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CN101691403B - 抗对虾白斑症病毒囊膜蛋白vp28独特型单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

抗对虾白斑症病毒囊膜蛋白vp28独特型单克隆抗体及其制备方法 Download PDF

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CN101691403B CN2009100173917A CN200910017391A CN101691403B CN 101691403 B CN101691403 B CN 101691403B CN 2009100173917 A CN2009100173917 A CN 2009100173917A CN 200910017391 A CN200910017391 A CN 200910017391A CN 101691403 B CN101691403 B CN 101691403B
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Abstract

本发明公开了一种抗对虾白斑症病毒囊膜蛋白VP28独特型单克隆抗体及其制备方法，所述单抗是由保藏号为：CCTCC-C200938的杂交瘤细胞AMVP分泌的，该单抗是以抗WSSV-VP28单抗(Ab1)为抗原制备的，能与兔抗WSSV-VP28抗体结合；具有与WSSV竞争结合兔抗WSSV-VP28抗体的能力；且以该单抗为抗原制备的抗抗WSSV-VP28独特型抗体(Ab3)能与WSSV结合，其结合位点在WSSV的囊膜上，Ab3能中和WSSV感染，具有Ab1特性。本发明首次将该抗独特型抗体应用于WSSV研究中，并且建立了运用间接酶联免疫吸附法和竞争酶联免疫吸附法检测的筛选体系，还采用间接免疫荧光法、金标记免疫电镜法和螯虾体内中和实验证明了Ab3具有Ab1特性，从而验证了本发明单抗具有模拟最初抗原WSSV-VP28的特性。

Description

抗对虾白斑症病毒囊膜蛋白VP28独特型单克隆抗体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种单克隆抗体(单抗)及其制备方法，具体是抗对虾白斑症病毒(Whitespot syndrome virus，WSSV)囊膜蛋白VP28(virus protein 28)的独特型单抗及其制备方法，属于分子免疫学和病毒学交叉技术领域。 
背景技术
WSSV是一种具有囊膜的双链DNA病毒，具有很高的侵染能力和复制能力，宿主范围十分广泛。国内外已有的研究涉及WSSV的形态结构、化学组成和理化特性、基因组及其编码多肽、宿主和传播途径及流行病学等方面，探明WSSV感染的分子机理、寻找预防和控制WSSV感染的有效方法和措施是目前研究的热点。病毒入侵细胞的路径之一是病毒囊膜蛋白与宿主特异性细胞受体相结合，继而侵入并感染细胞，因此，研究WSSV吸附和侵入宿主细胞过程中起关键作用的蛋白以及宿主细胞上的病毒特异性受体蛋白，对研究WSSV感染的机理和预防控制具有重要意义。目前研究表明，在已发现和鉴定的WSSV蛋白中，囊膜蛋白VP28的特异性抗体能中和WSSV的感染，因此WSSV-VP28被认为在病毒感染过程中起着非常重要的作用。抗独特型抗体具有模拟抗原的特性，在医学上被用于受体研究、自身免疫病发病机理研究和新型疫苗研究等方面，而在水产动物疾病研究上应用甚少，关于WSSV或其相关蛋白的抗独特型抗体的研究未见报道。 
发明内容
