，第65卷(第3期)，2013年3月，第608-617页)。最后，结果支持建立了如本文中提供的方案。
实施例17：评价抗HUMIRA免疫应答
材料
雷帕霉素购自TSZ CHEM(185 Wilson Street，Framingham，MA 01702；产品代码R1017)。丙交酯∶乙交酯比例为3∶1并且特性黏度为0.75dL/g的PLGA购自SurModicsPharmaceuticals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码7525 DLG7A)。甲基醚封端的PEG嵌段为约5,000Da并且整体特性黏度为0.5DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物购自Lakeshore Biochemicals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码100DL mPEG 5000 5CE)。
Figure BDA0002259400510000731
聚乙烯醇4-88，USP(85％至89％水解的，黏度为3.4mPa·s至4.6mPa·s)购自EMD Chemicals Inc.(480 South Democrat RoadGibbstown，NJ 08027.产品代码1.41350)。
方法
如下制备溶液：
溶液1：二氯甲烷中的75mg/mL PLGA、25mg/mL PLA-PEG-OMe和12.5mg/mL雷帕霉素。该溶液通过将PLGA、PLA-PEG-OMe和雷帕霉素溶解于纯二氯甲烷中制备。溶液2：100mMpH 8磷酸盐缓冲液中的50mg/mL聚乙烯醇。
使用水包油型乳剂制备纳米载体。如下制备O/W乳剂：将溶液1(1.0mL)和溶液2(3.0mL)合并在小压力管中并使用Branson Digital Sonifier 250以30％振幅进行超声处理60秒。将O/W乳剂添加至含有70mM pH 8磷酸盐缓冲溶液的烧杯并在室温下搅拌2小时以使二氯甲烷蒸发并形成纳米载体。将一部分的纳米载体经如下洗涤：将纳米载体混悬液转移至离心管并在75,600×g和4℃下离心50分钟，除去上清液并将沉淀物重悬于磷酸缓冲盐水中。重复洗涤操作并将沉淀物重悬于磷酸缓冲盐水中以获得约10mg/mL的最终纳米载体分散体。
通过动态光散射确定纳米载体的尺寸。通过HPLC分析确定纳米载体中雷帕霉素的量。通过重量法确定总干纳米载体质量/mL混悬液。
Figure BDA0002259400510000741
使用上述材料和方法产生含雷帕霉素的纳米载体。通过动态光散射确定纳米载体的尺寸。通过HPLC分析确定纳米载体中雷帕霉素的量。通过重量法确定总干纳米载体质量/mL混悬液。
Figure BDA0002259400510000742
对关节炎动物中的抗HUMIRA免疫应答和中和应答进行评价。过表达人肿瘤坏死因子α的转基因动物(huTNFaTg)在出生后20周内发生进行性类风湿性关节炎。这一过程可通过使用全人抗人TNFα抗体阿达木单抗或HUMIRA来预防。然而，重复施用初始治疗剂量的HUMIRA(60μg)导致中和治疗益处的抗药物抗体形成(ADA)。考虑到Humira的治疗效果，可注射较高量的Humira(200μg)以克服该对抗性免疫应答。
对于前3次注射(第5周至7周龄)，在肩胛下区域内，向年龄匹配的huTNFαTg 5周龄雌性动物皮下注射盐水(PBS)或者60μg或200μgHUMIRA(每周)(第5周至第10周)，或者60μgHUMIRA和0.87mg致耐受性纳米颗粒的混合物，之后进行3次单独HUMIRA的周注射(相同量)(第8周至第10周龄)。图17(左图)中的结果示出了在不同时间点所有动物的血液中的抗体效价。如所预期的，经对照模拟物处理的动物无抗效价；而在仅接受HUMIRA的动物中可观察到稳健的抗HUMIRA抗体应答。在第5周至7周龄的纳米载体处理甚至在无处理的情况下进行3次HUMIRA注射(第8周至第10周)后导致完全抵抗发生抗HUMIRA效价。值得注意的是，三次HUMIRA注射导致对照动物具有非常高的效价(第7周效价)，而经纳米载体处理动物中的三次类似注射(总共6次注射)则完全抵抗发生效价(第10周)。图16示出了给药方案。
对这些动物之肢体的监测揭示了在6周龄就已显现的进行性疾病。单独HUMIRA显著阻断疾病进程，而向该方案添加纳米载体极大地阻断关节炎症状的出现。评分(图17(右图))为4个独立评分员的平均总分，如下：1)表示滑膜炎、关节积液和软组织肿胀，2)包括增殖性发炎滑液组织，其生长进入关节腔并破坏软骨，3)表示软骨的广泛损失、关节边缘的腐蚀和畸形，4)几乎为具有关节的纤维性或骨性硬化的疾病的末期，其结束其功能寿命。
