ES2390476T3

ES2390476T3 - Anticuerpos monoclonales frente a fucosil-GM1 y procedimientos de uso de anti-fucosil-GM1

Info

Publication number: ES2390476T3
Application number: ES06840172T
Authority: ES
Inventors: Cynthia A. Vistica; Eric H. Holmes; Peter Brams; Alison Witte; Josephine M. Cardarelli
Original assignee: Medarex LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 2005-12-08
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2012-11-13
Anticipated expiration: 2026-12-08
Also published as: US20220403046A1; HK1185085A1; NZ568551A; US20190315881A1; US20160024221A1; EA017491B1; EP1960434B1; US9138475B2; IL231169A0; US20170190785A1; PL1960434T3; CA2638902A1; EP1960434A2; JP5897051B2; CN103204931B; SG174783A1; CN101356195A; JP5512128B2; WO2007067992A9; KR20080090405A

Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende los dominios CDR1, CDR2, y CDR3, y una región variable de la cadena ligera, que comprende los dominios CDR1, CDR2, y CDR3, en el que: (a) el CDR1 de la región variable de la cadena pesada comprende la SEC ID Nº 16; (b) el CDR2 de la región variable de la cadena pesada comprende la SEC ID Nº 22; (c) el CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprende la SEC ID Nº 28; (d) el CDR1 de la región variable de la cadena ligera comprende la SEC ID Nº 34; (e) el CDR2 de la región variable de la cadena ligera comprende la SEC ID Nº 40; y (f) el CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprende la SEC ID Nº 46, en el que el anticuerpo se une específicamente a fucosil-GM1.

Description

Anticuerpos monoclonales frente a fucosil-GM1 y procedimientos de uso de anti-fucosil-GM1

Antecedentes

El fucosil-GM1 es un esfingolípido gangliósido monosialo compuesto por un componente lipídico de ceramida que ancla la molécula a la membrana celular y un componente carbohidrato que está expuesto en la superficie celular. Los antígenos carbohidratos son los antígenos más expresados sobre la superficie celular de los cánceres (Feizi T. (1985) Nature 314: 53-7). En algunos tipos de tumores, como el cáncer pulmonar microcítico (SCLC), las respuestas iniciales a la quimioterapia son impresionantes pero rápidamente se producen recidivas resistentes a la quimioterapia. La intervención con muevas inmunoterapias pueden tener éxito para superar las recaídas resistentes a fármacos (Johnson DH. (1995) Lung Cancer 12 Suppl 3: S71-5). Se ha demostrado que varios antígenos carbohidratos, como los gangliósidos GD3 y GD2, funcionan como dianas eficaces para inmunoterapia pasiva como MAb (Irie RF y Morton DL. (1986) PNAS 83: 8694-8698; Houghton AN y col. (1985) PNAS 82: 1242-1246). También se ha demostrado que los antígenos gangliósidos son dianas eficaces para inmunoterapia activa con vacunas en ensayos clínicos (Krug LM y col. (2004) Clinical Cancer Research 10: 6094-6100; Dickler MN y col. (1999) Clinical Cancer Research 5: 2773-2779; Livingston PO y col. (1994) J Clin Oncol.12: 1036-44). De hecho, suero derivado de pacientes de SCLC que desarrollaron títulos de anticuerpos frente a fucosil-GM1 tras vacunación con antígeno conjugado con KLH de mostró unión específica a células tumorales y citotoxicidad dependiente del complemento específica de tumor. Las toxicidades asociadas con el título anti-fucosil-GM1 fueron leves y transitorias, y tres pacientes con SCLC en etapa limitada no tuvieron recaídas a 18, 24 y 30 meses (Krug y col., ant.; Dickler y col., ant.).

Se ha demostrado la existencia de expresión de fucosil-GM1 en un elevado porcentaje de casos de SCLC y, al contrario que otros antígenos gangliósidos, el fucosil-GM1 tiene poca o ninguna expresión en tejidos normales (Nilsson y col. (1984) Glycoconjugate J 1: 43-9; Krug y col., ant. Brezicka y col. (1989) Cancer Res 49: 1300-5; Zhangyi y col. (1997) Int J Cancer 73: 42-49; Brezicka y col. (2000) Lung Cancer 28: 29-36; Fredman y col. (1986) Biochim Biophys Acta 875: 316-23; Brezicka y col. (1991) APMIS 99: 797-802; Nilsson y col. (1986) Cancer Res 46: 1403-7). La presencia de fucosil-GM1 se ha demostrado en medios de cultivo de líneas celulares de SCLC, en extractos tumorales y suero de xenoinjertos de ratón atímicos y en el suero de pacientes de SCLC con enfermedad en estadio avanzado (Vangsted y col. (1991) Cancer Res 51: 2879-84; Vangsted y col. (1994) Cancer Detect Prev

18: 221-9). Estos informes proporcionan pruebas convincentes para fucosil-GM1 como antígeno tumoral altamente específico al que pueden dirigirse inmunoterapias.

De acuerdo con esto, se desean agentes que reconozcan fucosil-GM1 y procedimientos de uso de estos agentes.

Resumen

Es un objetivo de la presente invención proporcionar anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales humanos que se unan a fucosil-GM1 y que exhiban numerosas propiedades deseables. Este objetivo se puede conseguir mediante las características definidas en las reivindicaciones independientes. Otras potenciaciones se caracterizan en las reivindicaciones adjuntas. Estas propiedades pueden incluir unión de alta afinidad a fucosil-GM1 y unión a la línea celular de cáncer de pulmón microcítico humano DMS-79 (SCLC humano ATCC # CRL-2049). También se proporcionan procedimientos para tratar diversas enfermedades mediadas por fucosil-GM1 usando los anticuerpos y composiciones de la presente divulgación.

En un primer aspecto, esta divulgación atañe a un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo se une específicamente a fucosil-GM1; y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende los dominios CDR1, CDR2, y CDR3; y una región variable de la cadena ligera que comprende los dominios CDR1, CDR2, y CDR3, en la que (a) la CDR1 de la región variable de la cadena pesada comprende la SEC ID Nº 16; (b) la CDR2 de la región variable de la cadena pesada comprende la SEC ID Nº 22; (c) la CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprende la SEC ID Nº 28;

(d) la CDR 1 de la región variable de la cadena ligera comprende la SEC ID Nº 34; (e) la CDR2 de la región variable de la cadena ligera comprende la SEC ID Nº 40; y (f) la CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprende la SEC ID Nº 46.

En otra realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo compite de forma cruzada por la unión a fucosil-GM1 con un anticuerpo de referencia; en el que el anticuerpo de referencia es un anticuerpo del primer aspecto mencionado anteriormente de la presente divulgación.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 10.

En un aspecto, el anticuerpo monoclonal aislado de esta divulgación, o una porción de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que es el producto, o derivado, de un gen VH 3-48 humano, en el que el anticuerpo se une específicamente a fucosil-GM1. El anticuerpo monoclonal aislado de la presente divulgación, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región variable de cadena ligera que es el producto, o derivado, de un gen VK L15 humano, en el que el anticuerpo se une específicamente a fucosil-GM1.

Una combinación preferida comprende:

(a) una CDR1 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 13;

(B) una CDR2 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 19;

(c) una CDR3 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 25;

(d) una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 31;

(e) una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 37; y

(f) un CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 43. Otra combinación preferida comprende:

(a) una CDR1 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 14;

(b) una CDR2 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 20;

(c) una CDR3 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 26;

(d) una CDR 1 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 32;

(e) una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 38; y

(f) una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 44. Otra combinación preferida comprende:

(a) una CDR1 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 15;

(b) una CDR2 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 21;

(c) una CDR3 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 27;

(d) una CDR 1 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 33;

(e) una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 39; y

(f) una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 45. Otra combinación preferida comprende:

(a) una CDR1 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 16;

(b) una CDR2 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 22;

(c) una CDR3 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 28;

(d) una CDR 1 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 34;

(e) una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 40; y

(f) una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 46. Otra combinación preferida comprende:

(a) una CDR1 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 17;

(b) una CDR2 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 23;

(c) una CDR3 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 29;

(d) una CDR 1 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 35;

(e) una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 41; y

(f) una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 47.

Otra combinación preferida comprende:

(a): una CDR1 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 18;

(b): una CDR2 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 24;

(c): una CDR3 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 30;

(d): una CDR 1 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 36;

(e): una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 42; y

(f): una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 48.

Otros anticuerpos preferidos de la presente divulgación, o porciones de unión a antígeno de los mismos, comprenden:

(a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1; y

(b): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 7. Otra combinación preferida comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2; y

(b): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 8. Otra combinación preferida comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 3; y

(b): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 9. Otra combinación preferida comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4; y

(b): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 10. Otra combinación preferida comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 5; y

(b): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 11. Otra combinación preferida comprende:

(a): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 6; y

(b): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 12.

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, por ejemplo un isotipo IgG1 o IgG4. Como alternativa, los anticuerpos pueden ser fragmentos de anticuerpo, tal como fragmentos Fab o Fab’2, o anticuerpos de una cadena.

La presente divulgación también proporciona un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la presente divulgación, una porción de unión a antígeno del mismo, unido a un agente terapéutico, tal como una citotoxina o un isótopo radioactivo. La presente divulgación también proporciona una molécula bioespecífica comprende un anticuerpo, una porción de unión a antígeno del mismo, de la presente divulgación, unido a un resto funcional que tiene una especificidad de unión diferente que dicho anticuerpo, una porción de unión a antígeno del mismo.

También se proporcionan composiciones que comprenden un anticuerpo, una porción de unión a antígeno del mismo, o inmunoconjugado o molécula biespecífica, de la presente divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En la presente divulgación también se abarcan moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno del mismo, de la presente divulgación, así como vectores de expresión que comprenden dichos ácidos nucleicos y células huésped que comprenden dichos vectores de expresión. Además, la presente divulgación proporciona un ratón transgénico que comprende los transgenes de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana, en el que el ratón expresa un anticuerpo de la presente divulgación así como hibridomas preparados a partir de dicho ratón, en el que el hibridoma produce el anticuerpo de la presente divulgación.

En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de la presente divulgación para usar en el tratamiento o la prevención de una enfermedad caracterizada por el crecimiento de células tumorales que expresan fucosil-GM1. Esta enfermedad puede ser, por ejemplo, cáncer, por ejemplo cáncer de pulmón (incluido cáncer de pulmón microcítico).

En una realización preferida, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-fucosil-GM1 para usar en el tratamiento del cáncer in vivo. Ejemplos de otros cánceres que se pueden tratar usando los procedimientos de la presente divulgación incluyen cáncer de pulmón, incluido cáncer de pulmón microcítico y cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer renal (p. ej., carcinoma de células renales), glioblastoma, tumores cerebrales, leucemias crónicas o agudas, incluidas leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia de linfocitos T del adulto (LLA-T), leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfomas (p. ej., linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, linfoma linfocítica, linfoma primaria del SNC, linfoma de células T, linfoma de Burkitt, linfoma de células grandes anaplásico (ALCL), linfomas de células T cutáneos, linfomas de células hendidas pequeñas nodulares, linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfomas inmunoblásticos, linfomas/leucemia de células T (ATLL), cánceres de linfomas foliculares eritroblásticos/centrocíticos (cb/cc), linfomas de células grandes difusas de linaje B, linfoma de células T de tipo linfadenopatía angioinmunoblástica (AILD) y linfomas basados en la cavidad corporal asociados con el VIH), carcinomas embrionarios, carcinomas indiferenciados de la rinofaringe (p.ej., enfermedad, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y otros linfomas de células B, carcinomas nasofaríngeos, cáncer de huesos, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, melanoma maligno cutáneo intraocular, cáncer de útero, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de testículos, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma de cérvix, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, tumores sólidos de la infancia, cáncer de la vejiga urinaria, cáncer del riñón o del uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco del encéfalo, adenoma hipofisario, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, cánceres inducidos por el ambiente, incluidos los inducidos por el asbestos, por ejemplo mesotelioma y combinaciones de dichos cánceres.

Otras características y ventajas de la presente divulgación se pondrán de manifiesto a partir de la descripción detallada siguiente y los ejemplos.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A muestra la secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 3C4. Las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 se delinean y se indican las derivaciones de las líneas germinales V, D y J.

La Figura 1B muestra la secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 3C4. Las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 se delinean y se indican las derivaciones de las líneas germinales V y J.

La figura 2A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 49) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 1) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano SB1. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº 13), CDR2 (SEC ID Nº 19), y CDR3 (SEC ID Nº: 25) se delinean y se indican las derivaciones de las líneas germinales V, D y J.

La figura 2B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 55) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 7) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 5B1. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº 31), CDR2 (SEC ID Nº 37), y CDR3 (SEC ID Nº: 43) se delinean y se indican las derivaciones de las líneas germinales V y J.

La figura 3A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 50) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 2) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 5B1. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº 14), CDR2 (SEC ID Nº 20), y CDR3 (SEC ID Nº: 26) se delinean y se indican las derivaciones de las líneas germinales V, D y J.

La figura 3B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 56) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 8) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 5B1. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº 32), CDR2 (SEC ID Nº 38), y CDR3 (SEC ID Nº: 44) se delinean y se indican las derivaciones de las líneas germinales V y J.

La figura 4A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 51) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 3) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 7D4. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº 15), CDR2 (SEC ID Nº 21), y CDR3 (SEC ID Nº: 27) se delinean y se indican las derivaciones de las líneas germinales V, D y J.

La figura 4B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 57) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 9) de la

región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 7D4. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº 33), CDR2 (SEC ID Nº 39), y CDR3 (SEC ID Nº: 45) se delinean y se indican las derivaciones de las líneas germinales V y J.

La figura 5A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 52) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 4) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 7E4. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº 16), CDR2 (SEC ID Nº 22), y CDR3 (SEC ID Nº: 28) se delinean y se indican las derivaciones de las líneas germinales V, D y J.

La figura 5B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 58) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 10) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 7E4. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº 34), CDR2 (SEC ID Nº 40), y CDR3 (SEC ID Nº: 46) se delinean y se indican las derivaciones de las líneas germinales V y J.

La figura 6A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 53) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 5) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 13B8. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº 17), CDR2 (SEC ID Nº 23), y CDR3 (SEC ID Nº: 29) se delinean y se indican las derivaciones de las líneas germinales V, D y J.

La figura 6B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 59) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 11) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 13B8. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº 35), CDR2 (SEC ID Nº 41), y CDR3 (SEC ID Nº: 47) se delinean y se indican las derivaciones de las líneas germinales V y J.

La Figura 7 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada de 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5 con la secuencia de aminoácidos VH 3-48 de la línea germinal humana (SEC ID Nº 61).

La Figura 8 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena ligera de 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5 con la secuencia de aminoácidos Vk L15 de la línea germinal humana (SEC ID Nº 62).

Las Figuras 9A-C muestran los resultados de experimentos de ELISA que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos contra fucosil-GM1 se unen específicamente a fucosil-GM1.

Las Figuras 10A-C muestran los resultados de experimentos de ELISA con células enteras que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos contra fucosil-GM1 se unen específicamente a células que expresan fucosil-GM1.

Las Figuras 11A-C muestran los resultados de experimentos de citometría de flujo que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos (A y B) contra Fucosil-GM1 se unen a la superficie celular de las líneas celulares DMS79 y H-4-II-E que expresan fucosil-GM1, y que (C) se encontró que las células DMS79 continuaban expresando fucosil-GM1 in vivo (es decir, tras la implantación en un ratón).

Las Figuras 12A y B muestran los resultados de experimentos de internalización de ELISA Hum-Zap que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos contra fucosil-GM1 se pueden internalizar en células + para fucosil-GM1. Las Figuras 13A y B muestran los resultados de un ensayo de proliferación celular de citotoxicidad (CDC) dependiente del complemento que demuestra que los anticuerpos anti-fucosil-GM1 monoclonales humanos matan las líneas celulares (A) DMS79 y (B) H-4-II-E que expresan fucosil-GM1. Las Figuras 14A y B muestran los resultados de un ensayo de proliferación celular de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) que demuestra que los anticuerpos anti-fucosil-GM1 monoclonales humanos matan las líneas celulares que expresan fucosil-GM1 en ausencia de bloqueo con CD16. El anticuerpo monoclonal anti-fucosil-GM1 5B1 a 10 mg/kg por ratón; (D) El anticuerpo monoclonal anti-fucosil-GM1 5B1 a 30 mg/kg por ratón; (E) El anticuerpo monoclonal antifucosil-GM1 57E4 a 10 mg/kg por ratón; O (F) El anticuerpo monoclonal anti-fucosil-GM1 7E4 a 30 mg/kg por ratón. El volumen del tumor el primer día de tratamiento fue de aproximadamente 200 mm3. Las Figuras 16A y B muestran la media y la mediana del volumen tumoral, respectivamente, de los ratones mostrados en la Figura 15. La Figura 17 muestra el peso medio del grupo de los ratones mostrados en la Figura 15.

Descripción detallada

En un aspecto, la presente divulgación se refiere, en general, a anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a fucosil-GM1. En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgación exhiben una o más propiedades funcionales deseables, tales como unión de alta afinidad a fucosil-GM1 y/o la capacidad para inhibir el crecimiento de células tumorales in vivo o in vitro. En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgación proceden de secuencias concretas de líneas germinales de las cadenas pesada y ligera y/o comprenden características estructurales concretas, tales como regiones de CDR que comprenden secuencias de aminoácidos concretas. La presente divulgación proporciona anticuerpos aislados, procedimientos de fabricar dichos anticuerpos, inmunoconjugados y moléculas biespecíficas que comprenden dichos anticuerpos y composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos,

inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la presente divulgación. La presente divulgación también se refiere a procedimientos de usar los anticuerpos, tal como para tratar enfermedades tales como cáncer.

Con el fin de que la presente divulgación pueda entenderse con mayor facilidad, primero se definen ciertos términos y expresiones. A lo largo de la descripción detallada se exponen definiciones adicionales.

La expresión “respuesta inmunitaria” se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células presentadoras de antígeno, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluidos anticuerpos, citosina y complemento) que tiene como resultado daños selectivos, destrucción o eliminación del cuerpo humano de patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.

Una “vía de transducción de la señal” se refiere a la relación bioquímica entre varias moléculas de transducción de la señal que desempeñan un papel en la transmisión de una señal de una parte de una célula a otra parte de una célula. Como se usa en el presente documento, la expresión “receptor de superficie celular” incluye por ejemplo, moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y la transmisión de dicha señal a través de la membrana plasmática de una célula. Un ejemplo de un “receptor de superficie celular” de la presente divulgación es el receptor de fucosil-GM1.

Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” incluye anticuerpos enteros y cualquier fragmento de unión al antígeno (es decir, “porción de unión a antígeno”) o cadenas sencillas de los mismos. Un “anticuerpo” se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por puentes disulfuro, o una porción de unión a antígeno del mismo. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de la cadena pesada (en la presente memoria descriptiva abreviada como VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta por tres dominios CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de la cadena ligera (en la presente memoria descriptiva abreviada como VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas que se denominan regiones estructurales (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi, en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del huésped, incluidas varias células del sistema inmunológico (p. ej., células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico.

La expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente “fragmento de anticuerpo”), como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (p. ej., fucosil-GM1). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab es un fragmento monovalente compuesto por los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab’)2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra;

(iii) un fragmento Fd que consta de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consta de los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward y coI., Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes distintos, pueden unirse, usando procedimientos recombinantes, mediante un ligador sintético que permite que se formen en forma de una proteína de una cadena en la que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242: 423-426 y Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Estos anticuerpos de cadena sencilla también se pretende que entren dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas para los expertos en la técnica y los fragmentos se seleccionan según su utilidad del mismo modo que son anticuerpos intactos.

Con un “anticuerpo aislado”, como se usa en el presente documento, se pretende hacer referencia a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (p. ej., un anticuerpo aislado que se une a fucosil-GM1 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen a antígenos distintos a fucosil-GM1). Además, un anticuerpo asilado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o sustancias químicas.

Los términos “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpo monoclonal” como se usan en la presente memoria se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular sencilla. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad y afinidad de unión sencilla por un epítopo concreto.

Con la expresión “anticuerpo humano”, como se usa en la presente memoria, se pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las que las regiones marco y CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de la

línea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también procede de las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la presente divulgación pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o especificidad e sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo). No obstante, con la expresión “anticuerpo humano”, como se usa en la presente memoria, no se pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.

