KR100489617B1

KR100489617B1 - 흰반점바이러스 감염의 예방 및 치료를 위한 수용성 항체단백질 및 이를 포함한 알, 및 이들의 제조방법

Info

Publication number: KR100489617B1
Application number: KR10-2002-0057892A
Authority: KR
Inventors: 김정우; 김도균; 이경화; 신순오; 양시용; 안태영
Original assignee: 주식회사 단바이오텍; 김정우
Priority date: 2002-09-24
Filing date: 2002-09-24
Publication date: 2005-05-17
Also published as: KR20040026426A

Abstract

본 발명은 흰반점바이러스 감염의 예방 및 치료를 위한 수용성 항체 단백질 및 이를 포함한 알, 및 이들의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 흰반점바이러스 유래의 단백질을 유전자 재조합으로 제조한 후, 이를 항원으로 사용하여 면역화시킨 산란계로부터 산란되고, 새우, 게, 가재 등의 갑각류를 폐사시키는 흰반점바이러스에 의한 감염을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 항체 단백질을 포함한 알 및 이러한 알의 난황으로부터 분리되고, 흰반점바이러스의 감염을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 항체 단백질에 관한 것이다. 또한, 이들의 제조방법 및 이 수용성 항체 단백질을 포함하는 백신 및 진단키트에 관한 것이다.

Description

흰반점바이러스 감염의 예방 및 치료를 위한 수용성 항체 단백질 및 이를 포함한 알, 및 이들의 제조방법{Soluble antibody protein for prophylaxis and treatment of white spot syndrome virus infection, eggs containing thereof and method for producing thereof}

본 발명은 흰반점바이러스 감염의 예방 및 치료를 위한 수용성 항체 단백질 및 이를 포함한 알, 및 이들의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 흰반점바이러스 유래의 단백질을 유전자 재조합으로 제조한 후, 이를 항원으로 사용하여 면역화시킨 산란계로부터 산란되고, 새우, 게, 가재 등의 갑각류를 폐사시키는 흰반점바이러스의 감염을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 항체 단백질을 포함한 알 및 이러한 알의 난황으로부터 분리되고, 흰반점바이러스의 감염을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 항체 단백질에 관한 것이다. 또한, 이들의 제조방법 및 이 수용성 항체 단백질을 포함하는 백신 및 진단키트에 관한 것이다.

흰반점바이러스(White Spot Syndrome Virus(WSSV))는 전세계에 폭넓게 분포되어 있는 바이러스로, 바이론 말단 부위에 꼬리와 유사한 부착물을 갖고, rod 형태의 캡시드(capsid) 및 피막(envelop)이 존재하는 난형의 바실러스와 유사한 형태를 가지고 있어, 베큘로바이러스 또는 바실러스 유사형 바이러스(bacillus-like formed virus)라 불리었으나, 최근에는 유전학적으로 새로운 바이러스 그룹인 whispovirus로 명명되고 있다(Van Hulten, M.C.W et al., Analysis of a genomic segment of white spot syndrome virus of shrimp containing ribonucleotide reductase genes and repeat region, J. Gen. Virol., 2000). 이 바이러스의 길이는 약 275nm이고, 직경이 약 120nm이며, 약 290kb의 크기를 갖는 2중 나선 DNA(double-stranded DNA)로 구성되어 있다.

흰반점바이러스는 주로 새우, 가재, 게 등의 갑각류에 감염되는데, 특히 새우에 감염되면 새우의 갑피(carapace), 외지(appendage) 및 큐티클에 흰반점이 나타나고, 새우의 간췌장(hepatopancreas)이 붉은색을 띠게 되며, 감염 후 3 내지 5일이 경과하면 폐사하게 된다. 따라서, 흰반점바이러스의 급증은 새우 양식업 등에 막대한 손해를 일으키게 되므로, 흰반점바이러스의 감염을 예방 및 치료할 수 있는 백신 등에 대한 필요성이 점점 증대되고 있다.

따라서, 흰반점바이러스의 감염을 예방 및 치료하기 위한 백신 등을 제조하기 위하여 많은 연구가 이루어지고 있는데, 일예로, 항혈청(Van Hulten M.C.W et al., White spot syndrome virus envelope protein VP28 is involved in the systemic infection of shrimp, Virology, 2001)이나 단일클론항체(Zhan W.B, Neutralization by monoclonal antibodies against white spot syndrome virus in vivo of crayfish, cambarus proclarkii. 3rd Korea-Japan-China joint symposium for the exchange of marine and fishery science and technology, 2002)를 이용하여 항체를 개발하는 방법이 보고되었다. 그러나, 이 경우 다량의 바이러스 및 혈청항체를 얻는데 경비가 많이 소요되고, 이들의 분리 및 보관에 따른 기술적 문제점 등으로 인하여 실용적이지 못한 문제점이 있다. 또한, 초유항체의 경우에는 초유가 제한된 기간에만 분비되기 때문에 충분한 양의 초유항체 생산이 불가능한 실정이다.

따라서, 본 발명자들은 산란계의 알을 이용한 항체단백질에 대한 연구에 의해 산란계의 알에 함유되어 있는 난황이 특이항체의 풍부한 자원이 될 수 있다는 사실(Gassmann, et al., FASEB J., 4, 2528-2538 (1990))로부터, 산란계를 면역화시키는 방법으로 흰반점바이러스에 대한 항체를 생산하여 흰반점바이러스의 감염에 의한 갑각류의 폐사를 예방 및 치료하고자 하였다.

