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KR101521197B1 - 병용 요법에 있어서 ｃｄ83의 용도 - Google Patents

병용 요법에 있어서 ｃｄ83의 용도 Download PDF

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KR101521197B1
KR101521197B1 KR1020087032243A KR20087032243A KR101521197B1 KR 101521197 B1 KR101521197 B1 KR 101521197B1 KR 1020087032243 A KR1020087032243 A KR 1020087032243A KR 20087032243 A KR20087032243 A KR 20087032243A KR 101521197 B1 KR101521197 B1 KR 101521197B1
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찰스 니콜레트
스티븐 브랜드
젠 종
하오 왕
재클린 에이알피
시오반 람차란
미린 로리아 바로자
Original Assignee
아르고스 쎄라퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 CD83의 사용을 포함함을 특징으로 하여 원치 않는 면역 반응을 억제 및/또는 예방하는 개선된 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, CD83은 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물과 함께 대상에 병용투여된다. 관용 수지상 세포 및 조절 T 세포를 발생시키기 위한 방법이 또한 제공된다. 이들 세포는 시험관 내에서 치료 목적의 추가 세포를 생산하는데 사용하거나, 생체 내에서 원치 않는 면역 반응을 억제하고/하거나 예방하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 방법은 자가면역 질환의 중증도를 예방하거나 감소시키기 위해 사용할 수 있으며, 또한 적어도 하나의 치료 조성물, 예를 들어, 치료 단백질 또는 이식 조직에 대한 내성을 유도하기 위해 사용할 수 있다.

Description

병용 요법에 있어서 ＣＤ83의 용도{USE OF CD83 IN COMBINATION THERAPIES}
본 출원은 2007년 5월 3일에 출원된 미국 가출원 제60/927,377호 및 2006년 8월 18일에 출원된 미국 가출원 제60/838,812호에 대한 우선권을 주장하며, 이들의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함되어 있다.
본 발명은 원치 않는 면역 반응을 억제 또는 예방하기 위하여 대상을 치료하는 개선된 방법에 관한 것이다. 본 방법은 CD83의 사용 및 치료 조성물에 대한 대상의 내성화를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 이식 조직의 거부를 예방하는데 사용될 수 있다.
포유동물의 면역 시스템은 많은 수의 외래 항원에 대한 보호 반응을 제공할 수 있다. 불행하게도, 바로 이 반응성이 치료 용도로 사용하고자 하는 화합물, 예를 들어, 이식 조직, 유전자 요법 벡터, 및 특정 장애 및 질환의 요법에 사용되는 화합물(특히 단백질)에 대해서도 나타날 때 문제가 야기될 수 있다. 예를 들어, B형 혈우병으로 고통받는 환자는 치료 인자 IX 뿐아니라 이들 환자에서 인자 IX를 발현하기 위해 사용되는 유전자 도입 벡터에 대해서도 면역 반응을 나타낼 수 있 다(참조: Dobryzynski et al. (2006) Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA 103: 4592-4597). 유사하게, 치료용 항체(예를 들어, Rituxan? and Bexxar?)에 의해 치료받은 환자들은 치료용 항체에 대한 면역 반응을 나타낼 수 있으며, 이로 인해 항체는 치료 효과가 없어지고 환자에게 추가의 위험이 뒤따르게 된다.
불행하게도, 원치 않는 면역 반응을 예방하거나 제거하기 위한 현재의 치료법은 통상 면역 반응의 포괄적 억제를 유발하는 화합물의 사용을 포함한다(참조: Chapter 14 of Janeway et al., eds. (2001) Immunobiology (5th ed., Garland Publishing, New York, NY)). 이러한 치료는 미래의 감염에 대하여 환자를 위험에 빠뜨리며(참조: Gottschalk et al . (2005) Annu . Rev . Med. 56: 29-44), 일반적으로 바람직하지 않으며 심각한 부작용을 일으킨다. 상이한 치료법을 조합한 몇가지 연구는 일부 조합이 실제로 독성을 악화시킴을 보여주었다(참조: Andoh et al . (1996) Transplantation 62: 311-316). 현재 이용가능한 치료법은 또한 일부 경우(예를 들어, 조직 이식)에, 장기간에 걸친, 환자의 생애 남은 기간 동안의 치료를 요구할 수 있다.
또한, 예를 들어, 접촉성 피부염, 만성 천식, 약물 알러지 및 전신적 과민반응과 같은 알러지 반응 및 과민성 반응(참조: Chapter 12 of Janeway et al., eds. (2001) Immunobiology (5th ed., Garland Publishing, New York, NY))을 치료함에 있어서 집중적이고 시간-제한적인 면역 시스템의 억제가 필요한 경우가 많이 있다. 일반적으로, 이러한 반응을 억제하기 위한 임상적 치료는 광범위한 효과를 나타낸 다(참조: Janeway et al ., id.). 또 다른 예는 B-세포-매개성 반응에서 나타난다. B 세포는 항체-매개성 이식 거부의 일차적인 매개자이며, 항원 제시 세포로서도 작용한다. 그러나, 원치 않는 B-세포-매개성 반응의 역효과를 예방하기 위한 현재 요법은 CD20에 대한 단클론항체(mAb)를 사용하는 고갈(depletion)에 제한되어 있으며, B 세포 활성화 및/또는 분화를 예방하기 위한 효과적인 요법은 존재하지 않는다. 원치 않는 면역 반응에 대해 현재 사용되는 다른 치료법은 비만 세포에 의해 생산된 염증성 매개자의 합성 또는 효과를 차단하기 위한 특정 저해제를 사용하는 것이다. 탈감작(desensitization)을 유도하기 위해 고안된 일부 치료법은 특정 항원(들)을 주사하는 것이며; 이러한 치료법은 알러지항원(allergen)에 대한 면역 반응을 TH2에서 TH1 타입 반응으로 전환시켜 IgE 대신에 IgG가 생산되도록 하는 것으로 생각된다. 이러한 치료법은 많은 경우에 성공적이지만, 항상 그러하지는 않다.
세포 림프구용해, 지연형 과민반응(DTH), 이식 거부 및 동종 이식 거부를 포함한 많은 형태의 면역이 T 세포에 의해 매개된다(참조: Paul (1993) Fundamental Immunology (Raven Press, New York, New York) (3d ed.)). T 세포의 거동은 수지상 세포(dendritic cells; "DCs")에 의해 영향받으며, 이들은 면역 시스템의 전문적인 항원-제시 세포로서 T 세포 반응을 급격히 자극할 수 있다(때로는 "면역촉진성 수지상세포"로 지칭되기도 한다; 참조: Banchereau and Schmitt, eds. (1995) Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology, Vol. 2 (Plenum Press, New York); Schuler et al . (2003) Curr . Opin . Immunol. 15: 138-147; U.S. Pat. App. No. 10/287,813).
어떤 경우에, 수지상 세포는 면역 내성에 있어서 중요한 역할을 하기도 한다. 본 명세서에서 이들은 때때로 "관용 수지상 세포"로 지칭된다(참조: Steinman et al . (2003) Ann . Rev . Immunol . 21: 685-711; Kubach et al . (2005) Int . J. Hematol. 81: 197-203). 불행히도, 수지상 세포는 말초 혈액에서 드물게 나타나므로, 어떤 적용을 위해서는 관용 수지상 세포의 치료량을 생산하기 위한 생체외 방법이 필요할 수 있다. 면역촉진성 DC를 제조하기 위한 방법이 기재되어 있으나(참조: U.S. Pat. No. 6,274,378), 이들 DC는 관용적이지 않다. "조절 T 세포"를 포함한 다른 타입의 세포들도 관용성에 있어서 역할을 수행하는 것으로 나타났다(참조: Boehmer (2005) Nat . Immunol. 6: 338-344). 설치류에 대한 연구 결과, 자가 반응성 T 세포의 활성화 및 효과자(effector) 기능을 둘다 활성적 및 압도적으로 예방하는 전문적 조절 (또는 "억제") T 세포에서의 특이한 CD4+ CD25+ 개체수가 확인되었다(Sakaguchi et al . (1995) J. Immunol. 155: 1151-1164; Takahashi et al . (1998) Int . Immunol . 10: 1969-1980; Itoh et al . (1999) J. Immunol. 162: 5317-5326). 이러한 조절 T 세포의 제거 또는 불활성화의 결과 심각한 자가면역 질환이 나타났으며 동종항원 및 종양에 대한 면역반응이 증가하였다(참조: Shimizu et al . (1999) J. Immunol. 163: 5211-5218). 최근의 연구결과 인간에서의 조절 T 세포가 동정되었다(U.S. Pat. App. No. 10/661,804). 조절성을 가지지만 CD4+ CD25+ T 세포는 아닌 인간 T 세포의 제조가 또한 보고되었다(참조: U.S. Pat. App. No. 10/618,134).
CD83은 면역글로불린("Ig") 수퍼패밀리 단백질에 속하는 분자이다(참조: Zhou et al. (1999) J. Immunol. 149: 735-742; U.S. Pat. No. 7,169,898; 리뷰 논문 Fujimoto and Tedder (2006) J. Med . Dent . Sci . 53: 86-91). CD83의 정확한 기능은 아직 밝혀지지 않았지만, CD83의 가용성 형태가 미성숙 및 성숙 수지상 세포 양쪽에 결합한다고 보고되었다(참조: Lechmann et al . (2001) J. Exp . Med. 194: 1813-1821). 상기 저자는 또한 이 단백질이 시험관내 성숙한 수지상 세포에 의한 CD80 및 CD83의 발현을 감소시키고, 시험관내에서 T 세포를 자극하는 수지상 세포의 능력을 저해한다고 보고하였다(참조: Lechmann et al. (2002) Trends in Immunology 23: 273-275). 다른 이들은 생체내 CD83의 가용성 형태의 존재를 보고하였다(참조: Hock et al. (2002) Int . Immunol. 13: 959-967). HSV-1-감염된 DC에 대한 연구 결과, 바이러스 감염이 CD83을 분해시키고 CD83 mRNA 전달을 저해함이 증명되었는데; HSV-1에 의한 상기 가능한 이탈 메카니즘은 추가로 DC 생물학에 대한 CD83의 중요성을 뒷받침한다(참조: Kruse et al. (2000) J. Virol. 74: 7127-7136). 문헌(Kruse et al . (2000) J. Exp . Med. 191: 1581-1589)에 따르면, GC7 (N(1)-구아닐-1,7-디아미노헵탄)이 CD83 mRNA의 핵세포질 전좌(nucleocytoplasmic translocation)를 방해하고, CD83의 표면 발현을 예방하며 이들 DC에 의한 T 림프구의 활성화를 유의하게 저해하는 것으로 나타났다.
CD83은 약 45 kDa의 단일-쇄 당단백질이며, CD83의 미성숙 형태는 단백질이 막에 삽입될 때 제거되는 시그널 펩티드를 포함하고 있다. 성숙 CD83은 세포외 도 메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인의 3개 구조 도메인을 포함한다(참조: WO 2004/046182, 이는 정확하게 세포외 도메인을 동정하고 있다). CD83 세포외 도메인은 적어도 2개의 엑손에 의해 암호화되는 단일 Ig-유사 (V-타입) 도메인을 포함하며(참조: Zhou et al. (1999) J. Immunol . 149: 735-742; GenBank ID #Z11697), 천연의 성숙 수지상 세포("mDCs")의 세포 표면 상에서 매우 강력하게 발현된다.
미국특허 제5,316,920호 및 상응하는 WO 93/21318호는 CD83 단백질("HB15"로 지칭됨) 및 "HB15 단백질, 또는 그의 특이적 도메인, 리간드 결합 단편 또는 면역특이적 단편을 포함한 일부를 암호화하는 cDNA 서열"을 기재하고 있다(col. 2, lines 23-25). 상기 특허는 또한 "HB15에 반응성인 항체의 사용 및 면역학적 장애, 질환 또는 증후군을 치료하기 위해 항-HB15 항체 또는 HB15 기능에 대한 기타 길항제를 사용하는 방법"에 대해 논의하고 있다(요약서 참조). 상기 특허는 또한 "HB15 단백질, 면역특이적 또는 리간드 결합 단편 또는 그의 특이적 도메인, 또는 HB15 기능을 방해하는 HB15에 대한 기타 길항제가 면역 반응 또는 세포 상호작용의 전개 또는 진행을 변형 또는 저해하거나, 약물, 독소 또는 조영제를 HB15를 발현하는 세포에 전달하기 위하여 치료적으로 사용될 수 있다"고 고찰하고 있다(col. 3, lines 6-12).
미국특허 제5,710,262호 (미국특허 제5,316,920호로 등록된 출원의 일부계속출원) 및 상응하는 WO 95/29236호는 CD83 단백질에 관한 것이며, 인간 및 마우스 단백질을 비교설명하고 있다(col. 2, lines 46-48). 이들 특허 및 출원은 추가로 "인간 HB15 또는 HB15의 포유류 동족체를 제조하는 방법(col. 3, lines 5-6), 항체 의 생산(col. 4, lines 35-37), 및 "HB15를 발현하는 세포에 약물, 독소 또는 조영제를 전달"하기 위한 HB15 항체의 용도(col. 4, lines 38-39)를 개시하고 있다.
WO 97/29781호는 "항원-특이적 항체의 생산을 자극하는 CD83 시약 및 항원을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여함을 특징으로 하여 체액 면역 반응을 자극하는 방법"에 관한 것이다(p. 1). 상기 출원은 "바람직한 구체예에서, CD83 시약은 CD83의 세포외 도메인을 암호화하는 DNA 및 상기 도메인을 포함하는 CD83 펩티드이다"라고 기술한다(p. 2). 상기 출원은 또한, 포유동물에서 바람직하지 않은 항원 특이적 반응을 저해하는 CD83 항체의 용도를 논의하고, "이러한 방법들이 ... 조직 또는 기관 이식 거부 뿐아니라 자가면역질환을 예방 또는 치료하고, 알러지 또는 천식의 치료 또는 예방에 있어서 유용하다"고 기술한다(p. 3).
WO 2004/046182호 및 상응하는 미국특허 제7,169,898호(이들은 둘 다 그 전체 내용이 본 명세서에 원용에 의해 포함되어 있다)는 CD83의 세포외 도메인을 정확하게 동정하고, "수지상 세포, T 세포 및/또는 B 세포를 포함하는 세포성 면역 반응의 기능장애 또는 원치 않는 기능에 의해 유발된 질환 또는 의학적 병태를 치료 또는 예방하기 위한 ... CD83 패밀리 멤버 단백질의 가용성 형태의 용도"를 제시한다(WO 2004/046182, p. 7). 상기 PCT 출원은 CD83의 한 형태가 미성숙 및 성숙 수지상 세포 양쪽에서 변형된 표면 마커 발현 패턴을 유도한다고 기재하고 있다(p. 12). 또한, "본 발명의 단백질의 CD83 패밀리 멤버의 가용성 형태가 T 세포 및/또는 B 세포에 대한 수지상 세포의 상호작용을 파괴할 수 있고/있거나 수지상 세포-T 세포 군집의 형성을 저해할 수 있다..."(p. 14; 참조: Senechal et al. (2004) Blood 103: 4207-4215). 상기 출원은 추가로, hCD83ext로 처리된 마우스가 실험적 자가면역 뇌척수염("EAE")과 연계된 전형적인 마비를 나타내지 않는다는 사실을 개시한다(p. 12; 참조: Zinser et al. (2004) J. Exp . Med. 200: 345-351).
상기 설명한 바에 비추어 볼 때, 본 출원인은 면역 반응의 포괄적 억제를 발생시키지 않고 환자에게 다른 해악을 초래하지 않으면서 특정 조성물에 대한 면역 반응을 억제할 수 있는 안전하고 효과적인 치료법이 필요함을 인식하였다.
발명의 요약
본 발명은 CD83을 사용함을 특징으로 하여 원치 않는 면역 반응을 억제하고/하거나 예방하는 개선된 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, CD83이 적어도 하나의 다른 면역 억제 화합물과 함께 대상에게 병용투여된다. 관용 수지상 세포 및 조절 T 세포를 발생시키기 위한 방법이 또한 제공된다. 이들 세포는 시험관 내에서 치료 목적의 추가 세포를 생산하는데 사용하거나, 생체 내에서 원치 않는 면역 반응을 억제하고/하거나 예방하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 방법은 자가면역 질환의 중증도를 예방하거나 감소시키기 위해 사용할 수 있으며, 또한 적어도 하나의 치료 조성물, 예를 들어, 치료 단백질 또는 이식 조직에 대한 내성을 유발하기 위해 사용할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 대상을 치료하는데 CD83을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 CD83을 단독으로 또는 적어도 하나의 다른 면역 억제 화합물과 배합하여 사용한다. CD83을 단독으로 또는 적어도 하나의 다른 면역 억제 화합물과 배합하여 사용하는 방법이 제공되며; CD83 및 적어도 하나의 다른 면역 억제 화합물을 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 본 발명의 방법은 적어도 하나, 두개, 세개, 네개, 또는 다섯개 이상의 면역 억제 화합물과 함께 CD83을 사용하는 방법을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 또한 다른 화합물의 사용을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 대상이 치료 조성물(들)에 대해 내성을 갖도록 적어도 하나의 치료 조성물이 CD83과 함께 대상에 병용투여된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 CD83 및 적어도 하나의 다른 면역 억제 화합물을 적어도 하나의 치료 조성물과 함께 대상에게 병용투여함으로써 대상이 내성을 갖도록 함을 특징으로 한다. 본 발명의 방법은, 예를 들어, 적어도 하나의 치료 조성물에 대한 내성을 갖도록 유도하거나 자가면역 질환의 중증도를 예방하거나 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 치료 조성물은 이식 조직일 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 이식 조직의 거부를 예방하기 위해 사용된다.
본 발명은 또한 생체내 또는 시험관내(예를 들어, 생체외)에서 CD83 및 적어도 하나의 다른 면역 억제 화합물의 존재하에 성숙시킴을 통해 관용 수지상 세포를 생산함을 특징으로 하는, 대상의 내성화 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 관용 수지상 세포는 조절 T 세포를 생산하기 위해 사용된다. 본 발명에서 관용 수지상 세포 및 조절 T 세포는 생체내 또는 생체외에서 생산될 수 있으며; 생체외 생산된 세포를 대상에게 투여할 수 있다. 본 발명에서 관용 수지상 세포 및 조절 T 세포는 자기유래이거나 줄기 세포로부터 유래된 것일 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 면역 반응의 기능장애 또는 원치 않는 기능에 의해 유발된 질환 또는 의학적 병태(예를 들어, 장애)를 치료 또는 예방할 뿐아니라 항원에 대한 내성화를 위해 사용될 수 있으며, 여기에서 CD83 및 적어도 하나의 다른 면역 억제 화합물의 유효량을 대상에게 투여한다.
본 발명의 목적은 구체예에 따라 상이할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 목적은 치료 조성물에 대한 대상의 완전한 내성화를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 목적은 면역 반응의 기능장애 또는 원치 않는 기능에 의해 유발된 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상을 예방, 치료, 감소, 및/또는 완화시킴을 포함한다. 이러한 목적의 적어도 하나가 달성되는 경우 대상이 내성화되고/되거나 면역억제되었다고 판단된다(즉, 면역관용이 유도되거나 획득되었다고 판단된다). 따라서, 본 명세서에서 대상을 "내성화"하거나 "면역억제"를 유도하였다는 것은 수지상 세포, B 세포 또는 T 세포를 포함하는 면역 반응의 기능장애 또는 원치 않는 기능에 의해 유발된 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상이 비처리 대조군 또는 다른 적합한 대조군과 비교하여(예를 들어, 치료가 면역 반응의 발생을 예방하거나 면역 반응 중증도를 감소시키기 위한 것일 경우, 치료전 증상과 비교하거나, 치료부재시 증상의 기대 중증도와 비교하여) 예방, 치료, 감소, 또는 완화되었음을 의미한다. 당업자라면 증상의 측정 및 평가 방법의 선택 및 적용 뿐아니라 적합한 대조군의 선택에 대해서도 정통하다.
따라서, 면역 반응의 기능장애 또는 원치 않는 기능에 의해 유발된 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상이 적합한 대조군과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 감소되거나 완화된 경우 대상이 내성화되었다고 판단하고/하거나 면역 억제가 발생하였다고 판단한다. 치료가 대상에서 자가면역 장애가 발생할 위험을 감소시키기 위한 구체예에 있어서, 적합한 대조군과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 만큼 위험이 감소하거나 완화되며, 이러한 산정은 대상의 개체군에 대해 통계적으로 수행될 수 있다. 치료가 치료 조성물에 대해 대상을 내성화하기 위한 구체예에 있어서, 적합한 대조군과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 만큼 면역 반응의 원치 않는 기능이 감소한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 목적은 관용 수지상 세포의 생산을 포함하며; 이러한 구체예에서 "증상"은 생체내 또는 시험관내 세포 거동의 변수를 지칭한다.
본 발명의 방법은 치료 목적으로 유용하며, 따라서 면역 반응의 기능장애 또는 원치 않는 기능에 의해 유발된 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상을 예방하거나, 치료하거나, 완화시키기 위한 것이다. 적합한 대조군, 예를 들어, 치료전 증상과 비교하거나, 치료가 예방을 목적으로 하는 경우 증상의 기대 중증도와 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 70%, 90% 또는 그 이상만큼 증상이 감소하거나, 증가하거나, 개선된다면 질환 또는 장애의 증상이 감소되거나 완화된 것으로 판단한다. 당업자는 증상에 있어서의 변화를 평가하기 위한 기술 및 기준에 대해 정통하다. 면역 반응의 기능장애 또는 원치 않는 기능에 의해 유발된 질환 또는 장애의 증상은 당업자에게 공지되어 있으며 하기를 포함한다: 이식 조직의 비정상적인 조직구조; 이식 조직의 비정상적 기능; 진단 또는 이식과 같은 사건 후의 단기 생존기간; 원치 않는 항체 또는 원치 않는 세포(예를 들어, 항원-특이적 수지상 세포 또는 T 세포)와 같이, 혈액 내의 지표 단백질(들) 또는 다른 화합물(들)의 비정상적으로 또는 바람직하지 않게 높거나 낮은 수준 또는 개수; 혈액 또는 그 밖의 체내에서 지표 세포의 비정상적으로 또는 바람직하지 않게 높거나 낮은 수준 또는 개수, 예를 들어, 원치 않는 면역 반응이 개시되거나 유지되도록 하는 조절 T 세포의 바람직하지 않게 낮은 수준 또는 개수.
