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CN104530225A - 基因组被修饰的细胞 - Google Patents

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CN104530225A
CN104530225A CN201410524492.4A CN201410524492A CN104530225A CN 104530225 A CN104530225 A CN 104530225A CN 201410524492 A CN201410524492 A CN 201410524492A CN 104530225 A CN104530225 A CN 104530225A
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CN
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antibody
cell
sugar chain
gene
antibody compositions
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大贯尚子
佐藤光男
森胜弘
山野和也
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Kyowa Kirin Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
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Publication date
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Abstract

本申请涉及基因组被修饰的细胞，所述的修饰使与糖链修饰相关的酶活性较其亲代细胞更降低或消失，在所述修饰中，N-糖苷连接的糖链复合体中岩藻糖的1位与还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位在通过α-键连接，以及用该细胞产生抗体组合物的方法。

Description

基因组被修饰的细胞
本申请是2012年6月15日提交的申请号为201210201592.4，发明名称为“基因组被修饰的细胞”申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种基因组被修饰的细胞，与其亲代细胞相比，具有降低的或去除了和糖链修饰相关的酶的活性，所述糖链中岩藻糖的1-位与N-糖苷连接糖链复合体还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键结合，以及采用该细胞产生抗体分子的过程。
背景技术
在IgG类抗体的Fc区，存在两个N-糖苷连接糖链结合位点。在血清IgG中，通常在糖链结合位点上结合了一个具有多个分支的复合物型糖链，其中加入的唾液酸或等分N-乙酰氨基葡萄糖很少。已知就半乳糖加入至复合物型糖链非还原末端上和岩藻糖添加至还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上有一定的多样性[Biochemistry(生物化学),36,130(1997)]。
这种糖链结构已认为可通过糖链基因来确定，也就是合成糖链的糖基转移酶的基因和水解糖链的糖酵解酶的基因。
N-糖苷连接糖链的合成如下所述。
糖蛋白在内质网(以后称为“ER”)腔中用糖链进行修饰。在N-糖苷连接糖链的生物合成步骤中，相对大的糖链被转移至在ER腔中延伸的多肽链上。在转变过程中，糖链首先连续加入到由大约20个α-异戊二烯单位组成的长链脂质载体的磷酸基团上，称为磷酸多萜醇(此后有时称为"P-Dol")。即，N-乙酰氨基葡萄糖被转移至磷酸多萜醇形成GlcNAc-P-P-Dol，然后转移又一个GlcNAc，从而形成GlcNAc-GlcNAc-P-P-Dol。下一步，5个甘露糖(此后有时甘露糖被称为"Man")被转移，因此形成(Man)5-(GlcNAc)2-P-P-Dol，然后四个Man和三个葡萄糖(此后葡萄糖有时被称为"Glc")被转移。因此，形成了糖链前体，(Glc)3-(Man)9-(GlcNAc)2-P-P-Dol，称为形成了核心寡糖。含有14个糖的糖链前体被作为一个团体转移至内质网腔中含有天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸序列的多肽上。在反应中，结合至核心寡糖上的磷酸多萜醇(P-P-Dol)被释放，但通过焦磷酸酶的水解作用再次成为磷酸多萜醇，并再进行循环。在糖链与多肽结合后立即开始糖链的加工。即，三个Glc和一个或两个Man在内质网上被删除，已知α-l,2-葡萄糖苷酶I，α-l,3-葡萄糖苷酶II和α-l,2-甘露糖苷酶与删除作用有关。在内质网上被加工的糖蛋白被转移至高尔基体上，被进行不同的修饰。在高尔基体的池(cis)部分，存在有关添加甘露糖磷酸的N-乙酰氨基葡萄糖磷酸转移酶，N-乙酰氨基葡萄糖1-磷酸二酯α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和α-甘露糖苷酶I，并将Man残基还原至5。在高尔基体的中间部分，存在涉及在复合物型N-糖苷连接糖链的外侧第一个GlcNAc的添加的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(GnTI)，涉及删除两个Man的α-甘露糖苷酶II，涉及从外侧添加第二个GlcNAc的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶II(GnTII)和涉及岩藻糖添加至还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上的αl,6-岩藻糖基转移酶。在高尔基体的trans部分，存在与半乳糖的添加有关的半乳糖转移酶和与唾液酸如N-乙酰神经氨酸的添加有关的唾液酸转移酶或类似物。已知N-糖苷连接糖链是通过这些不同酶的作用形成的。
就抗体中的糖链而言，据报道岩藻糖向抗体N-糖苷连接糖链还原末端N-乙酰氨基葡萄糖的添加修饰极大地改变了抗体的抗体依赖的细胞介导细胞毒活性(此后称为“ADCC活性”)(WO00/61739)。这个报道表明糖链的结构在人抗体IgG1亚型的效应器功能中发挥重要作用。
通常，考虑用作药物的大多数人源化抗体通过使用遗传重组技术制备，使用动物细胞，如中国仓鼠卵巢组织来源的CHO细胞作为宿主细胞产生。但如上所述，由于糖链结构在抗体的效应器功能中发挥非常重要的作用，并在宿主细胞表达的糖蛋白的糖链结构中观察到一些差异，需要开发用于产生具有更高效应器功能的抗体的宿主细胞。
也已经进行了修饰通过导入有关糖链修饰的酶基因产生的糖蛋白的糖链结构的尝试，作为其例子，已有报道1)可能产生一种蛋白，其中大量唾液酸通过将大鼠β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶导入CHO细胞中而被添加至糖链的非还原末端上[J.Biol.Chem.(生物化学杂志),261,13848(1989)]，2)通过将人β-半乳糖苷-2-α-岩藻糖基转移酶转移至小鼠L细胞中，可能表达一种H抗原，其中岩藻糖(此后称为“Fuc”)被添加至糖链的非还原末端上(Fucαl-2Galβ1-)[Science(科学),252,1668(1991)]，和3)通过使用一种导入了β-l,4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII)的CHO细胞产生一种抗体，从而可能产生一种N-糖苷连接糖链的等分N-乙酰氨基葡萄糖添加比例很高的抗体[Glycobiology(糖生物学),5,813(1995):WO 99/54342]。当通过使用导入了GnTIII的CHO细胞表达抗体时，所述抗体显示较亲代细胞中表达的抗体高16倍的ADCC活性。然而，由于已有报道GnTIII或β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(GnTV)的过度表达显示出对CHO细胞的毒性，因此其不适合产生抗体药物。
对糖蛋白的生产例子也已有报道，其中产生的糖链结构可通过使用一种突变体作为宿主细胞而改变，该突变体中有关糖链修饰的酶基因的活性被改变，作为其例子，已有报道使用CHO细胞的一种突变体克隆产生了具有高甘露糖型(high mannose type)糖链结构的抗体，该突变体克隆中4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(GnTI)被删除[J.Immunol.(免疫学杂志),160,3393(1998)]。另外，已经报道了一种抗体表达，其具有一种糖链结构，其中唾液酸未被添加至糖链非的还原末端侧，和通过使用CMP-唾液酸转运子或UDP-半乳糖转运子缺陷克隆产生的未添加半乳糖的抗体表达例子，但没有发现具有增强的效应器功能，适合用作药物的抗体[J.Immunol.(免疫学杂志),160,3393(1998)]。由于已经获得的突变体克隆是通过诱变剂处理导入随机突变得到的克隆，它们不适合作为用于产生药学制剂的克隆。
因此，为了修饰制备的糖蛋白的糖链结构，已经进行了许多在宿主细胞中控制有关糖链修饰的酶活性的尝试。但实际上，由于糖链修饰机制是多样化和复杂的，不能说糖链的生理作用已被完全阐明，因此目前的情况是要反复试验和错误。特别的是已经逐渐地阐明了抗体的效应器功能受糖链结构的影响很大，但能够产生具有最合适的糖链结构修饰的抗体分子的宿主细胞目前还没有获得。
发明内容
本发明涉及下列的(1)至(43)。
(1)一种修饰基因组以使与糖链修饰相关的酶的活性比其亲代细胞更低或消失的细胞，所述糖链中岩藻糖的1位与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接。
(2)根据(1)的细胞,其中编码糖链修饰相关酶的基因组基因被敲除，所述糖链中岩藻糖的1位与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接。
(3)根据(1)或(2)的细胞,编码糖链修饰相关酶的基因组上的所有等位基因被敲除，所述糖链修饰中岩藻糖的1位与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接。
(4)根据(1)至(3)任一项中的细胞，与糖链修饰相关的酶是αl,6-岩藻糖基转移酶，所述糖链中岩藻糖的1位与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接。
(5)根据(4)的细胞,αl,6-岩藻糖基转移酶是选自以下(a)至(d)的DNA编码的蛋白质：
(a)含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的DNA；
(b)含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的DNA；
(c)在严格条件下，与包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的DNA杂交，并具有αl,6-岩藻糖基转移酶活性的DNA；
(d)在严格条件下，与包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的DNA杂交，并具有αl,6-岩藻糖基转移酶活性的DNA。
(6)根据(4)的细胞,αl,6-岩藻糖基转移酶是选自以下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)的蛋白质：
(a)含有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的蛋白质；
(b)含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的蛋白质；
(c)含有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中至少一个氨基酸被删除、取代、插入、和/或添加的氨基酸序列，并具有αl,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(d)含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列中至少一个氨基酸被删除、取代、插入、和/或添加的氨基酸序列，并具有αl,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(e)含有与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列具有80％或以上同源性的氨基酸序列，并具有αl,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(f)含有与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列具有80％或以上同源性的氨基酸序列，并具有αl,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质。
(7)根据(1)至(6)任一项中的细胞,此细胞对识别糖链的凝集素具有抗性，所述糖链中岩藻糖的1位与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接。
(8)根据(7)的细胞,此细胞对选自以下(a)至(d)的至少一个凝集素具有抗性:
(a)小扁豆凝集素；
(b)豌豆凝集素；
(c)蚕豆凝集素；
(d)陈皮木耳凝集素。
(9)根据(1)至(8)任一项中的细胞,此细胞选自以下(a)至(j):
(a)来源于中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞；
(b)大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞；
(c)小鼠骨髓瘤细胞系NS0细胞；
(d)小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0-Agl4细胞；
(e)来源于叙利亚仓鼠肾组织的BHK细胞；
(f)产生抗体的杂交瘤细胞；
(g)人白血病细胞系Namalwa细胞；
(h)胚胎干细胞；
(i)受精卵细胞；
(j)植物细胞。
(10)根据(1)至(9)任一项中的细胞,此细胞含有编码抗体分子的基因。
(11)根据(10)的细胞,此的抗体分子选自以下的(a)至(d):
(a)人抗体；
(b)人源化抗体；
(c)含(a)或(b)Fc区的抗体片段；
(d)含(a)或(b)Fc区的融合蛋白质。
(12)根据(10)或(11)的细胞,其中抗体分子属于IgG型。
(13)根据(1)至(12)任一项中的细胞，此细胞产生的抗体组合物比其亲代细胞产生的抗体组合物具有更高的抗体依赖性细胞介导细胞毒活性。
(14)根据(13)的细胞,其中具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物比其亲代细胞产生的抗体组合物具有更高的糖链比例，所述糖链中岩藻糖不与Fc区结合的N–糖苷连接的糖链总复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖连接。
(15)根据(14)的细胞,其中不连接岩藻糖的糖链中，岩藻糖的1位不与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接。
(16)根据(13)至(15)任一项中的细胞,其中岩藻糖不与还原端的N-乙酰氨基葡萄糖通过α-键连接的糖链比例是抗体组合物中与Fc区结合的N-糖苷连接糖链总复合体的20％或以上。
(17)根据(13)至(16)任一项中的细胞,其中具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物没有岩藻糖与糖链还原端的N-乙酰氨基葡萄糖结合的糖链。
(18)一种产生抗体组合物的方法，其中所述的方法包括使用根据求10至17任一项中所述的细胞。
(19)一种产生抗体组合物的方法,所述方法包括在培养基中培养根据(10)至(18)任一项中所述的细胞，在培养基中形成和积累抗体组合物；并从培养基中回收抗体组合物。
(20)根据(18)或(19)所述的方法，所述抗体组合物是比其亲代细胞产生的抗体组合物具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物。
(21)根据(20)的步骤,所述的具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物比其亲代细胞产生的抗体组合物具有更高的糖链比例，所述糖链中岩藻糖不与Fc区结合的N–糖苷连接的糖链总复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖连接。糖不与N-乙酰氨基葡萄糖在还原端结合。
(22)根据(21)的步骤,所述的不连接岩藻糖的糖链中，岩藻糖的1位不与N-糖苷连接的糖链总复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接。
(23)根据(20)至(22)任一项中的细胞,所述的具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物是与抗体组合物Fc区结合的N–糖苷连接的糖链总复合体中，岩藻糖不与还原端的N-乙酰氨基葡萄糖通过α-键连接的糖链比例是抗体组合物中与Fc区结合的N-糖苷连接糖链总复合体的20％或以上。
(24)根据(20)至(23)任一项中的细胞,所述的具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物是没有岩藻糖与糖链中还原端N-乙酰氨基葡萄糖连接的抗体组合物。
(25)使用根据(1)至(9)任一项中细胞产生的转基因非人动物或植物或其后代。
(26)根据(24)的转基因非人动物或植物或其后代,所述的转基因非人动物选自牛、绵羊、山羊、猪、马、小鼠、大鼠、家禽、猴和兔。
(27)根据(25)或(26)所述的转基因非人动物或植物或其后代，其被导入了编码抗体分子的基因。
(28)根据(27)的转基因非人动物或植物或其后代,所述的抗体分子选自以下(a)至(d):
(a)人抗体；
(b)人源化抗体；
(c)含(a)或(b)Fc区的抗体片段；
(d)含(a)或(b)Fc区的融合蛋白质。
(29)根据(27)或(28)的转基因非人动物或植物或其后代,所述的抗体分子属于IgG族。
(30)一种产生抗体组合物的步骤，其特征在于包括培养根据(27)至(29)任一项中的转基因非人动物或植物；分离从培养的动物或植物中诱导的含有抗体分子的组织或体液；从分离的组织或体液中回收含所需抗体分子的抗体组合物。
(31)一种产生抗体组合物的步骤,其特征在于包括从根据(26)至(29)任一项中的转基因非人动物或植物或其后代中分离产生抗体的细胞；在培养基中培养分离的产生抗体的细胞，在培养基中形成和积累抗体组合物；从培养基中回收抗体组合物。
(32)根据(30)或(31)的步骤,所述的抗体组合物是比基因组未被修饰的转基因非人动物或植物或其后代产生的抗体组合物具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物。
(33)根据(32)的步骤,所述的具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物比基因组未被修饰的转基因非人动物或植物或其后代产生的抗体组合物具有较高比例的糖链，所述糖链中岩藻糖不与和抗体组合物Fc区结合的N–糖苷连接的糖链总复合体的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖连接。
(34)根据(33)的步骤,糖链中岩藻糖的1位不与N–糖苷连接的糖链总复合体的还原端位置的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接。
(35)根据(32)至(34)任一项中的步骤,具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物中岩藻糖不与还原端的N-乙酰氨基葡萄糖通过α-键连接的糖链比例是抗体组合物中与Fc区结合的N-糖苷连接糖链总复合体的20％或以上。
(36)根据(32)至(35)任一项中的细胞，具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物是糖链中没有岩藻糖与还原端的N-乙酰氨基葡萄糖连接的抗体组合物。
(37)一种含有Fc区具有N-糖苷连接糖链的抗体分子的抗体组合物,具有岩藻糖不与和抗体组合物Fc区结合的N–糖苷连接的糖链总复合体的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖连接的糖链。
(38)根据37所述的抗体组合物，不连接岩藻糖的糖链是岩藻糖的1位不与N–糖苷连接的糖链复合体的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接的糖链。
(39)一种通过(18)至(24)任一项中的步骤产生的抗体组合物。
(40)一种通过(27)至(36)任一项中的步骤产生的抗体组合物。
(41)含有根据(37)至(40)任一项中的抗体组合物作为活性成分的药物。
(42)根据(41)的药物，其是以下疾病的诊断剂、预防剂或治疗剂：肿瘤相关疾病、变态反应相关疾病、炎症相关疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病、病毒感染相关疾病或细菌感染相关疾病。
(43)在生产根据(41)或(42)的药物中对根据(37)至(40)任一项的抗体组合物的应用。
在修饰基因组以便较其亲代细胞具有较低的或去除了有关糖链修饰酶的活性的细胞(此后称为“本发明的细胞”)中修饰基因组的方法并不特别限制，只要细胞基因组的修饰是为了较其亲代细胞具有较低的或去除了有关糖链修饰酶(此后称为"αl,6-岩藻糖修饰酶")的活性，其特征在于所述糖链中岩藻糖的1-位与N-糖苷连接糖链复合体还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键结合。
亲代细胞是降低或去除αl,6-岩藻糖修饰酶活性的方法应用于基因组之前的细胞。亲代细胞不特别限制，包括下列细胞。
NS0亲代细胞包括下列文献中所描述的NS0细胞如BIO/TECHNOLOGY,10,169(1992)和Biotechnol.Bioeng.,73,261(2001),在RIKEN细胞银行，物理化学研究协会中登记的NSO细胞系(RCB 0213)，通过将这些细胞系移植至它们可生长的培养基中获得的亚细胞系，和类似细胞。
SP2/0-Ag14亲代细胞包括在下面文献中所描述的SP2/0-Ag14细胞，如J.Immunol.(免疫学杂志),126,317(1981),Nature(自然),276.269(1978)和Human Antibodies and Hybridomas,3,129(1992),在ATCC中登记的SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL-1581)，通过将这些细胞系移植至它们生长的培养基中获得的亚细胞系(ATCC CRL-1581.1)，和类似细胞。
来自中国仓鼠卵巢组织的CHO亲代细胞包括在下列文献中所描述的CHO细胞，如Journal of Experimental Medicine(实验医学杂志)(Jikken Igaku),108,945(1958),Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,60,1275(1968),Genetics(遗传学),55,513(1968),Chromosoma(染色体),41.,129(1973),Methods in Cell Science(细胞学方法),18,115(1996),Radiation Research(放射研究),148,260(1997),Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,77,4216(1980),Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,60,1275(1968),Cell(细胞),6,121(1975)和Molecular Cell Genetics(遗传学),Appendix I,H(883-900页),在ATCC登记的细胞系CHO-K1(ATCC CCL-61)、细胞系DUXB11(ATCC CRL-9096)和细胞系Pro-5(ATCC CRL-1781)，市售的细胞系CHO-S(Life Technologies的Cat#11619)，通过将这些细胞系移植至它们生长的培养基中获得的亚细胞系，和类似细胞。
大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20亲代细胞包括从Y3/Agl.2.3细胞(ATCC CRL-1631)建立的细胞系，在下面文献中描述的YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞如J.Cell.Biol.,93,576(1982)和Methods Enzymol.(酶学方法),73B,1(1981),在ATCC登记的YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL-1662)，通过将这些细胞系移植至它们生长的培养基中获得的亚细胞系，和类似细胞。
岩藻糖的1位通过α-键和复合体N-糖苷连接糖链的还原末端N-乙酰氨基葡萄糖的6位结合的反应。涉及在复合体N-糖苷连接糖链的还原末端通过α-键岩藻糖的1位和N-乙酰氨基葡萄糖的6位结合的反应的酶包括对在复合体N-糖苷连接糖链的还原末端通过α-键岩藻糖的1位和N-乙酰氨基葡萄糖的6位结合的反应有影响的酶。
1,6-岩藻糖修饰酶包括αl,6-岩藻糖基转移酶，α-L-岩藻糖苷酶和类似酶。
对在复合体N-糖苷连接糖链的还原末端通过α-键岩藻糖的1位和N-乙酰氨基葡萄糖的6位结合的反应有影响的酶也包括对涉及在复合体N-糖苷连接糖链的还原末端通过α-键岩藻糖的1位和N-乙酰氨基葡萄糖的6位结合反应的酶活性有影响的酶，和对物质的结构如酶的底物一样有影响的酶。
在本发明中，αl,6-岩藻糖修饰酶包括下列(a),(b),(c)或(d)的DNA编码的蛋白和下列(e),(f),(g),(h),(i)或(j)的蛋白质：
(a)含有SEQ ID NO:1代表的核苷酸序列的DNA；
(b)含有SEQ ID NO:2代表的核苷酸序列的DNA；
(c)与含有SEQ ID NO:1代表的核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交并编码具有α1,6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA；
(d)与含有SEQ ID NO:2代表的核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交并编码具有α1,6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA；
(e)含有SEQ ID NO:4代表的氨基酸序列的蛋白质；
(f)含有SEQ ID NO:5代表的氨基酸序列的蛋白质；
(g)含有下列的氨基酸序列的蛋白质，其中在由SEQ ID NO:4所代表的氨基酸序列其中至少一个氨基酸被删除、取代、插入和/或添加，并具有α1,6-岩藻糖转移酶活性；
(h)含有下列的氨基酸序列的蛋白质，其中在由SEQ ID NO:5所代表的氨基酸序列，其中至少一个氨基酸被删除、取代、插入和/或添加，并具有α1,6-岩藻糖转移酶活性；
(i)含有与SEQ ID NO:4所代表的氨基酸序列具有80％或更多同源性的氨基酸序列，并具有αl,6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质；
(j)含有与SEQ ID NO:5所代表的氨基酸序列具有80％或更多同源性的氨基酸序列，并具有αl,6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质，和类似物。
在本发明中，在严格条件下杂交的DNA是例如通过如克隆杂交(colony hybridization)，噬菌斑杂交或Southern印迹杂交的方法，使用如具有SEQ ID NO:1或2代表的核苷酸序列的DNA或其部分片段作为探针获得的DNA，并特别包括可在0.7至1.0M氯化钠存在下，采用滤膜在65℃进行杂交所鉴定的DNA，其中群体或噬菌斑来源的DNA片段固定在滤膜上，然后在65℃使用0.1至2×SSC溶液(由150mM的氯化钠和15mM的柠檬酸钠组成的1×SSC溶液的组合物)冲洗滤膜。可以根据已描述的方法进行杂交，如在Molecular Cloning,A Labooratory Manual(分子克隆，实验手册)，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press(冷泉港实验室印刷)(1989)(此后称为“分子克隆，第二版”),现代分子生物学方法，John Wiley&Sons,1987-1997(此后称为“现代分子生物学方法”),DNA克隆：核心技术，实践方法，第二版，牛津大学(1995)；和类似文章。可杂交的DNA包括与SEQ ID NO:1或2所示核苷酸序列具有至少60％或更多，优选70％或更多，更优选80％或更多，进一步优选90％或更多，更为优选的是95％或更多，最优选98％或更多。
在本发明中，含有SEQ ID NO:4或5所代表的氨基酸序列,其中至少一个氨基酸被删除，取代，插入和/或添加，并具有α1,6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质，可通过例如将一个位点定向突变导入分别具有SEQ ID NO:4或5所示氨基酸序列的蛋白质的编码DNA中，使用如下所述的位点定向突变，如在分子克隆，第二版；现代分子生物学方法，Nucleic Acids Research(核酸研究),10,6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,79,6409(1982)；Gene(基因),34,315(1985)；Nucleic Acids Research(核酸研究),13,4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,82,488(1985)；和类似文章。被删除，取代，插入和/或添加的氨基酸数量是一个或多个，这个数量不特别限制，但这个数量是可以通过一种已知的技术,如位点定向突变删除，取代或添加，例如1至几十，优选1至20，更优选1至10，最优选1至5。
在本发明中，含有与SEQ ID NO:4或5所示氨基酸序列具有80％或更多同源性的氨基酸序列，并具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质，当采用分析软件如BLAST[J.Mol.Biol.,215,403(1990)],FAST A[酶学方法,183,63(1990)]或类似方法计算时，与SEQ ID NO:4或5所示氨基酸序列具有至少80％或更多，优选85％或更多，更优选90％或更多，仍更优选95％或更多，更为优选97％或更多，最优选99％或更多的同源性。
在本发明中，修饰基因组以便有关糖链修饰的酶活性的降低或消除超过其亲代细胞，所述的糖链中岩藻糖的1位通过α-键和复合体N-糖苷连接糖链的还原末端N-乙酰氨基葡萄糖的6位连接，其含义是突变被导入酶的表达控制区，以便减少这种酶的表达，或突变被导入基因的氨基酸序列中以便降低这种酶的功能。导入突变的含义是在基因组的核苷酸序列中进行修饰，如删除，取代，插入和/或添加。
基因组基因被敲除的细胞的含义是在细胞中基因组基因的表达或功能完全被抑制。基因组基因被敲除的细胞包括从基因组中完全或部分删除目的基因的细胞。作为获得这种细胞的方法，可以使用任何技术，只要目的基因组能够被修饰。但优选遗传工程技术。例子包括：
(a)一种基因破坏技术，包括靶向编码1,6-岩藻糖修饰酶的基因，
(b)导入编码1,6-岩藻糖修饰酶显性负突变基因的技术，
(c)将突变导入编码1,6-岩藻糖修饰酶的基因中的技术，
(d)抑制编码α1,6-岩藻糖修饰酶的基因转录和/或翻译的技术。
而且，本发明的细胞可通过使用以下的方法获得，即通过使用选择对植物凝集素有抗性的克隆，所述凝集素可识别其中岩藻糖的1位通过α-键和复合体N-糖苷连接糖链的还原末端N-乙酰氨基葡萄糖的6位连接的糖链。
植物凝集素抗性细胞的生长不受细胞培养过程中植物凝集素有效浓度的抑制。有效浓度是亲代细胞不能正常生长的浓度，或高于该浓度亲代细胞不能生长的浓度，该浓度优选类似于亲代细胞不能正常生长的浓度，更优选是亲代细胞不能正常生长的浓度2至5倍，仍更优选至少是亲代细胞不能正常生长的浓度10倍，最优选高于亲代细胞不能正常生长的浓度至少20倍。
在本发明中，不能抑制生长的植物凝集素的有效浓度可根据细胞系来决定，通常为10μg/ml至10.0mg/ml，优选0.5至2.0mg/ml。