本发明的目的是提供一种由杂交瘤细胞分泌的抗WSSV-VP28独特型单抗及其制备方法，为进一步确认WSSV-VP28在病毒感染中所起的作用，筛选WSSV的黏附蛋白和鉴定细胞受体蛋白提供新的研究思路和研究方法，进而深入研究WSSV的感染机理，通过切断病毒的感染途径，实现预防控制对虾WSSV病的目的。 
本发明的目的是由以下技术方案实现的：研制了一种抗WSSV-VP28独特型单抗(Ab2)，该单抗是由保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2009年5月11日，保藏号为：CCTCC-C200938的杂交瘤细胞AMVP分泌的，该单抗是以抗WSSV-VP28单抗(Ab1)为抗原制备的，能与兔抗WSSV-VP28抗体结合；具有与WSSV竞争结合兔抗WSSV-VP28抗体的能力；且以该单抗为抗原制备的抗抗WSSV-VP28独特型抗体(Ab3)能与WSSV结合，其结合位点在WSSV的囊膜上，Ab3能中和WSSV感染，具有Ab1特性。 
一种制备抗WSSV-VP28独特型单抗的方法，所述的制备方法是：纯化经体内、体外中和实验已验证的具有中和性的抗WSSV-VP28单抗(Ab1)为抗原，免疫小鼠，取脾脏以获得脾细胞；取小鼠P3-X63-Ag8U1骨髓瘤细胞，培养至指数生长期；将脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合；融合细胞采用免疫学方法筛选，筛选得到分泌抗WSSV-VP28独特型单抗的杂交瘤细胞，经有限稀释法克隆得到杂交瘤细胞株；以常规方法培养所得到的克隆细胞株，收集培养液或注入小鼠腹腔制备腹水，以硫酸铵沉淀和亲和层析方法纯化后得到抗WSSV-VP28独特型单抗。 
所述的免疫学的筛选方法是间接酶联免疫吸附法和竞争酶联免疫吸附法。所述的免疫学的鉴定方法是竞争酶联免疫吸附法、间接免疫荧光法、金标记免疫电镜法和螯虾体内中和实验。间接酶联免疫吸附法确定了该单抗能与兔抗WSSV-VP28抗体结合，竞争酶联免疫吸附法证明该单抗能竞争抑制兔抗WSSV-VP28抗体与WSSV的结合，间接免疫荧光法、金标记免疫电镜法证实Ab3与Ab1都能与WSSV囊膜结合，螯虾体内中和实验证明Ab3具有中和性。 
抗WSSV-VP28独特型单抗的鉴定方法是：以纯化的抗WSSV-VP28独特型单抗(Ab2)免疫小鼠制备抗抗WSSV-VP28独特型抗体(Ab3)，采用免疫学的鉴定方法鉴定Ab3对应的抗原决定簇与Ab1一样，位于WSSV的囊膜上，并采用螯虾体内中和实验证明Ab3具有中和性，表明Ab3具有Ab 1特性，也就证明了Ab2具有模拟WSSV-VP28特性，是抗WSSV-VP28独特型单抗。 
本发明单抗经竞争酶联免疫吸附法证明能与WSSV竞争结合兔抗WSSV-VP28抗体，Ab3经间接免疫荧光法、金标记免疫电镜法证明，能与WSSV特异性结合并且其结合位点位于WSSV囊膜上，螯虾体内中和实验证明了Ab3能部分中和WSSV感染，延缓螯虾死亡。 
在倒置显微镜下观察，生长状态良好的该杂交瘤细胞，其外观饱满、浑圆、折光性强、细胞大小均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞有无限分裂增殖能力；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，其培养基由桃红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的抗WSSV-VP28独特型单抗。 