这些结果表明，本文中提供的方法和组合物可降低或预防针对治疗性蛋白质的抗体形成并且提高其效力。特别地，如上所述，这些结果表明：将与合成纳米载体连接之免疫抑制剂与HUMIRA一起施用可降低不期望的抗HUMIRA抗体应答。证明HUMIRA效力提高的进一步降低的关节炎评分也证明了伴随施用的益处。这证明，与合成纳米载体连接之免疫抑制剂的伴随施用不仅降低针对治疗性蛋白质的不期望免疫应答而且提高效力。这还证明，在本文中提供的本发明伴随施用下不需要较高剂量的治疗剂。此外，基于在相同HUMIRA剂量下关节炎评分的降低水平，与在无本文中提供之免疫抑制剂剂量的伴随施用下所需的HUMIRA量相比，还可使用降低的HUMIRA量，并且其可实现提高的效力。重点指出的是，本实施例中使用的HUMIRA量为60μg，与本领域中为了通过HUMIRA实现炎症的最大抑制而使用的约200μg量相比，这远远降低(Binder等，Arthritis&Rheumatism，第65卷(第3期)，2013年3月，第608-617页)。最后，结果支持建立了如本文中提供的方案。
实施例18：针对具有经包封雷帕霉素的鸡卵清蛋白的抗体特异性致耐受性应答
NP[Rapa]材料和方法
材料
雷帕霉素购自TSZ CHEM(185 Wilson Street，Framingham，MA 01702)，产品代码R1017。丙交酯∶乙交酯比例为1∶1并且特性黏度为0.24dL/g的PLGA购自LakeshoreBiomaterials(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211)，产品代码5050 DLG 2.5A。甲基醚封端的PEG嵌段为约5,000Da并且整体特性黏度为0.50DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物购自Lakeshore Biomaterials(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211)，产品代码100DL mPEG 5000 5CE。
Figure BDA0002259400510000761
聚乙烯醇4-88，USP(85％至89％水解的，黏度为3.4mPa·s至4.6mPa·s)购自EMD Chemicals Inc.(480 South Democrat RoadGibbstown，NJ 08027)，产品代码1.41350。CeIlgro磷酸缓冲盐水1X(PBS 1X)购自Corning(9345 Discovery Blvd.Manassas，VA 20109)，产品代码21-040-CV。
方法
如下制备溶液：
溶液1：聚合物和雷帕霉素混合物通过将75mg/mL PLGA、25mg/mL PLA-PEG-OMe和12.5mg/mL雷帕霉素溶解于二氯甲烷中制备。溶液2：在100mM pH 8磷酸盐缓冲液中以50mg/mL制备聚乙烯醇。
如下制备O/W乳剂：将溶液1(1.0mL)和溶液2(3.0mL)合并在小压力管中并使用Branson Digital Sonifier 250以30％振幅进行超声处理60秒。将O/W乳剂添加至含有70mM pH 8磷酸盐缓冲溶液(60mL)的敞口烧杯。制备另外三份相同的O/W乳剂，并添加至与第一乳剂相同的烧杯。然后，将这些乳剂在室温下搅拌2小时以使二氯甲烷蒸发并形成纳米载体。将一部分的纳米载体经如下洗涤：将纳米载体混悬液转移至离心管并在75,600×g和4℃下离心35分钟，除去上清液并将沉淀物重悬于PBS 1X中。重复洗涤操作并随后将沉淀物重悬于PBS 1X中以获得基于聚合物的标称浓度为10mg/mL的纳米载体混悬液。如上所述在独立烧杯中制备相同的配制物并在洗涤步骤之后与第一配制物合并。使用来自Pall型号4656的1.2μm PES膜注射式过滤器过滤经混合的纳米载体溶液并将其储存在-20℃下。
通过动态光散射确定纳米载体的尺寸。通过HPLC分析确定纳米载体中雷帕霉素的量。通过重量法确定总干纳米载体质量/mL混悬液。
NP[OVA]材料和方法
材料
卵清蛋白购自Worthington Biochemical Corporation(730 Vassar Avenue，Lakewood，NJ 08701)，产品代码LS003054)。具有54％丙交酯和46％乙交酯含量并且特性黏度为0.24dL/g的PLGA购自Lakcshorc Biomaterials(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211)，产品代码5050 DLG 2.5A)。甲基醚封端的PEG嵌段为约5,000Da并且Mw为28,000Da，特性黏度为0.38dL/g的PLA-PEG嵌段共聚物购自Lakeshore Biomaterials(756 TomMartin Drive，Birmingham，AL 35211)，产品代码100DL mPEG 5000 4CE。聚乙烯醇4-88，USP(85％至89％水解的，黏度为3.4mPa.s至4.6mPa.s)购自EMD ChemicalsInc.(480South Democrat Road Gibbstown，NJ 08027)，产品代码1.41350.1001。Cellgro磷酸缓冲盐水1X(PBS 1X)购自Corning(9345Discovery Blvd.Manassas，VA 20109)，产品代码21-040-CV。
方法
如下制备溶液：