作为凝集素，可以使用任何凝集素，只要它是可以识别岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链的凝集素。例子包括小扁豆凝集素LCA(来源于Lensculinaris的扁豆凝集素)，豌豆凝集素PSA(来源于Pisum sativum的豌豆凝集素)，一种蚕豆凝集素VFA(来源于Vicia faba的凝集素)，陈皮木耳凝集素AAL(来源于Aleuria aurantia的凝集素)等等。
本发明的细胞可以是任何细胞，只要其能够表达一种抗体分子。例子包括酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和类似物，具体的例子包括在下面第3项中所描述的那些。动物细胞包括来自中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞，大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL.P2 Gl1.16Ag.20细胞，小鼠骨髓瘤细胞系NSO细胞，小鼠骨髓瘤SP2/0-Agl4细胞，来自叙利亚仓鼠肾组织的BHK细胞，产生抗体的杂交瘤细胞，人白血病细胞系Namalwa细胞，胚胎干细胞，受精卵细胞和类似细胞。优选的例子包括用于产生抗体组合物的上述骨髓瘤细胞和杂交瘤细胞，产生人源化抗体和人抗体的宿主细胞，制备可产生人抗体的非人转基因动物的胚胎干细胞和受精卵细胞，制备可产生人源化抗体和人抗体的转基因植物的植物细胞，和类似细胞。
本发明的细胞产生的抗体组合物较亲代细胞所产生的抗体组合物的ADCC活性更高。
而且，本发明的细胞能够产生一种抗体组合物，其中在与组合物中Fc区结合的N-糖苷连接糖链总复合体中，岩藻糖不与糖链还原末端中N-乙酰氨基葡萄糖结合的糖链比例较亲代细胞产生抗体组合物高。
本发明涉及一种产生抗体组合物的过程，其特征是使用本发明的细胞。
抗体组合物是一种含有Fc区具有N-糖苷连接糖链复合体的抗体分子的组合物。
抗体是一种四聚体，其中两条多肽链，重链(此后称为“H链”)和轻链(此后称为“L链”)中的两个分子分别是相连的。每个H链N-末端的大约四分之一和L链N-末端的大约四分之一(每个都超过100个氨基酸)称为V区，该区富有多样性，并直接与抗原的结合有关。V区以外部分的较大部分称为C区。根据C区的同源性，抗体分子分为IgG,IgM,IgA,IgD和IgE几型。
同样，根据C区的同源性IgG型也进一步分为IgGl至IgG4亚型。
H链从其N-末端侧分为四个免疫球蛋白区VH,CH1,CH2和CH3，和在CH1和CH2之间将CH1和CH2分开的高度可变的多肽区，称为铰链区。含有铰链区后的CH2和CH3的结构单位称为Fc区，N-糖苷连接糖链结合在上面，该区也是Fc受体，补体和类似物结合的区域(免疫学图册，原版，Nankodo，2000年2月10日发行，第五版；抗体技术手册(Kotai Kogaku Nyumon),Chijin Shokan，1994年1月25日，第一版)。
根据与蛋白质部分的结合形式，糖蛋白，如抗体的糖链粗略地分为两种类型，即与天冬酰胺(N-糖苷连接的糖链)结合的糖链和与其他氨基酸，如丝氨酸、苏氨酸(O-糖苷连接糖链)结合的糖链。N-糖苷连接糖链有一个基本的共同核心结构，由下面的结构式(I)表示[生物化学实验方法23–研究糖蛋白糖链的方法(Gakujutsu Shuppan中心)，ReikoTakahashi主编(1989)]：
在结构式(I)中，与天冬酰胺结合的糖链末端称为还原末端，相反的一侧称为非还原末端。
N-糖苷连接糖链可以是任何N-糖苷连接糖链，只要它含有结构式(I)的核心结构。例子包括高甘露糖型，其中甘露糖与核心结构的非还原末端单独结合；复合物型，其中核心结构的非还原末端侧至少有一个半乳糖-N-乙酰氨基葡萄糖(此后称为“Gal-GlcNAc”)，Gal-GlcNAc的非还原末端侧具有一种唾液酸，等分N-乙酰氨基葡萄糖或类似的结构；杂交型，其中核心结构的非还原末端侧含有高甘露糖型和复合物型的两种分支；等等。
因为抗体分子中的Fc区具有N-糖苷连接糖链独立结合的部位，两条糖链结合一个抗体分子。因为与抗体分子结合的N-糖苷连接糖链包括含有结构式(I)所示核心结构的任何糖链，与抗体结合的两条N-糖苷连接糖链可能有许多糖链的组合。
因此，在本发明中，使用本发明的细胞制备的本发明的抗体组合物，含有相同糖链结构或不同糖链结构的抗体，只要从该组合物可获得本发明的效应。本发明的抗体组合物优选下面的一种抗体组合物，其中在与抗体组合物中与Fc区结合的N-糖苷连接糖链总复合体中，岩藻糖不与糖链还原末端中N-乙酰氨基葡萄糖结合的糖链比例较基因组未被修饰的亲代细胞所产生的抗体组合物高。
而且，在本发明中，通过使用非人动物或植物或其后代制备的抗体组合物含有具有相同糖链结构或不同糖链结构的抗体，只要从该组合物可获得本发明的效应，其特征在于所述动物或植物或其后代中，基因组被修饰以便其αl,6-岩藻糖修饰酶的活性更加降低或被消除。
本发明的抗体组合物优选下面一种抗体组合物，其中在与抗体组合物中Fc区结合的N-糖苷连接糖链总复合体中，岩藻糖不与糖链还原末端中N-乙酰氨基葡萄糖结合的糖链比例较通过使用基因组未被修饰的非人动物或植物或其后代(此后称为“亲代个体”)所产生的抗体组合物高。
基因组被修饰以便其αl,6-岩藻糖修饰酶的活性更加降低或被消除的转基因非人动物或植物或其后代可使用胚胎干细胞，受精卵或植物细胞来制备。
在本发明中，在与抗体组合物中包含的Fc区结合的N-糖苷连接糖链总复合体中，岩藻糖不与糖链还原末端中N-乙酰氨基葡萄糖结合的糖链比例是其中岩藻糖不与糖链还原末端中N-乙酰氨基葡萄糖结合的糖链数量和与抗体组合物中包含的Fc区结合的N-糖苷连接糖链复合体总数量的比例。
其中岩藻糖不与N-糖苷连接糖链复合体还原末端中N-乙酰氨基葡萄糖结合的糖链是在N-糖苷连接糖链复合体中，岩藻糖不与还原末端中N-乙酰氨基葡萄糖通过α-键结合的糖链。特别地是，其中岩藻糖的1-位不与N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键结合的N-糖苷连接糖链复合体。
在与本发明抗体组合物中包含的Fc区结合的N-糖苷连接糖链总复合体中，岩藻糖不与糖链还原末端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合的糖链比例优选20％或更多，更优选30％或更多，仍然更优选40％或更多，最优选50％或更多，甚至最优选100％。
较亲代细胞或亲代个体产生的抗体组合物有较高ADCC活性的抗体组合物包括，在与抗体组合物中Fc区结合的N-糖苷连接糖链总复合体中，岩藻糖不与糖链还原末端中N-乙酰氨基葡萄糖结合的糖链比例较亲代细胞或亲代个体所产生的抗体组合物高。例子包括一种抗体组合物，其活性至少为2倍，优选至少3倍，更优选至少5倍，进一步优选10倍或更高。最优选的抗体组合物是其中连接到抗体组合物中Fc区的所有N-糖苷连接糖链复合体是其中岩藻糖不与糖链还原末端中N-乙酰氨基葡萄糖结合的糖链。
糖链中岩藻糖不与糖链还原末端中N-乙酰氨基葡萄糖结合的糖链比例为100％的抗体组合物或所有N-糖苷连接糖链复合体都连接到抗体组合物中Fc区的是岩藻糖的1-位不与还原末端中N-乙酰氨基葡萄糖的6-位结合的糖链，其中的岩藻糖通过下面的第5项所述糖链分析方法不能检测到。
本发明获得的抗体组合物中，在与Fc区结合的N-糖苷连接糖链总复合体中，其中岩藻糖不与糖链还原末端中N-乙酰氨基葡萄糖结合的糖链比例较亲代细胞或亲代个体所产生的抗体组合物高，本发明中获得的抗体组合物的ADCC活性较含有亲代细胞或亲代个体产生的抗体分子的抗体组合物高。
ADCC活性是一种细胞毒活性，与活体内肿瘤细胞上存在的细胞表面抗原结合的抗体可通过存在于抗体Fc区和效应细胞表面上存在的Fc受体活化效应细胞，因此可干扰肿瘤细胞等[单克隆抗体：原理和应用,Wiley-Liss,Inc.,2.1章(1955)]。效应细胞包括杀伤细胞，自然杀伤细胞，活化的巨噬细胞等。
其中岩藻糖不与组合物中包含的糖链还原末端中N-乙酰氨基葡萄糖结合的糖链比例的测定可采用已知的方法如肼解作用，酶消化或类似方法从抗体分子中释放糖链，其特征在于所述的组合物含有具有Fc区中N-糖苷连接糖链复合体的抗体分子[Biochemical ExperimentationMethods 23-Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain(生物化学实验方法，研究糖蛋白的糖链结构的方法23)(Japan Scientific SocietiesPress(日本科学学会出版)),Reiko Takahashi编著(1989)]从抗体分子中释放糖链来测定，对于释放的糖链进行荧光标记或者放射性标记，然后通过层析方法分离标记的糖链。可选择的，释放的糖链也可以用HPAED-PAD方法分析来确定,[J Liq Chromatogr.,6,1577(1983)]。
同样，本发明的抗体优选可识别肿瘤相关抗原的抗体，识别变态反应或炎症相关抗原的抗体，识别心血管疾病相关抗原的抗体或识别下面所举例的病毒或细菌感染相关抗原的抗体，优选属于IgG类型。
识别肿瘤相关抗原的抗体包括抗-GD2抗体[Anticancer Res.(抗癌研究),13,331-336(1993)],抗-GD3抗体[Cancer Immunol.Immunother.,36,260-266(1993)],抗-GM2抗体[Cancer Res.(癌症研究),54,1511-1516(1994)],抗-HER2抗体[Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,89,4285-4289(1992)],抗-CD52抗体[Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,89,4285-4289(1992)],抗-MAGE抗体[British J.Cancer(癌症),83,493-497(2000)],抗-HM1.24抗体[Molecular Immunol.(分子免疫学),36,387-395(1999)],抗-甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)抗体[Cancer(癌症),88,2909-2911(2000)],抗碱性成纤维生长因子抗体和抗-FGF8抗体[Proc.Nail.Acad,Sci.USA,86,9911-9915(1989)],抗碱性成纤维生长因子受体抗体和抗-FGF8受体抗体[J.Biol.Chem.(生物化学杂志),265,16455-16463(1990)],抗胰岛素样生长因子抗体[J.Neurosci.Res.,40,647-659(1995)],抗胰岛素样生长因子受体抗体[J.Neurosci.Res.,40,647-659(1995)],抗-PMSA抗体[J.Urology(泌尿学研究),160.2396-2401(1998)],抗血管内皮细胞生长因子抗体[Cancer Res.(癌症研究),57,4593-4599(1997)],抗血管内皮细胞生长因子受体抗体[OncoGene(基因),19,2138-2146(2000)],抗-CA125抗体，抗-17-lA抗体，抗整合素αvβ3抗体，抗-CD33抗体，抗-CD22抗体，抗-HLA抗体，抗-HLA-DR抗体，抗-CD20抗体，抗-CD 19抗体，抗-EGF受体抗体[Immunology Today(今日免疫学),21(8)，403-410(2000)],抗-CD 10抗体[American Journal of ClinicalPathology(美国临床病理杂志),113，374-382(2000)]等。
识别变态反应或炎症相关抗原的抗体包括抗白介素6抗体[Immunol.Rev.(免疫学研究),127,5-24(1992)],抗白介素6受体抗体[Molecular Immunol.(分子免疫学),31,371-381(1994)],抗白介素5抗体[Immunol.Rev(免疫学研究).,127,5-24(1992)],抗白介素5受体抗体和抗白介素4抗体[Cytokine(细胞因子),3,562-567(1991)],抗白介素4抗体[J.Immunol.Meth.(免疫学方法杂志),217,41-50(1991)],抗肿瘤坏死因子抗体[Hybridoma,13,183-190(1994)],抗肿瘤坏死因子受体抗体[Molecular PharmacoL,58,237-245(2000)],抗-CCR4抗体[Nature(自然),400,776-780(1999)],抗化学趋化因子抗体[J.Immuno.Meth.(免疫学方法杂志),174,249-257(1994)],抗化学趋化因子受体抗体[J.Exp.Med.(实验方法杂志),186,1373-1381(1997)],抗-IgE抗体，抗-CD23抗体，抗-CD 11a抗体[Immunology Today(今日免疫学),21(8),403-410(2000)],抗-CRTH2抗体[J.Immuno.(免疫学杂志),162,1278-1286(1999)],抗-CCR8抗体(WO99/25734),抗-CCR3抗体(US6207155)等等。
识别心血管疾病相关抗原的抗体包括抗-GpIIb/IIIa抗体[J.Immunol.(免疫学杂志),152,2968-2976(1994)],抗血小板衍生生长因子抗体[Science(科学),253,1129-1132(1991)],抗血小板衍生生长因子受体抗体[J.Biol.Chem.(生物化学杂志),272,17400-17404(1997)],抗凝血因子抗体[Circulation(循环),101,1158-1164(2000)]等等。
识别自体免疫性疾病相关抗原的抗体包括抗自体DNA抗体[Immunol.Letters,72,61-68(2000)]等等。
识别病毒或细菌感染相关抗原的抗体包括抗gp120抗体[Structure(结构),8,385-395(2000)],抗-CD4抗体[J.Rheumatology(风湿病学杂志),25,2065-2076(1998)],抗-CCR4抗体，抗-Vero toxin抗体[J.Clin.Microbiol,37,396-399(1999)],自身免疫性疾病的抗体(银屑病、风湿性关节炎、克隆氏病、溃疡性结肠炎、全身性红斑狼疮、脑脊髓多发性硬化，等),抗-CD11a抗体、抗-ICAM3抗体、抗-CD80抗体、抗-CD2抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-整合素α4β7抗体、抗-GD40L抗体、抗-IL-2抗体[Immunology Today(今日免疫学),21(8),403-410(2000)]，等等。
抗体分子可以任何抗体分子，只要它含有抗体的Fc区。例子包括抗体，抗体片段，含有Fc区的融合蛋白，等等。
抗体是作为外源抗原刺激在活体中引起的免疫系统产生的一种蛋白质，具有与抗原特异结合的活性。例子包括由用抗原免疫的动物的脾细胞制备的杂交瘤细胞分泌的抗体；遗传重组技术制备的抗体，也就是通过将插入了抗体基因的抗体表达载体导入宿主细胞中获得的抗体；等等。具体的例子包括由杂交瘤产生的抗体，人源化抗体，人抗体等等。
杂交瘤是用来自抗原免疫的非人哺乳动物的B细胞和来自鼠或类似来源的骨髓瘤细胞之间细胞融合获得的一种细胞，可产生具有所需抗原特异性的单克隆抗体。
人源化抗体包括人嵌合抗体，人CDR移植抗体等。
人嵌合抗体是包括非人抗体的重链可变区(以下称为“HV”或者“VH”，可变链和重链分别为“V区域”和“H链”)和非人抗体轻链的可变区(以下称为“LV”或者“VL”)，人抗体重链恒定区(在此后也称作为“CH”)和人抗体轻链恒定区(在此后也称作为“CL”)的抗体。对于非人动物，任何动物例如小鼠，大鼠，仓鼠，兔等都可以使用，只要可以从中制备杂交瘤。
通过从产生单克隆抗体的杂交瘤中制备编码VH和VL的cDNA，把它们插入用于宿主细胞的表达载体中，宿主细胞具有编码人抗体CH和人抗体CL的基因，构建表达人嵌合抗体的载体，然后把载体导入用于表达载体的宿主细胞，产生人嵌合抗体。
对于人嵌合抗体的CH，可以应用任何CH，只要其属于人的免疫球蛋白(以下称为“hIg”)。那些属于hIgG的类别是优选的，也可以使用任何属于hIgG类的亚类，如hIgG1，hIgG2，hIgG3和hIgG4。同样地，对于人嵌合抗体的CL，可以使用任何CL，只要其属于hIg类，并且也可以使用那些属于κ或者λ类的CL。
人CDR-移植抗体是其中非人动物抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到人抗体的VH和VL的合适位置的抗体。
人CDR-移植抗体可通过构建编码V区域的cDNA制备，其中来源于非人动物的抗体VH和VL的CDR移植到人抗体的VH和VL的CDR区域，将它们插入到用于宿主细胞的表达载体中，该宿主细胞含有编码人抗体CH和人抗体CL的基因，由此构建了用于人-CDR移植抗体的表达的载体，然后将表达载体导入到宿主细胞来表达人CDR-移植抗体。
对于人CDR-移植抗体的CH，可以使用任何CH，只要它属于hIg类，但hIgG是优选的，任何属于hIgG类的亚类，如hIgG1，hIgG2，hIgG3和hIgG4也可以使用。同样地，对于人CDR-移植抗体的CL，可以应用任何CL，只要其属于hIg类，并且也可以使用那些属于κ或者λ类的CL。
人抗体起初是人体中自然存在的抗体，但是也包括从人抗体噬菌体库，产生人抗体的转基因动物和产生人抗体的转基因植物中得到的抗体。产生人抗体的转基因动物和产生人抗体的转基因植物是以基因工程，细胞过程和发育工程技术的最新进展为基础制备的。
通过分离人外周血淋巴细胞，用EB病毒等感染使其永生化，把它克隆获得能够产生抗体的淋巴细胞，培养该淋巴细胞，从培养基中分离和纯化抗体而获得人体中存在的抗体。
人抗体噬菌体库是一种文库，其中通过把从人B细胞中制备的编码抗体的基因插入噬菌体基因，抗体片段如Fab(抗原结合片段)，单链抗体等表达于噬菌体的表面。表达具有所需要的抗原结合活性的抗体片段的噬菌体，可以使用它结合于固定化抗原的底物的活性，作为标记从文库中回收。抗体片段可以进一步通过重组DNA技术转化为包括两个全长H链和全长L链的人抗体分子。
产生人抗体的转基因非人动物是人抗体被导入细胞中的非人动物。特别是产生人抗体的转基因动物可通过将人抗体基因导入小鼠的胚胎干细胞中，将胚胎干细胞移植进其他小鼠的早期胚胎中，然后使其发育来制备。通过将人嵌合抗体基因导入受精卵中，并进行发育，也可以制备转基因非人动物。就从产生人抗体的转基因非人动物中制备人抗体而言，通过使用通常在非人哺乳动物进行的杂交瘤制备方法获得产生人抗体的杂交瘤，然后进行培养，可产生人抗体并在培养基中积累。
转基因的非人动物包括牛、绵羊、山羊、猪、马、小鼠、大鼠、家禽、猴、兔等。
在本发明中也优选抗体是可识别肿瘤相关抗原的抗体，识别变态反应或炎症相关抗原的抗体，识别心血管疾病相关抗原的抗体，识别自体免疫疾病相关抗原的抗体或识别病毒或细菌感染相关抗原的抗体，优选属于IgG型的人抗体。
抗体片段是含有部分抗体Fc区的片段。Fc区是位于抗体H链C末端的区域，包括天然类型和突变类。IgG型Fc区的部分根据Kabat等人EU指数的编号，是从C末端226位点的Cys到C末端，或从C末端230位点的Pro到C末端[Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)]。例子包括抗体，抗体片段，含有Fc区的融合蛋白，和类似物。抗体片段包括H链单体，H链二聚体和类似物。
含有Fc区部分的融合蛋白是一种蛋白质，其中由抗体或抗体片段的Fc区的抗体与蛋白质，如酶或细胞因子融合的一种蛋白质(此后称为“Fc融合蛋白”)。
本发明在下面详细解释。
1.制备本发明的细胞
本发明的细胞通过下列的技术制备。
(1)含有靶向编码酶基因组成的基因破坏技术
本发明的细胞通过使用靶向编码1,6-岩藻糖修饰酶的基因的基因破坏技术进行制备，通过。有关糖链修饰作用的酶包括αl,6-岩藻糖基转移酶，α-L-岩藻糖苷酶等，其中在N-糖苷连接糖链复合体中，岩藻糖的1-位与还原末端中N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键结合。
基因破坏法可以是任何方法，只要它包括破坏靶酶基因在内。例子包括同源重组法，RNA-DNA寡聚核苷酸(RDO)法，采用逆转录病毒的方法，使用转座子的方法等。这些方法具体描述如下。
(a)通过同源重组制备本发明的抗体产生细胞
本发明细胞可通过靶向编码α1,6-岩藻糖修饰酶基因的同源重组技术，在修饰染色体上的目的基因制备。
染色体上的目的基因可采用在鼠胚操作，实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室印刷)(1994)(此后称为“鼠胚操作，实验室手册”)中所述的方法进行修饰；基因靶向，实践方法，IRL Press at Oxford University Press(1993)；Biomanual Series8,基因靶向，采用ES细胞制备突变鼠，Yodo-sha(1995)(此后称为“采用ES细胞制备突变鼠”)；或类似方法，如下。
制备编码αl,6-岩藻糖修饰酶的cDNA。
根据获得的cDNA，制备编码αl,6-岩藻糖修饰酶的基因组DNA。
根据基因组DNA的核苷酸序列，为要被修饰的目的基因的同源重组体制备目的载体(例如，αl,6-岩藻糖修饰酶的结构基因，或启动子基因)。
本发明的宿主细胞的产生可通过将制备的目的载体导入宿主细胞中，并选择一种细胞，其中在目的基因和目的载体之间发生了同源重组。
如宿主细胞一样，可使用任何细胞如酵母，动物细胞，昆虫细胞或植物细胞，只要它具有编码αl,6-岩藻糖修饰酶的目的基因。例子包括在下面第3项中所述的细胞。
获得编码αl,6-岩藻糖基转移酶的cDNA或基因组DNA的方法包括如下所述的方法。
cDNA的制备方法：
从各种宿主细胞中制备总RNA或mRNA。
从制备的总RNA或mRNA制备cDNA文库。
以αl,6-岩藻糖修饰酶为基础产生简并引物，例如采用制备的cDNA文库作为模板，通过PCR获得编码αl,6-岩藻糖修饰酶的人氨基酸序列和基因片段。
可通过使用已获得的基因片段作为探针，筛选cDNA文库，获得编码αl,6-岩藻糖修饰酶的cDNA。
如各种细胞的mRNA一样，可使用市售产品(如，由Clontech制造)或可如下从多种宿主细胞中制备。从各种宿主细胞中制备总RNA的方法包括硫氰酸胍-三氟醋酸铯法[酶学方法，154,3(1987)]，酸性硫氰酸胍苯酚氯仿(AGPC)法[Analytical Biochemistry(生物化学),162,156(1987)；Experimental Medicine(Jikken Igaku),9,1937(1991)]和类似方法。
而且，从总RNA中制备mRNA为poly(A)+RNA的方法包括寡(dT)-固化纤维素柱法(分子克隆，第二版)和类似方法。
另外，使用如Fast Track mRNA分离试剂盒(Invitrogen制造)，QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制造)或类似的试剂盒制备mRNA。
从制备的人或非人动物组织或细胞mRNA制备cDNA文库。制备cDNA文库的方法包括在分子克隆，第二版；现代分子生物学方法，实验室手册，第二版(1989)；和类似文章中所述的方法，或使用市售试剂盒如进行cDNA合成和质粒克隆的Superscript质粒系统(LifeTechnologies制造)，ZAP-cDNA合成试剂盒(STRATAGENE(基因)制造)和类似试剂盒的方法。
如为制备cDNA文库的克隆载体，可使用任何载体如噬菌体载体，质粒载体或类似物，只要它可在大肠杆菌K12中自主复制。例子包括ZAP Express[STRATAGENE(基因)制造，Strategies,5,58(1992)],pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research(核酸研究),17,9494(1989)],Lambda ZAP II(STRATAGENE(基因)制造)，λgt10和λgt11[DNA克隆，实践方法，1,49(1985)],λTriplEx(Clontech制造)，λExCell(Pharmacia制造)，pcD2[Mol.Cell.Biol,3,280(1983)],PUC18[Gene(基因),33,103(1985)]和类似物。
任何微生物可用作制备cDNA文库的宿主微生物，优选大肠杆菌。例子包括大肠杆菌XLl-Blue MRJF'[STRATAGENE(基因)制造，Strategies,5,81(1992)],大肠杆菌C600[Genetics(遗传学),39,440(\954)],大肠杆菌Y1088[Science(科学),222.778(1983)],大肠杆菌Y1090[Science(科学),222.778(1983)],大肠杆菌NM522[J.Mol.Biol,166,1(1983)],大肠杆菌K802[J.Mol Biol.,16,118(1966)],大肠杆菌JM105[Gem,38,275(1985)]和类似物。
CDNA文库可用在随后的分析中，以便获得全长cDNA，通过降低infull长cDNA的比例尽可能有效，通过使用Sugano等人开发的寡帽法制备的cDNA文库[Gene(基因),138,171(1994)；Gene(基因),200,149(1997)；蛋白，核酸，蛋白,41,603(1996)；实验药物(Jikken Igaku),11,2491(1993)；cDNA克隆(Yodo-sha)(1996)；制备基因文库的方法(Yodo-sha)(1994)]可用在下面的分析中。
以αl,6-岩藻糖修饰酶的氨基酸序列为基础，制备推定编码氨基酸序列的核苷酸序列的5’末端和3’末端核苷酸序列特异的简并引物，DNA使用制备的cDNA文库作为模板，通过PCR扩增[PCR方法，Academic Press(1990)]，获得编码αl,6-岩藻糖修饰酶的基因片段。
通常通过用于分析核苷酸的方法，如Sanger等人的双脱氧法[Proc.Nail.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)]，核苷酸序列分析仪如ABEPRISM 377 DNA测序仪(PE Biosystems制造)或类似方法，已获得的基因片段能够被证实是编码α1,6-岩藻糖修饰酶的DNA。
编码αl,6-岩藻糖修饰酶的DNA可通过进行菌落杂交或噬斑杂交来获得(分子克隆，第二版)，使用基因片段作为DNA探针，在包含在人或非人动物组织或细胞中的mRNA获得合成的cDNA或cDNA文库。
编码αl,6-岩藻糖修饰酶的DNA也可通过进行PCR筛选而获得，使用从包含在人或非人动物组织或细胞中的mRNA合成的cDNA或cDNA文库作为模板，使用的引物可用来获得编码αl,6-岩藻糖修饰酶的基因片段。
已获得的编码αl,6-岩藻糖修饰酶的DNA的核苷酸序列从其末端进行分析，通过通常用于分析核苷酸的方法进行测定，如Sanger等人的双脱氧法[Proc.Nail.Acad,Sci.USA,74,5463(1977)]，核苷酸序列分析仪如ABIPRISM 377 DNA测序仪(PE Biosystems制造)或类似方法。
编码αl,6-岩藻糖修饰酶的基因也可从数据库中的基因确定，以确定的cDNA的核苷酸序列为基础，使用同源检索程序如BLAST通过搜索核苷酸序列数据库如GenBank,EMBL,DDBJ等。
编码α1,6-岩藻糖修饰酶的基因核苷酸序列含有SEQ ID NO:1或2所示的核苷酸序列。
编码αl,6-岩藻糖修饰酶的cDNA也可通过化学合成获得，以确定的DNA的核苷酸序列为基础，使用一种DNA合成仪，如Perkin Elmer制造的392型DNA合成仪，或使用亚磷酰胺方法化学合成得到。
作为制备编码α1,6-岩藻糖修饰酶的基因组DNA的方法例子，下面所述的方法举例说明。
基因组DNA的制备方法：
制备基因组DNA的方法包括已知的方法，其描述见分子克隆，第二版；现代分子生物学方法；和类似文献。另外，编码α1,6-岩藻糖修饰酶的基因组DNA也可采用试剂盒，如来进行基因组DNA文库筛选系统(Genome Systems制造)，通用GenomeWalkerTM试剂盒(CLONTECH制造)或类似物。
编码α1,6-岩藻糖修饰酶的基因组DNA的核苷酸序列含有SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列。
在目的基因的同源重组中使用的目的载体可根据下面所述的方法进行制备，如基因靶向，实践方法，IRL Press at Oxford University Press(1993)；Biomanual Series 8,基因靶向，采用ES细胞制备突变小鼠，Yodo-sha(1995)；或类似文献。目的载体可使用替换型和插入型。
为了将目的载体导入各种宿主细胞，可使用在下面第3项中所述的适合多种宿主细胞的导入重组载体的方法。
有效选择同源重组体的方法包括如正选择，启动子选择，负选择或polyA选择，其描述见基因靶向，实践方法，ERL Press at OxfordUniversity Press(1993)；Biomanual Series 8,基因靶向，采用ES细胞制备突变小鼠,Yodo-sha(1995)；或类似文献。从选择出的克隆中选择目的同源重组体的方法包括基因组DNA的Southern杂交法(分子克隆，第二版)，PCR[PCR方法，Academic Press(1990)],和类似方法。
同源重组体的获得能够以有关糖链修饰的酶的活性变化为基础，其中岩藻糖的1-位与N-乙酰氨基葡萄糖的6-位在N-糖苷连接糖链的还原末端通过α-键结合。下面的方法作为选择转化体的方法的例子，描述如下。
选择转化体的方法：
选择其中α1,6-岩藻糖修饰酶的活性降低或被消除的细胞的方法包括生物化学方法或遗传工程技术，其描述见新生物化学实验从书3-糖类I，糖蛋白(Tokyo Kagaku Dojin),日本生物化学协会主编(1988)；细胞工程增刊，实验方法从书，糖类生物学实验方法，糖蛋白，糖脂和蛋白多糖(ShujuN-sha),Naoyuki Taniguchi,Akemi Suzuki,KiyoshiFurukawa和Kazuyuki Sugawara主编(1996)；分子克隆，第二版；现代分子生物学方法；和类似文献。生物化学方法包括的方法中，酶活性通过使用一种酶特异性底物和类似物进行测定。遗传工程技术包括Northern分析，RT-PCR和类似的测量编码酶的基因的mRNA量的方法。
确定植物凝集素抗性细胞的方法包括确定GDP-岩藻糖合成酶，α1,6-岩藻糖修饰酶或GDP-岩藻糖转运酶表达的方法，在直接添加植物凝集素的培养基中培养细胞的方法。特别是细胞中α1,6-岩藻糖修饰酶之一的α1,6-岩藻糖基转移酶mRNA表达量。其中α1,6-岩藻糖修饰酶活性降低的细胞对植物凝集素是有抗性的。
而且，以α1,6-岩藻糖修饰剂活性降低引起的形态学变化为基础选择细胞的方法，包括以制备的抗体分子的糖链结构为基础选择转化体的方法，使用细胞膜糖蛋白的糖链结构选择转化体的方法，和类似方法。使用产生抗体分子的糖链结构选择转化体的方法包括在下面第5项中所述的方法。使用细胞膜糖蛋白的糖链结构选择转化体的方法包括选择对可识别糖链结构的植物凝集素有抗性的克隆，其中岩藻糖的1-位与N-糖苷连接糖链复合体还原末端中的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键结合。例子包括使用植物凝集素的方法，其描述见SomaticCell.Mol.Gene(基因)t.,12,51(1986)。
作为凝集素，可以使用任何凝集素，只要它是可以识别岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链的凝集素。例子包括小扁豆凝集素LCA(来源于Lensculinaris的扁豆凝集素)，豌豆凝集素PSA(来源于Pisum sativum的豌豆凝集素)，一种蚕豆凝集素VFA(来源于Vicia faba的凝集素)，陈皮木耳凝集素AAL(来源于Aleuria aurantia的凝集素)等等。
特别的是本发明的宿主细胞的选择可通过培养细胞1天至2周，优选3天至1周，在含有浓度为几十μg/ml至10mg/ml，优选0.5至2.0mg/ml的植物凝集素组成的培养基中培养，传代存活的细胞或挑选出的克隆，转移至培养瓶中，随后继续在含有植物凝集素的培养基中培养。
(b)通过RDO法制备本发明的细胞
本发明细胞的制备可通过RDO法，靶向编码α1,6-岩藻糖修饰酶的基因，例如如下进行。
制备编码α1,6-岩藻糖修饰酶的cDNA或基因组DNA。
测定制备的cDNA或基因组DNA的核苷酸序列。
以确定的DNA序列为基础，设计和合成含有目的基因的一部分翻译区，一部分非翻译区或一部分内含子的适当长度的RDO构建物。
本发明细胞的获得可通过将合成的RDO导入宿主细胞中，然后选择转化体，在转化体中，靶酶，也就是α1,6-岩藻糖修饰酶中发生了突变。
作为宿主细胞，可以使用任何细胞如酵母，动物细胞，昆虫细胞或植物细胞，只要它含有编码α1,6-岩藻糖修饰酶的基因。例子包括在下面第3项中所述的宿主细胞。
将RDO导入多种宿主细胞中的方法包括在下面第3项中所描述的导入多种宿主细胞所适合的重组载体。
制备编码α1,6-岩藻糖修饰酶的cDNA的方法包括在1(1)项中所描述的“cDNA的制备方法”和类似方法。
制备编码α1,6-岩藻糖修饰酶的基因组DNA的方法包括在1(1)(a)中所描述的“基因组DNA的制备方法”和类似方法。