本发明单抗的抗原决定簇是Ab1的可变区，Ab1有中和WSSV感染的特性。本发明首次将该抗独特型抗体应用于WSSV研究中，并且建立了运用间接酶联免疫吸附法和竞争酶联免疫吸附法检测的筛选体系，还采用间接免疫荧光法、金标记免疫电镜法和螯虾体内中和实验证明了Ab3具有Ab1特性，从而验证了本发明单抗具有模拟最初抗原WSSV-VP28的特性。该单抗的研制，对进一步确认WSSV-VP28在WSSV感染中所起的作用，筛选WSSV黏附蛋白和鉴定细胞受体蛋白，从而深入研究WSSV的感染机理，切断WSSV的感染途径具有重要的意义。 
附图说明
图1为Ab1的转印免疫印迹检测结果图。 
图2为Ab1的螯虾体内中和实验结果图。 
图3为本发明单抗的竞争酶联免疫吸附法检测结果图。 
图4为本发明单抗及Ab3的竞争酶联免疫吸附法检测结果图。 
图5a为Ab1的间接免疫荧光检测结果图。 
b为Ab3的间接免疫荧光检测结果图。 
图6a为提纯WSSV的电镜观察结果图。 
b为Ab1的金标记免疫电镜结果图。 
c为Ab3的金标记免疫电镜结果图。 
图7为Ab3的螯虾体内中和实验结果图。 
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例进一步说明本发明。 
本发明的抗WSSV-VP28独特型单抗是由保藏号为：CCTCC-C200938的杂交瘤细胞分泌的，该单抗具有模拟WSSV-VP28的特性。 
本发明的制备抗WSSV-VP28独特型单抗的方法如下： 
实施例1 
所述的分泌抗WSSV-VP28单抗(Ab1)的一株杂交瘤细胞，其制备方法如下： 
一、抗原的制备 
(1)病毒的提纯：取感染WSSV濒死中国对虾的头胸部(去除肝胰腺)，剪碎后加入以TNE缓冲液(0.05M Tris-Hcl，0.1M NaCl，1mM EDTA，pH7.4)配制的25％(W/W)蔗糖溶液中研磨，研磨后的样品经600g离心20min，取上清；800g离心20min，取上清；20000g离心2h，弃去上清；沉淀以25％蔗糖溶液重悬后，铺于不连续蔗糖梯度上20000g离心2h；离心后取病毒区带，以TNE稀释6倍后20000g离心90min；所得沉淀用PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，8.09mM Na2HPO4，1.47mM KH2PO4，pH7.4)重悬，负染电镜观察，分装，冻存于-80℃备用。 
(2)将步骤(1)提纯的WSSV加入等体积含十二烷基磺酸钠的样品缓冲液，在沸水中煮3-5min后，加入电泳仪(Mini-PROTEAN II，Bio-Rad)上样孔中，电泳。取出电泳后的凝胶放在CuCl2可逆染色液(CuCl2 2H2O 5.11克溶于100ml双蒸水中)中染色，切下VP28蛋白条带，脱色、洗脱、透析、冷冻干燥后，以PBS溶解并调整蛋白浓度至1mg/ml，分装50μl/管，冻存于-80℃。 
二、免疫小鼠 
以步骤一提纯的WSSV-VP28蛋白为抗原，免疫Balb/c小鼠，免疫共分4次，前2次免疫间隔为2周，后2次免疫间隔为1周，前2次免疫为腹腔注射，后2次免疫为尾静脉注射： 
第1次，基础免疫，提纯的WSSV-VP28蛋白与福氏完全佐剂等体积混匀，每只注射100μl； 
第2次，加强免疫，提纯的WSSV-VP28蛋白与福氏不完全佐剂等体积混匀，每只注射100μl； 
第3-4次，加强免疫，每只注射提纯的WSSV-VP28蛋白注射50μl。 
三、细胞融合 
(1)乙醚麻醉免疫小鼠，无菌取出脾脏和胸腺后，分别过100目网筛，用RPMI-1640溶液吹打形成单细胞悬液； 
(2)分别将脾细胞悬液和胸腺细胞悬液800g离心3min，弃去上清液，脾细胞沉淀用RPMI-1640溶液重悬，胸腺细胞沉淀用含有1％HAT的RPMI-1640(含10％胎牛血清)选择性细胞培养液重悬； 