溶液1：在具有10重量％蔗糖的10mM磷酸盐缓冲液pH 8中制备50mg/mL卵清蛋白。溶液2：PLGA通过在化学通风橱中以100mg/mL二氯甲烷溶解PLGA制备。溶液3：PLA-PEG-OMe通过在化学通风橱中以100mg/mL二氯甲烷溶解PLA-PEG-OMe制备。溶液4：100mM磷酸盐缓冲液，pH 8中的65mg/mL聚乙烯醇。
首先，通过将溶液1至溶液3混合产生初级(W1/O)乳剂。将溶液1(0.2mL)、溶液2(0.75mL)和溶液3(0.25mL)合并在经在冰水浴中预冷却＞4分钟的小玻璃压力管中并使用Branson Digital Sonifier 250在冰浴上以50％振幅进行超声处理40秒。然后，如下形成次级(W1/O/W2)乳剂：向初级溶剂添加溶液4(3mL)，涡旋混合以产生乳状分散体并随后使用Branson Digital Sonifier 250在冰浴上以30％振幅进行超声处理60秒。将次级乳剂添加至含有PBS 1X(30mL)的敞口50mL烧杯。如上所述制备次级相同的双乳剂配制物并添加至与第一乳剂配制物相同的50mL烧杯。将两份制备物在室温下搅拌2小时以使二氯甲烷蒸发并形成纳米载体。将一部分的混悬的纳米载体经如下洗涤：将纳米载体混悬液转移至离心管并在75,600rcf下旋转50分钟，除去上清液并将沉淀物重悬于PBS 1X中。重复洗涤操作并随后将沉淀物重悬于PBS 1X中以获得基于聚合物的标称浓度为10mg/mL的纳米载体混悬液。将混悬液冷冻储存在-20℃下直至使用。
Figure BDA0002259400510000781
NP[GSK1059615]材料和方法
材料
GSK1059615购自MedChem Express(11 Deer Park Drive，Suite 102D MonmouthJunction，NJ 08852)，产品代码HY-12036。丙交酯∶乙交酯比例为1∶1并且特性黏度为0.24dL/g的PLGA购自Lakeshore Biomaterials(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL35211)，产品代码5050 DLG 2.5A。甲基醚封端的PEG嵌段为约5,000Da并且整体特性黏度为0.26DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物购自Lakeshore Biomaterials(756 Tom MartinDrive，Birmingham，AL 35211；产品代码100DL mPEG 5000 5K-E)。Cellgro磷酸缓冲盐水1XpH 7.4(PBS 1X)购自Corning(9345 Discovery Blvd.Manassas，VA 20109)，产品代码21-040-CV。
方法
如下制备溶液
溶液1：将PLGA(125mg)和PLA-PEG-OMe(125mg)溶解于10mL丙酮中。溶液2：在1mLN-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中制备10mg GSK1059615。
如下制备纳米载体：将溶液1(4mL)和溶液2(0.25mL)合并在小玻璃压力管中并在搅拌下将混合物逐滴添加至含有20mL超纯水的250mL圆底瓶。将该瓶安装在旋转式蒸发装置上，并在减压下除去丙酮。将一部分的纳米载体经如下洗涤：将纳米载体混悬液转移至离心管并在75,600rcf和4℃下离心50分钟，除去上清液并将沉淀物重悬于PBS 1X中。重复洗涤操作并将沉淀物重悬于PBS 1X中以获得基于聚合物的标称浓度为10mg/mL的纳米载体混悬液。然后，使用来自Pall，型号4656的1.2μm PES膜注射式过滤器过滤经洗涤的纳米载体溶液。如上所述制备相同的纳米载体溶液并在过滤步骤之后与第一纳米载体溶液合并。将均质混悬液冷冻储存在-20℃下。
通过动态光散射确定纳米载体的尺寸。通过351nm下的UV吸收确定纳米载体中GSK1059615的量。通过重量法确定总干纳米载体质量/mL混悬液。
Figure BDA0002259400510000791
在第-21天和第-14天，在尾静脉内对年龄匹配的(5周至6周)雌性C57BL/6小鼠静脉内注射盐水(未处理)，与1.2mg含雷帕霉素之纳米载体(NP[Rapa])或8mg装载GSK1059615之纳米载体(NP[GSK1059615])组合的1.1mg装载全卵清蛋白的纳米载体(NP[OVA])。
在第0天，在后肢内对所有动物皮下注射与2μg CpG混合的25μg颗粒OVA(pOVA)，随后在第7天和第14天仅注射25μg pOVA。在第21天，测量抗体效价。在不存在任何处理的情况下，动物发生针对OVA的稳健免疫应答，其可通过抗OVA IgG抗体效价进行测量。图18中所示之第21天的抗体效价证明：在相同溶液(NP[OVA]+NP[Rapa]或NP[GSK1059615])中与经包封OVA伴随施用的两种合成致耐受性纳米载体剂量甚至在单独注射1次OVA+CpG和注射2次OVA后有效地降低针对OVA的抗体形成。
这些结果表明：经包封的免疫抑制剂(例如，雷帕霉素和GSK1059615)当与蛋白质伴随递送时可在多次攻击和多个时间段内预防针对该蛋白质的抗体形成。这证明，两种不同种类的免疫抑制剂伴随施用降低针对蛋白质的不期望免疫应答。最后，结果支持建立了如本文中所提供的方案。