DNA的核苷酸序列的测定可通过用合适的限制性酶消化，将DNA片段克隆进质粒如pBluescript SK(-)(StrataGene(基因)制造)中，将克隆进行反应，该反应通常用作分析核苷酸序列的方法，如Sanger等人的双脱氧法[Proc.Natl.Acad Sci.USA,74,5463(1977)]或类似方法，然后通过自动核苷酸序列分析仪，如A.L.F.DNA测序仪(Pharmacia制造)或类似方法来分析克隆。
RDO可通过常规的方法或采用DNA合成仪来制备。
选择其中通过将RDO导入宿主细胞中，在靶酶，编码α1,6-岩藻糖修饰酶的基因中有突变发生的细胞的方法，包括直接检测染色体基因中突变的方法，其描述见分子克隆，第二版，现代分子生物学方法和类似方法。
而且，也可使用在1(1)(a)中所描述的以α1,6-岩藻糖修饰酶活性变化为基础的“选择转化体的方法”。
RDO构建物可以按照Science(科学),2731386(1996),NatureMedicine(天然药物),4,285(l998),Hepatology(肝脏病学),25,1462(1997),Gene Therapy(基因治疗),5,1960(1999),；J Mol.Med.(分子药物杂志).,75,829(1997),Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA,96,8774(1999),Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA,96,8768(1999),Nuc.Acids Res(核酸研究).,27,1323(1999),Invest.Dematol.,111,1172(1998),Nature Biotech.(自然生物技术),16,1343(1998)；Nature Biotech.(自然生物技术),18,43(2000)；Nature Biotech.(自然生物技术),18,555(2000)等中描述的方法设计。
(c)通过使用转座子的方法制备本发明的细胞
本发明的细胞可使用一种转座子系统诱导突变进行制备，其描述见Nature Genet.(自然遗传学),25,35(2000)或类似文献，然后以α1,6-岩藻糖修饰酶的活性，或制备的抗体分子或细胞膜糖蛋白的糖链结构为基础选择突变体。
转座子系统是通过在染色体中随机插入外源基因诱发突变的系统，其中插入在转座子之间的外源基因一般用作诱发突变的载体，并且同时向细胞中导入用于在染色体中随机插入基因的转位酶表达载体。
可以使用任何转位酶，只要其适合于使用的转座子的序列。
作为外源基因，可以使用任何基因，只要它可以在宿主细胞的DNA中诱发突变。
作为细胞，可使用任何细胞如酵母，动物细胞，昆虫细胞或植物细胞，只要它含有编码靶α1,6-岩藻糖修饰酶的基因。例子包括在下列第3项中所描述的宿主细胞。
为了将编码抗体分子的基因导入作为宿主细胞的本发明的细胞中，可使用下面第3项中所描述的导入多种宿主细胞适合的重组载体的方法。
以α1,6-岩藻糖修饰酶活性为基础，选择突变体的方法包括在1(1)(a)中所描述的以α1,6-岩藻糖修饰酶活性变化为基础的“选择转化体的方法”。
(d)通过反义方法或核糖核酸酶法制备本发明的细胞
本发明的细胞通过反义法或核糖核酸酶法来制备，方法的描述见Cell Technology,12,239(1993)；BIO/TECHNOLOGY,17,1097(1999)；Hum.Mol Genet.,5,1083(1995)；Cell Technology,13,255(1994)；Proc.Nail Acad.Sci.USA,96,1886(1999)；或类似文献，如以下面的方式通过靶向编码α1,6-岩藻糖修饰酶的基因。
制备目的基因的cDNA或基因组DNA。
测定制备的cDNA或基因组DNA的核苷酸序列。
以确定的DNA序列为基础，设计含有目的基因的一部分翻译区，一部分非翻译区或一部分内含子的适当长度的反义基因或核糖核酸酶构建物。
为了在细胞中表达反义基因或核糖核酸酶，通过将制备的DNA的片段或全长插入至合适表达载体启动子的下游制备重组载体。
通过将重组载体导入适合表达载体的宿主细胞获得转化体。
本发明的细胞能够通过以目的基因编码的蛋白质的活性为基础，选择转化体而获得。本发明的细胞也能够通过以细胞膜糖蛋白的糖链结构或制备抗体分子的糖链结构为基础，选择转化体而获得。
作为用于产生本发明细胞的宿主细胞，可使用任何细胞，如酵母，动物细胞，昆虫细胞或植物细胞，只要它含有目的基因。例子包括在下面第3项中所描述的宿主细胞。
作为表达载体，使用可在宿主细胞中自主复制，或可被整合进染色体中的载体，它含有的启动子处被传递了设计的反义基因或核糖核酸酶。例子包括在下面第3项中所描述的表达载体。
作为将基因导入多种宿主细胞中的方法，可使用在下面第3项中所描述的导入多种宿主细胞适合的重组载体的方法。
获得目的基因cDNA或基因组DNA的方法包括在1(1)(a)中“cDNA的制备方法”和“基因组DNA的制备方法”中所描述的方法。
以目的基因编码的蛋白质的活性为基础，选择方法包括在1(1)(a)项中“选择转化体的方法”中所描述的方法。
而且，以目的基因编码的蛋白质的活性降低所引起的形态学变化为基础，选择细胞的方法包括以制备的抗体分子的糖链结构为基础选择转化体的方法，以细胞膜糖蛋白的糖链结构为基础选择转化体的方法，和类似方法。以制备的抗体分子的糖链结构为基础选择转化体的方法包括下面第5项中所描述的方法。以细胞膜糖蛋白的糖链结构为基础选择转化体的方法包括上述选择对可识别糖链结构的植物凝集素有抗性的菌株的方法，该糖链结构中岩藻糖的1-位与N-糖苷连接糖链复合体还原末端中的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键结合。例子包括使用植物凝集素的方法，其描述见Somatic Cell.Mol.Gene(基因)t.,12,51(1986)。
而且，本发明的细胞可不使用表达载体而获得，通过直接将反义寡聚核苷酸或核糖核酸酶导入宿主细胞中，它们是以目的基因的核苷酸序列为基础设计的。
反义寡聚核苷酸或核糖核酸酶可通过通常的方法或使用DNA合成仪来制备。特别地是，其制备可用具有连续5至150个碱基，优选5至60个碱基，更优选10至40个碱基相应序列的寡聚核苷酸的序列信息为基础，在目的基因cDNA和基因组DNA的核苷酸序列中，通过合成寡聚核苷酸来进行，该寡聚核苷酸对应于与寡聚核苷酸互补的序列(反义寡聚核苷酸)或含有寡聚核苷酸序列的核糖核酸酶。
寡聚核苷酸包括寡聚RNA和寡聚核苷酸的衍生物(此后称为“寡聚核苷酸衍生物”)。
寡聚核苷酸衍生物包括其中寡聚核苷酸中的磷酸二酯键被转换为硫代磷酸键的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的磷酸二酯键被转变为N3'-P5'phosphoamidate键的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的核糖和磷酸二酯键被转变为肽-核酸键的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的尿嘧啶被C-5 propynyluracil替换的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的尿嘧啶被C-5噻唑尿嘧啶替换的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的胞嘧啶被C-5 propynylcytosine替换的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的胞嘧啶被吩嗪修饰的胞嘧啶替换的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的核糖被2'-O-丙基核糖替换的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的核糖被2'-甲氧乙氧基核糖替换的寡聚核苷酸衍生物[Cell Technology(Saibo Kogakn),l6,1463(1997)]。
(e)通过RNAi法制备本发明的细胞
本发明细胞可通过RNAi(RNA干涉)法靶向编码本发明蛋白的基因而制备，例如如下。RNAi法是指双链RNA被导入细胞中，存在于细胞中与RNA序列同源的mRNA被分解和破坏，抑制基因表达的方法。
制备目的基因的cDNA。
测定制备的cDNA的核苷酸序列。
以确定的DNA序列为基础，设计由目的基因的一部分翻译区或非翻译区组成的适当长度的RNAi基因构建物。
为了在细胞中表达RNAi基因，通过将制备的DNA的全长或片段插入至合适表达载体启动子的下游制备重组载体。
通过将重组载体导入适合表达载体的宿主细胞获得转化体。
本发明的细胞可以目的基因编码的蛋白质的活性或制备的抗体分子或细胞膜糖蛋白的糖链结构为基础，通过选择转化体而获得。
作为宿主细胞，可使用任何细胞，如酵母，动物细胞，昆虫细胞或植物细胞，只要它含有编码制备的抗体分子为目标的基因。例子包括在下面第3项中所描述的宿主细胞。
作为表达载体，使用可在宿主细胞中自主复制，或可被整合进染色体中的载体，它含有的启动子处被转入了设计的RNAi基因。例子包括在下面第3项中所描述的表达载体。
作为将基因导入多种宿主细胞中的方法，可使用下面第3项中所描述的导入多种宿主细胞适合的重组载体的方法。
以目的基因编码的蛋白质的活性为基础选择转化体的方法或以细胞膜糖蛋白糖链结构为基础选择转化体的方法包括在1(1)(a)项中所描述的方法。以制备的抗体分子糖链结构为基础选择转化体的方法包括在下面第5项中所描述的方法。
制备目的基因编码蛋白质的cDNA的方法包括在1(1)(a)项中“cDNA的制备方法”中所描述的方法和类似方法。
而且，本发明的细胞可不使用表达载体而获得，可通过直接导入以目的基因的核苷酸序列为基础设计的RNAi基因。
可通过常规方法或使用DNA合成仪制备RNAi基因。
RNAi基因构建物的设计可根据下面所描述的方法，见Nature(自然),391,806(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,95,15502(1998)；Nature(自然),395,854(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,96,5049(1999)；Cell(细胞),95,1017(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,96,1451(1999)；Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,95,13959(1998)；Nature(自然)Cell Biol,2,70(2000)；和类似文献。
在本发明的RNAi法中使用的RNA包括与编码有关糖链修饰的酶蛋白的DNA对应的RNA，所述的糖链中岩藻糖的1-位与N-糖苷连接糖链复合体还原末端中的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键结合，并优选与编码αl,6-岩藻糖基转移酶的DNA对应的RNA，该酶作为有关糖链修饰的酶蛋白，所述的糖链中岩藻糖的1-位与N-糖苷连接糖链复合体还原末端中的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键结合。
作为本发明的RNAi法中使用的RNA，可使用任何RNA，只要它是由RNA及其互补RNA组成的双链RNA，能够降低αl,6-岩藻糖基转移酶mRNA的量。关于RNA的长度，此RNA是优选1至30，更优选5至29，仍更优选10至29和最优选15至29个的连续RNA。
(2)通过导入显性失活突变体的方法制备本发明的细胞
本发明的细胞可通过使用导入蛋白质的显性失活突变体的方法靶向α1,6-岩藻糖修饰酶而制备。
作为显性失活突变体，例子为涉及细胞内糖核苷酸，GDP-岩藻糖转运至高尔基体的蛋白质。
已知细胞内糖核苷酸的转运子在内质网或高尔基体的膜上是以二聚体的形式起作用的[J.Biol.Chem.(生物化学杂志),275,17718(2000)]。也有报道，当细胞内糖核苷酸转运子的突变体在细胞内强制表达时，用野生型转运子形成杂二聚体，形成的杂二聚体具有抑制野生型同型二聚体的活性[J.Biol.Chem.(生物化学杂志),275,17718(2000)]。因此，制备细胞内糖核苷酸转运子的突变体，并导入细胞中以便作为显性失活突变体起作用。可采用位点定向诱变法来制备突变体，其描述见分子克隆，第二版，现代分子生物学方法和类似文献。
本发明细胞可采用根据下面文献中所描述的方法在上面制备的α1,6-岩藻糖修饰酶的显性失活突变体基因来制备，见分子克隆，第二版，现代分子生物学方法，操作鼠胚，或类似文献，例如如下。
制备α1,6-岩藻糖修饰酶的显性失活突变体基因。
以制备的显性失活突变体基因的全长DNA为基础，如果需要，制备含有部分编码蛋白质的适当长度的DNA片段。
通过将DNA片段或全长DNA插入至合适表达载体的启动子下游制备重组载体。
通过将重组载体导入适合表达载体的宿主细胞中获得转化体。
本发明的宿主细胞可以α1,6-岩藻糖修饰酶的活性或制备抗体分子或细胞膜糖蛋白的糖链结构为基础选择转化体而制备。
作为宿主细胞，可使用任何细胞，如酵母，动物细胞，昆虫细胞或植物细胞，只要它含有编码靶蛋白的基因。例子包括在下面第3项中描述的宿主细胞。
作为表达载体，使用可在宿主细胞中自主复制，或可被整合进染色体中的载体，它含有的启动子处编码目的显性失活突变体的DNA的转录可受影响。例子包括在下面第3项中所描述的表达载体。
作为将基因导入多种宿主细胞中的方法，可使用在下面第3项中所描述的导入多种宿主细胞适合的重组载体的方法。
以靶蛋白质的活性为基础选择突变体的方法或以细胞膜糖蛋白的糖链结构为基础选择突变体的方法包括上面1(1)项中所描述的方法。以制备的抗体分子的糖链结构为基础选择突变体的方法包括在下面第4项中所描述的方法。
(3)将突变导入酶中的方法
本发明细胞的制备可通过将突变导入编码α1,6-岩藻糖修饰酶的基因中，然后选择其中在酶中发生突变的目的克隆。
有关糖链修饰的酶包括α1,6-岩藻糖基转移酶，α-L-岩藻糖苷酶和类似物，所述的糖链中岩藻糖的1-位与N-糖苷连接糖链复合体还原末端中的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键结合。
方法包括1)一种方法，其中所需的克隆选自用诱变剂处理亲代细胞系诱导突变产生的突变体或以α1,6-岩藻糖修饰酶的活性为基础自发产生的突变体，2)一种方法，其中所需的克隆选自用诱变剂处理亲代细胞系诱导突变产生的突变体或以制备的抗体分子的糖链结构为基础自发产生的突变体和3)一种方法，其中所需的克隆选自用诱变剂处理亲代细胞系诱导突变产生的突变体或以细胞膜糖蛋白的糖链结构为基础自发产生的突变体。
作为诱导突变的处理，可以使用任何处理方法，只要它可诱导亲代细胞系中的DNA点突变，删除或移码突变。例子包括用乙基亚硝基脲，亚硝基胍，苯并芘或吖啶颜料处理，并用放射线处理。多种烷化剂和致癌剂也可用作诱变剂。使诱变剂作用于细胞的方法包括在组织培养技术，第三版(Asakura Shoten),日本组织培养协会主编(1996),Nature(自然)Genet.,24,314(2000)和类似文献中描述的方法。
自发产生的突变体包括在普通的细胞培养条件下不应用特殊的突变诱导处理，通过连续传代培养自发形成的突变体。
以α1,6-岩藻糖修饰酶的活性为基础选择目的克隆的方法，以制备的抗体分子的糖链结构为基础选择目的糖链的方法和以细胞膜糖蛋白的糖链结构为基础选择目的克隆的方法包括在1(1)(a)项中所描述的以α1,6-岩藻糖修饰酶活性变化为基础的“选择转化体的方法”。
(4)抑制GDP-岩藻糖转运蛋白的转录或翻译的方法
本发明宿主细胞可通过靶向编码α1,6-岩藻糖修饰酶的基因和采用反义RNA/DNA技术抑制目的基因的转录或翻译[BioScience(科学)and Industry,50,322(1992)；Chemistry(Kagaku),46,681(1991)；Biotechnology,9,358(1992)；Trends in Biotechnology,10,87(1992),Trends in Biotechnology,10,152(1992),Cell Technology,16,1463(1997)],三-herix技术[Trends in Biotechnology,10,132(1992)]或类似方法来制备。
2.制备本发明的转基因非人动物或植物或其子代
本发明的转基因非人动物或植物或其子代是其基因组基因被修饰的转基因非人动物或植物或其子代，修饰的方式是有关抗体分子糖链修饰的酶活性可被控制，可根据第1项中所描述的方法从胚胎干细胞，受精卵细胞或植物细胞，通过靶向编码α1,6-岩藻糖修饰酶的基因而制备。
有关糖链修饰的酶包括α1,6-岩藻糖基转移酶，α-L-岩藻糖苷酶和类似物，所述的糖链中岩藻糖的1-位与N-糖苷连接糖链复合体还原末端中的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键结合。
特殊的方法如下所述。
在转基因非人动物中，本发明的胚胎干细胞的制备可通过将在第1项中所描述的方法应用于所需的非人动物如牛、绵羊、山羊、猪、马、小鼠、大鼠、家禽、猴、兔或类似动物的胚胎干细胞，其中α1,6-岩藻糖修饰酶的活性可被控制。
特别地是，突变的克隆可通过使用一种已知的同源重组技术被制备，其中编码α1,6-岩藻糖修饰酶的基因被灭活或用任何序列取代[如，Nature(自然),326,6110,295(1987)；Cell(细胞),51.,3,503(1987)；或类似文献]。使用制备的突变克隆，含有胚胎干细胞克隆和正常细胞的嵌合个体的制备可通过注射嵌合体进入动物受精卵囊胚的方法或通过嵌合体聚集法。嵌合个体与正常个体杂交，以便获得转基因非人动物，其中在整个机体细胞中α1,6-岩藻糖修饰酶的活性是降低的。
根据在基因靶向，实践方法，IRL Press at Oxford University Press(1993)；Biomanual丛书8,基因靶向，使用ES细胞制备突变小鼠，Yodo-sha(1995)或类似文献中所描述的方法为目的基因的同源重组制备靶载体。靶载体可用替代型，插入型和基因捕获型中的任何一种。
作为将靶载体导入胚胎干细胞中的方法，可使用任何方法，只要它可将DNA导入动物细胞中。例子包括电穿孔[Cytotechnology(电穿孔),3,133(1990)]，磷酸钙法(日本已公布的未审查专利申请227075/90号)，脂染法[Proc.Nail Acad Sci.USA,84,7413(1987)]，注射法[操作鼠胚，实验室手册]，使用基因枪的方法(基因枪)(日本专利2606856号,日本专利2517813号),DEAE-葡聚糖法[Biomanual丛书4-基因传递和表达分析(Yodo-sha),Takashi Yokota和Kenichi Arai主编(1994)]，病毒载体法[操作鼠胚，第二版]和类似方法。
有效选择同源重组体的方法包括以下的方法，如正选择，启动子选择，负选择或polyA选择，其描述见基因靶向，实践方法，IRL Pressat Oxford University Press(1993),或类似文献。特别是在含有hprt基因的靶载体的情况下，它可被导入hprt基因缺陷的胚胎干细胞中，胚胎干细胞培养在含有氨基蝶呤，次黄嘌呤和胸腺嘧啶的培养基中，通过选择含有氨基蝶呤抗性克隆的同源重组体进行可选择hprt基因同源重组体的正选择。在含有新霉素抗性基因的靶载体的情况下，导入载体的胚胎干细胞培养在含有G418的培养基中，通过选择含有新霉素抗性基因的同源重组体进行正选择。在含有DT基因的靶载体情况下，培养导入载体的胚胎干细胞，通过选择生长克隆进行无DT基因同源重组体的负选择(因为DT基因表达，同时被整合在染色体中，被随机而不是同源重组导入染色体中的重组体由于DT的毒性而不能生长)。在已选择的克隆中选择目的同源重组体的方法包括基因组DNA的Southern杂交(分子克隆，第二版),PCR[PCR方法，Academic Press(1990)]和类似方法。
当胚胎干细胞采用嵌合体聚集法被导入受精卵中时，通常优选使用在8细胞期之前的发育期的受精卵。当胚胎干细胞使用注射嵌合体法被导入受精卵中时，通常优选使用8细胞期至囊胚期之间的发育期的受精卵。
当受精卵被移植进雌性小鼠中时，优选人工移植或种植从假孕雌性小鼠中获得的受精卵，其受精是通过与被结扎的雄性非人哺乳动物交配所诱发的。尽管假孕的雌性小鼠可通过自然的交配获得，但在应用促黄体激素释放激素(此后称为“LHRH”)或其类似物后，被诱发受精的假孕雌性小鼠可通过与雄性小鼠交配而获得。LHRH的类似物包括[3,5-Dil-Tyr5]-LHRH,[Gln8]-LHRH,[D-Ala6]-LHRH,des-GlylO-[D-His(Bzl)6]-LHRH乙胺和类似物。
本发明的受精卵细胞的制备也可通过将第1项中所描述的方法用于目的非人动物如牛、绵羊、山羊、猪、马、小鼠、大鼠、家禽、猴、兔或类似动物的受精卵，所述受精卵中α1,6-岩藻糖修饰酶的活性是降低的。
其中α1,6-岩藻糖修饰酶活性降低的转基因非人动物的制备可通过将制备的受精卵细胞移植至假孕雌性的输卵管或子宫中，使用在操作鼠胚，第二版或类似文献中所描述的胚胎移植法，然后动物分娩。
在转基因植物中，其中α1,6-岩藻糖修饰酶活性降低的本发明胼胝体的制备可通过将第1项中所描述的方法应用于目的植物的胼胝体或细胞中。
其中α1,6-岩藻糖修饰酶活性降低的转基因植物的制备可根据已知的方法，通过使用由生长素和细胞分裂素组成的培养基培养制备的胼胝体，使其再分化[Tissue Culture,20(1994)；Tissue Culture,21(1995)；Trends in Biotechnology,15,45(1997)]。
3.产生抗体组合物的方法
抗体组合物的获得可通过使用在下面文献中所描述的方法将其在宿主细胞中表达，见分子克隆，第二版，现代分子生物学方法，抗体，实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory,1988(此后称为“抗体”)；单克隆抗体：原理和实践，第三版，Acad.Press,1993(此后有时称为“单克隆抗体”)；和抗体工程，实践方法，IRL Press at Oxford University Press(此后有时称为“抗体工程”)，例如如下。
制备抗体分子的cDNA。
以制备的抗体分子的全长cDNA为基础，如果需要，制备含有部分编码蛋白质的组成的适当长度的DNA片段。
通过将DNA片段或全长cDNA插入至适当表达载体启动子的下游制备重组载体。
产生抗体分子的转化体可通过将重组载体导入适合表达载体的宿主细胞中而获得。
作为宿主细胞，可以使用任何酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或类似物，只要它表达目的基因。
涉及与抗体分子的Fc区结合的N-糖苷连接糖链修饰的酶通过遗传工程技术被导入的细胞如酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或类似物也可用作宿主细胞。
用于产生抗体组合物的宿主细胞包括在上面1中所制备的本发明细胞。
作为表达载体，使用可在宿主细胞中自主复制，或可被整合进染色体中的载体，它含有的启动子处可传递编码目的抗体分子的DNA。
根据在1(1)(a)中“cDNA的制备方法”中所描述的方法，使用，例如目的抗体分子特异的探针引物从人或非人组织或细胞中制备cDNA。
当酵母用作宿主细胞，表达载体包括YEP 13(ATCC 37115),YEp24(ATCC 37051),YcpS50(ATCC 37419)等。
可使用任何启动子，只要它可在酵母中发挥作用。例子包括糖酵解途径的基因如己糖激酶基因的启动子，PHO5启动子，PGK启动子，GAP启动子，ADH启动子，gal 1启动子，gal 10启动子，热休克蛋白启动子，MF αl启动子，CUP 1启动子等。
宿主细胞包括属于下列的种属，如酵母属，裂殖酵母属，克鲁维酵母属，丝孢酵母属，Schwanniomyces属和类似种属，如酿酒酵母，非洲粟酒彭贝裂殖酵母,乳酸克鲁维酵母,芽毛孢子菌和Schwanniomyces alluvins。
作为导入重组载体的方法，可使用任何方法，只要它可将DNA导入酵母中。例子包括电穿孔[Methods in Enzymology,194,182(1990)],原生质球法[Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,84,1929(1978)],醋酸锂法[J.Bacterial,153,163(1983)],在Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,75,1929(1978)中描述的方法和类似方法。
当动物细胞用作宿主细胞时，表达载体包括pcDNAI,pcDMS(从Funakoshi获得)，pAGE107[日本已公布未实审的专利申请22979/91号；Cytotechnology(电穿孔),3,133(1990)],pAS3-3(日本已公布未实审的专利申请227075/90号)，pCDMS[Nature(自然),329,840(1987)],pcDNAI/Amp(Invitrogen制造)，pREP4(Invitrogen制造),pAGE 103[J.Biochemistry(生物化学),101,1307(1987)],pAGE210和类似物。
可使用任何启动子，只要它能在动物细胞中发挥作用。例子包括巨细胞病毒(CMV)基因的IE(极早期)启动子，SV40的早期启动子，逆转录病毒的启动子，金属硫蛋白的启动子，热休克启动子，SRα启动子等。人CMVIE基因的增强子可与启动子一起使用。
宿主细胞包括人的细胞如Namalwa细胞，猴细胞如COS细胞，中国仓鼠细胞如CHO细胞或HBT5637(日本已公布未实审的专利申请No.299/88)，大鼠骨髓瘤细胞，小鼠骨髓瘤细胞，来自叙利亚仓鼠肾的细胞，胚胎干细胞，受精卵细胞和类似细胞。
作为导入重组载体的方法,可使用任何方法,只要它可将DNA导入动物细胞中。例子包括电穿孔[Cytotechnology(电穿孔),3,133(1990)]，磷酸钙法(日本已公布未实审的专利申请No.227075/90)，脂染法[Proc.Natl.Acad Sci.USA,84,7413(1987)]，注射法[操作鼠胚，实验室手册]，采用基因枪的方法(基因枪)(日本专利2606856号,日本专利2517813号)，DEAE-葡聚糖法[Biomanita从书4-基因传递和表达分析(Yodo-sha)，Takashi Yokota和Kenichi Arai主编(1994)]，病毒载体法(操作鼠胚，第二版)和类似物。
当昆虫细胞用作宿主，蛋白质可通过在现代分子生物学方法，杆状病毒表达载体，实验室手册，W.H.Freeman and Company,New York(1992),Bio/Technology,6,47(1988)或类似文献中所描述的方法进行表达，
蛋白质可通过在昆虫培养的上清液中获得重组病毒，然后用重组病毒感染昆虫细胞来表达。
在此方法中使用的基因导入载体包括pVL1392,pVL1393,pBlueBacIII(所有都由Invitrogen制造)和类似物。
杆状病毒包括加州苜蓿夜蛾核多角体病毒，可被甘蓝夜蛾家族的昆虫感染。
昆虫细胞包括草地贪夜蛾Sf9和Sf21的卵母细胞[现代分子生物学方法，杆状病毒表达载体，实验室手册，W.H.Freeman and Company,New York(1992)]，粉纹夜蛾High 5的卵母细胞(Invitrogen制造)和类似细胞。
为制备重组病毒将重组基因导入载体和杆状病毒共同导入的方法包括磷酸钙法(日本已公布未实审的专利申请227075/90号)，脂染法[Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,84,7413(1987)]和类似方法。
当植物细胞用作宿主细胞时，表达载体包括Ti质粒，烟草花叶病毒载体和类似载体。
作为启动子，可使用任何启动子，只要它能在植物细胞中发挥作用。例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，大米肌动蛋白1启动子和类似启动子。
宿主细胞包括烟草、马铃薯、胡萝卜、大豆、油菜、苜蓿、大米、小麦、大麦和类似的植物细胞。
作为导入重组载体的方法，可使用任何方法，只要它可将DNA导入植物细胞中。例子包括使用土壤杆菌(日本已公布未实审的专利申请140885/84号，日本已公布未实审的专利申请70080/85号,WO 94/00977)的方法，电穿孔(日本已公布未实审的专利申请251887/85号)，使用基因枪(基因枪)的方法(日本专利2606856号,日本专利2517813号)和类似方法。
作为表达抗体基因的方法，Fc区与其他蛋白的融合蛋白等的分泌产生，表达除了直接表达以外，可根据在分子克隆，第二版或其他文献中描述的方法进行。
当基因由酵母，动物细胞，昆虫细胞或植物细胞表达时，细胞中被导入了涉及糖链合成的基因，可获得通过被导入基因加入了糖或糖链的抗体分子。
抗体组合物的获得，可通过在培养基中培养已获得的转化体，以在培养基中产生和积累抗体分子，然后从得到的培养基中回收。采用培养基培养转化体的方法可根据通常用于培养宿主细胞的方法进行。
作为碳源。可使用那些被生物体吸收的碳源。例子包括碳水化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖，含有它们的糖蜜、淀粉和淀粉水解物；有机酸如乙酸和丙酸；醇类如乙醇和丙醇；和类似物。
氮源包括氨；无机酸或有机酸的铵盐如氯化铵、硫酸铵、醋酸铵和磷酸铵；其他含氮的化合物；蛋白胨；肉膏；酵母提取物；玉米浆；酪蛋白水解物；大豆粕(soybean meal)；大豆粕水解物；多种发酵细胞及其水解物；和类似物。
无机物包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸铜、碳酸钙和类似物。
通常在需氧的条件如振摇培养或水下换气搅拌培养系统中进行培养。培养的温度优选15至40℃，培养时间通常在16小时至7天。在培养中，pH维持在3.0至9.0。用无机酸或有机酸，碱溶液，尿素，碳酸钙，氨或类似物调整pH。
如果需要，在培养中可加入抗生素如氨苄青霉素或四环素至培养基。
当用通过使用诱导型启动子作为启动子获得的重组载体转化的微生物被培养时，如果需要可向培养基中加入诱导物。例如，当用通过lac启动子获得的重组载体转化的微生物被培养时，可向培养基中加入异丙基-β-D-硫基半乳糖吡喃糖苷，当用通过trp启动子获得的重组载体转化的微生物被培养时，可向培养基中加入吲哚丙烯酸。
当使用动物细胞作为宿主细胞获得的转化体被培养时，培养基包括通常使用的RPMI 1640培养基[美国医学协会月刊,199,519(1967)],Eagle's MEM培养基[科学,122,501(1952)],Dulbecco's modified MEM培养基[病毒学,8,396(1959)],199培养基[生物医学学会进展,73,1(1950)]和Whitten培养基[发育工程实验手册-制备转基因小鼠(KodaN-sha),M.Katsuki主编(1987)]，添加小牛血清等的培养基和类似物。
培养通常在pH 6至8，30至40℃，5％CO2下进行1至7天。
如果需要，可在培养中加入抗生素如卡那霉素或青霉素。
培养使用昆虫细胞作为宿主获得的转化体的培养基包括通常使用的TNM-FH培养基(Pharmingen制造)，Sf-900 II SFM培养基(LifeTechnologies制造)，ExCell 400和ExCell 405(都由JRH BioScience(科学)s制造),Grace昆虫培养基[Nature(自然),195,788(1962)]和类似培养基。
培养通常在中性pH 6至7，25至30℃进行1至5天。
另外，如果需要，在培养过程中可向培养基中加入抗生素如庆大霉素。
使用植物细胞作为宿主细胞获得的转化体可作为细胞培养，或在将其分化成为植物细胞或器官之后培养。培养转化体的培养基包括通常使用的Murashige和Skoog(MS)培养基和White培养基，加入植物激素如生长素，细胞因子等的培养基，和类似培养基。
培养通常在pH 5至9，20至40℃进行3至60天。
如果需要，在培养中可向培养基中加入抗生素如卡那霉素或潮霉素。
因此，抗体组合物的产生可通过培养来自酵母，动物细胞或植物细胞的转化体，根据通常的培养方法，从而产生和积累抗体组合物，然后从培养基中回收抗体组合物，其中转化体含有的重组载体中被插入了编码抗体分子的DNA。
产生抗体组合物的方法包括在宿主细胞中的细胞内表达方法，从宿主细胞的细胞外分泌方法，在宿主细胞膜外膜上产生的方法。可根据所使用的宿主细胞或产生的抗体组合物结构的改变来选择方法。
当本发明的抗体组合物在宿主细胞中或宿主细胞膜外膜上产生时，根据Paulson等人的方法[J.Biol.Chem.(生物化学杂志),264,17619(1989)],Lowe等人的方法[Proc.Natl.Acad Sci.USA,86,8227(1989),Gene(基因)s Develop.,4,1288(1990)],在日本已公布未实审的专利申请336963/93号和日本已公布未实审的专利申请823021/94号中描述的方法和类似方法，它可被主动分泌至细胞外。
也就是，通过使用基因重组技术，在表达载体中插入一个编码抗体分子的DNA和编码适合表达抗体分子的信号肽的DNA进入，将表达载体导入宿主细胞中，然后表达抗体分子，目的抗体分子可从宿主细胞中主动地被分泌至细胞外。
