KR20220010019A - 정의된 조직에서 다중 발현 카세트의 표적화된 통합에 의해 2가 이중특이성 항체 발현 세포를 생성하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본원에서는 2가 이중특이성 항체를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 단계, 및 상기 세포 또는 배양 배지로부터 상기 2가 이중특이성 항체를 회수하는 단계를 포함하며, 상기 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산은 포유동물 세포의 유전체 내로 안정적으로 통합되고, 5'에서 3' 방향으로 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트, 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트, 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트, 또는 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트, 제2 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트, 제2 경쇄를 부화화하는 제3 발현 카세트, 및 제1 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트 중 어느 하나를 포함하고, 상기 제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 상기 제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로 제1 경쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 상기 제1 경쇄는 N-말단에서 C-말단으로 제2 중쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고, 및
상기 제2 경쇄는 N-말단에서 C-말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하며, 상기 제1 중쇄 가변 도메인 및 상기 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고, 상기 제2 중쇄 가변 도메인 및 상기 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성하는, 방법이 보고된다.
상기 제2 경쇄는 N-말단에서 C-말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하며, 상기 제1 중쇄 가변 도메인 및 상기 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고, 상기 제2 중쇄 가변 도메인 및 상기 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성하는, 방법이 보고된다.
Description
본 발명은 세포주 생성 및 폴리펩티드 생성 분야에 속한다. 보다 정확하게는, 이중 재조합효소 매개 카세트 교환 반응에 의해 수득되어 특정 발현 카세트 서열이 포유동물 세포의 유전체 내로 통합되도록 하는 재조합 포유동물 세포가 본원에 보고된다. 상기 세포는 2가 이중특이성 항체의 생성 방법에 사용될 수 있다.
분비 및 당화 단백질, 예컨대 항체와 같은 것은 일반적으로 진핵 세포에서 재조합 발현에 의해 안정적 또는 일시적 발현으로서 생성된다.
관심의 외인성 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포를 생성하기 위한 한 전략은 관심의 폴리펩티드를 부호화하는 뉴클레오티드 서열의 무작위 통합에 이어 선택 및 단리 단계를 수반한다. 하지만, 상기 접근법은 몇 가지 단점이 있다. 첫째, 이처럼 세포의 유전체 내부로 뉴클레오티드 서열을 기능적으로 통합하는 것은 드물게 발생할 뿐만 아니라, 뉴클레오티드 서열이 통합되는 위치에 대한 무작위성을 감안할 때 상기 희귀한 사건은 다양한 유전자 발현 및 세포 성장 표현형을 유발한다. "위치 효과 변이"로 공지된 상기 변이는 적어도 부분적으로 진핵 세포 유전체 내에 존재하는 복잡한 유전자 조절 네트워크, 및 통합과 유전자 발현을 위한 특정 유전체 유전자좌의 접근성으로부터 비롯된다. 둘째, 일반적으로 무작위 통합 전략은 세포의 유전체 내로 통합된 뉴클레오티드 서열 복제의 수를 제어하지 않는다. 실제로, 유전자 증폭 방법은 높은 생산성의 세포를 수득하기 위해 종종 사용된다. 하지만, 상기 유전자 증폭은 불안정한 세포 성장 및/또는 생성물 발현과 같은 원치 않는 세포 표현형을 야기할 수도 있다. 셋째, 무작위 통합 과정에 내재된 통합 유전자좌의 이질성으로 인해, 형질감염(transfection) 후 수천 개의 세포들을 선별검사하여 관심 폴리펩티드의 바람직한 발현 수준을 나타내는 재조합 세포들을 단리하는 것은 시간 소모적이고 노동 집약적이다. 상기 세포들을 단리한 후에도 관심 폴리펩티드의 안정적인 발현이 보장되는 것이 아니며, 안정적인 상업적 생성 세포를 수득하기 위해 추가적인 선별검사가 필요할 수 있다. 넷째, 무작위 통합으로 수득한 세포들로부터 생성된 폴리펩티드는 높은 수준의 서열 변이를 나타내는데, 이는 부분적으로 높은 수준의 폴리펩티드 발현을 선택하는데 사용되는 선택제의 돌연변이 유발성 때문일 수 있다. 마지막으로, 생성될 폴리펩티드의 복잡성이 높을수록, 즉 세포 내부에서 관심 폴리펩티드를 형성하는 데 필요한 상이한 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 사슬의 수가 많을수록, 서로 상이한 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 사슬의 발현 비율을 제어하는 것이 더 중요해진다. 발현 비율의 제어는 관심 폴리펩티드의 높은 발현 수율에서 효율적인 발현, 정확한 조립 및 성공적인 분비를 가능하게 하는 데 필요하다.
재조합효소 매개 카세트 교환(RMCE)에 의한 표적된 통합은 외래 DNA를 진핵 숙주 유전체 내 소정의 부위로 특이적이고 효율적으로 지향시키는 방법이다(Turan et al., J. Mol. Biol. 407 (2011) 193-221).
WO 2006/007850은 항 레수스 D 재조합 다중클론 항체 및 개별 숙주 세포의 유전체 내로의 부위 특이적 통합을 이용한 제조 방법을 개시한다.
Crawford, Y., et al. (Biotechnol. Prog. 29 (2013) 1307-1315)는 조합된 phiC31 인테그라아제 및 CRE-Lox 기술을 사용하여 제한된 유전체 선별검사로부터의 표적 세포주 개발을 위하여 신뢰할 만한 숙주를 빠르게 식별하는 것을 보고하였다.
WO 2013/006142는 공여자 카세트를 이의 유전체 내에 안정적으로 통합한 유전자 변형 진핵 세포의 거의 균질한 군이 표적화 핵산 부위 및 선택 표지자 단백질 부호화 서열을 포함하는 단리된 핵산 단편에 작동가능하게 연결된 강한 폴리아데닐화 부위를 포함하며, 상기 단리된 핵산 단편은 제1 재조합 부위 및 제2 비동일 재조합 부위가 측접(flank)되는 것을 개시한다.
WO 2018/162517은 i) 발현 카세트 서열 및 ii) 상이한 발현 벡터 사이의 발현 카세트의 분포에 따라 발현 수율 및 생성물 품질의 높은 변동이 관찰되었음을 개시한다.
Tadauchi, T. 등은 항체를 발현하기 어렵게 만드는 요인을 체계적으로 조사하기 위해 조절된 표적 통합 세포주 개발 접근법을 활용하는 것을 개시한다(Biotechnol. Prog. 35 (2019) No. 2, 1-11).
Rajendra, Y. 등은 단일 쿼드 벡터가 안정한 CHO 세포주를 생성하기 위한 간단하지만 효과적인 대안적 접근법이며 임상 이종 mAb 치료제를 위한 세포주 생성을 가속화할 수 있다고 개시한다(Biotechnol. Prog. 33 (2017) 469-477).
WO 2017/184831은 진핵 세포에서 재조합 단백질의 부위 특이적 통합 및 발현, 특히 발현 강화 유전자좌를 사용함으로써 진핵 세포, 특히 중국 햄스터(Cricetulus griseus) 세포주에서 이중특이성 항체 항체를 포함하는 항체의 발현을 개선하는 방법을 개시한다고 주장한다. 상기 문서의 데이터는 익명으로 제공된 것이므로, 실제로 제시된 내용을 결론으로 받아들일 수는 없다.
본원에서는 2가 이중특이성 항체, 특히 도메인 교환을 갖는 2가 이중특이성 항체를 발현하는 재조합 포유동물 세포가 보고된다. 2가 이중특이성 항체는 상기 포유동물 세포에 의해 자연적으로 발현되지 않는 이종다량체 폴리펩티드이다. 보다 구체적으로, 2가 이중특이성 항체는 하기의 4개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 사슬로서: 전장 경쇄인 하나의 경쇄; 도메인 교환된 경쇄인 추가의 경쇄; 전장 중쇄인 하나의 중쇄; 및 도메인 교환된 중쇄인 추가의 중쇄로 구성된 이종다량체 단백질이다. 2가 이중특이성 항체의 발현을 달성하기 위해, 특이적이고 정의된 서열 내의 다수의 상이한 발현 카세트를 포함하는 재조합 핵산이 포유동물 세포의 유전체 내로 통합되었다.
본원에는 2가 이중특이성 항체을 발현하는 재조합 포유동물 세포를 생성하는 방법 및 상기 재조합 포유동물 세포를 사용하여 2가 이중특이성 항체를 생성하는 방법 또한 보고된다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 2가 이중특이성 항체는,
- N 말단에서 C 말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 제1 중쇄,
- N 말단에서 C 말단으로 제1 경쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 중쇄,
- N 말단에서 C 말단으로 제2 중쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 제1 경쇄, 및
- N 말단에서 C 말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 제2 경쇄를 포함하고,
상기 제1 중쇄 가변 도메인 및 상기 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고, 상기 제2 중쇄 가변 도메인 및 상기 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 2가 이중특이성 항체는,
- N 말단에서 C 말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 제1 중쇄,
- N 말단에서 C 말단으로 제2 중쇄 가변 도메인, CL 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 중쇄,
- N 말단에서 C 말단으로 제1 경쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 제1 경쇄, 및
- N 말단에서 C 말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 제2 경쇄를 포함하고,
상기 제1 중쇄 가변 도메인 및 상기 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고, 상기 제2 중쇄 가변 도메인 및 상기 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
본 발명은 포유동물 세포의 유전체 내로 통합됨으로써, 이종이량체 이가 이중특이성 항체, 즉 발현 카세트 조직의 발현에 필요한 상이한 발현 카세트의 서열이 2가 이중특이성 항체의 발현 수율에 영향을 미친다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
본 발명은 특이적 발현 카세트 조직을 갖는 이종다량체 2가 이중특이성 항체을 부호화하는 핵산을 포유동물 세포의 유전체 내로 통합함으로써 상기 2가 이중특이성 항체의 효율적인 재조합 발현 및 생성이 달성될 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
정의된 발현 카세트 서열은 이중 재조합 효소 매개 카세트 교환 반응에 의해 포유동물 세포의 유전체 내로 유리하게 통합될 수 있음이 밝혀졌다.
본 발명에 따른 일 양태는 2가 이중특이성 항체를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은,
a) 선택적으로 2가 이중특이성 항체의 발현에 적합한 조건하에서 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 단계, 및
b) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 2가 이중특이성 항체를 회수하는 단계를 포함하고,
2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산은 상기 포유동물 세포의 유전체 내로 안정적으로 통합되고, 5'에서 3' 방향으로,
(1)
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함하거나,
또는 (2)
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제1 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 데옥시리보핵산의 정확한 일 복제는 단일 부위 또는 유전자좌에서 포유동물 세포의 유전체 내로 안정적으로 통합된다.
본 발명의 일 양태는 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산으로서, 5'에서 3' 방향으로,
(1)
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함하거나,
또는 (2)
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제1 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함한다.
본 발명의 일 양태는 포유동물 세포에서 2가 이중특이성 항체의 발현을 위한 데옥시리보핵산의 사용으로서, 상기 데옥시리보핵산은 5'에서 3' 방향으로,
(1)
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함하거나,
또는 (2)
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제1 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함한다.
상기 사용의 일 구현예에서, 상기 데옥시리보핵산은 상기 포유동물 세포의 유전체 내로 통합된다.
일 구현예에서, 상기 데옥시리보핵산의 정확한 일 복제는 단일 부위 또는 유전자좌에서 상기 포유동물 세포의 유전체 내로 안정적으로 통합된다.
본 발명의 일 양태는 상기 세포의 유전체 내에 통합된 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산을 포함하는 재조합 포유동물 세포로서,
2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산은 5'에서 3' 방향으로,
(1)
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함하거나,
또는 (2)
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제1 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 데옥시리보핵산의 정확한 일 복제는 단일 부위 또는 유전자좌에서 포유동물 세포의 유전체 내로 안정적으로 통합된다.
모든 이전 양태들 중 일 구현예에서, 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산은,
- 상기 제1(최대 5') 발현 카세트에 대해 5'에 위치한 제1 재조합 인식 서열,
- 상기 제4(최대 3') 발현 카세트에 대해 3'에 위치한 제2 재조합 인식 서열, 및
- 제3 재조합 인식 서열로서,
- 상기 제1 및 제2 재조합 인식 서열 사이, 및
- 상기 2개의 발현 카세트 사이에 위치하는, 제3 재조합 인식 서열을 추가로 포함하고,
그리고
모든 재조합 인식 서열들은 상이하다.
일 구현예에서, 상기 제3 재조합 인식 서열은 제2 및 제3 발현 카세트 사이에 위치한다.
일 구현예에서, 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산은 선택 표지자에 대해 부호화하는 추가의 발현 카세트를 포함하고, 상기 선택 표지자에 대해 부호화하는 발현 카세트는 제3 재조합 인식 서열에 대해 부분적으로 5' 및 부분적으로 3'에 위치하며, 상기 발현 카세트의 5' 위치 부분은 프로모터 및 시작 코돈을 포함하고, 상기 발현 카세트의 3' 위치 부분은 시작 코돈 및 폴리A 신호가 없는 부호화 서열을 포함하며, 상기 시작 코돈은 부호화 서열에 작동 가능하게 연결된다.
본 발명의 일 양태는 3개의 상이한 재조합 인식 서열 및 8개의 발현 카세트를 차례로 포함하는, 2개의 데옥시리보핵산을 포함하는 조성물로서,
- 제1 데옥시리보핵산은 5'에서 3' 방향으로,
(1)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 복제를 포함하거나,
또는 (2)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 복제를 포함하고,
그리고
- 제2 데옥시리보핵산은 5'에서 3' 방향으로,
(1)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 복제,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열을 포함하거나,
또는 (2)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 복제,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제1 및 제2 데옥시리보핵산은 모두 (1)에 따른 조직을 포함하거나; 또는 상기 제1 및 제2 데옥시리보핵산 둘 모두는 (2)에 따른 조직을 포함한다.
모든 이전 양태들 중 일 구현예에서, 2가 이중특이성 항체을 부호화하는 데옥시리보핵산은 선택 표지자에 대해 부호화하는 추가의 발현 카세트를 포함한다.
일 구현예에서, 선택 표지자에 대해 부호화하는 발현 카세트는, 상기 제3 재조합 인식 서열에 대해
i) 5', 또는
ii) 3', 또는
iii) 부분적으로 5' 및 부분적으로 3'에
위치한다.
일 구현예에서, 선택 표지자에 대해 부호화하는 발현 카세트는 상기 제3 재조합 인식 서열에 대해 부분적으로 5' 및 부분적으로 3'에 위치하며, 상기 발현 카세트의 5' 위치 부분은 프로모터 및 시작 코돈을 포함하고, 상기 발현 카세트의 3' 위치 부분은 시작 코돈 및 폴리A 신호가 없는 부호화 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 선택 표지자를 부호화하는 발현 카세트의 5' 위치 부분은 시작 코돈에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고, 이로써 상기 프로모터 서열은 제2 발현 카세트에 의해 상류에 측접(즉, 하류에 위치)되고, 상기 시작 코돈은 제3 재조합 인식 서열에 의해 하류에 측접(즉, 상류에 위치)하며; 상기 선택 표지자를 부호화하는 발현 카세트의 3' 위치 부분은 시작 코돈이 결여된 선택 표지자를 부호화하는 핵산을 포함하고, 상기 제3 재조합 인식 서열에 의한 상류 및 상기 제3 발현 카세트에 의한 하류에 측접된다.
일 구현예에서, 상기 시작 코돈은 번역 시작 코돈이다. 일 구현예에서 상기 시작 코돈은 ATG이다.
본 발명의 일 양태는 상기 세포의 유전체 내에 통합된 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산을 포함하는 재조합 포유동물 세포로서,
2가 이중특이성 항체을 부호화하는 데옥시리보핵산은 하기의 요소들로서:
제1, 제2 및 제3 재조합 인식 서열,
제1 및 제2 선택 표지자, 및
제1 내지 제4 발현 카세트를 포함하고,
5'에서 3' 방향으로의 상기 요소들의 서열은,
RRS1-제1 EC-제2 EC-RRS3-SM1-제3 EC-제4 EC-RRS2이고,
여기서
RRS = 재조합 인식 서열,
EC = 발현 카세트,
SM = 선택 표지자이다.
본 발명의 일 양태는 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산을 포함하고 상기 2가 이중특이성 항체를 분비하는 재조합 포유동물 세포를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은:
a) 포유동물 세포의 유전체의 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 포유동물 세포를 제공하는 단계로서, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 표지자에 측접하는 제1 및 제2 재조합 인식 서열, 및 상기 제1 및 제2 재조합 인식 서열 사이에 위치한 제3 재조합 인식 서열을 포함하고, 모든 재조합 인식 서열은 상이한 단계;
b) 3개의 상이한 재조합 인식 서열 및 4개의 발현 카세트를 포함하는 2개의 데옥시리보핵산의 조성물을 a)에서 제공된 세포 내로 도입하는 단계로서,
- 제1 데옥시리보핵산은 5' 에서 3' 방향으로,
(1)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 복제를 포함하고,
또는 (2)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 복제를 포함하고,
그리고
- 제2 데옥시리보핵산은 5'에서 3' 방향으로,
(1)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 복제,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열을 포함하거나,
또는 (2)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 복제,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열을 포함하며,
상기 제1 및 제2 데옥시리보핵산의 제1 내지 제3 재조합 인식 서열은 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상의 제1 내지 제3 재조합 인식 서열과 일치하고,
하나의 제2 선택 표지자를 부호화하는 발현 카세트의 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 취합될 때 하나의 제2 선택 표지자의 기능적 발현 카세트를 형성하는 단계;
c) 하나 이상의 재조합 효소를,
i) b)의 제1 및 제2 데옥시리보핵산과 동시에,
또는
ii) 순차적으로 그 이후에
도입하는 단계로서,
상기 하나 이상의 재조합 효소는 상기 제1 및 제2 데옥시리보핵산의 재조합 인식 서열들을 인식하는; (그리고 선택적으로 상기 하나 이상의 재조합 효소는 재조합 효소 매개 카세트 교환을 2회를 실시하는;) 단계;
및
d) 상기 제 2 선택 표지자를 발현하고 상기 2가 이중특이성 항체를 분비하는 세포들을 선택하는 단계;를 포함함으로써,
상기 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산을 포함하고 상기 2가 이중특이성 항체를 분비하는 재조합 포유동물 세포를 생성하는 방법이다.
일 구현예에서, 상기 제1 및 제2 데옥시리보핵산은 모두 (1)에 따른 조직을 포함하거나; 또는 상기 제1 및 제2 데옥시리보핵산 둘 모두는 (2)에 따른 조직을 포함한다.
일 구현예에서, 하나의 제2 선택 표지자를 부호화하는 발현 카세트는 제3 재조합 인식 서열에 대해 부분적으로 5' 및 부분적으로 3'에 위치하며, 상기 발현 카세트의 5' 위치 부분은 프로모터 및 시작 코돈을 포함하고, 발현 카세트의 상기 3' 위치 부분은 시작 코돈 및 폴리A 신호가 없는 하나의 제2 선택 표지자의 부호화 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 하나의 제2 선택 표지자를 부호화하는 발현 카세트의 5' 말단 부분은 시작 코돈에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고, 이로써 상기 프로모터 서열은 제2 발현 카세트에 의해 상류에 측접(즉, 하류에 위치)되고, 상기 시작 코돈은 제3 재조합 인식 서열에 의해 하류에 측접(즉, 상류에 위치)하며; 하나의 제2 선택 표지자를 부호화하는 발현 카세트의 3' 말단 부분은 시작 코돈이 결여된 하나의 제2 선택 표지자의 부호화 서열을 포함하고 제3 재조합 인식 서열에 의해 상류에 측접되고, 제3 발현 카세트에 의해 하류에 측접된다.