경우에 따라, 대상으로부터 분리된 세포를 사용한 혼합 림프구 반응과 같은 시험관내 에세이를 사용하여 생체내 내성화 또는 내성 및/또는 면역억제를 측정할 수 있다. 유사하게, 수지상 세포, T 세포 또는 B 세포와 같은 다양한 타입의 세포를 사용한 생체외 에세이를 통해 생체외 세포에서 달성된 내성화 또는 내성 및/또는 면역억제를 측정할 수도 있다. 생체외 방법을 사용하여 내성화 또는 내성 및/또는 면역억제가 측정된다면, 적합한 대조군과 비교하여 면역 자극에 대한 세포의 반응이 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 70%, 90% 또는 그 이상 만큼 감소되는 경우내성화 또는 내성이 발생한 것으로 판단한다. 적당한 에세이를 이용하여 면역 반응을 직간접적으로 측정하며, 이는 당업계에 공지되어 있고, 하기를 포함하나 이들로 제한되지는 않는다: 혼합 림프구 반응 에세이; 세포독성 에세이; 항체 역가 에세이; IL-10의 생산 에세이; TGF-β의 생산 에세이; 세포 표면 마커의 산정; 및 Foxp3의 발현 에세이.
본 명세서에서 용어 "가용성 CD83" 또는 "sCD83"은 CD83 단백질 패밀리 멤버의 세포외 도메인의 적어도 일부를 포함하는 단백질성(proteinaceous) 분자를 지칭한다. 일부 구체예에서, 가용성 CD83 단백질은 자신이 발현되는 세포막에 분자를 고정시킬 수 있는 아미노산 서열을 갖지 않는다. 예를 들어, 가용성 CD83 단백질은 세포외 도메인 외부에 있는 전체 길이의 천연 CD83 단백질의 추가 잔기를 포함할 수 있다. CD83 단백질, 핵산 서열 및 구조는 당업계에 공지되어 있다. 인간 CD83의 핵산 서열(GenBank Accession No. Z11697)은 서열번호 1에 개시되어 있다. 이 서열은 포지션 11 내지 628의 암호화 서열(종결 코돈을 포함함) 및 포지션 11 내지 67의 신호 펩티드를 포함한다. 성숙 CD83 펩티드를 암호화하는 서열은 포지션 68 내지 625에 걸쳐 있다. 제한 효소 인식 부위는 서열의 시작 및 끝에 위치한다(포지션 1 내지 6 및 1755 내지 1760). 인간 CD83의 아미노산 서열(GenBank Accession No. Q01151, 서열번호 1에 개시된 핵산 서열에 의해 암호화됨)은 서열번호 2에 개시되어 있다.
CD83의 세포외 도메인은 천연의 전체 길이 단백질의 아미노산 20 내지 144를 포함하는 것으로 기술되어 있다. CD83의 전체 길이 아미노산 서열은 서열번호 2에 개시되어 있으며, 전체 길이 CD83의 아미노산 20 내지 144는 또한 서열번호 4에 개시되어 있다. 세포외 도메인을 암호화하는 CD83 핵산 서열의 일부는 서열번호 3에 개시되어 있다(참조: Zhou et al. (1992) J. Immunol. 149: 735-742; GenBank Accession Number Z11697; 및 SwissProt Acc. No. Q01151; 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된 WO 2004/046182).
다른 구체예에서, CD83 단백질은 "막 결합"되어 있다. 즉, CD83 단백질 패밀리 멤버의 세포외 도메인의 적어도 일부를 포함하며, 또한 세포막과 같은 막에 고정시킬 수 있는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 본 명세서에서 용어 "CD83"은 가용성 CD83 및 막-결합된 CD83을 포함한다.
일부 구체예에서, CD83 단백질은 서열번호 2 및/또는 SwissProt Acc. No. Q01151에 개시된 인간 CD83 단백질 서열의 상응하는 부분에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 가질 것이다. 따라서 용어 "CD83"은 쥐과(murine) CD83 단백질("HB15"라고도 지칭함; 참조: Berchtold et al. (1999) FEBS Lett . 461: 211-216)을 포함한다. 일부 구체예에서, CD83 단백질은 천연의 전체 길이 CD83 단백질로부터의 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 100, 또는 그 이상의 연속 아미노산 단편을 포함하거나, 이러한 단편과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다. 일반적으로, 본 명세서에서 "서열 동일성"은 서열 타입(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)에 적합한 내정 변수를 가지고 주지된 BLAST 정렬 프로그램을 사용하여 결정된 두 서열 사이의 서열 동일성을 지칭한다. 대체 프로그램으로는 BLASTN 및 BLASTP가 있으며; 이들 프로그램의 자세한 사항은 당업계에 공지되어 있고, NCBI (National Center for Biotechnology Information) 웹사이트에서 찾을 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에서 사용된 "가용성 CD83" 또는 "sCD83"은 CD83 단백질 패밀리 멤버의 세포외 도메인의 적어도 일부를 포함하는 에피토프를 지칭하며, 여기에서 상기 에피토프는 예를 들어 대상에게 투여되었을 때 그 자신에 대한 면역 반응을 자극한다. 이러한 구체예에서, sCD83인 에피토프에 대한 면역 반응은 본 명세서에서 sCD83에 대하여 기재된 활성 및 효과를 모방할 수 있다. 즉, sCD83인 에피토프에 대한 면역 반응은 천연 CD83의 세포외 도메인을 포함하는 sCD83의 활성을 가질 수 있거나, sCD83인 에피토프에 대한 면역 반응은 천연 CD83의 세포외 도메인을 포함하는 sCD83의 투여에 의해 생산된 효과와 유사한 효과를 투여 대상에 대해 나타낼 수 있다. 이러한 구체예에서, 에세이에서 또는 대상에 대한 CD83의 활성 또는 효과는 에피토프에 대한 면역 반응의 결과일 수 있거나, CD83 자체 활성으로부터의 결과이거나, 양쪽 모두일 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 CD83은 CD83 단백질의 이량체 또는 다량체일 수 있다. 이량화 또는 다량화는 CD83 단백질의 단량체 형태 안에 존재하는 시스테인 잔기(예를 들어, 천연 단백질의 포지션 12, 27, 35, 100, 107, 129 및 163에 존재한다) 사이에 하나 이상의 디설파이드 결합을 형성하거나, CD83 단백질의 단량체 형태 내부의 동일하거나 상이한 작용 부위(예를 들어, 카복시기, 아미노기, 히드록시기, 티오기 등)를 연결하는 이작용성 링커 분자(예를 들어, 디아민, 디카복실산 화합물 등)에 의해 이루어질 수 있다. 후자는 또한 폴리펩티드 링커(예를 들어, -[(Gly)xSer]y- (여기에서 x는 예를 들어 3 또는 4이며, y는 예를 들어 1 내지 5이다)와 같은 작은 극성 아미노산 잔기로부터 선택됨)를 사용하여, 재조합 기술에 의해 직접 생산될 수 있는 이량체 구조를 얻는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 CD83은 동종이량체 또는 동종다량체(예를 들어, 가용성 CD83의 5번째 시스테인 잔기(즉, 천연 단백질에서 아미노산 129에 상응하는 시스테인 잔기) 사이의 디설파이드 결합을 통해 연결된 천연 CD83 단백질(즉, 서열번호 2)의 아미노산 잔기 20 내지 144를 함유하는 sCD83)이다.
일부 구체예에서, CD83은 단량체일 수 있으며; 이러한 구체예에서 CD83의 천연 시스테인 잔기의 하나 이상이 다른 아미노산 잔기, 예를 들어, 작고/작거나 극성인 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 일부 구체예에서, 바람직하게는 작고/작거나 극성인 아미노산 잔기가 세린, 알라닌, 글리신, 발린, 트레오닌 등으로부터 선택된다. CD83이 단량체인 경우, 일부 구체예에서, CD83 단백질의 적어도 하나의 시스테인 잔기가 대체되며, 예를 들어, 전체 길이 천연 단백질의 포지션 129에 상응하는 시스테인 잔기가 알라닌으로 대체될 수 있다.
일부 구체예에서, 용어 "가용성 CD83" 또는 "sCD83"은 또한 CD83의 세포외 도메인의 적어도 일부와 작용성 단편 및 유도체와의 융합단백질을 포함한다(참조: WO 2004/046182). 적당한 융합 단백질은 융합 단백질이 본 명세서에 정의된 CD83 활성을 보유하는 한, CD83의 세포외 도메인의 적어도 일부와 적어도 하나의 다른 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 융합 단백질은 CD83의 세포외 도메인의 적어도 일부를 포함할 것이다. 이러한 단백질 또는 펩티드는 당업계에 공지되어 있다. 일부 구체예에서, 세포외 도메인 바깥의 CD83의 추가 잔기를 포함하는 단백질은 용어 "가용성 CD83"의 범주에 포함된다. 따라서, 적당한 유도체는 C- 또는 N-말단에 부착된 추가 서열을 갖는 단백질, 예를 들어, C-말단에 막관통 도메인 부분을 가졌거나 N-말단에 짧은 펩티드(예를 들어, 조작된 융합 단백질의 산물로서, 트롬빈 부위가 트롬빈에 의해 분해되어 생성될 수 있는 Gly-Ser-Pro-Gly; 또는 융합 단백질의 분해 후 GST 단편으로부터 생성된 짧은 펩티드)를 가진 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, sCD83은 천연의 전체 길이 단백질(서열번호 2)의 아미노산 20 내지 145로 구성되거나, 이를 포함하며, 이는 세포외 도메인 및 C-말단에 추가 아미노산을 포함한다. 다른 구체예에서, sCD83은 서열번호 2의 아미노산 20-143으로 구성된다.
본 발명에서 사용하기 위한 CD83의 활성은 당업계에 공지된 방법으로 평가할 수 있다. CD83 단백질은 임의의 적당한 에세이로 측정된 천연의 전체 길이 CD83 단백질의 적어도 하나의 활성을 나타내는 경우 "CD83 활성"을 갖는다고 말한다. CD83 단백질은 동일 에세이로 측정된 천연의 전체 길이 CD83 단백질 활성의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상을 가지는 경우 그러한 에세이에서 "CD83 활성"을 갖는다고 말한다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 CD83 단백질은 성숙 면역자극성 수지상 세포에 결합할 수 있으며, 이들 수지상 세포가 T-세포 증식을 자극하는 능력을 감소시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 실시예 9에 기술된 에세이에서, CD83은 성숙 DC 또는 단핵구에서 TNF-α를 억제하거나 감소시킬 것이다. 이 활성은 직간접적으로 평가될 수 있으며 생체내 또는 시험관내에서 측정될 수 있고; 적당한 에세이는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 혼합 림프구 반응 에세이, 또는 "MLR"을 들 수 있다(참조: Kruse et al. (2000) J. Virol. 74: 7127-7136; Lechmann et al . (2001) J. Exp . Med. 194: 1813-1821). 따라서, 본 발명에서 사용하기 위한 CD83 단백질은 T-세포 증식을 자극하는 성숙 면역자극성 수지상 세포의 능력을, 예를 들어, sCD83 부재하에 성숙 면역자극성 수지상 세포와 T-세포 사이의 상호작용과 같은 적합한 대조군과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상만큼 감소시킬 수 있다. 일부 구체예에서, CD83은 에피토프이며 면역 반응을 자극하는 활성을 가진다. 이 활성은 시험관내 에세이에서 CD83에 반응하여 생산된 항-CD83 항체를 동정하거나 이를 대상에게 투여함에 의해 에세이될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 CD83 단백질은 성숙 과정의 적어도 하나의 단계 중에 가용성 CD83의 존재하에 시험관내 성숙된 면역자극성 수지상 세포에 의한 TNF-α, CD80 및/또는 CD83의 발현을 적합한 대조군과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 감소시킬 수 있다(참조: Lechmann et al. (2001) J. Exp . Med. 194: 1813-1821; WO 2004/046182; 실시예 9). 이러한 방식으로, CD83은 세포 표면 마커의 발현을 변화시켰다고, 즉, 처리된 세포의 면역표현형을 변화시켰다고 할 수 있다. 세포 표면 마커의 발현을 분석하기 위한 통상의 기술(예를 들어, FACS 분석)에 의하면 때때로 세포의 혼합 개체군을 대표하는 데이터를 얻게 되므로, 특정 데이터 세트에서 어느 개체군이 대표될 수 있는가를 확인하기 위한 주의가 필요함을 당업자라면 이해한다.
CD83 단백질 패밀리의 다른 멤버는, 예를 들어, 세포외 부분을 암호화하는 인간 CD83 코딩 영역의 전부 또는 부분을 포함하는 핵산을 다른 동물, 예를 들어, 포유동물, 또는 동일 유기체의 다른 조직으로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, cDNA, 또는 RNA)의 다양한 공급원과 혼성화함으로써 얻을 수 있다. 본 발명에 따른 방법 및 조성물에서 사용되는 CD83 및 기타 단백질은 임의의 적당한 방법에 의해 생산되고 정제될 수 있다. 다양한 단백질 및 그의 유도체 뿐아니라 이들을 암호화하는 핵산을 생산하고, 정제하고, 조작하는 방법도 당업계에 주지되어 있다(참조: Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.); U.S. Pat. No. 7,169,898; U.S. Pat. App. No. 10/382,397; 및 U.S. Pat. App. No. 10/535,522).
일부 구체예에서, CD83은 CD83 단백질을 암호화하는 핵산을 대상에게 제공함에 의해 대상에게 투여된다. 예를 들어, CD83은 미국특허 제7,169,898호의 서열번호 1의 뉴클레오티드 58 내지 432를 포함하는 DNA 단편, 또는 상응하는 mRNA(참조: U.S. Pat. No. 7,015,204)로서 대상에게 투여될 수 있다. 유사하게, 일부 구체예에서, CD83은 CD83 단백질을 암호화하는 핵산으로 숙주 세포(즉, 세포)를 형질전환시킴으로써 시험관내 또는 생체내로 세포에 제공되며, 형질전환된 숙주 세포는 CD83 단백질을 발현함으로써 그 자신(즉, 형질전환된 숙주 세포) 뿐아니라 다른 세포에 CD83 단백질을 제공할 수 있다. 이러한 구체예에서, 적합한 숙주 세포는 수지상 세포를 포함한다. CD83이 CD83 단백질을 암호화하는 핵산으로서 제공되는 구체예에서, 용어 "CD83"은 또한 CD83 단백질을 암호화하는 핵산을 지칭할 수 있다. CD83 단백질을 암호화하는 한, DNA, RNA 또는 합성 핵산을 포함한 임의의 적당한 핵산이 사용될 수 있다. 핵산은 암호화된 단백질 또는 단백질 단편의 발현을 위한 적당한 벡터에 제공될 수 있다. 이들을 생산하는 적당한 벡터 및 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에서, "치료 조성물"은 그에 대한 면역 반응이 바람직하지 않은, 치료 목적으로 사용되는 외생적(exogenous) 조성물을 지칭한다. 이 경우에, 용어 "치료 조성물"은 순수 제제(즉, 단일의, 본질적으로 순수한 물질 또는 화합물로 구성된 제제) 뿐아니라 물질 또는 화합물의 혼합물을 포함한다. 본 명세서에서, 용어 "치료 목적"은 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상을 예방, 치료, 감소 또는 완화시키기 위한 노력을 포함한다. 이러한 방식으로, "치료 목적"은 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 치료 및 예방적 사용을 둘 다 포함하며; 따라서, 치료 조성물은 T 세포를 포함한 면역 반응의 기능장애 또는 원치않는 기능에 의해 유발된 질환 또는 장애의 발생을 예방하기 위해 사용되는 것을 포함한다.
본 발명에서 사용하기 위한 적당한 치료 조성물은 항체, 단백질, "작은 분자", 유전자 요법 벡터 및 유전자 요법 벡터에 의해 발현된 임의의 단백질, 항원, 알러지항원, 세포(줄기 세포 포함), 및 조직 이식물을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 이러한 카테고리들이 상호 배타적이어야 하는 것은 아니라고 이해되며; 따라서, 예를 들어, 많은 단백질이 항원이고, 많은 항원이 단백질이다. 치료 조성물이 CD83과 병용투여되지만, 대상이 적어도 하나의 다른 치료 조성물 또는 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물로 치료되지 않는 구체예에서, 치료 조성물은 이식 조직이 아니다. 치료 조성물이 CD83과 병용투여되지만, 대상이 적어도 하나의 다른 치료 조성물 또는 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물로 치료되지 않는 일부 구체예에서, 치료 조성물은 이식 조직과 연계된 항원이 아니다.
항원인 적당한 치료 조성물은 그에 대해 면역 반응이 발생할 수 있는 임의의 조성물(즉, 그에 대해 대상이 면역 반응을 나타내거나 나타낼 수 있는 임의의 조성물)이다. 적당한 항원은 단백질 및 단백질 단편, 예를 들어, 그에 대해 내성이 요구되는 자가면역 질환과 연계된 항원, 예를 들어, 자가면역 질환의 발생과 관련되거나 연계된 항원 또는 자가면역 질환을 가진 대상에서 그에 대한 항체가 발견되는 항원을 포함한다.
따라서, 예시적인 항원은 미엘린 염기성 단백질(다발성 경화증의 발생과 관련됨), 데스모글레인-3 단백질(심상성 천포창의 발생과 관련된다고 생각됨), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 수용체(그레이브스병의 발생과 관련됨), 갑상선 퍼옥시다제(하시모토 갑상선염의 발생과 관련됨), 아세틸콜린 수용체(중증근육무력증의 발생과 관련됨) 및 인슐린(I형 당뇨병의 발생과 관련됨)을 포함한다. 항체인 적당한 치료 조성물은 다클론항체, 단클론항체, 단일쇄 항체 또는 항체의 일부 또는 단편을 포함하는 임의 타입의 항체 또는 그의 유도체일 수 있다.
본 발명의 방법은 그에 대한 면역 반응이 일어나거나 일어날 수 있는 항원이 미지의 것인 경우에도 본 발명의 방법에서 사용되는 치료 조성물이 관용 세포로 하여금 원치 않는 면역 반응을 일으키게 하는 한 내성을 유도할 수 있다. 따라서, 적당한 치료 조성물은 그에 대해 원치 않는 면역 반응이 일어나거나 일어날 수 있는 조직 내부 또는 근처의 항원이 무엇이냐에 무관하게, 내성화가 요구되는 특정 조직과 연계된 항원을 포함한다. 이러한 방식으로, 일부 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 "결정인자 진열(determinant spreading)"이 일어나거나 일어날 수 있는 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는데 특별히 유용할 수 있다(참조: Dai et al. (2005) Cell . Mol . Immunol . 2: 169-175; Prat and Antel (2005) Curr . Opin. Neurol . 18: 225-230).
조직이 포함하고 있는 세포에 의해 항원이 발현되거나, 그 조직이 포함하고 있는 세포 상에서 또는 근처에서 항원 발견되는 경우(예를 들어, 조직의 세포외 매트릭스 내에서), 항원이 특정 조직과 "연계되어 있다"고 한다. 특정 조직과 "연계된" 항원의 사용은 조직 자체로부터 분리되어 정제된 형태의 항원의 사용을 포함하거나, 인사이투(즉, 조직 내에서)의 항원의 사용을 포함한다. 본 명세서에서 용어 "조직"은 개별적 기관(즉, 간, 신장, 심장, 폐 등) 뿐아니라 "액체" 조직(예를 들어, 혈액, 혈장과 같은 혈액 성분, T 세포와 같은 세포 등) 및 이들의 어느 한쪽 또는 양쪽의 일부 및 부분(subpart)을 포함한다.
경우에 따라, 치료 조성물은 본 발명의 방법에서 사용될 때 대상을 내성화시키는 능력 이외의 생물학적 활성을 갖지 못하도록 선택될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 치료 조성물은 천연 인슐린의 정상적인 생리적 활성을 갖지 않는 천연 인슐린 단백질의 일부 또는 단편으로만 구성될 수 있다. 항체인 적당한 치료 조성물은 다클론항체, 단클론항체, 단일-쇄 항체, 또는 항체의 일부 또는 단편을 포함하여 임의 타입의 항체 또는 그의 유도체일 수 있다. 당업자는 본 발명의 방법에 사용할 적당한 치료 조성물을 동정하고 제공할 수 있을 것이다.
적당한 치료 조성물은 본 발명의 목적이 달성되는 한(예를 들어, 이식 조직에 대한 내성화) 내성화가 요구되는 특정 조직과의 연계 여부와 무관하게 내성화를 자극하는 다른 약제 또는 항원을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 적당한 치료 조성물은 관심있는 조직으로부터 분리된 총 RNA 또는 RNA 서브셋을 포함하며; 이는 대상에게 직접 투여되거나(예를 들어, U.S. Pat. No. 7,015,204), 수지상 세포에 형질을 도입함으로써, 예를 들어, 대상을 치료하거나 조절 T 세포의 시험관내 생산을 위해 사용될 수 있다. 단백질 또는 폴리펩티드인 치료 조성물은 단백질 또는 폴리펩티드로서 투여될 수 있거나, 이를 암호화하는 핵산을 세포 또는 대상에게 제공함으로써 투여될 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 치료 조성물은 RNA를 포함한다(참조: U.S. Pat. No. 7,015,204). 일부 구체예에서, 하나 초과의 치료 조성물이 대상에게 투여된다.
