KR20220024637A - 정의된 조직의 다수 발현 카세트들의 표적화 통합에 의한 3가 항체 발현 세포의 생성 방법 - Google Patents
정의된 조직의 다수 발현 카세트들의 표적화 통합에 의한 3가 항체 발현 세포의 생성 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 3가 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 단계, 및 이러한 세포 또는 배양 배지로부터 3가 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 3가 항체의 생산 방법을 기재하며, 이때 3가 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 포유동물 세포 게놈에 안정적으로 통합되고, 5'-에서 3'-방향으로 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트, 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트, 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트, 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트를 포함하며, 이때 제1 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 제1 경쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 제2 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 제1 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 중쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고, 및 제2 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고, 이때 제1 중쇄 가변 도메인과 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고 제2 중쇄 가변 도메인과 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
Description
본 발명은 세포주 생성 및 폴리펩티드 생산 분야에 관한 것이다. 보다 정확하게는, 이중 재조합효소 매개 카세트 교환 반응에 의해 수득된 재조합 포유동물 세포가 본원에 기재되며, 이는 특정 발현 카세트 서열을 포유동물 세포의 게놈 내로 통합시킨다. 상기 세포는 3가 다중특이성 항체의 생산 방법에 사용될 수 있다.
발명의 배경
분비 및 글리코실화된 폴리펩티드, 예를 들어, 항체는 일반적으로 진핵 세포에서 안정하거나 일시적인 발현으로서 재조합 발현에 의해 생산된다.
관심 외인성 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포를 생성하기 위한 하나의 전략은 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 무작위 통합에 이어 선택 및 단리 단계를 포함한다. 그러나 이 방법에는 몇 가지 단점이 있다. 첫째, 뉴클레오티드 서열 그 자체의 세포의 게놈으로의 기능적 통합은 드문 사건일 뿐만 아니라, 뉴클레오티드 서열이 통합되는 위치에 대한 무작위성을 감안할 때, 이러한 드문 사건들은 다양한 유전자 발현 및 세포 성장 표현형을 초래한다. “위치 효과 변이”로 알려진 이러한 변이는 적어도 부분적으로 진핵 세포 게놈에 존재하는 복잡한 유전자 조절 네트워크와 통합 및 유전자 발현을 위한 특정 게놈 유전자좌의 접근성에서 비롯된다. 둘째, 무작위 통합 전략은 일반적으로 이러한 세포들의 게놈에 통합된 뉴클레오티드 서열 사본의 수를 제어하지 않는다. 실제로 유전자 증폭 방법은 종종 높은 생산성의 세포를 얻기 위해 사용된다. 그러나 이러한 유전자 증폭은 또한 예를 들어, 불안정한 세포 성장 및/또는 생성물 발현을 가지는 것과 같은 원치 않는 세포 표현형을 유발할 수 있다. 셋째, 무작위 통합 과정에 내재된 통합 유전자좌 이종성으로 인해, 형질 감염 후 수천 개의 세포들을 스크리닝하여, 관심 폴리펩티드의 바람직한 발현 수준을 나타내는 재조합 세포들을 단리하는 것은 시간 및 노동 집약적이다. 이러한 세포들을 단리한 후에도 관심 폴리펩티드의 안정적인 발현이 보장되는 것은 아니며 안정적인 상업적 생산 세포를 얻기 위해 추가 스크리닝이 필요할 수 있다. 넷째, 무작위 통합에 의해 수득된 세포들로부터 생성된 폴리펩티드는 높은 수준의 서열 변이를 나타내는데, 이는 부분적으로 높은 발현 수준의 폴리펩티드를 선별하는데 사용되는 선별제의 돌연변이 유발성 때문일 수 있다. 마지막으로, 생산될 폴리펩티드의 복잡성이 높을수록, 즉 세포 내부에서 관심 폴리펩티드를 형성하는 데 필요한 상이한 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 사슬의 수가 많을수록, 서로 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 사슬의 발현 비율을 제어하는 것이 더 중요해진다. 발현 비율의 제어는 관심 폴리펩티드를 높은 발현 수율로 효율적인 발현, 정확한 조립 및 성공적인 분비를 가능하게 하는 데 필요하다.
재조합효소 매개 카세트 교환 (RMCE)에 의한 표적된 통합은 외래 DNA를 진핵 숙주 게놈의 예정된 부위로 특이적이고 효율적으로 지정하는 방법이다 (Turan 등, J. Mol. Biol. 407 (2011) 193-221).
WO 2006/007850은 항-레서스 D 재조합 다클론 항체 및 개별 숙주 세포의 게놈으로의 부위-특이적 통합을 사용하는 제조 방법을 개시하고 있다.
Crawford, Y. 외(Biotechnol. Prog. 29 (2013) 1307-1315)는 결합된 phiC31 인테그라제 및 CRE-Lox 기술을 사용하는 제한된 게놈 스크리닝에서 표적 세포주 개발을 위하여 신뢰성 있게 숙주를 빠르게 식별하는 것을 개시했다.
WO 2013/006142는 그 게놈 내에 안정하게 통합된 유전적으로 변형된 진핵 세포의 거의 균질한 모집단을 개시하는데, 공여자 카세트는 표적화 핵산 부위 및 선별가능한 마커 단백질-코딩 서열을 포함하는 단리된 핵산 단편에 작동가능하게 연결된 강한 폴리아데닐화 부위를 포함하며, 상기 단리된 핵산 단편에는 제1 재조합 부위 및 제2 비-동일 재조합 부위가 연접(flank)된다.
WO 2018/162517은 i) 발현 카세트 서열 및 ii) 상이한 발현 벡터 사이의 발현 카세트의 분포에 따라 발현 수율 및 생성물 품질의 높은 변동이 관찰되었음을 개시하였다.
Tadauchi, T., 등의 문헌은 항체를 발현하기 어렵게 만드는 요인을 체계적으로 조사하기 위해 조절된 표적화 통합 세포주 개발 접근법을 활용하는 것을 개시한다 (Biotechnol. Prog. 35 (2019) No. 2, 1-11).
WO 2016/079076은 FolR1 및 CD3에 대한 T-세포 활성화 이중특이성 항원 결합 분자를 개시한다. 실시예 29에서 일시적 형질감염을 사용하는 이중특이성 FolR1/CD3-카파-람다 항체의 생성이 기술되고 3개의 발현 벡터의 플라스미드 비는 1:1:1이었다. 실시예 36에서 HEK293-EBNA 세포를 1:2:1:1 비율(“벡터 중쇄 Fc(홀)”: “벡터 경쇄” : “벡터 경쇄 CrossFab” : “벡터 중쇄 Fc(놉)-FabCrossFab”)의 상응하는 발현 벡터를 사용하여 공동-형질감염하는 것에 의한 DP47 GS TCB의 제조를 기재한다. 유사한 내용이 WO 2017/055389 및 WO 2016/020309에 제공되어 있다.
WO 2014/033074는 혈액 뇌 장벽 셔틀을 개시하고 있다. 실시예 2는 형질감염 시 등몰 플라스미드 비의3개 발현 플라스미드를 사용하는 3가 MAb31-scFab(8D3)의 일시적 생산을 개시하고 있다.
WO 2017/184831은 진핵 세포에서 재조합 단백질의 부위-특이적 통합 및 발현, 특히 발현-증진 유전자좌를 사용함으로써 진핵 세포, 특히 차이니즈 햄스터 (크리세툴루스 그리세우스, Cricetulus griseus) 세포주에서 이중특이성 항체를 포함하는 항체의 발현을 개선하는 방법을 개시한다. 이 문서의 데이터는 익명으로 제공되므로 실제로 수행된 작업에 대한 결론을 내릴 수 없다.
Rajendra, Y., 등의 문헌은 단일 쿼드 벡터가 안정적인 CHO 세포주의 생성을 위한 간단하지만 효과적인 대안적 접근법이며 임상 이종 mAb 치료제를 위한 세포주 생성을 가속화할 수 있음을 개시하고 있다 (Biotechnol. Prog. 33 (2017) 469-477).
발명의 요약
본원에는 3가 항체, 특히 이중특이성 3가 항체, 예를 들어, T-세포 이중특이성 항체 (TCB)를 발현하는 재조합 포유동물 세포가 보고되어 있다. 3가 항체는 상기 포유동물 세포에 의해 자연적으로 발현되지 않는 이종다량체 폴리펩티드이다. 보다 구체적으로, 3가 항체는 다음과 같은 4개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 사슬들로 구성된 이종다량체성 단백질이다: 전장 경쇄인 하나의 경쇄; 도메인 교환된 경쇄인 추가 경쇄; 전장 중쇄인 하나의 중쇄; 및 또 다른 도메인 교환된 중쇄 또는 경쇄 Fab 단편을 포함하는 연장된 중쇄인 추가 중쇄. 3가 항체의 발현을 구현하기 위해, 특이적이고 정의된 서열 내 다수의 상이한 발현 카세트를 포함하는 재조합 핵산이 포유동물 세포의 게놈 내로 통합되었다.
특히, 본 발명에 따른 방법은 T-세포 이중특이성 항체 (TCB)의 생성에 사용될 수 있다. 이들은 예를 들어, WO 2013/026831에 설명된 형태를 가질 수 있다. 이들 분자는 T-세포 상의 CD3 (제1 특이성) 및 표적 (예: 종양) 세포 상의 항원 (제2 특이성)에 동시에 결합하여 표적 세포의 사멸을 유도할 수 있다.
본원에는 3가 항체, 특히 3가 이중특이성 항체, 더욱 특히 TCB를 발현하는 재조합 포유동물 세포를 생성하는 방법 및 상기 재조합 포유동물 세포를 사용하여 3가 항체, 특히 3가 이중특이성 항체, 더욱 특히 TCB를 생성하는 방법도 보고되어 있다.
한 바람직한 구체예에서 3가 이중특이성 항체는 다음을 포함하고:
a)
각각 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 Fab 단편,
b)
CH1 및 CL 도메인이 서로 교환된 제2 항원에 특이적으로 결합하는 하나의 도메인 교환된 Fab 단편,
c) 제1 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 및 제2 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 하나의 Fc-영역,
이때 제1 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단은 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드들 중 하나의 N-말단에 연결되고 도메인 교환된 Fab 단편의 CL-도메인의 C-말단은 다른 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 N-말단에 연결되고, 및
이때 제2 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단은 제1 Fab 단편의 VH 도메인의 N-말단에 또는 도메인 교환된 Fab 단편의 VH 도메인의 N-말단에 연결되고, 및
이때 제1 항원 또는 제2 항원은 인간 CD3이다.
한 바람직한 구체예에서 3가 이중특이성 항체는 다음을 포함하고:
a)
각각 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 Fab 단편,
b)
VH 및 VL 도메인이 서로 교환된 제2 항원에 특이적으로 결합하는 하나의 도메인 교환된 Fab 단편,
c) 제1 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 및 제2 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 하나의 Fc-영역,
이때 제1 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단은 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드들 중 하나의 N-말단에 연결되고 도메인 교환된 Fab 단편의 CH1-도메인의 C-말단은 다른 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 N-말단에 연결되고, 및
이때 제2 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단은 제1 Fab 단편의 VH 도메인의 N-말단에 또는 도메인 교환된 Fab 단편의 VL 도메인의 N-말단에 연결되고, 및
이때 제1 항원 또는 제2 항원은 인간 CD3이다.
한 바람직한 구체예에서 3가 이중특이성 항체의 제1 경쇄 및 제2 경쇄 어떤 것도 공통 경쇄 또는 범용 경쇄가 아니다.
본 발명은 포유동물 세포의 게놈에 통합됨으로써, 이종다량체 3가 항체, 즉 발현 카세트 조직의 발현에 필요한 상이한 발현 카세트의 서열이 3가 항체 (예를 들어, TCB)의 발현 수율에 영향을 미친다는 발견 내용에, 적어도 부분적으로, 기초한다.
본 발명은 적어도 부분적으로, 특이적 발현 카세트 조직을 갖는 이종다량체, 3가 이중특이성 항체 (예를 들어, TCB)를 인코딩하는 핵산을 포유동물 세포의 게놈에 통합함으로써 3가 이중특이성 항체 (예를 들어, TCB)가 효율적으로 재조합 발현 및 생성될 수 있다는 발견에 기초한다.
정의된 발현 카세트 서열은 이중 재조합효소 매개 카세트 교환 반응에 의해 포유동물 세포의 게놈으로 유리하게 통합될 수 있음이 밝혀졌다.
본 발명에 따른 한 양상은 3가 항체 (예를 들어, TCB)를 생성하기 위한 방법으로서 다음 단계들을 포함하고:
a)
선택적으로 3가 항체 (예를 들어, TCB)의 발현에 적합한 조건하에서 3가 항체 (예를 들어, TCB)를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 단계, 및
b)
세포 또는 배양 배지로부터 3가 항체 (예를 들어, TCB)를 회수하는 단계,
이때 3가 항체 (예를 들어, TCB)를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 포유동물 세포의 게놈에 안정적으로 통합되고 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함한다:
1)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 선택적으로 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는
2)
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
이때 제1 내지 제3 발현 카세트는 단방향으로 배열되고, 제4 내지 제6 발현 카세트는 단방향으로 그리고 제1 내지 제3 발현 카세트와 반대 방향으로 배열되고;
또는
3)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트.
한 바람직한 구체예에서 제1 중쇄는 CH3 도메인에 돌연변이 T366W (Kabat에 따른 넘버링)를 포함하고 제2 중쇄는 CH3 도메인에 돌연변이 T366S, L368A, 및 Y407V (Kabat에 따른 넘버링)를 포함하고, 또는 그 역이다. 한 구체예에서 중쇄 중 하나는 돌연변이 S354C를 추가로 포함하고 각각의 다른 중쇄는 돌연변이 Y349C (Kabat에 따른 넘버링)를 포함한다. 한 구체예에서 제1 중쇄는 또 다른 도메인 교환된 Fab 단편을 포함하는 연장된 중쇄이다. 한 구체예에서 제1 경쇄는 도메인 교환된 경쇄이다.
한 구체예에서 데옥시리보핵산은 제2 중쇄를 인코딩하는 제1 및 제2 발현 카세트 사이에 추가 발현 카세트를 포함한다.
한 구체예에서
- 제1 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 제1 경쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제2 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제1 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 중쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고, 및
- 제2 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고,
이때 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고 제2 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
한 구체예에서
- 제1 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 제2 중쇄 가변 도메인, CL 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제2 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제1 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 경쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고, 및
- 제2 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고,
이때 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고 제2 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
한 구체예에서, 데옥시리보핵산 사본이 단일 부위 또는 유전자좌에서 포유동물 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된다.
본 발명의 한 양상은 3가 항체(예를 들어, TCB)를 인코딩하는 데옥시리보핵산으로서 5'-에서 3'-방향으로 다음을 포함한다:
1)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 선택적으로 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는
2)
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
이때 제1 내지 제3 발현 카세트는 단방향으로 배열되고, 제4 내지 제6 발현 카세트는 단방향으로 그리고 제1 내지 제3 발현 카세트와 반대 방향으로 배열되고;
또는
3)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트.
한 바람직한 구체예에서 제1 중쇄는 CH3 도메인에 돌연변이 T366W (Kabat에 따른 넘버링)를 포함하고 제2 중쇄는 CH3 도메인에 돌연변이 T366S, L368A, 및 Y407V (Kabat에 따른 넘버링)를 포함하고, 또는 그 역이다. 한 구체예에서 중쇄 중 하나는 돌연변이 S354C를 추가로 포함하고 각각의 다른 중쇄는 돌연변이 Y349C (Kabat에 따른 넘버링)를 포함한다. 한 구체예에서 제1 중쇄는 또 다른 도메인 교환된 Fab 단편을 포함하는 연장된 중쇄이다. 한 구체예에서 제1 경쇄는 도메인 교환된 경쇄이다.
한 구체예에서 데옥시리보핵산은 제2 중쇄를 인코딩하는 제1 및 제2 발현 카세트 사이에 추가 발현 카세트를 포함한다.
한 구체예에서
- 제1 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 제1 경쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제2 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제1 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 중쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고, 및
- 제2 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고,
이때 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고 제2 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
한 구체예에서
- 제1 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 제2 중쇄 가변 도메인, CL 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제2 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제1 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 경쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고, 및
- 제2 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고,
이때 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고 제2 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
본 발명의 한 양상은 포유동물 세포에서 3가 항체 (예를 들어, TCB)의 발현을 위한, 데옥시리보핵산의 용도로서 5'-에서 3'-방향으로 다음을 포함한다:
1)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 선택적으로 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는
2)
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
이때 제1 내지 제3 발현 카세트는 단방향으로 배열되고, 제4 내지 제6 발현 카세트는 단방향으로 그리고 제1 내지 제3 발현 카세트와 반대 방향으로 배열되고;
또는
3)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트.
한 바람직한 구체예에서 제1 중쇄는 CH3 도메인에 돌연변이 T366W (Kabat에 따른 넘버링)를 포함하고 제2 중쇄는 CH3 도메인에 돌연변이 T366S, L368A, 및 Y407V (Kabat에 따른 넘버링)를 포함하고, 또는 그 역이다. 한 구체예에서 중쇄 중 하나는 돌연변이 S354C를 추가로 포함하고 각각의 다른 중쇄는 돌연변이 Y349C (Kabat에 따른 넘버링)를 포함한다. 한 구체예에서 제1 중쇄는 또 다른 도메인 교환된 Fab 단편을 포함하는 연장된 중쇄이다. 한 구체예에서 제1 경쇄는 도메인 교환된 경쇄이다.
한 구체예에서 데옥시리보핵산은 제2 중쇄를 인코딩하는 제1 및 제2 발현 카세트 사이에 추가 발현 카세트를 포함한다.
한 구체예에서
- 제1 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 제1 경쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제2 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제1 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 중쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고, 및
- 제2 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고,
이때 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고 제2 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
한 구체예에서
- 제1 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 제2 중쇄 가변 도메인, CL 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제2 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제1 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 경쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고, 및
- 제2 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고,
이때 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고 제2 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
용도의 한 구체예에서 데옥시리보핵산은 포유동물 세포의 게놈 내로 통합된다.
용도의 한 구체예에서, 데옥시리보핵산 사본이 단일 부위 또는 유전자좌에서 포유동물 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된다.
본 발명의 한 양상은 세포의 게놈에 통합된 3가 항체 (예: TCB)를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하는 재조합 포유동물 세포이며,
이때 3가 항체 (예를 들어, TCB)를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함한다:
1)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 선택적으로, 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는
2)
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
이때 제1 내지 제3 발현 카세트는 단방향으로 배열되고, 제4 내지 제6 발현 카세트는 단방향으로 그리고 제1 내지 제3 발현 카세트와 반대 방향으로 배열되고;
또는
3)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트.
한 바람직한 구체예에서 제1 중쇄는 CH3 도메인에 돌연변이 T366W (Kabat에 따른 넘버링)를 포함하고 제2 중쇄는 CH3 도메인에 돌연변이 T366S, L368A, 및 Y407V (Kabat에 따른 넘버링)를 포함하고, 또는 그 역이다. 한 구체예에서 중쇄 중 하나는 돌연변이 S354C를 추가로 포함하고 각각의 다른 중쇄는 돌연변이 Y349C (Kabat에 따른 넘버링)를 포함한다. 한 구체예에서 제1 중쇄는 또 다른 도메인 교환된 Fab 단편을 포함하는 연장된 중쇄이다. 한 구체예에서 제1 경쇄는 도메인 교환된 경쇄이다.
