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KR20230066552A - 항체-다량체-융합체의 발현 방법 - Google Patents

항체-다량체-융합체의 발현 방법 Download PDF

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KR20230066552A
KR20230066552A KR1020237006455A KR20237006455A KR20230066552A KR 20230066552 A KR20230066552 A KR 20230066552A KR 1020237006455 A KR1020237006455 A KR 1020237006455A KR 20237006455 A KR20237006455 A KR 20237006455A KR 20230066552 A KR20230066552 A KR 20230066552A
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하랄트 뒤르
콜러 클라우디아 페르라라
샤흐람 미사기
에이미 셴
스타일리아니 투르나비티
슈엣 밍 입
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에프. 호프만-라 로슈 아게
제넨테크, 인크.
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Abstract

(a) 항체 중쇄와 항체 경쇄, 및
(b) N-말단에서 C-말단 방향으로, 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 제1 부분, 항체 중쇄 CH1 도메인 또는 항체 경쇄 불변 도메인, 항체 힌지 영역, 항체 중쇄 CH2 도메인 및 항체 중쇄 CH3 도메인을 포함하는 제1 융합 폴리펩티드, 및 N-말단에서 C-말단 방향으로, 상기 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 제2 부분, 및 상기 제1 폴리펩티드가 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 경우, 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하거나, 또는 상기 제1 폴리펩티드가 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경우, 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 제2 융합 폴리펩티드
를 포함하는 항체-다량체-융합 폴리펩티드의 제조하는 방법으로서,
이때 (i) (a)의 항체 중쇄와 (b)의 제1 융합 폴리펩티드, (ii) (a)의 항체 중쇄와 (a)의 항체 경쇄, 및 (iii) (b)의 제1 융합 폴리펩티드와 (b)의 제2 융합 폴리펩티드는 각각 서로 독립적으로 적어도 하나의 이황화 결합에 의해 서로에 대해 공유적으로 연계되며,
상기 항체-다량체-융합체는 상기 항체 중쇄, 상기 항체 경쇄, 상기 제1 융합 폴리펩티드 및 상기 제2 융합 폴리펩티드에 대한 화학양론적 비율 1:1:2:1인 발현 카세트로 포유류 세포를 형질감염시켜 확득된 재조합 포유류 세포에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는 방법이 본원에 보고된다.

Description

항체-다량체-융합체의 발현 방법
본 발명은 세포주 제조 및 폴리펩티드 제조 분야에 관한 것이다. 보다 정확하게는, 항체-다량체-융합체의 개별 폴리펩티드에 대한 발현 카세트의 특정된 비율로 비-생산성 포유류 세포를 형질감염시킴으로써, 재조합 포유류의 재조합적 생산성 세포의 제조 방법이 본원에서 보고된다. 전술한 세포는 항체-다량체-융합체의 제조 방법에 이용될 수 있다.
분비 및 글리코실화된 폴리펩티드, 예를 들면, 항체들은 진핵 세포에서 일반적으로 안정적 발현 또는 일시적인 발현에 의한, 재조합 발현으로 생성된다.
만들어질 폴리펩티드의 복잡성이 높아질수록, 가령, 세포 내에서 관심대상 폴리펩티드의 형성에 필요한 상이한 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 쇄의 수가 많아질 수록, 상이한 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 쇄의 서로에 대한 발현 비율의 제어가 더 중요해진다. 발현 비율의 제어는 관심대상 폴리펩티드의 높은 발현 수율로 효율적인 발현, 정확한 어셈블리 및 성공적인 분비를 가능하게 하기 위해 필요하다.
외인성 관심대상 폴리펩티드를 발현시키는 재조합 세포를 생성하기 위한 한 가지 전략은 관심대상 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 무작위 통합 및 이에 이은 선택 단계 및 분리 단계가 연루된다.
재조합효소 매개된 카세트 교환(RMCE)에 의한 표적화된 통합은 외래 DNA를 진핵 숙주 게놈의 사전-특정된 부위로 특이적이며, 효율적으로 보내는 방법이다 (Turan et al., J. Mol. Biol. 407 (2011) 193-221).
Crawford et al.은 조합된 φC31 인테그라제 및 CRE-Lox 기술을 사용하여, 제한된-게놈 스크리닝으로부터 표적화된 세포주 개발을 위한 신뢰할 수 있는 숙주의 빠른 식별에 대해 보고했다 (Biotechnol. Prog. 29 (2013) 1307-1315).
Rajendra et al.는 단일 쿼드(quad) 벡터가 안정적인 CHO 세포주 생성을 위한 간단하면서도 유효 대체 접근법이며, 임상적 헤테로-mAb 치료요법제를 위한 세포주 생성을 가속화할 수 있다고 보고했다(Biotechnol. Prog. 33 (2017) 469-477).
Bahr et al.는 중국 햄스터 난소 세포에서 표적화된 통합을 사용한 플랫폼 발현 시스템의 개발을 보고했다 (proceedings of Cell Culture Engineering XVI, 2018).
Carver et al.는 소단위 유전자 투여량 및 위치의 최적화를 통해, 표적화된 통합 숙주에서 항체 생산을 최대화하는 시키는 것을 보고했다 (Biotechnol. Prog. (2020) e2967).
본 발명은 다음의 독립적인 측면 및 종속적인 구체예들에 의해 특정된다:
1. 본 발명의 제1 측면은 항체-다량체-융합 폴리펩티드를 제조하는 방법이며,
이때 상기 폴리펩티드는 다음을 포함한다:
(a) 항체 중쇄와 항체 경쇄, 및
(b) N-말단에서 C-말단 방향으로, 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 제1 부분, 항체 중쇄 CH1 도메인 또는 항체 경쇄 불변 도메인, 항체 힌지 영역, 항체 중쇄 CH2 도메인 및 항체 중쇄 CH3 도메인을 포함하는 제1 융합 폴리펩티드, 및 N-말단에서 C-말단 방향으로, 상기 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 제2 부분, 및 상기 제1 폴리펩티드가 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 경우, 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하거나, 또는 상기 제1 폴리펩티드가 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경우, 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 제2 융합 폴리펩티드,
이때
(i) (a)의 항체 중쇄와 (b)의 제1 융합 폴리펩티드, (ii) (a)의 항체 중쇄와 (a)의 항체 경쇄, 및 (iii) (b)의 제1 융합 폴리펩티드와 (b)의 제2 융합 폴리펩티드는 각각 서로 독립적으로 적어도 하나의 이황화 결합에 의해 서로에 대해 공유적으로 연계되며,
이때
상기 항체 중쇄와 항체 경쇄의 가변 도메인들은 결합 부위 항원에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고,
상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드는 상기 항체 중쇄, 상기 항체 경쇄, 상기 제1 융합 폴리펩티드 및 상기 제2 융합 폴리펩티드에 대한 화학양론적 비율이 1:1:2:1인 발현 카세트로 (부모계) 포유류 세포를 형질감염시켜 확득된 재조합 포유류 세포에 의해 발현되는 것을 특징으로 한다.
2. 측면 1에 따른 방법에서, 이때 상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드는 일시적으로 발현되거나, 또는 안정적으로 발현된다.
3. 측면 1 또는 구체예 2 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 포유류 세포는 CHO 세포, 선호적으로는 CHO-K1, 또는 HEK 세포다.
4. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 3 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 형질감염은 4개 벡터에 의한 형질감염이며, 이에 의해 각 벡터는 상기 발현 카세트 중 정확하게 하나의 발현 카세트를 포함한다.
5. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 3 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 형질감염은 3개 벡터에 의한 형질감염이며, 이에 의해 2개 벡터는 상기 발현 카세트 중 정확하게 2개 발현 카세트를 포함하며, 한 개 벡터는 상기 발현 카세트 중 정확하게 하나의 발현 카세트를 포함한다.
6. 구체예 4에 따른 방법에서, 이때 상기 형질감염은 3개 벡터에 의한 형질감염이며, 이에 의해 상기 제1 벡터는 상기 항체 중쇄 및 항체 경쇄용 발현 카세트를 포함하며, 상기 제2 발현 벡터는 상기 제1 융합 폴리펩티드 및 제2 융합 폴리펩티드용 발현 카세트를 포함하고, 상기 제3 벡터는 상기 제1 융합 폴리펩티드용 한 개 발현 카세트를 포함한다.
7. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 6 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 제1 융합 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로 연결된 TNF 리간드 패밀리 구성원의 2개 엑토도메인 또는 이의 단편을 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 제1 부분으로 포함하고, 상기 제2 융합 폴리펩티드는 전술한 TNF 리간드 패밀리 구성원의 오로지 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편을 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 제2 부분으로 포함하거나, 또는 이의 역을 포함한다.
8. 구체예 7에 따른 방법에서, 이때
(a) 상기 제1 융합 폴리펩티드는 상기 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 제1 부분으로써, TNF 리간드 패밀리 구성원의 제1 엑토도메인 또는 이의 단편, 스페이서 도메인 및 전술한 TNF 리간드 패밀리 구성원의 제2 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 이때
- 상기 스페이서 도메인은 폴리펩티드이며, 적어도 25개 아미노산 잔기를 포함하고,
- 상기 TNF 리간드 패밀리 구성원의 제1 엑토도메인 또는 이의 단편은 직접적으로 또는 제1 펩티드 링커를 통하여 상기 스페이서 도메인의 N-말단에 융합되며,
- 상기 전술한 TNF 리간드 패밀리 구성원의 제2 엑토도메인 또는 이의 단편은 직접적으로 또는 제2 펩티드 링커를 통하여 상기 스페이서 도메인의 C-말단에 융합되며,
(b) 상기 제2 융합 폴리펩티드는 상기 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 제2 부분으로써 전술한 TNF 리간드 패밀리 구성원의 제3 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는데, 이는 직접적으로 또는 제3 펩티드 링커를 통하여
- 상기 제1 융합 폴리펩티드 내 전술한 TNF 리간드 패밀리 구성원의 제2 엑토도메인의 C-말단에 융합되거나, 또는 상기 제2 융합 폴리펩티드 내 상기 스페이서 도메인의 C-말단에 융합되거나, 또는
- 상기 항원 결합 도메인의 제2 부분이 상기 제2 융합 단백질의 스페이서 도메인의 C-말단에 융합된 경우라면, 상기 제1 융합 폴리펩티드 내 전술한 TNF 리간드 패밀리 구성원의 제2 엑토도메인의 C-말단에 융합되는, 방법.
9. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 8 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때
상기 제1 융합 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 제1 부분, 항체 경쇄 불변 도메인, 항체 힌지 영역, 항체 중쇄 CH2 도메인 및 항체 중쇄 CH3 도메인을 포함하고,
제2 융합 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 상기 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 제2 부분 및 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는, 방법.
10. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 9 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때
상기 제1 융합 폴리펩티드는 노브(knob) 돌연변이를 포함하고,
상기 항체 중쇄는 홀(hole) 돌연변이들을 포함한다.
11. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 10 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 (a)의 항체 중쇄 및 (b)의 제1 융합 폴리펩티드는 Fc-영역을 형성한다.
12. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 11 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 (a)의 항체 중쇄 및 (b)의 제1 융합 폴리펩티드는 IgG1 Fc-영역 또는 IgG4 Fc-영역을 형성한다.
13. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 12 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 Fc-영역은 위치 234와 위치 235 및/또는 위치 329 (Kabat EU 번호매김)에서 아미노산 치환을 더 포함하는 IgG1 Fc-영역이다.
14. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 13 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 Fc-영역은 아미노산 치환 L234A, L235A 및/또는 P329G (Kabat EU 번호매김)을 더 포함하는 IgG1 Fc-영역이다.
15. 구체예 7 내지 구체예 14 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 제1 융합 폴리펩티드 내 TNF 리간드 패밀리 구성원의 2개 엑토도메인 또는 이의 단편들은 제1 펩티드 링커에 의해 각각 서로 연결되며, 이의 C-말단에서 제2 펩티드 링커에 의해 CH1 도메인에 융합되며, 상기 제2 융합 폴리펩티드 내 전술한 TNF 리간드 패밀리 구성원의 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편은 이의 C-말단에서 제3 펩티드 링커에 의해 상기 항체 경쇄 불변 도메인에 융합된다.
16. 구체예 7 내지 구체예 14 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 제1 융합 폴리펩티드 내 TNF 리간드 패밀리 구성원의 2개 엑토도메인 또는 이의 단편들은 제1 펩티드 링커에 의해 각각 서로 연결되며, 이의 C-말단에서 제2 펩티드 링커에 의해 경쇄 불변 도메인에 융합되며, 상기 제2 융합 폴리펩티드 내 전술한 TNF 리간드 패밀리 구성원의 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편은 이의 C-말단에서 제3 펩티드 링커에 의해 상기 항체 중쇄 CH1 도메인에 융합된다.
아미노산17. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 16 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 부분에 인접한 CL 도메인 내 위치 123 (Kabat EU 번호매김)의 아미노산은 아르기닌 (R)으로 대체되었으며, 위치 124 (Kabat EU 번호매김)의 아미노산은 리신 (K)으로 치환되었으며, 이때 상기 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 부분에 인접한 CH1 도메인 내 위치 147 (Kabat EU 번호매김)의 아미노산 및 위치 213 (Kabat EU 번호매김)의 아미노산은 글루탐산 (E)으로 치환되었다.
18. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 17 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄의 가변 도메인들은 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성한다.
19. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 18 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항체 중쇄의 가변 도메인들과 항체 경쇄는 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 흑색종-연합된 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 암-배아 항원 (CEA), CD19, CD20 및 CD33으로 구성된 군에서 선택된 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성한다.
20. 구체예 7 내지 구체예 19 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 TNF 리간드 패밀리 구성원은 인간 T-세포 활성화를 공동-자극한다.
21. 구체예 7 내지 구체예 20 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 TNF 리간드 패밀리 구성원은 4-1-BBL 및 OX40L로부터 선택된다.
22. 구체예 7 내지 구체예 21 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 TNF 리간드 패밀리 구성원은 4-1-BBL이다.
23. 구체예 7 내지 구체예 22 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 TNF 리간드 패밀리 구성원의 엑토도메인은 서열 식별 번호: 01, 서열 식별 번호: 02, 서열 식별 번호: 03, 서열 식별 번호: 04, 서열 식별 번호: 56, 서열 식별 번호: 100, 서열 식별 번호: 101 및 서열 식별 번호: 102로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
24. 구체예 7 내지 구체예 23 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 TNF 리간드 패밀리 구성원의 엑토도메인은 서열 식별 번호: 01 또는 서열 식별 번호: 56의 아미노산 서열을 포함한다.
25. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 24 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때
(a) 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄는 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 결합 부위를 형성하고,
(b) 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 05, 서열 식별 번호: 57, 서열 식별 번호: 58 및 서열 식별 번호: 59로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 01, 서열 식별 번호: 56, 서열 식별 번호: 03 및 서열 식별 번호: 04로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
26. 구체예 7 내지 구체예 21 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 TNF 리간드 패밀리 구성원은 OX40L이다.
27. 구체예 7 내지 구체예 21 및 구체예 26 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 TNF 리간드 패밀리 구성원의 엑토도메인은 서열 식별 번호: 43 또는 서열 식별 번호: 44의 아미노산 서열, 특히, 서열 식별 번호: 43의 아미노산 서열을 포함한다.
28. 구체예 7 내지 구체예 21 및 구체예 26 내지 구체예 27 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항체-다량체-융합체는
(a) 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 적어도 하나의 모이어티, 및
(b) 상기 제1 융합 폴리펩티드 및 제2 융합 폴리펩티드는 이황화 결합에 의해 서로 연계되며, 이때 상기 항원 결합 분자는 상기 제1 융합 폴리펩티드가 서열 식별 번호: 99 또는 서열 식별 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 융합 폴리펩티드가 서열 식별 번호: 43 또는 서열 식별 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
29. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 28 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항원은 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP)이다.
30. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 29 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄의 가변 도메인들은 FAP에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고, (i) 서열 식별 번호: 06 또는 서열 식별 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 식별 번호: 07 또는 서열 식별 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열 식별 번호: 08 또는 서열 식별 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열 식별 번호: 09 또는 서열 식별 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 식별 번호: 10 또는 서열 식별 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열 식별 번호: 11 또는 서열 식별 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
31. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 30 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄의 가변 도메인들은 FAP에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고, 서열 식별 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열 식별 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인, 또는 서열 식별 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열 식별 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하고, 또는 이때 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 98의 아미노산 서열을 포함한다.
32. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 31 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 (i) 상기 항체 중쇄는 서열 식별 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 상기 항체 경쇄는 서열 식별 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나, 또는 상기 항체 중쇄는 서열 식별 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 상기 항체 경쇄는 서열 식별 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, (ii) 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 13, 서열 식별 번호: 68, 서열 식별 번호: 71 및 서열 식별 번호: 73으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 14, 서열 식별 번호: 69, 서열 식별 번호: 70, 서열 식별 번호: 72 및 서열 식별 번호: 74로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
33. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 32 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 (i) 상기 항체 중쇄는 서열 식별 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 상기 항체 경쇄는 서열 식별 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나, 또는 상기 항체 중쇄는 서열 식별 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 상기 항체 경쇄는 서열 식별 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, (ii) 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 75, 서열 식별 번호: 77, 서열 식별 번호: 79 및 서열 식별 번호: 82로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 76, 서열 식별 번호: 78, 서열 식별 번호: 80 및 서열 식별 번호: 83로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
34. 청구항 1 내지 28 및 42 내지 47 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄는 (인간) FAP에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고, 상기 항체 중쇄는 서열 식별 번호: 141의 아미노산 서열을 보유하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 142의 아미노산 서열을 보유하고, 이때 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 80의 아미노산 서열을 포함한다.
35. 측면 1 또는 구체예 2 내지 구체예 28 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항원은 CEA이다.
36. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 28 및 구체예 35 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄의 가변 도메인들은 CEA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고, (i) 서열 식별 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 식별 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열 식별 번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열 식별 번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 식별 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열 식별 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
37. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 28 및 구체예 35 내지 구체예 36 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄의 가변 도메인들은 CEA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고, 서열 식별 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인과 서열 식별 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함한다.
38. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 28 및 구체예 35 내지 구체예 37 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 항체-다량체-융합체는
(i) 서열 식별 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄, 및 서열 식별 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 중쇄,
(ii) 서열 식별 번호: 13, 서열 식별 번호: 68, 서열 식별 번호: 71 및 서열 식별 번호: 73로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제1 융합 폴리펩티드, 및
(iii) 서열 식별 번호: 14, 서열 식별 번호: 69, 서열 식별 번호: 70, 서열 식별 번호: 72 및 서열 식별 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 제2 융합 폴리펩티드를 포함한다.
39. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 28 및 구체예 35 내지 구체예 38 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 항체-다량체-융합체는
(i) 서열 식별 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄, 및 서열 식별 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 중쇄,
(ii) 서열 식별 번호: 75, 서열 식별 번호: 77, 서열 식별 번호: 79 및 서열 식별 번호: 82로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제1 융합 폴리펩티드, 및
(iii) 서열 식별 번호: 76, 서열 식별 번호: 78, 서열 식별 번호: 80 및 서열 식별 번호: 83로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제2 융합 폴리펩티드를 포함한다.
40. 측면 1 및 구체예 2 내지 구체예 28 및 구체예 35 내지 구체예 39 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 항체-다량체-융합체는
(i) 서열 식별 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 식별 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열 식별 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는
(ii) 서열 식별 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 식별 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열 식별 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는
41. 측면 1 또는 구체예 2 내지 구체예 28 및 구체예 35 내지 구체예 40 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄는 (인간) CEA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고, 상기 항체 중쇄는 서열 식별 번호: 143의 아미노산 서열을 보유하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 92의 아미노산 서열을 보유하고, 이때 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 80의 아미노산 서열을 포함한다.
42. 측면 1 또는 구체예 2 내지 구체예 28 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항원은 CD19이다.
43. 측면 1 또는 구체예 2 내지 구체예 28 및 구체예 42중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄의 가변 도메인들은 CD19에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고, (i) 서열 식별 번호: 104 또는 서열 식별 번호: 105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 식별 번호: 106 또는 서열 식별 번호: 107의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열 식별 번호: 108 또는 서열 식별 번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열 식별 번호: 110 또는 서열 식별 번호: 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 식별 번호: 112 또는 서열 식별 번호: 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열 식별 번호: 114 또는 서열 식별 번호: 115의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
44. 측면 1 또는 구체예 2 내지 구체예 28 및 구체예 42 내지 구체예 43 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄의 가변 도메인들은 CD19에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고, 서열 식별 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열 식별 번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하고, 또는 서열 식별 번호: 118의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열 식별 번호: 119의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함한다.
45. 측면 1 또는 구체예 2 내지 구체예 28 및 구체예 42 내지 구체예 44 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때
(i) 상기 중쇄는 서열 식별 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나, 또는 상기 중쇄는 서열 식별 번호: 118의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 119의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나, 또는
(ii) 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 13, 서열 식별 번호: 68, 서열 식별 번호: 71 및 서열 식별 번호: 73로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
(iii) 상기 제2 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 14, 서열 식별 번호: 69, 서열 식별 번호: 70, 서열 식별 번호: 72 및 서열 식별 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
46. 측면 1 또는 구체예 2 내지 구체예 28 및 구체예 42 내지 구체예 45 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때
(i) 상기 중쇄는 서열 식별 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나, 또는 상기 중쇄는 서열 식별 번호: 118의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 119의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나, 또는
(ii) 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 75, 서열 식별 번호: 77, 서열 식별 번호: 79 및 서열 식별 번호: 82로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
(iii) 상기 제2 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 76, 서열 식별 번호: 78, 서열 식별 번호: 80 및 서열 식별 번호: 83로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
47. 측면 1 또는 구체예 2 내지 구체예 28 및 구체예 42 내지 구체예 45 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때
(i) 상기 중쇄는 서열 식별 번호: 120의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 121의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 122의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
(ii) 상기 중쇄는 서열 식별 번호: 123 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 124의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 122의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
(iii) 상기 중쇄는 서열 식별 번호: 125 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 126의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 127의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
(iv) 상기 중쇄는 서열 식별 번호: 128 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 129의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 127의 아미노산 서열을 포함한다.
48. 측면 1 또는 구체예 2 내지 구체예 28 및 구체예 42 내지 구체예 47 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄는 (인간) CD19에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고, 상기 항체 중쇄는 서열 식별 번호: 144의 아미노산 서열을 보유하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 127의 아미노산 서열을 보유하고, 이때 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 80의 아미노산 서열을 포함한다.
49. 측면 1 또는 구체예 2 내지 구체예 48 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 (부모계) 포유류 세포의 형질감염은 표적화된 통합 형질 감염이다.
50. 구체예 49에 따른 방법에서, 이때 상기 표적화된 통합 형질 감염은 이중 재조합효소 매개된 카세트 교환이다.
51. 구체예 49 내지 구체예 50 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 (부모계) 포유류 세포는 이의 게놈 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 랜딩 부위(landing site)를 갖는 CHO 세포이다.
52. 구체예 51에 따른 방법에서, 이때 상기 랜딩 부위는 제1 선별 마커와 제2 선별 마커를 포함하며, 이의 측면에 2개 RRS들이 있으며, 이때 상기 제1 선별 마커는 상기 제2 선별 마커와는 상이하다.
53. 구체예 52에 따른 방법에서, 이때 상기 제1 선별 마커는 글루타민 합성효소 선별 마커이며, 상기 제2 선별 마커는 GFP 형광 단백질이다.
54. 구체예 52에 따른 방법에서, 이때 상기 통합된 랜딩 부위는 티미딘 키나제 선별 마커 및 HYG 선별 마커를 포함한다.
55. 구체예 52 내지 구체예 54 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 선별 마커 양쪽에 측면에 있는 2개 RRS들은 상이하다.
56. 구체예 51 내지 구체예 55 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 랜딩 부위는 Cre 재조합효소 매개된 DNA 재조합을 위한 3개의 이형특이적 loxP 부위들을 포함한다.
57. 구체예 56에 따른 방법에서, 이때 상기 이형특이적 loxP 부위들은 L3, LoxFas 및 2L이다.
58. 구체예 57에 따른 방법에서, 이때 상기 L3 및 2L는 각각 5'-단부 및 3'-단부에 랜딩 부위 측면 배치되며, LoxFas는 상기 L3 부위와 2L 부위 사이에 위치한다.
59. 구체예 51 내지 구체예 58 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 랜딩 부위는 IRES를 통하여 상기 GFP 형광 단백질의 발현에 연계된 선별 마커의 발현에 연계된 바이시스트로닉 단위를 더 함유한다.
60. 측면 1 또는 구체예 2 내지 구체예 59 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드는 5'-에서 3'-방향으로 다음을 포함하는 상기 세포의 게놈 내 통합된, 데옥시리보핵산으로부터 발현된다:
- 상기 제1 융합 폴리펩티드를 인코드하는 제1 발현 카세트,
- 상기 제1 융합 폴리펩티드를 인코드하는 제2 발현 카세트,
- 상기 제2 융합 폴리펩티드를 인코드하는 제3 발현 카세트,
- 상기 항체 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
- 상기 항체 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트.
