TWI266802B

TWI266802B - G01n 33/569 200601 a i htw

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Publication number: TWI266802B
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Original assignee: 13 2000 00 00 0
Priority date: 1999-08-03
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Publication date: 2006-11-21
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1266802 A7 B7 五、發明説明（1 ) 裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明係關於源自白斑症病毒之蛋白質、其編碼之核酸序列、以及使用該蛋白質生產用來預防及/或治療甲殼綱動物白斑症之疫苗。白斑症病毒（WS SV)在東南亞是造成蝦類動物疾病的主要病毒。該病毒普遍係寄生在甲殼綱動物之寄主中（ Flegel，1 9 9 7 )，且其分離株基因間的變異並不大（Lo etal’ 1 9 9 9 )。由電子顯微鏡（EM)的硏究顯示病毒顆粒具有被膜及具有桿狀至子彈型的外觀，長約 2 7 5毫微米以及寬1 2 0毫微米，而且在其中一端具有尾狀物。核莢膜不具被膜，有交叉斜紋的外觀，大小約 3 0 0 晕微米 X 7 0笔微米（Wongteerasupayaetal·，經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 9 9 5 )。在形態學上，此病毒顆粒位於細胞核，其形態上使人聯想到昆蟲之桿狀病毒（Durand et al·，1 9 9 7 ) 。因此最初係將W S S V分類成桿狀病毒家族中的一個身份未明的成員（.Francki et al.，1 9 9 1 )，並將此病毒稱之爲全身性外細胞層中細胞層的桿狀病毒（S Ε Μ B V )或白斑桿狀病毒（W S Β V )。目前因爲缺少分子方面的資料，所以將W S S V從此家族中排除（Murphy et al.，1 9 9 5 )。由限制內切酶之分析可得知，此雙股D N A病毒的D N A 大小超過 2 0 0 k b ( Yang et al.，1 9 9 7 )。在東南亞的養蝦事業中，爆發WS SV流行病會導致養殖蝦類大量死亡。此疾病的特徵是在蝦之甲殼、附屬肢體及表皮上出現白斑且在肝胰腺上出現淡紅色的斑點。受感染的蝦隻有嗜眠的徵兆並且進食速度遽降，且在3至5天之內死 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇'〆297公釐） 1266802 經濟部智慧財產局R工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2 ) 亡。爆發WS SV會導致養蝦事業嚴重的損失，因此亟須尋求可以保護蝦隻對抗W S S V感染之疫苗。有了可確認並特徵化W S S V的主要結構蛋白質將有助於該疫苗之發展。在WS SV中，目前已確認四種主要的蛋白質，稱爲V P28 (28仟道爾頓）、VP26 (26仟道爾頓）、v P 2 4 ( 2 4仟道爾頓）以及V P 1 9 ( 1 9仟道爾頓），其分子量係以空馬西亮藍（Coo massie Brilliant Blue)—染色的硫酸十二酯鈉聚丙醯胺膠片電泳之移動性估算。V P 2 6及VP 2 4是核殼衣蛋白質，而VP 2 8及 V P 1 9是被膜蛋白質。從序列分析中可得知W S S V蛋白質之N -端胺基酸序列，並確認其基因（分別爲 νρ28、νρ26、νρ24、νρ19)位於 W S S V基因體。ν ρ 2 6之開放閱讀框架（〇R F )包含 5 5 5個核苷酸（序列確認號碼：1 )，連同V P 2 6推演之1 8 4個胺基酸序列（序列確認號碼：3 )，示於圖2 b 。v p 2 6之第二個開放閱讀框架包含6 1 2個核苷酸，示於序列確認號碼：9，推演之胺基酸序列係由 2 0 4個殘基組成，示於序列確認號碼：1 0。v p 2 8之開放閱讀框架包含6 1 5個核苷酸（序列確認號碼：2 )，連同推演之胺基酸序列（序列確認號碼：4 )示於圖2 c。 V P 2 8推演之胺基酸序列有2 0 4個胺基酸。 V P 2 6及V P 2 8在N —端含有推定之橫越細胞膜之結構區以及許多推定之N -以及〇-糖基化作用位點。基因V P 2 6以及v p 2 8之〇RF上所編碼之蛋白質，在理論上其本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -5 - w (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1266802 A7 B7 五、發明説明（3 ) 大小分別爲2 0仟道爾頓以及2 2仟道爾頓。 v p 2 6及V P 2 8理論上之胺基酸序列已透過蛋白質序列分析直接地加以証實。V P 2 6及V P 2 8在理論上之大小與利用空馬西亮藍（Coomassie Brilliant Blue)—染色的硫酸十二酯鈉聚丙醯胺膠片電泳移動性加以估算，二者之間有 6仟道爾頓之差別。此大小上的差異可用轉譯後修飾，如糖基化作用、磷酸化作用等，加以說明。V P 2 4之N -端胺基酸序列以及V P 1 9之部份胺基酸序列分別爲序列確認號碼：5以及6。v p 2 4完整的開放閱讀框架包含6 2 7個核苷酸，連同推演之V P 2 4胺基酸序列描述於序列確認號碼：1 1。V P 2 4推演之胺基酸序列有2 0 8個殘基，描述於序列確認號碼：1 2。四種蛋白質及其個別地核苷酸序列均具有W S S V的專一性。本發明係首次提供生產重組疫苗（保護甲殻綱動物對抗 W S S V感染）之方法。經確認及特徵化的四種 WSSV之主要蛋白質VP28、VP26、VP24以及 V P 1 9，據發現適用於生產次單元疫苗以保護甲殼綱動物對抗W S S V感染。選殖及特徵化本發明之核苷酸序列後可使用重組技藝生產W S S V的結構蛋白質。此方法得到之重組W S S V結構蛋白質，大體上不含其它 W S S V蛋白質。分離w S S V結構蛋白質後可用以生產次單元疫苗以保護甲殼綱動物對抗w S S V感染。此外，編碼 W S S V結構蛋白質的核苷酸序列可用以生產載體疫苗以保護甲殼綱動物對抗w S S V感染。本發明之核苷酸序列可運本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -6 -

U -裝--- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1T— 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1266802 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ____ B7五、發明説明（4 ) 用在診斷方面，例如偵測養殖場中是否有 w S SV之存在。此外，本發明之WS SV蛋白質可用於生產w S S V專一的抗體。此類抗體可用於產生ws SV疫苗以進行甲殻綱動物之被動免疫。抗體亦可運用在診斷方面，如偵測養殖場中之甲殼綱動物中是否有W S S V之存在。因此本發明之首要目的是提供一種W S S V的結構蛋白質。更明確的說，本發明係提供VP24、VP26、VP 2 8及V P 1 9結構蛋白質。本發明特別提供蛋白質V P 2 6，其胺基酸序列如圖2 b (序列確認號碼：3 )或其衍生的序列，如序列確認號碼：1 0，及V P 2 8其胺基酸序列如圖2 c (序列確認號碼：4 )或其衍生的序列。本發明更進一步的提供包含N —端胺基酸序列Μ Η M W G V Y A A I LAGLTLILVVISIVVTNIELNKKLDKKDK 之VP24蛋白質（序列確認號碼：5 )或其衍生物，以及包含部份胺基酸序列I V L I S I(G/V)I L V L A V Μ N V(P/A/T)MGPKKDS之VP19蛋白質（序列確認號碼：6 )或其衍生物。較佳之蛋白質爲V Ρ 2 4其胺基酸序列如序列確認號碼·· 1 2或其衍生的序列。胺基酸序列序列確認號碼：3、4、5、6、1 0或1 2衍生之蛋白質序列亦在本發明之範圍內。本發明中蛋白質衍生的胺基酸序列’與描述於序列確認號.碼：3、4、1 〇或1 2之胺基酸序列或描述於序列確認號碼：5或6之部份序列比較之下’顯示其包含改變胺基酸之序列，而該改變不會影響蛋白質的免疫性或產生免疫的特性。本發明中蛋白質免疫的特性係指蛋白質產生本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公麓） _ 7 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝- -訂線 1266802 Α7 Β7 五、發明説明（5 ) 能辨視及/或與該W S S V蛋白質反應之抗體的能力。產生免疫的特性，係指蛋白質引發甲殼綱動物對抗W S S V感染之保護反應的能力。該改變可發生在依據本發明之序列，例如在整體胺基酸序列上發生保留性胺基酸的取代、刪除、插入、逆轉或加入。如前述，胺基酸取代預期不會改變免疫的性質。相關胺基酸之間的胺基酸取代在演化上相當頻繁，尤其是Ser/Ala、 Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、Ile/Val(參見 Dayhof，M.D.， Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found.，Washington D.C.，1 978，vol. 5，suppl. 3) 〇以演化上的資訊爲基礎，Lip man以及Pearson發展出一種快速且敏感的方法對蛋白質進行比對（Science, 1 985，vol.2 2 7，1 4 3 5 - 1 4 4 1 )以及決定具有序列相似性之蛋白質與胜肽之間的相似性。目前有許多電腦程式，如：F A S T A、T F A S T A、B L A S T等，可測定給定之胺基酸序列以及其衍生蛋白質或胜肽間的序列相似性；序列之間最適化的相配區域可自動地被此類程式加以測定。因此依據本發明蛋白質之衍生物仍可引發辨視及可與W S S V結構蛋白質反應的抗體 ’或引發接種的甲殼綱動物之保護反應對抗w S S V感染。其它依據本發明，可使用的衍生蛋白質爲WS SV蛋白質的片段，該片段仍可引發辨視及可與W S S V結構蛋白質反應的抗體’或引發接種的甲殼綱動物之保護反應對抗W S S V 感染。本發明的第二個特色是提供編碼一個或多個w S S V結本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） •裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -8- 1266802 A7 五、發明説明（6 ) 構蛋白質的核酸序列。更佳者，本發明提供分別編碼主要結構蛋白質VP24、VP26、VP28及/或 V P 1 9的核酸序列。本發明尤其是提供v p 2 6、v p 2 8及v p 2 4之核酸序列（分別描述於序列確認號碼：1或 9、序列確認號碼：序列確認號碼：2或1 1 )，分別編碼 V P 2 6、V P 2 8以及V P 2 4。各別之核苷酸序列起始自編碼推演之第一個胺基酸Μ之密碼子A T G終止於編碼C -端胺基酸之密碼子。與本發明之核酸序列（序列描述於序列確認號碼：1或序列確認號碼：2或序列確認號碼：9或序列確認號碼：1 1 )具有序列相似性之序列亦在本發明之範圍內。本發朋中序列相似性係指至少7 0 %、較佳者7 5 %、更佳者8 0 %、最佳者8 5 %之相似性。最佳的核酸序列是與序列確認號碼：1、2、9或1 1至少有9 0 %，更佳者有9 5 %相似性之序列。本發明中序列相似性之測定係比較特定之核苷酸序列與序列確認號碼：1、序列確認號碼：2或序列確認號碼：1 1序列之對應部分。本發明中序列相似性百分比之定義是比對的序列之間相同核苷酸之百分比。序列相似性可用電腦程式（如BLAST N等）測定。此類程式可自動地測定最適化的相配區域。從W S S V緊密相關的品系中可使用例行的選殖程序及雜交技藝輕易地分離與依據本發明序列確認號碼：1、2、 1 1或9或此類序列片段具有序列相似性之核酸序列。雜交係於迫切的條件下進行，較佳者爲高度迫切的條件。迫切的 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝·