그러나, 산란계에 바이러스 항체를 유도하기 위해서는 생균이나 약독화 또는 불활성화된 바이러스를 사용하여야 하는데, 바이러스 자체를 항원으로 사용하는 경우에는 바이러스 내에 여러 이종 단백질이 많이 함유되어 있기 때문에 단일항원을 사용하는 경우에 비해 항체 역가가 높게 나타나지 않는 단점이 있다. 더구나, 흰반점바이러스의 경우에는 숙주세포가 아직 밝혀지지 않아 계대배양이 어렵기 때문에 생균이나 약독화 또는 불활성화된 바이러스를 항원으로 이용한다는 것이 현실적으로 불가능한 상황이다.

이에, 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하기 위해서 연구한 결과, 종래 흰반점바이러스의 병원성 인자로 알려져 흰반점바이러스의 예방 및 치료를 위한 백신 등에 사용되고 있는 흰반점바이러스 유래의 구조단백질 VP28, VP19, VP26 및 VP24(국제 공개 WO 01/09340 참조)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 2종 이상을 포함하는 융합 단백질을 유전자 재조합에 의해 제조하고, 이를 항원으로 이용하여 산란계에 면역시킨 후 면역화된 산란계로부터 산란된 알의 난황에서 수용성 항체 단백질을 분리하여 흰반점바이러스에 대한 중화 테스트를 실시한 결과, 흰반점바이러스에 대한 중화율이 높게 나타남으로써 이 수용성 항체 단백질이 갑각류의 폐사를 예방 및 치료하는데 유용한 항체로 사용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 흰반점바이러스 유래의 구조단백질 VP28, VP19, VP26 및 VP24를 유전자 재조합에 의해 제조하고, 이를 항원으로 이용하여 산란계를 면역시킨 후, 면역화된 산란계로부터 산란된 알의 난황에서 분리된 수용성 항체 단백질들도 흰반점바이러스에 대한 중화율이 높게 나타나 갑각류의 폐사를 예방 및 치료하는데 유용한 항체로 사용될 수 있음을 확인하였다.

따라서, 한 가지 관점으로서, 본 발명은 갑각류 폐사를 유발하는 흰반점바이러스 감염의 예방 및 치료를 위한 항체를 제조하는데 있어서 항원으로 사용되는 융합 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 제공한다.

다른 관점으로서, 본 발명은 (a) 흰반점바이러스 유래의 구조단백질 VP28, VP19, VP26 및 VP24를 코딩하는 유전자들로 이루어진 군에서 선택된 적어도 2종 이상의 유전자를 결합시킨 다음, 이 결합유전자를 유전자에 작동 가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키는 단계; (b) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질 전환시키는 단계; (c) 생성된 형질 전환체를 상기 결합 유전자의 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건하에서 배양하는 단계; 및 (d) 배양된 형질전환체를 파쇄시키고 파쇄물로부터 융합 단백질을 분리, 정제하여 융합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질의 제조방법을 제공한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 흰반점바이러스 유래 단백질을 항원으로 하여 면역화된 산란계로부터 산란되고, 흰반점바이러스의 감염을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 항체 단백질을 포함하는 알을 제공한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 흰반점바이러스 유래 단백질을 항원으로 하여 면역화된 산란계로부터 산란된 알의 난황으로부터 분리되고, 흰반점바이러스의 감염을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 항체 단백질을 제공한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 흰반점바이러스 유래 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터에 삽입시키는 단계; (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기의 적절한 배지 및 조건하에서 배양하는 단계; (d) 배양된 형질전환체를 파쇄시키고 파쇄물로부터 재조합 단백질을 분리· 정제하여, 재조합 단백질을 수득하는 단계; (e) 수득된 재조합 단백질로 산란계를 면역화시키는 단계; (f) 면역화된 산란계로부터 알을 산란시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하여, 흰반점바이러스의 감염을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 항체 단백질을 포함한 알을 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 흰반점바이러스 유래 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터에 삽입시키는 단계; (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기의 적절한 배지 및 조건하에서 배양하는 단계; (d) 배양된 형질전환체를 파쇄시키고 파쇄물로부터 재조합 단백질을 분리· 정제하여, 재조합 단백질을 수득하는 단계; (e) 수득된 재조합 단백질로 산란계를 면역화시키는 단계; (f) 면역화된 산란계로부터 알을 산란시키는 단계; (g) 산란된 알의 난황으로부터 수용성 항체 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하여, 흰반점바이러스의 감염을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 항체 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 수용성 항체 단백질 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하여, 흰반점바이러스의 감염을 예방 및 치료하기 위한 백신을 제공한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 수용성 항체 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하여, 흰반점바이러스를 검출하기 위한 진단키트를 제공한다.

본 발명에 있어서 갑각류의 폐사를 유발하는 흰반점바이러스의 병원성인자로서는 흰반점바이러스의 피막 단백질 VP28과 VP19, 흰반점바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 VP26과 VP24로 이루어진 군에서 선택된 적어도 2종 이상을 포함하는 융합단백질을 유전자 재조합으로 제조하여 사용한다. 또한, 흰반점바이러스 유래의 구조단백질 VP28, VP19, VP26 및 VP24를 유전자 재조합으로 제조하여 사용한다. 여기서 갑각류는 새우, 가재, 바다가재, 참새우, 게 등을 의미한다.