61. 측면 1 또는 구체예 2 내지 구체예 60 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 단일 부위 또는 유전자좌에서 상기 포유류 세포의 게놈으로 안정적으로 통합된다.
62. 구체예 60 내지 구체예 61 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 다음을 더 포함한다:
- 상기 제1 발현 카세트에 대해 5' (가장 5')에 위치한 제1 재조합 인지 서열,
- 상기 제5 발현 카세트의 3' (가장 3') 에 위치한 제2 재조합 인지 서열, 및
- 아래에 위치한 제3 재조합 인지 서열,
- 상기 제1 재조합 인자와 상기 제2 재조합 인지 서열 사이, 및
- 상기 제3 발현 카세트와 제4 발현 카세트 사이,
이때 모든 재조합 인지 서열들은 상이하다.
63. 구체예 60 내지 구체예 62 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 선별 마커를 인코딩하는 추가 발현 카세트를 더 포함한다.
64. 구체예 63에 따른 방법에서, 이때 상기 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트는 상기 제3 재조합 인지 서열에 대해 다음 중 하나에 위치한다:
i) 5'에, 또는
ii) 3'에, 또는
iii) 일부는 5'에, 및 일부는 3'에.
65. 구체예 63 내지 구체예 64 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트는 상기 제3 재조합 인지 서열에 대해 일부는 5'에 위치하며, 일부는 3'에 위치하며, 이때 전술한 발현 카세트의 5'-위치한 부분은 프로모터 및 시작-코돈을 포함하고, 전술한 발현 카세트의 3'-위치한 부분은 시작-코돈없는 상기 코딩 서열 및 polyA 신호를 포함한다.
66. 구체예 60 내지 구체예 65 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드를 인코딩하는 데옥시리보핵산는 선별 마커를 인코딩하는 추가 발현 카세트를 포함하고, 상기 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트는 상기 제3 재조합 인지 서열에 대해 일부는 5'에 위치하고, 일부는 3'에 위치하고, 이때 전술한 발현 카세트의 5'-위치한 부분은 프로모터 및 시작-코돈을 포함하고, 전술한 발현 카세트의 3'-위치한 부분은 시작-코돈없는 상기 코딩 서열 및 polyA 신호를 포함하고, 이때 상기 시작-코돈은 상기 코딩 서열에 작동가능하도록 연계된다.
67. 구체예 65 내지 구체예 66 중 임의의 하나에 따른 방법에서, 이때 상기 시작-코돈은 ATG이다.
본 발명은 상이한 폴리펩티드들을 포함하는 복합체 분자, 즉, 이형다량체인 항체-다량체-융합체의 발현을 위해, 특정된 발현 카세트 비율을 이용하면 포유류 세포, 이를 테면, HEK 세포 또는 CHO 세포에서 이들 항체-다량체-융합체를 효율적으로 발현 및 생산하게 된다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
본 발명은 상이한 폴리펩티드들을 포함하는 복합체 분자, 즉, 이형다량체인 항체-다량체-융합체의 일시적 발현 뿐만 아니라 안정적인 발현을 위해, 동일한 특정된 발현 카세트 비율을 이용하면 최고 발현 수율 및 산물의 품질을 얻게된다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
I. 정의
본원에서 이용된 바와 같이, 상기 중쇄와 경쇄의 모든 불변 영역 및 도메인의 아미노산 위치는 Kabat, et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에서 기술된 Kabat 번호매김 체계에 따라 번호매김되며, 본원에서 "Kabat에 따른 번호매김"으로 지칭된다. 특히, Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)의 Kabat 번호매김 체계 (페이지 647-660 참고)는 카파 및 람다 동형(isotype)의 경쇄 불변 도메인 CL에 이용되며, Kabat EU 색인 번호매김 체계 (페이지 661-723 참고)는 불변 중쇄 도메인 (CH1, 힌지, CH2 및 CH3)에 이용되며, 이는 본원에서 이 경우에서 "Kabat EU 색인에 따른 번호매김"으로 지칭함으로써 더 명확하게 한다).
노브-인투-홀(knobs into holes)의 이량체화 및 항체 공작에서 이의 사용에 관해서 Carter P.; Ridgway J.B.B.; Presta L.G.: Immunotechnology 2 (1996) 73-73(1)에서 기술된다.
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 전반적인 정보는 다음에서 제공된다: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
본 발명을 실행하기 위한 유용한 방법들과 기술들은 예를 들면, Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997); Glover, N.D., and Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (1985), Oxford University Press; Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture - a practical approach, IRL Press Limited (1986); Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, Second, CHSL Press (1992); Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J., ed., Cell Biology, Second Edition, Academic Press (1998); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, second edition, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987)에서 기술된다.
재조합 DNA 기술을 사용하면 핵산 유도체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 치환, 변경, 교환, 결실 또는 삽입에 의해, 개별 뉴클레오티드 위치 또는 다수의 뉴클레오티드 위치에서 이러한 유도체들은 변형될 수 있다. 변형 또는 유도체화는 예를 들어, 부위 지향된 돌연변이생성에 의해 수행될 수 있다. 이러한 변형은 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다 (예를 들면, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B.D., and Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England 참고).
본 명세서 및 첨부된 구체예들에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수 언급이 내포된다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들면, "하나의 세포"에 대한 언급에는 복수의 이러한 세포 및 당업자에게 공지된 이의 등가물 및 기타 등등이 내포된다. 마찬가지로, 용어 단수 부정관사("a", "an"), "하나 또는 그 이상의" 및 "적어도 하나"는 상호 교환적으로 사용된다. "포함하는", "내포하는" 및 "보유하는"이라는 용어는 상호 교환적으로 사용될 수 있음에 유의해야 한다.
용어 "약(about)"은 이 용어 다음의 수치의 +/- 20% 범위를 나타낸다. 한 구체예에서, 용어 "약(about)"은 이 용어 다음의 수치의 +/- 10% 범위를 나타낸다. 한 구체예에서, 용어 "약(about)"은 이 용어 다음의 수치의 +/- 5% 범위를 나타낸다.
"~를 포함하는"이라는 용어는 "~로 구성되는"이라는 용어를 또한 포괄한다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 세포"란 최종 유전적 변형 후의 세포, 예를 들어, 관심대상의 폴리펩티드를 발현시키고, 임의의 규모에서 상기 관심대상 폴리펩티드의 생산에 사용될 수 있는 세포를 의미한다. 예를 들면, 재조합효소 매개된 카세트 교환(RMCE)를 겪었고, 이로 인하여 관심대상의 폴리펩티드에 대한 코딩 서열이 숙주 세포의 게놈 내로 도입된 "외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유류 세포"가 "재조합 세포"이다. 비록 이 세포는 여전히 추가 RMCE 반응을 수행할 수 있지만, 그렇게 하도록 의도된 것은 아니다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "재조합 포유류 세포"는 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유류 세포를 말하다. 이러한 재조합 포유류 세포들은 이러한 세포들의 자손을 비롯한, 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산(들)이 도입된 세포이다. 따라서, 용어 "이종성(heterologous) 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유류 세포"란 이 포유류 세포의 게놈에 통합되고, 해당 이종성 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 외인성 뉴클레오티드 서열를 포함하는 세포를 말한다. 하나의 구체예에서, 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유류 세포는 해당 숙주 세포의 게놈의 유전자좌내 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포이며, 이때 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 제1 선별 마커의 측면에 있는 제1 재조합 인지 서열과 제2 재조합 인지 서열, 및 상기 제1 재조합 인지 서열과 제2 재조합 인지 서열 사이에 위치한 제3 재조합 인지 서열을 포함하며, 이들 모든 재조합 인지 서열은 상이하다.
"외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유류 세포 " 및 "재조합 세포"는 모두 "형질전환된 세포"이다. 이 용어에는 일차 형질전환된 세포, 뿐만 아니라 계대의 수에 관계없이 이로부터 파생된 자손이 내포된다. 자손은 예를 들면, 핵산 함량이 부모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 그러나 돌연변이를 함유할 수 있다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 또는 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포괄된다.
용어 "통합 부위"는 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입된, 세포의 게놈 내 핵산 서열을 뜻한다. 특정 구체예들에서, 통합 부위는 세포 게놈 내 2개 인접 뉴클레오티드 사이에 위치한다. 특정 구체예들에서, 통합 부위에는 뉴클레오티드 서열 띠가 내포된다. 특정 구체예들에서, 상기 통합 부위는 포유류 세포의 게놈의 특정 유전자좌 내에 위치한다. 특정 구체예들에서, 상기 통합 부위는 포유류 세포의 내인성 유전자 내에 있다.
용어 "벡터" 또는 "플라스미드"는 호환이용될 수 있으며, 본원에서 이용된 바와 같이, 이에 연계되어 있는 또다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어에는 숙주 세포 안으로 도입되어, 숙주 세포의 게놈에 통합된 백터, 뿐만 아니라 자가-복제가능한 핵산 구조로써의 벡터가 내포된다. 특정 벡터들은 이들에게 작동가능하도록 연계된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 본원에서는 상기 벡터를 "발현 벡터"라고 한다.
용어 "~에 결합하는"이란 이의 표적에 대한 결합 부위의 결합을 나타내는데, 이를 테면, 예를 들면, 각각의 항원에 대한 항체 중쇄 가변 도메인와 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 결합 부위의 결합을 뜻한다. 이러한 결합은 예를 들면, BIAcore® 분석 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)을 이용하여 결정할 수 있다. 즉, 용어 "(항원에) 결합하는"이란 시험관내 분석에서 항체가 이의 항원(들)에 대해 결합한다는 것을 뜻한다. 하나의 구체예에서, 결합은 결합 분석에 의해 결정되는데, 이때 해당 항체는 표면에 결합되고, 이 항체에 대한 항원의 결합은 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정된다. 결합이란 예를 들면, 10-8 M 또는 이 미만의 결합 친화성 (KD)을, 일부 구체예들에서 10-13 내지 10-8 M의 결합 친화성을, 일부 구체예들에서 10-13 내지 10-9 M의 결합 친화성을 의미한다. 용어 "결합하는"이란 또한 용어 "특이적 결합"이 또한 내포된다.
예를 들면, BIAcore® 분석의 하나의 있을 수 있는 구체예에서, 상기 항원은 표면에 결합하고, 항체의 결합, 즉, 이의 결합 부위(들)에의 결합은 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 측정된다. 결합 친화성은 용어 ka (복합체 형성을 위한 연합에서 연합 상수: 속도 상수), kd (상기 복합체의 해리를 위한 해리 상수; 속도 상수), 및 KD (kd/ka)로 정의된다. 대안적으로, SPR 센서그램의 결합 신호는 공명 신호 높이 및 해리 거동과 관련하여, 참조의 응답 신호와 직접 비교할 수 있다.
용어 "결합 부위"는 표적에 대해 결합 특이성을 나타내는 임의의 단백질성 엔터티를 뜻한다. 이는 예를 들면, 수용체, 수용체 리간드, 안티칼린, 아피바디(affibody), 항체, 등등일 수 있다. 따라서, 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "결합 부위"란 폴리펩티드가 특이적으로 결합할 수 있는, 또는 제2 폴리펩티드에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 폴리펩티드를 뜻한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "외인성"이란 뉴클레오티드 서열가 특정 세포로부터 기원되지 않고, DNA 전달 방법, 예를 들면, 형질감염, 전기천공, 또는 형질변환 방법들에 의해 전술한 세포로 도입될 수 있음을 의미한다. 따라서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 인위적인 서열이며, 이때 이러한 인위성은 예를 들면, 상이한 기원의 하위서열의 조합 (예를 들면, SV40 프로모터가 있는 재조합효소 인지 서열과 녹색 형광 단백질의 코딩 서열의 조합은 인위적인 핵산임)으로부터 기인될 수 있거나 또는 서열의 일부분의 결실 (예를 들면, 막-결합된 수용체의 세포외 도메인만을 코딩하는 서열, 또는 cDNA)로부터 기인될 수 있거나, 또는 핵염기의 돌연변이로 기인될 수 있다. 용어 "내인성"이란 세포로부터 기인된 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. "외인성" 뉴클레오티드 서열은 기본 조성에서는 동일한 "내인성" 대응부(counterpart)를 가질 수 있고, 그러나 여기에서 상기 "외인성" 서열은 예를 들면, 재조합 DNA 기술을 통하여 해당 세포로 도입된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "선별 마커"는 해당 유전자를 휴대하는 세포가 상응하는 선별제의 존재 하에 이 유전자를 특이적으로 선택하도록 만들거나, 또는 이 유전자에 반하게 선택되도록 유전자를 뜻한다. 예를 들면, 이에 국한되지는 않지만, 선별 마커는 각 선별제의 존재 하에서(선별적 배양 조건) 이 선별 마커 유전자에 의해 형질전환된 숙주 세포를 양성적으로 선별되도록 만들 수 있고; 형질전환-안된 숙주 세포는 이러한 선별적 배양 조건 하에서 성장할 수 없거나, 또는 생존할 수 없다. 선별 마커는 양성적, 음성적, 또는 이중-기능적일 수 있다. 양의 선별 마커는 해당 마커를 유대하고 있는 세포가 선택될 수 있도록 하며, 반면 음성적 선별 마커는 해당 마커를 휴대하고 있는 세포들을 선택적으로 제거되도록 할 수 있다. 선별 마커는 약물에 대한 내성을 부여하거나, 또는 숙주 세포의 대사적 결함 또는 이화작용적 결함을 보상할 수 있다. 그중에서도, 원핵 세포에서 암피실린, 테트라사이클린, 카나마이신 또는 클로람페니콜에 대한 내성을 부여하는 유전자가 사용될 수 있다. 진핵 세포에서 선별 마커로 유용한 저항성 유전자에는 다음의 것들이 내포되나, 이에 국한되지 않는다: 아미노글리코시드 포스포트란스퍼라제 (APH) (예를 들면, 하이그로마이신 포스포트란스퍼라제 (HYG), 네오마이신 및 G418 APH), 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 티미딘 키나제 (TK), 글루타민 합성효소 (GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소 (인돌), 히스티디놀 탈수소효소 (히스티디놀 D)에 대한 유전자, 및 푸로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, Zeocin, 및 미코페놀산에 대한 저항성을 인코딩하는 유전자. 추가 마커 유전자들은 WO 92/08796 및 WO 94/28143에서 기술된다.
상응하는 선별제의 존재 하에서 선별의 용이성을 넘어, , 선별 마커는 대안적으로 해당 세포에 정상적으로 존재하지 않은 분자일 수도 있는데, 예를 들면, 녹색 형광 단백질 (GFP), 강화된 GFP (eGFP), 합성 GFP, 황색 형광 단백질 (YFP), 강화된 YFP (eYFP), 청록 형광 단백질 (CFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-red, DsRed-단량체, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald, CyPet, mCFPm, Cerulean, 및 T-Sapphire일 수 있다. 이러한 분자를 발현시키는 세포들은 예를 들어, 인코딩된 폴리펩티드에 의해 방출된 각각 형광의 검출 또는 이러한 형광의 부재에 의해, 이 유전자를 휴대하지 않는 세포들과 구별될 수 있다.
용어 "섬유아세포 활성화 단백질 (FAP)"는 프롤릴 엔도펩티다제 FAP 또는 Seprase (EC 3.4.21)로도 공지되어 있으며, 이것은 달리 명시되지 않는 한, 영장류(예를 들면, 인간) 비-인간 영장류(예를 들면, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 쥐)와 같은 포유류를 비롯하여, 임의의 척추동물 기원의 임의의 천연 FAP를 지칭한다. 이 용어는 "전장"의, 비-처리된 FAP, 뿐만 아니라 세포에서 처리된 임의의 형태의 FAP를 포괄한다. 이 용어는 FAP로부터 자연 발생적인 변이체, 예를 들면, 스플라이스(splice) 변이체들 또는 대립유전자 변이체들을 또한 포괄한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 인간, 마우스 및/또는 사이노몰구스 FAP에 특이적 결합을 할 수 있다. 인간 FAP의 아미노산 서열은 UniProt (www.uniprot.org) 수탁 번호 Q12884 (버젼 149, 서열 식별 번호: 17), 또는 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2에서 도시된다. 인간 FAP의 세포외 도메인 (ECD)은 아미노산 위치 26에서 아미노산 위치 760까지다. His-테그된 인간 FAP ECD의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 식별 번호: 14 및 서열 식별 번호: 15로 나타낸다. 마우스 FAP의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P97321 (버젼 126, 서열 식별 번호: 18), 또는 NCBI RefSeq NP_032012.1에서 도시된다. 마우스 FAP의 세포외 도메인 (ECD)은 아미노산 위치 26에서 아미노산 위치 761까지다. 서열 식별 번호: 19 및 서열 식별 번호: 20은 His-테그된 마우스 FAP ECD의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열을 각각 나타낸다. 서열 식별 번호: 21 및 서열 식별 번호: 22은 His-테그된 사이노몰구스 FAP ECD의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열을 각각 나타낸다. 선호적으로는, 본 발명의 항-FAP 결합 분자는 FAP의 세포외 도메인에 결합한다. 항-FAP 결합 분자들의 예시는 WO 2012/020006에서 기술된다.
용어 "TNF 리간드 패밀리 구성원" 또는 "TNF 패밀리 리간드"는 전-염증성 사이토킨을 지칭한다. 일반적으로 사이토킨, 특히 TNF 리간드 패밀리의 구성원은 면역계의 자극 및 조화(coordination)에 중요한 역할을 한다. 현재, 19개의 사이토킨이 서열, 기능 및 구조적 유사성에 기초하여, TNF(종양 괴사 인자) 리간드 슈퍼패밀리의 구성원으로 확인되었다. 이들 모든 리간드는 C-말단 세포외 도메인 (엑토도메인), N-말단 세포내 도메인 및 단일 막경유 도메인을 갖는 유형 II 막경유 단백질이다. TNF 상동성 도메인(THD)으로 알려진 C-말단 세포외 도메인은 수퍼패밀리 구성원 사이에 20-30% 아미노산 동일성을 가지며, 수용체에 대한 결합을 담당한다. 상기 TNF 엑토도메인은 TNF 리간드가 이들의 특이적 수용체들에 의해 인지되는 삼량체 복합체를 형성을 담당한다.
상기 TNF 리간드 패밀리의 구성원은 다음으로 구성된 군에서 선별된다: Lymphotoxin α (LTA 또는 TNFSF1로도 공지됨), TNF (TNFSF2로도 공지됨), LTβ (TNFSF3로도 공지됨), OX40L (TNFSF4로도 공지됨), CD40L (CD154 또는 TNFSF5로도 공지됨), FasL (CD95L, CD178 또는 TNFSF6로도 공지됨), CD27L (CD70 또는 TNFSF7로도 공지됨), CD30L (CD153 또는 TNFSF8로도 공지됨), 4-1-BBL (TNFSF9로도 공지됨), TRAIL (APO2L, CD253 또는 TNFSF10로도 공지됨), RANKL (CD254 또는 TNFSF11로도 공지됨), TWEAK (TNFSF12로도 공지됨), APRIL (CD256 또는 TNFSF13로도 공지됨), BAFF (CD257 또는 TNFSF13B로도 공지됨), LIGHT (CD258 또는 TNFSF14로도 공지됨), TL1A (VEGI 또는 TNFSF15로도 공지됨), GITRL (TNFSF18로도 공지됨), EDA-A1 (엑토디스플라신 A1로도 공지됨) 및 EDA-A2 (엑토디스플라신 A2로도 공지됨)로 구성된 군에서 선택된 . 상기 용어는 달리 명시되지 않는 한, 포유류, 이를 테면, 영장류 (예를 들면, 인간), 비-인간 영장류 (예를 들면, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류 (예를 들면, 마우스와 쥐)를 비롯한 임의의 척추동물 기원으로부터 임의의 고유한 TNF 패밀리 리간드를 지칭한다. 본 발명의 특이적 구체예들에서, 상기 TNF 리간드 패밀리 구성원은 OX40L, FasL, CD27L, TRAIL, 4-1-BBL, CD40L 및 GITRL로 구성된 군에서 선택된다. 특정 구체예에서, 상기 TNF 리간드 패밀리 구성원은 4-1-BBL 및 OX40L에서 선택된다.
추가 정보, 특히 TNF 리간드 계열 구성원의 서열은 UniProt(www.uniprot.org)와 같이 공개적으로 액세스 가능한 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 에를 들어, 상기 인간 TNF 리간드들은 다음의 아미노산 서열들을 보유한다: 인간 Lymphotoxin α (UniProt 수탁 번호 P01374, 서열 식별 번호: 24), 인간 TNF (UniProt 수탁 번호 P01375, 서열 식별 번호: 25), 인간 Lymphotoxin α (UniProt 수탁 번호 Q06643, 서열 식별 번호: 26), 인간 OX40L (UniProt 수탁 번호 P23510, 서열 식별 번호: 27), 인간 CD40L (UniProt 수탁 번호 P29965, 서열 식별 번호: 28), 인간 FasL (UniProt 수탁 번호 P48023, 서열 식별 번호: 29), 인간 CD27L (UniProt 수탁 번호 P32970, 서열 식별 번호: 30), 인간 CD30L (UniProt 수탁 번호 P32971, 서열 식별 번호: 31), 4-1-BBL (UniProt 수탁 번호 P41273, 서열 식별 번호: 32), TRAIL (UniProt 수탁 번호 P50591, 서열 식별 번호: 33), RANKL (UniProt 수탁 번호 O14788, 서열 식별 번호: 34), TWEAK (UniProt 수탁 번호 O43508, 서열 식별 번호: 35), APRIL (UniProt 수탁 번호 O75888, 서열 식별 번호: 36), BAFF (UniProt 수탁 번호 Q9Y275, 서열 식별 번호: 37), LIGHT (UniProt 수탁 번호 O43557, 서열 식별 번호: 38), TL1A (UniProt 수탁 번호 O95150, 서열 식별 번호: 39), GITRL (UniProt 수탁 번호 Q9UNG2, 서열 식별 번호: 40) 및 엑토디스플라신 A (UniProt 수탁 번호 Q92838, 서열 식별 번호: 41).
"엑토도메인"은 세포외 공간(즉, 표적화된 세포 외부 공간)으로 확장되는 막 단백질의 도메인이다. 엑토도메인은 일반적으로 신호 전달을 유도하는 표면과의 접촉을 시작하는 단백질의 일부이다. 따라서, 본원에서 특정된 바와 같이, TNF 리간드 패밀리 구성원의 엑토도메인은 세포외 공간 (세포외 도메인)으로 확장되는 TNF 리간드 단백질의 일부분을 지칭할 뿐만 아니라, 대응하는 TNF 수용체에 대한 결합을 담당하는 더 짧은 부분들 또는 이의 단편들도 또한 내포된다. 따라서, 용어 "TNF 리간드 패밀리 구성원 또는 이의 단편의 엑토도메인"은 세포외 도메인을 형성하는 TNF 리간드 패밀리 구성원의 세포외 부분을 지칭하거나, 또는 수용체 (수용체 결합 도메인)에 여전히 결합할 수 있는 부분을 지칭한다.
용어 "동시-자극성 TNF 리간드 패밀리 구성원" 또는 "동시-자극성 TNF 패밀리 리간드"이란 T-세포의 증식 및 사이토킨 생산을 동시-자극할 수 있는 TNF 리간드 패밀리 구성원의 하위집단을 지칭한다. 이러한 TNF 계열 리간드들은 해당 TNF 수용체와 상호 작용할 때 TCR 신호를 공동 자극할 수 있고, 이들의 수용체와의 상호작용은 TNFR-연관 인자(TRAF)의 모집으로 이어지며, 이로써 T-세포 활성화를 초래하는 신호 캐스케이드가 개시된다. 동시-자극성 TNF 패밀리 리간드들은 4-1-BBL, OX40L, GITRL, CD70, CD30L 및 LIGHT로 구성된 군에서 선택되며, 더 구체적으로 상기 동시-자극성 TNF 리간드 패밀리 구성원은 4-1-BBL 및 OX40L로 구성된 군에서 선택된다.