实施例19：使用降低的药效学有效剂量的本发明方法(预示性的)
招募3,200名患有类风湿性关节炎的人对象以进行一系列临床试验。在试验性剂量范围试验中，将1,200名对象分成4组(安慰剂和实施例3的合成纳米载体的3个不同剂量水平)。使全部4个组中的每个对象接受两轮的HUMIRA 40mg s.c.与伴随的安慰剂或合成纳米载体。将组中最大降低抗HUMIRA抗体平均水平的合成纳米载体剂量认定为本试验的“免疫抑制剂剂量”。
在另一试验性试验中，将招募的人对象分为4个测试组，每个组500名对象。在以免疫抑制剂剂量施用合成纳米载体的情况下，根据下表伴随施用安慰剂、HUMIRA和实施例3的合成纳米载体(除测试组1之外)。
Figure BDA0002259400510000801
Figure BDA0002259400510000811
对目标药效学作用(“PD作用”)进行评价，在此情况下，其为每个测试组中对象的ACR 20、50和70应答的平均值。观察测试组1中对象的PD作用并将测试组1中的HUMIRA剂量主观定义为HUMIRA的药效学有效剂量(“PD有效剂量”)。
然后，对测试组2至4的PD作用进行评价，并将PD作用并未与测试组1的PD作用显著不同的最低剂量认定为HUMIRA之降低的药效学有效剂量。
在应用试验性试验期间所建立的信息时，将HUMIRA之降低的药效学有效剂量与免疫抑制剂剂量(包含实施例3的合成纳米载体)伴随施用于经诊断患有类似风湿性关节炎和处于产生针对HUMIRA之抗体的风险之中的对象。在另一个实施方案中，制备使用在试验性试验期间建立的信息的方案以指导将HumiraTM和实施例3的合成纳米载体伴随给药于经诊断患有类风湿性关节炎和具有或预期具有针对HUMIRA之抗体的对象。然后，使用该方案来指导将HUMIRA之降低的药效学有效剂量和实施例3的合成纳米载体伴随施用于人对象。
实施例20：证明增强的药效学作用的本发明方法(预示性的)
招募3,700名患有类风湿性关节炎的人对象以进行一系列临床试验。在试验性剂量范围试验中，将1,200名对象分成4组(安慰剂和实施例3的合成纳米载体的3个不同剂量水平)。使全部4个组中的每个对象接受两轮的HUMIRA 40mg s.c.与伴随的安慰剂或合成纳米载体。将组中最大降低抗HUMIRA抗体的平均水平的合成纳米载体剂量认定为本试验的“免疫抑制剂剂量”。
在另一试验性试验中，将招募的人对象分为3个测试组，其中两个活性物测试组各自具有1000名对象，一个安慰剂组具有500名对象。在以免疫抑制剂剂量施用合成纳米载体的情况下，根据下表伴随施用安慰剂、HUMIRA和实施例3的合成纳米载体(除测试组1之外)。
测试组号 mmRNA剂量 NC施用(sc)
1 40mg sc -
2 40mg sc +
3 安慰剂 安慰剂
对目标药效学作用(“PD作用”)进行评价，在此情况下，其为每个测试组中对象的ACR 20、50和70应答的平均值。观察测试组1中对象的PD作用并将其与测试组2中的PD作用进行比较。当与在测试组1中观察到的PD作用进行比较时，观察测试组2中在伴随施用免疫抑制剂剂量后HUMIRA之药效学作用的任何增强。
在应用试验性试验期间所建立的信息时，将HUMIRA的标准40mg剂量与免疫抑制剂剂量(包含实施例3的合成纳米载体)伴随施用于经诊断患有类似风湿性关节炎和处于产生针对HUMIRA之抗体的风险之中的对象。在另一个实施方案中，制备使用在试验性试验期间建立的信息的方案以指导将HUMIRA和实施例3的合成纳米载体伴随给药于经诊断患有类风湿性关节炎和已知或认为具有针对HUMIRA之抗体的对象。然后，使用该方案来指导将HUMIRA与实施例3的合成纳米载体伴随施用于人对象。使用本文中公开的方法记录在伴随施用之后任何增强的药效学作用。
实施例21：证明增强的药效学作用的本发明方法(预示性的)
招募3,200名患有化疗相关性贫血的人对象以进行一系列临床试验。在试验性剂量范围试验中，根据de Fougerolles等的美国专利申请2013/0115272制备编码红细胞生成素的经修饰mRNA(“mmRNA”)。将1,200名对象分成4组(安慰剂和实施例3的合成纳米载体的3个不同剂量水平)。使全部4个组中的每个对象伴随接受治疗剂量的mmRNA与安慰剂或合成纳米载体。将组中最大降低抗mmRNA抗体的平均水平的合成纳米载体剂量认定为本试验的“免疫抑制剂剂量”。
在另一试验性试验中，将招募的人对象分为4个测试组，每个测试组各自具有500名对象。在以免疫抑制剂剂量施用合成纳米载体的情况下，根据下表伴随施用安慰剂、mmRNA和实施例3的合成纳米载体(除测试组1之外)。
测试组号 HUMIRA剂量 NC施用(sc)
1 治疗剂量sc -
2 治疗剂量sc +
3 1/2治疗剂量sc +
4 1/4治疗剂量sc +
5 安慰剂 安慰剂
对目标药效学作用(“PD作用”)进行评价，在此情况下，其为每个测试组中对象的化疗诱导的贫血反应的平均值。观察测试组1中对象的PD作用并将测试组1中的mmRNA剂量主观定义为mmRNA的药效学有效剂量(“PD有效剂量”)。