根据在日本已公布未实审的专利申请227075/90号中描述的方法也可通过使用一种基因扩增系统，使用二氢叶酸还原酶基因增加其产量。
另外，抗体组合物也可通过使用导入了基因的动物个体(转基因非人动物)或植物个体(转基因植物)来产生，其构建是通过被导入了基因的动物或植物细胞的再分化。
当转化体是动物个体或植物个体，抗体组合物的产生可根据一种通常的方法通过饲养或培养该个体产生和积累抗体组合物，然后从动物或植物个体中回收抗体组合物。
通过使用动物个体产生抗体组合物的方法包括一种目的抗体组合物在根据一种已知方法导入基因而构建的动物中产生的方法[AmericanJournal of Clinical Nutrition,63,627S(1996)；Bio/Technology,9,830(1991)]。
在动物个体的情况下，抗体组合物的产生可通过饲养转基因的非人动物，该动物被导入了编码抗体分子的DNA，因而在动物中产生和积累抗体组合物，然后从动物中回收抗体组合物。动物中产生和积累组合物的位置包括乳汁(日本已公布未实审的专利申请309192/88号)和动物的卵。作为在此情况下使用的启动子，可使用任何启动子，只要它可在动物中发挥作用。优选的例子包括乳腺细胞特异性启动子如酪蛋白启动子，β酪蛋白启动子，β乳球蛋白启动子，乳清酸性蛋白启动子和类似启动子。
通过使用植物个体产生抗体组合物的方法包括一种方法，其中抗体组合物的产生是通过培养一种转基因植物，该植物通过已知的方法被导入了编码抗体分子的DNA[Tissue Culture,20(1994)；Tissue Culture,21(1995)；Trends in Biotechnology,15,45(1997)]，以在植物中产生和积累抗体组合物，然后从植物中回收抗体组合物。
关于通过转化体产生的抗体组合物的纯化而言，该转化体中被导入了编码抗体分子的基因，例如当抗体组合物在细胞内以溶解状态表达时，培养后的细胞离心回收，悬浮在水缓冲液中，然后用超声波振荡器,French press,Manton Gaulin匀浆器,dynomill或类似方法破坏获得无细胞提取物。从通过离心无细胞提取物获得的上清液中可获得抗体组合物的纯化产物，通过使用通常的酶分离纯化技术如溶剂提取；盐析和硫酸铵脱盐等；用有机溶剂沉淀；使用树脂如二乙氨乙基(DEAE)-琼脂糖凝胶或DIAION HPA-75(Mitsubishi Chemical制造)的阴离子交换色谱；使用树脂如S-Sepharose FF(Pharmacia制造)的阳离子交换树脂；使用树脂如丁基-琼脂糖凝胶，苯基-琼脂糖凝胶的疏水色谱；使用分子筛的凝胶过滤；亲和色谱；色谱聚焦；电泳如等电点聚焦；和类似单独使用或联合使用的方法。
当抗体组合物也通过形成不溶体在细胞内表达时，以相同的方式回收细胞，破坏和离心，抗体组合物的不溶体作为沉淀部分被回收。回收的抗体不溶体采用蛋白质变性剂溶解。通过稀释或透析溶解的溶液，将抗体组合物制成正常的三维结构，然后通过相同的分离纯化方法获得抗体组合物的纯化产物。
当抗体组合物被分泌至细胞外时，抗体组合物或其衍生物从培养上清液中回收。即，通过如离心的技术处理培养基获得可溶的部分，从可溶的部分中通过相同的分离纯化方法获得抗体组合物的纯化制剂。
因此得到的抗体组合物包括抗体，抗体片段，由抗体Fc区组成的融合蛋白，和类似物。
作为获得抗体组合物的例子，产生人源化抗体组合物和Fc融合蛋白的方法在下面详述，但其他的抗体组合物也可用类似于该法的方式获得。
A.制备人源化抗体组合物
(1)构建人源化抗体表达的载体
人源化抗体表达的载体是插入了编码人抗体H链和L链C区基因的动物细胞表达载体，其构建可通过将编码人抗体每条CH和CL的基因克隆进动物细胞的表达载体中。
人抗体的C区可以是任何人抗体的CH和CL。例子包括人抗体H链中属于IgGl亚型的C区(此后称为"hCγl"),人抗体L链中属于K型的C区(此后称为"hCκ"),和类似物。
作为编码人抗体CH和CL的基因，可使用由外显子和内含子组成的染色体DNA，也可使用cDNA。
作为动物细胞的表达载体，可使用任何载体，只要编码人抗体C区的基因可被插入其中并在其中表达。例子包括pAGE 107[Cytotechnology(电穿孔),3,133(1990)],pAGE103[J.Biocfiem.,101,1307(1987)],pHSG274[Gene(基因),27,223(1984)],pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,78,1527(1981),pSGlβd2-4[Cytotechnology(电穿孔),4,173(1990)]等。在动物细胞的表达载体中的启动子和增强子含有SV40早期启动子和增强子[J.Biochem.(生物化学杂质),101,1307(1987)],莫罗尼鼠白血病病毒LTR启动子[Biochem.Biophys.Res.Comnun.,149,960(1987)],免疫球蛋白H链启动子[Cell(细胞),41,479(1985)]和增强子[Cell(细胞),33,717(1983)]和类似物。
已构建的人源化抗体表达载体可用来在动物细胞中表达人嵌合抗体和人CDR-移植抗体。
(2)编码非人动物抗体V区cDNA的制备方法
编码非人动物抗体如鼠抗体VH和VL的cDNA可以下列的方式获得。
cDNA从产生目的鼠抗体的杂交瘤细胞中提取的mRNA合成。已合成的cDNA被克隆进载体如噬菌体或质粒中以获得cDNA文库。每个含有编码VH的cDNA的重组噬菌体或重组质粒和含有编码VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒从文库中分离，使用现有鼠抗体的C区部分或V区部分作为探针。测定在重组噬菌体或重组质粒上目的鼠抗体VH和VL的全部核苷酸序列，从核苷酸序列推算出VH和VL的全长按计算序列。
作为非人动物，可使用任何动物如小鼠，大鼠，仓鼠或兔，只要可从中产生杂交瘤细胞。
从杂交瘤细胞中制备总RNA的方法包括硫氰酸胍-三氟醋酸铯法[Methods in Enzymology,154,3(1987)]和类似方法，从总RNA中制备mRNA的方法包括寡聚(dT)-固定纤维素柱法[分子克隆，实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]和类似方法。另外，从杂交瘤细胞中制备mRNA的试剂盒的实施例包括Fast Track mRNA分离试剂盒(Invitrogen制造)，Quick Prep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制造)和类似物。
合成cDNA和制备cDNA文库的方法包括常规的方法[分子克隆，实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989),现代分子生物学方法，增刊1-34],使用市售试剂盒的方法，试剂盒如SuperscriptTM,cDNA合成和质粒克隆的质粒系统(GEBCO BRL制造)或ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene制造)，和类似物。
在制备cDNA文库过程中，插入了从杂交瘤细胞中提取的mRNA作为模板合成的cDNA的载体可以是任何载体，只要可插入cDNA。实施例包括ZAP Express[Strategies,5,58(1992)],pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research,17,9494(1989)],XzapII(Stratagene制造)，λgt10和λgt11[DNA克隆，实践方法，I,49(1985)],Lambda BlueMid(Clontech制造)，λExCell,pT7T318U(Pharmacia制造)，pcD2[Mol.Cell.Biol.,3,280(1983)],pUCIS[Gene,33,103(1985)]和类似物。
作为被导入了从噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的大肠杆菌，可使用任何大肠杆菌，只要可被导入，表达和保留cDNA文库。实施例包括XL 1-Blue MRF[Strategies,5,81(1992)],C600[Genetics,39,440(1954)],Y1088和Y1090[Science,222,778(1983)],NM522[J.Mol,Biol.,166,1(1983)],K802[J.Mol.Biol.,16,118(1966)],JM105[Gene,38,275(1985)]和类似物。
作为从cDNA文库中选择编码非人动物抗体H链和L链V区的cDNA克隆的方法，可使用采用同位素或荧光标记探针的菌落杂交或噬斑杂交[分子克隆，实验室手册，第二版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)]。编码VH和VL的cDNA可通过制备引物，进行聚合酶链式反应而制备[此后称为“PCR”；分子克隆，实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；现代分子生物学方法,增刊1-34]使用从mRNA或cDNA文库中合成的cDNA作为模板。
cDNA核苷酸序列的测定可通过用适当的限制性酶消化已选择的cDNA，将DNA片段克隆进如pBluescript SK(-)(Stratagene制造)的质粒中，进行通常使用的核苷酸序列分析方法如Sanger等人的双脱氧法[Proc.Nat/.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)]或类似方法的反应，然后使用自动核苷酸序列分析仪如A.L.F.DNA测序仪(Pharmacia制造)或类似仪器分析克隆。
不管已获得的cDNA是否编码含有分泌信号的抗体VH和VL全长氨基酸序列，序列可通过从已测定的核苷酸序列推导VH和VL的全长核苷酸序列，并将其与已知抗体VH和VL的全长氨基酸序列比较而证实[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dep.Healthand Human Services(1991)]。
(3)来源于非人动物的抗体的V区的氨基酸序列分析
关于包括分泌信号序列的抗体的H链和L链的V区的全长氨基酸序列，分泌信号序列和N-端氨基酸序列的长度可以推导出来，通过把它们与已知抗体的H链和L链的V区的全长氨基酸序列[Sequences ofproteins of Immunological Interest,US Dep.Health and Human Services(具有免疫学重要性的蛋白质的序列，美国，健康与人类服务进展)(1991)]加以比较，可以发现它们所属的亚群。另外，可以通过把它们与已知抗体的H链和L链的V区的氨基酸序列[Sequences of proteins ofImmunological Interest,US Dep.Health and Human Services(具有免疫学重要性的蛋白质的序列，美国，健康与人类服务进展)(1991)]加以比较，也可发现H链和L链的V区的每个CDR的氨基酸序列。
(4)表达人嵌合抗体的载体的构建
表达人嵌合抗体的载体的构建，如条目3(1)中描述的，通过在人源化抗体表达的载体中，把编码来源于非人动物的抗体的H链和L链的V区的cDNA克隆进入编码人抗体的H链和L链的C区的基因的上游。例如，表达人嵌合抗体的载体可以通过把编码来源于人类动物的抗体的H链和L链的V区的每个cDNA，与合成的DNA加以连接构建，此处合成的DNA包括来源于非人动物的抗体的H链和L链的V区的3’-末端核苷酸序列，人抗体的H链和L链的C区的5’-末端核苷酸序列，并且在两个末端都有合适的限制性内切酶识别位点，和把它们克隆到载体中含有的编码人抗体的H链和L链的C区的基因的上游，此载体是如条目3(1)所描述构建的适合表达的人源化抗体的表达载体。
(5)编码人CDR-移植抗体V区的cDNA的构建
编码人CDR-移植抗体H链和L链的V区的cDNA可以如以下获得。首先，选择用于移植来源于非人动物的抗体的H链和L链的V区的CDR的人抗体的H链和L链的V区的框架(以下称为“FR”)的氨基酸。作为人抗体H链和L链V区FR的氨基酸序列，任何氨基酸都可以使用，只要它们来源于人抗体。例子包括数据库，例如蛋白质数据库中登记的人抗体H链和L链V区FR的氨基酸序列，通常人抗体H链和L链V区FR的每个亚群的氨基酸序列[Sequences of proteins ofImmunological Interest,US Dep.Health and Human Services(具有免疫学重要性的蛋白质的序列，美国，健康与人类服务进展)(1991)]等。为了制备有效活性的人CDR-移植抗体，优选的选择与来源于非人动物的目的抗体的H链和L链的V区的氨基酸序列同源性尽可能高的氨基酸序列(至少60％或更多)。
然后，来源于非人动物的目的抗体的H链和L链的V区的CDR氨基酸序列，移植到选择的人抗体的H链和L链的V区的FR氨基酸序列，设计人CDR-移植抗体H链和L链V区的氨基酸序列。考虑抗体基因核苷酸序列中发现的密码子选择的频率，把设计的氨基酸序列转变为DNA序列[Sequences of proteins of Immunological Interest,USDep.Health and Human Services(具有免疫学重要性的蛋白质的序列，美国，健康与人类服务进展)(1991)]，设计编码人CDR-移植抗体H链和L链V区氨基酸序列的DNA序列。以设计的DNA序列为基础，合成几种长度约100个碱基的合成DNA，使用它们进行PCR。在此情况下，考虑到PCR的反应效率和可以合成的DNA的长度，每种H链和L链优选设计4到6种合成DNA。
而且，通过把合适的限制性内切酶的识别位点导入存在于合成DNA的两个末端的5’-端，合成DNA可以容易的克隆进入在条目3(1)中构建的，用于人源化抗体表达的载体中。PCR后，扩增的产物克隆进入质粒例如pBluescript SK(-)(Stratagene生产)或相似的质粒，通过条目3(2)中的方法确定核苷酸序列，获得含有编码需要的人CDR-移植抗体的H链和L链的V区的氨基酸序列的DNA序列的质粒。
(6)人CDR移植抗体V区氨基酸序列的修饰
已知当通过仅将非人动物抗体VH和VL中的CDR简单地移植至人抗体VH和VL中FR中产生人CDR移植抗体时，其抗原结合活性低于原始的非人动物抗体的结合活性[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。就其原因，考虑Fr而不是CDR的几个氨基酸残基直接或间接与原始非人动物抗体VH和VL中的抗原结合活性有关，它们可改变为人抗体VH和VL中的不同FR氨基酸残基。为了解决这个问题，在人CDR移植抗体中，在人抗体VH和VL的FR氨基酸序列中，与结合抗原直接相关的氨基酸残基，或通过与CDR中的氨基酸残基相互作用或通过保持抗体的三维结构与结合抗原间接有关的氨基酸残基，被鉴定并修饰为可在原始非人动物抗体中发现的一种氨基酸序列，以增加已被降低的抗原结合活性[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。
在人CDR移植抗体的产生中，最重要的是如何有效鉴别FR中与抗原结合活性有关的氨基酸残基，这样构建抗体的三维结构，并通过X-射线晶体学[J.Mol Biol,112,535(1977)],计算机建模[ProteinEngineering,7,1501(1994)]或类似方法来分析。尽管抗体的三维结构信息已经用于产生人CDR移植抗体的产生，用于产生可用于产生所有抗体的人CDR移植抗体的方法现在还没有建立。因此，现在需要进行多种尝试，例如产生每个抗体的几种修饰抗体，阐明每个修饰抗体和其抗体结合活性之间的关系。
为了根据如3(5)所述的PCR进行修饰，已选择的人抗体VH和VL的FR氨基酸序列的修饰可使用多种合成DNA来完成。就通过PCR获得的扩增产物而言，根据3(2)中所述的方法测定核苷酸序列以证实是否已经进行了目标修饰。
(7)构建用于人CDR-移植抗体表达的载体
通过把编码条目3(5)和(6)中构建的人CDR-移植抗体H链和L链的V区的cDNA克隆进入编码条目3(1)中描述的用于人源化抗体表达的载体中的人抗体的H链和L链的C区基因的上游，构建用于人CDR-移植抗体表达的载体。例如，通过在条目3(5)和(6)中进行PCR构建H链和L链的V区时，把合适的限制性内切酶识别序列导入所用的合成的DNA片段两个末端的5’-末端中，这样人CDR-移植抗体H链和L链的V区cDNA可以克隆进入如条目3(1)中描述的用于人源化抗体表达的载体中编码人抗体的H链和L链的C区的基因的上游，以这样的方式它们可以以合适的方式表达，因此构建了人CDR移植抗体的表达载体。
(8)稳定产生人源化抗体
通过把条目3(4)或(7)中描述的表达人源化抗体的载体导入合适的动物细胞，能获得稳定产生人嵌合抗体和人CDR-移植抗体(在下文中两者都称为“人源化抗体”)的转化体。
把表达人源化抗体的载体导入细胞的方法包括电穿孔[日本公开的审查的专利申请257891/90号,Cytotechnology(电穿孔),3,133(1990)]等。
作为表达人源化抗体的载体导入的动物细胞，可以使用任何细胞，只要是可以产生人源化抗体的动物细胞。
例子包括小鼠骨髓瘤细胞，例如NS0细胞和SP2/0细胞，中国仓鼠卵巢细胞，例如CHO/dhfr-细胞和CHO/DG44细胞；大鼠骨髓瘤细胞，例如YB2/0细胞和IR983F细胞；来源于叙利亚仓鼠肾的BHK细胞；人骨髓瘤细胞例如Namalwa细胞等。优选中国仓鼠卵巢细胞CHO/DG44细胞、大鼠骨髓瘤细胞YB2/0细胞和在1项中所描述的细胞。
导入表达人源化抗体的载体后，根据日本公开的审查的专利申请号257891/90中公开的方法，使用用于动物细胞培养的含有例如G418硫酸盐(以下称为“G418”，由SIGMA制备)的培养基，选择能够稳定产生人源化抗体的转化体。作为动物细胞培养的培养基，可以提及的是RPMI 1640培养基(Nissui Pharmaceutical生产)，GIT培养基(NihonPharmaceutical生产)，EX-CELL 302培养基(JRH生产)，IMDM培养基(GIBCO BRL生产)，Hybridoma-SFM培养基(GIBCO BRL生产)，往这些培养基中加入多种添加剂例如胎牛血清(以下称为“FCS”)获得的培养基等。通过在培养基中培养获得的转化体，在培养基中产生和积累人源化抗体。培养基中人源化抗体的产生和抗原结合活性可以用例如酶联免疫吸附试验[以下称为“ELISA”，Antibodies：ALaboratory Manual(实验手册),Cold Spring Harbor Laboratory,第14章(1998),Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,Academic Press(美国学术出版社)Limited(1996)]等方法测定。而且，根据日本公开的审查的专利申请257891/90号中公开的方法，使用DHFR基因扩增系统，可以使通过转化体产生人源化抗体的产量增加。
使用蛋白A柱[Antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验手册)Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室),第8章(1988),Monoclonal Antibodies Principles and Practice(单克隆抗体：原理于实践),Academic Press(美国学术出版社)Limited(1996)]，从转化体的培养基上清中纯化人源化抗体。另外，也可以使用一般用于纯化蛋白质的纯化方法。例如，通过凝胶过滤，离子交换层析，超滤相结合进行提纯。能够分别测定纯化的人源化抗体的H链，L链和整体抗体分子的分子量，例如，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳[以下称为“SDS-PAGE”，Nature(自然),227,680(1970)],Western blotting[Antibodies A Laboratory Manual(抗体：实验手册),第12章(1988)，Monoclonal Antibodies(单克隆抗体)]等。
B.制备Fc融合蛋白
(1)构建Fc融合蛋白的表达载体
Fc融合蛋白的表达载体是一种被插入了编码人抗体的Fc区和要被融合的蛋白质的基因的动物细胞表达载体，它的构建可通过将编码人抗体的Fc区和要被融合的蛋白质的每个基因克隆进动物细胞的表达载体中。
人抗体的Fc区包括那些除了含有CH2和CH3区的区域以外，含有铰链区的一部分和/或CH1的区域。也可以是任何Fc区，只要CH2或CH3的至少一个氨基酸被删除，取代，添加或插入，实质上具有与Fc γ受体的结合活性。
作为编码人抗体的Fc区和要被融合的蛋白的基因，可使用由外显子和内含子组成的染色体DNA，也可使用cDNA。连接基因和Fc区的方法包括使用每个基因序列作为模板的PCR(分子克隆),CurrentProtocols in Molecular.Biology(现代分子生物学实验方法),增刊l-34)。
作为动物细胞的表达载体，可使用任何载体，只要编码人抗体C区的基因被插入其中和在其中表达。例子包括pAGE107[Cytotechnology(电穿孔),3,133(1990)],pAGElOS[J.Biochem.(生物化学杂质),101，1307(1987)],pHSG274[Gene(基因),27,223(1984)],pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,78,1527(1981),pSGl p d2-4[Cytotechnology(电穿孔),4,173(1990)]和类似物。动物细胞表达载体中的启动子和增强子含有SV40早期启动子和增强子[J.Biochem.(生物化学杂质),101,1307(1987)],莫洛尼小鼠白血病病毒LTR启动子[Biochem.Biophys.Res.Commun.,149,960(1987)],免疫球蛋白H链启动子[Cell(细胞),41,479(1985)]和增强子[Cell(细胞),33,717(1983)]，和类似物。
(2)制备编码人抗体Fc区和要被融合的蛋白的DNA
编码人抗体Fc区和要被融合蛋白的DNA可以下面的方式获得。
从表达要与Fc融合的目的蛋白的细胞或组织提取的mRNA合成cDNA。已合成的cDNA被克隆进载体中如噬菌体或质粒以获得cDNA文库。含有编码目的蛋白的cDNA的重组噬菌体或重组质粒通过使用目的蛋白部分基因序列作为探针从文库中分离。测定重组噬菌体或重组质粒上目的抗体的全长核苷酸序列，从核苷酸序列推导出全长氨基酸序列。
作为非人动物，可使用任何动物如小鼠，大鼠，仓鼠或兔，只要可从其中取出细胞或组织。
从细胞或组织制备总RNA的方法包括硫氰酸胍-三氟醋酸铯法[Methods in Enzymology,154,3(1987)]和类似方法，从总RNA制备mRNA的方法包括寡聚(dT)-固定纤维素柱法(分子克隆，第二版)和类似方法。另外，从细胞或组织制备mRNA的试剂盒包括Fast Track mRNA分离试剂盒(Invitrogen制造)，Quick Prep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制造)和类似方法。
合成cDNA和制备cDNA文库的方法包括常规方法(分子克隆),Current Protocols in Molecular.Biology(现代分子生物学实验方法),增刊l-34)；使用市售试剂盒如SuperscriptTM,cDNA合成和质粒克隆的质粒系统(GIBCO BRL制造)或ZAP-cDNA合成试剂盒(StrataGene(基因)制造)的方法；和类似方法。
在制备cDNA文库过程中，被插入了cDNA的载体可以是任何载体，只要可插入cDNA，该cDNA是使用从细胞或组织提取的mRNA作为模板合成的。例子包括ZAP Express[Strategies,5,58(1992)],pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research(核酸研究),17,9494(1989)],XzapII(StrataGene(基因)制造),λgt10和λgt11[DNA克隆，实践方法，I,49(1985)],Lambda BlueMid(Clontech制造),AExCell(细胞),pT7T318U(Pharmacia制造),pcD2[Mol.Cell Biol,3,280(1983)],pUC18[Gene(基因),33,103(1985)]和类似物。
作为被导入了从噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的大肠杆菌，可使用任何大肠杆菌，只要可导入，表达和保持cDNA文库。例子包括XLl-Blue MRF'[Strategies,5,81(1992)],C600[Genetics(遗传学),39,440(1954)],Y1088和Y1090[Science(科学),222,778(1983)],NM522[J.Mol.Biol.,166,1(1983)],K802[J.Mol.Biol.,16,118(1966)],JM105[Gene(基因),38,275(1985)]和类似物。
作为从cDNA文库中选择编码目的蛋白的cDNA克隆的方法，可使用采用同位素或荧光标记的探针的菌落杂交或噬斑杂交(分子克隆，第二版)。编码目的蛋白的cDNA也可根据PCR，通过制备引物，使用从mRNA或cDNA文库中合成的cDNA作为模板而制备。
将目的蛋白与人抗体Fc区融合的方法包括PCR。例如，在编码目的蛋白的基因序列的5’末端和3’末端设计合成的寡聚DNA(引物)，进行PCR以制备PCR产物。以同样的方法，为编码要融合的人抗体Fc区的基因序列设计引物以制备PCR产物。在此时，以下列的方式设计引物，在要被融合的蛋白的PCR产物3’末端和Fc区PCR产物的5’末端之间存在有相同的限制性酶位点或相同的基因序列。当需要修饰连接位点周围的氨基酸时，通过使用被导入突变的引物导入突变。进一步通过使用两种已获得的PCR片段进行PCR以连接基因。它们也可在用相同的限制性酶处理后通过连接反应被连接。
DNA的核苷酸序列的确定可通过使用适当的限制性酶消化用上述的方法连接的基因序列，将DNA片段克隆进质粒中如pBluescript SK(-)(StrataGene(基因)制造)，使用通常使用的核苷酸序列分析方法如Sanger等人的双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,74,5463(1977)]或自动核苷酸序列分析仪如A.L.F.DNA测序仪(Pharmacia制造)进行分析。
不管已获得的cDNA是否编码含有分泌信号的Fc融合蛋白的全长氨基酸序列，序列可通过从已测定的核苷酸序列推导Fc融合蛋白的全长核苷酸序列，并将其与目的氨基酸序列比较而证实。
(3)稳定产生Fc融合蛋白
能够稳定产生Fc融合蛋白的转化体通过将在(1)中所描述的Fc融合蛋白表达载体导入适当的动物细胞中而获得。
将Fc融合蛋白表达载体导入动物细胞中的方法包括电穿孔[日本已公布未实审的专利申请257891/90号,Cytotechnology(电穿孔),3,133(1990)]和类似方法。
作为被导入Fc融合蛋白表达载体的动物细胞，可使用任何细胞，只要它是可产生Fc融合蛋白的动物细胞。
优选的例子包括小鼠骨髓瘤细胞如NS0细胞和SP2/0细胞，中国仓鼠卵巢细胞如CHO/dhfr-细胞和CHO/DG44细胞，大鼠骨髓瘤细胞如YB2/0细胞和IR983F细胞，来自叙利亚仓鼠肾的BHK细胞，人骨髓瘤细胞如Namalwa细胞，和类似细胞，优选中国仓鼠卵巢细胞CHO/DG44细胞，大鼠骨髓瘤YB2/0细胞和在1项中所描述的本发明方法中使用的宿主细胞。
在导入Fc融合蛋白表达载体后，根据日本已公布未实审的专利申请257891/90号中所描述的方法通过使用含有如G418和类似试剂的动物细胞培养基，选择能够稳定产生Fc融合蛋白表达载体的转化体的选择。培养动物细胞的培养基包括RPMI 1640培养基(NissuiPharmaceutical制造)，GIT培养基(Nihon Pharmaceutical制造),EX-CELL302培养基(JRH制造),IMDM培养基(GEBCO BRL制造)，Hybridoma-SFM培养基(GIBCO BRL制造)。通过向这些培养基中加入多种添加物如胎牛血清获得的培养基，和类似培养基。可通过在培养基中培养已获得的转化体在培养上清液中产生和积累Fc融合蛋白质。在培养上清液中Fc融合蛋白的产生量和抗原结合活性可通过如ELISA的方法来测量。也可采用dhfr基因扩增系统根据在日本已公布未实审的专利申请257891/90号中描述的方法增加转化体产生的Fc融合蛋白的量。
可采用蛋白A柱从转化体的培养上清液中纯化Fc融合蛋白(抗体，第8章；单克隆抗体)。另外，也可使用通常用作蛋白纯化的纯化方法。例如，可通过联合使用凝胶过滤，离子交换色谱和超滤来进行纯化。作为整个纯化的Fc融合蛋白分子，分子量通过SDS-PAGE[Nature(自然),227,680(1970)],Western blotting[抗体，第12章,(1988),单克隆抗体]或类似方法来测定。
因此，采用动物细胞作为宿主细胞产生抗体组合物的方法已经被描述，但如上所述，抗体组合物也可通过酵母，昆虫细胞，植物细胞，动物个体或植物个体通过相同的方法在动物细胞中产生。
当细胞天生具有表达抗体分子的能力，目的抗体组合物的产生可采用在1项中所描述的方法通过制备产生抗体的细胞，培养细胞，然后从得到的培养基中纯化抗体组合物。
4.抗体组合物的活性评价
作为纯化抗体组合物的量、纯化抗体与抗原结合的活性和纯化抗体组合物的效应器功能的测量方法,可以使用单克隆抗体、抗体工程学等文献中描述的已知方法。
例如,当抗体组合物是人源化抗体时,其与抗原的结合活性和与抗原阳性的培养克隆的结合活性可以通过如ELISA和免疫荧光法的方法检测[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]。对抗原阳性培养克隆的细胞毒活性可以通过测量补体-依赖的细胞毒活性(此后称为"CDC活性")、ADCC活性[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]等来评价。
此外,抗体组合物在人中的安全性和疗效可以通过使用相对接近于人的适当动物种属模型如Macaca fascicularis来评价。
5.抗体组合物中糖链的分析
在各种细胞中表达的抗体分子的糖链结构可以根据糖蛋白的糖链结构的一般分析进行分析。例如，结合于IgG分子的糖链包括中性糖链例如半乳糖，甘露糖或岩藻糖，氨基糖例如N-乙酰氨基葡萄糖，酸性糖例如唾液酸，可以通过例如使用糖组合物分析糖链结构，二维糖链图谱等方法分析。
(1)中性糖和氨基糖成分的分析
抗体组合物的糖链可以通过把糖链用酸例如三氟乙酸酸解，释放出中性糖和氨基糖，测定组合物比率来分析。
例子包括使用由Dionex生产的糖组合物分析仪(BioLC)的方法。BioLC是一种用HPAEC-PAD(高效阴离子交换色谱法脉冲电流测定)[J Liq.Chromatogr.(液相色谱杂志),6,1577(1983)]分析糖组合物的仪器。
组合物的比率也可以用使用2-氨基吡啶的荧光标记法分析。具体的，把酸解过的样品用2-氨基吡啶化的荧光标记，然后HPLC分析组合物，组合物的比率可以根据已知方法[Agric.Biol Chem.(农业生物化学),55(1),283-284(1991)]计算，
(2)糖链结构的分析
抗体分子的糖链结构可以用二维糖链图谱法分析[Anal Biochem.(农业生物化学),171,73(1988),Biochemical Experimentation Methods23-Methods for.Studying Glycoprotein Sugar Chains(生物化学实验方法23-研究糖蛋白糖链的方法)(Japan Scientific Societies Press(日本科学学会出版))由Reiko Takahashi编辑(1989)]。二维糖链图谱法是通过，例如，分别用反相色谱法得到的糖链的滞留时间或洗脱位置作为X轴，正相色谱法得到的糖链的滞留时间或洗脱位置作为y轴，把它们与已知糖链的结果相比较，从而推导糖链结构的方法。
具体的，把抗体肼解，糖链从抗体释放出来，释放的糖链用2-氨基吡啶(以下称为“PA”)荧光标记[J.Biocbcni.,95,197(1984)]，然后糖链通过凝胶过滤，和反相色谱，从过量PA-处理试剂中分离出来。然后，分离的糖链的每个峰经正相色谱法分离。通过把得到的结果标绘在二维糖链图谱上，把它们与糖链标准点(由Takara Slluzo绘制)或文献[Anal Biochem.,171,73(l988)]比较推导出糖链结构。
通过二维糖链图谱方法推导出的结构可以进一步用质谱法，例如每个糖链的MALDI-TOF-MS确证。
6.本发明中获得的抗体组合物的应用
本发明中获得的抗体组合物具有高ADCC活性。具有高ADCC活性的抗体可用于预防和治疗各种疾病，包括癌症、炎症性疾病、免疫疾病如自体免疫疾病、变态反应等,心血管疾病和各种由如病毒和感染引起的疾病。