앞서 본원에서 기술된 바와 같이, 4-1-BBL은 유형 II 막경유 단백질이며, 상기 TNF 리간드 패밀리의 한 구성원이다. 서열 식별 번호: 32의 아미노산 서열을 갖는 완전한 또는 전장의 4-1-BBL은 세포 표면에 삼량체를 형성하는 것으로 기술되었다. 트리머의 형성은 4-1-BBL의 엑토도메인의 특정 모티브에 의해 가능하다. 전술한 모티브(motives)는 본원에서 "삼량체화 영역"으로 지정된다. 인간 4-1-BBL 서열의 아미노산 50-254 (서열 식별 번호: 42)은 4-1-BBL의 세포외 도메인을 형성하고, 심지어 이의 단편들도 상기 삼량체를 형성할 수 있다. 본 발명의 특이적 구체예들에서, 용어 "4-1-BBL 또는 이의 단편의 엑토도메인"은 서열 식별 번호: 04 (인간 4-1-BBL의 아미노산 52-254 of ), 서열 식별 번호: 01 (인간 4-1-BBL의 아미노산 71-254), 서열 식별 번호: 03 (인간 4-1-BBL의 아미노산 80-254) 및 서열 식별 번호: 02 (인간 4-1-BBL의 아미노산 85-254)로부터 선택된 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드, 또는 서열 식별 번호: 56 (인간 4-1-BBL의 아미노산 71-248), 서열 식별 번호: 102 (인간 4-1-BBL의 아미노산 52-248), 서열 식별 번호: 101 (인간 4-1-BBL의 아미노산 80-248) 및 서열 식별 번호: 100 (인간 4-1-BBL의 아미노산 85-248)로부터 선택된 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드를 지칭하고, 뿐만 아니라 삼량체화를 할 수 있는 상기 엑토도메인의 다른 단편들도 여기에 내포된다.
앞서 본원에서 기술된 바와 같이, OX40L은 유형 II의 또다른 막경유 단백질이며, 상기 TNF 리간드 패밀리의 추가 구성원이다. 완전한 또는 전장의 인간 OX40L은 서열 식별 번호: 27의 아미노산 서열을 보유한다. 인간 OX40L 서열의 아미노산 51-183 (서열 식별 번호: 43)은 OX40L의 세포외 도메인을 형성하고, 심지어 이의 단편들도 상기 삼량체를 형성할 수 있다. 본 발명의 특이적 구체예들에서, 용어 "OX40L 또는 이의 단편의 엑토도메인"은 서열 식별 번호: 43 (인간 OX40L의 아미노산 51-183) 또는 서열 식별 번호: 44 (인간 OX40L의 아미노산 52-183)로부터 선택된 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드를 지칭하고, 뿐만 아니라 삼량체화를 할 수 있는 상기 엑토도메인의 다른 단편들도 여기에 내포된다.
용어 "펩티드 링커"란 하나 또는 그 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20개 아미노산을 포함하는 펩티드를 지칭한다. 펩티드 링커들은 당분야에 공지되어 있거나, 또는 본원에서 기술된다. 적합한, 비-면역원성 링커 펩티드들은 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커이며, 이때 "n"은 일반적으로 1과 10 사이의 숫자, 전형적으로 1과 4 사이의 숫자, 구체적으로 2이며, 가령, GGGGS (서열 식별 번호: 81), GGGGSGGGGS (서열 식별 번호: 12), SGGGGSGGGG (서열 식별 번호: 45) 및 GGGGSGGGGSGGGG (서열 식별 번호: 46)로 구성된 군에서 선택된 펩티드이고, 또한 서열GSPGSSSSGS (서열 식별 번호: 47), GSGSGSGS (서열 식별 번호: 48), GSGSGNGS (서열 식별 번호: 49), GGSGSGSG (서열 식별 번호: 50), GGSGSG (서열 식별 번호: 51), GGSG (서열 식별 번호: 52), GGSGNGSG (서열 식별 번호: 53), GGNGSGSG (서열 식별 번호: 54) 및 GGNGSG (서열 식별 번호: 55)이 내포된다. 특히 관심대상의 펩티드 링커는 (G4S)1 또는 GGGGS (서열 식별 번호: 81), (G4S)2 또는 GGGGSGGGGS (서열 식별 번호: 12) 및 GSPGSSSSGS (서열 식별 번호: 47), 더 구체적으로 (G4S)2 또는 GGGGSGGGGS (서열 식별 번호: 12) 및 GSPGSSSSGS (서열 식별 번호: 47)이다.
"융합된" 또는 "연결된"이란 구성요소(예를 들어, 상기 TNF 리간드 패밀리 구성원의 폴리펩티드 및 엑토도메인)가 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해, 펩티드 결합에 의해 연결됨을 의미한다.
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반 정보는 다음에서 제공된다: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
"중쇄"라는 용어는 본 명세서에서 원래의 의미, 즉 항체를 형성하는 4개의 폴리펩티드 쇄 중 2개의 더 큰 폴리펩티드 쇄를 나타내는 것으로 사용된다 ( 예를 들면, Edelman, G.M. and Gally J.A., J. Exp. Med. 116 (1962) 207-227 참고). 이 문맥에서 용어 "더 큰"이란 분자량, 길이 및 아미노산의 갯수 중 임의의 것을 의미할 수 있다. "중쇄"라는 용어는 이 중쇄가 존재하는 개별 항체 도메인의 서열 및 수와는 무관하다. 이 용어는 전적으로 각 폴리펩티드의 분자량에 따라 지정된다.
"경쇄"라는 용어는 본 명세서에서 원래의 의미, 즉 항체를 형성하는 4개의 폴리펩티드 쇄 중 2개의 더 작은 폴리펩티드 쇄를 나타내는 것으로 사용된다(예를 들면, Edelman, G.M. and Gally J.A., J. Exp. Med. 116 (1962) 207-227 참고). 이 문맥에서 용어 "더 작은"이란 분자량, 길이 및 아미노산의 갯수 중 임의의 것을 의미할 수 있다. "경쇄"라는 용어는 이 중쇄가 존재하는 개별 항체 도메인의 서열 및 수와는 무관하다. 이 용어는 전적으로 각 폴리펩티드의 분자량에 따라 지정된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 상기 중쇄와 경쇄의 모든 불변 영역 및 도메인의 아미노산 위치는 Kabat, et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에서 기술된 Kabat 번호매김 체계에 따라 번호매김되며, 본원에서 "Kabat에 따른 번호매김"으로 지칭된다. 특히, Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)의 Kabat 번호매김 체계 (페이지 647-660 참고)는 카파 및 람다 동형(isotype)의 경쇄 불변 도메인 CL에 이용되며, Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)의 Kabat EU 색인 번호매김 체계 (페이지 661-723 참고)는 불변 중쇄 도메인 (CH1, 힌지, CH2 및 CH3)에 이용되며, 이는 본원에서 이 경우에서 "Kabat EU 색인에 따른 번호매김"으로 지칭함으로써 더 명확하게 한다).
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 전장의 항체, 단클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 및 항체-항체 단편-융합체, 뿐만 아니라 이의 조합을 비롯한, 각종 항체 구조를 포괄한다.
용어 "항체 결합 부위"란 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인 쌍을 의미한다. 항원에 대한 적절한 결합을 보장하기 위해, 이러한 가변 도메인은 동족 가변 도메인, 즉 함께 속한다. 항체 결합 부위는 적어도 3개의 HVRs (예를 들면, VHH의 경우에) 또는 3-6개의 HVRs (예를 들면, 자연 발생적, 가령, VH/VL 쌍을 갖는 통상적 항체의 경우)를 포함한다. 일반적으로, 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기가 결합 부위를 형성하고 있다. 이들 잔기는 통상적으로, 항체 중쇄 가변 도메인과 이에 대응하는 항체 경쇄 가변 도메인의 쌍에 함유되어 있다. 상기 항체의 항원-결합 부위는 "초가변 영역" 또는 "HVRs"의 아미노산 잔기들을 포함한다. "틀구조(framework)" 또는 "FR" 영역들은 본원에서 특정된 초가변 영역 잔기 또는 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 영역들이다. 따라서, 항체의 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, FR1, HVR1, FR2, HVR2, FR3, HVR3 및 FR4 영역들을 포함한다. 특히, 상기 중쇄 가변 도메인의 HVR3 영역은 항원 결합에 가장 많이 기여하고, 항체의 결합 특이성을 특정하는 영역이다. "기능적 결합 부위"는 이의 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. "~에 특이적으로 결합하는"이라는 용어는 시험관내 분석에서, 하나의 구체예로, 결합 분석에서 이의 표적에 대한 결합 부위의 결합을 나타낸다. 그러한 결합 분석은 결합 이벤트가 검출될 수 있는 한, 임의의 분석이 될 수 있다. 예를 들면, 항체가 표면에 결합되고, 항체에 대한 항원(들)의 결합은 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정되는 분석에 의해 측정된다. 대안으로, 브릿징(bridging) ELISA가 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변인 아미노산 잔기 띠를 포함하고 (본원에서 공통적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDRs"으로도 지칭됨) 및/또는 구조적으로 정의된 루프 ("초가변 루프")를 형성하고 및/또는 항원- 함유 잔기들 ("항원 접촉부")을 함유하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개 HVRs를 포함한다; 중쇄 가변 도메인 VH (H1, H2, H3)에 3개, 및 상기 경쇄 가변 도메인 VL (L1, L2, L3) 3개.
HVRs에는 다음이 내포된다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에서 생성되는 초가변 루프 (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에서 생성되는 CDRs (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에서 생성되는 항원 접촉부(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및
(d) 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3)를 비롯한, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.
다른 언급이 없는 한, HVR 잔기와 가변적 도메인 (예로써, FR 잔기)에 있는 다른 잔기들은 Kabat et al., 에 따라 번호매김된다.
항체의 "부류(class)"는 항체의 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역, 선호적으로는 Fc-영역의 유형을 말한다. 항체에는 5 가지 주요 부류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 및 이들중 몇 가지는 하위클래스(이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더 세분될 수 있다. 면역글로블린의 상이한 부류에 대응하는 중쇄-불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다.
용어 "중쇄 불변 영역"은 불변 도메인을 함유하는 면역글로불린 중쇄 영역을 뜻하는데, 가령, 고유의 면역글로불린의 경우, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 말하거나, 또는 전장의 면역글로불린의 경우, 제1 불변 도메인, 힌지 영역,제2 불변 도메인 및 제3 불변 도메인을 뜻한다. 하나의 구체예에서, 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 해당 중쇄의 Ala118 (Kabat EU 색인에 따른 번호매김)에서 카르복실-말단까지다. 그러나, 상기 불변 영역의 C-말단 리신 (Lys447)(Kabat EU 색인에 따른 번호매김)은 존재할 수도, 또는 존재하지 않을 수도 있다. 용어 "불변 영역"이란 쇄-간 이황화 결합을 형성하는 힌지 영역 시스테인 잔기들을 통해 서로 공유적으로 연계될 수 있는 2개의 중쇄 불변 영역을 포함하는 이량체를 나타낸다.
용어 "중쇄 Fc-영역"은 힌지 영역 (중간 및 하부 힌지 영역), 제2 불변 도메인, 예를 들면, CH2 도메인, 및 제3 불변 도메인, 예를 들면, CH3 도메인 중 적어도 일부분을 함유하는, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 뜻한다. 하나의 구체예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Asp221, 또는 Cys226, 또는 Pro230 (Kabat EU 색인에 따른 번호매김)에서 중쇄의 카르복실-말단까지다. 따라서, Fc-영역은 불변 영역보다 더 작지만, C-말단 부분은 이와 동일하다. 그러나, 중쇄 Fc-영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수도, 또는 존재하지 않을 수도 있다 (Kabat EU 색인에 따른 번호매김). 용어 "Fc-영역"은 쇄-간 이황화 결합을 형성하는 힌지 영역 시스테인 잔기들을 통해 서로 공유적으로 연계될 수 있는 2개 중쇄 Fc-영역을 포함하는 이량체를 의미한다.
항체의 불변 영역, 보다 정확하게는 Fc-영역(및 마찬가지로 불변 영역)은 보체 활성화, C1q 결합, C3 활성화 및 Fc 수용체 결합에 직접적으로 연루된다. 보체 시스템에 대한 항체의 영향은 특정 조건에 따라 다르지만, C1q에 대한 결합은 Fc 영역의 정의된 결합 부위에 의해 발생된다. 이러한 결합 부위들은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들면, Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; 및 EP 0 307 434에 기술되어 있다. 이러한 결합 부위는 예를 들면, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329 (Kabat의 EU 색인에 따른 번호매김)이다. 하위부류 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체는 일반적으로 보체 활성화, C1q 결합 및 C3 활성화를 나타내고, 반면 IgG4는 보체 시스템을 활성화시키지 않고, C1q에 결합하지 않으며, C3를 활성화시키지 않는다. "항체의 Fc-영역"은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 항체의 파파인 절단에 기초하여 특정된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 실제적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 획득된 항체를 지칭하며, 즉, 상기 개체군을 구성하는 개별 항체는 동일하거나, 및/또는 예를 들면, 자연 발생 돌연변이를 내포하거나 또는 단일클론 항체 제조물의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체 (이런 변이체는 일반적으로 미량으로 존재함)들을 제외하고, 같은 에피토프에 결합한다. 상이한 결정인자 (에피토프)를 지향하는 상이한 항체들이 전형적으로 내포되는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 단일클론 항체 제조물의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정인자를 지향한다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 균질한 개체군으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 표시하고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 단클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파아지-디스플레이 방법 및 인간 면역 글로불린 좌의 전부 또는 일부를 함유하는 이식유전자를 가진 동물을 이용하는 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
본 출원 내에서 사용되는 용어 "가(valent)"는 항체에서 특정 수의 결합 부위가 존재함을 나타낸다. 이와 같이, 용어 "2가(bivalent)", "4가(tetravalent)", 및 "6가(hexavalent)"는 각각 2개 결합 부위, 4개 결합 부위, 및 6개 결합 부위가 존재함을 나타낸다.
"단일특이적 항체"는 단일 결합 특이성을 갖는 항체, 즉, 하나의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 나타낸다. 단일특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들면, F(ab')2) 또는 이들의 조합(예를 들면, 전장 항체 + 추가적인 scFv 단편 또는 Fab 단편)으로 준비될 수 있다. 단일특이적 항체는 1가(monovalent)일 필요가 없으며, 즉, 단일특이적 항체는 하나의 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 고유 항체는 단일특이적이지만, 2가이다.
"노브-인투-홀(knobs into holes)" 이량체화 및 항체 공작에서 이의 사용에 관해서 Carter P.; Ridgway J.B.B.; Presta L.G.: Immunotechnology 2 (1996) 73-73(1)에서 기술된다.
항체의 중쇄에서 CH3 도메인은 "노브-인투-홀(knob-into-holes)" 기술에 의해 변경될 수 있으며, 몇 가지 예시들이 예를 들면, WO 96/027011, Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; 및 Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681에서 기술된다. 이 방법에서, 2개의 CH3 도메인의 상호작용 표면은 이들 2개의 CH3 도메인 및 이를 포함하는 폴리펩티드의 이종이량체화를 증가시키도록 변경된다. 2개의 각 CH3 도메인 (2개 중쇄의)은 "노브"일 수 있고, 다른 하나는 "홀"이 될 수 있다. 이황화 가교의 도입으로 이종이량체는 더욱 안정화되고 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35), 수율은 증가된다.
(항체 중쇄의) CH3 도메인에서 돌연변이 T366W(Kabat EU 색인에 따른 번호매김)는 "노브-돌연변이" 또는 "돌연변이 노브"로 표시되며, (항체 중쇄의) CH3 도메인에서 돌연변이 T366S, L368A, Y407V는 "홀-돌연변이" 또는 "돌연변이 홀" 로 표시된다. 예를 들면, "노브-돌연변이" ("노브-cys-돌연변이" 또는 "돌연변이 노브-cys"로 나타냄)로써 중쇄의 CH3 도메인으로 S354C 돌연변이 (Kabat EU 색인에 따른 번호매김)를 도입시키고, "홀-돌연변이" ("홀-cys-돌연변이" 또는 "돌연변이 홀-cys"로 나타냄)로써, 중쇄의 CH3 도메인으로 Y349C 돌연변이를 도입시킴으로써 CH3 도메인 사이의 추가적인 쇄-간 이황화 다리도 사용할 수 있다(Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681).
본원에서 이용된 바와 같이용어 "도메인 교차(crossover)"는 한 쌍의 항체 중쇄 VH-CH1 단편과 이에 상응하는 동족 항체 경쇄, 즉, 항체 Fab (단편 항원 결합)에서, 도메인 서열은 적어도 하나의 중쇄 도메인이 그에 상응하는 경쇄 도메인으로 치환된다는 점에서(이 반대의 경우도 마찬가지) 고유 항체의 서열로부터 서 벗어난다는 것을 뜻한다. 3개 일반적인 유형의 도메인 교차가 있다: (i) CH1 도메인과 CL 도메인의 교차, 이로써 경쇄의 도메인 교차에 의해 VL-CH1 도메인 서열로 되며, 중쇄 단편의 도메인 교차에 의해 VH-CL 도메인 서열로 된다 (또는 VH-CL-힌지-CH2-CH3 도메인 서열을 갖는 전장의 항체 중쇄), (ii) VH 도메인과 VL 도메인의 도메인 교차, 이로써 경쇄에서 도메인 교차에 의해 VH-CL 도메인 서열이 되며, 중쇄 단편에서 도메인 교차에 의해 VL-CH1 도메인 서열이 되며, (iii) 완전한 경쇄 (VL-CL) 및 완전한 VH-CH1 중쇄 단편의 도메인 교차 ("Fab 교차"), 이로써 도메인 교차에 의해 VH-CH1 도메인 서열을 갖는 경쇄가 되며, 도메인 교차에 의해 VL-CL 도메인 서열을 갖는 중쇄 단편이 된다 (전술한 모든 도메인 서열은 N-말단에서 C-말단 방향으로 표시됨).
본원에서 이용된 바와 같이, 상응하는 중쇄 및 경쇄 도메인에 대해 "서로 대체된(replaced by each other)"이라는 용어는 전술한 도메인 교차를 의미한다. 이와 같이, CH1 도메인과 CL 도메인이 "서로 대체"될 때, 상기 항목 (i)에서 언급된 도메인 교차를 말하고, 그 결과로 생성된 중쇄 도메인 및 경쇄 도메인 서열을 지칭한다. 따라서, VH와 VL이 "서로 교체"될 때, 상기 항목 (ii)에서 언급된 도메인 교차를 지칭하고; 및 CH1 도메인과 CL 도메인이 "서로 대체"되고, VH 도메인과 VL 도메인이 "서로 대체"될 때, 상기 항목 (iii)에서 언급된 도메인 교차를 지칭한다. 도메인 교차가 내포된 이중특이적 항체들은 예를 들면, WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254 및 Schaefer, W., et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 108 (2011) 11187-11192에서 보고된다. 이러한 항체들을 일반적으로 CrossMab이라고 명명한다.
다중특이적 항체는 한 가지 구체예에서 다음 중 하나의 도메인 교차가 내포된 적어도 하나의 Fab 단편을 포함한다: 상기 항목 (i)에서 언급된 바와 같은, CH1 도메인과 CL 도메인의 도메인 교차, 또는 상기 항목 (ii)에서 언급된 바와 같은, VH 도메인과 VL 도메인의 도메인 교차, 또는 상기 항목 (iii)에서 언급된 바와 같은, VH-CH1 도메인과 VL-VL 도메인의 도메인 교차. 도메인 교차를 갖는 다중특이적 항체들의 경우에서, 동일한 항원(들)에 특이적으로 결합하는 Fab는 동일한 도메인 서열이 되도록 구축된다. 따라서, 도메인 교차 갖는 하나 이상의 Fab가 다중특이적 항체에 포함되는 경우, 전술한 Fab(들)은 동일한 항원에 특이적으로 결합한다.
"인간화된(humanized)" 항체는 비-인간 HVRs의 아미노산 잔기들과 인간 FRs의 아미노산 잔기들을 포함하는 항체를 말한다. 특정 구체예들에 있어서, 인간화된 항체는 실질적으로 최소한 하나의, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함하는데, 이때 HVRs (가령, CDRs)의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 비-인간 항체에 대응하며, FRs의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화된 항체는 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 최소한 일부를 임의선택적으로 포함할 수 있다. 항체의 "인간화된 형태(humanized form)"는 가령, 비-인간 항체가 인간화를 겪은 항체를 말한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "재조합 항체"는 재조합 수단, 이를 테면, 재조합 세포에 의해 제조, 발현, 창출 또는 단리된 모든 (키메라, 인간화된 및 인간) 항체를 뜻한다. 여기에는 재조합 세포, 이를 테면, NS0, HEK, BHK 또는 CHO 세포로부터 단리된 항체들이 내포된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"이란 무손상 (intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는 손상되지 않은 항체의 부분(즉, 이 부분은 기능적 단편임)을 포함하는 손상되지 않은 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편들의 예시로는 Fv; Fab; Fab'; Fab'-SH; F(ab')2; 이중특이적 Fab; 디아바디(diabodies); 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들면, scFv 또는 scFab)가 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"이란 무손상 (intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는 손상되지 않은 항체의 부분(즉, 이 부분은 기능적 단편임)을 포함하는 손상되지 않은 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편들의 예시로는 Fv; Fab; Fab'; Fab'-SH; F(ab')2; 이중특이적 Fab; 디아바디(diabodies); 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들면, scFv 또는 scFab)가 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
본원에 사용된 "표적 세포 항원"이란 표적 세포, 예를 들어, 암 세포 또는 종양 기질의 세포와 같은 종양 내의 세포의 표면 상에 제시된 항원 결정자를 지칭한다. 특정 구체예들에서, 상기 표적화된 세포 항원은 종양 세포의 표면 상에 있는 항원이다. 하나의 구체예에서, 표적 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 암-배아 항원 (CEA), 흑색종-연합된 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), CD19, CD20 및 CD33로 구성된 군에서 선택된다. 특히, 상기 표적화된 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP)이다.
용어 "CD19"는 B-림프구 항원 CD19 (B-림프구 표면 항원 B4 또는 T-세포 표면 항원 Leu-12로도 공지됨)을 지칭하며, 달리 명시되지 않는 한, 포유류, 이를 테면, 영장류 (예를 들면, 인간) 비-인간 영장류 (예를 들면, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류 (예를 들면, 마우스와 쥐)를 비롯한, 임의의 척추동물 기원의 임의의 고유한 CD19들이 내포된다. 인간 CD19의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P15391 (버젼 160, 서열 식별 번호: 103)에 도시된다. 이 용어는 "전장의" 미-처리된 인간 CD19, 뿐만 아니라 본원에 보고된 항체가 이에 결합하는 한, 세포에서 처리되어 생성되는 임의의 형태의 인간 CD19를 포괄한다. CD19는 프레(pre)-B 세포, 초기 발달 단계의 B 세포{즉, 미숙한 B 세포), 혈장으로의 최종 분화를 통한 성숙한 B 세포, 및 악성 B 세포를 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는, 인간 B 세포의 표면에서 발현되는 구조적으로 구별되는 세포 표면 수용체다. CD19는 대부분의 프레(pre)-B 급성 림프구성 백혈병(ALL), 비-호지킨 림프종, B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL), 전-림프구성 백혈병, 털 세포 백혈병, 일반 급성 림프구성 백혈병 및 일부 Null-급성 림프구성 백혈병에서 발현된다. 형질 세포에서 CD19의 발현은 다발성 골수종과 같은 분화된 B 세포 종양에서 또한 발현될 수 있음을 시사한다. 따라서, CD19 항원은 비-호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병 및/또는 급성 림프구성 백혈병의 치료에서 면역요법의 표적이다.
용어 "섬유아세포 활성화 단백질 (FAP)"는 프롤릴 엔도펩티다제 FAP 또는 Seprase (EC 3.4.21)로도 공지되어 있으며, 이것은 달리 명시되지 않는 한, 영장류(예를 들면, 인간) 비-인간 영장류(예를 들면, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 쥐)와 같은 포유류를 비롯하여, 임의의 척추동물 기원의 임의의 천연 FAP를 지칭한다. 이 용어는 "전장"의, 비-처리된 FAP, 뿐만 아니라 세포에서 처리된 임의의 형태의 FAP를 포괄한다. 이 용어는 FAP로부터 자연 발생적인 변이체, 예를 들면, 스플라이스(splice) 변이체들 또는 대립유전자 변이체들을 또한 포괄한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 인간, 마우스 및/또는 사이노몰구스 FAP에 특이적 결합을 할 수 있다. 인간 FAP의 아미노산 서열은 UniProt (www.uniprot.org) 수탁 번호 Q12884 (버젼 149, 서열 식별 번호: 17), 또는 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2에서 도시된다. 인간 FAP의 세포외 도메인 (ECD)은 아미노산 위치 26에서 아미노산 위치 760까지다. His-테그된 인간 FAP ECD의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 식별 번호: 14 및 서열 식별 번호: 15로 나타낸다. 마우스 FAP의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P97321 (버젼 126, 서열 식별 번호: 18), 또는 NCBI RefSeq NP_032012.1에서 도시된다. 마우스 FAP의 세포외 도메인 (ECD)은 아미노산 위치 26에서 아미노산 위치 761까지다. 서열 식별 번호: 19 및 서열 식별 번호: 20은 His-테그된 마우스 FAP ECD의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열을 각각 나타낸다. 서열 식별 번호: 21 및 서열 식별 번호: 22는 His-테그된 사이노몰구스 FAP ECD의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열을 각각 나타낸다. 선호적으로는, 본 발명의 항-FAP 결합 분자는 FAP의 세포외 도메인에 결합한다. 항-FAP 결합 분자들의 예시는 WO 2012/020006에서 기술된다.