유전자 재조합에 의한 융합 단백질의 제조는 공지 기술을 사용할 수 있다. 일반적인 유전자 재조합에 의한 융합 단백질의 제조는 병원체로부터 게놈 RNA 또는 DNA를 분리하고, 이로부터 중합효소 연쇄반응을 실시하여 cDNA를 제조하며, 생성된 cDNA를 주형으로 하여 결합시키고자 하는 각각의 표적유전자를 증폭하고, 상기 각각의 표적유전자를 결합시킨 다음, 결합 유전자의 DNA 서열을 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터에, 그 DNA 서열과 작동가능하게 연결되어 그 DNA 서열의 발현을 조절할 수 있도록 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질감염 또는 형질전환시키며, 생성된 형질감염 또는 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기의 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, 배양된 형질전환체로부터 생성된 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 단계로 구성된다. 이때, 상기에서와 같이 유전자들을 먼저 결합한 후, 결합 유전자가 발현되도록 벡터에 삽입할 수 있지만, 결합시키고자 하는 유전자중 하나의 유전자를 벡터에 삽입시키고, 다시 이 벡터에 다른 유전자를 삽입하여 유전자들이 결합되게 할 수도 있다. 제조된 융합 단백질 중, 피막단백질인 VP28과 VP19로 이루어진 TrVP28:19의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되고, 이를 코딩하는 유전자의 염기서열은 서열번호 1로 표시된다. 융합 단백질 이외의 다른 재조합 단백질도 일반적인 유전자 재조합 방법에 의해 제조한다.

흰반점바이러스의 게놈 DNA는 흰반점바이러스를 새우에 인공 감염시킨 후, 감염된 새우로부터 다시 분리한 흰반점바이러스를 배양용 배지에 접종하여 적합한 배양조건하에서 배양하여 균체를 획득한 다음, 여기에 용해완충용액을 가하여 균체를 용균시키고, 원심분리하여 획득한 상청액으로부터 단백질과 RNA 등을 제거하여 순수한 RNA만을 추출함으로써 획득할 수 있다. 흰반점바이러스의 배양용 배지로는 특별히 한정되지는 않으나 트립톤, 효모추출물 및 NaCl로 구성된 LB배지를 사용한다. 바람직한 배양 조건으로는 배양 온도 범위 30℃ 내지 40℃ 에서 10시간 내지 30시간 배양한다. 배양액의 원심분리는 10,000rpm 내지 15,000rpm에서 1분 내지 10분간 실시한다. 본 발명에서는 미국 아리조나 대학으로부터 분양받은 흰반점바이러스와 흰반점바이러스의 게놈 DNA를 사용하는 것이 바람직하다.

흰반점바이러스 유래의 단백질 VP28, VP19, VP26 및 VP24를 코딩하는 유전자들은 상기 흰반점바이러스 게놈 DNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응으로 증폭함으로써 제조할 수 있다. 중합효소 연쇄반응에 사용되는 시발체는 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)을 제외한 수용성 펩타이드만을 반응시키기 위해 유전자 은행에서 획득한 vp28, vp19, vp26 및 vp24의 염기서열(AF173993, AF369029, AF173992 및 AF228518)을 참고로 하여 합성한다.

제조된 유전자는 적합한 벡터에 클로닝한다. 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 예를 들어, pUC8, pBR322, pET/Rb, pMAL-c2x, pET28a 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 pGEX.4T.1(phamacia)를 사용한다. 본 발명에 예시된 발현 벡터는 흰반점바이러스의 피막단백질 VP28과 V19로 이루어진 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 DNA 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 pGdk, 피막 단백질 VP28을 코딩하는 유전자의 DNA 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 pGEX:TrVP28, 뉴클레오캡시드 단백질 VP26을 코딩하는 유전자의 DNA 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 pGEX:TrVP26, 뉴클레오캡시드 단백질 VP24를 코딩하는 유전자의 DNA 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 pGEX:TrVP24 등이 있다.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다. "숙주 세포"는 원핵 또는 진핵세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 예를 들면 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 대장균을 사용한다.

본 발명의 재조합 플라스미드를 상기 숙주세포에 형질전환하는 방법은 통상의 형질전환 방법, 예를 들어 DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트법, 일렉트로포레이션 방법 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(isoprophyl-β-D-thiogalatopyranoside; IPTG)를 첨가하는 방법을 사용한다.

형질전환체 또는 형질감염체 및 이의 배양물로부터 재조합 단백질을 분리하는 것은 통상적인 공지의 방법에 의해 실시될 수 있다. 불필요한 세포 조각(cell debris) 등을 제거하기 위해 세포 용해물 또는 세포 배양물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 적용한다. 예를 들어, 이온교환 크로마토그래피, 겔-침투 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼 등은 컬럼 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따라 형질전환된 대장균을 초음파 파쇄한 후 약 4℃에서 5,000 내지 9,000Xg, 10분 내지 40분 원심분리하여 상청액을 회수하고 회수한 상청액을 컬럼을 이용하여 순수한 단백질 분획을 분리한다.

본 발명에 따라 제조된 상기 재조합 단백질을 항원으로 사용하여 산란계에 면역화시키는 방법은 당 분야의 통상적인 기술에 따라 실시할 수 있다. 본 발명에 이용되는 산란계로는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 산란율이 높은 백색레그혼계, 로드아일랜드계, 하이라인 브라운계 등을 이용하는 것이 바람직하다. 산란계에 항원 단백질을 투여하는 경로로는 복멤브레인내, 근육내, 안내 또는 피하 주사 등이 포함된다. 본 발명의 항원 단백질은 보조제, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 사용하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.

추가항원접종(booster)은 충분한 항체가 얻어질 때까지 실시할 수 있다. 바람직하게는 약 2주 간격으로 3회 내지 4회 면역을 실시하고, 다음 접종은 약 8주 간격으로 실시한다. 면역화된 산란계로부터 알을 수집하고 이로부터 목적하는 단백질을 분리한 다음 유도된 단백질의 양을 측정하여 그 증가량이 정체 상태에 도달하면, 최종적으로 알을 회수한다.