在癌症即恶性肿瘤情况下,癌症细胞增长。一般的抗肿瘤药抑制癌细胞的生长。相反,具有高ADCC活性的抗体可经其细胞杀伤作用损害癌细胞而治疗癌症,因此是比一般的抗肿瘤药更有效的治疗剂。目前,在癌症治疗药中,抗体药物单独的抗肿瘤效果是不够的,因此已进行与化疗的联合治疗[Science(科学),280,1197(1998)]。如果发现单独用本发明的抗体组合物有较高的抗肿瘤效果,那么对化疗的依赖性将下降，副作用将减少。
在免疫疾病如炎症性疾病、自体免疫疾病和变态反应中,疾病的体内反应是由免疫细胞释放的介质分子引起的,因此可以通过采用具有高ADCC活性的抗体清除免疫细胞来抑制变态反应。
心血管疾病包括动脉硬化等。目前,动脉硬化采用气囊导管治疗，但采用具有高ADCC活性的抗体可以通过抑制气囊导管治疗后再狭窄中的动脉细胞生长来预防和治疗心血管疾病。
通过采用具有高ADCC活性的抗体抑制被病毒或细菌感染的细胞的增殖可以预防和治疗包括病毒和细菌感染的各种疾病。
识别肿瘤相关抗原的抗体、识别变态反应或炎症相关抗原的抗体、识别心血管疾病相关抗原的抗体，和识别病毒或细菌感染相关抗原的抗体在下面举例说明。
识别肿瘤相关抗原的抗体包括：抗GD2抗体[Anticancer Res.(抗癌研究),13,331-336(1993)]、抗GD3抗体[Cancer Immunol.Immunother.,36,260-266(1993)]、抗GM2抗体[Cancer Res.(癌症研究),54,1511-1516(1994)]、抗HER2抗体[Proc.Natl.Acad Sci.USA,89,4285-4289(1992)]、抗CD52抗体[Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,89,4285-4289(1992)]、抗MAGE抗体[British J.Cancer(癌症),83,493-497(2000)]、抗HM1.24抗体[Molecular Immunol.(分子免疫学),36,387-395(1999)]、抗甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)抗体[Cancer(癌症),88,2909-2911(2000)]、抗FGF8抗体(Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA,86,9911-9915(1989)、抗碱性成纤维细胞生长因子抗体和抗FGF8受体抗体(J.Biol.Chem,265,16455-16463(1990))、抗碱性成纤维细胞生长因子受体抗体和抗胰岛素样生长因子抗体[J.Neurosci.Res.,40,647-659(1995)]、抗胰岛素样生长因子受体抗体[J.Neurosci.Res.,40,647-659(1995)]、抗PMSA抗体[J.Urology(泌尿学研究),160,2396-2401(1998)]、抗血管内皮细胞生长因子抗体[Cancer Res.(癌症研究),57,4593-4599(1997)]、抗血管内皮细胞生长因子受体抗体[OncoGene,19,2138-2146(2000)]、抗CA125抗体、抗17-1A抗体、抗整合素avβ3抗体、抗CD33抗体、抗CD22抗体、抗HLA抗体、抗HLA-DR抗体、抗CD20抗体、抗CD19抗体、抗EGF受体抗体(Immunology Today(今日免疫学),21(8),403-410(2000))、抗CD10抗体[American Journal of Clinical Pathology(美国临床病理杂志),113，374-382(2000)]，等。
识别变态反应或炎症相关抗原的抗体包括：抗白介素6抗体[Immunol.Rev.(免疫学研究),127,5-24(1992)]、抗白介素6受体抗体[Molecular Immunol.(分子免疫学),31,371-381(1994)]、抗白介素5抗体[Immunol.Rev(免疫学研究).,127,5-24(1992)]、抗白介素5受体抗体和抗白介素4抗体[Cytokine(细胞因子),3,562-567(1991)]、抗白介素4受体抗体[J.Immunol.(免疫学杂志)Meth.,217,41-50(1998)]、抗肿瘤坏死因子抗体[Hybridoma,13,183-190(1994)]、抗肿瘤坏死因子受体抗体[Molecular Pharmacol,58,237-245(2000)]、抗CCR4抗体[Nature(自然),400,776-780(1999)]、抗细胞因子抗体[J.Immuno.Meth,174,249-257(1994)]、抗细胞因子受体抗体[J.Exp.Med.(实验方法杂志),186,1373-1381(1997)]、抗IgE抗体、抗CD23抗体、抗CD11a抗体[Immunology Today(今日免疫学),21(8).,403-410(2000)]、抗CRTH2抗体(J Immunol.,162,1278-1286(1999))、抗CCR8抗体(WO99/25734)、抗CCR3抗体(US6207155),等。
识别心血管病相关抗原的抗体包括：抗GpIIb/IIIa抗体[J.Immunol.,152.2968-2976(1994)]、抗血小板衍生的生长因子抗体[Science(科学),253,1129-1132(1991)]、抗血小板衍生的生长因子受体抗体[J.Biol.Chem.(生物化学杂志),272,17400-17404(1997)]和抗凝血因子抗体[Circulation(循环),101,1158-1164(2000)]，等。
识别自体免疫疾病相关抗原的抗体包括：抗自体-DNA抗体[Immunol.Letters,72,61-68(2000)]，等。
识别病毒或细菌感染相关抗原的抗体包括：抗gp120抗体[Structure(结构),8,385-395(2000)]、抗CD4抗体[J.Rheumatology(风湿病学杂志),25,2065-2076(1998)]、抗CCR4抗体、抗Vero毒素抗体[J.Clin.Microbiol,37,396-399(1999)]、抗自体免疫疾病(牛皮癣、风湿性关节炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、脑脊髓多发性硬化,等)抗体、抗CDlla抗体、抗ICAM3抗体、抗CD80抗体、抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗整合素α4β7抗体、抗GD40L抗体、抗IL-2抗体[Immunology Today(今日免疫学),21(8),403-410(2000)],等。
这些抗体可从公共组织获得，如ATCC(The American Type CultureCollection)、The Institute of Physical and Chemical Research的RIKEN基因库,和National Institute of BioScience and Human Technology,Agency of Industrial Science and Technology,或获取自所有的试剂销售公司如Dainippon Pharmaceutical,R&D SYSTEMS,PharMingen,Cosmo Bio和Funakoshi。
本发明的抗体组合物可以作为单独的治疗试剂给药。通常，优选的是抗体组合物与至少一种药学可接受的载体混合，把它作为药学配方，用制备药学的技术领域中已知的合适方法制备。
优选的是选择治疗中最有效的给药途径。例子包括口服、非肠道给药，例如口腔的、气管的、直肠的、皮下的、肌肉的、静脉内的施用。在抗体制备中，静脉内施用是优选的。
剂形包括喷雾、胶囊、片剂、颗粒、糖浆、乳剂、栓剂、注射剂、软膏剂、粘膏剂等。
合适于口服的药学制剂的例子包括乳剂、糖浆、胶囊、片剂、粉末、颗粒等等。
液体制剂，例如乳剂和糖浆，可以用如添加剂、水；糖例如蔗糖、山梨醇和果糖；二元醇例如聚乙二醇和丙二醇；油例如芝麻油、橄榄油和豆油；防腐剂例如p-对羟基苯甲酸酯；香料例如草莓香料和薄荷等制备。
胶、片剂、粉末、颗粒等可以用添加剂，赋形剂例如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露醇；分解剂例如淀粉和精氨酸钠；润滑剂例如硬脂酸镁和滑石；粘合剂例如聚乙烯醇、羟丙纤维素和明胶，表面活性剂例如脂肪酸酯，可塑剂例如丙三醇制备。
适合非肠道给药的药学制剂包括注射剂、栓剂、喷雾剂等等。
注射剂可以使用载体例如盐溶液、葡萄糖溶液或它们的混合物等等。粉末注射剂可以用常规方法制备的冷冻干燥的抗体组合物，往其中加入氯化钠制备。
栓剂可以使用载体，例如可可脂、氢化脂或羧酸制备。
喷雾也可以使用这样的抗体组合物或使用不刺激患者口腔或气管粘膜，并且通过把它分散成细颗粒而促进抗体组合物吸收的载体制备。
载体包括乳糖、甘油等。根据抗体组合物和载体的性质，可以制备药学制剂例如喷雾剂和干粉。另外，作为口服制剂的添加剂例子的成分也可以添加到非肠道的制剂中。
虽然临床剂量或施用频率根据目的治疗效果、施用方法、治疗周期、年龄、体重等等不同，但是一般是10微克/千克到20微克/千克/天/人。
而且，作为检验抗体组合物对不同肿瘤细胞的抗肿瘤作用的方法，体外检验包括CDC活性检测方法、ADCC活性检测方法等；体内检验包括在实验动物例如小鼠中使用肿瘤系统的抗肿瘤实验等。
CDC活性和ADCC活性测定和抗肿瘤实验可以根据cancerImmunology Immunotherapy，36，373(1993)；Cancer Research，54，1511(1944)等中描述的方法进行。
本发明将根据实验例详细描述如下；然而，实验仅仅是本发明的简单说明，本发明的范围不受此限制。
附图说明
图1显示由大鼠骨髓瘤YB2/0细胞衍生的克隆KM2760#58-35-16和克隆1-15产生的抗CCR4嵌合抗体对CCR4/EL-4细胞的ADCC活性。纵坐标和横坐标分别显示细胞毒活性和抗体浓度,"n"和"A"分别表示由克隆KM2760#58-35-16产生的抗CCR4嵌合抗体KM2760-1的活性和由克隆1-15产生的抗CCR4嵌合抗体KM2760-2的活性。
图2显示从导入mfFUTS-6和pAGE249的克隆产生的抗体中制备的PA处理糖链的洗脱方式,通过其反相HPLC分析获得。图2A和图2B分别显示从导入mfFUT8-6的克隆产生的抗体中制备的PA处理糖链的洗脱方式,和从导入pAGE249的克隆产生的抗体中制备的PA处理糖链的洗脱方式。纵坐标和横坐标分别显示相对荧光强度和洗脱时间。
图3显示采用RT-PCR在每个宿主克隆中测定的FUT8和β-肌动蛋白转录产物水平的照片。用能够产生KM2760-1的克隆KM2760#58-35-16、能够产生KM2760-2的克隆1-15和亲代大鼠骨髓瘤YB2/0细胞制备的cDNAs作为模板,用FUT8特异的引物对(SEQ IDNO:13和14)或β-肌动蛋白特异的引物对(SEQ ID NOs:l1和12)进行PCR,并通过对反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳给出所得的结果。
图4显示质粒ploxPPuro的构造。
图5显示质粒pKOFUT8gE2-l的构造。
图6显示质粒pKOFUT8gE2-2的构造。
图7显示质粒pscFUT8gE2-3的构造。
图8显示质粒pKOFUT8gE2-3的构造。
图9显示质粒pKOFUT8gE2-4的构造。
图10显示质粒pKOFUT8gE2-5的构造。
图11显示质粒pKOFUT8Puro的构造。
图12显示作为αl,6-岩藻糖基转移酶基因断裂的CHO克隆的克隆IstΔFUT82-46-1和克隆2-46-H10的基因组Southern分析照片。
图13显示作为αl,6-岩藻糖基转移酶基因断裂的CHO克隆的克隆IstΔFUT82-46和克隆IstΔFUT82-46-H10的基因组Southern分析照片。
图14显示纯化自FUT8等位基因断裂克隆的抗CCR4嵌合抗体的ADCC活性。纵坐标和横坐标分别显示细胞毒活性和抗体浓度。"▲"和"■"分别表示从产生抗CCR4嵌合抗体的CHO细胞克隆5-03衍生的纯化抗体的活性和从克隆Ist.FUT82-46-1衍生的纯化抗体的活性。
图15显示质粒Pkofut8Neo的构造。
图16显示克隆基因组Southern分析照片，克隆中CHO/DG44细胞FUT8等位基因的拷贝之一是断裂的。
图17显示克隆基因组Southern分析照片，克隆中CHO/DG44细胞的两个PUTS等位基因都是断裂的。
图18显示克隆基因组Southern分析照片，克隆中耐药基因从CHO/DG44细胞的两个PUTS等位基因中去除。
图19显示质粒pBS-2B8L的构造。
图20显示质粒pBS-2B8H和质粒pBS-28B8Hm的构造。
图21显示质粒pKANTEX2B8P的构造。
图22显示从FUT8基因双敲除的CHP/DG44克隆中纯化的抗CD20嵌合抗体对人B淋巴细胞培养细胞系Raji细胞的ADCC活性。纵坐标和横坐标分别显示细胞毒活性和抗体浓度。
图23显示质粒CHfFUT8-pCR2.1的构造。
具体实施方式
实施例1
产生稳定生产抗CCR4嵌合抗体的细胞:
采用WO 01/64754中描述的抗CCR4嵌合抗体的串联式表达载体pKANTEX2160以如下方式制备，能够稳定生产抗CCR4嵌合抗体的细胞。
(1)用大鼠骨髓瘤YB2/0细胞制备生产抗体的细胞
通过电穿孔将10μg抗CCR4嵌合抗体表达载体pKANTEX2160导入4×l06大鼠骨髓瘤YB2/0细胞(ATCC CRL 1662)[Cytotechnology(电穿孔),3,133(1990)]后,将细胞悬浮在40mlHybridoma-SFM-FBS(5)[Hybridoma-SFM培养基(由Invitrogen生产)添加了5％FBS(由PAA Laboratories生产)]中，并以200μl/孔分配进96孔培养板(由Sumitomo Bakelite生产)。在5％CO2孵箱中37℃培养24小时后,添加G418至1mg/ml浓度,随后培养1至2周。通过集落形成观察到显示G418耐受的转化株生长，从该孔中回收培养上清物,通过实施例2的(2)项中描述的ELISA测定上清物中抗CCR4嵌合抗体的抗原结合活性。
对于培养上清物中观察到产生抗CCR4嵌合抗体的孔中的转化株,为了增加用DHFR基因扩增系统生产抗体的量,将它们每一个悬浮在添加了1mg/ml G418和50nM DHFR抑制剂MTX(由SIGMA生产)的Hybridoma-SFM-FBS(5)培养基中以得到1-2×l05细胞/ml的密度,该悬浮液以1ml分配进24孔平板(由Greiner生产)的孔中。在5％CO2孵箱中37℃培养1至2周后,诱导了显示50nM MTX耐受的转化株。观察到转化株生长的孔中培养上清物内抗CCR4嵌合抗体的抗原结合活性通过实施例2的(2)项中描述的ELISA测定。
对于培养上清物中观察到产生抗CCR4嵌合抗体的孔中的转化株,通过相同的方法提高MTX浓度,最终获得能够在添加了200nM MTX的Hybridoma-SFM-FBS(5)培养基上生长，并能够高度生产抗CCR4嵌合抗体的转化株。将获得的转化株通过限制稀释两次制成单细胞(克隆),且将获得的克隆称为克隆KM2760#58-35-16。在此情况下,采用WO00/61739中描述的αl,6-墨角藻糖基转移酶(此后称为"FUT8")基因转录产物的测定方法,选择生产相对小量转录产物的克隆，并被用作适当的克隆。
(2)用CHO/DG44细胞制备生产抗体的细胞
通过电穿孔将4μg抗CCR4嵌合抗体表达载体pKANTEX2160导入1.6×l06 CHO/DG44细胞[Cytotechnology(电穿孔),3,133(1990)]后,将细胞悬浮在10ml IMDM-dFBS(10)-HT(l)[IMDM培养基(由Invitrogen生产)添加了10％dFBS(由Invitrogen生产)和1×浓度的HT添加物(由Invitrogen生产)]中，并以100μl/孔分配进96孔培养板(由Iwaki Glass生产)。在5％CO2孵箱中37℃培养24小时后,培养基改变为IMDM-dFBS(l0)(添加10％透析FBS的IMDM培养基),随后培养1至2周。从观察到形成了显示不依赖HT的转化株生长的孔中回收培养上清物,通过实施例2的(2)项中描述的ELISA测定上清物中抗CCR4嵌合抗体产生的量。
对于培养上清物中观察到产生抗CCR4嵌合抗体的孔中的转化株,为了增加用DHFR基因扩增系统生产抗体的量,将它们每一个悬浮在添加了50nM MTX的IMDM-dFBS(l0)培养基中以得到1-2×l05细胞/ml的密度,该悬浮液以0.5ml分配进24孔平板(由Iwaki Glass生产)的孔中。在5％CO2孵箱中37℃培养1至2周后,诱导了显示50nM MTX耐受的转化株。对于观察到生长的孔中的转化株,MTX浓度通过相同的方法提高到200nM,最终获得能够在添加了200nM MTX的IMDM-dFBS(l0)培养基上生长，并能够大量生产抗CCR4嵌合抗体的转化体。获得的转化株被叫做克隆5-03。
实施例2
FUT8基因表达减少的产生抗体的细胞产生的抗体组合物与其亲代细胞产生的抗体组合物的比较:
比较基因组被修饰的细胞产生的抗体组合物和其亲代细胞产生的抗体组合物间的ADCC活性，所述修饰降低了αl,6-岩藻糖修饰酶的活性。
(1)制备抗体组合物
作为基因组被修饰的产抗体细胞产生的抗体组合物，所述修饰降低了αl,6-岩藻糖修饰酶的活性，使用从KM2760#58-35-16培养上清物中纯化的抗体组合物KM2760-1，其中FUT8基因转录产物在实施例1的(1)项中进行描述。
由亲代大鼠骨髓瘤细胞YB2/0细胞(ATCC CRL1662)产生的抗体组合物制备如下。
通过电穿孔将10μg抗CCR4嵌合抗体表达载体pKANTEX2160(描述于WO 01/64754中)导入4×l06大鼠骨髓瘤YB2/0细胞(ATCC CRL1662)[Cytotechnology(电穿孔),3,133(1990)]后,将细胞悬浮在40mlHybridoma-SFM-FBS(5)[Hybridoma-SFM培养基(由Invitrogen生产)添加了5％FBS(由PAA Laboratories生产)]中，并以200μl/孔分配进96孔培养板(由Sumitomo Bakelite生产)。在5％CO2孵箱中37℃培养24小时后,添加G418至浓度为1mg/ml，随后培养1至2周。通过集落形成观察到显示G418耐受的转化株生长，从该孔中回收培养上清物,通过本实施例(2)项中描述的ELISA测定上清物中抗CCR4嵌合抗体的抗原结合活性。
对于培养上清物中观察到产生抗CCR4嵌合抗体的孔中的转化株,为了增加用DHFR基因扩增系统生产抗体的量,将它们每一个悬浮在添加了1mg/ml G418和50nM DHFR抑制剂MTX(由SIGMA生产)的Hybridoma-SFM-FBS(5)培养基中以得到1-2×l05细胞/ml密度,该悬浮液以1ml分配进24孔平板(由Greiner生产)的孔中。在5％CO2孵箱中37℃培养1至2周后,诱导了具有50nM MTX耐受的转化株。观察到转化株生长的孔中培养上清物内抗CCR4嵌合抗体的抗原结合活性通过本实施例(2)项中描述的ELISA测定。
对于培养上清物中观察到产生抗CCR4嵌合抗体的孔中的转化株,通过相同的方法提高MTX浓度,最终获得能够在添加了200nM MTX的Hybridoma-SFM-FBS(5)培养基上生长，并能够大量生产抗CCR4嵌合抗体的转化株。将获得的克隆叫做克隆1-15。克隆1-15不通过限制稀释转变成单细胞(克隆)。
由转化株克隆1-15产生的抗CCR4嵌合抗体如下纯化。
将表达抗CCR4嵌合抗体的转化株克隆1-15悬浮在添加了200nMMTX和5％Daigo's GF21(由Wako Pure Chemical Industries生产)的Hybridoma-SFM(由Invitrogen生产)培养基中以得到2×105细胞/ml密度，并采用旋转瓶(Iwaki Glass生产)在37℃的恒温仓内进行fed-batch振摇培养。培养8至10天后,用Prosep-A(由Millipore生产)柱和凝胶过滤从回收的培养上清物中纯化抗CCR4嵌合抗体。纯化的抗CCR4嵌合抗体叫做克隆KM2760-2。
(2)抗体组合物的抗体结合活性
此实施例(1)项中获得的两种抗体组合物的抗体结合活性通过下面显示的ELISA检测。
选择化合物1(SEQ ID NO:6)作为能够与抗CCR4嵌合抗体反应的人CCR4细胞外区域肽。为了在ELISA活性检测中使用它,通过以下方法制备与BSA(牛血清白蛋白)(由Nacalai Tesque生产)的共扼物并用作抗原。即,含25mg/ml SMCC[4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-l-甲酸N-羟琥珀酰亚胺酯](由Sigma生产)的DMSO溶液100ml在用旋涡器搅拌的情况下逐滴加入900ml含10mg BSA的PBS溶液中，随后轻轻搅拌30分钟。在凝胶过滤柱如用25ml PBS平衡的NAP-10柱上,加入1ml反应溶液，然后用1.5ml PBS洗脱，将得到的洗出液用作BSA-SMCC溶液(通过280nM处的吸光率计算BSA浓度)。接着,将250ml PBS加入0.5mg化合物1中，然后通过添加250ml DMF将其完全溶解,在涡旋状态下加入BSA-SMCC溶液,随后轻轻搅拌3小时。反应溶液在4℃下用PBS透析过夜,向其中加入叠氮钠至终浓度为0.05％,混合物经0.22mm滤器过滤，以用作BSA-化合物1溶液。
制备的共扼物以0.05μg/ml和50μl/孔分配进96孔EIA板(由Greiner生产)，并在4℃过夜孵育以贴附。用PBS冲洗每个孔后,以100μl/孔向其中加入1％BSA-PBS，令其在室温下反应以阻断残余的活性基团。用含0.05％Tween20的PBS(此后称作"Tween-PBS")冲洗每个孔后,以50μl/孔添加转化株的培养上清物，并在室温反应1小时。反应后,用Tween-PBS冲洗每个孔,然后，以50μl/孔添加用1％BSA-PBS稀释6000倍的过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(γ)抗体溶液(AmericanQualex生产)作为二抗，并室温反应1小时。反应并随后用Tween-PBS冲洗后,以50μl/孔添加ABTS底物溶液显色，此后20分钟，通过以50μl/孔添加5％SDS溶液终止反应。其后,测量415nm处的吸光率。
上述ELISA测量的结果是,纯化的KM2760-1和KM2760-2在与CCR4部分肽的结合活性上是相似的。
(3)纯化的KM2760-1和2760-2的ADCC活性。
纯化的KM2760-1和2760-2的ADCC活性检测如下。
抗CCR4嵌合抗体对高度表达人CCR4的CCR4/EL-4细胞(WO01/64754)的ADCC活性。
(a)制备靶细胞悬浮液
制备l.5×l06 WO 01/64754描述的表达人CCR4的CCR4/EL-4细胞后,相当于5.55MBq当量的放射活性物质Na2 51CrO4加入其中,随后在37℃反应1.5小时因而用放射性同位素标记细胞。反应后,通过悬浮在培养基中再离心，冲洗细胞3次,重新悬浮在培养基中然后在冰上4℃孵育30分钟以自发分解放射活性物质。离心后,通过加入15ml培养基调节细胞到2×l05细胞/ml密度，并用作靶细胞悬浮液。
(b)制备人效应细胞悬浮液
从健康供体采集60ml外周血,其中加入0.6ml肝素钠(由ShimizuPharmaceutical生产),随后轻轻混合。采用Lymphoprep(由AXISSHIELD生产)按照厂家使用说明书离心混合物(800g,20分钟)以分离单核细胞层。通过用培养基离心(1,400rpm,5分钟)3次冲洗细胞，然后重悬浮在培养基中至5×106细胞/ml密度并被用作人效应细胞悬浮液。
(c)检测ADCC活性
在96孔U-形底平板(由Falcon生产)的每个孔中分发50μl(1×104细胞/孔)(1)项中制备的靶细胞悬浮液。然后,添加(2)项中制备的人效应细胞悬浮液100μl(5×105细胞/孔,效应细胞和靶细胞比例成为50:1)。此外,加每种抗CCR4嵌合抗体至终浓度为0.0001到10μg/ml,随后37℃反应4小时。反应后,离心平板并用γ-计数器检测上清物中的51Cr的量。通过进行相同的步骤,采用没有人效应细胞悬浮液和抗体溶液的单独培养基并测量上清物中51Cr的量，计算自发解离的51Cr量。通过进行相同的步骤,采用1mol/L盐酸溶液而非抗体溶液和人效应细胞悬浮液并测量上清物中51Cr的量，计算总解离的51Cr量。根据方程式(I)计算ADCC活性(％)。
根据以上方法测量的结果,KM2760-1和KM2760-2的活性显著不同,KM2760-2的活性显著低于KM2760-1(图1)。
(4)抗体组合物的糖链分析
KM2760-1和KM2760-2的糖链分析如下。
KM2760-1和KM2760-2均接受肼解作用以从蛋白上裂解糖链[Method of Enzymology,83,263(1982)]。在通过减压条件下的蒸发作用去除肼后,添加醋酸铵水溶液和醋酸酐进行N-乙酰化作用。冻干后,进行2-氨基嘧啶荧光标记[J.Biochem.(生物化学杂质),95,197(1984)]。用Superdex Peptide HR 10/30柱(由Pharmacia生产)从多余的试剂中分离荧光标记的糖链基团(PA-处理的糖链基团)。用离心浓缩器干燥糖链馏分并被用作纯化的PA-处理的糖链基团。接着,纯化的PA-处理的糖链基团用CLC-ODS柱(Shimadzu生产)接受反相HPLC分析(图2)。
用磷酸钠缓冲液(pH 3.8)作为缓冲液A，磷酸钠缓冲液(pH3.8)+0.5％1-丁醇作为缓冲液B,按如下梯度进行分析。
图2中显示的峰(1)至(8)具有以下结构。
GlcNAc、Gal、Man、Fuc和PA分别表示N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖和吡啶基氨基。
图2中,无αl,6-岩藻糖的糖链基团比例从峰(1)至(4)占峰(1)至(8)的面积计算,结合α1,6-岩藻糖的糖链基团比例从计算峰(5)至(8)占峰(1)至(8)的面积计算。
KM2760-1无αl,6-岩藻糖的糖链的比例不同于KM2760-2。
(5)产抗体细胞αl,6-墨角藻糖基转移酶基因的表达水平
图3显示根据实施例8的WO 00/61739描述的方法测量的，亲代大鼠骨髓瘤YB2/0细胞、能够产生KM2760-1的克隆KM2760#58-35-16和能够产生KM2760-2的克隆1-15的αl,6-墨角藻糖基转移酶和β-肌动蛋白基因转录产物测定水平的结果。克隆1-15产生αl,6-墨角藻糖基转移酶基因的量与亲代大鼠骨髓瘤YB2/0细胞相似,但克隆KM2760#58-35-16产生的量明显少于其它克隆。
基于上述结果证实,基因组被修饰的产抗体细胞可以比其亲代细胞产生具有更高ADCC活性的抗体组合物，所述修饰使其αl,6-岩藻糖修饰酶活性比其亲代细胞更低或删除。
实施例3
制备FUT8基因删除的CHO细胞并用该细胞产生抗体:
制备CHO细胞，并评价该细胞产生的抗体的ADCC活性，所述CHO细胞中含CHO细胞FUT8基因外显子2的基因组区域被删除。
1.构建中国仓鼠FUT8基因外显子2靶向载体质粒pKOFUT8Puro
(1)构建质粒ploxPPuro
质粒ploxPPuro按以下步骤构建(图4)。
在35μl NE缓冲液4(由New England Biolabs生产)中溶解1.0μgpKOSelectPuro(由Lexicon生产),向其中加入20单位限制性酶AscI(由New England Biolabs生产),随后37℃消化2小时。消化后,溶液进行0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳以纯化大约1.5Kb的含嘌呤霉素抗性基因表达单位的DNA片段。
另一方面,在日本公开的未审查专利申请No.314512/99中描述的质粒ploxP 1.0μg溶解在35μl NE缓冲液4(由New England Biolabs生产)中,向其中加入20单位限制性酶AscI(由New England Biolabs生产),随后37℃消化2小时。消化后,溶液进行0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳以纯化大约2.0Kb的DNA片段。
混合获得的衍生自质粒pKOSelectPuro的AscI-AscI片段(4.5μl,大约1.5Kb)、0.5μl衍生自质粒ploxP的AscI-AscI片段(大约2.0Kb)和5.0μl Ligation High(由Toyobo生产),随后16℃结合30分钟。通过使用反应溶液转化大肠杆菌DH5α株,按照已知的方法从获得的氨比西林抗性克隆中分离质粒DNA。在此,质粒被叫做ploxPPuro。
(2)构建质粒pKOFUT8gE2-l
采用参考实施例(2)中获得的质粒pFUT8fgE2-2，通过以下步骤构建质粒pKOFUT8gE2-l，质粒pFUT8fgE2-2具有含中国仓鼠FUT8外显子2的基因组区域(图5)。
在含100μg/ml BSA(New England Biolabs生产)的35μl NE缓冲液1(New England Biolabs生产)中溶解2.0μg质粒pFUT8fgE2-2,向其中加入20单位限制性酶SacI(由New England Biolabs生产),随后37℃消化2小时。通过乙醇沉淀从反应溶液中回收DNA片段，并溶解在含100μg/ml BSA(New England Biolabs生产)的35μl NE缓冲液2(New England Biolabs生产)中,向其中加入20单位限制性酶EcoRV(由New England Biolabs生产)，随后37℃消化2小时。消化后,溶液进行0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳以纯化大约1.5Kb的DNA片段。
分别地,1.0μg质粒LITMUS28(New England Biolabs生产)溶解在35μl含100μg/ml BSA(New England Biolabs生产)的NE缓冲液1(NewEngland Biolabs生产)中,向其中加入20单位限制性酶Sad(由NewEngland Biolabs生产)，随后37℃消化2小时。通过乙醇沉淀从反应溶液中回收DNA片段，并溶解在含100μg/ml BSA(New EnglandBiolabs生产)的35μl NE缓冲液2(New England Biolabs生产)中,向其中加入20单位限制性酶EcoKV(由New England Biolabs生产)，随后37℃消化2小时。消化后,溶液进行0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳以纯化大约2.8Kb的DNA片段。
混合获得的衍生自质粒pFUT8fgE2-2的EcoRV-SacI片段(4.5μl,大约1.5Kb)、0.5μl衍生自质粒LITMUS28的EcoKV-SacI片段(大约2.8Kb)和5.0μl Ligation High(由Toyobo生产),随后16℃结合30分钟。用反应溶液转化大肠杆菌DH5α株,按照已知的方法从获得的氨比西林抗性克隆中分离质粒DNA。在此,质粒被叫做pKOFUT8gE2-1。
(3)构建质粒pKOFUT8gE2-2
采用(2)项中获得的质粒pKOFUT8gE2-l，通过以下步骤构建质粒pKOFUT8gE2-2(图6)。
在含100μg/ml BSA(New England Biolabs生产)的30μl NE缓冲液2(New England Biolabs生产)中溶解2.0μg质粒pKOFUT8gE2-l,向其中加入20单位限制性酶EcoRV(由New England Biolabs生产),随后37℃消化2小时。通过乙醇沉淀从反应溶液中回收DNA片段，并溶解在含100μg/ml BSA(New England Biolabs生产)的30μl NE缓冲液1(New England Biolabs生产)中,向其中加入20单位限制性酶KpnI(由New England Biolabs生产)，随后37℃消化2小时。消化后,溶液进行0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳以纯化大约1.5Kb的DNA片段。
分别地,1.0μg质粒ploxPPuro溶解在30μl NE缓冲液4(NewEngland Biolabs生产)中,向其中加入20单位限制性酶HpaI(由NewEngland Biolabs生产)，随后37℃消化2小时。通过乙醇沉淀从反应溶液中回收DNA片段，并溶解在含100μg/ml BSA(New EnglandBiolabs生产)的30μl NE缓冲液1(New England Biolabs生产)中,向其中加入20单位限制性酶KpnI(由New England Biolabs生产)，随后37℃消化2小时。消化后,溶液进行0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳以纯化大约3.5Kb的DNA片段。
混合获得的4.0μl衍生自质粒pKOFUT8gE2-l的EcoKV-KpnI片段(大约1.5Kb)、1.0μl衍生自质粒ploxPPuro的HpaI-KpnI片段(大约3.5Kb)和5.0μl Ligation High(由Toyobo生产)后,混合物在16℃进行结合反应30分钟。用反应溶液转化大肠杆菌DH5α株,按照已知的方法从获得的氨比西林抗性克隆中分离质粒DNA。在此,质粒被叫做pKOFUT8gE2-2。
(4)构建质粒pscFUT8gE2-3
采用参考实施例(2)中获得的质粒pFUT8fgE2-4，通过以下步骤构建质粒pscFUT8gE2-3，质粒pFUT8fgE2-4具有含中国仓鼠FUT8外显子2的基因组区域(图7)。
