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KR102512592B1 - 항-ｈｅｒ2 글리코항체 및 이의 용도 - Google Patents

항-ｈｅｒ2 글리코항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR102512592B1
KR102512592B1 KR1020167036523A KR20167036523A KR102512592B1 KR 102512592 B1 KR102512592 B1 KR 102512592B1 KR 1020167036523 A KR1020167036523 A KR 1020167036523A KR 20167036523 A KR20167036523 A KR 20167036523A KR 102512592 B1 KR102512592 B1 KR 102512592B1
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KR
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her2
glcnac
antibody
man
glycan
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KR1020167036523A
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치-휴이 웡
충-이 우
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아카데미아 시니카
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Publication date
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Abstract

본 발명은 각 Fc 상에 동일한 N-글리칸을 갖는 항-HER2 IgG 분자의 동종 집단을 포함하는 항-HER2 모노클로날 항체의 신규한 부류에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 항-HER2 모노클로날 항체로부터 Fc 글리코조작(glycoengineering)에 의해 형성될 수 있다. 중요하게, 본 발명의 항체는 글리코조작되지 않은 상응하는 모노클로날 항체와 비교하여 증가된 ADCC 활성 및 증가된 Fc 수용체 결합 친화력과 함께 개선된 치료 가치(therapeutic value)를 갖는다.

Description

항-ＨＥＲ2 글리코항체 및 이의 용도{ANTI-HER2 GLYCOANTIBODIES AND USES THEREOF}
관련 출원
본 출원은 2014년 3월 27일에 출원된 미국가출원번호("USSN") 제62/003,104호, 2014년 7월 2일에 출원된 USSN 62/020,199호, 및 2015년 1월 30일에 출원된 USSN 제62/110,338호에 대한 우선권의 이익을 청구한다. 이러한 문헌들 각각의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
Fc 글리코실화(Fc glycosylation)는 치료 모노클로날 항체(therapeutic monoclonal antibody)의 분야에서 중요한 대상이다. Fc 글리코실화는 Fc 수용체 결합 및 보체 활성화(complement activation)와 같은 Fc 이펙터(Fc effector) 기능을 상당히 개질시킬 수 있고, 이에 따라, 치료 항체의 생체내 안전성 및 효능 프로파일에 영향을 미칠 수 있다.
치료 모노클로날 항체를 형성시키기 위한 유전학적 조작을 기초로 한 여러 발현계(expression system)가 보고되었다. 이러한 것은 효모, 예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 곤충(insect) 세포주, 및 심지어 박테리아를 포함한다. 그러나, 발현계는 치료 항체의 이펙터 기능에 악영향을 미칠 수 있는 여러 단점들을 일으킨다.
대부분의 승인된 바이오약제(biopharmaceutical)는 요망되는 글리코실화 패턴을 갖는 단백질을 전달하고 이에 따라 감소된 면역원성 및 보다 높은 생체내 효능 및 안정성을 보장하기 위해 포유동물 세포 배양 시스템에서 형성된다. 비-인간 포유동물 발현계, 예를 들어, CHO 또는 NS0 세포는 복잡한 인간형 글리칸을 첨가하기 위해 요구되는 기구(machinery)을 갖는다. 그러나, 이러한 계(system)에서 형성되는 글리칸은 인간에서 형성된 글리칸과는 다를 수 있다. 이의 글리코실화 기구는 종종, 단백질 접힘(protein folding)을 변경시키고, 면역원성을 유도시키고, 약물의 혈액 순환 수명(circulatory life span)을 감소시킬 수 있는 요망되지 않는 탄수화물 결정인자(determinant)를 첨가한다. 특히, N-아세틸뉴라민산으로서의 시알산은 대부분의 포유동물 세포에서 효율적으로 첨가되지 않으며, 6-연결(linkage)은 이러한 세포에서 없어진다(missing). 세포를 시알산 전달을 위해 요망되는 다양한 효소적 활성을 갖도록 조작하는 것은 단백질 약물에 글리코형태(glycoform)의 인간-유사 패턴을 제공하는데 아직 성공하지 못하였다. 지금까지, 동물 세포 또는 글리코단백질(glycoprotein)을 인간 단백질과 가능한 한 밀접하게 닮은 고도의 시알릴화된 생성물로 조작하는 것이 요구되고 있다.
또한, 포유동물 세포 배양물은 모두 동일한 성질을 갖지 않는 글리코실화 패턴의 불균일 혼합물(heterogeneous mixture)을 전달한다. 치료 단백질의 안전성, 효능 및 혈청 반감기와 같은 성질들은 이러한 글리코실화 패턴에 의해 영향을 받을 수 있다.
1998년에 승인된 HER2-과발현 전이성 유방암에 걸린 환자의 치료를 위한 트라스투즈맙(Herceptin®)(Baselga et al, (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744)은 Her2/neu 수용체의 세포외 성분에 결합하는 인간화된 항-HER2 IgG 항체이다. HER2의 과발현은 인간 유방암의 대략 20%에서 관찰되고(하기에서 HER2-양성 유방암으로 지칭됨), 이러한 종양과 관련된 침습적 성장(aggressive growth) 및 불량한 임상 결과(poor clinical outcome)에 연루된다[Slamon et al (1987) Science 235: 177-182]. 트라스투즈맙은 다양한 상이한 메카니즘으로 기능하지만, 주요 작용은 암 세포의 표면 상에서 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER-2)의 세포외 막 부분에 결합하여, 이의 세포내 티로신 키나아제의 활성화를 방해하는 것이다. 헤르셉틴은 항체 의존 세포성 세포독성(antibody dependent cellular cytotoxicity; ADCC)을 매개하는 면역계에서 작용하고, 보체(complement)를 고정시킬 수 있지만, 보체 의존 세포성 세포독성(Complement Dependant Cell Cytotoxicity; CDC)을 매개하지 못하는 것으로 여겨진다.
트라스투즈맙은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 형성되는 것으로서, Fc 도메인에서 글리코실화 패턴에서 매우 이종성을 나타낸다. 불균일 혼합물에서 항-HER2 IgG 분자들 각각은 모두 동일한 성질을 가지지 않을 수 있으며, 치료 단백질에 결합된 특정의 N-연결된 올리고당은 환자에서 요망되지 않는 효과를 촉발시킬 수 있고, 이에 따라, 환자에게 안전성이 우려된다. 단일 제제(단일치료법)로서 제공된 항체 트라스투즈맙에 대한 반응 비율(response rate)은 약 15 내지 26%의 범위이다.
이에 따라, 본 발명의 일 양태는 각 Fc 상에 동일한 N-글리칸을 갖는 항-HER2 IgG 분자의 동종 집단을 포함하는 항-HER2 글리코항체의 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항-HER2 글리코항체는 Fc 글리코조작에 의해 항-HER2 모노클로날 항체로부터 형성될 수 있다. 중요하게, 항-HER2 글리코항체는 글리코조작되지 않은 상응하는 모노클로날 항체와 비교하여 증가된 ADCC 활성 또는 증가된 Fc 수용체 결합 친화력을 갖는 개선된 치료 가치(therapeutic value)를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "항-HER2 글리코항체"("항-HER2 GAb")는 Fc 상에 동일한 글리코형태(glycoform)를 갖는 항-HER2 IgG 분자의 동종 집단에 관한 것이다. 용어 "항-HER2 글리코항체"("항-HER2 GAb")는 항-HER2 글리코항체에서 개개의 IgG 분자를 지칭한다.
바람직한 구현예에서, N-글리칸은 Fc 영역의 Asn-297에 부착된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-HER2 글리코항체는 SEQ ID NO: 1로 기술된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 2로 기술된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 글리코항체는 트라스투즈맙(Herceptin®)의 경쇄 서열 및 중쇄 서열을 포함한다.
본원에는 트라스투즈맙으로부터 Fc 글리코조작에 의해 구성된 다수의 기능적 활성의 항-HER2 글리코항체가 기술된다. 중요하게, 최적화된 글리코형태를 갖는 항-HER2 글리코항체는 트라스투즈맙과 비교하여 개선된 ADCC 활성을 나타낸다. 이는 개선된 ADCC 활성을 갖는 동종으로 Fc-글리코실화된 항-HER2 항체가 성공적으로 형성됨을 나타내는 첫번째 보고서이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-HER2 글리코항체는 글리코항체가 트라스투즈맙과 비교하여 FcγRIIIA에 대한 향상된 결합을 나타내는 것을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 N-글리칸은 바이안테너리(biantennary) 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸은 바이섹팅(bisecting) GlcNAc를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 N-글리칸은 적어도 하나의 α2-6 말단 시알산을 포함한다. 특정 구현예에서, N-글리칸은 하나의 α2-6 말단 시알산을 포함한다. 바람직한 구현예에서, N-글리칸은 두 개의 α2-6 말단 시알산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 N-글리칸은 적어도 하나의 α2-3 말단 시알산을 포함한다. 특정 구현예에서, N-글리칸은 하나의 α2-3 말단 시알산을 포함한다. 바람직한 구현예에서, N-글리칸은 두 개의 α2-3 말단 시알산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 N-글리칸은 적어도 하나의 갈락토오스를 포함한다. 특정 구현예에서, N-글리칸은 하나의 갈락토오스를 포함한다. 바람직한 구현예에서, N-글리칸은 두 개의 갈락토오스를 포함한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 N-글리칸에는 코어 푸코오스가 존재하지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 N-글리칸은 Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2, Sia2(α2-3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, Sia2(α2-3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2, Sia2(α2-3/α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, Sia2(α2-6/α2-3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, Sia2(α2-3/α2-6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2, Sia2(α2-6/α2-3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2, Sia(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, Sia(α2-3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, Sia(α2-6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2, Sia(α2-3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2, Sia(α2-6)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, Sia(α2-3)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, Sia(α2-6)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2, Sia(α2-3)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2, GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, GalGlcNAc3Man3GlcNAc2, GlcNAc3Man3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2 및 Man3GlcNAc2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는다.
바람직한 구현예에서, 본원에 기술된 N-글리칸은 Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2, Sia2(α2-3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, Sia2(α2-3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2, Sia2(α2-3/α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, Sia2(α2-6/α2-3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, Sia2(α2-3/α2-6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2, Sia2(α2-6/α2-3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2, Sia(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, Sia(α2-3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, Sia(α2-6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2, Sia(α2-3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2, Sia(α2-6)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, Sia(α2-3)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, Sia(α2-6)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2, Sia(α2-3)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 and Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는다.
본 발명의 다른 양태는 본원에 기술된 항-HER2 글리코항체 또는 이의 항원 결합 단편의 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제형을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 약제학적 제형은 치료법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 항-HER2 GAb 분자는 HER2와 관련된 인간 질병을 치료하고 진단하기 위해 유용하다. 바람직한 구현예에서, 항-HER2 GAb 분자는 유방암 또는 다른 HER2-관련 종양 또는 다른 질병에 걸린 환자에게 투여된다.
본원에는 환자에서 HER2-발현 암을 치료하는 방법으로서, 환자에게 유효량의 본원에 기술된 약제 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, HER2-발현 암은 유방암이다.
본 발명의 항-HER2 GAb 분자는 화학요법 및 방사선요법을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다른 항암 요법과 조합하여, 및 특정의 다른 경우에, G-CSF와 같은 일부 시토카인과 조합하여 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 실질적으로 동종의 글리코항체 및 다른 항체 및/또는 다른 치료제를 포함하는 단일요법 또는 병용 요법을 위해 적합한 병용 약제 조성물을 또한 제공한다. 약제 조성물은 공동제형(coformulation)으로서 투여되거나 동시-투여 치료 요법(therapeutic regimen)에서 사용될 수 있다.
본원에 기술된 항-HER2 글리코항체는 FDA에 의해 승인되거나 개발 중인 항-HER2 모노클로날 항체로부터 형성될 수 있다. 항-HER2 모노클로날 항체는 인간화되거나, 인간이거나, 키메라일 수 있다.
본원에 기술된 항-HER2 글리코항체는 시험관 내에서 형성될 수 있다. 항-HER2 글리코항체는 Fc 글리코조작에 의해 형성될 수 있다. 특정 구현예에서, 항-HER2 글리코항체는 포유동물 세포 배양에 의해 얻어진 항-HER2 모노클로날 항체로부터 효소적으로 또는 화학효소적으로 조작된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-HER2 글리코항체를 제조하는 방법으로서, (a) 항-HER2 모노클로날 항체를 알파-푸코시다제 및 적어도 하나의 엔도글리코시다제와 접촉시켜 Fc 상에 탈푸코실화된 단당류 GlcNAc를 지닌 항-HER2 모노클로날 항체를 형성시키고, (b) 적합한 조건 하에서 탄수화물 모이어티를 GlcNAc에 첨가하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 항-HER2 글리코항체를 제조하기 위해 사용되는 항-HER2 모노클로날 항체는 트라스투즈맙(Herceptin®)이다.
일부 구현예에서, 탄수화물 모이어티는 Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia2(α2-3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia2(α2-3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia2(α2-3/α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia2(α2-6/α2-3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia2(α2-3/α2-6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia2(α2-6/α2-3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia(α2-3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia(α2-6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia(α2-3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia(α2-6)GalGlcNAc2Man3GlcNAc, Sia(α2-3)GalGlcNAc2Man3GlcNAc, Sia(α2-6)GalGlcNAc3Man3GlcNAc, Sia(α2-3)GalGlcNAc3Man3GlcNAc, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, GalGlcNAc2Man3GlcNAc, GalGlcNAc3Man3GlcNAc, GlcNAc3Man3GlcNAc, GlcNAc2Man3GlcNAc, GlcNAcMan3GlcNAc 및 Man3GlcNAc로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 탄수화물 모이어티는 Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia2(α2-3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia2(α2-3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia2(α2-3/α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia2(α2-6/α2-3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia2(α2-3/α2-6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia2(α2-6/α2-3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia(α2-3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia(α2-6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia(α2-3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia(α2-6)GalGlcNAc2Man3GlcNAc, Sia(α2-3)GalGlcNAc2Man3GlcNAc, Sia(α2-6)GalGlcNAc3Man3GlcNAc, Sia(α2-3)GalGlcNAc3Man3GlcNAc, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc 및 Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc로 이루어진 군으로부터 선택된다.
단계 (b)에서의 첨가는 트랜스글리코실라아제(gransglycosylase)에 의해 수행될 수 있다. 트랜스글리코실라아제는 EndoS, EndoH, EndoA 및 EndoM을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 방법을 위해 유용한 엔도글리코시다제(endoglycosylase)는 EndoS, EndoH, EndoA, EndoM 및 Endo-F3을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 알파-푸코시다제는 SEQ ID NO: 5와 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 일치한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 알파-푸코시다제는 재조합 박테로이데스(Bacteroides) 알파-L-푸코시다제이다.
본 발명의 하나 이상의 구현예들의 세부사항은 하기 설명에 기술되어 있다. 본 발명의 다른 특징 또는 장점은 하기 도면 및 여러 구현예의 상세한 설명으로부터 그리고 또한 첨부된 청구범위로부터 명백하게 될 것이다.
도 1은 모노클로날 항체의 Fc 글리코조작의 도식적 도면(schematic representation)을 도시한 것이다. 경로 (A)는 푸코실화된 항체 및 비푸코실화된 항체의 혼합물을 야기시키는 당해 분야에 공지된 방법들을 도시한 것이다. 경로 (B)는 동종 글리코항체를 야기시키는 본 발명의 방법을 도시한 것이다.
도 2는 항-HER2 GAb 102, 102, 104, 105, 106, 107, 108, 110 및 111의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다.
도 3은 ESI/MS에 의한 항-HER2 GAb101의 무손상 분자량을 도시한 것이다.
도 4는 ESI/MS에 의한 항-HER2 GAb104의 무손상 분자량을 도시한 것이다.
도 5는 항-HER2 GAb 101의 트립신 소화 후 분열된 글리코펩티드 TKPREEQYNSTYR(SEQ ID NO: 3)의 MS 스펙트럼을 도시한 것이다. 도 5는 SEQ ID NO: 4로서 "EEQYNSTYR"을 기술한다.
도 6은 항-HER2 GAb 104의 트립신 소화 후 분열된 글리코펩티드 TKPREEQYNSTYR(SEQ ID NO: 3)의 MS 스펙트럼을 도시한 것이다. 도 6은 SEQ ID NO: 4로서 "EEQYNSTYR"을 기술한다.
도 7은 항-HER2 GAb 101, 102, 104, 106, 107, 108, 및 트라스투즈맙의 ADCC 활성을 도시한 것이다. 리툭시맙은 음성 대조군으로서 사용되었다.
이에 따라, 개선된 항-HER2 항체로 모노클로날 항체 요법을 개선시키기 위한 요구가 여전히 존재한다. 치료 항체를 형성시키기 위해 고려되는 불균일 혼합물 중의 몇몇 특정 글리코형태는 치료 목적을 위한 요망되는 글리코형태로서 널리 공지된 글리칸 구조 및 서열을 함유한다.