然后，对测试组2至4的PD作用进行评价，并将PD作用并未与测试组1的PD作用显著不同的最低剂量认定为mmRNA之降低的药效学有效剂量。在应用试验性试验期间所建立的信息时，将mmRNA之降低的药效学有效剂量与免疫抑制剂剂量(包含实施例3的合成纳米载体)伴随施用于经诊断患有化疗相关性贫血和处于产生针对mmRNA之抗体的风险之中的对象。
在另一个实施方案中，制备使用在试验性试验期间建立的信息的方案以指导将mmRNA和实施例3的合成纳米载体伴随给药于经诊断患有化疗相关性贫血和已知或认为具有针对mmRNA之抗体的对象。然后，使用该方案来指导将mmRNA之降低的药效学有效剂量和实施例3的合成纳米载体伴随施用于人对象。
实施例22：在多次给药期间维持生物药物的效力的方法
生物药物通常在多次给药之后逐渐丧失活性。效力丧失的一个常见原因是ADA的形成。ADA可例如如下导致药物效力丧失：1)增强对药物的清除，使得多剂量之后药物的PK显著低于单剂量之后药物的PK；或者2)中和药物的活性，使得多剂量之后药物的生物学活性显著低于单剂量之后药物的生物学活性。期望在多次给药期间维持生物药物的活性。
表达人TNF-α的转基因小鼠在5周至20周龄内自发地发生关节炎。在第5周至第11周，每周在有或无来自实施例16的合成纳米载体的情况下用HUMIRA(60μg/注射)处理小鼠。图B(图19)示出了在第一剂量之后HUMIRA的血清水平(第1天)。在6个HUMIRA剂量之后，HUMIRA的血液水平接近经单独HUMIRA处理的小鼠的基线，并且在整个第20周内保持较低(图C，图19，黑色正方形)。相比之下，经HUMIRA和合成纳米载体处理的小鼠表现出与第一剂量之后类似的HUMIRA血清水平(图C，图19，蓝色三角形)，表明合成纳米载体处理能够在多次给药之后使HUMIRA维持有效的血液水平。
在经单独HUMIRA处理的小鼠中，血清HUMIRA血液水平的降低可归因于ADA的发生。截止第11周，经单独HUMIRA处理的小鼠产生高效价抗药物抗体(图A，图19，黑色正方形符号)。相比之下，经合成纳米载体处理的小鼠表现出很低或未表现出抗HUMIRA抗体应答(图A，图19，蓝色三角形)。在实施例16中上述的关节炎疾病评分中明显的是，多次给药影响HUMIRA血清水平的降低(图D，图19)。经单独HUMIRA处理的小鼠在第10周至第20周表现出关节炎评分的次最佳降低(图D，图19，将黑色正方形与黑色圆形进行比较)。相比之下，经合成纳米载体处理的小鼠表现出对关节炎的强抑制(图C，图19，蓝色三角形)。
这些结果表明，在多次给药下维持药物水平对药物效力是重要的，并表明与合成纳米载体连接的免疫抑制剂通过抑制ADA应答来在多次给药下维持药物水平。因此，这些结果证明了如本文中所提供的将治疗性大分子与免疫抑制剂重复施用的益处。结果还证明了能够确定可在对象中实现期望的治疗效果和/或降低的ADA应答的方案。
实施例23：证明增强的药效学作用的本发明方法(预示性的)
招募3,700名患有类风湿性关节炎的人对象以进行一系列临床试验。在试验性剂量范围试验中，将1,200名对象分成4组(安慰剂和纳米结晶雷帕霉素的3个不同剂量水平)。使全部4个组中的每个对象接受两轮的HUMIRA 40mg s.c.与伴随的安慰剂或纳米结晶雷帕霉素。将组中最大降低抗HUMIRA抗体的平均水平的纳米结晶雷帕霉素剂量认定为本试验的“免疫抑制剂剂量”。
在另一试验性试验中，将招募的人对象分为3个测试组，其中两个活性物测试组各自具有1000名对象，一个安慰剂组具有500名对象。在以免疫抑制剂剂量施用合成纳米载体的情况下，根据下表伴随施用安慰剂、HUMIRA和纳米结晶雷帕霉素(除测试组1之外)。
测试组号 HUMIRA剂量 免疫抑制剂剂量(sc)
1 40mg sc -
2 40mg sc +
3 安慰剂 安慰剂
对目标药效学作用(“PD作用”)进行评价，在此情况下，其为每个测试组中对象的ACR 20、50和70应答的平均值。观察测试组1中对象的PD作用并将其与测试组2中的PD作用进行比较。当与在测试组1中观察到的PD作用进行比较时，观察测试组2中在伴随施用免疫抑制剂剂量后HUMIRA之药效学作用的任何增强。
在应用试验性试验期间所建立的信息时，将HUMIRA的标准40mg剂量与免疫抑制剂剂量(包含纳米结晶雷帕霉素)伴随施用于经诊断患有类似风湿性关节炎和处于产生针对HUMIRA之抗体的风险之中的对象。在另一个实施方案中，制备使用在试验性试验期间建立的信息的方案以指导将HUMIRA和纳米结晶雷帕霉素伴随给药于经诊断患有类风湿性关节炎和已知或认为具有针对HUMIRA之抗体的对象。然后，使用该方案来指导将HUMIRA和纳米结晶雷帕霉素伴随施用于人对象。使用本文中公开的方法记录在伴随施用之后任何增强的药效学作用。
实施例24：证明增强的药效学作用的本发明方法(预示性的)
招募3,200名患有化疗相关性贫血的人对象以进行一系列临床试验。在试验性剂量范围试验中，根据de Fougerolles等的美国专利申请2013/0115272制备编码红细胞生成素的经修饰mRNA(“mmRNA”)。将1,200名对象分成4组(安慰剂和纳米结晶雷帕霉素的3个不同剂量水平)。使全部4个组中的每个对象伴随接受治疗剂量的mmRNA与安慰剂或纳米结晶雷帕霉素。将组中最大降低抗mmRNA抗体的平均水平的纳米结晶雷帕霉素剂量认定为本试验的“免疫抑制剂剂量”。