在35μl NE缓冲液1(New England Biolabs生产)中溶解2.0μg质粒pFUT8fgE2-4,向其中加入20单位限制性酶HpaII(由New EnglandBiolabs生产),随后37℃消化2小时。通过乙醇沉淀从反应溶液中回收DNA片段，然后用Blunting High(Toyobo生产)按照厂家使用说明书将DNA末端改变成钝末端。通过苯/氯仿提取和乙醇沉淀回收DNA片段，并溶解在35μl NE缓冲液2(New England Biolabs生产)中,向其中加入20单位限制性酶HindIII(由New England Biolabs生产)，随后37℃消化2小时。消化后,溶液进行0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳以纯化大约3.5Kb的DNA片段。
分别地,1.0μg质粒LITMUS39(New England Biolabs生产)溶解在35μl NE缓冲液2(New England Biolabs生产)中,溶液与20单位限制性酶EcoRV(New England Biolabs生产)和20单位限制性酶HindIII(NewEngland Biolabs生产)混合，并在37℃消化2小时。消化后,溶液进行0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳以纯化大约2.8Kb的DNA片段。
混合获得的衍生自质粒pFUT8fgE2-4的HpaII-HindIII片段(4.0μl,大约3.5Kb)、1.0μl衍生自质粒LITMUS39的EcoRV-HindIII片段(大约2.8Kb)和5.0μl Ligation High(由Toyobo生产),随后16℃结合30分钟。用反应溶液转化大肠杆菌DH5α株,按照已知的方法从获得的氨比西林抗性克隆中分离质粒DNA。在此,质粒被叫做pscFUT8gE2-3。
(5)构建质粒pKOFUT8gE2-3
采用参考实施例(2)中获得的质粒pFUT8fgE2-4，通过以下步骤构建质粒pKOFUT8gE2-3，质粒pFUT8fgE2-4具有含中国仓鼠FUT8外显子2的基因组区域(图8)。
在35μl EcoRI的NE缓冲液(New England Biolabs生产)中溶解2.0μg质粒pFUT8fgE2-4,向其中加入20单位限制性酶EcoRI(由NewEngland Biolabs生产)和20单位限制性酶HindIII(New England Biolabs生产),随后37℃消化2小时。消化后,溶液进行0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳以纯化大约1.8Kb的DNA片段。
分别地,1.0μg质粒pBluescript II KS(+)(Stratagene生产)溶解在35μl EcoRI的NE缓冲液(New England Biolabs生产)中,向其中加入20单位限制性酶EcoRI(New England Biolabs生产)和20单位限制性酶HindIII(New England Biolabs生产)，随后37℃消化2小时。消化后,溶液进行0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳以纯化大约3.0Kb的DNA片段。
混合获得的衍生自质粒pFUT8fgE2-4的Hindlll-EcdRI片段(4.0μl,大约1.8Kb)、1.0μl衍生自质粒pBluescript II KS(+)的HindIII-EcoRI片段(大约3.0Kb)和5.0μl Ligation High(由Toyobo生产),随后16℃结合30分钟。用反应溶液转化大肠杆菌DH5α株,按照已知的方法从获得的氨比西林抗性克隆中分离质粒DNA。在此,质粒被叫做pKOFUT8gE2-3。
(6)构建质粒pKOFUT8gE2-4
采用(4)项和(5)项中获得的质粒pscFUT8fgE2-3和pKOFUT8gE2-3，通过以下步骤构建质粒pKOFUT8gE2-4(图9)。
在35μl含100μg/ml BSA(New England Biolabs生产)的SalI NE缓冲液(New England Biolabs生产)中溶解1.0μg质粒pscFUT8gE2-3,向其中加入20单位限制性酶SalI(由New England Biolabs生产),随后37℃消化2小时。通过乙醇沉淀从反应溶液中回收DNA片段，并溶解在30μl含100μg/ml BSA(New England Biolabs生产)的NE缓冲液2(New England Biolabs生产)中,向其中加入20单位限制性酶HindIII(由New England Biolabs生产)，随后37℃消化2小时。消化后,溶液进行0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳以纯化大约3.6Kb的DNA片段。
分别地,1.0μg质粒pKOFUT8gE2-3(New England Biolabs生产)溶解在35μl SalI的NE缓冲液(New England Biolabs生产)中,向其中加入20单位限制性酶SalI(由New England Biolabs生产)，随后37℃消化2小时。通过乙醇沉淀从反应溶液中回收DNA片段，并溶解在35μlNE缓冲液2(New England Biolabs生产)中,向其中加入20单位限制性酶HindIII(由New England Biolabs生产)，随后37℃消化2小时。消化后,向其中加入35μl 1mol/1 Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)和3.5μl大肠杆菌CIS衍生的碱性磷酸酶(Takara Shuzo生产),接着在65℃反应30分钟以使DNA末端去磷酸化。去磷酸化作用处理后,通过苯/氯仿提取和乙醇沉淀回收DNA片段，并溶解在10μl消毒水中。
混合获得的衍生自质粒pscFUT8gE2-3的SalI-HindIII片段(4.0μl,大约3.1Kb)、1.0μl衍生自质粒pKOFUT8gE2-3的Sall-HindIII片段(大约4.8Kb)和5.0μl Ligation High(由Toyobo生产),随后16℃结合30分钟。用反应溶液转化大肠杆菌DH5α株,按照已知的方法从获得的氨比西林抗性克隆中分离质粒DNA。在此,质粒被叫做pKOFUT8gE2-4。
(7)构建质粒pKOFUT8gE2-5
采用(3)项和(6)项中获得的质粒pKOFUT8gE2-2和pKOFUT8gE2-4，通过以下步骤构建质粒pKOFUT8gE2-5(图10)。
在30μl NE缓冲液4(New England Biolabs生产)中溶解1.0μg质粒pKOFUT8gE2-2,向其中加入20单位限制性酶Smal(由NewEngland Biolabs生产),随后25℃消化2小时。通过乙醇沉淀从反应溶液中回收DNA片段，并溶解在30μl NE缓冲液2(New EnglandBiolabs生产)中,向其中加入20单位限制性酶BamHI(由NewEngland Biolabs生产)，随后37℃消化2小时。消化后,向其中加入30μl 1mol/1 Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)和3.0μl大肠杆菌C15衍生的碱性磷酸酶(Takara Shuzo生产),接着在65℃反应1小时以使DNA末端去磷酸化。去磷酸化作用处理后,通过苯/氯仿提取和乙醇沉淀回收DNA片段，并溶解在10μl消毒水中。
分别地,1.0μg质粒pKOFUT8gE2-4溶解在30μl NE缓冲液4(NewEngland Biolabs生产)中,向其中加入20单位限制性酶SmaI(NewEngland Biolabs生产)，随后25℃消化2小时。通过乙醇沉淀从反应溶液中回收DNA片段，并溶解在30μl NE缓冲液2(New EnglandBiolabs生产)中,向其中加入20单位限制性酶BamHI(由NewEngland Biolabs生产)，随后37℃消化2小时。消化后,溶液进行0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳以纯化大约5.2Kb的DNA片段。
混合获得的衍生自质粒pKOFUT8gE2-2的SmaI-BamHI片段(0.5μl,大约5.0Kb)、4.5μl衍生自质粒pKOFUT8gE2-4的Smal-BamHl片段(大约5.4Kb)和5.0μl Ligation High(由Toyobo生产),随后16℃结合15小时。用反应溶液转化大肠杆菌DH5α株,按照已知的方法从获得的氨比西林抗性克隆中分离质粒DNA。在此,质粒被叫做pKOFUT8gE2-5。
(8)构建质粒pKOFUT8Puro
采用(7)项中获得的质粒pKOFUT8gE2-5，通过以下步骤构建质粒pKOFUT8Puro(图11)。
在50μl NE缓冲液4(New England Biolabs生产)中溶解1.0μg质粒pKOSelectDT(由Lexicon生产),向其中加入16单位限制性酶RsrII(由New England Biolabs生产),随后37℃消化2小时。消化后,溶液进行0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳以纯化大约1.2Kb含白喉毒素表达单位的DNA片段。
分别地,1.0μg质粒pKOFUT8gE2-5溶解在50μl NE缓冲液4(NewEngland Biolabs生产)中,向其中加入16单位限制性酶RsrII(由NewEngland Biolabs生产)，随后37℃消化2小时。消化后,向其中加入30μl 1mol/1 Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)和3.0μl大肠杆菌CIS衍生的碱性磷酸酶(Takara Shuzo生产),接着在65℃反应1小时以使DNA末端去磷酸化。去磷酸化作用处理后,通过苯/氯仿提取和乙醇沉淀回收DNA片段，并溶解在10μl消毒水中。
混合获得的衍生自质粒pKOSelectDT的RsrII-RsrII片段(1.0μl,大约1.2Kb)、1.0μl衍生自质粒pKOFUT8gE2-5的RsrII-RsrII片段(大约10.4Kb)、3.0μl消毒水和5.0μl Ligation High(由Toyobo生产),随后16℃结合30分钟。用反应溶液转化大肠杆菌DH5α株,按照已知的方法从获得的氨比西林抗性克隆中分离质粒DNA。在此,质粒被叫做pKOFUT8Puro。
2.制备CHO细胞，其中含FUT8基因外显子2的基因组区域的一个拷贝是断裂的
(1)导入靶向载体
在本实施方案1项中构建的中国仓鼠FUT8基因组区域靶向载体pKOFUT8Puro被导入实施例1的(2)项中制备的克隆5-03。
如下所述，按照电穿孔将质粒pKOFUT8Puro的基因导入克隆5-03[Cytofechnology,3,133(1990)]。首先,150μg质粒pKOFUT8Puro溶解在1.8ml SalI的NE缓冲液(New England Biolabs生产)中,向其中加入600单位限制性酶SalI(New England Biolabs生产),随后37℃消化5小时以获得线性片段。用苯/氯仿抽提提取反应溶液,随后乙醇沉淀,回收的线性质粒被制成1μg/μl的水溶液。分别地,克隆5-03悬浮在K-PBS缓冲液(137mmol/1 KC1,2.7mmol/1 NaCl,8.1mmol/1 Na2HPO4,1.5mmol/1 KH2PO4,4.0mmol/1 MgCl2)中至8×l07细胞/ml密度。200μl细胞悬浮液(1.6×l06细胞)与4μl(4μg)线性质粒混合后,全部体积的细胞-DNA混合物被转移进Gene Pulser Cuvette(电极间距离2mm)(由BIO-RAD生产)，然后用细胞融合设备Gene Pulser(由BIO-RAD生产)以350V脉冲压和250μF电容进行电穿孔。用30个试管以相同的方式进行电穿孔后,细胞悬浮液悬浮在添加了10％胎牛血清(由LifeTechnologies生产)和1×浓度HT添加物(Life Technologies生产)的IMDM培养基(由Life Technologies生产)中，并接种进30个10cm直径的粘附细胞培养器(Falcon生产)中。在5％CO2中37℃培养24小时后,去除培养上清物,给予10ml添加了15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生产)和10％胎牛透析血清(Life Technologies生产)的IMDM培养基(LifeTechnologies生产)。每隔3至4天重复更换培养基培养10天后,获得了嘌呤霉素-抗性克隆。
(2)制备导入了靶向载体的克隆
如下获取(1)项中获得的嘌呤霉素-抗性克隆中的任意900个集落。
首先,从形成了嘌呤霉素-抗性克隆集落的10cm碟中去除培养上清物，并在后来置于立体显微镜下的碟中加入7ml磷酸盐缓冲液。接着,刮下每个集落，用Pipetteman(由GILSON生产)吸取并转移进96孔圆底平板(Falcon生产)中。胰蛋白酶处理后,每个克隆被接种进96孔平底平板用于贴附细胞培养(Iwaki Glass生产)，在添加了15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生产)和10％胎牛透析血清(Life Technologies生产)的IMDM培养基(Life Technologies生产)中培养1周。
培养后,平板中的每个克隆被胰蛋白酶处理，然后与两倍体积的冷冻培养基(20％DMSO,40％胎牛血清,40％IMDM)混合。一半混合物接种进贴附细胞培养的96孔平底平板(Iwaki Glass生产)中作为复制板,而剩下的一半混合物被低温贮藏作为母板。在添加了15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生产)和10％胎牛透析血清(Life Technologies生产)的IMDM培养基(Life Technologies生产)中培养复制板1周。
(3)通过基因组PCR诊断同源重组
通过基因组PCR进行(2)项中获得的900个克隆的同源重组诊断。
首先,按照已知的方法[Analytical Biochemistry,201,331(1992)]制备(2)项中制备的复制板中每个克隆的基因组DNA，并在30μl TE-核糖核酸酶缓冲液(pH 8.0)(10mmol/1 Tris-HCl,1mmol/1 EDTA,200μg/ml核糖核酸酶A)中溶解过夜。此外,设计与参考实施方案中获得的FUT8基因组区域间靶向载体同源区外序列结合的引物(由SEQ ID NO:15描述)，和与载体中loxP序列结合的引物(由SEQ ID NO:16描述)。
用DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo生产),制备含10μl上面制备的每个基因组DNA溶液的25μl反应溶液[ExTaq缓冲液(Takara Shuzo生产),0.2mmol/1 dNTPs和0.5μmol/1基因特异引物(SEQ ID NOs:15和16)],并进行聚合酶链式反应(PCR)。通过94℃加热3分钟，随后38次循环的加热94℃1分钟、60℃1分钟和72℃2分钟，作为一个循环进行PCR。
PCR后,反应溶液进行0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳,大约1.7Kb的含CHO细胞基因组区和靶向载体同源区之间边缘区的特异性扩增片段被确定为阳性克隆。用此方法发现一个阳性克隆。
(4)通过基因组Southern印迹诊断同源重组
对(3)项中证实的一个阳性信号克隆通过基因组Southern印迹进行同源重组诊断。
在(2)项中冷冻保存的母板中间,选择在(3)项中发现含阳性克隆的96孔平板并在5％CO2下37℃孵育10分钟。孵育后,从对应于阳性克隆的孔中收集细胞并接种进贴附细胞的24孔平底板(Greiner生产)中。在添加了15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生产)和10％胎牛透析血清(LifeTechnologies生产)的IMDM培养基(Life Technologies生产)中培养1周后,细胞被接种进贴附细胞的6孔平底板(Greiner生产)中。按照已知的方法[Nucleic Acids Research,3,2303(1976)]从平板中制备每个克隆的基因组DNA，并在150μl TE-核糖核酸酶缓冲液(pH 8.0)(10mmol/1Tris-HCl,1mmol/1 EDTA,200μg/ml核糖核酸酶A)中溶解过夜。
在120μl NE缓冲液3(New England Biolabs生产)中溶解12μg获得的基因组DNA,向其中加入25单位限制性酶PstI(New England Biolabs生产),随后37℃消化过夜。通过乙醇沉淀从反应溶液中回收DNA片段,溶解在20μl TE缓冲液(pH 8.0,10mmol/1 Tris-HCl,1mmol/1 EDTA)中，然后进行0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳。电泳后,基因组DNA按照已知的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,3683(1979)]转移到尼龙膜上。转移完成后,尼龙膜在80℃加热2小时。
分别地,Southern印迹中使用的探针制备如下。首先,设计与靶向载体同源区外序列结合的引物(SEQ ED NOs:9和10)，该同源区与参考实施例(2)中获得的FUT8基因组区同源。接着,用DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo生产),制备含4.0ng参考实施例(2)中获得的质粒pFUT8fgE2-2的20μl反应溶液[ExTaq缓冲液(Takara Shuzo生产),0.2mmol/1 dNTPs和0.5μmol/1基因特异引物(SEQ ID NOs:9和10),进行聚合酶链式反应(PCR)。通过94℃加热1分钟，随后25次循环的加热94℃30秒、55℃30秒和74℃1分钟，作为一个循环进行PCR。PCR后,反应溶液进行1.75％(w/v)琼脂糖凝胶电泳以纯化大约230bp的探针DNA片段。获得的探针DNA溶液(5μl)被放射性同位素标记，采用1.75MBq的[α-32P]dCTP和Megaprime DNA标记系统,dCTP(Ainersham Pharmacia Biotech生产)。
杂交如下进行。首先,尼龙膜密封在滚瓶中,添加15ml杂交液[5×SSPE,50×Denhaldt's溶液,0.5％(w/v)SDS,100μg/ml鲑精DNA]65℃3小时进行预杂交。接着,32P-标记的探针DNA被热变性并放入瓶中。然后,在65℃加热尼龙膜过夜。
杂交后,在50ml 2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸湿尼龙膜并在65℃加热15分钟。重复冲洗步骤两次后,在50ml 0.2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸湿尼龙膜并在65℃加热15分钟。冲洗后,尼龙膜在-80℃与X线胶片接触两夜以显影。
通过限制性酶PstI处理,从野生型FUT8等位基因中形成大约4.4Kb的DNA片段。另一方面,从等位基因中形成了大约6.0Kb的DNA片段，在其中产生了与靶向载体同源的重组。
通过此方法,从(3)项中的阳性克隆基因组DNA中发现了这种大约4.4Kb和大约6.0Kb的特异片段。由于两个片段的数量比例是1:1,证实该克隆是FUT8等位基因的一个拷贝断裂了的克隆。此后,该克隆被叫做克隆Ist.FUTS 2-46。
3.从CHO细胞中删除耐药基因，所述CHO细胞中FUT8基因的一个拷贝是断裂的
(1)导入Cre重组酶表达载体
Cre重组酶表达载体pBS185(Life Technologies生产)被导入本实施方案2项制备的克隆Ist.FUTS 2-46中。
如下所述，按照电穿孔[Cytolechnology,1,133(1990)]将质粒pBS185导入克隆Ist.FUT82-46。首先,克隆Ist.FUTS 2-46悬浮在K-PBS缓冲液(137mmol/1 KC1,2.7 mmol/1 NaCl,8.1mmol/1 Na2HPO4,1.5mmol/1 KH2PO4,4.0mmol/1 MgCl2)中至8×l07细胞/ml密度。200μl细胞悬浮液(1.6×l06细胞)与4μg质粒pBS185混合后,全部体积的细胞-DNA混合物被转移进Gene Pulser Cuvette(电极间距离2mm)(由BIO-RAD生产)，然后用细胞融合设备Gene Pulser(由BIO-RAD生产)以350V脉冲压和250μF电容进行基因转移。
基因转移后,细胞悬浮液悬浮在添加了10％胎牛血清(由LifeTechnologies生产)和1×浓度HT添加物(Life Technologies生产)的10mlIMDM培养基(由Life Technologies生产)中，并用相同的培养基进一步稀释20,000倍。细胞被接种进7个10cm直径的粘附细胞培养器(Falcon生产)，然后在5％CO2中37℃培养24小时。培养后,去除培养上清物,给予10ml添加了10％胎牛透析血清(Life Technologies生产)的IMDM培养基(Life Technologies生产)。每隔3至4天重复更换培养基进行培养10天。
(2)制备导入了Cre重组酶表达载体的克隆
如下获取(1)项中获得的克隆中的任意400个集落。
首先,从10cm碟中去除培养上清物，并在后来置于立体显微镜下的碟中加入7ml磷酸盐缓冲液。接着,刮下每个集落，用Pipetteman(由GILSON生产)吸取并转移进96孔圆底平板(Falcon生产)中。胰蛋白酶处理后,每个克隆被接种进贴附细胞培养的96孔平底平板(Iwaki Glass生产)中，在添加了10％胎牛透析血清(Life Technologies生产)的IMDM培养基(Life Technologies生产)中培养1周。
培养后,用胰蛋白酶处理平板中的每个克隆，然后与两倍体积的冷冻培养基(20％DMSO,40％胎牛血清,40％IMDM)混合。一半混合物接种进贴附细胞培养的96孔平底平板(Iwaki Glass生产)中以制备复制板,而剩下的一半被低温贮藏作为母板。
接着,在添加了15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生产)和10％胎牛透析血清(Life Technologies生产)的IMDM培养基(Life Technologies生产)中培养复制板6天。在有嘌呤霉素情况下阳性克隆消失，阳性克隆中由于Cre重组酶的表达，插入loxP序列间的嘌呤霉素-抗性基因被删除。通过选择方法,发现了91个阳性克隆。
(3)通过基因组Southern印迹诊断耐药基因删除
对(2)项中发现的阳性克隆中的随意6个克隆进行基因组Southern印迹诊断耐药基因删除。
在(2)项中冷冻保存的母板中间,选择含6个阳性克隆的96孔平板并在5％CO2下37℃孵育10分钟。孵育后,从对应于每个阳性克隆的孔中收集细胞并接种进用于贴附细胞的24孔平底板(Greiner生产)中。在添加了10％胎牛透析血清(Life Technologies生产)的IMDM培养基(Life Technologies生产)中培养1周后,细胞被接种进用于贴附细胞的6孔平底板(Greiner生产)中。按照已知的方法[Nucleic Acids Research,3,2303(1976)]从平板中制备每个克隆的基因组DNA，并在150μl TE-核糖核酸酶缓冲液(pH 8.0)(10mmol/1 Tris-HCl,1mmol/1 EDTA,200μg/ml核糖核酸酶A)中溶解过夜。
在120μl BamHI的NE缓冲液(New England Biolabs生产)中溶解12μg获得的基因组DNA,向其中加入20单位限制性酶BamUI(NewEngland Biolabs生产),随后37℃消化过夜。通过乙醇沉淀从反应溶液中回收DNA片段,溶解在20μl TE缓冲液(pH 8.0,10mmol/1 Tris-HCl,1mmol/1 EDTA)中，然后进行0.4％(w/v)琼脂糖凝胶电泳。电泳后,基因组DNA按照已知的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,3683(1979)]转移到尼龙膜上。转移完成后,尼龙膜在80℃加热2小时。
分别地,Southern印迹中使用的探针制备如下。首先,设计与参考实施方案中获得的FUT8基因组区中靶向载体同源区外序列结合的引物(SEQ ED NOs:9和10)。接着,用DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo生产),通过制备20μl含4.0ng参考实施例(2)中获得的质粒pFUT8fgE2-2的反应溶液[ExTaq缓冲液(Takara Shuzo生产),0.2mmol/1dNTPs和0.5μmol/1基因特异引物(SEQ ID NOs:9和10),进行聚合酶链式反应(PCR)。通过94℃加热1分钟，随后25次循环的加热94℃30秒、55℃30秒和74℃1分钟，作为一个循环进行PCR。PCR后,反应溶液进行1.75％(w/v)琼脂糖凝胶电泳以纯化大约230bp的探针DNA片段。采用1.75MBq的[α-32P]dCTP和Megaprime DNA标记系统,dCTP(Ainersham Pharmacia Biotech生产)，5μl获得的探针DNA溶液被放射性同位素标记。
杂交如下进行。首先,尼龙膜密封在滚瓶中,添加15ml杂交液[5×SSPE,50×Denhaldt's溶液,0.5％(w/v)SDS,100μg/ml鲑精DNA]65℃3小时进行预杂交。接着,32P-标记的探针DNA被热变性并放入瓶中,在65℃加热尼龙膜过夜。
杂交后,在50ml 2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸湿尼龙膜并在65℃加热15分钟。重复冲洗步骤两次后,在50ml 0.2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸湿膜并在65℃加热15分钟。尼龙膜冲洗后,在-80℃与X线胶片接触两夜以显影。
通过上面描述的限制性酶BamHI处理,从野生型FUT8等位基因中形成了大约25.5Kb的DNA片段。而且,从等位基因中形成了大约20.0Kb的DNA片段，在其中产生了与靶向载体同源的重组。此外,当嘌呤霉素-抗性基因(大约1.5Kb)从产生了同源重组的等位基因中被删除时,用相同的处理形成大约18.5Kb的DNA片段。
通过此方法,从6个克隆的5个克隆基因组DNA中发现了大约25.5Kb和大约18.5Kb的特异片段。由于两个片段的数量比例是1:1,显示嘌呤霉素-抗性基因从克隆中被删除，该克隆FUT8基因组区的一个拷贝是断裂的。此后,该克隆被叫做克隆Ist.FUTS 2-46-1。同样,克隆Ist.FUT82-46-1、克隆Ist.FUT82-46和克隆5-03基因组Southern印迹的结果显示在图12。而且,克隆Ist.FUT82-46-1,以2-46-1的分类命名于2001年9月26日以保藏号FERM BP-7755保藏在独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物保藏中心(日本，茨城县)(Tsukuba Central6,1,Higashi 1-Chome Tsukuba-shi,Ibaraki-ken 305-8566 Japan)。
4.纯化FUT8基因断裂克隆产生的抗体
通过断裂FUT8等位基因的一个拷贝在本实施例3项中获得的克隆Ist.FUT82-46-1悬浮在添加了15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生产)和10％胎牛透析血清(Life Technologies生产)的IMDM培养基(LifeTechnologies生产)中至3×105细胞/ml密度,然后总悬浮液的60ml被接种进两个T182烧瓶用于贴附细胞培养(Greiner生产)。培养3天后,丢弃上清物并改变为总共60ml的EXCELL301培养基(由JRH Biosciences生产)。
在5％CO2培养箱中37℃培养7天后,计算完整细胞数以证实其生存能力几乎是相同的(每个30％或以下),然后回收每个细胞悬浮液。以3,000rpm 4℃离心细胞悬浮液10分钟,以10,000rpm 4℃离心回收的上清物1小时，然后用具有0.22μm孔径的150ml容量PES FilterUnit(NALGENE生产)过滤。
在0.8cm直径的柱中充填Prosep-A HighCapacity(bioPROCESSING生产)至2cm厚度，用10ml 0.1mol/1柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)和10ml 1mol/1氨基乙酸/NaOH-0.15mol/1 NaCl缓冲液(pH 8.6)按此顺序冲洗以达到平衡载体。接着,每个培养上清物100ml通过此柱并用50ml 1mol/1氨基乙酸/NaOH-0.15 mol/1 NaCl缓冲液(pH8.6)冲洗。冲洗后,Prosep-A吸附的抗体用2.5ml 0.1mol/1柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)洗脱,洗脱物以500μl分馏，每个馏分通过与100μl2mol/1Tris-HCl(pH 8.5)混合被中和。通过BCA方法[Anal.Biochem.,150,76(1985)]选择两个含高浓度抗体的馏分(总共1.2 ml),合并，然后用10mol/1柠檬酸盐-0.15mol/1 NaCl缓冲液(pH 6.0)透析一昼夜。透析后,回收抗体溶液并用0.22μm孔径的Millex GV(MILLIPORE生产)进行消毒过滤。
5.FUT8基因断裂克隆产生的抗体组合物的ADCC活性
为了评价本实施方案4项中纯化的抗CCR4抗体的ADCC活性,采用WO 01/34754中描述的CCR4-阳性克隆CCR4/EL-4检测ADCC活性。
在添加了10％胎牛血清(Life Technologies生产)的RPMI1640培养基(由Life Technologies生产)(此后称为"RPMI1640-FBS(10)")中传代培养的1×l06细胞CCR4/EL-4克隆被悬浮在500μl RPMI1640-FBS(10)中,此后向其中加入3.7MBq的Na2 51CrO4,随后37℃培养90分钟以用放射性同位素标记细胞。以1,200rpm离心5分钟后,丢弃上清物，靶细胞悬浮在5ml RPMI1640-FBS(10)中。重复3次冲洗步骤，然后在冰上孵育细胞悬浮液30分钟以自发分解放射活性物质。再重复两次冲洗步骤，然后在5ml RPMI1640-FBS(1O)中悬浮细胞从而制备2.0×l05细胞/ml的靶细胞悬浮液。
分别地,从健康供体采集30ml静脉血,与0.5ml肝素钠(由ShimizuPharmaceutical生产)轻轻混合，然后与30ml生理盐(OtsukaPharmaceutical生产)混合。混合后,10ml混合物轻轻盖在4mlLymphoprep(NYCOMED PHARMA AS生产)上，以2,000rpm室温离心30分钟。从离心管中收集分离的单核细胞部分,合并，然后悬浮在30mlRPMI1640-FBS(10)中。以1,200rpm室温离心15分钟后,丢弃上清物，并在20ml RPMI1640-FBS(10)中悬浮细胞。重复两次冲洗步骤，然后用RPMI1640-FBS(10)制备2.5×l06细胞/ml的效应细胞悬浮液。
将靶细胞悬浮液以50μl(1×l04细胞/孔)分入96孔U形底平板(Falcon生产)的每个孔中。随后,效应细胞悬浮液以100μl(2.5×l05细胞/孔)分入每孔，从而调节效应细胞与靶细胞的比例为25:1。接着,用RPMI1640-FBS(10)从本实施方案4项中获得的每个抗CCR4抗体制备0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml的系列稀释溶液,稀释的溶液以50μl分入孔中至终浓度分别为0.0025μg/ml、0.025μg/ml、0.25μg/ml和2.5μg/ml。在5％CO2中37℃反应4小时后,以1,200rpm离心平板5分钟。分批取出每孔中75μl的上清物到12mm直径RIA管(IWAKI生产)中,用MINAX-γ自动-γ计数器5550(PACKARD生产)测量解离的51Cr的量。
此外,在添加150μl RPMI 1640-FBS(1O)而没有效应细胞悬浮液和抗体溶液的反应混合物中进行相同的反应计算自发解离的51Cr的量。在添加100μl 1N盐酸和50μl RPMI1640-FBS(10)而没有效应细胞悬浮液和抗体溶液的反应混合物中进行相同的反应计算总解离的51Cr的量。
采用这些值,根据(3)项中描述的方程式(I)计算ADCC活性。
图13显示每个抗CCR4抗体的ADCC活性。从FUT8等位基因一个拷贝断裂的克隆1st.FUT82-46-1中获得的抗体比CHO克隆基因断裂前的克隆5-03产生的抗体显示显著高的ADCC活性。此外,没有观察到这些抗体抗原结合活性的改变。基于此结果证实，通过断裂宿主细胞中FUT8等位基因可以改善产生的抗体的ADCC活性。