La expresión “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a anticuerpos que muestran una especificidad de unión única que tienen regiones variables en las que las regiones marco y CDR proceden de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos se producen mediante un hibridoma incluye una célula B obtenida de un animal transgénico no humano, por ejemplo un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgen de la cadena pesada humana y un transgen de la cadena ligera condensados a una célula inmortalizada.

La expresión “anticuerpo humano recombinante”, como se usa en la presente memoria, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (p. ej., un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos (que se describe más adelante), (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatoria recombinante y (d) anticuerpos preparado, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones marco y CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. No obstante, en ciertas realizaciones, dichos anticuerpos humanos recombinantes se pueden someter a mutagénesis in vitro (o cuando se usa un animal transgénico de las secuencias de Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan y están relacionadas con las secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la líneas germinales de anticuerpos humanos in vivo.

Como se usa en la presente memoria, “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpo (p. ej., IgM o IgG1) codificado en los genes de la región constante de la cadena pesada.

Las frases “un anticuerpo que reconoce un antígeno” y “un anticuerpo específico de un antígeno” se usan de forma intercambiable en la presente memoria con el término “un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno."

La expresión “derivados de anticuerpo humano” se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, por ejemplo un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.

Con la expresión “anticuerpo humanizado” se pretende hace referencia a anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas. Se pueden hacer modificaciones adicionales en la región marco dentro de las secuencias marco humanas.

Con la expresión “anticuerpo quimérico” se pretende hacer referencia a anticuerpos en los que las secuencias de la región variable derivan de una especie y las secuencias de la región constante derivan de otra especie, tal como un anticuerpo en el que las secuencias de la región variable derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de la región constante derivan de un anticuerpo humano.

Como se usa en el presente documento, un anticuerpo que “se une específicamente a fucosil-GM1” hace referencia a un anticuerpo que se une a fucosil-GM1 con una KD de 1 x 10-7 M o menor, más preferentemente 5 x 10-8 M o menor, más preferentemente 1 x 10-8 M o menor, más preferentemente 5 x 10-9 M o menor.

El término “Kasoc.” o "Ka", como se usa en el presente documento, hace referencia a la tasa de asociación de una interacción antígeno-anticuerpo concreta, mientras que los términos "Kdis" o "Kd," como se usa en el presente documento, hace referencia a la tasa de disociación de una interacción antígeno-anticuerpo concreta. El término "KD", como se usa en el presente documento, hace referencia a la constante de disociación, que se obtiene de la proporción entre Kd y Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa en concentración molar (M). Los valores de KD para los anticuerpos se pueden determinar usando procedimientos bien establecidos en la técnica. Un procedimiento preferido para determinar la KD de un anticuerpo es usando resonancia de plasmón superficial, preferentemente usando un sistema biosensor como un sistema Biacore®.

Como se usa en el presente documento, la expresión “afinidad alta” para un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de10-8 M o menor, más preferentemente 10-9 M o menor e incluso más preferentemente 10-10 M o menor para un antígeno diana. No obstante, unión de “afinidad elevada” puede variar para otros isotipos del anticuerpo. Por ejemplo, unión de “afinidad alta” para un isotipo IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de10-7 M o menor, más preferentemente 10-8 M o menor e incluso más preferentemente 10-9 M o menor.

Como se usa en el presente documento, el término “sujeto” incluye cualquier animal humano o no humano. La expresión “animal no humano” incluye todos los vertebrados, por ejemplo mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles etc.

Varios aspectos de la presente divulgación se describen con más detalle en las subsecciones siguientes.

Anticuerpos anti-fucosil-GM1

Los anticuerpos de la presente divulgación se caracterizan por características o propiedades funcionales concretas de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se unen específicamente a fucosil-GM1, preferentemente fucosil-GM1. Preferentemente, un anticuerpo de la presente divulgación se une a fucosil-GM1 con una afinidad alta, por ejemplo con una KD de 1 x 10-7 M o menor. Los anticuerpos anti-fucosil-GM1 de la presente divulgación exhiben una

o más de las características siguientes:

(a): se unen específicamente a fucosil-GM1; y

(b): se unen a la línea celular de cáncer de pulmón microcítico humano DMS-79 (SCLC humano ATCC # CRL2049).

Preferentemente, el anticuerpo se une a fucosil-GM1 con una KD de 5 x 10-8 M o menor, se une a fucosil-GM1 con una KD de 1 x 10-8 M o menor, se une a fucosil-GM1 con una KD de 5 x 10-9 M o menor, o se une a fucosil-GM1 con una KD de entre 1 x 10-8 M y 1 x 10-10 M o menor. En la técnica se conocen ensayos estándar para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos al fucosil-GM1, incluidos, por ejemplo, ELISA, transferencias Western y RIA. La cinética de unión (p. ej., afinidad de unión) de los anticuerpos también se puede evaluar mediante ensayos estándar conocidos en la técnica, tal como ELISA y análisis Scatchard y Biacore.

Anticuerpos monoclonales 5B1. 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5

Anticuerpos preferidos de la presente divulgación son los anticuerpos monoclonales humanos SB1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5, aislados y caracterizados estructuralmente como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Las secuencias de aminoácidos de VH de 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5 se muestran en las SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5 y 6, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de VL de SB1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5 se muestran en las SEC ID Nº 7, 8, 9, 10, 11 y 12, respectivamente.

Dado que cada uno de estos anticuerpos se puede unir a fucosil-GM1, las secuencias de VH y VL se pueden “mezclar y emparejar” para crear otras moléculas de unión anti-fucosil-GM1 de la presente divulgación. La unión a fucosil-GM1 de dichos anticuerpos “mezclados y emparejados” se puede analizar usando los ensayos de unión descritos anteriormente en los Ejemplos (p. ej., ELISA). Preferentemente, cuando las cadenas VH y VL se mezclan y emparejan, una secuencia de VH de un emparejamiento VH/VL concreto se sustituye con una secuencia de VH estructuralmente similar. Asimismo, preferentemente, una secuencia de VL de un emparejamiento VH/VL concreto se sustituye con una secuencia de VL estructuralmente similar.

De acuerdo con esto, en un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende:

(a): una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5 y 6; y

(b): una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 7, 8, 9, 10, 11 y 12;

en las que el anticuerpo se une específicamente a fucosil-GM1, preferentemente fucosil-GM1.

Las combinaciones preferidas de cadenas pesada y ligera incluyen:

(a): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 7; o

(a): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 8; o

(a): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 9; o

(a): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 10; o

(a): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 5; y (b)

una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 11; o

(a): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 6; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 12.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos que comprenden CDR1, CDR2 y CDR3 de la

5 cadena pesada y de la cadena ligera de 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5, o combinaciones de los mismos. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de VH de 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5 se muestran en las SEC ID Nº 13, 14, 15, 16, 17 y 18, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de VH de 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5 se muestran en las SEC ID Nº 19, 20, 21, 22, 23 y 24, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de VH de 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5 se muestran en las SEC ID Nº 25, 26, 27,

10 28, 29 y 30, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de Vk de 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5 se muestran en las SEC ID Nº 31, 32, 33, 34, 35 y 36, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de Vk de 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5 se muestran en las SEC ID Nº 37, 38, 39, 40, 41 y 42, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de Vk de 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5 se muestran en las SEC ID Nº 43, 44, 45, 46, 47 y 48, respectivamente. Las regiones CDR se delinean usando el

15 sistema Kabat (Kabat, E. A., y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).

Dado que cada uno de estos anticuerpos se puede unir a fucosil-GM1 y que la especificidad de unión a antígeno se proporciona principalmente en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3, y las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de VH y las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de Vk se pueden “mezclar y emparejar” (Es decir, CDR de diferentes 20 anticuerpos se pueden mezclar y emparejar, aunque cada anticuerpo puede contener una CDR1, CDR2 y CDR3 de VH y una CDR1, CDR2 y CDR3 de Vk) para crear otras moléculas de unión anti-fucosil-GM1 de la presente divulgación. La unión a fucosil-GM1 de dichos anticuerpos “mezclados y emparejados” se puede analizar usando los ensayos de unión descritos anteriormente en los Ejemplos (p. ej., ELISA, análisis Biacore). Preferentemente, cuando las secuencias de CDR de VH se mezclan y emparejan, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia 25 de VH concreta se sustituye con una secuencia(s) de CDR estructuralmente similar. Asimismo, las secuencias de CDR de Vk se mezclan y emparejan, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de Vk concreta se sustituye preferentemente con una secuencia(s) de CDR estructuralmente similar. Para el experto en la técnica será evidente que nuevas secuencias de VH y VL se pueden crear sustituyendo una o más secuencias de la región CDR de VH y/o VL con secuencias estructuralmente similares de las secuencias de CDR divulgadas en el presente

30 documento para anticuerpos monoclonales 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5.

De acuerdo con esto, en otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende:

(a) una CDR1 de la región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 13, 14, 15, 16, 17 y 18;

35 (b) una CDR2 de la región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 19, 20, 21, 22, 23 y 24;

(c) una CDR3 de la región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 25, 26, 27, 28, 29 y 30;

(d) una CDR1 de la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos 40 seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 31, 32, 33, 34, 35 y 36;

(e): una CDR2 de la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 37, 38, 39, 40, 41 y 42; y

(f): una CDR3 de la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 43, 44, 45, 46, 47 y 48;

45 en las que e anticuerpo se une específicamente a fucosil-GM1, preferentemente fucosil-GM1.

En una realización preferida, el anticuerpo comprende:

(a): una CDR1 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 13;

(b): una CDR2 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 19;

(c): una CDR3 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 25;

50 (d) una CDR 1 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 31;

(e): una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 37; y

(f): una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 43.

En otra realización preferida, el anticuerpo comprende:

(a): una CDR1 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 14;

(b): una CDR2 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 20;

(c): una CDR3 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 26;

(d): una CDR 1 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 32;

(e): una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 38; y

(f): una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 44. En otra realización preferida, el anticuerpo comprende:

(a): una CDR1 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 15;

(b): una CDR2 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 21;

(c): una CDR3 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 27;

(d): una CDR 1 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 33;

(e): una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 39; y

(f): una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 45. En otra realización preferida, el anticuerpo comprende:

(a): una CDR1 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 16;

(b): una CDR2 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 22;

(c): una CDR3 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 28;

(d): una CDR 1 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 34;

(e): una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 40; y

(f): una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 46. En otra realización preferida, el anticuerpo comprende:

(a): una CDR1 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 17;

(b): una CDR2 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 23;

(c): una CDR3 de región variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 29;

(d): una CDR 1 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 35;

(e): una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 41; y

(f): una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 47. En otra realización preferida, el anticuerpo comprende:

En la técnica se conoce bien que el dominio CDR3, independientemente de los dominios CDR1 y/o CDR2. solo puede determinar la especificidad de unión de un anticuerpo o un antígeno afín y que múltiples anticuerpos pueden generarse de forma predecible que tiene la misma especificidad de unión en base a una secuencia de CDR3 común. Véase, por ejemplo, Klimka y col., British J. of Cancer 83(2): 252-260 (2000) (que describe la producción de un

anticuerpo anti-CD30 humanizado usando solo el CDR3 de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD30 murino Ki-4); Beiboer y col., J. Mol. Biol. 296: 833-849 (2000) (que describe anticuerpos recombinantes frente a la glicoproteína-2 epitelial (EGP-2) usando solo la secuencia de CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo anti-EGP-2 MOC-31 murino parental); Rader y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-915 (1998) (que describen un panel de anticuerpos av�3 anti-integrina humanizados que usan el dominio CDR3 de la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo av�3 anti-integrina murino LM609, en el que cada anticuerpo miembro comprende una secuencia clara fuera del dominio de CDR3 y capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo murino parental con afinidades tan altas o más que las del anticuerpo murino parental); Barbas y col., J. Am. Chem. Soc.

116: 2161-2162 (1994) (que divulgan que el dominio CDR3 proporciona la contribución más significativa a la unión al antígeno); Barbas y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 2529-2533 (1995) (que describe el injerto de secuencias de CDR3 de cadena pesada de Fabs (SI-1, SI-40, y SI-32) contra ADN placentario humano sobre la cadena pesada de un Fab del toroide anti-tétanos de modo que sustituye la CDR2 de la cadena pesada existente y que demuestra que el dominio de CDR3 solo confería especificidad de unión) y Ditzel y col., J. Immunol. 157: 739-749 (1996) (que describe estudios de injertos en el que la transferencia de solo la CDR3 de la cadena pesada de un fab poliespecífico parental LNA3 a una cadena pesada de un Fab p313 de unión al toxoide del tétanos IgG monoespecífico era suficiente para conservar la especificidad de unión del Fab parental).

Anticuerpos que tienen secuencias de líneas germinales concretas

En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación comprende una región variable de la cadena pesada de un gen de inmunoglobulina de cadena pesada de la línea germinal concreta y/o una región variable de la cadena ligera de un gen de inmunoglobulina de cadena ligera de la línea germinal concreta.

Por ejemplo, en una realización preferida, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto, o derivado, de un gen VH 3-48 humano, en el que el anticuerpo se une específicamente a fucosil-GM1, preferentemente fucosil-GM1. En otra realización preferida, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto, o derivado, de un gen L5 de VK humano, en el que el anticuerpo se une específicamente a fucosil-GM1, preferentemente fucosil-GM1. En otra realización preferida más, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo:

(a): comprende una región variable de cadena pesada que es el producto, o derivado de, un gen VH 3-48 humano (en el que el gen codifica la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº 61);

(b): comprende una región variable de cadena ligera que es el producto, o derivado de, un gen VK L15 humano (en el que el gen codifica la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº 62); y

(c): se unen específicamente a fucosil-GM1.

Ejemplos de anticuerpos que tienen VH y VK de VH 3-48 y VK L15, respectivamente, son 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5.

Como se usa en el presente documento, un anticuerpo humano comprende regiones variables de las cadenas pesada o ligera que es “el producto de” o “derivado de” una secuencia de la línea germinal si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Dichos sistemas incluye inmunizar un ratón transgénico portador de genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o seleccionar una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana que se expresan en fagos con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es “el producto de” o “derivado de” una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana se puede identificar como tal comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con la secuencia de aminoácidos de inmunoglobulinas de la línea germinal humana y seleccionado la secuencia de la inmunoglobulina de la línea germinal humana de secuencia más cercana (es decir, el mayor % de identidad) a la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es “el producto de” o “derivado de” una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana puede contener diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de la línea germinal debido a, por ejemplo, mutaciones somáticas naturales o la introducción intencionada de una mutación dirigida a un sitio. No obstante, un anticuerpo humano seleccionado normalmente tiene una identidad de secuencia del 90 % en la secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana y contiene residuos de aminoácidos que identifican el anticuerpo humano como humano en comparación con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de la línea germinal de otras especies (p. ej., secuencias de la línea germinal murinas). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede una identidad de secuencia de al menos un 95 %, o incluso de al menos 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % en la secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos codificada por el gen de la inmunoglobulina de la línea germinal.

Normalmente, un anticuerpo humano derivado de una secuencia de la línea germinal humana mostrará no más de 10 diferencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de la inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede mostrar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2, o 1 diferencias de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de la inmunoglobulina de

la línea germinal.

Anticuerpos homólogos

En otra realización, un anticuerpo de la presente divulgación comprende regiones variables de las cadenas pesada y ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que son homólogas con las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos preferidos descritos en el presente documento, y en el que los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-fucosil-GM1 de la presente divulgación.

Por ejemplo, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en el que:

(a): la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 80 % con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5 y 6;

(b): la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 80 % con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 7, 8, 9, 10, 11 y 12; y el anticuerpo exhibe una o más de las propiedades siguientes:

(c): el anticuerpo se une a fucosil-GM1 con una KD de 1 x 10-7 M o menor.

(d): el anticuerpo se une a la línea celular de cáncer de pulmón microcítico humano DMS-79 (SCLC humano ATCC # CRL-2049).

En otras realizaciones, las secuencias de aminoácidos de VH y/o VL pueden tener una homología del 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con las secuencias indicadas anteriormente. Un anticuerpo que tiene regiones VH y/o VL que tienen una homología alta (es decir, 80 % o mayor) con las regiones VH y/o VL de las secuencias indicadas anteriormente, se pueden obtener mediante mutagénesis (p. ej., dirigida a sitio o mutagénesis mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican las SEC ID Nº 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 y 60, seguido de ensayos del anticuerpo alterado codificado para la función conservada (es decir, las funciones indicadas en (c) y (d) anteriormente) usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos es equivalente al porcentaje de identidad entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología= nº de posiciones idénticas/nº total de posiciones por 100), teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se han de introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede conseguir usando un algoritmo matemático, tal como se describe en los ejemplos no limitantes siguientes.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete se software GCG (disponible en www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

Adicionalmente o como alternativa, las secuencias de proteínas de la presente divulgación pueden usarse además como “secuencia de consulta” para realizar una búsqueda contra bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Dichas búsquedas se pueden realizar usando el programa XBLAST (versión 2.0) of Altschul, y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Las búsquedas de proteínas en BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación= 50; longitud de texto= 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de anticuerpos de la presente divulgación. Para obtener alineaciones de huecos con fines comparativos, se puede usar Gapped BLAST como se describe en Altschul y col., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Cuando se usan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los respectivos programas (p. ej., XBLAST y NBLAST). (Véase www.ncbi.nlm.nih.gov).

Anticuerpos con modificaciones conservadoras

En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, en las que una o más de estas secuencias CDR comprenden secuencias de aminoácidos especificadas basadas en los anticuerpos preferidos descritos en el presente documento

(p. ej., 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 o 18D5), o modificaciones conservadoras de los mismos, y en los que los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-fucosil-GM1 de la presente divulgación. De acuerdo con esto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una

porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias CDR1,CDR2, y CDR3, y una región variable de la cadena ligera, que comprende las secuencias CDR1,CDR2, y CDR3, en el que:

(a): la CDR3 de la región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 25, 26, 27, 28, 29 y 30, y modificaciones conservadoras de las mismas;

(b): la CDR3 de la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 43, 44, 45, 46, 47 y 48; y modificaciones conservadoras de las mismas; y el anticuerpo exhibe una o más de las propiedades siguientes:

(c): se une específicamente a fucosil-GM1; y

En una realización preferida, la secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 19, 20, 21, 22, 23 y 24, y modificaciones conservadoras de las mismas; y la secuencia de CDR2 de la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 37, 38, 39, 40, 41 y 42, y modificaciones conservadoras de las mismas; En otra realización preferida, la secuencia de CDR1 de la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 13, 14, 15, 16, 17 y 18, y modificaciones conservadoras de las mismas; y la secuencia de CDR1 de la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 31, 32, 33, 34, 35 y 36, y modificaciones conservadoras de las mismas;

Como se usa en el presente documento, con la expresión “modificaciones conservadoras de la secuencia” se pretende hacer referencia a modificaciones de aminoácidos que no afectan significativamente ni alteran las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Dichas modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos. Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo de la presente divulgación mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, tal como mutagénesis dirigida a sitio y mutagénesis mediada por PCR. Sustituciones conservadoras de aminoácidos son aquellas en las que el residuo de aminoácido está sustituido por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas beta (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la presente divulgación se pueden sustituir con otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales y el anticuerpo alterado se puede analizar para determinar la conservación de la función (es decir, las funciones indicadas en (c) y (d) anteriormente) usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

Anticuerpos que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos anti-fucosil-GM1 de la presente divulgación

En otra realización, la presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen al mismo epítopo sobre fucosil-GM1 que cualquiera de los anticuerpos monoclonales de la presente divulgación, en los que (a) la CDR1 de la región variable de cadena pesada comprende la SEC ID Nº 16; (b) la CDR2 de la región variable de la cadena pesada comprende la SEC ID Nº 22; (c) la CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprende la SEC ID Nº 28; (d) la CDR 1 de la región variable de la cadena ligera comprende la SEC ID Nº 34; (e) la CDR2 de la región variable de la cadena ligera comprende la SEC ID Nº 40; y (f) la CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprende la SEC ID Nº 46, (es decir, los anticuerpos que tienen la capacidad para competir de forma cruzada por la unión a fucosil-GM1 con cualquiera de dichos anticuerpos monoclonales de la presente divulgación). En realizaciones preferidas, el anticuerpo de referencia para los estudios de competición cruzada puede ser el anticuerpo monoclonal 7E4 (que tiene secuencias de VH y VL como se muestran en las SEC ID Nº 4 y 10, respectivamente). Dichos anticuerpos de competición cruzada se pueden identificar en base a su capacidad para competir de forma cruzada con 7E4 en ensayos de unión a fucosil-GM1 estándar. Para ejemplos, se pueden usar análisis BIAcore y ensayos ELISA o citometría de flujo para demostrar competición cruzada con los anticuerpos de la presente divulgación. La capacidad de un anticuerpo de ensayo para inhibir la unión de, por ejemplo, 7E4, a fucosil-GM1 demuestra que el anticuerpo de ensayo puede competir con 7E4 por la unión a fucosil-GM1 y, por tanto, se une al mismo epítopo sobre fucosil-GM1 que 7E4. En una realización preferida, el anticuerpo que se une al mismo epítopo sobre fucosil-GM1 que 7E4 es un anticuerpo monoclonal humano. Dichos anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar y aislar como se describe en los Ejemplos.