일 구현예에서, 상기 시작 코돈은 번역 시작 코돈이다. 일 구현예에서, 상기 시작 코돈은 ATG이다.
모든 이전 양태 및 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 제1 데옥시리보핵산은 제1 벡터 내로 통합되고 상기 제2 데옥시리보핵산은 제2 벡터 내로 통합된다.
모든 이전 양태 및 구현예들 중 일 구현예에서, 발현 카세트의 각각은 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 부호화 서열, 및 폴리아데닐화 신호 서열, 및 선택적으로 후속되는 종결자 서열을 포함한다.
모든 이전 양태 및 구현예들 중 일 구현예에서,
항체 사슬에 대한 각각의 발현 카세트는 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 항체 사슬을 부호화하는 핵산, 및 폴리아데닐화 신호 서열 및 선택적으로 종결자 서열을 포함하고,
그리고
선택 표지자를 부호화하는 각각의 발현 카세트는 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 상기 선택 표지자를 부호화하는 핵산, 및 폴리아데닐화 신호 서열 및 선택적으로 종결자 서열을 포함한다.
이전의 모든 양태 및 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 프로모터는 인트론 A를 갖거나 갖지 않는 인간 CMV 프로모터이고, 상기 폴리아데닐화 신호 서열은 bGH 폴리A 부위이며, 상기 종결자 서열은 hGT 종결자이다.
종결자 서열은 RNA 중합효소 II에 의한 매우 긴 RNA 전사체의 생성, 즉 본 발명에 따른 데옥시리보핵산 내의 다음 발현 카세트 내로의 통독(read-through)을 방지하고 본 발명에 따른 방법에 사용된다. 즉, 관심적인 한 구조 유전자의 발현은 이의 자체 프로모터에 의해 제어된다.
따라서, 폴리아데닐화 신호 및 종결자 서열의 조합에 의해 효율적인 전사 종결이 달성된다. 즉, RNA 중합효소 II의 통독은 이중 종결 신호의 존재에 의해 방지된다. 상기 종결자 서열은 복잡한 분해능을 시작하고 DNA 주형으로부터 RNA 중합효소의 해리를 촉진한다.
모든 이전의 양태 및 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 프로모터는 인트론 A를 갖는 인간 CMV 프로모터이고, 상기 폴리아데닐화 신호 서열은 bGH 폴리아데닐화 신호 서열이고, 상기 종결자는 선택 표지자의 발현 카세트를 제외하고는 hGT 종결자이며, 여기서 상기 프로모터는 SV40 프로모터이고 상기 폴리아데닐화 신호 서열은 SV40 폴리아데닐화 신호 서열이며 종결자 서열은 존재하지 않는다.
모든 이전의 양태 및 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 포유동물 세포는 CHO 세포이다. 일 구현예에서, 상기 CHO 세포는 CHO-K1 세포이다.
모든 양태 및 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 2가 이중특이성 항체는 항 ANG2/VEGF 이중특이성 항체이다. 일 구현예에서, 상기 이중특이적 항 ANG2/VEGF 항체는 RG7221 또는 바누시주맙이다.
모든 양태 및 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 2가 이중특이성 항체는 항 ANG2/VEGF 이중특이성 항체이다. 일 구현예에서, 상기 이중특이적 항 ANG2/VEGF 항체는 RG7716 또는 파리시맙이다.
상기 ANG2/VEGF 이중특이성 항체는 WO 2010/040508, WO 2011/117329, WO 2014/009465에 보고되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 원용된다.
모든 양태 및 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 2가 이중특이성 항체는 항 PD1/TIM3 이중특이성 항체이다. 상기 항체는 WO 2017/055404에 보고되며, 이는 그 전체가 본원에 원용된다.
모든 양태 및 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 2가 이중특이성 항체는 항 PD1/Lag3 이중특이성 항체이다. 상기 항체는 WO 2018/185043에 보고되며, 이는 그 전체가 본원에 원용된다.
모든 이전의 양태 및 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 2가 이중특이성 항체의 제1 경쇄 및 제2 경쇄 중 어느 것도 공통 경쇄 또는 범용 경쇄가 아니다.
모든 이전의 양태 및 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 제2 중쇄 가변 도메인 및 상기 제1 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고, 상기 제1 중쇄 가변 도메인 및 상기 제2 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
모든 양태 및 구현예들 중 바람직한 일 구현예에서, 정확히 2개의 데옥시리보핵산이 포함되거나 도입된다.
본 발명에 따른 데옥시리보핵산 내의 개별 발현 카세트들은 순차적으로 배열된다. 하나의 발현 카세트의 끝과 이후 다음 발현 카세트의 시작 사이의 거리는 단디 몇 개의 뉴클레오티드에 불과하며, 이는 클로닝 절차에 필요한, 즉 이로부터 기인한 것이다.
모든 이전의 양태 및 구현예들 중 일 구현예에서, 2개의 바로 이어지는 발현 카세트는 최대 100 bps 떨어져 있다(즉, 각각 폴리 A 신호 서열 또는 종결자 서열의 끝에서 다음 프로모터 요소의 시작이 최대 100개의 염기쌍(bps)이 될 때까지). 일 구현예에서, 2개의 바로 이어지는 발현 카세트는 최대 50 bps 떨어져 있다. 바람직한 일 구현예에서, 2개의 바로 이어지는 발현 카세트는 최대 30 bps 떨어져 있다.
도 1: 2개의 독립적인 RMCE를 동시에 실시하기 위해 3개의 RRS 부위들을 사용하는 2-플라스미드 RMCE 전략의 개략도.
본 발명은 상이한 폴리펩티드를 포함하는 복합 분자, 즉 이종다량체인 2가 이중특이성 항체의 발현을 위해, 정의되고 특이적인 발현 카세트 조직의 사용은 CHO 세포와 같은 포유동물 세포에서 2가 이중특이성 항체의 효율적인 발현 및 생성을 유발한다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
본 발명은 이중의 재조합 효소 매개 카세트 교환(RMCE)이 재조합 CHO 세포와 같은 재조합 포유동물 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초하고, 정의되고 특이적인 발현 카세트 서열이 유전체 내로 통합되어, 이로 인해 결과적으로 2가 이중특이성 항체의 효율적인 발현 및 생성을 유발한다. 상기 통합은 표적화된 통합에 의한 포유동물 세포 유전체 내의 특정 부위에서 유효하다. 이로써, 이종다량체 2가 이중특이성 항체의 상이한 폴리펩티드의 서로에 대한 발현 비율을 제어하는 것이 가능해진다. 결국, 이로인해 높은 발현 수율의 정확하게 접히고 조립된 2가 이중특이성 항체에서 효율적인 발현, 올바른 조립 및 성공적인 분비가 달성된다.
I. 정의
본 발명을 실시하기 위한 유용한 방법 및 기술은, 예컨대 Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997); Glover, N.D., and Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (1985), Oxford University Press; Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture - a practical approach, IRL Press Limited (1986); Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, Second Edition, CHSL Press (1992); Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J., ed., Cell Biology, Second Edition, Academic Press (1998); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, second edition, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987)에 기재되어 있다.
재조합 DNA 기술을 사용하여 핵산 유도체를 생성할 수 있다. 상기 유도체는, 예를 들어 치환, 변경, 교환, 결실 또는 삽입에 의해 개별적 또는 여러 뉴클레오티드 위치에서 변형될 수 있다. 변형 또는 유도체화는, 예를 들어 부위 지향된 돌연변이유발에 의해 실시될 수 있다. 상기 변형은 당업계의 숙련가에 의해 쉽게 실시될 수 있다(예컨대, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B.D., and Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England를 참조).
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수형 "하나(a)", “한(an)” 및 "그것(the)"은 문맥상 명확히 다르게 언급하지 않는 한 복수형을 포함한다는 것을 유념하여야 한다. 따라서, 예를 들어 "하나의 세포"에 대한 지칭은 당업계의 숙련가에게 공지된 복수의 상기 세포들 및 이의 등가물 등을 포함한다. 마찬가지로, 용어 "하나(또는 한)", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 호환적으로 사용된다. 용어 "포함하는", "구비하는" 및 "갖는"은 호환적으로 사용될 수 있음을 유의하여야 한다.
용어 “약”은 이후에 이어지는 수치의 +/- 20% 범위를 나타낸다. 일 구현예에서, 용어 "약"은 이후에 이어지는 수치의 +/- 10% 범위를 나타낸다. 일 구현예에서, 용어 "약"은 이후에 이어지는 수치의 +/- 5 % 범위를 나타낸다.
용어 "포함하는"은 또한 용어 "구성되는"을 포함한다.
용어 "외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 세포"는 그 내부로 하나 이상의 외인성 핵산(들)이 도입된 세포를 수반하고, 상기 세포의 자손을 포함하며, 이들은 추가의 유전적 변형을 위한 시작점을 형성하도록 의도된다. 따라서, 용어 "외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 세포"는 포유동물 세포의 유전체의 유전자좌 내의 단일 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 수반하며, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 표지자에 측접하는 적어도 제1 및 제2 재조합 인식 서열(상기 재조합 효소 인식 서열들은 상이함)을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 세포는 숙주 세포의 유전체의 유전자좌 내의 단일 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포로서, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 표지자에 측접하는 제1 및 제2 재조합 인식 서열, 및 상기 제1 및 제2 재조합 인식 서열 사이에 위치하는 제3 재조합 인식 서열을 포함하고, 상기 모든 재조합 인식 서열은 상이하다.
본원에 사용된 용어 "재조합 세포"는, 예컨대 관심 폴리펩티드를 발현하는 세포와 같은 최종 유전자 변형 후의 세포로서, 임의의 규모에서도 상기 관심 폴리펩티드의 생성에 사용될 수 있는 세포를 의미한다. 예를 들어, 재조합효소 매개 카세트 교환(RMCE)을 거쳐 관심 폴리펩티드에 대한 부호화 서열이 숙주 세포의 유전체 내로 도입되는 "외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 세포"는 "재조합 세포"이다. 상기 세포가 추가의 RMCE 반응을 계속하여 실시할 수는 있지만 그렇게 하도록 의도된 것은 아니다.
"외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 세포" 및 "재조합 세포"는 둘 다 "형질전환된 세포"이다. 상기 용어는 계대의 수에 관계없이 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 모 세포와, 예컨대 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함우할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에 대하여 선별검사되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 발명에 수반된다.
“단리된" 조성물은 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리되어 있던 조성물이다. 일부 구현예들에서, 조성물은, 예를 들어 전기영동의(예컨대, SDS-PAGE, 등전초점조절(IEF), 모세관전기영동, CE-SDS) 또는 크로마토그래피(예컨대, 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되었을 때 95% 또는 99% 순도를 초과하여 정제된다. 예컨대, 항체 순도를 평가하는 방법들을 검토하려면, 예컨대 Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87을 참조한다.
“단리된” 핵산은 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 상기 핵산 분자를 보통 함유하는 세포 안에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 이의 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체 외부에 존재한다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 항체는 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리되어 있던 폴리펩티드 분자 또는 항체 분자를 지칭한다.
용어 “통합 부위”는 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입된 세포의 유전체 내에서의 핵산 서열을 의미한다. 특정 구현예들에서, 통합 부위는 세포의 유전체 내에서 2개의 인접한 뉴클레오티드들 사이에 존재한다. 특정 구현예들에서, 통합 부위는 뉴클레오티드 서열의 스트레치를 포함한다. 특정 구현예들에서, 상기 통합 부위는 포유동물 세포 유전체의 특정 유전자좌 내에 위치한다. 특정 구현예들에서, 상기 통합 부위는 포유동물 세포의 내인성 유전자 내부에 존재한다.
본원에서 호환적으로 사용될 수 있는 용어 "벡터" 또는 "플라스미드"는 이것이 연결되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 유전체 내로 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터들은 작동 가능하게 연결된 핵산들의 발현을 지시할 수 있다. 본원에서는 상기 벡터를 “발현 벡터"라고 한다.
용어 “~에 결합”은 결합 부위의 이의 표적에 대한 결합, 예컨대 예를 들어 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 결합 부위의 각 항원에 대한 결합을 나타낸다. 상기 결합은, 예를 들어 비아코어(BIAcore)® 분석(GE 헬스케어(Healthcare), 스웨덴 웁살라 소재)을 사용하여 결정될 수 있다. 즉, 용어 "(항원에 대한) 결합"은 시험관내 분석에서 항체의 이의 항원(들)에 대한 결합을 나타낸다. 일 구현예에서, 결합은 항체가 표면에 결합되고 항체에 대한 항원의 결합이 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정되는 결합 분석에서 결정된다. 결합은, 예컨대 10-8 M 이하, 일부 구현예들에서 10-13 내지 10-8 M, 일부 구현예들에서 10-13 내지 10-9 M의 결합 친화도(KD)를 의미한다. 용어 "결합"은 또한 용어 "특이적 결합"도 포함한다.
예를 들어, 비아코어® 분석의 한 가능한 구현예에서 항원은 표면에 결합되고 항체의 결합, 즉, 이의 결합 부위(들)은 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정된다. 결합 친화도는 용어 ka(결합 상수: 복합체를 형성하는 결합에 관한 속도 상수), kd(해리 상수; 복합체의 해리에 관한 속도 상수), 및 KD(kd/ka)로 정의된다. 대안적으로, SPR 센서그램의 결합 신호는 공명 신호 높이 및 해리 거동과 관련하여 기준 응답 신호와 직접 비교할 수 있다.
용어 "결합 부위"는 표적에 대한 결합 특이성을 나타내는 임의의 단백질성 실체를 나타낸다. 이는, 예컨대 수용체, 수용체 리간드, 안티칼린, 어피바디, 항체 등일 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "결합 부위"는 제2 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있거나 제2 폴리펩티드에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 폴리펩티드를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "선택 표지자"는 유전자를 보유하는 세포가 상응하는 선택제의 존재하에 특이적으로 선택되거나 이에 반하여 선택되도록 하는 유전자를 나타낸다. 예를 들어, 제한없이, 선택 표지자는 선택 표지자 유전자로 형질전환된 숙주 세포가 각각의 선택제의 존재하에(선택 배양 조건) 양성으로 선택되도록 할 수 있다; 형질전환되지 않은 숙주 세포는 선택 배양 조건하에서 성장하거나 생존할 수 없다. 선택 표지자는 양성, 음성 또는 이작용기성일 수 있다. 양성 선택 표지자는 표지자를 보유한 세포에 대한 선택을 허용하는 반면, 음성 선택 표지자는 표지자를 보유한 세포가 선택적으로 제거되도록 할 수 있다. 선택 표지자는 약물에 대한 내성을 부여하거나 숙주 세포 내의 대사 또는 이화작용의 결함을 보상할 수 있다. 원핵 세포에서는 무엇보다도 암피실린, 테트라시클린, 카나마이신 또는 클로람페니콜에 대한 내성을 부여하는 유전자를 사용할 수 있다. 진핵 세포에서 선택 표지자로 유용한 내성 유전자에는 아미노글리코시드 포스포 전달효소(APH)(예컨대, 히그로마이신 포스포 전달효소(HYG), 네오마이신 및 G418 APH), 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나아제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티디놀 탈수소효소(히스티디놀 D)에 대한 유전자 및 퓨로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 및 마이코페놀산에 대한 내성을 부호화하는 유전자가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 추가의 표지자 유전자들이 WO 92/08796 및 WO 94/28143에 기재되어 있다.
상응하는 선택제의 존재하에서 선택을 용이하게 하는 것 외에도 선택 표지자는 대안적으로 로세포 내에 정상적으로 존재하지 않는 분자, 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP), 강화된 GFP(eGFP), 합성 GFP, 노란색 형광 단백질(YFP), 강화 YFP(eYFP), 시안 형광 단백질(CFP), m플럼(mPlum), m체리(mCherry), td토마토(tdTomato), m스트로베리(mStrawberry), J-레드, DsRed-단량체, m오렌지, mKO, m시트린(mCitrine), 비너스(Venus), Y펫(YPet), 에메랄드, Cy펫(CyPet), mCFPm, 세룰리안(Cerulean) 및 T-사파이어(T-Sapphire)일 수 있다. 이러한 분자를 발현하는 세포는 부호화된 폴리펩티드에 의해 방출되는 형광의 검출 여부 등에 의해 이 유전자를 보유하지 않는 세포와 구별될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 구성요소들의 병치를 지칭하며, 여기서 구성요소들은 이들을 의도한 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계로 존재한다. 예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서가 부호화 서열의 전사를 조절하는 작용을 하는 경우, 프로모터 및/또는 인핸서는 부호화 서열에 작동가능하게 연결된다. 특정 구현예들에서, "작동가능하게 연결된" DNA 서열들은 단일 염색체에서 연속적이고 인접해 있다. 특정 구현예들에서, 예컨대 분비 리더 및 폴리펩티드와 같은 2개의 단백질 부호화 영역들을 연결하는 것이 필요한 경우, 서열들은 연속으로 인접하며 동일한 리딩 프레임에 존재한다. 특정 구현예들에서, 작동가능하게 연결된 프로모터는 부호화 서열의 상류에 위치하고 이에 인접할 수 있다. 특정 구현예들에서, 예를 들어 부호화 서열의 발현을 조절하는 인핸서 서열들과 관련하여, 두 성분은 인접하지는 않지만 작동가능하게 연결될 수 있다. 인핸서가 부호화 서열의 전사를 증가시키면 인핸서는 부호화 서열에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된 인핸서는 부호화 서열의 상류, 내부 또는 하류에 위치할 수 있고 부호화 서열의 프로모터로부터 상당한 거리에 위치할 수 있다. 작동가능한 연결은 당업계에 공지된 재조합 방법, 예컨대 PCR 방법을 사용하여 및/또는 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 달성될 수 있다. 편리한 제한 부위가 존재하지 않는 경우 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 기존 관행에 따라 사용할 수 있다. 내부 리보솜 진입 부위(IRES)는 내부 위치에서 5' 말단 독립 방식으로 오픈 리딩 프레임(ORF)의 번역을 시작할 수 있는 경우 ORF에 작동가능하게 연결된다.
본원에 사용된 용어 "측접"은 제1 뉴클레오티드 서열이 제2 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단, 또는 양쪽 말단에 위치함을 지칭한다. 측접 뉴클레오티드 서열은 제2 뉴클레오티드 서열에 인접하거나 이로부터 정해진 거리에 존재할 수 있다. 측접 뉴클레오타이드 서열의 길이에는 특별한 제한이 없다. 예를 들어, 측접 서열은 몇 개의 염기 쌍 또는 수천 개의 염기 쌍이될 수 있다.
데옥시리보핵산은 부호화 및 비부호화 가닥을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "5'" 및 "3'"은 부호화 가닥 상의 위치를 가리킨다.