용어 "암-배아 항원 (CEA)"는 암-배아 항원-관현된 세포 흡착 분자 5 (CEACAM5)로도 공지되어 있으며, 달리 명시되지 않는 한, 포유류, 이를 테면, 영장류 (예를 들면, 인간), 비-인간 영장류 (예를 들면, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류 (예를 들면, 마우스와 쥐)를 비롯한 임의의 척추동물 기원으로부터 임의의 고유한 CEA 패밀리 리간드를 지칭한다. 인간 CEA의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P06731 (버젼 151, 서열 식별 번호: 23)에 도시된다. CEA는 오랫동안 종양 관련 항원으로 확인되었다. (Gold and Freedman, J Exp. Med., 121:439-462, 1965; Berinstein N. L., J Clin. Oncol. 20:2197-2207, 2002). 원래 태아 조직에서만 발현되는 단백질로 분류되었던 CEA는 현재 여러 정상 성인 조직에서 확인되었다. 이들 조직은 위장관, 호흡기관, 비뇨생식관의 세포, 결장, 자궁경부, 땀샘, 전립선의 세포를 비롯한, 기원이 주로 상피다 (Nap et al., Tumour Biol., 9 (1988) 145-153; Nap et al., Cancer Res., 52 (1992) 2329-2339). 상피 기원의 종양 및 이들의 전이는 종양 관련 항원으로서 CEA를 함유한다. CEA의 존재 자체가 암성 세포로의 변환을 나타내지는 않지만, CEA의 분포가 암시적이다. 정상 조직에서, CEA는 일반적으로 세포의 정점 표면에서 발현되며(
Figure pct00001
S., Semin. Cancer Biol. 9 (1999) 67-81), 혈류에서 항체에 접근할 수 없게 만든다. 정상 조직과 달리, CEA는 암 세포의 전체 표면에 걸쳐 발현되는 경향이 있다 (
Figure pct00002
S., Semin Cancer Biol. 9 (1999) 67-81). 이러한 발현 패턴의 변화는 CEA가 암 세포에서 항체 결합에 접근할 수 있게 한다. 또한, CEA 발현은 암세포에서 증가한다. 또한, 증가된 CEA 발현은 전이로 이어질 수 있는 세포간 유착 증가를 촉진시킨다 (Marshall J., Semin Oncol., 30 (2003) (a Suppl. 8) 30-36). 다양한 종양 개체에서 CEA 발현의 유병률은 일반적으로 매우 높다. 발표된 데이터와 일치하게, 조직 샘플에서 수행된 자체 분석에서 높은 유병률을 확인했는데, 대장암(CRC)에서 대략적으로 95%, 췌장암에서 90%, 위암에서 80%, 비-소세포 폐암(NSCLC, HER3와 함께 발현됨)에서 60%, 유방암에서 40%; 소세포 폐암 및 교모세포종에서 발현은 낮았다.
CEA는 세포 표면에서 쉽게 절단되어, 직접 또는 림프관을 통해 종양에서 혈류로 배출된다. 이러한 속성 때문에, 혈청 CEA 수치는 암 진단 및 암, 특히 대장암의 재발 여부를 선별하는 임상 지표로 사용되었다 (Goldenberg, D.M., Int. J. Biol. Mark. 7 (1992) 183-188; Chau I., et al., J. Clin. Oncol. 22 (2004) 420-1429; Flamini, et al., Clin. Cancer Res. 12 (2006) 6985-6988).
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "이종성(heterologous)"이란 폴리펩티드가 특정 세포에서 기인되지 않고, 해당 인코딩 핵산이 DNA 전달 방법, 예를 들면, 형질감염, 전기천공, 또는 형질변환 방법에 의해 전술한 세포로 도입됨을 나타낸다. 따라서, 이종성 폴리펩티드는 이를 발현시키는 세포에게는 인위적인 폴리펩티드이며, 이에 의해 해당 폴리펩티드가 상이한 세포/유기체로부터 기원하는 천연 발생 폴리펩티드인지, 또는 인공적으로 만들어진 폴리펩티드인지 여부와는 무관하다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란 설명된 구성 요소들의 위치가 의도된 방식으로 기능할 수 있는 관계에 있는 두개 또는 그 이상의 구성요소들의 병치(juxtaposition)를 의미한다. 예를 들면, 프로모터 및/또는 인헨서는 해당 프로모터 및/또는 인헨서가 해당 코딩 서열의 전사를 조절하는 작용을 한다면, 이 코딩 서열에 작동가능하도록 연계된다. 특정 구체예들에서, "작동 가능하도록 연계된" DNA 서열들은 단일 염색체에서 근접하고, 인접해 있다. 특정 구체예들에서, 예를 들면, 2개 단백질 인코딩 영역, 이를 테면, 분비 리더와 폴리펩티드를 연결시킬 필요가 있을 때, 이들 서열은 근접하고, 인접해 있으며, 동일한 판독틀 안에 있다. 특정 구체예들에서, 작동가능하도록 연계된 프로모터는 상기 코딩 서열의 상류에 위치하며, 이에 인접해있을 수 있다. 특정 구체예들에서, 예를 들면, 코딩 서열의 발현을 조절하는 인헨서 서열의 경우, 2개 구성요소는 인접하지는 않지만, 작동가능하도록 연계될 수 있다. 인헨서가 코딩 서열의 전사를 증가시킨다면, 이 인헨서는 해당 코딩 서열에 작동가능하도록 연계된다. 작동 가능하게 연결된 인헨서는 코딩 서열의 상류, 내부 또는 하류에 위치할 수 있고, 코딩 서열의 프로모터로부터 상당한 거리에 위치할 수 있다. 작동가능한 링키지는 당업계에 공지된 재조합 방법, 예를 들어, PCR 방법을 사용하여 및/또는 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 달성될 수 있다. 편리한 제한절단 부위가 존재하지 않으면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커는 종래의 절차에 따라 사용될 수 있다. 내부 리보솜 진입 부위(IRES)는 5' 단부-독립적인 방식으로 내부 위치에서 ORF의 해독 개시를 허용하는 경우, 개방 판독틀(ORF)에 작동 가능하도록 연계된다.
II. 조성물 및 방법
일반적으로, 예를 들어, 관심대상 폴리펩티드의 재조합 대규모 생산을 위해, 치료용 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드를 안정적으로 발현시키고 분비시키는 세포가 필요하다. 이러한 세포를 "재조합 세포" 또는 "재조합 생산 세포"라고 하며, 이러한 세포를 생성하는 데 사용되는 공정을 "세포주 개발"이라고 한다. 세포주 개발 공정의 첫 번째 단계에서, 적절한 숙주 세포, 예를 들어, CHO 세포는 관심대상 폴리펩티드의 발현에 적합한 핵산 서열로 형질감염된다. 두 번째 단계에서, 관심대상 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과 동시-형질감염된 선별 마커의 동시-발현에 기초하여, 관심대상 폴리펩티드를 안정적으로 발현시키는 세포를 선별한다.
폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 즉 코딩 서열을 구조 유전자라고 부른다. 이러한 구조 유전자는 단순한 정보이며, 발현을 위해서는 추가적인 조절 요소들이 필요하다. 따라서, 일반적으로 구조 유전자는 발현 카세트에 통합된다. 발현 카세트가 포유동물 세포에서 기능하기 위해, 필요한 최소한의 조절 요소들은 전술한 포유동물 세포에서 기능적이며, 구조 유전자의 상류, 즉 5'에 위치하는 프로모터, 및 전술한 포유동물 세포에서 기능을 하는 폴리아데닐화 신호 서열 (이는 구조 유전자의 하류, 즉 3'에 위치함)이다. 프로모터, 구조 유전자 및 폴리아데닐화 신호 서열은 작동가능하게 연결된 형태로 배열된다.
관심대상 폴리펩티드가 상이한 (단량체성) 폴리펩티드들로 구성된 이형다량체성 폴리펩티드인 경우, 단일 발현 카세트가 필요할 뿐만 아니라, 포함된 구조 유전자에서 상이한 다수의 발현 카세트가 필요한데, 즉, 이형다량체 폴리펩티드의 상이한 (단량체성) 폴리펩티드 각각에 대한 적어도 하나의 발현 카세트가 필요하다. 예를 들면, 항체-다량체-융합 폴리펩티드는 하나의 경쇄, 하나의 중쇄, 하나의 중쇄 불변 도메인-융합 폴리펩티드 및 하나의 경쇄 불변 도메인 융합 폴리펩티드를 포함하는 이형다량체성 폴리펩티드이다. 따라서, 항체-다량체-융합 폴리펩티드는 상이한 4개 폴리펩티드로 구성된다. 따라서, 항체-다량체-융합 폴리펩티드의 발현을 위해, 4개의 발현 카세트가 필요하다: 경쇄용으로 하나, 중쇄용으로 하나, 중쇄 불변 영역 융합 폴리펩티드용으로 하나, 및 경쇄 불변 영역 융합 폴리펩티드용으로 하나.
관심대상의 폴리펩티드에 대한 발현 카세트(들)은 통칭으로 소위 "발현 벡터"에 통합된다. "발현 벡터"는 박테리아 세포에서 해당 벡터의 증폭 및 포유동물 세포에서 포함된 구조 유전자(들)의 발현을 위해 필요한 모든 요소를 제공하는 핵산이다. 전형적으로, 발현 벡터는 원핵생물 플라스미드 증식 단위, 예를 들어, 대장균의 경우, 복제 원점, 원핵 세포 선별 마커, 진핵 세포 선별 마커, 관심대상의 구조 유전자(들)의 발현에 필요한 발현 카세트를 포함한다. "발현 벡터"는 포유류 세포에 발현 카세트를 도입하기 위한 수송 수단이다.
이전 단락에서 약술한 바와 같이, 발현되는 폴리펩티드가 더 복잡할수록, 상이한 발현 카세트의 필요한 갯수는 더 많아진다. 본질적으로 발현 카세트의 수와 함께, 숙주 세포의 게놈에 통합될 핵산의 크기도 증가된다. 동시에, 발현 벡터의 크기도 증가된다. 그러나, 벡터 크기에서 실질적인 상한 범위는 약 15kbps인데, 그 이상의 크기는 취급 및 처리 효율성이 크게 떨어진다. 이 문제는 둘 또는 그 이상의 발현 벡터를 사용하여 해결할 수 있다. 이로써, 발현 카세트는 각각 발현 카세트의 일부만을 포함하는 상이한 발현 벡터들 간에 분할될 수 있다.
일반적으로, 세포주 개발(CLD)은 관심대상의 폴리펩티드에 대한 발현 카세트의 무작위 통합(RI) 또는 표적화된 통합(TI)에 의존한다.
II.a 본 발명에 따른 방법
본 발명은 상이한 폴리펩티드들을 포함하는 복합체 분자, 즉, 이형다량체인 항체-다량체-융합체의 발현을 위해, 특정된 발현 카세트 비율을 이용하면 포유류 세포, 이를 테면, CHO 세포 또는 HEK 세포에서 이들 항체-다량체-융합체를 효율적으로 발현 및 생산하게 된다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
본 발명은 상이한 폴리펩티드들을 포함하는 복합체 분자, 즉, 이형다량체인 항체-다량체-융합체의 일시적 발현 뿐만 아니라 안정적인 발현을 위해, 동일한 특정된 발현 카세트 비율을 이용하면 최고 발현 수율 및 산물의 품질을 얻게된다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
본 발명은 재조합 포유류 세포에 의한 항체-다량체-융합체의 발현을 위해, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 제1 융합 폴리펩티드 및 제2 융합 폴리펩티드에 대한 발현 카세트의 비율이 1:1:2:1의 화학양론적 비율을 이용할 때 유익하다는, 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 이 비율을 이용함으로써, 수율 및 부산물 형성에 대한 개선된 항체-다량체-융합체의 발현을 얻을 수 있다. 이 비율은 발현 방법과 무관하다는 것이 추가로 밝혀졌는데, 즉, 단일 발현 카세트 또는 다중 발현 카세트 벡터를 사용하여, 벡터 구성 뿐만 아니라 일시적 세포주 뿐만 아니라 안정한 세포주도 동일한 비율로 획득된다는 사실을 추가로 알아내었다.
다음에서, 본 발명은 인간 FAP 및 제1 융합 폴리펩티드 및 제2 융합 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 형성하는 항체 중쇄 및 항체 경쇄의 쌍을 포함하는 이형다량체성 항체-다량체-융합체로 구체화되며, 이때 상기 다량체는 삼량체성 인간 4-1-BBL이다. 이들 실험은 단지 본 발명의 개념을 설명하기 위해 제시된 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 항체 쇄 및 임의의 다량체 폴리펩티드의 임의의 쌍도 마찬가지로 사용될 수 있다.
무작위 통합, 일시적 형질감염, 단일 발현 카세트 벡터들
제1 실험 설정에서, 항-FAP 항체-4-1-BBL 다량체-융합체의 일시적 생산이 수행되었다. 하나의 벡터가 항체-다량체-융합체의 단일 폴리펩티드에 대한 단일 발현 카세트만을 포함하는, 상이한 특정된 화학양론적 비율로 벡터 세트를 이용하였다. 결과는 다음 표에 나와 있다. HC = 항체 중쇄, LC = 항체 경쇄, FH = 제1 융합 폴리펩티드, FL = 제2 융합 폴리펩티드, 실험. = 실험 번호, eff. 역가 = 유효 역가 (역가 및 주요 피크 생성), rel. eff. 역가 = 상대적인 유효 역가 (1:1:2:2의 발현 카세트 비율로 정규화시킨 상대적 역가).
Figure pct00003
1:1:2:1의 발현 카세트 비율이 최상의 결과를 가져오고, 1:1:2:2의 발현 카세트보다 전반적으로 20% 더 높은 유효 역가 및 35% 더 높은 유효 역가를 가져온다는 것을 볼 수 있다.
무작위 통합, 일시적 형질감염, 다중 발현 카세트 벡터들
제2 실험 설정에서, 항-FAP 항체-4-1-BBL 다량체-융합체의 일시적 생산이 수행되었다. 각 벡터가 항체-다량체-융합체의 단일 폴리펩티드에 대한 하나의 또는 두 개의 발현 카세트만을 포함하는, 상이한 특정된 화학양론적 비율로 벡터 세트를 이용하였다. 결과는 다음 표에 나와 있다. HC = 항체 중쇄, LC = 항체 경쇄, FH = 제1 융합 폴리펩티드, FL = 제2 융합 폴리펩티드, 실험. = 실험 번호, eff. 역가 = 유효 역가 (역가 및 주요 피크 생성), rel. eff. 역가 = 상대적인 유효 역가 (1:1:2:2의 발현 카세트 비율로 정규화시킨 상대적 역가).
Figure pct00004
벡터 1 = HC 및 LC에 대한 발현 카세트를 갖는 이중 발현 카세트 벡터;
벡터 2 = FH 및 FL에 대한 발현 카세트를 갖는 이중 발현 카세트 벡터;
벡터 3 = FH에 대한 발현 카세트를 갖는 단일 발현 카세트 벡터
1:1:2:1의 발현 카세트 비율이 최상의 결과를 가져오고, 1:1:2:2의 발현 카세트보다 전반적으로 40% 더 높은 유효 역가 및 67% 더 높은 유효 역가를 가져온다는 것을 볼 수 있다.
안정적인 무작위 통합, 다중 발현 카세트 벡터들
제3 실험 설정에서, 항-FAP 항체-4-1-BBL 다량체-융합체의 안정적인 생산이 수행되었다. 각 벡터가 항체-다량체-융합체의 단일 폴리펩티드에 대한 하나의 또는 두 개의 발현 카세트만을 포함하는, 상이한 특정된 화학양론적 비율로 벡터 세트를 이용하였다. 결과는 다음 표에 나와 있다. HC = 항체 중쇄, LC = 항체 경쇄, FH = 제1 융합 폴리펩티드, FL = 제2 융합 폴리펩티드, 실험. = 실험 번호, eff. 역가 = 유효 역가 (역가 및 주요 피크 생성), rel. eff. 역가 = 상대적인 유효 역가 (1:1:2:2의 발현 카세트 비율로 정규화시킨 상대적 역가).
Figure pct00005
벡터 1 = HC 및 LC에 대한 발현 카세트를 갖는 이중 발현 카세트 벡터;
벡터 2 = FH 및 FL에 대한 발현 카세트를 갖는 이중 발현 카세트 벡터;
벡터 3 = FH에 대한 발현 카세트를 갖는 단일 발현 카세트 벡터
실험 1과 실험 2의 각 비율에 대해, 단일 세포 클론이 있는 60개 플레이트를 배양했다. 회분식 배양 제품 품질(CE-SDS에서 주요-피크%), 뿐만 아니라 플레이트 웰의 회수율, 역가 및 산물의 품질을 분석했다. 결과는 다음 표들에서 제시된다.
Figure pct00006
Figure pct00007
1:1:2:1의 발현 카세트 비율(1:1+1 벡터 비율)의 경우 더 나은 성장(회복), 1:1:2:2의 발현 카세트 비율(1:2 벡터 비율)과 비교하여 20% 이상의 합류를 갖는 웰이 2배, 양성 역가의 클론이 2배로 획득된다는 것을 볼 수 있다.
보다 상세하게는, 합류 및 역가(>5% 합류 및 IgG 양성)에 기초하여, 선별되었다. 양성 역가의 모든을 다음 선별 단계로 처리했다. 클론의 두 배는 1:1:2:1의 발현 카세트 비율(1:1+1 벡터 비율)로 형질감염된 세포를 포함하는 플레이트에서 유래되었다.
추가 ELISA 재시험 분석을 위해, 총 1056개의 클론을 선택하였다. 여기서 1/3은 1:1:2:2의 발현 카세트 비율(벡터 비율 1:2; 352개 클론)으로 얻은 클론이며, 2/3는 1:1:2:1의 발현 카세트 비율(벡터 비율 1:1+1, 704개 클론)로 얻은 클론이다.
제2 선별은 ELISA 결합 및 가교 분석을 기반으로 했다.
총 1056개의 클론 중 220개의 클론이 항체-다합체-융합체(주-산물)의 두 부분을 모두 발현하는 것으로 밝혀졌다. 1:1:2:1(벡터 비율 1:1+1)의 발현 카세트 비율에서 4배 더 많은 클론이 파생되었고: 20%(45개 클론)는 1:1:2:2의 발현 카세트 비율 (벡터 비율 1:2)에서 파생되었으며, 80% (175개 클론)은 1:1:2:1의 발현 카세트 비율 (플라스미드 비율 1:1:1 (1:1+1))로부터 파생되었다.
요약하면:
(45/352)*100%=1:1:2:2의 발현 카세트 비율로 얻은 클론의 12.78% (플라스미드 비율 1:2)는 ELISA 재시험에서 우수한 제품 품질을 나타내고,
반면,
(175/704)*100%=1:1:2:2의 발현 카세트 비율로 얻은 클론의 24.86% (벡터 비율 1:1:1)는 ELISA 재시험에서 우수한 제품 품질을 나타낸다.
따라서, 일시적 형질감염에서 얻은 결과가 안정적인 형질감염에서 또한 확인된다.
무작위 통합, 일시적 형질감염, 단일 발현 카세트 벡터들
제4 실험 설정에서, 항-CEA 항체-4-1-BBL 다량체-융합체의 일시적 생산이 수행되었다. 단일 발현 카세트를 각각 포함하는 벡터 세트를 특정된 상이한 화학양론적 비율로 이용하였다. 결과는 다음 표에 나와 있다. HC = 항체 중쇄, LC = 항체 경쇄, FH = 제1 융합 폴리펩티드, FL = 제2 융합 폴리펩티드, 실험. = 실험 번호, eff. 역가 = 유효 역가 (역가 및 주요 피크 생성), rel. eff. 역가 = 상대적인 유효 역가 (1:1:2:2의 발현 카세트 비율로 정규화시킨 상대적 역가).
Figure pct00008
1:1:2:1의 발현 카세트 비율이 최상의 결과를 가져오고, 1:1:2:2의 발현 카세트보다 전반적으로 15% 더 높은 유효 역가 및 24% 더 높은 유효 역가를 가져온다는 것을 볼 수 있다.
표적화된 통합, 안정적인 형질감염, 이중 RMCE
제5 실험 설정에서, 표적화된 통합을 이용한, 항-FAP 항체-4-1-BBL 다량체-융합체의 안정적인 생산이 수행되었다. 벡터 집합, 즉 전면 벡터와 및 후면 벡터가 사용되었다. Cre-재조합효소와 이중 재조합효소 매개된 카세트 교환 반응을 이용하여 표적화된 통합이 실행되었다. 전면 벡터와 및 후면 벡터는 하기 표에서 약술된 바와 같이, 상이한 발현 카세트를 포함한다: HC = 항체 중쇄, LC = 항체 경쇄, FH = 제1 융합 폴리펩티드, FL = 제2 융합 폴리펩티드.
Figure pct00009
전면 벡터와 후면 벡터에 각각 포함된 발현 카세트의 서로 다른 수에 기초하여, 서로 상이하게 특정된 화학양론적 비율을 사용했다. 안정적인 형질감염된 세포 풀(pools)에서 얻은 결과는 다음 표에 제시되어 있다(n=2). HC = 항체 중쇄, LC = 항체 경쇄, FH = 제1 융합 폴리펩티드, FL = 제2 융합 폴리펩티드, 실험. = 실험 번호, eff. 역가 = 유효 역가 (역가 및 주요 피크 생성), rel. eff. 역가 = 상대적인 유효 역가 (1:1:2:2의 발현 카세트 비율로 정규화시킨 상대적 역가).
Figure pct00010
1:1:2:1의 발현 카세트 비율이 최상의 결과를 가져오고, 1:1:2:2의 발현 카세트보다 전반적으로 45% 더 높은 유효 역가 및 45% 더 높은 유효 역가를 가져온다는 것을 볼 수 있다.
무작위 통합, 일시적 형질감염, 단일 발현 카세트 벡터들
제6 실험 설정에서, 항-CD19 항체-4-1-BBL 다량체-융합체의 일시적 생산이 수행되었다. 하나의 벡터가 항체-다량체-융합체의 단일 폴리펩티드에 대한 단일 발현 카세트만을 포함하는, 상이한 특정된 화학양론적 비율로 벡터 세트를 이용하였다. 결과는 다음 표에 나와 있다. HC = 항체 중쇄, LC = 항체 경쇄, FH = 제1 융합 폴리펩티드, FL = 제2 융합 폴리펩티드, 실험. = 실험 번호, eff. 역가 = 유효 역가 (역가 및 주요 피크 생성), rel. eff. 역가 = 상대적인 유효 역가 (1:1:2:2의 발현 카세트 비율로 정규화시킨 상대적 역가).
Figure pct00011
1:1:2:1의 발현 카세트 비율이 최상의 결과를 가져오고, 1:1:2:2의 발현 카세트보다 전반적으로 9% 더 높은 유효 역가 및 23% 더 높은 유효 역가를 가져온다는 것을 볼 수 있다.
요약:
따라서, 세포주의 생성에 사용된 방법과 독립적으로 1:1:2:1(HC:LC:FH:FL)의 발현 카세트 비율은 산물의 품질 개선, 즉 유효한 역가를 초래한다. 추가적으로, 항체-다량체-융합체를 발현하기에 적합한 안정한 클론의 수의 증가를 얻을 수 있다.
II.b TNF 분자와 상호작용하는 리간드
TNF(종양 괴사 인자) 수용체 수퍼패밀리의 분자와 상호작용하는 리간드는 면역계의 조직 및 기능에서 중추적인 역할을 한다. 면역 반응, 조혈 및 형태형성과 같은 정상적인 기능을 조절하면서, 상기 TNF 패밀리 리간드 (사이토킨이라고도 함)는 종양 형성, 이식 거부, 패혈성 쇼크, 바이러스 복제, 골 흡수, 류마티스 관절염 및 당뇨병에서 역할을 한다(Aggarwal, 2003). 상기 TNF 리간드 패밀리는 'TNF 상동성 도메인'(THD)으로 명명된 보존된 C-말단 도메인의 존재를 특징으로 하는, 19가지 유형 II (즉, 세포내 N 말단 및 세포외 C-말단) 막관통 단백질을 인코딩하는 18개의 유전자로 구성된다. 이 도메인은 수용체 결합을 담당하고, 따라서 TNF 리간드 패밀리 구성원의 생물학적 활성에 중요하다. 패밀리 구성원 간의 서열 동일성은 ∼20-30%이다 (Bodmer, 2002). 상기 TNF 리간드 패밀리의 구성원들은 자가-어셈블리, 비-공유적 삼량체로서 이의 생물학적 기능을 발휘한다 (Banner et al, Cell 73 (1993) 431-445). 따라서, 상기 TNF 패밀리 리간드는 TNFR 슈퍼패밀리의 해당 수용체들에 결합하고, 이를 활성화시킬 수 있는 삼합체를 형성한다.
TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원인 4-1-BB(CD137)는 T-세포 활성화에 의해 발현이 유도되는 분자로 처음 확인되었다(Kwon and Weissman, 1989). 후속 연구에서 T-림프구 및 B-림프구(Snell et al., 2011; Zhang et al., 2010), NK-세포(Lin et al., 2008), NKT-세포(Kim et al., 2008), 단핵구(Kienzle and von Kempis, 2000; Schwarz et al., 1995), 호중구(Heinisch et al., 2000), 비만세포(Nishimoto et al., 2005) 및 수지상 세포 뿐만 아니라, 비-조혈 기원 세포 이를 테면, 내피 세포 및 평활근 세포(Broll et al., 2001; Olofsson et al., 2008)에서 4-1-BB의 발현이 입증되었다. 상이한 세포 유형들에서, 4-1-BB의 발현은 대부분 유도 가능하며, T-세포 수용체(TCR) 또는 B-세포 수용체 촉발과 같은 다양한 자극 신호에 의해 유도되며, 전염증성 사이토킨의 공동-자극 분자 또는 수용체를 통해 유도되는 신호 전달에 의해 유도된다(Diehl et al., 2002; von Kempis et al., 1997; Zhang et al., 2010).
4-1-BB 리간드 (4-1-BBL 또는 CD137L)의 발현은 더 제한적이며, 전문 항원 제시 세포(APC), 이를 테면, B-세포, 수지상 세포(DCs) 및 대식세포에서 관찰된다. 4-1-BBL의 유도성 발현은 αβ 및 γδ T-세포 하위집단 모두를 비롯한, T-세포 및 내피 세포에 대해 특징적이다 (Shao and Schwarz, 2011에서 검토됨).
CD137 신호전달은 NK 세포의 IFNγ 분비 및 증식을 자극할 뿐만 아니라(Buechele et al., 2012; Lin et al., 2008; Melero et al., 1998), 이들의 증가된 생존 및 용량에 의해 나타나는 바와 같이, 사이토킨을 분비하고, 공동-자극 분자를 상향조절하기 위해, DC 활성화를 촉진하는 것으로 알려져 있다 (Choi et al., 2009; Futagawa et al., 2002; Wilcox et al., 2002). 그러나, CD137은 T-세포의 CD4+ 하위집단 및 CD8+ 하위집단 모두에서 TCR-유도된 활성화를 조절하는 공동-자극 분자로 가장 잘 특징지어진다. TCR 촉발과 조합하여, 효현성 4-1-BB-특이적 항체들은 T-세포의 증식을 강화시키고, 림프구 분비를 자극하며, 활성화-유도된 세포 사멸에 대한 T-림프구의 민감도를 감소시킨다 (Snell et al., 2011에서 검토됨).
시험관 내에서 T 세포에 대한 4-1-BB 항체의 이러한 공동 자극 효과에 따라, 종양 보유 마우스에 대한 이들의 투여는 많은 실험적 종양 모델에서 강력한 항종양 효과를 유도한다(Melero et al., 1997; Narazaki et al., 2010). 그러나, 4-1-BB는 일반적으로 다른 면역 조절 화합물(Curran et al., 2011; Guo et al., 2013; Morales-Kastresana et al., 2013; Teng et al., 2009; Wei et al., 2013), 화학요법적 시약 (Ju et al., 2008; Kim et al., 2009), 종양-특이적 백신화 (Cuadros et al., 2005; Lee et al., 2011) 또는 방사선요법 (Shi and Siemann, 2006)과 함께 투여할 때만 항종양제로서의 효능을 나타낸다. 생체 내 고갈 실험은 CD8+ T-세포가 4-1-BB-특이적 항체의 항종양 효과에서 가장 중요한 역할을 한다는 것을 입증했다. 그러나, 종양 모델에 따라, 또는 항-4-1-BB를 비롯한 조합 요법에 따라, 상이한 유형의 세포들, 이를 테면, DCs, NK-세포 또는 CD4+ T-세포의 기여에 대해 보고되었다 (Melero et al., 1997; Murillo et al., 2009; Narazaki et al., 2010; Stagg et al., 2011).
상이한 림프구 하위집단에 대한 이들의 직접적인 효과에 추가적으로, 4-1-BB 효현제(agonists)는 종양 혈관 내피 상에 세포-간 흡착 분자 1(ICAM1) 및 혈관 세포 흡착 분자 1(VCAM1)의 4-1-BB-매개된 상향 조절을 통하여 종양에서 활성화된 T-세포의 침윤 및 유지를 또한 유도할 수 있다 (Palazon et al., 2011).
4-1-BB 촉발은 또한 종양 미세-환경에서 또는 만성 감염 동안, 면역 관용의 파괴에 기여할 수 있는 가용성 항원에 노출시킴으로써, 유도된 T-세포 무력증 상태를 역전시킬 수 있다 (Wilcox et al., 2004).
생체 내에서 4-1-BB 효현성 항체의 면역조절 속성은 항체 분자 상에 야생형 Fc-부분의 존재를 필요로 하고, 이로써 TNFR-슈퍼패밀리의 다른 세포사멸- 유도하는 구성원에, 또는 면역 조절 구성원에 특이적인 작용 항체에 대해 기술되었던 바와 같이, Fc-수용체 결합이 이러한 시약의 약리학적 활성에 필요한 중요한 사건임을 암시하는 것으로 보인다 (Li and Ravetch, 2011; Teng et al., 2009). 그러나, 기능적으로 활성인 Fc 도메인을 갖는 4-1-BB-특이적 효현성 항체의 전신 투여는 마우스에서 기능적 Fc 수용체들의 부재 시 감소하거나 또는 상당히 개선되는, 간 독성과 관련된 CD8+ T-세포의 확장을 또한 유도한다 (Dubrot et al., 2010). 인간의 임상 시험에서 (ClinicalTrials.gov, NCT00309023), Fc-적격 4-1-BB 효현성 항체(BMS-663513)는 12주 동안 매 3주에 한 번씩 투여되어, 흑색종, 난소 또는 신장 세포 암종 환자들에서 이 질환의 안정화를 유도했다. 그러나, 또다른 시험에서 제공된 동일한 항체(NCT00612664)는 4 등급 간염을 유발시켜, 이 시험은 종료되었다 (Simeone and Ascierto, 2012).
총체적으로, 이용가능한 전-임상 및 임상 데이터는 효과적인 4-1-BB 효현제들에 대한 임상적 필요성이 높다는 것을 명확하게 보여준다. 그러나, 차세대 약물 후보는 조혈 세포 및 내피 세포 표면 상에서 4-1-BB와 효과적으로 연루되어야 하고, 뿐만 아니라, 제어불가능한 부작용을 피하기 위해, Fc-수용체에 결합하는 것 이외의 기전을 통해 이를 달성할 수 있어야 한다. 후자는 종양-특이적 또는 종양-연합된 모이어티에 대한 우선적으로 결합하고, 올리고머화를 통해 달성될 수 있다.
4-1-BB 리간드의 하나의 세포외 도메인과 단일 쇄 항체 단편(Mueller et al., 2008; Hornig et al., 2012) 또는 융합 단백질 중쇄의 C-말단에 융합된 단일 4-1-BB 리간드로 구성된(Zhang et al, 2007) 융합 단백질들이 만들어졌다. WO 2010/010051은 서로 연계되고, 항체 부분에 융합된 3개의 TNF 리간드 엑토도메인으로 구성된 융합 단백질의 생성을 개시한다.
그러나, 종양-특이적 또는 종양-연합된 표적에 대해 선호적으로 결합할 수 있는 모이어티와 공동자극 TNF 리간드 삼량체를 형성할 수 있는 모이어티를 복합시키고, 약제학적으로 유용하기에 충분한 안정성을 갖는 새로운 항원 결합 분자가 여전히 필요하다. 본 발명의 항원 결합 분자들은 둘 모두를 포함하고, 놀랍게도 이들은 삼량체의, 따라서, 생물학적 활성 TNF 리간드를 제공하는데, 이때 삼합체화된 TNF 리간드 엑토도메인 중 하나는 이 분자의 다른 2개의 TNF 리간드 엑토도메인이 아닌 또다른 폴리펩티드에 위치한다.
II.c 재조합 방법 및 조성물들
항체는 예를 들어, US 4,816,567에 기재된 바와 같이, 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성될 수 있다. 이들 방법을 위해, 항체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 단리된 핵산(들)이 제공된다.
한 측면에서, 항체-다량체-융합 폴리펩티드를 만드는 방법이 제공되며, 이때 이 방법은 상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 항체-다량체-융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산(들)을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 임의선택적으로 해당 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드를 외수하는 것을 포함한다.
항체-다량체-융합 폴리펩티드의 재조합 생산을 위해, 예를 들면, 본원에서 기술된 바와 같은 상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 단리하고, 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/발현을 위해, 하나 또는 그 이상의 벡터로 삽입한다. 그러한 핵산은 통상적인 절차를 사용하여 용이하게 분리 및 서열화되거나 또는 재조합 방법에 의해 생성되거나 또는 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다.
일반적으로, 예를 들어, 관심대상 폴리펩티드의 재조합 대규모 생산을 위해, 치료용 항체-다량체-융합 폴리펩티드로써, 상기 폴리펩티드를 안정적으로 발현시키고 분비시키는 세포가 필요하다. 이러한 세포를 "재조합 세포" 또는 "재조합 생산 세포"라고 하며, 이러한 세포를 생성하는 데 사용되는 공정을 "세포주 개발"이라고 한다. 세포주 개발 공정의 첫 번째 단계에서, 적절한 숙주 세포, 예를 들어, CHO 세포는 관심대상 폴리펩티드의 발현에 적합한 핵산 서열로 형질감염된다. 두 번째 단계에서, 관심대상 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과 동시-형질감염된 선별 마커의 동시-발현에 기초하여, 관심대상 폴리펩티드를 안정적으로 발현시키는 세포를 선별한다.
폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 즉 코딩 서열을 구조 유전자라고 부른다. 이러한 구조 유전자는 단순한 정보이며, 발현을 위해서는 추가적인 조절 요소들이 필요하다. 따라서, 일반적으로 구조 유전자는 소위, 발현 카세트에 통합된다. 발현 카세트가 포유동물 세포에서 기능하기 위해, 필요한 최소한의 조절 요소들은 전술한 포유동물 세포에서 기능적이며, 구조 유전자의 상류, 즉 5'에 위치하는 프로모터, 및 전술한 포유동물 세포에서 기능을 하는 폴리아데닐화 신호 서열 (이는 구조 유전자의 하류, 즉, 3'에 위치함)이다. 프로모터, 구조 유전자 및 폴리아데닐화 신호 서열은 작동가능하게 연결된 형태로 배열된다.
이전 단락에서 약술한 바와 같이, 발현되는 폴리펩티드가 더 복잡할수록, 상이한 발현 카세트의 필요한 갯수는 더 많아진다. 본질적으로 발현 카세트의 수와 함께, 숙주 세포의 게놈에 통합될 핵산의 크기도 증가된다. 동시에, 발현 벡터의 크기도 증가된다. 그러나, 벡터 크기에서 실질적인 상한 범위는 약 15kbps인데, 그 이상의 크기는 취급 및 처리 효율성이 크게 떨어진다. 이 문제는 둘 또는 그 이상의 발현 벡터를 사용하여 해결할 수 있다. 이로써, 발현 카세트는 각각 발현 카세트의 일부만을 포함하는 상이한 발현 벡터들 간에 분할될 수 있고, 크기는 작아진다.
이종성 폴리펩티드, 이를 테면, 예를 들면, 항체-다량체-융합 폴리펩티드를 발현시키는 재조합 세포의 생성을 위한 세포주 개발(CLD)는 관심대상의 이종성 항체-다량체-융합 폴리펩티드의 발현 및 생산에 요구되는 각 발현 카세트를 포함하는 핵산(들)의 무작위 통합 (RI) 또는 표적화된 통합 (TI)을 이용한다.
일반적으로, RI를 사용하면, 여러 벡터 또는 이의 단편들이 동일한 또는 상이한 유전자좌에서 세포의 게놈에 통합된다.
일반적으로, TI를 사용하면, 상이한 발현 카세트를 포함하는 이식유전자의 단일 사본이 숙주 세포 게놈의 사전-결정된 "핫-스팟(hot-spot)"에 통합된다.
(글리코실화된) 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 일반적으로, 예를 들어, 다세포 유기체, 이를 테면, 척추동물로부터 유래된다.
II.d 숙주 세포
현탁액에서 성장하도록 적응된 임의의 포유동물 세포주는 본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있다. 또한, 통합 방법과 독립적으로, 즉, RI 및 TI를 위해 임의의 포유류 숙주 세포를 사용할 수 있다.
유용한 포유류 숙주 세포주의 예로는 인간 양막 세포 (예를 들면, Woelfel, J. et al., BMC Proc. 5 (2011) P133에서 기술된 CAP-T 세포); SV40 (COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통 형질전환된 ; 인간 배아 신장 계통 (예를 들면, Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74에서 기술된 HEK293 또는 HEK293T); 아기 햄서트 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들면, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252에서 기술된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부암 세포 (HELA); 갯과 신장 세포 (MDCK; 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유선 종양 (MMT 060562); TRI 세포 (예를 들면, Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68에서 기술된 바와 같은); MRC 5 세포; 및 FS4 세포들이 있다. 기타 유용한 포유류 숙주 세포주에는 DHFR-CHO 세포를 비롯한 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포주, 이를 테면, Y0, NS0 및 Sp2/0이 내포된다. 항체 생산에 적합한 특정 포유류 숙주 세포의 검토를 위해, 예를 들면, Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268를 참고한다.
하나의 구체예에서, 포유류 숙주 세포는, 예를 들면, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (예를 들면, CHO K1, CHO DG44, 등등), 인간 배아 신장 (HEK) 세포, 림프 세포 (예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포), 또는 인간 양막 세포 (예를 들면, CAP-T, 등등)이 있다. 바람직한 하나의 구체예에서, 포유류 숙주 세포는 CHO 세포다.
표적화된 통합은 외인성 뉴클레오티드 서열이 포유류 세포 게놈에서 사전-결정된 부위로 통합되도록 한다. 특정 구체예들에서, 상기 표적화된 통합은 게놈에 존재하고, 통합될 외인성 뉴클레오티드 서열에 존재하는 하나 또는 그 이상의 재조합 인식 서열들(RRSs)을 인지하는 재조합효소에 의해 매개된다. 특정 구체예들에서, 상기 표적화된 통합은 상동성 재조합에 의해 매개된다.
"재조합 인지 서열" (RRS)이란 재조합효소에 의해 인지되는 뉴클레오티드 서열이며, 재조합효소-매개된 재조합 이벤트에 필요조건 및 충분조건이다. RRS는 뉴클레오티드 서열에서 재조합 이벤트가 발생할 위치를 특정하는 데 사용될 수 있다.
특정 구체예들에서, RRS는 Cre 재조합효소에 의해 인지될 수 있다. 특정 구체예들에서, RRS는 FLP 재조합효소에 의해 인지될 수 있다. 특정 구체예들에서, RRS는 Bxb1 인테그라제에 의해 인지될 수 있다. 특정 구체예들에서, RRS는 φC31 인테그라제에 의해 인지될 수 있다.
RRS가 LoxP 부위에 있는 특정 구체예들에서, 세포는 재조합을 수행하기 위해 Cre 재조합효소를 필요로 한다. RRS가 FRT 부위에 있는 특정 구체예들에서, 세포는 재조합을 수행하기 위해 FLP 재조합효소를 필요로 한다. RRS가 Bxb1 attP 또는 Bxb1 attB 부위에 있는 특정 구체예들에서, 세포는 재조합을 수행하기 위해 Bxb1 인테그라제를 필요로 한다. RRS가 φC31 attP 또는 φC31 attB 부위에 있는 특정 구체예들에서, 세포는 재조합을 수행하기 위해 φC31 인테그라제를 필요로 한다. 이들 재조합 효소는 해당 효소 또는 단백질의 인코딩 서열 또는 mRNA를 포함하는 발현 벡터를 사용하여, 세포 내로 도입될 수 있다.
TI와 관련하여, 게놈 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된, 본원에 기재된 바와 같은 랜딩 부위를 포함하는 TI에 적합한 임의의 공지된 또는 미래의 포유동물 숙주 세포가 본 발명에서 사용될 수 있다. 이러한 세포를 포유류 TI 숙주 세포로 나타낸다. 특정 구체예들에서, 상기 포유류 TI 숙주 세포는 본원에서 기술된 랜딩 부위를 포함하는 햄스터 세포, 인간 세포, 쥐 세포, 또는 마우스 세포다. 바람직한 하나의 구체예에서, 상기 포유류 TI 숙주 세포는 CHO 세포다. 특정 구체예들에서, 상기 포유류 TI 숙주 세포는 게놈의 유전자좌 내 단일 부위에 통합된 본원에서 기술된 랜딩 부위를 포함하는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, CHO K1 세포, CHO K1SV 세포, CHO DG44 세포, CHO DUKXB-11 세포, CHO K1S 세포, 또는 CHO K1 M 세포다.
특정 구체예들에서, 포유류 TI 숙주 세포는 통합된 랜딩 부위를 포함하며, 이때 상기 랜딩 부위는 하나 또는 그 이상의 재조합 인지 서열 (RRS)을 포함한다. RRS는 재조합효소, 예를 들면, Cre 재조합효소, FLP 재조합효소, Bxb1 인테그라제, 또는 φC31 인테그라제에 의해 인지될 수 있다. RRS는 LoxP 서열, LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, Lox66 서열, FRT 서열, Bxb1 attP 서열, Bxb1 attB 서열, φC31 attP 서열, 및 φC31 attB 서열로 구성된 군에서 각각 독립적으로선택될 수 있다. 다수의 RRS가 존재해야 하는 경우, 동일하지 않은 RRS가 선택되는 한, 각 서열의 선택은 서로 연관된다.
특정 구체예들에서, 상기 랜딩 부위는 하나 또는 그 이상의 재조합 인지 서열 (RRS)을 포함하고, 이때 상기 RRS는 재조합효소에 의해 인지될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 통합된 랜딩 부위는 적어도 2개 RRS들을 포함한다. 특정 구체예들에서, 통합된 랜딩 부위는 3개 RRS를 포함하며, 이때 상기 제3 RRS는 제1 및 제2 RRS 사이에 위치한다. 선호되는 특정 구체예들에서, 3개 RRS들 모두다 상이하다. 특정 구체예들에서, 상기 랜딩 부위는 제1, 제2 및 제3 RRS를 포함하며, 상기 제1 및 제2 RRS 사이에 적어도 하나의 선별 마커가 위치하며, 상기 제3 RRS는 상기 제1 및/또는 상기 제2 RRS와는 상이하다. 특정 구체예들에서, 상기 랜딩 부위는 제2 선별 마커를 더 포함하며, 상기 제1 선별 마커와 제2 선별 마커는 상이하다. 특정 구체예들에서, 상기 랜딩 부위는 제3 선별 마커와 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 더 포함하며, 이때 IRES는 상기 제3 선별 마커에 작동가능하도록 연계된다. 상기 제3 선별 마커는 상기 제1 선별마커 또는 제2 선별 마커와 상이할 수 있다.
본 발명은 여기에서 HEK 및 CHO 세포로 예시되지만, 이것은 단지 본 발명을 예시하기 위해 제시된 것이며 어떤 식으로든 제한으로 해석되어서는 안 된다. 실질적 범위는 청구범위에 명시되어 있다.
본 발명의 방법에 이용하기에 적합한 예시적인 포유류 TI 숙주 세포는 세포의 게놈 유전자좌 내 단일 부위에 통합된 랜딩 부위를 포함하는 CHO 세포이며, 이때 상기 랜딩 부위는 Cre 재조합효소 매개된 DNA 재조합을 위한 3개 이형특이적 loxP 부위들을 포함한다.
이 실시예에서, 상기 이형특이적 loxP 부위들은 L3, LoxFas 및 2L이며 (예를 들면, Lanza et al., Biotechnol. J. 7 (2012) 898-908; Wong et al., 핵산s Res. 33 (2005) e147), 이에 의해 L3과 2L는 각각 5'-단부 및 3'-단부에서 상기 랜딩 부위의 측면에 있고, LoxFas는 L3 부위와 2L 부위 사이에 위치한다. 상기 랜딩 부위는 형광 GFP 단백질의 발현을 위해 IRES를 통하여 선별 마커 발현에 연계된 바이시스트로닉 단위를 더 함유하고, 이로써 양의 선별에 의해 해당 랜딩 부위를 안정하시키고, 뿐만 아니라 형질감염 및 Cre-재조합(음의 선별) 후, 해당 부위의 부재에 대해 선별이 가능하다. 녹색 형광 단백질 (GFP)은 RMCE 반응을 모니터링하는 역할을 한다.
이전 단락에 요약된 랜딩 부위의 이러한 배치는 두 벡터, 예를 들면,L3 부위 및 LoxFas 부위를 품고있는 소위 전면 벡터(front vector), 및 LoxFas 부위 및 2L 부위를 품고 있는 후면 벡터(back vector)의 동시 통합을 허용한다. 상기 랜딩 부위에 존재하는 것과 상이한 선별 마커 유전자의 기능적 요소들이 두 벡터 사이에 분포될 수 있다: 프로모터 및 시작 코돈은 전면 벡터에 위치할 수 있는 반면, 코딩 영역 및 폴리 A 신호는 후면 벡터에 위치한다. 이들 두 벡터로부터의 전술한 핵산의 정확한 재조합효소-매개된 통합만이 각각의 선별제에 대한 저항성을 유도한다.
일반적으로, 포유류 TI 숙주 세포는 해당 포유류 세포의 게놈의 유전자좌 내 단일 부위에 통합된 랜딩 부위를 포함하는 포유류 세포이며, 이때 상기 랜딩 부위는 적어도 하나의 제1 선별 마커의 측면에 있는 제1 재조합 인지 서열과 제2 재조합 인지 서열, 및 제1 재조합 인지 서열과 제2 재조합 인지 서열 사이에 있는 제3 재조합 인지 서열을 포함하며, 이들 모든 재조합 인지 서열은 상이하다.
상기 선별 마커(들)은 아미노글리코시드 포스포트란스퍼라제 (APH) (예를 들면, 하이그로마이신 포스포트란스퍼라제 (HYG), 네오마이신 및 G418 APH), 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 티미딘 키나제 (TK), 글루타민 합성효소 (GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소 (인돌), 히스티디놀 탈수소효소 (히스티디놀 D), 및 푸로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 조이신, 및 미코페놀산에 대한 저항성을 인코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 상기 선별 마커(들)은 녹색 형광 단백질 (GFP), 강화된 GFP (eGFP), 합성 GFP, 황색 형광 단백질 (YFP), 강화된 YFP (eYFP), 청록 형광 단백질 (CFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-red, DsRed-단량체, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald6, CyPet, mCFPm, Cerulean, 및 T-Sapphire로 구성된 군에서 선택된 형광 단백질일 수 있다.
외인성 뉴클레오티드 서열은 해당 뉴클레오티드 서열이 특정 세포로부터 기원되지 않고, DNA 전달 방법, 예를 들면, 형질감염, 전기천공, 또는 형질변환 방법들에 의해 전술한 세포로 도입될 수 있는 뉴클레오티드 서열이다. 특정 구체예들에서, 포유류 TI 숙주 세포는 해당 포유류 세포의 게놈에서 하나 또는 그 이상의 통합 부위에 통합된 적어도 하나의 랜딩 부위를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 랜딩 부위는 상기 포유류 세포의 게놈의 특정 유전자좌 내 하나 또는 그 이상의 통합 부위에 통합된다.
특정 구체예들에서, 상기 통합된 랜딩 부위는 적어도 하나의 선별 마커를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 통합된 랜딩 부위는 제1, 제2 및 제3 RRS, 및 적어도 하나의 선별 마커를 포함한다. 특정 구체예들에서, 선별 마커는 상기 제1 및 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정 구체예들에서, 2개 RRS들은 적어도 하나의 선별 마커의 측면에 있고, 즉, 제1 RRS는 상기 선별 마커의 5' (상류)에 위치하며, 제2 RRS는 상기 선별 마커의 3' (하류)에 위치한다. 특정 구체예들에서, 제1 RRS는 상기 선별 마커의 5'-단부에 인접하며, 제2 RRS는 상기 선별 마커의 3'-단부에 인접한다. 특정 구체예들에서, 상기 랜딩 부위는 제1, 제2 및 제3 RRS, 및 상기 제1 및 제3 RRS 사이에 위치한 적어도 하나의 선별 마커를 포함한다.