본 발명은 "글리코항체(glycoantibody)"라 명명되는 신규한 부류의 모노클로날 항체의 개발에 관한 것이다. 용어 "글리코항체"는 Fc 상에 단일의 동종 글리코형태를 갖는 모노클로날 항체(바람직하게, 치료 모노클로날 항체)의 동종 집단을 지칭하기 위해 발명자 Dr. Chi-Huey Wong에 의해 처음으로 사용되었다. 동종 집단을 포함하는 개개 글리코항체는 동일하고, 동일한 에피토프(epitope)에 결합하고, 잘 규정된 글리칸 구조 및 서열을 갖는 동일한 Fc 글리칸을 함유한다.
본 발명의 실무는 달리 명시하지 않는 한, 당업계 내에 속하는, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술들을 이용할 것이다. 이러한 기술들은 문헌에서 충분히 설명된다[예를 들어, 문헌[Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Antibodies: A Laboratory Manual, by Harlow and Lane s (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); 및 Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)]를 참조].
정의:
본원에서 사용되는 용어 "글리칸(glycan)"은 다당류, 올리고당 또는 단당류를 지칭한다. 글리칸은 당 잔기의 모노머 또는 폴리머일 수 있고, 선형 또는 분지형일 수 있다. 글리칸은 천연 당 잔기(예를 들어, 글루코오스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸 뉴라민산, 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스, 헥소오스, 아라비노오스, 리보오스, 자일로오스, 등) 및/또는 개질된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보오스, 2'-데옥시리보오스, 포스포만노오스, 6'-설포-N-아세틸글루코사민, 등)을 포함할 수 있다. 글리칸은 또한, 본원에서 글리코콘쥬게이트(glycoconjugate), 예를 들어, 당단백질, 당지질(glycolipid), 글리코펩티드, 당단백질체(lycoproteome), 펩티도글리칸, 리포다당류 또는 프로테오글리칸의 탄수화물 부분을 지칭하기 위해 사용된다. 글리칸은 대개 오로지 단당류들 간에 O-글리코시드 연결(O-glycosidic linkage)로 이루어진다. 예를 들어, 셀룰로오스는 ß-1,4-연결된 D-글루코오스로 이루어진 글리칸(또는, 더욱 상세하게, 글루칸)이며, 키틴은 ß-1,4-연결된 N-아세틸-D-글루코사민으로 이루어진 글리칸이다. 글리칸은 단당류 잔기의 호모 또는 헤테로폴리머일 수 있고 선형 또는 분지형일 수 있다. 글리칸은 당단백질 및 프로테오글리칸에서와 같이 단백질에 부착된 것으로 확인될 수 있다. 이러한 것은 일반적으로 세포의 외부 표면 상에서 확인된다. O- 및 N-연결된 글리칸은 진핵 생물에서 매우 일반적이지만, 또한, 덜 일반적이지만, 원핵 생물에서 발견될 수 있다. N-연결된 글리칸은 세쿠온(sequon)에서 아스파라긴의 R-기 질소(N)에 부착된 것으로 확인된다. 세쿠온은 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 서열이며, 여기서, X는 프랄린을 제외한 임의 아미노산이다.
본원에서 사용되는 용어 "푸코오스", "코어 푸코오스" 및 "코어 푸코오스 잔기"는 교대해서 사용되고, α1,6-위치에서 N-아세틸글루코사민에 연결된 푸코오스를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "푸코실화된"은 Fc의 N-글리칸에서 코어 푸코오스의 존재를 지칭하며, 여기서, 용어 "탈푸코실화된"은 Fc의 N-글리칸에서 코어 푸코오스의 부재를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "N-글리칸", "N-연결된 글리칸", "N-연결된 글리코실화", "Fc 글리칸" 및 "Fc 글리코실화"는 교대로 사용되고, Fc-함유 폴리펩티드에서 아스파라긴 잔기의 아미드 질소에 연결된 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)에 의해 부착된 N-연결된 올리고당을 지칭한다. 용어 "Fc-함유 폴리펩티드"는 Fc 영역을 포함하는, 항체와 같은 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 패턴 "글리코실화 패턴" 및 "글리코실화 프로파일"은 교대로 사용되고, 당단백질 또는 항체로부터 효소적으로 또는 화학적으로 배출되고 예를 들어, LC-HPLC, 또는 MALDI-TOF MS, 등을 이용하여 이의 탄수화물 구조에 대해 분석된 N-글리칸의 특징적인 "지문(fingerprint)"을 지칭한다[예를 들어, 문헌[Current Analytical Chemistry, Vol. 1, No. 1 (2005), pp. 28-57]에서의 리뷰(review)를 참조, 이러한 문헌은 전문이 본원에 참고로 포함됨].
본원에서 사용되는 용어 "글리코조작된 Fc"는 본원에서 사용될 때, 효소적으로 또는 화학적으로 변경되거나 조작된 Fc 영역 상의 N-글리칸을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "Fc 글리코조작"은 글리코조작된 Fc를 제조하기 위해 사용되는 효소적 또는 화학적 과정을 지칭한다. 예시적인 조작 방법은 예를 들어, USSN12/959,351호(Wong et al)에 기술되어 있으며, 이의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용으로부터 얻어진 생화학적 사건을 지칭한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 보체 의존 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존 세포-매개된 세포독성(ADCC); 식균 작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절, 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 당해 분야에 공지된 다양한 검정들을 이용하여 평가될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체-의존 세포-매개된 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살생(NK) 세포, 호중구, 및 대식 세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR) 상에 결합된 분비된 Ig가 이러한 세포독성 이펙터 세포를 항원-함유 타겟 세포에 특이적으로 결합시키고 후속하여 세포 독소로 타겟 세포를 사멸시킬 수 있는 세포독성 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포를 "갖추고(arm)", 이러한 사멸을 위해 절대적으로 요구된다. ADCC, NK 세포를 매개하기 위한 일차 세포는 단지 FcγRIII 만을 발현시키며, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 포함한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464쪽의 표 3에서 요약되어 있다. 고려되는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예를 들어, 미국특허번호 제5,500,362호 또는 미국특허번호 제5,821,337호에 기술된 것이 수행될 수 있다. 이러함 검정을 위한 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 및 자연 살생(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 고려되는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어, 문헌[Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 기술된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "보체 의존 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 타겟 세포의 용해를 지칭한다. 전통적인 보체 경로의 활성화는 이의 동족 항원에 결합된 (적절한 하위부류의) 항체에 보체 시스템(C1q)의 제1 성분의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기술된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다.
"아폽토시스(apoptosis)를 유발시키는" 항체는 아넥신의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편화, 및/또는 막 소포(아폽토성 바디(apoptotic body))의 형성에 의해 결정된 바와 같은 프로그래밍된 세포사를 유발시키는 것이다. 바람직하게, 세포는 감염된 세포이다. 다양한 방법은 아폽토시스와 관련된 세포 사건(cellular event)을 평가하기 위해 이용 가능하다. 예를 들어, 포스파티딜 세린(PS) 전위는 아넥신 결합에 의해 측정될 수 있으며, DNA 단편화는 DNA 래더링(laddering)을 통해 평가될 수 있으며, DNA 단편화와 함께 핵/염색사 응축(chromatin condensation)은 저이배체 세포(hypodiploid cell)에서의 임의 증가에 의해 평가될 수 있다. 바람직하게, 아폽토시스를 유발시키는 항체는 아넥신 결합 검정에서 미처리된 세포에 비해 약 2 내지 50배, 바람직하게, 약 5 내지 50배, 및 가장 바람직하게, 약 10 내지 50배의 아넥신 결합의 유발을 야기시키는 것이다.
"키메라(Chimeric)" 항체(면역글로불린)는 특정 종으로부터 유도되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상응하는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부를 가지며, 사슬(들)의 나머지는 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한, 다른 종으로부터 유도되거나 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체, 뿐만 아니라, 이러한 항체의 단편에서 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상응한다[미국특허번호 4,816,567; 및 Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:6851-6855 (1984)]. 본원에서 사용되는 인간화된 항체는 키메라 항체의 서브세트(subset)이다.
비-인간(예를 들어, 무린) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분에 대하여, 인간화된 항체는 수용주(recipient)의 초가변 영역 잔기가 요망되는 특이성, 친화력, 및 용량(capacity)을 갖는 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종(도너 항체)으로부터의 초가변 영역 잔기에 의해 대체되는 인간 면역글로불린(수용주 또는 수용체 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR)은 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수용주 항체에서 또는 도너 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형(modification)은 결합 친화력과 같은 항체 성능을 추가로 개량시키기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 모두 적어도 하나의, 및 통상적으로 두 개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 루프와 일치하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 영역이며, FR 영역은 결합 친화력을 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. FR에서 이러한 아미노산 치환의 수는 통상적으로 H 사슬에서 6 이하이며, L 사슬에서, 3 이하이다. 인간화된 항체는 선택적으로, 또한, 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 통상적으로, 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가 세부사항을 위하여, 문헌[Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr . Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "완화(alleviation)"는 치료학적 치료 및 예방학적(prophylactic 또는 preventative) 수단 둘 모두를 지칭하며, 여기서, 목적은 타겟화된 병리학적 질환 또는 질병을 예방하거나 늦추기(완화시키기) 위한 것이다. 치료를 필요로 하는 대상은 이미 질환에 걸린 대상, 뿐만 아니라, 질환에 걸리기 쉬운 대상, 또는 질환이 예방되는 대상을 포함한다. 피검체 또는 포유동물은, 본 발명의 방법에 따라 치료량의 항체를 수용한 후에, 환자가 하기 기술된 것들 중 하나 이상의 관찰 가능한 및/또는 측정 가능한 감소 또는 부재를 나타내는 경우에, 감염증에 대해 성공적으로 "치료"된다: 감염된 세포의 수의 감소 또는 감염된 세포의 부재; 감염된 전체 세포의 백분율의 감소; 및/또는 특정 감염과 관련된 증상들 중 하나 이상의 어느 정도까지의 경감; 감소된 이환율 및 치사율, 및 삶의 질의 문제의 개선. 질병의 성공적인 치료 및 개선을 평가하기 위한 상기 파라미터들은 의사에게 널리 알려진 통상적인 절차에 의해 용이하게 측정 가능하다.
하나 이상의 추가 치료제와 "병용한" 투여는 동시(병행) 및 임의 순서의 연속 투여를 포함한다.
본원에서 사용되는 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도로 노출되는 세포 또는 포유동물에 대해 비독성인 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 생리학적으로 허용되는 담체는 pH 완충된 수용액이다. 생리학적으로 허용되는 담체의 예는 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 당 알코올, 예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들어, 소듐; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, TWEEN™ 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 PLURONICS™를 포함한다.
용어 "글리코항체"는 Fc 영역에 결합된 단일의 균일화된 글리코형태를 갖는 모노클로날 항체(바람직하게, 치료 모노클로날 항체)의 동종 집단을 지칭하기 위해 발명자 Dr. Chi-Huey Wong에 의해 만들어졌다. 본질적으로 동종 집단을 포함하는 개개 글리코항체는 동일하고, 동일한 에피토프에 결합하고, 명확한 글리칸 구조 및 서열을 갖는 동일한 Fc 글리칸을 함유한다.
Fc 영역의 글리코실화 프로파일의 문맥에서 용어 "동종(homogeneous)", "균일한(uniform)", "균일하게(uniformly)" 및 "동종성(homogeneity)"은 교대로 사용되고, 소량 또는 미량의 전구체 N-글리칸을 지니지 않은 하나의 요망되는 N-글리칸 종에 의해 표현되는 단일의 글리코실화 패턴을 의미하도록 의도된다. 특정 구현예에서, 전구체 N-글리칸의 미량은 약 2% 미만이다.
"본질적으로 순수한" 단백질은 조성물의 총 중량을 기준으로 하여, 예를 들어, 적어도 약 91 중량%, 적어도 약 92 중량%, 적어도 약 93 중량%, 적어도 약 94 중량%, 적어도 약 95 중량%, 적어도 약 96 중량%, 적어도 약 97 중량%, 적어도 약 98 중량%, 또는 적어도 약 99 중량%를 포함하는 적어도 약 90 중량%의 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다.
"본질적으로 동종의" 단백질은 조성물의 총 중량을 기준으로 하여, 예를 들어, 적어도 약 98.5 중량%, 적어도 약 99 중량%를 포함하는 적어도 약 98 중량%의 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다. 특정 구현예에서, 단백질은 항체, 구조적 변형체, 및/또는 이의 항원 결합 단편이다.
본원에서 사용되는 용어 " IgG", "IgG 분자", "모노클로날 항체", "면역글로불린", 및 "면역글로불린 분자"는 교대로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체를 결합시키는 것(감마 수용체)으로서, 수용체의 대립 변형체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태(spliced form)를 포함하는, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), 및 FcγRIII (CD16) 하위부류의 수용체를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함하며, 이는 이의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 이의 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 이의 세포지 도메인에서 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITIM)를 함유한다[문헌[M. in Daeeron, Annu . Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)]의 리뷰 참조]. FcR은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin . Med . 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 앞으로 확인되는 것을 포함하는 다른 FcR은 본원에서 용어 "FcR"에 의해 포함된다. 이러한 용어는 또한, 신생아 수용체, FcRn을 포함하며, 이는 태아로의 모계 IgG의 전달의 원인이 된다[Guyer et al., J. Immunol . 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)].
본원에서 사용되는 용어 "항원"은 면역 반응을 유발시킬 수 있는 임의 물질로서 정의된다. 본원에서 사용되는 용어 "항원 특이적"은 특정 항원, 또는 항원의 단편의 공급이 특이적 세포 증식을 야기시키는 세포 집단의 성질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역원성"은 면역원, 항원, 또는 백신이 면역 반응을 자극시키는 능력을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "에피토프"는 항체 또는 T 세포 수용체의 항원 결합 사이트를 접촉시키는 항원 분자의 부분으로서 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합하는"은 결합 쌍들(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 상호작용을 지칭한다. 다양한 경우에, 특이적인 결합은 약 10-6 몰/리터, 약 10-7 몰/리터, 또는 약 10-8 몰/리터 이하의 친화력 상수에 의해 구현될 수 있다.
"단리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리되고/거나 회수되는 것이다. 이의 천연 환경의 오염 성분들은 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 구 "실질적으로 유사한," "실질적으로 동일한", "균등한", 또는 "실질적으로 균등한"은 당업자가 두 개의 수치들 간의 차이가 상기 수치(예를 들어, Kd 수치, 항-바이러스 효과, 등)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 생물학적 및/또는 통계학적 유의성이 거의 없거나 전혀 없게 되는 것으로 여겨지도록, 두 개의 수치(예를 들어, 하나는 분자와 관련되지 않으며, 다른 하나는 기준/비교 분자와 관련됨) 간에 충분히 높은 유사성을 나타낸다. 상기 두 개의 값 간의 차이는 기준/비교 분자에 대한 값의 함수로서, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만 및/또는 약 10% 미만이다.
본원에서 사용되는 구 "실질적으로 감소된," 또는 "실질적으로 상이한"은 당업자가 두 개의 수치들 간의 차이가 상기 수치(예를 들어, Kd 수치)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 통계학적 유의성을 지니는 것으로 여겨지도록, 두 개의 수치(일반적으로 분자와 관련된 수치 및 기준/비교체 분자와 관련된 수치) 간의 충분히 높은 정도의 차이를 의미한다. 상기 두 수치 간의 차이는, 예를 들어, 기준/비교체 분자에 대한 수치에 따라, 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과, 및/또는 약 50% 초과이다.
"결합 친화력"은 일반적으로, 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 사이트와 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 간의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에서 사용되는 "결합 친화력"은 결합 쌍의 일원들(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화력을 지칭한다. 이의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화력은 해리 상수(Kd)에 의해 표현될 수 있다. 친화력은 본원에 기술된 것들을 포함하는, 당해 분야에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화력 항체는 일반적으로 항원을 서서히 결합하고, 용이하게 해리하는 경향이 있으며, 고-친화력 항체는 일반적으로 항원을 보다 빠르게 결합하고 보다 길게 결합을 유지하는 경향이 있다. 결합 친화력을 측정하는 다양한 방법들이 당해 분야에 공지되어 있는데, 이러한 방법들 중 임의 방법은 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 특정의 예시적인 구현예는 하기에 기술된다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 이러한 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이고, 항원-결합 사이트를 함유한다.
용어 "가변성"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 중에서 서열에 있어서 상당히 상이하고 이의 특정 항원에 대해 각 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변능력은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 상보성-결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역으로 불리워지는 세 개의 세그먼트에서 집중된다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존된 부분은 프레임워크(FR)로 불리워진다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR 영역을 포함하며, 이는 루프 연결을 형성하는, 3개의 CDR에 의해 연결된, 베타-시트 구성을 크게 사용되고 일부 경우에, 베타-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬에서 CDR은 FR 영역에 의해 아주 근접하여 함께 유지되며, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께, 항체의 항원-결합 사이트의 형성에 기여한다[문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조]. 불변 도메인은 항원에 항체를 결합시키는데 직접적으로 관여하지 않고, 항체-의존적 세포 독성에서 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
항체의 파파인 소화는 각각이 단일 항원-결합 사이트를 갖는 "Fab" 단편, 및 용이하게 결정화하는 능력을 반영하는 잔류 "Fc" 단편이라 불리워지는 두 개의 동일한 항원-결합 단편을 형성시킨다. 펩신 처리는 두 개의 항원-조합 사이트를 가지고 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')2 단편를 수득한다.