Anticuerpos sometidos a ingeniería y modificados

Un anticuerpo de la presente divulgación se pueden preparar además usando un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias VH y/o VL divulgadas en el presente documento como materiales de partida para someter a ingeniería a un anticuerpo modificado, en el que el anticuerpo modificado puede tener propiedades del anticuerpo de partida. Un anticuerpo se puede someter a ingeniería modificando uno o más residuos en una o las dos regiones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo en una o más regiones CDR y/o en una o más regiones marco. Adicionalmente o alternativamente, un anticuerpo se puede someter a ingeniería modificando los residuos en las regiones constantes, por ejemplo, para alterar el efecto o la(s) funciones del anticuerpo.

Un tipo de región variable sometido a ingeniería que se puede realizar es el injerto de CDR. Los anticuerpos interaccionan con antígenos diana predominantemente a través de residuos de aminoácidos que se localizan en las seis regiones de complementariedad (CDR) de las cadena pesada y la ligera. Por este motivo, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Dado que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que simulen las propiedades de los anticuerpos específicos naturales construyendo vectores de expresión que incluyan secuencias CDR del anticuerpo natural específico introducido en las secuencias estructurales de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véase, por ejemplo, Riechmann, L. y col., (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. y col. (1986) Nature 321: 522-525; Queen, Cy col. (1989) Proc. Natl. Acad See. U.S.A. 86: 10029-10033; patente de EE.UU. nº 5,225,539 de Winter, y las patentes de EE.UU. nº 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 de Queen y col.)

De acuerdo con esto, otra realización la presente divulgación atañe a un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 13, 14, 15, 16, 17 y 18, las SEC ID Nº 19, 20, 21, 22, 23 y 24 y las SEC ID Nº 25, 26, 27, 28, 29 y 30, respectivamente, y un región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de CDR, CDR2 y CDR2 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 31, 32, 33, 34, 35 y 36, las SEC ID Nº 37, 38, 39, 40, 41 y 42 y las SEC ID Nº 43, 44, 45, 46, 47 y 48, respectivamente. Por tanto, dichos anticuerpos contienen las secuencias CDR de VH y VL de los anticuerpos monoclonales 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 o 18D5, aunque pueden contener diferentes secuencias de marco de estos anticuerpos.

Dichas secuencias estructurales se puede obtener de bases de datos de ADN públicos o referencias publicadas que incluye las secuencias génicas de anticuerpo germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal para los genes de la región variable de la cadena pesada y ligera humana se pueden encontrar en la base de datos de la secuencia de la línea germinal humana "VBase" (disponible en Internet at www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase), así como en Kabat, E. A., y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publicación Nº 91-3242); Tomlinson, I. M., y col. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227: 776-798; y Cox, J. P. L. y col. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24: 827-836, los contenidos de cada uno de las cuales se incorporan expresamente en el presente documento por referencia. Como otro ejemplo, las secuencias de ADN dé la línea germinal para los genes de la región variable de las cadenas pesada y ligera humanas se pueden encontrar en la base de datos de Genbank. Por ejemplo, las siguientes secuencias de la línea germinal de la cadena pesada encontradas en el ratón HuMAb de HCo7 están disponibles en los números de acceso en Genbank adjuntos: 1-69 (NG_0010109, NT_ 024637 y BC070333), 3-33 (NG_0010109 y NT_024637) y 3-7 (NG_0010109 y NT_024637). Como otro ejemplo, las siguientes secuencias de la línea germinal de la cadena pesada encontradas en el ratón HuMAb de HCo12 están disponibles en los números de accieso en Genbank adjuntos: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 and BC070333), 5-51 (NG_0010109 y NT_ 024637), 4-34 (NG_0010109 y NT_024637), 3-30.3 (?) y 3-23 (AJ406678).

Secuencias marco preferidas para usar en los anticuerpos de la presente divulgación son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias marco usadas por anticuerpos determinados de la presente divulgación, por ejemplo similares a las secuencias marco 3-48 de VH (SEC ID Nº 61) y/o a las secuencias marco VK L15 (SEC ID Nº 62) usadas por los anticuerpos monoclonales preferidos de la presente divulgación. Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de VH y las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de VK se pueden injertar en las regiones marco que tienen la secuencia idéntica a la encontrada en el gen de inmunoglobulina de la línea germinar a partir del cual procede la secuencia marco o las secuencias CDR se pueden injertar en las regiones marco que contienen una o más mutaciones en comparación con las secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, se ha descubierto que, en ciertos casos, es beneficioso mutar residuos dentro de las regiones marco para mantener o potenciar la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 de Queen y col.)

Otro tipo de modificación en la región variable es mutar los residuos de aminoácidos en las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 de VH y/o VK para mejorar de este modo una o más de las proteínas de unión (p. ej., afinidad) del anticuerpo de interés. Se puede realizar mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis mediada por PCR para introducir la(s) mutación(es) y el efecto sobre la unión al anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés) se puede evaluar en ensayos in vivo o in vitro como se describe en el presente documento y se proporciona en los Ejemplos.

Preferentemente se introducen modificaciones conservadoras (como se ha tratado anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos, pero preferentemente son sustituciones. Además, normalmente no se alteran más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos en una región de CDR.

De acuerdo con esto, en otro realización, la presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales aislados anti-fucosil-GM1, o porciones de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variables de la cadena pesada, que comprende: (a) una CDR1 de la VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 13, 14, 15, 16, 17 y 18, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con las SEC ID Nº 13, 14, 15, 16, 17 y 18; (b) una región CDR2 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 19, 20, 21, 22, 23 y 24, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con las SEC ID Nº 19, 20, 21, 22, 23 y 24; (c) una región CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 25, 26, 27, 28, 29 y 30, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con las SEC ID Nº 25, 26, 27, 28, 29 y 30; (d) una región CDR1 de VK que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 31, 32, 33, 34, 35 y 36, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con las SEC ID Nº 31, 32, 33, 34, 35 y 36; (e) una región CDR2 de VK que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 37, 38, 39, 40, 41 y 42, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, cuatro o cinco sustituciones, deleciones

o adiciones de aminoácidos, en comparación con las SEC ID Nº 37, 38, 39, 40, 41 y 42; y (f) una región CDR3 de VK que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 43, 44, 45, 46, 47 y 48, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con las SEC ID Nº 43, 44, 45, 46, 47 y 48.

Los anticuerpos sometidos a ingeniería de la presente divulgación incluyen aquellos en los que se han realizado modificaciones en los residuos marco dentro de VH y/o VK para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente, dichas modificaciones en marco se realizan para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque es la “retromutación” de uno o más residuos marco en la correspondiente secuencia de la línea germinal. Más específicamente, un anticuerpo que se ha sometido a mutación somática puede contener residuos marco que difieren de la secuencia de la línea germinal a partir de la que deriva el anticuerpo. Dichos residuos se pueden identificar comparando las secuencias marco del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal a partir de la que deriva el anticuerpo.

Por ejemplo, para 7E4, el residuo aminoacídico nº 11 (en FR1) de VH es una serina, mientras que este residuo en la correspondiente secuencia de la línea germinal VH 3-48 es una leucina. Para devolver las secuencias de la región marco a su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas se pueden “retromutar” en la secuencia de la línea germinal, por ejemplo mediante mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis mediada por PCR (p. ej., el residuo 11 de FR1 de la VH de 7E4 se puede “retromutar” desde serina a leucina).

Como otro ejemplo, para 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5, el residuo aminoacídico nº 16 (en FR1) de VH es un ácido glutámico, mientras que este residuo en la correspondiente secuencia de la línea germinal VH 3-48 es una glicina. Para devolver las secuencias de la región marco a su configuración de la línea germinal, por ejemplo, el residuo nº 16 de 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5 se puede “retromutar” desde ácido glutámico a glicina. Dichos anticuerpos “retromutados” también están destinados a estar dentro de la presente divulgación.

Como otro ejemplo, para 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5, el residuo aminoacídico nº 23 (en FR1) de VH es una valina, mientras que este residuo en la correspondiente secuencia de la línea germinal VH 3-48 es una alanina. Para devolver las secuencias de la región marco a su configuración de la línea germinal, por ejemplo, el residuo nº 23 de 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5 se puede “retromutar” desde valina a alanina. Dichos anticuerpos “retromutados” también están destinados a estar dentro de la presente divulgación.

Por ejemplo, para 7D4, el residuo aminoacídico nº 24 (en FR1) de VH es una valina, mientras que este residuo en la correspondiente secuencia de la línea germinal VH 3-48 es una alanina. Para devolver las secuencias de la región marco a su configuración de la línea germinal, por ejemplo, el residuo nº 24 de 7D4 se puede “retromutar” desde valina a alanina. Dichos anticuerpos “retromutados” también están destinados a estar dentro de la presente divulgación.

Como otro ejemplo, para 13B8, , el residuo aminoacídico nº 29 (en FR1) de VH es una leucina, mientras que este residuo en la correspondiente secuencia de la línea germinal VH 3-48 es una fenilalanina. Para devolver las secuencias de la región marco a su configuración de la línea germinal, por ejemplo, el residuo nº 29 de 13B8 se puede “retromutar” desde leucina a fenilalanina. Dichos anticuerpos “retromutados” también están destinados a estar dentro de la presente divulgación.

Como otro ejemplo, para 7D4,13B8 y 18D5 el residuo aminoacídico nº 48 (en FR1) de VH es una isoleucina, mientras que este residuo en la correspondiente secuencia de la línea germinal VH 3-48 es una valina. Para devolver las secuencias de la región marco a su configuración de la línea germinal, por ejemplo, el residuo nº 48, (el residuo nº 13 (en FR2) de la VH de 7D4, 13B8 y 18D5 se puede “retromutar” desde isoleucina a valina. Dichos anticuerpos

“retromutados” también están destinados a estar dentro de la presente divulgación.

Como otro ejemplo, para 7D4 y 18D5, el residuo aminoacídico nº 84 (en FR3) de VH es una serina, mientras que este residuo en la correspondiente secuencia de la línea germinal VH 3-48 es una asparagina. Para devolver las secuencias de la región marco a su configuración de la línea germinal, por ejemplo, el residuo nº 84, (el residuo nº 18 en FR3) de la VH de 7D4 y 18D5 se puede “retromutar” desde serina a asparagina. Dichos anticuerpos “retromutados” también están destinados a estar dentro de la presente divulgación.

Otro tipo de modificación en el marco implica mutar uno o más residuos dentro de la región marco, o incluso en una

o más regiones CDR, para eliminar los epítopos de las células T para reducir de este modo la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este enfoque también se denomina “desinmunización" y se describe con mayor detalle en la publicación de patente de EE.UU. nº 20030153043 de Carr y col.

Además o de forma alternativa a las modificaciones realizadas dentro del marco o las regiones CDR, los anticuerpos de la presente divulgación se pueden someter a ingeniería para incluir modificaciones dentro de la región Fc, normalmente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, como la semivida en suero, la fijación del complemento, la unión al receptor Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Además, un anticuerpo de la presente divulgación puede modificarse químicamente (p. ej., se pueden unir uno o más restos químicos al anticuerpo) o puede modificarse para alterar su glicosilación, de nuevo para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con más detalle a continuación. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice de UE de Kabat.

En una realización, la región bisagra de CH1 se modifica de tal modo que el número de residuos de cisteína en la región bisagra se altera, por ejemplo se incrementa o se disminuye. Este enfoque se describe adicionalmente en la patente de EE.UU. nº 5.677.425 de Bodmer y col. El número de residuos de cisteína en la región bisagra de CH1 se altera para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada o para incrementar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otra realización, la región bisagra de Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, una o más mutaciones de aminoácidos se introducen en la región interfaz del dominio de CH2-CH3 del fragmento bisagra-Fc de modo que el anticuerpo tienen una unión a la proteína A de estafilococos (SpA) alterada respecto a la unión a Spa del dominio bisagra-Fc nativo. Este enfoque se describe con mayor detalle en la patente de EE.UU. nº 6.165.745 de Ward y col.

En otra realización, el anticuerpo se modifica para incrementar su semivida biológica. Son posibles varios enfoques. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las mutaciones siguientes: T252L, T254S, T256F, como se describe en la patente de EE.UU. nº 6,277,375 de Ward. Como alternativa, para incrementar la semivida biológica, el anticuerpo se puede alterar en la región CH1 o CL para contener un epítopo de unión al receptor salvaje tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las patentes de EE.UU. nº 5,869,046 y 6,121,022 de Presta y col.

En otras realizaciones más, la región Fc de se altera sustituyendo al menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente para alterar la(s) función(es) efectora(s) del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 se pueden sustituir con un residuo de aminoácido diferente de modo que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector pero conserve la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo parental. El ligando efector por el que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente C1 del complemento. Este enfoque se describe con más detalle en las patentes de EE.UU. nº 5,624,821 y 5,648,260, ambas de Winter y col.

En otro ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos 329, 331, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 se pueden sustituir con un residuo de aminoácido diferente de modo que el anticuerpo tenga alterada la unión a C1q y/o reducida o anulada la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Este enfoque se describe con más detalle en las patentes de EE.UU. nº 6.194.551; de Idusogie y col.

En otro ejemplo, uno o más aminoácidos en las posiciones de aminoácidos 231 y 239 se alteran de modo que se altera la capacidad del anticuerpo para unirse al complemento. Este enfoque se describe adicionalmente en la publicación de PCR WO 94/29351 de Bodmer y col.

En otro ejemplo más, la región Fc se modifica para incrementa la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o incrementar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy modificando uno o más aminoácidos en las posiciones siguientes: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Este enfoque se describe con más detalle en la publicación PCT WO 00/42072 de Presta. Además, los sitios de unión en IgG1 humana por FcyR1, FcyRII, FcyRIII y FcRn se han mapeado y se han descrito variantes con mejor unión (Véase, Shields, R.L. y col. (2001) J. Biol. Chem. 276: 6591-6604). Se demostró que mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 mejoraban la unión a FcyRIII. Adicionalmente, se demostró que las siguientes combinaciones de mutantes mejoraban la unión a

FcyRIII. T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A.

En otra forma de realización más, la glicosilación de una anticuerpo se modifica. Por ejemplo, se puede realizar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación se puede alterar para, por ejemplo, incrementar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dichas modificaciones en el hidrato de carbono se pueden conseguir mediante, por ejemplo, alteración de uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden efectuar una o más sustituciones de aminoácidos que tengan como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación en la región marco para eliminar de este modo la glicosilación en dicho sitio. Dicha aglicosilación puede incrementar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dicho enfoque se describe con más detalle en las patentes de EE.UU. nº 5.714.350 y 6.350.861 de Co y col.

Adicionalmente o como alternativa, se puede fabricar un anticuerpo que tiene un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades mejores de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tiene mayores estructuras de GlcNac de bisección. Se ha demostrado que dichos patrones de glicosilación alterada incrementan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Dichas modificaciones en el hidrato de carbono se pueden conseguir mediante, por ejemplo, expresión del anticuerpo en una célula huésped con una maquinaria de glicosilación alterada. Las células con una maquinaria de glicosilación alterada se han descrito en la técnica y se pueden usar como células huésped en las que expresar anticuerpos recombinantes de la presente divulgación para producir, de este modo, un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, las líneas celulares Ms704, Ms705, y Ms709 carecen el gen de la fucosiltransferasa, FUT8 (alfa (1,6) fucosiltransferasa), de modo que los anticuerpos expresados en las líneas celulares Ms704, Ms705, y Ms709 carecen de mucosa en sus hidratos de carbono. Las líneas celulares FUT8-/- Ms704, Ms705 y Ms709 se crearon mediante alteración dirigida del gen de la FUT8 en células CHO/DG44 usando dos vectores de reemplazo (véase la publicación de patente de EE.UU. nº 20040110704 de Yamane y col. y Yamane-Ohnuki y col. (2004) Biotechnol Bioeng 87: 614-22). Como otro ejemplo, el documento EP 1,176,195 de Hanai y col. describe una línea celular con un gen de FUT8 alterado funcionalmente que codifica una fucosil transferasa, de modo tal que los anticuerpos expresados en dicha línea celular exhiben hipofucosilación reduciendo o eliminando la enzima relacionada con el enlace alfa-1,6. Hanai y col. también describen líneas celulares que tienen una actividad enzimática baja para añadir mucosa a la N-acetilglucosamina que se une a la región Fc del anticuerpo no tiene la actividad enzimática, por ejemplo la línea celular de mieloma de rata YB2/0 (ATCC CRL 1662). La publicación PCT WO 03/035835 de Presta describe una variante de la línea celular CHO, célula Lec13, con mejor capacidad para unir la mucosa a hidratos de carbono unidos a Asn(297), que también tiene como resultado la hipofucosilación de anticuerpos expresados en dicha célula huésped (véase también, Shields,

R.L. y col. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740). La publicación PCT WO 99/54342 de Umana y col. describe líneas celulares sometidos a ingeniería para expresar glicosiltransferasas de modificación de glicoproteína (p. ej., beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de modo que los anticuerpos expresados en las líneas celulares sometidos a ingeniería exhiban estructuras GlcNac de bisección que tiene como resultado una mayor actividad ADCC de los anticuerpos (véase también Umana y col. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-180). Como alternativa, los residuos de fucosa del anticuerpo se pueden escindir usando una enzima fucosidasa. Por ejemplo, la fucosidasa alfa-L-fucosidasa eliminar residuos de fucosilo de los anticuerpos (Tarentino, A.L. y col. (1975) Biochem.

14: 5516-23).

Otra modificación de los anticuerpos del presente documento que se contempla en la presente divulgación es la pegilación. Un anticuerpo se puede pegilar para, por ejemplo, incrementar la semivida biológica (p. ej., en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, normalmente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), como un éster reactivo o derivado aldehído de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se unen al anticuerpo o al fragmento de anticuerpo. Preferentemente, la pegilación se lleva a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula PEG reactiva (o un polímero hidrosoluble reactivo análogo). Como se usa en el presente documento, el término “polietilenglicol" está destinado a abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivar otras proteínas, tal como mono (C1-C10) alcoxi o ariloxi-polietilengicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas realizaciones, el anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo aglicosilado. En la técnica se conocen procedimientos para pegilar proteínas y se pueden aplicar a los anticuerpos de la presente divulgación. Por ejemplo, véase el documento EP 0 154 316 de Nishimura y col. y el documento EP 0 401 384 de Ishikawa y col.

Procedimientos de producción de anticuerpos mediante ingeniería

Como se ha comentado anteriormente, los anticuerpos anti-fucosil-GM1 que tienen secuencias de VH y VK divulgadas en el presente documento se pueden usar para crear nuevos anticuerpos anti-fucosil-GM1 modificando las secuencias de VH y VK o la(s) región(es) constante(s) unidas a las mismas. Por tanto, en otro aspecto de la presente divulgación, las características estructurales de un anticuerpo anti-fucosil-GM1 de la presente divulgación, por ejemplo 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 o 18D5, se usan para crear anticuerpos anti-fucosil-GM1 relacionados estructuralmente que conservan al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la presente divulgación, tal como la unión a fucosil-GM1. Por ejemplo, una o más regiones CDR de 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 o 18D5, o mutaciones de las mismas, se pueden combinar de forma recombinante con regiones marco conocidas y/o las otras CDR para crear otros anticuerpos anti-fucosil-GM1 sometidos a ingeniería recombinante de la presente divulgación, como se ha tratado anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen las descritas en la sección anterior. El material de partida para el procedimiento de ingeniería es una o más de las secuencias VH y/o VK proporcionadas en el presente documento o una o más regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo sometido a ingeniería no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como o proteína) un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias VH y/o VK proporcionadas en el presente documento o una o más regiones CDR de las mismas. En su lugar, la información contenida en la(s) secuencias se usa como material de partida para crear una(s) secuencias de

5 “segunda generación” derivadas de la(s) secuencias originales y, después, se preparan las secuencias de de “segunda generación” y se expresan como proteína.