实施例4
从FUT8基因一个拷贝被破坏的CHO细胞制备高耐药克隆:
一般知道，两个等位基因均被破坏的克隆是通过在培养基中培养细胞，然后分离耐药克隆而获得的，培养细胞中用靶载体通过同源重组技术获得的基因组基因的一个等位基因被破坏,在培养基中用于选择插入靶载体克隆的阳性选择剂浓度被升高大约10倍[操控小鼠胚胎,实验室手册；基因靶向,实用方法,IRL Press at Oxford University Press(1993),用ES细胞制备突变体小鼠]。
因此,用实施方案3的2(3)项中获得的克隆Ist.FUTS 2-46，根据已知的方法[Molecular and Cellular Biology,12,2391(1992)]，FUT8基因2个拷贝被破坏的转化株制备如下。
(1)制备高浓度嘌呤霉素-抗性克隆
1×l08细胞量的克隆Ist.FUTS 2-46悬浮在添加了10％透析胎牛血清(Life Technologies生产)的IMDM培养基(Life Technologies生产)中,并接种进20个贴附细胞培养的10cm碟器皿(Falcon生产)中，然后在5％CO2条件下37℃培养24小时。培养后,丢弃上清物，以10ml分发添加了150μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生产)和10％透析的胎牛血清(LifeTechnologies生产)的IMDM培养基(Life Technologies生产)。每隔3至4天重复更换此培养基,进行培养12天。
按以下步骤收集形成的90个耐药集落。首先,从10cm碟中丢弃培养上清物，用7ml磷酸盐缓冲液替换，然后将碟置于立体显微镜下。接着,剥离集落，用Pipetteman(GILSON生产)吸取并转移进96孔圆底平板(Falcon生产)。胰蛋白酶处理后,每个克隆接种进贴附细胞的96孔平底板(Iwaki Glass生产)，在添加了150μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生产)和10％透析的胎牛血清(Life Technologies生产)的IMDM培养基(Life Technologies生产)中培养1周。
培养后,平板上的每个克隆接受胰蛋白酶处理，并与两倍体积的冷冻培养基(20％DMSO,40％胎牛血清,40％IMDM)混合。其一半体积接种进贴附细胞的96孔平底平板(Iwaki Glass生产)以制备复制板,剩下的一半体积被低温贮藏作为母板。在添加了15mg/ml嘌呤霉素(SIGMA生产)和10％透析的胎牛血清(Life Technologies生产)的IMDM培养基(Life Technologies生产)中培养复制板1周。
(2)通过基因组Southern印迹诊断同源重组
按照以下步骤，通过基因组Southern印迹对(1)项中获得的所有耐药克隆进行同源重组诊断。
在用胰蛋白酶处理(1)项中制备的复制板后,所有克隆被接种进贴附细胞的24孔平底板(Greiner生产)。所有克隆在添加了150μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生产)和10％透析的胎牛血清(Life Technologies生产)的IMDM培养基(Life Technologies生产)中培养1周,用胰蛋白酶处理并接种进贴附细胞的6孔平底板(Greiner生产)。根据已知的方法[NucleicAcids Research,3,2303(1976)]从平板中制备每个克隆的基因组DNA，并在150μl TE-核糖核酸酶缓冲液(pH 8.0)(10mmol/1 Tris-HCl,1mmol/1EDTA,200mg/ml核糖核酸酶A)中溶解过夜。
在120μl BamHI的NE缓冲液(New England Biolabs生产)中溶解12μg上面制备的基因组DNA,向其中加入25单位限制性酶BamHI(New England Biolabs生产),随后在37℃消化。通过乙醇沉淀法从反应溶液中回收DNA片段,溶解在20μl TE缓冲液(pH 8.0,10mmol/1Tris-HCl,1mmol/1 EDTA)中，然后进行0.6％(w/v)琼脂糖凝胶电泳。电泳后,基因组DNA根据已知的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,3683(1979)]转移到尼龙膜上。转移后,尼龙膜在80℃进行热处理2小时。
另一方面,Southern印迹的探针制备如下。采用DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo生产),通过制备20μl反应溶液[ExTaq缓冲液(Takara Shuzo生产),0.2mmol/1 dNTPs，0.5μmol/1上述基因特异引物(SEQ ID NOs:9和10)]进行聚合酶链式反应(PCR)。通过94℃加热1分钟，随后25次循环的94℃30秒、55℃30秒和74℃1分钟，作为一个循环进行PCR。PCR后,反应溶液进行1.75％(w/v)琼脂糖凝胶电泳以纯化大约230bp的探针DNA片段。采用1.75MBq的[α32P]dCTP和Megaprime DNA标记系统,dCTP(Ainersham Pharmacia Biotech生产)，5μl获得的探针DNA溶液被放射性同位素标记。
杂交如下进行。首先,上面的尼龙膜被密封在滚瓶中,添加15ml杂交液[5×SSPE,50×Denhaldt's溶液,0.5％(w/v)SDS,100mg/ml鲑精DNA]65℃进行预杂交3小时。接着,32P-标记的探针DNA被热变性，放入瓶中并65℃加热过夜。
杂交后,在50ml 2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸湿尼龙膜并65℃加热15分钟。重复此冲洗步骤两次后,在50ml 0.2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸湿该膜并在65℃加热15分钟。冲洗后,尼龙膜在-80℃与X线胶片接触两夜以显影。
通过上面限制性酶BamHI处理,从野生型FUT8等位基因中获得了大约25.5Kb的DNA片段。另一方面,从等位基因中形成了大约20.0Kb的DNA片段，所述的等位基因产生于通过相同的限制性酶处理与靶向载体的同源重组。
根据此方法,发现仅显示上面大约14.0Kb的同源重组区特异片段的克隆(图14)。此克隆被称为克隆2-46-H10。
实施例5
制备基因组上所有现有FUT8基因均断裂的CHO/DG44细胞:
制备CHO/DG44克隆，其中含FUT8两个等位基因的翻译启始密码子的基因组区被删除。
1.构建中国仓鼠FUT8基因外显子2靶向载体质粒pKOFUT8Neo
按照以下步骤，通过用新霉素-抗性基因表达单位取代靶向载体质粒pKOFUT8Puro中所含的嘌呤霉素-抗性基因表达单位构建质粒pKOFUT8Neo(图15)，其中质粒pKOFUT8Puro在实施例3的段落1中获得。
在50μl NE缓冲液4(New England Biolabs生产)中溶解1.0μg质粒pKOSelectNeo(Lexicon生产),向其中加入16单位限制性酶AscI(由New England Biolabs生产),随后37℃消化2小时。用乙醇沉淀法从反应溶液中收集DNA片段，并溶解在含100μg/ml BSA(NewEngland Biolabs生产)的50μl NE缓冲液4(New England Biolabs生产)中,向其中加入20单位限制性酶ApaLI(由New England Biolabs生产)，随后25℃消化2小时。消化后,获得的液体进行0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，大约1.6Kb的含新霉素-抗性基因表达单位的DNA片段被纯化。
分别地,1.0μg质粒pKOFUT8Puro溶解在50μl NE缓冲液4(NewEngland Biolabs生产)中,向其中加入16单位限制性酶Ascl(由NewEngland Biolabs生产)，随后37℃消化2小时。消化后,向其中加入30μl pH8.0的1mol/1 Tris-HCl缓冲液和3.0μl大肠杆菌C15衍生的碱性磷酸酶(Takara Shuzo生产),在65℃反应1小时以使DNA末端去磷酸化。去磷酸化作用后,进行苯/氯仿提取和乙醇沉淀，回收的DNA片段溶解在10μl无菌水中。
混合上面获得的1.0μl衍生自质粒pKOSelectNeo的AscI-AscI片段(大约1.6Kb)、1.0μl衍生自质粒pKOFUT8Puro的AscI-AscI片段(大约10.1Kb)、3.0μl无菌水和5.0μl Ligation High(由Toyobo生产)后,在16℃进行结合反应30分钟。用反应溶液转化大肠杆菌DH5α株,根据已知的方法从获得的氨比西林抗性克隆中分离每个质粒DNA。此质粒叫做pKOFUT8Neo。
2.制备基因组上FUT8基因一个拷贝断裂的CHO/DG44细胞：
(1)制备靶向载体导入克隆
在二氢叶酸还原酶基因(dhfr)缺乏的来自中国仓鼠卵巢的CHO/DG44细胞中[Somatic Cell and Molecular Genetics,12,555(1986)],导入此实施方案1项中构建的中国仓鼠FUT8基因组区靶向载体pKOFUT8Neo。根据以下步骤，通过电穿孔将质粒pKOFUT8Neo的基因导入CHO/DG44细胞[Cytotechnology(电穿孔),3,133(1990)]。首先,280μg质粒pKOFUT8Neo被溶解在含100μg/ml BSA(New EnglandBiolabs生产)的1.2ml SalI的NE缓冲液(New England Biolabs生产),然后向其中加入400单位限制性酶SalI(New England Biolabs生产),通过37℃消化5小时进行线性化。用苯/氯仿抽提提取反应溶液,随后乙醇沉淀,回收的线性质粒被制成1μg/μl的水溶液。分别地,CHO/DG44细胞悬浮在K-PBS缓冲液(137mmol/1 KC1,2.7mmol/1 NaCl,8.1mmol/1Na2HPO4,1.5mmol/1 KH2PO4,4.0mmol/1 MgCl2)中至8×l07细胞/ml密度。200μl细胞悬浮液(1.6×l06细胞)与4μl(4μg)上述线性化质粒混合后,全部量的细胞-DNA混合物液体被转移进Gene Pulser Cuvette(电极间距离2mm)(由BIO-RAD生产)，并用细胞融合设备Gene Pulser(由BIO-RAD生产)以350V脉冲压和250μF电容进行基因导入。导入基因的细胞悬浮液悬浮在添加了10％胎牛血清(由Invitrogen生产)和1×浓度HT添加物(Invitrogen生产)的IMDM培养基(由Invitrogen生产)中，并接种在10cm的粘附细胞培养器(Falcon生产)上。在5％CO2中37℃培养24小时后,去除培养上清物,以10ml/孔将添加了600μg/mlG418(Nacalai Tesque生产)、1×浓度TIT添加物(Invitrogen生产)和10％胎牛血清(Invitrogen生产)的IMDM培养基(Invitrogen生产)分发给每个孔。每隔3至4天重复更换培养基进行培养15天以获得G418-抗性克隆。
(2)通过基因组PCR诊断同源重组
根据以下步骤，通过基因组PCR对(1)项获得的G418-抗性克隆进行同源重组诊断。
用胰蛋白酶处理96孔平板上获得的G418-抗性克隆，然后与两倍量的冷冻培养基(20％DMSO,40％胎牛血清,40％IMDM)混合。一半量的混和物被接种进贴附细胞的96孔平底板(Asahi Technoglass生产)作为复制板,而剩下的一半用于低温贮藏作为母板。
在添加了600μg/ml G418(Nacalai Tesque生产)、1×浓度HT添加物(Invitrogen生产)和10％胎牛血清(Invitrogen生产)的IMDM培养基(Invitrogen生产)中孵育复制板1周，根据已知的方法[AnalyticalBiochemistry,201,331(1992)]制备每个克隆的基因组DNA,它们每一个在30μl TE-核糖核酸酶缓冲液(pH 8.0)(10mmol/1 Tris-HCl,1mmol/1 ETDA,200μg/ml核糖核酸酶A)中溶解过夜。
其后的聚合酶链式反应(PCR)进行如下，使用与参考实施方案获得的FUT8基因组区中靶向载体同源区之外部分的序列结合的引物(SEQID NO:13或15),和与内部载体序列结合的引物(SEQ ID NO:14或16)。特异地,制备25μl反应溶液[DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo生产),ExTaq缓冲液(Takara Shuzo生产),0.2mmol/1 dNTPs,0.5μmol/1上述基因特异的引物(正向引物由SEQ ID NO:13或15显示,反向引物由SEQ ID NO:14或16显示)]，所述反应溶液含上面制备的每个基因组DNA溶液10μl，通过94℃加热3分钟，随后94℃加热1分钟、60℃1分钟和72℃2分钟作为一个循环进行PCR。
PCR后,反应溶液进行0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，观察到的1.7Kb的特异扩增包括CHO细胞基因组区和靶向载体同源区的边界部分,被确定为阳性克隆(50-10-104)。
(3)通过基因组Southern印迹诊断同源重组
根据以下步骤，通过基因组Southern印迹对(2)项中获得的阳性证实克隆进行同源重组诊断。
在冷冻状态贮藏的母板中间,选择在(2)项中发现的含阳性克隆的96孔平板，令其在5％CO2下37℃放置10分钟。放置后,来自对应于阳性克隆孔中的细胞被接种在贴附细胞的24孔平底板(Greiner生产)上。在添加了600μg/ml G418(由Nacalai Tesque生产),1×浓度HT添加物(Invitrogen生产)和10％胎牛血清(Invitrogen生产)的IMDM培养基(Invitrogen生产)中培养1周后,细胞被接种在贴附细胞的6孔平底板(Greiner生产)上。按照已知的方法[Nucleic Acids Research,3,2303(1976)]从平板中制备每个克隆的基因组DNA，并在150μl TE-核糖核酸酶缓冲液(pH 8.0)(10mmol/1 Tris-HCl,1mmol/1 EDTA,200μg/ml核糖核酸酶A)中溶解过夜。
在含100μg/ml BSA(New England Biolabs生产)的120μl BamHI的NE缓冲液(New England Biolabs生产)中溶解12μg上面制备的基因组DNA,向其中加入25单位限制性酶BamHL(New England Biolabs生产),随后37℃消化过夜。通过乙醇沉淀法从反应溶液中收集DNA片段,溶解在20μl TE缓冲液(pH 8.0)(10mmol/1 Tris-HCl,1mmol/1 EDTA)中，并进行0.6％(w/v)琼脂糖凝胶电泳。电泳后,基因组DNA按照已知的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,3683(1979)]转移到尼龙膜上。转移后,尼龙膜在80℃进行热处理2小时。
分别地,Southern印迹的探针制备如下。首先,根据下面的步骤使用与参考实施例获得的FUT8基因组区中靶向载体同源区之外部分的序列结合的引物(SEQ ID NO:9和10)进行PCR。特异地,制备20μl反应溶液[DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo生产),ExTaq缓冲液(TakaraShuzo生产),0.2mmol/1 dNTPs,0.5μmol/1上述基因特异的引物(SEQ IDNO:9和10)]，所述反应溶液含4.0ng参考实施例(2)中获得的质粒pFUT8fgE2-2，通过25个循环的94℃加热1分钟、94℃30秒、55℃30秒和74℃1分钟作为一个循环进行PCR。PCR后,反应溶液进行1.75％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，大约230bp的探针DNA片段被纯化。采用[α-32P]dCTP 1.75MBq和Megaprime DNA标记系统,dCTP(AinershamPharmacia Biotech生产)，对5μl探针DNA溶液进行放射性同位素标记。
杂交如下进行。首先,上述尼龙膜被封装在滚瓶中,向其中加入15ml杂交液[5×SSPE,50×Denhaldt's溶液,0.5％(w/v)SDS,100μg/ml鲑精DNA]，随后在65℃杂交3小时。接着,用32P-标记的探针DNA被热变性并倒入瓶中，65℃加热过夜。
杂交后,在50ml 2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸湿尼龙膜并65℃加热15分钟。重复上述冲洗操作两次后,在50ml 0.2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸湿该膜并在65℃加热15分钟。冲洗后,尼龙膜在-80℃与X线胶片接触以显影。
通过上述用限制性酶BamHI处理,从野生型FUT8等位基因中获得了大约25.5Kb的DNA片段。另一方面,通过相同的限制性酶处理，从发生靶向载体同源重组的等位基因中获得了大约20.0Kb的DNA片段。
基于本方法,从阳性克隆50-10-104的基因组DNA中发现了大约25.5Kb和大约20.0Kb的上述特异片段(图16)。由于两个片段的数量比是1:1,证实克隆是半敲除的克隆，其中FUT8等位基因的一个拷贝是断裂的。
3.制备基因组中FUT8基因被双敲除的CHO/DG44细胞
(1)制备靶向载体导入的克隆
在实施例3的1项中构建的中国仓鼠FUT8基因组区靶向载体pKOFUT8Puro被导入本实施例2项中获得的FUT8半敲除克隆50-10-104。
根据以下步骤，通过电穿孔导入质粒pKOFUT8Puro的基因[Cytotechnology(电穿孔),3,133(1990)]。首先,440μg质粒pKOFUT8Puro被溶解在含100μg/ml BSA(New England Biolabs生产)的2.4ml SalI的NE缓冲液(New England Biolabs生产)中,向其中加入800单位限制性酶SalI(New England Biolabs生产),通过37℃消化5小时进行线性化。用苯/氯仿抽提提取反应溶液,随后乙醇沉淀,回收的线性质粒被制成1μg/μl的水溶液。分别地,50-10-104悬浮在K-PBS缓冲液(137mmol/1 KC1,2.7mmol/1 NaCl,8.1mmol/1 Na2HPO4,1.5mmol/1KH2PO4,4.0mmol/1 MgCl2)中至8×l07细胞/ml密度。200μl细胞悬浮液(1.6×l06细胞)与4μl(4μg)上述线性化质粒混合后,全部量的细胞-DNA混合物液体被转移进Gene Pulser Cuvette(电极间距离2mm)(由BIO-RAD生产)，并用Gene Pulser细胞融合设备(由BIO-RAD生产)以350V脉冲压和250μF电容进行基因导入。导入基因的细胞悬浮液悬浮在添加了10％胎牛血清(由Invitrogen生产)和1×浓度HT添加物(Invitrogen生产)的IMDM培养基(由Invitrogen生产)中，并接种在10cm的粘附细胞培养碟(Falcon生产)上。在5％CO2和37℃下孵育细胞24小时后,去除培养上清物,以10ml分发添加了15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生产)、1x浓度HT添加物(Invitrogen生产)和10％胎牛血清(Invitrogen生产)的IMDM培养基(Invitrogen生产)。每隔7天重复进行培养基更换培养15天以获得耐药克隆。
(2)通过基因组Southern印迹诊断同源重组
根据以下步骤，通过基因组Southern印迹对(1)项中获得的耐药克隆进行同源重组诊断。
从发现嘌呤霉素-抗性克隆的10cm碟中去除培养上清物，注入7 ml磷酸盐缓冲液，然后转移到立体显微镜下。接着,刮下集落，用Pipetteman(GILSON生产)吸取并收集到96孔圆底平板(Falcon生产)中。胰蛋白酶处理后,每个克隆被接种在贴附细胞的96孔平底板(AsahiTechnoglass生产)上，在添加了15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生产)、1×浓度HT添加物(Invitrogen生产)和10％胎牛血清(Invitrogen生产)的IMDM培养基(Invitrogen生产)中培养1周。
培养后,用胰蛋白酶处理平板的每个克隆,然后种在贴附细胞的24孔平底板上(Greiner生产)。在添加了15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生产)、1×浓度HT添加物(Invitrogen生产)和10％胎牛血清(Invitrogen生产)的IMDM培养基(Invitrogen生产)中培养1周后,克隆被接种在贴附细胞的6孔平底板(Greiner生产)上。根据已知的方法[Nucleic AcidsResearch,3,2303,(1976)]从平板上制备每个克隆的基因组DNA，在150μl TE-核糖核酸酶缓冲液(pH 8.0)(10mmol/1 Tris-HCl,1mmol/1ETDA,200μg/ml核糖核酸酶A)中溶解过夜。
在含100μg/ml BSA(New England Biolabs生产)的120μl BamHI的NE缓冲液(New England Biolabs生产)中溶解12μg上面制备的基因组DNA,加入25单位限制性酶BamHI(New England Biolabs生产),随后37℃消化过夜。通过乙醇沉淀法从反应溶液中收集DNA片段,溶解在20μl TE缓冲液(pH 8.0)(10mmol/1 Tris-HCl,1mmol/1 EDTA)中，并进行0.6％(w/v)琼脂糖凝胶电泳。电泳后,基因组DNA按照已知的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,3683(1979)]转移到尼龙膜上。转移后,尼龙膜在80℃进行热处理2小时。
分别地,Southern印迹所用的探针制备如下。首先，使用与FUT8基因组区中靶向载体同源区之外部分的序列结合的引物(SEQ ID NO:11或12)，根据以下步骤进行PCR。特异地,制备20μl反应溶液[DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo生产),ExTaq缓冲液(Takara Shuzo生产),0.2mmol/1 dNTPs,0.5μmol/1上述的基因特异引物(SEQ ID NO:11和12)]，所述反应溶液含4.0ng参考实施例(2)中获得的质粒pFUT8fgE2-2，通过94℃加热1分钟，随后25个循环的94℃30秒、55℃30秒和74℃1分钟反应作为一个循环进行PCR。PCR后,反应溶液进行1.75％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，大约230bp的探针DNA片段被纯化。采用[α-32P]dCTP 1.75MBq和Megaprime DNA标记系统、dCTP(Amersham Pharmacia Biotech生产)对5μl探针DNA溶液进行放射标记。
杂交如下进行。首先,上述尼龙膜被封装在滚瓶中,向其中加入15ml杂交液[5×SSPE,50×Denhalt's溶液,0.5％(w/v)SDS,100μg/ml鲑精DNA]，在65℃进行预杂交3小时。然后,用32P标记的探针DNA被热变性并倒入瓶中，65℃加热过夜。
杂交后,在50ml 0.2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸湿尼龙膜并65℃加热15分钟。重复上述冲洗操作两次,然后在50ml0.2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸湿该膜并在65℃加热15分钟。冲洗后,尼龙膜在-80℃与X线胶片接触以显影。
通过上述用限制性酶BamHI处理,从野生型FUT8等位基因中获得了大约25.5Kb的DNA片段。另一方面,通过相同的限制性酶处理，从发生靶向载体同源重组的等位基因中获得了大约20.0Kb的DNA片段。
通过本方法,从耐药克隆WK704的基因组DNA中仅发现了大约20.0Kb的同源重组区特异片段(图17)。由于对野生型等位基因特异的片段消失(箭头所指部分),证实克隆是基因组上全部现有FUT8等位基因断裂的克隆。
4.从FUT8基因双敲除的CHO/DG44细胞中去除耐药基因
(1)导入Cre重组酶表达载体
Cre重组酶表达载体pBS185(Life Technologies生产)被导入本实施方案3项制备的FUT8双敲除克隆的WK704中。
根据如下步骤，通过电穿孔[Cytolechnology,3,133(1990)]将质粒pBS185基因导入每个FUT8双敲除克隆中。首先,每个FUT8双敲除克隆被悬浮在K-PBS缓冲液(137mmol/1 KC1,2.7mmol/1 NaCl,8.1mmol/1 Na2HPO4,1.5mmol/1 KH2PO4,4.0mmol/1 MgCl2)中至8×l07细胞/ml密度。200μl细胞悬浮液(1.6×l06细胞)与4μg质粒pBS185混合后,全部量的细胞-DNA混合物液体被转移进Gene Pulser Cuvette(电极距离：2mm)(由BIO-RAD生产)，用细胞融合设备Gene Pulser(由BIO-RAD生产)以350V脉冲压和250μF电容进行基因导入。导入后,每个细胞悬浮液悬浮在10ml添加了10％胎牛血清(由Invitrogen生产)和1×浓度HT添加物(Invitrogen生产)的IMDM培养基(由Invitrogen生产)中，并用相同的培养基进一步稀释20,000倍。每个稀释的溶液接种在7个10cm的粘附细胞培养碟(Falcon生产)上，在5％CO2中37℃孵育10天以形成集落。
(2)制备Cre重组酶表达载体导入克隆
根据以下步骤从由WK704基因导入获得的集落中收集任意的克隆。首先,从10cm碟中去除培养上清物，注入7ml磷酸盐缓冲液，然后转移到立体显微镜下。接着,刮下集落，用Pipetman(由GILSON生产)吸取并收集在96孔圆底平板(Falcon生产)中。胰蛋白酶处理后,每个克隆被接种在贴附细胞的96孔平底平板(Iwaki Glass生产)上，在添加了10％胎牛血清(Invitrogen生产)和1×浓度HT添加物(Invitrogen生产)的IMDM培养基(Invitrogen生产)中培养1周。
培养后,用胰蛋白酶处理上面平板中的每个克隆，与两倍量的冷冻培养基(20％DMSO,40％胎牛血清,40％IMDM)混合。其一半量接种在贴附细胞的96孔平底板(Asahi Technoglass生产)上作为复制板,另一方面,剩下的一半被低温贮藏作为母板。
然后,在添加了600μg/ml G418(Nacalai Tesque生产)、15μg/ml嘌呤霉素(SIGMA生产)、10％胎牛血清(Invitrogen生产)和1×浓度HT添加物(Invitrogen生产)的IMDM培养基(Invitrogen生产)中孵育复制板7天。根据Cre重组酶的表达,在有G418和嘌呤霉素情况下阳性克隆消失，阳性克隆中loxP序列间两个等位基因上的耐药基因被去除。用此阴性选择技术发现了阳性克隆。
(3)通过基因组Southern印迹诊断耐药基因去除
根据以下步骤，通过基因组Southern印迹对(2)项中获得的阳性克隆(4-5-C3)的耐药基因去除进行诊断。
在(2)项中冷冻状态贮藏的母板间,选择含以上阳性克隆的96孔平板并在5％CO2下37℃放置10分钟。放置后,对应于以上克隆孔的细胞被接种到贴附细胞的24孔平底板(Greiner生产)上。在添加了10％胎牛血清(Invitrogen生产)和1x浓度HT添加物(Invitrogen生产)的IMDM培养基(Invitrogen生产)中培养1周后,细胞被接种在用于贴附细胞的6孔平底板(Greiner生产)上。按照已知的方法[Nucleic Acids Research,3,2303(1976)]从平板中制备每个克隆的基因组DNA，并在150μl TE-核糖核酸酶缓冲液(pH 8.0)(10mmol/1 Tris-HCl,1mmol/1 EDTA,200μg/ml核糖核酸酶A)中溶解过夜。
在120μl含100μg/ml BSA(New England Biolabs生产)NE缓冲液2(New England Biolabs生产)中溶解12μg上面制备的基因组DNA,向其中加入20单位限制性酶NheI(New England Biolabs生产),随后37℃消化过夜。通过乙醇沉淀法从反应溶液中收集DNA片段,溶解在20μl TE缓冲液(pH 8.0)(10mmol/1 Tris-HCl,1mmol/1 EDTA)中，并进行0.6％(w/v)琼脂糖凝胶电泳。电泳后,基因组DNA通过已知的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,3683(1979)]转移到尼龙膜上。转移后,尼龙膜在80℃加热2小时。
分别地，用于Southern印迹的探针制备如下。首先，使用与FUT8基因组区中靶向载体同源区之外部分的序列结合的引物(SEQ ID NO:10和11)，根据以下步骤进行PCR。特异地,制备20μl反应溶液[DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo生产),ExTaq缓冲液(Takara Shuzo生产),0.2mmol/1 dNTPs,0.5μmol/1上述的基因特异引物(SEQ ID NOs:11和12)]，所述反应溶液含4.0ng参考实施例(2)中获得的质粒pFUT8fgE2-2，通过94℃加热1分钟，随后25个循环的94℃30分钟、55℃30分钟和74℃1分钟反应作为一个循环进行PCR。PCR后,反应溶液进行1.75％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，大约230bp的探针DNA片段被纯化。采用[α-32P]dCTP 1.75MBq和Megaprime DNA标记系统、dCTP(Amersham Pharmacia Biotech生产)对5μl探针DNA溶液进行放射标记。设计与参考实施方案中获得的FUT8基因组区中靶向载体同源区外序列结合的引物(SEQ ED NOs:9和10)。
杂交如下进行。首先,上述尼龙膜被封装在滚瓶中,添加15ml杂交液[5×SSPE,50×Denhalt's溶液,0.5％(w/v)SDS,100μg/ml鲑精DNA]在65℃3小时进行杂交。然后,用32P-标记的探针DNA被热变性并倒入瓶中,并在65℃加热过夜。
杂交后,在50ml 2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸湿尼龙膜并在65℃加热15分钟。重复上述冲洗操作两次后,在50ml 0.2×SSC-0.1％(w/v)SDS中浸湿膜并在65℃加热15分钟。冲洗后,尼龙膜在-80℃与X线胶片接触以显影。
通过上述的限制性酶NheI处理,从野生型FUT8等位基因中形成了大约8.0Kb的DNA片段。此外,通过相同的限制性酶处理，从发生了靶向载体同源重组的等位基因中获得了大约9.5Kb的DNA片段。而且,当新霉素抗性基因(大约1.6Kb)或嘌呤霉素抗性基因(大约1.5kb)从发生了同源重组的等位基因中被去除时,用相同的处理获得了大约8.0Kb的DNA片段。
通过本方法,从检测的阳性克隆4-5-C3(实施例4(3)项中的阳性克隆)的基因组DNA中仅发现了大约8.0Kb的同源重组区特异片段(图18)。
实施例6
FUT8等位基因双敲除的CHO/DG44细胞中抗体分子的表达:
1.制备抗CD20嵌合抗体表达载体
(1)构建编码抗CD20小鼠单克隆抗体VL的cDNA
如下采用PCR构建编码抗CD20小鼠单克隆抗体2B8 VL的氨基酸序列的cDNA(SEQ ID NO:17)，所述抗体在WO94/11026中描述。
首先,PCR扩增引物的结合核苷序列(包括为人源化抗体表达克隆到载体上的限制性酶识别位点)被加到WO94/11026中描述的VL核苷序列的5'-末端和3'-末端。设计的核苷序列从5'-末端侧被分成总共6个核苷序列，每个大约100个碱基(以其尾部具有大约20个碱基的末端共同序列的方式调节相邻的核苷序列)，并以正义链和反义链的交替顺序制备6个合成的DNA，SEQ ID NOs:19,20,21,22,23和24(委托GENSET公司)。
每个寡核苷加入50μL反应溶液[KOD DNA聚合酶添加产物PCR缓冲液#1(Toyobo生产),0.2mM dNTPs,1mM氯化镁,0.5μM M13引物M4(Takara Shuzo生产),0.5μM Ml3引物RV(Takara Shuzo生产)]中至终浓度0.1μM。采用DNA热循环仪GeneAmp PCR System 9600(PerkinElmer生产),添加2.5单位KOD DNA聚合酶(Toyobo生产)后，94℃加热反应溶液3分钟,随后25个循环的94℃30秒、55℃30秒和℃1分钟加热为一个循环,进一步在72℃加热10分钟。然后,25μL反应溶液用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN生产)进行琼脂糖凝胶电泳以收集大约0.44kb VL的PCR产物。