"Fv"는 완전 항원-인식 및 -결합 사이트를 함유하는 최소 항체 단편이다. 2-사슬 Fv 종에서, 이러한 영역은 단단한 비-공유 결합의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 다이머로 이루어진다. 단쇄 Fv 종에서, 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-사슬 Fv 종에서의 구조와 유사한 "다이머" 구조에서 결합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 결합될 수 있다. 이러한 구성에서, 각 가변 도메인의 세 개의 CDR이 VH-VL 다이머의 표면 상에서 항원-결합 사이트를 규정하기 위해 상호작용한다는 것이다. 총괄적으로, 6개의 CDR은 항체에 대한 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 단지 세 개의 CDR을 포함하는 Fv의 절반)은 항원인 인지하고 결합시키는 능력을 가지며 전체 결합 사이트에 비해 더욱 낮은 친화력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇 개의 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과는 다르다. Fab'-SH는 본원에서, 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 자유 티올 기를 지니는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래, Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 형성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 알려져 있다.
임의 척추동물 종으로부터의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리워지는 두 개의 명확하게 구별되는 타입들 중 하나로 지정될 수 있다.
이의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체(면역글로불린)은 상이한 부류로 지정될 수 있다. 5개의 주요 면역글로불린 부류가 존재한다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. 그리고, 이러한 것들 중 여러 개는 하위부류(동형(isotype)), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 분할될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불리워진다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 구성은 널리 알려져 있고, 일반적으로, 예를 들어, 문헌[Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000)]에 기술된다. 항체는 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비-공유 결합에 의해 형성된, 보다 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체," "완전 항체" 및 "전 항체"는 본원에서 하기에서 규정된 바와 같은 항체 단편이 아닌, 이의 실질적으로 무손상 형태의 항체를 지칭하기 위해 교대로 사용된다. 이러한 용어들은 특히, Fc 영역을 함유한 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"항체 단편"은 완전 항체의 단지 일부를 포함하는 것으로서, 여기서, 일부는 완전 항체에 존재할 때 그러한 부분과 일반적으로 연관된 기능들 중 적어도 하나의, 그리고, 대부분 또는 모두를 보유한다. 일 구현예에서, 항체 단편은 완전 항체의 항원 결합 사이트를 포함하고, 이에 따라, 항원을 결합시키는 능력을 보유한다. 다른 구현예에서, 항체 단편, 예를 들어, Fc 영역을 포함하는 항체 단편은 완전 항체에 존재할 때 Fc 영역과 일반적으로 관련된 생물학적 기능, 예를 들어, FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및 보체 결합 중 적어도 하나를 보유한다. 일 구현예에서, 항체 단편은 완전 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 일가 항체이다. 예를 들어, 이러한 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 암(arm)을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 얻어진 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 포함하는 개개 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 이에 따라, 수식어 "모노클로날"은 별개의 항체의 혼합물이지 않는 것과 같은 항체의 특징을 명시하는 것이다. 이러한 모노클로날 항체는 통상적으로, 타겟을 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서, 타겟-결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열로부터의 단일 타겟 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 공정에 의해 얻어졌다. 예를 들어, 선택 공정은 복수의 클론, 예를 들어, 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터의 독특한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 타겟 결합 서열이 예를 들어, 타겟에 대한 친화력을 개선시키고, 타겟 결합 서열을 인간화하고, 세포 배양에서 이의 생산을 개선시키고, 생체내에서의 이의 면역원성을 감소시키고, 다가특이적 항체, 등을 생성시키기 위해 추가로 변경될 수 있으며, 변경된 타겟 결합 서열을 포함하는 항체가 또한 본 발명의 모노클로날 항체인 것으로 이해될 것이다. 통상적으로 상이한 결정 인자(에피토프)에 관한 상이한 항체를 포함하는 폴리크롤날 항체 제조물과는 상반되게, 모노클로날 항체 제조물의 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정 인자에 관한 것이다. 이의 특이성 이외에, 모노클로날 항체 제조물은 이러한 것들이 통상적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 수득되는 것으로서 항체의 특징을 명시하고, 임의 특정 방법에 의해 항체의 생산을 요구하는 것으로서 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 예를 들어, 하이브리도마 방법(예를 들어, 문헌[Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al., Antibody: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal antibody and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)] 참조), 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국특허번호 제4,816,567호 참조), 파지 디스플레이 기술(예를 들어, 문헌[예를 들어, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)] 참조], 및 인간 면역글로불린 좌위(loci) 또는 유전자 엔코딩 인간 면역글로불린 서열의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서의 인간 또는 인간-유사 항체를 형성시키기 위한 기술, 예를 들어, WO98/24893; WO96/34096; WO96/33735; WO91/10741; 문헌[Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국특허번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; 문헌[Marks et al., Bio. Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조]를 포함하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 상세하게, 이러한 것이 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄가 특정 종으로부터 유도되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 유사하고 사슬(들)의 나머지가 다른 종으로부터 유도되거나 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 유사한 "키메라" 항체, 뿐만 아니라, 이러한 항체의 단편을 포함한다[미국특허번호 제4,816,567호; 및 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]].
또한, 하기 리뷰 문헌 및 이러한 문헌에서 인용된 참조문헌이 참고된다[Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)].
용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는, 본원에서 사용될 때, 순서대로 초가변적이고/거나 구조적으로 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역을 포함하는데, VH에서 3개((H1, H2, H3)를 가지며, VL에서 3개(L1, L2, L3)를 갖는다. 다수의 추가변 영역 도해가 사용되고 있고, 본원에 포함된다. 카베트 상보성 결정 영역(Kabat Complementarity Determining Region; CDR)은 서열 가변성을 기초로 하고, 가장 일반적으로 사용되는 것이다[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]. 코티아(Chothia)는 또한, 구조적 루프의 위치를 지칭한다[Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]. AbM 초가변 영역은 카베트 CDR과 코티아 구조적 루프 간의 절충을 나타내는 것으로서, 옥스포드 분자 AbM 항체 모델링 소프트웨어(Oxford Molecular's AbM antibody modeling software)에 의해 사용되고 있다. "접촉" 초가변 영역은 이용 가능한 복잡한 결정 구조의 분석을 기초로 한다. 이러한 초가변 영역들 중 각각으로부터의 잔기는 하기에 주지된다.
루프 카베트 AbM 코티아 접촉
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(카베트 번호지정)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(코티아 번호지정)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
초가변 영역은 하기와 같이 "확장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 또는 49-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3) 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 이러한 정의들 각각을 위하여 상기 카베트 등의 문헌에 따라 번호지정된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 규정된 바와 같은 초가변 영역 잔기와는 다른 가변 도메인 잔기이다.
용어 "카베트에서와 같은 가변 도메인 잔기 번호지정" 또는 "카베트에서와 같은 아미노산 위치 번호지정" 및 이의 변형예는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서 항체의 편성(compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용되는 번호지정 시스템을 지칭한다. 이러한 번호지정 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축, 또는 이러한 도메인에 삽입에 상응하는 보다 적은 또는 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 이후에 단일 아미노산 삽입물(카베트에 따라 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 이후에 삽입된 잔기(예를 들어, 카베트에 따라 잔기 82a, 82b, 및 82c, 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카베트 번호지정은 "표준" 카베트 번호지정된 서열과 함께 항체의 서열의 상동의 영역에서 정렬에 의해 제공된 항체에 대해 결정될 수 있다.
"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서, 이러한 도메인은 폴리펩티드 단쇄에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 항원 결합을 위해 scFV가 요망되는 구조를 형성시키게 하는, VH 도메인과 VL 도메인 간의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. 문헌[scFv see Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]의 리뷰가 참조된다.
용어 "이중체(diabody)"는 두 개의 항원-결합 사이트를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하는 것으로서, 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상에 두 개의 도메인들 간에 쌍을 형성하기에 너무 짧은 링커를 이용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보적인 도메인과 강제로 쌍을 이루고, 두 개의 항원-결합 사이트를 생성시킨다. 이중체는 예를 들어, EP 404,097; WO93/1161; 및 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에서 보다 충분히 기술된다.
"인간 항체"는 인간에 의해 형성된 항체에 해당하고/거나 본원에 기술된 바와 같이 인간 항체를 제조하기 위한 임의 기술을 이용하여 제조된 아미노산 서열을 지닌 것이다. 이러한 인간 항체의 정의는 상세하게 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 배제한다.
"친화력 성숙된(affinity matured)" 항체는 이의 변형(들)을 지니지 않은 모 항체와 비교하여, 항원에 대한 항체의 친화력의 개선을 야기시키는 하나 이상의 이의 HVR에서 하나 이상의 변형을 갖는 것이다. 일 구현예에서, 친화력 성숙된 항체는 타겟 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화력을 갖는다. 친화력 성숙된 항체는 당해 분야에 공지된 절차에 의해 형성된다. 문헌[Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH 도메인 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화력 성숙(affinity maturation)을 기술한다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 랜덤 돌연변이 유발은 문헌[Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기술되어 있다.
"차단" 항체 또는 "길항" 항체는 항체가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 특정 차단 항체 또는 길항 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 완전히 억제한다.
본원에서 사용되는 "작용 항체"는 고려되는 폴리펩티드의 기능적 활성들 중 적어도 하나를 모방하는 항체이다.
"질환"은 본 발명의 항체로의 치료로부터 유익한 임의 증상이다. 이는 포유동물이 고려되는 질환에 취약한 병리학적 증상을 포함하는 만성 및 급성 질환 또는 질병을 포함한다. 본원에서 치료될 질환의 비-제한적인 예는 암을 포함한다.
용어 "세포 증식성 질환" 및 "증식성 질환"은 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련된 질환을 지칭한다. 일 구현예에서, 세포 증식 질환은 암이다.
본원에서 사용되는 "종양"은 악성 또는 양성이든지 간에 모든 신생 세포 성장 및 증식, 및 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "암," "암성," "세포 증식성 질환," "증식성 질환" 및 "종양"은 본원에서 지칭될 때 서로 배타적이지 않다.
용어 "암" 및 "암성"은 일반적으로 조절되지 않은 세포 성장/증식에 의해 통상적으로 특징되는 포유동물에서의 생리학적 증상을 지칭하거나 이를 기술한다. 암의 예는 암종, 림프종(예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종, 및 백혈병을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특별한 예는 평평상피 세포 암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암, 폐의 평편상피 암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장 암, 간 암, 전립선 암, 외음부 암, 갑상선 암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프증식성 질환, 다양한 타입의 두경부암을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항원"은 면역 반응을 유발시킬 수 있는 임의 물질로서 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 특이적"은 특정 항원, 또는 항원의 단편의 공급이 특정 세포 증식을 야기시키는 세포 집단의 성질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "치료"는 치료될 개체 또는 세포의 자연적인 과정을 변경시키는 시도에서 임상적 개재를 지칭하고, 예방을 위한 또는 임상 병리학의 과정 동안에 수행될 수 있다. 요망되는 치료 효과는 질병의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질병의 임의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 염증 및/또는 조직/장기 손상을 예방하거나 감소시킴, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질병 또는 질환의 발달을 지연시키기 위해 사용된다.
"개체" 또는 "피검체"는 척추동물이다. 특정 구현예에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들어, 소), 스포츠 동물, 애완동물(예를 들어, 고양이, 개, 및 말), 영장류, 마우스, 및 랫트를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 척추동물은 인간이다.
치료 목적을 위한 "포유동물"은 인간을 포함하는 포유동물, 가축 및 농장 동물, 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소, 등으로서 분류되는 임의 동물을 지칭한다. 특정 구현예에서, 포유동물은 인간이다.
"유효량"은 요망되는 치료학적 또는 예방학적 결과를 달성하기 위해, 필수적인 투약량에서 그리고 필수적인 시간 동안, 효과적인 양을 지칭한다.
본 발명의 물질/분자의 "치료학적 유효량"은 질병 상태, 개체의 연령, 성별, 및 체중, 및 물질/분자가 개체에서 요망되는 반응을 유발시키는 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한, 치료학적으로 유익한 효과가 물질/분자의 임의 독성 또는 유해한 효과에 비해 더욱 큰 양이다. "예방학적 유효량"은 요망되는 예방학적 결과를 달성하기 위해, 필수적인 복용량으로 및 시간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 통상적으로, 필수적인 것은 아니지만, 예방학적 용량이 질병의 초기 단계 이전 또는 초기 단계의 피검체에서 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량에 보다 적을 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 예방하고/거나 세포의 파괴를 야기시키는 물질을 지칭한다. 이러한 용어는 방사성 동위원소(예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학치료제(예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 덱소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신, 또는 다른 인터칼레이션제, 효소 및 이의 단편, 예를 들어, 누클레올리트리엔자임, 항생 물질, 및 톡신, 예를 들어, 소분자 톡신, 또는 단편 및/또는 변형체를 포함하는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 톡신, 및 하기에 기재된 다양한 항종양 또는 항암제)를 포함하도록 의도된다. 다른 세포독성제는 하기에 기술되어 있다. 종양파괴제는 종양 세포의 파괴를 야기시킨다.
"화학치료제"는 암의 치료에서 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 예는 알칼리화제, 예를 들어, 티오테파 및 CYTOXAN® 시클로스포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올멜라민을 포함하는 에틸렌이민, 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로신나비놀(드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸(HYCAMTIN®), CPT-11(이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄포테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신을 포함함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포사이드; 트립토피신(특히, 트립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로마파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴; 항생제, 예를 들어, 에네디인 항생제(예를 들어, 칼리케아마이신, 특히, 칼리케아마이신 감마1I 및 칼리케아마이신 오메가I1(예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 디네마이신 A를 포함한 디네마이신; 에스페라마이신; 뿐만 아니라, 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소 단백질 에네다인 항생제 발색단), 아크라시노마이신, 아크티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 카크티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필, 크로모마이신, 다크티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루신, ADRIAMYCIN® 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 및 데옥시독소루비신을 포함함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 테베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사산물, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 폴산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 푸린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-아드레날, 예를 들어, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예를 들어, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예를 들어, 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 착물(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히, T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신(ELDISINE®, FILDESIN®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, TAXOL® 파클리탁셀(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ 파클리탁셀의 크레모포어-부재, 알부민-조작된 나노입자 제형(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.), 및 TAXOTERE® 독세탁셀(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로란부실; 겜시타빈(GEMZAR®); 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어, 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴(VELBAN®); 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴(ONCOVIN®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈(NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이성질체 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로르니틴(DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노산; 카페시타빈(XELODA®); 상기들 중 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라., 상기한 것 중 둘 이상의 조합물, 예를 들어, CHOP, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니솔론의 병행 치료를 위한 약어, 및 FOLFOX, 5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴(ELOXATIN™)으로의 치료 요법에 대한 약어를 포함한다.
본원에서 사용되는 "치료"는 치료될 개체 또는 세포의 자연적인 과정을 변경시키는 시도에서 임상적 개재를 지칭하고, 예방을 위한 또는 임상 병리학의 과정 동안에 수행될 수 있다. 요망되는 치료 효과는 질병의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질병의 임의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 염증 및/또는 조직/장기 손상을 예방하거나 감소시킴, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질병 또는 질환의 발달을 지연시키기 위해 사용된다.
"개체" 또는 "피검체"는 척추동물이다. 특정 구현예에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들어, 소), 스포츠 동물, 애완동물(예를 들어, 고양이, 개, 및 말), 영장류, 마우스, 및 랫트를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 척추동물은 인간이다.
치료 목적을 위한 "포유동물"은 인간을 포함하는 포유동물, 가축 및 농장 동물, 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소, 등으로서 분류되는 임의 동물을 지칭한다. 특정 구현예에서, 포유동물은 인간이다.
"유효량"은 요망되는 치료학적 또는 예방학적 결과를 달성하기 위해, 필수적인 투약량에서 그리고 필수적인 시간 동안, 효과적인 양을 지칭한다.
본 발명의 물질/분자의 "치료학적 유효량"은 질병 상태, 개체의 연령, 성별, 및 체중, 및 물질/분자가 개체에서 요망되는 반응을 유발시키는 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한, 치료학적으로 유익한 효과가 물질/분자의 임의 독성 또는 유해한 효과에 비해 더욱 큰 양이다. "예방학적 유효량"은 요망되는 예방학적 결과를 달성하기 위해, 필수적인 복용량으로 및 시간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 통상적으로, 필수적인 것은 아니지만, 예방학적 용량이 질병의 초기 단계 이전 또는 초기 단계의 피검체에서 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량에 보다 적을 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 예방하고/거나 세포의 파괴를 야기시키는 물질을 지칭한다. 이러한 용어는 방사성 동위원소(예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학치료제(예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 덱소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신, 또는 다른 인터칼레이션제, 효소 및 이의 단편, 예를 들어, 누클레올리트리엔자임, 항생 물질, 및 톡신, 예를 들어, 소분자 톡신, 또는 단편 및/또는 변형체를 포함하는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 톡신, 및 하기에 기재된 다양한 항종양 또는 항암제)를 포함하도록 의도된다. 다른 세포독성제는 하기에 기술되어 있다. 종양파괴제는 종양 세포의 파괴를 야기시킨다.