본 발명에 따른 수용성 항체 단백질은 상기 회수된 알에서 난황을 분리하고, 이를 증류수로 희석한 다음, 상기 희석액의 pH를 4.0 내지 6.0으로 조절한 후 동결시키고, 동결체를 해동시킨 다음, 원심분리하여 얻어진 상청액을 여과하여 분리할 수 있다. 바람직하게는 회수된 알에서 난황을 분리하고 증류수를 가하여 5배 내지 15배로 희석한 다음, 희석액의 pH를 약 5.0으로 조절한 후 -10℃ 내지 -30℃ 에서 24시간 이상 동결시키고, 동결체를 실온에서 해동시켜 5,000 내지 15,000×g, 10℃ 내지 20℃ 에서 20 내지 40분간 원심분리하며, 형성된 상청액을 여과지로 여과하여 분리한다.

유도된 단백질 양의 측정은 당 분야의 통상적인 방법에 따라 측정할 수 있으며, 바람직하게는 효소면역흡착법 또는 마이크로타이터법으로 측정한다. 더욱 바람직하게는 마이크로플레이트에 부착된 재조합 단백질과 본 발명에 따라 면역화된 알의 난황으로부터 분리한 수용성 항체 단백질을 반응시킨 다음 알칼린 포스페이트로 희석한 2차항체를 반응시키고 여기에 기질용액으로 포스페이트 섭스트레이트 타블레트를 가하여 효소의 작용에 의한 발색반응을 405nm 파장에서 측정함으로써 유도된 단백질의 양을 정량하는 방법인 효소면역측정법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay; ELISA)을 사용한다.

본 발명에 따라 생성된 알의 난황으로부터 분리된 수용성 항체 단백질의 면역원성을 중화 테스트로 확인한다. 그 결과, 본 발명의 수용성 항체 단백질은 흰반점바이러스에 대한 중화율이 높게 나타났으므로, 흰반점바이러스의 감염에 의한 갑각류의 폐사를 예방 및 치료하는데 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 수용성 항체 단백질은 갑각류에의 흰반점바이러스 감염을 예방 및 치료하기 위한 백신에 포함된다. 즉, 본 발명에 따른 백신은 유효한 양의 수용성 항체 단백질과 약리학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 여기서, 용어 "유효한 양"은 갑각류에서 면역반응을 유도하기에 충분한 양을 의미한다. 약리학적으로 허용가능한 담체는 멸균수, 염수, 완충액, 알코올, 폴리올 등을 의미한다.

백신이 사용되는 갑각류는 그 종류가 특별히 한정되지 않지만, 새우, 참새우(prawn), 바다가재, 가재, 게 등이 있다.

백신은 일반적인 백신의 제조방법에 의해 제조할 수 있는데, 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences(A.R. Gennaro et al., Chapter 72, pp. 1389-1404, Philadelphia Chollege of Pharmacy and Science, 18th edition, 1990)에 기재되어 있는 방법으로 제조할 수 있다.

백신의 사용량은 백신의 형태, 투여경로, 투여시간, 바이러스의 감염상태 등에 따라 다르지만, 일반적으로 갑각류당 0.01 내지 1000㎍의 단백질, 바람직하게는 0.5 내지 500㎍의 단백질, 더 바람직하게는 0.1 내지 100㎍의 단백질이 투여되도록 사용된다.

본 발명의 백신은 주사, 침지, 스프레이, 경구 등의 경로에 의해 갑각류에 투여할 수 있다. 특히, 갑각류를 양식하는 경우에는 침지 또는 경구로 투여하는 것이 바람직하다. 경구를 통해 백신으로 투여하는 경우에는 적절한 담체와 함께 혼합하여 투여하는 것이 바람직하다. 이러한 담체로는 셀룰로오스, 사료, 대사물질 등이 있다.

본 발명에 따른 수용성 항체 단백질은 흰반점바이러스의 검출을 위한 진단키트에 포함될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

흰반점바이러스의 vp28, vp19, vp26 및 vp24 유전자 클로닝

흰반점바이러스와 흰반점바이러스의 게놈 DNA는 미국 아리조나 대학에서 분양받아서 사용하였다.

흰반점바이러스의 vp28 유전자 및 vp19 유전자의 클로닝에 사용되는 시발체는 예상되는 트랜스멤브레인 도메인(http://www.cbc.dtu.dk/ 참조)의 C-말단과 N-말단 아미노산 잔기를 제외하고, 유전자은행(EMBL, Nucleotide Sequence Database, Cambridge, U.K.)에서 얻은 흰반점바이러스(human rotavirus Wa strain) vp28 유전자와 vp19 유전자의 염기서열(AF173993, AF369029)을 참고로 하여 합성하였다. 이때, 각 시발체의 말단에 BamHI 과 SalI 혹은 SalI 과 HindⅢ 제한효소 인식부위를 삽입하였다. 합성된 시발체는 다음과 같다.

vp28의 정방향 시발체 : 5'-GTAGGATCCACTGTGACCAAGACCATCGAA-3'

역방향 시발체 : 5'-GTAGTCGACAATTGGTGCGCCAAAGGTGGTA-3'

vp19의 정방향 시발체 : 5'-CTGTCGACGCCACCACGACTAACACT-3'

역방향 시발체 : 5'-CTAAGGTTCTGCCTCCTCTTGGGG-3'