용어 "면역억제 화합물"은 림프구의 T 및/또는 B 클론의 개체군 크기를 격감시킬 수 있는 화합물 또는 그들의 반응성, 증식(expansion) 또는 분화를 억제할 수 있는 화합물을 지칭한다. 본 발명의 방법에서 사용되기 위한 면역억제 화합물은 하기를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다: 사이클로스포린("CsA"로도 공지됨, Neoral? 또는 Sandimmune?로 시판됨) 및 타크롤리무스("FK506"으로도 공지됨, Prograf?로 시판됨)을 포함하는 칼시뉴린(calcineurin) 저해제; 마이코페놀레이트 모페틸("MMF"로도 공지됨, Cellcept?로 시판됨) 및 아자티오프린(Azasan? 또는 Imuran?로 시판됨)과 같은 퓨린 대사 저해제; 에베롤리무스(Certican?로 시판됨) 및 시롤리무스("라파마이신" 또는 "Rapa"로도 공지됨, Rapamune?으로 시판됨)와 같은 증식 저해제; 항-CD45 및 항-CD45RB(참조: U.S. Pat. No. 7,160,987)와 같은 단클론항체("mAb"); OKT3와 같은 T-세포에 대한 단클론항체; 바실릭사맙 및 다클리주맙과 같은, 인간화 항-TaT 항체를 포함하는, IL-2 수용체에 대한 단클론항체; CTLA-4-Ig1 융합 단백질과 같은, T-세포 보조자극 경로를 차단하는 물질; 키메리즘(즉, 이식편 조직이 자기(self)로 인식되는 공여자 및 수용자 면역 세포의 공존)을 유도할 수 있는 물질; 및 사이클로포스파미드(Cytoxan?으로 시판됨)와 같은 논-미엘로블러티브(non-myeloblative) 이식전 치료제. 면역 억제제 및 그들의 표적에 대한 논의는 문헌(Stepkowski (2000) Expert Rev . Mol . Med. June 21, 2000: 1-23.)을 참조할 수 있다.
시롤리무스("라파마이신" 또는 "Rapa"로도 공지됨, Rapamune?으로 시판됨)는 현재 13세 이상의 신장 이식 환자에서 기관 거부의 예방을 위해 사용된다. 제조자는 Rapamune?이 처음에는 사이클로스포린 및 코르티코스테로이드와 함께 처방되어 사용되어야 한다고 추천한다. 실험 모델(마우스, 돼지 및/또는 영장류)에서의 연구 결과, 시롤리무스가 동종이식편, 예를 들어, 신장, 심장, 피부, 섬(islet), 소장, 췌십이지장 조직, 및 골수의 생존을 연장시키는 것으로 나타났다. 시롤리무스는 랫트에서 심장 및 신장 동종이식편의 급성 거부를 전환시켰으며, 감작된(presensitized) 랫트에서 이식편 생존을 연장시켰다. 일부 연구에서, 시롤리무스의 면역억제 효과는 요법의 중지 후 6개월까지 지속되었다. 시롤리무스의 내성화 효과는 동종-특이적이다. 자가면역 질환의 설치류 모델에서 시롤리무스는 전신홍반루푸스, 콜라겐-유도성 관절염, 자가면역(타입 I) 당뇨병, 자가심근염, 실험적 알러지성 뇌척수염, 이식편대숙주 질환 및 자가면역성 포도막염과 연계된 면역-매개 사건을 억제하였다.
마이코페놀레이트 모페틸("MMF"로도 공지됨, Cellcept?로 시판됨)은 현재 동종이형의 심장 또는 간 이식을 수용하는 환자에서 기관 거부를 예방하기 위해 사용된다. 제조자는 Cellcept?가 사이클로스포린 및 코르티코스테로이드와 함께 사용되어야 한다고 추천한다. 마이코페놀레이트 모페틸은 실험적 동물 모델에서 신장, 심장, 간, 창자, 사지, 소장, 이자섬 및 골수를 포함한 동종이형의 이식 생존을 연장시키는 것으로 입증되었다. 마이코페놀레이트 모페틸은 또한 개(canine) 신장 모델 및 랫트 심장 동종이식편 모델에서 진행중의 급성 거부를 전환시키는 것으로 나타났으며, 랫트의 대동맥 및 심장 동종이식편 뿐아니라 영장류 이종이식편의 실험적 모델에서 증식성 동맥병증을 저해하였다. 마이코페놀레이트 모페틸은 또한 종양 진행을 저해하고 쥐과 종양 이식 모델에서 생존을 연장시키는 것으로 입증되었다. 마이코페놀레이트 모페틸은 단독으로 사용되거나 다른 면역억제제와 조합하여 사용될 수 있다.
타크롤리무스("FK506"으로도 공지됨, Prograf?로 시판됨)는 현재 동종이형의 간, 신장 또는 심장 이식을 수용하는 환자에서 기관 거부를 예방하기 위해 사용된다. 타크롤리무스는 부신 코르티코스테로이드와 함께 사용되어야 한다. 심장 이식 수용자에서, Prograf?는 아자티오프린 또는 MMF와 함께 사용되는 것이 추천된다. 타크롤리무스는 간, 신장, 심장, 골수, 소장 및 이자, 폐 및 기관, 피부, 각막 및 사지의 동물 이식 모델에서 숙주 및 이식편의 생존을 연장시키는 것으로 나타났다. 동물에서, 타크롤리무스는 일부 체액면역을 억제하고, 동종이식편 거부, 지연형 과민, 콜라겐-유도성 관절염, 실험적 알러지성 뇌척수염 및 이식편대숙주 질환과 같은 세포-매개성 반응을 크게 억제하는 것으로 입증되었다. 본 발명은 임의의 화합물 또는 그들의 조합의 작용 기전에 구애되지 않으며, 비록 타크롤리무스의 정확한 작용 기전이 알려져 있지는 않지만, 타크롤리무스는 칼시뉴린의 포스파타제 활성을 저해하며, T-림프구 활성화를 저해하는 것으로 생각된다.
사이클로스포린("CsA"로도 공지됨, Neoral? 또는 Sandimmune?로 시판됨)은 현재 신장, 간 및 심장의 동종이형 이식에 대한 기관 거부를 예방하기 위해 사용된다. 사이클로스포린은 아자티오프린 및 코르티코스테로이드와 조합하여 사용되어 왔으며, 류머티스 관절염 환자에서 메토트렉세이트와 조합하여 사용될 수 있다. 사이클로스포린은 중증의 활성 류머티스 관절염 질환이 메토트렉세이트에 충분히 반응하지 않는 경우에 이 질환 환자의 치료를 위해 사용된다. 사이클로스포린은 또한 중증의 난치성 플라크 건선을 가진 비면역타협의(nonimmunocompromised) 성인 환자치료에 사용된다. 사이클로스포린은 동물 모델에서 피부, 신장, 간, 심장, 이자, 골수, 소장 및 폐와 관련된 동종이형 이식물의 생존을 연장시키는 강력한 면역억제제이다. 사이클로스포린은 다양한 기관에 대한 많은 동물 종에서 일부 체액면역을 억제하고, 동종이식편 거부, 지연형 과민, 실험적 알러지성 뇌척수염, 프로인트 보조 관절염 및 이식편대숙주 질환과 같은 세포-매개성 면역 반응을 크게 억제하는 것으로 나타났다. 비록 본 발명이 임의의 화합물 또는 그들의 조합의 작용 기전에 구애되지는 않지만, 사이클로스포린은 세포 주기의 G0 및 G1기에서 면역적격 림프구를 저해하며, 바람직하게는 T-림프구를 저해하는 것으로 나타났다.
물질의 "유효량"은 본 발명의 방법에 따라 대상에게 투여되는 경우 본 발명의 적어도 하나의 목적을 달성하기에 적어도 충분한 양을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 치료 조성물의 "유효량"은 치료 조성물이 CD83 및 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물과 함께 대상에게 병용투여되는 경우 치료 조성물에 대해 대상이 내성을 갖도록 하기에 적어도 충분한 양이다. 유사하게, CD83의 "유효량"은 치료 조성물 및 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물과 함께 투여되는 경우 치료 조성물에 대해 대상이 내성을 갖도록 하기에 적어도 충분한 양이다. 면역억제 화합물의 "유효량"은 CD83 및 임의로 치료 조성물과 함께 투여되는 경우 면역 반응의 기능장애 또는 원치 않는 기능에 의해 유발된 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상에 대해 측정가능한 효과를 나타내기에 적어도 충분한 양이다. 일부 구체예에서, 면역억제 화합물의 유효량은 본 명세서의 다른 부분에 정의된 바와 같은 내성 및/또는 면역억제를 유도하기에 적어도 충분한 양이다. 면역억제 화합물의 유효량은 개별적인 대상이 나타내는 증상에 비추어 결정할 수 있거나, 임상 연구로부터 결정될 수 있거나, 모델 시스템의 적합한 연구로부터 외삽될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 면역억제 화합물의 유효량은 본 발명의 방법을 이용한 임상 연구에서 결정된 투여량 범위에 기초하여 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상에 대해 측정가능한 효과를 나타내리라 예측되는 양을 포함한다.
유효량은 하나 이상의 복용량, 적용량 또는 투여량으로 투여될 수 있다. 적합한 복용량, 적용량 및 투여량은 다수의 인자에 따라 변할 수 있으며, 인자는 하기를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다: 조성물의 특이 활성; 조성물의 제형; 치료하고자 하는 대상의 체중, 연령, 건강, 질환 및 병태; 및 조성물의 대상으로의 투여 경로. 어떤 경우에, 유효량이 되기에 필요한 CD83의 최소량은 환자에게 이미 존재하는 CD83, 특히 가용성 CD83의 존재에 의해 감소할 수 있으며(참조: Hock et al . (2006) (Tissue Antigens 67: 57-60)); 당업자는 최상의 결과를 얻기 위하여 투여량 및 복용량을 용이하게 조절할 수 있을 것이다. 예를 들어, CD83은 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 7, 10, 20, 50, 70, 100, 200, 500 또는 700 mg/kg의 하한, 또는 1, 2, 5, 7, 10, 20, 50 또는 100 g/kg의 하한; 및 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 7, 10, 20, 50, 70, 100, 200, 500 또는 700 mg/kg의 상한, 또는 1, 2, 5, 7, 10, 20, 50, 100 또는 200 g/kg의 상한을 갖는 범위 내에서 환자에게 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 그에 대한 면역 반응이 일어나거나 일어날 수 있는 항원이 미지의 것인 경우에도 내성을 유도할 수 있다. 따라서, 적당한 치료 조성물은 그에 대해 원치 않는 면역 반응이 일어나거나 일어날 수 있는 조직 내부 또는 근처의 항원이 무엇이냐에 무관하게, 내성화가 요구되는 특정 조직과 연계된 항원을 포함한다. 이러한 방식으로, 일부 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 "결정인자 진열"이 일어나거나 일어날 수 있는 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는데 특별히 유용할 수 있다(참조: Dai et al. (2005) Cell . Mol . Immunol. 2: 169-175; Prat and Antel (2005) Curr . Opin . Neurol . 18: 225-230). 조직이 포함하고 있는 세포에 의해 항원이 발현되거나, 조직이 포함하고 있는 세포 상에서 또는 근처에서 항원이 발견되는 경우, 그 항원은 특정 조직과 "연계되어" 있다.
본 발명의 방법은, 조합 치료의 효능이 두가지 개별적 치료를 조합한 것으로부터 예상되는 것보다 훨씬 높게 나타나는 방식으로, CD83을 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물과 함께 병용투여함에 의해 생산된 상승 효과의 이점을 제공한다. 또한, CD83이 두 가지 이상의 다른 면역억제 화합물과 함께 대상에게 병용투여되는 경우, 훨씬 더 큰 이점이 제공될 수 있다. 이런 방식으로, 본 발명은 개별적 치료를 단독으로 수행함에 의해 제공되는 것보다 훨씬 큰 효능을 갖는 조합(또는, "병용투여") 치료를 제공한다. 일부 구체예에서, 조합 또는 병용투여 치료는 각각의 개별적인 치료에 의해 제공된 이점의 합보다 큰 이점을 제공한다. 일부 구체예에서, 조합 또는 병용투여 치료는 개별적인 치료에 의해 제공된 이점에 비해 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 50%, 75%, 100%, 200% 또는 그 이상, 또는 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배 또는 그 이상 만큼 더 큰 이점을 제공한다. 일부 구체예에서, 조합 또는 병용투여 치료는 각각의 개별적인 치료에 의해 제공된 이점의 합보다 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 50%, 75%, 100%, 200% 또는 그 이상, 또는 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배 또는 그 이상 만큼 더 큰 이점을 제공한다.
조합(또는 "병용투여") 치료의 상기 개선된 효능은 대상을 치료함에 있어 화합물이 단독으로 사용되는 경우에 요구되는 것보다 적은 투여량으로 개별적 화합물을 사용하는 본 발명의 치료 방법을 제공한다. 이런 방식으로, 본 발명은 각각의 개별적 화합물을 현재 사용하는 것보다 적게 사용하는 효과적인 치료를 가능하게 한다. 즉, 본 발명은 대상을 치료하기 위해 감소된 양의 화합물을 사용하는 방법 및 대상을 치료하기 위해 사용된 화합물의 양을 감소시키는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 더 적은 투여량이 사용됨으로 인해 부작용의 발생가능성이 낮아지고/지거나 부작용의 감소된 중증도를 나타내는 치료를 추가로 제공한다. 이러한 부작용은 일반적으로 칼시뉴린 저해제(예를 들어, 신독성)와 함께 나타나는 것을 포함한다. 개별적인 칼시뉴린 저해제는 또한 특정 부작용을 나타내는 경향이 있으며; 예를 들어, 사이클로스포린 치료에 나타나는 경향이 있는 부작용은 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 진전(tremor), 검 과다형성 다모증(gum hyperplasia hirsutism) 및 피부 변화를 포함하는 한편, 타크롤리무스 치료에 나타나는 경향이 있는 부작용은 증가된 빈도의 당뇨병을 포함하나 사이클로스포린 치료와 비교하여 고지혈증, 고혈압 및 검 과다형성이 감소한다. 마이코페놀레이트 모페틸이 통상 나타내는 부작용은 백혈구 감소증, 설사, 빈혈, 고혈압, 식도염, 위염 및 위장관 출혈 위험이 증가하는 것이다.
"더 낮은 용량"은 개별적인 화합물이 대상을 치료하기 위해 사용되는 양 미만의 투여량 수준으로 대상에게 투여되는 의미로 사용된다. 일부 구체예에서, "더 낮은 용량"은 개별적인 화합물이 제조자에 의해 추천되는 양, 즉, 화합물에 대한 사용설명서에서 추천된 투여량 수준 미만의 투여량 수준으로 대상에게 투여되는 의미로 사용된다. 참고로, 관심있는 몇가지 화합물에 대한 사용설명서에서 현재 추천되고 있는 투여량 수준은 다음과 같다. 추천 투여량 수준이 요법 또는 치료 간격(treatment interval)의 단계에 의해 변화하는 경우에(예를 들어, 새로운 이식 환자에 대한 투여량 수준 대 유지 투여량 수준), 본 발명의 방법은 요법 또는 치료 간격의 오직 한 단계 중에, 또는 요법 또는 치료 간격의 적어도 한 단계 중에 더 낮은 용량의 화합물로 대상이 치료되는 치료방법을 포함한다. 요법 및/또는 치료 간격의 단계는 당업자에 의해 이해되며, 예를 들어, 다음을 포함한다: 만성 자가면역 장애 또는 질환의 장기 유지 또는 관리; 이식전 준비; 이식후 회복; 및 이식후 유지. 대안적으로, 치료 간격은 1일, 1주, 1달, 또는 2, 3, 4, 5 또는 6달, 또는 1년과 같이 치료가 이루어지고/지거나 평가되는 기간, 또는 그 중에 또는 그 후에 대상이 일정한 치료 목표(들)를 달성한 것으로 보이는 간격일 수 있다.
타크롤리무스("FK506"으로도 공지됨, Prograf?로 시판됨)의 경우, 제조자는 이식으로부터 6시간이 지난 후 0.01 mg/kg/일(심장 이식의 경우)의 출발 용량으로 투여하거나, 0.03-0.05 mg/kg/일(간 또는 신장 이식의 경우)의 지속 정맥 주입 투여를 추천한다. 지속 주입은 환자가 경구 투여를 견딜 수 있을 때까지만 지속되어야 한다.
시롤리무스("라파마이신"으로도 공지됨, Rapamune?으로 시판됨)의 경우, 추천 용량은 환자에 대한 면역학적 위험 및 이식후 치료의 단계에 따라 달라진다. 낮거나 중간 정도의 면역학적 위험이 있는 환자에 대해서는 Rapamune? 경구 용액 및 정제를 사이클로스포린 및 코르티코스테로이드와 조합하여 사용하는 것이 추천되며; 사이클로스포린은 이식 후 2-4달에 사용이 중단되어야 한다. 신생(de novo) 이식 수용자의 경우에, 유지 용량의 3배에 해당하는 Rapamune?의 부하 용량(loading dose)이 제공되어야 한다. 예를 들어, 신장 이식 환자의 경우에, 6 mg의 부하 용량과 함께 2 mg의 유지 용량이 추천된다. 사이클로스포린 중단이 고려되는 환자는 Rapamune?과 사이클로스포린 조합 요법을 수용해야만 한다. 이식 후 2 내지 4달에, 사이클로스포린은 4 내지 8주에 걸쳐 점진적으로 중단되어야 하며, Rapamune? 용량은 이식 후 처음 1년간 16 내지 24 ng/mL 범위로 전체 혈액 최저치를 얻을 수 있도록 조절되어야 하며; 그 후에 목표는 10-20 ng/mL이 되어야 한다.
면역학적 위험이 높은 환자의 경우에 처음 1년간 Rapamune? 경구 용액 및 정제를 사이클로스포린 및 코르티코스테로이드와 조합하여 사용하는 것이 추천된다. 사이클로스포린과 함께 Rapamune?를 수용하는 환자의 경우, Rapamune? 요법은 이식 후 1일에 15 mg 이하의 부하 용량으로 시작하여야 한다. 이식 후 제2일부터 5 mg/일의 초기 유지 용량이 제공되어야 한다. 사이클로스포린의 출발 용량은 분리된 용량으로 7 mg/kg/일 이하이어야 하며, 그 후 목표로 하는 전체 혈액 최저농도 (즉, 혈중 최소 농도)를 달성하도록 용량을 조절하여야 한다. 프레드니손 역시 최소 5 mg/일로 투여되어야 한다.
신장 동종이식편 수용자에게 사용되는 경우, Rapamune?의 초기 용량은 이식 후 가능한 빨리 투여되어야 한다. Rapamune? 농도의 비항정 상태(non-steady-state)에 기초한 빈번한 Rapamune? 용량 조절은 과용량 또는 저용량의 결과를 초래할 수 있으며, 따라서 용량 조절은 주의깊게 이루어지고 감시되어야 한다. 일단 유지 용량이 조절되면, 환자는 적어도 7 내지 14일간 새로운 유지 용량으로 지속되어야 한다.
마이코페놀레이트 모페틸("MMF"로도 공지됨, Cellcept?로 시판됨)의 경우, 제조자는 신장 이식 환자에 대하여 2그램의 총 1일 용량에 대해 1일 2회 경구 또는 정맥으로(2시간 이상에 걸쳐서) 1그램의 용량으로 투여하는 것을 추천한다. 3개월 내지 18세 사이의 소아과 환자의 경우, Cellcept? 경구 현탁액의 추천 1일 용량은 1일 2회 600 mg/m2(최대 2 그램/10 ml 경구 현탁액)이다. 예를 들어, 무게의 함수로서 신체 표면적의 표준 표를 사용하여 신체 표면적을 결정할 수 있다(참조: Sharkey et al. (2001) British J. Cancer 85: 23-28). 심장 이식 환자의 경우, 성인은 1 그램의 용량으로 2시간 이상에 걸쳐 1일 2회("b.i.d.") 정맥 투여하거나, 3 그램의 1일 용량에 대해 1일 2회 1.5 그램씩 경구투여하여 치료하여야 한다. 간 이식 환자의 경우, 성인은 1 그램의 용량으로 2시간 이상에 걸쳐 b.i.d. 정맥 투여하거나, 3 그램의 총 1일 용량에 대해 1.5 그램씩 b.i.d. 경구투여하여 치료하여야 한다.
사이클로스포린("CsA"로도 공지됨, Neoral? 또는 Sandimmune?로 시판됨)의 경우, 제조자가 추천하는 것은 Neoral?의 초기 경구 용량이 이식 전 4-12 시간 또는 수술 후에 제공될 수 있는 것이다. 신규 이식 환자에 있어서, 평균 초기 용량(±SD)은 신장 이식 환자의 경우 9(±3) mg/kg/일이고, 간 이식 환자의 경우 8(±4) mg/kg/일이며, 심장 이식 환자의 경우 7(±3) mg/kg/일이다. 총 1일 용량을 2개의 동일 용량으로 분할하고, 용량을 예정된 사이클로스포린 혈중 농도를 달성하기 위하여 조절하며; 개인의 체중에 따른 전형적인 투여량 스케쥴은 최초 14일간 2 mg/kg/일부터 시작하고; 그 후, 1주까지 1 mg/kg/일로 투여량을 줄이며, 2주까지 0.6 mg/kg/일로 좀 더 줄이고, 1달까지 0.3 mg/kg/일로, 2달까지 0.15 mg/kg/일로 줄이며, 그 후에는 유지 요법에 진입한다. 초기에는 아드레날 코르티코스테로이드와의 부가 요법이 추천된다.
류마티스 관절염의 치료에 사이클로스포린 초기 용량은 분할된 경구 용량으로서 1일 2회 투여된 2.5 mg/kg/일이다. 살리실레이트, 비스테로이드성 소염제 및 경구 코르티코스테로이드의 기타 치료가 계속될 수 있다. 임의 시점에서의 유해 사례를 조절하기 위하여, 용량을 25-50% 만큼 감소시켜야 한다. 건선의 치료에 있어서, 사이클로스포린의 초기 용량은 분할된 경구 용량으로서 1일 2회 투여된 2.5 mg/kg/일이다. 유해 사례를 차단하기 위하여 적어도 4주간 환자는 상기 용량을 유지하여야 한다. 4주 후에 유의한 임상적 개선이 보이지 않는 경우, 용량을 0.5 mg/kg/일씩 2주 간격으로 최대 4 mg/kg/일까지 증가시킬 수 있다. 임의 시점에서의 유해 사례를 조절하기 위하여, 용량을 25-50% 만큼 감소시켜야 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "화합물", "조성물" 및 "물질"은 각각 본 발명의 방법에 사용되기 위한 임의의 물질(즉, CD83, 치료 조성물, 또는 면역억제 화합물을 포함)을 포함한다. 한 물질은 또 다른 물질과 "병용투여"되며, 물질들이 대상에게 동시 투여되거나, 또 다른 물질이 대상에게 투여되기 전후 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14 시간 이내, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 또는 200 일 이내에 한 물질이 대상에게 투여될 때 "병용투여"가 발생한다. 물질들이 동시 투여될 때, 이들은 투여 전에 조합될 수도 있고, 동시에 별도로 투여될 수도 있다.