하나 이상의 추가 치료제"와 조합한" 투여는 동시(병행) 및 임의 순서의 연속적인 투여를 포함한다.
글리코항체
배양물에서 포유동물 세포로부터 형성된 재조합 단백질의 글리코실화는 치료 항체의 효과적인 사용을 보장하는데 중요한 공정이다[Goochee et al., 1991; Jenkins and Curling, 1994]. 포유동물 세포 배양물은 동일한 성질들을 모두 가지지 않는 글리코실화 패턴들의 불균일 혼합물을 전달한다. 치료 단백질의 안전성, 효능 및 혈청 반감기와 같은 성질들은 이러한 글리코실화 패턴에 의해 영향을 받을 수 있다. 본 발명자들은 "글리코항체"로 명명된 모노클로날 항체의 신규한 부류의 개발에 의해 글리코형태 이종성 문제를 성공적으로 다루었다.
용어 "글리코항체"는 본 발명자, Dr. Chi-Huey Wong에 의해 Fc 상에 단일의 동종 글리코형태를 갖는 모노클로날 항체(바람직하게, 치료 모노클로날 항체)의 동종 집단을 지칭하기 위해 만들어진 것이다. 동종 집단을 포함하는 개개 글리코항체는 동일하고, 동일한 에피토프에 결합하고, 명확한 글리칸 구조 및 서열을 갖는 Fc 글리칸을 함유한다.
글리코항체는 상업적으로 입수 가능하거나 개발 중인 모노클로날 항체(바람직하게, 치료 모노클로날 항체)로부터 발생될 수 있다. 치료 용도를 위한 모노클로날 항체는 인간화되거나, 인간이거나, 키메라일 수 있다. 치료 용도를 위한 승인된 모노클로날 항체의 예는 무로모맙, 아브식시맙, 리툭시맙, 다클리주맙, 바실릭시맙, 팔리비주맙, 인플락시맙, 트라스투즈맙, 에타네르셉트, 겜투주맙, 알렘투주맙, 이브리토모맙, 아달리무맙, 알레파셉트, 오말리주맙, 에팔리주맙, 세툭시맙, 베바시주맙, 나탈리주맙, 라니비주맙, 파니투무맙, 에클리주맙, 및 세르톨리주맙을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본원에는 Fc 글리코조작에 의해 치료 모노클로날 항체로부터 유도된 작용성 활성 글리코항체가 기술된다. 최적화된 글리코형태를 갖는 글리코항체는 치료 모노클로날 항체와 비교하여 더욱 강력한 생물학적 활성을 나타낸다. 최적화된 글리코형태를 갖는 글리코항체가 치료 용도를 위한 대안을 제공할 수 있다는 것이 고려된다.
항- HER2 글리코항체 (항- HER2 GAb )
HER2 유전자는 유방암의 대략 30%에서 과발현되거나 증폭된다. HER2 과발현 또는 증폭을 갖는 유방암 환자는 무병(disease-free) 및 전체 생존을 단축시킨다. HER2 단백질은 HER2 유전자를 과발현시키는 암의 항체 요법을 위한 독특하고 유용한 타겟인 것으로 사료된다. 모노클로날 항체 항-HER2, 트라스투즈맙(Herceptin®)은 이러한 타겟과 관련된 악성 암에 대한 요법에서 성공적으로 사용되었으며, 이는 HER2 과발현 유방암의 치료를 위해 1998년에 FDA에 의해 승인되었다. 유방암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 HER2를 발현시키는 세포를 수반하는 소정 범위의 질병을 예방하고/거나 치료하는데 더욱 효과적인 HER2에 대한 개선된 치료 항체가 요구되고 있다.
본 발명은 "항-HER2 글리코항체"("항-HER2 GAb")로 명명되는 항-HER2 항체의 신규한 부류를 특징으로 한다. 항-HER2 글리코항체는 Fc 글리코조작에 의해 항-HER2 모노클로날 항체로부터 발생될 수 있다. 동종 집단을 포함하는 개개 항-HER2 글리코항체는 동일하고, 명확한 글리칸 구조 및 서열을 갖는 동일한 Fc 글리칸을 함유한다. 본 발명에 따른 항-HER2 GAb는 이의 모 항체와 동일한 인간 HER2 항원의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본원에서 사용되는 용어 "부모 항체(parental antibody)"는 항-HER2 글리코항체를 형성시키기 위해 사용되는 항-HER2 모노클로날 항체를 지칭한다.
부모 항체는 포유동물 세포 배양물, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 곤충 세포주와 같은 세포 배양에 의해 얻어질 수 있다. 바람직하게, 부모 항체는 포유동물 세포 배양물에서 형성된다. 부모 항체는 FDA 승인되거나 개발 중에 있다. FDA 승인되 항-HER2 치료 항체는 트라스투즈맙(헤르셉틴), 라파티닙(티케르브), 페르투주맙(페르제타), 아도-트라스투즈맙 엠탄신(카드실라, 게넨테크)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-HER2 GAb는 SEQ ID NO: 1에 기술된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 2에 기술된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 항-HER2 GAb는 트라스투즈맙의 경쇄 서열 및 중쇄 서열을 포함한다.
하기 표 1은 트라스투즈맙의 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 나타낸다.
표 1
Figure 112016127948226-pct00001
일부 구현예에서, N-글리칸은 Fc 영역의 Asn-297에 부착된다.
본 발명에 따른 N-글리칸은 "트리만노오스 코어" 또는 "오당류 코어"로서도 지칭되는 Man3GlcNAc2의 공통의 오당류 코어를 가지며, 여기서 "Man"은 만노오스를 지칭하며, "Glc"는 글루코오스를 지칭하며, "NAc"는 N-아세틸를 지칭하며, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 지칭한다.
일부 구현예에서, N-글리칸은 바이안테너리 구조(biantennary structure)를 갖는다.
본원에 기술된 N-글리칸은 "바이섹팅(bisecting)" GlcNAc를 포함하는 사슬내 치환(intrachain substitution)을 가질 수 있다. 글리칸이 트리만노오스 코어 상에 바이섹팅 GlcNAc를 포함할 때, 구조는 Man3GlcNAc3으로서 나타낸다. 글리칸이 트리만노오스 코어에 부착된 코어 푸코오스를 포함할 때, 구조는 Man3GlcNAc2(F)로서 나타낸다. N-글리칸은 하나 이상의 말단 시알산을 포함할 수 있다(예를 들어, N-아세틸뉴라민산). "Sia"로서 표현되는 구조는 말단 시알산으로서 지칭된다. 시알릴화(시알릴화)는 바이안테너리 구조의 α1-3 또는 α1-6 암 중 어느 하나 상에서 일어날 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 N-글리칸은 적어도 하나의 α2-6 말단 시알산을 포함한다. 특정 구현예에서, N-글리칸은 하나의 α2-6 말단 시알산을 포함한다. 바람직한 구현예에서, N-글리칸은 두 개의 α2-6 말단 시알산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 N-글리칸은 적어도 하나의 α2-3 말단 시알산을 포함한다. 특정 구현예에서, N-글리칸은 하나의 α2-3 말단 시알산을 포함한다. 바람직한 구현예에서, N-글리칸은 두 개의 α2-3 말단 시알산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 N-글리칸은 적어도 하나의 갈락토오스를 포함한다. 특정 구현예에서, N-글리칸은 하나의 갈락토오스를 포함한다. 바람직한 구현예에서, N-글리칸은 두 개의 갈락토오스를 포함한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 N-글리칸에는 코어 푸코오스가 존재하지 않는다.
표 2는 항-HER2 글리코항체의 예시적인 N-글리칸을 나열한 것이다. 본 발명의 구현예는 본원에 나열된 임의 N-글리칸을 포함하거나 배제할 수 있다.
표 2
Figure 112016127948226-pct00002
Figure 112016127948226-pct00003
Figure 112016127948226-pct00004
항- HER2 글리코항체의 생물학적 특징
Fc 상에서의 글리코실화는 ADCC, CDC 및 순환 반감기(circulating half-life)를 포함한 다양한 면역글로불린 이펙터-매개 기능에 영향을 미칠 수 있다. ADCC 향상은 치료 항체 약물 효능을 개선시키기 위한 중요한 전략이다. 이는 보다 낮은 약물 비용의 이익을 위해 유효 약물 투여량을 낮추는 가능성을 갖는다. 본원에 기술된 항-HER2 글리코항체는 기능적 성질들에 의해 특징될 수 있다. 항-HER2 GAb는 인간 HER2 발현 세포에 대한 아폽토시스를 포함하는 세포 성장 억제 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항-HER2 GAb는 이의 부모 항체와 비교하여 더욱 강력한 세포 성장 억제 활성을 나타낸다.
항- HER2 글리코항체의 ADCC 활성
본 발명에 따른 글리코항체의 ADCC 활성은 부모 항체의 ADCC 활성과 비교하여 적어도 3배 증가된, 바람직하게, 적어도 9배, 더욱 바람직하게, 적어도 10배 증가된 ADCC 활성, 바람직하게, 적어도 12배 증가된 ADCC 활성, 바람직하게, 적어도 20배 증가된 ADCC 활성, 가장 바람직하게, 적어도 30배 증가된 ADCC 활성이다.
본 발명의 글리코항체의 ADCC 용해 활성은 SKBR5, SKBR3, LoVo, MCF7, OVCAR3 및/또는 Kato III과 같은 타겟 암 세포주를 사용하여 부모 항체와 비교하여 측정될 수 있다.
표 3은 트라스투즈맙과 비교하여 항-HER2 GAb의 예시적인 향상된 ADCC 활성을 나열한 것이다. 예시적인 검정은 실시예에 기술되어 있다.
표 3
Figure 112016127948226-pct00005
본원에 기술된 다수의 항-HER2 GAb, 특히, GAb101, 및 GAb104는 이의 부모 항체, 트라스투즈맙과 비교하여 향상된 ADCC 활성을 나타낸다. 본 발명의 글리코항체가 HER2-양성 질병에 대한 치료제로서 우수한 효과를 나타낼 수 있으며, 본 발명의 목적이 치료제의 개발에서 항-HER2 GAb를 사용하기 위한 것이라는 것이 고려된다.
항- HER2 글리코항체의 CDC 활성
본원에 기술된 글리코항체는 놀랍게도, CDC에 영향을 미치지 않으면서 개선된 ADCC를 제공할 수 있다. 예시적인 CDC 검정은 실시예에 기술되어 있다. 예시적인 구현예에서, 글리코항체의 ADCC는 증가되지만, 다른 면역글로불린-타입 이펙터 기능, 예를 들어, 보체-의존적 세포독성(CDC)은 유사하게 유지되거나 크게 영향을 미치지 않는다.
FcγRIII과 항- HER2 글리코항체 간의 결합
표 4는 항-HER2 GAb 및 헤르셉틴의 예시적인 FcγRIIIA 결합을 나열한 것이다.
표 4
Figure 112016127948226-pct00006
FcγRIIIA 결합은 당해 분야에 공지된 검정을 이용하여 측정될 수 있다. 예시적인 검정은 실시예에 기술되어 있다. Fc 수용체 결합은 항-HER2 GAb 대 트라스투즈맙의 상대비로서 결정될 수 있다. 예시적인 구현예에서 Fc 수용체 결합은 적어도 2.5배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배 또는 20배, 30배, 40배, 50배 또는 보다 높게 증가된다.
트라스투즈맙과 비교하여, 결합 데이타에서는, 항-HER2 GAb, 특히, GAb101 및 GAb104가 타겟 분자 HER2에 대한 보다 강력한 결합 친화력을 나타낸다는 것을 보이고 있다.
종합하면, 항-HER2 GAb, 특히, GAb101, 및 GAb104는 트라스투즈맙과 비교하여 향상된 ADCC 활성 및 보다 강력한 FcγRIIIA 결합 친화력을 나타낸다. 본 발명의 글리코항체가 단독으로, 또는 바람직하게, 둘 이상의 이러한 항체를 포함하는 조성물에서, 및 선택적으로 화학요법과 같은 다른 치료와 조합하여, 우수한 임상적 반응을 제공할 수 있다는 것이 고려된다. ADCC-향상된 항-HER2 글리코항체가 HER2-양성 질병에 대한 대안적인 치료제를 제공할 수 있다는 것이 고려된다. 본 발명의 글리코항체는 유리하게, 현 투여 경로 및 현 치료 요법을 변경시키기 위해 사용될 수 있으며, 이의 증가된 이펙터 기능으로서 이러한 것들이 보다 낮은 농도에서 그리고 적은 빈도수로 투약될 수 있으며, 이에 의해 항체 독성 및/또는 항체 내성의 발달에 대한 가능성을 낮출 수 있다. 또한, 이의 개선된 이펙터 기능은 이전에 재조합 숙주계에서 형성되는 상응하는 항-HER2 모노클로날 항체로의 치료에 비해 내성적이거나 다루기 힘든 임상적 적응증(clinical indication)을 치료하기 위한 새로운 접근법을 산출한다.
항- HER2 GAb의 제조
본 발명의 항-HER2 글리코항체는 상업적으로 입수 가능하거나 전임상 또는 임상 개발 중에 있는 항-HER2 모노클로날 항체("부모 항체")로부터 Fc 글리코조작에 의해 형성될 수 있다. 바람직하게, 모노클로날 항체는 치료 모노클로날 항체이다. Fc 글리코조작은 효소적으로 또는 화학효소적으로 수행될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 부모 항체는 트라스투즈맙이다.
본 발명의 글리코항체에서 N-글리칸은 바람직하게 탈푸코실화된다.
N-글리칸의 탈푸코실화는 Fc 도메인의 N-글리칸에서 코어 푸코오스를 제거하기 위한 공정이다. 탈푸코실화는 효소적으로 이용될 수 있다. N-글리칸이 두 개의 Fc 도메인들 사이에 엠베딩되기 때문에, 효소적 탈푸코실화 효율은 입체적 방해로 인해 훨씬 더 낮으며, 즉, 푸코오스 잔기에 대한 포코시다제의 접근은 Fc 도메인의 일부에 의해 차단된다.
다수의 α-푸코시다제는 당해 분야에 공지되어 있다. 예는 터보코르누투스(Turbo cornutus), 카로니아 람파스(Charonia lampas), 바실러스 풀미난스(Bacillus fulminans), 아스페르길러스 나이거(Aspergillus niger), 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 소 신장(Bovine kidney)(Glyko), 닭 간(chicken liver)으로부터의 α-푸코시다제[Tyagarajan et al., 1996, Glycobiology 6:83-93], 및 잔토모나스 마니호티스(Xanthomonas manihotis)(Glyko, PROzyme)로부터의 α-푸코시다제 II를 포함한다. 푸코시아제의 여러 변형체들이 또한 상업적으로 입수 가능하다[그 중에서도, Glyko, Novato, Calif.; PROzyme, San Leandro, Calif.; Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, Calif.]. 그러나, α-푸코시다제는 N-연결된 글리칸으로부터 코어 푸코오스를 효율적으로 제거하기 위한 것으로 알려져 있지 않다.
WO 2013/12066호에는 소 신장으로부터 α-푸코시다제에 의한 (Fucαl,6)GlcNAc-리툭시맙의 탈푸코실화가 기재되어 있다. WO 2013/12066호에 기재되어 있는 바와 같이, (Fuc αl, 6)GlcNAc-리툭시맙의 반응 혼합물은 (Fucαl,6)GlcNAc-리툭시맙에서 푸코오스를 완전히 제거하기 위해 37℃에서 20일 동안 소 신장(Prozyme으로부터 상업적으로 입수 가능함)으로부터의 α-푸코시다제와 함께 인큐베이션되었다.
면역글로불린의 열적 불안정성은 당해 분야에 공지되어 있다[Vermeer et al., Biophys J. Jan 78: 394-404 (2000)]. Fab 단편은 열처리에 대해 가장 민감하며, Fc 단편은 감소하는 pH에 대해 가장 민감하다. 항체의 열적 안정성 및 기능성 활성을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 WO 2013/12066호에 기술된 바와 동일한 실험을 수행하였고, 항체가 37℃에서 3일 동안 열처리 후 CD20에 대한 결합 친화력을 약 10% 손실하였음을 발견하였다. 또한, 본 출원인은 항체가 37℃에서 7일 동안 열처리 후 CD20에 대한 결합 친화력을 약 20% 손실하였음을 발견하였다. 항체가 지연된 열 처리, 예를 들어, WO 2013/12066호에 기술된 바와 같이, 37℃에서 20일 동안의 열 처리 후에 CD20에 대한 결합 친화력을 상당히 손실시킬 것이라는 것이 고려된다.
개선된 치료 가치를 갖는 글리코항체를 합성하기 위한 본 발명자의 시도에서, 본 발명자들은 N-연결된 글리칸으로부터 푸코오스 잔기를 효율적으로 제거할 수 있는 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis) α-푸코시다제(GenBank accession no. YP_212855.1)를 예상치 못하게 발견하였다. 효율적인 탈푸코실화는 특정 효소를 사용하여 성공적으로 달성되었다. 중요하게, 본 발명의 글리코항체를 만드는 효율은 도 1에 예시된 바와 같이, N-글리칸의 손쉬운 탈푸코실화를 형성시키는 특정 α-푸코시다제의 사용에 의해 가치 있게 개선되었다.