본원에 사용된 용어 "외인성"은 뉴클레오티드 서열이 특정 세포로부터 유래하지 않고 DNA 전달 방법, 예컨대, 형질감염, 전기천공 또는 형질전환 방법에 의해 상기 세포로 도입된다는 것을 나타낸다. 따라서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 인공 서열인데, 인공성은, 예컨대 상이한 기원의 서브서열들의 조합(예컨대, 재조합효소 인식 서열과 SV40 프로모터 및 녹색 형광 단백질의 부호화 서열의 조합은 인공 핵산임)으로부터 또는 서열의 일부의 결실(예컨대, 막-결합 수용체 또는 cDNA의 세포외 도메인만을 부호화하는 서열) 또는 핵염기의 돌연변이로부터 유래될 수 있다. 용어 "내인성"은 뉴클레오티드 서열이 세포로부터 유래함을 지칭한다. "외인성" 뉴클레오티드 서열은 기본 조성에 있어서 동일한 "내인성" 대응부를 가질 수 있으나, 여기서 "외인성" 서열은 예를 들어, 재조합 DNA 기술을 통해 숙주 세포로 도입된다.
항체
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열들의 일반적인 정보는 다음 문헌들에 제공되어 있다: Kabat, E.A., 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
용어 "중쇄"는 이의 원래의 의미, 즉 항체를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬 중 2개의 더 큰 폴리펩티드 사슬을 나타내는 것으로 본원에서 사용된다(예컨대, Edelman, G.M. and Gally J.A., J. Exp. Med. 116 (1962) 207-227을 참조). 상기 문맥에서, 용어 "더 큰"은 분자량, 길이 및 아미노산 수 중 임의의 것을 지칭할 수 있다. 용어 "중쇄"는 그 안에 존재하는 개별 항체 도메인의 서열 및 수와 무관하다. 각각의 폴리펩티드의 분자량을 기준으로 단독으로 배정된다.
용어 "경쇄"는 이의 원래의 의미, 즉 항체를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬 중 2개의 더 작은 폴리펩티드 사슬을 나타내는 것으로 본원에서 사용된다(예컨대, Edelman, G.M. and Gally J.A., J. Exp. Med. 116 (1962) 207-227을 참조). 상기 문맥에서, 용어 "더 작은"은 분자량, 길이 및 아미노산 수 중 임의의 것을 지칭할 수 있다. 용어 "경쇄"는 그 안에 존재하는 개별 항체 도메인의 서열 및 수와 무관하다. 각각의 폴리펩티드의 분자량을 기준으로 단독으로 배정된다.
본원에서 사용되는, 중쇄 및 경쇄의 모든 불변 영역 및 도메인의 아미노산 위치는 Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에 기재된 카바트 넘버링 시스템에 따라 넘버링되며 본원에서 이는 "카바트에 따른 넘버링"으로 지칭된다. 구체적으로, Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)의 카바트 넘버링 시스템(647-660 페이지를 참조)은 카파 및 람다 동형의 경쇄 불변 도메인 CL에 대해 사용되고, Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)의 카바트 EU 지수 넘버링 시스템(661-723 페이지 참조)은 불변 중쇄 도메인들에 대해 사용된다(CH1, 힌지, CH2 및 CH3, 이 때 본원에서 “카바트 EU 지수에 따른 넘버링”을 지칭함으로써 보다 명확해짐).
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며 전장 항체, 단일클론 항체, 다중특이성 항체(예컨대, 이중특이성 항체) 및 항체-항체 단편 융합 뿐만 아니라 이의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 수반한다.
용어 "고유 항체"는 다양한 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린 분자를 나타낸다. 예를 들어, 고유 IgG 항체는 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질로서 이황화 결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된다. N 말단에서 C 말단까지, 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH)에 이어서 3개의 중쇄 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 가지며, 이에 의해 제1 및 제2 중쇄 불변 도메인 사이에는 힌지 영역이 위치한다. 유사하게, N 말단에서 C 말단까지, 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL)에 이어서 경쇄 불변 도메인(CL)을 갖는다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2가지 유형 중에서 하나에 배정될 수 있다.
용어 "전장 항체"는 고유 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 나타낸다. 전장 항체는 N 말달에서 C 말단 방향으로 각각 가변 도메인 및 불변 도메인을 포함하는 2개 이상의 전장 항체 경쇄 뿐만 아니라 N 말단에서 C 말단 방향으로 각각 가변 도메인, 제1 불변 도메인, 힌지 영역, 제2 불변 도메인 및 제3 불변 도메인을 포함하는 2개의 항체 중쇄를 포함한다. 고유 항체와 대조적으로, 전장 항체는 추가의 면역글로불린 도메인, 예컨대 예를 들어 하나 이상의 추가 scFv, 또는 중쇄 또는 경쇄 Fab 단편, 또는 전장 항체의 상이한 사슬의 말단 중 하나 이상에 접합되지만 각 말단에는 단일 단편만 접합된 scFab를 포함할 수 있다. 상기 접합체들 또한 용어 전장 항체에 수반된다.
용어 "항체 결합 부위"는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 쌍을 나타낸다. 항원에 대한 적절한 결합을 보장하기 위해, 상기 가변 도메인은 동족 가변 도메인이고, 즉 함께 속한다. 항체의 경우 결합 부위는 적어도 3개의 HVR(예컨대, VHH의 경우) 또는 3-6개의 HVR(예컨대, 자연 발생, 즉 VH/VL 쌍을 갖는 통상적인 항체의 경우)을 포함한다. 일반적으로, 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기들이 결합 부위를 형성하고 있다. 상기 잔기들은 일반적으로 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 대응하는 항체 경쇄 가변 도메인에 포함된다. 항체의 항원 결합 부위는 "초가변 영역"또는 "HVR"의 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 영역은 본원에서 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 N 말단에서 C 말단으로 영역 FR1, HVR1, FR2, HVR2, FR3, HVR3, 및 FR4를 포함한다. 특히, 중쇄 가변 도메인의 HVR3 영역은 항원 결합에 가장 많이 기여하고 항체의 결합 특이성을 정의하는 영역이다. "기능적 결합 부위"는 그 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 용어 "~에 특이적으로 결합하는"은 결합 분석의 한 구현예에서 시험관내 분석에서 그의 표적에 대한 결합 부위의 결합을 나타낸다. 상기 결합 분석은 결합 이벤트가 검출될 수 있는 한 임의의 분석일 수 있다. 예를 들어, 항체가 표면에 결합되고 항원(들)이 항체에 결합하는 분석은 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정된다. 대안적으로, 가교 ELISA가 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “초가변 영역” 또는 “HVR”은 서열에서 초가변인 (“상보성 결정 영역” 또는 “CDR”) 및/또는 구조적으로 정의된 루프 (“초가변 루프”)를 형성하고 및/또는 항원-함유 잔기들 (“항원 접촉부”)을 함유하는 아미노산 잔기 연장부들을 포함하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체들은 다음 6개의 HVR들을 포함한다; 중쇄 가변 도메인 VH에서 3개(H1, H2, H3), 및 경쇄 가변 도메인 VL에서 3개(L1, L2, L3).
HVR은
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)에서 발생하는 초가변 루프(Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)에서 발생하는 CDR(Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)에 발생하는 항원 접촉(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및
(d) 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3), 및 94-102(H3)을 포함하는 (a), (b), 및/또는 (c)의 조합을 포함한다.
다르게 지시되지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인의 다른 잔기(예컨대, FR 잔기)는 본원에서 상기 Kabat et al.에 따라서 넘버링된다.
항체의 “부류”는 이의 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역, 바람직하게는 Fc 영역의 유형을 지칭한다. 항체에는 5가지 주요 분류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들 중 몇몇은 하위부류(동형), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 세분될 수 있다. 상이한 면역글로불린 부류에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 α, δ, ε, γ 및 μ로 각각 불린다.
용어 "중쇄 불변 영역"은 불변 도메인을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 영역, 즉 천연 면역글로불린의 경우 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인 또는 전장 면역글로불린의 경우 제1 불변 도메인, 힌지 영역, 제2 불변 도메인 및 제3 불변 도메인을 나타낸다. 일 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 Ala118에서부터 중쇄의 카르복실 말단까지 연장된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 하지만, 불변 영역의 C 말단 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 용어 “불변 영역”은 사슬간 이황화 결합을 형성하는 힌지 영역 시스테인 잔기를 통해 서로 공유결합으로 연결될 수 있는 2개의 중쇄 불변 영역을 포함하는 이량체를 나타낸다.
용어 "중쇄 Fc 영역"은 힌지 영역(중간 및 하부 힌지 영역), 제2 불변 도메인, 예컨대 CH2 도메인 및 제3 불변 도메인, 예컨대 CH3 도메인의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 나타낸다. 일 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Asp221, Cys226, 또는 Pro230에서부터 중쇄의 카르복실 말단까지 확장된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 따라서, Fc 영역은 불변영역보다 작지만 C 말단 부분은 이와 동일하다. 하지만, 중쇄 영역의 Fc 영역의 C 말단 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 용어 “Fc 영역”은 사슬간 이황화 결합을 형성하는 힌지 영역 시스테인 잔기를 통해 서로 공유결합으로 연결될 수 있는 2개의 Fc 중쇄 불변 영역을 포함하는 이량체를 나타낸다.
항체의 불변 영역, 더 정확하게는 Fc 영역(및 마찬가지로 불변 영역)은 보체 활성화, C1q 결합, C3 활성화 및 Fc 수용체 결합에 직접적으로 관여한다. 보체 시스템에 대한 항체의 영향은 특정 조건에 따라 다르지만 C1q에 대한 결합은 Fc-영역 내 정의된 결합 부위에 의해 발생한다. 상기 결합 부위는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; and EP 0 307 434에 의해 기재된다. 상기 결합 부위들은, 예컨대 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329이다(카바트의 EU 지수에 따른 넘버링). 하위부류 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체는 일반적으로 보체 활성화, C1q 결합 및 C3 활성화를 나타내는 반면, IgG4는 보체 시스템을 활성화하지 않고 C1q에 결합하지 않으며 C3를 활성화하지 않는다. "항체의 Fc 영역"은 당업자에게 일반적으로 공지된 용어이며 항체의 파파인 절단을 기준으로 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동종의 항체군으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 즉, 상기 군을 포함한 개별 항체들은 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합한다. 단, 일반적으로 소량으로 존재하는 변이체 항체가 가능한 경우, 예컨대 자연발생 돌연변이를 포함하거나 단일클론 항체 제제의 생성 중에 발생하는 경우는 제외한다. 상이한 결정기(에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정기에 대해 지향된다. 따라서, 수식어 “단일클론”은 항체의 실질적으로 동종의 군으로부터 수득되는 것으로서 항체의 특징을 표시하고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 전시 방법, 그리고 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 함유하는 유전자도입 동물을 활용하는 방법을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다.
본 출원 내에서 사용된 용어 "~가(valent)"는 항체에서 지정된 수의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 이처럼, 용어 "2가", "4가", 및 "6가"는 항체에서 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위, 및 6개의 결합 부위 각각의 존재를 나타낸다.
"단일특이성 항체"는 단일 결합 특이성을 갖는, 즉 하나의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 나타낸다. 단일특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예컨대, F(ab')2) 또는 이의 조합 (예컨대, 전장 항체 + 또 다른 scFv 또는 Fab 단편)으로 제조될 수 있다. 단일특이성 항체는 1가일 필요가 없다, 즉, 단일특이성 항체는 하나의 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 천연 항체는 단일특이적이지만 2가이다.
"다중특이성 항체"는 동일한 항원 또는 2개의 상이한 항원상의 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 나타낸다. 다중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예컨대, F(ab')2 이중특이성 항체) 또는 이의 조합 (예컨대, 전장 항체 + 또 다른 scFv 또는 Fab 단편)으로 제조될 수 있다. 다중특이성 항체는 적어도 2가이다, 즉 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 또한 다중특이성 항체는 적어도 이중특이적이다. 따라서, 2가 이중특이성 항체는 다중특이성 항체의 가장 단순한 형태이다. 2개, 3개 또는 그 이상(예컨대, 4개)의 기능적 항원 결합 부위를 가진 조작된 항체 또한 보고된 바 있다(예컨대, US 2002/0004587 A1를 참조).
특정 구현예들에서, 상기 항체는 다중특이성 항체, 예컨대 적어도 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 특정 구현예들에서, 결합 특이성 중에서 하나는 제1 항원에 대한 것이고, 다른 하나는 상이한 항원에 대한 것이다. 특정 구현예들에서, 다중특이성 항체는 동일한 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다중특이성 항체는 또한 항원을 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화하는데 사용될 수 있다.
다중특이성 항체를 만들는 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동발현 (Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, and Traunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659를 참조), 및 “구멍 내로의 돌기(knob-in-hole)” 가공(예컨대, 미국 특허 제5,731,168호)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다중특이성 항체는 또한 항체 Fc 이종이량체 분자를 만들기 위한 정전기 조향 효과를 조작함으로써(WO 2009/089004); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합시킴으로써(예컨대, 미국 특허 제4,676,980호 및 Brennan, M., et al., Science 229 (1985) 81-83을 참조); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이성 항체를 생성함으로써(예컨대, Kostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553; 이중특이성 항체 단편을 만들기 위한 특정 기술을 사용함으로써(예컨대, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); 및 단일 사슬 Fv(scFv) 이량체를 사용함으로써(예컨대, Gruber, M., et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374를 참조); 및 예컨대, Tutt, A., et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69)에 기재된 바와 같이 삼중특이성 항체를 제조함으로써 제조할 수 있다.
항체 또는 단편은 또한 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, or WO 2010/145793에 기재된 바와 같은 다중특이성 항체일 수 있다.
항체 또는 이의 단편은 또한 WO 2012/163520에 개시된 바와 같은 다중특이성 항체일 수 있다.
이중특이성 항체는 일반적으로 동일한 항원 상의 2개의 상이한 비중첩 에피토프 또는 상이한 항원 상의 2개의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 분자이다.
상기 맥락에서 용어 "비중첩"은 이중특이적 Fab의 제1 파라토프 내에 포함된 아미노산 잔기가 제2 파라토프에 포함되지 않고, 이중특이적 Fab의 제2 파라토프 내에 포함된 아미노산이 제1 파라토프 내에 포함되지 않음을 나타낸다.
“구멍 내로의 돌기” 이량체화 모듈 및 항체 공학에서의 이의 사용은 Carter P.; Ridgway J.B.B.; Presta L.G.: Immunotechnology, Volume 2, Number 1, February 1996, pp. 73-73(1)에 기재되어 있다.
항체 중쇄들의 CH3 도메인들은 “구멍 내로의 돌기” 기술에 의해 변경될 수 있으며, 상기 기술은, 예컨대 WO 96/027011, Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; 및 Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681에 몇가지 실시예로 상세히 기재되어 있다. 상기 방법에서 2개의 CH3 도메인들의 상호작용 표면들을 변화시켜 상기 2개 CH3 도메인들의 이종이량체화 그리고 이에 따라 이들을 포함하는 폴리펩티드의 이종이량체화를 증가시킨다. (2개의 중쇄의)2개의 CH3 도메인의 각각은 "돌기"일 수 있고, 다른 하나는 "구멍"이다. 이황화 가교의 도입은 상기 이종이량체를 추가로 안정화시키고(Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) 수율을 증가시킨다.
(항체 중쇄의)CH3 도메인에서 돌연변이 T366W는 "돌기 돌연변이" 또는 "돌연변이 돌기"로 표시되고 (항체 중쇄의)CH3 도메인에서 돌연변이 T366S, L368A, Y407V는 "구멍 돌연변이 "또는 "돌연변이 구멍"으로 표시된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). CH3 도메인들 사이의 추가적인 사슬간 이황화 가교가 또한 사용될 수 있는데(Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681), 예컨대 “돌기 돌연변이”가 있는 중쇄의 CH3 도메인에 S354C 돌연변이를 도입시킴으로써(“돌기-시스 돌연변이” 또는 “돌연변이 돌기-시스”로 표시됨) 및 “구멍 돌연변이”가 있는 중쇄의 CH3 도메인에 Y349C 돌연변이를 도입함으로써(“구멍-시스 돌연변이” 또는 “돌연변이 구멍-시스”로 표시)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링) 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "도메인 교차"는 한 쌍의 항체 중쇄 VH-CH1 단편 및 이의 상응하는 동족 항체 경쇄에서, 즉, 항체 Fab (단편 항원 결합)에서, 적어도 하나의 중쇄 도메인이 이의 상응하는 경쇄 도메인에 의해 치환되어 해당 도메인 서열이 고유 항체의 서열로부터 벗어나는 것을 나타낸다. 하기와 같은 3가지 일반 유형의 도메인 교차가 존재한다: (i) CH1 및 CL 도메인들의 교차로서, 이는 경쇄에서의 도메인 교차에 의해 VL-CH1 도메인 서열을 그리고 중쇄 단편에서의 도메인 교차에 의해 VH-CL 도메인 서열(또는 VH-CL-힌지-CH2-CH3 도메인 서열을 가지는 전장 항체 중쇄)을 초래함, (ii) VH 및 VL 도메인들의 도메인 교차로서, 이는 경쇄에서의 도메인 교차에 의해 VH-CL 도메인 서열을 그리고 중쇄 단편에서의 도메인 교차에 의해 VL-CH1 도메인 서열을 초래함, 및 (iii) 완전 경쇄(VL-CL) 및 완전 VH-CH1 중쇄 단편의 도메인 교차(“Fab 교차”)로서, 이는 도메인 교차에 의해 VH-CH1 도메인 서열을 갖는 경쇄를 그리고 도메인 교차에 의해 VL-CL 도메인 서열을 갖는 중쇄 단편을 초래함(전술한 모든 도메인 서열은 N 말단에서 C 말단 방향으로 표시됨).
본원에서 사용되는 용어 상응하는 중쇄 및 경쇄 도메인에 대해 "서로 대체된"은 전술한 도메인 교차를 지칭한다. 이에 따라, CH1 및 CL 도메인들이 “서로에 의해 대체되는” 경우, 이는 항목 (i)에서 언급된 도메인 교차 및 이에 의해 생성된 중쇄 및 경쇄 도메인 서열을 지칭하는 것이다. 따라서, VH 및 VL이 “서로에 의해 대체되는” 경우, 이는 항목 (ii)에서 언급된 도메인 교차를 지칭하고; CH1 및 CL 도메인들이 “서로에 의해 대체되고” VH 및 VL 도메인들이 “서로에 의해 대체되는” 경우, 이는 항목 (iii)에서 언급된 도메인 교차를 지칭한다. 도메인 교차를 포함하는 이중특이성 항체들은, 예컨대 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254 and Schaefer, W., et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 108 (2011) 11187-11192에 보고된다. 상기 항체들은 일반적으로 크로스맵(CrossMab)으로 명명된다.
다중특이성 항체들은 또한 일 구현예에서 상기 항목 (i)에 언급된 CH1 및 CL 도메인의 도메인 교차, 또는 상기 항목 (ii)에 언급된 VH 및 VL 도메인의 도메인 교차, 또는 상기 항목 (iii)에 언급된 VH-CH1 및 VL-VL 도메인의 도메인 교차 중 하나를 포함하는 적어도 하나의 Fab 단편을 포함한다. 도메인 교차를 가지는 다중특이성 항체의 경우, 동일한 항원(들)에 특이적으로 결합하는 Fab들은 동일한 도메인 서열이 되도록 구성된다. 그러므로, 도메인 교차를 가지는 하나 이상의 Fab가 다중특이성 항체에 포함되는 경우, 상기 Fab(들)는 동일한 항원에 특이적으로 결합한다.