(3)取3×107个处于对数生长期的P3-X63-Ag8U1骨髓瘤细胞，800g离心3min，弃去上清液后，用RPMI-1640溶液重悬； 
(4)将脾细胞悬液与骨髓瘤细胞悬液混合均匀后，800g离心3min，吸去上清液，轻弹离心管底，使两种细胞沉淀充分混匀成糊状；用吸管吸取预热到37℃的聚乙二醇溶液1ml，缓缓滴加到离心管内；然后在37℃水浴中静置5min； 
(5)继续滴加已经预热到37℃的RPMI-1640溶液15ml； 
(6)补加RPMI-1640溶液至40ml，经800g离心3min，弃去上清液； 
(7)沉淀的细胞以预热到37℃的RPMI-1640(含10％胎牛血清)细胞培养液3ml重悬； 
(8)将细胞悬液加入步骤(2)制备的胸腺细胞悬液，混合均匀后滴加到96孔培养板中； 
(9)将培养板放入37℃CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察细胞生长情况，取杂交瘤细胞培养液检测。 
四、筛选和克隆 
(1)初步筛选 
杂交瘤细胞群落长到占96孔培养板的孔底面积约1/3时，采用间接免疫荧光法初步筛选抗WSSV的阳性杂交瘤细胞株。 
①取感染WSSV的病虾鳃组织，生理盐水清洗，吸干水分后，OCT包埋，冰冻切片，切片厚度5μm。切片贴至干净载玻片上，自然晾干，丙酮固定，-20℃保存备用； 
②吸取杂交瘤细胞培养液，滴加在切片上，37℃湿盒中孵育45min； 
③用含0.05％吐温-20的PBS(PBST)洗涤3次，每次5min； 
④将异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠IgG抗体液滴加在切片上，37℃湿盒中避光孵育45min； 
⑤取出载玻片，同步骤③洗涤；封片，观察。 
(2)克隆 
采用有限稀释法对检测为阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆，步骤如下： 
①乙醚麻醉小鼠，取胸腺，制成单细胞悬液； 
②胸腺细胞悬液800g离心3min，弃去上清，沉淀用10ml RPMI-1640(含10％胎牛血清)细胞培养液重悬； 
③取阳性孔的杂交瘤细胞约100个，加入10ml胸腺细胞悬液中； 
④细胞悬液用滴管吹打均匀，滴加到96孔培养板中，每孔100μl，平均每个孔约含有一个杂交瘤细胞； 
⑤培养板放入37℃CO2培养箱中培养； 
⑥两周后按照本实施例步骤四(1)所述方法检测单个克隆孔的杂交瘤细胞培养液； 
⑦把所得阳性单个克隆孔的杂交瘤细胞按上述方法再克隆一次，以保证为抗体阳性单克隆。 
(3)二次筛选 
采用转印免疫印迹法从初步筛选得到的抗WSSV的阳性杂交瘤细胞株中筛选抗WSSV-VP28阳性杂交瘤细胞株： 
①步骤一(1)中提纯的病毒加入样品缓冲液，煮沸后进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后，取出凝胶； 
②剪取与电泳凝胶相同大小的硝酸纤维素膜(孔径0.22μm)以电转移缓冲液(25mmol/L Tris-Base，192mmol/L甘氨酸，20％甲醇，pH 8.3)润湿，剪取比凝胶稍大的滤纸以电转移缓冲液润湿，按照滤纸-硝酸纤维素膜-凝胶-滤纸的顺序放置，入盛有电转移缓冲液的电泳槽内，将硝酸纤维素膜面向阳极；200mA电泳5h； 
③转移完毕，取出硝酸纤维素膜；将硝酸纤维素膜用PBS洗10min，然后放入3％的牛血清白蛋白溶液中37℃封闭1h； 
④用PBST洗涤3次，每次5min； 
⑤将硝酸纤维素膜置入抗WSSV抗体阳性杂交瘤细胞培养液中，37℃孵育1h，同④法洗涤； 