본 발명의 방법은 각 화합물 또는 조성물의 단일 용량 또는 투여량 또는 다중 용량 또는 투여량을 포함할 수 있다. 다중 투여가 수행되는 구체예에서, 화합물 또는 조성물의 적어도 하나의 투여는 투여되는 다른 화합물 또는 조성물의 "유효성 시간대(window of effectiveness)" 이내에 발생할 것이다. 일부 구체예에서, 조합 치료의(즉, 양쪽 물질 투여의) 효능이 적합한 대조군 실험에서 이들이 분리되어 투여되는 경우 개별적 치료의 한쪽 또는 양쪽 모두와 비교하여 더 크거나 크다고 예측되거나 상이한 경우 두번째 물질은 첫번째 물질의 "유효성 시간대" 이내에 투여된 것으로 간주된다. 일부 구체예에서, 조합 치료의(즉, 양쪽 물질 투여의) 효능이 적합한 대조군 실험에서 이들이 분리되어 투여되는 경우 개별적 치료의 조합 효능과 비교하여 더 크거나 크다고 예측되거나 상이한 경우 두번째 물질은 첫번째 물질의 "유효성 시간대" 이내에 투여된 것으로 간주된다. 예를 들어, CD83의 투여 및 CD83의 유효성 시간대 내의 치료 조성물의 투여를 포함하는 방법에 의해 대상이 치료 조성물에 대해 내성화될 수 있으며; 치료 조성물의 투여가 CD83의 유효성 시간대 밖에서 일어나는 것과 같이 대상이 CD83 및 치료 조성물에 의해 분리되어 치료받은 경우 상기 결과는 예측되지 못하였을 것이다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 화합물 또는 조성물은 한 물질의 "유효성 시간대"가 적어도 하나의 다른 물질의 "유효성 시간대"와 적어도 일부 중첩되도록 투여된다. 조합 치료의 효능이 적합한 대조군 실험에서 이들이 분리되어 투여되는 경우 개별적 치료의 조합 효능과 비교하여 더 크거나 크다고 예측되거나 상이한 경우 이러한 중첩이 일어났다고 간주된다. 일부 구체예에서, 치료의 특정 과정 중에, 하나 이상의 물질의 유효성 시간대 전에, 중에, 또는 후에 추가의 투여가 발생할 수 있는 반면, 다른 실험에서, 하나 이상의 물질의 유효성 시간대 밖에서는 추가의 투여가 없다. 일부 구체예에서, 각 물질의 모든 투여는 대상에게 투여되는 서로 다른 물질의 유효성 시간대 내에서 발생한다. 2개 초과의 물질이 대상에게 투여되는 구체예에서, 한 물질은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 다른 물질의 유효성 시간대 내에서 투여될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 하나 초과의 치료 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 다중 치료 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 치료 조성물은 유사하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서 대상에게 투여되는 치료 조성물은 관련된 항원을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일부 구체예에서, 대상에게 투여되는 치료 조성물은 특정 조직으로부터 제조된 RNA("총 조직 RNA")를 포함할 수 있다.
대상은 치료 목적으로 CD83에 의해 외생적 화합물에 대해 내성화될 수 있는 것이기 때문에, 적어도 치료 중에, 또는 적어도 CD83의 유효성 시간대 중에 내성화가 요구되지 않는 화합물에 대상이 노출되지 않는 것이 중요하다. 따라서, 예를 들어, 종양-특이적 항원 및 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함한 질환-유발 미생물에 대상이 노출되지 않아야 한다. 일반적으로, 본 명세서에서, "대상"은 치료를 필요로 하는 임의의 동물을 의미한다. 따라서, 예를 들어, "대상"은 인간 환자 또는 비인간 포유동물 환자일 수 있거나, 또 다른 동물 환자일 수 있다.
질환 또는 의학적 병태의 예방이 요구되는 경우, 대상은 규칙적인 간격(예를 들어, 대략 2년, 1년, 6개월, 2 내지 4달, 또는 1달에 한번)으로 치료될 수 있다. 그러나, 본 발명의 모든 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 면역 반응의 기능장애 또는 원치 않는 기능에 의해 유발된 특정 질환 또는 장애를 가진 것으로 확인된 대상 또는 특정 질환 또는 장애의 발병 가능성이 있는 것으로 확인된 대상에게 투여된다. 예를 들어, 대상의 가족력, 유전자 테스트 또는 대상의 효소 또는 대사물 수준을 결정하기 위한 테스트, 또는 다른 질환 또는 장애의 진단 결과 대상이 이러한 특정 질환 또는 장애의 발병 가능성이 있는 것으로 확인될 수 있다. 이런 방식으로, 예를 들어, 본 발명의 방법은 자가면역 질환을 치료하기 위해, 자가면역 질환의 발병을 예방하기 위해, 또는 대상의 자가면역 질환 발병에 대한 위험을 감소시키기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, 면역 반응의 기능장애 또는 원치 않는 기능에 의해 유발된 특정 질환 또는 의학적 병태를 완화 또는 예방하기 위해 대상을 더 이상 치료하지 않을 때 치료 과정이 종결된다.
따라서, 본 발명은 면역 반응의 기능장애 또는 원치 않는 기능에 의해 유발된 질환 또는 의학적 병태의 치료 또는 예방 방법을 제공하며, 여기에서 면역억제가 이루어질 수 있도록 CD83의 유효량이 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물과 함께 대상에게 병용투여된다. 임의로, 치료 조성물도 투여될 수 있다. 치료 조성물이 투여되는 경우, 대상이 치료 조성물에 대해 내성화될 수 있도록 CD83의 유효성 시간대 중에 치료 조성물을 대상에게 투여한다. 이 목적이 달성되는 한, CD83 및 치료 조성물의 전달을 위해 임의의 투여 형태가 선택될 수 있다. 따라서, 예를 들어, CD83 및 치료 조성물은 함께 동일한 투여 형태를 통해 투여될 수도 있고, 분리되고/되거나 상이한 투여 형태를 통해 투여될 수도 있다. 따라서, 예를 들어, CD83은 단백질로서 대상에 투여되거나, CD83을 암호화하는 핵산(예를 들어, mRNA로서 또는 발현벡터 내에서)으로서 대상에 투여될 수 있다.
본 발명의 방법은 예를 들어, 알러지; 천식; 조직 이식 거부; 만성적으로 투여된 물질에 대한 면역 반응; 자가면역 질환, 예를 들어, 중증 근육 무력증, 다발성 경화증, 혈관염, 크론씨병 또는 궤양성 대장염과 같은 만성 염증성 창자 질환, 강직성 척추염, 전신홍반 루푸스, 건선과 같은 피부 질환, 류마티스 관절염 및 인슐린-의존성 당뇨병; 및 AIDS와 같이 면역 반응의 기능장애 또는 원치 않는 기능에 의해 유발된 질환 또는 장애에 걸리거나 걸릴 수 있는 대상을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 예를 들어, 백혈병(다발성 골수종 및 급성 림프성 백혈병을 포함)과 같은 B-세포 증식증; AIDS와 연계된 B-세포 과다활동; 독성 쇼크 증후군; 혈청병; 및 치주병(참조: Mahanonda et al. (2002) J. Periodontal Res. 37: 177-183)과 같이 B-세포 또는 B-세포 기능과 관련된 질환 또는 장애로 인해 고생하는 대상을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 혈청병은 어떤 투약 또는 항혈청에 대한 원치 않는 면역 반응에 의해 유발된 일군의 증상이다. 즉, 혈청병은 수동 면역을 유도하기 위한 노력으로 다른 동물 또는 인간으로부터의 항혈청이 대상에게 제공되었을 때 나타날 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 B-세포 또는 B-세포 기능과 관련된 질환 또는 장애의 치료를 제공하며, 여기에서 치료는 B-세포 고갈(depletion), 즉, 대상에서 B 세포의 수 및/또는 아형(subtype)의 감소를 초래하지 않는다.
본 발명의 조성물 및 방법은 단독으로 사용될 수 있거나(즉, 이들은 다른 치료를 받지 않는 대상을 치료하기 위해 사용될 수 있다), 다른 치료를 받는 중이거나 받은 대상에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 특정 질환 또는 장애로 고생하는 대상은 본 발명의 방법 및 조성물 만으로만 치료될 수 있거나, 본 발명의 방법 및 조성물 뿐 아니라, 예를 들어, 종래의 화학요법 또는 약제 치료와 같이 특정 질환 또는 장애에 의해 영향을 받거나 받을 수 있는, 대상에게 통상 투여되는 다른 치료 또는 요법으로 치료될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 방법은 비-면역억제 화합물을 포함하는 다른 화합물의 사용 또는 병용투여를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은, 예를 들어, 코르티코스테로이드, 항염증제, 예를 들어, 아자티오프린, 및 대사길항물질 약물, 예를 들어, 메토트렉세이트를 포함하는 다른 화합물의 사용 또는 병용투여를 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 조직 수용자에서 조직 이식 거부의 적어도 하나의 증상을 예방, 치료 또는 완화시키기 위해 사용된다. 이러한 구체예에서, 이식 수용자("수용자" 또는 대상)는 CD83 및 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물 또는 적어도 하나의 치료 조성물로 치료될 수 있다. 치료 조성물은 이식 조직과 연계된 항원, 예를 들어, 이식 조직 샘플의 용해 또는 균질화에 의해 이식 조직으로부터 제조되거나 추출된 항원일 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법에 따른 이식 수용자의 치료는 조직 이식 전, 이식과 함께(즉, 동시에), 및/또는 이식 후 치료를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 치료 조성물은 이식 조직 자체이므로 이식 조직의 도입 이외에 수용자에게 치료 조성물의 추가 투여를 하지 않으며; 이러한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물 또는 적어도 하나의 치료 조성물이 또한 투여된다. 일부 구체예에서, 거부를 예방하기 위한 이식 수용자의 지속적인 치료가 불필요하게 되도록 본 발명의 방법은 조직 이식 거부의 모든 유해 증상을 예방, 치료, 또는 완화시키며; 이러한 구체예에서 대상에게 이식편 내성이 유도되었다고 한다.
일부 구체예에서, 의도된 수용자에게 이식하기 위해 조직을 적출하기 전에 이식될 조직의 공여자("이식 공여자")를 치료할 수 있다(예를 들어, 본 발명의 방법에 따른 CD83 및 적어도 하나의 다른 면역억제제 및, 임의로, 적어도 하나의 치료 조성물을 사용하여). 일부 구체예에서, 본 명세서에 기술한 바와 같이, 이식 공여자에게 물질을 투여하지만, 치료의 목적은 이식 수용자의 내성 및/또는 면역억제를 유도하기 위한 것이다. 여기에서도, 치료 조성물은 이식 조직(예를 들어, 기관)과 연계된 항원일 수 있다. 일부 구체예에서, 이식 공여자 및 이식 수용자 양쪽을 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있다.
일부 구체예에서, 이식하고자 하는 조직이 공여자로부터 적출된 다음 CD83 함유 용액에 노출될 수 있으며; 즉, 예를 들어, 조직을 이식하기 전에 CD83 함유 용액에 저장하고/하거나 용액으로 관류시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 이식하고자 하는 조직이 공여자로부터 적출된 다음 CD83 및 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물 함유 용액에 노출될 수 있으며; 즉, 예를 들어, 조직을 CD83 및 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물 함유 용액에 저장하고/하거나 용액으로 관류시킬 수 있다. 치료 조성물은 또한 공여자에게 투여될 수 있다. 그 결과, 상기 조직이 이식 수용자에게 도입될 때, 조직 내부 및 조직 표면상의 CD83 및 다른 면역억제 화합물(들)이 조직과 연계된 항원과 함께 대상에게 병용투여될 것이다. 본 명세서에서 "조직"은 개별적 기관 및/또는 분화된(specialized) 조직(예를 들어, 간, 신장, 심장, 폐, 피부, 이자섬 등) 뿐아니라 "액체" 조직(예를 들어, 혈액, 혈장과 같은 혈액 성분, 수지상 세포와 같은 세포 등)을 포함하며; 용어 "조직"은 또한 개별적 기관 및 "액체" 조직의 일부 및 부분(subpart)을 포함한다.
당업자는 수용자 및 공여자 양쪽에 대해 최상의 가능한 성과를 내기 위한 이식 수용자 및 공여자의 평가 및 치료 방법에 정통하다. 따라서, 당업자는 특정 대상에게 적합한 CD83, 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물, 및 임의로 치료 조성물의 복용량 및 투여량을 용이하게 평가하고 조정할 수 있을 것이다. 상기 논의된 바에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 본 발명의 방법은 다수의 단계를 포함하며; 이들 단계는 적어도 하나의 본 발명의 목적이 달성되는 한 임의의 순서로 수행될 수 있다. 상기 방법이 다중 화합물의 다중 투여를 포함할 수 있기 때문에, 단계의 일부 중첩이 또한 발생할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 유전자 요법 벡터, 예를 들어, 아데노-연계성 바이러스("AAV") 및 AAV로부터 유래된 벡터, 및/또는 유전자 요법 벡터에 의해 암호화된 유전자 산물에 대한 내성을 제공한다. 따라서, 예를 들어, 특정 유전자 산물을 결여한 대상(예를 들어, 대상이 특정 단백질의 부재를 초래하는 유전적 결함을 가지는 경우)에게 유전자 요법이 투여되는 경우, 유전자 산물이 대상에게 도입될 때 이에 대한 원치 않는 면역 반응을 예방하기 위해 본 발명의 방법을 이용하여 상기 대상을 치료할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용된 유전자 요법 벡터는 어떤 병리학도 수반하지 않을 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 대상에게 반복적으로(즉, "만성적으로") 투여되는 물질 및 그에 대한 면역 반응이 바람직하지 않은 물질, 예를 들어, 다발성 경화증으로 고생하는 대상에게 종종 투여되는 베타 인터페론에 대한 내성을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 "관용"; 즉, 앞에서 기술한 바와 같이, 면역 내성을 유도할 수 있는(즉, "대상을 내성화하는") 수지상 세포("DC")를 제공한다. 수지상 세포의 관용 활성은 직간접적으로 평가될 수 있으며, 생체내 또는 시험관내에서 측정될 수 있고; 적당한 에세이가 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 시험관내 CD4+ T 세포 개체군과의 인큐베이션 후 조절 T 세포를 생산하는 능력 및/또는 CD14 또는 CD80과 같은 세포 표면 마커의 발현에 있어서 검출가능한 변화를 포함한다(참조: Steinman et al . (2003) Ann . Rev . Immunol . 21: 685-711; Kubach et al . (2005) Int . J. Hematol. 81: 197-203).
본 발명의 관용 수지상 세포에 의해 유도된 내성은 생체내 또는 생체외 유도될 수 있으며, DC에 의해 제공된 항원에 특이적일 수 있다. 용어 "면역자극성" DC는 본 명세서에서 "정상" 또는 천연 DC를 본 발명의 관용 DC와 구별하기 위해 사용된다. 관용 DC를 생산하기 위한 본 발명의 방법은 생체내 또는 생체외 수행될 수 있으며, 세포를 CD83 및 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물에 노출시키는 단계를 포함한다. 생체내 또는 생체외(시험관내)와 무관하게, 성숙 과정 중에 또는 성숙 과정이 완결된 후에 세포를 CD83 및 다른 면역억제 화합물(들)에 노출시킬 수 있다. 성숙 과정이 시험관내 수행되는 구체예에서, "노출된"은 세포가 CD83 및 다른 면역억제 화합물(들)의 존재하에 인큐베이션되거나, CD83 및 다른 면역억제 화합물(들)의 존재하에 배양(culture)될 수 있음(즉, 세포가 성장하고 분할될 수 있음)을 의미한다. 세포는 임의의 적당한 방식으로 CD83 및 다른 면역억제 화합물(들)에 노출될 수 있으며; 예를 들어, CD83 및 다른 면역억제 화합물(들)은 성장 배지에 첨가되거나, 가능한 경우, CD83 및 다른 면역억제 화합물(들)의 하나 이상이 이들을 암호화하는 RNA에 의한 형질감염 세포에 의해 배양액에서 발현될 수 있다.
일부 구체예에서, 관용 DC를 생산하는 방법은 생산 과정 중에(예를 들어, 최종 성숙 단계 중에) 미성숙 DC를 CD83 및 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물에 노출시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 이들 방법에서, 미성숙 수지상 세포는 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 50 또는 100 마이크로그램/배지 ml의 하한; 및 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 50, 100 또는 200 마이크로그램/배지 ml의 상한을 갖는 범위에서 CD83에 노출될 수 있다. 가장 바람직하게, DC는 1-10㎍/ml CD83의 존재하에 성숙된다. 다른 면역억제 화합물(들)의 복용량은 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "미성숙 DC"는 적합하게 배양되는 경우(시험관내의 경우) 또는 성숙되도록 허용된 경우(생체내의 경우) 성숙 수지상 세포가 될 수 있는 세포를 의미한다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 성숙 과정의 적어도 한 단계 중에 세포를 CD83에 노출시키고 성숙 과정의 적어도 한 단계 중에 세포를 다른 면역억제 화합물(들)에 노출시킴을 포함하며; 이들 단계는 동일 단계(들)이거나 상이하고/하거나 중첩되지 않는 단계(들)일 수 있다. 일부 구체예에서, 세포들은 성숙 과정의 적어도 한 단계 중에; 성숙 과정의 하나 초과의 단계 중에; 또는 성숙 과정의 전체 과정 중에 CD83 및/또는 다른 면역억제 화합물(들)에 노출된다.
본 발명의 관용 수지상 세포는 또한, 세포를 항원으로 "펄싱(pulsing)"하거나 세포를 RNA로 변환시킴으로써 제공하기 위한 항원을 로딩할 수 있다(참조: U.S. Pat. No. 6,387,701; U.S. Pat. No. 6,670,186; U.S. App. No. 10/362,715). 본 발명의 방법은 추가의 이점을 제공하기 위하여 당업계의 다른 방법과 조합될 수도 있다(참조: U.S. Pat. No. 5,831,068; U.S. App. No. 11/246,387). 본 발명의 방법을 이루는 단계들이 원하는 결과를 산출하는 임의의 순서로 수행될 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 예를 들어, 세포는 이들이 CD83 및/또는 다른 면역억제 화합물(들)에 노출되기 전 또는 후에 항원으로 로딩될 수 있다. 이런 방식으로, 본 발명의 방법은 성숙 과정 중에 CD83, 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물, 및 임의의 치료 조성물(예를 들어, 관심 있는 항원)을 세포에 병용투여함을 특징으로 하는 방법에 의해 관용 수지상 세포를 생산한다.
성숙 면역자극성 수지상 세포는 일반적으로 세포 표면 마커의 특징적 배열을 나타낸다. 따라서, 일반적으로, 성숙 면역자극성 DC에서는 CD14가 전혀 또는 거의 발현되지 않을 것이다. 또한, 일반적으로, 성숙 면역자극성 DC(생체내 생산된 천연 DC이든, 시험관내 생산된 DC이든)는, 예를 들어, 세포 표면 마커 CD80, CD83 및 CD86을 발현하고, IL-12를 분비하는 특성을 나타낼 것이다. 반면에, 일부 구체예에서는, 본 발명의 방법에 의해 생산된 관용 DC가 적어도 하나의 이들 특징적인 세포 표면 마커의 감소된 발현 수준을 나타낸다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 관용 DC 상의 특정 세포 표면 마커의 발현 수준은 적합한 대조군 세포(예를 들어, 천연 성숙 면역자극성 DC 또는 시험관내 성숙을 통해 얻어진 성숙 면역자극성 DC) 상의 동일한 세포 표면 마커의 발현 수준과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 만큼, 또는 검출할 수 없을 정도로 감소한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 관용 DC는 CD83의 검출불가능한 발현 및 CD80의 크게 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구체예에서, 본 발명의 관용 DC는 적합한 대조군 세포와 비교하여 각 마커에 대해 적어도 95% 감소된 CD83 발현 및 적어도 50% 감소된 CD80 발현을 나타낸다. 또한, 일부 구체예에서, 본 발명의 관용 DC는 성숙 면역자극성 DC에 비해 CD14의 발현이 더 높은 것으로 나타날 것이다. 관용 수지상 세포는 당업계에 공지된 기술(참조: WO 2004/046182)을 사용하거나 하기 실험섹션에 기술된 바에 따라 생산되고/되거나 기능이 에세이될 수 있다.
예를 들어, 1% 인간 혈장을 포함하는 표준 배지(예를 들어, 글루타민(200 ㎍/ml, BioWhittaker, Verviers, Belgium), 페니실린/스트렙토마이신(20 ㎍/ml), 10 mM Hepes, pH 7.5 (Sigma-Aldrich), 및 단일 공여자로부터의 1% 인간 혈장(56℃에서 30분간 인큐베이션하여 미리 열-불활성화시킨 것)으로 보충된 RPMI 1640 (BioWhittaker, Verviers, Belgium))를 사용하여 배양할 수 있다. 인간 PBMC는 Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)에서 침전시켜 버피 코트(buffy coat)로부터 분리하고, IgG(Cohn 분획으로부터의 10 ㎍/ml γ-글로불린; Sigma-Aldrich)로 코팅된 100 mm 배양 접시 상에 접종하고, 37 ℃의 5% CO2 조건하에 인큐베이션할 수 있다. 1시간 및 7시간 인큐베이션 후에, 비-부착 세포 분획을 제거하고 부착 세포를 사이토킨 GM-CSF (800 U/ml) 및 IL-4 (500 U/ml)가 보충된 1% 인간 혈장 배지에서 추가로 배양한다. 인큐베이션 기간 중의 제3일에 신선한 배지(400 U/ml 농도의 GM-CSF 및 500 U/ml 농도의 IL-4를 포함)를 첨가한다. 제4일 또는 제5일에, 비-부착 세포를 회수하고, 계수하고, 0.3-0.5 x 105 세포/ml의 밀도로 새 접시로 옮긴다. 최종 성숙 단계를 위해 1% 인간 혈장 배지를 TNF-α(1.25 ng/ml), GM-CSF(40 U/ml), IL-4(200 U/ml), 프로스타글란딘 E2(0.5 pg/ml; 참조: Lechmann et al . (2001) J. Exp . Med. 194: 1813-1821), 및 가용성 CD83(4 ㎍/ml)로 보충한다. 대안적으로, 최종 성숙 단계를 위하여, 성숙 칵테일에 IL-1β, TNF-α, PGE2, 및 가용성 CD83 (4 ㎍/ml)를 포함시킨다. 제8일에 세포를 FACS로 분석할 수 있다. 이 방법으로 성숙된 세포는 정상적으로 성숙된 DC(참조: WO 2004/046182)와 비교할 때, CD80(예를 들어, 96% 에서 66%로) 및 CD83 (예를 들어, 96% 에서 30%로)의 명백히 감소된 세포 표면 발현과 CD14 양성 세포에 있어서의 증가를 나타내었다. 다른 세포 표면 마커(예를 들어, MHC 클래스 I 및 II)의 발현은 유의적인 영향을 받지 않았다. 다른 구체예에서, 세포는 상기 설명된 프로토콜에 따라 성숙될 수 있지만, 가용성 CD83은 1일, 2일, 3일 또는 그 이상 후에 성숙 칵테일에 첨가될 수 있다.