"인간화된" 항체는 비인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 항체를 지칭한다. 특정 구현예들에 있어서, 인간화된 항체는 실질적으로 최소한 하나의, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함하는데, 이때 HVR들(예컨대, CDRs)의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 비인간 항체에 대응하며, FRs의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체의 "인간화된 형태", 예컨대 비인간 항체는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "재조합 항체"는 재조합 수단, 예컨대 재조합 세포에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 항체(키메라, 인간화 및 인간)를 나타낸다. 여기에는 NS0, HEK, BHK 또는 CHO 세포와 같은 재조합 세포에서 분리된 항체가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "항체 단편"은 원형 항체가 결합하는 항원에 결합하는 원형 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자, 즉 기능적 단편을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv; Fab; Fab'; Fab'-SH; F(ab')2; 이중특이적 Fab; 디아 바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예컨대, scFv 또는 scFab)를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
II. 조성물 및 방법
일반적으로, 예를 들어 치료용 폴리펩티드와 같은 관심 폴리펩티드의 재조합 대규모 생산을 위해서는 상기 폴리펩티드를 안정적으로 발현하고 분비하는 세포가 필요하다. 이러한 세포를 "재조합 세포" 또는 "재조합 생성 세포"라고 하며 이러한 세포를 생성하는 데 사용되는 과정을 "세포주 개발"이라고 한다. 세포주 개발 과정의 제1 단계에서 적절한 숙주 세포, 예를 들어, CHO 세포가 상기 관심 폴리펩티드의 발현에 적합한 핵산 서열로 형질감염된다. 제2 단계에서 관심 폴리펩티드를 안정적으로 발현하는 세포는 관심 폴리펩티드를 부호화하는 핵산으로 공동 형질감염되었던 선택 표지자의 공동 발현에 기초하여 선택된다.
폴리펩티드를 부호화하는 핵산, 즉 부호화 서열을 구조 유전자라고 한다. 이러한 구조 유전자는 단순한 정보이며, 그 발현을 위해서는 추가적인 조절 요소들이 필요하다. 따라서, 일반적으로 구조 유전자는 발현 카세트에 통합된다. 발현 카세트가 포유동물 세포에서 기능하기 위해 필요한 최소한의 조절 요소들은, 구조 유전자에 대한 상류, 즉 5'에 위치하는 상기 포유동물 세포에서 기능하는 프로모터, 및 구조 유전자의 하류, 즉 3'에 위치 상기 포유동물 세포에서 기능하는 폴리아데닐화 신호 서열에 해당한다. 상기 프로모터, 구조 유전자, 및 폴리아데닐화 신호 서열은 작동가능하게 연결된 형태로 배열된다.
관심 폴리펩티드가 상이한 (단량체) 폴리펩티드로 구성된 이종다량체 폴리펩티드인 경우, 단일 발현 카세트 뿐만 아니라 함유된 구조 유전자가 상이한 다수의 발현 카세트, 즉 상기 이종다량체 폴리펩티드의 상이한 (단량체) 폴리펩티드 각각에 대한 하나 이상의 발현 카세트가 필요하다. 예컨대, 전장 항체는 2개의 경쇄 복제와 2개의 중쇄 복제를 포함하는 이종다량체 폴리펩티드이다. 따라서, 전장 항체는 2개의 상이한 폴리펩티드로 구성된다. 따라서, 전장 항체의 발현을 위해서는 2개의 발현 카세트가 필요하며, 하나는 경쇄용이고 다른 하나는 중쇄용이다. 만약, 예를 들어, 전장 항체가 이중특이성 항체인 경우, 즉 항체가 2개의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 상이한 결합 부위를 포함하는 경우, 경쇄 및 중쇄 또한 서로 상이하다. 따라서, 이러한 이중특이성 전장 항체는 4개의 상이한 폴리펩티드로 구성되며 4개의 발현 카세트가 필요하다.
관심 폴리펩티드에 대한 발현 카세트(들)는 소위 "발현 벡터"로 차례로 통합된다. "발현 벡터"는 포유동물 세포에서 포함된 구조 유전자(들)의 발현뿐만 아니라 박테리아 세포들 내의 상기 벡터의 증폭을 위한 모든 필요 요소들을 제공하는 핵산이다. 통상적으로, 발현 벡터는 복제 기점을 포함하는 원핵 플라스미드 증식 단위, 예컨대 대장균, 및 원핵생물 선택 표지자 뿐만 아니라 진핵생물 선택 표지자, 및 구조적 관심 유전자(들)의 발현에 필요한 발현 카세트를 포함한다. "발현 벡터"는 포유류 세포 내에 발현 카세트를 도입하기 위한 운반체이다.
이전 단락들에서 개괄된 바와 같이, 발현될 폴리펩티드가 복잡할수록, 상이한 발현 카세트의 수도 더 많이 필요하다. 본질적으로 숙주 세포의 유전체에 통합되는 핵산의 크기도 발현 카세트의 수와 함께 증가한다. 부수적으로, 발현 벡터의 크기도 증가한다. 하지만, 취급 및 처리 효율성이 크게 떨어지는 약 15 kbps 범위의 벡터 크기에는 실질적인 상한이 존재한다. 이러한 사안은 2개 이상의 발현 벡터를 사용하여 처리할 수 있다. 기존의 세포주 개발(CLD)은 관심 폴리펩티드(SOI)에 대한 발현 카세트를 운반하는 벡터들의 무작위 통합(RI)에 따른다.
기존의 세포주 개발 (CLD)은 관심 서열 (SOI)을 운반하는 플라스미드의 무작위 통합 (RI)에 의존한다. 일반적으로, 벡터가 무작위 접근 방식으로 형질감염되면 여러 벡터 또는 그 단편들이 세포의 유전체 내로 통합된다. 따라서, RI를 기반으로 하는 형질감염 과정은 예측이 안된다.
따라서, 상이한 발현 벡터 사이에서 발현 카세트를 분할하면서 크기 문제를 처리하면, 통합된 발현 카세트의 무작위 수 및 그 공간적 분포라는 새로운 문제가 발생한다.
일반적으로, 구조 유전자의 발현을 위한 발현 카세트가 세포의 유전체에 더 많이 통합될수록 각각의 발현된 폴리펩티드의 양이 더 많아진다. 통합된 발현 카세트의 수 외에도 통합의 부위와 유전자좌도 발현 수율에 영향을 미친다. 만약, 예를 들어, 발현 카세트가 세포의 유전체 내의 전사 활성이 낮은 부위에 통합되면 부호화된 폴리펩티드는 소량만 발현된다. 그러나, 동일한 발현 카세트가 높은 전사 활성을 갖는 세포 유전체 내의 부위에 통합되면 부호화된 폴리펩티드가 다량으로 발현된다.
이종다량체 폴리펩티드의 상이한 폴리펩티드들에 대한 발현 카세트들이 모두 동일한 빈도에서 및 유사한 전사 활성을 갖는 유전자좌에서 통합되는 한, 상기와 같은 발현 상의 차이는 문제를 야기하지 않는다. 이러한 상황에서 다량체 폴리펩티드의 모든 폴리펩티드는 동일한 양으로 발현되며, 다량체 폴리펩티드는 제대로 조립되게 된다.
하지만, 상기 시나리오는 가능성이 매우 낮으며, 2개 초과의 폴리펩티드로 구성된 분자에 대해 보장할 수 있는 것도 아니다. 예컨대, WO 2018/162517에는 i) 발현 카세트 서열에 따라 그리고 ii) 상이한 발현 벡터 사이의 발현 카세트들의 분포에 따라, RI를 사용하여 발현 수율 및 생성물 품질의 높은 변동이 관찰되었다고 개시되어 있다. 이러한 이론에 구속됨이 없이, 이러한 관찰은 상이한 발현 벡터들로부터 상이한 발현 카세트들이 상이한 빈도로 세포 내의 상이한 유전자좌에서 통합됨으로써 이종다량체 폴리펩티드의 상이한 폴리펩티드가 차등적인, 즉 적절하지 않은 상이한 비율의 발현을 초래한다는 사실에 기인한다. 이에 의해, 단량체 폴리펩티드의 일부는 더 많은 양으로 존재하고 나머지는 더 적은 양으로 존재한다. 이종다량체 폴리펩티드의 단량체들 사이의 이러한 불균형은 불완전 조립, 오조립 및 분비 속도 저하를 유발한다. 이전의 모든 것들은 정확하게 접힌 이종다량체 폴리펩티드의 더 낮은 발현 수율 및 생성물-관련 부산물의 더 높은 분율을 초래하게 된다.
기존의 RI CLD와 달리 표적화 통합(TI) CLD는 세포의 유전체의 소정의 "핫스팟"에서 상이한 발현 카세트들을 포함하는 이식유전자를 도입한다. 또한, 상기 도입은 발현 카세트들의 정의된 비율로 이루어진다. 따라서, 이러한 이론에 구속됨이 없이, 이종다량체 폴리펩티드의 모든 상이한 폴리펩티드는 동일한(또는 적어도 유사하고 단지 약간 상이한) 비율 및 적절한 비율로 발현된다. 이로 인해, 정확하게 조립된 이종다량체 폴리펩티드의 양이 증가되어야 하고 제품 관련 부산물의 분율이 감소되어야 한다.
또한, 정의된 복제 수와 정의된 통합 부위가 주어지면, TI에 의해 얻은 재조합 세포는 RI에 의해 얻은 세포에 비해 더 나은 안정성을 가져야 한다. 또한, 선택 표지자는 적절한 TI를 갖는 세포를 선택하는 데만 사용되며 높은 수준의 이식유전자 발현을 갖는 세포를 선택하는 데 사용되지 않기 때문에, 부분적으로는 메토트렉세이트(MTX) 또는 메티오닌 설폭시민(MSX)과 같은 선택제의 돌연변이 유발성으로 인해 서열 변이체(SV)의 가능성을 최소화하도록 돌연변이 유발이 적은 표지자를 적용할 수 있다.
하지만, TI 내에 사용된 이식유전자에서 발현 카세트의 서열, 즉 발현 카세트 조직이 2가 이중특이성 항체 발현에 중대한 영향을 미친다는 것이 현재 밝혀졌다.
본 발명은 개별적인 발현 카세트의 정의된 수 및 서열을 갖는 특정 발현 카세트 조직을 사용한다. 이로 인해, 포유동물 세포에서 발현되는 2가 이중특이성 항체의 높은 발현 수율 및 양호한 생성물 품질을 가져온다.
본 발명에 따른 발현 카세트 서열과 이식유전자의 정의된 통합을 위해 TI 방법론이 사용된다. 본 발명은 2-플라스미드 재조합 효소 매개 카세트 교환(RMCE) 반응을 사용하여 재조합 포유동물 세포를 발현하는 2가 이중특이성 항체를 생성하는 신규한 방법을 제공한다. 개선 사항은, 무엇보다도, 정의된 서열 내 동일한 유전자좌에서의 정의된 통합에 따른 2가 이중특이성 항체의 높은 발현 및 생성물 관련 부산물 형성의 감소에 있다.
본 개시된 발명의 요지는 2가 이중특이성 항체의 안정적인 대규모 생성을 위한 재조합 포유동물 세포를 생성하기 위한 방법뿐만 아니라 유리한 부산물 프로파일과 함께 2가 이중특이성 항체의 높은 생산성을 갖는 재조합 포유동물 세포를 위한 방법을 제공한다.
본원에서 사용된 2-플라스미드 RMCE 전략을 통해 동일한 TI 유전자좌에 다중 발현 카세트를 삽입할 수 있다.
II. a 본 발명에 따른 이식유전자 및 방법
본원에서는 2가 이중특이성 항체를 발현하는 재조합 포유동물 세포가 보고된다. 2가 이중특이성 항체는 상기 포유동물 세포에 의해 자연적으로 발현되지 않는 이종다량체 폴리펩티드이다. 보다 구체적으로, 2가 이중특이성 항체는 4개의 폴리펩티드로서: 제1 항체 중쇄, 제2 항체 중쇄, 제1 항체 경쇄 및 제2 항체 경쇄로 이루어진 이종다량체성 단백질이다. 2가 이중특이성 항체의 발현을 달성하기 위해, 특이적이고 정의된 서열 내의 상이한 발현 카세트를 포함하는 재조합 핵산이 포유동물 세포의 유전체 내로 통합되었다.
본원에는 2가 이중특이성 항체을 발현하는 재조합 포유동물 세포를 생성하는 방법 및 상기 재조합 포유동물 세포를 사용하여 2가 이중특이성 항체를 생성하는 방법 또한 보고된다.
본 발명은 포유동물 세포의 유전체 내로 통합됨으로써, 이종이량체 이가 이중특이성 항체, 즉 발현 카세트 조직의 발현에 필요한 상이한 발현 카세트의 서열이 2가 이중특이성 항체의 발현 수율에 영향을 미친다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
본 발명은 이중의 재조합 효소 매개 카세트 교환(RMCE)이 재조합 CHO 세포와 같은 재조합 포유동물 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초하고, 정의되고 특이적인 발현 카세트 서열이 유전체 내로 통합되어, 이로 인해 결과적으로 2가 이중특이성 항체의 효율적인 발현 및 생성을 유발한다. 상기 통합은 표적화된 통합에 의한 포유동물 세포 유전체 내의 특정 부위에서 유효하다. 이로써, 이종다량체 항체의 상이한 폴리펩티드의 서로에 대한 발현 비율을 제어하는 것이 가능해진다. 결국, 이로 인해 높은 발현 수율의 정확하게 접히고 조립된 2가 이중특이성 항체에서 효율적인 발현, 올바른 조립 및 성공적인 분비가 달성된다.
2가 이중특이성 항체는 헤테로-4-머로서, 이의 발현을 위해 4개 이상의 상이한 발현 카세트가 필요하다: 제1은 제1 항체 중쇄의 발현을 위한 것이고, 제2는 제2 항체 중쇄의 발현을 위한 것이고, 제3은 제1 항체 경쇄의 발현을 위한 것이며, 제4는 제2 항체 경쇄의 발현을 위한 것이다. 추가적으로, 양성 선택 표지자(들)에 대한 하나 이상의 추가 발현 카세트(들)가 포함될 수 있다.
도메인 교차/교환이 있는 하나의 2가 이중특이성 항체에 대해 일시적 형질감염으로부터 하기의 결과가 수득되었다(벡터는 표시된 발현 카세트로만 구성됨: l+h = 1개의 경쇄 발현 카세트 및 구멍 돌연변이를 갖는 1개의 중쇄용 발현 카세트를 포함하는 벡터; xl+k = 도메인 교환을 갖는 경쇄에 대한 하나의 발현 카세트 및 돌기 돌연변이를 갖는 중쇄에 대한 하나의 발현 카세트를 포함하는 벡터; xl+h = 도메인 교환을 갖는 경쇄에 대한 하나의 경쇄 발현 카세트 및 구멍 돌연변이를 갖는 중쇄에 대한 하나의 발현 카세트를 포함하는 벡터; 및 l+k = 경쇄에 대한 하나의 발현 카세트 및 돌기 돌연변이를 갖는 중쇄에 대한 하나의 발현 카세트를 포함하는 벡터:
l = 경쇄; h = 구멍 돌연변이를 갖는 중쇄; xl = 도메인 교환을 갖는 경쇄; k = 돌기 돌연변이를 갖는 중쇄
일시적인 형질감염으로 수득한 결과에서 알 수 있는 바와 같이 4개의 발현 카세트의 서열 및 조합은 상이한 발현 수율 및 생성물 품질을 가져온다.
일반적으로 일시적인 단백질 발현 프로파일이 안정적인 발현 프로파필을 예측한다는 것은 당업계에서 인정된다(예컨대, Diepenbruck, C., et al. Mol. Biotechnol. 54 (2013) 497-503; Rajendra, Y., et al. Biotechnol. Prog. 33 (2017) 469-477).
TI 숙주의 생산성에 대한 발현 카세트 조직의 효과를 조사하기 위해, 도메인 교차/교환을 갖는 2가 이중특이성 항체의 개별 사슬의 발현 카세트의 상이한 수 및 조직을 함유하는 2개의 플라스미드(전방 및 후방 벡터)를 형질감염시켜 RMCE 안정 풀을 생성하였다. 유세포 분석에 의한 RMCE의 선택, 회수 및 검증 후, 풀(pool)들의 생산성을 14일 유가식 생산 분석에서 평가하였다.
안정적인 형질감염된 세포에서 발현 수율 및 생성물 품질에 대한 항체 사슬 발현 카세트 조직의 효과를 도메인 교환을 갖는 6개의 상이한 2가 이중특이성 항체에 대해 평가하였다. 모두 다른 표적화 특이성을 가졌다. 일부는 상이한 VH/VL 쌍의 효과도 분석되었다. 상기 10가지 상이한 항체에 대해 하기의 결과가 수득되었다.
k = 돌기 돌연변이를 갖는 중쇄; h = 구멍 돌연변이를 갖는 중쇄; l = 경쇄; xl = 도메인 교환을 갖는 경쇄; var = 상기한 결합 부위 서열본 발명은 하기와 같이 요약된다.
본 발명에 따른 독립적인 양태는 2가 이중특이성 항체를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은,
a) 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 단계, 및
b) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 2가 이중특이성 항체를 회수하는 단계를 포함하고,
상기 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산은 상기 포유동물 세포의 유전체 내로 안정적으로 통합되고, 5'에서 3' 방향으로,
(1)
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함하거나,
또는 (2)
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제1 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함하며,
선택적으로 상기 제1 또는 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제1 또는 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 상응하는 도메인 교환된 중쇄이고,
선택적으로 (1)의 경우 또는 (1) 및 (2)의 경우 상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함하거나, 또는 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산의 안정적인 통합은 포유동물 세포의 유전체 내로 안정적으로 통합되고, 발현 카세트의 특정 서열이 유지되는 한 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 실시될 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 상응하는 도메인 교환된 중쇄이다.
바람직한 일 구현예에서, (1)의 경우 또는 (1) 및 (2)의 경우 상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 상응하는 도메인 교환된 중쇄이고,
그리고
상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함한다.
본 발명의 독립적인 양태는 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산으로서, 5'에서 3' 방향으로,
(1)
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함하거나,
또는 (2)
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제1 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함하며,
선택적으로 상기 제1 또는 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제1 또는 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 상응하는 도메인 교환된 중쇄이고,
선택적으로 (1)의 경우 또는 (1) 및 (2)의 경우 상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함하거나, 또는 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 상응하는 도메인 교환된 중쇄이다.
바람직한 일 구현예에서, (1)의 경우 또는 (1) 및 (2)의 경우 상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 상응하는 도메인 교환된 중쇄이고,
그리고
상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함한다.
본 발명의 독립적인 양태는 포유동물 세포에서 2가 이중특이성 항체의 발현을 위한 데옥시리보핵산의 사용으로서, 상기 데옥시리보핵산은 5'에서 3' 방향으로,
(1)
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함하거나,
또는 (2)
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제1 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함하며,
선택적으로 상기 제1 또는 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제1 또는 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 상응하는 도메인 교환된 중쇄이고,
선택적으로 (1)의 경우 또는 (1) 및 (2)의 경우 상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함하거나, 또는 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 상응하는 도메인 교환된 중쇄이다.