한 구체예에서 데옥시리보핵산은 제2 중쇄를 인코딩하는 제1 및 제2 발현 카세트 사이에 추가 발현 카세트를 포함한다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서
- 제1 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 제1 경쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제2 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제1 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 중쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고, 및
- 제2 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고,
이때 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고 제2 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서
- 제1 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 제2 중쇄 가변 도메인, CL 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제2 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제1 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 경쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고, 및
- 제2 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고,
이때 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고 제2 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
한 구체예에서, 데옥시리보핵산 사본이 단일 부위 또는 유전자좌에서 포유동물 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 3가 항체 (예를 들어, TCB)를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 다음을 추가로 포함하고:
- 제1 (가장 5'쪽)의 발현 카세트에 대해 5'에 위치하는 제1 재조합 인식 서열,
- 제6 (가장 3'쪽) 발현 카세트에 대해 3'에 위치하는 제2 재조합 인식 서열,
- 다음에 위치하는 제3 재조합 인식 서열:
- 제1 및 제2 재조합 인식 서열 사이, 및
- 2개의 발현 카세트들 사이,
그리고
이때, 모든 재조합 인식 서열은 상이하다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 제3 재조합 인식 서열은 제3 및 제4 발현 카세트 사이에 위치한다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 3가 항체 (예를 들어, TCB)를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 선별 마커를 인코딩하는 추가 발현 카세트를 포함하고, 이러한 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트는 제3 재조합 인식 서열에 대해 일부분 5' 및 일부분 3'에 위치하며, 상기 발현 카세트의 5'-위치 부분은 프로모터 및 개시 코돈을 포함하고 상기 발현 카세트의 3'-위치 부분은 폴리A 신호 및 개시 코돈이 없는 코딩 서열을 포함하며, 이때 개시 코돈은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 한 양상은 3개의 상이한 재조합 인식 서열 및 6개의 발현 카세트를 차례로 포함하는 2개의 데옥시리보핵산을 포함하는 조성물로서, 이때
- 제1 데옥시리보핵산은 5'-에서 3'-방향으로 다음을 포함하고:
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
그리고
- 제2 데옥시리보핵산은 5'-에서 3'-방향으로 다음을 포함한다:
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열.
한 바람직한 구체예에서 제1 중쇄는 CH3 도메인에 돌연변이 T366W (Kabat에 따른 넘버링)를 포함하고 제2 중쇄는 CH3 도메인에 돌연변이 T366S, L368A, 및 Y407V (Kabat에 따른 넘버링)를 포함하고, 또는 그 역이다. 한 구체예에서 중쇄 중 하나는 돌연변이 S354C를 추가로 포함하고 각각의 다른 중쇄는 돌연변이 Y349C (Kabat에 따른 넘버링)를 포함한다. 한 구체예에서 제1 중쇄는 또 다른 도메인 교환된 Fab 단편을 포함하는 연장된 중쇄이다. 한 구체예에서 제1 경쇄는 도메인 교환된 경쇄이다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서
- 제1 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 제1 경쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제2 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제1 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 중쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고, 및
- 제2 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고,
이때 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고 제2 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서
- 제1 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 제2 중쇄 가변 도메인, CL 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제2 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제1 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 경쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고, 및
- 제2 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고,
이때 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고 제2 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 3가 항체 (예를 들어, TCB)를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 선별 마커를 인코딩하는 추가 발현 카세트를 추가로 포함한다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트는 제3 재조합 인식 서열에 대해 다음에 위치한다:
i) 5', 또는
ii) 3', 또는
iii) 일부분 5' 및 일부분 3'.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트는 제3 재조합 인식 서열에 대해 일부분 5' 및 일부분 3'에 위치하며, 상기 발현 카세트의 5'-위치 부분은 프로모터 및 개시-코돈을 포함하고 상기 발현 카세트의 3'-위치 부분은 폴리A 신호 및 개시 코돈이 없는 코딩 서열을 포함한다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 5'-위치 부분은 개시 코돈에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고, 이에 의해 프로모터 서열은 상류에서 제3 발현 카세트에 연접되고 (즉, 제3 발현 카세트에 대해 하류에 위치) 개시 코돈은 하류에서 제4 재조합 인식 서열에 연접되고 (즉, 제4 재조합 인식 서열의 상류에 위치); 그리고 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 3'-위치 부분은 개시 코돈이 없는 선별 마커를 인코딩하는 핵산을 포함하며 상류에서 제3 재조합 인식 서열에 연접되고 하류에서 제5 발현 카세트에 연접된다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 개시 코돈은 전사 개시 코돈이다. 한 구체예에서 개시 코돈은 ATG이다.
본 발명의 한 양상은 세포의 게놈에 통합된 3가 항체 (예: TCB)를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하는 재조합 포유동물 세포이며,
이때 3가 항체 (예를 들어, TCB)를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 다음 구성요소들을 포함하고:
제1, 제2 및 제3 재조합 인식 서열,
제1 및 제2 선별 마커, 및
제1 내지 제6 발현 카세트,
이때 상기 구성요소들의 서열들은 5'- 에서 3'- 방향으로
RRS1-제1 EC-제2 EC-제3 EC-RRS3-SM1-제4 EC-제5 EC-제6 EC-RRS2
이고 이때
RRS = 재조합 인식 서열
EC = 발현 카세트,
SM = 선별 마커이다.
본 발명의 한 양상은 3가 항체 (예를 들어, TCB)를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하고 3가 항체 (예를 들어, TCB)를 분비하는 재조합 포유동물 세포를 생산하는, 다음 단계들을 포함하는 방법이며:
a) 포유동물 세포의 게놈 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 세포를 제공하는 단계, 이때 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 제1 선별 마커에 연접하는 제1 및 제2 재조합 인식 서열, 및 제1 및 제2 재조합 인식 서열 사이에 위치한 제3 재조합 인식 서열을 포함하고, 모든 재조합 인식 서열은 상이하며;
b) a)에서 제공된 세포에 3개의 상이한 재조합 인식 서열 및 6개의 발현 카세트를 포함하는 2개의 데옥시리보핵산 조성물을 도입하는 단계, 이때
제1 데옥시리보핵산은 5'-에서 3'-방향으로 다음을 포함하고:
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 하나의 제2 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 5'-말단 부분, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
그리고
제2 데옥시리보핵산은 5'-에서 3'-방향으로 다음을 포함하고:
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 하나의 제2 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 3'-말단 부분,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
이때 제1 및 제2 데옥시리보핵산의 제1 내지 제3 재조합 인식 서열은 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상의 제1 내지 제3 재조합 인식 서열과 일치하고,
이때 하나의 제2 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 5'-말단 부분 및 3'-말단 부분은 함께 하나의 제2 선별 마커의 기능적 발현 카세트를 형성하고;
c) i) b)의 제1 및 제2 데옥시리보핵산과 동시에; 또는
ii) 이후 순차적으로
하나 이상의 재조합효소를 도입하는 단계,
이때 하나 이상의 재조합효소는 제1 및 제2 데옥시리보핵산의 재조합 인식 서열을 인식하고; (그리고 선택적으로 하나 이상의 재조합효소는 2개의 재조합효소 매개 카세트 교환을 수행하고;)
그리고
d)
제2 선별 마커를 발현하고 3가 항체 (예를 들어, TCB)를 분비하는 세포를 선택하는 단계,
이로써, 3가 항체 (예를 들어, TCB)를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하고 3가 항체 (예를 들어, TCB)를 분비하는 재조합 포유동물 세포를 생산한다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 바람직한 구체예에서 제1 중쇄는 CH3 도메인에 돌연변이 T366W (Kabat에 따른 넘버링)를 포함하고 제2 중쇄는 CH3 도메인에 돌연변이 T366S, L368A, 및 Y407V (Kabat에 따른 넘버링)를 포함하고, 또는 그 역이다. 한 구체예에서 중쇄 중 하나는 돌연변이 S354C를 추가로 포함하고 각각의 다른 중쇄는 돌연변이 Y349C (Kabat에 따른 넘버링)를 포함한다. 한 구체예에서 제1 중쇄는 또 다른 도메인 교환된 Fab 단편을 포함하는 연장된 중쇄이다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 제1 경쇄는 도메인 교환된 경쇄이다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서
- 제1 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 제1 경쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제2 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제1 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 중쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고, 및
- 제2 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고,
이때 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고 제2 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서
- 제1 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 제2 중쇄 가변 도메인, CL 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제2 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제1 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 경쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고, 및
- 제2 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고,
이때 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고 제2 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 하나의 제2 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트는 제3 재조합 인식 서열에 대해 일부분 5' 및 일부분 3'에 위치하며, 상기 발현 카세트의 5'-위치 부분은 프로모터 및 개시-코돈을 포함하고 상기 발현 카세트의 3'-위치 부분은 폴리A 신호 및 개시 코돈이 없는 하나의 제2 선별 마커의 코딩 서열을 포함한다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 하나의 제2 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 5'-말단 부분은 개시 코돈에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고, 이에 의해 프로모터 서열은 상류에서 발현 카세트에 연접되고 (즉, 발현 카세트에 대해 하류에 위치) 개시 코돈은 하류에서 제3 재조합 인식 서열에 연접되고 (즉, 제3 재조합 인식 서열의 상류에 위치); 그리고 하나의 제2 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 3'-위치 부분은 개시 코돈이 없는 하나의 제2 선별 마커의 코딩 서열을 포함하며 상류에서 제3 재조합 인식 서열에 연접되고 하류에서 발현 카세트에 연접된다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 개시 코돈은 번역 개시 코돈이다. 한 구체예에서 개시 코돈은 ATG이다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 제1 데옥시리보핵산은 제1 벡터에 통합되고 제2 데옥시리보핵산은 제2 벡터에 통합된다.
모든 전술한 양상 및 구체예들 중 한 구체예에서, 발현 카세트 각각은 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하고, 선택적으로 종결인자 서열이 후속된다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서
i) 제1 발현 카세트는 5'- 에서 3'- 방향으로 프로모터, 제1 중쇄를 인코딩하는 핵산, 및 폴리아데닐화 신호 서열 및 선택적으로 종결인자 서열을 포함하고,
ii) 제 2 발현 카세트는 5'- 에서 3'- 방향으로 프로모터, 제1 경쇄를 인코딩하는 핵산, 및 폴리아데닐화 신호 서열 및 선택적으로 종결인자 서열을 포함하고,
iii) 제 3 발현 카세트는 5'- 에서 3'- 방향으로 프로모터, 제1 경쇄를 인코딩하는 핵산, 및 폴리아데닐화 신호 서열 및 선택적으로 종결인자 서열을 포함하고,
iv) 제 4 발현 카세트는 5'- 에서 3'- 방향으로 프로모터, 제2 중쇄를 인코딩하는 핵산, 및 폴리아데닐화 신호 서열 및 선택적으로 종결인자 서열을 포함하고,
v) 제 5 발현 카세트는 5'- 에서 3'- 방향으로 프로모터, 제2 경쇄를 인코딩하는 핵산, 및 폴리아데닐화 신호 서열 및 선택적으로 종결인자 서열을 포함하고,
vi) 제 6 발현 카세트는 5'- 에서 3'- 방향으로 프로모터, 제2 경쇄를 인코딩하는 핵산, 및 폴리아데닐화 신호 서열 및 선택적으로 종결인자 서열을 포함하고, 및
vii)
발현 카세트 선별 마커를 인코딩하는 각각의 발현 카세트는 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 선별 마커를 인코딩하는 핵산, 및 폴리아데닐화 신호 서열 및 선택적으로 종결인자 서열을 포함한다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 프로모터는 인트론 A가 있는 인간 CMV 프로모터이고, 폴리아데닐화 신호 서열은 bGH 폴리A 부위이고 종결인자는 hGT 종결인자이다.
종결인자 서열은 RNA 중합효소 II에 의한 매우 긴 RNA 전사체의 생성, 즉, 본 발명에 따라 그리고 본 발명의 방법에서 사용되는 데옥시리보핵산에서 다음 발현 카세트로의 리드-쓰루 (read-through)를 방지한다. 즉, 하나의 관심 구조 유전자의 발현은 자체 프로모터에 의해 제어된다.
따라서, 폴리아데닐화 신호와 종결인자 서열의 조합에 의해 효율적인 전사 종결이 달성된다. 즉, RNA 중합효소 II의 리드-쓰루는 이중 종결 신호의 존재에 의해 방지된다. 종결인자 서열은 복잡한 분해를 시작하고 DNA 템플릿으로부터 RNA 중합효소의 해리를 촉진한다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 프로모터는 인트론 A를 갖는 인간 CMV 프로모터이고, 폴리아데닐화 신호 서열은 bGH 폴리아데닐화 신호 서열이고, 종결인자는 선별 마커의 발현 카세트를 제외한 hGT 종결인자이고, 이때 프로모터는 SV40 프로모터이고 폴리아데닐화 신호 서열은 SV40 폴리아데닐화 신호 서열이고 종결인자는 없다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 포유동물 세포는 CHO 세포이다. 한 구체예에서 CHO 세포는 CHO-K1 세포이다.
모든 양상 및 구체예들 중 한 구체예에서 3가 항체는 치료 항체이다.
모든 양상 및 구체예들 중 한 구체예에서 3가 이중특이성 (치료) 항체 (TCB)는 다음을 포함하고:
- 제1 및 제2 Fab 단편, 여기서 제1 및 제2 Fab 단편의 각각의 결합 부위는 제2 항원에 특이적으로 결합하고,
- 제3 Fab 단편, 이때 제3 Fab 단편의 결합 부위는 제1 항원에 특이적으로 결합하고, 제3 Fab 단편은 가변 경쇄 도메인(VL) 및 가변 중쇄 도메인(VH)이 서로 대체되는 도메인 교차를 포함하고, 및
- 제1 Fc-영역 폴리펩티드 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 Fc-영역,
이때 제1 및 제2 Fab 단편은 각각 중쇄 단편 및 전장 경쇄를 포함하고,
이때 제1 Fab 단편의 중쇄 단편의 C-말단은 제1 Fc-영역 폴리펩티드의 N-말단에 융합되고,
이때 제2 Fab 단편의 중쇄 단편의 C-말단은 제3 Fab 단편의 가변 경쇄 도메인의 N-말단에 융합되고 제3 Fab 단편의 중쇄 불변 도메인 1의 C-말단은 제2 Fc-영역 폴리펩티드의 N-말단에 융합된다.
본원의 모든 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 적어도 하나의 선별 마커 발현 카세트는 항체 중쇄 및 경쇄 발현 카세트와 반대 방향으로 배향된다.
본원의 모든 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 항체 중쇄 및 경쇄 발현 카세트는 서로에 대해 단방향으로 배열되고 (즉, 3'-에서 5'-방향으로 동일한 방향을 가짐) 선별 마커 발현 카세트 중 적어도 하나는 항체 중쇄 및 경쇄 발현 카세트에 대해 양방향으로 배열된다.
모든 양상 및 구체예들 중 한 구체예에서 3가 항체는 항-CD3/CD20 이중특이성 항체이다. 한 구체예에서 항-CD3/CD20 이중특이성 항체는 TCB이고 CD20은 제2 항원이다. 한 구체예에서 이중특이성 항-CD3/CD20 항체는 RG6026이다. 이러한 항체는 WO 2016/020309에 보고되어 있으며, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
모든 양상 및 구체예들 중 한 구체예에서 3가 항체는 항-CD3/CEA 이중특이성 항체이다. 한 구체예에서 항-CD3/CEA 이중특이성 항체는 TCB이고 CEA는 제2 항원이다. 한 구체예에서 이중특이성 항-CD3/CEA 항체는 RO6958688 또는 RG7802 또는 시비사타맙이다. 이러한 항체는 WO 2017/055389에 보고되어 있으며, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 3가 이중특이성 항체의 제1 경쇄 및 제2 경쇄 어떤 것도 공통 경쇄 또는 범용 경쇄가 아니다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서, 제2 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
모든 양상 및 구체예들 중 한 바람직한 구체예에서 제1 결합 부위는 인간 CD3에 특이적으로 결합한다.
모든 양상 및 구체예들 중 한 바람직한 구체예에서 제2 결합 부위는 인간 CD3에 특이적으로 결합한다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 바람직한 구체예에서 정확하게 2개의 데옥시리보핵산이 포함되거나 도입된다.
본 발명에 따른 데옥시리보핵산의 개별 발현 카세트는 순차적으로 배열된다. 하나의 발현 카세트의 단부와 이후 후속되는 발현 카세트의 시작 사이의 거리는 수 개의 뉴클레오티드에 불과한데, 이는 복제 절차에 필요한 것, 즉, 복제 절차의 결과이다.
모든 전술한 양상들 및 구체예들 중 한 구체예에서 바로 후속되는 2개의 발현 카세트는 최대 100 bps 떨어져있다 (즉, 폴리A 신호 서열 또는 종결인자 서열 각각의 단부로부터, 후속 프로모터 구성요소의 시작까지 최대 100개 염기쌍 (bps)이다). 한 구체예에서 바로 후속되는 2개의 발현 카세트들은 최대 50 bps 떨어져있다. 한 바람직한 구체예에서 바로 후속되는 2개의 발현 카세트들은 최대 25 bps 떨어져있다.
발명의 구체예들에 관한 상세한 설명
본 발명은, 상이한 폴리펩티드들을 포함하는 복합체 분자, 즉, 이종다량체인 3가 항체 (예를 들어, TCB)의 발현에 있어서, 정의된 특이적 발현 카세트 조직의 사용이 포유동물 세포, 예를 들어, CHO 세포에서 3가 항체 (예를 들어, TCB)의 효율적인 발현 및 생산을 가져온다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
본 발명은, 정의된 특이적 발현 카세트 서열이 게놈에 통합되어 있는 재조합 포유동물 세포, 예를 들어, 재조합 CHO 세포의 생산에 이중 재조합효소 매개된 카세트 교환 (RMCE)이 사용될 수 있으며, 이는 결과적으로 3가 항체 (예를 들어, TCB)의 효율적인 발현 및 생산을 가져온다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 통합은 표적화된 통합에 의해 포유동물 세포 게놈의 특정 부위에서 수행된다. 이에 의해 이종다량체, 3가 항체 (예를 들어, TCB)의 상이한 폴리펩티드들의 서로에 대한 발현 비율을 제어하는 것이 가능하다. 이로써 결과적으로 올바르게 폴딩되어 조립된 3가 항체 (예를 들어, TCB)의 높은 수율의 효율적 발현, 올바른 조립 및 성공적 분비가 달성된다.
I. 정의
본 발명의 실시함에 유용한 방법 및 기술들은 예컨대, Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997); Glover, N.D., and Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (1985), Oxford University Press; Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture - a practical approach, IRL Press Limited (1986); Watson, J.D., 등, Recombinant DNA, Second Edition, CHSL Press (1992); Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J., ed., Cell Biology, Second Edition, Academic Press (1998); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, second edition, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987)에 기재되어 있다.
재조합 DNA 기술을 사용하여 핵산 유도체를 생성 할 수 있다. 이러한 유도체는 예를 들어 치환, 변경, 교환, 결실 또는 삽입에 의해 개별적인 또는 여러 뉴클레오티드 위치에서 변형 될 수 있다. 예를 들어, 변형 또는 유도체화는 부위 지정 돌연변이유발에 의해 실시 될 수 있다. 해당 분야의 당업자는 이러한 변형들을 용이하게 실시할 수 있다 (예컨대, Sambrook, J., 등, Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B.D., and Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, 영국 참조).
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는, 단수형 “하나” 및 “그것”은 문맥에서 달리 명확히 언급이 없는 한 복수형을 포함함을 유념하여야 한다. 그러므로, 예를 들면, “하나의 세포”에 대한 지칭은 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 공지된 복수의 이러한 세포들 및 이의 균등물들, 등을 포함한다. 용어 “하나 이상” 및 “적어도 하나”는 본 출원에서 호환적으로 사용된다. 용어 “포함하는”, “비롯한” 및 “가지는”은 호환적으로 사용될 수 있음을 유의하여야 한다.
용어 “약”은 이후에 따라오는 수치값의 +/- 20 % 범위를 나타낸다. 한 구체예에서 용어 약은 이후에 따라오는 수치값의 +/- 10 % 범위를 나타낸다. 한 구체예에서 용어 약은 이후에 따라오는 수치값의 +/- 5 % 범위를 나타낸다.
용어 “~을 포함하는”은 또한 용어 “~로 구성되는”을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 “CD20-TCB”는 CD20-표적화 TCB (TCB 형태의 CD20-TCB; RG6026; 항-CD3/CD20 항체)를 나타내며, 이는 긴 반감기 및 높은 역가를 가지는데, 이는 CD20에 대한 고-결합력 2가 결합 그리고 B- 및 T-세포-결합 도메인들의, 기존에 정의된 2:1 TCB 분자 형식의 머리-대-꼬리 배향에 의해 가능한 것이다 (예를 들어, Bacac, M., 등, Clin. Cancer Res. 22 (2016) 3286-3297; Bacac, M., 등, Oncoimmunology 5 (2016) e1203498 참조).
“외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 세포”라는 용어는 하나 이상의 외인성 핵산(들)이 도입된 세포를 포함하고, 이러한 세포의 자손을 포함하며, 이들은 추가의 유전적 변형을 위한 시작점을 형성하고자 한다. 따라서, “외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 세포”라는 용어는 포유동물 세포의 게놈 유전자좌 내의 단일 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 포함하며, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 제1 선별 마커에 연접하는 적어도 제1 및 제2 재조합 인식 서열(이들 재조합효소 인식 서열들은 상이함)을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 세포는 숙주 세포의 게놈 유전자좌 내의 단일 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포로서, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 제1 선별 마커에 연접하는 적어도 제1 및 제2 재조합 인식 서열, 및 상기 제1 및 제2 재조합 인식 서열 사이에 위치하는 제3 재조합 인식 서열을 포함하고, 상기 모든 재조합 인식 서열은 상이하다.