、tT 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -9- 1266802 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 _____B7五、發明説明（7 ) 雜交條件據瞭解其中淸洗條件爲溫度6 5 °C下之1 X S S C 、0 . 1 % S D S ;高度迫切的條件下意指淸洗條件中S S C濃度降低至0 · 3 X S S C。只要能排除確認鹼基之誤差，特定的資訊不應作狹義之解釋。揭示在此的特定序列亦可用來分離其它品系中之同源核苷酸序列。與描述於序列確認號碼：1、2或1 1序列具有序列相似性之核酸序列，其編碼蛋白質之胺基酸序列與描述於序列確認號碼：3、4、1 0或1 2之胺基酸序列或描述於序列確認號碼：5以及6之部份的胺基酸序列相較之下可發現一些改變，該改變不會影響該蛋白質的免疫性或產生免疫的性質。編碼V P 2 6蛋白質的同源核苷酸序列之實施例爲序列確認號碼：9之核苷酸序列，其編碼之 V P 2 6蛋白質與描述於序列確認號碼：3之胺基酸序列相較之下也可發現一些改變。依據本發明之W S S V蛋白質可經標準生化的分離以及 ’純化方法得到或彼可經一般的重組技藝製備。依據本發明之核苷酸序列，尤其是適當於生產重組的W S S V結構蛋白質，且大體上不含其它WS SV蛋白質。核苷酸序列可加入能表現蛋白質的適當表現載體，與該表現載體轉形入適當的寄主細胞，並在適當的培養液中培養寄主細胞。表現的蛋白質可從細胞或培.養液中加以分離及純化。適當的表現載體包括 :質體、黏接質體、病毒以及YAC (人造的酵母菌染色體 )，其包含複製以及表現所必須要的控制區域。表現載體可在寄主細胞進行表現。適當的寄主細胞爲，例如：細菌、酵本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -10 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· *tx 線 1266802 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 __B7_五、發明説明（8 ) 母菌細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞。該表現技藝爲熟知的技藝（參見 Sambrooke et al·，Molecular Cloning:a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，1989; King and Possee，1992) o 本發明第三個特色係提供一種疫苗’其係包含一個或多個WSSV病毒顆粒結構蛋白質VP24、VP26、VP 2 8或V P 1 9以及醫藥學上可接受的載體。更明確的說，依據本發明之疫苗包含病毒顆粒蛋白質VP 2 4、VP 2 6 、VP 2 8或VP 1 9或組合二種或更多之該蛋白質。依據本發明較佳之疫苗包含V P 2 4，其係包含序列確認號碼 :1 2之胺基酸序列或序列確認號碼：5之N -端胺基酸序列或上述任一序列之衍生序列，或 .V P 2 6，其係包含序列確認號碼：3、序列確認號碼：1 0之胺基酸序列，或上述任一序列之衍生序列，或 V P 2 8，其係包含序列確認號碼：4之胺基酸序列或其衍生序列，或V P 1 9，其係包含序列確認號碼：6之N -端胺基酸序列或其衍生序列，或組合二種或更多之該蛋白質。依據本發明更佳之疫苗包含WS SV蛋白質 VP26以及VP28，以及視需要地包含VP24。此外，依據本發明之核酸序列可用以生產載體疫苗，以接種至甲殼綱動物對抗W S S V感染。載體疫苗據瞭解爲~ 種疫苗，其爲活菌、衰減細菌或已修飾的病毒，彼之遺傳物質中插入一個或多個異種的核苷酸序列。此類所謂的載體細菌或病毒能共同表現插入的核苷酸所編碼的異種蛋白質。因本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(210X 297公楚) ^11 - ~ ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂線 1266802 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 __ _B7五、發明説明（9 ) 此本發明的第四個特色係提供載體疫苗，其係包含活體減毒的細菌或病毒以及醫藥學上可接受的載體，其中該細菌或病毒經修飾後在其遺傳物質中包含一個或多個本發明之核苷酸序歹ij。依據本發明之疫苗可用以保護甲殻綱動物，如：蝦，其中包括（但非限於）蝦科之成員，例如：大虎蝦、太平洋白、中國暇、淺水香蒸暇、或美匹暇（Metapeaeus spp.); 對蝦’其中包括（但非限於）淡水蝦科（palaem〇nidae )家族之成員，例如：淡水蝦（Macrobrachium spp.)或淡水蝦（ Palaemon spp.);龍蝦，其中包括（但非限於）刺龍蝦科（ Palinuridae)以及深海龍蝦科（Nephropidae)家族之成員，例如：藍龍蝦屬、小龍蝦屬、刺龍蝦屬或龍蝦屬；淡水螯蝦 ’其中包括（但非限於）淡水繁暇科（A s t a c i d a e )家族之成貝’例如·淡水蜜暇屬、小龍暇屬（p r 0 c a 1Ώ b a ni s s p p ·)、及盲螯蝦屬（Oronectes spp·);以及蟹，其中包括（但非限於 )巨蟹科（Cancridae)及泳蟹科（p01.tuidae)家族之成員，例如：巨蟹屬（Cancer spp.)、藍蟹屬（Callinectes spp.) 、綠蟹屬（Car ci n us spp.)及泳蟹屬（p〇r tun us spp.)。依據本發明之疫苗可依據熟知技藝的熟手熟知的技藝及目己地於例如 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18，t h edition(1990), eds. A.R. Gennaro et al., chapter 72, pp. 1389- 1404，Philadelphia College of Pharmacy and Science 中的技藝製備。依據本發明之疫苗包含有效量之一個或多個蛋白質、載本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 -線 1266802 A7 _B7___ 五、發明説明（1〇 ) 體細菌或依據本發明之病毒、以及醫藥學上可接受的載體。本文之”有效的”其定義爲可充分的引發甲殼綱動物保護反應的用量。載體或蛋白質用量取決於載體或蛋白質之類型、投藥路徑、投藥時間、接種的物種與年齡、一般的健康狀況、溫度以及飮食。一般而言，每隻動物可使用之劑量爲0 · 0 1至 1000微克之蛋白質，較佳者0·5至500微克，更佳者0.1至100微克蛋白質。當使用病毒的載體疫苗時，每隻動物可使用之劑量爲1 0 3至1 0 8 P f U (菌斑形成單位）。適於依據本發明之疫苗使用的醫藥學上可接受的載體爲無菌及生理上相容的（例如）滅菌水、生理食鹽水、緩衝水 .溶液，如：鹼金屬磷酸鹽（例如P B S )、醇類、多元醇等。此外依據本發明之疫苗可包含其它的添加劑，如：輔助劑、穩定劑、抗氧化劑、防腐劑以及其他物質。適當的輔助劑包括（但非限於）鋁鹽類或凝膠、丙烯酸聚合物（carbomers )、非離子性團塊共聚物（ blockco polymers )、生育酌、單磷化脂 A ( monophospheryllipid A )、胞壁基二胜肽、油性乳狀液、葡聚糖、細胞分裂素、皂素（如Quil A )等。輔助劑之用量由輔助劑本生的天然特性決定。依據本發明疫苗使用的適當穩定劑包括（但非限於）碳水化合物，如：山梨醇、甘露糖醇、澱粉、蔗糖、糊精、以及葡萄糖、蛋白質，如：白蛋白或酪蛋白、以及緩衝溶液，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 13 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝----Γ.:--訂----- 線經濟部智慧財產局D貝工消費合作社印製 1266802 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 __B7_五、發明説明（11 ) 如：鹼性的磷酸鹽。適當的防腐劑中包括局部抗菌劑及硫柳汞。依據本發明之疫苗可經注射、浸沒、浸塗、噴灑或氣溶膠、或口服的投用。疫苗較佳者係經浸沒或口服的投用至甲殼綱動物，尤其是當用於商業的水產養殖場。口服的投用疫苗時較佳者係與適於口服投藥的載體混合，即纖維素、食物或可代謝的物質，如：α -纖維素或不同之植物或動物油。.口服的投遞依據本發明之疫苗時尤佳的食物載體爲活體飼料（因其能封包疫苗）。適當的活體飼料包括（但非限於）類浮游生物非選擇的過濾飼料，較佳者爲輪蟲、鹹水暇（artemia )等。最佳者爲鹹水蝦（Artemia sp.) ο 依據本發明之蛋白質可使用一般精於此技藝之熟手熟知的技藝產生抗體。較佳者係用蛋白質產生專一的單株抗體。依據本發明之抗體可依據標準技藝製備。對動物（例如老鼠 )進行蛋白質之免疫反應並用熟知的技藝選擇可產生蛋白質專一性單株抗體之融合瘤（參見例如Cligan et al.(eds)， Current protocols in Immunology 1 9 9 2 ; Kohler and Milstein, Nature 256, pp. 495-497, 1975; Steenbakkers et al.5 Mol. Biol. Rep. 19，pp· 1 25- 1 34，1 994)。所得到之抗體可用於診斷偵測養殖.場所之W S S V或偵測甲殼綱動物體內存在之 W S S V。依據本發明之核苷酸序列亦可適用於診斷法。以該序列或片段合成之引子用（例如）P C R技藝偵測養殖場所或甲殼綱動物體內存在之W S S V。因此，本發明之另一 i紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -14 - ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 訂線 1266802 A7 B7 五、發明説明（12 ) 特色係提供診斷的組套，包含依據本發明之一個或多個核苷酸序列或抗體。依據本發明對抗蛋白質VP28、VP26、 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) VP 2 4以及VP 1 9之抗體可進一步的用以生產抗體疫苗對甲殼綱動物進行被動免疫。因此，本發明進一步的特色係提供對抗W S S V之被動免疫疫苗，該疫苗包含對抗v p 2 8、VP26、VP24、或VP19或二種或更多該蛋白質組合之抗體。該疫苗可用上述之標準技藝製備。較佳之口服投藥疫苗其製備係將抗體與可食用之載體（如魚類食物）混合。更佳之疫苗係爲雞蛋製備的抗體（