바람직한 일 구현예에서, (1)의 경우 또는 (1) 및 (2)의 경우 상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 상응하는 도메인 교환된 중쇄이고,
그리고
상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함한다.
본 발명의 독립적인 양태는 상기 세포의 유전체 내에 통합된 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산을 포함하는 재조합 포유동물 세포로서,
2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산은 5'에서 3' 방향으로,
(1)
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함하거나,
또는 (2)
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제1 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함하며,
선택적으로 상기 제1 또는 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제1 또는 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 상응하는 도메인 교환된 중쇄이고,
선택적으로 (1)의 경우 또는 (1) 및 (2)의 경우 상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함하거나, 또는 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 상응하는 도메인 교환된 중쇄이다.
바람직한 일 구현예에서, (1)의 경우 또는 (1) 및 (2)의 경우 상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 상응하는 도메인 교환된 중쇄이고,
그리고
상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함한다.
본 발명의 독립적인 양태는 3개의 상이한 재조합 인식 서열 및 4개의 발현 카세트를 차례로 포함하는, 2개의 데옥시리보핵산을 포함하는 조성물로서,
- 제1 데옥시리보핵산은 5' 에서 3' 방향으로,
(1)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 복제를 포함하거나,
또는 (2)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 복제를 포함하고,
그리고
- 제2 데옥시리보핵산은 5'에서 3' 방향으로,
(1)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 복제,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열을 포함하거나,
또는 (2)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 복제,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열을 포함하며,
선택적으로 상기 제1 또는 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제1 또는 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 상응하는 도메인 교환된 중쇄이고,
선택적으로 (1)의 경우 또는 (1) 및 (2)의 경우 상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함하거나, 또는 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
일 구현예에서, 상기 제1 및 제2 데옥시리보핵산은 모두 (1)에 따른 조직을 포함하거나; 또는 상기 제1 및 제2 데옥시리보핵산 둘 모두는 (2)에 따른 조직을 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 상응하는 도메인 교환된 중쇄이다.
바람직한 일 구현예에서, (1)의 경우 또는 (1) 및 (2)의 경우 상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 상응하는 도메인 교환된 중쇄이고,
그리고
상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함한다.
본 발명의 독립적인 양태는 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산을 포함하고 상기 2가 이중특이성 항체를 분비하는 재조합 포유동물 세포를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은:
a) 포유동물 세포의 유전체의 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 포유동물 세포를 제공하는 단계로서, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 표지자에 측접하는 제1 및 제2 재조합 인식 서열, 및 상기 제1 및 제2 재조합 인식 서열 사이에 위치한 제3 재조합 인식 서열을 포함하고, 모든 재조합 인식 서열은 상이한, 단계;
b) 3개의 상이한 재조합 인식 서열 및 4개의 발현 카세트를 포함하는 2개의 데옥시리보핵산의 조성물을 a)에서 제공된 세포 내로 도입하는 단계로서,
- 제1 데옥시리보핵산은 5' 에서 3' 방향으로,
(1)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 복제를 포함하거나,
또는 (2)
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 복제를 포함하고,
그리고
- 제2 데옥시리보핵산은 5'에서 3' 방향으로,
(1)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 복제,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열을 포함하거나,
또는 (2)
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 복제,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열을 포함하며,
선택적으로 상기 제1 또는 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제1 또는 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 상응하는 도메인 교환된 중쇄이고,
선택적으로 (1)의 경우 또는 (1) 및 (2)의 경우 상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함하거나, 또는 그 반대의 경우도 마찬가지인데,
상기 제1 및 제2 데옥시리보핵산의 제1 내지 제3 재조합 인식 서열은 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상의 제1 내지 제3 재조합 인식 서열과 일치하고,
하나의 제2 선택 표지자를 부호화하는 발현 카세트의 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 취합될 때 하나의 제2 선택 표지자의 기능적 발현 카세트를 형성하는 단계;
c) 하나 이상의 재조합 효소를,
i) b)의 제1 및 제2 데옥시리보핵산과 동시에,
또는
ii) 순차적으로 그 이후에
도입하는 단계로서,
상기 하나 이상의 재조합 효소는 상기 제1 및 제2 데옥시리보핵산의 재조합 인식 서열들을 인식하는; (그리고 선택적으로 상기 하나 이상의 재조합 효소는 재조합 효소 매개 카세트 교환을 2회를 실시하는;) 단계;
및
d) 상기 제 2 선택 표지자를 발현하고 상기 2가 이중특이성 항체를 분비하는 세포들을 선택하는 단계;를 포함함으로써,
상기 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산을 포함하고 상기 2가 이중특이성 항체를 분비하는 재조합 포유동물 세포를 생성하는, 방법이다.
일 구현예에서, 상기 제1 및 제2 데옥시리보핵산 둘 모두는 (1)에 따른 조직을 포함하거나; 또는 상기 제1 및 제2 데옥시리보핵산 둘 모두는 (2)에 따른 조직을 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 상응하는 도메인 교환된 중쇄이다.
바람직한 일 구현예에서, (1)의 경우 또는 (1) 및 (2)의 경우 상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 상응하는 도메인 교환된 중쇄이고,
그리고
상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함한다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산의 정확한 일 복제는 표적화된 통합에 의해 포유동물 세포의 유전체에서 단일 유전자좌 내로 안정적으로 통합된다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산의 정확한 일 복제는 단일 또는 이중 재조합 효소 매개 카세트 교환 반응에 의해 포유동물 세포의 유전체에서 단일 유전자좌 내로 안정적으로 통합된다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함하거나, 또는 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 중쇄 중 하나는 돌연변이 S354C를 추가로 포함하고 각각의 다른 중쇄는 돌연변이 Y349C를 포함한다(카바타에 따른 넘버링).
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 제1 중쇄는 추가적인 도메인 교환 Fab 단편을 포함하는 연장된 중쇄이다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 제1 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제1 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 중쇄이다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 중쇄이다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, (1)의 경우 또는 (1) 및 (2)의 경우 상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함하거나, 또는 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 제1 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제1 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 중쇄이고, (1)의 경우 또는 (1) 및 (2)의 경우 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함한다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 제2 경쇄는 VH-CL(VH-VL 도메인 교환) 또는 VL-CH1(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 경쇄이고 각각의 제2 중쇄는 VL-CH1-CH2-CH3(VH-VL 도메인 교환) 또는 VH-CL-CH2-CH3(CH1-CL 도메인 교환)을 포함하는 도메인 교환된 중쇄이고, (1)의 경우 또는 (1) 및 (2)의 경우 상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함한다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서,
- 제1 중쇄는 N 말단에서 C 말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제2 중쇄는 N 말단에서 C 말단으로 제1 경쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제1 경쇄는 N 말단에서 C 말단으로 제2 중쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고, 그리고
- 제2 경쇄는 N 말단에서 C 말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하며,
상기 제1 중쇄 가변 도메인 및 상기 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고, 상기 제2 중쇄 가변 도메인 및 상기 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서,
- 제1 중쇄는 N 말단에서 C 말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제2 중쇄는 N 에서 C 말단으로 제2 중쇄 가변 도메인, CL 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 제1 경쇄는 N 말단에서 C 말단으로 제1 경쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고, 그리고
- 제2 경쇄는 N 말단에서 C 말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하며,
상기 제1 중쇄 가변 도메인 및 상기 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고, 상기 제2 중쇄 가변 도메인 및 상기 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성한다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 데옥시리보핵산의 정확한 일 복제는 단일 부위 또는 유전자좌에서 포유동물 세포의 유전체 내로 안정적으로 통합된다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산은 선택 표지자에 대해 부호화하는 추가의 발현 카세트를 포함한다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 선택 표지자에 대해 부호화하는 발현 카세트는 제3 재조합 인식 서열에 대해 부분적으로 5' 및 부분적으로 3'에 위치하며, 상기 발현 카세트의 5' 위치 부분은 프로모터 및 시작 코돈을 포함하고, 상기 발현 카세트의 3' 위치 부분은 시작 코돈 및 폴리A 신호가 없는 부호화 서열을 포함하며, 상기 시작 코돈은 부호화 서열에 작동 가능하게 연결된다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 선택 표지자를 부호화하는 발현 카세트의 5' 위치 부분은 시작 코돈에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고, 이로써 상기 프로모터 서열은 제2 발현 카세트에 의해 상류에 측접되고, 상기 시작 코돈은 제3 재조합 인식 서열에 의해 하류에 측접하며; 상기 선택 표지자를 부호화하는 발현 카세트의 3' 위치 부분은 시작 코돈이 결여된 선택 표지자를 부호화하는 핵산을 포함하고, 상기 제3 재조합 인식 서열에 의한 상류 및 상기 제3 발현 카세트에 의한 하류에 측접되며, 상기 시작 코돈은 부호화 서열에 작동 가능하게 연결된다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서,
항체 사슬에 대한 각각의 발현 카세트는 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 항체 사슬을 부호화하는 핵산, 및 폴리아데닐화 신호 서열 및 선택적으로 종결자 서열을 포함하고,
그리고
선택 표지자를 부호화하는 각각의 발현 카세트는 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 상기 선택 표지자를 부호화하는 핵산, 및 폴리아데닐화 신호 서열 및 선택적으로 종결자 서열을 포함한다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 프로모터는 인트론 A를 갖는 인간 CMV 프로모터이고, 상기 폴리아데닐화 신호 서열은 bGH 폴리아데닐화 신호 서열이고, 상기 종결자는 선택 표지자의 발현 카세트를 제외하고는 hGT 종결자이며, 여기서 상기 프로모터는 SV40 프로모터이고 상기 폴리아데닐화 신호 서열은 SV40 폴리아데닐화 신호 서열이며 종결자 서열은 존재하지 않는다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 포유동물 세포는 CHO 세포이다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 모든 카세트는 단방향으로 배열된다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 선택 표지자에 대해 부호화하는 발현 카세트는 제3 재조합 인식 서열에 대해 부분적으로 5' 및 부분적으로 3'에 위치하며, 상기 발현 카세트의 5' 위치 부분은 프로모터 및 시작 코돈을 포함하고, 상기 발현 카세트의 3' 위치 부분은 시작 코돈 및 폴리A 신호가 없는 부호화 서열을 포함한다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 선택 표지자를 부호화하는 발현 카세트의 5' 위치 부분은 시작 코돈에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고, 이로써 상기 프로모터 서열은 제2 발현 카세트에 의해 상류에 측접(즉, 하류에 위치)되고, 상기 시작 코돈은 제3 재조합 인식 서열에 의해 하류에 측접(즉, 상류에 위치)하며; 상기 선택 표지자를 부호화하는 발현 카세트의 3' 위치 부분은 시작 코돈이 결여된 선택 표지자를 부호화하는 핵산을 포함하고, 상기 제3 재조합 인식 서열에 의한 상류 및 상기 제3 발현 카세트에 의한 하류에 측접된다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 시작 코돈은 번역 시작 코돈이다. 일 구현예에서, 상기 시작 코돈은 ATG이다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 제1 데옥시리보핵산은 제1 벡터 내로 통합되고 상기 제2 데옥시리보핵산은 제2 벡터 내로 통합된다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 발현 카세트 각각은 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 부호화 서열, 및 폴리아데닐화 신호 서열, 및 선택적으로 후속되는 종결자 서열을 포함하며, 이들은 모두 서로 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 포유동물 세포는 CHO 세포이다. 일 구현예에서, 상기 CHO 세포는 CHO-K1 세포이다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 재조합 효소 인식 서열은 L3, 2L 및 LoxFas이다. 일 구현예에서, L3은 서열번호 01의 서열을 갖고, 2L3은 서열번호 02의 서열을 가지며, LoxFas는 서열번호 03의 서열은 갖는다. 일 구현예에서, 제1 재조합 효소 인식 서열은 L3이고, 제2 재조합효소 인식 서열은 2L이며, 제3 재조합효소 인식 서열은 LoxFas이다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 프로모터는 인트론 A를 갖는 인간 CMV 프로모터이고, 상기 폴리아데닐화 신호 서열은 bGH 폴리A 부위이고, 상기 종결자 서열은 hGT 종결자이다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 프로모터는 인트론 A를 갖는 인간 CMV 프로모터이고, 상기 폴리아데닐화 신호 서열은 bGH 폴리A 부위이고, 상기 종결자 서열은 상기 선택 표지자들)의 발현 카세트(들)를 제외한 hGT 종결자이며, 여기서 상기 프로모터는 SV40 프로모터이고 상기 폴리아데닐화 신호 서열은 SV40 폴리A 부위이며, 종결자 서열은 존재하지 않는다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 인간 CMV 프로모터는 서열번호 04의 서열은 갖는다. 일 구현예에서, 상기 인간 CMV 프로모터는 서열번호 06의 서열은 갖는다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 bGH 폴리아데닐화 신호 서열은 서열번호 08의 서열은 갖는다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 hGT 종결자는 서열번호 09의 서열은 갖는다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 SV40 프로모터는 서열번호 10의 서열은 갖는다.
본 발명의 모든 독립된 양태 및 모든 종속적 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 SV40 폴리아데닐화 신호 서열은 서열번호 07의 서열은 갖는다.
본 발명에 따른 모든 양태 및 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 2가 이중특이성 항체는 항 ANG2/VEGF 이중특이성 항체이다. 일 구현예에서, 상기 이중특이적 항 ANG2/VEGF 항체는 RG7221 또는 바누시주맙이다.
본 발명에 따른 모든 양태 및 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 2가 이중특이성 항체는 항 ANG2/VEGF 이중특이성 항체이다. 일 구현예에서, 상기 이중특이적 항 ANG2/VEGF 항체는 RG7716 또는 파리시맙이다.
상기 ANG2/VEGF 이중특이성 항체는 WO 2010/040508, WO 2011/117329, WO 2014/009465에 보고되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 원용된다.
본 발명에 따른 모든 양태 및 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 2가 이중특이성 항체는 항 PD1/TIM3 이중특이성 항체이다. 상기 항체는 WO 2017/055404에 보고되며, 이는 그 전체가 본원에 원용된다.
본 발명에 따른 모든 양태 및 구현예들 중 일 구현예에서, 상기 2가 이중특이성 항체는 항 PD1/Lag3 이중특이성 항체이다. 상기 항체는 WO 2018/185043에 보고되며, 이는 그 전체가 본원에 원용된다.
II.b 재조합효소 매개 카세트 교환(RMCE)
표적화된 통합은 외인성 뉴클레오티드 서열이 포유동물 세포 유전체의 소정의 부위에 통합될 수 있게 한다. 특정 구현예들에서, 표적화된 통합은 하나 이상의 재조합 인식 서열(RRS)을 인식하는 재조합효소에 의해 매개된다. 특정 구현예들에서, 표적화 통합은 동종 재조합에 의해 매개된다.
"재조합 인식 서열"(RRS)은 재조합효소에 의해 인식되는 뉴클레오티드 서열이며 재조합효소-매개 재조합 발생에 필요충분하다. RRS를 사용하여 뉴클레오티드 서열에서 재조합 발생이 일어날 위치를 정의할 수 있다.
특정 구현예들에서, RRS는 LoxP 서열, LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, Lox66 서열, FRT 서열, Bxb1 attP 서열, Bxb1 attB 서열, φC31 attP 서열, 및 φC31 attB 서열로 이루어진 군에서 선택된다. 여러 RRS를 선택해야 하는 경우, 동일하지 않은 RRS가 선택되는 한, 각 서열들의 선택은 다른 서열에 따라 달라진다.
특정 구현예들에서, RRS는 Cre 재조합 효소에 의해 인식될 수 있다. 특정 구현예들에서, RRS는 FLP 재조합 효소에 의해 인식될 수 있다. 특정 구현예들에서, RRS는 Bxb1 통합 효소에 의해 인식될 수 있다. 특정 구현예들에서, RRS는 φC31 통합 효소에 의해 인식될 수 있다.
특정 구현예들에서, RRS가 LoxP 부위인 경우 세포는 재조합을 실시하기 위해 Cre 재조합 효소를 필요로 한다. 특정 구현예들에서, RRS가 FRT 부위인 경우 세포는 재조합을 실시하기 위해 FLP 재조합 효소를 필요로 한다. 특정 구현예들에서, RRS가 Bxb1 attP 또는 Bxb1 attB 부위인 경우 세포는 재조합을 실시하기 위해 Bxb1 통합효소를 필요로 한다. 특정 구현예들에서 RRS가 φC31 attP 또는 φC31attB 부위인 경우 세포는 재조합을 실시기 위해 φC31 통합 효소를 필요로 한다. 재조합효소들은 효소의 부호화 서열을 포함하는 발현 벡터를 사용하여 세포로 도입될 수 있다.
Cre-LoxP 부위 특이적 재조합 시스템은 많은 생물학적 실험 시스템에서 널리 사용되어 왔다. Cre는 34bp LoxP 서열들을 인식하는 38-k0Da의 부위 특이적 DNA 재조합 효소이다. Cre는 박테리오파지 P1에서 파생되며 티로신 패밀리 부위 특이적 재조합효소에 속한다. Cre 재조합효소는 LoxP 서열들 사이의 분자내 및 분자간 재조합을 매개할 수 있다. LoxP 서열은 2개의 13bp 역상 반복부가 측접되어 있는 8bp 비회문식 코어 영역으로 구성된다. Cre 재조합효소는 13bp 반복부에 결합함으로써, 8bp 코어 영역 내부에서 재조합을 매개한다. Cre-LoxP 매개 재조합은 고효율로 발생하며 임의의 다른 숙주 인자들을 필요로 하지 않는다. 2개의 LoxP 서열들이 동일한 뉴클레오티드 서열상에 동일한 방향으로 배치되는 경우, Cre 매개 재조합은 이러한 2개 LoxP 서열들 사이에 위치한 DNA 서열들을 공유결합상 폐쇄 원형으로서 절제할 것이다. 2개의 LoxP 서열들이 동일한 뉴클레오티드 서열 상의 역상 위치에 배치되는 경우, Cre 매개 재조합은 2개 서열들 사이에 위치한 DNA 서열들의 방향을 반전시킨다. 2개의 LoxP 서열들이 2개의 상이한 DNA 분자들 상에 존재하고 하나의 DNA 분자가 원형인 경우, Cre 매개 재조합은 원형 DNA 서열을 통합시킨다.
특정 구현예들에서, LoxP 서열은 야생형 LoxP 서열이다. 특정 구현예들에서, LoxP 서열은 돌연변이 LoxP 서열이다. Cre 매개 통합 또는 대체의 효율성을 증가시키기 위한 돌연변이 LoxP 서열들이 개발되었다. 특정 구현예들에서, 돌연변이 LoxP 서열은 LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, 및 Lox66 서열로 이루어진 군에서 선택된다. 예를 들어, Lox71 서열은 왼쪽 13bp 반복부에 5bp 돌연변이를 가진다. Lox66 서열은 오른쪽 13bp 반복부에 5bp 돌연변이를 가진다. 야생형 및 돌연변이 LoxP 서열들은 모두 Cre-의존성 재조합을 매개할 수 있다.