본원에 사용된 “재조합 세포”라는 용어는 예를 들어, 관심 폴리펩티드를 발현하는 세포와 같은 최종 유전자 변형 후의 세포로서, 어떠한 규모에서도 상기 관심 폴리펩티드의 생산에 사용될 수 있는 세포를 의미한다. 예컨대, 재조합효소 매개 카세트 교환(RMCE)을 거쳐, 이에 의해 관심 폴리펩티드의 코딩 서열들이 숙주 세포의 게놈 내로 도입되어 있는 “외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 세포”는 “재조합 세포”이다. 세포는 여전히 또 다른 RMCE 반응을 수행할 수 있지만 그렇게 하도록 의도된 것은 아니다.
“외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 세포” 및 “재조합 세포”는 둘 다 “형질전환된 세포”이다. 이러한 용어는 계대의 수에 관계없이 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은, 예를 들어, 핵산 함량이 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만 돌연변이를 포함할 수 있다. 최초 형질전환된 세포에 대하여 스크리닝된 또는 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 보유한 돌연변이 자손이 본 발명에 포함된다.
“단리된” 조성물은 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리되어 있는 조성물이다. 일부 구체예들에 있어서, 조성물은 예를 들면, 전기영동의 (예로써, SDS-PAGE, 등전초점조절 (IEF), 모세관전기이동, CE-SDS) 또는 크로마토그래피 (예로써, 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되었을 때 95 % 또는 99 % 순도 이상으로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 검토는 예로써, Flatman, S. 등, J. Chrom. B 848 (2007) 79-87을 참고한다.
“단리된” 핵산은 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리되어 있는 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 보통 포함하는 세포 안에 있는 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체외부에 존재한다.
“단리된” 폴리펩티드 또는 항체는 그 자연 환경의 성분들로부터 분리되어 있는 폴리펩티드 분자 또는 항체 분자를 지칭한다.
“통합 부위”라는 용어는 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입되는 세포 게놈 내의 핵산 서열을 의미한다. 특정 실시예들에서, 통합 부위는 숙주 세포 게놈상의 2개의 인접 뉴클레오티드들 사이에 존재한다. 특정 구체예들에서, 통합 부위는 뉴클레오티드 서열들의 스트레치를 포함한다. 특정 구체예들에서, 통합 부위는 포유동물 세포 게놈의 특정 유전자좌 내부에 위치한다. 특정 구체예들에서, 통합 부위는 포유동물 세포의 내인성 유전자 내부에 존재한다.
본원에서 사용되는 호환적으로 사용될 수 있는 용어 “벡터” 또는 “플라스미드”는 이것이 연결되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조의 벡터, 뿐만 아니라 이것이 도입되어 있는 숙주 세포의 게놈 내부에 통합된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본원에서 “발현 벡터”라고 한다.
용어 “~에 결합”은 결합 부위의 그 표적에 대한 결합, 가령, 예컨대, 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 결합 부위의 각 항원에 대한 결합을 나타낸다. 이러한 결합은, 예를 들어, BIAcore®분석 (GE Healthcare, Uppsala, 스웨덴)을 사용하여 결정될 수 있다. 즉, 용어 “(항원에 대한) 결합”은 시험관내에서 항체의 그 항원(들)에 대한 결합을 나타낸다. 한 구체예에서 결합은 항체가 표면에 결합되고 항체에 대한 항원의 결합이 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 측정되는 결합 분석에서 결정된다. 결합은, 예컨대, 10-8 M 이하, 일부 구체예들에서 10-13 내지 10-8 M, 일부 구체예들에서 10-13 내지 10-9 M의 결합 친화도 (KD)를 의미한다. 용어 “결합”은 또한 용어 “특이적으로 결합”을 포함한다.
예를 들어, BIAcore®분석의 한 가능한 구체예에서 항원은 표면에 결합되고 항체의 결합, 즉, 이의 결합 부위(들)은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정된다. 결합 친화도는 용어 ka (결합 상수: 복합체를 형성하는 결합에 관한 속도 상수), kd (해리 상수; 복합체의 해리에 관한 속도 상수), 및 KD (kd/ka)로 정의된다. 대안으로, SPR 센서그램의 결합 신호는 공명 신호 높이 및 해리 거동과 관련하여 기준 응답 신호와 직접 비교할 수 있다.
용어 “결합 부위”는 표적에 대한 결합 특이성을 나타내는 임의의 단백질성 엔터티를 나타낸다. 이것은 예를 들어 수용체, 수용체 리간드, 안티칼린, 아피바디, 항체 등 일 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 “결합 부위”는 제 2 폴리펩티드에 특이적으로 결합 할 수 있거나 이에 의해 특이적으로 결합 될 수 있는 폴리펩티드를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 “선별 마커”는 유전자를 보유하는 세포가 상응하는 선별 제제의 존재하에 특이적으로 선별되거나 이에 대해 선별되도록 하는 유전자를 나타낸다. 예를 들어, 제한없이, 선별 마커는 선별 마커 유전자로 형질전환된 숙주 세포가 각각의 선별 제제의 존재하에 (선별 배양 조건) 양성으로 선별되도록 할 수 있다; 형질전환되지 않은 숙주 세포는 선별 배양 조건하에서 성장하거나 생존 할 수 없다. 선별 마커는 양성, 음성 또는 이-작용기성 일 수 있다. 양성 선별 마커는 마커를 보유한 세포에 대한 선택을 허용하는 반면, 음성 선별 마커는 마커를 보유한 세포가 선택적으로 제거되도록 할 수 있다. 선별 마커는 약물에 대한 내성을 부여하거나 숙주 세포의 대사 또는 이화작용 결함을 보상할 수 있다. 원핵 세포에서는 무엇보다도 암피실린, 테트라이클린, 카나마이신 또는 클로람페니콜에 대한 내성을 부여하는 유전자를 사용할 수 있다. 진핵 세포에서 선별 마커로 유용한 내성 유전자에는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 (APH) (예컨대, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HYG), 네오마이신 및 G418 APH), 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 티미딘 키나제 (TK), 글루타민 합성효소 (GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소 (인돌), 히스티디놀 탈수소효소 (히스티디놀 D)에 대한 유전자 및 퓨로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 및 마이코페놀산에 대한 내성을 인코딩하는 유전자가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 마커 유전자들은 WO 92/08796 및 WO 94/28143에 기재되어 있다.
상응하는 선별 제제의 존재하에서 선별을 용이하게 하는 것 외에도 선별 마커는 세포에 정상적으로 존재하지 않는 분자를 부호화하는 유전자, 예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP), 강화된 GFP (eGFP), 합성 GFP, 옐로우 형광 단백질 (YFP), 강화 YFP (eYFP), 시안 형광 단백질 (CFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-red, DsRed-모노머, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald, CyPet, mCFPm, Cerulean 및 T-Sapphire을 대안적으로 제공할 수 있다. 이러한 분자를 발현하는 세포들은 예를 들어 인코딩된 폴리펩티드에 의해 방출되는 형광의 검출 또는 부재 각각에 의해 이 유전자를 보유하지 않는 세포와 구별 될 수 있다.
본원에 사용된 용어 “작동가능하게 연결된”은 2개 이상의 구성요소들의 병치를 지칭하며, 여기서 구성요소들은 이들을 의도한 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계로 존재한다. 예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서가 코딩 서열의 전사를 조절하는 작용을 하는 경우, 프로모터 및/또는 인핸서는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 특정 구체예들에서, “작동가능하게 연결된” DNA 서열들은 단일 염색체에서 연속이고 인접해 있다. 특정 구체예에서, 예를 들어, 분비 리더 및 폴리펩티드와 같은 2개의 단백질 인코딩 영역들을 연결하는 것이 필요한 경우, 서열들은 연속으로 인접하며 동일한 리딩 프레임에 존재한다. 특정 구체예에서, 작동가능하게 연결된 프로모터는 코딩 서열의 상류에 위치하고 이에 인접 할 수 있다. 특정 구체예에서, 예를 들어 코딩 서열의 발현을 조절하는 인핸서 서열들과 관련하여, 두 구성성분은 인접하지는 않지만 작동가능하게 연결될 수 있다. 인핸서가 코딩 서열의 전사를 증가시키면 인핸서는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된 인핸서는 코딩 서열의 상류, 내부 또는 하류에 위치 할 수 있고 코딩 서열의 프로모터로부터 상당한 거리에 위치 할 수 있다. 작동가능한 연결은 당업계에 공지된 재조합 방법, 예를 들어, PCR 방법을 사용하여 및/또는 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 달성 될 수 있다. 편리한 제한 부위가 존재하지 않는 경우 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 기존 관행에 따라 사용할 수 있다. 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)는 내부 위치에서 5' 말단-독립 방식으로 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 번역을 시작할 수 있는 경우 ORF에 작동가능하게 연결된다.
본원에 사용된 용어 “연접”은 제 1 뉴클레오티드 서열이 제 2 뉴클레오티드 서열의 5'- 또는 3'- 말단, 또는 양쪽 말단에 위치함을 지칭한다. 연접 뉴클레오티드 서열은 제2 뉴클레오티드 서열에 인접하거나 이로부터 정해진 거리에 존재할 수 있다. 연접 뉴클레오티드 서열의 길이에는 특별한 제한이 없다. 예를 들어, 연접 서열은 몇 개의 염기 쌍 또는 수천 개의 염기 쌍이 될 수 있다.
데옥시리보핵산은 코딩 및 비-코딩 가닥을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 “5'“ 및 “3'“은 코딩 가닥 상의 위치를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 “외인성”은 뉴클레오티드 서열이 특정 세포로부터 유래하지 않고 DNA 전달 방법, 예를 들어, 형질감염, 전기천공 또는 형질전환 방법에 의해 상기 세포로 도입된다는 것을 나타낸다. 따라서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 인공 서열인데, 이러한 인공성은, 예를 들어 상이한 기원의 하위서열들의 조합(예를 들어, 재조합효소 인식 서열과 SV40 프로모터 및 녹색 형광 단백질의 코딩 서열의 조합은 인공 핵산임)으로부터 또는 서열 일부의 결실 (예를 들어, 막-결합 수용체 또는 cDNA의 세포외 도메인만을 코딩하는 서열) 또는 핵염기의 돌연변이로부터 유래될 수 있다. 용어 “내인성”은 뉴클레오티드 서열이 숙주 세포로부터 유래함을 지칭한다. “외인성” 뉴클레오티드 서열은 기본 조성에 있어서 동일한 “내인성” 대응부를 가질 수 있으나, 여기서 “외인성” 서열은 예를 들어, 재조합 DNA 기술을 통해 숙주 세포로 도입된다.
항체
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열들의 일반적인 정보는 다음 문헌들에 제공되어 있다: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
용어 “중쇄”는 항체를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬들 중 2개의 더 큰 폴리펩티드 사슬들을 나타내는 원래 의미로 본원에서 사용된다 (예를 들어, Edelman, G.M. and Gally J.A., J. Exp. Med. 116 (1962) 207-227 참조). 이 문맥에서 “더 큰”이라는 용어는 분자량, 길이 및 아미노산 수 중 어느 하나를 나타낼 수 있다. 용어 “중쇄”는 그 안에 존재하는 개별 항체 도메인의 서열 및 수와 무관하다. 이는 오직 각 폴리펩티드의 분자량을 기준으로 할당된다.
용어 “경쇄”는 항체를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬들 중 2개의 더 작은 폴리펩티드 사슬들을 나타내는 원래 의미로 본원에서 사용된다 (예를 들어, Edelman, G.M. and Gally J.A., J. Exp. Med. 116 (1962) 207-227 참조). 이 문맥에서 “더 작은”이라는 용어는 분자량, 길이 및 아미노산 수 중 어느 하나를 나타낼 수 있다. 용어 “경쇄”는 그 안에 존재하는 개별 항체 도메인의 서열 및 수와 무관하다. 이는 오직 각 폴리펩티드의 분자량을 기준으로 할당된다.
본원에서 사용되는, 중쇄 및 경쇄의 모든 불변 영역들 및 도메인들의 아미노산 위치는 Kabat, 등의, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에 기재된 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링되며 본원에서 이는 “Kabat에 따른 넘버링”으로 지칭된다. 구체적으로, Kabat, 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)의 Kabat 넘버링 시스템 (647-660 페이지 참조)은 카파 및 람다 아이소형의 경쇄 불변 도메인 CL에 대해 사용되고, Kabat, 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)의 Kabat EU 색인 넘버링 시스템 (661-723 페이지 참조)은 불변 중쇄 도메인들에 대해 사용된다 (CH1, 힌지, CH2 및 CH3, 이는 본 명세서에서 이러한 경우 “Kabat EU 색인에 따른 넘버링”을 지칭함으로써 보다 명확해진다).
본원에서 용어 “항체”는 가장 넓은 의미로 사용되며 전장 항체, 단일클론 항체, 다중특이성 항체 (예를 들어, 이중특이성 항체) 및 항체-항체 단편-융합 뿐만 아니라 이의 조합을 포함하는 다양한 항체 구조를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 “고유 항체”는 구조가 변화하는 자연 발생 면역글로불린 분자를 나타낸다. 예를 들면, 고유 IgG 항체는 이종사량체 당단백질로써, 약 150,000 달톤이며, 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄를 포함하며, 이들은 이황화 결합에 의해 연결되어 있다. N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH), 이어서 3개의 중쇄 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 가지며, 이에 의해 제 1 및 제 2 중쇄 불변 도메인 사이에 힌지 영역이 위치된다. 유사하게, N-에서 C-말단으로, 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL), 이어서 경쇄 불변 도메인 (CL)을 가진다. 항체의 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 카파 (κ및 람다 (λ라고 하는 두 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
용어 “전장 항체”는 고유 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 나타낸다. 전장 항체는 각각 N-에서 C-말단 방향으로 가변 영역 및 불변 도메인을 포함하는 둘 이상의 전장 항체 경쇄, 뿐만 아니라 각각 N-에서 C-말단 방향으로 가변 영역, 제 1 불변 도메인, 힌지 영역, 제 2 불변 도메인 및 제 3 불변 도메인을 포함하는 2개의 중쇄를 포함한다. 고유 항체와 대조적으로, 전장 항체는 전장 항체의 서로 다른 사슬들의 말단 중 하나 이상에, 그러나 각 말단에는 하나의 단편만 접합된 추가 면역글로불린 도메인, 가령, 예를 들어, 하나 이상의 추가 scFv, 또는 중쇄 또는 경쇄 Fab 단편, 또는 scFab을 포함할 수 있다. 이들 접합체 또한 전장 항체라는 용어에 포함된다.
용어 “항체 결합 부위”는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 쌍을 나타낸다. 항원에 대한 적절한 결합을 보장하기 위해 이러한 가변 도메인은 동족체 가변 도메인이다, 즉, 함께 속한다. 항체의 경우 결합 부위는 적어도 3개의 HVR (예컨대, VHH의 경우) 또는 3-6개의 HVR (예컨대, 자연 발생, 즉 VH/VL 쌍을 갖는 통상적인 항체의 경우)을 포함한다. 일반적으로 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기들이 결합 부위를 형성하고 있다. 이들 잔기는 일반적으로 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 상응하는 항체 경쇄 가변 도메인에 포함된다. 항체의 항원-결합 부위는 “초가변 영역”또는 “HVR”의 아미노산 잔기를 포함한다. “프레임워크”또는 “FR”영역은 본원에 정의된 초가변 영역 잔기들 이외의 가변 도메인 영역들이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 FR1, HVR1, FR2, HVR2, FR3, HVR3 및 FR4 영역을 포함한다. 특히 중쇄 가변 도메인의 HVR3 영역은 항원 결합에 가장 많이 기여하고 항체의 결합 특이성을 정의하는 영역이다. “기능적 결합 부위”는 그 표적에 특이적으로 결합 할 수 있다. 용어 “~에 특이적으로 결합하는”은 결합 분석의 한 구체예에서 시험관내 분석에서 그의 표적에 대한 결합 부위의 결합을 나타낸다. 이러한 결합 분석은 결합 이벤트가 검출 될 수 있는 한 임의의 분석 일 수 있다. 예를 들어, 항체가 표면에 결합되고 항원(들)이 항체에 결합하는 분석은 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 측정된다. 대안으로, 가교 ELISA가 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “초가변 영역” 또는 “HVR”은 서열에서 초가변인 (“상보성 결정 영역” 또는 “CDR”) 및/또는 구조적으로 정의된 루프 (“초가변 루프”)를 형성하고 및/또는 항원-함유 잔기들 (“항원 접촉부”)을 함유하는 아미노산 잔기 연장부들을 포함하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체들은 다음 6개의 HVR들을 포함한다; 중쇄 가변 도메인 VH에서 3개 (H1, H2, H3), 및 경쇄 가변 도메인 VL에서 3개 (L1, L2, L3).
HVR은 다음을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에서 나타나는 초가변 루프 (Chothia, C. 및 Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에서 나타나는 CDR (Kabat, E.A. 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에서 나타나는 항원 접촉부 (MacCallum 등, J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및
(d) 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3)을 포함하는, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.
달리 언급이 없는 한, HVR 잔기들 및 가변 도메인 내 다른 잔기들 (예컨대, FR 잔기)은 상기 Kabat 등에 기재된 바에 따라 본 명세서에서 넘버링된다.
항체의 분류는 그 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역, 바람직하게는 Fc-영역의 유형을 말한다. 항체에는 5 가지 주요 분류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들중 몇몇은 하위분류(아이소형), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더욱 세분될 수 있다. 상이한 면역글로불린 분류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 차례로 α , δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
용어 “중쇄 불변 영역”은 불변 도메인들, 즉, 고유 면역글로불린의 경우 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인 또는 전장 면역글로불린의 경우 제1 불변 도메인, 힌지 영역, 제2 불변 도메인 및 제3 불변 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 영역을 나타낸다. 한 구체예에서, 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 Ala118로부터 중쇄의 카르복실-말단까지 확장된다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링). 그러나, 불변 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링). 용어 “불변 영역”은 2개의 중쇄 불변 영역을 포함하는 이량체를 나타내며, 이는 사슬간 이황화 결합을 형성하는 힌지 영역 시스테인 잔기를 통해 서로 공유 연결될 수 있다.
용어 “중쇄 Fc-영역”은 힌지 영역 (중앙 및 하부 힌지 영역), 제2 불변 도메인, 예를 들어, CH2 도메인, 및 제3 불변 도메인, 예를 들어, CH3 도메인 중 적어도 일 부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 나타낸다. 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Asp221, Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단까지 확장된다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링). 따라서, Fc-영역은 불변 영역보다 작지만 C-말단 부분에서는 이와 동일하다. 그러나, 중쇄 Fc-영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링). 용어 “Fc-영역”은 2개의 중쇄 Fc-영역을 포함하는 이량체를 나타내며, 이는 사슬간 이황화 결합을 형성하는 힌지 영역 시스테인 잔기를 통해 서로 공유 연결될 수 있다.
항체의 불변 영역, 보다 간단하게 Fc-영역 (및 마찬가지로 불변 영역)은 보체 활성화, C1q 결합, C3 활성화 및 Fc 수용체 결합에 직접적으로 관여한다. 보체 시스템에 대한 항체의 영향은 특정 조건에 따라 다르지만 C1q에 대한 결합은 Fc-영역 내 정의된 결합 부위에 의해 발생한다. 이러한 결한 부위들은 해당 분야에 공지이며 예컨대, Lukas, T.J., 등, J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., 등, Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., 등, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., 등, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., 등, J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., 등, Immunology 86 (1995) 319-324; 및 EP 0 307 434에 기재되어 있다. 이러한 결합 부위들은 예컨대, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329이다 (Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링). 하위분류 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체는 일반적으로 보체 활성화, C1q 결합 및 C3 활성화를 나타내는 반면, IgG4는 보체 시스템을 활성화하지 않고 C1q에 결합하지 않으며 C3를 활성화하지 않는다. “항체의 Fc-영역”은 당업자에게 잘 알려진 용어이며 항체의 파파인 절단을 기준으로 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 “단일클론 항체”는 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 즉, 개별 항체는 동일한 집단 및/또는 같은 에피토프에 결합하는 모집단을 포함하는데, 다만, 변이체 항체, 가령, 자연 발생적 돌연변이 또는 단일클론 항체 제재를 만드는 동안 발생되는 돌연변이를 가진 변이체 항체 가능성이 있으며, 이러한 변이체들은 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정부위(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 통상적으로 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정부위에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 “단일클론(monoclonal)”은 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 전시 방법, 그리고 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 내포하는 유전자도입 동물을 활용하는 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 “~가”는 항체 내 특정 수의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 이와 같이, 용어들 “2가”, “4가”, 및 “6가”는 항체에서 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위, 및 6개의 결합 부위 각각의 존재를 나타낸다.