이에 따라, 본 발명은 α-푸코시다제의 조성물, 및 α-푸코시다제를 사용하여 N-글리칸의 코어 푸코오스를 제거하는 개선된 방법을 제공한다. α-푸코시다제는 SEQ ID NO: 5의 서열과 적어도 80%, 85% 90%, 95%, 98% 또는 99% 일치성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 변형체를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 개선된 탈푸코실화 방법은 항체를 α-푸코시다제와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서, α-푸코시다제는 SEQ ID NO: 5의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 일치성을 갖는 아미노산 서열, 이의 변형체 또는 이의 단편을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본원에는 항-HER2 글리코항체를 제조하는 개선된 방법이 기술되는데, 이러한 방법은 (a) 항-HER2 모노클로날 항체를 α-푸코시다제 및 적어도 하나의 엔도글리코시다제와 접촉시켜 단일 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 갖는 탈푸코실화된 항체를 수득하는 단계, 및 (b) 적합한 조건 하에서 GlcNAc에 탄수화물 모이어티를 첨가하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-HER2 모노클로날 항체는 트라스투즈맙이다.
엔도글리코시다제는 N-글리칸에서 올리고당의 가변 부분을 잘라 버리기 위해 사용된다. 본원에서 사용되는 엔도글리코시다제의 예는 EndoA, EndoF, EndoF1, EndoF2, EndoH, EndoM, EndoS, 및 이의 변형체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에 따른 α-푸코시다제는 SEQ ID NO: 5의 서열과 적어도 85% 일치성을 갖는 아미노산 서열, 이의 기능성 변형체를 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, α-푸코시다제는 SEQ ID NO: 5의 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 일치성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, α-푸코시다제는 재조합 박테로이데스 α-푸코시다제이다.
Figure 112016127948226-pct00007
본 발명의 방법에서 단계 (a)는 단일 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 갖는 탈푸코실화된 항체를 야기시킨다. 트랜스글리코실라아제를 사용한 후속 효소-매개 글리코실화는 GlcNAc에 명시된 탄수화물 모이어티를 첨가하고 당 사슬을 연장시키기 위해 수행된다. 이에 따라, 글리코항체의 동질성 집단이 형성될 수 있다. 본원에 기술된 트랜스글리코실라아제의 예는 EndoA, EndoF, EndoF1, EndoF2, EndoH, EndoM, EndoS, 및 이의 변형체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 따른 탄수화물 모이어티는 Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia2(α2-3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia2(α2-3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia2(α2-3/α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia2(α2-6/α2-3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia2(α2-3/α2-6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia2(α2-6/α2-3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia(α2-3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia(α2-6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia(α2-3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia(α2-6)GalGlcNAc2Man3GlcNAc, Sia(α2-3)GalGlcNAc2Man3GlcNAc, Sia(α2-6)GalGlcNAc3Man3GlcNAc, Sia(α2-3)GalGlcNAc3Man3GlcNAc, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, GalGlcNAc2Man3GlcNAc, GalGlcNAc3Man3GlcNAc, GlcNAc3Man3GlcNAc, GlcNAc2Man3GlcNAc, GlcNAcMan3GlcNAc 및 Man3GlcNAc로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 탄수화물 모이어티는 Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia2(α2-3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia2(α2-3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia2(α2-3/α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia2(α2-6/α2-3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia2(α2-3/α2-6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia2(α2-6/α2-3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia(α2-3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc, Sia(α2-6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia(α2-3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc, Sia(α2-6)GalGlcNAc2Man3GlcNAc, Sia(α2-3)GalGlcNAc2Man3GlcNAc, Sia(α2-6)GalGlcNAc3Man3GlcNAc, Sia(α2-3)GalGlcNAc3Man3GlcNAc, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc 및 Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법에서 단계 (b)는 당 사슬 연장을 야기시킨다. 당 사슬 연장을 위한 하나의 방법은 효소-촉매화 글리코실화 반응을 통해 일어난다. 당해 분야에는, 글리코실화 반응이 산, 물, 등의 임의 수반되는 제거 없이 부가 반응 및 발달(advance)이기 때문에, 효소-촉매화 글리코실화 반응 중에서 당 도너로서 당 옥사졸린을 사용한 글리코실화가 올리고당을 합성하기 위해 유용하다는 것은 널리 알려져 있다[Fujita, et al., Biochim. Biophys. Acta 2001, 1528, 9-14]
일부 구현예에서, 탄수화물 모이어티는 당 옥사졸린이다.
적합한 조건은 또한, 적어도 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 70분, 80분, 90분 또는 100분, 바람직하게, 60분 미만 동안 반응 혼합물의 인큐베이션을 포함한다. 인큐베이션은 바람직하게, 실온에서, 더욱 바람직하게, 대략 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 또는 45℃, 및 가장 바람직하게, 대략 37℃에서 일어난다.
본 발명의 α-푸코시다제의 폴리펩티드가 이의 단리 또는 정제를 보조하기 위해 유도체화되거나 개질될 수 있다는 것으로 이해될 것이다. 이에 따라, 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 폴리펩티드는 분리 수단에 직접적으로 그리고 특이적으로 결합할 수 있는 리간드의 첨가에 의해 유도체화되거나 개질된다. 대안적으로, 폴리펩티드는 결합 쌍의 하나의 일원의 첨가에 의해 유도체화되거나 개질되며, 분리 수단은 결합 쌍의 다른 일원의 첨가에 의해 유도체화되거나 개질되는 시약을 포함한다. 임의 적합한 결합 쌍이 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 폴리펩티드가 결합 쌍의 하나의 일원의 첨가에 의해 유도체화되거나 개질되는 바람직한 구현예에서, 폴리펩티드는 바람직하게, 히스티딘-태그화되거나 바이오틴-태그화된다. 통상적으로, 히스티딘 또는 바이오틴 태그의 아미노산 코딩 서열은 유전자 수준으로 포함되며, 단백질은 대장균(E. coli)에서 재조합으로 발현된다. 히스티딘 또는 바이오틴 태그는 통상적으로 N-말단 또는 C-말단 중 어느 하나에서 폴리펩티드의 하나의 단부에 존재한다. 히스티딘 태그는 통상적으로 6개의 히스티딘 잔기로 이루어지며, 이는 이러한 것 보다, 통상적으로 최대 7, 8, 9, 10 또는 20개의 아미노산 보다 길거나 보다 짧은, 예를 들어, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산을 가질 수 있다. 또한, 히스티딘 태그는 하나 이상의 아미노산 치환, 바람직하게, 상기에서 정의된 바와 같은 보존적 치환을 함유할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 변형체 폴리펩티드는 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열에서 벗어나지만, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 효소의 동일한 또는 유사한 기능을 나타내는 폴리펩티드이다.
본원에서 사용되는, 서열에 대한 백분율(%) 서열 일치성은 최대 백분율 서열 일치성을 달성하기 위해 서열을 정렬시키고 필요한 경우에, 갭을 도입한 후에, 기준 폴리펩티드 서열에서 아미노산 잔기와 일치하는 후보 폴리펩티드 서열에서 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 백분율 서열 일치성을 결정할 목적을 위한 정렬은 당업자 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어, BLAST, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 대한 최대 정렬을 달성하기 위해 요구되는 임의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예는 실시예에서 입증된다.
약제 조성물 및 제형
본원에 기술된 바와 같이 항-HER2 GAb의 제조 후에, "사전-동결건조된 제형"이 형성될 수 있다. 제형을 제조하기 위한 항-HER2 GAb는 바람직하게, 본질적으로 순수하고, 요망되게 본질적으로 동질성을 나타낸다(즉, 오염 단백질 등이 존재하지 않음). "본질적으로 순수한" 단백질은 조성물의 총 중량을 기준으로 하여, 적어도 약 90 중량%의 단백질, 바람직하게, 적어도 약 95 중량%의 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다. "본질적으로 동질성을 나타내는" 단백질은 조성물의 총 중량을 기준으로 하여, 적어도 약 99 중량%의 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다. 특정 구현예에서, 단백질은 항체이다.
사전-동결건조된 제형에서 항-HER2 GAb의 양은 요망되는 용량 부피, 투여 모드(들), 등을 고려하여 결정된다. 선택되는 단백질이 완전 항체(전장 항체)인 경우에, 약 2 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 바람직하게, 약 5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL 및 더욱 바람직하게, 약 20 내지 30 mg/mL는 예시적인 출발 단백질 농도이다. 단백질은 일반적으로 용액 중에 존재한다. 예를 들어, 단백질은 약 4 내지 8, 및 바람직하게, 약 5 내지 7의 pH에서 pH-완충된 용액에 존재할 수 있다. 예시적인 완충제는 히스티딘, 포스페이트, 트리스, 시트레이트, 숙시네이트, 및 다른 유기산들을 포함한다. 완충제 농도는 예를 들어, 완충제 및 제형(예를 들어, 재구성된 제형)의 요망되는 등장성에 따라 약 1 mM 내지 약 20 mM, 또는 약 3 mM 내지 약 15 mM일 수 있다. 바람직한 완충제는 하기에서 입증된 바와 같이, 이러한 것이 동결건조보호 성질을 가질 수 있다는 점에서 히스티딘이다. 숙시네이트는 다른 유용한 완충제인 것으로 나타났다.
동결건조보호제는 사전-동결건조된 제형에 첨가된다. 바람직한 구현예에서, 동결건조보호제는 수크로오스 또는 트레할로오스와 같은 비-환원당이다. 사전-동결건조된 제형에서 동결건조보호제의 양은 일반적으로, 재구성 시에, 얻어진 제형이 등장성일 것이다. 그러나, 고장성 재구성된 제형이 또한 적합할 수 있다. 또한, 동결건조보호제의 양은 동결건조 시에 단백질의 분해/응집의 허용되지 않는 양이 일어나도록 너무 낮지 않아야 한다. 동결건조보호제가 당(예를 들어, 수크로오스 또는 트레할로오스)이고 단백질이 항체인 경우에, 사전-동결건조된 제형에서 예시적인 동결건조보호제 농도는 약 10 mM 내지 약 400 mM, 및 바람직하게, 약 30 mM 내지 약 300 mM, 및 가장 바람직하게, 약 50 mM 내지 약 100 mM이다.
단백질 대 동결건조보호제의 비는 각 단백질 및 동결건조보호제 조합에 대해 선택된다. 선택되는 단백질로서의 항체 및 높은 단백질 농도를 갖는 등장성 재구성된 제형을 발생시키기 위한 동결건조보호제로서의 당(예를 들어, 수크로오스 또는 트레할로오스)의 경우에, 항체에 대한 동결건조보호제의 몰비율은 1 mole 항체 당 약 100 내지 약 1500 mole 동결건조보호제, 및 바람직하게, 1 mole 항체 당 약 200 내지 약 1000 mole의 동결건조보호제, 예를 들어, 1 mole 항체 당 약 200 내지 약 600 mole의 동결건조보호제이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 사전-동결건조된 제형에 계면활성제를 첨가하는 것이 요망되는 것으로 확인되었다. 대안적으로, 또는 추가로, 계면활성제는 동결건조된 제형 및/또는 재구성된 제형에 첨가될 수 있다. 예시적인 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188); 트리톤; 소듐 도데실 설페이트(SDS); 소듐 라우렐 설페이트; 소듐 옥틸 글리코사이드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사크로신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스타미도프로필-, 팔니도프로필-, 또는 이소스테아라미도프로필-베타인(예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스타미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아라미도프로필-디메틸아민; 소듐 메틸 코코일-, 또는 디소듐 메틸 올레일-타우레이트; MONAQUATTM 시리즈(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 코폴리머(예를 들어, Pluronics, PF68 etc)를 포함한다. 첨가되는 계면활성제의 양은 재구성된 단백질의 응집을 감소시키고 재구성 후에 미립자의 형성을 최소화한다. 예를 들어, 계면활성제는 사전-동결건조된 제형에서 약 0.001 내지 0.5%, 및 바람직하게, 약 0.005 내지 0.05%의 양으로 존재할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 동결건조보호제(예를 들어, 수크로오스 또는 트레할로오스) 및 벌크화제(예를 들어, 만니톨 또는 글리신)의 혼합물은 사전-동결건조 제형의 제조에서 사용된다. 벌크화제는 과도한 포켓, 등이 없는 균일한 동결건조된 케이크의 생산을 가능하게 할 수 있다.
다른 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기술된 것은 사전-결정된 제형(및/또는 동결건조된 제형 및/또는 재구성된 제형)에 포함될 수 있으며, 단, 이러한 것들은 제형의 요망되는 특징에 악영향을 미치지 않는다. 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용주에 대해 비독성이고, 추가적인 완충제; 보존제; 보조-용매; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 생분해성 폴리머, 예를 들어, 폴리에스테르; 및/또는 염-형성 반대 이온, 예를 들어, 소듐을 포함한다.
본원에 기술된 약제 조성물 및 제형은 바람직하게, 안정하다. "안정한" 제형/조성물은 항체가 저장 시에 이의 물리적 및 화학적 안정성 및 보존성을 본질적으로 봉하는 것이다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술은 당해 분야에서 입수 가능하고, 문헌[Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)]에서 재검토되어 있다. 안정성은 선택된 온도에서 선택된 시기 동안 측정될 수 있다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제형은 멸균되어야 한다. 이는 동결건조 및 재구성 이전 또는 후에, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 대안적으로, 전체 혼합물의 멸균성은 예를 들어, 약 120℃에서 약 30분 동안 단백질을 제외한 구성성분들을 오토클레이브처리함으로써 달성될 수 있다.
단백질, 동결건조보호제 및 다른 선택적 성분들을 함께 혼합한 후에, 제형은 동결건조된다. 다수의 상이한 동결건조제, 예를 들어, Hull50®(Hull, USA) 또는 GT20®(Leybold-Heraeus, Germany) 동결건조제는 이러한 목적을 위하여 입수 가능하다. 동결-건조는 제형을 동결시키고 후속하여 1차 건조를 위해 적합한 온도에서 동결된 함유물로부터 얼음을 승화시킴으로써 달성된다. 이러한 조건 하에서, 생성물 온도는 공융점 또는 제형의 붕괴 온도 미만이다. 통상적으로, 1차 건조를 위한 저장 온도는 통상적으로 약 50 내지 250 mTorr 범위의 적합한 압력에서 약 -30℃ 내지 25℃의 범위일 것이다(단, 생성물은 1차 건조 동안 동결된 상태를 유지한다). 제형, 샘플을 보유하는 용기(예를 들어, 유리 바이알)의 크기 및 타입, 및 액체의 부피는 주로 건조를 위해 요구되는 시간을 지시할 것이며, 이는 수 시간 내지 수 일(예를 들어, 40 내지 60시간)의 범위일 수 있다. 제2 건조 단계는 주로 용기의 타입 및 크기, 및 사용되는 단백질의 타입에 따라, 약 0 내지 40℃에서 수행될 수 있다. 그러나, 본원에서, 제2 건조 단계가 필수적이지 않을 수 있다는 것이 확인되었다. 예를 들어, 동결건조의 전체 물 제거 시기 전반에 걸친 저장 온도는 약 15 내지 30℃(예를 들어, 약 20℃)일 수 있다. 제2 건조를 위해 요구되는 시간 및 압력은 예를 들어, 온도 및 다른 파라미터에 따라 적합한 동결건조된 케이크를 형성시키는 것일 것이다. 제2 건조 시간은 생성물에서 요망되는 잔류 수분 수준에 의해 지시되고, 통상적으로 적어도 약 5 시간(예를 들어, 10 내지 15시간) 소요된다. 압력은 제1 건조 단계 동안 이용되는 것과 동일할 수 있다. 동결-건조 조건은 제형 및 바이알 크기에 따라 달라질 수 있다.
일부 경우에, 이동 단계를 방지하기 위해 단백질의 재구성이 수행되는 용기에서 단백질 제형을 동결건조시키는 것이 요망될 수 있다. 이러한 경우에 용기는 예를 들어, 3, 5, 10, 20, 50 또는 100 cc 바이알일 수 있다. 일반적인 문제로서, 동결건조는 이의 수분 함량이 약 5% 미만, 바람직하게, 약 3% 미만인 동결건조된 제형을 야기시킬 것이다.
요망되는 단계에서, 통상적으로, 환자에 단백질을 투여하기 위한 시간일 때, 동결건조된 제형은, 재구성된 제형에서 단백질 농도가 적어도 50 mg/mL, 예를 들어, 약 50 mg/mL 내지 약 400 mg/mL, 더욱 바람직하게, 약 80 mg/mL 내지 약 300 mg/mL, 및 가장 바람직하게, 약 90 mg/mL 내지 약 150 mg/mL이도록 희석제로 재구성될 수 있다. 재구성된 제형에서 이러한 높은 단백질 농도는 재구성된 제형의 피하 전달이 의도되는 경우에 특히 유용한 것으로 여겨진다. 그러나, 다른 투여 경로, 예를 들어, 정맥내 투여를 위하여, 재구성된 제형에서 단백질의 보다 낮은 농도가 요망될 수 있다(예를 들어, 재구성된 제형에서 약 5 내지 50 mg/mL, 또는 약 10 내지 40 mg/mL 단백질). 특정 구현예에서, 재구성된 제형 중 단백질 농도는 사전-동결건조된 제형에서 보다 상당히 높다. 예를 들어, 재구성된 제형 중의 단백질 농도는 사전-동결건조된 제형 중의 농도의 약 2 내지 40배, 바람직하게, 3 내지 10배, 및 가장 바람직하게, 3 내지 6배(예를 들어, 적어도 3배 또는 적어도 4배)일 수 있다.