용어 "매칭 RRS"는 두 RRS간에 재조합이 발생함을 나타낸다. 특정 구현예들에서, 2개의 매칭 RRS는 동일하다. 특정 구현예들에서, 두 RRS 모두는 야생형 LoxP 서열들이다. 특정 구현예들에서, 두 RRS 모두는 돌연변이체 LoxP 서열들이다. 특정 구현예들에서, 두 RRS 모두는 야생형 FRT 서열들이다. 특정 구현예들에서, 두 RRS 모두는 돌연변이 FRT 서열들이다. 특정 구현예들에서, 2개의 매칭 RRS는 상이한 서열들이지만 동일한 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정 구현예들에서, 제1 매칭 RRS는 Bxb1 attP 서열이고 제2 매칭 RRS는 Bxb1 attB 서열이다. 특정 구현예들에서, 제1 매칭 RRS는 φC31 attP 서열이고 제2 매칭 RRS는 φC31 attB 서열이다.
II.c TI에 적합한 예시적인 포유동물 세포
상기 기재된 바와 같은 외인성 핵산("랜딩 부위")을 포함하는 TI에 적합한 어떠한 공지된 또는 공지될 포유동물 세포가 본 발명에서 사용될 수 있다.
본 발명은 이전 표제에 따른 외인성 핵산(랜딩 부위)을 포함하는 CHO 세포로 예시된다. 이는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며 어떤 식으로든 제한으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 진정한 범위는 청구범위에 제시되어 있다.
바람직일 일 구현예에서, 포유동물 세포의 유전체 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 세포는 CHO 세포이다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 유전체의 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 예시적인 포유동물 세포는, Cre 재조합 효소 매개 DNA 재조합을 위한 3개의 이종특이적 loxP 부위를 포함하는 랜딩 부위(= 포유동물 세포의 유전체 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열)를 보유하는 CHO 세포이다. 상기 이종특이적 loxP 부위는 L3, LoxFas 및 2L이고(예컨대, Lanza et al., Biotechnol. J. 7 (2012) 898-908; Wong et al., Nucleic Acids Res. 33 (2005) e147), 이로써 상기 L3 및 2L은 각각 5' 말단 및 3' 말단에서 착륙 지점의 측접하고 상기 LoxFas는 L3 및 2L 부위 사이에 위치한다. 랜딩 부위는 IRES를 통한 선택 표지자의 발현을 형광 GFP 단백질의 발현과 연결하는 바이시스트론 단위를 추가로 포함하여, 양성 선택에 의한 랜딩 부위를 안정화할 수 있을 뿐만 아니라 형질감염 및 Cre 재조합(음성 선택) 후 상기 부위의 부재에 대해 선택할 수 있다. 녹색 형광 단백질(GFP)은 RMCE 반응을 모니터링하는 역할을 한다. 예시적인 GEP는 서열번호 11의 서열은 갖는다.
이전 단락에서 개괄된 랜딩 부위의 이러한 구성을 통해, L3 및 LoxFas 부위를 갖는 소위 전방 벡터와 LoxFas 및 2L 부위를 포함하는 후방 벡터의 두 벡터의 동시적인 통합이 가능하다. 랜딩 부위에 존재하는 것과 상이한 선택 표지자 유전자의 기능적 요소들은 두 벡터 사이에 분포되어 있다: 프로모터와 시작 코돈은 전방 벡터에 위치하는 반면 부호화 영역과 폴리 A 신호는 후방 벡터에 위치한다. 두 벡터로부터의 상기 핵산의 정확한 Cre-매개 통합만이 각각의 선택제에 대한 내성을 유도한다.
일반적으로, TI에 적합한 포유동물 세포는 포유동물 세포의 유전체 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 세포이고, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 표지자에 측접하는 적어도 제1 및 제2 재조합 인식 서열, 및 상기 제1 및 제2 재조합 인식 서열 사이에 위치하는 제3 재조합 인식 서열을 포함하고, 상기 모든 재조합 인식 서열은 상이하다. 상기 외인성 뉴클레오타이드 서열을 "랜딩 부위"라고 한다.
현재 개시된 발명의 요지는 외인성 뉴클레오티드 서열의 TI에 적합한 포유동물 세포를 사용한다. 특정 구현예들에서, TI에 적합한 포유동물 세포는 포유동물 세포의 유전체의 통합 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. TI에 적합한 이러한 포유동물 세포는 TI 숙주 세포를 의미할 수도 있다.
특정 구현예들에서, TI에 적합한 포유동물 세포는 랜딩 부위를 포함하는 햄스터 세포, 인간 세포, 랫트 세포, 또는 마우스 세포이다. 특정 구현예들에서, TI에 적합한 포유동물 세포는 랜딩 부위를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, CHO K1 세포, CHO K1SV 세포, CHO DG44 세포, CHO DUKXB-11 세포, CHO K1S 세포, 또는 CHO K1M 세포이다.
특정 구현예들에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 2개의 RRS를 포함한다. 특정 구현예들에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 2개의 RRS를 포함한다. RRS는 재조합 효소, 예를 들어, Cre 재조합 효소, FLP 재조합 효소, Bxb1 통합 효소, 또는 φC31 통합 효소에 의해 인식될 수 있다. RRS는 LoxP 서열, LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, Lox66 서열, FRT 서열, Bxb1 attP 서열, Bxb1 attB 서열, φC31 attP 서열, 및 φC31 attB 서열로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다.
특정 구현예들에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 제1, 제2 및 제3 RRS, 그리고 제1 및 제2 RRS 사이에 위치한 적어도 하나의 선택 표지자를 포함하고, 제3 RRS는 제1 또는 제2 RRS와 상이하다 특정 구현예들에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 제2 선택 표지자를 추가로 포함하며, 제1 및 제2 선택 표지자는 상이하다. 특정 구현예들에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 제3 선택 표지자 및 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 IRES는 제3 선택 표지자에 작동가능하게 연결된다. 제3 선택 표지자는 제1 또는 제2 선택 표지자와 상이할 수 있다.
선택 표지자들은 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제(APH) (예컨대, 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제(HYG), 네오마이신 및 G418 APH), 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티딘올 탈수소효소(히스티딘올 D) 및 퓨로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 및 마이코페놀산에 대한 내성을 부호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 선택 표지자(들)는 녹색 형광 단백질(GFP), 강화 GFP(eGFP), 합성 GFP, 황색 형광 단백질(YFP), 강화 YFP(eYFP), 시안 형광 단백질(CFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-red, DsRed-단량체, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald6, CyPet, mCFPm, Cerulean 및 T-Sapphire으로 구성된 군에서 선택되는 형광 단백질일 수도 있다.
특정 구현예들에서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 제1, 제2 및 제3 RRS, 및 제1 및 제3 RRS 사이에 위치한 적어도 하나의 선택 표지자를 포함한다.
외인성 뉴클레오티드 서열은 특정 세포에서 유래하지 않지만 DNA 전달 방법, 예를 들어 형질감염, 전기천공 또는 형질전환 방법에 의해 상기 세포 내로 도입될 수 있는 뉴클레오티드 서열이다. 특정 구현예들에서, TI에 적합한 포유동물 세포는 포유동물 세포의 유전체에서 하나 이상의 통합 부위에 통합된 적어도 하나의 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예들에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 포유동물 유전체의 특정 유전자좌 내부의 하나 이상의 통합 부위에 통합된다.
특정 구현예들에서, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 재조합 인식 서열 (RRS)을 포함하며, 여기서 RRS는 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정 구현예들에서, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 2개의 RRS를 포함한다. 특정 구현예들에서, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 3개의 RRS를 포함하고, 여기서 제3 RRS는 제1 및 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정 구현예들에서, 제1 및 제2 RRS는 동일하고 제3 RRS는 제1 또는 제2 RRS와 상이하다. 특정 바람직한 구현예에서, 3개의 RRS는 모두 상이하다. 특정 구현예들에서, RRS는 LoxP 서열, LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, Lox66 서열, FRT 서열, Bxb1 attP 서열, Bxb1 attB 서열, φC31 attP 서열, φC31 attB 서열로 이루어진 군에서 서로 독립적으로 선택된다.
특정 구현예들에서, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 선택 표지자를 포함한다. 특정 구현예들에서, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 제1, 제2 및 제3 RRS, 및 적어도 하나의 선택 표지자를 포함한다. 특정 구현예들에서, 선택 표지자는 제1 및 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정 구현예들에서, 2개의 RRS들에는 적어도 하나의 선택 표지자가 측접된다, 즉, 제1 RRS는 선택 표지자의 5' 상류에 위치하고 제2 RRS는 3' 하류에 위치한다. 특정 구현예들에서, 제1 RRS는 선택 표지자의 5' 말단에 인접하고 제2 RRS는 선택 표지자의 3' 말단에 인접한다.
특정 구현예들에서, 선택 표지자는 제1 및 제2 RRS 사이에 위치하며 이들 2개의 측접 RRS들은 상이하다. 특정 구현예들에서, 제1 측접 RRS는 LoxP L3 서열이고 제2 측접 RRS는 LoxP 2L 서열이다. 특정 구현예들에서, LoxP L3 서열은 선택 표지자의 5'에 위치하고 LoxP 2L 서열은 선택 표지자의 3'에 위치한다. 특정 구현예들에서, 제1 측접 RRS는 야생형 FRT 서열이고 제2 측접 RRS는 돌연변이체 FRT 서열이다. 특정 구현예들에서, 제1 측접 RRS는 Bxb1 attP 서열이고 제2 측접 RRS는 Bxb1 attB 서열이다. 특정 구현예들에서, 제1 측접 RRS는 φC31 attP 서열이고 제2 측접 RRS는 φC31 attB 서열이다. 특정 구현예들에서, 2개의 RRS는 동일한 방향으로 배치된다. 특정 구현예들에서, 2개의 RRS는 모두 정 또는 역방향으로 존재한다. 특정 구현예들에서, 2개의 RRS는 반대 방향으로 배치된다.
특정 구현예들에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 2개의 RRS가 측접된 제1 및 제2 선택 표지자를 포함하고, 여기서 제1 선택 표지자는 제2 선택 표지자와 상이하다. 특정 구현예들에서, 2개의 선택 표지자들은 모두 글루타민 합성효소 선택 표지자, 티미딘 키나제 선택 표지자, HYG 선택 표지자, 및 퓨로마이신 내성 선택 표지자로 구성된 그룹에서 선택된다. 특정 구현예들에서, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 티미딘 키나제 선택 표지자 및 HYG 선택 표지자를 포함한다. 특정 구현예들에서, 제1 선택 표지자는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제(APH) (예컨대, 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HYG), 네오마이신 및 G418 APH), 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티디놀 탈수소효소(히스티디놀 D)에 대한 유전자 및 퓨로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 및 마이코페놀산에 대한 내성을 부호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 특정 구현예들에서, 제1 선택 표지자는 글루타민 합성효소 선택 표지자이고 제2 선택 표지자는 GFP 표지자이다. 특정 구현예들에서, 두 선택 표지자 모두가 측접되는 2개의 RRS는 상이하다.
특정 구현예들에서, 선택 표지자는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 특정 구현예들에서, 선택 표지자는 SV40 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 특정 구현예들에서, 선택 표지자는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
특정 구현예들에서, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 3개의 RRS를 포함한다. 특정 구현예들에서, 제3 RRS는 제1 및 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정 구현예들에서, 제1 및 제2 RRS는 동일하고 제3 RRS는 제1 또는 제2 RRS와 상이하다. 특정 바람직한 구현예에서, 3개의 RRS는 모두 상이하다.
II.d 본 발명을 실시하기에 적합한 벡터 예시
상기 개괄한 "단일 벡터 RMCE" 이외에도 신규한 "2-벡터 RMCE"를 실시하여 두 핵산의 동시표적화 통합을 실시할 수 있다.
"2-벡터 RMCE" 전략은 본 발명에 따른 벡터 조합을 사용하여 본 발명에 따른 방법에서 사용된다. 예를 들어, 제한이 아니라, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 3개의 RRS를, 예컨대, 제3 RRS (“RRS3”)가 제1 RRS (“RRS1”) 및 제2 RRS (“RRS2”) 사이에 존재하는 배열로 포함할 수 있으며, 동시에 제1 벡터는 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열 상의 제1 및 제3 RRS에 매칭되는 2개의 RRS를 포함하고, 제2 벡터는 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열 상의 제3 및 제2 RRS에 매칭되는 2개의 RRS를 포함한다. 2 벡터 RMCE 전략의 한 예가 도 1에 도시되어 있다. 이러한 2개의 벡터 RMCE 전략을 통해, TI에 적합한 포유동물 세포의 유전체 내의 TI 이후에 본 발명에 따른 발현 카세트 조직이 수득할 수 있도록 RRS의 각 쌍 사이의 각각의 서열에서 적절한 수의 SOI를 통합함으로써 다중 SOI의 도입이 가능하다.
2-플라스미드 RMCE 전략은 3개의 RRS 부위를 사용하여 2회의 독립 RMCE를 동시에 실시하는 것을 포함한다(도 1). 따라서 2-플라스미드 RMCE 전략을 사용하는 TI에 적합한 포유동물 세포의 랜딩 부위에는 제1 RRS 부위(RRS1) 또는 제2 RRS 부위(RRS2)와 교차 활성이 없는 제3 RRS 부위(RRS3)를 포함한다. 표적화되는 2개의 발현 플라스미드는 효율적인 표적화를 위해 동일한 측접 RRS 부위들을 필요로 하는데, 하나의 발현 플라스미드(전방)는 RRS1 및 RRS3가 측접되고 다른 하나(후방)는 RRS3 및 RRS2가 측접된다. 또한, 2-플라스미드 RMCE에는 2개의 선택 표지자들이 필요하다. 1개의 선택 표지자 발현 카세트를 2 부분으로 나누었다. 전방 플라스미드는 프로모터 및 이에 이어 시작 코돈 및 RRS3 서열을 포함한다. 후방 플라스미드는 시작 코돈(ATG)을 뺀 선택 표지자 부호화 영역의 N 말단에 융합된 RRS3 서열을 가질 수 있다. 추가적인 뉴클레오티드는 융합 단백질, 즉 작동 가능한 연결에 대한 프레임 내 번역을 보장하기 위해 RRS3 부위와 선택 표지자 서열 사이에 삽입될 필요가 있을 수 있다. 두 플라스미드가 모두 정확하게 삽입된 경우에만 선택 표지자의 전체 발현 카세트가 조립되어, 세포가 각 선택제에 내성을 갖게 된다. 도 1는 2-플라스미드 RMCE 전략을 보여주는 개략도이다.
단일 벡터 및 2-벡터 RMCE 모두를 통해, 기증자 DNA에 존재하는 DNA 서열을 통합 부위 있는 포유동물 세포의 유전체의 DNA 서열과 정확하게 교환하여 포유동물 세포 유전체의 소정의 부위에 하나 이상의 기증자 DNA 분자를 단방향 통합할 수 있게 된다. 이들 DNA 서열은 i) 적어도 하나의 선택 표지자 또는 특정 2-벡터 RMCE에서 "분할 선택 표지자" 및/또는 ii) 적어도 하나의 외인성 SOI에 측접한 2개의 이종특이적 RRS에 의해 특징된다.
RMCE는 표적 유전체 유전자좌 내부의 2개의 이종특이적 RRS와 공여체 DNA 분자 사이에 재조합효소에 의해 촉매되는 이중 재조합 교차 이벤트들을 포함한다. RMCE는 전방 및 후방 벡터로부터의 DNA 서열 복제를 포유동물 세포 유전체의 소정의 유전자좌로 조합하여 도입하도록 설계된다. 교차 발생을 단 하나만 포함하는 재조합과 달리, RMCE는 원핵 벡터 서열이 포유동물 세포의 유전체 내로 도입되지 않도록 실시되어 원치 않는 숙주 면역 또는 방어 기제의 촉발을 감소 및/또는 방지할 수 있다. RMCE 절차는 다중 DNA 서열로 반복될 수 있다.
표적화된 통합은 2개의 RMCE에 의해 달성되며, 여기서 이종다량체 폴리펩티드의 일부 및/또는 2개의 이종특이적 RRS가 측접된 적어도 하나의 선택 표지자 또는 그 일부를 부호화하는 적어도 하나의 발현 카세트를 각각 포함하는 2개의 상이한 DNA 서열 모두가 TI에 적합한 포유동물 세포 유전체의 소정의 부위로 통합된다. 특정 구현예들에서, 표적화된 통합은 다수의 RMCE에 의해 달성되며, 여기서 이종다량체 폴리펩티드의 일부 및/또는 2개의 이종특이적 RRS가 측접된 적어도 하나의 선택 표지자 또는 그 일부를 부호화하는 적어도 하나의 발현 카세트를 각각 포함하는, 다수의 벡터로부터의 DNA 서열 모두가 TI에 적합한 포유동물 세포 유전체의 소정의 부위로 통합된다. 특정 구현예들에서, 선택 표지자는 이중 RMCE에 의한 둘 모두의 정확한 통합만이 선택 표지자의 발현을 허용하도록 제1 벡터 상에서 부분적으로 부호화되고 제2 벡터 상에서 부분적으로 부호화될 수 있다. 이러한 시스템의 한 예가 도 1에 제시된다.
특정 구현예들에서, 재조합 효소 매개 재조합을 통한 표적화된 통합은 원핵 벡터로부터의 서열이 없는 숙주 세포 유전체의 하나 이상의 소정의 통합 부위 내에 통합된 다량체 폴리펩티드에 대한 선택 표지자 및/또는 상이한 발현 카세트를 유도한다.
묘사되고 청구된 다양한 구현예에 더하여, 개시된 요지는 본원에서 개시되고 또한 청구된 특징의 다른 조합을 갖는 다른 구현예에 관한 것이다. 따라서, 본원에서 제시된 특정 특징은 개시된 요지가 본원에서 개시된 특징의 임의의 적합한 조합을 포함하도록, 개시된 요지의 범위 내에서 다른 방식으로 서로 조합될 수 있다. 개시된 요지의 특정한 구현예에 관한 전술한 설명은 예시 및 설명의 목적으로 제시되었다. 이것은 완전하거나 또는 개시된 요지를 개시된 구현예로만 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
다양한 변형과 변이가 개시된 요지의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서, 개시된 요지의 조성물과 방법에서 만들어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 개시된 요지는 첨부된 청구항의 범위 안에 있는 변형과 변이 및 이들의 등가물을 포함하는 것으로 의도된다.
다양한 간행물, 특허 및 특허 출원이 본원에서 인용되는데, 이의 내용은 그 전체가 본원에 원용된다.
다음의 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 그 진정한 범위는 첨부된 청구범위에 제시되어 있다.
서열의 설명
서열번호 01: L3 재조합 효소 인식 서열의 예시적인 서열
서열번호 02: 2L 재조합 효소 인식 서열의 예시적인 서열
서열번호 03: LoxFas 재조합효소 인식 서열의 예시적인 서열
서열번호 04-06: 인간 CMV 프로모터의 예시적인 변이체
서열번호 07: 예시적인 SV40 폴리아데닐화 신호 서열
서열번호 08: 예시적인 bGH 폴리아데닐화 신호 서열
서열번호 09: 예시적인 hGT 종결자 서열
서열번호 10: 예시적인 SV40 프로모터 서열
서열번호 11: 예시적인 GFP 핵산 서열
실시예
실시예 1
일반적인 기술
1) 재조합 DNA 기술
DNA를 조작하기 위해, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, (1989)에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하였다. 분자 생물학적 시약들은 제조업체의 지침에 따라 사용되었다.