IgY抗體）。以下實施例係用以闡明本發明而不是限制本發明之範圍圖形說明圖1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 w S S V蛋白質。（A )完整的病毒顆粒負性染色的T E Μ圖。（B ) W S S V核莢膜負性染色的T E Μ圖。（C )純化的W S S V，1 5 %空馬西（Coomassie )染色的硫酸十二酯鈉聚丙醯胺膠片電泳分析。行1 :低分子量蛋白質標識。行2 ··.未經感染的蝦子之純化的” W S S v顆粒”。行3 :純化的W S S V顆粒。行4 :純化的 W s S V核莢膜。圖2 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1266802 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（13) WSSV VP26及VP28之核苷酸序列。（A) WSSV基因片段上VP26及VP28的片段。（B)V P 2 6之核苷酸以及蛋白質序列，（c) VP28之核苷酸以及蛋白質序列。vp26及vp28個別之ORF，起始自編碼推演之胺基酸序列的第一個Μ殘基A T G密碼子。N -端序列胺基酸用粗體表示；推定之N -糖基化作用位點用底線表示，推定之〇-糖基化作用位點用雙底線表示。V P 2 8 上退化引子所在位置之核苷酸序列用斜體字表示。圖3 (A ) V P 2 6及（B ) V P 2 8之疏水性圖。圖4 昆蟲細胞中用桿狀病毒表現W S S V的結構蛋白質，並用1 5 % S D S P a g e凝膠及西方墨點分析。（A ) S t 2 1細胞萃取液之空馬西（Coomassie )染色的電泳膠片。行1 :低分子量蛋白質標識。行2 :控制組之感染。行3 :AcMNPV — wt 之感染。行 4 ·· AcMNPV-GFP 之感染。行 5 : AcMNPV-WSSVvp26 之感染。行 6 ·· AcMNPV- WSSVvp28之感染。行7 : W S S V。（ B )使用抗純化的 W S S V多株抗體進行西方墨點。圖5 用結構蛋白質V P 2 8的抗血淸中和蝦中之w s s v。負性控制組··蝦接受N a C 1溶液。正性控制組：蝦接受w S SV但無抗血淸。免疫前血淸：蝦接受WS SV以及免疫前血淸。VP 2 8抗血淸：蝦接受病毒以及抗一 -¾衣----r; (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂----線本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -16- 1266802 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _____B7 _五、發明説明（14 ) V P 2 8抗血淸。圖6 蝦接種w S S V蛋白質。負性的控制組：蝦接種 N a C 1溶液。正性控制組：蝦接種N a C 1及W S S V。第3組：蝦接種V P 2 4。第4組：蝦接種V P 2 6 c。第 5組：蝦接種V P 2 8。第6組：蝦接種混合之 VP24、VP26c以及VP28。實施例方法白斑症病毒之產生及純化用於此硏究之病毒係分離自泰國的大虎蝦。感染的組織在T N緩衝溶液（2 0毫莫耳濃度T r i s — H C 1、4 0 0毫莫耳濃度N a C 1，ρ Η 7 · 4 )中均質化。於1，7 0 0 X g離心1 0分鐘之後過濾上淸液（0 . 4 5微米濾膜 )。將濾液從肌肉注射入健康的大虎蝦腹部第四節側面的區域以引發感染。於4天之後從垂死的蝦中放出血淋巴液並與修飾的 A1 s e v e r 溶液（R 〇 d 1· i g u e z e t a 1.， 1 9 9 5 )(抗凝血劑）混合。用T Η E ( 2 0毫莫耳濃度 Tds HC1、400毫莫耳濃度NaC 1、5毫莫耳濃度ED T A，ρ Η 7 . · 4 )稀釋之後，在4 t、1 ，7〇0 x g下離心1 0分鐘分離血球使血淋巴液澄淸。離心沈澱病毒顆粒 (4 °C、4 5，0 0 0 X g下離心1小時）並將沈澱塊懸浮於T N中。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） · 17 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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11T 線 1266802 ΑΊ B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（15 ) 用Nonidet P 4 〇 ( N P 4 〇 )移除病毒顆粒之病毒被膜。將百分之一的N P 4 0添加於病毒溶液中，在室溫下輕搖反應3 0分鐘。沈澱核莢膜（4 t：、8 0，0 0 〇 X g下離心3 0分鐘）。將沈澱塊溶於T E ( 1 0毫莫耳濃度 Tris-HCl、1 毫莫耳濃度 EDTA，pH7.5)。病毒顆粒懸浮液之硫酸十二酯鈉聚丙醯胺膠片電泳分析進行蛋白質分析時，將W S S V病毒顆粒製備物（被膜病毒顆粒、核莢膜及負性的對照組）用1 5 %硫酸十二酯鈉聚丙醯胺膠片電泳分析。硫酸十二酯鈉聚丙醯胺膠片電泳凝膝係使用空馬西亮藍（Coomassie Brilliant Blue )染色檢視蛋白質。電子顯微鏡進行穿透式電子顯微鏡（T E Μ )時，將病毒懸浮液置於塗覆弗木（f 〇 1· m ν a r )以碳穩定的錄網（4 0 0篩孔）上，用磷鎢酸（2 % P T A )進行負性的染色。樣品用Philips C Μ 1 2電子顯微鏡檢查。核酸之純化將純化的病毒粒子經蛋白酶Κ ( 〇 · 2毫克/毫升）及肉胺醯基（1 % )在4 5 °C下處理3小時後，接著用酚/氯仿萃取及TE (10毫莫耳濃度Ti: i s—Hci 、1毫莫耳濃度EDTA，pH 7 · 5)透析分離病毒的DNA。 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公f l (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝- 訂線 1266802 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（16 ) D N A之純度及濃度用瓊脂糖凝膠電泳加以測定，使用已知分子量大小之標識進行比對。質體建築體將W S S V次基因體的片段選殖入pBluescript SK + (Stratagene)，並使用標準技藝轉形入大腸桿菌 D Η 5 a ( Sambrook et al.，1 9 8 9 )。依據標準方法進行D N A分離、限制酵素水解、瓊脂糖凝膠電泳以及菌落提舉（lifting ) ( Sambiook et al·，1 9 8 9 )。使用設計合成的引子進行P C R ^以W S S V之總D N A作爲模板，使用退化引子（依據V P 2 8之N -端胺基酸序列）以P C R放大編碼v p 2 8 N -端的D N A。正向引子爲 5，CAGAATTCTCDATNGTYTTNGTNAC 3,（序歹[J 確言忍號石馬·· 7 )，逆向弓丨子爲 5’CAGAATTCATGGAYYTNWSNTTYAC 3,（序列確認號碼：8 )(內含EcoRI位點，斜體字）（D = A、 T 或 G ; N 二 A、C、G、或丁； Y 二 C 或丁； W=A 或 T ;S = C或G )。使用一組退化的P C R引子（依據V P 2 4之N -端胺基酸序列）以W S S V之總D N A作爲模板，以P C R放大v p 2 4的N -端。正向引子爲 5，CAGAATTCATGCAYATGTGGGGNGT 3,（序歹11 確認、號石馬：1 3 )，逆向弓丨子爲 5’CAGAATTCYTTRTCYTTYTTRTCIARYTT 3’（序列確認號碼：1 4 )，二者均含E c 〇 R I位點（斜體字）。本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐Ί :19一: (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝· -ΙΊ---訂線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1266802 A7 ____B7_ 五、發明説明（17 ) D N A定序及電腦分析定序之質體D N A係經QIAprep微製備系統或；fETstai· 質體純化系統（Qiagen，lnc.)純化。定序係使用通用的 P Blue script正向及逆向核苷酸引子以及訂製合成的引子從雙股進行。自動定序係使用Applied Biosystems automated DNA sequencer(Eurogentec，比利時）進行。定序後用UWGCG電腦程式（版本10 · 〇)分析。 D N A以及推演之胺基酸序歹[J在 GenBank/EMBL、 SWISSPORT及PIR資料庫中用程式F A S T A、 Ί F A S T A (Pearson&Lipman，1 9 8 8 )及 B L A S T ( Altschul et al.，1 9 9 7 )比對。 .細胞及病毒將黏蟲（Spodoptera frugiperda)細胞（S ί — A E - 2 1 ) ( Vaughn et al·，1 9 7 7 )用補充 1 0 % 胎牛血淸（ F C S )的Grace’s昆蟲培養液（GIBCO BRL)進行培養。用歐多（Autographacalifornica)細胞核的多角病毒之 E 2 —品系（AcMNPV)(Smitli and Sumiiiers，1 9 8 2 )作爲野生型（w t )病毒。細胞培養用例行的程序維持，病毒感染之方法依據發表的方法（S u m m e 1· s a n d S m i t h，1 9 8 7 ; K i n g and Possee，1992)進行。遺傳工程構築重組病毒使用Bac-to-Bac系統（GIBCO BRL)在昆蟲細胞過度表本紙张尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） -20 - 裝---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