在另一试验性试验中，将招募的人对象分为4个测试组，每个测试组各自具有500名对象。在以免疫抑制剂剂量施用纳米结晶雷帕霉素的情况下，根据下表伴随施用安慰剂、mmRNA和实施例3的合成纳米载体(除测试组1之外)。
Figure BDA0002259400510000861
对目标药效学作用(“PD作用”)进行评价，在此情况下，其为每个测试组中对象的化疗诱导的贫血反应的平均值。观察测试组1中对象的PD作用并将测试组1中的mmRNA剂量主观定义为mmRNA的药效学有效剂量(“PD有效剂量”)。
然后，对测试组2至4的PD作用进行评价，并将PD作用并未与测试组1的PD作用显著不同的最低剂量认定为mmRNA的降低的药效学有效剂量。在应用试验性试验期间所建立的信息时，将mmRNA之降低的药效学有效剂量与免疫抑制剂剂量(包含纳米结晶雷帕霉素)伴随施用于经诊断患有化疗相关性贫血和处于产生针对mmRNA之抗体的风险之中的对象。
在另一个实施方案中，制备使用在试验性试验期间建立的信息的方案以指导将mmRNA和纳米结晶雷帕霉素伴随给药于经诊断患有化疗相关性贫血和已知或认为具有针对mmRNA之抗体的对象。然后，使用该方案来指导将mmRNA之降低的药效学有效剂量和纳米结晶雷帕霉素伴随施用于人对象。
本发明还涉及以下实施方案：
1.一种方法，其包括：
提供免疫抑制剂剂量，其中所述免疫抑制剂剂量与合成纳米载体连接；以及
将治疗性大分子的降低的药效学有效剂量与所述免疫抑制剂剂量伴随施用于其中预期发生抗治疗性大分子抗体应答的对象；
其中所述伴随施用根据方案进行，所述方案已被证明，与当不与所述免疫抑制剂剂量伴随施用并且存在抗治疗性大分子抗体应答时施用所述治疗性大分子相比，在与所述免疫抑制剂剂量伴随施用后以所述治疗性大分子的所述降低的药效学有效剂量产生药效学作用。
2.实施方案1所述的方法，其中所述方法还包括确定所述方案。
3.实施方案1或2所述的方法，其中所述方法还包括确定所述降低的药效学有效剂量。
4.实施方案1至3中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述施用之前和/或之后在所述对象中评估所述药效学作用。
5.实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述施用通过静脉内、腹膜内或皮下施用进行。
6.一种方法，其包括：
提供免疫抑制剂剂量，其中所述免疫抑制剂剂量与合成纳米载体连接；以及
将治疗性大分子的降低的药效学有效剂量与所述免疫抑制剂剂量伴随施用；
其中所述治疗性大分子的所述降低的药效学有效剂量低于治疗性大分子的以下药效学有效剂量：(A)在抗治疗性大分子抗体应答存在下施用所述治疗性大分子，和(B)不与所述免疫抑制剂剂量伴随施用所述治疗性大分子。
7.实施方案6所述的方法，其中所述方法还包括确定所述降低的药效学有效剂量。
8.实施方案6或7所述的方法，其中所述方法还包括在所述施用之前和/或之后在对象中评估药效学作用。
9.实施方案6至8中任一项所述的方法，其中所述施用通过静脉内、腹膜内或皮下施用进行。
10.一种方法，其包括：
提供免疫抑制剂剂量，其中所述免疫抑制剂剂量与合成纳米载体连接；以及
将治疗性大分子的药效学有效剂量与免疫抑制剂剂量伴随施用于其中预期发生抗治疗性大分子抗体应答的对象；
其中所述伴随施用根据方案进行，所述方案已被证明，与当不与所述免疫抑制剂剂量伴随施用且各自存在抗治疗性大分子抗体应答时施用所述治疗性大分子相比，在与所述免疫抑制剂剂量伴随施用后增强所述治疗性大分子的药效学作用。
11.实施方案10所述的方法，其中所述方法还包括确定所述方案。
12.实施方案10或11所述的方法，其中所述方法还包括确定所述药效学有效剂量。
13.实施方案10至12中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述施用之前和/或之后在所述对象中评估所述药效学作用。
14.实施方案10至13中任一项所述的方法，其中所述施用通过静脉内、腹膜内或皮下施用进行。
15.一种方法，其包括：
提供免疫抑制剂剂量，其中所述免疫抑制剂剂量与合成纳米载体连接；
将治疗性大分子的药效学有效剂量与所述免疫抑制剂剂量伴随施用于其中预期发生抗治疗性大分子抗体应答的对象；以及
在所述伴随施用之后记录增强的药效学作用。
16.实施方案15所述的方法，其中所述方法还包括确定所述药效学有效剂量。
17.实施方案15或16所述的方法，其中所述方法还包括在所述施用之前和/或之后在所述对象中评估所述药效学作用。
18.实施方案15至17中任一项所述的方法，其中所述施用通过静脉内、腹膜内或皮下施用进行。
19.一种方法，其包括：
提供在一个或更多个对象中重复给药后导致或预期导致抗治疗性大分子抗体的治疗性大分子；
提供免疫抑制剂剂量，其中所述免疫抑制剂剂量与合成纳米载体连接；以及
以相同或较低的剂量将所述治疗性大分子与所述免疫抑制剂剂量向对象伴随地重复给药。
20.实施方案19所述的方法，其中伴随施用根据方案进行，所述方案已被证明，使得在将两个或更多个治疗性大分子剂量给予对象期间维持所述治疗性大分子的药效学作用。
21.实施方案20所述的方法，其中所述方法还包括确定所述方案。