De acuerdo con esto, en otra forma de realización la presente divulgación proporciona un procedimiento para preparar un anticuerpo anti-fucosil-GM1 que comprende:

(a) proporcionar: (i) una secuencia de anticuerpo de la región variable de cadena pesada que comprende una

10 secuencia de CDR1 seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 13, 14, 15, 16, 17 y 18, una región CDR2 seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 19, 20, 21, 22, 23 y 24, y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 25, 26, 27, 28, 29 y 30; y/o (ii) una secuencia de anticuerpo de la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de CDR1 seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 31, 32, 33, 34, 35 y 36, una región CDR2 seleccionada del grupo

15 constituido por las SEC ID Nº 37, 38, 39, 40, 41 y 42, y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 43, 44, 45, 46, 47 y 48;

(b) alterar al menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de la región variable de la cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de la región variable de la cadena ligera para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y

20 (c) expresar la secuencia alterada del anticuerpo como una proteína,

Se pueden usar técnicas de biología molecular estándar para preparar y expresar la secuencia alterada del anticuerpo.

Preferentemente, el anticuerpo codificado por la(s) secuencia(s) alterada(s) del anticuerpo es uno que conserve algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-fucosil-GM1 descritos en el presente

25 documento, en el que las propiedades funcionales incluyen, entre otros,

(a): el anticuerpo se une a fucosil-GM1 con una KD de 1 x 10-7 M o menor.

Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados se pueden evaluar usando ensayos estándar disponibles

30 en la técnica y/o descritos en el presente documento, como los indicados en los Ejemplos (p. ej., citometría de flujo, ensayos de unión).

En ciertas realizaciones de los procedimientos de anticuerpos sometidos a ingeniería de la presente divulgación se pueden introducir mutaciones de forma aleatoria o selectiva junto con toda o parte de una secuencia de codificación del anticuerpo anti-fucosil-GM1 y los anticuerpos anti-fucosil-GM1 modificados resultantes se pueden someter a 35 detección selectiva de la actividad de unión y/u otras propiedades funcionales como se describe en el presente documento. En la técnica se describen procedimientos de mutaciones. Por ejemplo, la publicación PCT WO 02/092780 de Short describe procedimientos para crear y seleccionar mutaciones de anticuerpos usando mutagénesis de saturación, unión por engarce sintético o una combinación de ambos. Como alternativa, la publicación de PCT WO 03/074679 de Lazar y col. describe procedimientos de uso de procedimientos de detección

40 selectiva por ordenador para optimizar las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos.

Moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la presente divulgación

Otro aspecto de la presente divulgación atañe a moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la presente divulgación. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular, o en forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico se “aísla” o se “convierte en 45 sustancialmente puro” cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas estándar, incluido tratamiento alcalino/SDA, bandas con CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros bien conocidos en la técnica. Véase F. Ausubel, y col., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Un ácido nucleico de la presente divulgación puede ser, por ejemplo, ADN o ARN y pueden o no contener

50 secuencias intrónicas. En una forma de realización preferida, este ácido nucleico es una molécula de ADNc.

Los ácidos nucleicos de la presente divulgación se pueden obtener usando técnicas convencionales de biología molecular. Para los anticuerpos expresados por hibridomas (p. ej., hibridomas preparados a partir de ratones transgénicos que portan genes de inmunoglobulina como se describe más adelante), los ADNc que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo preparado por el hibridoma se pueden obtener mediante técnicas estándar 55 de amplificación por PCR o de clonación de ADNc. Para los anticuerpos obtenidos de una biblioteca de genes de inmunoglobulina (p. ej,. usar técnicas de expresión en fago), el ácido nucleico que codifica el anticuerpo se puede

recuperar de la biblioteca.

Las moléculas de ácidos nucleicos preferidos de la presente divulgación son aquellos que codifican las secuencias VH y VL de los anticuerpos monoclonales 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 o 3C4. Las secuencias de ADN de las secuencias de VH de 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5 se muestran en las SEC ID Nº 49, 50, 51, 52, 53 y 54, respectivamente. Las secuencias de ADN de las secuencias de VL de 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5 se muestran en las SEC ID Nº 55, 56, 57, 58, 59 y 60, respectivamente.

Una vez que se han obtenido los fragmentos de ADN que codifica los segmentos de VH y VL, estos fragmentos de ADN se pueden manipular adicionalmente mediante técnicas estándar de ADN recombinante, por ejemplo para convertir los genes de la región variable en genes de la cadena del anticuerpo de longitud completa, en genes del fragmento Fab o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH está unido operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un conector flexible. La expresión “unido operativamente”, como se usa en este contexto”, está destinada a significar que los dos fragmentos de ADN están unidos de un modo tal que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en el marco.

El ADN aislado que codifica la región VH se puede convertir en un gen de la cadena pesada de longitud completa mediante unión operativa del ADN que codifica la región VH en otra molécula de ADN que codifica las regiones constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de los genes de las regiones constantes de la cadena pesada se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Edición, U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, MD, NIH Publicación nº 913242) y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de la cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero, más preferentemente, es una región constante de IgG1 o IgG4. Para un gen de la cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica VH se puede unir operativamente a otra molécula de ADN que codifica la región constante CH1 de la cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la región VL se puede convertir en un gen de la cadena ligera de longitud completa (así como el gen de la cadena ligera de Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica VL en otra molécula de ADN que codifica la región constante de la cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena ligera se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Edición, U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, MD, NIH Publicación nº 913242) y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de la cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, pero, más preferentemente, es una región constante kappa.

Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL están unidos de forma operativa a otro fragmento que codifica un ligador flexible, por ejemplo que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4 -Ser)3, de modo que las secuencias VH y VL se puedan expresar en forma de una proteína monocatenaria contigua, con las regiones VL y VH unidas mediante el ligador flexible (véase, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242: 423-426; Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty y col., (1990) Nature 348: 552-554).

Producción de anticuerpos monoclonales de la presente divulgación

Los anticuerpos monoclonales (mAb) de la presente divulgación se pueden producir mediante varias técnicas, incluida la metodología de anticuerpo monoclonal convencional, por ejemplo la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495. Aunque se prefieren los procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, se pueden usar otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo transformación viral u oncogénica de linfocitos B.

El sistema de animales preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión se conocen en la técnica. Las parejas de fusión (p. ej., células de mieloma murino) y los procedimientos de fusión también se conocen.

En una forma de realización preferida, los anticuerpos de la presente divulgación son anticuerpos monoclonales. Dichos anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra fucosil-GM1 se pueden generar usando ratones transgénicos o transcromosómicos portadores de partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos o transcromosómicos incluyen ratones denominados en el presente documento ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y en el presente documento se denominan de forma colectiva “ratones Ig humana”.

El ratón HuMAb ® (Medarex, Inc.) contiene miniloci del gen de la inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina de las cadenas pesada y ligera K (P y y) humanas desorganizadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci de las cadenas P y K endógenas (véase, por ejemplo, Lonberg, y col. (1994) Nature 368(6474): 856-859). De acuerdo con esto, los ratones exhiben menor expresión de IgM o K y en respuesta a la inmunización, los transgenes de la cadena pesada y ligera humanas sufren desplazamiento de clase y mutación

somática para generar anticuerpos monoclonales IgG K humana de alta afinidad. (1994) ant., revisado en Lonberg,

N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology Vol. 113: 49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764: 536-546). La preparación y uso de ratones HuMab y las modificaciones genómicas portadas por dichos ratones se describe adicionalmente en Taylor, L. y col. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. y col. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3720-3724; Choi y col. (1993) Nature Genetics 4: 117123; Chen, J. y col. (1993) EMBO J., 12: 821-830; Tuaillon y col. (1994) J. Immunol., 152: 2912-2920; Taylor, L. y col. (1994) International Immunology 6: 579-591; y Fishwild, D. y col. (1996) Nature Biotechnology 14: 845, cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad. Véanse también las patentes de EE.UU. números 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; all de Lonberg y Kay; la patente de EE.UU. . 5,545,807 de Surani y col.; las publicaciones PCT Nº WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg y Kay; y la publicación PCT Nº WO 01/14424 de Korman y col.

En otra realización, los anticuerpos humanos de la presente divulgación se pueden producir usando un ratón portador de secuencias de inmunoglobulina humana o transgenes y transcromosomas, tales como un ratón portador de un transgen de la cadena pesada humana y un transcromosoma de la cadena ligera humana. Dichos ratones, denominados en el presente documento “ratones KM ™", se describen con detalle en la publicación PCT WO 02/43478 de Ishida y col.

Todavía más, sistemas de animales transgénicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y se puede usar para producir anticuerpos anti-fucosil-GM1 de la presente divulgación. Por ejemplo, se puede usar un sistema de animales transgénicos alternativo denominado el Xenomouse (Abgenix, Inc.); dichos ratones se describen en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 y 6,162,963 de Kucherlapati y col.

Además, sistemas de animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y se puede usar para producir anticuerpos anti-fucosil-GM1 de la presente divulgación. Por ejemplo se pueden usar ratones portadores de un transcromosoma de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana, denominados “ratones TC”, dichos ratones se describen en Tomizuka y col. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727. Además, en la técnica se han descrito vacas portadoras de transcromosomas de cadenas pesadas y ligeras humanas (Kuroiwa y col. (2002) Nature Biotechnology 20: 889-894) y se pueden usar para producir anticuerpos anti-fucosil-GM1 de la presente divulgación.

Los anticuerpos monoclonales humanos de la presente divulgación también se pueden preparar usando procedimientos de expresión en fagos para seleccionar bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Dichos procedimientos de expresión en fagos para aislar anticuerpos humanos se establecen en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. números 5,223,409; 5,403,484; y 5,571,698 de Ladner y col.; las patentes de EE.UU. números 5.427.908 y 5.580.717; de Dowwr y col., las patentes de EE.UU. números 5,969,108 and 6,172,197 de McCafferty y col.; y las patentes de EE.UU. números. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 y 6,593,081 de Griffiths y col.

Los anticuerpos monoclonales humanos de la presente divulgación también se pueden preparar usando ratones SCID en los que se han reconstituido las células inmunitarias humanas de modo que se pueda generar una respuesta de anticuerpos humanos tras inmunización. Dichos ratones se describen en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº 5,476,996 and 5,698,767 de Wilson y col.

Inmunización de ratones con Ig humana

Cuando se usan ratones con Ig humana para producir anticuerpos humanos de la presente divulgación, dichos ratones se pueden inmunizar con una preparación purificada o enriquecida de antígeno fucosil-GM1 y/o fucosil-GM1 recombinante o una proteína de fusión fucosil-GM1, como se describe en Lonberg, N. y col. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. y col. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 y la publicación PCT WO 98/24884 y WO 01/14424. Preferentemente, los ratones tenían 6-16 semanas de edad tras la primera infusión. Por ejemplo, se puede usar una preparación purificada o recombinante (5-50 µg) del antígeno fucosil-GM1 para inmunizar los ratones con Ig humana por vía intraperitoneal.

En el Ejemplo 1 más adelante se describen procedimientos detallados para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos frente a fucosil-GM1. La experiencia acumulada con varios antígenos ha demostrado que los ratones transgénicos responden cuando son inmunizados inicialmente por vía intraperitoneal (IP) con antígeno en adyuvante completo de Freund, seguido de inmunizaciones IP en semanas alternas (hasta un total de 6) con el antígeno en adyuvante incompleto de Freund. No obstante, también se ha encontrado que los adyuvantes distintos a los de Freund son eficaces. Además, se encuentra que las células enteras en ausencia de adyuvante son muy inmunogénicas. La respuesta inmunitaria se puede monitorizar durante el curso del protocolo de inmunización, obteniéndose las muestras de plasma mediante extracciones retroorbitales. El plasma se puede someter a detección selectiva mediante ELISA (como se ha descrito más adelante) y los ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina anti-fucosilGM1 humana se pueden usar para las fusiones. Los ratones recibieron refuerzos por vía intravenosa con el antígeno 3 días antes del sacrificio y de la extracción del bazo. Se espera que se tengan que

realizar 2-3 fusiones para cada inmunización. Normalmente se inmunizan entre 6 y 24 ratones para cada antígeno. Normalmente, se usan las cepas HCo7 y HCo12. Además, los transgenes HCo7 y HCo12 se pueden introducir en un único ratón que tienen dos transgenes de cadena pesada humanos diferentes (HCo7/HCo12). Como alternativa o adicionalmente se puede usar la cepa de ratones KM™, como se describe en el Ejemplo 1.

Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la presente divulgación

Para generar hibridomas productores de anticuerpos monoclonales humanos de la presente divulgación se pueden aislar los esplenocitos y/o las células de los ganglios linfáticos de ratones inmunizados y se pueden fusionar con una línea celular inmortalizada adecuada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes se pueden someter a detección selectiva para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Por ejemplo, las suspensiones celulares simples de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados se fusionaron con un sexto del número de P3X63-Ag8.653 células de mieloma de ratón no secretoras (A.T.C.C., CRL 1580) con el 50 % de PEG. Como alternativa, las suspensiones celulares simples de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados se pueden fusionar usando un procedimiento de elecrofusión basado en campo eléctrico, usando un electroporador de fusión celular en cámara grande Cyto Pulse (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD). Las células se siembran en placas a aproximadamente 2 x105 en placa de microtitulación de fondo plano, seguido de una incubación de una semana en medio DMEM rico en glucosa con L-glutamina y piruvato sódico (Mediatech, Inc., Herndon, VA) y que contiene además el 20 % de suero bovino fetal (Hyclone, Logan, UT), el 18 % de medio acondicionado P388DI, el 5 % de factor de clonación de Origen Hybridoma (BioVeris, Gaithersburg, VA), L-glutamina 4 mM, HEPES 5 mM, mercaptoetanol 0,055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina y medio 1X Hipoxantinaaminopterina-timidina (HAT) (Sigma; el HAT se añade 24 horas después de la fusión). Tras una semana, se cultivaron las células en medio en el que HAT se había sustituido por HT. Los pocillos individuales se pueden someter después a detección selectiva con ELISA para anticuerpos IgG e IgM monoclonales humanos. Una vez producido un crecimiento extenso del hibridoma, el medio normalmente se puede observar tras 10-14 días. Los hibridomas secretores de anticuerpos se pueden volver sembrar, a someter a detección selectiva y, si siguen siendo positivos para IgG humana, los anticuerpos monoclonales se pueden subclonan al menos dos veces mediante dilución límite. Los subclones estables se pueden cultivar después in vitro para generar cantidades pequeñas de anticuerpo en medio de cultivo tisular para caracterizar.

Para purificar los anticuerpos monoclonales humanos, los hibridomas seleccionados se pueden cultivar en matraces giratorios de dos litros para purificación de los anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografía de afinidad con sefarosa-proteína A (Pharmacia, Piscataway, N.J.). La IgG eluida se puede comprobar mediante electroforesis en gel y cromatografía de líquidos de alto rendimiento alto para garantizar la pureza. La solución tampón se puede intercambiar en PBS y la concentración se puede determinar mediante DO280 usando el coeficiente de extinción 1,43. Los anticuerpos monoclonales se pueden separar en partes alícuotas y almacenar a -80 ºC.

Generación de transfectomas que producen anticuerpos monoclonales de la presente divulgación

Los anticuerpos de la presente divulgación también se pueden producir en un transfectoma de la célula huésped usando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y procedimientos de transfección génica como se sabe bien en la técnica (p. ej., Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, los ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de longitud parcial o completa se pueden obtener mediante técnicas de biología molécula estándar (p. ej., amplificación con PCR o clonación de ADNc usando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interés) y los ADN se pueden insertar en vectores de expresión de modo que los genes están operablemente unidos a secuencias de control de la transcripción y la traducción. En este contexto, la expresión “unido de forma operativa” quiere decir que un gen del anticuerpo está ligado en un vector tal que las secuencias de control de la transcripción y la traducción dentro del vector sirven a la función prevista de regulación de la transcripción y la traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se escogen de modo que sean compatibles con la célula huésped usada para la expresión. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en un vector distintos o, más normalmente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante procedimientos estándar (p. ej., ligando sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y en el vector, o ligando los extremos romos si no hay sitios de restricción presentes). Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente memoria se pueden usar para crear genes de los anticuerpos de longitud completa de un isotipo de anticuerpo insertándolas en vectores de expresión que ya codifican las regiones constante de la cadena pesada y constantes de la cadena ligera del isotipo deseado, de modo que el segmento VH está operativamente unido al(los) segmento(s) CH dentro del vector y el segmento VK está unido operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicionalmente, o como alternativa, el vector de expresión recombinante también puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena del anticuerpo a partir de una célula huésped. El gen de la cadena del anticuerpo puede clonarse en el vector de modo que el péptido señal esté unido dentro del marco al extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no inmunoglobulínica).

Además de los genes de la cadena del anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la presente divulgación portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena del anticuerpo en una célula huésped. Con la expresión “secuencia reguladora” se pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (p. ej., señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de la cadena de anticuerpo. Dichas secuencias reguladoras se describen en, por ejemplo, Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluida la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se va a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Secuencias reguladoras preferidas para la expresión en células huésped de mamífero incluyen elementos víricos que dirigen niveles elevados de expresión proteica en células de mamífero, tal como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), virus 40 de simios (SV40), adenovirus (p. ej., el promotor tardío principal del adenovirus (AdMLP)), y polioma. Como alternativa, se pueden usar secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de ß-globina. Todavía más, los elementos reguladores compuestos por secuencias de fuentes diferentes, tal como el sistema promotor de SRa, que contiene las secuencias del promotor temprano de SV40 y la repetición terminal larga del virus de la leucemia de células T de tipo 1 (Takebe, Y. y col., (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 466-472).

Además de los genes de la cadena del anticuerpo y de las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la presente divulgación pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en las células huésped (p. ej., orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células huésped en las que se ha introducido el vector (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel y col.) Por ejemplo, normalmente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, a una célula huésped en la que el vector se ha introducido. Entre los genes marcadores seleccionables preferidos se incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para usar en células huésped dhfr- con selección con metotrexato/amplificación) y el gen neo (para la selección de G418).

Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, el(los) vector(es) de expresión que codifican las cadenas ligera y pesada se transfeccionan en una célula huésped mediante técnicas estándar. Las diversas formas del término “transfección” están destinadas a abarcar una amplia variedad de técnicas usadas habitualmente para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariota o eucariota, por ejemplo electroporación, precipitación con fosfato cálcico, transfección en DEAE-dextrano y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la presente divulgación en células huésped tanto procariotas como eucariotas, la expresión de anticuerpos en células eucariotas, y más preferentemente en células huésped de mamífero, es la más preferida porque es más probable que dichas células eucariotas, y en particular las células de mamífero, se ensamblen y secreten un anticuerpo inmunológicamente activo y adecuadamente plegado. Se ha notificado que la expresión procariótica de los genes de anticuerpos es ineficaz para la producción de altos rendimientos de anticuerpo activo (Boss, M. A. y Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6 12-13).

Células huésped de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la presente divulgación incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluidas las células dhfr-, CHO, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, usadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo tal como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. En concreto, para usar con las células de mieloma NSO, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión génica GS divulgado en los documentos WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338,841. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpo se introducen en células huésped de mamífero, los anticuerpos se producen mediante cultivo de las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que crecen las células huésped. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo usando procedimientos de purificación proteica estándar.

Caracterización de la unión del anticuerpo al antígeno

Los anticuerpos de la presente divulgación se pueden analizar según la unión a fucosil-GM1, por ejemplo ELISA estándar. Brevemente, las placas de microtitulación se revisten con fucosil-GM1 purificado a 0,25 !g/ml en PBS y después se bloquean con el 5 % se seroalbúmina bovina en PBS. Las diluciones del anticuerpo (p. ej., diluciones de plasma de ratones inmunizados con fucosil-GM1) se añaden a cada pocillo y se incuban durante 1-2 horas a 37 ºC. Las placas se lavan con PBS/Tween y después se incuban con un reactivo secundario (p. ej., para anticuerpos humanos, un reactivo policlonal específico de Fc de IgG anti-humana de cabra) conjugado con fosfatasa alcalina durante 1 hora a 37 ºC. Después de lavar, las placas se desarrollan con sustrato pNPP (1 mg/ml) y se analizan a una DO de 405-650. Preferentemente, los ratones que desarrollan los títulos más altos se usarán para las fusiones.

Para la detección selectiva de hibridomas que mostraron reactividad positiva con el inmunógeno fucosil-GMI se puede usar un ensayo ELISA como se ha descrito antes. Los hibridomas que se unen con avidez alta al fucosil-GM1 se subclonan y se caracterizan después. Un clon de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las células parentales (determinado por ELISA) se escogió para hacer un banco celular de 5-10 viales almacenados a -140 ºC para la purificación de los anticuerpos.