“단일특이성 항체”는 하나의 항원에 대해 단일 결합 특이성을 갖는, 즉, 특이적으로 결합하는 항체를 나타낸다. 단일특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예컨대, F(ab')2) 또는 이의 조합 (예컨대, 전장 항체 + 또 다른 scFv 또는 Fab 단편)으로 제조 될 수 있다. 단일특이성 항체는 1가일 필요가 없다, 즉, 단일특이성 항체는 하나의 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 포함 할 수 있다. 예를 들어, 천연 항체는 단일특이성이지만 2가이다.
“다중특이성 항체”는 동일한 항원 또는 2개의 상이한 항원상의 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 나타낸다. 다중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예컨대, F(ab')2 이중특이성 항체) 또는 이의 조합 (예컨대, 전장 항체 + 또 다른 scFv 또는 Fab 단편)으로 제조 될 수 있다. 다중특이성 항체는 적어도 2가이다, 즉 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 또한 다중특이성 항체는 적어도 이중특이성이다. 그러므로, 2가, 이중특이성 항체는 다중특이성 항체의 가장 단순한 형태이다. 2개, 3개 또는 그 이상 (예컨대, 4개)의 기능적 항원 결합 부위를 가진 조작된 항체도 보고된 바 있다 (예컨대, US 2002/0004587 A1 참조).
일부 구체예들에서, 항체는 다중특이성 항체, 예를 들어, 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 특정 구체예들에서, 결합 특이성 중에서 하나는 제1 항원에 대한 것이고, 다른 하나는 상이한 제2 항원에 대한 것이다. 특정 구현예들에서, 다중특이성 항체는 동일한 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다중특이성 항체는 또한 세포독성제를 항원을 발현하는 세포에 국재화하는데 사용될 수 있다.
다중특이성 항체를 제조하기 위한 기술에는 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동 발현 (Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, 및 Traunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659), 및 “놉-인-홀” 조작 (예를 들어, US 5,731,168 참조)가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 다중특이성 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 만들기 위해 정전기 조정 효과를 조작하여 (WO 2009/089004); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교하여 (예를 들어, 미국 특허 제 4,676,980, 및 Brennan, M. 등, Science, 229 (1985) 81-83 참조); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이성 항체를 생산하여 (예를 들어, Kostelny S.A., 등, J. Immunol., 148 (1992):1547-1553 참조); 이중특이성 항체 단편들을 제조하기 위한 특정 기술들 사용하여(예를 들어, Hollinger, P., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (1993) 6444-6448 참조); 그리고 단일-사슬 Fv (scFv) 이량체들을 사용하여 (예를 들어, Gruber, M., 등, J. Immunol., 152 (1994) 5368-5374 참조); 그리고 예를 들어, Tutt, A., 등 J. Immunol. 147 (1991) 60-69에 기재된 바와 같이 삼중특이성 항체를 제조하여 제조될 수 있다.
항체 또는 단편은 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, 또는 WO 2010/145793에 기재된 바와 같은 다중특이성 항체 일 수도 있다.
항체 또는 이의 단편은 또한 WO 2012/163520에 개시된 다중특이성 항체일 수 있다.
이중특이성 항체는 일반적으로 동일한 항원 상의 2개의 상이한 비중첩 에피토프 또는 상이한 항원 상의 2개의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 분자이다.
이 내용에서 용어 “비중첩”은 이중특이성 Fab의 제1 파라토프 내에 포함된 아미노산 잔기가 제2 파라토프에 포함되지 않고, 이중특이성 Fab의 제2 파라토프 내에 포함된 아미노산이 제1 파라토프에 포함되지 않음을 나타낸다.
“놉 인투 홀” 이량체화 모듈 및 항체 공학에 있어서의 이의 용도는 Carter P.; Ridgway J.B.B.; Presta L.G.: Immunotechnology, Volume 2, Number 1, February 1996, pp. 73-73(1)에 기재되어 있다.
항체 중쇄들의 CH3 도메인들은 “놉-인투-홀” 기술에 의해 변경될 수 있으며, 이러한 기술은 예컨대, WO 96/027011, Ridgway, J.B., 등, Protein Eng. 9 (1996) 617-621; 및 Merchant, A.M., 등, Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681에 몇가지 실시예로 상세히 기재되어 있다. 이 방법에서 2개의 CH3 도메인들의 상호작용 표면들을 변화시켜 이들 2개 CH3 도메인들의 이종이량체화 그리고 이에 따라 이들을 포함하는 폴리펩티드의 이종이량체화를 증가시킨다. (2개의 중쇄 중) 2개의 CH3 도메인들 각각은 “놉” 일 수 있고, 다른 하나는 “홀” 일 수 있다. 이황화물 가교를 도입하면 이종이량체가 더욱 안정화되고 (Merchant, A.M., 등, Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., 등, J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) 수율이 더욱 증가된다.
(항체 중쇄의) CH3 도메인에서 돌연변이 T366W는 “놉-돌연변이” 또는 “돌연변이 놉”으로 표시되고 (항체 중쇄의) CH3 도메인에서 돌연변이 T366S, L368A, Y407V는 “홀 돌연변이 “또는 “돌연변이 홀”로 표시된다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링). CH3 도메인들 사이의 또 다른 사슬간 이황화물 가교가 또한 사용될 수 있는데(Merchant, A.M., 등, Nature Biotech. 16 (1998) 677-681), “놉-돌연변이”가 있는 중쇄의 CH3 도메인에 S354C 돌연변이를 도입 (“놉-시스-돌연변이” 또는 “돌연변이 놉-시스”로 표시) 그리고 “홀-돌연변이”가 있는 중쇄의 CH3 도메인에 Y349C 돌연변이를 도입 (“홀-시스-돌연변이” 또는 “돌연변이 홀-시스”로 표시) (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)함에 의한 것이 그 예이다.
본원에서 사용되는 용어 “도메인 교차”는 한 쌍의 항체 중쇄 VH-CH1 단편 및 이의 상응하는 동족 항체 경쇄에서, 즉, 항체 Fab (단편 항원 결합)에서, 적어도 하나의 중쇄 도메인이 이의 상응하는 경쇄 도메인에 의해 치환되어 해당 도메인 서열이 고유 항체의 서열로부터 벗어나는 것을 나타낸다. 다음과 같은 3가지 일반 유형의 도메인 교차가 존재한다: (i) CH1 및 CL 도메인들의 교차, 이는 경쇄에서의 도메인 교차에 의해 VL-CH1 도메인 서열을 그리고 중쇄 단편에서의 도메인 교차에 의해 VH-CL 도메인 서열을 (또는 VH-CL-힌지-CH2-CH3 도메인 서열을 가지는 전장 항체 중쇄) 초래, (ii) VH 및 VL 도메인들의 도메인 교차, 이는 경쇄에서의 도메인 교차에 의해 VH-CL 도메인 서열을 그리고 중쇄 단편에서의 도메인 교차에 의해 VL-CH1 도메인 서열을 초래, 및 (iii) 완전 경쇄 (VL-CL) 및 완전 VH-CH1 중쇄 단편의 도메인 교차 (“Fab 교차”), 이는 도메인 교차에 의해 VH-CH1 도메인 서열을 가지는 경쇄를 및 도메인 교차에 의해 VL-CL 도메인 서열을 가지는 중쇄 단편을 초래 (전술한 모든 도메인 서열들은 N-말단에서 C-말단 방향으로 표시됨).
본원에서 사용되는 용어 상응하는 중쇄 및 경쇄 도메인에 대해 “서로 대체된”은 전술한 도메인 교차를 지칭한다. 이에 따라, CH1 및 CL 도메인들이 “서로에 의해 대체되는” 경우, 이는 항목 (i)에서 언급된 도메인 교차 및 이에 의해 생성된 중쇄 및 경쇄 도메인 서열을 지칭하는 것이다. 따라서, VH 및 VL이 “서로에 의해 대체되는” 경우, 이는 항목 (ii)에서 언급된 도메인 교차를 지칭하고; CH1 및 CL 도메인들이 “서로에 의해 대체되고” VH 및 VL 도메인들이 “서로에 의해 대체되는” 경우, 이는 항목 (iii)에서 언급된 도메인 교차를 지칭한다. 도메인 교차를 포함하는 이중특이성 항체들은, 예컨대, WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254 및 Schaefer, W., 등, Proc. Natl. Acad. Sci USA 108 (2011) 11187-11192에 보고되어 있다. 이러한 항체들은 일반적으로 CrossMab으로 명명된다.
다중특이성 항체들은 또한 한 구체예에서 상기 항목 (i)에 언급된 CH1 및 CL 도메인의 도메인 교차, 또는 상기 항목 (ii)에 언급된 VH 및 VL 도메인의 도메인 교차, 또는 상기 항목 (iii)에 언급된 VH-CH1 및 VL-VL 도메인의 도메인 교차를 포함하는 적어도 하나의 Fab 단편을 포함한다. 도메인 교차를 가지는 다중특이성 항체의 경우, 동일한 항원(들)에 특이적으로 결합하는 Fab들은 동일한 도메인 서열이 되도록 구성된다. 그러므로, 도메인 교차를 가지는 하나 이상의 Fab가 다중특이성 항체에 포함되는 경우, 상기 Fab(들)는 동일한 항원에 특이적으로 결합한다.
“인간화” 항체는 비인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 항체를 지칭한다. 특정 구체예들에 있어서, 인간화 항체는 실질적으로 최소한 하나의, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함하는데, 이때 HVR들 (가령, CDRs)의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 비-인간 항체에 대응하며, FRs의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 최소한 일부를 포함할 수 있다. 항체의 “인간화 형태”, 가령, 비-인간 항체는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 “재조합 항체”는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 항체 (키메라, 인간화 및 인간), 예를 들어, 재조합 세포를 나타낸다. 여기에는 NS0, HEK, BHK 또는 CHO 세포와 같은 재조합 세포에서 단리된 항체가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 “항체 단편”은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자, 즉 기능적 단편을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv; Fab; Fab'; Fab'-SH; F(ab')2; 이중특이성 Fab; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자 (예컨대, scFv 또는 scFab)를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
II. 조성물 및 방법들
일반적으로, 예를 들어 치료용 폴리펩티드와 같은 관심 폴리펩티드의 재조합 대규모 생산을 위해서는 상기 폴리펩티드를 안정적으로 발현하고 분비하는 세포가 필요하다. 이러한 세포를 “재조합 세포” 또는 “재조합 생성 세포”라고 하며 이러한 세포를 생성하는 데 사용되는 과정을 “세포주 개발”이라고 한다. 세포주 개발 과정의 제1 단계에서 적절한 숙주 세포, 예를 들어, CHO 세포가 상기 관심 폴리펩티드의 발현에 적합한 핵산 서열로 형질감염된다. 제2 단계에서 관심 폴리펩티드를 안정적으로 발현하는 세포는 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산으로 공동-형질감염되었던 선별 마커의 공동-발현에 기초하여 선택된다.
폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 즉, 코딩 서열을 구조 유전자라고 한다. 이러한 구조 유전자는 단순한 정보이며, 그 발현을 위해서는 추가적인 조절 요소들이 필요하다. 따라서, 일반적으로 구조 유전자는 발현 카세트에 통합된다. 발현 카세트가 포유동물 세포에서 기능하기 위해 필요한 최소한의 조절 요소들은, 구조 유전자에 대해 상류, 즉, 5'에 위치하는 상기 포유동물 세포에서 기능하는 프로모터, 및 구조 유전자의 하류, 즉, 3'에 위치하는 상기 포유동물 세포에서 기능하는 폴리아데닐화 신호 서열이다. 상기 프로모터, 구조 유전자, 및 폴리아데닐화 신호 서열은 작동가능하게 연결된 형태로 배열된다.
관심 폴리펩티드가 상이한 (단량체) 폴리펩티드로 구성된 이종다량체 폴리펩티드인 경우, 단일 발현 카세트 뿐만 아니라 함유된 구조 유전자가 상이한 다수의 발현 카세트, 즉, 상기 이종다량체 폴리펩티드의 상이한 (단량체) 폴리펩티드 각각에 대한 하나 이상의 발현 카세트가 필요하다. 예컨대, 전장 항체는 2개의 경쇄 사본과 2개의 중쇄 사본을 포함하는 이종다량체 폴리펩티드이다. 따라서, 전장 항체는 2개의 상이한 폴리펩티드로 구성된다. 따라서, 전장 항체의 발현을 위해서는 2개의 발현 카세트가 필요하며, 하나는 경쇄용이고 다른 하나는 중쇄용이다. 만약, 예를 들어, 전장 항체가 이중특이성 항체인 경우, 즉 항체가 2개의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 상이한 결합 부위를 포함하는 경우, 경쇄 및 중쇄는 또한 서로 상이하다. 따라서, 이러한 이중특이성 전장 항체는 4개의 상이한 폴리펩티드로 구성되며 4개의 발현 카세트가 필요하다.
관심 폴리펩티드에 대한 발현 카세트(들)는 차례로 소위 “발현 벡터”에 통합된다. “발현 벡터”는 포유동물 세포에서 포함된 구조 유전자(들)의 발현뿐만 아니라 박테리아 세포들 내의 상기 벡터의 증폭을 위한 모든 필요 요소들을 제공하는 핵산이다. 통상적으로, 발현 벡터는 복제 기점을 포함하는 대장균 등의 원핵 플라스미드 증식 유닛, 및 원핵생물 선별 마커, 뿐만 아니라 진핵생물 선별 마커, 및 관심 구조 유전자(들)에 필요한 발현 카세트를 포함한다. “발현 벡터”는 포유류 세포 내에 발현 카세트를 도입하기 위한 운반 비히클이다.
전술한 단락들에서 설명된 바와 같이, 발현될 폴리펩티드가 복잡할수록, 상이한 발현 카세트의 수도 더 많이 필요하다. 본질적으로 숙주 세포의 게놈에 통합되는 핵산의 크기도 발현 카세트의 수와 함께 증가한다. 부수적으로, 발현 벡터의 크기도 증가한다. 그러나, 취급 및 처리 효율성이 크게 떨어지는 약 15kbps 범위의 벡터 크기에는 실질적인 상한이 존재한다. 이러한 사안은 2개 이상의 발현 벡터를 사용하여 처리할 수 있다. 이로써 발현 카세트는 각각이 발현 카세트들의 일부만을 포함하는 상이한 발현 벡터들 사이에 분할될 수 있다.
기존의 세포주 개발(CLD)은 관심 폴리펩티드(SOI)에 대한 발현 카세트를 운반하는 벡터들의 무작위 통합(RI)에 따른다. 일반적으로, 벡터가 무작위 접근 방식으로 형질감염되면 여러 벡터 또는 그 단편들이 세포의 게놈에 통합된다. 따라서, RI를 기반으로 하는 형질감염 과정은 예측이 안된다.
따라서, 발현 카세트들을 상이한 발현 벡터들 사이에 분할하면서 크기 문제를 처리하면, 통합된 발현 카세트의 난수 및 그 공간적 분포라는 새로운 문제가 발생한다.
일반적으로, 구조 유전자의 발현을 위한 발현 카세트가 세포의 게놈에 더 많이 통합될수록 각각의 발현된 폴리펩티드의 양이 더 많아진다. 통합된 발현 카세트의 수 외에도 통합 부위와 유전자좌도 발현 수율에 영향을 미친다. 만약, 예를 들어, 발현 카세트가 세포의 게놈 내의 전사 활성이 낮은 부위에 통합되면 인코딩된 폴리펩티드는 소량만 발현된다. 그러나, 동일한 발현 카세트가 높은 전사 활성을 갖는 세포 게놈 내의 부위에 통합되면 인코딩된 폴리펩티드가 다량으로 발현된다.
이종다량체 폴리펩티드의 상이한 폴리펩티드들에 대한 발현 카세트들이 모두 동일한 빈도로 그리고 유사한 전사 활성을 갖는 유전자좌에서 통합되는 한, 상기와 같은 발현 상의 차이는 문제를 야기하지 않는다. 이러한 상황에서 다량체 폴리펩티드의 모든 폴리펩티드는 동일한 양으로 발현되며, 다량체 폴리펩티드는 제대로 조립되게 된다.
그러나 이러한 시나리오는 가능성이 매우 낮으며, 2개 초과의 폴리펩티드로 구성된 분자에 대해 보장할 수 있는 것도 아니다. 예컨대, WO 2018/162517에는 i) 발현 카세트 서열에 따라 그리고 ii) 상이한 발현 벡터 사이의 발현 카세트들의 분포에 따라, RI를 사용하여 발현 수율 및 생성물 품질의 높은 변동이 관찰되었다고 개시되어 있다. 이러한 이론에 구속됨이 없이, 이러한 관찰은 상이한 발현 벡터들로부터 상이한 발현 카세트들이 상이한 빈도로 세포 내의 상이한 유전자좌에서 통합됨으로써 이종다량체 폴리펩티드의 상이한 폴리펩티드가 차등적인, 즉 적절하지 않은 상이한 비율의 발현을 초래한다는 사실에 기인한다. 이에 의해, 단량체 폴리펩티드의 일부는 더 많은 양으로 존재하고 나머지는 더 적은 양으로 존재한다. 이종다량체 폴리펩티드의 단량체들 사이의 이러한 불균형은 불완전 조립, 오조립 및 분비 속도 저하를 유발한다. 이전의 모든 것들은 정확하게 폴딩된 이종다량체 폴리펩티드의 더 낮은 발현 수율 및 더 높은 비율의 생성물-관련 부산물을 초래하게 된다.
기존의 RI CLD와 달리 표적화 통합(TI) CLD는 세포의 게놈의 소정의 “핫스팟”에서 상이한 발현 카세트들을 포함하는 이식유전자를 도입한다. 또한, 이러한 도입은 발현 카세트들의 정의된 비율로 이루어진다. 따라서, 이러한 이론에 구속됨이 없이, 이종다량체 폴리펩티드의 모든 상이한 폴리펩티드는 동일한(또는 적어도 유사하고 단지 약간 상이한) 비율 및 적절한 비율로 발현된다. 이로 인해, 정확하게 조립된 이종다량체 폴리펩티드의 양이 증가되어야 하고 생성물 관련 부산물의 비율이 감소되어야 한다.
또한, 정의된 복제수와 정의된 통합 부위가 주어지면, TI에 의해 얻은 재조합 세포는 RI에 의해 얻은 세포에 비해 더 나은 안정성을 가져야 한다. 더욱이, 선별 마커는 적절한 TI를 갖는 세포를 선택하는 데만 사용되며 높은 수준의 이식유전자 발현을 갖는 세포를 선택하는 데 사용되지 않기 때문에, 부분적으로는 메토트렉세이트(MTX) 또는 메티오닌 설폭시민(MSX)과 같은 선별제의 돌연변이 유발성으로 인해 서열 변이체(SV)의 가능성을 최소화하도록 돌연변이 유발이 적은 마커를 적용할 수 있다.
그러나, TI 내에 사용된 이식유전자에서 발현 카세트의 서열, 즉 발현 카세트 조직이 3가 항체 (예를 들어, TCB) 발현에 중대한 영향을 미친다는 것이 발견되었다.
본 발명은 정의된 수 및 서열의 개별적인 발현 카세트들을 갖는 특이적 발현 카세트 조직을 사용한다. 이로 인해, 포유동물 세포에서 발현되는 3가 항체 (예를 들어, TCB)의 높은 발현 수율 및 우수한 생성물 품질을 가져온다.
본 발명에 따른 발현 카세트 서열과 이식유전자의 정의된 통합을 위해 TI 방법이 사용된다. 본 발명은 2-플라스미드 재조합 효소 매개 카세트 교환(RMCE) 반응을 사용하여 재조합 포유동물 세포를 발현하는 3가 항체 (예를 들어, TCB)를 생성하는 신규한 방법을 제공한다. 개선 사항은, 무엇보다도, 정의된 서열 내 동일한 유전자좌에서의 정의된 통합에 따른 3가 항체 (예를 들어, TCB)의 높은 발현 및 생성물 관련 부산물 형성의 감소에 있다.