i— I § 線 1266802 A7 B7 五、發明説明（18 ) 現w s S V v P 2 4 (序列確認號碼：1 2 ·)、 v p 2 6 (序列確認號碼：3 ) 、V P 2 6 c (序列確認號 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 碼：1 0 )及V P 2 8 (序列確認號碼：4 )。爲了增進昆蟲細胞感染後，B a c - t 〇 - B a c重組細胞之偵測及滴定’將p 1 0啓動子控制下之綠色螢光蛋白質（ G F P )基因引入pFastBac-DUAL載體。質體PVL92GFP經 X b a 1及Κ ρ η 1水解之後移除G F P基因（Reilander et ’ 1 9 9 6 )。用瓊脂糖凝膠電泳及GlassMAX純化（ GIBCO BRL )分離內含G F P之7 0 0個鹼基對的片段，使用D N A聚合酶鈍端化及插入pFastBac-DUAL的p 1 0啓動子下游多重選殖區域I I之S m a I位點。生成的質體稱爲 pFastBac-D/GFP，其係在多角素（polyhedrin)啓動子下游含有可插入外來基因之區域I。依據Bac-to-Bac系統之說明（G I B C〇 B R L )構築在 P 1 0啓動子控制下僅表現G F P之重組病毒，此病毒稱爲 AcMNPV-GFP。經濟部智慧財產局S工消費合作社印製用內含推定之完整的v p 2 6 (序列確認號碼：1 )及 v p 2 8 (序列確認號碼：2 )開放閱讀框架（〇RFs)之WSS'，質體進行PCR，在Vp26 (序列確認號碼：1 )及v p 2 8 (序列確認號碼：2 ) 〇R F之3 端引入B a m Η I位點並在5 ’端引入 Hindlll位點，先將其選殖入ρ Ε Τ 2 8 a載體（Novagen) ，用B a m Η I及N 〇 t I切除後插入質體pFastBa〇D/GFP 之多角素（polyhednn )啓動子的下游。生成的質體分別稱本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X 297公釐） -21 - 1266802 _B7_ 五、發明説明（19 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲 pFastBac-D/Gvp26及 pFastBac-D/G-vp28。用內含推定之〇 R F的質體用P C R使用引子放大V p 2 6 c (序列確認號碼：9 )及v p 2 4 (序列確認號碼：1 1 )以在5 ’端引入B a m Η I位點以及在3 ’端引入EcoRI位點。將v p 2 6 c (序列確認號碼：9 )及v p 2 4 (序列確認號碼：1 1 )之〇R F水解後插入 pFastBac-D/GFP之多角素（ polyhedrin)啓動子的下游，產生質體pFastBac-D/G-vp26c及 pFastBac-D/G-vp24。p 1 0啓動子控制下表現G F P之重組病毒及多角素（polyhedrin )啓動子控制下表現V P 2 4 ( 序列確認號碼：1 2 ) 、V P 2 6 (序列確認號碼·· 3 )、 V P 2 6 c (序列確認號碼：1〇） V P 2 8 (序列確認號碼：4 )之重組病毒係依據B a c -t 〇 — B a c系統之說明加以構築（GIBCO BRL)，該病毒分別稱爲 AcMNPV - WSSVvp24、 AcMNPVWSSVvp26、AcMNPV - WSSVv p26 c 及 AcMNPV— WSSV vp28。經濟部智慧財1局員工消f合作社印製硫酸十二酯鈉聚丙醯胺膠片電泳分析、蛋白質定序以及免疫墨點分析感染野生型A c Μ N P V及重組A c Μ N P V的昆蟲細胞所表現的異種蛋白質（G F Ρ、V Ρ 2 6、λ，Ρ 2 8 )係以1 5 %硫酸十二酯鈉聚丙醯胺膠片電泳凝膠分析。蛋白質係使用空馬西売藍（C ο 〇 m a s s i e Β I· i 11 i a n t Β1 u e )染色顯現。使用C A P S緩衝溶液（內含1 〇 %甲醇、1 〇毫莫耳濃度之CAPS)用二氟聚亞乙烯基（PVDF)膜（Bi -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!0X 297公釐） 1266802 Μ 經濟部智慧財產局S工消費合作社印製 ___ _ _Β7五、發明説明（20 ) R a d )或使用T r i s -甘胺酸緩衝溶液（2 5毫莫耳濃度T r 1 s鹼、1 9 2毫莫耳濃度甘胺酸、1 〇 % ( v / v )甲醇，p Η 8 · 3 )用 ImmobilonTm-P(Millip〇re)進行半乾燥墨點。P V D F膜上之蛋白質係使用空馬西亮藍（ Coomassie Brilliant Blue)染色顯現。將 W S S V病毒顆粒製備物上主要的蛋白質條帶從濾膜上剪下並作 N - 端定序（ProSeq. Inc.，Massachusetts)。 Immobulon-P膜用內含2 %低脂奶粉（Campina，荷蘭）之TBS(0.2M NaCl、50毫莫耳濃度 T r i s — H C 1 ，p Η 7 . 4 )進行阻塞。將墨點與多株的兔子抗—W S S V 血淸（來自 Prof. P.C. Loli，University of Honolulu，Hawaii，用內含〇 · 2% 低脂奶粉之 TBS 1 : 2 0 0 0稀釋）在室溫下反應1小時，進行免疫偵測。接著，使用結合辣根過氧化酶之兔子抗體之抗體（Amersham )(濃度爲1 : 2 0 0 〇稀釋）以”增強化學冷光一光偵測組套” （A m e r s h a in )進行偵測。 V P 2 8多株的抗體使用桿狀病毒A cMNPV - WS SVv p 2 8在昆蟲細胞中表現主要的W S S V結構被膜蛋白質V P 2 8，.用 Prepcell(Biorad)及分層收集器純化。收集及濃縮內含 V P 2 8之分層。將純化的V P 2 8蛋白質注射入兔子產生多株的抗體。抗體與內含純化的W S S V病毒顆粒進行西方墨點測試，並挑出可與與W S S V病毒顆粒V P 2 8反應良本紙張尺度適用中國國家標準（) A4規格（2I0X297公釐) -23 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝 :訂線 1266802 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（21 ) 好之抗體。用此v P 2 8抗血淸進行w S S V中和實驗。 W S S V病毒標準液從一週前肌肉內的注射低濃度W S S V之淡水螯蝦（ Procambarus clarkii )的血淋巴液純化病毒產生白斑症病毒（ W S S V )病毒標準液。血淋巴液經連續蔗糖梯度離心純化，移除病毒條帶。沈澱病毒之後，將病毒溶於T E ( p Η 7 • 5 )。病毒標準液儲存在- 7 0 °C下直到實驗時使用爲止〇接種蛋白質主要的W S S V結構被膜蛋白質V P 2 8 (序列確認號碼：4 )及核殼衣蛋白質V P 2 6 c (序列確認號碼：1 〇 )及V P 2 4 (序列確認號碼：1 2 )，其係使用桿狀病毒 AcMNPVWSSVvp28、AcMNPV—WSSV vp26 c 及 AcMNPV—WSSVvp 2 4·(其可在p 1 0啓動子控制下表現G F P，並在多角素 (ρ ο 1 y h e d r i η )啓動子控制下表現表現 W S S V結構的蛋白質）在昆蟲細胞中表。感染後3天收集感染的昆蟲細胞並甩超音波打破。用上淸液接種大虎蝦。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（2】ΟΧ 297公釐） - 24 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁

裝· ,-ιτ 線 12668〇2

，説明（22 ) $驗之6組蝦子：組組名接種追加劑刺激蝦隻別# 數目 1 負性的對照組 330毫莫耳 330毫莫耳 330毫莫耳 10 '--- 》辰度N a C1 濃度NaCl 濃度NaCl 2 正性對照組 330毫莫耳 330毫莫耳 wssv 10 濃度NaCl 濃度NaCl 3 ——- VP28 VP28 VP28 WSSV 15 4 VP26c VP26c VP26c wssv 15 5 VP24 VP24 VP24 wssv 15 6___ MIX m i x mix wssv 15 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝----Ί 在MI X組中等體積之VP28、VP2 6 c及 V P 2 4溶液在注射之前混合。於接種5天之後，對蝦進行追加注射。刺激二天後注射W S S V (病毒標準液，參見中和實驗）。蝦於注射之後監測6天，死蝦用電子顯微鏡檢查 W S S V是否存在。結果分離W S S V蛋白質進行定序肌肉內注射純化的病毒後會使大虎蝦感染w s S V。感染四天之後，從感染動物的血淋巴液分離病毒。從未感染的暇中取得血淋巴液作爲負性的對照組。此類製備物經電子顯微鏡檢查分析W S S V病毒顆粒之存在及純度。未感染動物的樣品，沒有觀察到病毒顆粒，但感染動物的樣品，觀察到許多主要被膜病毒顆粒（圖1 a ) 。N P 4 0處理後將病毒的被膜自病毒顆粒移除之後產生純化的核莢膜（圖1 b )， $ 線經濟部智慧財產局K工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2)0X 297公釐） -25 - 1266802 A7 _____ B7 五、發明説明（23 ) w S s V核莢膜的表面有分節的外觀（Durand et al.，1 9 9 7 )。被膜病毒顆粒及核莢膜蛋白質用硫酸十二酯鈉聚丙醯胺膠片電泳（圖1 C )分離。病毒顆粒中可確認四種主要的胜肽，進視分子量分別爲2 8 ( v P 2 8 )、2 6 ( V P 2 6) 、2 4 ( V P 2 4 )、及 1 9 仟道爾頓（V P 1 9 ) 。亦觀察到數個較不明顯的條帶，大約有六個條帶介於3 0 至6 5仟道爾頓及至少七個弱蛋白質條帶介於8 6仟道爾頓至1 3 0仟道爾頓。源自血淋巴液的三個主要的蛋白質條帶與病毒顆粒可被共同純化，分子量介於6 7仟道爾頓至7 8 仟道爾頓。存在於此區域之次要的蛋白質條帶無法在此凝膠中被觀察到（圖1 )。純化的核莢膜中不含主要的W S S V 蛋白質VP28及VP19 (圖lc)，因此彼似乎是來自 .病毒的被膜或外層。V P 2 6及V P 2 4存在於核莢膜及病毒顆粒，故顯示彼係來自核殻衣。將硫酸十二酯鈉聚丙醯胺膠片電泳凝膠之內含物用半乾燥墨點法轉移至二氮聚亞乙燒基膜’並剪下主要的病毒的蛋白質條帶及定序。VP28及VP26之N -端有 4 0個以上之胺基酸被定序（分別爲圖2 b及2 c中之粗體字）°VP26 之 N — 端序列含 MEFGNLTNLDVAI IAILSIAIIALIVIMVIMIVFN 丁 RVGRSVV AN。VP 2 8 之 N —端序列含 MDLSFTLSVVSAIL AITAVIAVFIVIFRYHNTVTKTIEtHsD，其中位置第3 9之蘇胺酸及位置4 1的絲胺酸並不確定。二個 N -端序列均具疏水性（圖3 ) 。V P 2 4經N -端胜肽定 (諳先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝- 線經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X29*7公釐） _ 26 - 1266802 經濟部智慧財產局資工消費合作社印製 A7 ___ B7 五、發明説明（24 ) 序得到的N -端胺基酸序列爲Μ Η M W G V Y A A I L A G ltlilvvisivvtnielnkkldkkd

K(SEQIDN05 ) 。V P 1 9 之 N —端被阻塞，V P 1 9 經 C N B r水解去除阻塞的胜肽，得到部份之內部胺基酸序列爲 1 V L I S I(G/V)I L V L A V Μ N V(P/A/T) M G P K K D S ( 序列確認號碼：6 ) 。V P 1 9部份之胺基酸序列上位置7 可能爲G或V，位置1 7可能爲P、A或T。 2 4仟道爾頓蛋白質基因之位置及序列依據V P 2 4的N -端蛋白質序列設計一組退化的 P C R 弓I 子，正向引子爲 5，CAGAATTCATGCAYATGTGGGGNGT 3’ （序歹!J 確認、號石馬：1