재구성은 일반적으로, 완전한 수화를 보장하기 위해 약 25℃의 온도에서 일어나며, 다른 온도가 요망되는 경우에 사용될 수 있다. 재구성을 위해 요구되는 시간은 예를 들어, 희석제의 타입, 부형제(들) 및 단백질의 양에 따를 것이다. 예시적인 희석제는 멸균수, 주사용 세균발육억제수(BWFI), pH 완충 용액(예를 들어, 포스페이트-완충 염수), 멸균 염수 용액, 링거 용액, 또는 덱스트로오스 용액을 포함한다. 희석제는 선택적으로, 보존제를 함유한다. 예시적인 보존제는 상술된 바와 같으며, 방향족 알코올, 예를 들어, 벤질 또는 페놀 알코올이 바람직한 보존제이다. 사용되는 보존제의 양은 단백질 및 보존제 효능 시험과의 양립성을 위한 상이한 보존제 농도를 평가함으로써 결정된다. 예를 들어, 보존제가 방향족 알코올(예를 들어, 벤질 알코올)인 경우에, 이는 약 0.1 내지 2.0% 및 바람직하게, 약 0.5 내지 1.5%, 및 가장 바람직하게, 약 1.0 내지 1.2%의 양으로 존재할 수 있다. 바람직하게, 재구성된 제형은 크기가 10 ㎛ 미만인 바이알 당 6000개 미만의 입자를 갖는다.
면역콘쥬게이트
다른 양태에서, 본 발명은 화학치료제, 약물, 성장 억제제, 톡신(예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 톡신, 또는 이의 단편) 또는 방사성 동위원소(예를 들어, 방사콘쥬게이트(radioconjugate))와 같은 세포독성제에 콘쥬게이션된 항체를 포함하는, 면역콘쥬게이트, 또는 항체-약물 콘쥬게이트(ADC)를 제공한다.
세포독성제 또는 세포정지제, 즉, 암의 치료에서 종양 세포를 사멸시키거나 억제시키기 위한 약물의 국소 전달을 위한 항체-약물 콘쥬게이트의 사용[Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; 미국특허번호 4,975,278]은 종양으로의 약물 모이어티의 타겟화된 전달, 및 여기에서의 세포내 축적을 가능하게 하며, 여기서, 이러한 비콘쥬게이션된 약물 제제의 전신 투여는 정상 세포 뿐만 아니라 제거하고자 하는 종양 세포에 대한 허용되지 않는 독성의 수준을 야기시킬 수 있다[Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506]. 최소 독성과 함께 최대 효능이 이에 의해 추구된다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 둘 모두는 이러한 전략에서 유용한 것으로서 보고되었다[Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87]. 이러한 방법에서 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다[Rowland et al., (1986) supra]. 항체-톡신 콘쥬게이트에서 사용되는 톡신은 박테리아 톡신, 예를 들어, 디프테리아 톡신, 식물 톡신, 예를 들어, 리신, 소분자 톡신, 예를 들어, 겔다나마이신[Mandler et al (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791], 마이탄시노이드[EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623], 및 칼리케아마이신[Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342]을 포함한다. 톡신은 튜부틴 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라아제 억제를 포함하는 메카니즘에 의해 이의 세포독성 및 세포정지 효과를 가져올 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 콘쥬게이션될 때 불활성이거나 낮은 활성을 나타내는 경향이 있다.
항체 유도체
본 발명의 항체는 당해 분야에 공지되고 용이하게 입수 가능한 추가적인 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 개질될 수 있다. 일 구현예에서, 항체의 유도체화를 위해 적합한 모이어티는 수용성 폴리머이다. 수용성 폴리머의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 코폴리머, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 코폴리머, 폴리아미노산(호모폴리머 또는 랜덤 코폴리머 중 어느 하나), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 코폴리머, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 이의 수중 안정성으로 인해 제조에 있어서 장점을 가질 수 있다. 폴리머는 임의 분자량일 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 폴리머의 수는 다양할 수 있고, 하나 초과의 폴리머가 부착되는 경우에, 폴리머는 동일한 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화를 위해 사용되는 폴리머의 수 및/또는 타입은 항체 유도체가 규정된 조건, 등 하에서 치료법에서 사용될 것인지 간에, 개선될 항체의 특정 성질 또는 기능을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 고려사항을 기반으로 하여 결정될 수 있다.
다른 구현예에서, 방사선에 대한 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체와 비단백질성 모이어티의 콘쥬게이트가 제공된다. 일 구현예에서, 비단백질성 모이어티는 카본 나노튜브이다[Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 11600-11605 (2005)]. 방사선은 임의 파장을 가질 수 있고, 일반 세포에 해롭지 않지만, 항체-비단백질성 모이어티에 인접한 세포가 사멸되는 온도까지 비단백질성 모이어티를 가열시키는 파장을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
치료 적용
트라스투즈맙(Herceptin®)은 널리 사용되고, 초기 뿐만 아니라 전이성 유방암에 걸린 환자의 치료를 위해 당해 분야에 공지되어 있으며, 이의 종양은 HER2 단백질을 과발현시키거나 HER 2 유전자 증폭을 갖는다. 당해 분야에서, 헤르셉틴/트라스투즈맙으로의 유방암 환자의 치료는, 예를 들어, HER2-양성 질병을 갖는 환자에게 제안되고 일반적이다. 유방암에서 HER2-양성 질병은 면역조직화학적 방법(예를 들어, HER2(+++) 또는 HER2 유전자 증폭(예를 들어, 종양 세포 당 HER2 유전자의 4개 초과의 사본의 HER2 유전자 사본수) 또는 둘 모두에 의해 검출된 높은 HER2(단백질) 발현 수준이 유방 조직 생검 또는 유방 조직 절제와 같은 환자로부터 얻어진 샘플에서 또는 전이성 부위로부터 유도된 조적에서 확인되는 경우에 존재한다.
ADCC-향상된 항-HER2 글리코항체는 HER2-발현 종양을 치료하기 위한 대안적인 치료제를 제공한다. 본 발명의 글리코항체는 유리하게, 현 투여 경로 및 현 치료 요법을 변경시키기 위해 사용될 수 있으며, 이의 증가된 이펙터 기능 수단으로서, 이러한 것은 보다 낮은 농도로 및 낮은 빈도수로 투약될 수 있고, 이에 의해 항체 독성 및/또는 항체 내성의 발달에 대한 가능성을 감소시킨다. 또한, 이의 개선된 이펙터 기능은 재조합 호스트 시스템에서 형성된 상응하는 항-HER2 모노클로날 항체로의 치료에 대해 종래에 내성적이거나 내화적인 임상적 적응증(clinical indication)을 치료하기 위한 새로운 접근법을 산출한다.
이에 따라, 본 발명은 환자에게 유효량의 본원에 기술된 글리코항체를 투여하는 것을 포함하는 HER2-발현 종양을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 유방암을 치료하는 방법을 제공한다.
상술된 조성물은 약제 조성물일 수 있는데, 이는 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
조성물은 전달을 필요로 하는 피검체(예를 들어, 암에 걸리거나 걸리기 쉬운 인간 환자)에 조성물을 투여함으로써 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 항암제는 암을 치료하는데 효과적인 양으로 피검체에 전달된다. 다른 구현예에서, 탈착 가능한 라벨, 바람직하게, 암 영상화를 위해 적합한 제제는 피검체(예를 들어, 고체 종양에 걸리거나 종양에 걸리기 쉬운 인간 환자)에 암 세포 및/또는 암성 조직으로 전달된다.
"아폽토시스를 유발시키는" 항체는 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편화, 및/또는 막 소포(아폽토성 바디)의 형성에 의해 결정하는 경우 프로그래밍된 세포사를 유발시키는 것이다. 바람직하게, 세포는 감염된 세포이다. 다양한 방법은 아폽토시스와 관련된 세포 사건을 평가하기 위해 이용 가능하다. 예를 들어, 포스파티딜 세린(PS) 전위는 아넥신 결합에 의해 측정될 수 있으며, DNA 단편화는 DNA 래더링을 통해 평가될 수 있으며, DNA 단편화와 함께 핵/염색사 응축은 저이배체 세포의 임의 증가에 의해 평가될 수 있다. 바람직하게, 아폽토시스를 유발시키는 항체는 아넥신 결합 검정에서 처리되지 않은 세포에 비해 약 2 내지 50배, 바람직하게, 약 5 내지 50배, 및 가장 바람직하게, 약 10 내지 50배의 아넥신 결합의 유발을 야기시키는 것이다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역(천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변형체 Fc 영역)에 기여 가능한 그러한 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 동형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존 세포-매개 세포독성(ADCC); 식균 작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
"항체-의존 세포-매개된 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포(예를 들어, 천연살(NK) 세포, 호중구, 및 대식 세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합된 분비된 Ig가 항원-지닌 타겟 세포에 이러한 세포독성 이펙터 세포를 특이적으로 결합시킬 수 있고 후속하여 타겟 세포를 세포톡신으로 사멸시키는 세포독성 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포를 "연결시키며" 이러한 서멸을 위해 요구된다. ADCC, NK 세포를 매개시키기 위한 1차 세포는 단지 FcγRIII을 발현사키고, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발견하였다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464쪽, 표 3에 요약되어 있다. 고려되는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 시험관내 ADCC 검정, 예를 들어, 미국특허번호 5,500,362호 또는 미국특허번호 5,821,337호에 기술된 것이 수행될 수 있다. 이러한 검정을 위한 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 및 자연살(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 고려되는 분자의 ADCC 활성은 시험관 내에서, 예를 들어, 동물 모델, 예를 들어, 문헌[Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998)]에 기술된 것으로 평가될 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 특정 구현예에서, FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)를 결합시키고 수용체의 대립 변형체 및 교대로 접소된 형태를 포함하는, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함하며, 이는 이의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 이의 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 이의 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITIM)를 함유한다[reviewed by M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)]. FcR은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토되어 있다. 미래에 동정되는 것을 포함하는 다른 FcR은 본원에서 용어 "FcR"에 의해 포함된다. 이러한 용어는 또한 신생아 수용체, FcRn을 포함하며, 이는 태아로의 모계 IgG의 전달의 원인이 된다[Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)].
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현시키고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현시키고, ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 매개체의 예는 PBMC, NK 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하며, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 이펙터 세포는 천연 공급원으로부터, 예를 들어, 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"보체 의존 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 타겟 세포의 용해를 지칭한다. 전통적인 보체 경로의 활성화는 이의 동족 항원에 결합되는 (적절한 하위부류의) 항체에 대한 보체 시스템(C1q)의 제1 성분의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기술된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "완화"는 치료학적 처리 및 예방적 수단 둘 모두를 지칭하며; 여기서, 목적은 타겟화된 병리학적 질병 또는 질환을 예방하거나 늦추기(줄이기) 위한 것이다. 치료를 필요로 하는 것은 이미 질환을 갖는 것, 뿐만 아니라 질환을 갖기 쉬운 것, 또는 질환이 예방되는 것을 포함한다. 피검체 또는 포유동물은, 본 발명의 방법에 따른 항체의 치료량을 수용한 후에, 환자가 하기한 것들 중 하나 이상에서 또는 이의 부재 하에 관찰 가능한 및/또는 측정 가능한 감소를 나타내느 경우에 감염증에 대해 성공적으로 "치료된다": 감염된 세포의 수의 감소 또는 감염된 세포의 부재; 감염된 총 세포의 백분율의 감소; 및/또는 특정 감염증과 관련된 증상들의 하나 이상의 어느 정도의 완화; 감소된 이환율 및 치사율, 및 삶의 질 문제의 개선. 질병의 성공적인 치료 및 개선을 평가하기 위한 상기 파라미터는 의사에게 잘 알려진 일반적인 절차에 의해 용이하게 측정 가능하다.
용어 "치료학적 유효량"은 피검체 또는 포유동물에서 질병 또는 질환을 "치료"하기 위해 효과적인 항체 또는 약물의 양을 지칭한다. 상기 "치료하는"의 정의를 참조한다.
하나 이상의 추가 치료제"와 병용한" 투여는 동시(병행) 및 임의 순서의 연속적 투여를 포함한다.
본원에서 사용되는 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유동물에 대해 비독성인 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 생리학적으로 허용되는 담체는 pH 완충된 수용액이다. 생리학적으로 허용되는 담체의 예는 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산을 포함한 항산화제; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 당 알코올, 예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들어, 소듐; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, TWEEN™ 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 PLURONICS™를 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 세부사항은 하기 설명에 기술된다. 본 발명의 다른 특징 또는 장점은 여러 구현예들의 하기 도면 및 상세한 설명으로부터, 및 또한, 첨부된 청구범위로부터 명백하게 될 것이다.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 하기의 실시예에 기술된 기술들이 본 발명의 실행에서 잘 기능하기 위해 본 발명자에 의해 발견되는 기술들을 나타내고, 이에 따라, 이의 실행을 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 여겨질 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 그러나, 당업자는 본 발명의 측면에서, 다수의 변형예가 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 같은 또는 유사한 결과를 기술하고 여전히 얻어지는 특정 구현예들에서 이루어질 수 있다는 것을 인식할 수 있다.
실시예
예시적 일반적인 절차
방법 A: 티오 - 글리칸 공여체에 의한 글리코실화
글리코실화를 위한 분자체 MS-4Å를 활성화시키기 위해, 이를 진공 시스템에 연결시키고, 1시간 동안 가열시켰다. 활성화된 분자체를 실온까지 냉각시킨 후에, 이를 공여체(1 위치 글리코실화를 위한 1.5 내지 2.0 당량) 및 수용체(1.0 당량)를 함유한 플라스크에 첨가하였다. 디클로로메탄을 혼합물에 첨가하고, 이후에, 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. N-요오도숙신이미드(NIS, 1.7 내지 2.2 당량) 및 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(TMSOTf, 0.1 당량)를 -78℃에서 용액에 첨가하고, 이후에, 용액을 -20℃에서 교반하였다. 반응을 박막 크로마토그래피(TLC) 분석에 의해 모니터링하였고, 이를 유리-후면 실리카겔 플레이트(Merck DC Kieselgel 60F254) 상에서 수행하였고, UV 광(254 nm) 및 산성 세릭 암모늄 몰리브데이트에 의해 시각화하였다. 수용체를 완전히 소비한 후에, 반응을 포화 NaHCO3(aq), 및 20% Na2S2O3으로 켄칭시키고, 이후에, 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하였다. 수층을 2 부분의 디클로로메탄으로 추출한 후에, 합한 유기층을 염수로 세척하고, MgSO4 상에서건조시키고, 농축하였다. 미정제물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용리 시스템으로서 톨루엔/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 생성물을 수득하였다(소율은 반응기에 나타냄).
방법 B: 플루오라이드 - 글리칸 공여체에 의한 글리코실화
건조 톨루엔 중의 은 트리플레이트(5 당량), 비스(시클로펜타디에닐)하프늄 디클로라이드(3.5 당량) 및 4Å 활성화된 분자체의 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 -50℃까지 냉각시키고, 톨루엔 중 수용체(1.0 당량) 및 공여체(1.2 내지 1.5 당량)의 혼합물을 첨가하였다. 혼합물을 -10℃에서 2 내지 8시간 동안 교반하였다. TLC에서 수용체의 완전한 소비가 지시된 후에, 반응을 Et3N으로 켄칭시키고, EtOAc로 희석시키고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 여액을 수성 NaHCO3, 및 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 중에 농축시켰다. 미정제물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용리 시스템으로서 톨루엔/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 생성물을 수득하였다(수율은 반응식에 나타냄).
방법 C: O-아세틸의 탈보호화
NaOMe(0.25 당량)를 THF/메탄올(2/3) 중 출발 물질(1.0 당량)의 용액에 첨가하였다. 반응을 실온에서 교반하고, TLC 분석에 의해 모니터링하였다. 아세틸 기를 완전히 탈보호화한 후에, 용액을 IR-120에 의해 중화시키고, 여과하고, 농축시켰다. 미정제물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용리 시스템으로서 헥산/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 생성물을 수득하였다(수율은 반응식에 나타냄).
방법 D: O- Troc의 탈보호화
Zn 분말(20 당량) 및 아세트산(0.2 당량)을 THF 중 출발 물질(1.0 당량)의 용액에 첨가하였다. 반응을 실온에서 교반하고, 박막 크로마토그래피(TLC) 분석에 의해 모니터링하였다. Troc 기를 완전히 탈보호화한 후에, 용액을 IR-120에 의해 중화시키고, 여과하고, 농축시켰다. 미정제물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용리 시스템으로서 헥산/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 생성물을 수득하였다(수율은 반응식에 나타냄).