본 개시된 발명의 요지는 3가 항체 (예를 들어, TCB)의 안정적인 대규모 생산을 위한 재조합 포유동물 세포의 생산 방법, 뿐만 아니라 유리한 부산물 프로파일의 3가 항체 (예를 들어, TCB)의 생산성이 높은 재조합 포유동물 세포를 제공한다.
본원에서 사용된 2-플라스미드 RMCE 전략을 통해 동일한 TI 유전자좌에 다수의 발현 카세트를 삽입할 수 있다.
II.a 본 발명에 따른 이식유전자 및 방법
본원은 3가 항체 (예를 들어, TCB)를 발현하는 재조합 포유동물 세포를 기재한다. 3가 항체 (예를 들어, TCB)는 상기 포유동물 세포에 의해 자연적으로 발현되지 않는 이종다량체 폴리펩티드이다. 더욱 특히, 3가 항체 (예를 들어, TCB)는 4개의 폴리펩티드: 제1 및 제2 경쇄 그리고 제1 및 제2 중쇄로 구성된 이종이량체 단백질이다. 3가 항체 (예를 들어, TCB)의 발현을 구현하기 위해, 특이적이고 정의된 서열 내 다수의 상이한 발현 카세트를 포함하는 재조합 핵산이 포유동물 세포의 게놈 내로 통합되었다.
본원에는 3가 항체 (예를 들어, TCB)를 발현하는 재조합 포유동물 세포를 생성하는 방법 및 상기 재조합 포유동물 세포를 사용하여 3가 항체 (예를 들어, TCB)를 생성하는 방법도 보고되어 있다.
본 발명은 포유동물 세포의 게놈에 통합됨으로써, 이종다량체 3가 항체 (예를 들어, TCB), 즉 발현 카세트 조직의 발현에 필요한 상이한 발현 카세트의 서열이 3가 항체 (예를 들어, TCB)의 발현 수율에 영향을 미친다는 발견 내용에, 적어도 부분적으로, 기초한다.
본 발명은, 정의된 특이적 발현 카세트 서열이 게놈에 통합되어 있는 재조합 포유동물 세포, 예를 들어, 재조합 CHO 세포의 생산에 이중 재조합효소 매개된 카세트 교환 (RMCE)이 사용될 수 있으며, 이는 결과적으로 3가 항체 (예를 들어, TCB)의 효율적인 발현 및 생산을 가져온다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 통합은 표적화된 통합에 의해 포유동물 세포 게놈의 특정 부위에서 수행된다. 이에 의해 이종다량체 폴리펩티드의 상이한 폴리펩티드들의 서로에 대한 발현 비율을 제어하는 것이 가능하다. 이로써 결과적으로 올바르게 폴딩되어 조립된 3가 항체 (예를 들어, TCB)의 높은 수율의 효율적 발현, 올바른 조립 및 성공적 분비가 달성된다.
As 3가 항체 (예를 들어, TCB)는 이종-4량체이기 때문에, 이의 발현에 다음과 같은 적어도 4개의 상이한 발현 카세트가 필요하다: 제1 경쇄의 발현을 위한 제1, 제2 경쇄의 발현을 위한 제2, 제1 중쇄의 발현을 위한 제3 및 제2 중쇄의 발현을 위한 제4. 추가적으로, 양성 선별 마커(들)을 위한 하나 이상의 추가 발현 카세트(들)이 포함될 수 있다.
한 예에서, TI 숙주에서 생산성에 대한 발현 카세트 조직의 효과를 조사하기 위해, TCB 형태의 3가 항체의 상이한 수 및 조직의 개별 사슬들을 함유하는 2개의 플라스미드(전방 및 후방 벡터)를 형질감염시켜 RMCE 풀을 생성하였다. RMCE의 선별, 회수 및 유세포 분석에 의한 검증 후, 풀들의 생산성을 14일 유가식 생산 분석에서 평가하였다. 특정 벡터 조직들의 경우 참조 풀과 비교하여 역가의 증가가 관찰되었다.
5가지 상이한 TCB의 발현에 대한 항체 사슬 발현 카세트 조직의 효과를 평가하였다. TCB 1 내지 5는 모두 상이한 표적화 특이성을 가졌다. TCB 3은 4개의 상이한 항-CD3 결합 부위로 테스트되었다.
TCB-1에 대해 다음과 같은 결과를 얻었다; 참조 조직은 회색으로 음영처리됨, k = 놉 돌연변이를 가진 중쇄; h = 홀 돌연변이를 가진 중쇄; l = 경쇄; xl = 도메인 교환을 가진 경쇄:
MP = 주 생성물, eff. titer = 유효 역가 = 주 생성물%를 곱한 역가
본 발명은 아래와 같이 요약된다.
본 발명에 따른 한 독립적인 양상은 3가 항체를 생성하기 위한 방법으로서 다음 단계들을 포함하고:
a) 3가 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 단계, 및
b) 세포 또는 배양 배지로부터 3가 항체를 회수하는 단계,
이때 3가 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 포유동물 세포의 게놈에 안정적으로 통합되고 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함한다:
(1)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
또는 (2)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는 (3)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
또는 (4)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는 (5)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제7 발현 카세트,
또는 (6)
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트.
3가 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산의, 포유동물 세포 게놈으로의 안정한 통합은 발현 카세트들의 특정 서열이 유지되는 한 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 한 독립적인 양상은 3가 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산으로서 5'-에서 3'-방향으로 다음을 포함한다:
(1)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
또는 (2)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는 (3)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
또는 (4)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는 (5)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제7 발현 카세트,
또는 (6)
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트.
본 발명에 따른 한 독립적인 양상은 포유동물 세포에서 3가 항체의 발현을 위한, 데옥시리보핵산의 용도로서 5'-에서 3'-방향으로 다음을 포함한다:
(1)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
또는 (2)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는 (3)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
또는 (4)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는 (5)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제7 발현 카세트,
또는 (6)
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트.
본 발명에 따른 한 독립적인 양상은 세포의 게놈에 통합된 3가 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하는 재조합 포유동물 세포이며,
이때 3가 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함한다:
(1)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
또는 (2)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는 (3)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
또는 (4)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는 (5)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제7 발현 카세트,
또는 (6)
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트.
본 발명에 따른 한 독립적인 양상은 3개의 상이한 재조합 인식 서열 및 5 내지 7개의 발현 카세트를 차례로 포함하는, 2개의 데옥시리보핵산을 포함하는 조성물로서, 여기서
- 제1 데옥시리보핵산은 5'-에서 3'-방향으로 다음을 포함하고:
(1)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (2)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (3)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (4)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (5)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (6)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
그리고
- 제2 데옥시리보핵산은 5'-에서 3'-방향으로 다음을 포함한다:
(1)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (2)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (3)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (4)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (5)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제7 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (6)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열.
한 구체예에서 제1 및 제2 데옥시리보핵산은 둘 모두 (1)에 따른 조직을 포함하고; 또는 제1 및 제2 데옥시리보핵산 둘 모두 (2)에 따른 조직을 포함하고; 또는 제1 및 제2 데옥시리보핵산은 둘 모두 (3)에 따른 조직을 포함하고; 또는 제1 및 제2 데옥시리보핵산은 둘 모두 (4)에 따른 조직을 포함하고; 또는 제1 및 제2 데옥시리보핵산은 둘 모두 (5)에 따른 조직을 포함하고; 또는 제1 및 제2 데옥시리보핵산은 둘 모두 (6)에 따른 조직을 포함한다.
본 발명에 따른 한 독립적인 양상은 3가의 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하고 3가의 항체를 분비하는 재조합 포유동물 세포를 생산하는 방법으로서, 다음 단계를 포함한다:
a) 포유동물 세포의 게놈 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 세포를 제공하는 단계, 이때 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 제1 선별 마커에 연접하는 제1 및 제2 재조합 인식 서열, 및 제1 및 제2 재조합 인식 서열 사이에 위치한 제3 재조합 인식 서열을 포함하고, 모든 재조합 인식 서열은 상이하며;
b) a)에서 제공된 세포에 3개의 상이한 재조합 인식 서열 및 5 내지 7개의 발현 카세트를 포함하는 2개의 데옥시리보핵산 조성물을 도입하는 단계, 이때
- 제1 데옥시리보핵산은 5'-에서 3'-방향으로 다음을 포함하고:
(1)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (2)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (3)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (4)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (5)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (6)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
그리고
- 제2 데옥시리보핵산은 5'-에서 3'-방향으로 다음을 포함한다:
(1)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (2)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (3)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (4)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (5)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제7 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (6)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
이때 제1 및 제2 데옥시리보핵산의 제1 내지 제3 재조합 인식 서열은 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상의 제1 내지 제3 재조합 인식 서열과 일치하고,
이때 하나의 제2 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 5'-말단 부분 및 3'-말단 부분은 함께 하나의 제2 선별 마커의 기능적 발현 카세트를 형성하고;
c) i) b)의 제1 및 제2 데옥시리보핵산과 동시에;
또는
ii) 이후 순차적으로
하나 이상의 재조합효소를 도입하는 단계,
이때 하나 이상의 재조합효소는 제1 및 제2 데옥시리보핵산의 재조합 인식 서열을 인식하고; (그리고 선택적으로 하나 이상의 재조합효소는 2개의 재조합효소 매개 카세트 교환을 수행하고;)
그리고
d)
제2 선별 마커를 발현하고 3가 항체를 분비하는 세포를 선택하는 단계,
이로써, 3가 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하고 3가 항체를 분비하는 재조합 포유동물 세포를 생산한다.
한 구체예에서 제1 및 제2 데옥시리보핵산은 둘 모두 (1)에 따른 조직을 포함하고; 또는 제1 및 제2 데옥시리보핵산 둘 모두 (2)에 따른 조직을 포함하고; 또는 제1 및 제2 데옥시리보핵산은 둘 모두 (3)에 따른 조직을 포함하고; 또는 제1 및 제2 데옥시리보핵산은 둘 모두 (4)에 따른 조직을 포함하고; 또는 제1 및 제2 데옥시리보핵산은 둘 모두 (5)에 따른 조직을 포함하고; 또는 제1 및 제2 데옥시리보핵산은 둘 모두 (6)에 따른 조직을 포함한다.
본 발명의 모든 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들 중 한 구체예에서 3가 이중특이성 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 표적화 통합에 의해 포유동물 세포 게놈 내 단일 유전자좌에 안정하게 통합된다.
본 발명의 모든 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들 중 한 구체예에서 3가 이중특이성 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 단일 또는 이중 재조합효소-매개 카세트 교환 반응에 의해 포유동물 세포 게놈 내 단일 유전자좌에 안정하게 통합된다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 제1 중쇄는 CH3 도메인에 돌연변이 T366W (Kabat에 따른 넘버링)를 포함하고 제2 중쇄는 CH3 도메인에 돌연변이 T366S, L368A, 및 Y407V (Kabat에 따른 넘버링)를 포함하고, 또는 그 역이다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 중쇄 중 하나는 돌연변이 S354C를 추가로 포함하고 각각의 다른 중쇄는 돌연변이 Y349C (Kabat에 따른 넘버링)를 포함한다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 제1 중쇄는 또 다른 도메인 교환된 Fab 단편을 포함하는 연장된 중쇄이다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 제1 경쇄는 도메인 교환된 경쇄 VH-VL 또는 CH1-CL이다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서
- 제1 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 제1 경쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제2 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제1 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 중쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고, 및
- 제2 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고,
이때 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고 제2 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서
- 제1 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 제2 중쇄 가변 도메인, CL 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제2 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제1 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 경쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고, 및
- 제2 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고,
이때 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고 제2 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 데옥시리보핵산은 단일 부위 또는 유전자좌에서 포유동물 세포의 게놈에 안정하게 통합된다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 3가 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 선별 마커를 인코딩하는 추가 발현 카세트를 포함한다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트는 제3 재조합 인식 서열에 대해 일부분 5' 및 일부분 3'에 위치하며, 상기 발현 카세트의 5'-위치 부분은 프로모터 및 개시-코돈을 포함하고 상기 발현 카세트의 3'-위치 부분은 폴리A 신호 및 개시 코돈이 없는 코딩 서열을 포함하고, 이때 개시 코돈은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 5'-위치 부분은 개시 코돈에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고, 이에 의해 프로모터 서열은 상류에서 제3 발현 카세트에 연접되고 개시 코돈은 하류에서 제3 재조합 인식 서열에 연접되고; 그리고 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 3'-위치 부분은 개시 코돈이 없는 선별 마커를 인코딩하는 핵산을 포함하며 상류에서 제3 재조합 인식 서열에 연접되고 하류에서 제4 발현 카세트에 연접되며, 이때 개시 코돈은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서
항체 사슬에 대한 각 발현 카세트는 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 항체 사슬을 인코딩하는 핵산, 폴리아데닐화 신호 서열 및 선택적으로 종결인자 서열을 포함하고,
그리고
선별 마커를 인코딩하는 각각의 발현 카세트는 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 선별 마커를 인코딩하는 핵산, 및 폴리아데닐화 신호 서열 및 선택적으로 종결인자 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 프로모터는 인트론 A를 갖는 인간 CMV 프로모터이고, 폴리아데닐화 신호 서열은 bGH 폴리아데닐화 신호 서열이고, 종결인자는 선별 마커의 발현 카세트를 제외한 hGT 종결인자이고, 이때 프로모터는 SV40 프로모터이고 폴리아데닐화 신호 서열은 SV40 폴리아데닐화 신호 서열이고 종결인자는 없다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 포유동물 세포는 CHO 세포이다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 5'에서 3'- 방향으로의 조직이 제1 발현 카세트로서 제1 중쇄를 인코딩하는 발현 카세트를 갖는 경우 모든 카세트는 단방향으로 배열된다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 5'-에서 3'-방향의 구조가 제1 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트, 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트, 제1 중쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트, 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 또는 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트인 경우, 제1 내지 제3 발현 카세트는 단방향으로 배열되고 제4 내지 제6 발현 카세트는 단방향으로 배열되고 이로써 제1 내지 제3 발현 카세트는 제4 내지 제6 발현 카세트의 반대 방향으로 배열된다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트는 제3 재조합 인식 서열에 대해 일부분 5' 및 일부분 3'에 위치하며, 상기 발현 카세트의 5'-위치 부분은 프로모터 및 개시-코돈을 포함하고 상기 발현 카세트의 3'-위치 부분은 폴리A 신호 및 개시 코돈이 없는 코딩 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 5'-위치 부분은 개시 코돈에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고, 이에 의해 프로모터 서열은 상류에서 제2 발현 카세트에 연접되고 (즉, 제2 발현 카세트에 대해 하류에 위치) 개시 코돈은 하류에서 제3 재조합 인식 서열에 연접되고 (즉, 제3 재조합 인식 서열의 상류에 위치); 그리고 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 3'-위치 부분은 폴리아데닐화 서열에 작동가능하게 연결된 개시 코돈이 없는 선별 마커를 인코딩하는 핵산을 포함하며 상류에서 제3 재조합 인식 서열에 연접되고 하류에서 제3 발현 카세트에 연접된다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 개시 코돈은 번역 개시 코돈이다. 한 구체예에서 개시 코돈은 ATG이다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 제1 데옥시리보핵산은 제1 벡터에 통합되고 제2 데옥시리보핵산은 제2 벡터에 통합된다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 발현 카세트 각각은 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하고, 선택적으로 종결인자 서열이 후속되며, 이들은 모두 서로 작동가능하게 연결된다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 포유동물 세포는 CHO 세포이다. 한 구체예에서 CHO 세포는 CHO-K1 세포이다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 재조합효소 인식 서열은 L3, 2L 및 LoxFas이다. 한 구체예에서 L3는 서열 번호: 01의 서열을 가지고, 2L은 서열 번호: 02의 서열을 가지며 LoxFas는 서열 번호: 03의 서열을 가진다. 한 구체예에서, 제1 재조합효소 인식 서열은 L3이고, 제2 재조합효소 인식 서열은 2L이고, 제3 재조합효소 인식 서열은 LoxFas이다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 프로모터는 인트론 A를 갖는 인간 CMV 프로모터이고, 폴리아데닐화 신호 서열은 bGH 폴리A 부위이고 종결인자 서열은 hGT 종결인자이다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 프로모터는 인트론 A를 갖는 인간 CMV 프로모터이고, 상기 폴리아데닐화 신호 서열은 bGH 폴리A 부위이고, 상기 종결인자 서열은 상기 선별 마커들)의 발현 카세트(들)를 제외한 hGT 종결인자이며, 여기서 상기 프로모터는 SV40 프로모터이고 상기 폴리아데닐화 신호 서열은 SV40 폴리A 부위이며, 종결인자 서열은 존재하지 않는다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 인간 CMV 프로모터는 서열 번호: 04의 서열을 가진다. 한 구체예에서 인간 CMV 프로모터는 서열 번호: 06의 서열을 갖는다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 bGH 폴리아데닐화 신호 서열은 서열 번호: 08이다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 hGT 종결인자는 서열 번호: 09의 서열을 가진다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 SV40 프로모터는 서열 번호: 10의 서열을 가진다.
본 발명에 따른 각 독립적인 양상들 및 모든 종속적인 구체예들의 한 종속적 구체예에서 SV40 폴리아데닐화 신호 서열은 서열 번호: 07이다.
본 발명에 따른 모든 양상 및 구체예들의 한 구체예에서 3가 항체는 치료 항체이다.
본 발명에 따른 모든 양상 및 구체예들의 한 구체예에서 3가 이중특이성 (치료) 항체 (TCB)는 다음을 포함하고:
- 제1 및 제2 Fab 단편, 여기서 제1 및 제2 Fab 단편의 각각의 결합 부위는 제2 항원에 특이적으로 결합하고,
- 제3 Fab 단편, 이때 제3 Fab 단편의 결합 부위는 제1 항원에 특이적으로 결합하고, 제3 Fab 단편은 가변 경쇄 도메인(VL) 및 가변 중쇄 도메인(VH)이 서로 대체되는 도메인 교차를 포함하고, 및
- 제1 Fc-영역 폴리펩티드 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 Fc-영역,
이때 제1 및 제2 Fab 단편은 각각 중쇄 단편 및 전장 경쇄를 포함하고,
이때 제1 Fab 단편의 중쇄 단편의 C-말단은 제1 Fc-영역 폴리펩티드의 N-말단에 융합되고,
이때 제2 Fab 단편의 중쇄 단편의 C-말단은 제3 Fab 단편의 가변 경쇄 도메인의 N-말단에 융합되고 제3 Fab 단편의 중쇄 불변 도메인 1의 C-말단은 제2 Fc-영역 폴리펩티드의 N-말단에 융합된다.
본 발명에 따른 모든 양상 및 구체예들의 한 구체예에서 3가 항체는 항-CD3/CD20 이중특이성 항체이다. 한 구체예에서 항-CD3/CD20 이중특이성 항체는 TCB이고 CD20은 제2 항원이다. 한 구체예에서 이중특이성 항-CD3/CD20 항체는 RG6026이다. 이러한 항체는 WO 2016/020309에 보고되어 있으며, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명에 따른 모든 양상 및 구체예들의 한 구체예에서 3가 항체는 항-CD3/CEA 이중특이성 항체이다. 한 구체예에서 항-CD3/CEA 이중특이성 항체는 TCB이고 CEA는 제2 항원이다. 한 구체예에서 이중특이성 항-CD3/CEA 항체는 RO6958688 또는 RG7802 또는 시비사타맙이다. 이러한 항체는 WO 2017/055389에 보고되어 있으며, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
II.b 재조합효소 매개 카세트 교환(RMCE)
표적화 통합은 외인성 뉴클레오티드 서열이 숙주 세포 게놈의 예정된 부위에 통합될 수 있게 한다. 특정 구체예에서, 표적화 통합은 하나 이상의 재조합 인식 서열 (RRS)을 인식하는 재조합효소에 의해 매개된다. 특정 구체예에서, 표적화 통합은 상동성 재조합에 의해 매개된다.
“재조합 인식 서열” (RRS)은 재조합효소에 의해 인식되는 뉴클레오티드 서열이며 재조합효소-매개 재조합 이벤트에 필요충분하다. RRS를 사용하여 뉴클레오티드 서열에서 재조합 발생이 일어날 위치를 정의할 수 있다.