CD83 및 다른 면역억제 화합물(들)에 노출된 수지상 세포를 다양한 방법으로 CD83 및 다른 면역억제 화합물(들)에 노출되지 않은 수지상 세포와 비교하여 그들의 관용성 또는 면역자극성을 평가할 수 있다. 적합한 에세이가 당업계에 공지되어 있으며(예를 들어, MLR 에세이); 일부는 또한 실험 섹션에 기재되어 있다. MLR 에세이의 대표적인 특징은 면역자극성 DC 및 증식 T 세포의 군집 형성이다. 에세이의 제1일에 가용성 CD83을 첨가하면 대표적인 세포 군집 형성을 강력하게 저해한다(참조: Lechmann et al. (2001) J. Exp . Med. 194: 1813-1821). 또한, 가용성 CD83은 농도-의존적인 방식으로 T 세포 증식을 자극하는 성숙 수지상 세포의 능력을 저해한다(참조: Lechmann et al. (2001), ibid).
일부 구체예에서, 관용 수지상 세포를 사용하여 조절 T 세포를 생산한다(참조: U.S.Pat. App. No. 10/661,804). 간략히, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 개체군으로부터 조절 T 세포를 생산할 수 있다. 이들 T 세포 개체군은 대상으로부터 분리하거나 배양할 수 있다. 예를 들어, 개체군을 세포 표면 마커로 분류하여 특정 세포의 농축 개체군을 포함하도록 한(예를 들어, CD4+ CD25+ T 세포 또는 CD4+ CD25- T 세포) T 세포의 부분개체군(subpopulation)도 사용할 수 있다. 그 다음, T 세포를 본 발명의 관용 수지상 세포, 즉, 예를 들어, 성숙 과정 중에 sCD83 및 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물에 노출된 수지상 세포와 배양하거나 인큐베이션한다. 조절 T 세포가 시험관내에서 생산되는 경우에, 관용 수지상 세포는 T 세포에 대해 동종이형이거나(allogeneic) 유전적 동계(syngeneic)일 수 있다. 일부 구체예에서, 관용 DC는 항원으로 로딩될 수 있다(예를 들어, 항원으로 펄싱하거나 항원-암호화 RNA로 형질감염시킴). 이러한 구체예에서, 관용 DC는 항원을 T 세포에 제공할 수 있다.
관용 T 세포의 생산 중에, T 세포를 1회 이상 관용 DC에 노출시키고/시키거나 관용 DC와 함께 배양할 수 있다. 예를 들어, T 세포를 수일 또는 수주간 DC와 함께 배양할 수 있으며, 혼합 배양에서 필요한 경우 DC를 보충할 수 있다. 일부 구체예에서, 배양은 치료량의 조절 T 세포가 얻어질 때까지 지속될 것이다. 얻어지는 결과를 개선하기 위하여 다른 배양 기술 및/또는 첨가제를 사용할 수 있으며; 예를 들어, 배양 배지는 IL-2와 같은 사이토킨도 포함할 수 있다.
일반적으로, 조절 T 세포는 IL-10 및/또는 TGF-β(참조: Walsh et al . (2004) J. Clin . Invest. 114: 1398-1403)를 분비하며; 이들 사이토킨의 분비를 확인하기 위한 에세이가 당업계에 공지되어 있다. 일부 구체예에서, 조절 T 세포는 혼합 림프구 반응을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 90%, 95% 또는 100% 만큼 저해할 것이다. 혼합 림프구 반응 에세이가 당업계에 주지되어 있다. 본 발명의 조절 T 세포는 항원-특이적일 수 있다. CD4+ CD25+ 조절 T 세포는 일반적으로 CD4, CD25 및 Foxp3을 포함한 특징적인 세포 표면 마커를 발현시키며; 세포 표면 마커에 대한 에세이가 당업계에 주지되어 있다.
용어 "벡터"는 폴리뉴클레오티드의 삽입(insertion) 또는 혼입(incorporation)에 의해 조작될 수 있는 당업계 공지의 플라스미드, 바이러스 또는 다른 비히클을 지칭한다. 이러한 벡터는 유전자 조작(즉, "벡터 클로닝")에 사용되거나, 삽입된 폴리뉴클레오티드("발현 벡터")를 전사하고/하거나 번역하기 위해 사용된다. 벡터는 일반적으로 세포에서의 증식을 위한 복제 개시점(origin of replication) 및 프로모터를 적어도 포함한다. 본 명세서에 설명된 발현 조절 요소(expression control element)를 포함한 발현 벡터 내에 존재하는 조절 요소는 적절한 전사 및 번역을 촉진하기 위해 포함된다(예를 들어, 인트론에 대한 스플라이싱 신호, mRNA의 프레임 내 번역을 허용하기 위한 유전자의 정확한 리딩 프레임의 유지, 종결 코돈 등). 본 명세서에서 사용된 용어 "조절 요소"는 최소한 그의 존재가 발현에 영향을 미칠 수 있는 하나 이상의 구성성분을 포함하며; 본 명세서에서 사용된 용어 "발현 조절 요소"는 핵산 서열의 발현을 조절하며 그에 작동적으로 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 지칭한다. 핵산 서열에 작동적으로 연결된 발현 조절 요소는 전사를 조절하며, 경우에 따라 핵산 서열의 번역을 조절한다. 따라서 발현 조절 요소는 경우에 따라 단백질-암호화 유전자 앞에 프로모터, 인핸서, 전사 터미네이터 및/또는 시작 코돈(예를 들어, ATG)을 포함한다. 벡터는 또한 추가의 구성성분, 예를 들어, 선도 서열(leader sequence) 및 융합 단백질 서열을 포함할 수 있다. "작동적으로 연결된"은 구성성분들이 의도된 방식으로 기능을 수행하게끔 허용하는 관계로 병치되어 있음을 지칭한다.
"프로모터"는 전사를 지시하기에 충분한 적어도 최소한의 서열을 의미한다. 본 발명에서 또는 본 발명과 함께 사용할 프로모터는 경우에 따라 항시성(constitutive)이거나 유도성(inducible)일 수 있다(참조: Bitter et al . (1987) Methods in Enzymology 153: 516-544). 유도성 프로모터는 외부 신호 또는 약제에 의해 활성화된다. 다른 프로모터 요소는 특이적 세포 타입, 조직 또는 생리학적 병태에 대한 프로모터-의존성 유전자 발현의 조절을 제공하기에 충분한 것을 포함할 수 있으며; 이러한 요소는 유전자의 5', 3', 또는 인트론 영역에 위치할 수 있다. 유용한 프로모터는 또한 특정 조건하에서만 활성인 "조건부 프로모터"를 포함한다. 예를 들어, 조건부 프로모터는 특정 약제(예를 들어, 화합물)가 존재하는 경우 불활성 또는 억제되어 있을 수 있으나, 약제가 더 이상 존재하지 않는 경우 활성 또는 억제되지 않은 상태일 수 있다.
본 명세서에서 "형질감염시키기" 또는 "형질감염"은 하나 이상의 외생적 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 진핵 세포 내로 도입하는 것을 지칭한다. 형질감염은 핵산 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 단백질이 발현될 수 있도록 하는 방식으로 도입됨을 포함한다. 형질감염 방법은 당업계에 공지되어 있으며 다양한 기술, 예를 들어, 전기 천공법(electroporation), 단백질-기제, 지질-기제, 및 양이온성 이온-기제의 핵산 전달 복합체를 사용하는 방법, 바이러스 벡터, "유전자 총" 전달, 및 다양한 기타 기술을 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에서, 세포(예를 들어, DC) 내로 도입된 폴리뉴클레오티드는 세포를 유전적으로 개질하지 않으며 안정적으로 유지되지도 않는다. 용어 "유전적으로 개질된" 또는 "형질전환된"은 외부 유전자 또는 핵산 서열이 포함 및/또는 발현되고 이에 따라 세포 또는 그의 후손의 유전자형이 개질되는 것을 의미하며; 일부 구체예에서는 세포의 표현형도 바뀌게 된다. "유전적으로 개질된" 또는 "형질전환된"은 또한 세포의 내생적 뉴클레오티드에 임의의 추가, 결실 또는 붕괴가 발생함을 지칭한다. 도입된 폴리뉴클레오티드가 안정적으로 유지되기 위해서는 통상 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포와 양립할 수 있는 복제 개시점을 포함하거나, 염색체외(extrachromosomal) 레플리콘(예를 들어, 플라스미드) 또는 핵 또는 미토콘드리아 염색체와 같은 세포의 레플리콘 내에 통합되는 것이 필요하다.
용어 "일시적으로 형질감염된"은 세포가 형질감염되었으나 유전적으로 개질되지 않았고 따라서 세포의 후손이 형질전환된 유전적 물질(예를 들어, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드)를 물려받지 않음을 지칭한다. 유전적 물질은 RNA일 수도 있고, 그것이 RNA로 전사되어 유전적 물질에 의해 암호화된 단백질이 발현될 수도 있다. 이러한 발현을 본 명세서에서는 "일시적인 발현"이라고 지칭한다. 보통은, 일시적인 발현은 형질감염된 유전적 물질이 염색체 내로 혼입되지 않음으로써 이루어진다.
본 발명의 일부 구체예에서, 수지상 세포는 RNA 전기 천공법을 사용하여 일시적으로 형질감염된다. RNA 전기 천공법은 당업계에 주지되어 있다. 일반적으로, mRNA는 염색체적으로건 염색체외적으로건 세포 게놈의 영구적인 부분이 되지 않는다. 목적하는 단백질을 일시적으로 발현하는데 사용될 수 있는 임의의 다른 방법도 본 발명의 범위 내에서 고려된다. 이 방법은 게놈의 영구적 변경을 포함하지 않으며(즉, 세포에 상속가능한 유전적 변화를 초래하지 않으며), 따라서 레트로바이러스 및 아데노바이러스와 같은 바이러스를 사용함에 따라 수반되는 불이익을 회피하게 된다.
필요한 경우, DNA에 의한 세포의 형질전환은 당업자에게 공지된 통상의 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포가 진핵세포인 경우, DNA 형질전환 방법은 예를 들어 칼슘 포스페이트 공침전법, 마이크로주사, 전기 천공법과 같은 통상의 기계적 방법, 리포좀으로 둘러싸인 플라스미드의 삽입, 및 바이러스 벡터를 포함한다. 진핵 세포는 또한 관심 있는 핵산을 암호화하는 DNA 서열 및/또는 본 명세서에 기술된 것과 같은 선택가능한 표현형을 암호화하는 제2의 외래 DNA 분자와 함께 형질전환될 수 있다. 또 다른 방법은 진핵 세포를 일시적으로 감염 또는 형질전환시켜 단백질을 발현하도록 진핵 바이러스 벡터, 예를 들어, 시미안 바이러스 40(SV40) 또는 소의 파필로마 바이러스를 사용하는 것이다. 형질전환 후에 통상의 방법에 따라 CD83을 분리하고 정제할 수 있다. 예를 들어, 발현 숙주(예를 들어, 세균)로부터 준비된 용해물을 HPLC, 크기-배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피 또는 다른 정제 기술을 사용하여 정제할 수 있다. 펩티드 합성기(예를 들어, Applied Biosystems, Inc., Model 430A (ABI, Foster City, Calif., USA) 등)를 사용한 화학적 합성에 의해서도 실질적으로 순수한 단백질을 얻을 수 있다. CD83은 하기 실험 섹션에 기재된 바에 따라서도 생산할 수 있다.
CD83 및 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물 또는 적어도 하나의 치료 조성물을 포함하는 본 발명에 따른 의약 또는 약제학적 조성물의 생산 및 이러한 의약 또는 약제학적 조성물의 사용은 통상의 약제학적 기술 방법에 따른 관용적인 방법으로 이루어질 수 있으며, 따라서 당업자에 의해 용이하게 제공된다. 당업자는 상이한 화합물 및/또는 증상에 대해 상이한 형태의 투여가 적합하리라는 것을 인정할 것이며, 가장 적합한 투여 방법을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들어, 건선은 피부 투여에 적합한 제형으로 국소 치료될 수 있는 반면, 전신홍반 루푸스는 복강내 주사에 적합한 제형을 대상에게 투여하여 치료할 수 있다. 당업계 기술을 가진 실무자는 화합물의 복용량 및 투여량을 조정하기 위한 기준 및 방법, 예를 들어, 생화학적 및 면역학적 에세이를 포함한 통상의 임상적 및 실험적 테스트에서 얻어진 결과의 평가에 정통하다. 경우에 따라, 의약의 구성성분은 분리되어 투여될 수 있다.
일반적으로 본 발명의 화합물은 다양한 증상 및 투여 경로 타입에 적합한 의약 형태를 제공하기 위하여 적당하고 약제학적으로 허용되는 보조제(adjuvant) 및/또는 담체와 함께 가공된다. 적당한 약제학적 조성물은 또한 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 보조제의 예는 문헌(Gennaro (1995) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Pub. Co., Easton, PA, U.S.)을 참조할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 신속한 홍수(flooding) 효과 또는 서방성 방출 효과와 같이 제각기 바람직한 방출율이 얻어지도록 의약을 생산할 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 치료 방법은 대상의 생체내에서 내성 및/또는 면역억제를 유도하기 위한 CD83 및 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물 및 임의로 치료 조성물(예를 들어, 항원)의 사용을 포함한다. 대상에 이러한 물질을 투여하는 수단은 통상의 생리학적으로 허용되는 경로, 예를 들어, 경구, 폐(pulmonary), 비경구(근육내, 관절내, 복강내, 정맥내(IV) 또는 피하 주사), 흡입(미세 분말 제형 또는 미세 분무(에어로졸)), 경피, 진피내, 비내, 질, 직장, 또는 설하의 투여 경로를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 이들 물질(즉, CD83, 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물, 및 임의로 치료 조성물)은 담체와 함께 투여될 수 있고, 동일 제형 내에서 동일 투여 경로를 통해 투여되거나, 상이한 제형 내에서 및/또는 상이한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 바람직하게, 각 물질은 병용투여에 따른 최적의 치료 효과를 얻기 위하여 최적의 복용량으로 투여된다. 예를 들어, 항체는 정맥내 주사를 통해 투여될 수 있는 반면, CD83은 복강내 주사를 통해 투여될 수 있고, 면역억제 화합물은 환제를 사용하여 경구복용될 수 있다.
담체는 임의의 적당한 생리학적 용액 또는 분산제 등을 포함한다. 생리학적 용액은 임의의 허용되는 용액 또는 분산 매질, 예를 들어, 식염수 또는 완충 식염수를 포함한다. 담체는 또한 항균 및 항진균제, 등장성 흡착 지연제 등을 포함할 수 있다. 임의의 통상적인 매질, 담체 또는 약제가 활성 성분과 양립할 수 있는 한, 그의 사용이 고려된다. 담체는 인터류킨-10(IL-10) 및 TGF-β와 같은 사이토킨을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 하나 이상의 부가적 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
약제학적 조성물이 특정 동물 종에 투여하기 위한 핵산을 포함하는 경우, 본 발명에서 사용하기 위한 핵산은 그 종으로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, CD83을 암호화하는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)를 포함하는 약제학적 조성물이 인간에게 투여되는 경우, 핵산은 CD83 단백질의 인간 형태 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 핵산은 세포막 투과성 및/또는 세포의 핵산 흡수를 증가시키는 약제와 함께 투여될 수 있다. 이러한 약제로는 문헌(예를 들어, Antony et al . (1999) Biochemistry 38: 10775-10784)에 기재된 폴리아민류; 문헌(예를 들어, Escriou et al. (1998) Biochem . Biophys . Acta 1368: 276-288)에 기재된 측쇄 폴리아민류; 문헌(예를 들어, Guy-Caffey et al. (1995) J. Biol . Chem . 270: 31391-31396)에 기재된 폴리아미노리피드류; 문헌(Feigner et al . (1987) Proc . Nat'l . Acad. Sci . USA 84: 7413-7417)에 기재된 DOTMA 및 문헌(예를 들어, Benimetskaya et al . (1998) Nucl . Acids Res. 26(23): 5310-5317)에 기재된 양이온성 포르피린류(porphyrins)를 들 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 조성물, 의약 및 치료 방법은 또한 본 발명의 방법에 따라 생산된 관용 DC 및 조절 T 세포를 포함하며, 대상의 생체내에서 내성을 유도하기 위한 이들의 용도를 포함한다. 본 발명의 관용 DC 및/또는 조절 T 세포를 대상에게 투여하는 수단은 통상의 생리학적으로 허용되는 경로, 예를 들어, 복강내, 정맥내(IV) 또는 피하 주사를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 본 발명의 세포(즉, 본 발명의 방법에 의해 생산된 관용 DC 및/또는 조절 T 세포)는 담체와 함께 투여될 수 있다. 이러한 담체는 임의의 적당한 생리학적 용액 또는 분산제 등, 예를 들어, 식염수 또는 완충 식염수를 포함한다. 담체는 또한 항균 및 항진균제, 등장성 흡착 지연제 등을 포함할 수 있다. 임의의 통상적인 매질, 담체 또는 약제가 활성 성분(즉, 관용 DC 및/또는 조절 T 세포)과 양립할 수 있는 한, 조성물에서의 그의 사용이 고려된다.
당업자에게 정통한 바와 같이, 생체내 투여하고자 하는 본 발명의 세포의 용량은 숙주종, 연령, 체중 및 질환 상태를 포함하는 다양한 변수를 참조하여 결정된다. 복용량은 숙주 내에서 목표로 하는 위치, 예를 들어, 공여자로부터의 조직 이식 부위에도 의존한다. 예를 들어, 삽입된 조직 부위를 직접적인 목표로 하는 경우는 포유류 숙주의 혈류 내로 투여하는 경우와 상이한 용량을 요구할 수 있다. 용량은 바람직하게는 투여가 유효한 결과를 유발할 수 있도록 선택되며, 이는 분자적 에세이 또는 대상의 적당한 증상에 대한 감시에 의해 측정될 수 있다. 용량은 투여당 약 적어도 1 x 104 세포 내지 약 적어도 1 x 109 세포의 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 용량은 약 5 x 105 세포 내지 약 5 x 107 세포 범위이다. 최대 치료 효과를 얻기 위하여, 몇가지 용량이 요구될 수 있다.
경우에 따라, 본 발명의 세포의 이전 투여가 이용될 수도 있다. 따라서, 예를 들어, 이식 조직의 생존 연장을 위해 세포를 사용하고자 하는 경우, 이식 1주 전과 같이 이식 전에 이식 수용자에게 세포를 투여할 수 있다. 이식 조직의 허용성 또는 거부의 결여를 확실히 하기 위하여 이식시 및 그 후에(예를 들어, 이식 후 1 내지 2주간, 또는 임상적 평가에 기초하여 필요한 기간) 투여될 수도 있다. 경우에 따라, 치료는 본 명세서에 기술된 1회 이상의 개별적 치료를 포함할 수 있고; 따라서, 예를 들어, 환자의 치료 과정은 sCD83 및 적어도 하나의 다른 면역억제 화합물의 투여를 포함할 수 있으며 관용 DC의 투여를 포함할 수도 있다.
본 명세서에 인용된 각각의 특허, 특허출원, 과학 논문, 책 또는 책의 장, 및 기타 문헌은 각각의 개별적인 인용이 특별히 개별적으로 원용에 의해 포함되는 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
도 1 (실시예 2 참조)은 세포가 유래된 마우스에 투여된 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌(KLH; key-hole limpet hemocyanin) 농도의 함수로서 T-세포 증식 에세이에서의 [3H]-티미딘 흡수를 보여준다. 간단히 설명하면, 동물을 sCD83으로 처리한 다음 KLH를 주사하였다; 28일 후, 비장 세포를 적출하고 상이한 용량의 KLH로 다시 자극하였다. sCD83으로 처리된 동물(다이아몬드) 뿐아니라 비처리된 대조군 동물(네모) 또는 BSA로 처리된 대조군 동물(세모)로부터 얻어진 세포에 대해 KLH 농도(㎍/㎖)의 함수로서 3H-티미딘의 혼입(incorporation)을 나타내었다.
도 2는 세포가 유래된 마우스에 투여된 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌(KLH) 농도의 함수로서 T-세포 증식 에세이에서의 [3H]-티미딘 흡수를 보여준다(실시예 3참조). 간단히 설명하면, 동물을 sCD83으로 처리한 다음 KLH를 주사하였다; 10일 후, 비장 세포를 제거하고 상이한 용량의 KLH로 다시 자극하였다. sCD83으로 처리된 동물(다이아몬드)로부터 얻어진 세포 뿐아니라 모의-접종된 대조군 동물(세모) 에 대해 KLH 농도(㎍/㎖)의 함수로서 3H-티미딘의 혼입(incorporation)을 나타내었다.
도 3은 세포가 유래된 마우스에 투여된 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌(KLH) 농도의 함수로서 T-세포 증식 에세이에서의 [3H]-티미딘 흡수를 보여준다(실시예 3참조). 간단히 설명하면, 동물을 sCD83으로 처리한 다음 KLH를 주사하였다; 22일 후, 비장 세포를 적출하고 상이한 용량의 KLH로 다시 자극하였다. sCD83으로 처리된 동물(다이아몬드)로부터 얻어진 세포 뿐아니라 모의-접종된 대조군 동물(세모) 에 대해 KLH 농도(㎍/㎖)의 함수로서 3H-티미딘의 혼입(incorporation)을 나타내었다.