3 ) ’ 逆向弓丨子爲 5fCAGAATTCYTTRTCYTTYTTRTCIARYTT 3 ’（序列確認號碼：1 4 )，二者均含E c 〇 R I位點（斜體字）。進行 P C R時係使用W S S V基因的D N A作爲模板。得到 1 3 3個鹼基對長的片段，於2 %瓊脂糖凝膠純化之後，選殖入pBluescdpt SK +及定序。此P C R產物之序列對應至 W S S V V P 2 4的N -端蛋白質序列（序列確認號碼： 5 )並用於作爲作爲對W S S λπ質體基因庫進行菌落提舉測定之探針（Sanibrook et a]·，1 9 8 9 )以確認 V Ρ 2 4 完整的◦ R F。一段1 8仟鹼基對之B a m Η I片段可與此片段雜交，故選來作進一步的分析。在1 8仟鹼基對之B a m Η I片段中發現完整的本紙張尺度適用中國國家摞準（CNS ) Α4规格（210Χ297公釐) ~' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1266802 A7 B7 經濟部智慧坷產局員工消費合作社印製五、發明説明（25 ) V P 2 4 〇R F (含6 2 7個核苷酸），及此基因之啓動子區域。轉譯的起始密碼子位於高效率的真核轉譯起始序列 (AAAATGC )之內（Kozak，1 9 8 9 )。啓動子區域有富合A / T的序列，但無一致的T A T A盒。聚A信號與轉譯終止密碼子重疊。v p 2 4 〇R F (序列確認號碼：1 1 )編碼2 0 8個胺基酸之推定的蛋白質（序列確認號碼·· 1 2 )，其中內含實驗測定之V P 2 4的N -端胺基酸序列（序列確認號碼：5 ) 。V P 2 4理論上之大小爲2 3仟道爾頓，等電點爲8 · 7。V P 2 4發現四個可能產生N -聯結的糖基化作用（N -丨P } —〔 s T〕一 { P丨）的位點，一個〇—糖基化作用（Hansen et al.，1 9 9 8 )位點及9 個可能的磷酸化作用位點（〔S T〕一 X - X -〔 D E〕或〔S 丁一 X —〔 R K〕〕，但不知是否會發生任何修飾。V P 2 4中沒有發現其它PRO SITE資料庫中之構型存在。電腦分析2 0 8個胺基酸後顯示在V P 2 4之N -端有強疏水性的區域存在，其中包括推定之橫越細胞膜之α -螺旋，由 6至2 5個胺基酸形成。Gamier et al·之算則（1 9 7 8 ) 預測蛋白質上有數個其它α -螺旋及万-薄片。 2 6仟道爾頓蛋白質基因之位置及序列將部份之W S S V基因的基因庫以Hindlll、及B a m Η I 位點構築入 pBlnescript-SK + (van Hulten et al.， 2 0 0 0 )，從許多W S S V片段得到端點之核苷酸序列。編碼V P 2 6 N -端之核普酸序列出現在一個6仟驗基之 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣訂 % 線本纸張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（2】0X 297公釐） -28- 1266802 A7 B7 經濟部智慧財產局Μ工消費合作社印製五、發明説明（26 ) B a m η ]；片段之端點（圖2 a )。甲硫胺酸起始密碼子周圍的序列（A A A A T G G )符合Kozak規則爲高效率的真核的轉譯起點（Kozak，1 9 8 9 ) 。λ，ρ 2 6中未轉譯的領導序列僅測到4 9個核苷酸，延伸到終端之B a m Η I位點（圖2 a )。 6仟鹼基之B a m Η I片段中內含5 5 5核苷酸之開放閱讀框架，其中包括編碼V Ρ 2 6之Ν —端胺基酸（圖2 b )。聚A信號位於v p 2 6之轉譯的終止密碼子下游的9 4 核苷酸。此〇R F ( v p 2 6 )編碼之蛋白質爲 1 8 4個胺基酸，理論上之大小爲2 0仟道爾頓。推定之蛋白質爲鹼性的蛋白質，等電點爲9 · 4 。使用程式 N e t 〇 g 1 y c (H a n s e n e t a 1.，1 9 9 8 )預測，可能有三個 N — 聯結的糖基化作用（N - { P丨一〔S T〕—丨P })位點存在，三個推定之〇-糖基化作用位點（圖2 b )。十三個可能的磷酸化作用位點（〔S T〕一 X - X -〔 D E〕或〔 ST — X — 〔RK〕〕，但無其它構型存在於PROSITE資料庫中。 V P 2 6之1 8 4個胺基酸經疏水性分析後顯示一個強疏水性的區域位於蛋白質N 一端（圖3 a ) °此區域內含推定之橫越細胞膜之固定錨，由1 2至3 4個胺基酸形成的α -螺旋。固定錦後接著一段帶正電的區域，其中內含二個精胺酸，顯示C 一端部分的方向是面對細胞質側（Sonnhammer et a].，1 9 9 8 )。除了橫越細胞膜之α -螺旋之外’使用Gamier et al·算則（1 9 7 8 )發現在位置 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝- 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) Α4規格（210X 297公f ) -29- 1266802 經濟部智慧財產局8工涓費合作社印製 A7 _____B7___ 五、發明説明（27 ) 1 2 7至1 4 1可能有々一薄片。蛋白質中僅有一個半胱胺酸，因此蛋白質內無法形成雙硫鍵之交互聯結。此半胱胺酸位於蛋白質之C 一端部分，V P 2 8亦復如是。 2 8仟道爾頓蛋白質基因之位置及序列轉譯W S S V端點的片段序列無法得到V P 2 8之胺基酸序列。故依據此胜肽之N -端序列設計一組退化引子。正向弓丨子爲 5’CAGAATTCTCD ATNGTYTTNGTNAC 3’ （序歹[J 確認號碼：7 )，逆向弓|子爲5’CAGAATTCATGGAYYTN WSNTTYAC 31序列確認號碼：8 )，均含E c 〇 R I位點 (斜體字）。引子在序列上之位置參見圖2 c。進行 P C R時係使用W S S V基因的D N A作爲模板。得到 1 2 8個鹼基對長之片段，用2 · 5 %瓊脂糖凝膠純化之後，選殖入p BI u e s c r i p t S K +並定序。核普酸序列編碼 W S S V V P 2 8 N -端蛋白質之序列，此1 2 8個鹼基對片段可用於數個W S S V質體基因庫之菌落提舉（lift )測定（Sambrook et al.，1 9 8 9 )。一個 3 仟驗基之 HindiII片段可與此片段雜交並可進一步的分析。此3仟驗基之H i n d I I I片段含6 1 2核普酸之完整的〇R F ( v p 2 8 )及此基因之啓動子區域（圖2 c ) 。甲硫胺酸起始密碼子位於高效率的真核的轉譯起始序列（ GTCATGG)之內（Kozak，1 989)。啓動子區域無一致的TATA盒，但有富含A/T之區域。聚A信號在轉譯的終止密碼子下游的5 5個核苷酸。本紙張尺度適用中國國家標準（cns ) A4規格（2ΐ〇χ 297公釐Ί - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝訂 § 線 1266802 Μ Β7 經濟部智慧財產局Κ工消費合作社印製五、發明説明（28 ) 〇R F編碼2 0 4個胺基酸之推定蛋白，包括N -端定序的胺基酸。此酸性蛋白質理論上的大小爲2 2仟道爾頓，等電點爲4 . 6。五個可能產生的N -聯結的糖基化作用（N -{ P丨一〔S 丁〕一丨P丨）位點，二個〇糖基化作用（ Hansen et al.，1 9 9 8 )(圖2 c )位點及9個可能的磷酸化作用位點（〔S T〕— X - X -〔 D E〕或〔3丁}(— 〔RK〕〕°VP28上無其它存在於PROSITE資料庫之構型。電腦分析蛋白質的2 0 4個胺基酸後顯示在蛋白質的N 一端有一個強疏水性的區域（圖3 b )，其中包括由9至2 7個胺基酸形成的推定之橫越細胞膜之α -螺旋序列。V P 2 6中此橫越細胞膜之固定序列之後接著正電價之區域，表示此蛋白質爲由外向內之方向排列。序列之C 一端部分另有一疏水性的區域，可能構成橫越細胞膜之序列。然而V Ρ 2 8在此位置依據G a m i e 1· e t a 1 · ( 1 9 7 8 ) ·算則無無α -螺旋。算則進一步的預測α -螺旋位於8 9至9 9，但此蛋白質並無/3 —薄片。如同V Ρ 2 6， V Ρ 2 8中僅有一個半胱胺酸^此半胱胺酸亦位於蛋白質之 C 一端部分。重組ν ρ 2 4、ν ρ 2 6及ν ρ 2 8之表現及分析使用B a c — t 〇 — B a c系統（GIBCO BRL)在昆蟲細胞中產生表現推定之W S S V病毒顆粒蛋白質（ V P 2 4、V P 2 6、λ，P 2 6 c 及 V P 2 8 )之重組桿 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 訂線本紙依尺度適用中國國家標準（〇奶）六4規格（2】0\ 297公釐） -31 - 1266802 A7 B7 五、發明説明（29 ) 狀病毒。vp2 4_、vp26、vp26c 及 vp28 基因 (分別爲序列確認號碼：1 1、序列確認號碼：1、序列確認號碼：9及序列確認號碼：2 )係選殖入質體pFastBac-D/GFP (含有P 1 0啓動子控制的下游之GFP基因）中多角素（polyhedrin)啓動子的下游。來自pFastBac-D/GFP (對照組）之重組病毒及含有v P 2 4、v p 2 6、v p 2 6 c 及v p 2 8之質體分別稱爲

AcMNPV - GFP、AcMNPV— WSSVvp 24、AcMNPV-WSSVvp26、AcMNPV-WSSVvp26c、及 AcMNPVWSSVvp 2 8。所有重組病毒在P 1 〇啓動子控制下表現G F P ;後四個者質體在多角素（polyhedrin )啓動子控制下分別地表現額外的V P 2 4 (序列確認號碼：1 2 ) 、V P 2 6 (序列確認號碼·· 3 ) 、V P 2 6 c (序列確認號碼： 1〇)及 VP28(SEQ ID N〇4)。

感染 cMNPV — wt、AcMNPV — GFP、 AcMNPV — WSSVvp26、及 AcMNPVWSSVvp28 之 S F 2 1細胞的萃取液用1 5 % S I D S — P年齡凝膠進行分析。感染野生型A c Μ N P V (圖4 a，行3 )的細胞中，可見到3 2仟道爾頓之條帶，其代表多角素（polyhedrin )。感染A c Μ N P V — G F P之細胞（行4 )及感染表現 W S S V蛋白質之重組細胞（行5及6 )的萃取液中，可觀察到G F Ρ蛋白質之條帶大約2 9仟道爾頓。感染c Μ Ν Ρ V 一 G F Ρ的細胞G F Ρ之表現較在啓動子控制下表現W S 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -32 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝- ---訂線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ^2668〇2