특정 구체예들에서, 선별 마커는 제1 및 제2 RRS 사이에 위치하고, 2개의 측면 RRS들은 상이하다. 선호되는 특정 구체예들에서, 상기 제1 측면 RRS는 LoxP L3 서열이며, 상기 제2 측면 RRS는 LoxP 2L 서열이다. 특정 구체예들에서, LoxP L3은 상기 선별 마커의 5'에 위치하고, LoxP 2L 서열은 상기 선별 마커의 3'에 위치한다. 특정 구체예들에서, 상기 제1 측면 RRS는 야생형 FRT 서열이며, 상기 제2 측면 RRS는 돌연변이 FRT 서열이다. 특정 구체예들에서, 상기 제1 측면 RRS는 Bxb1 attP 서열이며, 상기 제2 측면 RRS는 Bxb1 attB 서열이다. 특정 구체예들에서, 상기 제1 측면 RRS는 φC31 attP 서열이며, 상기 제2 측면 RRS는 φC31 attB 서열이다. 특정 구체예들에서, 2개의 RRS들은 동일한 방향으로 위치해 있다. 특정 구체예들에서, 2개의 RRS들은 모두 전진 방향, 또는 후진 방향으로 있다. 특정 구체예들에서, 2개의 RRS들은 반대 방향으로 위치해 있다.
특정 구체예들에서, 상기 통합된 랜딩 부위는 제1 선별 마커와 제2 선별 마커를 포함하며, 이의 측면에 2개 RRS들이 있으며, 이때 상기 제1 선별 마커는 상기 제2 선별 마커와는 상이하다. 특정 구체예들에서, 2개 선별 마커들은 글루타민 합성효소 선별 마커, 티미딘 키나제 선별 마커, HYG 선별 마커, 및 푸로마이신 저항성 선별 마커로 구성된 군에서 서로 독립적으로 선택된다. 특정 구체예들에서, 상기 통합된 랜딩 부위는 티미딘 키나제 선별 마커 및 HYG 선별 마커를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 제1 선별 마커는 아미노글리코시드 포스포트란스퍼라제 (APH) (예를 들면, 하이그로마이신 포스포트란스퍼라제 (HYG), 네오마이신 and G418 APH), 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 티미딘 키나제 (TK), 글루타민 합성효소 (GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소 (인돌), 히스티디놀 탈수소효소 (히스티디놀 D), 및 푸로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 조이신, 및 미코페놀산에 대한 저상성을 인코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되며, 상기 제2 선별 마커는 GFP, eGFP, 합성 GFP, YFP, eYFP, CFP, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-red, DsRed-단량체, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald, CyPet, mCFPm, Cerulean, 및 T-Sapphire 형광 단백질로 구성된 군에서 선택된다. 특정 구체예들에서, 상기 제1 선별 마커는 글루타민 합성효소 선별 마커이며, 상기 제2 선별 마커는 GFP 형광 단백질이다. 특정 구체예들에서, 선별 마커들 측면에 있는 2개의 RRS들은 상이하다.
특정 구체예들에서, 상기 선별 마커는 프로모터 서열에 작동가능하도록 연계된다. 특정 구체예들에서, 상기 선별 마커는 SV40 프로모터에 작동가능하도록 연계된다. 특정 구체예들에서, 상기 선별 마커는 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터에 작동가능하도록 연계된다.
II.e 표적화된 통합
본 발명에 따른 재조합 포유류 세포 생성을 위한 한 가지 방법이 표적화된 통합 (TI)이다.
표적화된 통합에서, 포유동물 TI 숙주 세포의 게놈에서 특정 유전자좌에 외인성 핵산을 도입하기 위해, 부위-특이적 재조합이 사용된다. 이것은 게놈의 통합 부위에 있는 서열이 외인성 핵산으로 교환되는 효소적 공정이다. 이러한 핵산 교환의 수행에 사용되는 시스템 중 하나는 Cre-lox 시스템이다. 이러한 교환을 촉매하는 효소는 Cre 재조합효소다. 교환될 서열은 게놈 뿐만 아니라 외인성 핵산에서 2개의 lox(P)-부위의 위치에 의해 특정된다. 이러한 lox(P)-부위들은 Cre 재조합효소에 의해 인지된다. 더 이상 필요한 것은 없는데, 즉, ATP 등이 없다. 원래, Cre-lox 시스템은 박테리오파지 P1에서 발견되었다.
Cre-lox 시스템은 포유류, 식물, 박테리아 및 효모와 같은 다양한 세포 유형에서 작동한다.
하나의 구체예에서, 상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산은 단일 또는 이중 재조합효소 매개된 카세트 교환 (RMCE)에 의해 포유류 TI 숙주 세포로 통합되었다. 이로써, 재조합 포유류 세포, 이를 테면, 재조합 CHO 세포가 얻어지며, 이때 특정된, 특이적 발현 카세트 서열이 게놈의 단일 유전자좌로 통합되고, 이는 결국 항체-다량체-융합 폴리펩티드의 효율적인 발현 및 생산으로 이어진다.
Cre-LoxP 부위-특이적 재조합 시스템은 많은 생물학적 실험 시스템에서 널리 사용되었다. Cre 재조합효소는 34 bp의 LoxP 서열을 인지하는 38-kDa 부위-특이적 DNA 재조합효소다. Cre 재조합효소는 박테리오파지 P1에서 파생되며, 티로신 패밀리 부위-특이적 재조합효소에 속한다. Cre 재조합효소는 LoxP 서열 사이의 분자내 재조합 및 분자간 재조합 모두를 중재할 수 있다. LoxP 서열은 13bp의 역전된 2개 반복부가 측면에 있는 8bp의 비-팔린드롬회성 코어 영역으로 구성된다. Cre 재조합효소는 상기 13 bp의 반복부에 결합하고, 이로 인하여 8 bp의 코어 영역내 재조합을 매개한다. Cre-LoxP-매개된 재조합은 고효율로 발생하며, 다른 숙주 요소가 필요하지 않다. 2개의 LoxP 서열이 동일한 뉴클레오티드 서열 상의 동일한 방향에 위치한다면, Cre 재조합효소-매개된 재조합은 두 개의 LoxP 서열 사이에 위치한 DNA 서열을 공유적으로 닫힌 원으로 절단시킨다. 2개의 LoxP 서열이 동일한 뉴클레오티드 서열 상에 역전된 위치로 존재한다면, Cre 재조합효소-매개된 재조합으로 상기 2개 서열 사이에 위치한 DNA 서열 방향이 역전될 것이다. 만약 2개의 LoxP 서열이 상이한 2개의 DNA 분자 상에 있고, 한 개 DNA 분자가 원형이라면, Cre 재조합효소-매개된 재조합으로 원형 DNA 서열을 통합시킬 것이다.
"RRS들을 매칭시킨다"라는 용어는 두 개의 RRS들 사이에 재조합이 일어나는 것을 나타낸다. 특정 구체예들에서, 상기 2개의 매칭 RRS들은 동일하다. 특정 구체예들에서, 이들 두 RRS들은 모두 야생형 LoxP 서열이다. 특정 구체예들에서, 이들 두 RRS들은 돌연변이 LoxP 서열이다. 특정 구체예들에서, 이들 두 RRS들은 야생형 FRT 서열이다. 특정 구체예들에서, 이들 두 RRS들은 돌연변이 FRT 서열이다. 특정 구체예들에서, 상기 2개의 매칭 RRS들은 상이한 서열이지만, 그러나 동일한 재조합효소에 의해 인지될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 제1 매칭 RRS는 Bxb1 attP 서열이며, 상기 제2 매칭 RRS는 Bxb1 attB 서열이다. 특정 구체예들에서, 상기 제1 매칭 RRS는 φC31 attB 서열이며, 상기 제2 매칭 RRS는 φC31 attB 서열이다.
본 발명의 특정 구체예들에서, "2개-플라스미드 RMCE" 전략 또는 "이중 RMCE"는 2개-벡터 조합을 이용한다. 예를 들면 (이에 국한되지 않지만), 통합된 랜딩 부위는 3개 RRS들을 포함할 수 있는데, 예를 들면, 이때 상기 제3 RRS ("RRS3")는 상기 제1 RRS ("RRS1")와 제2 RRS ("RRS2") 사이에 존재하는 배열을 하고 있고, 한편 제1 벡터는 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상에 제1 및 제3 RRS와 일치되는 두 개 RRS들을 포함하고, 제2 벡터는 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상에 제3 및 제2 RRS와 일치되는 두 개의 RRS들을 포함한다.
2개-플라스미드 RMCE 전략은 2가지 독립적인 RMCE들을 동시에 수행하기 위해 3개의 RRS 부위들을 이용하는 것이 연루되어 있다. 따라서, 2개-플라스미드 RMCE 전략을 이용하여 포유류 TI 숙주 세포에서 랜딩 부위에는 상기 제1 RRS 부위 (RRS1) 또는 제2 RRS 부위 (RRS2)와 교차 활성을 가지지 않는 제3 RRS 부위 (RRS3)가 내포된다. 표적화될 2개의 플라스미드들은 효율적인 표적화를 위해 동일한 측면 RRS 부위를 필요로 하는데, 하나의 플라스미드(전면)는 RRS1 및 RRS3 측면에 있고, 다른 하나의 플라스미드(후면)는 RRS3 및 RRS2 측면에 있다. 추가적으로, 2개-플라스미드 RMCE에는 2개의 선별 마커들이 필요하다. 한 개 선별 마커 발현 카세트는 두 부분으로 갈라진다. 전면 플라스미드는 프로모터, 이어서 시작 코돈와 RRS3 서열을 함유할 것이다. 후면 플라스미드는 시작-코돈 (ATG)을 제외한, 선별 마커 코딩 영역의 N-말단에 융합된 RRS3 서열을 가질 것이다. 해당 융합 단백질의 틀내 해독을 확보하기 위해, 상기 RRS3 부위와 선별 마커 서열 사이에 삽입될 추가 뉴클레오티드, 즉, 작동가능한 링키지가 필요할 수 있다. 두 플라스미드 모두가 모두 올바르게 삽입된 경우에만, 해당 선택 마커의 전체 발현 카세트가 어셈블리되며, 따라서 세포에게 각각의 선별제에 저항성이 부여된다.
2개-플라스미드 RMCE는 표적 게놈 유전자좌 내의 2개의 이형특이성 RRS와 공여 DNA 분자 간 재조합 효소에 의해 촉매되는 이중 재조합 교차-사건이 연루된다. 2개-플라스미드 RMCE는 포유류 TI 숙주 세포 게놈의 사전-결정된 유전자좌로 전면-벡터와 후면- 벡터의 DNA 서열 사본이 도입하도록 설계된다. RMCE는 원핵 벡터 서열이 포유류 TI 숙주 세포의 게놈에 도입되지 않고, 따라서 숙주 면역 또는 방어 기전의 원치 않는 촉발이 감소 및/또는 방지되도록 구현될 수 있다. 상기 RMCE 절차는 다중 DNA 서열로 반복될 수 있다.
특정 구체예들에서, 표적화된 통합은 2개의 RMCE에 의해 이루어지고, 이때 각 서열이 2개의 이형특이적 RRS의 측면에 상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드의 일부분을 인코드하는 적어도 하나의 발현 카세트, 및/또는 적어도 하나의 선별 마커 또는 이의 일부분을 포함하고 있는 2개의 상이한 DNA 서열은 포유류 TI 숙주 세포와 매칭되는 RRS의 게놈의 사전-결정된 부위로 통합된다. 특정 구체예들에서, 표적화된 통합은 다중 RMCEs에 의해 이루어지고, 이때 다중 벡터들의 DNA 서열은 각각 2개의 이형특이적 RRS의 측면에 항체-다량체-융합 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 발현 카세트 및/또는 적어도 하나의 선별 마커 또는 이의 일부분을 포함하고, 이들은 모두 포유류 TI 숙주 세포의 게놈의 사전-결정된 부위로 통합된다. 특정 구체예들에서 상기 선별 마커는 제1 벡터 상에 부분적으로 인코드될 수 있고, 제2 벡터 상에 부분적으로 인코드될 수 있고, 이중 RMCE에 의한 모두 올바른 통합되어야 만, 이들 선택 마커의 발현이 허용된다.
특정 구체예들에서, 재조합효소-매개된 재조합에 의한 표적화된 통합으로, 원핵 세포의 서열이 없이, 선별 마커 및/또는 숙주 세포 게놈 서열의 하나 또는 그 이상의 사전-결정된 통합 부위로 통합된 항체-다량체-융합 폴리펩티드에 대한 상이한 발현 카세트가 되도록 한다.
서열 식별 번호: 130: L3 재조합효소 인지 서열의 예시적인 서열
서열 식별 번호: 131: 2L 재조합효소 인지 서열의 예시적인 서열
서열 식별 번호: 132: LoxFas 재조합효소 인지 서열의 예시적인 서열
서열 식별 번호: 133-5: 인간 CMV 프로모터의 예시적인 변이체
서열 식별 번호: 136: 예시적인 SV40 폴리아데닐화 신호 서열
서열 식별 번호: 137: 예시적인 bGH 폴리아데닐화 신호 서열
서열 식별 번호: 138: 예시적인 hGT 종료인자 서열
서열 식별 번호: 139: 예시적인 SV40 프로모터 서열
서열 식별 번호: 140: 예시적인 GFP 핵산 서열
***
도시되고, 구체화된 다양한 구체예에 더하여, 개시된 주제는 또한 여기에 개시되고, 구현된 특징의 다른 조합을 갖는 다른 구체예들에 관한 것이다. 이와 같이, 여기에 제시된 특정한 특징들은 개시된 주제가 여기에 개시된 특징들의 임의의 적합한 조합을 포함하도록 개시된 주제의 범위 내에서 다른 방식으로 서로 조합될 수 있다. 개시된 주제의 특이적 구체예들의 전술한 설명은 예시 및 설명의 목적으로 제공되었다. 개시된 주제를 개시된 구체예들로 제한하거나 또는 배타적이지 않다.
개시된 주제의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고, 개시된 주제의 조성물 및 방법에 대해 다양한 수정 및 변형이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 개시된 주제는 첨부된 구체예들 및 이의 균등물의 범위 내에 있는 수정 및 변형을 포함하는 것으로 의도된다.
다양한 간행물, 특허 및 특허 출원이 본 명세서에 인용되어 있으며, 그 내용은 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다.
하기 실시예들과 서열들은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 구체예들에 기재되어 있다.
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실시예:
실시예 1
일반적인 기술
재조합 DNA 기술
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, (1989)에 기술된 바와 같이 DNA를 조작하기 위해 표준 방법이 사용되었다. 분자 생물학적 시약들은 제조업체의 지침에 따라 사용되었다.
유전자 합성
원하는 유전자 세그먼트는 Geneart GmbH (Regensburg, Germany)에서 화학적 합성에 의해 준비되었다. 합성된 유전자 단편들을 증식/증폭을 위해, 대장균 플라스미드로 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 단편들의 DNA 서열은 DNA 시퀀싱에 의해 검증되었다. 대안으로, 짧은 합성 DNA 단편들은 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 어닐링하거나 또는PCR을 통해 어셈블링하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 metabion GmbH(Planegg-Martinsried, Germany)에서 마련하였다.
DNA 서열 결정
DNA 서열은 MediGenomix GmbH(Martinsried, Germany) 또는 SequiServe GmbH(Vaterstetten, Germany)에서 수행된 이중 가닥 시퀀싱에 의해 결정되었다.
DNA 서열 및 단백질 서열 분석, 및 서열 데이터 관리
EMBOSS(European Molecular Biology Open Software Suite) 소프트웨어 패키지와 Invitrogen의 Vector NTI 버전 11.5 또는 Geneious 프라임이 서열 생성, 맵핑, 분석, 주석 및 도해에 사용되었다.
시약
모든 상업용 화학 물질, 항체 및 키트는 달리 명시되지 않는 한, 제조업체의 프로토콜에 따라 제공된 대로 사용되었다.
단백질 측정
Pace, et al., Protein Science 4 (1995) 2411-1423에 따라 아미노산 서열에 기초하여 산출된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 결정함으로써 정제된 항체 및 유도체의 단백질 농도를 측정하였다.
상층액에서 항체 농도 측정
1) 단백질 A 비드
세포 배양 상층액에서 항체 농도는 단백질 A 아가로스-비드를 사용한 면역침전에 의해 추정되었다 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). 따라서, 60 μL 단백질 A 아가로스 비드를 TBS-NP40 (150 mM NaCl 및 1% Nonidet-P40이 보충된, 50 mM Tris 완충액, pH 7.5)에서 3회 세척하였다. 이어서, 1-15mL 세포 배양 상청액을 TBS-NP40에서 사전-평형화시킨 단백질 A 아가로스 비드에 적용했다. 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후, 비드를 Ultrafree-MC-필터 컬럼(Amicon)에서 0.5mL TBS-NP40으로 1회, 0.5mL 2x 인산 완충 식염수(2xPBS, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)로 2회, 및 0.5mL 100mM 구연산나트륨 완충액(pH 5.0)으로 짧게 4회 세척했다. 35μL NuPAGE® LDS 샘플 완충액(Invitrogen)을 첨가하여, 결합된 항체를 용출했다. 시료의 절반을 각각 NuPAGE® 시료 환원제와 합치거나 또는 환원하지 않은 상태로 두고 10분 동안 70℃에서 가열시켰다. 결과적으로, 5-30μL를 4-12% NuPAGE® Bis-Tris SDS-PAGE 젤(Invitrogen)(환원되지 않은 SDS-PAGE의 경우 MOPS 완충액과 함꼐, 및 환원된 SDS-PAGE의 경우 NuPAGE® 항산화제 실행 완충액 첨가제(Invitrogen)와 MES 완충액과 함께)에 제공하였고, Coomassie Blue로 착색시켰다.
2) 친화성 HPLC
세포 배양 상청액 내 항체 농도를 친화성 HPLC 크로마토그래피로 정량적으로 측정하였다. 간략하게 설명하자면, 단백질 A에 결합하는 항체를 함유하는 세포 배양 상청액을 Applied Biosystems Poros A/20 컬럼 상의 200 mM KH2PO4, 100 mM 구연산나트륨, pH 7.4에 적용시켰고, Agilent HPLC 1100 시스템 상에서 200 mM NaCl, 100 mM 구연산, pH 2.5로 용리시켰다. 용출된 항체는 UV 흡광도 및 피크 면적 통합으로 정량화하였다. 정제된 표준 IgG1 항체가 표준으로 사용되었다.
3) 샌드위치 ELISA
세포 배양 상청액 내 항체 및 유도체의 농도를 샌드위치-IgG-ELISA로 측정했다. 간략하게 설명하자면, StreptaWell High Bind Streptavidin A-96 웰 미량적정 플레이트(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)에 웰당 100 μL의 바오티닐화된 항-인간 IgG 포획 분자 F(ab')2<h-Fcγ> BI(Dianova)를 실온에서 1시간 동안 또는 4℃에서 0.1μg/mL로 피복시키고, 후속적으로 웰당 200 μL의 PBS, 0.05% Tween (PBST, Sigma).로 3회 세척하였다. 그 후, 각각의 항체를 함유하는 세포 배양 상청액의 PBS(Sigma)를 웰당 100 μL의 일련의 희석액을 웰에 첨가하였고, 진탕기에서 실온에서 1-2시간 동안 항온처리하였다. 웰을 웰당 200μL의 PBST로 3회 세척하였고, 검출 항체로써 100μL의 F(ab')2<hFcγ>POD(Dianova)를 mL당 0.1μg으로 사용하여 1-2시간 동안 항온처리함으로써 결합된 항체를 검출했다. 결합되지 않은 검출 항체는 웰당 200 μL의 PBST로 3회 세척하여 제거했다. 결합된 검출 항체는 웰당 100 μL의 ABTS를 첨가한 후, 항온처리함으로써 검출했다. 측정 파장 405nm(기준 파장 492nm)에서 Tecan Fluor Spectrometer에서 흡광도를 측정했다.
CHO 숙주 세포주의 배양
CHO 숙주 세포는 85%의 습도, 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 37℃에서 배양되었다. 그들은 300μg/mL 하이그로마이신 B와 4μg/mL의 제2 선택 마커를 함유하는 전용 DMEM/F12-기반 배지에서 배양되었다. 세포는 총 부피 30mL에서 0.3x10E6 세포/ml의 농도로 매 3일 또는 매 4일마다 분할하였다. 배양을 위해 125mL의 배플-없는, Erlenmeyer 진탕 플라스크를 사용했다. 세포를 5cm의 진탕 진폭으로, 150rpm에서 진탕시켰다. Cedex HiRes Cell Counter (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)로 세포 수를 측정했다. 세포는 60일령이 될 때까지, 배양물에서 유지되었다.
형질변환 10-베타 기능성 대장균(E. coli) 세포
형질변환을 위해, 10-베타 기능성 대장균 세포를 얼음 위에서 해동시켰다. 그 후, 2 μL의 플라스미드 DNA를 세포 현탁액에 직접 피펫팅했다. 튜브를 가볍게 치고, 30분 동안 얼음 위에 두었다. 그 후, 세포를 42℃ 따뜻한 발열-블록에 넣고, 정확히 30초 동안 열-충격을 가했다. 그 직후, 세포를 얼음 위에서 2분 동안 냉각시켰다. 950μL의 NEB 10-베타 성장 배지를 세포 현탁액에 첨가했다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 진탕 항온처리했다. 그런 다음, 50-100μL를 미리-데운(37℃) LB-Amp 한천 플레이트에 피펫팅하고, 일회용 주걱으로 펼쳤다. 상기 플레이트를 37℃에서 밤새 항온처리했다. 암피실린에 대한 내성 유전자를 휴대하고 있는 플라스미드가 성공적으로 통합된 박테리아만이 이 플레이트에서 자랄 수 있다. 다음날, 단일 콜로니를 찍어내고, 후속적으로 플라스미드 준비를 위해, LB-Amp 배지에서 배양시켰다.
박테리아 배양
대장균(E. coli) 배양은 Luria Bertani의 줄임말인 LB-배지에서 수행되었으며, 여기에 1mL/L 100mg/mL 암피실린을 첨가하여 0.1mg/mL의 암피실린 농도를 만들었다. 상이한 플라스미드 준비물의 양에 대해, 단일 박테리아 콜로니를 다음의 양으로 접종하였다.
표: 대장균 배양 용적
Figure pct00012
Mini-Prep의 경우, 96-웰 2mL 딥-웰 플레이트를 웰당 1.5mL의 LB-Amp 배지로 채웠다. 콜로니를 선택하여 이쑤시개로 찍어내었고, 이를 배지에 넣었다. 모든 콜로니가 선택되었을 때, 끈적끈적한 공기 다공성 막으로 플레이트를 닫았다. 이 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 200rpm의 진탕 속도로 23시간 동안 항온처리하였다.
Mini-Preps의 경우, 15mL 튜브(통풍 뚜껑 포함)에 3.6mL LB-Amp 배지를 채우고, 박테리아 콜로니를 동일하게 접종했다. 상기 이쑤시개는 제거하지 않았고, 배양하는 동안 튜브에 그대로 두었다. 96-웰 플레이트와 마찬가지로, 튜브를 37℃, 200rpm에서 23시간 동안 항온처리하였다.
Maxi-Prep의 경우, 200mL의 LB-Amp 배지를 오토클레이브된, 1 L의 Erlenmeyer 유리로 된 플라스크에 채우고, 약 5시간이 경과된 박테리아 일일 배양액 1mL를 접종했다. 상기 Erlenmeyer 플라스크를 종이 마개로 닫았고, 37℃, 200rpm에서 16시간 동안 항온처리하였다.
플라스미드 준비
Mini-Prep의 경우, 50μL의 박테리아 현탁액을 1mL 딥-웰 플레이트로 옮겼다. 그 후, 박테리아 세포를 플레이트에서 3000rpm, 4℃에서 5분 동안 원심분리했다. 상청액을 제거하였고, 박테리아 펠릿이 있는 플레이트를 EpMotion에 넣었다. 대략적으로 90분 후, 실행이 완료되었고, 용출된 플라스미드 DNA를 추가 사용을 위해 EpMotion로부터 꺼낼 수 있다.
Mini-Prep의 경우, 인큐베이터에서 15mL 튜브를 꺼내었고, 3.6mL 박테리아 배양액을 2mL Eppendorf 튜브 2개에 나눠 담았다. 이들 튜브를 실온에서 3분 동안 탁상용 마이크로원심분리기에서 6,800xg로 원심분리시켰다. 그 후, 제조업체의 지침에 따라 Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit로 Mini-Prep을 수행했다. 플라스미드 DNA 농도는 Nanodrop으로 측정되었다.
Maxi-Prep은 제조업체의 지침에 따라, Macherey-Nagel NucleoBond® Xtra Maxi EF 키트를 사용하여 수행되었다. DNA 농도는 Nanodrop으로 측정되었다.