특정 구체예들에서, RRS는 LoxP 서열, LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, Lox66 서열, FRT 서열, Bxb1 attP 서열, Bxb1 attB 서열, 
C31 attP 서열, 및 
C31 attB 서열로 구성된 그룹에서 선택된다. 여러 RRS를 선택해야 하는 경우, 동일하지 않은 RRS가 선택되는 한, 각 서열들의 선택은 다른 서열에 따라 달라진다.
특정 구체예들에서, RRS는 Cre 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정 구체예들에서, RRS는 FLP 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정 구체예들에서, RRS는 Bxb1 통합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정 구체예들에서, RRS는 
C31 통합효소에 의해 인식될 수 있다.
특정 구체예들에서 RRS가 LoxP 부위인 경우 숙주 세포는 재조합을 수행하기 위해 Cre 재조합효소를 필요로 한다. 특정 구체예들에서 RRS가 FRT 부위인 경우 숙주 세포는 재조합을 수행하기 위해 FLP 재조합효소를 필요로 한다. 특정 구체예들에서 RRS가 Bxb1 attP 또는 Bxb1 attB 부위인 경우 숙주 세포는 재조합을 수행하기 위해 Bxb1 통합효소를 필요로 한다. 특정 구체예들에서 RRS가 
C31 attP 또는 
C31attB 부위인 경우 숙주 세포는 재조합을 수행하기 위해 
C31 통합효소를 필요로 한다. 재조합효소들은 효소의 인코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 사용하여 숙주 세포로 도입될 수 있다.
Cre-LoxP 부위-특이적 재조합 시스템은 많은 생물학적 실험 시스템에서 널리 사용되어 왔다. Cre는 34bp LoxP 서열들을 인식하는 38kDa의 부위-특이적 DNA 효소이다. Cre는 박테리오파지 P1에서 파생되며 티로신 패밀리 부위-특이적 재조합효소에 속한다. Cre 재조합효소는 LoxP 서열들 사이의 분자내 및 분자간 재조합을 매개 할 수 있다. LoxP 서열은 2개의 13bp 역상 반복부가 연접되어 있는 8bp 비-회문식 코어 영역으로 구성된다. Cre 재조합효소는 13bp 반복부에 결합함으로써, 8bp 코어 영역 내부에서 재조합을 매개한다. Cre-LoxP 매개 재조합은 고효율로 발생하며 임의의 다른 숙주 인자들을 필요로 하지 않는다. 2개의 LoxP 서열들이 동일한 뉴클레오티드 서열상에 동일한 방향으로 배치되는 경우, Cre-매개 재조합은 이러한 2개 LoxP 서열들 사이에 위치한 DNA 서열들을 공유결합적으로 폐쇄된 원형으로서 절제할 것이다. 2개의 LoxP 서열들이 동일한 뉴클레오티드 서열 상의 역상 위치에 배치되는 경우, Cre-매개 재조합은 2개 서열들 사이에 위치한 DNA 서열들의 방향을 반전시킨다. 2개의 LoxP 서열들이 두 개의 상이한 DNA 분자들 상에 존재하고 하나의 DNA 분자가 원형인 경우, Cre-매개 재조합은 원형 DNA 서열을 통합시킨다.
특정 구체예들에서, LoxP 서열은 야생형 LoxP 서열이다. 특정 구체예들에서, LoxP 서열은 돌연변이 LoxP 서열이다. Cre-매개 통합 또는 대체의 효율성을 증가시키기 위한 돌연변이 LoxP 서열들이 개발되었다. 특정 구체예들에서, 돌연변이 LoxP 서열은 LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, 및 Lox66 서열로 구성된 그룹에서 선택된다. 예를 들어, Lox71 서열은 왼쪽 13bp 반복부에 5bp 돌연변이를 가진다. Lox66 서열은 오른쪽 13bp 반복부에 5bp 돌연변이를 가진다. 야생형 및 돌연변이 LoxP 서열들은 모두 Cre-의존성 재조합을 매개 할 수 있다.
“매칭 RRS”라는 용어는 두 RRS간에 재조합이 발생함을 나타낸다. 특정 구체예들에서, 2개의 매칭 RRS는 동일하다. 특정 구체예들에서, 두 RRS 모두는 야생형 LoxP 서열들이다. 특정 구체예들에서, 두 RRS 모두는 돌연변이체 LoxP 서열들이다. 특정 구체예들에서, 두 RRS 모두는 야생형 FRT 서열들이다. 특정 구체예들에서, 두 RRS 모두는 돌연변이 FRT 서열들이다. 특정 구체예들에서, 2개의 매칭 RRS는 상이한 서열들이지만 동일한 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정 구체예들에서, 제 1 매칭 RRS는 Bxb1 attP 서열이고 제 2 매칭 RRS는 Bxb1 attB 서열이다. 특정 구체예들에서, 제 1 매칭 RRS는 
C31 attP 서열이고 제 2 매칭 RRS는 
C31 attB 서열이다.
II.c TI에 적합한 예시적인 포유동물 세포
상기 기재된 바와 같은 외인성 핵산(“랜딩 부위”)을 포함하는 TI에 적합한 어떠한 공지된 또는 공지될 포유동물 세포가 본 발명에서 사용될 수 있다.
본 발명은 이전 표제에 따른 외인성 핵산(랜딩 부위)을 포함하는 CHO 세포로 예시된다. 이는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며 어떤 식으로든 제한으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 진정한 범위는 청구범위에 제시되어 있다.
한 바람직한 구체예에서, 포유동물 세포의 게놈 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 세포는 CHO 세포이다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 게놈의 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 예시적인 포유동물 세포는, Cre 재조합효소 매개 DNA 재조합을 위한 3개의 이종특이성 loxP 부위를 포함하는 랜딩 부위(= 포유동물 세포의 게놈 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열)를 보유하는 CHO 세포이다. 이러한 이종특이성 loxP 부위는 L3, LoxFas 및 2L이며 (예를 들어, Lanza 등, Biotechnol. J. 7 (2012) 898-908; Wong 등, Nucleic Acids Res. 33 (2005) e147 참조), 여기서 L3 및 2L 각각 5'- 말단과 3'- 말단에서 랜딩 부위에 연접하며 LoxFas는 L3와 2L 부위 사이에 위치한다. 랜딩 부위는 IRES를 통한 선별 마커의 발현을 형광 GFP 단백질의 발현과 연결하는 바이시스트론 단위를 추가로 포함하여, 양성 선택에 의한 랜딩 부위를 안정화할 수 있을 뿐만 아니라 형질감염 및 Cre 재조합(음성 선택) 후 상기 부위의 부재에 대해 선택할 수 있다. 녹색 형광 단백질(GFP)은 RMCE 반응을 모니터링하는 역할을 한다. 예시적인 GFP는 서열 번호: 11의 서열을 가진다.
이전 단락에서 개괄된 랜딩 부위의 이러한 구성을 통해, L3 및 LoxFas 부위를 갖는 소위 전방 벡터와 LoxFas 및 2L 부위를 포함하는 후방 벡터의 두 벡터의 동시적인 통합이 가능하다. 랜딩 부위에 존재하는 것과 상이한 선별 마커 유전자의 기능적 요소들은 두 벡터 사이에 분포되어 있다: 프로모터와 개시 코돈은 전방 벡터에 위치하는 반면 코딩 영역과 폴리 A 신호는 후방 벡터에 위치한다. 두 벡터로부터의 상기 핵산의 정확한 Cre-매개 통합만이 각각의 선별제에 대한 내성을 유도한다.
일반적으로, TI에 적합한 포유동물 세포는 포유동물 세포의 게놈 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 세포이고, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 제1 선별 마커에 연접하는 적어도 제1 및 제2 재조합 인식 서열, 및 상기 제1 및 제2 재조합 인식 서열 사이에 위치하는 제3 재조합 인식 서열을 포함하고, 상기 모든 재조합 인식 서열은 상이하다. 상기 외인성 뉴클레오티드 서열을 “랜딩 부위”라고 한다.
본원에 개시된 발명의 요지는 외인성 뉴클레오티드 서열의 TI에 적합한 포유동물 세포를 사용한다. 특정 실시예들에서, TI에 적합한 포유동물 세포는 포유동물 세포의 게놈의 통합 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. TI에 적합한 이러한 포유동물 세포는 TI 숙주 세포를 의미할 수도 있다.
특정 실시예들에서, TI에 적합한 포유동물 세포는 랜딩 부위를 포함하는 햄스터 세포, 인간 세포, 랫트 세포, 또는 마우스 세포이다. 특정 실시예들에서, TI에 적합한 포유동물 세포는 랜딩 부위를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, CHO K1 세포, CHO K1SV 세포, CHO DG44 세포, CHO DUKXB-11 세포, CHO K1S 세포, 또는 CHO K1M 세포이다.
특정 구체예들에서, TI에 적합한 포유동물 세포는 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이 때 외인성 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 재조합 인식 서열 (RRS)을 포함한다. 특정 구체예들에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 2개의 RRS를 포함한다. RRS는 재조합효소, 예를 들어, Cre 재조합효소, FLP 재조합효소, Bxb1 통합효소, 또는 
C31 통합효소에 의해 인식될 수 있다. RRS는 LoxP 서열, LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, Lox66 서열, FRT 서열, Bxb1 attP 서열, Bxb1 attB 서열, 
C31 attP 서열, 및 
C31 attB 서열로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다.
특정 구체예들에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 제 1, 제 2 및 제 3 RRS, 그리고 제 1 및 제 2 RRS 사이에 위치한 적어도 하나의 선별 마커를 포함하고, 제 3 RRS는 제 1 및/또는 제 2 RRS와 상이하다. 특정 구체예들에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 제 2 선별 마커를 추가로 포함하며, 제 1 및 제 2 선별 마커는 상이하다. 특정 구체예들에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 제 3 선별 마커 및 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 추가로 포함하며, 여기서 IRES는 제 3 선별 마커에 작동가능하게 연결된다. 제3 선별 마커는 제1 또는 제2 선별 마커와 상이할 수 있다.
선별 마커(들)은 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 (APH) (예컨대, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HYG), 네오마이신 및 G418 APH), 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 티미딘 키나제 (TK), 글루타민 합성효소 (GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소 (인돌), 히스티딘올 탈수소효소 (히스티딘올 D) 및 퓨로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 및 마이코페놀산에 대한 내성을 인코딩하는 유전자로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다. 선별 마커(들)는 녹색 형광 단백질(GFP), 강화 GFP(eGFP), 합성 GFP, 황색 형광 단백질(YFP), 강화 YFP(eYFP), 시안 형광 단백질(CFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-red, DsRed-단량체, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald6, CyPet, mCFPm, Cerulean 및 T-Sapphire으로 구성된 군에서 선택되는 형광 단백질일 수도 있다.
특정 구체예들에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 제 1, 제 2, 및 제 3 RRS, 제 1 및 제 3 RRS 사이에 위치한 적어도 하나의 선별 마커를 포함한다.
외인성 뉴클레오티드 서열은 특정 세포에서 유래하지 않지만 DNA 전달 방법, 예를 들어 형질감염, 전기천공 또는 형질전환 방법에 의해 상기 세포 내로 도입될 수 있는 뉴클레오티드 서열이다. 특정 실시예들에서, TI에 적합한 포유동물 세포는 포유동물 세포의 게놈에서 하나 이상의 통합 부위에 통합된 적어도 하나의 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구체예들에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 TI 숙주 세포 게놈의 특정 유전자좌 내부의 하나 이상의 통합 부위에 통합된다.
특정 구체예들에서, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 재조합 인식 서열 (RRS)을 포함하며, 여기서 RRS는 재조합효소에 의해 인식 될 수 있다. 특정 구체예들에서, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 2개의 RRS를 포함한다. 특정 구체예들에서, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 3개의 RRS를 포함하고, 이 때 제 3 RRS는 제 1 및 제 2 RRS 사이에 위치한다. 특정 구체예들에서, 제1 및 제2 RRS는 동일하고 제3 RRS는 제1 또는 제2 RRS와 상이하다. 특정 바람직한 구체예에서, 3개의 RRS는 모두 상이하다. 특정 구체예들에서, RRS는 LoxP 서열, LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, Lox66 서열, FRT 서열, Bxb1 attP 서열, Bxb1 attB 서열, 
C31 attP 서열, 
C31 attB 서열로 구성된 그룹에서 서로 독립적으로 선택된다.
특정 구체예들에서, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 선별 마커를 포함한다. 특정 구체예들에서, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 제 1, 제 2 및 제 3 RRS, 및 적어도 하나의 선별 마커를 포함한다. 특정 구체예들에서, 선별 마커는 제1 및 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정 구체예들에서, 2개의 RRS들에는 적어도 하나의 선별 마커가 연접된다, 즉, 제1 RRS는 선별 마커의 5' (상류)에 위치하고 제2 RRS는 3' (하류)에 위치한다. 특정 구체예들에서, 제1 RRS는 선별 마커의 5'-단부에 인접하고 제2 RRS는 선별 마커의 3'-단부에 인접한다.
특정 구체예들에서, 선별 마커는 제 1 및 제 2 RRS 사이에 위치하며 이들 2개의 연접 RRS들은 상이하다. 특정 구체예들에서, 제1 연접 RRS는 LoxP L3 서열이고 제2 연접 RRS는 LoxP 2L 서열이다. 특정 구체예들에서, LoxP L3 서열은 선별 마커의 5'에 위치하고 LoxP 2L 서열은 선별 마커의 3'에 위치한다. 특정 구체예들에서, 제1 연접 RRS는 야생형 FRT 서열이고 제2 연접 RRS는 돌연변이체 FRT 서열이다. 특정 구체예들에서, 제1 연접 RRS는 Bxb1 attP 서열이고 제2 연접 RRS는 Bxb1 attB 서열이다. 특정 구체예들에서, 제1 연접 RRS는 
C31 attP 서열이고 제2 연접 RRS는 
C31 attB 서열이다. 특정 구체예들에서, 2개의 RRS는 동일한 방향으로 배치된다. 특정 구체예들에서, 2개의 RRS는 모두 정 또는 역방향으로 존재한다. 특정 구체예들에서, 2개의 RRS는 반대 방향으로 배치된다.
특정 구체예들에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 2개의 RRS가 연접된 제1 및 제2 선별 마커를 포함하고, 여기서 제1 선별 마커는 제2 선별 마커와 상이하다. 특정 구체예들에서, 2개의 선별 마커들은 모두 글루타민 합성효소 선별 마커, 티미딘 키나제 선별 마커, HYG 선별 마커, 및 퓨로마이신 내성 선별 마커로 구성된 그룹에서 선택된다. 특정 구체예들에서, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 티미딘 키나제 선별 마커 및 HYG 선별 마커를 포함한다. 특정 구체예들에서, 제1 선별 마커는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 (APH) (예컨대, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HYG), 네오마이신 및 G418 APH), 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 티미딘 키나제 (TK), 글루타민 합성효소 (GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소 (인돌), 히스티디놀 탈수소효소 (히스티디놀 D)에 대한 유전자 및 퓨로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 및 마이코페놀산에 대한 내성을 부호화하는 유전자로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다. 특정 구체예들에서, 제1 선별 마커는 글루타민 합성효소 선별 마커이고 제2 선별 마커는 GFP 마커이다. 특정 구체예들에서, 두 선별 마커 모두가 연접되는 2개의 RRS는 상이하다.
특정 구체예들에서, 선별 마커는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 특정 구체예들에서, 선별 마커는 SV40 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 특정 구체예들에서, 선별 마커는 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
특정 구체예들에서, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 3개의 RRS를 포함한다. 특정 구체예들에서, 제 3 RRS는 제 1 및 제 2 RRS 사이에 위치한다. 특정 구체예들에서, 제1 및 제2 RRS는 동일하고 제3 RRS는 제1 또는 제2 RRS와 상이하다. 특정 바람직한 구체예에서, 3개의 RRS는 모두 상이하다.
II.d 본 발명을 실시하기에 적합한 벡터 예시
상기 개괄한 “단일 벡터 RMCE” 이외에도 신규한 “2-벡터 RMCE”를 수행하여 두 핵산의 동시 표적화 통합을 수행할 수 있다.
“2-벡터 RMCE” 전략은 본 발명에 따른 벡터 조합을 사용하여 본 발명에 따른 방법에서 사용된다. 예를 들어, 제한은 아니지만, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 3개의 RRS를, 예컨대, 제3 RRS (“RRS3”)가 제1 RRS (“RRS1”) 및 제2 RRS (“RRS2”) 사이에 존재하는 배열로 포함할 수 있으며, 동시에 제1 벡터는 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열 상의 제1 및 제3 RRS에 매칭되는 2개의 RRS를 포함하고, 제2 벡터는 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열 상의 제3 및 제2 RRS에 매칭되는 2개의 RRS를 포함한다. 2 벡터 RMCE 전략의 한 예가 도 1에 도시되어 있다. 이러한 2개의 벡터 RMCE 전략을 통해, TI에 적합한 포유동물 세포의 게놈에서 TI 이후에 본 발명에 따른 발현 카세트 조직이 수득될 수 있도록 RRS들의 각 쌍들 사이의 각각의 서열에 적절한 수의 SOI를 통합시킴으로써 다수 SOI의 도입이 가능하다.
2-플라스미드 RMCE 전략은 3개의 RRS 부위를 사용하여 2회의 독립 RMCE를 동시에 실시하는 것을 포함한다 (도 1). 따라서 2-플라스미드 RMCE 전략을 사용하는 TI에 적합한 포유동물 세포의 랜딩 부위는 제1 RRS 부위(RRS1) 또는 제2 RRS 부위(RRS2)와 교차 활성이 없는 제3 RRS 부위(RRS3)를 포함한다. 표적화되는 2개의 발현 플라스미드는 효율적인 표적화를 위해 동일한 연접 RRS 부위들을 필요로 하는데, 하나의 발현 플라스미드 (전방)는 RRS1 및 RRS3가 연접되고 다른 하나 (후방)는 RRS3 및 RRS2가 연접된다. 또한, 2-플라스미드 RMCE에는 2개의 선별 마커들이 필요하다. 1개의 선별 마커 발현 카세트를 2 부분으로 나누었다. 전방 플라스미드는 프로모터 및 이에 이어 개시 코돈 및 RRS3 서열을 포함한다. 후방 플라스미드는 개시 코돈(ATG)이 없는 선별 마커 코딩 영역의 N-말단에 융합된 RRS3 서열을 가질 것이다. 추가적인 뉴클레오티드는 융합 단백질, 즉 작동 가능한 연결에 대한 프레임 내 번역을 보장하기 위해 RRS3 부위와 선별 마커 서열 사이에 삽입될 필요가 있을 수 있다. 두 플라스미드가 모두 정확하게 삽입된 경우에만 선별 마커의 전체 발현 카세트가 조립되어, 세포가 각 선별 제제에 내성을 갖게 된다. 도 1은 2-플라스미드 RMCE 전략을 보여주는 개략도이다.
단일 벡터 및 2-벡터 RMCE 모두를 통해, 공여자 DNA에 존재하는 DNA 서열을 통합 부위가 존재하는 포유동물 세포의 게놈 내 DNA 서열과 정확하게 교환하여 포유동물 세포 게놈의 예정된 부위에 하나 이상의 공여자 DNA 분자(들)을 단방향 통합할 수 있게 된다. 이들 DNA 서열은 i) 적어도 하나의 선별 마커 또는 특정 2-벡터 RMCE에서 “분할 선별 마커” 및/또는 ii) 적어도 하나의 외인성 SOI에 연접한 2개의 이종특이성 RRS를 특징으로 한다.
RMCE는 표적 게놈 유전자좌 내부의 2개의 이종특이적 RRS와 공여자 DNA 분자 사이에 재조합효소에 의해 촉매되는 이중 재조합 교차 사건들을 포함한다. RMCE는 전방 및 후방 벡터로부터의 DNA 서열 사본을 포유동물 세포 게놈의 예정된 유전자좌로 조합하여 도입하도록 설계된다. 교차 사건을 단 하나만 포함하는 재조합과 달리, RMCE는 원핵 벡터 서열이 숙주 세포 게놈에 도입되지 않도록 실시되어 원치 않는 숙주 면역 또는 방어 메커니즘 촉발을 감소 및/또는 방지할 수 있다. RMCE 절차는 다수의 DNA 서열들을 사용하여 반복될 수 있다.