⑥将硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig抗体(1∶4000稀释)中，37℃孵育1h，同⑥法洗涤； 
⑦将硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶发色液(NBT-BCIP发色液)中发色，直到颜色清晰，去离子水洗涤终止反应。 
(4)三次筛选 
采用螯虾体内中和实验筛选具有中和性的抗WSSV-VP28单克隆抗体： 
①将上述实施例1中的一(1)提纯的WSSV用无菌PBS 1∶100稀释，以WSSV稀释液与阳性单克隆杂交瘤细胞培养液等体积混合为实验组；以WSSV稀释液与骨髓瘤细胞培养液等体积混合为阳性对照；以骨髓瘤细胞培养液为阴性对照；各组样品室温放置2h后，注射螯虾进行体内中和实验。 
②分别从螯虾的腹面第三腹节皮下注射，每尾50μl。 
③实验组和对照组养殖条件相同，每天换水一次。注射之后每天早晚观察记录死亡数。 
结果：经间接免疫荧光法初步筛选得到的10株阳性杂交瘤细胞分泌的单抗能与WSSV特异性结合，采用有限稀释法对这10株阳性杂交瘤细胞进行了克隆；通过转印免疫印迹法、螯虾体内中和实验筛选出了1株抗原决定簇位于囊膜蛋白VP28上，具有明显中和性的抗WSSV-VP28单抗用于抗独特型单抗的研制。见图1、图2。图1中：M是标准分子量蛋白电泳后的考马斯亮蓝染色结果；V是提纯WSSV电泳后的考马斯亮蓝染色结果；1是将Ab1与转印后的WSSV蛋白带反应，Ab1识别分子量为28kDa的蛋白。图2中：阳性对照是将骨髓瘤细胞培养液与WSSV稀释液孵育后，注射入螯虾体内，15天中螯虾的死亡率变化，螯虾在注射后第1天出现死亡，第7天死亡率即达到100％；阴性对照是将骨髓瘤细胞培养液注射入螯虾体内，15天中螯虾的死亡率变化，到第15天时，螯虾死亡率为5％；Ab1是将Ab1与WSSV孵育后，注射入螯虾体内，15天中螯虾的死亡率变化，螯虾第5天出现死亡，第15天死亡率达到100％。 
实施例2 
抗WSSV-VP28独特型单克隆抗体的制备： 
一、抗原的制备 
Balb/c小鼠每只腹腔注射0.5ml液体石蜡，10天后腹腔注射分泌抗WSSV-VP28单克隆抗体(Ab1)的杂交瘤细胞，饲养并密切观察小鼠，14天左右小鼠腹部膨大后抽取腹水。腹水经辛酸-硫酸铵法初步纯化后再以Protein G Agarose(Amersham)纯化，调整浓度2mg/ml，分装备用。 
二、免疫小鼠 
以本实施例一提纯的Ab1作为抗原，免疫Balb/c小鼠，免疫共分5次进行，前2次免疫间隔为2周，后3次免疫间隔为1周，前2次免疫为腹腔注射，后3次免疫为尾静脉注射。 
第1次，基础免疫，提纯的Ab1与福氏完全佐剂等体积混匀，每只注射100μl； 
第2次，加强免疫，提纯的Ab1与福氏不完全佐剂等体积混匀，每只注射100μl； 
第3-5次，加强免疫，每只注射提纯的Ab1 50μl。 
三、细胞融合 
按照实施例1步骤三所述方法进行细胞融合。 
四、筛选和克隆 
(1)初步筛选 
待融合后的杂交瘤细胞群落长到96孔培养板的孔底面积约1/3时开始检测，采用间接酶联免疫吸附法初步筛选抗WSSV-VP28抗独特型单克隆抗体阳性杂交瘤细胞。 
①以纯化的WSSV-VP28蛋白免疫新西兰白兔，制备兔抗WSSV-VP28抗体，抗血清经辛酸硫酸铵法纯化，用碳酸盐包被液(pH 9.6)稀释至蛋白浓度0.02mg/ml，以每孔100μl加入96孔酶标板，4℃包被过夜； 
②吸出包被液，用PBST洗涤3次，每次5min； 
③每孔加入200μl 3％的牛血清白蛋白，37℃封闭1h； 
④同步骤②洗涤； 
⑤每孔加入杂交瘤细胞培养液100μl，以骨髓瘤细胞培养液为阴性对照，37℃孵育1h； 
⑥同步骤②洗涤； 