Para purificar los anticuerpos anti-fucosil-GM1, los hibridomas seleccionados se pueden cultivar en matraces giratorios de dos litros para purificación de los anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografía de afinidad con sefarosa-proteína A (Pharmacia, Piscataway, N.J.). La IgG eluida se puede comprobar mediante electroforesis en gel y cromatografía de líquidos de alto rendimiento alto para garantizar la pureza. La solución tampón se puede intercambiar en PBS y la concentración se puede determinar mediante DO280 usando el coeficiente de extinción 1,43. Los anticuerpos monoclonales se pueden separar en partes alícuotas y almacenar a -80 ºC.

Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-fucosil-GM1 seleccionados se unen a epítopos únicos, cada anticuerpo se puede biotinilar usando reactivos disponibles comercialmente (Pierce, Rockford, IL). Se pueden realizar estudios de competición usando anticuerpos monoclonales sin marcar y anticuerpos monoclonales biotinilados usando placas de ELISA revestidas con fucosil-GM1 como se ha descrito anteriormente. La unión de mAb biotinilado se puede detectar con una sonda de fosfatasa alcalina-estreptavidina.

Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados se pueden realizar ELISAS de isotipo usando reactivos específicos de anticuerpos de un isotipo concreto. Por ejemplo, para determinar el isotipo de un anticuerpo monoclonal humano, los pocillos de las placas de microtitulación se pueden revestir con 1 µg/ml de la inmunoglobulina anti-humana durante la noche a 4 ºC. Después de bloquear con el 1 % de BSA, se hacen reaccionar las placas con 1 µg/ml o menos de los anticuerpos monoclonales o controles del isotipo purificados a temperatura ambiente durante de una a dos horas. Los pocillos se pueden hacer reaccionar después con sondas conjugadas con fosfatasa alcalina específica de IgM humana o de IgG1 humana. Las placas se desarrollan y analizan como se ha descrito en lo que antecede.

Adicionalmente se puede analizar la reactividad de las IgG humanas anti-fucosil-GM1 con el antígeno fucosil-GM1 mediante transferencia western. Brevemente, el fucosil-GM1 se puede preparar y someter a electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida. Tras la electroforesis, los antígenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, se bloquean con el 10 % de suero bovino fetal y se usan como sondas los anticuerpos monoclonales que se van a analizar. La unión de IgG humana se puede detectar usando fosfatasa alcalina con IgG anti-humana y se desarrollan con comprimidos de sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).

Inmunoconjugados

En otro aspecto, la presente divulgación caracteriza un anticuerpo anti-fucosil-GM1, o un fragmento de unión al mismo, conjugado con un resto terapéutico, tal como una citotoxina, un fármaco (p. ej., un inmunosupresor) o una radiotoxina. Dichos conjugados se denominan en el presente documento “inmunconjugados”. Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se denominan “inmunotoxinas”. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células (p. ej., las mata). Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihIdroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramIcina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y análogos u homólogos de los mismos. Agentes terapéuticos también incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (p. ej., metotrexato 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (p.ej., mecloretamina, tiotepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino(II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (p.ej., daunorubicina (antes daunomicina) y doxorubicina), antibióticos (p.ej., dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)), y agentes antimitóticos (p.ej., vincristina y vinblastina).

Otros ejemplos preferidos de citotoxinas terapéuticas que se pueden conjugar con un anticuerpo de la presente divulgación incluyen ducocarmicinas, calicheamicinas, maitansinas y auristatinas, y derivados de las mismas. Un ejemplo de conjugado del anticuerpo con calicheamicina está disponible comercialmente (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst). Ejemplos de citotoxinas terapéuticas se pueden encontrar en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 6548530 y 6281354 y las solicitudes de patente de EE.UU. Nº US 2003/0064984, US 2003/0073852 y US 2003/0050331.

Las citotoxinas se pueden conjugar con anticuerpos de la presente divulgación usando la tecnología de conectores disponible en la técnica. Ejemplos de tipos de conectores que se han usado para conjugar una citotoxina con un anticuerpo incluyen, entre otros, hidrazonas, tioéteres, ésteres, disulfuros y conectores que contienen péptidos. Se puede escoger un conector que sea, por ejemplo, susceptible a la escisión mediante pH bajo en el compartimento lisosomal o susceptible a la escisión con proteasas, tales como proteasas expresadas preferentemente en tejido tumoral tales como catepsinas (p. ej., catepsinas B. C, D).

Para una discusión adicional de los tipos de citotoxinas, conectores y procedimientos para conjugar agentes terapéuticos con los anticuerpos véase también, Saito, G. y col. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3: 207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2: 750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264.

Los anticuerpos de la presente divulgación también se pueden conjugar con un isótopo radioactivo para generar

productos radiofarmacéuticos citotóxicos, también denominados radioinmunoconjugados. Ejemplos de isótopos radioactivos que e pueden conjugar con anticuerpos para usar diagnóstica o terapéuticamente incluyen, entre otros, yodo131, indio111, ytrio90 y lutecio177 . En la técnica se establecen procedimientos para preparar radioinmunoconjugados. Ejemplos de radioinmunoconjugados están disponibles comercialmente, incluidos Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) y Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals) y se pueden usar procedimientos similares para preparar radioinmunoconjugados usando los anticuerpos de la presente divulgación.

Los conjugados de anticuerpos de la presente divulgación se pueden usar para modificar una respuesta biológica dada y el resto farmacológico no debe interpretarse como limitado a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto farmacológico puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o la toxina diftérica; una proteína tal como el factor de necrosis tumoral o el interferón -y; o modificadores de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, linfocinas, interleucina 1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulante de las colonias de granulocitos-macrófagos ("GM-CSF"), factor estimulante de las colonias de granulocitos("G-CSF"), u otros factores de crecimiento.

Las técnicas para conjugar estos restos terapéuticos con anticuerpos son bien conocidas, véase, por ejemplo, Amon y col., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld y col (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y col., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2ª Ed.), Robinson y col. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents en Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y col. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin y col. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe y col., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).

Anticuerpos biespecíficos

En otro aspecto, la presente divulgación caracteriza moléculas biespecíficas que comprenden un anticuerpo antifucosil-GM1, o un fragmento del mismo, de la presente divulgación. Un anticuerpo de la presente divulgación, o porciones de unión al antígeno del mismo, pueden derivar o unirse a otra molécula funcional, por ejemplo otro péptido o proteína (p. ej., otro anticuerpo o ligando de un receptor) para generar una molécula biespecífica que se une a al menos dos sitios de unión o moléculas diana diferentes. De hecho, el Un anticuerpo de la presente divulgación puede derivar de o unirse a más de una de otras moléculas funcionales para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión y/o moléculas diana diferentes; dichas moléculas multiespecíficas también están destinadas a entrar dentro de la expresión “molécula biespecífica”, como se usa en el presente documento. Para crear una molécula biespecífica de la presente divulgación, un anticuerpo de la presente divulgación puede estar funcionalmente unido (p. ej., mediante acoplamiento químico, fusión genéticas, asociación no covalente u otra cosa) a una o más moléculas de unión tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de modo que tienen como resultado una molécula biespecífica.

De acuerdo con esto, la presente divulgación incluye moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de unión por fucosil-GM1 y una segunda especificidad de unión por un segundo epítopo diana. En una realización concreta de la presente divulgación, el segundo epítopo diana es un receptor Fc, por ejemplo el receptor FcyRI (CD64) humano o un receptor Fca humano (CD89). Por tanto, la presente divulgación incluye moléculas inespecíficas capaces de unirse a células efectoras que expresan FcyR o FcaR (p. ej., monocitos, macrófagos o células polimorfonucleares (PMN) y a células diana que expresan fucosil-GM1. Estas Moléculas biespecíficas dirigen las células que expresan fucosil-GM1 a células efectoras y desencadenan actividades de las células efectoras mediadas por el receptor Fc, tal como fagocitosis de células que expresan fucosil-GM1, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), liberación de citocinas o generación del anión superóxido.

En una realización de la presente divulgación en la que la molécula biespecífica es multiespecífica, la molécula puede además incluir una tercera especificidad de unión, además de a una especificidad de unión anti-Fc y una especificidad de unión anti-fucosil-GM1. En una realización, la tercera especificidad de unión es un factor antipotenciación (FP), por ejemplo una molécula que se une a una proteína de superficie implicada en la actividad citotóxica y, de este modo, aumenta la respuesta inmunitaria contra la célula diana La “porción del factor antipotenciación” puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo funcional o un ligando que se une a una molécula dada, por ejemplo un antígeno o un receptor, y, de este modo, tiene como resultado una potenciación del efecto de los determinantes de unión para el receptor Fc o el antígeno de la célula diana. La “porción del factor antipotenciación” se puede unir a un receptor Fc o a un antígeno de la célula diana. Como alternativa, la porción del factor anti-potenciación se puede unir a una entidad que es diferente de la entidad a la que se unen las especificidades de unión primera y segunda. Por ejemplo, la porción del factor anti-potenciación se puede unir a una célula T citotóxica (p. ej., mediante CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra célula inmunitaria que tiene como resultado un incremento de la respuesta inmunitaria contra la célula diana).

En una realización, las moléculas biespecíficas de la presente divulgación comprenden como una especificidad de

unión al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, incluidos, por ejemplo, un Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, o Fv de cadena sencilla. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o de cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como un Fv o una construcción de cadena sencilla como se ha descrito en Ladner y col., la patente de EE.UU. nº 4,946,778, cuyos contenidos se incorporan expresamente por referencia.

En una realización, un anticuerpo monoclonal proporciona la especificidad de unión por un receptor Fcy cuya unión no es bloqueada por la inmunoglobulina G humana (IgG). Como se usa en el presente documento, la expresión “receptor de IgG” se refiere a cualquiera de los ocho genes de la cadena y localizados en el cromosoma 1. Estos genes codifican un total de doce isoformas del receptor transmembranales o solubles que se agrupan en tres clases del receptor Fcy: FcyRI (CD64), Fcy RII(CD32) y FcyRIII (CD16). En una realización preferida, el receptor Fcy es FcyRI humano de afinidad alta. El FcyRI humano es una molécula de 72 kDa, que muestra una afinidad alta por la IgG monomérica (108 - 109 M-1).

La producción y caracterización de ciertos anticuerpos monoclonales anti-Fcy se describen en Fanger y col., en la publicación PCT WO 88/00052 y en la patente de EE.UU. nº 4,954,617, cuyas enseñanzas se incorporan completamente por referencia en el presente documento. Estos anticuerpos se unen a un epítopo de FcyRI, FcyRII o FcyRIII en un sitio que es distinto del sitio de unión a Fcy del receptor y, por tanto, su unión no se bloquea sustancialmente con niveles fisiológicos de IgG. Los anticuerpos anti-FcyRI específicos útiles en la presente divulgación son mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. El hibridoma productor de mAb 32 está disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo, número de acceso en ATCC HB9469.

En otras realizaciones, El anticuerpo anti-receptor Fcy es una forma humanizada del anticuerpo monoclonal 22 (H22). La producción y caracterización del anticuerpo H22 se describe en Graziano, R.F. y col. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 y la publicación PCT WO 94/10332. La línea celular productora del anticuerpo H22 se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo con la designación HA022CL1 y tiene el nº de acceso CRL 11177.

En otras realizaciones preferidas más, la especificidad de unión por un receptor Fc es proporcionada por un anticuerpo que se une a un receptor de IgA humano, por ejemplo un receptor Fc-alfa (Fca RI (CD89)), cuya unión no es bloqueada preferentemente por la inmunoglobulina A humana (IgA). Con la expresión “receptor de IgA" se pretende inducir el producto génico de un gen a (Fca RI) localizado en el cromosoma 19. Se sabe que este gen codifica varias isoformas transmembranales sometidas alternativamente a corte y empalme de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89) se expresa de forma constitutiva en monocitos/macrófagos, granulocitos eosinófilos y neutrófilos, pero no sobre poblaciones de células no efectoras. FcaRI tiene una afinidad media (" 5 X 107 M-1) para IgA1 y para IgA2, que se aumenta tras la exposición a citocinas tales como G-CSF o GM-CSF (Morton, H.C. y col. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440). Se han descrito cuatro anticuerpos monoclonales específicos de FcaRI, identificados como A3, A59, A62 and A77, que se unen a FcaRI fuera del dominio de unión al ligando de IgA (Monteiro, R.C. y col. (1992) J. Immunol., 148: 1764).

FcaRI Y FcyRI son receptores desencadenantes preferidos para usar en las moléculas biespecíficas de la presente divulgación porque (1) se expresan principalmente en las células efectoras inmunitarias, por ejemplo monocitos, PMN, macrófagos y células dendríticas; (2) se expresan a niveles altos (p. ej., 5.000-100.000 por célula); (3) mediadores de actividades citotóxicas (p. ej., ADCC, fagocitosis); (4) median la presentación antigénica potenciada de antígenos, incluidos autoantígenos, dirigidos a ellos.

Aunque se prefieren los anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que se pueden usar en las moléculas biespecíficas de la presente divulgación son anticuerpos monoclonales murinos humanizados y quiméricos.

Las moléculas biespecíficas de la presente divulgación se pueden preparar conjugando las especificidades de unión constituyentes, por ejemplo las especificidades de unión anti-FcR y anti-fucosil-GM1 usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica se puede generar por separado y después conjugarse entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, para la conjugación covalente se pueden usar diversos agentes de acoplamiento o reticulación. Ejemplos de agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA), ácido 5,5’-ditiobis(2nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (dPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) y 4-(Nmaleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véase, por ejemplo, Karpovsky y col. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA y col., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648). Otros procedimientos incluyen los descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan y col. (1985) Science 229: 8183), y Glennie y col. (1987) J. Immunol., 139: 2367-2375). Agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles en Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, se pueden conjugar mediante enlaces sulfhidrilo de las regiones bisagra en el extremo C de las dos cadenas pesadas. En una realización particularmente preferida, la región bisagra se modifica para contener un número impar de residuos de sulfhidrilo, preferentemente uno, antes de la conjugación.

Como alternativa, ambas especificidades de unión se pueden codificar en el mismo vector y se expresan y ensamblan en la misma célula huésped. Este procedimiento es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab’)2 o ligando x proteína de fusión Fab. Una molécula biespecífica de la

presente divulgación puede ser una molécula de cadena sencilla que comprende un anticuerpo de cadena sencilla y un determinante de unión o una molécula biespecífica de cadena sencilla que comprende dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas de cadena sencilla. En, por ejemplo, la patente de EE.UU. número 5,260,203; la patente de EE.UU. número 5,455,030; la patente de EE.UU. número 4,881,175; la patente de EE.UU. número 5,132,405; la patente de EE.UU. número 5,091,513; la patente de EE.UU. número 5,476,786; la patente de EE.UU. número 5,013,653; la patente de EE.UU. número 5,258,498; y la patente de EE.UU. número 5,482,858 se describen procedimientos para preparar moléculas biespecíficas.

La unión de las moléculas biespecíficas a sus dianas específicas se puede confirmar mediante, por ejemplo, ensayo de inmunosorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), análisis FACS, bioensayos (p. ej., inhibición del crecimiento) o ensayo de transferencia de tipo Western. Cada uno de estos ensayos detecta, en general, la presencia de complejos proteína-anticuerpo de interés concreto empleando un reactivo marcado (p. ej., un anticuerpo) específico del complejo de interés. Por ejemplo, los complejos FcR-anticuerpo se pueden detectar usando, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo unido a enzima que reconoce y se une específicamente a los complejos anticuerpo-FcR. Como alternativa, los complejos se pueden detectar usando cualquiera de varios otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar radioactivamente y usar en un radioinmunoensayo (RIA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, que se incorpora en e presente documento por referencia). El isótopo radioactivo se puede detectar por medios tales como el uso de un contador y o un contador de centelleo o mediante autorradiografía.

Composiciones Farmacéuticas

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición, por ejemplo una composición farmacéutica que contiene uno o una combinación de anticuerpos monoclonales, o porción(es) de unión a antígeno de los mismos, de la presente divulgación, formulados junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden incluir uno o una combinación de anticuerpos (p. ej., dos o más diferentes) o inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la presente divulgación. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la presente divulgación puede comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados o biespecíficas) que se unen a diferentes epítopos sobre el antígeno diana o que tienen actividades de complementariedad.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación también se pueden administrar en terapia de combinación, es decir combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un anticuerpo anti-fucosil-GM1 de la presente divulgación combinado con al menos otro agente antiinflamatorio o inmunosupresor. Ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en terapia de combinación se describen con mayor detalle a continuación en la sección de usos de los anticuerpos de la presente divulgación.

Como se usa en el presente documento, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (p. ej., mediante inyección o infusión). En función de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, inmunoconjugado o molécula biespecífica, se puede recubrir con un material para proteger el compuesto de la acción de los ácidos y de otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Los compuestos farmacéuticos de la presente divulgación pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto parental y que no produce ningún efecto toxicológico indeseado (véase, por ejemplo, Berge, S.M., y col. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de bases. Las sales de adición de ácido incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso, y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos alifáticos mono y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos fenil-sustituidos. ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición de bases incluyen las derivadas de metales alcalino-térreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N’-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Una composición farmacéutica de la presente divulgación también pueden incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes hidrosolubles, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato sódico, metabisulfito sódico, sulfito sódico y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tal como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que se pueden usar en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos

inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones pueden también contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de los microorganismos se puede asegurar mediante procedimientos de esterilización, como anteriormente, y mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenes, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico y similares, en las composiciones. Además, una absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede efectuar mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y/o gelatina.

Vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto cuando alguno de los medios o agentes convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación. En las composiciones también pueden incorporarse compuestos activos suplementarios.

Normalmente, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular en forma de una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para la elevada concentración del fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede efectuar incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo sales de monoestearato y gelatina.

Se pueden preparar soluciones inyectables estériles mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente adecuado con uno o una combinación de ingredientes enumerados en lo que antecede, según se requiera, seguido por esterilización por microfiltración. En general, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados en lo que antecede. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación preferidos son secado al vacío y liofilización, que da un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución del mismo previamente filtrada para esterilizar.

La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con el material transportador para producir una única forma de dosificación variará en función del sujeto tratado, y el modo de administración concreto. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con el material transportador para producir una única forma de dosificación generalmente será la cantidad de la composición que produzca un efecto terapéutico. En general, de un cien por cien, esta cantidad variará de aproximadamente 0,01 por ciento a aproximadamente noventa y nueve por ciento del ingrediente activo, preferentemente de aproximadamente 0,1 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, más preferentemente de aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 30 por ciento del ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (p. ej., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, varias dosis divididas se pueden administrar en el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente tal como indican las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a unidades físicamente pequeñas adaptadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que se van a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el transportador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosificación de la presente divulgación está dictada y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico concreto que se debe conseguir y (b) de las limitaciones inherentes en la técnica de formar tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.

Para la administración del anticuerpo, la dosificación varía de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg y, más normalmente, de 0,01 a 5 mg/kg, del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o en el intervalo de 1-10 mg/kg. Un ejemplo de régimen de tratamiento implica la administración una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada de tres a 6 meses. Regímenes de dosificación preferidos para un

anticuerpo anti-fucosil-GM1 de la presente divulgación incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal mediante administración intravenosa, administrándose el anticuerpo usando uno de los regímenes de dosificación siguientes: (i) cada cuatro semanas para seis dosificaciones, después cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.

En algunos procedimientos, se administran de forma simultánea dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes afinidades de unión, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado entra dentro de los intervalos indicados. Normalmente, el anticuerpo se administra varias veces. Los intervalos entre dosificaciones únicas pueden ser, por ejemplo, semanales, mensuales, cada tres meses o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indica midiendo los niveles en sangre del anticuerpo frente al antígeno diana en el paciente. En algunos procedimientos, la dosificación se ajusta para alcanzar una concentración del anticuerpo en plasma de 1-1.000 !g/ml y en algunos procedimientos 25-300 !g/ml.