도 4는 실시예 5에 기술된 실험 결과를 나타내며, 가용성 CD83("sD83")이 생체외 B-세포 증식을 억제함을 보여주고 있다.
도 5는 실시예 5에 기술된 실험 결과를 나타내며, sCD83이 이식조직 수용자(transplant recipient)의 B 세포에 의한 생체외 항체 생산을 억제함을 보여주고 있다. 별표는 p < 0.01을 나타낸다.
도 6은 실시예 7에 기술된 실험 결과를 나타내며, sCD83이 외래 항원에 대해 B 세포에 의한 동종-항체 반응의 유발을 예방할 수 있음을 보여주고 있다.
도 7은 실시예 8에 기술된 실험 결과를 나타내며, sCD83을 시롤리무스(sirolimus)("Rapa") 및 항-CD45RB mAb와 함께 병용투여함에 의해 이식된 심장 조직이 장기 생존함을 보여주고 있다.
도 8은 실시예 8에 기술된 실험 결과를 나타내며, sCD83을 시롤리무스("Rapa") 및 항-CD45RB mAb와 함께 병용투여함에 의해 이식조직 수용자에서 DC 성숙이 저해됨을 보여주고 있다. 별표는 p < 0.05를 나타낸다.
도 9는 실시예 8에 기술된 실험 결과를 나타내며, 도 9와 마찬가지로, sCD83을 시롤리무스("Rapa") 및 항-CD45RB mAb와 함께 병용투여함에 의해 이식조직 수용자에서 DC 성숙이 저해됨을 보여주고 있다. 별표는 p < 0.01을 나타낸다.
도 10은 실시예 8에 기술된 실험 결과를 나타내며, sCD83을 시롤리무스("Rapa") 및 항-CD45RB mAb와 함께 병용투여함에 의해 이식조직 수용자에서 조절 T 세포가 생성됨을 보여주고 있다. 별표는 p < 0.01을 나타낸다.
도 11은 실시예 9에 기술된 실험 결과를 나타내며, sCD83이 필리핀 원숭이(cynomolgus monkeys)로부터의 mDC에 의한 mDC 활성화 마커의 표면 발현 및 시험관내 TNF-α 생산을 억제함을 보여주고 있다.
도 12는 실시예 9에 기술된 실험 결과를 나타내며, sCD83이 시험관내 TNF-α 생산 및 단핵구 활성화 마커의 표면 발현을 적당히 억제함을 보여주고 있다.
도 13은 실시예 9에 기술된 실험 결과를 나타내며, sCD83이 조절 T 세포의 생성을 촉진함을 보여준다. 수직 축은 CD4+ CD25+ iFoxp3+ 세포의 퍼센트를 나타낸다.
도 14는 실시예 9에 기술된 실험 결과를 나타내며, 가용성 CD83으로 처리된 수지상 세포에 의해 조절 T 세포의 생성이 증가됨을 보여주고 있다.
이하, 본 발명의 다양한 측면이 실시예를 통해 좀더 특별히 기술된다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예에 의해 설명된 구체예로 한정되지 않으며, 전체적으로 본 명세서에서 좀더 충분히 기재하는 바와 같은 이점을 제공한다.
실험
일반적 방법
일반적 기술은 문헌(Current Protocols in Immunology, eds. Coico et al. (Wiley, Hoboken, NJ))을 참조한다.
웨스턴 블로팅 / 쿠마시 블루 염색: sCD83 평가의 전형적 방법은 다음과 같다. sCD83의 각 샘플에 대해, 1 마이크로그램의 sCD83을 완충 용액(running buffer) 및 2 마이크로리터의 β-머캅토에탄올과 함께 준비하였다. 샘플을 96도에서 10분간 가열한 다음 인비트로겐 4-12% 폴리아크릴아미드겔 상에서 전개하였다. 겔을 쿠마시 블루로 직접 염색하거나, 필요한 경우 막으로 이동시켰다. 막을 1/1000 CD83 4B5 단클론 1차 항체 및 그 후 1/20,000 염소 항-랫트 2차 항체로 탐침시키고; 아머샴 화학발광 시약으로 신호를 현상하였다.
영장류 혼합 림프구 반응(" MLR "): 2마리의 상이한 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey)의 혈액 샘플로부터 PBMC를 피콜(Ficoll) 구배 분리를 사용하여 분리하였다. 미토마이신 C 또는 방사능 처리를 통해 자극 세포를 비증식성이 되게 하였다. 자극 세포 및 반응 세포를 3 x 105 세포/웰이 되도록 접종하고 적정량(titrating amount)의 sCD83으로 처리하였다. 96시간에 3H-티미딘(1 μCi/웰)을 배양물에 가하였다. 세포를 18 내지 20시간 후에 수확(harvest)하고, 분석하여 T-세포 증식량을 결정하였다.
TNF -α, CD86 및 CCR5 의 염색: TNF-α(세포내) 및 CD86 및 CCR5(표면)에 대한 염색은 다음과 같이 수행하였다. 필리핀 원숭이로부터 총 혈액 샘플(whole blood sample)을 얻고, sCD83과 함께 12 시간 인큐베이션하였다. 샘플을 100 ng/mL LPS 및 100 U/mL IFN-γ로 6시간 자극하였다. TNF-α에 대한 세포내 염색은 상업적으로 구입가능한 Fix/Perm 키트를 사용하여 수행하였다. 교대로, CD86 및 CCR5에 대한 표면 염색은 표준 기술을 사용하여 수행하였다. 염색 후, 적혈구를 용해하고 결과를 BD 플로우 사이토미터(BD Flow Cytometer; Becton Dickinson)로 분석하였 다.
B 세포 증식 프로토콜: 마우스 비장 세포의 단일 세포 현탁액을 제조하고, ACK 용해 완충액을 사용하여 적혈구를 용해시켰다(참조: Current Protocols in Immunology, eds. Coico et al. (Wiley, Hoboken, NJ)). CD19 MACS 비드를 사용하여 B-세포를 정제하고, 105 세포/웰의 순수한 B-세포를 적정량의 sCD83과 3 시간 예비-인큐베이션하였다. 그 후, B-세포를 2 ㎍/mL LPS로 자극하였다. 48 시간에, 1 μCi의 3H-티미딘/웰을 배양액에 가하였다. 18 내지 20시간 후 세포를 수확하여 B-세포 증식량을 결정하였다.
시험관내 작업을 위한 항체 생산 프로토콜: IgM 및 IgG를 다음과 같이 생산하였다. 2 x 106 B-세포/웰(C57Bl/6 마우스 유래)의 순수한 개체군을 적정 농도의 sCD83(15 내지 90 ㎍/mL) 존재하에 20 ㎍/mL의 LPS(항체 생산을 유도하기 위한)와 함께 배양하였다. 배양 72 시간 후 상등액을 수확하고, 상등액 중의 IgM 및 IgG 생산을 ELISA로 측정하였다.
아이소타입 전환( Isotype Switching ): 2 x 106 B 세포/웰(C57Bl/6 마우스 유래)의 순수한 개체군을 하기 처리 중의 하나와 함께 배양하였다: 20 ㎍/mL의 LPS (IgG2b의 유도를 위함); 20 ㎍/mL LPS, 800 U/mL IL-4, 및 150 U/mL IL-5(IgG1의 유도를 위함); 또는 20 ㎍/mL LPS & 1000 U/mL IFN-γ(IgG2a의 유도를 위함). 각각의 처리에서, 일부 세포는 또한 60 ㎍/mL sCD83과 함께 배양하고, 일부는 비처리 대조군으로 지정하였다. 72 시간 후 세포를 수확하고, Fc 수용체 결합 면역글로불린을 제거하기 위하여 간단한 산 세척을 수행하였다. 그 후, 표면 IgG2b, IgG1 및 IgG2a를 각각 검출하기 위하여, 하기 중의 하나를 사용하여 세포를 염색하였다: 항-IgM-FITC 및 항-IgG2b-RPE; 항-IgM-FITC 및 항-IgG1-RPE; 또는 항-IgM-FITC 및 항-IgG2a-RPE.
생체외 작업을 위한 항체 생산 프로토콜: B 세포 증식: C3H 마우스로부터의 이소 심장 동종이식편(heterotopic cardiac allograft)을 C57Bl/6 마우스에 부여하였다. 그 후, 마우스를 미처리 상태로 놔두거나, 일일 용량 100 ㎍의 sCD83으로 복강내 주사 처리하였다. 미처리 마우스의 대략적인 평균 생존 기간인 8 일째에 마우스를 희생하였다. 마우스 비장으로부터 B-세포를 수확하고, 105 B-세포/웰의 순수한 개체군을 2 ㎍/mL의 LPS와 함께 배양하여 세포를 자극하였다(sCD83 미첨가). 48 시간 배양 후 3H-티미딘을 첨가하고, 18-20 시간의 추가 배양 후 세포를 수확하여 3H-티미딘 혼입을 측정하였다.
IgM 및 IgG 생산: C3H 마우스로부터의 이소 심장 동종이식편을 C57Bl/6 마우스에 부여하였다. 그 후, 마우스를 미처리 상태로 놔두거나, 일일 용량 100 ㎍의 sCD83으로 복강내 주사 처리하였다. 미처리 마우스의 대략적인 평균 생존 기간인 8 일째에 마우스를 희생하였다. 수용자 마우스 비장으로부터 B-세포를 수확하고, 2 x 106 B-세포/웰에서 20 ㎍/mL LPS와 함께 배양하였다(항체 생산을 유도하기 위함, sCD83 미첨가). 72 시간 배양 후 상등액을 수확하여 IgM 및 IgG 생산을 ELISA로 측 정하였다.
이식: 마우스주(mouse strain)의 선택 과정 및 기준은 당업계에 공지되어 있다(참조: Wang et al . (2003) J. Immunol. 171: 3823-3836).
실시예 1: 재조합 가용성 CD83 의 생산
세균주 및 플라스미드: GST와 융합된 CD83(sCD83)의 세포외 도메인을 암호화하는 cDNA를 포함하는 플라스미드 pGEX2ThCD83ext를 재조합 GST-hCD83ext를 생산하기 위한 발현 벡터로 사용하였고, 이를 IPTG-유도성 tac 프로모터의 조절하에 두었다(참조: Lechmann et al. (2002) Protein Expression and Purification 24: 445-452). GST 및 hCD83ext 사이 경계의 트롬빈 분해 부위의 디자인으로 인하여, 최종 sCD83 산물은 아미노 말단에 4개의 여분 아미노산(Gly-Ser-Pro-Gly)을 가진다.
GST - sCD83 의 배양: 알렉산더 스타인카세러 박사에 의해 친절하게 제공된 이.콜라이 생산 균주를 -80℃에서 냉동 보관하고, 50 ㎍/mL 암피실린(Amp)을 포함하는 LB 아가 플레이트(5 g/L NaCl, 5 g/L 박토 효모 추출물(Bacto yeast extract), 10 g/L 박토 트립톤, 및 15 g/L 박토 아가) 상에 도말(streaking)하여 소생시켰다. 플레이트를 약 15 시간 37℃에서 인큐베이션하였다. 몇 개의 분리된 단일 콜로니를 사용하여 50 ㎍/mL Amp를 포함하는 600-mL LB 배지에 접종하였다. 그 후, 배양액을 약 16 시간 200 rpm의 회전 진탕기 상에서 37℃로 인큐베이션하였다. 종균 배양(seed culture; 600 mL 이하)을 사용하여 1 내지 15 리터 작업 부피의 배양 배지 (5 g/L NaCl, 20 g/L 박토 효모 추출물, 20 g/L 박토 트립톤, 및 5 g/L 글루코즈) 를 포함하는 바이오리액터(MBR Bioreactor AG, Wetzikon, Switzerland)에 접종하였다. 세포가 2.0 ± 0.2 OD600의 지정된 세포 밀도까지 성장하였을 때, GST-hCD83ext 생산 유도를 위하여 배양액을 0.5 mM 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 보충하였다. 50 μL/L의 소포제 289(Sigma, St. Louis, MO, USA)도 배양액에 가하여 배양 중의 과도한 거품을 피하였다. 통기(aeration)를 위하여, 바이오리액터를 필터-멸균된 공기를 사용하여 1.5 vvm으로 퍼지하였다. pH 전극(Ingold Messtechnik AG, Zurich, Switzerland), pH 조절기(Model pH-40, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA), 및 2개의 연동 펌프(Watson Marlow, Falmouth, UK)를 조합 사용하여 3 N NH4OH 또는 3 N H3PO4를 가하여 배양액 pH를 7.00 ± 0.15로 유지하였다. 유도 후, 바이오리액터를 28℃ 및 600~650 rpm에서 6 시간동안 작동시켰다.
sCD83 의 다운스트림 프로세싱: 배양 후, 세포를 6000 x g 및 2℃에서 원심분리하여 수확하고, 무게를 재고, 추후 사용을 위하여 -80℃에 보관하였다. 보통, 8~10 OD600의 세포 밀도를 갖는 1 리터 배양액으로부터 약 20 g의 습윤 세포 무게(wcw)의 세포 페이스트가 얻어질 수 있으며, 이는 1 g wcw가 400~500 OD600-단위와 대략적으로 균등함을 의미한다. hCD83ext의 정제를 위한 용해물을 준비하기 위하여, 인산 완충 식염수(PBS, pH 7.3)에서 냉동 세포 페이스트의 대략적인 양을 현탁시켜 0.05 g-wcw/mL의 세포 현탁액을 준비하였다. 레귤러 팁(regular tip; Misonix, Farmingdale, NY, USA)으로 초음파 분쇄기(ultrasonic processor)를 사용 하여 100-mL 세포 현탁액 배치를 약 20~25 OD600에서 4분간 간헐적으로(0.5 초 작동/0.5 초 정지) 초음파처리 하였다. 처리된 세포 용해물을 15,000 x g 및 2℃에서 15분간 원심분리하여 세포 잔해를 제거하였다. 총 가용성 단백질을 포함하는 상등액을 단백질 정제를 위한 후속 크로마토그래피 처리 전에 0.45-㎛ 필터를 사용하여 여과하였다.
GST-CD83 융합 단백질을 GST 친화성 크로마토그래피로 포획하기 위하여, 상기 준비된 용해물 100 mL를 20-mL GSTrap 칼럼(GE Healthcare, Baie d'Urfe, Quebec, Canada)에 4 mL/분의 유속으로 로딩하였다. 칼럼에 결합되어 있는 동안, GST-hCD83ext 융합이 10 U/mL 트롬빈에 의해 인 사이투 분해되었다(즉, "칼럼상 분해"). 이를 위하여, GST-hCD83ext 융합에 의해 결합된 GSTrap 칼럼 내의 PBS 결합 완충액을 칼럼 내로의 수동 주입을 통해 10 U/mL 트롬빈을 포함하는 동부피의 결합 완충액으로 대체하였다. 주변 온도에서 약 2.5 h 동안 분해를 수행하고, 트롬빈으로 오염된 hCD83ext를 주로 포함하는 GSTrap 칼럼 내의 벌크 액체를 1 칼럼 부피의 결합 완충액을 사용하여 배출하였다. 나머지 분해되지 않은 GST-hCD83과 함께 GST 부분을 용출 완충액으로 용출시켰다. 칼럼상 분해의 양호한 성능을 유지하기 위하여 GSTrap 칼럼을 1M NaOH 및 6M 구아니딘 HCl로 세척하여 칼럼에 포획된 다양한 단백질 불순물을 제거하였다.
CD83으로부터 트롬빈 및 기타 불순물 단백질을 제거하기 위하여 연마(polishing) 단계를 수행하였다. 비록 이 정제 단계를 수행하는데 HPLC 시스템도 사용될 수 있지만, 이 프로세싱을 위하여 강력한 음이온-교환 칼럼(30-mL HiTrap Q HP in XK16/20, GE Healthcare)이 장착된 FPLC 시스템(AKTApurifier UPC 10, GE Healthcare)을 사용하였다. 사용된 로딩 및 용출 완충액은 각각 50 mM NaCl를 포함하는 트리스 완충액(20 mM, pH 7.5) 및 1 M NaCl을 포함하는 트리스 완충액이었다. 먼저, FPLC 시스템의 음이온-교환 칼럼을 로딩 완충액으로 평형화하였다. 그 다음, 상기 방법으로 GSTrap 칼럼으로부터 용출된 단백질 용액을 칼럼에 로딩하였다. hCD83ext 함유 분획을 용출시키고, 모으고, 고압의 교반된 셀을 사용하는 한외여과(Amicon, Model 8050 with YM10 disk, Millipore Canada, Cambridge, Ontario, Canada) 또는 유사한 한외여과 단위를 사용하여 농축한 다음, -20℃에 저장하였다. 축적된 양이 추가의 내독소 제거를 위한 프로세싱에 충분하게 될 때까지 매일 상기 산물 축적(product accumulation)을 수행하였다.
추가의 내독소 제거를 위해, 약 1 g의 축적된 sCD83을 연마 단계를 위한 동일한 실험 설정(set-up) 및 프로토콜을 사용한 음이온-교환 크로마토그래피로 처리하였다. 이 프로세싱 단계를 위한 모든 완충액은 주사용수(WFI)를 사용하여 제조하였다. hCD83ext 함유 분획을 모으고 고압의 교반된 셀을 사용한 한외여과로 농축시켰다. 최종적으로, CD83 산물 분획은 추가로 무스탕 E 필터(Pall Life Sciences, Mississauga, Ontario, Canada) 또는 내독소 제거를 위한 유사 여과 단위를 사용하여 여과한 다음 여과-멸균될 수 있다. 각 산물 분획의 내독소를 에세이하였다.
분석 프로토콜: 배양액 시료를 식염수 용액으로 적절히 희석한 다음 분광 광 도계(DU?520, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)를 사용하여 OD600으로 세포 밀도를 측정하였다. 분석용 세포 추출물을 준비하기 위하여, 40 OD600-단위('OD600 x mL'로 정의됨)의 세포를 6000 x g, 2℃에서 10분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 3 mL PBS에 재현탁시키고, 프렌치 프레스(Thermo Electron Corporation, USA)로 분쇄한 다음, 15,000 x g, 2℃에서 15분간 원심분리하여 세포 잔해를 제거하였다. 세포 분쇄는 다른 물리적(예를 들어, 초음파) 또는 화학적 방법을 사용해서도 이루어질 수 있다. 가용성 단백질을 포함하는 상등액을 사용하여 GST 에세이 및 SDS 겔을 수행하였다. 불용성 단백질 및 세포 잔해를 포함하는 펠렛을 인산 완충액으로 세척하고, TE/SDS 완충액(10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1% SDS)에 재현탁시키고, 100℃까지 5분간 가열하여 용해시켰다. 펠렛의 단백질 함량을 불용성 분획으로서 분석하였다.
GST 기능은 1-클로로-2,4-디니트로벤젠(CDNB) 및 글루타치온을 기질로 사용하여 주변온도에서 에세이하였다. GST(및 그의 융합 단백질)는 2개 기질 사이의 반응을 촉매하여 340 nm에서 검출될 수 있는 접합체(conjugate) 산물을 형성한다. 1 단위(UGST)는 1 OD340/분으로 흡광도를 증가시키는 효소의 양으로 정의된다. 부피 활성(volumetric activity)(UGST/mL)는 비활성(UGST/OD600-단위)과 세포 밀도(OD600)의 곱이다. 내독소는 상업적인 에세이 키트(LAL QCL-1000, Cambrex Bio Science Inc., Walkersville, MD, USA)를 사용하여 에세이하며; 부피 내독소 농도(EU/mL)는 비(specific) 내독소 농도(EU/mg)와 단백질 농도(mg/mL)의 곱이다. 4% 폴리아크릴아미드 스태킹 겔(stacking gel)에 의해 스태킹된 12.5% 폴리아크릴아미드 분리 겔을 사용하여 Mini-PROTEAN?II 전기영동 셀(Bio-Rad, Hercules, CA)에서 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하였다. 세포 추출물의 단백질 시료(0.12 OD600-단위의 가용성 및 불용성 분획 양쪽 모두)와 적절한 양의 정제 산물을 로딩하였다. 200 V의 일정한 전압에서 약 45분간 전기영동을 수행하였다. 겔을 쿠마시 블루 또는 질산은으로 염색하여 건조시키고 스캔하여 처리된 시료로부터 내독소가 제거되었는지를 확인하였다. 정제 단백질을 냉동시키고, -20℃ 또는 -80℃의 PBS(인산 완충 식염수)(pH 7.5)에서 보관하였다.
실시예 2: 가용성 CD83 은 자가면역 질환의 마우스 모델에서 포괄적 면역억제를 유도하지 않는다
실험적 자가면역 뇌척수염("EAE")은 침범된 조직의 농후한 자가면역 CD4+ 림프구 침윤과 같이 전신홍반 루푸스("SLE")와 일부 병리학적 특성을 공유하는 질환인 다발성 경화증의 동물 모델로서 작용한다. 가용성 CD83이 EAE의 유발에 의해 초래된 마비를 감소시킬 수 있는 것으로 보고되었다(참조: Zinser et al. (2004) J. Exp. Med. 200: 345-351). 이 마우스 질환 모델과 연계하여 CD83에 의해 유발된 면역억제가 특이적인지 또는 포괄적 면역억제인지를 결정하고자 하였다.
EAE를 유발하기 위하여, 마우스를 중추신경계의 신경세포를 둘러싸는 수초의 구성성분인 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(myelin oligodendrocyte glycoprotein; MOG) 유래의 펩티드, 및 백일해 독소로 면역화하였다(참조: Zinser et al. (2004) J. Exp . Med. 200: 345-351). 10일 후부터 시작하여, 10일간 매일 마우스에 가용성 CD83(100 ㎍)을 접종하였다. 가용성 CD83을 마지막으로 주사하고 28일 후, 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌("KLH," 10 ㎍/마우스)을 마우스에 피하주사하였다. 10일 후, 비장세포를 마우스로부터 적출하고 상이한 용량의 KLH로 다시 자극시켰다. 이 자극에 따른 반응결과인 림프구 증식을 [3H]-티미딘 혼입에 의해 측정하였다. 그 결과(도 1 참조), 이들 마우스로부터의 림프구가 KLH에 반응하여 증식되었으며, 이는 동물들이 면역적격(immunocompetent)이며 가용성 CD83이 오래 지속되는 포괄적 면역억제를 유발하지 않음을 입증하고 있다.