2) DNA 서열 결정
DNA 서열분석은 세퀴서브(SequiServe) GmbH(독일 바터스테튼 소재)에서 실시하였다.
3) DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
서열 생성, 매핑, 분석, 주석 및 예시를 위해 유럽 분자생물학 개방형 소프트웨어(European Molecular Biology Open Software Suite, EMBOSS) 소프트웨어 패키지와 및 인비트로겐(Invitrogen)의 벡터(Vector) NTI 버전 11.5를 사용하였다.
4) 유전자 및 올리고뉴클레오티드 합성
제네아트(Geneart) GmbH(독일 레겐스부르크 소재)에서 화학 합성에 의해 원하는 유전자 단편을 제조하였다. 합성된 유전자 단편은 증식/증폭을 위해 대장균 플라스미드 내로 클로닝되었다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 대안적으로, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 어닐링하거나 PCR을 통해 짧은 합성 DNA 단편을 조립하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 메타비온(metabion) GmbH(독일 플라네그-마르틴세리(Planegg-Martinsried) 소재)에 의해 제조되었다.
5) 시약
다르게 명시되지 않는 한, 모든 상업용 화학 물질, 항체 및 키트는 제조업체의 프로토콜에 따라 제공된 대로 사용하였다.
6) TI 숙주 세포주의 배양
TI CHO 숙주 세포는 85% 습도 및 5% CO2의 가습 배양기에서 37°C에서 배양하였다. 상기 세포는 300 μg/ml 히그로마이신 B 및 4 μg/ml의 제2 선택 표지자를 포함하는 등록된 DMEM/F12 기반 배지에서 배양하였다. 상기 세포를 30 ml의 총 부피에서 0.3x10E6 세포/ml의 농도로 3일 또는 4일마다 분할하였다. 배양을 위해 125 ml의 비배플 삼각 플라스크를 사용하였다. 세포를 5 cm의 진탕 진폭으로 150 rpm에서 진탕시켰다. 세포 수는 세덱스(Cedex HiRes) 세포 계수기로 측정하였다. 세포는 60일이 될 때까지 배양 상태로 유지하였다.
7) 클로닝
일반
R 부위를 사용한 클로닝은 이어지는 단편에 있는 서열과 동일한 관심 유전자(GOI) 옆의 DNA 서열에 따라 달라진다. 이처럼, 단편의 조립은 동일한 서열의 중첩 및 DNA 리가아제에 의해 조립된 DNA의 틈이 연속적으로 봉인됨으로써 가능하다. 따라서, 단일 유전자, 특히 올바른 R 부위를 함유하는 특정 예비 벡터 내에서의 클로닝이 필요하다. 상기 예비 벡터의 성공적인 클로닝 후, R 부위에 측접된 관심 유전자는 상기 R 부위 바로 옆에서 절단되는 효소에 의한 제한 분해를 통해 절단한다. 마지막 단계는 모든 DNA 단편을 한 단계로 조립하는 것이다. 더 자세하게, 5'-핵산말단가수분해효소는 중첩된 영역(R 부위)의 5' 말단을 제거한다. 그 후, 상기 R 부위의 어닐링을 실시할 수 있고 DNA 중합효소가 3' 말단을 확장하여 서열의 간격을 채운다. 마지막으로, DNA 리가아제는 뉴클레오티드 사이의 틈을 밀봉한다. 핵산말단가수분해효소, DNA 중합효소 및 리가아제와 같은 다양한 효소를 포함하는 조립 마스터 혼합물을 첨가하고 50°C에서 반응 혼합물을 배양하면 단일 단편이 하나의 플라스미드로 조립된다. 그 후, 유능한 대장균 세포가 플라스미드로 형질전환된다.
일부 벡터의 경우, 제한 효소를 통한 클로닝 전략을 사용하였다. 적합한 제한 효소를 선택하여 원하는 관심 유전자를 잘라낸 후 결찰에 의해 다른 벡터 내로 삽입할 수 있다. 따라서, 다중 클로닝 부위(MCS)에서 절단하는 효소를 현명한 방식으로 사용하고 선택함으로써 단편을 정확한 배열로 결찰하는 것이 바람직하다. 만약 벡터 및 단편이 동일한 제한효소로 미리 잘려져 있다면, 단편 및 벡터의 끈적한 말단이 완벽하게 맞물린 후, DNA 리가아제에 의해 결찰될 수 있다. 결찰 후, 유능한 대장균 세포는 새로 생성된 플라스미드로 형질전환된다.
제한 분해를 통한 클로닝
제한 효소로 플라스미드를 분해하기 위해, 하기의 성분들을 얼음 위에서 함께 피펫팅하였다:
한 번의 분해에 더 많은 효소를 사용한 경우, 각 효소 1 μl를 사용하고 다소간의 PCR 등급의 물을 첨가하여 부피를 조정하였다. 모든 효소는 새로운 잉글랜드 바이오랩스(England Biolabs)의 컷스마트(CutSmart) 완충액(100% 활성)과 함께 사용하기에 적격이고 동일한 배양 온도(모두 37°C)를 갖는다는 전제 조건에서 선택하였다. 열 혼합기 또는 열 순환기를 사용하여 배양을 실시함으로써, 샘플을 일정한 온도(37°C)에서 배양하였다. 배양 중에는 샘플을 교반하지 않았다. 배양 시간은 60분으로 설정하였다. 그 후, 샘플을 로딩 염료와 직접 혼합하고 아가로스 전기영동 젤에 로딩하거나 추가 사용을 위해 4°C/얼음에서 보관하였다.
겔 전기영동을 위해 1% 아가로스 겔을 준비하였다. 따라서, 다목적 아가로스 1.5 g을 125 삼각 플라스크에 넣고 150 ml TAE 완충액으로 채웠다. 혼합물을 아가로스가 완전히 용해될 때까지 전자레인지에서 가열하였다. 0.5 μg/ml 브롬화 에티듐을 아가로스 용액에 첨가하였다. 그 후, 겔을 몰드에서 주조하였다. 아가로스가 세팅된 후, 몰드를 전기영동 챔버에 넣고 챔버를 TAE 완충제로 채웠다. 그 후, 샘플을 로딩하였다. 제1 주머니(왼쪽부터)에 적절한 DNA 분자량 표지자를 로딩한 후, 다음 샘플이 로딩하였다. 상기 겔은 <130 V에서 약 60분 동안 실행하였다. 전기영동 후 겔을 챔버에서 제거하고 UV 영상장치에서 분석하였다.
표적 밴드를 절단하고 1.5 ml 에덴도르프 튜브로 옮겼다. 겔 정제를 위해, 제조업체의 지침에 따라 키아겐(Qiagen)의 키아퀵(QIAquick) 겔 추출 키트를 사용하였다. DNA 단편은 다음 번 사용을 위해 -20°C에서 보관하였다.
결찰을 위한 단편은 삽입물과 벡터 단편의 길이 및 서로의 상관 관계에 따라 삽입물에 대한 벡터의 몰비를 1:2, 1:3 또는 1:5으로 하여 피펫팅하였다. 벡터 내로 삽입해야 하는 단편이 짧은 경우, 1:5 비율을 사용하였다. 삽입물이 길수록, 벡터와 상관관계에서 더 적은 양을 사용하였다. 각 결찰에 50 ng의 벡터를 사용하고 NE바이오계산기(NEBioCalculator)로 특정 양의 삽입물을 계산하였다. 결찰을 위해, NEB의 T4 DNA 결찰 키트를 사용하였다. 결찰 혼합물의 예는 하기의 표에 나타내었다:
DNA와 물의 혼합, 완충액의 첨가 및 최종적으로 효소의 첨가로 시작하여 모든 성분을 얼음 위에서 함께 피펫팅하였다. 반응물을 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 잠시 마이크로퓨징(microfuge)한 다음 실온에서 10분 동안 배양하였다. 배양 후, T4 리가아제를 65°C에서 10분 동안 열 불활성화시켰다. 샘플을 얼음 위에서 냉각시켰다. 최종 단계에서 10-베타 적격 대장균 세포를 결찰된 플라스미드 2 μl로 형질전환하였다(하기를 참조). R 부위 조립을 통한 클로닝
조립을 위해, 각 말단에 R 부위가 있는 모든 DNA 단편을 얼음 위에서 함께 피펫팅하였다. 4개 초과의 단편을 조립할 때 제조업체에서 권장하는 대로 모든 단편에 대해 등몰비(0.05 ng)를 사용하였다. 반응 혼합물의 절반은 NE빌더(Builder) HiFi DNA 조립 마스터 혼합물에 의해 구현하였다. 총 반응 부피는 40 μl였으며 PCR의 정제수로 채웠다. 하기의 표에는 예시적인 피펫팅 방법을 나타내었다.
반응 혼합물의 설정 후, 튜브를 60분 동안 지속적으로 50°C에서 열순환기에서 배양하였다. 성공적인 조립 후, 10-베타 적격 대장균 박테리아를 조립된 플라스미드 2 μl로 형질전환하였다(하기를 참조). 형질전환 10-베타 적격 대장균 세포
형질전환을 위해, 10-베타 적격 대장균 세포를 얼음 위에서 해동시켰다. 그 후, 2 μl의 플라스미드 DNA를 세포 현탁액에 직접 피펫으로 옮겼다. 튜브를 가볍게 치고 30분 동안 얼음 위에 두었다. 이후, 42°C로 따뜻하게 데워진 열 블록에 세포를 넣고 정확히 30초 동안 열 충격을 가했다. 바로 직후, 세포를 얼음 위에서 2분 동안 냉각시켰다. 950 ㎕의 NEB 10-베타 성장 배지를 세포 현탁액에 첨가하였다. 세포를 진탕하에 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 50-100 μl를 미리 데워진(37°C) LB-Amp 한천 플레이트에 피펫으로 옮기고 일회용 주걱으로 펼쳤다. 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하였다. 암피실린에 대한 내성 유전자를 가지고 있는 플라스미드를 성공적으로 통합한 박테리아만이 상기 플레이트에서 자랄 수 있다. 다음 날, 단일 군락을 선택하고 후속 플라스미드의 제조를 위해 LB-Amp 배지에서 배양하였다.
박테리아 배양
박테리아 배양은 Luria Bertani의 약자인 LB 배지에서 실시하였으며, 여기에 1 ml/L 100 mg/ml 암피실린을 첨가하여 0.1 mg/ml의 암피실린 농도를 생성하였다. 상이한 플라스미드 제제의 양을 제조하기 위해, 하기의 양에 대해 단일 박테리아 군락을 접종하였다.
미니-프렙의 경우 96웰 2 ml 딥웰 플레이트를 웰당 1.5 ml LB-Amp 배지로 채웠다. 군락을 골라내고 이쑤시개를 배지에 집어넣었다. 모든 군락이 선택되었을 때, 플레이트는 끈적끈적한 공기 다공성 막으로 닫았다. 플레이트를 23시간 동안 200 rpm의 진탕 속도로 37°C에서 배양하였다. 미니-프렙의 경우, 15 ml 튜브(환기 뚜껑 포함)에 3.6 ml LB-Amp 배지를 채우고 박테리아 군락을 동일하게 접종하였다. 배양하는 동안 이쑤시개를 빼지 않고 튜브에 그대로 두었다. 96웰 플레이트와 마찬가지로 튜브를 37°C, 200 rpm에서 23시간 동안 배양하였다.
맥시-프렙의 경우, 200 ml의 LB-Amp 배지를 오토클레이브 유리 1L 삼각 플라스크에 채우고 약 5시간 경과된 1 ml의 박테리아 일일 배양액을 접종하였다. 삼각 플라스크를 종이 플러그로 닫고 37°C, 200 rpm에서 16시간 동안 배양하였다.
플라시미드 제조
미니-프렙의 경우, 박테리아 현탁액 50 μl를 1 ml 딥웰 플레이트로 옮겼다. 그 후, 박테리아 세포를 플레이트에서 3000 rpm으로 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 박테리아 펠렛이 있는 플레이트를 EpMotion에 넣었다. 90분에 실행을 완료하였고 용출된 플라스미드 DNA는 다음 번의 사용을 위해 EpMotion에서 제거할 수 있었다.
미니-프렙의 경우, 15 ml 튜브를 배양기에서 꺼내고 3.6 ml 세균 배양물을 2 ml 삼각 튜브 2개로 나눴다. 튜브를 실온에서 3분 동안 탁상 위 미세원심분리기에서 6,800 xg로 원심분리하였다. 그 후, 제조사의 지침에 따라 키아겐 QIAprep 스핀 미니프렙 키트를 사용하여 미니-프렙을 실시하였다. 플라스미드 DNA 농도는 나노드롭(Nanodrop)으로 측정하였다.
맥시-프렙(Maxi-Prep)은 제조업체의 지침에 따라 마셔레이-나겔 뉴클레오본드(Macherey-Nagel NucleoBond)® 엑스트라 맥시(Xtra Maxi) EF 키트를 사용하여 실시하였다. DNA 농도는 나노드롭으로 측정하였다.
에탄올 석출
DNA 용액의 부피를 2.5배 부피의 에탄올 100%와 혼합하였다. 혼합물을 -20℃에서 10분 동안 배양한 후, DNA를 14,000 rpm, 4°C에서 30분 동안 원심분리하였다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 70% 에탄올로 세척하였다. 다시, 튜브를 14,000 rpm, 4°C에서 5분 동안 원심분리하였다. 피펫팅으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 건조시켰다. 에탄올이 증발되면 적절한 양의 엔도톡신이 없는 물을 첨가하였다. DNA를 4°C에서 밤새 물에 재용해시켰다. 소량을 취하여 나노드롭 장치로 DNA 농도를 측정하였다.
실시예 2
플라스미드 생성
발현 카세트 조성물
항체 사슬의 발현을 위해, 하기의 기능적 요소들을 포함하는 전사 단위를 사용하였다:
- 인트론 A를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 즉각적인 초기 증폭자 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),
- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 각각의 항체 사슬을 부호화하는 핵산,
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA), 및
- 선택적으로 인간 가스트린 종결자(hGT).
발현될 바람직한 유전자를 포함하는 발현 단위/카세트 옆에 기본/표준 포유류 발현 플라스미드는 하기를 함유한다:
- 대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기점, 및
- 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자.
전방 및 후방 벡터 클로닝
2-플라스미드 항체 구조체를 구성하기 위해, 항체 HC 및 LC 단편을 L3 및 LoxFAS 서열을 포함하는 전방 벡터 백본과 LoxFAS 및 2L 서열 및 pac 선택 표지자를 포함하는 후방 벡터에 클로닝했다. Cre 재조합 효소 플라스미드 pOG231 (Wong, E.T., et al., Nuc. Acids Res. 33 (2005) e147; O'Gorman, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 14602-14607)를 모든 RMCE 공정에 사용하였다.
각각의 항체 사슬을 부호화하는 cDNA는 유전자 합성에 의해 생성하였다.(진아트(Geneart), 라이프 테크놀로지스(Life Technologies Inc.)). 유전자 합성 및 백본-벡터를 HindIII-HF 및 EcoRI-HF(NEB)로 37°C에서 1시간 동안 분해하고 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 삽입물 및 중추의 DNA 단편을 아가로스 겔에서 잘라내고 키아퀵(QIAquick) 겔 추출 키트(키아겐)을 이용하여 추출하였다. 정제된 삽입물 및 중추 단편은 3:1의 삽입물/중추 비율로 제조업체 프로토콜에 따라 래피드 결찰 키트(Rapid Ligation Kit, 로슈)를 통해 결찰되었다. 이후, 42°C에서 30초 동안의 열 충격을 통해 적합한 E.coli DH5α에서 결찰 접근이 실시되었고, 37°C에서 1시간 동안 배양한 후 선택을 위해 암피실린을 갖는 우무 평판에 도말하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하였다.
다음 날 클론을 선택하고, 미니 또는 맥시-프렙을 위해 진탕 하에 37°C에서 밤새 배양하였으며, 이는 EpMotion® 5075(에덴도르프) 또는 QIAprep 스핀 미니-프렙 키트(키아겐)/뉴클레오본드 엑스트라 맥시 EF 키트(NucleoBond Xtra Maxi EF Kit, Macherey & Nagel)를 각각 이용하여 실시하였다. 모든 구축물은 바람직하지 않은 돌연변이(SequiServe GmbH)가 없는지 확인하기 위해 서열분석하였다.
제2 클로닝 단계에서, 이전에 클로닝된 벡터를 제1 클로닝 단계와 동일한 조건으로 KpnI-HF/SalI-HF 및 SalI-HF/MfeI-HF로 분해하였다. TI 중추 벡터를 KpnI-HF 및 MfeI-HF로 분해하였다. 상기와 같이 분리 및 추출을 실시하였다. 정제된 삽입물 및 중추의 결찰은 4°C에서 밤새 1:1:1의 삽입물/삽입물/중추 비율로 제조 프로토콜에 따라 T4 DNA 리가아제(NEB)를 사용하여 실시하였고, 65°C에서 10분 동안 비활성화시켰다. 후속 클로닝 단계를 상기 기재된 바와 같이 실시하였다.
클로닝된 플라스미드는 TI 형질감염 및 풀 생성에 사용하였다.
실시예 3
배양, 형질감염, 선택 및 풀 생성
TI 숙주 세포를 등록된 DMEM/F12 기반 배지에서 표준 가습 조건(95% rH, 37°C, 및 5% CO2) 하에서 150 rpm의 일정한 교반 속도로 일회용 125 ml 통기 진탕 플라스크에서 번식시켰다. 3-4 일마다 세포를 3x10E5개 세포/ml 농도의 유효 농도로 선택 표지자 1 및 선택 표지자 2를 포함하는 화학적으로 정의된 배지에 접종하였다. Cedex HiRes 세포 계수기(F. 호프만-라 로슈(Hoffmann-La Roche Ltd), 스위스 바젤 소재)를 사용하여 배양물의 밀도 및 생존력을 측정하였다.
안정적인 형질감염을 위해 등몰량의 전방 및 후방 벡터를 혼합하였다. 5 μg의 혼합물에 1 μg의 Cre 발현 플라스미드를 첨가하였다.
형질감염 2일 전에 TI 숙주 세포를 4x10E5개 세포/ml의 밀도로 신선한 배지에 접종하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 뉴클레오펙터(Nucleofector) 키트 V(론자(Lonza), 스위스 소재)를 사용하여 뉴클레오펙터 장치로 형질 감염을 실시하였다. 3x10E7개 세포들을 30 μg 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 후 세포들을 선택자가 없는 30 ml 배지에 접종하였다.