⑦每孔加入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig(1∶4000稀释)100μl，37℃孵育1h； 
⑧同步骤②洗涤后，每孔加入100μl 4-硝基酚磷酸盐(pNPP)发色液，暗处反应5-30min，每孔加入50μl 2M的NaOH终止发色，稳定3-5min，以酶标仪测各孔405nm波长处的OD值。计算各实验孔与阴性对照OD值之比(P/N)，当P/N≥2.1时为阳性。 
(2)克隆：按照实施例1四(2)中步骤①-⑤对检测出为阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆。两周后按照本实施例四(1)步骤①-⑧检测单个克隆孔的杂交瘤细胞培养液，把所得阳性单个克隆孔的杂交瘤细胞再克隆一次，以保证为抗体阳性单克隆。 
(3)二次筛选 
初步筛选得到的阳性杂交瘤细胞共6株(分别命名为单抗A、B、C、D、E、F)分别注入小鼠腹腔生产腹水，采用竞争酶联免疫吸附法进行二次筛选： 
①实施例1一(1)中提纯的WSSV用碳酸盐包被液1∶40稀释，WSSV稀释液以每孔100μl加入96孔酶标板中，4℃包被过夜； 
②吸出包被液，用PBST洗涤3次，每次5min； 
③每孔加入200μl 3％的牛血清白蛋白，37℃封闭1h； 
④同步骤②洗涤； 
⑤调整兔抗WSSV-VP28抗体浓度为40μg/ml，单抗A、B、C、D、E、F分别以PBS梯度稀释10、100、1000倍，抗体稀释液分别与兔抗WSSV-VP28抗体等体积混合为实验组，4℃放置过夜后，每孔加入100μl混合液，37℃孵育1h，以PBS代替单抗为无竞争对照组； 
⑥同步骤②洗涤； 
⑦每孔加入100μl碱性磷酸酶标记的羊抗兔Ig(1∶4000稀释)，37℃孵育1h； 
⑧同步骤②洗涤；每孔加入100μl 4-硝基酚磷酸盐(pNPP)发色液，暗处反应5-30min，每孔加入50μl 2M的NaOH终止发色，稳定3-5min，以酶标仪测各孔405nm波长处的OD值。按照抑制率＝(1-OD实验组/OD无竞争对照组)×100％的公式计算抑制率。 
结果：筛选出的单抗A能与WSSV竞争结合兔抗WSSV-VP28抗体，随着抗体稀释倍数的增加，抑制率降低，见图3。单抗A是由保藏号为：CCTCC-C200938的杂交瘤细胞分泌的，该单抗为抗WSSV-VP28独特型单克隆抗体。 
五、冻存 
取生长旺盛，形态良好的单抗A细胞，制成细胞悬液，200g离心5min，去上清，加冻存液(9份RPMI-1640培养基+1份二甲亚砜)，使最终细胞密度为5×106个/ml，将1ml细胞悬液装于2ml冻存管中，拧紧螺盖，放于-80℃超低温冰箱内过夜(8-12h)后，再浸入液氮内长期保存。本发明获得生长旺盛，形态良好的杂交瘤细胞，定名为：杂交瘤细胞AMVP，保藏号为：CCTCC-C200938，保藏日期为：2009年5月11日。 
实施例3 
本发明抗WSSV-VP28独特型单克隆抗体的竞争酶联免疫吸附法鉴定： 
①实施例1步骤一(1)提纯的WSSV以碳酸盐包被液1∶40稀释，以每孔100μl加入96孔酶标板中，4℃包被过夜； 
②吸出包被液，用PBST洗涤3次，每次5min； 
③每孔加入200μl 3％的牛血清白蛋白，37℃封闭1h； 
④同步骤②洗涤； 
⑤以辛酸-硫酸铵法纯化的本发明单抗为抗原，免疫Balb/c小鼠获得抗血清(Ab3)，本发明单抗和Ab3分别以PBS梯度稀释10、20、40、80、160、320、640、1 280、2 560、5120倍，本发明单抗和Ab3的各梯度稀释液再分别与浓度为40μg/ml的兔抗WSSV-VP28抗体等体积混合为实验组，4℃过夜后，每孔加入100μl混合液，37℃孵育1h，以PBS代替本发明单抗和Ab3为无竞争对照； 