22.实施方案19至21中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在施用所述两个或更多个剂量之前和/或之后在所述对象中评估药效学作用。
23.实施方案19至22中任一项所述的方法，其中所述施用通过静脉内、腹膜内或皮下施用进行。
24.一种组合物或药盒，其包含：
免疫抑制剂剂量，其中所述免疫抑制剂与合成纳米载体连接；和
治疗性大分子的降低的药效学有效剂量。
25.实施方案24所述的组合物或药盒，其中所述组合物或药盒用于本文中提供的任一种方法。
26.实施方案24或25所述的组合物或药盒，其中所述组合物或药盒还包含可药用载体。
27.一种组合物或药盒，其包含：
治疗性大分子的降低的药效学有效剂量，其用于与免疫抑制剂剂量相组合的本文中提供之任一种方法，其中免疫抑制剂与合成纳米载体连接。
28.实施方案27所述的组合物或药盒，其还包含可药用载体。
29.前述实施方案中任一项所述的方法或组合物或药盒，其中所述治疗性大分子未与所述合成纳米载体连接。
30.前述实施方案中任一项所述的方法或组合物或药盒，其中所述治疗性大分子与所述合成纳米载体连接。
31.前述实施方案中任一项所述的方法或组合物或药盒，其中所述合成纳米载体不包含治疗性大分子APC可呈递抗原。
32.实施方案24至31中任一项所述的组合物或药盒，其中所述免疫抑制剂剂量和所述治疗性大分子包含在分离的容器中。
33.实施方案24至31中任一项所述的组合物或药盒，其中所述免疫抑制剂剂量和所述治疗性大分子包含在同一容器中。
34.实施方案1至9中任一项所述的方法或者前述实施方案中任一项所述的组合物或药盒，其中所述治疗性大分子的所述降低的药效学有效剂量比治疗性大分子的以下药效学有效剂量低至少30％：(A)在抗治疗性大分子抗体应答存在下施用所述治疗性大分子，和(B)不与所述免疫抑制剂剂量伴随施用所述治疗性大分子。
35.实施方案34所述的方法或组合物或药盒，其中所述降低的药效学有效剂量降低至少40％。
36.实施方案35所述的方法或组合物或药盒，其中所述降低的药效学有效剂量降低至少50％。
37.前述实施方案中任一项所述的方法或组合物或药盒，其中所述免疫抑制剂剂量包含：他汀类、mTOR抑制剂、TGF-β信号传导剂、皮质类固醇、线粒体功能的抑制剂、P38抑制剂、NF-κβ抑制剂、腺苷受体激动剂、前列腺素E2激动剂、磷酸二酯酶4抑制剂、HDAC抑制剂或蛋白酶体抑制剂。
38.实施方案37所述的方法或组合物或药盒，其中所述mTOR抑制剂是雷帕霉素。
39.前述实施方案中任一项所述的方法或组合物或药盒，其中所述治疗性大分子包含治疗性蛋白质。
40.实施方案39所述的方法或组合物或药盒，其中所述治疗性蛋白质用于蛋白质替代或蛋白质补充治疗。
41.前述实施方案中任一项所述的方法或组合物或药盒，其中所述治疗性大分子包含：可输注或可注射的治疗性蛋白质、酶、酶辅因子、激素、血液因子或凝血因子、细胞因子、干扰素、生长因子、单克隆抗体、多克隆抗体或与庞皮病相关的蛋白质。
42.实施方案41所述的方法或组合物或药盒，其中所述可输注或可注射的治疗性蛋白质包含：托珠单抗、α-1抗胰蛋白酶、Hematide、白蛋白干扰素α-2b、Rhucin、替莫瑞林、奥瑞珠单抗、贝利木单抗、聚乙二醇化重组尿酸酶、他利苷酶α、阿加糖酶α或葡糖脑苷脂酶α。
43.实施方案41所述的方法或组合物或药盒，其中所述酶包含：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。
44.实施方案41所述的方法或组合物或药盒，其中所述酶包含用于溶酶体贮积症的酶替代治疗的酶。
45.实施方案44所述的方法或组合物或药盒，其中所述用于溶酶体贮积症的酶替代治疗的酶包含：伊米苷酶、a-半乳糖苷酶A(a-gal A)、阿加糖酶β、酸性α-葡糖苷酶(GAA)、阿葡糖苷酶α、LUMIZYME、MYOZYME、芳基硫酸酯酶B、拉罗尼酶、ALDURAZYME、艾杜硫酶、ELAPRASE、芳基硫酸酯酶B或NAGLAZYME。
46.实施方案41所述的方法或组合物或药盒，其中所述酶包含KRYSTEXXA(聚乙二醇化重组尿酸酶)。
47.实施方案41所述的方法或组合物或药盒，其中所述单克隆抗体包含HUMIRA(阿达木单抗)。
48.实施方案41所述的方法或组合物或药盒，其中所述细胞因子包含：淋巴因子、白介素、趋化因子、1型细胞因子或2型细胞因子。
49.实施方案41所述的方法或组合物或药盒，其中所述血液因子或凝血因子包含：因子I、因子II、组织因子、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XII、因子XIII、冯·维勒布兰德因子、前激肽释放酶、高分子量激肽原、纤连蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂(ZPI)、纤溶酶原、α2-抗纤溶酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI1)、纤溶酶原激活物抑制剂-2(PAI2)、癌促凝物质或阿法依伯汀。
50.实施方案49所述的方法或组合物或药盒，其中所述血液因子或凝血因子是因子VIII。