經濟部智慧財產局S工消費合作社印製五、發明説明（3〇 ) S V蛋白質的桿狀病毒G F P之表現強（行5及6 )。感染各種A c Μ N P V之重組細胞，用 U V照射細胞亦可立即觀察到上述之現象，其中以 A CMNPV - GFP感染後的細胞中之GFP螢光爲最強 (朱顯示）。在多角素（polyhedrin )啓動子控制下 W S S V蛋白質之表現顯著的較高於p 1 〇啓動子控制下G Fp之表現（行5及6) 。AcMNPV-WSSVvp26感染的細胞 t萃取液中可觀察到2 1仟道爾頓蛋白質強列的表現，大部分爲WSSV VP26 (行 5)。感染 cMNPV - WS S V v p 2 8的細胞中觀察到2 8仟道爾頓蛋白質強列的表現（行6 )。此類凝膠中G F P之位置經西方分析使用抗-GFP抗血淸証實（數據未顯示）。野生型及重組A c Μ N P V感染的S f 2 1細胞樣品用硫酸十二酯鈉聚丙醯胺膠片電泳凝膠電泳後進行西方分析。用抗W S S V病毒顆粒的多株抗體偵測重組V P 2 6及V P 2 8 (圖4 b )。此類細胞萃取液均偵測到 V P 2 6及V P 2 8。偵測到之V P 2 6爲2 1仟道爾頓，與空馬西亮藍（Coo massie Brilliant Blue)—染色的凝膠一致（圖4 a ，行5 ;圖4 b，行5 )。重組V P 2 8與W S S V病毒顆粒V P 2 8之移動位置相同，顯著的較高於此蛋白質理論上的大小2 2仟道爾頓。多株的抗體與昆蟲細胞（行2 )或桿狀病毒（行3及4 )蛋白質並無交互反應，此類樣品中觀察到的背景反應非常低。感染 cMNPV— WSSV vp26 c 及 AcMNPV- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 29*7公釐） - 33 - ' (諳先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} •裝· 訂線 1266802 A7 B7 經濟部智慈財產局K工消費合作社印製五、發明説明（31 ) WSSVvp24的S ί 2 1細胞之萃取液用1 5 %硫酸十二酯鈉聚丙醯胺膠片電泳凝膠分析。低分子量標識及純化的 W S S λ?病毒顆粒亦於相同凝膠中同時分析。在 AcMNPV— WSSVvp26 c &AcMNPV- W S S v p 2 4感染的細胞中觀察到2 9仟道爾頓之弱條帶（代表G F P )，感染的細胞於U V照射之後亦可淸楚的觀察到。此外在AcMNPV - WSSVvp26 c感染的細胞中，在凝膠的2 6仟道爾頓之相同位置上觀察到如同病毒顆粒W S S V 2 6仟道爾頓條帶般之強條帶。感染c Μ N Ρ V — W S S V ν ρ 2 4的細胞中，淸楚的觀察到2 4仟道爾頓條帶，對應到W S S V病毒顆粒2 4仟道爾頓位置的蛋白質。爲了證實感染A cMNPV - W S S ΛΑ v p 2 6 c的細胞中2 6仟道爾頓的條帶以及感染 A c Μ Ν Ρ V - W S S V ν ρ 2 4的細胞中2 4仟道爾頓之條帶相應於W S S V病毒顆粒之2 6仟道爾頓及2 4仟道爾頓蛋白質，使用W S S V病毒顆粒多株的抗體進行西方墨點分析。可偵測到感染AcMNPV-WSSVvp26c細胞的2 6仟道爾頓條帶以及感染A c Μ Ν Ρ V - W S S V ν ρ 2 4細胞的 2 4仟道爾頓條帶。 V Ρ 2 6及V Ρ 2 8之相關性在GenBank/EMBL、SWISSP〇R丁及 Ρ I R資料庫中使用FASTA ' TFASTA及 BLAST進行WSSV VP24、VP26、 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐） -34- 1266802 A7 _ B7^發明説明（32 ) V P 2 6 c及V P 2 8之相似性搜索。在G e η B a n k中沒有發現序列間顯者的相似性、與桿狀病毒被膜或殼衣蛋白質無顯著的相似性、與其它大的D N A病毒的結構蛋白質無顯著的相似性。中和實驗從滴定實驗得到病毒標準液之滴定濃度。將病毒標準液稀釋成1 xl 〇7至5x1 011倍，各稀釋中取1 〇微升肌肉內的注射至1 0隻蝦子（大虎蝦，3 - 4個月大）。1 X 1 0 8稀釋之W S S V標準液在7 - 1 2天後之死亡率爲5 0 %並用於更進一步的實驗。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

.裝用於中和實驗的4組蝦子：組# 組名注射 #蝦 1 負性的對照組 330毫莫耳濃度NaCl 10 2 正性的對照組 WSSV 10 3 免疫前血淸 WSSV +免疫前血淸 15 4 VP28抗血淸 AVSSV + VP28 抗血淸 15 j---訂線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製每組中每隻蝦投用的病毒總量是固定的，等於1 〇微升之1 X 1 0 8稀釋的病毒標準液。第3及4組之血淸濃度爲相同（每次注射：1微升W S S V及9微升血淸）。蝦子於注射之後監測4週並用電子顯微鏡檢查死蝦中是否有W S S V之存在。結杲示於圖5。第1組（負性的對照組）無蝦因W S S V而死，因此死本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) 規格（2】0Χ 297_公釐） -35- 1266802 Α7 Β7 經濟部智慧財產局8工消費合作社印製五、發明説明（33 ) 亡率爲〇 %。正性對照組（第2組），於2 3天之後死亡率到達1 0 0%。將免疫前血淸（兔子注射VP 2 8蛋白質之前取得之血淸）添加至W S S V (第3組）中於第2 5天死亡率到達1 0 0%。當VP 2 8抗血淸添加至 W S S V (第4組），所有蝦子均存活死亡率爲〇 %。此類結果顯示V P 2 8抗血淸可中和大虎蝦中W S S V之感染。接種蛋白質第3 — 6組注射5微升（接種）及1 0微升（追加劑）之不同的蛋白質溶液。接種的第3組接受2 . 5微克 λ厂P 2 8蛋白質，第4組接受3 · 6微克V P 2 6 c蛋白質，第5組接受0 . 7微克的V Ρ 2 4蛋白質。第6組接受由等體積V Ρ 2 8 —、V Ρ 2 6 c -及V Ρ 2 4溶液組成的混合液，總量爲2 . 7微克的蛋白質。追加注射時蝦接受較高量的蛋白質：第3組爲9 · 6微克的VP28蛋白質、第4 組爲5 · 7微克的V Ρ 2 6 c蛋白質、第5組爲5 · 9微克的V Ρ 2 4蛋白質以及第6組總量7 · 1微克的蛋白質。所有各組的蝦均注射1 0微升之1 X 1 0 8稀釋的W S S V標準溶液。接種的結果示於圖6。第1組（負性的對照組）無蝦因 W S S V而死，因此死亡率爲〇 %。第2組，蝦於感染之後一天開始死亡，死亡率增大。雖然此類蝦子如中和實驗般接受相同之W S S V病毒劑量，第2組的蝦子較早開始死亡。此可能爲此實驗之蝦子接受多重注射，在緊迫的壓力下引起 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝—— ---^11--- 線-- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X29*7公釐） -36- 1266802 經濟部智慧財產局"'貝工消費合作社印紫 A7 __B7_ 五、發明説明（34 ) 的結果。第3 - 5組（分別接種V P 2 4、 P 2 6 c及V P 2 8的蝦子）的死亡率開始下降，第6組 (接種V Ρ 2 4、V Ρ 2 6 c及V Ρ 2 8之混合物的蝦子），無蝦因W S S V而死，因此死亡率爲0 %。接種個別蛋白質最適的劑量可增加保護的效應對抗W S S V感染。參考文獻 Altschul，S·，Madden, T·，Schaffer, A., Zhang, J·，Zhang, Z., Miller, W., and Lipman, D.( 1 997). Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein 資料庫 search programs. Nucleic Acids Res.25,3389-3402 o Durand, S., Lightner, D. V·，Redman，R. M·，and Bοnami, J. R. ( 1 99 7). Ultrastructure and morphogenesis of White Spot Syndrome Baculovirus(WSSV). Diseases A quat. Organisms 29,2〇5-211° Flegel，T. W.( 1 997). Major viral diseases of the black tiger p r a w n (P e n a e u s m ο η o d ο n) in Thailand. World J. Microbiol. Biotechnol.13,433-442 o Fra ncki, R. I. B·，Fauquet，C. M., Knudson，D. L·，and Brown, F. (1991) · "Classification and Nomenclature of Viruses:Fifth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses". Springer-Verlag，New York o Gamier, J.， Osguthorpe, D. J. and Robson 5 B. ( 197 8) Analysis of the accuracy and implications of simple method for 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -37 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

•裝—— -訂---—^---- 經濟部智慧財產局β(工消費合作社印製 1266802 A7 ___B7_ 五、發明説明（35 ) predicting the secondary structure of globular proteins. J. Mol. Bi〇1.120,97-120 。

Hansen, J. E., Lund,〇·，Tolstrup，N., Gooley，A. A., Williams, K. L.5 and Brunak, S.(1998). NetOglyc:Prediction of mucin type O-glycosylation sites based on sequence context and surface accessibility :Glycoconj. J· 1 5，1 1 5-1 30 o

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） -38- 1266802 A7 B7 五、發明説明（36 )

Reilandei·，H·，Haase, W.，and Maul? G. ( 1 996). Functional expression of the Aequorea victoria green fluorescent protein in insect cells using the baculovirus expression system. Biochem . Biοphy s. Res. Commun. 219，14-20。

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裝·

線經濟部智慈財產局员工消費合作社印製本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2I0X297公釐） -40- V1266802 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（38 )

SEQUENCE LISTING

<110> Akzo Nobel KV <120> Proteins derived from White Spot Syndrom virus and uses thereof