然后,通过限制性酶SmaI(Takara Shuzo生产)从质粒pBluescriptllSK(-)(Stratagene生产)中获得的DNA 0.1μg和上面获得的大约0.1μgPCR产物中加入无菌水至总体积7.5μL,向其中加入7.5μL TAKARA连接试剂盒ver.2(Takara Shuzo生产)的溶液I和0.3μL限制性酶SmaI(Takara Shuzo生产),随后在22℃反应2小时。采用如此获得的重组体质粒DNA溶液转化大肠杆菌DH5α株(Toyobo生产)。从转化株克隆中制备每个质粒DNA，用BigDye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit v2.0(Applied Biosystems生产)根据所附的厂家说明书进行反应,然后用同一公司的DNA测序仪ABI PRISM 377分析核苷序列。从而,获得图19中显示的具有目的核苷序列的质粒pBS-2B8L。
(2)构建编码抗CD20小鼠单克隆抗体VH的cDNA
如下采用PCR构建编码抗CD20小鼠单克隆抗体2B8 VH的氨基酸序列的cDNA(SEQ ID NO:18)，所述抗体在WO94/11026中描述。
首先,PCR扩增引物的结合核苷序列(包括为人源化抗体表达克隆到载体上的限制性酶识别序列)被加到WO94/11026中描述的VH核苷序列的5'-末端和3'-末端。设计的核苷序列从5'-末端侧被分成总共6个核苷序列，每个大约100个碱基(以其尾部具有大约20个碱基的末端共同序列的方式调节相邻的核苷序列)，并以正义链和反义链的交替顺序制备6个合成的DNA，SEQ ID NOs:25,26,27,28,29和30(委托GENSET公司)。
每个寡核苷加入50μL反应溶液[KOD DNA聚合酶添加产物PCR缓冲液#1(Toyobo生产),0.2mM dNTPs,1mM氯化镁,0.5μM M13引物M4(Takara Shuzo生产),0.5μM Ml3引物RV(Takara Shuzo生产)]中至终浓度0.1μM,和采用DNA热循环仪GeneAmp PCR System 9600(PerkinElmer生产),在其中加入2.5单位KOD DNA聚合酶(Toyobo生产)后，94℃加热3分钟,随后25个循环的94℃30秒、55℃30秒和℃1分钟加热为一个循环,进一步在72℃加热19分钟。然后，25μL反应溶液用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN生产)进行琼脂糖凝胶电泳以收集大约0.49kb VH的PCR产物。
然后,通过限制性酶SmaI(Takara Shuzo生产)从质粒pBluescriptIISK(-)(Stratagene生产)中获得的DNA 0.1μg和上述获得的大约0.1μgPCR产物中加入无菌水至总体积7.5μL,向其中加入7.5μL TAKARA连接试剂盒ver.2(Takara Shuzo Co生产)的溶液I和0.3μL限制性酶SmaI(Takara Shuzo生产),随后22℃反应过夜。
采用如此获得的重组体质粒DNA溶液转化大肠杆菌DH5α株(Toyobo生产)。从转化株克隆中制备每个质粒DNA，用BigDyeTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0(AppliedBiosystems生产)根据所附的厂家说明书进行反应,然后用同一公司的DNA测序仪ABI PRISM 377分析核苷序列。从而,获得图20中显示的具有目的核苷序列的质粒pBS-2B8H。
然后,设计表示为SEQ ID NO:31的合成DNA以将位置14的氨基酸残基从Ala取代为Pro,该取代使用pBluescriptII的LA PCR体外突变引物对(Takara Shuzo生产)通过PCR进行如下。制备50μL含1ng上述质粒pBS-2B8H的反应溶液[LA PCR缓冲液II(由Takara Shuzo生产),2.5单位TAKARA LA Taq,0.4mM dNTPs,2.5mM氯化镁,50nM T3BcaBEST测序引物(Takara Shuzo生产),50nM上述引物以诱导突变(SEQ ID NO:31,由GENSET生产)]后,用DNA热循环仪GeneAmp PCRSystem 9600(Perkin Elmer生产),使反应溶液进行25个循环的94℃加热30秒、55℃2分钟和72℃一分半钟为一个循环的反应。然后,30μL反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳,用QIAquick Gel ExtractionKit(QIAGEN生产)收集大约0.44kb的PCR产物并制成30μL的水溶液。此外,用50μL含1ng上述质粒pBS-2B8H的反应溶液[LA PCR缓冲液II(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生产),2.5单位TAKARA LA Taq,0.4mMdNTPs,2.5mM氯化镁,50nM T7 BcaBEST测序引物(Takara Shuzo Co.,Ltd.生产),50nM MUT Bl引物(Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)]，以相同的方式进行PCR。然后,30μL反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳,用QIAquickGel Extraction Kit(QIAGEN生产)收集大约0.63kb的PCR产物并制成30μL的水溶液。随后,0.5μL上面分别获得的大约0.44kb的PCR产物和大约0.63kb的PCR产物被加入47.5μL反应溶液[LA PCR缓冲液II(Takara Shuzo生产),0.4mM dNTPs,2.5mM氯化镁]中,用DNA热循环仪GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer生产),使反应溶液进行如下反应：90℃加热10分钟,随后冷却至37℃超过60分钟,然后保持37℃温度15分钟从而进行DNA退火。添加2.5单位TAKARA LATaq(Takara Shuzo生产)并在72℃反应3分钟后，分别加入10pmol T3BcaBEST测序引物(Takara Shuzo生产)和T7 BcaBEST测序引物(Takara Shuzo生产),将反应溶液制成50μL并进行10次循环反应：94℃加热30秒,55℃2分钟和72℃一分半钟为一循环。然后,用QIA快速PCR纯化试剂盒(QIAGEN生产)纯化25μL反应溶液，一半量用10单位限制性酶KpnI(Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)和10单位限制性酶SacI(Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)在37℃进行反应1小时。通过琼脂糖凝胶电泳分馏反应溶液并收集大约0.59kb的KpnI-SacI片段。
接着,用10单位限制性酶KpnI(Takara Shuzo生产)和10单位限制性酶SacI(Takara Shuzo生产)在37℃与1μg pBluescriptllSK(-)(Stratagene生产)反应1小时,然后,通过琼脂糖凝胶电泳分馏反应溶液以收集大约2.9kb的KpnI-SacI片段。
采用DNA Ligation Kit Ver.2(Takara Shuzo生产)的溶液I，根据所附的厂家说明书连接衍生自如上所述获得的PCR产物的KpnI-SacI片段和衍生自质粒pBluescriptII SK(-)的KpnI-SacI片段。采用如此获得的重组体质粒DNA溶液转化大肠杆菌DH5α株(Toyobo生产)。从转化株克隆中制备每个质粒DNA，用BigDye Terminator Cycle SequencingReady Reaction Kit v2.0(Applied Biosystems生产)根据所附的厂家说明书进行反应,然后用同一公司的DNA测序仪ABI PRISM 377分析核苷序列。
从而,获得图20中显示的具有目的核苷序列的质粒pBS-2B8Hm。
(3)构建抗CD20人嵌合抗体的表达载体。
采用为人源化抗体表达的载体pKANTEX93[Mol.ImmunoL,37,1035(2000)]及(1)和(2)项中获得的质粒pBS-2B8L和pBS-2B8Hm,抗CD20人嵌合抗体(此后称为"抗CD20嵌合抗体")的表达载体pKANTEX2B8P构建如下。
在2μg(1)项获得的质粒pBS-2B8L用10单位限制性酶BsiWI(New England Biolabs生产)在55℃反应1小时后,进一步用10单位限制性酶EcoRI(Takara Shuzo生产)在37℃进行反应1小时。通过琼脂糖凝胶电泳分馏反应溶液以收集大约0.41kb的BsiWI-EcoRI片段。
然后,2μg人源化抗体表达的质粒pKANTEX93用10单位限制性酶BsiWI(New England Biolabs生产)在55℃反应1小时,并进一步用10单位限制性酶EcoRI(Takara Shuzo生产)在37℃进行反应1小时。通过琼脂糖凝胶电泳分馏反应溶液以收集大约12.75kb的BsiWI-EcoRI片段。
接着,采用DNA Ligation Kit Ver.2(Takara Shuzo生产)的溶液I，根据所附的厂家说明书连接上面获得的衍生自质粒pBS-2B8L的BsiWI-EcoRI片段和衍生自质粒pKANTEX93的BsiWI-EcoRI片段。采用如此获得的重组体质粒DNA溶液转化大肠杆菌DH5α株(Toyobo生产)以获得图21显示的质粒pKANTEX2B8-L。
然后,2μg(2)项获得的质粒pBS-2B8Hm用10单位限制性酶ApaI(Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)在37℃反应1小时,再进一步用10单位限制性酶NotI(Takara Shuzo Co.,Ltd生产)在37℃进行反应1小时。通过琼脂糖凝胶电泳分馏反应溶液以收集大约0.45kb的ApaI-NotI片段。
接着,3μg质粒pKANTEX2B8-L用10单位限制性酶ApaI(TakaraShuzo Co.,Ltd.生产)在37℃反应1小时,再进一步用10单位限制性酶NotI(Takara Shuzo Co.,Ltd生产)在37℃进行反应1小时。通过琼脂糖凝胶电泳分馏反应溶液以收集大约13.16kb的ApaI-NotI片段。
然后,采用DNA Ligation Kit Ver.2(Takara Shuzo生产)的溶液I，根据所附的厂家说明书连接上面获得的衍生自质粒pBS-2B8Hm的ApaI-NotI片段和衍生自质粒pKANTEX2B8-L的ApaI-NotI片段。采用如此获得的重组体质粒DNA溶液转化大肠杆菌DH5α株(Toyobo生产)，从转化株克隆制备每个质粒DNA。
用获得的质粒,采用BigDye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit v2.0(Applied Biosystems生产),以同一公司的DNA测序仪ABI PRISM 377分析核苷序列。结果证实，获得了图21显示的以目的DNA克隆的质粒pKANTEX2B8P。
2.抗CD20嵌合抗体的表达
本实施例的1项获得的抗CD20抗体表达载体pKANTEX2B8P被导入实施例5的3项制备的FUT8基因双敲除克隆WK704中。
按如下步骤通过电穿孔[Cytotechnology(电穿孔),3,133(1990)]进行WK704的质粒pKANTEX2B8P基因导入。首先,10μg质粒pKANTEX2B8P溶解在100μl NE缓冲液4(New England Biolabs生产)中,向其中加入40单位限制性酶AatII(New England Biolabs生产),然后37℃消化2小时进行线性化。用苯/氯仿抽提提取反应溶液,随后乙醇沉淀,并将回收的线性质粒制成1μg/μl的水溶液。分别地,WK704悬浮在K-PBS缓冲液(137mmol/1 KC1,2.7mmol/1 NaCl,8.1mmol/1Na2HPO4,1.5mmol/1 KH2PO4,4.0mmol/1 MgCl2)中至8×l07细胞/ml密度。200μl细胞悬浮液(1.6×l06细胞)与4μl(4μg)上述线性化质粒结合后,全部细胞-DNA混合物被转移到Gene Pulser Cuvette(电极距离：2mm)(由BIO-RAD生产)，用细胞融合设备Gene Pulser(由BIO-RAD生产)以350V脉冲压和250μF电容进行基因导入。基因导入后,细胞悬浮液悬浮在添加了10％胎牛血清(由Invitrogen生产)和1×浓度HT添加物(Invitrogen生产)的IMDM培养基(由Invitrogen生产)中，并接种在粘附细胞培养的T75烧瓶(Greiner生产)上。在5％CO2中37℃培养24小时后,去除培养上清物,向其中加入10ml添加了10％胎牛透析血清(Invitrogen生产)的IMDM培养基(Invitrogen生产)。每隔3至4天重复更换培养基进行培养15天,获得WK704-2B8P转化株。此外,克隆WK704-2B8P,以WK704-2B8P的分类命名于2003年3月20日以保藏号FERM BP-8337保藏在独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物保藏中心(日本，茨城县)(Tsukuba Central 6,1,Higashi 1-ChomeTsukuba-shi,Ibaraki-ken 305-8566 Japan)。
3.抗神经节苷脂GD3嵌合抗体的表达
表达抗神经节苷脂GD3嵌合抗体的载体质粒pKANTEX641被导入实施例5的3项中制备的FUT8基因双敲除克隆WK704中，制备抗GD3嵌合抗体的稳定表达克隆。pKANTEX641是包含载体质粒pChi641LHGM4和载体pKANTEX93的衍生物，前者表达WOOO/61739中描述的抗GD3嵌合抗体，后者表达人源化抗体[Mol.Immunol.,37,1035(2000)]，其中含来自pChi641LHGM4的串联抗体表达单位的EcoRI-HindIII片段与含来自pKANTEX93的复制起始的EcoRI-HindIII片段连接。
按如下步骤通过电穿孔[Cytotechnology(电穿孔),3,133(1990)]进行WK704的质粒pKANTEX641基因导入。首先,10μg质粒pKANTEX641溶解在100μl NE缓冲液4(New England Biolabs生产)中,向其中加入40单位限制性酶AatII(New England Biolabs生产),然后37℃消化2小时进行线性化。用苯/氯仿抽提提取反应溶液,随后乙醇沉淀,并将回收的线性质粒制成1μg/μl的水溶液。分别地,WK704悬浮在K-PBS缓冲液(137mmol/1 KC1,2.7mmol/1 NaCl,8.1mmol/1Na2HPO4,1.5mmol/1 KH2PO4,4.0mmol/1 MgCl2)中至8×l07细胞/ml密度。200μl细胞悬浮液(1.6×l06细胞)与4μl(4μg)上述线性化质粒混和后,全部细胞-DNA混合物被转移到Gene Pulser Cuvette(电极距离：2mm)(由BIO-RAD生产)，用细胞融合设备Gene Pulser(由BIO-RAD生产)以350V脉冲压和250μF电容进行基因导入。基因导入后,细胞悬浮液悬浮在添加了10％胎牛血清(由Invitrogen生产)和1×浓度HT添加物(Invitrogen生产)的IMDM培养基(由Invitrogen生产)中，并接种在粘附细胞培养的T75烧瓶(Greiner生产)上。在5％CO2中37℃培养24小时后,去除培养上清物,向其中加入10ml添加了10％胎牛透析血清(Invitrogen生产)的IMDM培养基(Invitrogen生产)。每隔3至4天重复更换培养基进行培养15天,获得转化株WK704-2871。此外,克隆WK704-2871,以WK704-2871的分类命名于2003年3月20日以保藏号FERM BP-8336保藏在独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物保藏中心(日本，茨城县)(Tsukuba Central 6,1,Higashi 1-ChomeTsukuba-shi,Ibaraki-ken 305-8566 Japan)。
4.抗CCR4嵌合抗体的表达
表达WO 01/64754描述的抗CCR4嵌合抗体的载体pKANTEX2160被导入实施方案5的3项中制备的FUT8基因双敲除克隆WK704中，制备抗CCR4嵌合抗体的稳定表达克隆。
按如下步骤进行电穿孔技术[Cytotechnology(电穿孔),3,133(1990)]将质粒pKANTEX2160的基因导入WK704。首先,15μg质粒pKANTEX2160溶解在100μl NE缓冲液4(New England Biolabs生产)中,向其中加入40单位限制性酶AatII(New England Biolabs生产),然后37℃消化2小时进行线性化。用苯/氯仿抽提提取反应溶液,随后乙醇沉淀,并将回收的线性质粒制成1μg/μl的水溶液。分别地,WK704悬浮在K-PBS缓冲液(137mmol/1 KC1,2.7mmol/1 NaCl,8.1mmol/1Na2HPO4,1.5mmol/1 KH2PO4,4.0mmol/1 MgCl2)中至8×l07细胞/ml密度。200μl细胞悬浮液(1.6×l06细胞)与4μl(4μg)上述线性化质粒结合后,全部细胞-DNA混合物被转移到Gene Pulser Cuvette(电极距离：2mm)(由BIO-RAD生产)，用细胞融合设备Gene Pulser(由BIO-RAD生产)以350V脉冲压和250μF电容进行基因导入。基因导入后,细胞悬浮液悬浮在添加了10％胎牛血清(由Invitrogen生产)和1×浓度HT添加物(Invitrogen生产)的IMDM培养基(由Invitrogen生产)中，并接种在粘附细胞培养的T75烧瓶(Greiner生产)上。在5％CO2中37℃培养24小时后,去除培养上清物,向其中加入10ml添加了10％胎牛透析血清(Invitrogen生产)的IMDM培养基(Invitrogen生产)。每隔3至4天重复更换培养基进行培养15天,获得转化株WK704-2760。此外,克隆WK704-2760,以WK704-2760的分类命名于2003年3月20日以保藏号FERM BP-8335保藏在独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物保藏中心(日本，茨城县)(Tsukuba Central 6,1,Higashi 1-ChomeTsukuba-shi,Ibaraki-ken 305-8566 Japan)。
5.抗体分子的纯化
在本实施方案的2项中获得的表达抗CD20抗体的克隆WK704-2B8P被悬浮在添加了10％胎牛透析血清(Invitrogen生产)的IMDM培养基(Invitrogen生产)中至3×105细胞/ml密度，300ml总体积被接种在10个贴附细胞培养的T182烧瓶(Greiner生产)上。本实施方案3项中获得的表达抗GD3抗体的克隆WK704-2871和本实施方案4项中获得的表达抗CCR4抗体的克隆WK704-2760以相同的方式接种。培养3天后,去除每个克隆的所有培养上清物并换成EXCELL301培养基(JRH Biosciences生产)。它们在5％CO2培养箱中37℃培养7天,然后收集每个细胞悬浮液。收集的所有细胞悬浮液的每一个以3000rpm和4℃离心10分钟以回收上清物,然后用0.22μm孔径和500ml体积的PES膜(Asahi Technoglass生产)过滤上清物。
在直径0.8cm的柱上充填0.5ml Mab Select(Amersham PharmaciaBiotech生产)，然后顺序地将3.0ml纯化水和3.0ml 0.2mol/1硼酸-0.15mol/1 NaCl缓冲液(pH 7.5)灌注到管中。此外,用2.0ml 0.1mol/1柠檬酸盐缓冲液(pH 3.5)和1.5ml 0.2mol/1硼酸-0.15mol/1 NaCl缓冲液(pH 7.5)连续清洗以平衡载体。然后,300ml上述上清物充填到柱上后,用3.0ml 0.2mol/1硼酸-0.15mol/1 NaCl缓冲液(pH 7.5)冲洗。冲洗后,载体上吸附的抗体用1.25ml 0.1mol/1柠檬酸盐缓冲液(pH 3.5)洗脱。在第一个250μl的洗脱部分被处理后,回收下一个洗脱部分1ml，通过与200μl 2mol/1 Tris-HCl(pH 8.5)混和被中和。获得的洗脱溶液用10mol/1柠檬酸-0.15mol/1 NaCl缓冲液(pH 6.0)在4℃透析过夜。透析后,回收抗体溶液，消毒并用0.22μm孔径的Millex GV(MILLIPORE生产)过滤。
实施例7
由FUT8等位基因双敲除的CHO/DG44细胞产生的抗体组合物的体外细胞毒活性(ADCC活性):
为了评价实施方案6中纯化的抗CD20抗体的体外细胞毒活性,ADCC活性检测如下。
(1)制备靶细胞悬浮液
用RPMI1640-FCS(5)培养基[添加了5％PCS的PRMI1640培养基(由GIBCO BRL生产)]通过离心分离和悬浮冲洗培养在RPMI1640-FCS(10)培养基[添加了10％PCS的PRMI1640培养基(由GIBCO BRL生产)]中的人B淋巴细胞培养细胞系Raji细胞(JCRB9012)。然后,用RPMI1640-FCS(5)培养基制备悬浮液至2×l06细胞/ml密度作为靶细胞悬浮液。
(2)制备效应细胞悬浮液
采集50ml健康个体静脉血后,在其中加入0.5ml肝素钠(由Shimizu Seiyaku生产),随后轻轻地混合。用Lymphoprep(由AXISSHIELD生产)根据厂家的使用说明书离心混合物(800g,20分钟)以分离单核细胞相。用RPMI1640-FCS(5)培养基通过离心分离冲洗细胞3次，并用相同的培养基重悬浮至4×106细胞/ml密度,得到的悬浮液被用作效应细胞悬浮液。
(3)ADCC活性的检测
在96孔U-形底平板(由Falcon生产)的每个孔中分发50μl(1×104细胞/孔)在上面(1)项中制备的靶细胞悬浮液。然后,添加上面(2)项中制备的效应细胞悬浮液50μl(2×105细胞/孔,效应细胞和靶细胞比例成为20:1)。此外,加各种抗CD20嵌合抗体至终浓度为0.3到3000ng/ml和总体积150μl,在37℃进行反应4小时。反应后,离心平板并通过CytoTox96非放射活性细胞毒性试验(由Promega生产)检测上清物中的乳酸脱氢酶(LDH)活性。通过进行上述相同的步骤计算靶细胞自发释放的LDH量,除仅使用培养基而没有效应细胞悬浮液和抗体溶液外，并测量上清物中的LDH活性。通过进行上述相同的步骤获得效应细胞自发释放的吸光率数据,除仅使用培养基而没有效应细胞悬浮液和抗体溶液外。通过进行上述相同的步骤测量上清物中的LDH活性计算与所有靶细胞坏死有关的总游离LDH量,除仅使用培养基而没有效应细胞悬浮液和抗体溶液外，在反应中止前45分钟添加15μl 9％Triton X-100溶液。根据以下公式(II)用这些值计算ADCC活性。
每个抗CD20抗体的ADCC活性显示在图22中。从FUT8基因双敲除克隆WK704-2B8P获得的抗体在所有抗体浓度上比商业获得的RituxanTM显示较高的ADCC活性，且最大细胞毒活性值也较高。RituxanTM是用CHO细胞作为宿主细胞产生的抗CD20嵌合抗体,其中FUT8基因是没有断裂的。此外,从FUT8基因双敲除克隆WK704-2871和克隆WK704-2760获得的每个抗体ADCC活性的检测结果显示，就抗CD20抗体而言，以相同方式获得了比FUT8基因没有断裂的普通CHO细胞系产生的抗体更高的细胞毒活性。根据以上结果发现,同采用FUT8基因没有断裂的宿主细胞相比，采用FUT8等位基因断裂的宿主细胞可以制备具有较高细胞毒活性的抗体。
实施例8
在FUT8等位基因双敲除的CHO/DG44细胞中产生的抗体组合物的糖链分析:
根据实施方案2(4)项中描述的方法，进行在实施方案6中获得的FUT8基因双敲除克隆产生的抗CD20抗体、抗GD3抗体和抗CCR4抗体的糖链分析。而且,根据已知的方法[Journal of LiquidChromatography,6,1577,(1983)]对抗体的糖链组合物进行单糖组合物分析。结果,在从FUT8基因双敲除克隆WK704获得的任何抗体中没有发现含岩藻糖的糖链结构。根据上述结果表明,通过在宿主细胞中断裂FUT8等位基因，可以完全地去除复合N-糖苷连接的糖链中岩藻糖的1位经α-键在还原端与N-乙酰氨基葡萄糖的6位结合的功能。
参考实施例
制备CHO细胞FUT8基因:
(1)制备CHO细胞FUT8 cDNA序列
从WO 00/61739实施方案8(1)项中培养第2天的CHO/DG44细胞制备的单链cDNA,通过以下步骤获得中国仓鼠FUT8 cDNA(图23)。
首先,从小鼠FUT8 cDNA序列(GenBank,AB025198)设计对5’端非翻译区特异的正向引物(显示为SEQ ID NO:7)和对3’端非翻译区特异的反向引物(显示为SEQ ID NO:8)。
接着,制备含1μl CHO/DG44细胞来源cDNA的25μl反应溶液[ExTaq缓冲液(由Takara Shuzo生产),0.2mmol/1 dNTPs,4％DMSO和0.5μmol/1特异引物(SEQ ID NOs:7和8)]，采用DNA聚合酶ExTaq(由Takara Shuzo生产)进行PCR。PCR反应条件：94℃加热1分钟，随后94℃30秒反应30个循环，55℃30秒和72℃2分钟一个循环，再在72℃加热10分钟。
PCR后,反应溶液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳,特异扩增的大约2Kb片段被纯化。按照TOPO TA克隆试剂盒(由Invitrogen生产)所附的使用说明书将4μl DNA片段插入质粒pCR2.1中,用反应溶液转化大肠杆菌DH5α株。按照已知的方法在获得的卡那霉素耐药克隆中从插入cDNA的8个克隆中分离质粒DNA。
采用DNA测序仪377(由Parkin Elmer生产)和BigDye TerminatorCycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(由Parkin Elmer生产)，按照厂家的使用说明书测定每个插入质粒的cDNA核苷酸序列。该方法证实所有插入的cDNA编码含CHO细胞FUT8全ORF的序列。在其中,选择序列中通过PCR完全不含碱基阅读错误的质粒DNA。在此,质粒被叫做CHfFUT8-pCR2.1。测定的CHO FUT8 cDNA的核苷酸序列和氨基酸序列分别由SEQ ID NOs:l和4显示。
(2)制备CHO细胞FUT8基因组序列
采用项目(1)中获得的CHO细胞FUT8 ORF全长cDNA片段作为探针，按照如分子克隆,第二版,分子生物学通用方法,实验室手册,第二版(1989)中所描述的已知基因组筛选方法，获得CHO细胞FUT8基因组克隆。接着,用各种限制性酶消化获得的基因组克隆后,用含CHO细胞FUT8 cDNA起始密码子的AfaI-Sau3AI片段(大约280bp)作为探针进行Southern杂交,然后从显示阳性反应的限制性酶片段中选择XbaI-XbaI片段(大约2.5Kb)和SacI-SacI片段(大约6.5Kb)，分别插入pBluescript II KS(+)(由Stratagene生产)中。
采用DNA测序仪377(由Parkin Elmer生产)和BigDye TerminatorCycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(由Parkin Elmer生产)，按照厂家的使用说明书测定每个获得的基因组片段的核苷酸序列。因此证实,XbaI-XbaI片段编码含CHO细胞FUT8外显子2的大约2.5Kb的上游内含子序列，SacI-SacI片段编码含CHO细胞FUT8外显子2的大约6.5Kb的下游内含子序列。在此,含XbaI-XbaI片段的质粒被叫做pFUT8fgE2-2,含SacI-SacI片段的质粒被叫做pFUT8fgE2-4。所测定的含CHO细胞FUT8外显子2的基因组区域核苷酸序列(大约9.0Kb)由SEQ ID N0:3显示。
工业实用性
本发明提供了基因组被修改的细胞，所述修改使与糖链修饰相关的酶活性较其亲代细胞更降低或消失，在所述修饰中，复合N-糖苷连接的糖链中岩藻糖的1位与N-乙酰氨基葡萄糖的6位在还原端通过α-键连接，提供了使用该细胞以及由该细胞制备的转基因非人动物或植物生产抗体的方法，提供了通过所述生产方法生产的抗体组合物以及含所述抗体组合物的药物。
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Claims (15)

1.一种含有在Fc区具有N-糖苷连接糖链的抗体分子的抗体组合物,其特征在于具有岩藻糖不与和抗体组合物Fc区结合的N–糖苷连接的糖链总复合体的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖连接的糖链。
2.权利要求1所述的抗体组合物,其特征在于所述不连接岩藻糖的糖链是岩藻糖的1位不与N–糖苷连接的糖链复合体的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接的糖链。
3.权利要求1所述的抗体组合物，其特征在于所述抗体组合物通过下列方法产生：所述方法包括使用含有编码抗体分子的基因的细胞，其中细胞的基因组被修饰以使αl,6-岩藻糖基转移酶的活性比其亲代细胞更低或消失，其中编码αl,6-岩藻糖基转移酶的基因组上的所有等位基因被敲除，并且所述的α1,6-岩藻糖基转移酶是选自以下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成的DNA编码的蛋白质；和
(b)由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成的蛋白质。
4.权利要求3所述的抗体组合物，其特征在于所述细胞对识别糖链的凝集素具有抗性，所述糖链中岩藻糖的1位与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接。
5.权利要求4所述的抗体组合物,其特征在于所述细胞对选自以下(a)至(d)的至少一种凝集素具有抗性：
(a)小扁豆凝集素；
(b)豌豆凝集素；
(c)蚕豆凝集素；
(d)陈皮木耳凝集素。
6.权利要求3所述的抗体组合物,其特征在于所述细胞选自以下(a)至(j)：
(a)来源于中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞；
(b)大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞；
(c)小鼠骨髓瘤细胞系NS0细胞；
(d)小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0-Ag14细胞；
(e)来源于叙利亚仓鼠肾组织的BHK细胞；
(f)产生抗体的杂交瘤细胞；
(g)人白血病细胞系Namalwa细胞；
(h)非人胚胎干细胞；
(i)非人受精卵细胞；
(j)植物细胞。
7.权利要求1所述的抗体组合物，其特征在于所述抗体分子选自以下的(a)至(d)：
(a)人抗体；
(b)人源化抗体；
(c)含(a)或(b)Fc区的抗体片段；
(d)含(a)或(b)Fc区的融合蛋白质。
8.权利要求1所述的抗体组合物，其特征在于所述抗体分子属于IgG型。
9.权利要求3所述的抗体组合物，其特征在于所述抗体组合物是比其亲代细胞产生的抗体组合物具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物。
10.权利要求9所述的抗体组合物,其特征在于所述具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物比其亲代细胞产生的抗体组合物具有更高的糖链比例。
11.权利要求9所述的抗体组合物，其特征在于所述具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物是与抗体组合物Fc区结合的N–糖苷连接的糖链总复合体中，岩藻糖不与还原端的N-乙酰氨基葡萄糖通过α-键连接的糖链比例是抗体组合物中与Fc区结合的N-糖苷连接糖链总复合体的20％以上。
12.权利要求9所述的抗体组合物，其特征在于所述具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物是没有岩藻糖与糖链中还原端N-乙酰氨基葡萄糖连接的抗体组合物。
13.权利要求1至12任一项所述的抗体组合物作为活性成分的药物。
14.权利要求13所述的药物，其特征在于所述药物是以下疾病的诊断剂、预防剂或治疗剂：肿瘤相关疾病、变态反应相关疾病、炎症相关疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病、病毒感染相关疾病或细菌感染相关疾病。
15.权利要求1至12任一项所述的抗体组合物在生产权利要求13或14所述的药物中的应用。
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