51.前述实施方案中任一项所述的方法或组合物或药盒，其中基于所述合成纳米载体的平均值，与所述合成纳米载体连接的免疫抑制剂的载量为0.1％至50％。
52.实施方案51所述的方法或组合物或药盒，其中所述载量为0.1％至20％。
53.前述实施方案中任一项所述的方法或组合物或药盒，其中所述合成纳米载体包含：脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、金属纳米颗粒、基于表面活性剂的乳剂、树状聚体、巴基球、纳米线、病毒样颗粒或者肽或蛋白质颗粒。
54.实施方案53所述的方法或组合物或药盒，其中所述合成纳米载体包含脂质纳米颗粒。
55.实施方案53所述的方法或组合物或药盒，其中所述合成纳米载体包含脂质体。
56.实施方案53所述的方法或组合物或药盒，其中所述合成纳米载体包含金属纳米颗粒。
57.实施方案56所述的方法或组合物或药盒，其中所述金属纳米颗粒包含金纳米颗粒。
58.实施方案53所述的方法或组合物或药盒，其中所述合成纳米载体包含聚合物纳米颗粒。
59.实施方案58所述的方法或组合物或药盒，其中所述聚合物纳米颗粒包含聚合物，所述聚合物为非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。
60.实施方案58或59所述的方法或组合物或药盒，其中所述聚合物纳米颗粒包含：聚酯、与聚醚连接的聚酯、聚氨基酸、聚碳酸酯、聚缩醛、聚缩酮、多糖、聚乙基
Figure BDA0002259400510000921
唑啉或聚乙烯亚胺。
61.实施方案60所述的方法或组合物或药盒，其中所述聚酯包含：聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物或聚己内酯。
62.实施方案60或61所述的方法或组合物或药盒，其中所述聚合物纳米颗粒包含聚酯和与聚醚连接的聚酯。
63.实施方案60至62中任一项所述的方法或组合物或药盒，其中所述聚醚包含聚乙二醇或聚丙二醇。
64.前述实施方案中任一项所述的方法或组合物或药盒，其中使用所述合成纳米载体的动态光散射获得的颗粒大小分布的平均值为大于100nm的直径。
65.实施方案64所述的方法或组合物或药盒，其中所述直径大于150nm。
66.实施方案65所述的方法或组合物或药盒，其中所述直径大于200nm。
67.实施方案66所述的方法或组合物或药盒，其中所述直径大于250nm。
68.实施方案67所述的方法或组合物或药盒，其中所述直径大于300nm。
69.前述实施方案中任一项所述的方法或组合物或药盒，其中所述合成纳米载体的纵横比大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10。

Claims (10)

1.一种方法，其包括：
提供免疫抑制剂剂量，其中所述免疫抑制剂剂量与合成纳米载体连接；以及
将治疗性大分子的降低的药效学有效剂量与所述免疫抑制剂剂量伴随施用于其中预期发生抗治疗性大分子抗体应答的对象；
其中所述伴随施用根据方案进行，所述方案已被证明，与当不与所述免疫抑制剂剂量伴随施用并且存在抗治疗性大分子抗体应答时施用所述治疗性大分子相比，在与所述免疫抑制剂剂量伴随施用后以所述治疗性大分子的所述降低的药效学有效剂量产生药效学作用。
2.权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括确定所述方案。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述方法还包括确定所述降低的药效学有效剂量。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述施用之前和/或之后在所述对象中评估所述药效学作用。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述施用通过静脉内、腹膜内或皮下施用进行。
6.一种方法，其包括：
提供免疫抑制剂剂量，其中所述免疫抑制剂剂量与合成纳米载体连接；以及
将治疗性大分子的降低的药效学有效剂量与所述免疫抑制剂剂量伴随施用；
其中所述治疗性大分子的所述降低的药效学有效剂量低于治疗性大分子的以下药效学有效剂量：(A)在抗治疗性大分子抗体应答存在下施用所述治疗性大分子，和(B)不与所述免疫抑制剂剂量伴随施用所述治疗性大分子。
7.权利要求6所述的方法，其中所述方法还包括确定所述降低的药效学有效剂量。
8.权利要求6或7所述的方法，其中所述方法还包括在所述施用之前和/或之后在对象中评估药效学作用。
9.权利要求6至8中任一项所述的方法，其中所述施用通过静脉内、腹膜内或皮下施用进行。
10.一种方法，其包括：
提供免疫抑制剂剂量，其中所述免疫抑制剂剂量与合成纳米载体连接；以及
将治疗性大分子的药效学有效剂量与免疫抑制剂剂量伴随施用于其中预期发生抗治疗性大分子抗体应答的对象；
其中所述伴随施用根据方案进行，所述方案已被证明，与当不与所述免疫抑制剂剂量伴随施用且各自存在抗治疗性大分子抗体应答时施用所述治疗性大分子相比，在与所述免疫抑制剂剂量伴随施用后增强所述治疗性大分子的药效学作用。
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