Como alternativa, el anticuerpo se puede administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosis y la frecuencia varían en función de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la semivida más prolongada, seguido de los anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. La dosis y la frecuencia de administración puede variar en función de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, una dosis relativamente baja se administra a intervalos relativamente infrecuentes en un periodo de tiempo largo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, en ocasiones se requiere una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduce o termina y, preferentemente, hasta que el paciente muestra mejora parcial o completa de los síntomas de enfermedad. Después, al paciente se le puede administrar un régimen profiláctico.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que es eficaz para alcanzar la respuesta terapéutica deseada para un paciente concreto, composición y modo de administración sin que sea tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de diversos factores farmacocinéticas, incluyendo, entre otros, la actividad del compuesto concreto de la presente divulgación usado, o el éster, la sal o la amida de las mismas, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción del compuesto concreto usado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones concretas usadas, la edad, el sexo, el peso, el estado de salud general y el historial médico previo del paciente que se esté tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

Una “dosificación terapéuticamente eficaz" de un anticuerpo anti-fucosil-GM1 de la presente divulgación tiene como resultado, preferentemente, una disminución de la gravedad de los síntomas de enfermedad, un incremento de la frecuencia y la duración de los periodos sin síntomas o una prevención de la alteración o discapacidad debido a la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de tumores, una “dosificación terapéuticamente eficaz" inhibe, preferentemente, el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en al menos aproximadamente el 20 %, más preferentemente en al menos aproximadamente el 40 %, incluso más preferentemente en al menos aproximadamente el 60 % y todavía más preferentemente en al menos aproximadamente el 80 % respecto a los sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral se puede evaluar en un sistema de modelo animal predictivo de la eficacia en tumores humanos. Como alternativa, esta propiedad de una composición se puede evaluar analizando la capacidad del compuesto para inhibir dicha inhibición in vitro mediante ensayos conocidos para el experto practicante. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor o, de otro modo, mejorar los síntomas en un sujeto. Un experto en la técnica sería capaz de determinar dichas cantidades basadas en factores tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto y la composición concreta o la vía de administración seleccionada.

Una composición de la presente divulgación se puede administrar mediante una o más vías de administración usando uno o más de diversos procedimientos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto en la técnica, la vía y/o el modo de administración variará según los resultados deseados. Las vías de administración preferidas para los anticuerpos de la presente divulgación incluyen las vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías parenterales, por ejemplo mediante inyección o infusión. La frase “administración parenteral” como se usan en el documento, significa modos de administración distintos a la administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección, e incluye, sin limitaciones, la inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal e infusión.

Como alternativa, un anticuerpo de la presente divulgación se puede administrar mediante una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo por vía intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.

Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protejan al compuesto frente a una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluidos implantes, parches transdérmicos y sistemas de liberación microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos procedimientos

para la preparación de dichas formulaciones están patentados o son generalmente conocidos para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Las composiciones terapéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización preferida, una composición terapéutica de la presente divulgación se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos divulgados en las patentes de EE.UU. nº 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; o 4,596,556. Ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente divulgación incluyen: la patente de EE.UU. nº 4,487,603, que divulga una bomba de microinfusión implantable para dispensar medicación a una velocidad controlada; la patente de EE.UU. nº 4,486,194, que divulga un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la patente de EE.UU. nº 4,447,233, que divulga una bomba de infusión de medicación para liberar medicación a una velocidad de infusión concreta; la patente de EE.UU. nº 4,447,224, que divulga un aparato de infusión implantable de flujo variable para la liberación continua del fármaco; la patente de EE.UU. nº 4,439,196, que divulga un sistema osmótico de liberación de fármaco que tiene compartimentos de múltiples cámaras; y la patente de EE.UU. nº 4,475,196, que divulga un sistema osmótico de liberación de fármaco.

Los expertos en la técnica conocen muchos otros implantes, sistemas de liberación y módulos.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos monoclonales humanos de la presente divulgación se pueden formular para garantizar una distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BHE) excluye muchos compuestos muy hidrófilos. Para garantizar que los compuestos terapéuticos de la presente divulgación atraviesan la BHE (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para los procedimientos de fabricación de liposomas, véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 4,522,811; 5,374,548; and 5,399,331. Los liposomas pueden comprender uno o más restos que se transportan de forma selectiva en células u órganos específicos, de modo que potencian la liberación dirigida del fármaco (véase, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Ejemplos de restos diana incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5,416,016 de Low y col.); manósidos (Umezawa y col., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticuerpos (P.G. Bloeman y col. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais y col. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); receptor de la proteína A de tensioactivo (Briscoe y col. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134); p120 (Schreier y col. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); véase también K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273.

Usos y procedimientos de la presente divulgación

Los anticuerpos, composiciones de anticuerpo y procedimientos de la presente divulgación tienen numerosas utilidades diagnósticas y terapéuticas in vitro e in vivo que implican el diagnostico y el tratamiento de trastornos mediados por fucosil-GM1. Por ejemplo, estas moléculas se pueden administrar a las células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo in vivo, para tratar, prevenir y diagnosticar varios trastornos. Como se usa en el presente documento, con el término “sujeto” se pretende incluir animales humanos o no humanos. Animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles. Sujetos preferidos incluyen pacientes humanos que tienen trastornos mediados por la actividad de fucosil-GM1 o que tienen trastornos que coinciden con una actividad mediada por fucosil-GM1. Los procedimientos son particularmente adecuados para tratar pacientes humanos que tienen un trastorno asociado con la expresión aberrante de fucosil-GM1 o incremento de la presencia de fucosil-GM1. Cuando los anticuerpos frente a fucosil-GM1 se administran junto con otro agente, los dos se pueden administrar en orden o de forma simultánea.

Dada la unión específica de los anticuerpos de la presente divulgación para fucosil-GM1, los anticuerpos de la presente divulgación se pueden usar para detectar específicamente expresión de fucosil-GM1 sobre la superficie de las células y, además, se puede usar para purificar fucosil-GM1 mediante purificación por inmunoafinidad.

La presente divulgación proporciona además procedimientos para detectar la presencia del antígeno fucosil-GM1 en una muestra o medir la cantidad del antígeno fucosil-GM1, que comprende poner en contacto la muestra y una muestra control con un anticuerpo monoclonal humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a antígeno fucosil-GM1, en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o la porción del mismo y fucosil-GM1. La formación de un complejo se detecta después, en el que una diferencia en la formación del complejo entre la muestra en comparación con la muestra control es indicativa de la presencia del antígeno fucosil-GM1 en la muestra.

Fucosil-GM1 se expresa en cáncer de pulmón microcítico, pero no se detecta en pulmones normales u otros tejidos (Nilsson y col. (1984) Glycoconjugate J 1: 43-9; Krug y col. (2004) Clin Cancer Res 10: 6094-100). Un anticuerpo anti-fucosil-GM1 se puede usar solo para inhibir el crecimiento de tumores cancerosos. Como alternativa, un anticuerpo anti-fucosil-GM1 se puede usar junto con otros agentes inmunogénicos, tratamientos estándar para el cáncer u otros anticuerpos, como se describe más adelante.

Se ha demostrado que los anticuerpos anti-fucosil-GM1 median en la potente CDC dirigida contra líneas celulares positivas para fucosil-GM1 (Livingston PO y col. (1994) J Clin Oncol.12: 1036-44; Brezicka y col. (2000) Cancer

Immunol Immunother 49: 235-42). Además, se ha comunicado que la activación del complemento inducida por anticuerpos monoclonales específicos de fucosil-GM1 en combinación con fármacos citostáticos tienen como resultado efectos citotóxicos sinérgicos sobre las líneas celulares que expresan fucosil-GM1 (Brezicka y Einbeigi (2001) Tumour Biol 22: 97-103). Por último, también se ha comunicado que los anticuerpos monoclonales antifucosil GM1 inhiben el injerto de células tumorales que expresan fucosil-GM1 en ratones atímicos (Brezicka y col. (1991) Int J Cancer 49: 911-8). Estos datos avalan el desarrollo de un anticuerpo monoclonal humano completamente frente a fucosil-GM1 como inmunoterapéutica para el tratamiento de SCLC solo o en combinación con agentes quimioterapéuticos.

Cánceres preferidos cuyo crecimiento se puede inhibir usando los anticuerpos de la presente divulgación incluyen los cánceres normalmente respondedores a inmunoterapia. Ejemplos no limitantes de cánceres preferidos para tratamiento incluyen cáncer de pulmón (incluido cáncer de pulmón microcítico y cáncer de pulmón amicrocítico). Ejemplos de otros cánceres que se pueden tratar usando los procedimientos de la presente divulgación incluyen cáncer de colon (incluido cáncer del intestino delgado), cáncer pulmón, cáncer de mama, cáncer de páncreas, melanoma (melanoma maligno metastásico), leucemia mieloide aguda, cáncer de riñón, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de ovarios y cáncer de próstata, cáncer renal (carcinoma de células renales), glioblastoma, tumores cerebrales, leucemias crónicas o agudas, incluida leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia de células T del adulto (T-LLA), leucemia mieloide crónica, leucemia linfobástica aguda, leucemia linfobástica crónica, linfomas (p. ej., linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, linfoma linfocítica, linfoma primario del SNC, linfoma de células T, linfoma de Burkitt, linfoma de células grandes anaplásico (ALCL), linfomas de células T cutáneos, linfomas de células hendidas pequeñas nodulares, linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfomas inmunoblásticos, linfomas/leucemia de células T (ATLL), cánceres de linfomas foliculares eritroblásticos/centrocíticos (cb/cc), linfomas de células grandes difusas de linaje B, linfoma de células T de tipo linfadenopatía angioinmunoblástica (AILD) y linfomas basados en la cavidad corporal asociados con el VIH), carcinomas embrionarios, carcinomas indiferenciados de la rinofaringe (p.ej., tumor de Schmincke), enfermedad de Castleman, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y otros linfomas de células B, carcinomas nasofaríngeos, cáncer de huesos, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, melanoma maligno cutáneo intraocular, cáncer de útero, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de testículos, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma de cérvix, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, tumores sólidos de la infancia, cáncer de la vejiga urinaria, cáncer del riñón o del uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco del encéfalo, adenoma hipofisario, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, cánceres inducidos por el ambiente, incluidos los inducidos por el asbestos, por ejemplo mesotelioma y combinaciones de dichos cánceres.

Además, dada la expresión de fucosil-GM1 sobre varias células tumorales, los anticuerpos humanos, composiciones de anticuerpos y procedimientos de la presente invención se pueden usar para tratar un sujeto con un trastorno tumorigénico, por ejemplo un trastorno caracterizado por la presencia de células tumorales que expresan fucosil-GM1 incluidos, por ejemplo, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón microcítico y cáncer de pulmón amicrocítico), cáncer de colon (incluido cáncer del intestino delgado), melanoma (p. ej., melanoma maligno metastático), leucemia mieloide aguda, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de ovarios y cáncer de próstata). Ejemplos de otros sujetos con un trastorno tumorigénico incluyen sujetos que tienen cáncer renal (carcinoma de células renales), cánceres que se pueden tratar usando los procedimientos de la presente divulgación incluyen cáncer de pulmón, incluido cáncer de pulmón microcítico y cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer renal (p. ej., carcinoma de células renales), glioblastoma, tumores cerebrales, leucemias crónicas o agudas, incluidas leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia de linfocitos T del adulto (LLA-T), leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfomas (p. ej., linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, linfoma linfocítica, linfoma primaria del SNC, linfoma de células T, linfoma de Burkitt, linfoma de células grandes anaplásico (ALCL), linfomas de células T cutáneos, linfomas de células hendidas pequeñas nodulares, linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfomas inmunoblásticos, linfomas/leucemia de células T (ATLL), cánceres de linfomas foliculares eritroblásticos/centrocíticos (cb/cc), linfomas de células grandes difusas de linaje B, linfoma de células T de tipo linfadenopatía angioinmunoblástica (AILD) y linfomas basados en la cavidad corporal asociados con el VIH), carcinomas embrionarios, carcinomas indiferenciados de la rinofaringe (p.ej., tumor de Schmincke), enfermedad de Castleman, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y otros linfomas de células B, carcinomas nasofaríngeos, cáncer de huesos, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, melanoma maligno cutáneo intraocular, cáncer de útero, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de testículos, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma de cérvix, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, tumores sólidos de la infancia, cáncer de la vejiga urinaria, cáncer del riñón o del uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco del encéfalo, adenoma hipofisario, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, cánceres inducidos por el ambiente, incluidos los inducidos por el asbestos, por ejemplo mesotelioma y combinaciones de dichos cánceres.

De acuerdo con esto, en una realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-Fucosil-GM1 humano (tal como cualquiera de los anticuerpo anti-Fucosil-GM1 humanos descritos en el presente documento, o una porción de unión a antígeno del mismo, para usar en un procedimiento de inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto.

En una realización, los anticuerpos (p. ej., anticuerpos monoclonales humanos, moléculas biespecíficas y multiespecíficas y composiciones) de la presente divulgación se pueden usar para detectar niveles de Fucosil-GM1 o niveles de células que contienen Fucosil-GM1 en la membrana de superficie, niveles que se pueden relacionar con ciertos síntomas de enfermedad. Como alternativa, los anticuerpos se pueden usar inhibir o bloquear la función de Fucosil-GM1 que, a su vez, pueden estar relacionados con la prevención o la mejora de síntomas de enfermedad, de modo que se implica al fucosil-GM1 como mediador de la enfermedad. Esto se puede conseguir poniendo en contacto una muestra experimental y una muestra control con el anticuerpo anti-fucosil-GM1 en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y fucosil-GM1. Cualquier complejo formado entre el anticuerpo y fucosil-GM1 se detecta y compara en la muestra experimental y el control.

En otra realización, los anticuerpos (p. ej., anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas y composiciones) de la presente divulgación se pueden analizar inicialmente por la actividad de unión asociada con el uso terapéutico o diagnóstico in vitro. Por ejemplo, las composiciones de la presente divulgación se pueden analizar usando ensayos de citometría de flujo descritos en los siguientes Ejemplos.

Los anticuerpos (p. ej., los anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas, inmunoconjugados y composiciones) de la presente divulgación tienen utilidad adicional en terapia y diagnóstico de enfermedades relacionadas con fucosil-GM1. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos, las moléculas multiespecíficas

o biespecíficas, y los inmunoconjugados se pueden usar para provocar in vivo o in vitro una o más de las siguientes actividades biológicas. inhibir el crecimiento y/o matar una célula que expresa fucosil-GM1; participar en la fagocitosis o la ADCC de una célula que expresa fucosil-GM1 en presencia de células efectoras humanas; o bloquear la unión del ligando de fucosil-GM1 a fucosil-GM1.

En una realización concreta, los anticuerpos (p. ej., anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas y composiciones) se usan in vivo para tratar o diagnosticar varias enfermedades relacionadas con fucosil-GM1. Ejemplos de enfermedades relacionadas con fucosil-GM1 incluyen, entre otras, cáncer de pulmón (incluidos cáncer de pulmón microcítico y cáncer de pulmón amicrocítico).

Vías de administración adecuadas de administración de las composiciones de anticuerpos (p. ej., anticuerpos monoclonales humanos, moléculas multiespecíficas o biespecíficas e inmunoconjugados) de la presente divulgación in vivo o in vitro son bien conocidas en la técnica y los expertos en la técnica las pueden seleccionar. Por ejemplo, composiciones de anticuerpos se pueden administrar mediante inyección (subcutánea o intravenosa). Las dosificaciones adecuadas de las moléculas usadas dependerán de la edad y el peso del sujeto y de la concentración y/o la formulación de la composición de anticuerpo.

Como se ha descrito anteriormente, los anticuerpos anti-fucosil-GM1 humanos de la presente divulgación se pueden administrar de forma conjunta con uno o más agentes terapéuticos, por ejemplo un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente inmunosupresor. El anticuerpo se puede unir al agente (como un inmunocomplejo) o se puede administrar por separado del agente. En el último caso (administración por separado), el anticuerpo se puede administrar antes, después o de forma concurrente con el agente o se puede administrar de forma conjunta con otras terapias conocidas, por ejemplo una terapia anticancerosa, por ejemplo radiación. Dichos agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos tales como doxorubicina (adriamicina), cisplatino, bleomicina sulfato, carmustina, clorambucilo y ciclofosfamida, hidroxiurea que, por sí mismos, son solo eficaces a niveles que son tóxicos o subtóxicos para un paciente. El cisplatino se administra por vía intravenosa como 100 mg/dosis una vez cada cuatro semanas y adriamicina se administra por vía intravenosa como una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. La administración conjunta de los anticuerpos anti-fucosil-GM1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente divulgación con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes anticancerosos que funcionan a través de diferentes mecanismos que dan un efecto citotóxico para las células tumorales humanas. Dicha administración conjunta puede resolver problemas debido al desarrollo de resistencia a fármacos o un cambio en la antigenicidad de las células tumorales que las convertirían en no reactivas con el anticuerpo.

En una realización, los inmunoconjugados de la presente divulgación se pueden usar para dirigir compuestos (p. ej., agentes terapéuticos, marcadores, citotoxinas, radiotoxinas inmunosupresores etc.) a células que tienen receptores de superficie de fucosil-GM1 uniendo dichos compuestos al anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo anti-fucosil-GM1 se pueden conjugar con cualquiera de los compuestos de toxina descritos en las patentes de EE.UU. nº 6,281,354 y6,548,530, la publicación de patente de EE.UU. Nº 20030050331, 20030064984, 20030073852 y 20040087497 o publicados en e documento WO 03/022806. Por tanto, la presente divulgación también proporciona procedimientos para localizar células ex vivo o in vivo que expresan fucosil-GM1 (p. ej., con un marcador detectable tal como un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático). Como alternativa, los inmunoconjugados se pueden usar para matar células que tienen receptores de superficie celular para fucosil-GM1 dirigiendo citotoxinas o radiotoxinas a fucosil-GM1.

Las células efectoras específicas de la diana, por ejemplo las células efectoras unidas a composiciones (por

ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la presente divulgación también se pueden usar como agentes terapéuticos. Las células efectoras para la diana pueden ser leucocitos humanos tales como macrófagos, neutrófilos o monocitos. Otras células incluyen eosinófilos, células asesinas naturales y otras células portadoras de receptores de IgG o IgA. Si se desea, las células efectoras se pueden obtener del sujeto que se va a tratar. Las células efectoras específicas de la diana se pueden administrar como una suspensión de células en una solución fisiológicamente aceptable. El número de células administradas puede ser del orden de 108-109, pero variará en función del fin terapéutico. En general, la cantidad será suficiente para obtener localización en la célula diana, por ejemplo una célula tumoral que expresa fucosil-GM1 y efectuar la muerte celular mediante, por ejemplo, fagocitosis. Las vías de administración también pueden variar.

La terapia con células efectoras específicas de la diana se puede realizar junto con otras técnicas para la eliminación de células a las que está dirigida. Por ejemplo, la terapia antitumoral usando las composiciones (p. ej., anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la presente divulgación y/o las células efectoras armadas con estas composiciones se pueden usar junto con quimioterapia. Adicionalmente, se puede usar inmunoterapia de combinación para dirigir dos poblaciones efectoras citotóxicas distintas hacia el rechazo de células tumorales. Por ejemplo, los anticuerpos anti-fucosil-GM1 unidos a anti-RI gamma-Fc o anti-CD3 se pueden usar junto con agentes de unión específicos de los receptores de IgG o IgA.

Las moléculas multiespecíficas y biespecíficas de la presente divulgación también se pueden usar para modular los niveles de FcyR o FcyR sobre las células efectoras, tal como mediante tapado y eliminación de los receptores sobre la superficie celular. Las mezclas de receptores anti-Fc se pueden usar para este fin.

Las composiciones (p. ej., anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) de la presente divulgación que tienen sitios de unión al complemento, tal como porciones de IgG1, -2 o -3 o IgM que se unen al complemento, también se pueden usar en presencia de complemento. En una realización, el tratamiento ex vivo de una población de células que comprende las células diana con un agente de unión de la presente divulgación y las células efectoras adecuadas se pueden suplementar mediante la adición del complemento o de suero que contiene complemento. La fagocitosis de células diana recubiertas con un agente de unión de la presente divulgación se puede mejorar uniendo las proteínas del complemento. En otra realización, las células diana recubiertas con las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la presente divulgación también se pueden lisar mediante el complemento. En otra forma de realización más, las composiciones de la presente divulgación no activan el complemento.

Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas, e inmunoconjugados) de la presente divulgación también se pueden administrar junto con el complemento. De acuerdo con esto, dentro del alcance de la presente divulgación se encuentran las composiciones que comprenden anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas o biespecíficas, y suero o complemento. Estas composiciones son ventajosas en cuanto a que el complemento se localiza en proximidad estrecha con los anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas o biespecíficas. Como alternativa, los anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas de la presente divulgación y el complemento o el suero se pueden administrar por separado.