표적화 통합은 2개의 RMCE에 의해 달성되며, 여기서 이종다량체 폴리펩티드의 일부 및/또는 2개의 이종특이성 RRS가 연접된 적어도 하나의 선별 마커 또는 그 일부를 인코딩하는 적어도 하나의 발현 카세트를 각각 포함하는 2개의 상이한 DNA 서열 모두가 TI에 적합한 포유동물 세포 게놈의 예정된 부위에 통합된다. 특정 실시예들에서, 표적화 통합은 다수의 RMCE에 의해 달성되며, 여기서 이종다량체 폴리펩티드의 일부 및/또는 2개의 이종특이성 RRS가 연접된 적어도 하나의 선별 마커 또는 그 일부를 인코딩하는 적어도 하나의 발현 카세트를 각각 포함하는, 다수의 벡터로부터의 DNA 서열 모두가 TI에 적합한 포유동물 세포 게놈의 예정된 부위에 통합된다. 특정 구체예에서, 선별 마커는 제1 벡터 상에 부분적으로 인코딩되고 제2 벡터 상에 부분적으로 인코딩되어, 이중 RMCE에 의한 둘 모두의 정확한 통합만이 선별 마커를 발현시킬 수 있게 된다. 이러한 시스템의 한 예가 도 1에 제시된다.
특정 실시예들에서, 재조합효소-매개 재조합을 통한 표적화 통합은 원핵 벡터로부터의 서열이 없는 숙주 세포 게놈의 하나 이상의 예정된 통합 부위 내에 통합되는 다량체 폴리펩티드에 대한 선별 마커 및/또는 상이한 발현 카세트를 유도한다.
설명된 그리고 청구범위에 기재된 다양한 구체예들 이외에도, 본 발명은 또한 본원에 개시되고 본원 청구범위에 기재된 특징들의 그 외 조합들을 가지는 다른 구체예들에도 관련된다. 이와 같이, 본원에 제시된 특정한 특징들은 개시된 발명이 본원에 개시된 특징들의 임의의 적절한 조합을 포함하도록 개시된 발명의 범위 내에서 다른 방식으로 서로 결합 될 수 있다. 상기 개시된 발명의 특정 구체예들에 대한 전술한 설명은 예시 및 설명의 목적으로 제시되었다. 이는 개시된 발명을 상기 개시된 구체예들에 모두 포함시키거나 제한하고자 하는 것이 아니다.
개시된 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 개시된 발명의 조성물 및 방법에서 다양한 수정 및 변형이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백 할 것이다. 따라서, 개시된 발명은 첨부된 청구범위 및 그 균등물의 범위에 속하는 수정 및 변형을 포함하고자 한다.
본 명세서에 인용된 다양한 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 내용 전문이 본원의 참고자료로 포함된다.
다음의 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 그 진정한 범위는 첨부된 청구범위에 제시되어 있다.
도면의 설명
도 1: 2개의 독립적인 RMCE를 동시에 수행하기 위해 3개의 RRS 부위들을 사용하는 2-플라스미드 RMCE 전략의 도식.
서열의 설명
서열 번호: 01: L3 재조합효소 인식 서열의 예시 서열
서열 번호: 02: 2L 재조합효소 인식 서열의 예시 서열
서열 번호: 03: LoxFas 재조합효소 인식 서열의 예시 서열
서열 번호: 04-06: 인간 CMV 프로모터의 예시 변이체
서열 번호: 07: 예시 SV40 폴리아데닐화 신호 서열
서열 번호: 08: 예시 bGH 폴리아데닐화 신호 서열
서열 번호: 09: 예시 hGT 종결인자 서열
서열 번호: 10: 예시 SV40 프로모터 서열
서열 번호: 11: 예시 GFP 핵산 서열
도 1: 2개의 독립적인 RMCE를 동시에 수행하기 위해 3개의 RRS 부위들을 사용하는 2-플라스미드 RMCE 전략의 도식.
서열의 설명
서열 번호: 01: L3 재조합효소 인식 서열의 예시 서열
서열 번호: 02: 2L 재조합효소 인식 서열의 예시 서열
서열 번호: 03: LoxFas 재조합효소 인식 서열의 예시 서열
서열 번호: 04-06: 인간 CMV 프로모터의 예시 변이체
서열 번호: 07: 예시 SV40 폴리아데닐화 신호 서열
서열 번호: 08: 예시 bGH 폴리아데닐화 신호 서열
서열 번호: 09: 예시 hGT 종결인자 서열
서열 번호: 10: 예시 SV40 프로모터 서열
서열 번호: 11: 예시 GFP 핵산 서열
실시예
실시예 1
일반적인 기술
1) 재조합 DNA 기술
Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, (1989)에 기재된 표준 방법을 사용하여 DNA를 조작하였다. 분자 생물학적 시약들은 제조업체의 지침에 따라 사용되었다.
2) DNA 서열 결정
DNA 시퀀싱은 SequiServe GmbH (Vaterstetten, 독일)에서 수행되었다.
3) DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite) 소프트웨어 패키지와 Invitrogen의 Vector NTI 버전 11.5 또는 Geneious Prime을 사용하여 시퀀스 생성, 매핑, 분석, 주석 및 일러스트레이션 하였다.
4) 유전자 및 올리고뉴클레오티드 합성
Geneart GmbH (Regensburg, 독일)에서 화학 합성에 의해 원하는 유전자 절편들을 제조하였다. 합성된 유전자 단편들은 증식/증폭을 위해 대장균 플라스미드에 클로닝되었다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 대안적으로, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드들을 어닐링함에 의해 또는 PCR을 통해 짧은 합성 DNA 단편들을 조립하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 metabion GmbH (Planegg-Martinsried, 독일)에 의해 제조되었다.
5) 시약
달리 명시되지 않는 한 모든 상업용 화학 물질, 항체 및 키트는 제조업체의 프로토콜에 따라 제공된 대로 사용되었다.
6) TI 숙주 세포주의 배양
TI CHO 숙주 세포는 85% 습도 및 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 37°C에서 배양되었다. 이들은 300μg/ml 하이그로마이신 B와 4μg/ml의 제2 선별 마커를 포함하는 시판 DMEM/F12 기반 배지에서 배양되었다. 세포들을 30ml의 총 부피에서 0.3x10E6 세포/ml의 농도로 3일 또는 4일마다 분할하였다. 배양을 위해 125ml 비-배플형 삼각 진탕 플라스크들을 사용하였다. 세포를 5cm의 진탕 진폭으로 150rpm에서 진탕시켰다. 세포 수는 Cedex HiRes 세포 계수기(Roche)로 측정되었다. 세포들은 60일이 될 때까지 배양 상태로 유지되었다.
7) 클로닝
일반
R-부위를 사용한 클로닝은 이어지는 단편들에 있는 서열들과 동일한 관심 유전자(SOI) 옆의 DNA 서열들에 따라 달라진다. 이와 같이 단편들의 조립은 동일한 서열들의 중첩 그리고 DNA 연결효소에 의한 조립된 DNA 내 틈들의 연속 봉쇄에 의해 가능하다. 그러므로 단일 유전자, 특히 올바른 R-부위들을 포함하는 예비 벡터들의 클로닝이 필요하다. 이러한 예비 벡터의 성공적인 클로닝 후, R-부위 옆에 있는 관심 유전자는 R-부위 바로 옆에서 절단되는 효소에 의한 제한 분해를 통해 절단된다. 마지막 단계는 모든 DNA 단편들을 한 단계에서 조립하는 것이다. 보다 상세하게는, 5'-엑소뉴클레아제는 중첩하는 영역들의 5'-단부 (R-부위들)을 제거한다. 그 후, R-부위들의 어닐링이 일어날 수 있고 DNA 중합효소가 3'-단부를 확장시켜 서열의 갭들을 채운다. 마지막으로, DNA 연결효소는 뉴클레오티드들 사이의 틈들을 봉쇄한다. 엑소뉴클레아제, DNA 중합효소 및 연결효소와 같은 다양한 효소를 포함하는 어셈블리 마스터 믹스를 추가한 후 50°C에서 반응 혼합물을 배양하면 단일 단편들이 하나의 플라스미드로 조립된다. 그 후, 전능 대장균 세포들은 플라스미드를 이용하여 형질전환된다.
일부 벡터의 경우 제한 효소를 통한 클로닝 전략이 사용되었다. 적절한 제한 효소를 선택하여, 원하는 관심 유전자를 잘라낸 후, 결찰에 의해 다른 벡터에 삽입할 수 있다. 따라서, 바람직하게는 다수의 클로닝 부위(MCS)에서 절단하는 효소들이 영리한 방식으로 사용 및 선택되므로, 단편들의 결찰은 올바른 배열로 수행될 수 있다. 만약 벡터와 단편이 동일한 제한효소로 미리 잘려져 있다면, 단편과 벡터의 점착성 단부들은 완벽하게 맞물려 DNA 연결효소에 의해 연결될 수 있다. 결찰 후, 전능 대장균 세포들은 새로이 생성된 플라스미드를 이용하여 형질전환된다.
제한 분해를 통한 클로닝
제한 효소로 플라스미드를 분해하기 위해 다음 성분들을 얼음 위에서 함께 피펫팅했다:
표: 제한 분해 반응 믹스
한 번의 분해에 더 많은 효소가 사용된 경우 각 효소 1μl를 사용하고 더 많거나 적은 PCR 등급의 물을 첨가하여 부피를 조정했다. 모든 효소는 새로운 England Biolabs의 CutSmart 완충액(100% 활성)과 함께 사용하기에 적합하고 동일한 배양 온도(모두 37°C)를 갖는다는 전제 조건에서 선택되었다.
온도 혼합기 또는 열 순환기를 사용하여 배양을 수행하여 샘플을 일정한 온도(37°C)에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 동안 샘플을 교반하지 않았다. 인큐베이션 시간은 60분으로 설정되었다. 그 후 샘플을 로딩 염료와 직접 혼합하고 아가로스 전기영동 겔에 로딩하거나 추가 사용을 위해 4°C/얼음에서 보관했다.
겔 전기영동을 위해 1% 아가로스 겔을 준비하였다. 그리하여 다목적 아가로스 1.5g을 125 삼각 플라스크에 넣고 150ml TAE 완충액으로 채웠다. 아가로스가 완전히 용해될 때까지 혼합물을 마이크로파로 가열하였다. 0.5 μg/ml 에티듐 브로마이드를 아가로스 용액에 첨가했다. 그 후, 겔을 몰드에서 주조하였다. 아가로스를 세팅한 후, 몰드를 전기영동 챔버에 넣고 챔버를 TAE-완충액으로 채웠다. 그 후 샘플을 로드했다. (왼쪽부터) 첫 번째 주머니에 적절한 DNA 분자량 마커를 로드한 다음 샘플을 로드하였다. 겔은 <130V에서 약 60분 동안 전기영동시켰다. 전기영동 후 겔을 챔버에서 제거하고 UV-이미지화장치에서 분석했다.
표적 밴드를 절단하고 1.5 ml 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 겔 정제를 위해 제조업체의 지침에 따라 Qiagen의 QIAquick 겔 추출 키트를 사용했다. DNA 단편은 추후 사용을 위해 -20°C에서 보관되었다.
결찰을 위한 단편들은, 인서트와 벡터 단편의 길이 및 서로의 상관 관계에 따라 1:2, 1:3 또는 1:5의 벡터 대 인서트 몰비로 함께 피펫팅되었다. 벡터에 삽입해야 하는 단편이 짧은 경우 1:5 비율을 사용했다. 인서트가 길면 벡터에 대한 상관관계에서 더 적은 양의 인서트가 사용되었다. 각 결찰에 50ng 양의 벡터를 사용하였으며, 인서트의 특정 양은 NEBioCalculator로 계산하였다. 결찰을 위해 NEB의 T4 DNA 결찰 키트를 사용했다. 결찰 혼합물의 예는 다음 표에 제시되어 있다:
표: 결찰 반응 믹스
DNA와 물을 혼합하는 것을 시작으로, 완충액을 첨가하고, 최종적으로 효소를 첨가하여, 모든 성분들을 얼음에서 함께 피펫팅하였다. 반응물을 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 잠시 마이크로퓨징한 다음 실온에서 10분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, T4 연결효소를 65°C에서 10분 동안 열 불활성화시켰다. 샘플을 얼음 위에서 냉각시켰다. 최종 단계에서 10-베타 전능 대장균 세포를 결찰된 플라스미드 2μl로 형질전환했다 (하기 참조).
R-부위 조립을 통한 클로닝
조립을 위해 각 단부에 R-부위들이 있는 모든 DNA 단편들을 얼음 위에서 함께 피펫팅했다. 4개 이상의 단편들을 조립할 때 제조업체에서 권장하는 대로 모든 단편들을 등몰비(0.05ng)로 사용했다. 반응 믹스의 절반은 NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 마스터 믹스에 의해 구현되었다. 총 반응 부피는 40μl였으며 PCR-클린 워터로 채워서 도달되었다. 다음 표에는 예시적인 피펫팅 방식이 제시되어 있다.
표: 어셈블리 반응 혼합물
반응 혼합물을 셋업한 후, 튜브를 일정하게 50°C에서 60분 동안 열순환장치에서 인큐베이션하였다. 성공적인 조립 후 10-베타 전능 대장균 박테리아는 조립된 플라스미드 DNA 2μl로 형질전환되었다 (아래 참조).
형질전환 10-베타 전능 대장균 세포
형질전환을 위해 10-베타 전능 대장균 세포를 얼음 위에서 해동시켰다. 그 후, 2 μl의 플라스미드 DNA를 세포 현탁액에 바로 피펫하여 옮겼다. 튜브를 가볍게 치고 30분 동안 얼음 위에 두었다. 이후 42°C로 따뜻하게 데워진 열 블록에 세포들을 넣고 정확히 30초 동안 열 충격을 가했다. 바로 직후, 세포들을 얼음 위에서 2분 동안 냉각시켰다. 950 μl의 NEB 10-베타 증식물 배지를 세포 현탁액에 첨가하였다. 세포들을 진탕 하에 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 50-100 μl를 예열된 (37°C) LB-Amp 한천 플레이트에 피펫하여 옮기고 일회용 주걱으로 펼쳤다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 암피실린에 대한 내성 유전자를 가지고 있는 플라스미드를 성공적으로 통합시킨 박테리아만이 이 플레이트에서 자랄 수 있다. 다음 날 싱글 콜로니들을 선택하고 후속 플라스미드 제조를 위해 LB-Amp 배지에서 배양했다.
박테리아 배양
대장균의 배양은 Luria Bertani의 약자인 LB 배지에서 수행되었는데, 여기에는 1ml/L 100mg/ml 암피실린이 첨가되어, 0.1mg/ml의 암피실린 농도가 생성되어 있었다. 상이한 플라스미드 준비량을 위해, 다음과 같은 양들을 싱글 박테리아 콜로니에 접종하였다.
표: 대장균 배양 부피
미니-프렙의 경우, 96-웰의 2ml 딥웰 플레이트를 웰당 1.5ml LB-Amp 배지로 채웠다. 콜로니를 골라내고 이쑤시개를 배지에 집어넣었다. 모든 콜로니들이 선택되었을 때, 플레이트를 점착성의 공기 다공성 막으로 닫았다. 플레이트를 23시간 동안 200rpm의 진탕 속도로 37℃인큐베이터에서 인큐베이션하였다.
미니-프렙의 경우 15ml 튜브 (환기 뚜껑 포함)에 3.6ml LB-Amp 배지를 채우고 박테리아 콜로니를 동일하게 접종했다. 인큐베이션하는 동안 이쑤시개를 제거하지 않고 튜브에 그대로 두었다. 96-웰 플레이트와 마찬가지로 튜브를 37°C, 200rpm에서 23시간 동안 인큐베이션했다.
맥시-프렙의 경우 200ml의 LB-Amp 배지를 오토클레이브 유리 1L 삼각 플라스크에 채우고 약 5시간 경과된 1ml의 박테리아 일일 배양액을 접종했다. 삼각 플라스크를 종이 플러그로 닫고 37°C, 200rpm에서 16시간 동안 인큐베이션했다.
플라스미드 제조
미니-프렙의 경우, 50μl의 박테리아 현탁액을 1ml 딥웰 플레이트로 옮겼다. 그 후, 박테리아 세포를 3000 rpm, 4℃의 플레이트에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 박테리아 펠릿이 있는 플레이트를 EpMotion에 넣었다. ca. 90분 후 실험이 완료되었고 용출된 플라스미드-DNA는 추후 사용을 위해 EpMotion으로부터 제거될 수 있었다.
미니-프렙의 경우 15ml 튜브를 인큐베이터에서 꺼내고 3.6ml 세균 배양물을 2ml 에펜도르프 튜브 2개에 나누었다. 튜브를 실온에서 3분 동안 탁상용 미세원심분리기에서 6,800xg로 원심분리했다. 그 후, 제조업체의 지시에 따라 Qiagen QIAprep 스핀 미니프렙 키트를 사용하여 미니-프렙을 수행했다. 플라스미드 DNA 농도는 Nanodrop으로 측정했다.
맥시-프렙은 제조업체의 지침에 따라 Macherey-Nagel NucleoBond®Xtra 맥시 EF 키트를 사용하여 수행되었다. DNA 농도는 Nanodrop으로 측정했다.
에탄올 침전
소정 부피의 DNA 용액을 2.5배 부피의 에탄올 100%와 혼합하였다. 혼합물을 -20℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 DNA를 30분 동안 14,000rpm, 4°C에서 원심분리했다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 70% 에탄올로 세척했다. 다시, 튜브를 14,000rpm, 4°C에서 5분 동안 원심분리했다. 상층액을 피펫팅하여 조심스럽게 제거하고 펠렛을 건조시켰다. 에탄올이 증발되면 엔도톡신이 없는 물을 적절한 양 첨가하였다. DNA를 밤새 4°C에서 물에 재용해시킬 시간이 주어졌다. 소량을 취하여 Nanodrop 장치로 DNA 농도를 측정했다.
실시예 2
플라스미드 생성
발현 카세트 조성
항체 사슬의 발현을 위해, 하기의 기능적 요소들을 포함하는 전사 단위를 사용하였다:
- 인트론 A를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 즉각적인 초기 증폭자 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),
- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 각각의 항체 사슬을 인코딩하는 핵산,
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA), 및
- 선택적으로 인간 가스트린 종결인자 (hGT).
발현하고자 하는 유전자를 포함하는 발현 유닛/카세트 이외에 기본/표준 포유류 발현 플라스미드는 다음을 포함한다:
- 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 가능하게 하는, 벡터 pUC18로부터의 복제 기점, 및
- 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마제 유전자.
전방- 및 후방-벡터 클로닝
2-플라스미드 항체 구조체를 구성하기 위해, 항체 HC 및 LC 단편을 L3 및 LoxFAS 서열을 포함하는 전방 벡터 백본과 LoxFAS 및 2L 서열 및 pac 선별 마커를 포함하는 후방 벡터에 클로닝했다. Cre 재조합효소 플라스미드 pOG231 (Wong, E.T., 등, Nucleic Acids Res 2005, 33, (17), e147; O'Gorman S et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, (26), 14602-7)가 모든 RMCE 과정들에서 사용되었다.
각각의 항체 사슬을 인코딩하는 cDNA들이 유전자 합성에 의해 생성되었다 (Geneart, Life Technologies Inc.). 유전자 합성 및 백본-벡터를 HindIII-HF 및 EcoRI-HF(NEB)로 37°C에서 1시간 동안 분해하고 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 인서트 및 백본의 DNA-단편을 아가로스 겔에서 잘라내고 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)을 이용하여 추출하였다. 정제된 인서트 및 백본 단편은 3:1의 인서트/백본 비율로 제조업체 프로토콜에 따라 Rapid Ligation Kit(Roche)를 통해 결찰되었다. 이후, 42°C에서 30초 동안의 열 충격을 통해 적합한 대장균 DH5α 에서 결찰 접근법이 수행되었고, 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 선별을 위해 암피실린이 있는 아가 플레이트에 도말하였다. 플레이트들을 37 °C에서 밤새 인큐베이션하였다.
다음 날 클론을 선택하고, 미니 또는 맥시-프렙을 위해 진탕하에 37°C에서 밤새 인큐베이션하였으며, 이는 EpMotion®5075(Eppendorf) 또는 QIAprep Spin 미니-프렙 키트 (Qiagen)/ NucleoBond Xtra 맥시 EF 키트 (Macherey & Nagel)를 각각 이용하여 수행하였다. 모든 구조체들을 시퀀싱하여 바람직하지 않은 돌연변이가 없는지 확인하였다 (SequiServe GmbH).