먼저 vp28 유전자를 클로닝하기 위하여, 흰반점바이러스의 게놈 DNA 50㎕, 상기 정방향 시발체 20pmol, 역방향 시발체 20pmol, 250μM dNTP, 2.5unit Taq DNA 중합효소의 조성으로 PCR을 수행하였다. PCR조건은 94℃ 45초, 56℃ 45초, 72℃ 1분을 한 회전으로 하여 30회전을 수행하였다. 아가로스 전기영동으로 증폭된 유전자를 확인하였다. 제한효소 BamHⅠ과 SalⅠ으로 증폭된 유전자를 처리한 후, pGEX.4T.1(Amersham pharmacia Biotech)에 클로닝하여 플라스미드 pGEX:TrVP28을 작성하였다.

vp19 유전자도 상기 vp19의 정방향 시발체와 역방향 시발체를 사용하여 상기와 동일한 방법으로 PCR을 수행하여 vp19 유전자를 증폭하고, 제한효소 SalⅠ과 HindⅢ로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리한 상기 플라스미드 pGEX:TrVP28에 클로닝하여 vp28 유전자 및 vp19 유전자 순서로 융합된 유전자를 포함하는 플라스미드 pGdk를 작성하였다. 재조합 플라스미드 pGdk의 작제 지도는 도 1과 같다. 융합 유전자 TrVP28:19의 염기서열은 서열번호 1에 나타내었다.

한편, 흰반점바이러스의 중화항체 형성에 관여하는 것으로 알려진 흰반점바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 VP26과 VP24를 코딩하는 유전자도 상기에서와 동일한 방법으로 클로닝하여 pGEX:TrVP26과 pGEX:TrVP24를 작성하였다. 이때, 사용된 시발체는 vp26과 vp24의 염기서열(AF173992와 AF228518)을 참고로 다음과 같이 합성하였다.

vp26의 정방향 시발체 : 5'-GTAGGATCCGTCCTAATCGTTATCATGGTTA-3'

역방향 시발체: 5'-GTAGTCGACTTACACATTCTTGGAGGTGAATCC-3'

vp24의 정방향 시발체 : 5'-GTAGGATCCGACAAGAAGGATAAAGACGCC-3'

역방향 시발체: 5'-CTAGTCGACTTACCCAACCTTAAACAG-3'

각각의 재조합 플라스미드 pGEX:TrVP28, pGdK, pGEX:TrVP26 및 pGEX:TrVP24를 대장균 JM109에 형질전환시켜 양성클론을 선택하였다.

실시예 2

재조합 단백질의 발현 및 정제

재조합 플라스미드 pGdk를 형질전환시켜 얻은 상기 실시예 1의 양성클론 10㎖를 암피실린을 포함한 LB 배지에 접종한 후, 하룻밤동안 37℃에서 진탕 배양하였다. 준비된 1000㎖의 LB 배지에 밤새 배양된 대장균을 접종하여 흡광도(A₆₀₀)가 1.0이 되도록 진탕배양하고 발현을 유도하기 위해 0.5mM의 IPTG를 가하여 37℃ , 25℃ 또는 20℃ 에서 16시간 더 배양한 다음, SDS-PAGE와 웨스턴 블럿으로 발현을 확인하였다(도 2 참조).

발현이 확인된 대장균을 원심분리(8,000rpm, 20분, 4℃ )하여 대장균 펠렛을 얻은 다음, 이를 완충액(20mM Tris-HCl pH 7.4, 200mM NaCl, 1mM EDTA)으로 현탁시켰다. 현탁액을 초음파 파쇄를 실시한 후, 원심분리(9,000×g, 30분, 4℃ )하여 상청액을 취한 뒤, 컬럼 완충액 PBS로 적당히 희석하여 Sepharose-4B 컬럼에 로딩하였다. 컬럼 완충액으로 세척하고, 50mM의 Tris-HCl(pH 8.0)과 10mM의 글루타치온을 함유하는 용출완충액으로 단백질 분획을 얻어 내었으며, BCA 분석 키트(price)로 정량한 결과, 대장균 1ℓ 배양시 1.5㎎의 융합 단백질 TrVP28:19를 얻었다.

상기 실시예 1에서 얻은 다른 양성클론들도 상기에서와 동일한 방법으로 발현시킨 뒤, 정제하여 재조합 단백질 TrVP28, TrVP26 및 TrVP24를 얻었다.

실시예 3

웨스턴 블럿 분석

상기 실시예 2에서 분리한 융합 단백질 TrVP28:19, TrVP28, TrVP26 및 TrVP24를 각각 웨스턴 블럿 시료 완충용액에 첨가시킨 다음 95℃ 에서 5분간 방치시키고 SDS-PAGE를 시행하였다. SDS-PAGE로 분리된 각각의 단백질을 니트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane)으로 옮기고, 흰반점바이러스 항혈청과 VP28의 단클론항체를 프라이머리 항체로 사용, 웨스턴 블럿을 실시하였다. 그 결과, 단클론항체를 사용한 경우에는 분자량이 약 45kDa인 단백질 TrVP28이 확인되었고, 나머지 3개의 단백질에서는 반응이 나타나지 않았다(도 3a 참조).

또한, 폴리클론항체의 경우 약 59kDa의 위치에서 융합 단백질 TrVP28:19가 확인되었으며, 나머지 단백질에서는 반응이 나타나지 않았다(도 3b 참조).

실시예 4

산란계의 면역유도

(4-1) 공시동물

상기 실시예 2에서 획득한 재조합 단백질들에 대한 수용성 단백질의 유도에 사용된 동물은 산란을 시작한 36주령의 ISA-브라운계의 산란계 50수(10수 / 그룹)를 5그룹(TrVP28, TrVP28:VP19, TrVP26, TrVP24, 4가지 단백질 혼합[이하 MxWVP])으로 나누어 사용하였다.