De acuerdo con esto, los pacientes tratados con composiciones de anticuerpos de la presente divulgación pueden administrarse adicionalmente (antes o simultáneamente o tras la administración de un anticuerpo humano de la presente divulgación) con otro agente terapéutico, tal como un agente citotóxico o radiotóxico, que potencia o aumenta el efecto terapéutico de los anticuerpos humanos.

En otras realizaciones, el sujeto puede ser tratado adicionalmente con un agente que modula, por ejemplo potencia

o inhibe, la expresión o la actividad de los receptores Fcy o Fcy mediante, por ejemplo, tratamiento del sujeto con una citocina. Las citocinas preferidas para administración durante tratamientos con la molécula multiespecífica incluyen el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), el factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF), interferón -y (IFN-y) y el factor de necrosis tumoral (TNF).

Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas, e inmunoconjugados) de la presente divulgación también se pueden usar para dirigirlas a células que expresan FcyR o Fucosil-GM1, por ejemplo para marcar dichas células. Para este uso, el agente de unión se puede unir a una molécula que se puede detectar. Por tanto, la presente divulgación proporciona procedimientos para localizar células ex vivo o in vitro que expresan receptores de Fc, tal como FcyR o Fucosil-GM1. El marcador detectable puede ser, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático.

También dentro del alcance de la presente divulgación hay kits que comprenden las composiciones de anticuerpos de la presente divulgación (p. ej., anticuerpos humanos, moléculas biespecíficas o multiespecíficas, o inmunoconjugados) e instrucciones de uso. El kit puede además contener uno o más reactivos adicionales, tales como un agente inmunosupresor, un agente citotóxico o un agente radiotóxico, o uno o más anticuerpos adicionales de la presente divulgación (p. ej., un anticuerpo monoclonal que tiene actividad de complementariedad que se une a un epítopo en el antígeno de fucosil-GM1 distinto del primer anticuerpo humano). Los kits normalmente incluyen una etiqueta que indica el uso previsto de los contenidos del kit. El término etiqueta incluye cualquier material escrito o grabado que se suministra en o con el kit o que, de otro modo, está incluido en el kit.

La presente divulgación se ilustra adicionalmente mediante los ejemplos siguientes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales humanos contra fucosil-GM1

Antígeno

Protocolos De inmunización usados como fucosil-GM1 adsorbido en el antígeno de Salmonella minnesota (Northwest Biotherapeutics, Inc.).

Ratones HuMab y KM™ transgénicos

Se prepararon anticuerpos monoclonales completamente humanos usando las cepas HCo7, HCo12, HCo7+HCo12 de ratones transgénicos HuMab y la cepa KM de ratones transcromosómicos transgénicos, cada uno de los cuales expresan genes de anticuerpos humanos. En cada una de estas cepas de ratones, el gen endógeno de la cadena ligera kappa de ratón se ha alterado de forma homocigota como se describe en Chen et al. (1993) EMBO J., 12: (811 -820) y el gen endógeno de la cadena pesada de ratón se ha alterado de forma homocigota como se describe en el Ejemplo 1 de la publicación PCT nº WO 01/09187. Cada una de estas cepas de ratón porta un transgen de la cadena ligera kappa humana, KCo5, como se describe en Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. La cepa HCo7 porta el transgen de la cadena pesada humana de HCo7 como se describe en las Patentes de EE.UU. Nº 5, 770, 429; 5,545,806; 5,625,825; and 5,545,807. La cepa HCo12 porta el transgen de la cadena pesada humana de HCo12 como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 01/09187 o el ejemplo 2 del documento WO 01/14424. La cepa HCo7+HCo12 porta los transgenes de la cadena pesada de HCo7 y HCo12. La cepa KM contiene el transcromosoma SC20 como se describe en la publicación PCT WO 02/43478. Todas estas cepas se denominan en el presente documento ratones HuMAb.

Inmunizaciones de HuMab y KM

Para generar los anticuerpos monoclonales completamente humanos frente a fucosil-GM1, los ratones HuMab y los ratones KM fueron inmunizados con fucosil-GM1 adsorbido mediante liofilización en la superficie de Salmonella Minnesota tratada con ácido (Northwest Biotherapuetics, Inc.). Los esquemas de inmunización general para ratones HuMab se describen en Lonberg y col. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. y col. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 y la publicación PCT WO 98/24884. Los ratones tenían 6-16 semanas de edad tras la primera infusión del antígeno.

Las inmunizaciones de los ratones transgénicos se realizaron por vía intraperitoneal (IP) o subcutánea (SC) con antígeno en adyuvante completo de Freund, seguido de 2-4 semanas de inmunización IP (hasta un total de 8 inmunizaciones) con el antígeno en adyuvante incompleto de Freund. La respuesta inmunitaria se monitorizó mediante ELISA (que se describe más adelante) de los sueros obtenidos de extracciones de sangre retroorbital. Los ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-fucosil-GM1 se usaron para las fusiones. Los ratones recibieron refuerzos por vía intravenosa con el antígeno 3 y 4 días antes del sacrificio y de la extracción del bazo.

Selección de ratones HuMab o KM ™ productores de anticuerpos anti-fucosil-GM1:

Para seleccionar los ratones HuMab o KM productores de anticuerpos que se unieron a fucosil-GM1 se analizaron los sueros de ratones inmunizados mediante ELISA tal como describen Fishwild y col. (1996). Brevemente, el fucosil-GM1 natural purificado de líneas celulares transfectantes con fucosil transferasa (Northwest Biotherapeutics, Inc.) o de cerebro bovino (Matreya, Inc) se solubilizó en metanol a 1 mg/ml y se adsorbió de forma pasiva sobre placas de microtitulación de polipropileno, 50 ul/pocillo, mediante liofilización a temperatura ambiente durante 1-2 horas. De un modo similar, las placas revestidas con antígenos control relacionadazos tales como GM1 se prepararon como contraselección para los anticuerpos de reacción cruzada. Después, las placas de ensayo se bloquearon con 250 µl/pocillo del 1 % de ovoalbúmina en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. A cada pocillo se añadieron diluciones de plasma de ratones inmunizados con fucosil-GM1 y se incubaron durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS/Tween y después se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con una IgGFc anti-humana de cabra o con anticuerpos policlonales IgMFc anti-humana de cabra específico conjugado cada uno con peroxidada de rábano (HRP). Después de lavar, las placas se desarrollaron con sustrato de TMB y se analizaron mediante espectrofotómetro a DO a 450 nm.

Los ratones con los títulos más altos de anticuerpos anti-fucosil-GM1 suficientes se usaron para las fusiones. Las fusiones se realizaron como se describe a continuación y los sobrenadantes del hibridoma se analizaron para detectar la actividad anti-Fucosil-GM1 mediante ELISA.

Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos contra fucosil-GM1:

Se aislaron esplenocitos de los ratones HuMab® y ratones KM™ y se fusionaron con una línea celular de mieloma de ratón usando PEG según protocolos estándar o electrofusión de campo eléctrico usando un electroporador de fusión celular de cámara grande Cyto Pulse (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD). Los hibridomas resultantes se sometieron después a detección selectiva para la producción de anticuerpos específicos de antígeno.

Las suspensiones celulares simples de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados se condensaron a un cuarto del número de P3X63-Ag8.653 células de mieloma de ratón no secretor (nº de registro en la A.T.C.C., CRL 1580) o células de mieloma de ratón no secretor SP2/0 (A.T.C.C., CRL 1581) con 50 % de PEG (Sigma).

Las suspensiones celulares simples de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados se condensaron a un cuarto del número de P3X63-Ag8.653 células de mieloma de ratón no secretor (nº de registro en la A.T.C.C., CRL 1580) o células de mieloma de ratón no secretor SP2/0 (A.T.C.C., CRL 1581) con 50 % de PEG (Sigma). Las células se sembraron en placas a una densidad de aproximadamente 1x105/ pocillo en placas de microtitulación de fondo plano y se incubaron durante aproximadamente dos semanas en medio selectivo que contiene el 10 % de suero bovino fetal, el 10 % de medio condicionado P388D1 (nº de registro en la A.T.C.C., CRLTIB-63), el 3-5 % origen (IGEN) en DMEM (Mediatech, Nº de catálogo CRL 10013, con alto contenido en glucosa, L-glutamina y piruvato sódico) más HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 mg/ml de gentamicina y Ix HAT (Sigma, nº de catálogo CRL P-7185). Tras 1-2 semanas se cultivaron las células en medio en el que HAT se había sustituido por HT. Los pocillos individuales se sometieron a detección selectiva después mediante ELISA (descrito anteriormente) para anticuerpos IgG e IgM anti-fucosil-GM1 humanos.

Los hibridomas con actividad de unión específica en el ensayo de ELISA se analizaron después mediante FACS (que se describe más adelante) por la unión específica a fucosil-GM1 adsorbido en células de mamífero. Los hibridomas que exhiben la unión específica más alta mediante ELISA y FACS se subclonaron al menos dos veces con dilución límite. Los subclones estables resultantes se cultivaron después in vitro para generar cantidades pequeñas de anticuerpo monoclonal en medio de cultivo tisular. El ELISA se repitió para confirmar la actividad de los subclones. Los subclones con la actividad más alta en el ELISA se escalaron para producir medio acondicionado suficiente (normalmente 1 l) para la purificación de anticuerpos monoclonales anti-fucosil-GM1 para su caracterización posterior..

Los clones del hibridoma 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8, 13B8a y 18D5 se seleccionaron para su análisis posterior.

Ejemplo 2: Caracterización estructural de anticuerpos monoclonales humanos 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4,13B8 y 18D5

Las secuencias de ADNc que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales humanos 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4,13B8 y 18D5 se obtuvieron de los hibridomas 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 y 18D5, respectivamente, usando técnicas de PCR estándar y se secuenciaron usando técnicas de secuenciación de ADN estándar.

Las secuencias de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada de 5B1 se muestran en la Figura 2A y en la SEC ID Nº 49 y 1, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 5B1 se muestran en la Figura 2B y en la SEC ID Nº 55 y 7, respectivamente.

La comparación de la secuencia de la inmunoglobulina de la cadena pesada 5B1 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocida demostró que la cadena pesada 5B1 usa un segmento de VH de VH 3-48 de la línea germinal humana, un segmento D de la línea germinal humana 1-1 y un segmento JH de la línea germinal humana JH 6b La alineación de la secuencia de VH de 5B1 con la secuencia VH 3-48 de la línea germinal se muestra en la Figura 7. El análisis posterior de la secuencia de VH de 5B1 usando el sistema de Kabat de la determinación de la región CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 and CD3 de la cadena pesada, como se muestra en las Figuras 2A y 7 y en las SEC ID Nº 13, 19 y 25 respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera 5B1 con las secuencias de la cadena ligera de la inmunoglobulina de la línea germinal humana conocida demostró que la cadena ligera 5B1 usa un segmento VL de VK L15 de la línea germinal humana y un segmento JK de la línea germinal humana JK 4. La alineación de la secuencia 581 VL con la secuencia de VK L15 de la línea germinal se muestra en la Figura 8. El análisis posterior de la secuencia 5B1 VL usando el sistema Kabat de la determinación de la región CDR condujo a las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera, como se muestra en las Figuras 2B y 8, y en las SEC ID Nº 31, 37 y 43 respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 5B1 se muestran en la Figura 3A y en la SEC ID Nº 50 y 2, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 5B1 se muestran en la Figura 3B y en la SEC ID Nº 56 y 8, respectivamente.

La comparación de la secuencia de la inmunoglobulina de la cadena pesada 5B1a con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocida demostró que la cadena pesada 5B1a usa un segmento de VH de VH 3-48 de la línea germinal humana, un segmento D de la línea germinal humana 1-1 y un segmento JH de la línea germinal humana JH 6b La alineación de la secuencia de VH de 5B1a con la secuencia VH 3-48 de la línea germinal se muestra en la Figura 7. El análisis posterior de la secuencia de VH de 5B1a usando el sistema de Kabat de la determinación de la región CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 and

CD3 de la cadena pesada, como se muestra en las Figuras 3A y 7 y en las SEC ID Nº 14, 20 y 26 respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera 5B1a con las secuencias de la cadena ligera de la inmunoglobulina de la línea germinal humana conocida demostró que la cadena ligera 5B1a usa un segmento VL de VK L15 de la línea germinal humana y un segmento JK de la línea germinal humana JK 4. La alineación de la secuencia 581 VL con la secuencia de VK L15 de la línea germinal se muestra en la Figura 8. El análisis posterior de la secuencia 5B1a VL usando el sistema Kabat de la determinación de la región CDR condujo a las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera, como se muestra en las Figuras 3B y 8, y en las SEC ID Nº 32, 38 y 44 respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada de 7D4 se muestran en la Figura 4A y en la SEC ID Nº 51 y 3, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 7D4 se muestran en la Figura 4B y en la SEC ID Nº 57 y 9, respectivamente.

La comparación de la secuencia de la inmunoglobulina de la cadena pesada 7D4 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocida demostró que la cadena pesada 7D4 usa un segmento de VH de VH 3-48 de la línea germinal humana, un segmento D de la línea germinal humana 1-1 y un segmento JH de la línea germinal humana JH 6b La alineación de la secuencia de VH de 7D4 con la secuencia VH 3-48 de la línea germinal se muestra en la Figura 7. El análisis posterior de la secuencia de VH de 7D4 usando el sistema de Kabat de la determinación de la región CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 and CD3 de la cadena pesada, como se muestra en las Figuras 4A y 7 y en las SEC ID Nº 15, 21 y 27 respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera 7D4 con las secuencias de la cadena ligera de la inmunoglobulina de la línea germinal humana conocida demostró que la cadena ligera 7D4usa un segmento VL de VK L15 de la línea germinal humana y un segmento JK de la línea germinal humana JK 4. La alineación de la secuencia 581 VL con la secuencia de VK L15 de la línea germinal se muestra en la Figura 8. El análisis posterior de la secuencia 7D4 VL usando el sistema Kabat de la determinación de la región CDR condujo a las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera, como se muestra en las Figuras 4B y 8, y en las SEC ID Nº 33, 39 y 45 respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada de 5B1 se muestran en la Figura 7E4 y en la SEC ID Nº 52 y 4, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 7E4 se muestran en la Figura 5B y en la SEC ID Nº 58 y 10, respectivamente.

La comparación de la secuencia de la inmunoglobulina de la cadena pesada 7E4 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocida demostró que la cadena pesada 7E4 usa un segmento de VH de VH 3-48 de la línea germinal humana, un segmento D de la línea germinal humana 1-1 y un segmento JH de la línea germinal humana JH 6b La alineación de la secuencia de VH de 7E4 con la secuencia VH 3-48 de la línea germinal se muestra en la Figura 7. El análisis posterior de la secuencia de VH de 7E4 usando el sistema de Kabat de la determinación de la región CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 and CD3 de la cadena pesada, como se muestra en las Figuras 5A y 7 y en las SEC ID Nº 16, 22 y 28 respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera 7E4 con las secuencias de la cadena ligera de la inmunoglobulina de la línea germinal humana conocida demostró que la cadena ligera 7E4 usa un segmento VL de VK L15 de la línea germinal humana y un segmento JK de la línea germinal humana JK 4. La alineación de la secuencia 7E4 VL con la secuencia de VK L15 de la línea germinal se muestra en la Figura 8. El análisis posterior de la secuencia 7E4 VL usando el sistema Kabat de la determinación de la región CDR condujo a las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera, como se muestra en las Figuras 5B y 8, y en las SEC ID Nº 34, 40 y 46 respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada de 13B8 se muestran en la Figura 6A y en la SEC ID Nº 53 y 5, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 13B8 se muestran en la Figura 6B y en la SEC ID Nº 59 y 11, respectivamente.

La comparación de la secuencia de la inmunoglobulina de la cadena pesada 13B8 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocida demostró que la cadena pesada 13B8 usa un segmento de VH de VH 3-48 de la línea germinal humana, un segmento D de la línea germinal humana 1-1 y un segmento JH de la línea germinal humana JH 6b La alineación de la secuencia de VH de 13B8 con la secuencia VH 3-48 de la línea germinal se muestra en la Figura 7. El análisis posterior de la secuencia de VH de 13B8 usando el sistema de Kabat de la determinación de la región CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 and CD3 de la cadena pesada, como se muestra en las Figuras 6A y 7 y en las SEC ID Nº 11, 17 y 23 respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera 13B8 con las secuencias de la cadena

ligera de la inmunoglobulina de la línea germinal humana conocida demostró que la cadena ligera 13B8 usa un segmento VL de VK L15 de la línea germinal humana y un segmento JK de la línea germinal humana JK 4. La alineación de la secuencia 13B8 VL con la secuencia de VK L15 de la línea germinal se muestra en la Figura 8. El análisis posterior de la secuencia 13B8 VL usando el sistema Kabat de la determinación de la región CDR condujo a las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera, como se muestra en las Figuras 6B y 8, y en las SEC ID Nº 35, 41 y 47 respectivamente.

La comparación de la secuencia de la inmunoglobulina de la cadena pesada 18D5 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocida demostró que la cadena pesada 18D5 usa un segmento de VH de VH 3-48 de la línea germinal humana, un segmento D de la línea germinal humana 1-1 y un segmento JH de la línea germinal humana JH 6b La alineación de la secuencia de VH de 18D5 con la secuencia VH 3-48 de la línea germinal se muestra en la Figura 7. El análisis posterior de la secuencia de VH de 18D5 usando el sistema de Kabat de la determinación de la región CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 and CD3 de la cadena pesada, como se muestra en las Figuras 7 y en las SEC ID Nº 18, 24 y 30 respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera 18D5 con las secuencias de la cadena ligera de la inmunoglobulina de la línea germinal humana conocida demostró que la cadena ligera 18D5 usa un segmento VL de VK L15 de la línea germinal humana y un segmento JK de la línea germinal humana JK 4. La alineación de la secuencia 18D5 VL con la secuencia de VK L15 de la línea germinal se muestra en la Figura 8. El análisis posterior de la secuencia 5B1 VL usando el sistema Kabat de la determinación de la región CDR condujo a las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera, como se muestra en las Figuras 2B y 8, y en las SEC ID Nº 36, 42 y 48 respectivamente.

Ejemplo 3. Preparación de células dopadas con fucosil-GM1

Se prepararon células que contenían fucosil-GM1 incluido en la membrana plasmática para usar en los ensayos de unión. Fucosil-GM1 purificado se solubilizó en una mezcla de 1:1 de cloroformo:metanol en un tubo de vidrio y se evaporó hasta sequedad en nitrógeno. Al fucosil-GM1 seco se añadió PBS sin Ca o Mg de modo que la concentración de antígeno fue de 200 mg/ml; se creó una emulsión agitando en vórtex durante 5 minutos, seguido de ultrasonidos durante 5 minutos. Una suspensión de células diana, normalmente HEK 293 (riñón humano, ATCC #CRL-1573) o Daudi (linfoma de Burkitt humano, ATCC # CCL213) se preparó en PBS a 2 x 106 células/ml Se mezclaron volúmenes iguales de emulsión de fucosil-GM1 y la suspensión celular hasta una concentración final de 10 mg de antígeno/106 células/ml. Las células más antígeno se incubaron para permitir fucosil-GM1

Ejemplo 4. Caracterización de la especificidad de unión y la cinética de unión de anticuerpos monoclonales humanos anti-fucosil-GM1

Especificidad de unión mediante ELISA

Los anticuerpos monoclonales humanos anti-fucosil-GM1 purificados se analizaron para determinar la unión específica a fucosil-GM1 purificado mediante ELISA con células dopadas y con antígeno recombinante. Todos los procedimientos se realizaron en hielo. El medio acondicionado e los cultivos de hibridoma positivos para ELISA se mezcló con antígeno o células en placas de fondo en ”V” y se incubaron durante 1 hora. Las células se lavaron y el anticuerpo unido se detectó con un anticuerpo secundario Fc de IgG anti-humano de ratón conjugado con HRP-Después de lavar, las placas se desarrollaron con un sustrato colorimétrico, se sedimentaron mediante centrifugación y el sobrenadante se transfirió a una placa de ensayo de microtitulación de fondo plano para análisis mediante espectrofotómetro. Los resultados se muestran en las figuras 9 (ELISA del antígeno) y 10 (ELISA de células enteras). Se mostró que los anticuerpos anti-fucosil-GM1 se unían específicamente a fucosil-GM1.