에탄올 침전
DNA 용액의 부피를 2.5-배 부피의 에탄올 100%와 혼합하였다. 혼합물을 -20℃에서 10분 동안 항온처리했다. 그런 다음, DNA를 14,000rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 조심스럽게 제거하였고, 펠릿을 70%(v/v) 에탄올로 세척시켰다. 다시, 튜브를 14,000rpm, 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 피펫팅으로 상청액을 조심스럽게 제거하였고, 펠릿을 건조시켰다. 에탄올이 증발되면, 적당량의 엔도톡신-없는 물을 첨가하였다. 4℃에서 밤새도록 물에 DNA가 다시 용해되도록 시간이 주어졌다. 소량을 취하고, Nanodrop 장치로 DNA 농도를 측정했다.
예비 항체 정제
표준 프로토콜을 참조하여, 여과된 세포 배양 상청액으로부터 항체를 정제하였다. 간단히 말해서, 항체를 단백질 A Sepharose 컬럼(GE healthcare)에 적용하였고, PBS로 세척했다. 항체의 용출은 pH 2.8에서 달성된 후 즉시 중화되었다. 응집된 단백질은 PBS 또는 150mM NaCl(pH 6.0)을 포함하는 20mM 히스티딘 완충액에서 크기 배제 크로마토그래피(Superdex 200, GE Healthcare)에 의해 단량체 항체로부터 분리되었다. 단량체 항체 분획을 모으고, 예를 들어, MILLIPORE Amicon Ultra(30 MWCO) 원심 농축기를 사용하여 농축(필요한 경우)시키고, -20℃ 또는 -80℃에서 냉동시키고, 보관했다. 샘플의 일부는 가령, SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 또는 질량 분석법에 의한 후속적인 단백질 분석 및 분석학적 특성화를 위해 제공되었다.
SDS-PAGE
NuPAGE® Pre-Cast 젤 시스템(Invitrogen)을 제조업체의 지침에 따라 사용했다. 특히, 10% 또는 4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS 사전-주조된 겔 (pH 6.4) 및 NuPAGE® MES (NuPAGE® 항산화제 실행 완충액 첨가체와 함께, 환원된 겔) 또는 MOPS (비-환원된 겔) 실행 완충액이 이용되었다.
CE-SDS
순도 및 항체 무결성(integrity)은 미세 유체 Labchip 기술(PerkinElmer, USA)을 사용하여 CE-SDS로 분석했다. 따라서, 제조업체의 지침에 따라 HT Protein Express Reagent Kit를 사용하여, CE-SDS 분석을 위해 5μL의 항체 용액을 준비하였고, HT Protein Express Chip을 사용하여 Labchip GXII 시스템에서 분석했다. Labchip GX 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석했다.
분석용 크기 배제 크로마토그래피
항체의 응집 및 올리고머 상태를 측정하기 위한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 HPLC 크로마토그래피로 수행했다. 간략하게 설명하자면, 단백질 A 정제된 항체를 Dionex Ultimate® 시스템 (Thermo Fischer Scientific) 상에서 Tosoh TSKgel G3000SW 컬럼의 300 mM NaCl, 50 mM KH2PO4/K2HPO4 완충액 (pH 7.5)에 적용시켰고, 또는 Dionex HPLC-시스템 상에 Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare)의 2 x PBS에 적용시켰다. 용출된 항체는 UV 흡광도 및 피크 면적 통합으로 정량화하였다. BioRad Gel Filtration Standard 151-1901이 표준으로 사용되었다.
질량 분석
이 섹션에서는 올바른 어셈블리(assembly)에 중점을 둔 항체/융합 단백질의 특성을 설명한다. 예상되는 일차 구조는 탈당화된 무손상 항체 및 특수한 경우 탈당화된/제한된 LysC 절단된 항체의 전자분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS)에 의해 분석되었다.
항체/융합 단백질은 1mg/mL의 단백질 농도에서 최대 17시간 동안 37℃에서 인산염 또는 Tris 완충액에서 N-글리코시다아제 F로 탈당화되었다. 제한된 LysC(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 절단은 각각, 실온에서 120시간 동안, 또는 37℃에서 40분 동안, Tris 완충액(pH 8)에서 100μg의 탈당화된 항체로 수행되었다. 질량 분석 전에 샘플을 Sephadex G25 컬럼(GE Healthcare)에서 HPLC를 통해 탈염시켰다. 총 질량은 TriVersa NanoMate 소스(Advion)가 장착된 maXis 4G UHR-QTOF MS 시스템(Bruker Daltonik) 상에서 ESI-MS를 통해 측정되었다.
실시예 2
무작위 통합을 위한 플라스미드 생성
항체/융합 단백질의 발현을 위해, CMV-인트론 A 프로모터가 있거나 또는 없는 cDNA 구조, 또는 CMV 프로모터가 있는 게놈 구조에 기반한, 일시적 발현(예를 들면, HEK293 세포에서)을 위한 발현 벡터가 적용될 수 있다.
발현 카세트 구성
항체 쇄의 발현을 위해 다음의 기능적 요소들을 포함하는 전사 단위를 사용하였다:
- 인트론 A이 내포된 인간 사이토메갈로바이러스의 초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미해독 영역 (5'UTR),
- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 각 항체 쇄를 인코딩하는 핵산,
- 소의 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA), 및
- 임의선택적으로, 인간 가스트린 종료인자 (hGT).
발현시키고자 하는 원하는 유전자가 내포된 발현 유닛/카세트 외에, 기본/표준 포유동물 발현 플라스미드는 다음을 함유한다:
- 대장균에서 이 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 원점, 및
- 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자.
항체 쇄들을 인코딩하는 융합 유전자들은 PCR 및/또는 유전자 합성에 의해 생성되고, 핵산 세그먼트의 연결에 의한 공지된 재조합 방법 및 기술, 예를 들어, 각 벡터에서 고유한 제한절단 부위를 사용하여, 어셈블리된다. 서브클로닝된 핵산 서열은 DNA 시퀀싱에 의해 확인된다. 일시적 형질감염의 경우, 형질전환된 대장균 배양물(NucleoBond AX, Macherey-Nagel)로부터 벡터 준비를 통해 더 많은 양의 벡터를 준비한다.
모든 구조체에서, 노브-인투-홀 이형이량체화 기술은 제1 CH3 도메인에서 전형적인 노브 (T366W) 치환, 및 제2 CH3 도메인에서 대응하는 홀 치환 (T366S, L368A 및 Y407V) (뿐만 아니라 2개 추가적으로 도입된 시스테인 잔기 S354C/Y349C) (상기에서 도시된 각 대응하는 중쇄 (HC) 서열에 함유됨)을 이용하였다.
실시예 3
일시적 발현
HEK 293 세포
일시적 발현은 현탁액-적응된 HEK293F (FreeStyle 293-F 세포; Invitrogen) 세포에서 형질감염 시약 293-프리 (Novagen)를 이용하여 수행되었다.
세포는 125mL 진탕 플라스크(37℃, 7% CO2, 85% 습도, 135rpm에서 항온처리/진탕)에서 해동된 후, 최소 4회(부피 30mL) 희석하여 계대되었다.
세포를 250mL 부피에서 3x10E5 세포/mL로 확장했다. 3일 후, 세포를 분할하였고, 1-리터 진탕 플라스크의 250mL 부피에서 7*105개 세포/mL의 밀도로 새로이 씨딩했다. 형질감염은 약 1.4 - 2.0 x 106개 세포/mL의 세포 밀도에서 24시간 후에 이루어질 것이다.
형질감염 전, 250μg 플라스미드-DNA를 예열된(수조; 37℃) Opti-MEM(Gibco)을 사용하여 최종 부피 10mL로 희석했다. 용액을 부드럽게 혼합시키고, 실온에서 5분 이하 동안 항온처리하였다. 그런 다음, 333.3 μL의 293-형질감염 시약이 없는(free) DNA-OptiMEM-용액에 첨가했다. 그 후, 용액을 부드럽게 혼합하였고, 실온에서 15-20분 동안 항온처리하였다. 혼합물의 전체 부피를 1 L 진탕 플라스크에 첨가했다. 세포를 37℃, 7% CO2, 85% 습도, 135rpm에서 6 또는 7일 동안 항온처리하였다.
10분 동안 2,000rpm, 4℃에서 첫 번째 원심분리-단계로 상청액을 수확했다. 그런 다음, 이 상층액을 20분 동안 4,000rpm, 4℃에서 두 번째 원심분리기를 위해 새로운 원심분리-플라스크로 옮겼다. 그 후, 세포가 없는 상청액을 0.22μm 바틀-탑-필터(bottle-top-filter)를 통해 여과시켰고, 냉동고(-20℃)에 보관했다.
CHO-K1 세포
일시적 발현은 형질감염 시약 Nucleofector 용액 V(Lonza) 및 전기천공용 Amaxa nucleoporator를 사용하여, 현탁액에 적응된 CHO-K1 세포에서 수행되었다.
세포는 125mL의 진탕 플라스크(37℃, 7% CO2, 85% 습도, 140rpm에서 항온처리)에서 해동된 후, 최소 4회 (부피 30mL) 희석하여 계대되었다.
세포를 250mL의 진탕 플라스크에서 60mL 부피에 3x105 세포/mL로 확장했다. 세포는 mL당 약 1.2-2.0 x 106개 세포의 세포 밀도에서 형질주입할 준비가 될 것이다. 1000rpm, 실온에서 10분 동안 원심분리하여, 총 1x107개의 세포를 수집하였다. 세포 펠릿을 100 μL의 사전-예열 (RT)시킨 Nucleofector 용액(Lonza)에 용해했다. 총 1.2pmol 또는 최대 플라스미드 DNA (물에 희석) 10μg을 최종 부피 10μL로 혼합한 다음, 100μL 형질감염 시약 및 1x107 세포와 혼합했다. 이어서 플라스미드 DNA, 형질감염 시약 및 세포의 혼합물을 전기천공 큐벳으로 옮겼다. 항온처리시간 없이, 바로 큐벳을 Nucleofector 시스템에 넣었다. 프로그램 "U-24"로 전기천공한 후, 사전-예열(37℃)시킨 배지 500μL를 큐벳에 추가했다. 전체 혼합물을 사전-예열(37℃)된 화학적 특정 배지(Invitrogen) 30mL가 담긴 125mL의 진탕 플라스크로 옮겼다.
CHO-K1 TI 세포
일시적 발현은 형질감염 시약 PE 완충액 및 전기천공용 MaxCyte (OC-400 프로세싱 어셈블리)으로 현탁액-적응된 CHO-K1 TI-숙주 세포에서 수행되었다.
세포는 125mL 진탕 플라스크(37℃, 5% CO2, 85% 습도, 150rpm에서 항온처리)에서 해동된 후, 최소 4회 계대되었다.
첫날, 세포를 진탕 플라스크에서 mL당 4x105 개의 세포로 확장했다. 셋째날, 이들 세포는 mL 당 약 1-2 x 106개 세포의 세포 밀도에서 형질주입할 준비가 될 것이다.
1000rpm, 실온에서 10분 동안 원심분리하여, 총 3x106개의 세포를 수집하였다. 세포 펠릿을 300μL의 PE 완충액(MaxCyte)에 용해한 다음, 최대 25μg의 플라스미드 DNA를 추가했다. 이어서 플라스미드 DNA, 형질감염 시약 및 세포의 혼합물을 전기천공 큐벳으로 옮긴 다음, "CHO-2" 및 프로세스 어셈블리 프로토콜을 사용하여 전기천공하였다. 전기천공 후, 전체 혼합물을 교반 없이 30분 동안 37℃에서 진탕 플라스크로 옮겼다. 30분 후, 회수 배지 30mL를 추가한다.
형질감염된 세포를 37℃, 5% CO2, 85% 습도, 100rpm에서 7일 동안 진탕 항온처리하였다.
ExpiCHO 세포
일시적 발현은 ExpiCHO-S 발현 시스템 (A29133; Gibco)으로 수행하였다.
제조업체의 지침에 따라 해동, 계대 배양 및 형질감염을 수행했다 (ExpiCHO 발현 시스템 (A29133) 사용자 지침 참고). 형질감염을 위해, "표준 프로토콜"(참조 페이지 12 A29133, 설명서)을 사용했다.
형질감염된 세포를 37℃, 7% CO2, 85% 습도, 140rpm에서 7일 동안 진탕 항온처리하였다.
10분 동안 1,000rpm, 4℃에서 첫 번째 원심분리- 단계로 상청액을 수확했다. 그런 다음, 이 상층액을 20분 동안 4,000rpm, 4℃에서 두 번째 원심분리기를 위해 새로운 원심분리-플라스크로 옮겼다. 그 후, 세포가 없는 상청액을 0.22μm 바틀-탑-필터(bottle-top-filter)를 통해 여과시켰고, 추가 사용할 때까지 냉동고(-20℃)에 보관했다.
실시예 4
안정적인 발현 및 정제
안정적인 세포주 생성
2개의 이중 플라스미드와 단일 플라스미드를 사용하여 숙주 세포주 CHO K1-M을 공동 형질감염시켰다. 상기 이중 플라스미드에는 FAP의 VL, VH 및 4-1-BBL 융합 단백질의 단량체 및 이량체 뿐만 아니라, FAP 및 4-1-BBL의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA 단편이 포함되어 있는 반면, 상기 단일 플라스미드에는 4-1-BBL의 이량체만 함유되어 있다. 모든 서열은 화학적으로 합성되고, 이렇게 함으로써, 이종성 DNA 요소들과 복합되는데, 이들 요소에는 다음의 것들이 내포된다: a) 5'-Kozak 서열이 내포된 5'-UTR , b) 리더 서열 (LL)용 DNA 세그먼트, c) 합성될 DNA 세그먼트의 5'-단부 및 3'-단부에 추가되는, 클로닝을 위한 적합한 제한절단 엔도뉴클레아제 부위.
상기 숙주 세포주는 Puck et al.,에 의해 도입된 CHO 세포주에서 확립된 프롤린 영양요구성 균주 K1 (Kao and Puck, 1967)로부터 파생된다. CHO K1 세포는 동결된 스톡 형태로 American Type Culture Collection (ATCC)(등록 번호 CCL-61)로부터 구하였고, 후속적으로 Roche Pharma, Penzberg,에서 화학적으로 특정된 배지 및 현탁액에 성장하도록 적응되었고, 이를 "CHO K1-M"로 명명한다.
CHO K1-M WCB의 한 개 앰플을 형질감염에 사용했다. 화학적으로 특정된 배지에서 선형화된 DNA를 사용하여 형질감염을 수행했다. 재조합 DNA를 안정적으로 통합한 클론은 DHFR/MTX 발현 시스템을 기반으로 선택되었다. 안정한 형질감염체를 선별하기 위해, 세포를 웰당 500개 세포의 밀도로, 384-웰 플레이트로 옮겼고, 400nM MTX를 함유하는 화학적으로 특정된 배지에서 배양했다. 이러한 조건들은 이중 플라스미드 및 단일 플라스미드에서 DHFR 유전자를 과발현시키는 세포만 살아남게 하였다.
형질감염 3주 후, 항-인간 Fc ELISA에 의해 인간 IgG의 존재에 대해 상청액을 스크리닝하였다. 항체 역가에 대해 양성인 클론을 96-웰 형식으로 확장한 다음, MTX 농도를 250nmol/L MTX로 감소시켰다. 1 주 후, 생산된 FAP 항체-4-1-BBL 융합 단백질 분자의 기능을 보장하기 위해 FAP 항원 및 4-1-BB 수용체에 대한 결합에 대해 ELISA로 클론을 테스트했다. 포지티브 클론을 확장시켰고, 예치했다.
항체의 정제
항체 함유 배양 상청액을 여과하였고, 2 단계 크로마토그래피로 정제하였다. PBS(1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl), pH 7.4로 평형화시킨 HiTrap MabSelectSuRe(GE Healthcare)를 사용하여, 친화성 크로마토그래피에 의해 이들 항체를 포획하였다. 결합되지 않은 단백질들은 평형 완충액으로 세척하여 제거하였고, 상기 항체는 50mM 시트레이트 완충액(pH 2.8)으로 회수하였고, 용출 직후 1M Tris-염기(pH 9.0)로 pH 6.0으로 중화시켰다. Superdex 200TM(GE Healthcare)의 크기 배제 크로마토그래피를 두 번째 정제 단계로 사용했다. 크기 배제 크로마토그래피는 20mM의 히스티딘 완충액, 0.14M NaCl, pH 6.0에서 수행되었다. 상기 체 함유 용액을 Biomax-SK 막(Millipore, Billerica, MA)이 장착된 Ultrafree-CL 원심 필터 유닛으로 농축하였고, -80℃에서 보관하였다.
실시예 5
표적화된 통합을 위한 플라스미드 생성
2개의 플라스미드 항체 구조체를 구축하기 위해, 각각의 구조 유전자를 L3 서열 및 LoxFas 서열을 함유하는 전면 벡터 백본과 LoxFas 서열 및 2L 서열 및 pac 선별가능한 마커를 함유하는 후면 벡터에 클로닝하였다. Cre 재조합효소 플라스미드 (예를 들면, Wong, E.T., et al., Nucl. Acids Res. 33 (2005) e147; O'Gorman, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 14602-14607 참고)를 모든 RMCE 공정에 이용하였다. 본원에 참고자료에 전문이 통합된 WO 2019/126634 참고.
각각의 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA는 유전자 합성(Geneart, Life Technologies Inc.)에 의해 생성되었다. 유전자 합성 및 백본-벡터를 37℃에서 1시간 동안 HindIII-HF 및 EcoRI-HF(NEB)로 절단시켰고, 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 삽입용 DNA-단편 및 백본의 DNA 단편을 아가로스 겔에서 잘라내어 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)로 추출했다. 정제된 삽입부 및 백본 단편은 제조업체의 프로토콜에 따라 인서트/백본 비율이 3:1인 Rapid Ligation Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 통해 결찰되었다. 결찰 접근법은 42℃에서 30초 동안 열 충격을 통해 기능성 대장균(E.coli) DH5α에서 형질전환되었고, 1시간 동안 37℃에서 항온처리 후, 선별용 암피실린과 함께 한천 플레이트에 도말시켰다. 플레이트를 37℃에서 밤새 항온처리했다.
다음 날, 클론을 선택하고 Mini 또는 Maxi-Preparation을 위해 진탕하면서 37℃에서 밤새 항온처리했고, 이는 각각 EpMotion® 5075(Eppendorf) 또는 QIAprep Spin Mini-Prep Kit(Qiagen)/NucleoBond Xtra Maxi EF Kit(Macherey & Nagel)로 수행되었다. 바람직하지 않은 임의의 돌연변이가 없는 지 여부를 확인하기 위해, 모든 구조체를 시퀀싱했다.
2차 클로닝 단계에서, 이전에 클로닝된 벡터를 1차 클로닝과 동일한 조건으로 KpnI-HF/SalI-HF 및 SalI-HF/MfeI-HF로 절단하였다. TI 백본 벡터는 KpnI-HF 및 MfeI-HF로 절단되었다. 분리 및 추출은 상기와 같이 수행하였다. 정제된 삽입부와 백본의 결찰은 제조 프로토콜에 따라, T4 DNA 리가제(NEB)를 사용하여 삽입부/삽입부/백본 비율이 1:1:1로, 밤새 4℃에서 수행되었고, 65℃에서 10분 동안 비활성화되었다. 다음 클로닝 단계들은 위에서 설명한 대로 수행되었다.
실시예 6
표적화된 통합에 의한 안정적인 세포주 생성
TI 랜딩 부위에 GFP 발현 카세트를 포함하는 CHO-K1 TI 숙주 세포들은 전용 DMEM/F12-기반 배지에서 150rpm의 일정한 교반 속도로, 표준 가습 조건(95% rH, 37℃ 및 5% CO2) 하에서 일회용 125mL 통풍 진탕 플라스크(vented shake flasks)에서 증식되었다. 매 3-4일마다, 세포를 mL당 3x10E5개의 세포 유효 농도로, 선택 마커 1 및 선택 마커 2를 함유하는 화학적으로 특정된 배지에 씨딩했다. Cedex HiRes 세포 계수기로 배양 밀도 및 생존력을 측정했다 (F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerland).
안정적인 형질감염을 위해, 등몰량의 전면 벡터와 후면 벡터를 혼합했다. 혼합물 5μg당 1μg의 Cre 발현 플라스미드를 첨가했고, 즉, 5μg의 Cre 발현 플라스미드 또는 Cre mRNA를 전면 및 후면 벡터 혼합물 25μg에 첨가했다.
형질감염 2일 전, TI 숙주 세포를 mL당 4x10E5 세포의 밀도로 신선한 배지에 씨딩하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라, Nucleofector Kit V(Lonza, Switzerland)를 사용하여 Nucleofector 장치로 형질 감염을 수행했다. 3x10E7 세포는 총 30μg의 핵산, 즉, 30μg의 플라스미드(5μg의 Cre 플라스미드 및 25μg의 전면 벡터와 후면 벡터 혼합물)로 형질감염되었다. 형질감염 후, 세포를 선별제 없이, 30mL의 배지에 씨딩하였다.
5일차에, 씨딩 후, 이들 세포를 원심분리하였고, 퓨로마이신(선별제1) 및 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-1-베타-D-아라비노푸라노실-5-요오도)우라실 (FIAU; 선별제2)를 함유하는 80mL의 화학적으로 특정된 배지로 재조합 세포의 선별을 위한 ml 당 6x10E5개 세포의 유효 농도로 옮겼다. 이들 세포를 분할없이 이 날로부터 37℃, 150rpm, 5% CO2, 및 85% 습도에서 항온처리하였다. 이 배양물의 세포 밀도 및 생존력을 정기적으로 모니터링했다. 배양물의 생존력이 다시 증가하기 시작했을 때, 선택제 1과 선택제 2의 농도는 이전에 사용된 양의 대략 절반으로 감소시켰다. 보다 구체적으로, 이들 세포의 회수를 촉진하기 위해, 생존율이 > 40%이고, 생존 세포 밀도(VCD)가 mL당 > 0.5x10E6개 세포인 경우, 선별 압력을 감소시켰다. 따라서, 4x10E5 세포/mL를 원심분리하였고, 40 ml의 선별 배지 II(화학적 특정 배지, ½ 선택 마커 1 & 선택 마커 2)에 재-현탁했다. 이들 세포는 이전과 동일한 조건으로 항온처리되었으며, 또한 분할시키지 않았다.
선택을 시작 후 10일차에, Cre 매개된 카세트 교환의 성공 여부는 이 세포 표면에 결합된 세포내 GFP 및 세포외 이종성 융합 폴리펩티드의 발현을 측정하는 유동 세포측정법에 의해 확인되었다. 인간 항체 경쇄 및 중쇄에 대한 APC 항체(알로피코시아닌-라벨링된 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG)를 FACS 착색에 사용하였다. 유세포 분석은 BD FACS Canto II 유세포 분석기(BD, Heidelberg, Germany)로 수행되었다. 샘플당 10,000개의 이벤트가 측정되었다. 살아있는 세포는 측면 산란(SSC)에 대한 전방 산란(FSC) 플롯에서 게이팅되었다. 살아있는 세포 게이트는 형질감염되지 않은 TI 숙주 세포로 정의되었고, FlowJo 7.6.5 EN 소프트웨어(TreeStar, Olten, Switzerland)를 사용하여 모든 샘플에 적용되었다. GFP의 형광은 FITC 채널(488nm에서 여기(excitation), 530nm에서 검출)에서 정량화되었다. 이종성 융합 폴리펩티드는 APC 채널(645nm에서 여기(excitation), 660nm에서 검출)에서 측정되었다. 부모계 CHO 세포, 즉, TI 숙주 세포의 생성에 사용된 세포들을 GFP 및 융합 폴리펩티드 발현에 대한 음성 대조군으로 사용하였다. 선별이 시작된 후 14일차 시점에, 생존율은 90%를 초과했고, 선별이 완료된 것으로 간주되었다.
실시예 7
FACS 스크리닝
형질감염 효율 및 형질감염의 RMCE 효율을 확인하기 위해, FACS 분석을 수행하였다. 형질감염된 접근법의 4x10E5 세포를 원심분리(1200rpm, 4분)하였고, 1mL PBS로 2회 세척하였다. PBS로 세척 단계 후, 펠릿을 400 μL PBS에 재현탁하였고, FACS 튜브(셀 스트레이너(strainer) 캡이 있는 Falcon ® 둥근 바닥 튜브; Corning)로 옮겼다. 측정은 FACS Canto II로 수행되었으며, 데이터는 소프트웨어 FlowJo로 분석되었다.