(4-2) 면역유도

준비된 5종의 재조합 단백질(1㎎/㎖)과 프로인트의 완전 보조제(Freund's complete adjuvant, Sigma Chemical Co.)를 각각 동량 혼합하여 유화시켰다. 상기 유화액 1㎖를 산란계의 흉근에 각각 0.25㎖씩 4곳에 근육 주사하여 1차 접종하였다. 추가항원주입(Booster injection)은 1차 접종 후 2주 간격으로 총 3회 실시하였으며 다음 접종은 8주 간격으로 실시하였다. 2차 접종부터는 프로인트의 불완전 보조제(Freund's incomplete adjuvant, Gibco)로 유화하여 1차 접종과 동일한 방법으로 실시하였다. 알은 매일 회수하여 8℃에 저장하여 실험에 이용하였다.

(4-3) 수용성 항체 단백질의 분리

채집한 알에서 난황을 분리한 후 증류수로 10배 희석하였다. 희석용액의 pH를 5.0으로 조정한 후 -20℃에서 하루 동안 동결하였다. 이를 실온에서 해동시킨 후 30분간 15℃에서 10,000×g로 원심분리하여 상청액만 수거하였다. 상청액을 여과지(Whatman No.1)로 여과하여 수용성 항체 단백질을 분리하였다. 한편, 분리된 항체 단백질은 -20℃ 에 보관하면서 각종 실험의 시료로 사용하였으며 일부는 냉동건조하여 보관하였다.

(4-4) ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)분석

재조합 단백질을 각각 5 내지 10㎍/㎖이 되도록 중탄산염 완충용액(pH 9.6)으로 희석하여 마이크로플레이트(MicrotestⅢ flexible Assay plate, Falcon 3991)에 4℃ 에서 하루 동안 피복하였다. 피복이 완료된 플레이트를 세척용액(0.02M 인산 완충용액, 0.13M NaCl, pH 7.2, 0.05% 트윈20)으로 3회 세척한 후 5% 탈지유 용액(pH 7.3, Difco)으로 2시간 동안 실온에서 방치하였다. 면역화된 알의 난황으로부터 분리한 수용성 항체 단백질을 5% 탈지유 용액과 PBST(PBS containing 0.05% Tween-20)를 동량으로 섞은 희석용액으로 2,000배부터 1,458,000배까지 3배수로 희석한 후 37℃ 에서 2시간 반응시켰다. 2차 항체는 알칼린 포스페이트가 결합된 어피니퓨어 토끼 항-닭 IgY(IgG)(conjugated AffiniPure rabbit anti-chicken IgY(IgG), Jackson, USA)를 5,000배로 희석하여 37℃ 에서 2시간 반응시켰다. 기질용액으로는 인산 기질 타블렛(Phosphate substrate tablets: ρ-nitrophenyl phosphate, Sigma-104)을 10% 디에탄올아민(0.5 mM MgCl₂ pH 9.8를 포함하는 디에탄올아민)에 녹인 용액을 사용하여 20분간 효소반응시켰다. 각 과정 중 플레이트의 세척은 6회씩 실시하였다. 반응억제제는 5M 수산화나트륨을 사용하였으며 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices ;E Max)를 이용하여 405nm에서 OD(optical density)를 측정한 결과, 알 유래 단백질이 유도됨을 확인하였다(도 4a 및 4b 참조).

실시예 5

흰반점바이러스에 대한 중화테스트

(5-1) 흰반점바이러스의 감염 농도 결정

분양받은 흰반점바이러스를 1x10², 1x10⁴, 1x10⁶, 1x10⁷, 1x10 ¹⁰씩 300mM 염화나트륨으로 희석하여 2~3g의 새우 제 3~4복절 사이에 20㎕씩 30게이지 주사기로 15마리/그룹을 주사하였으며, 대조군으로 300mM 염화나트륨을 상기와 동일한 방법으로 주사하였다. 주사 후, 2주일 동안 새우의 폐사율을 조사하여, 도 5에 나타내었다.

도 5로부터, 주사 후 10일 동안의 새우의 누적 폐사율이 40~60%인 바이러스 희석농도(1x10⁷)를 흰반점바이러스의 감염 농도로 결정하였다.

(5-2) 중화 테스트

상기 [5-1]에서 결정된 흰반점바이러스의 감염 농도(1x10⁷)로 바이러스를 희석하고, 하기 표 1에 기재된 바와 같이 단백질의 농도를 조정하였다. 각각의 단백질과 바이러스 희석액을 혼합하여 실온에서 1.5시간동안 중화시켰다. 이를 준비된 새우의 제 3~4복절 사이에 20㎕씩 30게이지 주사기로 주사하였다. 대조군으로는 330mM 염화나트륨, 흰반점바이러스, 면역전 수용성 단백질을 사용하였다. 주사 후 누적 폐사율을 조사하여 제조한 수용성 항체 단백질의 중화정도를 판단하였다. 그 결과를 도 6a 및 6b에 나타내었다.