<130> 1999484BI <140> < 141 > <150> EP 99202545.2 <151> 1999-08-03 <150> EP 00200248.3 <151> 2000-01-24 <160> 14 <170〉Patent.In Ver. 2.1 <210> 1 <211> 555 <212> DNA <213〉白班症病毒 <400> 1 . 、 atggaatttg gcaacctaac aaacctggac gttgcaatta ttgcaatctt. gtccattgca 60 atcattgctc taatcgttat catggttata atgattqtat tcaacacacg tgttggaaga 120 aqcgtcgtcg ctaattatga tcaqatqatg cqagtcccaa ttcaaagaag ggcaaaggta 190 atgtcaattc gtggagagag qtcctacaat actcctcttg gaaaggtggc catgaagaat 240 ggtc.tctccg ataaggacat gaaqgatgtt tctgctgatc ttgtcatctc taccgtcaca 300 gccccaaqga ctgatcccgc tqgcactgqg gc.cqagaact ctaacatgac tttgaagatc 360 ctcaacaaca ctggcgtcga tctcttgatc aacqacatta ctgttcggcc aactgttatt 420 gcaqgaaaca ttaagggaaa tactatgtcg aacacttact tctcgagcaa ggacat-taaa 4 8 0 tcttcatctt caaaaattac cctcattgac. gtgtgcagca aatttgaaga cgcgcagcct 540 tcgaagctac aatga 555 <210> 2 <211> 615 <212> DNA < 2 i 3 >白斑症病毒 <400 2 atggatcttt ctttcactct ttcggtcgtg tcgqccatcc tcgccatcac tgctgtgatt 60 qctgtattta ttatgatttt taggtatcac aacactgtaa ccaagaccst cgaaacccac 120 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家榡準（CKS ) A4規格（210X 297公釐） ·41 - 1266802 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（39 ) acaqacaata tcgagacaaa catgqatgaa aacctccgca ttcctgtqac tgctgaggtt. 180 ggatcaggct acttcaagat gactgatgtg tcctttgaca gcgacacctt gggcaaaatc 240 aagatccgca atggaaagtc tgatgcacag atgaaggaag aagatgcgga tcttgtcatc 300 actcccgtgg agggccgagc actcgaagtg actgtggggc agaatctcac ctttgaggga 360 acattcaagg tgtggaacaa cacatcaaga aagatcaaca tcactggtat gcagatggtg 420 ccaaagatta acccatcaaa ggcctttgtc ggtagctcca acacctcctc cttcaccccc 480 gtctctattg atgaggatga agttggcacc tttgtgtgtg gtaccacctt tggcgcacca 540 attgcagcta ccgccgqtgg aaatcttttc gacatgtacg tgcacgtcac ctactctggc 600 actgagaccg agtaa 615 <210> 3 <211> 184 <212> PRT < 213 >白班症病毒 <400〉 3 Met Glu Phe Gly Asn Leu Thr Asn Leu Asp Val Ala lie lie Ala lie 1 5 10 15 Leu Ser lie Ala lie lie Ala Leu He Val He Met Val He Met lie 20 25 30 Val Phe Asn Thr Arg Val Gly Arg Ser Val Val Ala Asn Tyr Asp Gin 35 e 40 45 Met Met Arg Val Pro lie Gin Arg Arg Ala Lys Val Met Ser He Arg 50 . 55 60 Gly Glu Arg Ser Tyr Asn Thr Pro Leu Gly Lys Val Ala Met Lys Asn 65 70 75 80 Gly Leu Ser Asp Lys Asp Met Lys Asp Val Ser Ala Asp Leu Val lie 85 90 95 Ser Thr Val Thr Ala Pro Arg Thr Asp Pro Ala Gly Thr Gly Ala Glu 100 105 110 Asn Ser Asn Met Thr Leu Lys lie Leu Asn Asn Thr Gly Val Asp Leu 115 120 125 Leu lie Asn Asp He Thr Val Arg Pro Thr Val lie Ala Gly Asn lie 130 135 140 Lys Gly Asn Thr Met Ser Asn Thr Tyr Phe Ser Ser Lys Asp lie Lys 145 150 155 160 Ser Ser Ser Ser Lys lie Thr Leu lie Asp Val Cys Ser Lys Phe Glu (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝----Ί J--訂----- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -42 - 1266802 A7 B7 五、發明説明（40 ) 165 1*70 175 Asp Ala Gin Pro Ser Lys Leu Gin .180 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 4 <211> 204 <212> PRT <213>白斑症病毒 <400> 4 Met Asp Leu Ser Phe Thr Leu Ser Val Val Ser Ala He Leu Ala He 1 5 10 15 Thr Ala Val lie Ala Val Phe He Val lie Phe Arg Tyr His Asn Thr 20 25 30 Val Thr Lys Thr lie Glu Thr His Thr Asp Asn lie Glu Thr Asn Met 35 40 45 Asp Glu Asn Leu Arg He Pro Val Thr Ala Glu Val Gly Ser Gly Tyr 50 · 55 6〇 Phe Lys Met Thr Asp Val Ser Phe Asp Ser Asp Thr Leu Gly Lys lie 65 70 75 80 Lys He Arg Asn Gly Lys Ser Asp Ala Gin Met Lys Glu Glu Asp Ala .85 90 95 Asp Leu Val lie Thr Pro Val Glu Gly Arg Ala Leu Glu Val Thr Val 100 105 110 Gly Gin Asn Leu Thr Phe Glu Gly Thr Phe Lys Val Trp Asn Asn Thr 115 120 125 Ser Arg Lys lie Asn lie Thr Gly Met Gin Met Val Pro Lys lie Asn 130 135 140 Pro Ser Lys Ala Phe Val Gly Ser Ser Asn Thr Ser Ser Phe Thr Pro 145 150 155 160 Val Ser He Asp Glu Asp Glu Val Gly Thr Phe Val Cys Gly Thr Thr 165 170 175 Phe Gly Ala Pro lie Ala Ala Thr Ala Gly Gly Asn Leu Phe Asp Met 180 185 190 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 竿訂

本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 43 - 1266802 A7 B7 五、發明説明（41 )

Tyr Val His Val Thr Tyr Ser Gly Thr Glu Thr Glu 195 200 <210> 5 <211> 39 <212> PRT <213>白斑症病毒 <400> 5 Met His Met Trp Gly Val Tyr: Ala Ala lie Leu Ala Gly Leu Thr Leu 1 5 l〇 15 He Leu Val Val lie Ser He Val Val Thr Asn He Glu Leu Asn Lys 20 25 30 Lys Leu Asp Lys Lys Asp Lys 35 · (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213〉人造序列、 <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> Xaa = Gly or Val <220> <221> UNSURE <222> (17) <223> Xaa = Pro or Ala or Thr <400> 6 He Val Leu He Ser lie Xaa He Leu Val Leu Ala Val Met Asn Val 1 5 15 Xaa Met Gly Pro Lys Lys Asp Ser 20 <210> 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -44- 裝：；訂， 1266802 A7 B7 五、發明説明（42 ) <211> 25 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子序列 <400> 7 caqaattctc datngtyttn gtnac 25 <210〉 8 <211> 25 <212> DNA <213〉人造序列 ! <220> <223>人造序列之說明：引子序列 <400> 8 cagaattcat ggayytnwsn ttyac 25 • <210> 9 <211> 615 <212> DNA · <213>白斑症病毒 <400> 9 atggaatttg gcaacctaac aaacctggac gttgcaatta ttgcaatctt gtccattgca 60 atcattgctc taatcgttat catggttata atgattgtat tcaacacacg tgttggaaga 120 agcgtcgtcg ctaattatga tcagatgatg cgagtcccaa ttcaaagaag qgcaaaggta 180 atgtcaattc gtggagagag gtcctacaat actcctcttg gaaaggtggc catgaagaat 240 qgtctctccg ataaggacat gaaggatgtt tctgctgatc ttgtcatctc taccgtcaca 300 gccccaagga ctgatcccgc tggcactggg gccgagaact ctaacatgac tttgaagatc 360 ctcaacaaca ctggcgtcga tctcttgatc aacgacatta ctgttcggcc aactgttatt 420 gcaggaaaca ttaagggaaa tactatgtcg aacacttact tctcgagcaa ggacattaaa 480 tcttcatctt caaaaattac cctcattgac gtgtgcagca aatttgaaga cggcgcagcc 540 ttcgaagcta caatgaacat tggattcacc tccaagaatg tgatcgatat caaggacgaa 600 atcaagaaga agtaa 615 <210> 10 <211〉 204 <212> PRT <213> 白斑症病毒本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） -45 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

m·- m.— ml _^ϋϋ —an— ——·ϋ \ V ——^ϋ ϋΜϋΒ mV ·ϋϋ . · 、v? 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1266802 A7 B7 五、發明説明（43 ) <220> · <223>人造序列之說明二引子：n是脫氡肌苷經濟部智慧財產局員工消煑合作社印裝 <400> 10 ' · Met Glu Phe Gly Asn Leu Thr Asn Leu Asp Val Ala lie lie Ala lie 1 5 10 15 Leu Ser lie Ala lie lie Ala Leu lie Val lie Met Val lie Met lie 20 25 30 Val Phe Asn Thr Arg Val Gly Arg Ser Val Val Ala Asn Tyr Asp Gin 35 40 45 Met Met Arg Val Pro lie Gin Arg Arg Ala Lys Val Met Ser lie Arg 50 55 60 Gly Glu Arg Ser Tyr Asn Thr Pro Leu Gly Lys Val Ala Met Lys Asn 65 70 · 75 80 Gly Leu Ser Asp Lys Asp Met Lys Asp Val Ser Ala Asp Leu Val lie 85 90 95 Ser Thr Val Thr Ala Ρςο Arg Thr Asp Pro Ala Gly Thr Gly Ala Glu 100 105 110 Asn Ser Asn Met Thr Leu Lys lie Leu Asn Asn Thr Gly Val Asp Leu 115 120 125 Leu lie Asn Asp lie Thr Val Arg Pro Thr Val lie Ala Gly Asn lie 130 135 140 Lys Gly Asn Thr Met Ser Asn Thr Tyr Phe Ser Ser Lys Asp lie Lys 145 150 155 160 Ser Ser Ser Ser Lys lie Thr Leu lie Asp Val Cys Ser Lys Phe Glu 165 170 175 Asp Gly Ala Ala Phe Glu Ala Thr Met Asn lie Gly Phe Thr Ser Lys 180 185 190 Asn Val lie Asp He Lys Asp Glu lie Lys Lys Lys 195 200 <210> 11 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -46- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -衣· 訂- 1266802 A7 B7 五、發明説明（44 ) <211〉 627 <212〉 DNA <213〉白班症病毒 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) <220> <22 3〉人造序列之說明：引子 <.400> 11 atgcacatgt ggggggttta cgccgctata ctggcgggtt tgacattgat actcgtggtt 60 atatctatag ttgtaaccaa catagaactt aacaagaaat tggacaagaa ggataaagac 120 gcctaccctg ttgaatctga aataataaac ttgaccatta acggtgttgc tagaggaaac 180 cactttaact ttgtaaacgg cacattacaa accaggaact atggaaaggt atatgtagct 240 ggccaaggaa cgtccgattc tgaactggta aaaaagaaag gagacataat cctcacatct 300 ttacttggag acggagacca cacactaaat gtaaacaaag ccgaatctaa agaattagaa 360 ttgtatgcaa gagtatacaa taatacaaag agggatataa cagtggactc tgtttcactg 420 tctccaggtc taaatgctac aggaagggaa ttttcagcta acaaatttgt attatatttc 480 aaaccaacag ttttgaagaa aaataggatc aacacacttg tgtttggagc aacgtttgac 540 gaagacatcg atgatacaaa taggcattat ctgttaagta tgcgattttc tcctggcaat 600 gatetgttta aggttgggga aaaataa 627 <210> 12 <211> 208 <212> PRT <213>白斑症病毒 <400> 12 '

Met His Met trp Gly Val Tyr Ala Ala lie Leu Ala Gly Leu Thr Leu

1 5 10 15 lie Leu Val Val He Ser He Val Val Thr Asn lie Glu Leu Asn Lys 20 25 30

Lys Leu Asp Lys Lys Asp Lys Asp Ala Tyr Pro Val Glu Ser Glu lie 35 40 45 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 lie Asn Leu Thr lie Asn Gly Val Ala Arg Gly Asn His Phe Asn Phe 50 55 60

Val Asn Gly Thr Leu Gin Thr Arg Asn Tyr Gly Lys Val Tyr Val Ala 65 . 70 75 80

Gly Gin Gly Thr Ser Asp Ser Glu Leu Val Lys Lys Lys Gly Asp. lie 85 90 95 lie Leu Thr Ser Leu Leu Gly Asp Gly Asp His Thr Leu Asn Val Asn 10〇 105 110 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -47 - 1266802 A7 B7 五、發明説明（45 )