방법 E: 벤질리덴의 탈보호화
p-톨루엔설폰산(pTSA, 1.5 당량)을 ACN/MeOH(2/1) 중 출발 물질(1.0 당량)의 용액에 첨가하였다. 반응을 실온에서 교반하고, 박막 크로마토그래피(TLC) 분석에 의해 모니터링하였다. 벤질리덴 기를 완전히 제거한 후에, 반응을 트리메틸아민에 의해 켄칭시키고, 이후에, 농축시켰다. 미정제물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용리 시스템으로서 헥산/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 생성물을 수득하였다(수율은 반응식에 나타냄).
방법 F: 전체 탈보호화
보호된 올리고당(50 mmol) 및 10 mL의 에틸렌 디아민:nBuOH(1/4)의 혼합물을 90℃에서 밤새 교반하였다. 휘발성 물질을 증발시키고, 미정제물을 10 mL Ac2O/피리딘(1/2)과 밤새 반응시켰다. 용매를 고진공을 이용하여 제거하고, 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(용리 시스템으로서 아세톤/톨루엔)에 의해 정제하였다. 생성물을 MeOH(10 mL) 중 소듐 메톡사이드를 사용하여 밤새 탈-아세틸화하였다. 반응을 IR-120을 사용하여 중화시키고, 이후에, 여과하고, 진공 중에 농축시켰다. 잔류물을 플레시 컬럼 크로마토그래피(용리 시스템으로서 아세톤/톨루엔)에 의해 정제하였다. 생성물을 10 mL MeOH:H2O:HCOOH(6/3/1)에 용해시키고, Pd(OH)2(50 중량%)를 첨가하고, 반응을 밤새 수소화하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 진공 중에 농축시켰다. 잔류물을 용리액으로서 물을 사용하여 G-15 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물을 동결건조시켜 백색 칼라의 분말을 수득하였다(수율은 반응식에 나타냄).
방법 G: 효소적 (2,6)- 시알릴화
출발 물질(5 μmol), CTP(1 μmol), Neu5Ac(9.5 μmol), PEP(10 μmol), α-2,6 시알릴트랜스퍼라아제(200 ㎕, 2 mg/L의 추정 농도), CMK(80 유닛), PK (40 유닛), 및 PPA(40 유닛)를 1% BSA 함유 50 μmol 소듐 카코딜레이트(pH 7.4)(130 ㎕)에 용해시켰다. 반응을 2일 동안 온화하게 교반하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. 생성물을 G-15 겔 크로마토그래피(용리액, H2O)를 사용함으로써 정제하여 동결건조 후 요망되는 생성물을 백색 고체로서 수득하였다.
빌딩 블록:
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비대칭 N- 글리칸을 합성하기 위한 실험적 절차
반응식 1
Figure 112016127948226-pct00009
비대칭 N- 글리칸을 합성하기 위한 실험적 절차
반응식 2
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반응식 3
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바이섹팅 - GlcNAc N- 글리칸을 합성하기 위한 실험적 절차
반응식 4
Figure 112016127948226-pct00012
실시예 1 : 예시적인 항- HER2 GAb의 형성
항- HER2 GAb301
트라스투즈맙 (헤르셉틴)의 Fc 영역으로부터 Asn297에서 N-연결된 글리칸의 완전한 제거는 PNGase F에 의해 달성되고, 4 내지 12% Bis-Tris NeuPAGE 및 개질된 및 비개질된 IgG로부터 트립신 글리코펩티드의 LC-MS/MS 분석으로 평가된다. 트립신 글리코펩티드의 분자량은 각 아스파라긴에서 N-연결된 글리코실화의 잠재적인 사이트를 결정하고 우세한 글리칸의 종을 설명하는데 도움을 준다.
항- HER2 GAb201
Fc 영역에서 GlcNAc-Fuc의 글리칸 구조를 지닌 통상적인 트라스투즈맙 (헤르셉틴)으로부터 유도된 글리코항체를 하나 이상의 엔도글리코시다제(Endo S 및/또는 Endo F1, Endo F2, Endo F3)로 처리하고, 이후에 알파-푸코시다제로 처리하여 높은 분열 효율로 코어 푸코오스를 분열시키고, Fc 영역에서 단당류 GlcNAc를 갖는 글리코항체를 야기시킨다.
50 mM 소듐 포스페이트 완충제(pH 7) 중의 Endo S(10 ㎍), Endo F1/ Endo F2/ Endo F3(10 ㎍), 푸코시다제(2 mg) 및트라스투즈맙(2 mg)의 혼합물을 37℃에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제를 위한 단백질 A 친화력 컬럼으로 처리하였다. 항-HER2 GAb201의 부분을 수집하였다(수율: 96.6%). 수집된 부분을 트립신처리하였다. 트립신처리된 글리코펩티드, TKPREEQYNSTYR(SEQ ID NO:3) 및 EEQYNSTYR(SEQ ID NO:4)을 나노분무 LC/MS를 이용하여 분석하여 항-HER2 GAb201의 글리코실화 패턴을 확인하였다.
항- HER2 GAb101
에탄올을 100 mL의 달걀 난황에 첨가하고, 철저하게 혼합하였다. 원심분리 후에, 상청액을 폐기하고, 펠렛을 수집하였다. 펠렛을 에탄올로 2회 세척하였다. 물을 펠렛에 첨가하고, 철저하게 혼합하였다. 혼합물을 원심분리하였다. 원심분리 후에, 상청액을 폐기하고, 펠렛을 수집하였다. 펠렛을 에탄올과 혼합하였다. 상청액을 수집하고, 동결건조시켜 1.5 g의 백색 탈-지방 분말을 수득하였다. 분말을 포스페이트 완충액에 용해시키고, 효소 소화를 위해 1 mg 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제로 처리하였다. 반응 혼합물을 수용성 유기 용매와 철저하게 혼합하고, 원심분리하여 상청액을 수집하였다. 상청액을 이온 교환 컬럼에 의해 정제하였다. 18 mg의 glcan-101(Sia2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc)을 수득하였다.
수중 글리칸-101(Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc)(30 mg), 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸륨 클로라이드(DMC)(62.7 mg) 및 Et3N(89 ㎕)의 용액을 4℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0.05% 수성 Et3N에 의해 용리되는 Sephadex G-25 컬럼 상에서의 겔 여과 크로마토그래피로 처리하여 글리칸 옥사졸린-101를 수집하였다.
글리칸 옥사졸린-101을 50 mM 트리스 완충액(pH 7.8) 중 엔도글리코시다제 및 항-HER2 GAb201의 혼합물에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 단백질 A 친화력 컬럼으로 정제하고, 이후에, 음이온 교환 컬럼 capto Q로 정제하여 요망되는 생성물, 항-HER2 GAb101을 수득하였다. 생성물을 트립신처리하고, 글리코펩티드, TKPREEQYNSTYR(SEQ ID NO:3) 및 EEQYNSTYR(SEQ ID NO:4)을 나노분무 LC/MS를 이용하여 분석하여 항-HER2 GAb101의 글리코실화 패턴을 확인하였다.
항- HER2 GAb102
수중 글리칸-102(Sia(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc)(30 mg), 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리늄 클로라이드(DMC)(62.7 mg) 및 Et3N(89 ㎕)의 용액을 4℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0.05% 수성 Et3N에 의해 용리되는 Sephadex G-25 컬럼 상에서의 겔 여과 크로마토그래피로 처리하였다. 생성물(글리칸 옥사졸린-102)을 함유한 부분들을 합하고, 동결건조시켜 백색 분말을 수득하였다.
글리칸 옥사졸린-102를 50 mM 트리스 완충액(pH 7.8) 중 엔도글리코시다제 및 항-HER2 GAb201의 혼합물에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 단백질 A 친화력 컬럼으로 정제하고, 이후에 음이온 교환 컬럼 capto Q으로 정제하여 요망되는 생성물, 항-HER2 GAb102를 수득하였다. 생성물을 트립신처리하고, 글리코펩티드, TKPREEQYNSTYR(SEQ ID NO:3) 및 EEQYNSTYR(SEQ ID NO:4)을 나노분무 LC/MS를 이용하여 분석하여 항-HER2 GAb102의 글리코실화 패턴을 확인하였다.
항- HER2 GAb103
수(593 ㎕) 중 글리칸-103(Sia(α2-6)GalGlcNAc2Man3GlcNAc)(30 mg), 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리늄 클로라이드(DMC)(62.7 mg) 및 Et3N(89 ㎕)의 용액을 4℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0.05% 수성 Et3N에 의해 용리되는 Sephadex G-25 컬럼 상에서의 겔 여과 크로마토그래피로 처리하였다. 생성물(글리칸 옥사졸린-103)을 함유한 부분들을 합하고, 동결건조시켜 백색 분말을 수득하였다.
글리칸 옥사졸린-103을 50 mM 트리스 완충액(pH 7.8) 중 엔도글리코시다제 및 항-HER2 GAb201의 혼합물에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 단백질 A 친화력 컬럼으로 정제하고, 이후에 음이온 교환 컬럼 capto Q으로 정제하여 요망되는 생성물, 항-HER2 GAb103을 수집하였다. 생성물을 트립신처리하고, 글리코펩티드, TKPREEQYNSTYR(SEQ ID NO:3) 및 EEQYNSTYR(SEQ ID NO:4)을 나노분무 LC/MS를 이용하여 분석하여 항-HER2 GAb103의 글리코실화 패턴을 확인하였다.
항- HER2 GAb104
수중 글리칸-104 (Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc)(30 mg), 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리늄 클로라이드(DMC)(62.7 mg) 및 Et3N(89 ㎕)의 용액을 4℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0.05% 수성 Et3N에 의해 용리되는 Sephadex G-25 컬럼 상에서의 겔 여과 크로마토그래피로 처리하였다. 생성물(글리칸 옥사졸린-104)을 함유한 부분들을 합하고, 동결건조시켜 백색 분말을 수득하였다.
글리칸 옥사졸린-104를 50 mM 트리스 완충액(pH 7.8) 중 엔도글리코시다제 및 항-HER2 GAb201의 혼합물에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 단백질 A 친화력 컬럼으로 정제하고, 이후에 음이온 교환 컬럼 capto Q으로 정제하여 요망되는 생성물, 항-HER2 GAb104를 수집하였다. 생성물을 트립신처리하고, 글리코펩티드, TKPREEQYNSTYR(SEQ ID NO:3) 및 EEQYNSTYR(SEQ ID NO:4)을 나노분무 LC/MS를 이용하여 분석하여 항-HER2 GAb104의 글루코실화 패턴을 확인하였다.
항- HER2 GAb 105
수중 글리칸-105(GalGlcNAc2Man3GlcNAc)(30 mg), 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리늄 클로라이드(DMC)(62.7 mg) 및 Et3N(89 ㎕)의 용액을 4℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0.05% 수성 Et3N에 의해 용리되는 Sephadex G-25 컬럼 상에서의 겔 여과 크로마토그래피로 처리하였다. 생성물(글리칸 옥사졸린-105)을 함유한 부분들을 합하고, 동결건조시켜 백색 분말을 수득하였다.
글리칸 옥사졸린-105를 50 mM 트리스 완충액(pH 7.8) 중 엔도글리코시다제 및 항-HER2 GAb201의 혼합물에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 단백질 A 친화력 컬럼으로 정제하고, 이후에 음이온 교환 컬럼 capto Q으로 정제하여 요망되는 생성물, 항-HER2 GAb105를 수집하였다. 생성물을 트립신처리하고, 글리코펩티드, TKPREEQYNSTYR(SEQ ID NO:3) 및 EEQYNSTYR(SEQ ID NO:4)을 나노분무 LC/MS를 이용하여 분석하여 항-HER2 GAb105의 글리코실화 패턴을 확인하였다
항- HER2 GAb 106
수(593 ㎕) 중 글리칸-106(GalGlcNAcMan3GlcNAc) (30 mg), 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리늄 클로라이드(DMC)(62.7 mg) 및 Et3N(89 ㎕)의 용액을 4℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0.05% 수성 Et3N에 의해 용리되는 Sephadex G-25 컬럼 상에서의 겔 여과 크로마토그래피로 처리하였다. 생성물(글리칸 옥사졸린-106)을 함유한 부분들을 합하고, 동결건조시켜 백색 분말을 수득하였다.
글리칸 옥사졸린-106을 50 mM 트리스 완충액(pH 7.8) 중 엔도글리코시다제 및 항-HER2 GAb201의 혼합물에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 단백질 A 친화력 컬럼으로 정제하고, 이후에 음이온 교환 컬럼 capto Q으로 정제하여 요망되는 생성물, 항-HER2 GAb106을 수집하였다. 생성물을 트립신처리하고, 글리코펩티드, TKPREEQYNSTYR(SEQ ID NO:3) 및 EEQYNSTYR(SEQ ID NO:4)을 나노분무 LC/MS를 이용하여 분석하여 항-HER2 GAb106의 글리코실화 패턴을 확인하였다
항- HER2 GAb107
수중 글리칸-107(GlcNAc3Man3GlcNAc) (30 mg), 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리늄 클로라이드(DMC)(62.7 mg) 및 Et3N(89 ㎕)의 용액을 4℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0.05% 수성 Et3N에 의해 용리되는 Sephadex G-25 컬럼 상에서의 겔 여과 크로마토그래피로 처리하였다. 생성물(글리칸 옥사졸린-107)을 함유한 부분들을 합하고, 동결건조시켜 백색 분말을 수득하였다.
글리칸 옥사졸린-107을 50 mM 트리스 완충액(pH 7.8) 중 엔도글리코시다제 및 항-HER2 GAb201의 혼합물에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 단백질 A 친화력 컬럼으로 정제하고, 이후에 음이온 교환 컬럼 capto Q으로 정제하여 요망되는 생성물, 항-HER2 GAb107을 수집하였다. 생성물을 트립신처리하고, 글리코펩티드, TKPREEQYNSTYR(SEQ ID NO:3) 및 EEQYNSTYR(SEQ ID NO:4)을 나노분무 LC/MS를 이용하여 분석하여 항-HER2 GAb107의 글리코실화 패턴을 확인하였다.
항- HER2 GAb 108
수중 글리칸-108(GlcNAc2Man3GlcNAc) (30 mg), 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리늄 클로라이드(DMC)(62.7 mg) 및 Et3N(89 ㎕)의 용액을 4℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0.05% 수성 Et3N에 의해 용리되는 Sephadex G-25 컬럼 상에서의 겔 여과 크로마토그래피로 처리하였다. 생성물(글리칸 옥사졸린-108)을 함유한 부분들을 합하고, 동결건조시켜 백색 분말을 수득하였다.
글리칸 옥사졸린-108을 50 mM 트리스 완충액(pH 7.8) 중 엔도글리코시다제 및 항-HER2 GAb201의 혼합물에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 단백질 A 친화력 컬럼으로 정제하고, 이후에 음이온 교환 컬럼 capto Q으로 정제하여 요망되는 생성물, 항-HER2 GAb108을 수집하였다. 생성물을 트립신처리하고, 글리코펩티드, TKPREEQYNSTYR(SEQ ID NO:3) 및 EEQYNSTYR(SEQ ID NO:4)을 나노분무 LC/MS를 이용하여 분석하여 항-HER2 GAb108의 글리코실화 패턴을 확인하였다.
항- HER2 GAb109
수중 글리칸-109(GlcNAcMan3GlcNAc) (30 mg), 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리늄 클로라이드(DMC)(62.7 mg) 및 Et3N(89 ㎕)의 용액을 4℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0.05% 수성 Et3N에 의해 용리되는 Sephadex G-25 컬럼 상에서의 겔 여과 크로마토그래피로 처리하였다. 생성물(글리칸 옥사졸린-109)을 함유한 부분들을 합하고, 동결건조시켜 백색 분말을 수득하였다.
글리칸 옥사졸린-109를 50 mM 트리스 완충액(pH 7.8) 중 엔도글리코시다제 및 항-HER2 GAb201의 혼합물에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 단백질 A 친화력 컬럼으로 정제하고, 이후에 음이온 교환 컬럼 capto Q으로 정제하여 요망되는 생성물, 항-HER2 GAb109를 수집하였다. 생성물을 트립신처리하고, 글리코펩티드, TKPREEQYNSTYR(SEQ ID NO:3) 및 EEQYNSTYR(SEQ ID NO:4)을 나노분무 LC/MS를 이용하여 분석하여 항-HER2 GAb109의 글리코실화 패턴을 확인하였다.
항- HER2 GAb110
수중 글리칸-110(GlcNAcMan3GlcNAc)(30 mg), 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리늄 클로라이드(DMC)(62.7 mg) 및 Et3N(89 ㎕)의 용액을 4℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0.05% 수성 Et3N에 의해 용리되는 Sephadex G-25 컬럼 상에서의 겔 여과 크로마토그래피로 처리하였다. 생성물(글리칸 옥사졸린-110)을 함유한 부분들을 합하고, 동결건조시켜 백색 분말을 수득하였다.
글리칸 옥사졸린-110를 50 mM 트리스 완충액(pH 7.8) 중 엔도글리코시다제 및 항-HER2 GAb201의 혼합물에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 단백질 A 친화력 컬럼으로 정제하고, 이후에 음이온 교환 컬럼 capto Q으로 정제하여 요망되는 생성물, 항-HER2 GAb110을 수집하였다. 생성물을 트립신처리하고, 글리코펩티드, TKPREEQYNSTYR(SEQ ID NO:3) 및 EEQYNSTYR(SEQ ID NO:4)을 나노분무 LC/MS를 이용하여 분석하여 항-HER2 GAb110의 글리코실화 패턴을 확인하였다.