⑥其余步骤及结果判定同实施例2中的四(3)步骤⑥-⑧。 
结果：本发明单抗及Ab3均能竞争抑制兔抗WSSV-VP28抗体与WSSV的结合，随着稀释倍数的增加，抑制率降低，见图4。 
实施例4 
抗WSSV-VP28单克隆抗体(Ab1)与抗抗WSSV-VP28独特型抗体(Ab3)的间接免疫荧光法鉴定： 
将Ab1与Ab3分别滴加于实施例1中的四(1)步骤①制备的切片上，37℃湿盒中孵育45min，其余步骤同实施例1中的四(1)步骤③-⑤。 
结果：Ab1和Ab3都能与WSSV发生特异性结合，再与荧光素标记的羊抗小鼠IgG抗体结合，感染WSSV的病虾鳃丝上可见黄绿色荧光，见图5a、5b。表明Ab3能与WSSV结合，具有Ab1特性。图5中：a是感染WSSV的病虾鳃与Ab1孵育后，再与荧光素标记的羊抗小鼠IgG抗体孵育，可观察到黄绿色荧光。b是感染WSSV病虾的鳃与Ab3孵育后，再与荧光素标记的羊抗小鼠IgG抗体孵育，可观察到黄绿色荧光。图中标尺为50μm。 
实施例5 
抗WSSV-VP28单克隆抗体(Ab1)与抗抗WSSV-VP28独特型抗体(Ab3)的金标记免疫电镜法鉴定： 
(1)吸取实施例1中的一(1)提纯的WSSV10μl，滴在覆有支持膜的铜网上，吸附10-15min，多余的液体用滤纸吸干。 
(2)吸取Ab1和Ab3各10μl分别滴在铜网上，室温结合20min； 
(3)用PBS冲洗5次； 
(4)吸取胶体金标记的羊抗小鼠IgG抗体10μl滴在铜网上，室温结合30min； 
(5)同步骤(3)冲洗，再经双蒸水冲洗2次，用滤纸吸干； 
(6)用2％磷钨酸(pH 6.5)负染约30秒，用滤纸吸干，电镜观察。 
结果：在WSSV粒子上结合有胶体金粒子，此结果直接证实Ab1和Ab3的抗原决定簇位于WSSV的囊膜上，见图6b、6c。图6中：a是提纯WSSV的电镜照片，病毒粒子纯度高，完整，具囊膜。b中可见胶体金颗粒结合在WSSV囊膜上，此结果证明Ab1的抗原决定簇位于囊膜上。c中可见胶体金颗粒结合在WSSV囊膜上，此结果证明Ab3的抗原决定簇位于WSSV囊膜上。图中标尺为100nm。 
实施例6 
按照实施例1中的四(四)所述方法采用螯虾体内中和实验证实抗抗WSSV-VP28独特型抗体(Ab3)的中和性。将实施例1中的一(1)提纯的WSSV用无菌PBS 1∶100稀释；以WSSV稀释液与Ab3等体积混合为实验组；以WSSV与正常小鼠血清等体积混合为阳性对照；以正常小鼠血清为阴性对照，各组样品室温放置2h后，注射螯虾进行体内中和实验。其余步骤同实施例1中的四(4)步骤②-③。 
本发明所采用的螯虾体内中和实验结果：阴性对照是将正常小鼠血清注射入螯虾体内， 15天中螯虾的死亡率变化，螯虾15天中无死亡；阳性对照是将与正常小鼠血清孵育的WSSV注射入螯虾体内，15天中螯虾的死亡率变化，螯虾在注射WSSV后第1天开始死亡，第7天死亡率达100％；Ab3是将与Ab3孵育的WSSV注射入螯虾体内，15天中螯虾的死亡率变化，螯虾在注射后第5天开始死亡，直到第15天，仍有近20％的螯虾存活，见图7。 
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，都没有超出本发明的保护范围。 

Claims (1)

1.一种抗对虾白斑症病毒囊膜蛋白VP28独特型单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体是由保藏号为：CCTCC－C200938的杂交瘤细胞AMVP分泌的。
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