Lys Ala Glu Ser Lys Glu Leu Glu Leu Tyr Ala Arg Val Tyr Asn Asn 115 120 125 Thr Lys Arg Asp lie Thr Val Asp Ser Val Ser Leu Ser Pro Gly Leu 130 135 140 Asn Ala Thr Gly Arg Glu Phe Ser Ala Asn Lys Phe Val Leu Tyr Phe 145 150 155 160 Lys Pro Thr Val Leu Lys Lys Asn Arg lie Asn Thr Leu Val Phe Gly 165 170 175 Ala Thr Phe Asp Glu Asp lie Asp Asp Thr Asn Arg His Tyr Leu Leu 180 185 190 Ser Met Arg Phe Ser Pro Gly Asn Asp Leu Phe Lys Val Gly Glu Lys 195 200 205 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <400> 13 cagaattcat gcayatgtgg ggngt 25 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝. 、1T·

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明二引子；n是脫氧肌笞 <400> 14 cagaattcyt trtcyttytt rtcnarytt 29 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -48 -

Claims

六、申請專利範圍1 附件2A : 第89 1 1 87 3 8號專利申請案中文申請專利範圍替換本民國95年7月4日修正 1 . 一種拮抗蝦感染白斑症病毒（W S S V )之藥學調製劑，其包含藥學上可接受之載體及蛋白質之混合物，每1個該蛋白質係分別由S E Q ID N〇·· 3或 1〇、SEQ ID N〇：4或SEQ ID N〇： 1 2所示之胺基酸序列所構成。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1266802 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍2 S E Q ID Ν Ο ： 3 Met Glu Phe Gly Asn Leu Thr Asr> Leu Asp Val Ala lie He Ala lie 1 5 10 15 Leu Ser He Ala lie lie Ala Leu lie Val He Met Val He Met He 20 25 30 Val Phe Asn Thr Arg Val Gly Arg Ser Val Val Ala Asn Tyr Asp Gin 35 40 45 Met Met Arg Val Pro lie Gin Arg Arg Ala Lys Vai Met Ser He Arg 50 55 60 Gly Glu Arg Ser Tyr J^sn Thr Pro Leu Gly Lys Val Ala Met Lys Asn 65 70 75 80 Giy I»eu Ser Asp Lys Asp Met Lys Asp Val Ser AIs Asp Leu Val lie 85 90 95 Ser Thr Val Thr Ala Pro Arg Thr Asp Pro Ala Gly Thr Gly Ala Glu 100 105 HO Asn Ser Asn Met Thr Leu Lys lie Leu Asn Asn Thr Gly Val Asp Leu 115 120 125 Leu lie Asn Asp He Thr Val Arg Pro Thr Val lie Ala Gly Asn lie 130 135 140 Lys Giy Asn Thr Met Ser Asn Thr Tyr Phe Ser Ser Lys Asp lie Lys 145 150 155 160 Ser Ser Ser Ser Lys lie Thr Leu He Asp Val Cys Ser Lys Phe Glu • 16'5 170 175 Asp Ala Gin Pro Ser Lys Leu Gin 180 (請先聞·#背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -2 - 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） 1266802 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製六、申請專利範圍3 S E Q ID Ν Ο ：· 4 Met Asp Leu Ser Phe 'Thr Leu Ser Val Val. Ser Ala lie Leu Ala lie •1 5 10 15 Thr Ala Val lie Ala Val Phe He Val lie Phe Arg Tyr His Asn Thr 20 25 30 Val Thr Lys Thr He Glu Thr His Thr Asp Asn He Θΐυ Thr Asn Met 35 40 . 45 Asp Glu Asn Leu Arg lie Pro Val Thr Ala Glu Val Gly Ser Gly Tyr 50 ： 55 ' 60 Phe Lys Met Thr Asp val Ser Phe Asp Ser Asp Thr Le*u Gly Lys lie 65 ΊΌ *75 80 Lys lie Arg Asn Gly bys Ser Asp Ala Gin Met iys Glu Glu Asp Ala .85 90 95 Asp Leu Val He Thr Pro Val Glu Gly Arg Ala Leu Glu Val Thr Val 100 105 110 Gly Gin Asn Leu Thr Phe Glu Gly Thr Phe Lys Val Trp Asn Asn Thr 115 120 125 Ser Arg Lys lie Asn He Thr Gly Met Gin Met Val* Pro Lys lie Asn 130 135 140 Pro Ser Lys Ala Phe Val Gly Ser Ser Asn .Thr Ser Ser Phe Thr Pro 145 150 155 260 Val Ser He Asp Glu Asp Glu Val Gly Thr Phe Val Cys Gly Thr Thr 165 170 1 175 Phe Gly Ala Pro lie Ala Ala Thr Ala Gly Gly Asn Leu Phe Asp Met 180 185 · * 190 Tyr Val His Vsl Thr Tyr Ser Gly Thr Glu Thr Glu 195 200 (請先閲·#背面之注意事項再填寫本頁) ------ I 訂*-----_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2】0Χ297公嫠） -3- 1266802 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍4S E Q ID NO： 10 Met Glu Phe Gly Asn Xeu Thr Asn Leu Asp Val Ala lie lie Ala He· 1 . 5 10 15 Leu Ser He Ala He lie Ala Leu lie Val'lie Me*t Val lie Met lie 20 25 30 Val Phe Thr Arg Val Gly Arc Ser Val Val Ala Asn Tyr Asp Gin 35 40 45 • Met Het Arg Val Pro lie Gin Arg Arg Ala hys V.al Met Ser lie Arg 50 55 60 . * % • * · Gly Glu Arg Ser Tyr Asn Thr Pro Leu Gly Lys Val Ala Met Lys-Asn 65 70 *75 80 Gly Leu Ser Asp. Lys Asp Met Lys Asp Val Ser Ala Asp Leu Val lie 85 90. 95 Ser Thr Val Thr Ala Pro Arg Thr Asp Pro Ala Gly Thr Gly Ala 100 105 110 Asn. Ser Asn Het Thr Leu Lys lie Leu Asn Asn Thr Gly VaX Asp Leri .115 120 1 125 * Leu lie Asn Asp He Thr Val Arg Pro Thr Val lie Ala Gly Asn lie 130 . 135 140 Lys Gly Asn Thr Met Ser Asn Thr Tyr Phe Ser Ser Lys Asp lie Lys 145 150 155 160 •- . S它r· Ser Ser Ser Lys He Thr Leu He Asp Val Cys Ser Lys Phe Glu 165 170 . 175 Asp Gly Ala Ala Phe Glu Ala Thr Met Asn lie Gly Phe Thr Ser Lys 180 185 190 · (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Asn Val Il*e Asp lie Lys Asp Glu He Lys Lys Lys 195 200 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -4- 1266802 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍5 SEQIDN〇：12 Wet His Wet Trp Giy VaH Tyr Ala Ala lie Leu Ala Gly Leu Thr l»eu 1 5 10 15 lie Leu Val Val lie Ser He Vai Val Thr Asn lie 6l*u Leu Asn Lys 20 25 30 Lys Leu Lys Lys Asp Lys Asp Ala Tyr Pro Val Glu Ser Glu He 35 40 45 lie Asb Leu Thr lie Asn Gly Val Ala Arg Gl.y Asn His Phe Asn Phe* 50 55 60 * Val Asn Gly Thr Leu Gin Thr Arg Asn Tyr Gly Lys Val Tyr Val Ala 65 # 70 75 80 :Gly Gin Gly Thr Ser Asp Ser Glu Leu Vai Lys Lys Lys Gly Asp lie 85 90 S5 lie Leu Thr Ser Leu Leu Gly Asp Gly Asp His Thr Leu Asn Val Asn 100 105 I 110 Lys Ala Glu Ser iys Glu Leu Glu Leu Tyr Ala Arg Val Tyr Asn Asn 115 120 125 Thr l»ys Arg Asp He Thr Val Asp Ser Val Ser Leu Ser Pro Gly Leu 130 * , 135 140 Asn Ala Thr Gly Arg Glu Phe Ser Ala Asn Lys Phe Val Leu Tyr Phe 145 150 155 160 Lys Pro Thjr Val Leu Lys Lys Asn Arg He Asn Thr Leu Val Phe Gly 165 HO 175 Ala Thr Phe Asp Glu Asp He Asp Asp Thr Asn Arg His Tyr Leu Leu 180 · 185 190 Ser Met Arg Phe Ser Pro Gly Asn Asp Leu Phe hys Val Gly Glu Lys 195 200 205 2 · —種源自白斑症病毒之結構蛋白質，其特徵在於該蛋白質係由SEQ ID N〇·· 12所示之胺基酸序列所構成。本纸張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲·#背面之注意事項再填寫本頁) .i. 、tT 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -5- 1266802 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製六、申請專利範圍6 S E Q ID N 〇：1 2 Met His Met Trp Gly Val Tyr Ala Ala He Leu Ala Gly Leu Thr Leu 1 5 10 15 He Le\i Val Val lie Sex He Val Val Thr Asn lie Glu Leu Asn Lys 20 25 30 Lys Leu Asp Lys Lys Asp Lys Asp Ala Tyr Pro Val Glu Ser Glu lie 35 * 40 45 lie Asn Leu Thr lie Asn Gly Val Ala Arg Gly Asn His Phe Asn Phe 50 55 60 Val Asn Gly Thr Leu Gin Thr Arg Asn Tyr Gly Lys Val Tyr Val Ala 65 . 70 75 80 Gly Gin Gly Thr Ser Asp· Ser Glv Leu Val Lys Lys Lys Gly Asp lie 85 90 95 He Leu Thr i5er Leu Leu Gly Asp Gly Asp His Thr Leu Asn Val Asn 100 105 110 * • Lys Ala Gl\}. Ser Lys Glu Leu Glu Leu Tyr Ala Arg Val Tyr Asn Asn 115 120 125 *Thr-Lys Arg Asp lie Thr Val Asp Ser Val Ser. Leu Ser Pro Gly Leu .130· 135 140 Asn Ala Thr Gly Arg Glu Phe Ser Ala Asn Lys Phe Val Leu Tyr Phe 145 150 ：155 160 Lys Pro Thr Val Leu Lys Lys Asn Arg lie Asn Thr Leu Val Phe Gly 165 -170 ' 1Ί5 Ala Thr Phe Asp Θΐυ Asp lie Asp Asp Thr Asn Arg His Tyr Leu Leu 180 · . 185 190 . Ser Met Arg Phe Ser Pro Gly Asn Asp Leu Phe Lys Val Gly Glu Lys 195 200 205 3 · —種申請專利範圍第2項之結構蛋白質作爲拮抗蝦感染白斑症病毒（WS SV)之免疫成份上之用途。 4 · 一種拮抗蝦感染白斑症病毒（W S S V )之藥學調製劑，其包含藥學上可接受之載體或載劑及拮抗 W S S V之結構蛋白質V P 2 8的抗體。本紙張尺度適用中國國家摞準（CNS ) A4规格（2】0X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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