항- HER2 GAb111
수중 글리칸-111(Man3GlcNAc)(30 mg), 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리늄 클로라이드(DMC)(62.7 mg) 및 Et3N(89 ㎕)의 용액을 4℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0.05% 수성 Et3N에 의해 용리되는 Sephadex G-25 컬럼 상에서의 겔 여과 크로마토그래피로 처리하였다. 생성물(글리칸 옥사졸린-111)을 함유한 부분들을 합하고, 동결건조시켜 백색 분말을 수득하였다.
글리칸 옥사졸린-111을 50 mM 트리스 완충액(pH 7.8) 중 엔도글리코시다제 및 항-HER2 GAb201의 혼합물에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 단백질 A 친화력 컬럼으로 정제하고, 이후에 음이온 교환 컬럼 capto Q으로 정제하여 요망되는 생성물, 항-HER2 GAb111을 수집하였다. 생성물을 트립신처리하고, 글리코펩티드, TKPREEQYNSTYR(SEQ ID NO:3) 및 EEQYNSTYR(SEQ ID NO:4)을 나노분무 LC/MS를 이용하여 분석하여 항-HER2 GAb111의 글리코실화 패턴을 확인하였다.
실시예 2 : 항- HER2 GAb의 특징분석
일반
글리코조작된 mAb의 MS 분광 분석. 글리코조작된 항체의 무손상 분자량을 BEH C4 컬럼(1.0 mm×150 mm,1.7 ㎛, Waters, Milford, MA)을 사용하여 ACQUITY UPLC(Waters, Milford, MA)가 장착된 LTQ Orbitrap XL ETD 질량 분광기(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) 상에서의 LC-ESI-MS에 의해 검색하였다. 간단하게, 사용되는 구배는 50 ㎕/분의 유량으로 3분에 1% 완충액 B에서 20분에 40% 완충액 B까지이며, 완충액 A는 H2O 중 0.1% 포름산이며, 완충액 B는 80% 아세토니트릴 중 0.1% 포름산이다. 전체 스캔 MS 조건: Iontrap으로 질량 범위 m/z 800-4000. 전기분무 전압은 4.0 kV에서 유지되며, 모세관 온도는 275℃으로 설정되었다.
트립신처리된 글리코펩티드의 분석을 위하여, 고해상도 및 고 질량 정확성 나노흐름 LC-MS/MS 실험을 나노전기분무 이온 소스(New Objective, Inc.), Agilent 1100 Series 바이너리 고성능 액체 크로마토그래피 펌프(Agilent Technologies, Palo Alto,CA)가 장착된 LTQFT Ultra(Linear quadrupole ion trap Fourier transform ion cyclotron resonance) 질량 분광기(Thermo Electron, san Jose, CA) 상에서 수행하였다.
MS에 의해 확인하였다(표 6, 항-HER2 GAb 101 및 104에 대해 도 3 및 도 4). N-글리칸 프로파일링을 트립신 소화에 의해 수행하였고, 분열된 글리코펩티드 TKPREEQYNSTYR을 기초로 하여 나노분무 LC/MS에 의해 분석하였다. 항-HER2 GAb 102, 104, 105, 106, 107, 108, 110 및 111을 동일한 방식으로 합성하였고, 본원에 기술된 바와 동일한 절차에 의해 분석하였다. 항-HER2 GAb 101,102, 104, 105, 106, 107, 108, 110 및 111에 대한 N-글리칸 프로파일링의 결과는 표 7에 나타내었다. 도 5 및 도 6은 항-HER2 GAb 101 및 104의 트립신 소화 후에 분열된 글리코펩티드 TKPREEQYNSTYR의 MS를 도시한 것이다.
표 6. ESI/MS 분석: 항-HER2 Gab의 무손상 분자량
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표 7. 항-HER2 GAb의 N-글리칸 프로파일링
표 7
Figure 112016127948226-pct00014
글리칸 옥사졸린-101을 50 mM 트리스 완충제(pH7.8) 중에서 EndoS 및 항-HER2 GAb201의 혼합물에 첨가하고, 실온 또는 30℃에서 0.5 내지 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응을 완료한 후에, 항-HER2 GAb101을 단백질 A 친화력 컬럼으로 정제하고, 추가 정제를 위해 음이온 교환 컬럼 capto Q에 로딩하였다. 정제된 항-HER2 GAb101을 SDS-PAGE에 의해 확인하였고, 항-HER2 GAb101의 IgG 분자의 분자량을 MS에 의해 확인하였다(표 6, 항-HER2 GAb 101 및 104에 대해 도 3 및 도 4). N-글리칸 프로파일링을 트립신 소화에 의해 수행하였고, 분열된 글리코펩티드 TKPREEQYNSTYR(SEQ ID NO: 3)을 기초로 하여 나노분무 LC/MS에 의해 분석하였다. 항-HER2 GAb 102, 104, 105, 106, 107, 108, 110 및 111을 동일한 방식으로 합성하였고, 본원에 기술된 바와 동일한 절차에 의해 분석하였다. 항-HER2 GAb 101,102, 104, 105, 106, 107, 108, 110 및 111에 대한 N-글리칸 프로파일링의 결과는 표 7에 나타내었다. 도 5 및 도 6은 항-HER2 GAb 101 및 104의 트립신 소화 후에 분열된 글리코펩티드 TKPREEQYNSTYR(SEQ ID NO: 3)의 MS를 도시한 것이다.
표 6. ESI/MS 분석: 항-HER2 Gab의 무손상 분자량
표 6
Figure 112016127948226-pct00015
표 7. 항-HER2 GAb의 N-글리칸 프로파일링
표 7
Figure 112016127948226-pct00016
실시예 3 : 항- Her2 GAb ELISA 결합 검정
일반
글리코조작된 헤르셉틴 항체의 SDS-PAGE 검색. 모든 SDS-PAGE 분석을 DTT 첨가와 함께 또는 이러한 첨가 없이 NuPAGE® Novex® 4 내지 12% Bis-Tris 겔(Invitrogen) 에테르로 수행하였다.
100 ㎕ 카보네이트 코팅 완충액(pH 10) 중 재조합 인간 HER2 단백질(Sino Biological Inc.로부터 구매함)(1 ㎍/mL)을 4℃에서 밤새 96웰 고-결합 플레이트 상에서 코팅하였다. PBST 중 2%의 소 혈청 혈청 알부민을 이후에 실온에서 1시간 동안 플레이트를 차단하기 위해 첨가하고, 후속하여, 항-HER2 GAb 101, 102, 104, 105, 106, 107, 108, 110 및 111의 순차 희석액을 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, HRP 콘쥬게이션된 항-인간 IgG를 반응 혼합물에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. OPD 기질의 분취액을 첨가하고, 450 nm에서의 흡광도를 기록하였다. 실험 전반에 걸쳐, 플레이트를 각 인큐베이션 단계 후에 PBS로 2회 세척하였다. ELISA 결합의 결과는 표 8에 나타내었다.
표 9는 항-HER2 GAb 및 트라스투즈맙의 ADCC 활성을 나열한다.
Figure 112016127948226-pct00017
실시예 5 : FcγRIIIA에 대한 항- HER2 GAb의 결합 친화력
일반
표면 플라스몬 공명( SPR ) 분석. 모든 SPR 실험을 진행 완충제(running buffer)로서 HBS-EP(10mM HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)를 사용하여 25℃에서 BIACORE T200로 수행하였다. 염소 항-인간 (Fab')2(Jackson Immuno Research Inc.)의 (Fab')2 단편을 사용하여 CM5 센서 칩의 기준 채널 및 활성 채널 둘 모두 상에서 고정시킨 후에 항체 샘플을 포집하였다. 글리코조작된 항체와 착물-타입 글리코실화된 FcγRIIIA(HEK293 세포로부터 발현됨) 간의 상호작용을 240초에 결합 후 420초의 해리 시간을 위해 30 ㎕/min에서 5개의 상이한 농도의 FcγRIIIA를 사용하여 단일 사이클 동력학 방법을 통해 기록하였다. 데이타를 백그라운드 차감을 위해 이중-참조로 처리하고, BiaEvaluation 소프트웨어(GE Healthcare)에서 1:1 Langmuir 결합 모델로 피팅하여 동력학/친화력 상수를 수득하였다.
FcγRIIIA를 HEK-293 세포주에 트랜스펙션시켜 재조합 단백질을 발현시켰다. 분비된 FcγRIIIA 재조합 단백질을 정제하고, 이후에, HBS-EP 완충제 중 일련의 농도(200 nM,100 nM, 50 nM, 25 nM, 및 12.5 nM)로 희석시켰다. 항-HER2 GAb101, GAb102, GAb103, GAb104, GAb105, GAb106, GAb107, GAb108, GAb109, GAb110 및 GAb111 각각을 HBS-EP 완충액 중에서 10 mg/ml까지 희석시키고, 이후에, 항-인간 Fab 도메인 항체가 사전-고정된 CM5 칩에 포집하였다. FcγRIIIA의 순차 적정(serial titration)를 주입하고, 30 ml/min의 유량으로 결합하였다. 단일 사이클 동력학 데이타를 Biacore T200 평가 소프트웨어를 이용하여 1:1 결합 모델로 피팅하여 평형 상수(Ka/Kd)를 측정하였다. 결과는 표 4에 나타내었다.
SEQUENCE LISTING <110> WONG, CHI-HUEY WU, CHUNG-YI <120> ANTI-HER2 GLYCOANTIBODIES AND USES THEREOF <130> G2112-01001 <140> 14/723,181 <141> 2015-05-27 <150> 62/110,338 <151> 2015-01-30 <150> 62/020,199 <151> 2014-07-02 <150> 62/003,104 <151> 2014-05-27 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 1 5 <210> 5 <211> 414 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Gln Gln Lys Tyr Gln Pro Thr Glu Ala Asn Leu Lys Ala Arg Ser Glu 1 5 10 15 Phe Gln Asp Asn Lys Phe Gly Ile Phe Leu His Trp Gly Leu Tyr Ala 20 25 30 Met Leu Ala Thr Gly Glu Trp Thr Met Thr Asn Asn Asn Leu Asn Tyr 35 40 45 Lys Glu Tyr Ala Lys Leu Ala Gly Gly Phe Tyr Pro Ser Lys Phe Asp 50 55 60 Ala Asp Lys Trp Val Ala Ala Ile Lys Ala Ser Gly Ala Lys Tyr Ile 65 70 75 80 Cys Phe Thr Thr Arg His His Glu Gly Phe Ser Met Phe Asp Thr Lys 85 90 95 Tyr Ser Asp Tyr Asn Ile Val Lys Ala Thr Pro Phe Lys Arg Asp Val 100 105 110 Val Lys Glu Leu Ala Asp Ala Cys Ala Lys His Gly Ile Lys Leu His 115 120 125 Phe Tyr Tyr Ser His Ile Asp Trp Tyr Arg Glu Asp Ala Pro Gln Gly 130 135 140 Arg Thr Gly Arg Arg Thr Gly Arg Pro Asn Pro Lys Gly Asp Trp Lys 145 150 155 160 Ser Tyr Tyr Gln Phe Met Asn Asn Gln Leu Thr Glu Leu Leu Thr Asn 165 170 175 Tyr Gly Pro Ile Gly Ala Ile Trp Phe Asp Gly Trp Trp Asp Gln Asp 180 185 190 Ile Asn Pro Asp Phe Asp Trp Glu Leu Pro Glu Gln Tyr Ala Leu Ile 195 200 205 His Arg Leu Gln Pro Ala Cys Leu Val Gly Asn Asn His His Gln Thr 210 215 220 Pro Phe Ala Gly Glu Asp Ile Gln Ile Phe Glu Arg Asp Leu Pro Gly 225 230 235 240 Glu Asn Thr Ala Gly Leu Ser Gly Gln Ser Val Ser His Leu Pro Leu 245 250 255 Glu Thr Cys Glu Thr Met Asn Gly Met Trp Gly Tyr Lys Ile Thr Asp 260 265 270 Gln Asn Tyr Lys Ser Thr Lys Thr Leu Ile His Tyr Leu Val Lys Ala 275 280 285 Ala Gly Lys Asp Ala Asn Leu Leu Met Asn Ile Gly Pro Gln Pro Asp 290 295 300 Gly Glu Leu Pro Glu Val Ala Val Gln Arg Leu Lys Glu Val Gly Glu 305 310 315 320 Trp Met Ser Lys Tyr Gly Glu Thr Ile Tyr Gly Thr Arg Gly Gly Leu 325 330 335 Val Ala Pro His Asp Trp Gly Val Thr Thr Gln Lys Gly Asn Lys Leu 340 345 350 Tyr Val His Ile Leu Asn Leu Gln Asp Lys Ala Leu Phe Leu Pro Ile 355 360 365 Val Asp Lys Lys Val Lys Lys Ala Val Val Phe Ala Asp Lys Thr Pro 370 375 380 Val Arg Phe Thr Lys Asn Lys Glu Gly Ile Val Leu Glu Leu Ala Lys 385 390 395 400 Val Pro Thr Asp Val Asp Tyr Val Val Glu Leu Thr Ile Asp 405 410 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 6 His His His His His His 1 5

Claims (29)

  1. 각 항-HER2 IgG 분자의 Fc 영역 상에 동일한 N-글리칸(N-glycan)을 갖는 항-HER2 IgG 분자의 동종 집단(homogeneous population)을 포함하는 항-HER2 글리코항체(glycoantibody) 또는 항원 결합 단편(antigen binding fragment)의 조성물로서,
    N-글리칸에 코어 푸코오스(fucose)가 존재하지 않고,
    N-글리칸이 Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2의 서열을 가지며,
    항-HER2 IgG 분자가 SEQ ID NO: 1로 기술된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 2로 기술된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고;
    항-HER2 글리코항체 또는 항원 결합 단편이 글리코조작되지 않은 상응하는 항체와 비교하여 증가된 항체-의존 세포-매개된 세포독성(ADCC) 활성을 갖는 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 항-HER2 IgG 분자가 트라스투즈맙(Trastuzumab)(헤르셉틴(Herceptin))의 경쇄 서열 및 중쇄 서열을 포함하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 항-HER2 글리코항체가 트라스투즈맙에 비해 향상된 ADCC를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 항-HER2 글리코항체가 트라스투즈맙에 비해 FcγRIIIA에 대한 향상된 결합을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, N-글리칸이 Fc 영역의 Asn-297에 부착된 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, N-글리칸이 두 개의 α2-6 말단 시알산을 포함하는 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항, 제3항 내지 제6항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 항-HER2 글리코항체 또는 항원 결합 단편의 조성물, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 HER2-발현 종양을 치료하기 위한 약제학적 제형(pharmaceutical formulation).
  13. 삭제
  14. 제12항에 있어서, 종양이 HER2-과발현 종양(HER2-overexpressing tumor)인 약제학적 제형.
  15. 제14항에 있어서, 상기 HER2-과발현 종양이 유방암인 약제학적 제형.
  16. 제12항에 있어서, 약제학적 제형이 항-HER2 치료제를 추가로 포함하는 약제학적 제형.
  17. 제16항에 있어서, 항-HER2 치료제가 라파티닙(Lapatinib), 트라스투즈맙 또는 페르투주맙(Pertuzumab)인 약제학적 제형.
  18. 제12항에 있어서, 약제학적 제형이 동시-투여(co-administration)로서 또는 공동-제형(co-formulation)으로서 환자에게 투여되는 제2 치료제를 추가로 포함하는 약제학적 제형.
  19. 제1항의 항-HER2 글리코항체를 제조하는 방법으로서,
    (a) 항-HER2 모노클로날 항체를 α-푸코시다제(α-fucosidase) 및 적어도 하나의 엔도글리코시다제(endoglycosidase)와 접촉시켜 단일 N-아세틸글루코사민을 갖는 탈푸코실화된 항체(GlcNAc)를 수득하고,
    (b) 탄수화물 모이어티(carbohydrate moiety)를 적합한 조건 하에서 GlcNAc에 첨가하는 것을 포함하고,
    탄수화물 모이어티가 Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 항-HER2 모노클로날 항체가 트라스투즈맙인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 항-HER2 글리코항체가 시험관 내에서 형성되는 방법.
  22. 제19항에 있어서, 항-HER2 글리코항체가 세포 배양(cell culturing)에 의해 수득된 항체로부터 효소적으로 조작되는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 방법이 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary; CHO) 세포주의 유가 배양(fed batch culturing)을 포함하는 방법.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 제19항에 있어서, 단계 (b)에서의 첨가가 트랜스글리코실라아제(transglycosylase)에 의해 수행되는 방법.
  27. 제19항에 있어서, 엔도글리코시다제가 EndoS, EndoS2, EndoH, EndoA, EndoM, EndoF, EndoF2, EndoF3인 방법.
  28. 제19항에 있어서, α-푸코시다제가 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 일치한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 방법.
  29. 제19항에 있어서, α-푸코시다제가 재조합 박테로이데스(Bacteroides) α-푸코시다제인 방법.
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