실시예 3: CD83 유효성 시간대의 종점의 특성조사
마우스를 대상으로 하여 CD83 투여 후 대상이 추가 투여된 항원에 대해 내성을 나타내는 기간을 결정하였다. 가용성 CD83(100 ㎍)을 이틀마다 10회 CBA 마우스에 주사 투여하였다. 11일 후, 처리된 동물을 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌(KLH, 10 ㎍)으로 면역화하였다. 10일 후 비장세포를 적출하고, 그 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된 국제특허공개 WO 2004/046182에 기재된 바에 따라 재자극 에세이를 수행하였다. 그 결과(도 2 참조), 상기 면역화 간격에서 대상은 항원에 대해 내성화되지 않았다.
또 다른 유사한 실험을 수행하였으며, 여기에서는 22일 후 처리 동물로부터 비장세포를 적출하고 재자극 에세이를 통해 평가하였는데; 상기 기술한 것과 유사한 결과를 얻었으며 도 3에 나타내었다.
실시예 4: 쥐과 골수 전구 세포로부터 관용 DC 의 생산
1 내지 4월령의 C57/BL6 마우스 및 BALB/C 마우스(수컷 또는 암컷; Charles River, Wiga, Sulzfeld, Germany)를 사용하였다. 골수 유래 수지상 세포("BM-DCs")를 문헌(참조: Lutz et al . (1999) J. Immunol . Meth . 223: 77)에 기술된 바에 따라 발생시켰다. RPMI 1640(Life Technologies, Karlsruhe, Germany)을 100 U/ml 페니실린(Sigma), 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(Sigma), 2 mM L-글루타민(Sigma), 50 ㎍/ml ME(Sigma), 및 10% 열-불활성화되고 여과된 FCS(PAA, Colbe, Germany)로 보충하였다. 인큐베이션 기간의 제0, 3, 6 및 8일에 GM-CSF를 200 U/ml (PrepoTech/Tebu, Rocky Hill, N.J.)로 사용하였다.
동종 MLR 에세이를 다음과 같이 수행하였다: BALB/C 마우스의 서혜 및 중간엽 림프절로부터 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 분리하고, BM-DC에 대한 준비 프로토콜의 제9일까지 처리된 BM-DC(상이한 비율로)와 함께 3일간 배양하였다(2 x 105 세포/웰). 96-웰 배양 접시에서 배양하였으며, 배지는 100 U/ml 페니실린, 100 pg/ml 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 50 ㎍/ml ME, 및 10% 열-불활성화되고 여과된 FCS로 보충된 200 마이크로리터의 RPMI 1640이었다. 세포를 [3H]-티미딘(1 μCi/웰; Amersham Pharmacia Biotech)로 16 시간 펄싱하였다. 이노테크 1H-110 수확기(Inotech, Dottikon, Switzerland)를 사용하여 유리 섬유 필터 상에서 배양액 상등액을 수확하고, 왈락 1450 마이크로플레이트 계수기(Wallac, Turku, Finnland)에서 필터를 계수하였다.
동종 MLR 에세이 결과, 마우스 면역자극성 수지상 세포와 마우스 T 세포 사이의 군집 형성이 가용성 CD83(여기에서는 hCD83ext)에 의해 저해되는 것으로 나타났다. 또한, 가용성 CD83은 농도 의존적인 방식으로 쥐과 면역자극성 수지상 세포가 T 세포를 자극하는 것을 저해하여 T 세포가 DC에 대한 노출에 반응하여 증식하지 않도록 하였다.
실시예 5: sCD83 는 생체외 B-세포 증식 및 기능을 억제한다
B-세포에 대한 sCD83의 효과를 다음과 같은 일련의 실험에서 측정하였다.
이식 수용자 B-세포의 증식에 대한 sCD83의 생체외 효과: C3H 마우스 심장을C57BL/6 마우스 복강 내에 이식하였다. 이식 8일 후(통상 비처리 마우스에서 이식이 거부될 때), 마우스를 희생하였다. 수용자 마우스로부터 B 세포를 정제하고, 배양하고, LPS로 자극하였다. 3H-티미딘 혼입을 분당 계수(cpm)로 측정하였다. 도 4의 결과는 sCD83이 생체외 B-세포 증식을 억제함을 나타낸다.
B 세포에 의한 생체외 항체 생산에 대한 sCD83의 효과: C3H 마우스 심장을 C57BL/6 마우스 복강내에 이식하였다. 이식 8일 후(통상 비처리 마우스에서 이식이 거부될 때), 마우스를 희생하였다. 수용자 마우스로부터 B 세포를 정제하고, 배양하고, LPS로 자극하였다. 배양 72시간 후, 상등액을 회수하고 ELISA를 이용하여 IgM 및 IgG 생산을 측정하였다. 도 5의 결과는 sCD83이 생체외 항체 생산을 억제함을 나타낸다.
실시예 6: 사이클로스포린, 타크롤리무스 또는 MMF 와 병용투여된 sCD83 은 동종이 식편 이식 수용자에서 심장 이식편 생존을 증가시킨다
상기와 같이 공여자 마우스로부터 심장을 적출하여 수용자 마우스의 복강 내(즉, 복강 내(intra-abdominal), 이소 심장 이식)에 이식하였다. 수용자 마우스를 상기와 같이 처리하였으며, 일부 처리는 이식 전에 시작하였다. 각 처리에 대해 이식 조직의 평균 생존 기간을 결정하였다.
C57BL/6 공여자 마우스 및 BALB/c 수용자 마우스를 사용하였다. 각 처리 그룹에 대해 이식 조직의 처리 및 생존을 표 1에 나타내었다. 이 세트의 실험에서, "제-1일"(즉, 이식 전일) 부터 제7일까지 100 ㎍의 sCD83를 매일 복강 내 주사하여 sCD83 처리를 시작한 다음, 제28일까지 하루 걸러씩 지속적으로 주사하였다. 여기에서, "제-1일"은 일반적으로 "제0일"로 지칭되는 이식일의 전일을 지칭한다. 사이클로스포린은 치료 용량 이하의 저용량(5 mg/kg/일) 또는 고용량(15 mg/kg/일)으로 매일 피하주사하여 처리하였다. 타크롤리무스는 8 mg/kg/일의 치료 용량 이하 저용량으로 매일 경구 투여하여 처리하였고, MMF는 80 mg/kg/일의 저용량으로 매일 경구 투여하여 처리하였다. 그 결과, 사이클로스포린, 타크롤리무스 또는 MMF와 병용 투여된 sCD83은 동종이식편 이식 수용자에서 심장 이식편 생존을 증가시키는 것으로 입증되었다.
표 1: 사이클로스포린, 타크롤리무스 또는 MMF 와 병용투여된 sCD83 은 BALB /c 수용 자에서 C57BL /6 심장의 심장 이식편 생존을 증가시킨다
C57BL/6 to BALB/c 개별 생존 (일) MST (일)
비처리 8, 8, 9, 9 8.5 ± 0.6
sCD83 15, 15, 16, 17 15.8 ± 1.0
CsA (5 mg/kg, historical) 9, 10, 10, 10, 10, 11, 11 10.1 ± 0.3
sCD83 + CsA (5 mg/kg) 18, 21, 23, 25 21.8 ± 3.0
CsA (15 mg/kg, historical) 14, 15, 15, 16, 16, 17 15.5 ± 1.1
sCD83 + CsA (15 mg/kg) 28, 35, 40, 41, 42 37.2 ± 5.8
타크롤리무스 13, 14, 14, 15, 16, 18, 19, 21 16.3 ± 1.0
sCD83 + 타크롤리무스 20, 27, 28, 30, 32, 35 28.7 ± 5.1
sCD83 + MMF 20, 22, 23, 26, 27, 28 24.3 ± 3.1
추가 실험에서, 이식 수용자를 더 짧은 과정의 투여 및 상이한 투여 경로로 처리하였다. 마우스는 일반적으로 상기와 같이 처리하였으며; C57BL/6 공여자 마우스로부터 심장을 적출하여 BALB/c 수용자 마우스의 복강 내에 이식하였다. 마우스당 1일 100 ㎍ 용량의 가용성 CD83과 1일 kg 당 15 mg 용량의 사이클로스포린을 제-1일에서 제7일까지 수용자 마우스에게 정맥내 투여하였다. 이식 조직의 평균 생존 기간은 100일을 넘었다.
실시예 7: sCD83 은 이식 수용자에서 동종항체 유도를 저해한다
비-조직적합성 개체 사이의 조직 이식은 이식 거부를 자극한다. 거부 과정은 세포성 및 체액성 면역 반응의 양쪽을 모두 포함할 수 있다. 이식 기관의 급성 거 부는 공여자-특이적 동종항원(즉, 외래 조직적합성 항원)에 지향된 항체 반응에 의해 매개될 수 있다. 또는, 동종항체 반응이 세포 매개성 반응에 의해 촉진된 공여자 조직 파괴로 인한 결과로서 유도될 수 있다. 어느 경우든, 수용자에서의 동종항체 반응의 존재를 공여자-유래 세포에 결합할 수 있는 수용자 혈청 내의 항체 역가를 통상 공여자-유래 비세포(splenocyte)의 염색에 의해 측정함으로써 검출할 수 있다. sCD83이 이식 실험에서 이식편의 생존 기간을 증가시켰으므로, sCD83이 이식 수용자에서 동종항체의 유도에 영향을 미치는지 여부를 결정하고자 하였다.
이 실험에서, 이식 수용자(대조군-처리된, sCD83-처리된 및 처리되지 않은 개별적 동물)로부터 혈청을 수집하였다. 이식 공여자(들)로부터 비세포를 적출하고 이식 수용자 혈청과 함께 인큐베이션하였다. 이식 공여자 비세포의 표면에 동종-항혈청으로부터의 항체가 결합하는지를 마우스 IgM 및 IgG의 Fc-단편에 특이적인 항체를 선택적으로 사용하여 감시하였다. 이 과정의 이점은 Ig가 여분의(extra)-세포 공급원(즉, 수용자 혈청)으로부터 유래된다면 Fc-단편 만을 이용할 수 있기 때문에 공여자 세포(예를 들어, 공여자 비세포 개체군 내의 B-세포)로부터 수동적으로 발현된 쥐과 항체를 측정하지 않는다는 것이며; 공여자 B-세포 표면 상의 공여자-유래 Ig의 Fc-단편 등이 Fc-수용체 내에 박히거나 세포 내에 체류함으로써 염색이 되지 않을 것이라는 점이다. 염색된 세포를 FACS를 사용하여 분석할 수 있다.
이식 절차 중에, C3H 마우스로부터 심장을 적출하여 C57BL/6 마우스에 이식한 다음, sCD83로 처리하거나 비처리하였다. 이식 8일 후(통상 비처리 마우스에서 이식이 거부(즉, 완전한 조직 거부)될 즈음의 시간), C57BL/6 이식 수용자로부터 혈청을 수집하였다. 이 수용자 혈청을 사용하여 C3H 공여자로부터의 비세포를 염색하였으며, 항-IgG 또는 항-IgM Fc-단편에 특이적인 FITC-접합 항체로 동종항체 결합을 검출하였다. 그 결과, sCD83으로 처리된 이식 수용자는 동종항체 활성이 낮은 것으로(즉, IgM 또는 IgG의 공여자-특이적 결합이 적은 것으로) 나타났으며, 이는 비수용(naive) 마우스(즉, 이식편을 수용하지 않은 마우스)로부터의 혈청 수준과 균등하였다(도 6 참조). C3H 심장 이식을 수용하고 sCD83으로 처리된 C57BL/6 마우스는 낮은 동종항체 활성을 나타내었는데, 이는 이식되지 않은 비수용 C57BL/6 마우스 유래의 혈청과 균등하였다. 대조적으로, 비처리되어 이식 조직이 거부된 이식 수용자로부터는 대조군보다 유의적으로 높은 수준으로 존재하는 동종항체가 검출되었다. 비처리 이식 수용자로부터의 혈청은 또한 C3H-공여자-유래 비세포를 대조군 수준 이상으로 염색할 수 있었다. 실험 결과, sCD83은 외래 항원(예를 들어, 이식 조직)에 대하여 B 세포에 의한 공여자-특이적 항체 생산을 억제하며 기관 거부를 예방할 수 있는 것으로 입증되었다.
실시예 8: 시롤리무스 및 CD45RB mAb 와 병용투여된 sCD83 은 동종이식편 이식 수용 자에서 심장 이식편의 장기간( long - term ) 생존을 달성한다
상기와 같이 공여자 마우스로부터 심장을 적출하여 수용자 마우스의 복강 내에 이식하였다(즉, 이소 이식). 수용자 마우스를 상기와 같이 처리하였으며, 일부 처리는 이식 전에 시작하였다. 동종 이식편의 생존을 감시하여 다음과 같이 등급을 매겼다: "A" 강한 박동(beating), "B" 박동(pulsation) 강도의 완만한 감소, "C" 박동 강도의 상당한 감소, "D" 심장 충격(impulse)의 완전한 정지. 각 처리에 대해 이식 조직의 평균 생존 기간을 결정하였다.
첫번째 세트의 실험에서, CH3 공여자 마우스 및 BALB/c 수용자 마우스를 사용하였다. 각 처리 그룹에 대해 이식 조직의 처리 및 생존을 표 2에 나타내었다. 이 세트의 실험에서, sCD83 처리를 제-1일(즉, 이식 전일)에 시작하여 제28일까지 지속하였으며, 100 ㎍의 sCD83를 매일 각각의 마우스에 복강 내 주사하였다. 시롤리무스 처리는 제0일(즉, 이식일)에 시작하여 제14일까지 지속하였으며, 2 mg/kg의 시롤리무스를 매일 각각의 마우스에 경구 투여하였다. 항-CD45RB 처리는 제0일에 시작하여 제14일까지 지속하였으며; 100 ㎍의 항-CD45RB(BioExpress, Inc., West Lebanon, New Hampshire)를 매일 각각의 마우스에 정맥 내 투여하였다.
표 2: 시롤리무스 및 CD45RB mAb 와 병용투여된 sCD83 은 BALB /c 수용자에서 C3H 심장의 심장 이식편의 장기간 생존을 달성한다
C3H-to-BALB/c 개별 이식 생존 (일) MST (일)
비처리 8, 8, 8, 9 8.3 ± 0.5
시롤리무스 12, 23, 25, 25 21.3 ± 6.2
항-CD45RB mAb 12, 15, 21 16.0 ± 4.6
sCD83 9, 9, 10, 12 10.0 ± 1.4
항-CD45RB mAB + 시롤리무스 31, 33, 36 33.3 ± 2.5
sCD83 + 시롤리무스 52, 53, 62 55.7 ± 5.5
sCD83 + 항-CD45RB mAb 35, 37, 38 36.7 ± 1.5
sCD83 + 시롤리무스 + 항-CD45RB mAB > 100 (x 4) > 100
추가 세트의 실험에서, C3H 마우스 심장을 C57BL/6 마우스의 복강 내에 이식하였다(결과는 표 3 및 도 7에 나타냄). 처리하지 않은 경우, 심장 이식편은 혈관 염, 출혈, 혈전증 및 CD4+ CD8+ 세포의 침윤의 특징을 갖는 급성 세포성 및 체액성 거부에 의해 8.5 ± 0.6일에 거부되었다. 또한, 수용자의 혈액 뿐아니라 이식 조직에서 고 수준의 IgG 및 IgM이 검출되었다. sCD83 단독 처리(즉, 제1일부터 제7일까지는 매일, 제8-16일 동안은 하루 걸러씩(q.o.d.) 100 ㎍의 sCD83을 복강 내 주사)는 급성 거부 증상을 감소시키고 심장 이식편 생존을 10.7 ± 1.5일까지 증가시켰으며; 400 ㎍의 sCD83에 의한 동일 처리는 심장 이식편 생존을 15 ± 1.0일까지 두배로 증가시켰다. 다른 처리로는 항-CD45RB 단클론항체("mAb")(즉, 제0일부터 제14일까지 매일 정맥 내 주사로 마우스당 100 ㎍) 또는 시롤리무스(즉, 제0일부터 제14일까지 매일 2 mg/kg 경구 투여("p.o."))를 치료 용량 이하의 저용량으로 투여하는 것을 들 수 있다. 이들 실험에서 치료 용량 이하의 저용량은 균등한 인간 용량에 기초하였다.
예기치 않게, 주사 당 100 ㎍의 저용량 sCD83이 항-CD45RB mAb 또는 시롤리무스의 치료 용량 이하의 저용량과 함께 상승적 효과를 나타내었으며; sCD83과의 조합 처리는 각각 이식편 생존을 32 ± 3.6일 및 39.3 ± 4.7일까지 추가로 개선하였다. 항-CD45RB mAb 및 시롤리무스의 조합 처리는 생존을 50.3 ± 3.1일까지 증가시켰다. 놀랍게도, 항-CD45RB mAb 및 시롤리무스 양쪽과 배합된 sCD83은 급성 거부를 효과적으로 예방하였으며, 100일 초과의 무한정한(indefinite) 생존으로 이식편 내성을 유도하였다(p<0.01 대 항-CD45RB mAb 및 시롤리무스와의 조합 처리). sCD83, 항-CD45RB mAb, 및 시롤리무스의 조합에 의해 처리(즉, 삼중 처리)된 마우 스로부터의 이식 심장을 수술 후 100일("POD100")에 조사한 결과, 혈관병증이 없는 정상적 조직학을 보여주었다. 이 실험 결과, 시롤리무스 및 항-CD45RB mAB와 sCD83의 병용투여를 포함하는 처리는 이식 심장 조직의 장기간 허용(acceptance)을 유도하였음이 입증되었다.
표 3: 시롤리무스 및 항- CD45RB mAb 와 조합된 sCD83 은 C57BL /6 수용자에서 C3H 심장의 심장 이식편의 장기간 생존을 달성한다
C3H-to-C57BL/6 개별 생존 (일) MST (일)
비처리 8, 8, 9, 9 8.5 ± 0.6
시롤리무스 15, 16, 19 16.7 ± 2.1
항-CD45RB mAb 14, 15, 15, 17 15.3 ± 1.3
sCD83 (100 ug)
sCD83 (266 ug)
sCD83 (400 ug)		 9, 11, 12
14, 15, 15
14, 15, 16		 10.7 ± 1.5
14.7 ± 0.6
15.0 ± 1.0
항-CD45RB mAB + 시롤리무스 46, 50, 52, 53 50.3 ± 3.1
sCD83 + 시롤리무스 34, 41, 43 39.3 ± 4.7
sCD83 + 항-CD45RB mAb 28, 33, 35 32.0 ± 3.6
sCD83 + 시롤리무스 + 항-CD45RB mAB > 100 (x 4) > 100
일반적으로, 본 발명은 임의의 특정 작동 기전에 의해 제한되지 않지만, C3H 조직의 BALB/c 마우스로의 이식은 항체-매개성 거부에 대한 모델 시스템이 될 것으로 생각되는 한편, C3H 조직의 C57BL/6 마우스로의 이식은 T-세포 매개성 거부에 대한 모델 시스템이 될 것으로 생각된다. sCD83 단독 및 다른 물질과 병용투여된 요법은 양쪽 시스템에서 이식편 생존을 개선하였는데, 이는 sCD83이 T-세포에 의해 매개된 것 뿐아니라 B-세포에 의해 매개된 원치 않는 면역 반응을 억제할 수 있음을 입증한다. 즉, sCD83은 C3H-to-BALB/c 마우스 심장 이식 모델에서 체액성 이식 편 거부를 억제할 수 있으며, 또한 C3H 에서 C57BL/6 마우스로의 심장 이식 모델에서 급성 세포성 이식편 거부를 억제할 수 있다.
sCD83, 항-CD45RB mAb, 및 시롤리무스의 삼중-처리된 수용자 마우스에서 관용 DC(즉, CD11c+ MHCIIlow CD40low CD86low IL-12- 세포) 및 조절 T 세포(CD4+ CD25+ Foxp3+ 세포)의 발생에 대한 처리 효과를 결정하기 위하여 조사하였다. 이들 마우스를 수술 후 100일에 조사하였을 때 관용 DC 및 조절 T 세포 모두 양적으로 증가된 것으로 밝혀졌다(도 8, 도 9 및 도 10에 나타낸 유세포 분석기 결과 참조). CXCR6 마커가 미성숙 DC의 특징인 반면, CXCR4 및 CCR7 마커는 성숙 DC의 특징이다. 도 9 및 10의 별표는 p < 0.01로 상이한 결과를 나타낸다. 따라서, 이러한 결과는 sCD83에 기초한 요법이 관용 DC 및 조절 T 세포 모두의 발생을 유도함을 입증한다.
실시예 9: sCD83 은 시험관내 TNF -α 생산 및 mDC 활성화 마커의 표면 발현을 억제한다
말초 혈액 DC, 단핵구 및 T 세포 상의 인간 sCD83의 시험관내 기능적 성질을 조사하고자 하였다. 4가지 색 염색으로 FACS를 사용하여 필리핀 원숭이로부터의 성숙 DC("mDCs")를 HLA-DR 양성, 직계성(lineage) 음성(즉, CD3, CD20, CD14, 및 CD16 음성), 및 CD11c 양성인 세포로 동정하였다. 세포내 TNF-α, IL-6, 및 표면 마커 CD83, CD80, CD86 및 CCR5(활성화된 성숙 DC에서 증가됨)도 감시하였다.
mDC에 대한 sCD83의 효과를 평가하기 위하여, 필리핀 원숭이로부터 분리된 PBMC(1 x 106 세포)를 sCD83과 함께 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 LPS(1 ㎍/ml) 및 IFN-γ(100 U/ml)로 6시간 자극하였다. 세포내 TNF-α 수준 및 표면 마커를 FACS를 사용하여 mDC에서 검출하였다. 3회 실험중 하나의 대표적인 결과를 도 11에 나타내었으며; 결과는 % 양성 세포 및 평균 형광 단위(MFU)로 나타내었다. 결과는 sCD83이 mDC에 의한 TNF-α의 시험관내 생산을 억제하며, 또한 mDC 활성화 마커 CD83, CD86, CCR5, 및 CD80의 표면 발현을 억제함을 보여주었다.