실시예 8
유가식(Fed-batch) 배양
화학적으로 특정된 전용 배지를 사용하여, 진탕 플라스크 또는 Ambr15 용기(Sartorius Stedim)에서 유가식 생산 배양을 수행했다. 세포를 0일 차에 1x10E6 세포/mL로 씨딩하였다. 배양물은 3일, 7일 및 10일에 전용 피드 배지를 받았다. 생존 세포 계수(VCC) 및 배양 중 세포의 생존율 백분율을 Cedex HiRes 기기(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 사용하여 0, 3, 7, 10 및 14일차에 측정했다. 포도당, 젖산염 및 산물 역가 농도는 Cobas Analyzer(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 사용하여, 3, 5, 7, 10, 12 및 14일차에 측정되었다. 상청액은 원심분리(10분, 1,000rpm 및 10분, 4,000rpm)에 의해 유가 배양 시작 후 14일 차에 수확하였고, 여과(0.22μm)에 의해 제거하였다. 14일차 역가는 UV 검출과 함께 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 측정되었다. 산물의 품질은 Caliper의 Labchip(Caliper Life Sciences)에서 결정했다.
실시예 9
융합 폴리펩티드 정량화
항-인간 IgG 샌드위치 ELISA로 배양 배지의 역가를 측정하였다. 간략하게 설명하자면, 상기 융합 폴리펩티드는 MaxiSorp 미량적정 플레이트 (NuncTM, Sigma-Aldrich)에 결합된 항-인간 Fc 항체로 세포 배양 유체로부터 포획되었고, 포획 항체와 상이한 에피토프에 결합하는 항-인간 Fc 항체-POD 콘쥬게이트로 검출되었다. 이차 항체는 BM 화학발광 ELISA 기질(POD)(Sigma-Aldrich)를 사용하는 화학발광에 의해 정량화되었다.
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Hoffmann-La Roche AG Genentech Inc. <120> Method for the expression of an antibody-multimer-fusion <130> P36273-WO <140> PCT/EP2021/070471 <141> 2021-07-22 <150> US 63/056468 <151> 2020-07-24 <160> 140 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp 1 5 10 15 Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu 20 25 30 Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val 35 40 45 Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val 50 55 60 Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg 65 70 75 80 Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His 85 90 95 Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr 100 105 110 Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly 115 120 125 Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val 130 135 140 His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala 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ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa 1140 ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga 1200 ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg cggattcccc gtgccaagag 1260 tgacgtaagt accgcctata gagtctatag gcccaccccc ttggcttctt atgcatgcta 1320 tactgttttt ggcttggggt ctatacaccc ccgcttcctc atgttatagg tgatggtata 1380 gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctcccctatt ggtgacgata 1440 ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac tctctttatt ggctatatgc 1500 caatacactg tccttcagag actgacacgg actctgtatt tttacaggat ggggtctcat 1560 ttattattta caaattcaca tatacaacac caccgtcccc agtgcccgca gtttttatta 1620 aacataacgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt tccggacatg ggctcttctc 1680 cggtagcggc ggagcttcta catccgagcc ctgctcccat gcctccagcg actcatggtc 1740 gctcggcagc tccttgctcc taacagtgga ggccagactt aggcacagca cgatgcccac 1800 caccaccagt gtgccgcaca aggccgtggc ggtagggtat gtgtctgaaa atgagctcgg 1860 ggagcgggct tgcaccgctg acgcatttgg aagacttaag gcagcggcag aagaagatgc 1920 aggcagctga gttgttgtgt tctgataaga gtcagaggta actcccgttg cggtgctgtt 1980 aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg ccaccagaca 2040 taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca gtcaccgtcc 2100 ttgacacggt ttaaacgccg ccacc 2125 <210> 136 <211> 129 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 136 aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60 aataaagcat ttttttcacc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta 120 tcatgtctg 129 <210> 137 <211> 225 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 137 ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60 tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120 tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180 gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225 <210> 138 <211> 73 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 138 caggataata tatggtaggg ttcatagcca gagtaacctt tttttttaat ttttatttta 60 ttttattttt gag 73 <210> 139 <211> 288 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 139 agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 60 tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 120 ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 180 aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 240 gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc cattttcg 288 <210> 140 <211> 798 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> green fluorescent protein encoding nucleic acid <400> 140 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720 ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tctgcagtcg acggtaccgc gggcccggga 780 tccaccggat ctagatga 798 SHEET INCORPORATED BY REFERENCE (RULE 20.6)

Claims (67)

  1. (a) 항체 중쇄와 항체 경쇄, 및
    (b) N-말단에서 C-말단 방향으로, 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 제1 부분, 항체 중쇄 CH1 도메인 또는 항체 경쇄 불변 도메인, 항체 힌지 영역, 항체 중쇄 CH2 도메인 및 항체 중쇄 CH3 도메인을 포함하는 제1 융합 폴리펩티드, 및 N-말단에서 C-말단 방향으로, 상기 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 제2 부분, 및 상기 제1 폴리펩티드가 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 경우, 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하거나, 또는 상기 제1 폴리펩티드가 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경우, 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 제2 융합 폴리펩티드
    를 포함하는 항체-다량체-융합 폴리펩티드의 제조 방법으로서,
    이때
    (i) (a)의 항체 중쇄와 (b)의 제1 융합 폴리펩티드, (ii) (a)의 항체 중쇄와 (a)의 항체 경쇄, 및 (iii) (b)의 제1 융합 폴리펩티드와 (b)의 제2 융합 폴리펩티드는 각각 서로 독립적으로 적어도 하나의 이황화 결합에 의해 서로에 대해 공유적으로 연계되며,
    이때
    상기 항체 중쇄와 항체 경쇄의 가변 도메인들은 결합 부위 항원에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고,
    상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드는 상기 항체 중쇄, 상기 항체 경쇄, 상기 제1 융합 폴리펩티드 및 상기 제2 융합 폴리펩티드에 대한 화학양론적 비율이 1:1:2:1인 발현 카세트로 (부모계) 포유류 세포를 형질감염시켜 확득된 재조합 포유류 세포에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드는 일시적으로 발현되거나, 또는 안정적으로 발현되는, 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 세포는 CHO 세포, 선호적으로는 CHO-K1, 또는 HEK 세포인, 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질감염은 4개 벡터에 의한 형질감염이며, 이에 의해 각 벡터는 상기 발현 카세트 중 정확하게 하나의 발현 카세트를 포함하는, 방법.
  5. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질감염은 3개 벡터에 의한 형질감염이며, 이에 의해 2개 벡터는 상기 발현 카세트 중 정확하게 2개 발현 카세트를 포함하며, 한 개 벡터는 상기 발현 카세트 중 정확하게 하나의 발현 카세트를 포함하는, 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 형질감염은 3개 벡터에 의한 형질감염이며, 이에 의해 상기 제1 벡터는 상기 항체 중쇄 및 항체 경쇄용 발현 카세트를 포함하며, 상기 제2 발현 벡터는 상기 제1 융합 폴리펩티드 및 제2 융합 폴리펩티드용 발현 카세트를 포함하고, 상기 제3 벡터는 상기 제1 융합 폴리펩티드용 한 개 발현 카세트를 포함하는, 방법.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로 연결된 TNF 리간드 패밀리 구성원의 2개 엑토도메인 또는 이의 단편을 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 제1 부분으로 포함하고, 상기 제2 융합 폴리펩티드는 전술한 TNF 리간드 패밀리 구성원의 오로지 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편을 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 제2 부분으로 포함하거나, 또는 이의 역을 포함하는, 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    (a) 상기 제1 융합 폴리펩티드는 상기 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 제1 부분으로써, TNF 리간드 패밀리 구성원의 제1 엑토도메인 또는 이의 단편, 스페이서 도메인 및 전술한 TNF 리간드 패밀리 구성원의 제2 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 이때
    - 상기 스페이서 도메인은 적어도 25개 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드이며,
    - 상기 TNF 리간드 패밀리 구성원의 제1 엑토도메인 또는 이의 단편은 직접적으로 또는 제1 펩티드 링커를 통하여 상기 스페이서 도메인의 N-말단에 융합되며,
    - 상기 전술한 TNF 리간드 패밀리 구성원의 제2 엑토도메인 또는 이의 단편은 직접적으로 또는 제2 펩티드 링커를 통하여 상기 스페이서 도메인의 C-말단에 융합되며,
    (b) 상기 제2 융합 폴리펩티드는 상기 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 제2 부분으로써 전술한 TNF 리간드 패밀리 구성원의 제3 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는데, 이는 직접적으로 또는 제3 펩티드 링커를 통하여
    - 상기 제1 융합 폴리펩티드 내 전술한 TNF 리간드 패밀리 구성원의 제2 엑토도메인의 C-말단에 융합되거나, 또는 상기 제2 융합 폴리펩티드 내 상기 스페이서 도메인의 C-말단에 융합되거나, 또는
    - 상기 항원 결합 도메인의 제2 부분이 상기 제2 융합 단백질의 스페이서 도메인의 C-말단에 융합된 경우라면, 상기 제1 융합 폴리펩티드 내 전술한 TNF 리간드 패밀리 구성원의 제2 엑토도메인의 C-말단에 융합되는, 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 융합 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 제1 부분, 항체 경쇄 불변 도메인, 항체 힌지 영역, 항체 중쇄 CH2 도메인 및 항체 중쇄 CH3 도메인을 포함하고,
    제2 융합 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 상기 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 제2 부분 및 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는, 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 융합 폴리펩티드는 노브(knob) 돌연변이를 포함하고,
    상기 항체 중쇄는 홀(hole) 돌연변이들을 포함하는, 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, (a)의 항체 중쇄 및 (b)의 제1 융합 폴리펩티드는 Fc-영역을 형성하는, 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, (a)의 항체 중쇄 및 (b)의 제1 융합 폴리펩티드는 IgG1 Fc-영역 또는 IgG4 Fc-영역을 형성하는, 방법.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc-영역은 위치 234와 위치 235 및/또는 위치 329 (Kabat EU 번호매김)에서 아미노산 치환을 더 포함하는 IgG1 Fc-영역인, 방법.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc-영역은 아미노산 치환 L234A, L235A 및/또는 P329G (Kabat EU 번호매김)을 더 포함하는 IgG1 Fc-영역인, 방법.
  15. 청구항 7 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 폴리펩티드 내 TNF 리간드 패밀리 구성원의 2개 엑토도메인 또는 이의 단편들은 제1 펩티드 링커에 의해 각각 서로 연결되며, 이의 C-말단에서 제2 펩티드 링커에 의해 CH1 도메인에 융합되며, 상기 제2 융합 폴리펩티드 내 전술한 TNF 리간드 패밀리 구성원의 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편은 이의 C-말단에서 제3 펩티드 링커에 의해 상기 항체 경쇄 불변 도메인에 융합되는, 방법.
  16. 청구항 7 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 폴리펩티드 내 TNF 리간드 패밀리 구성원의 2개 엑토도메인 또는 이의 단편들은 제1 펩티드 링커에 의해 각각 서로 연결되며, 이의 C-말단에서 제2 펩티드 링커에 의해 경쇄 불변 도메인에 융합되며, 상기 제2 융합 폴리펩티드 내 전술한 TNF 리간드 패밀리 구성원의 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편은 이의 C-말단에서 제3 펩티드 링커에 의해 상기 항체 중쇄 CH1 도메인에 융합되는, 방법.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 부분에 인접한 CL 도메인 내 위치 123 (Kabat EU 번호매김)의 아미노산은 아르기닌 (R)으로 대체되었으며, 위치 124 (Kabat EU 번호매김)의 아미노산은 리신 (K)으로 치환되었으며, 이때 상기 비-항체 다량체성 폴리펩티드의 부분에 인접한 CH1 도메인 내 위치 147 (Kabat EU 번호매김)의 아미노산 및 위치 213 (Kabat EU 번호매김)의 아미노산은 글루탐산 (E)으로 치환되었던, 방법.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄의 가변 도메인들은 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하는, 방법.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄의 가변 도메인들과 항체 경쇄는 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 흑색종-연합된 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 암-배아 항원 (CEA), CD19, CD20 및 CD33로 구성된 군에서 선택된 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하는, 방법.
  20. 청구항 7 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNF 리간드 패밀리 구성원은 인간 T-세포 활성화를 공동-자극시키는, 방법.
  21. 청구항 7 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNF 리간드 패밀리 구성원은 4-1-BBL 및 OX40L로부터 선택되는, 방법.
  22. 청구항 7 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNF 리간드 패밀리 구성원은 4-1-BBL인, 방법.
  23. 청구항 7 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, TNF 리간드 패밀리 구성원의 엑토도메인은 서열 식별 번호: 01, 서열 식별 번호: 02, 서열 식별 번호: 03, 서열 식별 번호: 04, 서열 식별 번호: 56, 서열 식별 번호: 100, 서열 식별 번호: 101 및 서열 식별 번호: 102로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  24. 청구항 7 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, TNF 리간드 패밀리 구성원의 엑토도메인은 서열 식별 번호: 01 또는 서열 식별 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  25. 청구항 1 내지 24 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄는 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 결합 부위를 형성하고,
    (b) 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 05, 서열 식별 번호: 57, 서열 식별 번호: 58 및 서열 식별 번호: 59로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 01, 서열 식별 번호: 56, 서열 식별 번호: 03 및 서열 식별 번호: 04로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  26. 청구항 7 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNF 리간드 패밀리 구성원은 OX40L인, 방법.
  27. 청구항 7 내지 21 및 26 중 어느 한 항에 있어서, TNF 리간드 패밀리 구성원의 엑토도메인은 서열 식별 번호: 43 또는 서열 식별 번호: 44의 아미노산 서열, 구체적으로 서열 식별 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  28. 청구항 7 내지 21 및 26 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-다량체-융합체는 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 표적 세포 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 적어도 하나의 모이어티, 및
    (b) 상기 제1 융합 폴리펩티드 및 제2 융합 폴리펩티드는 이황화 결합에 의해 서로 연계되며, 이때 상기 항원 결합 분자는 상기 제1 융합 폴리펩티드가 서열 식별 번호: 99 또는 서열 식별 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 융합 폴리펩티드가 서열 식별 번호: 43 또는 서열 식별 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
  29. 청구항 1 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원은 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP)인, 방법.
  30. 청구항 1 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄의 가변 도메인들은 FAP에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고, (i) 서열 식별 번호: 06 또는 서열 식별 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 식별 번호: 07 또는 서열 식별 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열 식별 번호: 08 또는 서열 식별 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열 식별 번호: 09 또는 서열 식별 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 식별 번호: 10 또는 서열 식별 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열 식별 번호: 11 또는 서열 식별 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 방법.
  31. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄의 가변 도메인들은 FAP에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고, 서열 식별 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열 식별 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인, 또는 서열 식별 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열 식별 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하고, 또는 이때 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  32. 청구항 1 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, (i) 상기 항체 중쇄는 서열 식별 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 상기 항체 경쇄는 서열 식별 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나, 또는 상기 항체 중쇄는 서열 식별 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 상기 항체 경쇄는 서열 식별 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, (ii) 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 13, 서열 식별 번호: 68, 서열 식별 번호: 71 및 서열 식별 번호: 73으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 14, 서열 식별 번호: 69, 서열 식별 번호: 70, 서열 식별 번호: 72 및 서열 식별 번호: 74로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  33. 청구항 1 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, (i) 상기 항체 중쇄는 서열 식별 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 상기 항체 경쇄는 서열 식별 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나, 또는 상기 항체 중쇄는 서열 식별 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 상기 항체 경쇄는 서열 식별 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, (ii) 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 75, 서열 식별 번호: 77, 서열 식별 번호: 79 및 서열 식별 번호: 82로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 76, 서열 식별 번호: 78, 서열 식별 번호: 80 및 서열 식별 번호: 83로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  34. 청구항 1 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄는 (인간) 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP)에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고, 상기 항체 중쇄는 서열 식별 번호: 141의 아미노산 서열을 보유하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 142의 아미노산 서열을 보유하고, 이때 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  35. 청구항 1 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원은 CEA인, 방법.
  36. 청구항 1 내지 28 및 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄의 가변 도메인들은 CEA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고, (i) 서열 식별 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 식별 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열 식별 번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열 식별 번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 식별 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열 식별 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 방법.
  37. 청구항 1 내지 28 및 35 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄의 가변 도메인들은 CEA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고, 서열 식별 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인과 서열 식별 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하는, 방법.
  38. 청구항 1 내지 28 및 35 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 항체-다량체-융합체는 다음을 포함하는, 방법:
    (i) 서열 식별 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄, 및 서열 식별 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 중쇄,
    (ii) 서열 식별 번호: 13, 서열 식별 번호: 68, 서열 식별 번호: 71 및 서열 식별 번호: 73로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제1 융합 폴리펩티드, 및
    (iii) 서열 식별 번호: 14, 서열 식별 번호: 69, 서열 식별 번호: 70, 서열 식별 번호: 72 및 서열 식별 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 제2 융합 폴리펩티드.
  39. 청구항 1 내지 28 및 35 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 항체-다량체-융합체는 다음을 포함하는, 방법:
    (i) 서열 식별 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄, 및 서열 식별 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 중쇄,
    (ii) 서열 식별 번호: 75, 서열 식별 번호: 77, 서열 식별 번호: 79 및 서열 식별 번호: 82로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제1 융합 폴리펩티드, 및
    (iii) 서열 식별 번호: 76, 서열 식별 번호: 78, 서열 식별 번호: 80 및 서열 식별 번호: 83로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제2 융합 폴리펩티드.
  40. 청구항 1 내지 28 및 35 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 항체-다량체-융합체는 다음을 포함하는, 방법:
    (i) 서열 식별 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 식별 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열 식별 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는
    (ii) 서열 식별 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 식별 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열 식별 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄.
  41. 청구항 1 내지 28 및 35 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄는 (인간) CEA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고, 상기 항체 중쇄는 서열 식별 번호: 143의 아미노산 서열을 보유하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 92의 아미노산 서열을 보유하고, 이때 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  42. 청구항 1 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원은 CD19인, 방법.
  43. 청구항 1 내지 28 및 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄의 가변 도메인들은 CD19에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고, (i) 서열 식별 번호: 104 또는 서열 식별 번호: 105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 식별 번호: 106 또는 서열 식별 번호: 107의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열 식별 번호: 108 또는 서열 식별 번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열 식별 번호: 110 또는 서열 식별 번호: 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 식별 번호: 112 또는 서열 식별 번호: 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열 식별 번호: 114 또는 서열 식별 번호: 115의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 방법.
  44. 청구항 1 내지 28 및 42 내지 43 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄의 가변 도메인들은 CD19에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고, 서열 식별 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열 식별 번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하고, 또는 서열 식별 번호: 118의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열 식별 번호: 119의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하는, 방법.
  45. 청구항 1 내지 28 및 42 내지 44 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 중쇄는 서열 식별 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나, 또는 상기 중쇄는 서열 식별 번호: 118의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 119의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나, 또는
    (ii) 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 13, 서열 식별 번호: 68, 서열 식별 번호: 71 및 서열 식별 번호: 73로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
    (iii) 상기 제2 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 14, 서열 식별 번호: 69, 서열 식별 번호: 70, 서열 식별 번호: 72 및 서열 식별 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  46. 청구항 1 내지 28 및 42 내지 45 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 중쇄는 서열 식별 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나, 또는 상기 중쇄는 서열 식별 번호: 118의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 119의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고,
    (ii) 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 75, 서열 식별 번호: 77, 서열 식별 번호: 79 및 서열 식별 번호: 82로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
    (iii) 상기 제2 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 76, 서열 식별 번호: 78, 서열 식별 번호: 80 및 서열 식별 번호: 83로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  47. 청구항 1 내지 28 및 42 내지 45 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 중쇄는 서열 식별 번호: 120의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 121의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 122의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
    (ii) 상기 중쇄는 서열 식별 번호: 123 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 124의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 122의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
    (iii) 상기 중쇄는 서열 식별 번호: 125 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 126의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 127의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
    (iv) 상기 중쇄는 서열 식별 번호: 128 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 129의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 127의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  48. 청구항 1 내지 28 및 42 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄와 항체 경쇄는 (인간) CD19에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 형성하고, 상기 항체 중쇄는 서열 식별 번호: 144의 아미노산 서열을 보유하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 127의 아미노산 서열을 보유하고, 이때 상기 제1 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 융합 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  49. 청구항 1 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (부모계) 포유류 세포의 형질감염은 표적 통합 형질 감염인, 방법.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 표적화된 통합 형질 감염은 이중 재조합효소 매개된 카세트 교환인, 방법.
  51. 청구항 49 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (부모계) 포유류 세포는 이의 게놈 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 랜딩 부위(landing site)를 갖는 CHO 세포인, 방법.
  52. 청구항 51에 있어서, 상기 랜딩 부위는 제1 선별 마커와 제2 선별 마커를 포함하며, 이의 측면에 2개의 RRS들이 있으며, 이때 상기 제1 선별 마커는 상기 제2 선별 마커와는 상이한, 방법.
  53. 청구항 52에 있어서, 상기 제1 선별 마커는 글루타민 합성효소 선별 마커이며, 상기 제2 선별 마커는 GFP 형광 단백질인, 방법.
  54. 청구항 52에 있어서, 상기 통합된 랜딩 부위는 티미딘 키나제 선별 마커 및 HYG 선별 마커를 포함하는, 방법.
  55. 청구항 52 내지 54 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선별 마커 양쪽에 측면에 있는 2개의 RRS들은 상이한, 방법.
  56. 청구항 51 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 랜딩 부위는 Cre 재조합효소 매개된 DNA 재조합을 위한 3개의 이형특이적 loxP 부위들을 포함하는, 방법.
  57. 청구항 56에 있어서, 상기 이형특이적 loxP 부위들은 L3, LoxFas 및 2L인, 방법.
  58. 청구항 57에 있어서, 상기 L3 및 2L는 각각 5'-단부 및 3'-단부의 랜딩 부위 측면 배치되며, LoxFas는 상기 L3 부위와 2L 부위 사이에 위치한, 방법.
  59. 청구항 51 내지 58 중 어느 한 항에 있어서, 상기 랜딩 부위는 IRES를 통하여 GFP 형광 단백질의 발현에 연계된 선별 마커의 발현에 연계된 바이시스트로닉 단위를 더 함유하는, 방법.
  60. 청구항 1 내지 57 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드는 5'-에서 3'-방향으로 다음을 포함하는 상기 세포의 게놈 내 통합된 데옥시리보핵산으로부터 발현되는, 방법:
    - 상기 제1 융합 폴리펩티드를 인코드하는 제1 발현 카세트,
    - 상기 제1 융합 폴리펩티드를 인코드하는 제2 발현 카세트,
    - 상기 제2 융합 폴리펩티드를 인코드하는 제3 발현 카세트,
    - 상기 항체 중쇄를 인코딩하는 제4 발현 카세트, 및
    - 상기 항체 경쇄를 인코딩하는 제5 발현 카세트.
  61. 청구항 1 내지 60 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 단일 부위 또는 유전자좌에서 상기 포유류 세포의 게놈으로 안정적으로 통합된, 방법.
  62. 청구항 60 내지 61 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 다음을 더 포함하는, 방법:
    - 상기 제1 발현 카세트에 대해 5' (가장 5')에 위치한 제1 재조합 인지 서열,
    - 상기 제5 발현 카세트의 3' (가장 3') 에 위치한 제2 재조합 인지 서열, 및
    - 아래에 위치한 제3 재조합 인지 서열,
    - 상기 제1 재조합 인자와 상기 제2 재조합 인지 서열 사이, 및
    - 상기 제3 발현 카세트와 제4 발현 카세트 사이,
    이때 모든 재조합 인지 서열들은 상이하다.
  63. 청구항 60 내지 62 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드를 인코딩하는 데옥시리보핵산은 선별 마커를 인코딩하는 추가 발현 카세트를 더 포함하는, 방법.
  64. 청구항 63에 있어서, 상기 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트는 상기 제3 재조합 인지 서열에 대해 다음 중 하나에 위치하는, 방법:
    i) 5'에, 또는
    ii) 3'에, 또는
    iii) 일부는 5'에, 및 일부는 3'에.
  65. 청구항 63 내지 64 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트는 상기 제3 재조합 인지 서열에 대해 일부는 5'에 위치하며, 일부는 3'에 위치하며, 이때 전술한 발현 카세트의 5'-위치한 부분은 프로모터 및 시작-코돈을 포함하고, 전술한 발현 카세트의 3'-위치한 부분은 시작-코돈없는 상기 코딩 서열 및 polyA 신호를 포함하는, 방법.
  66. 청구항 60 내지 65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-다량체-융합 폴리펩티드를 인코딩하는 데옥시리보핵산는 선별 마커를 인코딩하는 추가 발현 카세트를 포함하고, 상기 선별 마커를 인코딩하는 발현 카세트는 상기 제3 재조합 인지 서열에 대해 일부는 5'에 위치하고, 일부는 3'에 위치하고, 이때 전술한 발현 카세트의 5'-위치한 부분은 프로모터 및 시작-코돈을 포함하고, 전술한 발현 카세트의 3'-위치한 부분은 시작-코돈없는 상기 코딩 서열 및 polyA 신호를 포함하고, 이때 상기 시작-코돈은 상기 코딩 서열에 작동가능하도록 연계된, 방법.
  67. 청구항 65 내지 66 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시작-코돈은 ATG인, 방법.
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