그룹 번호	마리수	형태	주사
1	15	양성 대조구	흰반점바이러스
2	15	면역전 수용성 단백질^*	면역전 수용성 단백질^*(0.5mg)
3	15	항-MxWVP (0.5mg)	바이러스+항-MxWVP (0.5mg)
4	15	항-MxWVP (0.1mg)	바이러스+항-MxWVP (0.1mg)
5	15	항-MxWVP (0.01mg)	바이러스+항-MxWVP (0.01mg)
6	15	항-TrVP28:19 (0.5mg)	바이러스+항-TrVP28:19 (0.5mg)
7	15	항-TrVP28:19 (0.1mg)	바이러스+항-TrVP28:19 (0.1mg)
8	15	항-TrVP28:19 (0.01mg)	바이러스+항-TrVP28:19 (0.01mg)
9	15	음성 대조구	330mM 염화나트륨
*: 재조합 단백질을 산란계에 면역하기 전, 알을 수거한 후 알로부터 분리한 수용성 단백질

도 6a 및 도 6b로부터 알 수 있는 바와 같이, 융합 단백질 TrVP28:19를 항원으로 사용하여 산란계를 면역화시켜 유도한 항체를 사용한 경우, 흰반점바이러스에 대한 중화율이 가장 높게 나타났다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 항원으로서 흰반점바이러스에서 유래된 재조합 단백질을 사용하여 면역화된 산란계로부터 배출된 알 및 상기 알의 난황으로부터 분리된 수용성 항체 단백질은 흰반점바이러스에 대한 중화율이 높으므로, 이를 백신, 진단키트, 약제 등으로 제형화하여 사용하면 갑각류 폐사의 원인이 되는 흰반점바이러스의 감염을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

도 1은 갑각류의 폐사를 유발하는 흰반점바이러스에서 유래된 융합 단백질 TrVP28:19를 발현시키기 위한 재조합 플라스미드 pGdk의 작제 지도이다.

도 2는 재조합 단백질의 대장균에서의 발현을 확인한 웨스턴 블럿 결과이다.

<도면 부호에 대한 설명>

M:마커, A: 배양 전,

B: 배양 후 C:용해후 원심분리하여 얻은 펠렛

D: 용해후 원심분리하여 얻은 상청액

도 3a는 재조합 단백질과 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블럿 결과이다.

도 3b는 재조합 단백질과 흰반점바이러스의 토끼항혈청을 이용한 웨스턴 블럿 결과이다.

도 4a 및 4b는 본 발명의 재조합 단백질의 ELISA 분석 결과를 나타내는 그래프로, 그래프에서 GMT(geometric mean titer)는 항체가의 기하평균값을 의미한다.

도 5은 흰반점바이러스의 감염 농도의 결정을 위한 그래프이다.

도 6a는 흰반점바이러스에 대한 항-알 유래 단백질(TrVP28:19)의 중화 테스트에 관한 그래프이다.

도 6b는 흰반점바이러스에 대한 항-알 유래 단백질(MxWVP)의 중화 테스트에 관한 그래프이다.

<110> DAN Biotech KIM, Jung Woo <120> Soluble antibody protein for prophylaxis and treatment of white spot syndrome virus infection, eggs containing thereof and method for producing thereof <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 825 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> CDS <222> (7)..(822) <400> 1 ggatcc act gtg acc aag acc atc gaa acc cac aca gac aat atc gag 48 Thr Val Thr Lys Thr Ile Glu Thr His Thr Asp Asn Ile Glu 1 5 10 aca aac atg gat gaa agc ctc cgc att cct gtg act gct gag gtt gga 96 Thr Asn Met Asp Glu Ser Leu Arg Ile Pro Val Thr Ala Glu Val Gly 15 20 25 30 tca ggc tac ttc aag atg act gat gtg tcc ttt gac agc gac acc ttg 144 Ser Gly Tyr Phe Lys Met Thr Asp Val Ser Phe Asp Ser Asp Thr Leu 35 40 45 ggc aaa atc aag atc cgc aat gga aag tct gat gca cag atg aag gaa 192 Gly Lys Ile Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Asp Ala Gln Met Lys Glu 50 55 60 gaa gat gcg gat ctt gtc atc act ccc gtg gag ggc cga gca ctc gaa 240 Glu Asp Ala Asp Leu Val Ile Thr Pro Val Glu Gly Arg Ala Leu Glu 65 70 75 gtg act gtg ggg cag aat ctc acc ttt gag gga aca ttc aag gtg tgg 288 Val Thr Val Gly Gln Asn Leu Thr Phe Glu Gly Thr Phe Lys Val Trp 80 85 90 aac aac aca tca aga aag atc aac atc act ggt atg cag atg gtg aca 336 Asn Asn Thr Ser Arg Lys Ile Asn Ile Thr Gly Met Gln Met Val Thr 95 100 105 110 aag att aac cca tca aag gcc ttt gtc ggt agc tcc aac acc tcc tcc 384 Lys Ile Asn Pro Ser Lys Ala Phe Val Gly Ser Ser Asn Thr Ser Ser 115 120 125 ttc acc ccc gtc tct att gat gag gat gaa gtt ggc acc ttt gtg tgt 432 Phe Thr Pro Val Ser Ile Asp Glu Asp Glu Val Gly Thr Phe Val Cys 130 135 140 ggt acc acc ttt ggc gca cca att gtc gac gcc acc acg act aac act 480 Gly Thr Thr Phe Gly Ala Pro Ile Val Asp Ala Thr Thr Thr Asn Thr 145 150 155 ctt cct ttc ggc agg acc gga gcc cag gcc gct ggc cct tct tac acc 528 Leu Pro Phe Gly Arg Thr Gly Ala Gln Ala Ala Gly Pro Ser Tyr Thr 160 165 170 atg gaa gat ctt gaa ggc tcc atg tct atg gct cgc atg ggt ctc ttt 576 Met Glu Asp Leu Glu Gly Ser Met Ser Met Ala Arg Met Gly Leu Phe 175 180 185 190 ttg atc gtt gct atc tca att ggt atc ctc gtc ctg gcc gtc atg aat 624 Leu Ile Val Ala Ile Ser Ile Gly Ile Leu Val Leu Ala Val Met Asn 195 200 205 gta tgg atg gga cca aag aag gac agc gat tct gac act gat aag gac 672 Val Trp Met Gly Pro Lys Lys Asp Ser Asp Ser Asp Thr Asp Lys Asp 210 215 220 acc gat gat gat gac gac act gcc aac gat aac gat gat gag gac aaa 720 Thr Asp Asp Asp Asp Asp Thr Ala Asn Asp Asn Asp Asp Glu Asp Lys 225 230 235 tat aag aac agg acc agg gat atg atg ctt ctg gct ggg tcc gct ctt 768 Tyr Lys Asn Arg Thr Arg Asp Met Met Leu Leu Ala Gly Ser Ala Leu 240 245 250 ctg ttc ctc gtt tcc gcc gcc acc gtt ttt atg tct tac ccc aag agg 816 Leu Phe Leu Val Ser Ala Ala Thr Val Phe Met Ser Tyr Pro Lys Arg 255 260 265 270 agg cag taa 825 Arg Gln <210> 2 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Thr Val Thr Lys Thr Ile Glu Thr His Thr Asp Asn Ile Glu Thr Asn 1 5 10 15 Met Asp Glu Ser Leu Arg Ile Pro Val Thr Ala Glu Val Gly Ser Gly 20 25 30 Tyr Phe Lys Met Thr Asp Val Ser Phe Asp Ser Asp Thr Leu Gly Lys 35 40 45 Ile Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Asp Ala Gln Met Lys Glu Glu Asp 50 55 60 Ala Asp Leu Val Ile Thr Pro Val Glu Gly Arg Ala Leu Glu Val Thr 65 70 75 80 Val Gly Gln Asn Leu Thr Phe Glu Gly Thr Phe Lys Val Trp Asn Asn 85 90 95 Thr Ser Arg Lys Ile Asn Ile Thr Gly Met Gln Met Val Thr Lys Ile 100 105 110 Asn Pro Ser Lys Ala Phe Val Gly Ser Ser Asn Thr Ser Ser Phe Thr 115 120 125 Pro Val Ser Ile Asp Glu Asp Glu Val Gly Thr Phe Val Cys Gly Thr 130 135 140 Thr Phe Gly Ala Pro Ile Val Asp Ala Thr Thr Thr Asn Thr Leu Pro 145 150 155 160 Phe Gly Arg Thr Gly Ala Gln Ala Ala Gly Pro Ser Tyr Thr Met Glu 165 170 175 Asp Leu Glu Gly Ser Met Ser Met Ala Arg Met Gly Leu Phe Leu Ile 180 185 190 Val Ala Ile Ser Ile Gly Ile Leu Val Leu Ala Val Met Asn Val Trp 195 200 205 Met Gly Pro Lys Lys Asp Ser Asp Ser Asp Thr Asp Lys Asp Thr Asp 210 215 220 Asp Asp Asp Asp Thr Ala Asn Asp Asn Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Lys 225 230 235 240 Asn Arg Thr Arg Asp Met Met Leu Leu Ala Gly Ser Ala Leu Leu Phe 245 250 255 Leu Val Ser Ala Ala Thr Val Phe Met Ser Tyr Pro Lys Arg Arg Gln 260 265 270