단핵구에 대한 sCD83 효과를 평가하기 위하여, 필리핀 원숭이로부터 분리된 PBMC(1 x 106 세포)를 sCD83(1 x 106 세포)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 세포내 TNF-α 수준 및 표면 마커를 FACS를 사용하여 단핵구에서 검출하였다. 3회 실험중 하나의 대표적인 결과를 도 12에 나타내었으며; 결과는 % 양성 세포 및 평균 형광 단위(MFU)로 나타내었다. 결과는 sCD83이 단핵구에 의한 TNF-α의 시험관내 생산을 알맞게 억제하며, 또한 단핵구 활성화 마커의 표면 발현을 억제함을 보여주었다.
CD4+ T 세포에 대한 sCD83의 효과를 평가하기 위하여, 이들 세포를 필리핀 원숭이로부터 정제한 다음 sCD83 또는 항-CD28 mAb의 존재 또는 부재하에 6일간 자극하였다. 세포를 염색하여 조절 T 세포(즉, CD4+ CD25+ Foxp3+ 세포)를 동정하고 FACS로 분석하였다. 결과(도 13)는 sCD83이 조절 T 세포의 발생을 증진함을 시사한다.
다음과 같이, 필리핀 원숭이로부터 준비된 수지상 세포를 사용하여 조절 T 세포를 준비하였다. 필리핀 원숭이 골수성(myeloid) 수지상 세포를 7일간 GM-CSF 및 IL-4의 존재하에 CD14+ 단핵구 세포로부터 발생시켰으며; 가용성 CD83을 50 ug/ml로 제3일 내지 7일에 일부 배양액에 첨가하고, IL-1β, IL-6, TNF-α 및 PGE-2의 성숙화 칵테일을 제5일 내지 7일에 첨가하였다. 음성적 선택을 통해 T 세포(1 x 106/ml)를 분리하고, sCD83(50 ㎍/ml)으로 처리되거나 비처리된 동종이형의 성숙 수지상 세포를 사용하여 상이한 비율로 자극하였다. 세포를 염색하여 조절 T 세포(즉, CD4+ CD25+ Foxp3+ 세포)를 동정하고 FACS로 분석하였다. 결과(도 14)는, 특히 시험된 DC:T 비율이 높은 경우, 가용성 CD83으로 처리된 수지상 세포에 의해 발생된 조절 T 세포의 수가 증가됨을 보여주었다.
실시예 10: sCD83 의 B-세포 증식 및 시험관내 기능의 억제
시험관내 B-세포 증식에 대한 sCD83 효과의 평가: sCD83의 존재 또는 부재하에 C57BL/6 B-세포를 LPS로 자극하였다. 배양 48 시간 후, 분당 계수(cpm)로 3H-티미딘 혼입을 측정하였다. 결과를 평가하여 sCD83이 시험관내 B-세포 증식을 억제하는지 여부를 결정하였다.
B 세포에 의한 IgM 및 IgG 생산에 대한 sCD83의 효과 평가: C57BL/6 B-세포를 sCD83의 존재 또는 부재하에 LPS로 자극하였다. 배양 72 시간 후, 상등액을 수확하고 ELISA를 사용하여 IgM 또는 IgG 생산을 결정하였다. 결과를 평가하여 sCD83 이 시험관내 B-세포 항체 생산을 억제하는지 여부를 결정하였다.
실시예 11: 관용 수지상 세포의 생산 및 수지상 세포 기능의 평가
관용 수지상 세포는 다음과 같이 생산할 수 있다. 1% 인간 혈장이 포함된 표준 배지(예를 들어,글루타민(200 ㎍/ml, BioWhittaker, Verviers, Belgium), 페니실린/스트렙토마이신(20 ㎍/ml), 10 mM 헤페스, pH 7.5 (Sigma-Aldrich), 및 단일 공여자로부터의 1% 인간 혈장(56 ℃에서 30분간 인큐베이션하여 미리 열-불활성화시킴)으로 보충된 RPMI 1640(BioWhittaker, Verviers, Belgium))를 사용하여 세포를 배양할 수 있다. 인간 PBMC를 Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)에서 침전시켜 버피 코트로부터 분리하고, IgG(Cohn 분획으로부터의 10 ㎍/ml γ-글로블린; Sigma-Aldrich)로 코팅된 100 mm 배양 접시 상에 접종하고, 37 ℃의 5% CO2 조건하에 인큐베이션할 수 있다. 1시간 및 7시간 인큐베이션 후에, 비-부착 세포 분획을 제거하고 부착 세포를 사이토킨 GM-CSF (800 U/ml) 및 IL-4 (500 U/ml)가 보충된 1% 인간 혈장 배지에서 추가로 배양한다. 인큐베이션 기간 중의 제3일에 신선한 배지(400 U/ml 농도의 GM-CSF 및 500 U/ml 농도의 IL-4를 포함)를 첨가한다. 제4일 또는 제5일에, 비-부착 세포를 회수하고, 계수하고, 0.3-0.5 x 105 세포/ml의 밀도로 새 접시에 옮긴다. 최종 성숙 단계를 위해 1% 인간 혈장 배지를 TNF-α(1.25 ng/ml), GM-CSF(40 U/ml), IL-4(200 U/ml), 프로스타글란딘 E2(0.5 pg/ml; 참조: Lechmann et al . (2001) J. Exp . Med. 194: 1813-1821), 및 가 용성 CD83(4 ㎍/ml)로 보충한다. 대안적으로, 최종 성숙 단계를 위하여, 성숙 칵테일에 IL-1β, TNF-α, PGE2, 및 가용성 CD83(4 ㎍/ml)를 포함시킨다. 제8일에 세포를 FACS로 분석할 수 있다. 이 방법으로 성숙된 세포는 정상적으로 성숙된 DC(참조: WO 2004/046182)와 비교할 때, CD80(예를 들어, 96% 에서 66%로) 및 CD83(예를 들어, 96% 에서 30%로)의 명백히 감소된 세포 표면 발현과 CD14 양성 세포에 있어서의 증가를 나타내었다. 다른 세포 표면 마커(예를 들어, MHC 클래스 I 및 II)의 발현은 유의적인 영향을 받지 않았다. 다른 구체예에서, 세포는 상기 설명된 프로토콜에 따라 성숙될 수 있지만, 가용성 CD83 및 다른 면역억제 화합물(들)은 1일, 2일, 3일 또는 그 이상 후에 성숙 칵테일에 첨가될 수 있다(상기 논의된 바와 같이 개별적으로 또는 함께).
다음과 같이, 동종 혼합 림프구 반응("MLR") 에세이를 사용하여 수지상 세포를 평가할 수 있다. 버피 코트로부터 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 분리한다. 간략히, 수확한 비-부착성 세포 분획을 뉴라미다제-처리된 양의 적혈구와 함께 인큐베이션하고, 피콜 구배 원심분리에 의해 수집하고, 단일 AB 공여자로부터의 5% 인간 혈청으로 보충된 RPMI에서 배양한다. 그 후, 세포를 상이한 비율의 성숙 동종 면역자극성 DC와 함께 자극한다. 세포를 상이한 농도의 가용성 CD83(WO 2004/046182호에 기재된 "hCD83ext")과 인큐베이션하거나, 대조군으로서 BSA(BioRad)와 인큐베이션하거나, 비처리한다. T 세포(2 x 105 세포/웰) 및 DC를 96-웰 세포 배양 접시에서 단일 AB 공여자로부터의 5% 인간 혈청으로 보충된 RPMI에서 4 일간 함께 배양한다. [3H]-티미딘(1 μCi/웰; Amersham Pharmacia Biotech)으로 16 시간동안 세포를 펄싱한다. 1H-110 수확기(Inotech, Dottikon, Switzerland)를 사용하여 유리 섬유 필터 상에서 배양액 상등액을 수확하고, 왈락 1450 마이크로플레이트 계수기(Wallac, Turku, Finnland)에서 필터를 계수한다.
실시예 12: 다양한 자극에 반응한 CD83 유효성 시간대의 종점 결정
CD83 및 KLH 투여 사이의 간격(즉, 10 일, 8 일, 6 일, 4 일, 2 일, 1 일)을 변화시키면서 실시예 3에 본질적으로 기재된 바에 따라 마우스의 면역 반응을 평가하였다. 간격은 KLH를 사용한 재자극이 면역 반응을 유발하지 않는 기간으로 정의되며; 이 간격은 본 실험에서 민감성 시간대(window of sensitivity)의 마지막을 표시한다.
대상을 본질적으로 상기 기재된 바에 따라 평가하지만, 다른 면역 자극을 조사하였다. 이 프로토콜은 KLH 항원 대신에 제3의 피부 이식편을 사용하였다. 다른 프로토콜에서는 CD83 처리 중 및 처리 후(CD83 처리 전날, CD83 처리 다음날, 및 CD83 처리 후 3일)에 리슈만편모충(Leishmania)으로 감염시켰다. 다른 프로토콜에서는 CD83 처리 중 및 처리 후에 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV; lymphocytic choriomeningitis virus)로 감염시켰다.
실시예 13: CD83 에 반응한 기억 T 세포( Memory T cell )의 재활성화 평가
마우스를 LCMV로 감염시키고 28일 후 CD83을 주사하였다. IFNγ 및 IL-2를 생산하지만 표적 세포를 죽이지는 않는 LCMV-특이적 기억 T 세포가 존재 여부에 대하여 말초 혈액 단핵 세포(Peripheral Blood Mononuclear Cells; PBMCs)를 평가하였다.
실시예 14: 조절 T 세포에 대한 CD83 의 효과 평가
항원-특이적 T 세포를 시험관내 생산하여 가용성 CD83의 존재 또는 부재하에 수지상 세포에 노출시켰다. 그 후, T 세포를 에세이하여 증식(CFSE), 세포사멸(Annexin V), 사이토킨 생산(IFN-γ 및 IL-10), 및 Foxp3의 존재에 대한 CD83의 효과를 평가하며; 대략적인 에세이는 당업계에 공지되어 있다.
T 세포를 배양하고/하거나 시험관내 에세이할 수 있도록 포유류로부터 분리하였다. 확립된 과정에 따라 Ficoll-Hypaque 밀도 구배 원심분리를 사용하여 적혈구 및 호중구로부터 PBMC를 분리하였다. 1% 소 태자 혈청(FBS)이 보충된 개질 AIM-V(2 mM 글루타민이 포함된 AIM-V(GIBCO), 10 ㎍/ml 겐타마이신 설페이트, 및 50 ㎍/ml 스트렙토마이신으로 구성됨)로 세포를 세척하였다. 표준 기술에 따라 칼럼 또는 마그네틱 비드에 커플링된 적합한 단클론항체를 사용하는 음성적 또는 양성적 선택에 의해 T 세포를 농축시켰다(enriched). 세포의 일부(aliquot)에 대해 CD4, CD8, CD3 및 CD14의 발현을 포함하는 세포 표면 표현형을 분석하였다.
일부 경우에, 세포를 세척하고, 상기와 같이 개질되고 5% FBS 및 100 U/ml 재조합 IL-2(rIL-2)를 포함하는 AIM-V(보충된 AIM-V) ml 당 약 5 x 105 세포의 농도로 재현탁시켰다. 그 후, T 세포를 sCD83의 존재 또는 부재하에 면역자극성 또는 관용 수지상 세포에 노출시킬 수 있다.
증식을 자극하기 위하여, OKT3 단클론항체(Ortho Diagnostics)를 10 ng/ml의 농도까지 첨가할 수 있다. 세포를 24 웰 플레이트에 평판배양하고(웰당 세포 현탁액 0.5 ml), 5% CO2의 가습된 인큐베이터에서 약 37 ℃의 온도에서 배양하였다. OKT3 항체와 같은 반응성 조성물에 반응한 T 세포 증식을, 예를 들어, 3H-티미딘 흡수(uptake)를 측정함으로써 정량적으로 감시할 수 있다(참조: Caruso et al . (1997) Cytometry 27: 71).
수지상 세포에 노출시키는 동안 및 그 후에 T 세포에 의해 분비된 사이토킨의 유형 및 양의 분석은 기능적 활성의 측정일 수 있다. 사이토킨을 ELISA 또는 ELISPOT 에세이로 측정하여 사이토킨 생산 속도 및 총량을 결정할 수 있다(참조: Fujihashi et al . (1993) J. Immunol . Meth . 160: 181; Tanquay and Killion (1994) Lymphokine Cytokine Res. 13: 259; Parkhurst et al . (1996) Immunol. 157: 2539).
실시예 15: CD83 을 사용하여 생산된 조절 T 세포를 사용한 면역의 입양전달( Adoptive Transfer ) 평가
마우스를 10 ㎍의 KLH로 면역시켰다. CD83(100 ㎍)을 KLH 면역화 전날, 다음 날, 및 3일 후에 투여하였다. KLH 면역화 10일 후, 이들 동물로부터 비세포를 준비하고 비수용(naive) 동물에 전달하여 KLH로 면역화시키고 항원에 대한 면역 반응을 에세이하였다.
실시예 16: 관용 DC 를 사용한 내성의 입양전달
가용성 CD83을 포함하는 성숙화 단계로 준비된 관용 DC를 실시예 4에 기재된 바와 같이 준비하였다. 미성숙 DC를 관심 있는 항원 또는 관심 있는 항원을 암호화하는 핵산으로 로딩하였다. 이 DC를 대상에 전달하고 항원에 대한 대상의 면역 반응을 평가하였다.
실시예 17: 가용성 CD83 및 이식 기관의 병용투여
아웃브리드의 사이노몰구스 짧은꼬리 원숭이(outbred, juvenile cynomolgus macaques)에 신장 이식을 수행하고; 각각의 짧은꼬리 원숭이는 또 다른 짧은꼬리 원숭이로부터 적출된 신장을 수용하였다. 이식 과정 중에, 수용자 짧은꼬리 원숭이에 가용성 CD83을 3 내지 6 mg/kg/일의 용량으로 정맥 내 또는 복강 내 주사하였다. 28일간 하루 1회 또는 하루 4회 투여하였다. 대조군 짧은꼬리 원숭이는 가용성 CD83 없이 이식 기관만 수용하였다. 이식 과정 후, 짧은꼬리 원숭이의 생육성 및 이식 기관의 혈액 공급을 감시하였다.
SEQUENCE LISTING <110> ARGOS THERAPEUTICS, INC. Nicolette, Charles Brand, Stephen Zhong, Zhen Wang, Hao Arp, Jacqueline Ramcharran, Siobhan I. Baroja, Miren L. <120> Use of CD83 in Combination Therapies <130> ARG042WO <150> US 60/838,812 <151> 2006-08-18 <150> US 60/927,377 <151> 2007-05-03 <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1761 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1761) <223> Nucleic acid sequence also set forth in GENBANK Accession No. Z11697 <220> <221> CDS <222> (11)..(628) <220> <221> sig_peptide <222> (11)..(67) <400> 1 gaattccgcc atg tcg cgc ggc ctc cag ctt ctg ctc ctg agc tgc gcc 49 Met Ser Arg Gly Leu Gln Leu Leu Leu Leu Ser Cys Ala 1 5 10 tac agc ctg gct ccc gcg acg ccg gag gtg aag gtg gct tgc tcc gaa 97 Tyr Ser Leu Ala Pro Ala Thr Pro Glu Val Lys Val Ala Cys Ser Glu 15 20 25 gat gtg gac ttg ccc tgc acc gcc ccc tgg gat ccg cag gtt ccc tac 145 Asp Val Asp Leu Pro Cys Thr Ala Pro Trp Asp Pro Gln Val Pro Tyr 30 35 40 45 acg gtc tcc tgg gtc aag tta ttg gag ggt ggt gaa gag agg atg gag 193 Thr Val Ser Trp Val Lys Leu Leu Glu Gly Gly Glu Glu Arg Met Glu 50 55 60 aca ccc cag gaa 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taaagaagca ataaagaaga gtgccacatt tatttttata 1278 tctatatgta cttgtcaaag aaggtttgtg tttttctgct tttgaaatct gtatctgtag 1338 tgagatagca ttgtgaactg acaggcagcc tggacataga gagggagaag aagtcagaga 1398 gggtgacaag atagagagct atttaatggc cggctggaaa tgctgggctg acggtgcagt 1458 ctgggtgctc gtccacttgt cccactatct gggtgcatga tcttgagcaa gttccttctg 1518 gtgtctgctt tctccattgt aaaccacaag gctgttgcat gggctaatga agatcatata 1578 cgtgaaaatt ctttgaaaac atataaagca ctatacagat tcgaaactcc attgagtcat 1638 tatccttgct atgatgatgg tgttttgggg atgagagggt gctatccatt tctcatgttt 1698 tccattgttt gaaacaaaga aggttaccaa gaagcctttc ctgtagcctt ctgtaggaat 1758 tcc 1761 <210> 2 <211> 205 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Arg Gly Leu Gln Leu Leu Leu Leu Ser Cys Ala Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Ala Pro Ala Thr Pro Glu Val Lys Val Ala Cys Ser Glu Asp Val Asp 20 25 30 Leu Pro Cys Thr Ala Pro Trp Asp Pro Gln Val Pro Tyr Thr Val Ser 35 40 45 Trp Val Lys Leu Leu Glu Gly Gly Glu Glu Arg Met Glu Thr Pro Gln 50 55 60 Glu Asp His Leu Arg Gly Gln His Tyr His Gln Lys Gly Gln Asn Gly 65 70 75 80 Ser Phe Asp Ala Pro Asn Glu Arg Pro Tyr Ser Leu Lys Ile Arg Asn 85 90 95 Thr Thr Ser Cys Asn Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Thr Leu Gln Asp Pro 100 105 110 Asp Gly Gln Arg Asn Leu Ser Gly Lys Val Ile Leu Arg Val Thr Gly 115 120 125 Cys Pro Ala Gln Arg Lys Glu Glu Thr Phe Lys Lys Tyr Arg Ala Glu 130 135 140 Ile Val Leu Leu Leu Ala Leu Val Ile Phe Tyr Leu Thr Leu Ile Ile 145 150 155 160 Phe Thr Cys Lys Phe Ala Arg Leu Gln Ser Ile Phe Pro Asp Phe Ser 165 170 175 Lys Ala Gly Met Glu Arg Ala Phe Leu Pro Val Thr Ser Pro Asn Lys 180 185 190 His Leu Gly Leu Val Thr Pro His Lys Thr Glu Leu Val 195 200 205 <210> 3 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(375) <223> Nucleic acid sequence encoding extracellular domain of human CD83 <400> 3 acgccggagg tgaaggtggc ttgctccgaa gatgtggact tgccctgcac cgccccctgg 60 gatccgcagg ttccctacac ggtctcctgg gtcaagttat tggagggtgg tgaagagagg 120 atggagacac cccaggaaga ccacctcagg ggacagcact atcatcagaa ggggcaaaat 180 ggttctttcg acgcccccaa tgaaaggccc tattccctga agatccgaaa cactaccagc 240 tgcaactcgg ggacatacag gtgcactctg caggacccgg atgggcagag aaacctaagt 300 ggcaaggtga tcttgagagt gacaggatgc cctgcacagc gtaaagaaga gacttttaag 360 aaatacagag cggag 375 <210> 4 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(125) <223> Extracellular domain of human CD83 <400> 4 Thr Pro Glu Val Lys Val Ala Cys Ser Glu Asp Val Asp Leu Pro Cys 1 5 10 15 Thr Ala Pro Trp Asp Pro Gln Val Pro Tyr Thr Val Ser Trp Val Lys 20 25 30 Leu Leu Glu Gly Gly Glu Glu Arg Met Glu Thr Pro Gln Glu Asp His 35 40 45 Leu Arg Gly Gln His Tyr His Gln Lys Gly Gln Asn Gly Ser Phe Asp 50 55 60 Ala Pro Asn Glu Arg Pro Tyr Ser Leu Lys Ile Arg Asn Thr Thr Ser 65 70 75 80 Cys Asn Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Thr Leu Gln Asp Pro Asp Gly Gln 85 90 95 Arg Asn Leu Ser Gly Lys Val Ile Leu Arg Val Thr Gly Cys Pro Ala 100 105 110 Gln Arg Lys Glu Glu Thr Phe Lys Lys Tyr Arg Ala Glu 115 120 125

Claims (49)

  1. 면역 반응의 기능장애(dysfunction) 또는 원치 않는 기능에 의해 유발된 질환 또는 장애의 한가지 이상의 증상을 예방, 치료 또는 완화시키기 위한, 가용성 CD83과, 제1 면역 억제 화합물을 포함하는 조합물로서,
    상기 제1 면역 억제 화합물은 사이클로스포린, 타크롤리무스 및 시롤리무스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조합물.
  2. 제1항에 있어서, 가용성 CD83과 사이클로스포린을 포함하는 조합물.
  3. 제1항에 있어서, 가용성 CD83과 타크롤리무스를 포함하는 조합물로서, 상기 조합물은 마이코페놀레이트 모페틸을 추가로 포함하는 것인, 조합물.
  4. 제1항에 있어서, 가용성 CD83과 시롤리무스를 포함하는 조합물로서, 상기 조합물은 항-CD45RB mAb를 추가로 포함하는 것인, 조합물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 가용성 CD83 및 상기 제1 면역 억제 화합물은 동시에 투여되거나 또는 별도로 투여되는, 조합물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 가용성 CD83, 상기 타크롤리무스 및 상기 마이코페놀레이트 모페틸은 동시에 투여되거나 또는 별도로 투여되는 조합물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 가용성 CD83, 상기 시롤리무스 및 상기 항-CD45RB mAb은 동시에 투여되거나 또는 별도로 투여되는, 조합물.
  8. 공여자로부터 적출한 후 이식하기 전에 이식할 조직에 처리하기 위한, 가용성 CD83과, 제1 면역 억제 화합물을 포함하는 조합 조성물로서,
    상기 제1 면역 억제 화합물은 사이클로스포린, 타크롤리무스 및 시롤리무스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조합 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 가용성 CD83과 사이클로스포린을 포함하는, 조합 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 가용성 CD83과 타크롤리무스를 포함하는 조합 조성물로서,며, 상기 조합은 마이코페놀레이트 모페틸을 추가로 포함하는 것인, 조합 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 가용성 CD83과 시롤리무스를 포함하는 조합 조성물로서, 상기 조합은 항-CD45RB mAb를 추가로 포함하는 것인, 조합 조성물.
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