접종 후 5일째에 세포를 원심분리하고, 재조합 세포의 선택을 위해, 퓨로마이신(선택제 1) 및 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-1-베타-D-아라비노푸라노실-5-요오도)우라실(FIAU; 선택제 2)를 6x10E5 세포/ml의 유효 농도에서 함유하는 화학적으로 정의된 배지 80 mL로 옮겼다. 이날로부터 세포를 분리하지 않고 37℃, 150 rpm, 5% CO2, 및 85% 습도에서 배양하였다. 배양물의 세포 밀도와 생존력을 정기적으로 모니터링하였다. 배양물의 생존력이 다시 증가하기 시작했을 때, 선택제 1과 2의 농도는 이전에 사용된 양의 약 절반으로 감소되었다. 세포의 회복을 촉진하기 위해, 생존율이 > 40%이고 생존 세포 밀도(VCD)가 > 0.5x10E6 세포/mL인 경우 선택 압력을 감소시켰다. 따라서, 4x10E5 세포/ml를 원심분리하고, 40 ml 선택 배지 II(화학적으로 정의된 배지, ½ 선택 표지자 1 & 2)에 재현탁하였다. 세포를 이전과 동일한 조건에서 배양하고 또한 분할하지 않았다.
선택 시작 10일 후, Cre 매개된 카세트 교환의 성공은 세포 표면에 결합된 세포외 크로스맵 및 세포외 2가 이중특이성 항체의 발현을 측정하는 유세포 분석 측정으로 확인하였다(도 6). 인간 항체 경쇄 및 중쇄에 대한 APC 항체(알로피코시아닌 표지 F(ab')2 단편 염소 항인간 IgG)는 FACS 염색을 위한 것이었다. 유세포분석은 BD FACS Canto II 유세포분석기(BD, Heidelberg, 독일)를 사용하여 실시하였다. 샘플 당 10,000개의 이벤트가 측정되었다. 살아있는 세포는 측면 산란(SSC)에 대하여 전방 산란(FSC) 플롯에서 게이팅되었다. 살아있는 세포 게이트는 형질감염되지 않은 TI 숙주 세포로 정의되었으며 FlowJo 7.6.5 EN 소프트웨어 (TreeStar, Olten, Switzerland)를 사용하여 모든 샘플에 적용되었다. GFP의 형광은 FITC 채널에서 정량화되었다(488 nm에서 여기, 530 nm에서 검출). 2가 이중특이성 항체를 APC 채널에서 측정하였다(645 nm에서 여기, 660 nm에서 검출). 모 CHO 세포, 즉 TI 숙주 세포의 생성에 사용된 세포는 GFP 및 2가 이중특이성 항체 발현과 관련하여 음성 대조군으로 사용하였다. 선택 시작 14일 후에 생존율이 90%를 초과하고 선택이 완료된 것으로 간주되었다.
실시예 4
FACS 스크리닝
FACS 분석을 실시하여 형질 감염 효율과 형질 감염의 RMCE 효율을 확인하였다. 형질 감염된 접근법의 4x10E5 세포를 원심분리하고(1200 rpm, 4분), 1 mL PBS로 2회 세척하였다. PBS를 이용한 세척 단계 후, 펠릿을 400 μL PBS에 재현탁하고, FACS 튜브(세포 스트레이너 캡을 갖는 Falcon® Round-Bottom Tubes; Corning)로 이동하였다. 측정은 FACS Canto II로 실시되었으며, 데이터는 소프트웨어 FlowJo로 분석되었다.
실시예 5
유가식 배양
유가식 생산 배양은 화학적으로 정의된 등록된 배지를 사용하여 진탕 플라스크 또는 Ambr15 용기 (Sartorius Stedim)에서 실시하였다. 세포들을 0일차에 1x10E6개 세포/ml로 분주하고, 3일차에 온도를 37°C에서 35°C로 변경하였다. 3, 7 및 10일차에 배양물들에 등록된 공급 배지를 제공하였다. Vi-Cell™ XR 기기(Beckman Coulter)를 사용하여 0, 3, 7, 10 및 14일차에 배양된 세포의 생존 세포 수(VCC) 및 생존율을 측정했다. Bioprofile 400 분석장치(Nova Biomedical)를 사용하여 7, 10 및 14일차에 포도당 및 젖산 농도를 측정하였다. 원심분리(10분, 1000 rpm 및 10분, 4000 rpm)에 의한 급유 시작 후 14일에 상청액을 수확하고 여과(0.22 μm)하여 제거하였다. 14일째 역가는 UV 검출에 의한 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 측정하였다. 생성물 품질은 칼리퍼 랩칩(Caliper's LabChip, Caliper Life Sciences)에서 결정하였다.
실시예 6
벡터 설계의 효과
TI 숙주의 생산성에 대한 발현 카세트 조직의 효과를 조사하기 위해, 도메인 교차/교환을 갖는 2가 이중특이성 항체의 개별 사슬의 발현 카세트의 상이한 수 및 조직을 함유하는 2개의 플라스미드(전방 및 후방 벡터)를 형질감염시켜 RMCE 풀을 생성하였다. RMCE의 선택, 회수 및 유세포 분석에 의한 검증 후, 풀들의 생산성을 14일 유가식 생산 분석에서 평가하였다.
안정적인 형질감염된 세포에서 발현 수율 및 생성물 품질에 대한 항체 사슬 발현 카세트 조직의 효과를 도메인 교환을 갖는 6개의 상이한 2가 이중특이성 항체에 대해 평가하였다. 모두 다른 표적화 특이성을 가졌다. 일부는 상이한 VH/VL 쌍의 효과도 분석되었다. 상기 10가지 상이한 항체에 대해 하기의 결과가 수득되었다.
k = 돌기 돌연변이를 갖는 중쇄; h = 구멍 돌연변이를 갖는 중쇄; l = 경쇄; xl = 도메인 교환을 갖는 경쇄; var = 상기한 결합 부위 서열
SEQUENCE LISTING
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
Hoffmann-La Roche Inc.
<120> Method for the generation of a bivalent, bispecific antibody
expressing cell by targeted integration of multiple expression
cassettes in a defined organization
<130> P35598-WO
<150> EP19181097.7
<151> 2019-06-19
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L3
<400> 1
ataacttcgt ataaagtctc ctatacgaag ttat 34
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2L
<400> 2
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> loxFas
<400> 3
acaacttcgt atataccttt ctatacgaag ttgt 34
<210> 4
<211> 608
<212> DNA
<213> Human cytomegalovirus
<400> 4
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattagc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctccg tttagtgaac 600
gtcagatc 608
<210> 5
<211> 696
<212> DNA
<213> Human cytomegalovirus
<400> 5
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattagc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctccg tttagtgaac 600
gtcagatcta gctctgggag aggagcccag cactagaagt cggcggtgtt tccattcggt 660
gatcagcact gaacacagag gaagcttgcc gccacc 696
<210> 6
<211> 2125
<212> DNA
<213> Human cytomegalovirus
<400> 6
ctgcagtgaa taataaaatg tgtgtttgtc cgaaatacgc gttttgagat ttctgtcgcc 60
gactaaattc atgtcgcgcg atagtggtgt ttatcgccga tagagatggc gatattggaa 120
aaatcgatat ttgaaaatat ggcatattga aaatgtcgcc gatgtgagtt tctgtgtaac 180
tgatatcgcc atttttccaa aagtgatttt tgggcatacg cgatatctgg cgatagcgct 240
tatatcgttt acgggggatg gcgatagacg actttggtga cttgggcgat tctgtgtgtc 300
gcaaatatcg cagtttcgat ataggtgaca gacgatatga ggctatatcg ccgatagagg 360
cgacatcaag ctggcacatg gccaatgcat atcgatctat acattgaatc aatattggcc 420
attagccata ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca 480
tacgttgtat ccatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc 540
atgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca 600
tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc 660
gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat 720
agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt 780
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cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta 900
cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg 960
atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt 1020
gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac 1080
gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa 1140
ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga 1200
ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg cggattcccc gtgccaagag 1260
tgacgtaagt accgcctata gagtctatag gcccaccccc ttggcttctt atgcatgcta 1320
tactgttttt ggcttggggt ctatacaccc ccgcttcctc atgttatagg tgatggtata 1380
gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctcccctatt ggtgacgata 1440
ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac tctctttatt ggctatatgc 1500
caatacactg tccttcagag actgacacgg actctgtatt tttacaggat ggggtctcat 1560
ttattattta caaattcaca tatacaacac caccgtcccc agtgcccgca gtttttatta 1620
aacataacgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt tccggacatg ggctcttctc 1680
cggtagcggc ggagcttcta catccgagcc ctgctcccat gcctccagcg actcatggtc 1740
gctcggcagc tccttgctcc taacagtgga ggccagactt aggcacagca cgatgcccac 1800
caccaccagt gtgccgcaca aggccgtggc ggtagggtat gtgtctgaaa atgagctcgg 1860
ggagcgggct tgcaccgctg acgcatttgg aagacttaag gcagcggcag aagaagatgc 1920
aggcagctga gttgttgtgt tctgataaga gtcagaggta actcccgttg cggtgctgtt 1980
aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg ccaccagaca 2040
taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca gtcaccgtcc 2100
ttgacacggt ttaaacgccg ccacc 2125
<210> 7
<211> 129
<212> DNA
<213> Simian virus 40
<400> 7
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aataaagcat ttttttcacc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta 120
tcatgtctg 129
<210> 8
<211> 225
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 8
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tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 9
<211> 73
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
caggataata tatggtaggg ttcatagcca gagtaacctt tttttttaat ttttatttta 60
ttttattttt gag 73
<210> 10
<211> 288
<212> DNA
<213> Simian virus 40
<400> 10
agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 60
tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 120
ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 180
aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 240
gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc cattttcg 288
<210> 11
<211> 798
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> green fluorescent protein encoding nucleic acid
<400> 11
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tctgcagtcg acggtaccgc gggcccggga 780
tccaccggat ctagatga 798
Claims (14)
- 2가 이중특이성 항체를 생성하는 방법으로서,
a) 상기 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 단계, 및
b) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 상기 2가 이중특이성 항체를 회수하는 단계를 포함하며,
상기 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산은 상기 포유동물 세포의 유전체 내로 안정적으로 통합되고, 5'에서 3' 방향으로,
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함하고,
상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트(Kabat)에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함하는, 방법. - 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산으로서, 5'에서 3' 방향으로,
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함하고,
상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함하는, 데옥시리보핵산. - 포유동물 세포에서 2가 이중특이성 항체의 발현을 위한 데옥시리보핵산의 사용으로서, 상기 데옥시리보핵산은 5'에서 3' 방향으로,
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함하고,
상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함하는, 사용. - 세포의 유전체 내에 통합된 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산을 포함하는 재조합 포유동물 세포로서, 상기 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산은 5'에서 3' 방향으로,
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트, 및
- 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트를 포함하고,
상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함하는, 재조합 포유동물 세포. - 3개의 상이한 재조합 인식 서열 및 4개의 발현 카세트를 차례로 포함하는 2개의 데옥시리보핵산을 포함하는 조성물로서,
- 제1 데옥시리보핵산은 5'에서 3' 방향으로,
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 복제를 포함하고,
그리고
- 제2 데옥시리보핵산은 5'에서 3' 방향으로,
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 복제,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열을 포함하며,
상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함하는, 조성물. - 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산을 포함하고 상기 2가 이중특이성 항체를 분비하는 재조합 포유동물 세포를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은:
a) 포유동물 세포의 유전체의 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 포유동물 세포를 제공하는 단계로서, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 표지자에 측접하는 제1 및 제2 재조합 인식 서열, 및 상기 제1 및 제2 재조합 인식 서열 사이에 위치한 제3 재조합 인식 서열을 포함하고, 모든 재조합 인식 서열은 상이한 단계;
b) 3개의 상이한 재조합 인식 서열 및 4개의 발현 카세트를 포함하는 2개의 데옥시리보핵산의 조성물을 a)에서 제공된 세포 내로 도입하는 단계로서,
- 제1 데옥시리보핵산은 5'에서 3' 방향으로,
- 제1 재조합 인식 서열,
- 제1 경쇄를 부호화하는 제1 발현 카세트,
- 제1 중쇄를 부호화하는 제2 발현 카세트, 및
- 제3 재조합 인식 서열의 제1 복제를 포함하고,
그리고
- 제2 데옥시리보핵산은 5'에서 3' 방향으로,
- 제3 재조합 인식 서열의 제2 복제,
- 제2 경쇄를 부호화하는 제3 발현 카세트,
- 제2 중쇄를 부호화하는 제4 발현 카세트, 및
- 제2 재조합 인식 서열을 포함하며,
상기 제1 및 제2 데옥시리보핵산의 제1 내지 제3 재조합 인식 서열은 상기 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상의 제1 내지 제3 재조합 인식 서열과 일치하고,
하나의 제2 선택 표지자를 부호화하는 발현 카세트의 5' 말단 부분 및 3' 말단 부분은 함께 취합될 때 하나의 제2 선택 표지자의 기능적 발현 카세트를 형성하고;
상기 제1 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366W(카바트에 따른 넘버링)를 포함하고 상기 제2 중쇄는 CH3 도메인 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트에 따른 넘버링)를 포함하는 단계;
c) 하나 이상의 재조합 효소를,
i) b)의 제1 및 제2 데옥시리보핵산과 동시에,
또는
ii) 순차적으로 그 이후에
도입하는 단계로서,
상기 하나 이상의 재조합 효소는 상기 제1 및 제2 데옥시리보핵산의 재조합 인식 서열들을 인식하는 단계; (그리고 선택적으로 상기 하나 이상의 재조합 효소는 재조합 효소 매개 카세트 교환을 2회를 실시하는 단계;);
및
d) 상기 제 2 선택 표지자를 발현하고 상기 2가 이중특이성 항체를 분비하는 세포들을 선택하는 단계;를 포함함으로써
상기 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산을 포함하고 상기 2가 이중특이성 항체를 분비하는 재조합 포유동물 세포를 생성하는, 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 중쇄들 중 하나는 돌연변이 S354C를 추가로 포함하고 각각의 다른 중쇄는 돌연변이 Y349C(카바트에 따른 넘버링)를 포함하는, 2가 이중특이성 항체를 생성하는 방법, 또는 데옥시리보핵산, 또는 사용, 또는 재조합 포유동물 세포, 또는 조성물, 또는 재조합 포유동물 세포를 생성하는 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 경쇄는 VH-VL 교환 후 도메인 교환된 경쇄 VH-CH1 또는 CH1-CL 교환 후 도메인 교환된 경쇄 VL-CH1인, 2가 이중특이성 항체를 생성하는 방법, 또는 데옥시리보핵산, 또는 사용, 또는 재조합 포유동물 세포, 또는 조성물, 또는 재조합 포유동물 세포를 생성하는 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
- 상기 제1 중쇄는 N 말단에서 C 말단으로 제1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 상기 제2 중쇄는 N 말단에서 C 말단으로 제1 경쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고,
- 상기 제1 경쇄는 N 말단에서 C 말단으로 제2 중쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하고, 및
- 상기 제2 경쇄는 N 말단에서 C 말단으로 제2 경쇄 가변 도메인 및 CL 도메인을 포함하며,
상기 제1 중쇄 가변 도메인 및 상기 제2 경쇄 가변 도메인은 제1 결합 부위를 형성하고, 상기 제2 중쇄 가변 도메인 및 상기 제1 경쇄 가변 도메인은 제2 결합 부위를 형성하는, 2가 이중특이성 항체를 생성하는 방법, 또는 데옥시리보핵산, 또는 사용, 또는 재조합 포유동물 세포, 또는 조성물, 또는 재조합 포유동물 세포를 생성하는 방법. - 제1항, 제3항, 제4항 및 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 데옥시리보핵산의 정확히 하나의 복제는 단일 부위 또는 유전자좌에서 포유동물 세포의 유전체 내로 안정적으로 통합되는, 2가 이중특이성 항체를 생성하는 방법, 또는 데옥시리보핵산, 또는 사용, 또는 재조합 포유동물 세포, 또는 조성물, 또는 재조합 포유동물 세포를 생성하는 방법. - 제1항 내지 제5항 및 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 2가 이중특이성 항체를 부호화하는 데옥시리보핵산은 선택 표지자에 대해 부호화하는 추가적인 발현 카세트를 포함하고, 상기 선택 표지자에 대해 부호화하는 발현 카세트는 상기 제3 재조합 인식 서열에 대해 부분적으로 5' 및 부분적으로 3'에 위치하고, 상기 발현 카세트의 5' 위치 부분은 프로모터 및 시작 코돈을 포함하고, 상기 발현 카세트의 3' 위치 부분은 시작 코돈 및 폴리A 신호가 없는 부호화 서열을 포함하고, 상기 시작 코돈은 상기 부호화 서열에 작동 가능하게 연결되고, 상기 선택 표지자를 부호화하는 발현 카세트의 5' 위치 부분은 시작 코돈에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고, 상기 프로모터 서열은 상기 제2 발현 카세트에 의해 상류에 측접되고 상기 시작 코돈은 상기 제3 재조합 인식 서열에 의해 하류에 측접되며, 상기 선택 표지자를 부호화하는 발현 카세트의 3' 위치 부분은 시작 코돈이 없는 선택 표지자를 부호화하는 핵산을 포함하고 상기 제3 재조합 인식 서열에 의해 상류에 측접되고 상기 제3 발현 카세트에 의해 하류에 측접되며, 상기 시작 코돈은 상기 부호화 서열에 작동 가능하게 연결되는, 2가 이중특이성 항체를 생성하는 방법, 또는 데옥시리보핵산, 또는 사용, 또는 재조합 포유동물 세포, 또는 조성물, 또는 재조합 포유동물 세포를 생성하는 방법. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
항체 사슬에 대한 각각의 발현 카세트는 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 항체 사슬을 부호화하는 핵산, 및 폴리아데닐화 신호 서열 및 선택적으로 종결자 서열을 포함하고,
그리고
상기 선택 표지자를 부호화하는 각각의 발현 카세트는 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 상기 선택 표지자를 부호화하는 핵산, 및 폴리아데닐화 신호 서열 및 선택적으로 종결자 서열을 포함하고,
상기 프로모터는 인트론 A를 갖는 인간 CMV 프로모터이고, 상기 폴리아데닐화 신호 서열은 bGH 폴리아데닐화 신호 서열이고, 상기 종결자는 상기 선택 표지자의 발현 카세트를 제외하고는 hGT 종결자이며, 상기 프로모터는 SV40 프로모터이고 상기 폴리아데닐화 신호 서열은 SV40 폴리아데닐화 신호 서열이며 종결자는 결여된, 2가 이중특이성 항체를 생성하는 방법, 또는 데옥시리보핵산, 또는 사용, 또는 재조합 포유동물 세포, 또는 조성물, 또는 재조합 포유동물 세포를 생성하는 방법. - 제1항, 제3항, 제4항, 및 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 포유동물 세포는 CHO 세포인, 2가 이중특이성 항체를 생성하는 방법, 또는 데옥시리보핵산, 또는 사용, 또는 재조합 포유동물 세포, 또는 조성물, 또는 재조합 포유동물 세포를 생성하는 방법. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
모든 카세트는 단방향으로 배열되는, 2가 이중특이성 항체를 생성하는 방법, 또는 데옥시리보핵산, 또는 사용, 또는 재조합 포유동물 세포, 또는 조성물, 또는 재조합 포유동물 세포를 생성하는 방법.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0105 | International application |
Patent event date: 20211217 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
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| PA0201 | Request for examination | ||
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20240513 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E601 | Decision to refuse application | ||
| PE0601 | Decision on rejection of patent |
Patent event date: 20240722 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D |