Claims

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(a) 흰반점바이러스 유래의 구조단백질 VP28, VP19, VP26 및 VP24로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 단백질로 이루어진 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터에 삽입시키는 단계; (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건하에서 배양하는 단계; (d) 배양된 형질전환체를 파쇄시키고 파쇄물로부터 재조합 단백질을 분리, 정제하여, 재조합 단백질을 수득하는 단계; (e) 수득된 재조합 단백질로 산란계를 면역화시키는 단계; (f) 면역화된 산란계로부터 알을 산란시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하여, 흰반점바이러스의 감염을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 항체 단백질을 포함한 알을 제조하는 방법.
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제 19항에 있어서, 상기 (a) 단계의 융합 단백질이 흰반점바이러스의 피막단백질 VP28 및 흰반점바이러스의 피막단백질 VP19로 이루어지고, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질임을 특징으로 하는 알을 제조하는 방법.
제 21항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터가 재조합 플라스미드 pGdk임을 특징으로 하는 알을 제조하는 방법.
(a) 흰반점바이러스 유래의 구조단백질 VP28, VP19, VP26 및 VP24로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 단백질로 이루어진 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터에 삽입시키는 단계; (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건하에서 배양하는 단계; (d) 배양된 형질전환체를 파쇄시키고 파쇄물로부터 재조합 단백질을 분리, 정제하여, 재조합 단백질을 수득하는 단계; (e) 수득된 재조합 단백질로 산란계를 면역화시키는 단계; (f) 면역화된 산란계로부터 알을 산란시키는 단계; (g) 산란된 알의 난황으로부터 수용성 항체 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하여, 흰반점바이러스의 감염을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 항체 단백질을 제조하는 방법.
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제 23항에 있어서, 상기 (a) 단계의 융합 단백질이 흰반점바이러스의 피막단백질 VP28 및 흰반점바이러스의 피막단백질 VP19로 이루어지고, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질임을 특징으로 하는 수용성 항체 단백질을 제조하는 방법.
제 25항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터가 재조합 플라스미드 pGdk임을 특징으로 하는 수용성 항체 단백질을 제조하는 방법.
제 23항, 제 25항 또는 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (f) 단계는 알의 난황을 증류수로 희석하고, 희석된 난황 용액의 pH를 4.0 내지 6.0으로 조절한 후 동결시키고, 동결체를 해동한 다음, 원심분리하고, 이로부터 얻은 상청액을 여과하는 것으로 구성됨을 특징으로 하는 수용성 항체 단백질의 제조방법.
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