제2 클로닝 단계에서, 이전에 클로닝된 벡터들은 제1 클로닝 단계와 동일한 조건으로 KpnI-HF/SalI-HF 및 SalI-HF/MfeI-HF로 분해되었다. TI 백본 벡터는 KpnI-HF 및 MfeI-HF로 분해되었다. 상기와 같이 분리 및 추출을 수행하였다. 정제된 인서트와 백본의 결찰은 제조 프로토콜에 따라 4°C에서 밤새 1:1:1의 인서트/인서트/백본 비율로 T4 DNA 연결효소(NEB)를 사용하여 수행되었고, 65°C에서 10분 동안 비활성화되었다. 후속 클로닝 단계를 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.
클로닝된 플라스미드는 TI 형질감염 및 풀 생성에 사용되었다.
실시예 3
배양, 형질감염, 선택, 풀 생성
및 단일 세포 클로닝
TI 숙주 세포들을 시판 DMEM/F12 기반 배지에서 표준 가습 조건 (95% rH, 37°C, 및 5% CO2) 하에 150rpm의 일정한 교반 속도로 일회용 125ml 통기 진탕 플라스크에서 증식시켰다. 3-4 일마다 세포를 3x10E5개 세포/ml 농도의 유효 농도로 선별 마커 1 및 선별 마커 2를 포함하는 화학적으로 정의된 배지에 접종했다. Cedex HiRes 세포 계수기 (F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, 스위스)를 사용하여 배양물의 밀도 및 생존력을 측정했다.
안정적인 형질감염을 위해, 등몰량의 전방 및 후방 벡터를 등몰량으로 혼합하였다. 5 μg의 플라스미드 혼합물에 1 μg의 Cre 발현 플라스미드를 첨가하였다.
형질감염 2일 전에 TI 숙주 세포를 4x10E5개 세포/ml의 밀도로 새로운 배지에 접종하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Nucleofector 키트 V (Lonza, 스위스)를 사용하여 Nucleofector 장치로 형질 감염을 수행했다. 3x10E7개 세포들을 30 μg 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 후 세포들을 선별 물질이 없는 30ml 배지에 접종하였다.
접종 후 5일차에 세포들을 원심분리하고 재조합 세포들의 선별을 위해 퓨로마이신 (선별 물질 1) 및 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-1-베타-D-아라비노퓨라노실-5-아이오도)우라실 (FIAU; 선별 물질 2)을 함유하는 80 mL의 화학적으로 정의된 배지에 6x10E5 세포/ml의 유효 농도로 형질감염시켰다. 세포들을 37 °C, 150 rpm, 5% CO2, 및 85% 습도에서 인큐베이션 하였다 배양물의 세포 밀도와 생존력을 정기적으로 모니터하였다. 배양물의 생존력이 다시 증가하기 시작했을 때, 선별 물질 1과 2의 농도는 이전에 사용된 양의 약 절반으로 감소되었다. 보다 상세하게는, 세포의 회복을 촉진하기 위해 생존율이 > 40%이고 생존 세포 밀도(VCD)가 > 0.5x10E6 cells/mL인 경우 선별 압력을 감소시켰다. 따라서, 4x10E5개의 세포들/ml를 원심분리하고, 40 ml의 선별 배지 II (화학적으로 정의된 배지, ½ 선별 마커 1 & 2)에 재현탁하였다. 세포를 이전과 동일한 조건에서 인큐베이션하고 또한 분할하지 않았다.
선별 시작 10일 후, Cre 매개된 카세트 교환의 성공은 세포 표면에 결합된 세포외 3가 항체 (TCB) 및 세포내 GFP의 발현을 측정하는 유세포 분석 측정에 의해 확인되었다. 인간 항체 경쇄 및 중쇄에 대한 APC 항체 (알로피코시아닌-표지 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG)는 FACS 염색에 사용되었다. 유세포분석은 BD FACS Canto II 유세포분석기 (BD, Heidelberg, 독일)를 사용하여 수행되었다. 샘플 당 만 개의 이벤트가 측정되었다. 살아있는 세포는 측면 산란 (SSC)에 대하여 전방 산란 (FSC) 플롯에서 게이팅되었다. 살아있는 세포 게이트는 형질감염되지 않은 TI 숙주 세포로 정의되었으며 FlowJo 7.6.5 EN 소프트웨어 (TreeStar, Olten, Switzerland)를 사용하여 모든 샘플에 적용되었다. GFP의 형광은 FITC 채널에서 정량화되었다 (488 nm에서 여기, 530 nm에서 검출). 3가 항체 (TCB)는 APC 채널에서 측정하였다 (645 nm에서 여기, 660 nm에서 검출). 부모 CHO 세포, 즉 TI 숙주 세포의 생성에 사용된 세포는 GFP 및 3가 이중특이성 항체 발현과 관련하여 음성 대조군으로 사용되었다. 선별 시작 14일 후에 생존력이 90%를 초과하였으며 선별이 완료된 것으로 간주되었다.
실시예 4
FACS 스크리닝
FACS 분석을 수행하여 형질감염 효율과 형질감염의 RMCE 효율을 확인하였다. 형질감염된 접근법의 4x10E5개 세포들을 원심분리하고 (1200 rpm, 4분), 1 mL PBS로 2회 세척하였다. PBS를 이용한 세척 단계 후, 펠릿을 400 μL PBS에 재현탁하고, FACS 튜브(세포 스트레이너 캡을 갖는 Falcon®둥근 바닥 튜브; Corning)로 이동하였다. 측정은 FACS Canto II로 수행되었으며, 데이터는 소프트웨어 FlowJo로 분석되었다.
실시예 5
유가식 배양
유가식 생산 배양은 화학적으로 정의된 시판 생산 배지를 사용하여 진탕 플라스크 또는 Ambr15 용기 (Sartorius Stedim)에서 수행되었다. 세포들을 0일차에 1x10E6개 세포/ml로 씨딩하고, 3일차에 온도를 변경하였다. 3, 7 및 10일차에 배양물들에 시판 공급 배지를 제공하였다. Vi-Cell™XR 기기(Beckman Coulter)를 사용하여 0, 3, 7, 10 및 14일차에 배양된 세포의 생존 세포 수(VCC) 및 생존율을 측정했다. Bioprofile 400 분석장치 (Nova Biomedical)를 사용하여 7, 10 및 14일차에 포도당 및 젖산 농도를 측정하였다. 원심분리(10분, 1000 rpm 및 10분, 4000 rpm)에 의한 급유 시작 후 14일에 상청액을 수확하고 여과(0.22 μm)하여 제거하였다. 14일차 역가는 UV 검출에 의한 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용하여 측정하였다.
생성물의 품질은 Caliper's LabChip (Caliper Life Sciences)에 의해 결정되었다.
실시예 6
벡터 설계의 효과
TI 숙주에서 생산성에 대한 발현 카세트 조직의 효과를 조사하기 위해, TCB 형태의 3가 항체의 상이한 수 및 조직의 개별 사슬들을 함유하는 2개의 플라스미드(전방 및 후방 벡터)를 형질감염시켜 RMCE 풀을 생성하였다. RMCE의 선별, 회수 및 유세포 분석에 의한 검증 후, 풀들의 생산성을 14일 유가식 생산 분석에서 평가하였다. 특정 벡터 조직들의 경우 참조 풀과 비교하여 역가의 증가가 관찰되었다.
5가지 상이한 TCB의 발현에 대한 항체 사슬 발현 카세트 조직의 효과를 평가하였다. TCB 1 내지 5는 모두 상이한 표적화 특이성을 가졌다. TCB 3은 4개의 상이한 항-CD3 결합 부위로 테스트되었다.
TCB-1에 대해 다음과 같은 결과를 얻었다; 참조 조직은 회색으로 음영처리됨:
TCB-3에 대해 다음과 같은 결과를 얻었다:
TCB-2, -4 및 -5에 대해 다음과 같은 결과를 얻었다:
MP = 주 생성물, eff. titer = 유효 역가 = 주 생성물%를 곱한 역가
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
Hoffmann-La Roche Inc.
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by targeted integration of multiple expression cassettes in a
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 1
ataacttcgt ataaagtctc ctatacgaag ttat 34
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2L
<400> 2
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> loxFas
<400> 3
acaacttcgt atataccttt ctatacgaag ttgt 34
<210> 4
<211> 608
<212> DNA
<213> Human cytomegalovirus
<400> 4
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattagc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctccg tttagtgaac 600
gtcagatc 608
<210> 5
<211> 696
<212> DNA
<213> Human cytomegalovirus
<400> 5
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattagc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctccg tttagtgaac 600
gtcagatcta gctctgggag aggagcccag cactagaagt cggcggtgtt tccattcggt 660
gatcagcact gaacacagag gaagcttgcc gccacc 696
<210> 6
<211> 2125
<212> DNA
<213> Human cytomegalovirus
<400> 6
ctgcagtgaa taataaaatg tgtgtttgtc cgaaatacgc gttttgagat ttctgtcgcc 60
gactaaattc atgtcgcgcg atagtggtgt ttatcgccga tagagatggc gatattggaa 120
aaatcgatat ttgaaaatat ggcatattga aaatgtcgcc gatgtgagtt tctgtgtaac 180
tgatatcgcc atttttccaa aagtgatttt tgggcatacg cgatatctgg cgatagcgct 240
tatatcgttt acgggggatg gcgatagacg actttggtga cttgggcgat tctgtgtgtc 300
gcaaatatcg cagtttcgat ataggtgaca gacgatatga ggctatatcg ccgatagagg 360
cgacatcaag ctggcacatg gccaatgcat atcgatctat acattgaatc aatattggcc 420
attagccata ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca 480
tacgttgtat ccatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc 540
atgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca 600
tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc 660
gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat 720
agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt 780
acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc 840
cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta 900
cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg 960
atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt 1020
gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac 1080
gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa 1140
ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga 1200
ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg cggattcccc gtgccaagag 1260
tgacgtaagt accgcctata gagtctatag gcccaccccc ttggcttctt atgcatgcta 1320
tactgttttt ggcttggggt ctatacaccc ccgcttcctc atgttatagg tgatggtata 1380
gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctcccctatt ggtgacgata 1440
ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac tctctttatt ggctatatgc 1500
caatacactg tccttcagag actgacacgg actctgtatt tttacaggat ggggtctcat 1560
ttattattta caaattcaca tatacaacac caccgtcccc agtgcccgca gtttttatta 1620
aacataacgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt tccggacatg ggctcttctc 1680
cggtagcggc ggagcttcta catccgagcc ctgctcccat gcctccagcg actcatggtc 1740
gctcggcagc tccttgctcc taacagtgga ggccagactt aggcacagca cgatgcccac 1800
caccaccagt gtgccgcaca aggccgtggc ggtagggtat gtgtctgaaa atgagctcgg 1860
ggagcgggct tgcaccgctg acgcatttgg aagacttaag gcagcggcag aagaagatgc 1920
aggcagctga gttgttgtgt tctgataaga gtcagaggta actcccgttg cggtgctgtt 1980
aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg ccaccagaca 2040
taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca gtcaccgtcc 2100
ttgacacggt ttaaacgccg ccacc 2125
<210> 7
<211> 129
<212> DNA
<213> Simian virus 40
<400> 7
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcacc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta 120
tcatgtctg 129
<210> 8
<211> 225
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 8
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 9
<211> 73
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
caggataata tatggtaggg ttcatagcca gagtaacctt tttttttaat ttttatttta 60
ttttattttt gag 73
<210> 10
<211> 288
<212> DNA
<213> Simian virus 40
<400> 10
agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 60
tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 120
ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 180
aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 240
gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc cattttcg 288
<210> 11
<211> 798
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> green fluorescent protein encoding nucleic acid
<400> 11
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tctgcagtcg acggtaccgc gggcccggga 780
tccaccggat ctagatga 798
Claims (17)
- 다음 단계들을 포함하는, 3가 항체의 생산 방법:
a) 3가 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 단계, 및
b) 세포 또는 배양 배지로부터 3가 항체를 회수하는 단계,
이때 3가 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 포유동물 세포의 게놈에 안정적으로 통합되고 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함함:
(1)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
또는 (2)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는 (3)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
또는 (4)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는 (5)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제7 발현 카세트,
또는 (6)
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트. - 5'-에서 3'- 방향으로 다음을 포함하는, 3가 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산:
(1)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
또는 (2)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는 (3)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
또는 (4)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는 (5)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제7 발현 카세트,
또는 (6)
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트. - 포유동물 세포에서 3가 항체의 발현을 위한, 5'- 에서 3'- 방향으로 다음을 포함하는 데옥시리보핵산의 용도:
(1)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
또는 (2)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는 (3)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
또는 (4)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는 (5)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제7 발현 카세트,
또는 (6)
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트. - 세포의 게놈에 통합된 3가 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하는 재조합 포유동물 세포로서, 이때 3가 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 5'-에서 3'-방향으로 다음을 포함하는, 재조합 포유동물 세포:
(1)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
또는 (2)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는 (3)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
또는 (4)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
또는 (5)
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제7 발현 카세트,
또는 (6)
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트. - 3개의 상이한 재조합 인식 서열 및 5 내지 7개의 발현 카세트를 차례로 포함하는 2개의 데옥시리보핵산을 포함하는 조성물로서, 이때
- 제1 데옥시리보핵산은 5'-에서 3'-방향으로:
(1)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (2)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (3)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (4)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (5)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (6)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본
을 포함하고,
그리고
- 제2 데옥시리보핵산은 5'-에서 3'-방향으로:
(1)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (2)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (3)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (4)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (5)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제7 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (6)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열
을 포함하는, 조성물. - 3가 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하고 3가 항체를 분비하는 재조합 포유동물 세포를 생산하는, 다음 단계들을 포함하는 방법:
a) 포유동물 세포의 게놈 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 세포를 제공하는 단계, 이때 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 제1 선별 마커에 연접하는 제1 및 제2 재조합 인식 서열, 및 제1 및 제2 재조합 인식 서열 사이에 위치한 제3 재조합 인식 서열을 포함하고, 모든 재조합 인식 서열은 상이하며;
b) a)에서 제공된 세포에 3개의 상이한 재조합 인식 서열 및 5 내지 7개의 발현 카세트를 포함하는 2개의 데옥시리보핵산 조성물을 도입하는 단계, 이때
- 제1 데옥시리보핵산은 5'-에서 3'-방향으로:
(1)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (2)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (3)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (4)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (5)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본,
또는 (6)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트,
- 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 사본
을 포함하고,
그리고
- 제2 데옥시리보핵산은 5'-에서 3'-방향으로:
(1)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (2)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (3)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (4)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제1 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (5)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제7 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열,
또는 (6)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 사본,
- 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열
을 포함하며,
이때 제1 및 제2 데옥시리보핵산의 제1 내지 제3 재조합 인식 서열은 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상의 제1 내지 제3 재조합 인식 서열과 일치하고,
이때 하나의 제2 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 5'-말단 부분 및 3'-말단 부분은 함께 하나의 제2 선별 마커의 기능적 발현 카세트를 형성하고;
c) i) b)의 제1 및 제2 데옥시리보핵산과 동시에;
또는
ii) 이후 순차적으로
하나 이상의 재조합효소를 도입하는 단계,
이때 하나 이상의 재조합효소는 제1 및 제2 데옥시리보핵산의 재조합 인식 서열을 인식하고; (그리고 선택적으로 하나 이상의 재조합효소는 2개의 재조합효소 매개 카세트 교환을 수행하고;)
그리고
d) 제2 선별 마커를 발현하고 3가 항체를 분비하는 세포를 선택하는 단계,
이로써, 3가 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산을 포함하고 3가 항체를 분비하는 재조합 포유동물 세포를 생산함. - 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 제1 중쇄는 CH3 도메인에 돌연변이 T366W (Kabat에 따른 넘버링)를 포함하고 제2 중쇄는 CH3 도메인에 돌연변이 T366S, L368A, 및 Y407V (Kabat에 따른 넘버링)를 포함하고, 또는 그 역인, 3가 항체의 생산 방법 또는 데옥시리보핵산 또는 용도 또는 재조합 포유동물 세포 또는 조성물 또는 재조합 포유동물 세포의 생산 방법.
- 청구항 7에 있어서, 중쇄들 중 하나는 돌연변이 S354C를 추가로 포함하고 각각의 다른 중쇄는 돌연변이 Y349C (Kabat에 따른 넘버링)를 포함하는, 3가 항체의 생산 방법 또는 데옥시리보핵산 또는 용도 또는 재조합 포유동물 세포 또는 조성물 또는 재조합 포유동물 세포의 생산 방법.
- 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 제1 중쇄는 추가적인 도메인 교환된 Fab 단편을 포함하는 연장된 중쇄인, 3가 항체의 생산 방법 또는 데옥시리보핵산 또는 용도 또는 재조합 포유동물 세포 또는 조성물 또는 재조합 포유동물 세포의 생산 방법.
- 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 제1 경쇄는 도메인 교환된 경쇄 VH-VL 또는 CH1-CL인, 3가 항체의 생산 방법 또는 데옥시리보핵산 또는 용도 또는 재조합 포유동물 세포 또는 조성물 또는 재조합 포유동물 세포의 생산 방법.
- 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서,
- 제1 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 제1 경쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제2 중쇄는 N-에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제1 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 중쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고, 및
- 제2 경쇄는 N-에서 C-말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고,
이때 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고 제2 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성하는, 3가 항체의 생산 방법 또는 데옥시리보핵산 또는 용도 또는 재조합 포유동물 세포 또는 조성물 또는 재조합 포유동물 세포의 생산 방법. - 청구항 1, 3, 4 및 6 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 데옥시리보핵산은 단일 부위 또는 유전자좌에서 포유동물 세포의 게놈에 안정적으로 통합되는, 3가 항체의 생산 방법 또는 데옥시리보핵산 또는 용도 또는 재조합 포유동물 세포 또는 조성물 또는 재조합 포유동물 세포의 생산 방법.
- 청구항 1 내지 5 및 7 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 3가 항체를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 선별 마커를 인코딩하는 추가 발현 카세트를 포함하고, 이때 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트는 제3 재조합 인식 서열에 대해 일부분 5' 및 일부분 3'에 위치하며, 이때 상기 발현 카세트의 5'-위치 부분은 프로모터 및 개시-코돈을 포함하고 상기 발현 카세트의 3'-위치 부분은 폴리A 신호 및 개시 코돈이 없는 코딩 서열을 포함하고, 개시 코돈은 코딩 서열에 작동가능하게 연결되는, 3가 항체의 생산 방법 또는 데옥시리보핵산 또는 용도 또는 재조합 포유동물 세포 또는 조성물 또는 재조합 포유동물 세포의 생산 방법.
- 청구항 1 내지 5 및 7 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 이때 프로모터는 인트론 A를 갖는 인간 CMV 프로모터이고, 폴리아데닐화 신호 서열은 bGH 폴리아데닐화 신호 서열이고, 종결인자는 선별 마커의 발현 카세트를 제외한 hGT 종결인자이고, 이때 프로모터는 SV40 프로모터이고 폴리아데닐화 신호 서열은 SV40 폴리아데닐화 신호 서열이고 종결인자는 없는, 3가 항체의 생산 방법 또는 데옥시리보핵산 또는 용도 또는 재조합 포유동물 세포 또는 조성물 또는 재조합 포유동물 세포의 생산 방법.
- 청구항 1, 3, 4 및 6 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포는 CHO 세포인, 3가 항체의 생산 방법 또는 데옥시리보핵산 또는 용도 또는 재조합 포유동물 세포 또는 조성물 또는 재조합 포유동물 세포의 생산 방법.
- 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 5'-에서 3'-방향의 구조가 제1 발현 카세트로서 제1 중쇄를 인코딩하는 발현 카세트를 가지는 경우 모든 카세트들은 단방향으로 배열되는, 3가 항체의 생산 방법 또는 데옥시리보핵산 또는 용도 또는 재조합 포유동물 세포 또는 조성물 또는 재조합 포유동물 세포의 생산 방법.
- 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 5'-에서 3'-방향의 구조가 제1 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 카세트, 제1 경쇄를 인코딩하는 제2 발현 카세트, 제1 중쇄를 인코딩하는 제3 발현 카세트, 제2 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 제2 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트, 또는 제2 경쇄를 인코딩하는 제6 발현 카세트인 경우, 제1 내지 제3 발현 카세트는 단방향으로 배열되고 제4 내지 제6 발현 카세트는 단방향으로 배열되고 이로써 제1 내지 제3 발현 카세트는 제4 내지 제6 발현 카세트의 반대 방향으로 배열되는, 3가 항체의 생산 방법 또는 데옥시리보핵산 또는 용도 또는 재조합 포유동물 세포 또는 조성물 또는 재조합 포유동물 세포의 생산 방법.
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