Especificidad de unión mediante citometría de flujo

Las líneas celulares naturales positivas para fucosil-GM1, tales como -4-II-E (hematoma de rata ATCC# CRL-1548)

o DMS-79 (SCLC humano ATCC # CRL-2049) se usaron para determinar la especificidad de los anticuerpos monoclonales anti-fucosil-GM1 mediante citometría de flujo. Todos los procedimientos de tinción se realizaron en hielo. La unión de un anticuerpo monoclonal humano anti-fucosil-GM1 se evaluó incubando las células transfeccionadas con el anticuerpo monoclonal humano anti-fucosil-GM1 a una concentración de 10 mg/ml. Las células se lavaron y la unión se detectó con un Ab IgG anti-humano marcado con FITC. Los análisis citométricos de flujo se realizaron usando un clitómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Los resultados se representan en la Figura 11. El anticuerpo monoclonal humano anti-fucosil-GM1 se unió a las líneas celulares H4-II-E y DMS-79 . Este dato demuestra las especificidad de los anticuerpos monoclonales humanos anti-fucosil-GM1 para fucosil-GM1.

Ejemplo 5. Internalización del anticuerpo monoclonal anti-fucosil-GM1

Los HuMAb anti-fucosil-GM1 se analizaron por la capacidad para internalizarse en líneas celulares de expresión de fucosil-GM1 usando un ensayo de internalización Hum-Zap. El ensayo Hum-Zap analiza la internalización de un anticuerpo humano primario a través de la unión de un anticuerpo secundario con afinidad por IgG humana conjugada con la toxina saporina.

Las líneas celulares que expresan fucosil-GM1 (H-4-II-E o DMS 79) se suspendieron en medio de cultivo y se dispensaron en placas de cultivo de microtitulación a 7.500 células/pocillo. Se preparan diluciones en serie de los anticuerpos de ensayo y los controles de isotipos en medios de cultivo y se mezclaron con un exceso molar de 2:1 de anticuerpo secundario conjugado a saporina (Hum-Zap™, Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, IT-2225) durante 1 hora en hielo. Las mezclas de anticuerpo más saporina conjugada se mezclaron después con células y se incubaron a 37 ºC, durante 48-72 horas. La viabilidad celular se midió con la adición de MTS (Promega).

La DO se lee tras una incubación adicional de 4 horas, con la absorbancia inversamente proporcional a la internalización. Los resultados se muestran en las Figuras 12. Este dato demuestra que los anticuerpos anti-fucosil-GM1 humanos se pueden internalizar en las líneas celulares que expresan fucosil-GM1.

Ejemplo 6. Efecto de la citototoxicidad dependiente del complemento de anticuerpos anti-fucosil-GM1

Células diana, líneas celulares “dopadas” o naturales se suspendieron hasta 106/ml en tampón CDC (RPMI1640). El complemento humano (HC) se diluyó a 1: 3 en un medio de crecimiento de líneas celulares. Se prepararon diluciones en serie de anticuerpos de ensayo e isotipos control. Las células, el complemento y los anticuerpos se mezclaron en volúmenes iguales en una placa de ensayo de microtitulación y se incubaron a 37 ºC durante 2 horas. Se añadió Alamar blue a cada pocillo y las placas se incubaron durante 21 horas adicionales a 37 ºC. Las placas se leyeron en un lector de placas fluorescente usando un perfil de emisión de absorción a 530 nm/590 nm, con una viabilidad celular proporcional a las unidades de fluorescencia. Los resultados se muestran en la Figura 13. Los anticuerpos control humanos y de ratón exhiben una actividad CDC sólida y dependiente de la dosis en células DMS 79 y H-4-II-E. Los anticuerpos control de isotipo no muestran una citotoxicidad significativa. La actividad de DCD sobre las líneas celulares negativas para fucosil-GM1, tal como Ramos y ARH77, son insignificantes.

Ejemplo 7. Evaluación de la actividad ADCC de los anticuerpos anti-fucosil-GM1

En este ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-fucosil-GM1 se analizaron por su capacidad para matar las líneas celulares que expresan fucosil-GM1 en presencia de células efectoras a través de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) en un ensayo de citotoxicidad con fluorescencia.

La actividad de ADCC se mide usando el Delfia System (Perkin-Elmer). Brevemente, las células efectoras se cultivan en células mononucleares de sangre periférica humana (PMBC) mediante estimulación durante la noche con 200 u/ml de IL-2 y se resuspenden hasta 2 x 107/ml. Las células diana se diluyen hasta 106/ml y se cargan con un ligando de potenciación de la fluorescencia (BATDA) incubando 20 minutos y se diluyen hasta 2 x 107 células/ml. Las células efectoras y diana se combinan en una proporción de 100:1 en una placa de ensayo de microtitulación y se mezclaron con una dilución en serie del anticuerpo de ensayo y el isotipo control. Las placas se incuban 1 hora a 37 ºC, se centrifugan hasta sedimentación y se extraen 20 ul del sobrenadante y se mezclan con solución EU (Perkin-Elmer). La fluorescencia resultante del ligando liberado combinado con Eu se mide en un lector de placas de fusión (Perkin-Elmer) y es proporcional a la lisis celular. Los pocillos de ensayo con células efectoras en ausencia de anticuerpo y con detergente control para la lisis de fondo y la lisis completa, respectivamente, lo que permite calcular la lisis específica del anticuerpo. Los resultados se muestran en la Figura 14. Este dato demuestra que los anticuerpos anti-fucosil-GM1 son citotóxicos para las células que expresan fucosil-GM1 en la superficie celular.

Ejemplo 8. Inmunohistoquímica del carcinoma de pulmón

La capacidad del 7E4 anti-fucosil-GM1 de HuMAb para reconocer fucosil-GM1 mediante IHC se examinó usando biopsias clínicas de carcinoma de pulmón microcítico (SCLC) y carcinoma de pulmón amicrocítico (NSCLC).

Para inmunohistoquímica, se prepararon secciones de 5 mm congeladas (Ardais Inc, EE.UU.) de biopsias clínicas de carcinoma de pulmón microcítico (SCLC) y carcinoma de pulmón amicrocítico (NSCLC). Después de secar durante 30 minutos, las secciones se fijaron con metanol (a temperatura ambiente durante 10 minutos) y se secaron al aire durante 5 minutos. Los portas se lavaron en PBS y, después, se preincubaron con 10 % de suero de cabra normal en PBS durante 20 minutos y, después, se incubaron con 10 mg/ml de 7E4 biotinilado en PBS con 10 % de suero de cabra normal durante 30 minutos a temperatura ambiente, Los portas se lavaron tres veces con PBS y después se incubaron durante 30 minutos con estreptavidina-FITC (DAKO) a temperatura ambiente. Los portas se lavaron de nuevo con PBS y después se incubaron durante 30 minutos con el conjugado con HRP anti-FITC de cabra (DAKO) a temperatura ambiente. Los portas se lavaron de nuevo 3 veces con PBS. Se usó diaminobencidina (Sigma) como sustrato de HRP, lo que tiene como resultado una tinción marrón positiva para la unión de 7E4. Después de lavar con agua destilada, los portas se contratiñeron con hematoxilina durante 1 minuto para mostrar la estructura tisular. Después, los portas se lavaron durante 10 segundos en agua destilada corriente y se montaron en glycergel (DAKO). La tinción inmunohistoquímica de la biopsia clínica mostró una tinción positiva en las secciones de SCLC y de NSCLC. Solo las células malignas eran positivas en cada caso, el tejido pulmonar normal adyacente no se tiñó. La prevalencia global en el carcinoma de pulmón fue 5/13 analizadas (2/6 SCLC y 3/7 NSCLC). La IHQ fue negativa para la unión de 7E4 al tejido pulmonar normal.

Ejemplo 9. Producción de HuMAb no fucosilados

Se ha demostrado que los anticuerpos con cantidades menores de residuos de fucosilo aumentan la capacidad de

ADCC del anticuerpo. En este ejemplo, se produce un HuMAb anti-fucosil-GM1 que carece de residuos de fucosilo.

La línea celular CHO Ms704-PF, que carece del gen de la fucosiltransferasa, FUT 8 (Biowa, Inc., Princeton, NJ) se somete a electroporación con un vector que expresa las cadenas pesada y ligera de un HuMAb anti-Fucosil GM1. Los clones resistentes a fármacos se seleccionan según el crecimiento en medio de CHO para Ex-Cell 325-PF JRH Biosciences, Lenexa, KS) con L-glutamina mM t 500 mg/ml de G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los clones se seleccionan según la expresión de IgG mediante ensayo ELISA estándar.

Ejemplos 10. Eficacia in vivo de los anticuerpos monoclonales humanos anti-fucosil-GM1

Las células de cáncer de pulmón microcítico DMS79 (Fucosil-GM1+) se implantaron por vía subcutánea en ratones SCID macho (5 x 106 células/ratón) durante un tiempo suficiente (aproximadamente 8 días) para permitir la formación de tumores. El día 8 tras la implantación se tomaron medidas de los tumores y se aleatorios a los ratones en base al volumen medio del tumor (aproximadamente 200 mm3) a seis grupos de ocho ratones cada uno para la posterior terapia con anticuerpos. Los días 8 11, 15, 18, y 22 tras la implantación se inyectaron a los ratones por vía intraperitoneal (ip) como los grupos siguientes: (A) PBS (vehículo control); (B) IgG1 humana (isotipo control) a 30 mg/kg por ratón; (C) anticuerpo monoclonal anti-fucosil-GM1 5B1 a 10 mg/kg por ratón; (D) anticuerpo monoclonal anti-fucosil-GM1 5B1 a 30 mg/kg por ratón; (E) anticuerpo monoclonal anti-fucosil-GM1 7E4 a 10 mg/kg por ratón; o

(F) anticuerpo monoclonal anti-fucosil-GM1 7E4 a 30 mg/kg por ratón. Las composiciones de anticuerpo monoclonal usadas en estos experimentos tenían niveles bajos de endotoxina y ningún agregado significativo. Usando un compás de precisión electrónica se midieron los tumores en tres dimensiones (altura x anchura x longitud) y se calculó el volumen del tumor. Las mediciones del tumor se realizaron dos veces a la semana durante el experimento (61 días). Se sacrificó a los ratones cuando los tumores alcanzaron un punto del tumor designado (un volumen concreto del tumor, tal como 1500 mm3, y/o cuando el ratón mostró signos de molestias o una pérdida de peso de más de aproximadamente un 15 %).

Para analizar si los anticuerpos monoclonales anti-fucosil-GM1 retrasaban el crecimiento tumoral se monitorizó el día que el tumor alcanzó un volumen de 1000 mm3. Los anticuerpos monoclonales anti-fucosil-GM1 7E4 y 5B1 retrasaron significativamente el crecimiento tumoral en comparación con el vehículo y los isotipos control (véase la Tabla 1)- La eficacia del anticuerpo parece depender de la dosis, siendo los grupos de tratamiento con 30 mg/kg los que mostraban una mayor respuesta en cada caso. Además, los volúmenes tumorales en ratones tratados con el anticuerpo 7E4 a 30 mg/kg no alcanzaron nunca 1000 mm3 t tenían un volumen medio del tumor de 600 mm3 al finalizar el estudio el día 61.

Tabla 1.

Tratamiento: Día del volumen tumoral a 1.000 mm3

PBS (Vehículo control): 34

h-IgGI (isotipo control): 32

Anti-5B1 (10 mg/kg): 56

Anti-5B1 (30 mg/kg): 60

Anti-7E4 (10 mg/kg): 57

Anti-7E4 (30 mg/kg): > 61

Para analizar si fucosil-GM1 continuaba expresándose en las células DMS79 in vivo, la unión de los anticuerpos monoclonales 7E4 y 5B1 a las células DMS79 se analizó mediante FACS antes de la implantación y tras la recuperación de células DMS79 de tumores no tratados. Los anticuerpos unidos antes y después de la implantación de las células DMS79 demostraron que los niveles de expresión de fucosil-GM1 se mantuvieron in vivo (Figura 11C).

La Figura 15A muestra que todos los ratones control (Grupos A y B) excepto uno alcanzaron el punto final del tumor mucho antes del día 61. La figura 15B muestra que el grupo tratado con 10 mg/kg de anticuerpo 5B1 anti-fucosil-GM1 (Grupo C) tenían dos ratones que alcanzaron el punto final del tumor y seis ratones con tumores que tienen un volumen que varía de aproximadamente 600 mm3 a 1000 mm3, mientras que ninguno de los ocho ratones del grupo tratado con 30 mg/kg del anticuerpo 5B1 anti-fucosil-GM1 (Grupo D) alcanzó el punto final del tumor al día 61 (que tiene un volumen de 1.000 mm3 o menor). La Figura 15C muestra que ninguno de los ocho ratones del grupo tratado con 10 mg/kg del anticuerpo monoclonal 7E4 anti-fucosil-GM1 (Grupo E) alcanzó el punto final del tumor al día 61 (que tiene un volumen de 1.200 mm3 o menor y un ratón carecía de tumor). La Figura 15C muestra también que ninguno de los ocho ratones del grupo tratado con 30 mg/kg del anticuerpo monoclonal 7E4 anti-fucosil-GM1 (Grupo E) alcanzó el punto final del tumor al día 61 (que tiene un volumen de 800 mm3 o menor y dos ratones carecían de tumor). La Figura 16 muestra la media (A) y la mediana (B) de los volúmenes tumorales medidos el día 61. La eficacia del anticuerpo parece depender de la dosis, siendo los grupos de tratamiento con 30 mg/kg los que mostraban una mayor respuesta en cada caso en comparación con los controles

Tabla 2.

Grupo de cerdas: Inhibición del crecimiento tumoral (TGI) (Día 32) Sin tumor, 40 % día (nº/total)

Media del vol.*: % Mediana del vol.* %

PBS: 897 - 882 - -

h-IgG1: 1189 - 1066 - -

Anti-5B1 (10mg/kg): 227 81 201 81 -

Anti-5B1 (30mg/kg): 174 85 172 84 -

Anti-7E4 (10mg/kg): 177 85 175 84 12,5 % (1/8)

Anti-7E4 (30mg/kg): 116 90 141 87 25 % (2/8)

Este estudio indica que, en un modelo de tumor murino, el tratamiento con anticuerpo anti-fucosil-GM1 funciona de un modo dependiente de la dosis y tiene un efecto significativamente mayor sobre el crecimiento tumoral que el 5 vehículo y el isotipo control.

El tratamiento con anticuerpos anti-fucosil-GM1 tampoco hizo que los ratones perdieran peso ni produjo ningún otro efecto secundario significativo, lo que indica que estos anticuerpos son seguros y bien tolerados (Figura 17). De hecho, los anticuerpos anti-fucosil-GM1 mostraron una inhibición del crecimiento tumoral (TGI %) en porcentaje que varía del 81 al 90 % el día 32 (Tabla 2). Además, el tratamiento con el anticuerpo 7E4 a una dosis de 30 mg/kg tuvo

10 como resultado un 25 % de los ratones sin tumor.

La presente divulgación no debe quedar limitada en su alcance por las realizaciones descritas en el presente documento. De hecho, además, se pueden realizad varias modificaciones de la presente divulgación.

Este estudio indica que, en un modelo de tumor murino, el tratamiento con anticuerpo anti-fucosil-GM1 funciona de un modo dependiente de la dosis y tiene un efecto significativamente mayor sobre el crecimiento tumoral que el

15 vehículo y el isotipo control. El tratamiento con anticuerpos anti-fucosil-GM1 tampoco hizo que los ratones perdieran peso ni produjo ningún otro efecto secundario significativo, lo que indica que estos anticuerpos son seguros y bien tolerados (Figura 17). De hecho, los anticuerpos anti-fucosil-GM1 mostraron una inhibición del crecimiento tumoral (TGI %) en porcentaje que varía del 81 al 90 % el día 32 (Tabla 2). Además, el tratamiento con el anticuerpo 7E4 a una dosis de 30 mg/kg tuvo como resultado un 25 % de los ratones sin tumor.

20 LISTADO DE SECUENCIAS

SEC ID Nº: SECUENCIA SEC ID Nº SECUENCIA

1: VH a.a. 5B1 32 VK CDR1 a.a. 5B1a

2: VB a.a. 5B1a 33 VK CDR1 a.a. 7D4

3: VH a.a. 7D4 34 VK CDR1 a.a. 7E4

4: VH a.a. 7E4 35 VK CDR1 a.a. 13B8

5: VH a.a. 13B8 36 VK CDR1 a.a. 18D5

6: VH a.a. 18D5 37 VK CDR2 a.a. 5B1

7: VK a.a. 5B1 38 VK CDR2 a.a. 5B1a

8: VK a.a. 5B1a 39 VK CDR2 a.a. 7D4

9: VK a.a. 7D4 40 VK CDR2 a.a. 7E4

10: VK a.a. 7E4 41 VK CDR2 a.a. 13B8

11: VK a.a. 13B8 42 VK CDR2 a.a. 18D5

12: VK a.a. 18D5 43 VK CDR3 a.a. 5B1

13: VH CDR1 a.a. 5B1 44 VK CDR3 a.a. 5B1a

14: VH CDR1 a.a. 5B1a 45 VK CDR3 a.a. 7D4

15: VH CDR1 a.a. 7D4 46 VK CDR3 a.a. 7E4

16: VH CDR1 a.a. 7E4 47 VK CDR3 a.a. 13B8

17: VH CDR1 a.a. 13B8 48 VK CDR3 a.a. 18D5

18: VH CDR1 a.a. 18D5 49 VHn n.t. 5B1

19: VH CDR2 a.a. 5B1 50 VH n.t. 5B1a

20: VH CDR2 a.a. 5B1a 51 VH n.t. 7D4

21: VH CDR2 a.a. 7D4 52 VH n.t. 7E4

22: VH CDR2 a.a. 7E4 53 VH n.t. 13B8

23: VH CDR2 a.a. 13B8 54 VH n.t. 3C4

24: VH CDR2 a.a. 18D5 55 VK n.t. 5B1

25: VH CDR3 a.a. 5B1 56 VK n.t. 5B1a

26: VH CDR3 a.a. 5B1a 57 VK n.t. 7D4

27: VH CDR3 a.a. 7D4 58 VK n.t. 7E4

28: VH CDR3 a.a. 7E4 59 VK n.t. 13B8

29: VH CDR3 a.a. 13B8 60 VK n.t. 3C4

30: VH CDR3 a.a. 18D5 61 VH 3-48 línea germinal a.a.

31: VK CDR1 a.a. 5B1 62 VK L15 línea germinal a.a.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende los dominios CDR1, CDR2, y CDR3, y una región variable de la cadena ligera, que comprende los dominios CDR1, CDR2, y CDR3, en el que:

5 (a) el CDR1 de la región variable de la cadena pesada comprende la SEC ID Nº 16;

(b)

el CDR2 de la región variable de la cadena pesada comprende la SEC ID Nº 22;

(c)

el CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprende la SEC ID Nº 28;

(d)

el CDR1 de la región variable de la cadena ligera comprende la SEC ID Nº 34;

(e)

el CDR2 de la región variable de la cadena ligera comprende la SEC ID Nº 40; y

10 (f) el CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprende la SEC ID Nº 46,

en el que el anticuerpo se une específicamente a fucosil-GM1.
2.

El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une a la línea celular de cáncer de pulmón microcítico humano DMS-79 (SCLC humano ATCC # CRL-2049).
3.

El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que

15 comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una identidad de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 61; y/o una región variable de cadena ligera que tiene una identidad de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 62.
4. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que:

20 (a) la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4; y

(b) la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 10.
5. Un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo compite de forma cruzada por la unión a fucosil-GM1 con un anticuerpo de referencia, en el que el anticuerpo de referencia es un anticuerpo monoclonal humano aislado como se define en una cualquiera de

25 las reivindicaciones 1 a 4.
6.

El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es un anticuerpo de longitud completa de un isotipo IgG1 o IgG4.
7.

El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es un fragmento Fab o Fab’2 o un anticuerpo de una cadena.

30 8. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo hipofucosilado.
9.

Una composición que comprende el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10.

Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo

35 con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 unido a un agente terapéutico, tal como una citotoxina o un isótopo radioactivo.
11. Una composición que comprende el inmunoconjugado de la reivindicación 10 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo 40 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
13.

Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 12.
14.

Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 13.
15.

Un procedimiento para preparar un anticuerpo anti-fucosil-GM1 que comprende expresar el anticuerpo en la célula huésped de la reivindicación 14 y aislar el anticuerpo de la célula huésped.

45 16. Un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para usar en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por el crecimiento de células tumorales que expresan fucosil-GM1.
17.

El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo para uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la enfermedad es cáncer
18.

El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo para uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el cáncer es cáncer de pulmón.
19.

El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo para uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón microcítico.